ES2249046T3

ES2249046T3 - Utilizacion de lineas celulares humanas de la prostata para tratar el cancer de prostata.

Info

Publication number: ES2249046T3
Application number: ES99959542T
Authority: ES
Inventors: Angus George Onyvax Limited DALGLEISH; Peter Michael Onyvax Limited SMITH; Andrew Derek Onyvax Limited SUTTON; Anthony Ian Onyvax Limited WALKER
Original assignee: Onyvax Ltd
Current assignee: Onyvax Ltd
Priority date: 1998-12-10
Filing date: 1999-12-09
Publication date: 2006-03-16
Anticipated expiration: 2019-12-09
Also published as: NO20012634L; HUP0104568A2; PL348828A1; CA2354045A1; CA2354045C; ATE304365T1; JP2012021028A; KR20010090874A; WO2000033869A3; NO327044B1; AU763485B2; EP1137422B1; NO20012634D0; CZ300499B6; IL143296A; GB9827104D0; US20050249756A1; US8034360B2; ZA200104164B; DE69927286T2

Abstract

Un agente inmunoterapéutico alogénico para el tratamiento del cáncer de próstata en un paciente, que comprende tres líneas celulares prostáticas humanas procedentes de tres fuentes diferentes, de las cuales una, dos o tres líneas celulares derivan de tejido(s) normal(es), donde cada uno de dicho(s) tejido(s) normal(es) procede de una fuente que es próstata no cancerosa, y donde las líneas celulares procedentes de tres fuentes diferentes son genéticamente e inmunológicamente no coincidentes con el paciente.

Description

Utilización de líneas celulares humanas de la próstata para tratar el cáncer de próstata.

Campo de la invención

Esta invención tiene que ver con agentes para el tratamiento de cáncer primario, metastásico y residual en mamíferos (incluyendo humanos) mediante la inducción del sistema inmune del mamífero o del humano afectado por cáncer para que organice un ataque contra la lesión tumoral. En particular, la invención está relacionada con la utilización de células completas, derivados y porciones de las mismas con o sin adyuvantes de vacuna y/o otros factores accesorios. Más particularmente, esta publicación describe la utilización de combinaciones particulares de células completas y derivados y porciones de las mismas que constituyen la base de la estrategia de tratamiento.

Antecedentes de la invención

Se sabe en este campo que las células cancerosas contienen numerosas mutaciones, cualitativas y cuantitativas, espaciales y temporales, con relación a sus equivalentes normales no cancerosos, y que en ciertos periodos durante el crecimiento y la propagación de las células tumorales una proporción de las mismas es capaz de ser reconocida como células anormales por el sistema inmune de los huéspedes. Esto ha dado lugar a numerosos intentos de investigación en todo el mundo para desarrollar inmunoterapias que aprovechen el poder del sistema inmune de los huéspedes y lo dirijan para atacar a las células cancerosas, eliminando de este modo tales células aberrantes al menos hasta un nivel que no sea amenazador para la vida (revisado en Maraveyas, A. y Dalgleish, A.G., 1977, Active immunotherapy for solid tumours in vaccine design en The Role of Cytokine Networks, Ed. Gregoriadis y col., Plenum Press, New York, páginas 129-145; Morton, D.L. y Ravindranath, M.H., 1996, Current concepts concerning melanoma vaccines en Tumor Immunology - Immunotherapy and Cancer Vaccines, ed. Dalgleish, A.G y Browning, M. Cambridge University Press, páginas 241-268. Ver también otros artículos en estas publicaciones para más detalle).

Se han realizado numerosos abordajes en la búsqueda de inmunoterapias contra el cáncer, y éstos pueden ser clasificados en cinco categorías:

Inmunoterapia no específica

Los intentos para estimular el sistema inmune de forma no específica datan de hace más de un siglo con el trabajo pionero de William Coley (Coley, W.B., 1894, Treatment of inoperable malignant tumours with toxins of erisipelas and the Bacillus prodigosus. Trans. Am. Surg. Assoc. 12: 183). Aunque tuvo éxito solamente en un número de casos limitado (por ejemplo, BCG para el tratamiento del cáncer de la vejiga urinaria, IL-2 para el tratamiento de melanoma y cáncer renal), muchos reconocen que es poco probable que la inmunomodulación no específica demuestre ser suficiente para tratar la mayoría de los cánceres. Aunque los inmunoestimulantes no específicos pueden dar lugar a un estado general incrementado de sensibilidad inmune, carecen de la capacidad de vectorización y también de agudeza para tratar lesiones tumorales que tengan muchos mecanismos y plasticidad para evadir, resistir y subvertir la vigilancia inmune.

Anticuerpos y anticuerpos monoclonales

La inmunoterapia pasiva en forma de anticuerpos, y particularmente los anticuerpos monoclonales, han sido también objeto de investigación y desarrollo considerables como agentes anticancerosos. Aclamados originalmente como la bala mágica debido a su exquisita especificidad, los anticuerpos monoclonales no han respondido a sus expectativas en el campo de la inmunoterapia del cáncer por un número de razones, incluyendo respuestas inmunes a los propios anticuerpos (suprimiendo de este modo su actividad) y la incapacidad del anticuerpo para acceder a la lesión a través de los vasos sanguíneos. Hasta la fecha, se han registrado tres productos como agentes farmacéuticos para uso humano, a saber Panorex (Glaxo-Wellcome), Rituxan (IDEC/Genentech/ Hoffman la Roche) y Herceptin (Genentech/Hoffman la Roche) con más de otros 50 proyectos de investigación y desarrollo en tramitación. Pueden emplearse también anticuerpos en inmunoterapia activa utilizando anticuerpos anti-idiotipo que parece que remedan (en un sentido inmunológico) a antígenos del cáncer. Aunque elegante en concepto, la utilidad de los abordajes basados en anticuerpos puede resultar finalmente limitada por el fenómeno del "escape inmunológico", por el que un subgrupo de células cancerosas en un sujeto mamífero o humano muta y pierde el antígeno reconocido por el anticuerpo particular y de este modo puede dar lugar a la extensión de una población de células cancerosas que no son ya tratables con ese anticuerpo.

Vacunas subunidad

Sirviéndose de la experiencia en vacunas para enfermedades infecciosas y en otros campos, muchos investigadores han buscado identificar antígenos que estén exclusivamente o preferencialmente asociados con células cancerosas, a saber antígenos específicos de tumores (TSA) o antígenos asociados a tumores (TAA), y utilizar tales antígenos o fracciones de los mismos como base para una inmunoterapia activa específica.

Hay numerosas formas de identificar proteínas o péptidos derivados de las mismas que estén dentro de la categoría de TAA o TSA. Por ejemplo, es posible utilizar técnicas de presentación diferencial mediante las cuales se compara la expresión de ARN entre el tejido tumoral y el tejido normal adyacente con el fin de identificar ARNs que sean expresados exclusivamente o preferencialmente en la lesión. La secuenciación del ARN ha identificado varios TAAs y TSAs que se expresan en ese tejido específico en ese momento específico, pero en ellos reside la deficiencia potencial del abordaje en cuanto a que la identificación del TAA o TSA representa únicamente una "fotografía instantánea" de la lesión en un momento dado que puede no proporcionar un reflejo adecuado del perfil antigénico en la lesión a lo largo del tiempo. De manera similar, una combinación de clonaje y expresión de linfocitos T citotóxicos (CTL)-clonaje de ADNc del tejido tumoral ha dado lugar a la identificación de muchos TAA y TSA, particularmente en melanomas. El abordaje padece de la misma debilidad inherente que las técnicas de presentación diferencial, en cuanto a que la identificación de solamente un TAA o un TSA puede no proporcionar una representación apropiada de un perfil antigénico clínicamente relevante.

Más de cincuenta de tales planteamientos de vacuna subunidad están en desarrollo para el tratamiento de un amplio rango de cánceres, aunque ninguna de esas vacunas ha recibido todavía autorización de comercialización para ser utilizada como producto farmacéutico en humanos. De manera similar a la descrita para los planteamientos basados en anticuerpos anteriores, la vacunas subunidad pueden estar limitadas también por el fenómeno del escape inmunoló-
gico.

Terapia génica

La mayoría de los ensayos de terapia génica en sujetos humanos han sido en el área de tratamiento del cáncer, y de éstos una proporción sustancial ha sido diseñada para desencadenar y/o amplificar la respuesta inmune de los pacientes. Son de particular atención en desarrollo comercial Allovectin-7 y Leuvectin, que están siendo desarrollados por Vical Inc. para un rango de tumores humanos, CN706 que está siendo desarrollado por Calydon Inc. para el tratamiento del cáncer de próstata y la terapia génica de proteínas del estrés de StressGen Inc. para melanoma y cáncer de pulmón. Actualmente, es demasiado pronto para juzgar si éstas y las otras muchas "terapias inmunogénicas" en desarrollo por organismos comerciales y académicos demostrarán finalmente tener éxito, pero se acepta en general que es probable que la utilidad comercial de estos abordajes tarde más de una década en llegar.

Vacunas basadas en células

Los tumores tienen la singular capacidad de contrarrestar el sistema inmune de una variedad de formas incluyendo: la regulación por disminución de la expresión de proteínas diana potenciales; la mutación de las proteínas diana potenciales; la regulación por disminución de la expresión en superficie de receptores y otras proteínas; la regulación por disminución de la expresión de MHC de clase I y II, impidiendo de este modo la presentación directa de los péptidos TAA o TSA; la regulación por disminución de moléculas coestimulantes que da lugar a una estimulación incompleta de las células T produciendo anergia; el desprendimiento de porciones de membrana selectivas, no representativas, para que actúen como señuelo para el sistema inmune; el desprendimiento de porciones de membrana selectivas para anergizar el sistema inmune; la secreción de moléculas inhibidoras; la inducción de muerte de células T y muchas otras formas. Lo que se aprecia es que la heterogeneidad y plasticidad inmunológicas de los tumores en el organismo tendrán que ser igualadas hasta cierto grado por estrategias inmunoterapéuticas que incorporen de manera similar la heterogeneidad. La utilización de células cancerosas completas, o de derivados brutos de las mismas, como agentes inmunoterapéuticos contra el cáncer puede ser considerada como análoga a la utilización de virus completos inactivados o atenuados como vacunas contra enfermedades víricas. Las ventajas potenciales
son:

(a): las células completas contienen un amplio rango de antígenos, proporcionando un perfil antigénico de heterogeneidad suficiente para igualar al de las lesiones según se describió anteriormente;

(b): al ser multivalentes (esto es, que contienen múltiples antígenos), se reduce el riesgo de escape inmunológico (la probabilidad de que las células cancerosas "pierdan" todos estos antígenos es remota); y

(c): las vacunas basadas en células incluyen TSAs y TAAs que tienen que ser todavía identificados como tales; es posible, si no probable, que antígenos no identificados actualmente puedan ser clínicamente más relevantes que el número relativamente pequeño de TSAs/TAAs que se conocen.

Las vacunas basadas en células están dentro de dos categorías. La primera, basada en células autólogas, implica la extracción de una biopsia de un paciente, el cultivo de las células tumorales in vitro, la modificación de las células mediante transfección y/u otros medios, la irradiación de las células para convertirlas en incompetentes para la replicación y la inyección posterior de las células de nuevo al mismo paciente como vacuna. Aunque este procedimiento disfrutó de una atención considerable en la pasada década, es cada vez más obvio que esta terapia personalizada individualmente es inherentemente poco práctica por varias razones. El procedimiento requiere mucho tiempo (a menudo el tiempo de espera para la producción de dosis clínicas de la vacuna es superior a la esperanza de vida del paciente), es caro y, como producto "confeccionado a medida", no es posible especificar un producto estandarizado (solamente el procedimiento, no el producto, puede ser estandarizado y por tanto optimizado y sometido a control de calidad). Además, la biopsia del tumor utilizada para preparar la vacuna autóloga tendrá ciertas características de crecimiento, interacciones y comunicación con el tejido circundante que la hacen de algún modo única. Esto alude a una desventaja potencialmente significativa de la utilización de células autólogas para inmunoterapia: la biopsia que proporciona las células iniciales representa una instantánea inmunológica del tumor, en ese entorno y en ese punto de tiempo, y ésta puede ser inadecuada como representación inmunológica a lo largo del tiempo para la finalidad de una vacuna con actividad mantenida que pueda ser administrada durante el curso completo de la enfermedad.

El segundo tipo de vacuna basada en células, y sujeto de la presente invención, describe la utilización de células alogénicas que son genéticamente (y por tanto inmunológicamente) distintas a las de los pacientes. Las células alogénicas disfrutan de las mismas ventajas de multivalencia que las células autólogas. Además, como las vacunas de células alogénicas pueden estar basadas en líneas de células inmortalizadas que pueden ser cultivadas indefinidamente in vitro, este abordaje no padece por tanto de las desventajas de tiempo de espera y coste que tienen los abordajes autólogos. De manera similar, el abordaje alogénico ofrece la oportunidad de utilizar combinaciones de tipos celulares que pueden igualar el perfil de la enfermedad de un individuo en términos de etapa de la enfermedad, localización de la lesión y resistencia potencial a otras terapias.

Hay numerosos informes publicados sobre la utilidad de las vacunas contra el cáncer basadas en células (ver, por ejemplo, Dranoff, G. y col., WO 93/06867; Gansbacher, P., WO 94/18995; Jaffee, E.M. y col., WO 97/24132; Mitchell, M.S., WO 90/03183; Morton, D.M. y col., WO 91/06866). Estos estudios incluyen un rango de variaciones desde el procedimiento basal de utilización de células cancerosas como antígeno en inmunoterapia, hasta la transfección de las células para producir GM-CSF, IL-2, interferones u otras moléculas inmunológicamente activas y la utilización de genes "suicidas". Hay grupos que han utilizado líneas celulares alogénicas que tienen un HLA coincidente o parcialmente coincidente con el haplotipo del paciente y también líneas celulares alogénicas que no coinciden con el haplotipo del paciente en el campo del melanoma y también líneas de células prostáticas alogénicas no coincidentes transfectadas con MG-CSF.

Descripción de la invención

La invención aquí descrita se refiere a un producto compuesto por una línea o líneas celulares destinadas a ser utilizadas como agentes inmunoterapéuticos alogénicos para el tratamiento del cáncer en mamíferos y humanos.

Todos los estudios de vacunas contra el cáncer basadas en células realizados hasta la fecha tienen una característica en común, a saber la intención de utilizar células que contengan al menos algunos TSAs y/o TAAs que estén compartidos con los antígenos presentes en el tumor del paciente. En cada caso, se utilizan células tumorales como punto de partida sobre la premisa de que solamente las células tumorales contendrán TSAs o TAAs de relevancia, y de que los tejidos origen de las células coincidan con el lugar del tumor en los pacientes.

Un aspecto primario de la invención es la utilización de células inmortalizadas normales, no malignas, como base de una vacuna contra el cáncer de células alogénicas. Las células normales no poseen TSAs ni concentraciones relevantes de TAAs y, por tanto, es sorprendente que las células normales, según se describe en la presente, sean eficaces como vacunas anticancerosas. El abordaje es general y puede ser adaptado a cualquier tumor de mamífero mediante la utilización de células normales inmortalizadas derivadas del mismo tejido particular que el tumor que se desea tratar. Las células normales inmortalizadas pueden ser preparadas por los expertos en la técnica utilizando metodologías publicadas, o pueden ser obtenidas de bancos de células tales como ATCC o ECACC, o bien están disponibles en varios grupos de investigación de este campo.

Para el cáncer de próstata, por ejemplo, una vacuna puede estar basada en una o en una combinación de diferentes líneas celulares normales inmortalizadas derivadas de la próstata que pueden ser preparadas utilizando los métodos revisados y citados por Rhim, J.S. y Kung, H.-F., 1997, Critical Reviews in Oncogenesis 8(4):305-328, o seleccionadas de PNT1A (Nº de Ref. de la ECACC: 95012614), PNT2 (Nº de Ref. de la ECACC: 95012613) o PZ-HPV-7 (Número de la ATCC: CRL-2221).

Un aspecto más de la invención es la adición de TSAs y/o TAAs mediante la combinación de una o más línea(s) celular(es) normal(es) inmortalizada(s) con una, dos o tres líneas celulares diferentes derivadas de biopsias de cáncer primario o metastásico.

Todas las líneas celulares apropiadas mostrarán un buen crecimiento en cultivo celular a gran escala y una caracterización suficiente para permitir un control de calidad y una producción reproducible.

Las líneas celulares son irradiadas letalmente utilizando radiación gamma a 50-300 Gy para asegurar que son incompetentes para la replicación antes de ser utilizadas en el mamífero o en el humano.

Para que las líneas celulares y las combinaciones anteriormente referenciadas sean útiles como agentes inmunoterapéuticos deben ser congeladas para permitir su transporte y almacenamiento, por lo que un aspecto adicional de la invención es cualquier combinación de las células referenciadas anteriormente formulada con una solución crioprotectora. Las soluciones crioprotectoras adecuadas pueden incluir, pero no se limitan a, una solución acuosa de glicerol al 10-30% v/v, dimetil sulfóxido al 5-20% v/v o seroalbúmina humana al 5-20% p/v, que pueden ser utilizadas como crioprotectores individuales o en combinación.

Una realización más de la invención es la utilización de las combinaciones de líneas celulares con inmunoestimulantes no específicos tales como BCG o M. Vaccae, toxoide del tétano, toxoide de la difteria, Bordetella pertussis, interleuquina 2, interleuquina 12, interleuquina 4, interleuquina 7, Adyuvante Completo de Freund, Adyuvante Incompleto de Freund u otros agentes no específicos conocidos en la técnica. La ventaja es que los inmunoestimulantes generales crean un estado inmune generalmente intensificado, mientras que las combinaciones de líneas celulares añaden a la intensificación inmune a través de su disparidad de haplotipos, y dirigen la respuesta inmune hacia, una plétora de TAA y TSA como resultado de la heterogeneidad de sus orígenes específicos.

La invención será descrita a continuación con referencia a los ejemplos y figuras siguientes, en las cuales:

la Figura 1 muestra datos sobre la proliferación de células T en los pacientes 112, 307 y 406;

la Figura 2 muestra el análisis de Transferencia Western del suero de los pacientes 115, 304 y 402;

la Figura 3 muestra los títulos de anticuerpos del suero de los pacientes 112, 305 y 402;

la Figura 4 muestra datos de PSA de los pacientes 110, 303 y 404; y

la Figura 5 muestra curvas de supervivencia de ratones C57 inmunizados con melanocitos normales.

Ejemplo 1 Crecimiento, irradiación, formulación y almacenamiento de las células

Una línea celular inmortalizada derivada de tejido de próstata normal, concretamente PNT2, fue cultivada en botellas para cultivo rotatorias en medio RPMI 1640 suplementado con L-glutamina 2 mM y un 5% de suero de ternera fetal (FCS) después de su recuperación de depósitos de células en nitrógeno líquido. Después de la expansión en frascos estáticos T175, las células fueron sembradas en botellas rotatorias con un área de la superficie de cultivo de 850 cm^{2} a 1-20 x 10^{7} células por botella rotatoria.

Una línea celular inmortalizada derivada de tejido prostático primario, concretamente NIH1542-CP3TX, fue cultivada en botellas de cultivo rotatorias en medio KSFM suplementado con 25 \mug/ml de extracto de pituitaria bovina, 5 ng/ml de factor de crecimiento epidérmico, L-glutamina 2 mM, tampón HEPES 10 mM y un 5% de suero de ternera fetal (FCS) (de aquí en adelante denominado "KSFM modificado") después de su recuperación de depósitos celulares en nitrógeno líquido. Después de la expansión en frascos estáticos T175, las células fueron sembradas en botellas rotatorias con un área de la superficie de cultivo de 1.700 cm^{2} a 2-5 x 10^{7} células por botella rotatoria.

Se utilizaron también dos líneas celulares derivadas secundarias, a saber LnCap y Du145, ambas de las cuales procedían de la ATCC. La LnCap fue cultivada en frascos estáticos que tenían un área de la superficie de cultivo grande en medio RMPI suplementado con un 10% de FCS y L-glutamina 2 mM después de sembrar 1-10 x 10^{6} células por recipiente y posteriormente cultivadas hasta casi confluencia. La Du145 fue expandida a partir de depósitos celulares congelados en frascos estáticos y posteriormente sembradas en botellas rotatorias de 850 cm^{2} a 1-20 x 10^{7} células por botella y cultivadas hasta confluencia en medio DMEM que contenía un 10% de FCS y L-glutamina 2 mM. Todas las líneas celulares fueron recogidas utilizando tripsina a una concentración normal 1x. Después de un extenso lavado en DMEM, las células fueron resuspendidas a una concentración de 5-40 x 10^{6} células/ml e irradiadas con 50-300 Gy utilizando una fuente de Co^{60}. Después de la irradiación las células fueron formuladas en una solución de crioconservación compuesta por DMSO 10%, seroalbúmina humana 8% en solución salina tamponada con fosfato, y congeladas a una concentración celular de 5-150 x 10^{6} células/ml en nitrógeno líquido hasta que se requiriera su utilización.

Vacunación

Se seleccionaron pacientes con cáncer de próstata sobre la base de ser refractarios a la terapia hormonal, con un nivel de PSA en suero de al menos 30 ng/ml. Se solicitaron y se obtuvieron el permiso ético y la autorización de la MCA (Medicines Control Agency del R.U.) para llevar a cabo este ensayo.

Se siguió para cada brazo del ensayo uno de tres programas de vacunación:

	Líneas Celulares Administradas
Dosis	Brazo A del Ensayo	Brazo B del Ensayo	Brazo C del Ensayo
1, 2 y 3	PNT2	Du145	LnCap
4 y siguientes	PNT2/Du145/NIH1542	PNT2/Du145/LnCap	PNT2/NIH1542/LnCap

Las células fueron templadas suavemente en un baño de agua a 37ºC y mezcladas con un adyuvante micobacteriano antes de la inyección a los pacientes. Las inyecciones se realizaron intradérmicamente en cuatro lugares de inyección en las cuencas de los nódulos linfáticos drenantes. El intervalo mínimo entre las dosis fue de dos semanas, y la mayoría de las dosis se administraron a intervalos de cuatro semanas. Antes de la primera dosis, y antes de cualquiera de las dosis posteriores, se analizó a los pacientes para determinar hipersensibilidad de tipo retardado (DTH) frente a las cuatro líneas celulares enumeradas en el programa de vacunación anterior (todos lo análisis implicaban 0,8 x 10^{6} células sin adyuvante).

Análisis de la Respuesta Inmunológica (a) Respuestas de Proliferación de Células T

Con el fin de determinar si la vacunación tuvo como resultado una expansión específica de poblaciones de células T que reconocían antígenos derivados de las líneas celulares de la vacunación, llevamos a cabo un ensayo de proliferación de células T después de la estimulación con lisados de las líneas celulares prostáticas. Se extrajo sangre completa en cada visita a la clínica y se utilizó en un ensayo de proliferación basado en BrdU (bromodesoxiuridina) según se describe a continuación:

Método de proliferación con BrdU en los pacientes

Reactivos
RPMI		Life Technologies, Paisley, Escocia
BrdU		Sigma Chemical Co., Poole, Dorset
PharMlyse	35221E	Pharmingen, Oxford, R.U.
Cytofix/Cytoperm	2090KZ	\hskip1cm ''
Tampón Perm/Wash (10x)	2091KZ	\hskip1cm ''
FITC Anti-BrdU/ADNasa	340649	Becton Dickinson
PerCP Anti-CD3	347344	\hskip1cm ''
Pe Anti-CD4	30155X	Pharmingen
Pe Anti-CD8	30325X	\hskip1cm ''
FITC mu-IgG1	349041	Becton Dickinson
PerCP IgG1	349044	\hskip1cm ''
PE IgG1	340013	\hskip1cm ''

Método

1): Diluir 1 ml de sangre con 9 ml de RPMI + L-gln 2 mM + PS + 2-Me 50 \muM. No añadir suero. Dejar una noche a 37ºC.

2): La mañana siguiente, alicuotar 450 \mul de sangre diluida en los pocillos de una placa de 48 pocillos y añadir 50 \mul de lisado estimulante. El lisado se produce por la congelación-descongelación de las células tumorales (2 x 10^{6} equivalentes celulares/ml) 3x en nitrógeno líquido y el almacenamiento posterior de alícuotas congeladas hasta que se requiera su utilización.

3): Cultivar las células a 37ºC durante 5 días.

4): La tarde del día 5, añadir 50 \mul de BrdU @ 30 \mug/ml.

5): Alicuotar 100 \mul de cada muestra en una placa de 96 pocillos de fondo redondo.

6): Centrifugar la placa y desechar el sobrenadante.

7): Lisar los glóbulos rojos utilizando 100 \mul de Pharmlyse durante 5 minutos a temperatura ambiente.

8): Lavar 2x con 50 \mul de Cytofix.

9): Centrifugar y eliminar el sobrenadante mediante sacudida de la placa.

10): Permeabilizar con 100 \mul de Perm/Wash durante 10 minutos a temperatura ambiente.

11): Añadir 30 \mul de mezcla de anticuerpos que contiene anticuerpos a la dilución correcta completada hasta su volumen con Perm/Wash.

12): Incubar durante 30 minutos en oscuridad a temperatura ambiente.

13): Lavar 1x y resuspender en 100 \mul de paraformaldehído al 2%.

14): Añadir esto a 400 \mul de FACSFlow en tubos agrupados listos para el análisis.

15): Analizar en FACScan, almacenando 3000 eventos de CD3 acotados.

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Placa de 6 pocillos para la estimulación
	Nil	ConA	1542	LnCap	Du145	Pnt2
PBL 1
PBL 2
PBL 3
PBL 4
PBL 5
PBL 6

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Placa de 96 pocillos para la tinción con anticuerpos
PBL 1	PBL 2	PBL 3	PBL 4	PBL 5	PBL 6
Nil A	15 D	Nil A	15 D	Nil A	15 D	Nil A	15 D	Nil A	15 D	Nil A	15 D
Nil D	15 E	Nil D	15 E	Nil D	15 E	Nil D	15 E	Nil D	15 E	Nil D	15 E
Nil E	Ln D	Nil E	Ln D	Nil E	Ln D	Nil E	Ln D	Nil E	Ln D	Nil E	Ln D
Con D	Ln E	Con D	Ln E	Con D	Ln E	Con D	Ln E	Con D	Ln E	Con D	Ln E
Con E	Du D	Con E	Du D	Con E	Du D	Con E	Du D	Con E	Du D	Con E	Du D
	Du E		Du E		Du E		Du E		Du E		Du E
	Pn D		Pn D		Pn D		Pn D		Pn D		Pn D
	Pn E		Pn E		Pn E		Pn E		Pn E		Pn E
Leyenda
A: IgG1-FITC (5 \mul) \hskip3,5cm IgG1-PE (5 \mul) \hskip3,5cm IgG1-PerCP (5 \mul)
\hskip0,35cm 15 \mul MoAb + 15 \mul
D: BrdU-FITC (5 \mul) \hskip3,5cm CD4-PE (5 \mul) \hskip3,5cm CD3-PerCP (5 \mul)
\hskip0,35cm 15 \mul MoAb + 15 \mul
E: BrdU-FITC (5 \mul) \hskip3,5cm CD8-PE (5 \mul) \hskip3,5cm CD3-PerCP (5 \mul)
\hskip0,35cm 15 \mul MoAb + 15 \mul
15: NIH1542-CP3TX
Ln: LnCap
D: Du145
Pn: PNT2
Con: lectina ConA (control positivo)
Nil: Sin estimulación

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Los resultados de los ensayos de proliferación están mostrados en la Figura 1, en la que se representa gráficamente el índice de proliferación de células T positivas para CD4 o CD8 frente a los diferentes lisados celulares. El índice de proliferación es obtenido dividiendo el porcentaje de células T que proliferan entre el control sin lisado.

Se muestran los resultados de los pacientes número 112, 307 y 406. Se dan resultados para cuatro lisados celulares, a saber, NIH1542, LnCap, Du145 y PNT2. En términos generales, el 50% de los pacientes tratados presentan una respuesta proliferativa específica hacia al menos una de las líneas celulares.

(b) Transferencias Western Utilizando Suero de los Pacientes

Se prepararon lisados celulares estandarizados de varias líneas celulares prostáticas con el fin de permitir que cantidades similares de proteína fueran cargadas en un gel de SDS-PAGE desnaturalizante para análisis de Transferencia Western. Cada transferencia fue cargada con marcadores de peso molecular y cantidades iguales de proteína derivada de lisados celulares de NIH1542, LnCap, Du145 y PNT2. La transferencia fue sondada posteriormente con suero de los pacientes obtenido antes de la vacunación y 16 semanas después de la vacunación (de cuatro a seis dosis).

Método a) Preparación de las Muestras (Líneas Tumorales Prostáticas)

\bullet: Lavar las pellas celulares 3 veces en PBS

\bullet: Resuspender a 1 x 10^{7} células/ml de tampón de lisis

\bullet: Pasar a través de 5 ciclos de lisis por congelación-descongelación rápida en nitrógeno líquido/baño de agua

\bullet: Centrifugar a 1500 rpm durante 5 minutos para eliminar los desechos celulares

\bullet: Ultracentrifugar a 20.000 rpm durante 30 minutos para eliminar los contaminantes de membrana

\bullet: Alicuotar a 200 \mul y almacenar a -80ºC.

b) Electroforesis en Gel

\bullet: Mezclar los lisados 1:1 con tampón de muestra de Laemmli y llevar a ebullición durante 5 minutos

\bullet: Cargar muestras de 20 \mug en los pocillos con un gradiente de gel del 4-20%

\bullet: Correr los geles en tampón de transferencia de Bjerrum y Schafer-Nielson (con SDS) a 200 V durante 35 minutos.

c) Transferencia Western

\bullet: Equilibrar los geles, las membranas de nitrocelulosa y el papel de filtro en tampón de transferencia durante 15 minutos

\bullet: Colocar el sándwich de gel-nitrocelulosa sobre el ánodo de una celda de transferencia electroforética semiseca: 2 láminas de papel de filtro, membrana de nitrocelulosa, gel, 2 láminas de papel de filtro

\bullet: Aplicar el cátodo y correr a 25 V durante 90 minutos.

d) Detección Inmunológica de Proteínas

\bullet: Bloquear las membranas de nitrocelulosa durante una noche a 4ºC con Marvel al 5% en PBS/Tween 20 0,05%

\bullet: Lavar las membranas dos veces en PBS/Tween 20 0,05%, lavar después durante 20 minutos y 2 x 5 minutos a temperatura ambiente sobre una plataforma de agitación

\bullet: Incubar las membranas en una dilución 1:20 de plasma del paciente clarificado durante 120 minutos a temperatura ambiente sobre una plataforma de agitación

\bullet: Lavar igual que anteriormente con un lavado final adicional de 5 minutos

\bullet: Incubar las membranas en una dilución 1:250 de anti-IgG o IgM humana con biotina durante 90 minutos a temperatura ambiente sobre una plataforma de agitación

\bullet: Incubar las membranas en una dilución 1:1000 de conjugado estreptavidina-peroxidasa de rábano picante durante 60 minutos a temperatura ambiente sobre una plataforma de agitación

\bullet: Lavar igual que anteriormente

\bullet: Incubar las membranas en el sustrato de peroxidasa diaminobenzidina durante 5 minutos para permitir la producción de color, parar la reacción mediante lavado de la membrana con agua.

Los resultados de la Figura 3 para los pacientes 112, 305 y 402 muestran claramente que la vacunación durante el periodo de 16 semanas (de cuatro a seis dosis) puede tener como resultado un incremento del título de anticuerpos contra lisados de las líneas celulares y también una reactividad cruzada contra lisados no recibidos en este régimen de vacunación (distintos de los del análisis de DTH).

(c) Determinación del Título de Anticuerpos

Los títulos de anticuerpos fueron determinados revistiendo placas de ELISA con lisados de líneas celulares estandarizados y realizando estudios de dilución en el suero de pacientes vacunados.

Método de ELISA con IgG anti-lisado

1.: Revestir las placas con 50 \mul/pocillo de los lisados (@ 10 \mug/ml) utilizando las diluciones siguientes:

Lisado	Concentración de Proteína	Concentración de Revestimiento	cantidad/ml	cantidad en 5 ml (\mul)
PNT2	2,5 mg/ml	10 \mug/ml	3,89 \mul	19,4 \mul
1542	4,8 mg/ml	10 \mug/ml	2,07 \mul	10,3 \mul
Du145	2,4 mg/ml	10 \mug/ml	4,17 \mul	20,8 \mul
LnCap	2,4 mg/ml	10 \mug/ml	4,12 \mul	20,6 \mul

2.: Cubrir e incubar durante una noche @ 4ºC.

3.: Lavar 2x en PBS-Tween. Golpear la placa sobre toallas de papel para secarla.

4.: Bloquear con PBS/FCS al 10% (100 \mul/pocillo).

5.: Cubrir e incubar @ temperatura ambiente (TA) durante 1 hora (mínimo).

6.: Lavar 2x con PBS-Tween.

7.: Añadir 100 \mul de PBS-FCS al 10% a las filas 2-8.

8.: Añadir 200 \mul de muestra de plasma (diluida 1 en 100 en PBS-FCS al 10%, esto es, 10 \mul de plasma añadidos a 990 \mul de PBS-FCS al 10%) a la fila 1 y realizar diluciones seriadas de 100 \mul hacia abajo de la placa según sigue. Desechar los 100 \mul extra del último pocillo. Cubrir e incubar en la nevera durante una noche.

9.: Diluir el anticuerpo biotinilado (Pharmingen; IgG 34162D), esto es, concentración final 1 mg/ml (esto es, 20 ml en 10 ml).

10.: Cubrir e incubar @ TA durante 45 minutos.

11.: Lavar 6x igual que anteriormente.

12.: Diluir la estreptavidina-HRP (Pharmingen, 13047E 0; diluir 1:1000 (esto es, 10 \mul \rightarrow 10 ml).

13.: Añadir 100 \mul/pocillo.

14.: Incubar 30 minutos @ TA.

15.: Lavar 8x.

16.: Añadir 100 \mul de sustrato/pocillo. Permitir la producción de color durante 10-80 minutos a TA.

17.: Parar la reacción de color mediante la adición de 100 \mul de H_{2}SO_{4} 1 M.

18.: Leer la DO @ A405 nm.

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Los resultados de la Figura 3 para los pacientes 112, 305 y 402 muestran los títulos de anticuerpos basales (0), a las 4 semanas, a las 8 semanas y a las 16 semanas. Los datos muestran que después de la vacunación con al menos cuatro dosis, los pacientes pueden mostrar un incremento del título de anticuerpos contra los lisados de las líneas celulares y también reactividad cruzada frente a líneas celulares no recibidas en este régimen de vacunación (excepto como dosis de DTH).

(d) Evaluación de los Niveles de PSA

Los niveles de PSA de los pacientes que recibieron la vacuna fueron registrados en el momento de su incorporación al ensayo y a lo largo del curso de la vacunación, utilizando kits clínicos empleados rutinariamente. Los valores de PSA de los pacientes 110, 303 y 404 están mostrados en la Figura 4 (el eje vertical es PSA sérico en ng/ml; el eje horizontal es tiempo, representando el primer punto de tiempo el inicio del programa de vacunación) y representan una disminución o una estabilización parcial de los valores de PSA, que en este grupo de pacientes continua normalmente aumentando, a menudo exponencialmente. El resultado del paciente 110 es un tanto desconcertante por el tratamiento con radioterapia para aliviar el dolor óseo, aunque el nivel de PSA había disminuido antes de la radioterapia.

Ejemplo 2 Utilización de un Melanocito Normal en un Modelo de Protección de Melanoma Murino

Se utilizó una línea celular de melanocitos normales en un modelo de protección mediante vacunación de melanoma murino utilizando como dosis de desafío las B16.F10. Los ratones C57 recibieron dos vacunaciones de PBS, 5 x 10^{6} células de melanoma alogénicas K1735 irradiadas o 5 x 10^{6} células melanocitos normales autólogos Melan P1 irradiados los días -14 y -7. El desafío el día 0 fue con 1 x 10^{4} células B16.F10 y se midió el volumen del tumor cada tres días desde el día 10 en adelante. Los animales fueron sacrificados cuando el tumor había crecido hasta 1,5 x 1,5 cm medidos a través de las dimensiones máximas del tumor. La Figura 5 muestra que la vacunación con células Melan P1 ofrece cierto nivel de protección frente a este tumor murino particularmente agresivo.

Claims

1. Un agente inmunoterapéutico alogénico para el tratamiento del cáncer de próstata en un paciente, que comprende tres líneas celulares prostáticas humanas procedentes de tres fuentes diferentes, de las cuales una, dos o tres líneas celulares derivan de tejido(s) normal(es), donde cada uno de dicho(s) tejido(s) normal(es) procede de una fuente que es próstata no cancerosa, y donde las líneas celulares procedentes de tres fuentes diferentes son genéticamente e inmunológicamente no coincidentes con el paciente.

2. Un agente inmunoterapéutico para el tratamiento del cáncer de próstata de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende tres líneas celulares prostáticas humanas de las cuales una línea celular deriva de tejido normal y las otras dos líneas celulares derivan de tejidos tumorales.

3. Un agente inmunoterapéutico para el tratamiento del cáncer de próstata de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende tres líneas celulares prostáticas humanas de las cuales dos líneas celulares derivan de tejido normal y la otra línea celular deriva de un tejido tumoral.

4. Un agente inmunoterapéutico de las reivindicaciones 1, 2 y 3, donde las líneas derivadas de tejido normal son elegidas de entre PNT1A (Nº de Ref. de la ECACC 95012614) o PNT2 (Nº de Ref. de la ECACC 95012613).

5. Un agente inmunoterapéutico de cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 y 3, donde la(s) línea(s) derivada(s) de tejido tumoral es(son) elegida(s) de entre NIH1532-CP2TX (ATCC CRL-12038), NIH1535-CP1TX (ATCC CRL-12041), NIH1542-CP3TX (ATCC CRL-12037), CA-HPV-10 (ATCC CRL-2220), LnCap (ATCC CRL-1740), DU145 (ATCC HTB-81) o PC3 (ATCC CRL-1435).

6. Un agente inmunoterapéutico para el tratamiento del cáncer de próstata que comprende tres líneas celulares, concretamente PNT2, NIH1542-CP3TX (ATCC CRL-12037) y DU145 (ATCC HTB-81).

7. Un agente inmunoterapéutico para el tratamiento del cáncer de próstata que comprende tres líneas celulares, concretamente PNT2, NIH1542-CP3TX (ATCC CRL-12037) y LnCap (ATCC CRL-1740).

8. Un agente inmunoterapéutico para el tratamiento del cáncer de próstata que comprende tres líneas celulares, concretamente PNT2, DU145 (ATCC HTB-81) y LnCap (ATCC CRL-1740).

9. Un agente inmunoterapéutico de las reivindicaciones 1-8, en el que las líneas de células tumorales han sido irradiadas a 50-300 Gy.

10. Un agente inmunoterapéutico de las reivindicaciones 1-8, en el que las líneas de células tumorales han sido irradiadas a 100-150 Gy.

11. Una composición inmunogénica alogénica que comprende un agente inmunoterapéutico de cualquiera de las reivindicaciones 1-10 combinado con un adyuvante de vacuna seleccionado de entre preparaciones micobacterianas tales como BCG o M. Vaccae, toxoide tetánico, toxoide diftérico, Bordetella pertussis, interleuquina 2, interleuquina 12, interleuquina 4, interleuquina 7, Adyuvante Completo de Freund, Adyuvante Incompleto de Freund u otros agentes adyuvantes no específicos.

12. Una composición inmunogénica que comprende un agente inmunoterapéutico de cualquiera de las reivindicaciones 1-10 combinado con un adyuvante de vacuna seleccionado de preparaciones micobacterianas tales como BCG o M. Vaccae.

13. Un agente inmunoterapéutico o una composición inmunoterapéutica de cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en los que las células son formuladas con una solución crioprotectora incluyendo, pero sin limitarse a, una solución acuosa de glicerol al 10-30% v/v, dimetil sulfóxido al 5-20% v/v o seroalbúmina humana al 5-20% p/v, ya sea como crioprotectores individuales o en combinación.

14. Un agente inmunoterapéutico o una composición inmunoterapéutica de las reivindicaciones 1-12 en los que las células están formuladas con una solución crioprotectora que incluye dimetil sulfóxido al 5-20% v/v y seroalbúmina humana al 5-20% p/v en combinación.

15. Un agente inmunoterapéutico o una composición inmunoterapéutica de las reivindicaciones 1-14 que induce una respuesta inmune en pacientes caracterizada por la activación de células T inmunes.

16. Un agente inmunoterapéutico o una composición inmunoterapéutica de las reivindicaciones 1-14 que induce una respuesta inmune en pacientes caracterizada por la inducción de la producción de anticuerpos.

17. Un agente inmunoterapéutico o una composición inmunoterapéutica de las reivindicaciones 1-14 que induce una disminución de la tasa de incremento o un descenso del nivel de PSA sérico en pacientes con cáncer de próstata.

18. Un agente inmunoterapéutico o una composición inmunoterapéutica de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 17 que se administra intradérmicamente.

19. Un agente inmunoterapéutico o una composición inmunoterapéutica de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 17 que se administra intraprostáticamente.

20. Una composición de vacuna inmunoterapéutica alogénica para el tratamiento del cáncer de próstata, que comprende o que consta de un agente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes junto con un excipiente, adyuvante o vehículo fisiológicamente aceptable.

21. Utilización de un agente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento alogénico del cáncer de próstata humano.