KR20010082545A - 여성 성기능장애 치료용 화합물 - Google Patents

여성 성기능장애 치료용 화합물 Download PDF

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그레이엄 나이젤 모
크리스토퍼 피터 웨이맨
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디. 제이. 우드, 스피겔 알렌 제이
화이자 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 여성 성기능장애 (FSD), 특히 여성 성적 흥분장애 (FSAD)를 앓고 있는 여성의 치료 방법에 관한 것이다. 그 방법은 여성의 성기에서 cAMP를 상승작용시킬 수 있고, 여성의 성기에서 cAMP의 상승작용을 일으키는 양인 약제를 여성에게 전달시키는 것을 포함한다. 그 약제는 제약학상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 혼합될 수 있다.

Description

여성 성기능장애 치료용 화합물{Compounds for the Treatment of Female Sexual Dysfunction}
본 발명은 여성 성기능장애 (FSD), 특히 여성 성적 흥분장애 (FSAD)의 치료에 유용한 약제에 관한 것이다.
본 발명은 또한 FSD, 특히 FSAD의 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 FSD, 특히 FSAD의 치료에 유용한 화합물을 선별하기 위한 분석방법에 관한 것이다.
편의상, 하기 내용 중에 사용된 약어들의 목록을 청구범위 부분 앞에 제공한다.
여성 성적 반응
여성 성적 반응의 흥분 시기는 질 및 음핵 뿐만 아니라 다른 성기관에서 생리학적 변화가 일어날 때까지 욕구의 시기와 용이하게 구별되지 않는다. 성적 흥분 및 쾌감은 음핵, 음순 및 질벽의 충혈, 증가된 질 윤활 및 질 관강의 확장을 초래하는 혈관 및 신경근육 사건들의 조합에 의해 수반된다 [Levin, 1980; Ottesen, 1983; Levin, 1991; Levin, 1992; Sjoberg, 1992; Wagner, 1992; Schiaviet al., 1995; Masterset al., 1996; Bermanet al., 1999].
질 충혈은 누출이 일어날 수 있도록 하고, 이 과정은 증가된 질 윤활의 원인이 된다. 누출은 상피를 통하여, 그리고 질 표면 상으로 혈장의 흐름을 가능하게 하는데 이것에 대한 구동력은 흥분 상태 동안 질 모세혈관상의 증가된 혈류량이다. 또한, 충혈은 질 길이 및 관강 직경, 특히 질관의 말단 2/3 지점의 관강 직경의 증가를 초래한다. 질의 관강 확장은 질벽의 평활근 이완과 골반저근의 골격근 이완의 조합에 기인한다. 일부 성교동통장애, 예를 들면 질경련은, 적어도 부분적으로는 질의 확장을 방해하는 부적절한 이완에 기인하는 것으로 생각되고; 이것이 주로 평활근 문제인지 골격근 문제인지는 확인되야 한다 [Levin, 1980; Ottesen, 1983; Levin, 1991; Levin, 1992; Sjoberg, 1992; Wagner, 1992; Schiaviet al., 1995; Masterset al., 1996; Bermanet al., 1999].
질의 혈관계 및 미세 혈관계는 뉴로펩티드 및 다른 신경전달물질 후보물질을 함유하는 신경에 의해 자극받아 활동한다. 이들로는 칼시토닌 유전자-관련 펩티드(CGRP), 뉴로펩티드 Y (NPY), 산화질소 신타제 (NOS), 물질 P 및 혈관활성 장 펩티드 (VIP)가 있다 [Hoyle et al., 1996]. 음핵에 존재하는 펩티드는 하기에서 논의된다. 종종 VIP와 같은 장소에 위치하는 산화질소 신타제는 고유층의 혈관에서보다 오히려 심부 동맥 및 정맥에서 면역학적으로 보다 높은 발현을 나타낸다 [Hoyle et al., 1996].
여성 성기능장애
몇몇 개인들은 여성 성기능장애 (FSD)를 앓을 수 있다는 것이 공지되어 있다.
FSD는 여성이 성 표현에 있어서 만족을 찾을 수 없거나 찾기 어려운 것으로 가장 잘 정의된다. FSD는 몇 가지 다양한 여성 성장애에 대한 포괄적인 용어이다 [Leiblum, 1998, Bermanet al., 1999]. 여성은 성욕감퇴, 흥분 또는 오르가즘에 도달하기 어려움, 성교시의 통증 또는 이들 문제점들의 조합을 가질 수 있다. 몇 가지 타입의 질환, 의약, 상해 또는 심리학적 문제가 FSD를 야기시킬 수 있다.
부부간의 성기능장애를 조사한 연구는 여성 중 최대 76%가 성기능장애의 고충을 가지고 있고, 미국에서 여성의 30-50%가 FSD를 경험함을 보여준다.
FSD의 아형으로는 저활성 성욕장애, 여성 성적 흥분장애, 오르가즘장애 및 성욕장애가 있다.
개발 중인 치료는 FSD의 특정 아형, 주로 성욕 및 흥분장애를 치료하는 것을 목적으로 한다.
FSD의 범주는 이들을 정상적인 여성 성적 반응 시기: 욕구, 흥분 및 오르가즘과 대조함으로써 가장 잘 정의된다 [Leiblum 1988]. 욕구 또는 성적충동은 성 표현에 대한 본능적 욕구이고, 종종 관심이 있는 파트너와 동행시, 또는 다른 색정적인 자극에 노출되었을 때의 성적 생각 등으로 드러난다. 대조적으로, 성적 흥분은 성적 자극에 대한 혈관 반응으로, 그의 중요한 성분은 질 윤활 및 질의 신장이다. 따라서, 성욕과는 대조적으로 성적 흥분은 성기 (예를 들면 질 및 음핵) 혈류량과 관련되고 반드시 민감하지는 않은 반응이다. 오르가즘은 흥분 동안에 절정에 달한 성적 긴장의 해방이다. 따라서, FSD는 대표적으로는 여성이 이들 시기들 중의 어느 한 시기, 일반적으로 욕구, 흥분 또는 오르가즘 시기에 부적절하거나 만족스럽지 못한 반응을 가질 때 발생된다. FSD 범주에는 저활성 성욕장애, 성적 흥분장애, 오르가즘장애 및 성교동통장애가 포함된다.
여성이 전혀 또는 거의 성적 욕구가 없을 경우, 및 거의 또는 전혀 성적 생각 또는 환상을 갖지 않을 경우 저활성 성욕장애가 존재한다. 이러한 타입의 FSD는 자연적인 폐경기 또는 수술에 의한 폐경에 기인하는, 낮은 테스토스테론 농도에 의해 야기될 수 있다. 다른 원인으로는 질병, 의약, 피로, 우울증 및 불안증을 들 수 있다.
여성 성적 흥분장애 (FSAD)는 성적 자극에 대한 부적절한 성기 반응에 의해 특성화된다. 성기 (예를 들면, 질 및(또는) 음핵)가 정상적인 성적 흥분의 특색을 이루는 충혈을 일으키지 않는다. 질벽은 거의 윤활해지지 않고, 따라서 성교가 고통스럽다. 오르가즘이 방해받을 수 있다. 흥분장애는 폐경기, 또는 출산 후 및 수유 동안 감소된 에스트로겐에 의해서, 뿐만 아니라 당뇨병 및 아테롬성동맥경화증과 같은 혈관 성분과 관계있는 만성 질병에 의해 야기될 수 있다. 다른 원인은 이뇨제, 항히스타민제, 항우울증제, 예를 들면 SSRI 또는 항고혈압제를 이용한 치료로부터 야기된다. FSAD는 하기에서 보다 상세하게 논의된다.
성교동통장애 (성교불쾌증 및 질경련을 포함)는 삽입으로부터 발생되는 통증에 의해 특성화되고, 윤활을 감소시키는 의약, 자궁내막증, 골반 염증성 질환, 염증성 장질환 또는 요도의 문제에 의해 야기될 수 있다.
FSD의 이환률은, 그 용어가 몇 가지 타입의 문제를 포함하고, 이들 중 몇몇은 측정하기 어렵고, 및 FSD를 치료하는 데 대한 관심은 비교적 최근의 일이기 때문에 평가하기 어렵다. 많은 여성들의 성 문제는 여성 노화 과정과 직접적으로, 또는 당뇨병 및 고혈압과 같은 만성 질병과 관련되어 있다.
부분적으로는 상이한 평가 기준의 사용 때문이라고 하지만 이제까지 보고된 FSD의 발병 및 이환률에는 변동이 크다. 그러나, 대부분의 조사자들은, 다른 면에서 건강한 여성의 상당한 비율이 1개 이상의 FSD 서브그룹의 증상을 갖는 것으로 보고하고 있다. 예로서, 부부의 성기능장애를 비교한 연구는, 여성의 63%가 흥분 또는 오르가즘 기능장애를 가진 것에 비하여 남성의 40%가 발기 또는 사정 기능장애를 갖는 것으로 나타났다 [Franket al., 1978].
그러나, 여성 성적 흥분장애의 이환률은 조사에 따라 상당히 차이가 난다. 최근의 미국 국민 건강 및 사회 생활 조사 (National Health and Social Life Survey)에서는, 여성의 19%가 윤활 곤란이 있는 것으로 보고된 반면, 부인과 클리닉 외래 환자의 경우에는 여성의 14%가 유사한 윤활 곤란이 있는 것으로 보고되었다 [Rosenet al., 1993].
또한, 몇몇 연구는 또한 당뇨병 여성의 성적 흥분 기능장애를 보고하였는데 (최대 47%), 여기에는 감소된 질 윤활이 포함된다 [Winczeet al., 1993]. 신경병증증과 성기능장애 사이에는 연관성이 없었다.
수많은 연구들이 전체적으로 11 내지 48% 사이의 여성들이 연령에 따라 감소된 성욕을 가질 수 있음을 보여주기도 하였다. 유사하게, 11 내지 50% 사이의 여성이 흥분 및 윤활에 문제가 있고, 그러므로 성교시 통증을 경험하는 것으로 보고하고 있다. 질경련은 훨씬 덜 흔한 것으로 대략 1% 정도의 여성에 영향을 준다.
성경험을 한 여성에 대한 연구는 5-10%가 1차 성감이상증을 갖는 것으로 상세하게 설명한 바 있다. 다른 10%는 드문 오르가즘을 갖고, 추가 10%는 일관성 없이 오르가즘을 경험한다 [Spectoret al., 1990].
FSD는 성적 반응 주기의 별개의 시기에 증상을 나타내는 몇 가지 아형으로 이루어지기 때문에, 한 가지 치료법이 없다. 현재, FSD의 치료는 주로 심리학적 또는 관계 문제에 중점을 둔다. 이 의학적 문제의 연구에 대해 보다 많은 임상학적 및 기초 과학 연구가 이루어짐에 따라, FSD의 치료는 점진적으로 서서히 발전되고 있다. 여성의 성적 불만은 병리생리학상 관점으로 모두 심리학적인 것은 아니고, 특히 전반적인 여성 성 불만에 기여하는 맥관형 성기능장애 (예를 들면 FSAD) 요소를 가질 수 있는 개인의 경우에는 심리학적인 것이 아니다. FSD의 치료용으로 허가된 약물은 현재 없다. 실험 약물 요법은 에스트로겐 투여 (국소적으로 또는 호르몬 대체 요법으로), 안드로겐 또는 기분 전환 약물, 예를 들면 부스피론 또는트라조돈을 포함한다. 이들 선택할 수 있는 치료 방법은 낮은 효능 또는 허용될 수 없는 부작용 때문에 주로 만족스럽지 못하다.
FSD를 약물학적으로 치료하는 데 비교적 최근에 관심이 생겼기 때문에, 치료는 하기로 이루어진다: 심리학적 상담, 의사의 처방없이 팔리는 성생활용 윤활제, 및 다른 질환에 대하여 승인된 약물을 포함하는 연구조사 후보물질. 이들 의약은 테스토스테론이거나 에스트로겐과 테스토스테론의 병용인 호르몬제 및 보다 최근에는 남성 발기 기능장애에 효과적인 것으로 입증된 혈관 약물로 이루어진다. 이들 약제들 중의 어느 것도 FSD를 치료하는 데 매우 효과적인 것으로 입증되지는 못하였다.
여성 성적 흥분장애 (FSAD)
성적 흥분 반응은 골반에서의 혈관충혈, 질 윤활 및 팽창 및 외부 성기의 팽윤으로 이루어진다. 장애는 두드러진 고민 및(또는) 대인관계의 어려움을 야기시킨다. 부부의 성기능장애를 조사한 연구는, 여성 성적 흥분장애 (FSAD)로도 알려져 있는 성적 흥분 기능장애를 앓는 여성이 많이 있는 것으로 나타났다.
미국 정신과 협회 (American Psychiatric Association)의 진단 및 통계 매뉴얼 (DSM) IV은 여성 성적 흥분장애 (FSAD)를 다음과 같이 정의하고 있다:
"성 행위가 완료될 때까지 성적 흥분에 따른 적절한 윤활-팽윤 반응을 얻거나 유지하는 것의 계속적인 또는 재발성 불능장애가 두드러진 고민 또는 대인관계의 어려움을 야기시킴."
FSAD는 폐경 전, 당시 및 후의 (±HRT) 여성에 발병하는 매우 두드러진 성장애이다. 이것은 우울증, 심혈관계 질환, 당뇨병 및 UG 질병과 같은 부수적 질환과 관계있다.
FSAD의 1차적인 결과는 충혈/팽윤의 부족, 윤활의 부족 및 만족스러운 성기 흥분의 부족이다. FSAD의 2차적인 결과는 감소된 성욕, 성교 동안의 통증 및 오르가즘에 도달하기 어려움이다.
적어도 FSAD 증상을 갖는 환자의 일부분의 경우에는 혈관적인 원인이 있는 것으로 [Goldsteinet al., 1998], 이러한 관점을 지지하는 동물 데이타를 들어 최근에 가정된 바다 [Parket al., 1997].
효능에 대하여 연구중에 있는 FSAD 치료용 약물 후보물질은 주로 남성 성기로의 순환을 촉진시키는 발기 기능장애 치료제이다. 이들은 2가지 타입의 제제, 즉 경구 또는 설하 의약 (아포모르핀, 펜톨아민, 실데나필) 및 남성에서는 경요도로 주사되거나, 그리고 여성에서는 성기에 국소적으로 투여되는 프로스타글란딘 (PGE1-알프로스타딜)으로 이루어진다.
본 발명은 FSD, 특히 FSAD의 치료에 효과적인 방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 FSAD가 감소된 성기 혈류량, 특히 질 및(또는) 음핵에서의 감소된 혈류량과 연관되어 있다는 발견에 기초한다. 따라서, FSAD가 있는 여성의 치료는 혈관활성제를 사용한 성기 혈류량의 증가에 의해 달성될 수 있다. 본 연구에서, 본 발명자들은 cAMP가 질 및 음핵 혈관이완을 매개하고, 성기 (예를 들면, 질 및음핵) 혈류량이 cAMP 농도의 상승에 의해 향상되고/상승작용할 수 있음을 밝혀내었다. 이것은 생산적인 발견이다.
이와 관련하여, 누구도 이전에 FSAD가 이러한 방식으로, 즉 직접적인 또는 간접적인 cAMP 농도의 상승으로 치료될 수 있음을 제시하지 못하였다. 게다가, 당업계의 어떤 문헌도 FSAD가 cAMP 활성 및(또는) 농도의 불리한 변조와 관련되어 있거나 cAMP가 질 및 음핵 혈관이완을 매개하는 것에 대하여 제시하지 못하였다. 따라서, 본 발명은 더욱 더 놀라운 것이다.
또한, 본 발명자들은 본 발명의 약제를 사용함으로써 성기 충혈을 증가시키고, FSAD를 치료 (예를 들면 질의 증가된 윤활 및 질 및 음핵의 증가된 감도)할 수 있음을 발견하였다.
따라서, 개괄적으로, 본 발명은 FSD, 특히 FSAD를 치료하기 위한 cAMP 상승작용제의 사용에 관한 것이다.
본 발명은 정상적인 성적 흥분 반응, 즉 질, 음핵 및 음순 충혈을 야기시키는 증가된 성기 혈류량을 회복시키기 위한 방법을 제공하기 때문에 유리하다. 이것은 혈장 누출, 증가된 질 탄력 및 증가된 성기 (예를 들어, 질 및 음핵) 감도를 통해 질 윤활의 증가를 초래하게 된다. 따라서, 본 발명은 정상적인 성적 흥분 반응을 회복시키거나 가능하게 하기 위한 방법은 제공한다.
도 1은 골반 신경 자극과 혈류량 사이의 성기 혈류량-빈도수 반응 관계를 나타내는 그래프이다.
도 2는 VIP (a) 및 VIP의 반복 관주 (2b)의 질 혈류량에 대한 효과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 마취된 토끼에서 VIP, NEP 억제제, PDEcAMP억제제 또는 골반 신경 자극의 평균 동맥 혈압에 대한 효과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 마취된 토끼에서 포르스콜린 (cAMP 유사물)이 질 혈류량을 증가시키고 분리된 토끼 질에 대한 이완효과가 있음을 나타내는 그래프이다.
도 5는 마취된 토끼에서 VIP 및 포르스콜린 (cAMP 유사물)이 음액 혈류량을 증가시킴을 나타내는 그래프이다.
도 6은 마취된 토끼에서 골반 신경 자극에 의한 음핵 혈류량의 변화에 대한 NEP 억제제의 효과를 나타내는 그래프이다.
도 7은 NEP 억제제의 존재 및 부재 하에 VIP(6 ㎍/kg) 및 VIP(60 ㎍/kg)의 질 혈류량에 대한 효과를 나타내는 그래프이다.
도 8은 골반 신경 자극에 의한 질 혈류량의 증가에 대한 PDEcAMP타입2 억제제의 효과를 나타내는 그래프이다.
도 9는 VIP에 의해 유도된 질 혈류량의 증가에 대한 PDEcAMP타입2 억제제의 효과를 나타내는 그래프이다.
도 10은 마취된 토끼에서 골반 신경 자극에 의한 질 혈류량의 증가에 대한 NPY Y1 길항제의 효과를 나타내는 그래프이다.
도 11은 향상된 cAMP 신호화가 토끼에서 신경에 의해 매개된 질 혈류량의 증가를 상승시킴을 나타내는 그래프이다.
도 12는 골반 신경 자극에 의한 음핵 혈류량의 증가에 대한 NEPi의 효과를 나타내는 그래프이다.
한 면에서, 본 발명은 FSD, 특히 FSAD를 앓는 여성의 성기에서 cAMP를 상승작용시킬 수 있고 제약학상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 임의로 혼합되는약제를 포함하는, FSD, 특히 FSAD의 치료에 사용하기 위한 (또는 사용시의) 제약 조성물에 관한 것이다. 여기서, 조성물 (본 명세서에서 언급된 다른 임의의 조성물과 마찬가지로)은 나중에 FSD, 특히 FSAD의 치료에 사용되도록 포장될 수 있다.
다른 면에서, 본 발명은 FSD, 특히 FSAD의 치료용 의약의 제조에 사용되는, FSD, 특히 FSAD를 앓는 여성의 성기에서 cAMP를 상승작용시킬 수 있는 약제의 용도에 관한 것이다.
추가의 면에서, 본 발명은 여성의 성기에서 cAMP를 상승작용시킬 수 있고 여성의 성기에서 cAMP의 상승작용을 야기시킬 수 있는 양으로 사용되며, 임의로 제약학상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 혼합되는 약제를 여성에게 전달시키는 단계를 포함하는, FSD, 특히 FSAD를 앓는 여성의 치료 방법에 관한 것이다.
또 다른 면에서, 본 발명은 약제가 cAMP를 직접적으로 또는 간접적으로 상승작용시킬 수 있는지를 확인하는 단계를 포함하는 (여기서, 상기 약제 존재 하에 cAMP의 상승작용은 약제가 FSD, 특히 FSAD의 치료에 유용할 수 있음을 나타냄) FSD, 특히 FSAD의 치료에 사용될 수 있는 약제를 확인하기 위한 분석 방법에 관한 것이다.
예로서, 본 발명은 약제를 cAMP 활성 및(또는) 농도에 영향을 미칠 수 있는 성분과 접촉시키고, cAMP의 활성 및(또는) 농도를 측정하는 단계를 포함하는 (여기서, 상기 약제 존재 하에 cAMP의 상승작용은 약제가 FSD, 특히 FSAD의 치료에 유용할 수 있음을 나타냄) FSD, 특히 FSAD를 치료하기 위하여 cAMP를 직접적으로 또는 간접적으로 상승작용시킬 수 있는 약제를 확인하기 위한 분석 방법에 관한 것이다.
추가의 예로서, 본 발명은 약제를 cAMP와 접촉시키고, cAMP의 활성을 측정하는 단계를 포함하는 (여기서, 상기 약제 존재 하에 cAMP의 상승작용은 약제가 FSD, 특히 FSAD의 치료에 유용할 수 있음을 나타냄) FSD, 특히 FSAD를 치료하기 위하여 cAMP를 직접적으로 또는 간접적으로 상승작용시킬 수 있는 약제를 확인하기 위한 분석 방법에 관한 것이다.
추가의 면에서, 본 발명은 (a) 본 발명에 따른 분석을 수행하는 단계; (b) cAMP 활성을 직접적으로 또는 간접적으로 상승작용시킬 수 있는 1종 이상의 약제를 확인하는 단계; 및 (c) 1종 이상의 확인된 약제 일정량을 제조하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
이와 관련하여, (b) 단계에서 확인된 약제는 예를 들면 활성을 최대화시키도록 개질될 수 있으며, 이어서 단계 (a)가 반복될 수 있다. 이들 단계는 소정의 활성 또는 약물동력학적 프로필이 달성될 때까지 반복될 수 있다.
따라서, 추가의 면에서, 본 발명은 (a1) 본 발명에 따른 분석을 수행하는 단계; (b1) cAMP 활성을 직접적으로 또는 간접적으로 상승작용시킬 수 있는 1종 이상의 약제를 확인하는 단계; (b2) 상기 확인된 1종 이상의 약제를 개질시키는 단계; (a2) 임의로 (a1) 단계를 반복하는 단계; 및 (c) 1종 이상의 확인된 약제 (즉 개질된 약제) 일정량을 제조하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
추가의 면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 분석 방법인 시험관내 분석 방법에서 cAMP를 직접적으로 또는 간접적으로 상승작용시킬 수 있는 약제를 사용하여 cAMP를 생체내 상승작용시킴으로써 FSD, 특히 FSAD를 치료하는 방법에 관한 것이다.
추가의 면에서, 본 발명은 FSD, 특히 FSAD 치료용 제약 조성물의 제조에 사용되는 약제의 용도에 관한 것이다. 상기 약제는 본 발명의 방법에 따른 분석 방법인 시험관내 평가 분석방법에서 cAMP를 직접적으로 또는 간접적으로 상승작용시킬 수 있다.
추가의 면에서, 본 발명은 동물의 골반 신경 자극에 따른 상기 동물의 질 및(또는) 음핵 혈류량의 변화를 측정할 수 있는 수단을 포함하여, 마취시킨 암컷 동물을 포함하는, FSD (특히 FSAD)를 치료할 수 있는 약제를 확인하는 데 사용된 동물 모델에 관한 것이다.
추가의 면에서, 본 발명은 약제를 본 발명의 동물 모델에 투여하는 단계; 및 상기 동물의 질 및(또는) 음핵에서 혈류량의 증가 및(또는) cAMP의 임의의 상승작용을 측정하는 단계를 포함하는, FSAD를 치료하기 위하여 cAMP를 직접적으로 또는 간접적으로 상승작용시킬 수 있는 약제를 확인하기 위한 분석 방법에 관한 것이다.
보다 용이하게 참조할 수 있도록, 본 발명의 이들 및 추가의 면들은 이제 적절한 단락 제목 하에서 논의하고자 한다. 그러나, 각 단락 하의 내용이 반드시 이들 각각의 구체적인 단락으로 제한하는 것은 아니다.
바람직한 면
바람직하게는 약제는 FSAD를 치료하기 위한 것이다.
바람직하게는, 약제는 여성 성기 (예를 들면 질 또는 음핵) 혈관이완의 매개인자이다.
한 실시형태에서는, 바람직하게는 약제는 경구 투여용이다.
다른 실시형태에서는, 약제는 국소 투여용일 수 있다.
몇몇 경우, 바람직하게는 약제는 cAMP에 대한 간접적인 상승작용 효과를 나타낸다. 이러한 약제의 예로는, I:NEP 및(또는) I:NPY가 있다. 달리 표현하면, 몇몇 경우, 바람직하게는 약제는 cAMP에 대한 직접적인 상승작용 효과를 나타낸다. 약제는 자연적으로 발견되고 자연적으로 위치하는, 직접적으로 작용하는 약제, 예를 들면 자연적으로 발견되고 위치하는 VIP에 대하여 작용함으로써 cAMP에 대한 간접적인 상승작용 효과를 나타낼 수 있는 것으로 이해될 수 있다.
몇몇 경우, 바람직하게는 약제는 cAMP에 대한 직접적인 상승작용효과를 나타낸다. 이러한 약제의 예로는 I:PDE가 있다.
일부 경우, 본 발명의 약제는 다른 제약학상 활성 성분과 함께 투여될 수 있다. 여기서, 공동투여는 동일 경로에 의한 필요도 물론 없거니와 동일한 시간에 행해져야 할 필요는 없다. 공동투여 조성물의 한 예는 본 발명에 따른 약제 및 추가의 약제를 포함하는 조성물일 수 있으며, 이 때 추가 약제는 cAMP에 대한 직접적인 상승작용 효과를 가질 수 있다. 혼합 예는 아래에서 논의된다.
일부 경우, 바람직하게는 약제는 억제제이다. 즉 억제 기능을 나타낼 수 있다.
몇몇 경우, 바람직하게는 약제는 I:PDE (때로는 PDEi로 기록됨)이다.
일부 경우, 바람직하게는 약제는 I:PDE1 또는 I:PDE2 (종종 I:PDEII 또는 PDEIIi 또는 PDE2I 또는 I:PDE 타입2 또는 PDE 타입2i) 또는 I:PDE3 또는 I:PDE4또는 I:PDE7 또는 I:PDE8이고, 보다 바람직하게는 약제는 I:PDE2이다.
몇몇 경우, 바람직하게는 약제는 I:NEP (때로는 NEPi로 기록됨)이다.
몇몇 경우, 바람직하게는 약제는 I:NPY (때로는 NPYi로 기록됨)이다.
몇몇 경우, 바람직하게는 약제는 I:NPY Y1 또는 I:NPY Y2 또는 I:NPY Y5 (때로는 NPY YnI 또는 NPY Yni (여기서, n은 수용체 아형임)로 기록됨)이고, 보다 바람직하게는 약제는 I:NPY Y1이다.
몇몇 경우, 바람직하게는 약제는 선택적 I:PDEII이다.
몇몇 경우, 바람직하게는 약제는 선택적 I:NEP이다.
몇몇 경우, 바람직하게는 약제는 선택적 I:NPY이다.
바람직하게는, 상기 약제는 I:PDE 2 (I:PDE II), I:NEP (이 때 NEP는 EC 3.4.24.11임), I:NPY Y1 중의 1종 이상으로부터 선택된다.
보다 바람직하게는, 상기 약제는 선택적 I:PDE 2 (I:PDE II), 선택적 I:NEP (이 때 NEP는 EC 3.4.24.11임), 선택적 I:NPY Y1 중의 1종 이상으로부터 선택된다.
몇몇 경우, 바람직하게는 약제는 지속적인 혈압 강하 (예를 들면, 약 5분 이상의 기간에 걸친)를 야기시키지 않거나, 또는 지속적인 혈압 강하를 야기시키지 않는 방식으로 투여된다. 이 실시형태에서는, 약제가 국소적으로 투여된다면, 약제는 혈압 강하를 야기시킬 수 있는 능력을 가질 수 있으며 (예를 들면 정맥내로 투여되는 경우), 단 국소 투여에서는 최소량의 약제가 혈류 내로 들어가도록 하다. 경구 약제의 경우, 약제가 지속적인 혈압 강하를 야기시키지 않는 것이 바람직하다.
바람직한 면에서, 약제는 심박동수에 큰 변화를 야기시키지 않거나, 심박동수에 큰 변화를 야기시키지 않는 방식으로 투여된다.
치료
본 명세서에서 치료에 대한 모든 언급은 치유성, 경감성 및 예방적 치료를 포함하는 것으로 인식해야 한다. 바람직하게는, 용어 치료는 적어도 치유성 치료및(또는) 경감성 치료를 포함한다.
여성 성기
용어 "여성 성기"는 문헌 [Gray's Anatomy, C.D. Clemente, 13th American Edition]에 제공된 정의에 따라 사용되며, 다음과 같다:
"생식 기관은 내부 및 외부 군으로 이루어진다. 내부 기관은 골반 내에 위치하며, 난소, 난관, 자궁 및 질로 이루어진다. 외부 기관은 비뇨 생식기 격막의 표면 및 골반궁 아래에 있다. 이들은 음부, 대음순 및 소음순, 음핵, 전정, 전정구 및 대전정선을 포함한다."
내인성 cAMP
매우 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 약제는 내인성 cAMP를 상승작용, 예를 들면 내인성 cAMP 농도를 상승작용시킨다.
여기서, 용어 "내인성 cAMP"는 성적 자극 (성적 흥분)으로부터 발생되는 cAMP를 의미한다. 따라서, 용어는 성충동과는 무관하게 상승되게 되는 cAMP 농도는 포함하지 않는다.
따라서, 본 발명에 따르면, FSAD의 치료는 내인성 cAMP 신호 전달을 직접적으로나 간접적으로 상승작용시킴으로써 달성되는데, 이것은 다시 질 혈류량/윤활 및(또는) 음핵 혈류량을 증가시키고, 그럼으로써 자연적인 성적 흥분 반응을 증강시킨다. 따라서, 본 발명의 치료 방법은 정상적인 흥분 반응을 회복시키거나 상승작용시킨다. 본 발명의 치료 방법에서, 이러한 결과는 NEP (EC 3.4.24.11)의 억제제 또는 cAMP를 가수분해하는 PDE 억제제 또는 NPY 수용체 길항제의 사용에 의해 달성될 수 있다.
본 발명의 약제가 I:PDE인 경우, 상기 PDE는 cAMP를 가수분해하는 PDE (및 경우에 따라서는 cGMP를 가수분해)이다. 용어 "cAMP를 가수분해시킨다"는 또한 cAMP를 대사 및(또는) 분해시키는 것을 포함한다. 용어 "cAMP (및 임의로는 cGMP)를 가수분해시킨다"는 본 발명의 약제가 cAMP 외에 cGMP를 가수분해시킬 수 있을 수도 있음을 의미한다. 여기서, 용어 "cGMP를 가수분해시킨다"는 또한 cGMP를 대사 및(또는) 분해시키는 것을 포함한다. 그러나, 본 발명의 몇몇 실시형태의 경우, 본 발명의 약제가 반드시 cGMP를 가수분해시킬 수 있어야 할 필요는 없다는 것으로 이해되야 한다.
동물 시험 모델이 본 명세서에서 제공된다. 이 동물 시험 모델을 사용하여 cAMP 상승작용의 결과인 성기 혈류량의 증가를 측정할 수 있다. 이 동물 모델에서는, 골반 신경을 자극시키는데, 이것은 성적 흥분/반응의 생리학을 흉내내는 효과를 가져온다. 이들 실험에서, 신경이 자극받은 후에, 본 발명의 따른 약제는 대조군에서 보이는 증가 이상의 혈류량 증가를 초래한다. 자극이 없을 때, 약제는 혈류량의 증가를 초래하는 데 전혀 효과를 나타내지 못한다 (또는 무시할 만한 효과를 나타낸다). 전형적으로는, 이들 실험에서, 혈류량의 기준선 증가를 얻기 위하여 신경을 자극시킨다. 그 다음으로, 후보 (또는 실제) 약제를 전신으로 또는 국소적으로, 예를 들면 정맥내, 국소 또는 경구 경로에 의해 동물에 전달한다. 그 후, 대조군에서 보이는 증가와 비교하였을 때 혈류량이 증가하는 것은 시험물질이 본 발명에 따른 약제임을 제시하는 것이다.
성적 자극
본 발명은 또한 성적 자극 전과(또는) 성적 자극 동안 본 발명의 약제를 투여하는 것을 포함한다. 여기서 용어 "성적 자극"이란 용어 "성적 흥분"과 같은 뜻일 수 있다. 본 발명의 이러한 면은 전신 선택성을 제공하기 때문에 유리하다. 자연적인 캐스케이드는 단지 성기에서만 일어나고 다른 위치, 예를 들면 심장 등에서는 일어나지 않는다. 따라서, 성기에 대한 선택적 효과를 달성할 수 있다.
그러므로, 본 발명의 일부 면들의 경우, 성적 자극 단계가 있는 것이 매우 바람직하다. 본 발명자들은 이 단계가 전신 선택성을 제공할 수 있음을 발견하였다. 여기서, "성적 자극"은 시각적 자극, 육체적 자극, 청각적 자극 또는 상상적 자극 중의 하나 이상일 수 있다.
따라서, 바람직하게는 본 발명의 약제는, 특히 이들 약제가 경구 투여용일 경우에 성적 자극 전 또는 성적 자극 중에 전달된다.
그러므로, 이러한 바람직한 면의 경우, 본 발명은 FSAD의 치료용 의약의 제조에 사용되는 약제의 용도를 제공하는데, 이 때 약제는 FSAD를 앓는 여성의 성기에서 cAMP를 상승작용시킬 수 있으며, 상기 여성은 상기 의약을 투여하기 전 또는 투여하는 동안에 성적으로 자극받는다.
바람직하게는, 본 발명은 FSAD의 치료용 의약의 제조에 사용되는 약제의 용도를 제공하는데, 이 때 약제는 FSAD를 앓는 여성의 성기에서 cAMP를 상승작용시킬 수 있으며, 상기 여성은 상기 의약을 투여하기 전 또는 투여하는 동안에 성적으로 자극받고, 상기 의약은 상기 여성에게 경구로 전달된다.
또한, 이 바람직한 면의 경우, 본 발명은 FSAD를 앓는 여성의 치료 방법을 제공하는데, 이 때 이 방법은 성기에서 cAMP를 상승작용시킬 수 있는 약제를 여성에게 전달시키는 단계를 포함하며, 이 약제는 여성의 성기에서 cAMP의 상승작용을 야기시킬 수 있을 정도로 사용되며 제약학상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 임의로 혼합되고, 상기 여성은 상기 약제를 투여하기 전 또는 투여하는 동안에 성적으로 자극받는다.
바람직하게는, 본 발명은 FSAD를 앓는 여성의 치료 방법을 제공하는데, 이 때 이 방법은 성기에서 cAMP를 상승작용시킬 수 있는 약제를 여성에게 전달시키는 단계를 포함하며, 이 약제는 여성의 성기에서 cAMP의 상승작용을 야기시킬 수 있을 정도로 사용되며 제약학상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 임의로 혼합되고, 상기 여성은 상기 약제를 투여하기 전 또는 투여하는 동안에 성적으로 자극받고, 상기 약제는 경구로 상기 여성에게 전달된다.
cAMP의 상승작용
본 명세서에서 cAMP를 언급할 때 사용되는 용어 "상승작용시킨다"는 cAMP의효능을 증가시키고, cAMP의 농도를 증가시키고, cAMP의 활성을 증가시키고, cAMP 분해도를 감소시키고, cAMP 억제도를 감소시키는 것 중의 어느 하나 이상을 포함한다.
상승작용 효과는 직접적인 효과일 수 있다. 직접적인 효과의 한 예로는 cAMP의 발현을 증가시키는 약제에 의한 cAMP 농도의 상승조절이 있을 수 있다.
별법으로는, 상승작용 효과는 간접적인 효과일 수 있다. 이러한 효과의 한 예로는 cAMP의 농도 및(또는) 활성을 억제하고 및(또는) 감소시키는 물질에 대한 작용이 있을 수 있다. 이러한 효과의 다른 예로는 cAMP의 효능을 증가시키고, cAMP의 농도를 증가시키고, cAMP의 활성을 증가시키고, cAMP 분해도를 감소시키거나, cAMP 억제도를 감소시키는 물질의 작용을 증가시키는 것이 있을 수 있다.
PcAMP의 한 예로는 I:PDEII와 같은 I:PDE가 있을 수 있다.
cAMP 유사물
본 발명의 일부 면의 경우, 약제는 cAMP 유사물로서 작용할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "cAMP 유사물"은 여성 성기에서 cAMP와 유사한 방식으로 작용할(예, 유사한 생물학적 특성 및 효과를 가질) 수 있고, 이렇게 함으로써 cAMP 유사 성분의 효능을 증가시키고, cAMP 유사 성분의 농도를 증가시키고, cAMP 유사 성분의 활성을 증가시키고, cAMP 유사 성분의 분해도를 감소시키고, cAMP 유사 성분의 억제도를 감소시키는 것 중의 어느 하나 이상을 행하는 약제를 의미한다.
따라서, 한 면에서, 본 발명은 FSAD를 앓는 여성의 성기에서 cAMP 유사물로서 작용할 수 있으며, 제약학상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 임의로 혼합되는 약제를 포함하는, FSAD의 치료에 사용하기 위한 (또는 사용될 때의) 제약 조성물에 관한 것이다.
따라서, 다른 면에서, 본 발명은 FSAD 치료용 의약 (예를 들면 제약 조성물)의 제조에 사용되는 용도에 관한 것으로, 이 때, FSAD를 앓는 여성의 성기에서 cAMP 유사물로서 작용할 수 있다.
그러므로, 추가의 면에서, 본 발명은 성기에서 cAMP 유사물로서 작용할 수 있는 약제를 임의로는 제약학상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 혼합하여 여성의 성기에서 cAMP 농도를 상승작용시키는 양으로 여성에게 전달시키는 것을 포함하는, FSAD를 앓는 여성의 치료 방법에 관한 것이다.
cAMP 유사물의 한 예는 포르스콜린일 수 있다. 여기서, 본 발명자들은 포르스콜린이 질 및 음핵 혈류량을 증가시키고 질 이완제로도 작용할 수 있음을 발견하였다.
바람직한 면에서, cAMP 유사물은 경구로 투여된다.
cAMP의 활성화제
본 명세서에서 사용된 용어 "cAMP의 활성화제"는 여성 성기에서 cAMP를 조절하거나 방출시키는 물질을 의미한다. 조절은 직접적 (예를 들면, cAMP 그 자체에 대한) 또는 간접적 (예를 들면, cAMP의 활성화를 통해)일 수 있다. 용이하게 언급하기 위하여, 본 발명자들은 이들 물질을 AcAMP로 언급한다.
표적
본 명세서에서 본 발명에 관하여 언급할 때 용어 "표적"은 cAMP, AcAMP, IcAMP, 또는 AMcAMP인 임의의 물질을 의미한다. 달리 표현하면, 표적은 PcAMP표적으로서 언급될 수 있다.
본 발명의 약제에 대한 표적은 아미노산 서열 및(또는) 이를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및(또는) 이들 및(또는) 이들의 조절인자의 발현을 책임지는 발현 단위일 수 있다.
표적은 상기 표적의 조합일 수도 있다.
약제
약제는 PcAMP로서 작용할 수 있는 임의의 적합한 약제일 수 있다.
약제는 아미노산 서열 또는 이들의 화학 유도체일 수 있다. 물질은 심지어는 유기 화합물 또는 다른 화학물질일 수도 있다. 약제는 센스 서열 또는 안티센스 서열일 수 있는 뉴클레오티드 서열일 수 있다. 약제는 항체일 수도 있다.
따라서, 용어 "약제"에는 천연이거나 천연이 아닌 임의의 적합한 공급원에 의해 생성되거나 이들로부터 얻을 수 있는 화합물이 포함되나, 여기에 제한되지는 않는다.
약제는 펩티드를 포함할 수 있는 화합물, 뿐만 아니라 다른 화합물, 예를 들면 작은 유기 분자, 예를 들면 유도 화합물의 라이브러리로부터 얻을 수 있거나 디자인될 수 있다.
예로서, 약제는 천연 물질, 생물학적 거대분자, 또는 생물학적 물질로부터 제조된 추출물, 예를 들면 세균, 진균 또는 동물 (특히 포유동물) 세포 또는 조직, 유기 또는 무기 분자, 합성 약제, 반합성 약제, 구조 또는 기능 유사물, 펩티드, 펩티도유사물, 유도 약제, 전장 단백질로부터 절단된 펩티드, 합성적으로 (예를 들면 펩티드 합성기를 사용하여 또는 재조합 기술 또는 이들의 병용에 의해) 합성된 펩티드, 재조합 약제, 항체, 천연 또는 비천연 약제, 융합 단백질 또는 이들의 등가물 및 이들의 돌연변이물, 유도체 또는 혼합물일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "약제"는 단일 단위일 수 있거나 약제들의 혼합물일 수 있다.
약제가 유기 화합물인 경우, 몇몇 응용분야의 경우, 예를 들면 약제가 I:NEP인 경우 유기 화합물은 대표적으로는 아미드기 (즉, -N(H)-C(O)- 또는 -C(O)-N(H)-) 및 1개 이상의 히드로카르빌기를 포함할 수 있다. 여기서, 용어 "히드로카르빌기"는 적어도 C 및 H를 포함하는 기를 의미하며, 임의로 1개 이상의 다른 적합한 치환체를 포함할 수 있다. 상기 치환체의 예로는, 할로-, 알콕시-, 니트로-, 알킬기, 시클릭기 등이 포함될 수 있다. 치환체가 시클릭기인 가능성 이외에, 치환체들의 조합이 시클릭기를 형성할 수 있다. 히드로카르빌기가 1개 이상의 C를 포함하는 경우, 이들 탄소가 반드시 서로에 연결될 필요는 없다. 예를 들면, 탄소 원자들 중 2개 이상은 적합한 원소 또는 기를 통해 연결될 수 있다. 따라서, 히드로카르빌기는 헤테로 원자를 함유할 수 있다. 적합한 헤테로 원자는 당업계의 통상의 숙련인에게 명백할 것이고, 예를 들면 황, 질소 및 산소를 포함한다. 몇몇 경우, 바람직하게는 약제는 1개 이상의 시클릭기를 포함한다. 몇몇 경우, 바람직하게는 약제는 아미드 결합을 통해 다른 히드로카르빌기에 연결된 1개 이상의 시클릭기를 포함한다. 상기 화합물의 예는 본 명세서의 실시예 부분에 제공된다.
약제가 유기 화합물이라면, 몇몇 경우, 예를 들면 약제가 I:PDE인 경우, 유기 화합물은 대표적으로 2개 이상의 연결된 히드로카르빌기를 포함할 수 있다. 몇몇 경우, 바람직하게는 약제는 2개 이상의 시클릭기를 포함하며, 이 때 시클릭기들 중의 하나는 융합된 시클릭 고리 구조일 수 있다. 몇몇 경우, 바람직하게는 시클릭기들 중의 적어도 하나는 헤테로시클릭기이다. 몇몇 경우, 바람직하게는 헤테로시클릭기는 고리 중에 1개 이상의 N을 포함한다. 상기 화합물들의 예는 본 명세서의 실시예 부분에 제공된다.
약제가 유기 화합물이라면, 몇몇 경우, 예를 들면 약제가 I:NPY인 경우, 유기 화합물은 대표적으로는 2개 이상의 연결된 히드로카르빌기를 포함할 수 있다. 몇몇 경우, 바람직하게는 약제는 2개 이상의 시클릭기를 포함하며, 이 때 임의로 시클릭기들 중의 하나는 융합된 시클릭 고리 구조일 수 있다. 몇몇 경우, 바람직하게는 시클릭기들 중의 적어도 하나는 헤테로시클릭기이다. 몇몇 경우, 바람직하게는 헤테로시클릭기는 고리 중에 1개 이상의 N을 포함한다. 상기 화합물들의 예는 본 명세서의 실시예 부분에 제공된다.
약제는 할로기를 함유할 수 있다. 여기서, "할로"는 플루오로, 클로로, 브로모 또는 요오도를 의미한다.
약제는 1개 이상의 알킬, 알콕시, 알케닐, 알킬렌 및 알케닐렌기를 함유할수 있으며, 이들은 비분지쇄 또는 분지쇄일 수 있다.
약제는 제약학상 허용되는 염, 예를 들면 산 부가염 또는 염기염, 또는 이들의 수화물을 포함하는 이들의 용매화물의 형태일 수 있다. 적합한 염에 대하여 살펴보기 위해서는, 문헌 [Bergeet al, J. Pharm. Sci., 1977,66, 1-19]을 참조할 수 있다.
적합한 산 부가염은 무독성 염을 형성하는 산으로부터 형성되며, 예로는 히드로클로라이드, 브롬화수소산염, 요오드화수소산염, 황산염, 중황산염, 질산염, 인산염, 인산 수소, 아세테이트, 말레에이트, 푸마레이트, 락테이트, 타르트레이트, 시트레이트, 글루코네이트, 숙시네이트, 사카레이트, 벤조에이트, 메탄술폰산염, 에탄술폰산염, 벤젠술폰산염,p-톨루엔술폰산염 및 파모에이트 염이 있다.
적합한 염기염은 무독성 염을 형성하는 염기로부터 형성되며, 예로는 나트륨, 칼륨, 알루미늄, 칼슘, 마그네슘, 아연 및 디에탄올아민 염을 들 수 있다.
본 발명의 약제의 제약학상 허용되는 염은 약제의 용액과 적절할 경우 소정의 산 또는 염기를 함께 혼합시킴으로써 용이하게 제조될 수 있다. 염은 용액으로부터 침전될 수 있으며, 여과에 의해 수거될 수 있거나 용매를 증발시켜 회수할 수 있다.
본 발명의 약제는 다형성 형태로 존재할 수 있다.
본 발명의 약제는 1개 이상의 비대칭 탄소 원자를 함유할 수 있고, 따라서 2개 이상의 입체이성질체 형태로 존재한다. 약제가 알케닐 또는 알케닐렌기를 함유하는 경우, 시스 (E) 및 트랜스 (Z) 이성질체화도 일어날 수 있다. 본 발명은 약제의 개별 이성질체 및 적절할 경우, 그들의 혼합물과 함께 그들의 개별 호변이성질체를 포함한다.
부분입체이성질체 또는 시스 및 트랜스 이성질체의 분리는 통상적인 기술에 의해, 예를 들면 약제 또는 적합한 염 또는 이들의 유도체의 입체이성질체 혼합물의 분별 결정화, 크로마토그래피 또는 H.P.L.C.에 의해 달성될 수 있다. 또한, 약제의 개별 거울상이성질체는 또한 상응하는 광학적으로 순수한 중간체로부터 제조될 수 있거나 적합한 키랄 지지체를 사용하여 상응하는 라세미체에 대한 H.P.L.C.를 수행하는 것과 같은 분할에 의해, 또는 적절할 경우, 상응하는 라세미체와 적합한 광학 활성 산 또는 염기와 반응시켜 형성된 부분입체이성질체 염을 분별 결정하여 의해 제조할 수 있다.
또한, 본 발명은 약제의 모든 적합한 동위원소 변이체 또는 그의 제약학상 허용되는 염을 포함한다. 본 발명의 약제의 동위원소 변이체 또는 그의 제약학상 허용되는 염은, 1개 이상의 원자가 원자 번호는 동일하나 원자량이 일반적으로 자연에서 발견되는 원자 질량과는 상이한 원자로 치환된 것으로 정의된다. 약제 및 그의 제약학상 허용되는 염 내로 혼입될 수 있는 동위원소의 예로는 수소, 탄소, 질소, 산소, 인, 황, 불소 및 염소의 동위원소, 예를 들면 각각2H,3H,13C,14C,15N,17O,18O,31P,32P,35S,18F 및36Cl이 있다. 약제 및 그의 제약학상 허용되는 염의 특정 동위원소 변이체, 예를 들면 방사성 동위원소, 예를 들면3H 또는14C가혼입된 것이 약물 및(또는) 기질 조직 분포 연구에 유용하다. 삼중수소, 즉3H, 및 탄소-14, 즉14C 동위원소가 동위원소 변이체의 제조 용이함 및 검출가능성 때문에 특히 바람직하다. 추가로, 이중수소, 즉2H와 같은 동위원소를 이용한 치환은 보다 큰 대사 안정성으로부터 발생되는 특정 치료 이점들, 예를 들면 증가된 생체내 반감기 또는 감소된 투여량 요구조건을 제공할 수 있고, 그럼으로써 몇몇 경우에 바람직할 수 있다. 본 발명의 약제 및 이들의 본 발명의 제약학상 허용되는 염의 동위원소 변이체는 일반적으로 적합한 시약의 적절한 동위원소 변이체를 사용하는 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다.
본 발명의 약제가 전구약으로부터 유도될 수 있음을 당업계의 통상의 숙련인은 인식할 수 있을 것이다. 전구약의 예로는 특정 보호된 기(들)가 있고 그 자체로서는 약물학적 활성을 갖지 않을 수 있지만, 특정 경우에 투여된 (예를 들면 경구로 또는 비경구로) 후 체내에서 대사되어 약물학적으로 활성인 본 발명의 약제를 형성할 수 있는 인자를 들 수 있다.
예를 들면, 문헌 ["Design of Prodrugs" by H. Bundgaard, Elsevier, 1985 (기재된 내용은 본 명세서에 포함되는 것으로 함)]에 기재되어 있는 "전구-성분"으로 공지된 특정 성분들이 약제의 적절한 관능기 상에 위치할 수 있음을 추가로 인지해야 한다. 이러한 전구약들 역시 본 발명의 영역 내에 포함된다.
PcAMP는 cAMP의 효능을 직접적으로 또는 간접적으로 증가시키고, cAMP의 농도를 직접적으로 또는 간접적으로 증가시키고, cAMP의 활성을 직접적으로나 간접적으로 증가시키고, cAMP 분해도를 직접적으로 또는 간접적으로 감소시키거나, cAMP 억제도를 직접적으로 또는 간접적으로 감소시키는 것 중의 1종 이상을 행할 수 있다.
바람직하게는, 약제는 FSAD를 앓는 여성의 성기에서 cAMP 농도를 직접적으로 또는 간접적으로 증가시킨다.
보다 바람직하게는, 약제는 FSAD를 앓는 여성의 성기에서 cAMP 농도를 직접적으로 또는 간접적으로 선택적으로 증가시킨다.
보다 바람직하게는, 약제는 성적으로 흥분에 의해 유도된 cAMP인 cAMP 농도를 직접적으로 또는 간접적으로 선택적으로 증가시킨다.
매우 바람직한 면에서, 본 발명의 약제는 성적 흥분에 의해 유도된 cAMP의 상대량을 증가시킨다.
몇몇 경우, 약제는 FSAD를 선택적으로 치료한다.
한 면에서, 약제는 적합한 표적을 억제하거나 길항시킬 수 있고, 이렇게 함으로써 여성 성기에서 cAMP 수치를 상승작용시킨다. 본 명세서에서, 본 발명자들은 용어 억제제를 억제제 및(또는) 길항제를 의미하는 것으로 사용하였다.
다른 면에서, 약제는 적합한 표적을 활성화시키거나 항진시킬 수 있고, 이렇게 함으로써 여성 성기에서 cAMP 수치를 상승작용시킨다. 본 명세서에서, 본 발명자들은 용어 활성화제 및 상승조절제 억제제라는 용어를 활성화제 및(또는) 상승조절제 및(또는) 효능제을 의미하는 것으로 사용하였다.
따라서, 약제는 적합한 표적을 항진시키거나, 길항시키거나, 상승조절하거나억제할 수 있다.
약제는 이들 특성들 중 2개 이상을 나타낼 수 있는 단일 인자일 수 있다. 별법으로는, 또는 추가로, 약제는 이들 특성들 중 1개 이상을 나타낼 수 있는 약제들의 혼합물일 수 있다.
바람직하게는, 약제는 적합한 표적을 선택적으로 항진시키거나, 선택적으로 길항시키거나, 선택적으로 상승조절하거나 선택적으로 억제할 수 있다.
바람직하게는, 약제는 적합한 선택적 표적을 선택적으로 항진시키거나, 선택적으로 길항시키거나, 선택적으로 상승조절하거나 선택적으로 억제할 수 있다.
본 발명의 약제는 또한 1개 이상의 다른 유리한 기능적 특성을 표시할 수 있다. 예로서, 본 발명의 약제는 cAMP를 상승작용시킬 뿐만 아니라 cGMP를 상승작용시킬 수 있다.
몇몇 경우 (예를 들면, 국소 도포), 약제는 또한 ACE (안지오텐신 전환 효소) 억제 작용을 표시할 수 있다. ACE 분석은 본 명세서에서 실험 단락에서 제공된다. 몇몇 적용의 경우 (예를 들면 특정 환자 형태의 경우), 상기 약제 (즉, ACE 억제 작용도 나타내는 것)는 경구 투여용으로 적합하지 않을 수 있다.
몇몇 경우, 약제는 또한 ECE (내피 전환 효소) 억제 작용을 나타낼 수 있다. ECE 분석은 당업계에 공지되어 있다.
제약 혼합물
약제는 1종 이상의 다른 제약학적 활성제, 예를 들면 PcGMP(예를 들면, 포스포디에스테라제 타입 5 억제제, 예를 들면, 실데나필, 또는 산화질소 공여체 또는 산화질소 전구체, 예를 들면, L-아르기닌 또는 아르기나제의 억제제) 및(또는) 중추에 작용하는 약물 (예를 들면, 도파민 수용체 효능제, 예를 들면 아포모르핀 또는 도파민 D2 수용체 효능제, 예를 들면 PNU-95666 또는 멜라노코르틴 수용체 효능제, 예를 들면 멜라노탄 II)와 함께 사용될 수 있다. 약물로서 아포모르핀의 사용에 대한 내용은 US-A-5945117에서 찾아볼 수 있다. 이 특정 문헌에서, 아포모르핀은 설하 투여된다. 또한, 별법으로, 약제는 PDE5 억제제 [예를 들면 실데나필, 바르데나필 (Bayer BA 38-9456) 및 IC351 (시알리스, 아이코스 릴리)], 1종 이상의 산화질소 공여체 (예를 들면 NMI-921), 1종 이상의 도파민 수용체 효능제 (예를 들면 아포모르핀, 유프리마, 익스센), 1종 이상의 헤테로시클릭 아민, 예를 들면 WO 00/40226, 특히 실시예 번호 7, 8 및 9에 일반적 및 구체적으로 기재되어 있는 것, 1종 이상의 멜라노코르틴 수용체 효능제 (예를 들면 멜라노탄 II 또는 PT14), 1종 이상의 칼륨 채널 개방제 [예를 들면 KATP채널 개방제 (예를 들면 미녹시딜, 니코란딜)] 및(또는) 칼슘 활성화된 칼륨 채널 개방제 (예를 들면 BMS-204352), 1종 이상의 α1-아드레날린 수용체 길항제 (예를 들면 펜톨아민, 바소펨, 바소맥스), 1종 이상의 VIP 수용체 효능제 또는 VIP 동족체 (예를 들면 Ro-125-1553) 또는 VIP 단편, 1종 이상의 α-아드레날린 수용체 길항제와 VIP 혼합물 (예를 들면 인비코르프, 아비프타딜), 1종 이상의 α2-아드레날린 수용체 길항제 (예를 들면 요힘바인), 1종 이상의 에스트로겐, 에스트로겐과 메드록시프로게스테론 또는 메드록시프로게스테론 아세테이트 (MPA) 또는 에스트로겐과 메틸 테스토스테론 호르몬 대체 요법제 (예를 들면 HRT 특히 프레마린, 세네스틴, 에스트로페미날, 에퀸, 에스트라세, 에스트로펨, 엘레스테 솔로, 에스트링, 이스트라덤, 이스트라덤 TTS, 이스트라덤 매트릭스, 더메스트릴, 프렘페이스, 프렘프로, 프렘팩, 프레미크, 에스트라테스트, 에스트라테스트 HS, 티볼론), 1종 이상의 테스토스테론 대체제 [DHEA (데히드로안드로스텐디온), 테스토스테론 (토스트렐) 또는 테스토스테론 이식물 (오르가논)], 1종 이상의 테스토스테론/에스트라디올제, 1종 이상의 에스트로겐 길항제, 예를 들면, 라소폭시펜, 1종 이상의 세로토닌 수용체 효능제 또는 길항제 (예를 들면, 5HT1A, 5HT2C, 5HT2A 및 5HT3 수용체 효능제 및 길항제; WO2000/28993에 기재되어 있음), 1종 이상의 프로스타노이드 수용체 효능제 (예를 들면, 뮤즈, 알프로스타딜, 미소프로스톨), 1종 이상의 퓨린 수용체 효능제 (특히 P2Y2 및 P2Y4), 1종 이상의 항우울제 [예를 들면 부프로피온 (웰부트린), 미르타자핀, 네파조돈] 중의 1종 이상과 함께 사용될 수 있다.
IC351의 구조는 다음과 같다.
<화학식 IC351>
활성제들의 혼합물이 투여되는 경우, 이들은 동시에, 별도로 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
VIP 혼합물
본 발명에 따르면, 약제는 VIP (또는 바람직하게는 그들의 동족체 또는 그들의 단편이)가 아니다. 그러나, 몇몇 실시형태의 경우, 본 발명의 약제는 VIP 또는 그의 동족체 또는 그의 단편과 공동투여될 수 있다.
매우 바람직한 면에서, VIP 또는 그의 동족체 또는 그의 단편이 투여되지 않는다. 이것은 VIP 침출액이 상당한 심혈관 부작용, 예를 들면 심박동수의 증가 및 확장기 동맥 혈압의 감소를 야기시킨다는 보고가 있기 때문이다 [Ottesen 1983, 1987, 1995].
또한, 오트슨 (Ottesen) 및 협력자들이 VIP가 건강한 지원자에서 질 혈류량 및 윤활을 증가시킨다는 것을 입증하였을 지라도, VIP가 그의 효과를 발휘하는 메카니즘은 분명하지 않다. 문헌에는 상이한 2차 메신저 시스템, 예를 들면 cGMP/구아닐레이트 시클라제 (Ashur-Fabian, 1999); 일산화탄소 (CO)/헴 옥시게나제 (Fan et al., 1998) 및 cAMP/아데닐레이트 시클라제 (Foda, 1995; Schoeffter, 1985; Gu, 1992)를 통한 VIP 신호화의 수많은 예가 있다. 이것은 자궁 동맥에서 VIP의 혈관이완 효과가 어떻게 산화질소의 방출에 의해 설명될 수 있는지를 설명하는 최근의 보고서에 의해 예시된다 [Jovanovic, 1998]. 또한, 남성 비뇨 생시ㄱ기 기능에서 VIP가 산화질소 (NO)/cGMP를 조절한다는 증거가 있다 (Kim, 1994).
또한, 문헌에는 VIP가 질 평활근 세포 배양물에서 cAMP 농도에 어떤 영향도미치지 않음이 보고되어 있다 [Traish, A., Moreland, R.B., Huang, Y., et al. (1999). Development of human and rabbit vaginal smooth muscle cell cultures: Effects of vasoactive agents on intracellular levels of cyclic nucleotides.Mol. Cell Biol. Res. Comm.,2, 131-137 참조].
게다가, 후속 연구에서, 오트슨 (Ottesen) 및 협력자들은 (Palle, Bredkjaer, Ottesen and Fahrenkrug 1990 Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology vol 17 61-68 참조) 투여 경로와는 무관한 VIP의 질 혈류량에 대한 효과가 국소적인 반응이라기 보다는 전신적 혈관확장 효과의 일부분이라고 보고하고 있다. 또한, 이들은 VIP와 관련된 수많은 혈관 부작용, 즉 홍조, 저혈압 및 빈박에 대해 보고하고 있다.
K i 값
몇몇 적용의 경우, 바람직하게는 본 발명의 약제의 Ki값은 약 100 nM 미만, 바람직하게는 약 75 nM 미만, 바람직하게는 약 50 nM 미만, 바람직하게는 약 25 nM 미만, 바람직하게는 약 20 nM 미만, 바람직하게는 약 15 nM 미만, 바람직하게는 약 10 nM 미만, 바람직하게는 약 5 nM 미만이다.
K b 값
몇몇 적용의 경우, 바람직하게는 본 발명의 약제의 Kb값은 약 100 nM 미만, 바람직하게는 약 75 nM 미만, 바람직하게는 약 50 nM 미만, 바람직하게는 약 25 nM 미만, 바람직하게는 약 20 nM 미만, 바람직하게는 약 15 nM 미만, 바람직하게는 약10 nM 미만, 바람직하게는 약 5 nM 미만이다.
K a 값
몇몇 적용의 경우, 바람직하게는 본 발명의 약제의 Ka값은 약 100 nM 미만, 바람직하게는 약 75 nM 미만, 바람직하게는 약 50 nM 미만, 바람직하게는 약 25 nM 미만, 바람직하게는 약 20 nM 미만, 바람직하게는 약 15 nM 미만, 바람직하게는 약 10 nM 미만, 바람직하게는 약 5 nM 미만이다.
약물동력학
본 발명의 일부 실시형태의 경우, 바람직하게는 본 발명의 약제 (예를 들면 I:NEP)는 -2 내지 +4, 보다 바람직하게는 -1 내지 +2의 log D를 갖는다. log D는 예를 들면 문헌 [J. Pharm. Pharmacol. 1990, 42:144]에 기재되어 있는 바와 같이 당업계에 공지된 표준 방법에 의해 결정될 수 있다.
또한, 별법으로, 몇몇 실시형태의 경우, 바람직하게는 본 발명의 약제 (예를 들면 I:NEP)는 2 x 10-6cms-1, 보다 바람직하게는 5 x 10-6cms-1의 카코-2 플럭스를 갖는다. 카코 플럭스 (caco flux)는 문헌 [J. Pharm. Sci. 79, 7, p595-600 (1990), 및 Pharm. Res. vol 14, no. 6 (1997)]에 기재되어 있는 바와 같이 당업계에 공지된 표준 방법에 의해 결정될 수 있다.
선택성
몇몇 경우, 바람직하게는 본 발명의 약제는 소정의 표적에 대해 약 100배 이상의 선택성, 바람직하게는 소정의 표적에 대해 약 150배 이상의 선택성, 바람직하게는 소정의 표적에 대해 약 200배 이상의 선택성, 바람직하게는 소정의 표적에 대해 약 250배 이상의 선택성, 바람직하게는 소정의 표적에 대해 약 300배 이상의 선택성, 바람직하게는 소정의 표적에 대해 약 350배 이상의 선택성을 갖는다.
몇몇 경우, 바람직하게는 본 발명의 약제는 소정의 표적에 대해 약 400배 이상의 선택성, 바람직하게는 소정의 표적에 대해 약 500배 이상의 선택성, 바람직하게는 소정의 표적에 대해 약 600배 이상의 선택성, 바람직하게는 소정의 표적에 대해 약 700배 이상의 선택성, 바람직하게는 소정의 표적에 대해 약 800배 이상의 선택성, 바람직하게는 소정의 표적에 대해 약 900배 이상의 선택성, 바람직하게는 소정의 표적에 대해 약 1000배 이상의 선택성을 갖는다.
화학적 합성 방법
대표적으로 본 발명의 약제는 화학 합성 기술에 의해 제조되게 된다.
본 발명의 약제 또는 표적, 또는 그의 변이체, 동족체, 유도체, 단편 또는 유사물은 화학적 방법을 사용하여 제조되어 약제 전체 또는 일부분을 합성할 수 있다. 예를 들면, 펩티드는 고체상 기술에 의해 합성되고, 수지로부터 분해되고 및 예비 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다 [예를 들면, Creighton (1983) Proteins Structures And Molecular Principles, WH Freeman and Co. New York NY]. 합성 펩티드의 조성은 아미노산 분석 또는 서열분석에 의해 확인할 수 있다 [예를 들면, 에드만 (Edman) 분해 방법; Greighton, 상기함].
약제 또는 그의 변이체, 동족체, 유도체, 단편 또는 유사물의 직접적인 합성은 각종 고체상 기술 [Roberge JYet al(1995) Science 269: 202-204]을 사용하여수행할 수 있고, 예를 들면 ABI 43 1 A 펩티드 신티사이저 (Perkin Elmer)를 사용하여 제조업자가 제공한 지시사항에 따라 자동화 합성이 달성될 수 있다. 추가로, 약제 또는 그의 임의의 일부분을 포함하는 아미노산 서열은 직접적인 합성 동안 변화될 수 있거나 화학적 방법을 사용하여 다른 서브유닛의 서열 또는 그의 일부분과 융합되어 변이 약제 또는 표적, 예를 들면 변이 PDE, NEP 또는 NPY를 생성시킬 수 있다.
본 발명의 별법의 실시형태에서, 약제, 표적 또는 그의 변이체, 동족체, 유도체, 단편 또는 유사물의 코딩 서열은 당업계에 공지된 화학적 방법을 사용하여 전체 또는 일부분이 합성될 수 있다 [Caruthers MHet al(1980) Nuc Acids Res Symp Ser 215-23, Horn Tet al(1980) Nuc Acids Res Symp Ser 225-232 참조].
유사물
본 명세서에서 사용된 용어 "유사물"은 펩티드, 폴리펩티드, 항체 또는 표적에 대한 기준 약제와 동일한 정성적 활성 또는 효과가 있는 다른 유기 화학물질을 포함하는 임의의 화합물질에 관한 것이나, 여기에 한정되지 않는다.
화학적 유도체
본 명세서에서 사용된 용어 "유도체" 또는 "유도된"은 약제의 화학적 개질을 포함한다. 상기 화학적 개질의 예로는 수소의 할로기, 알킬기, 아실기 또는 아미노기에 의한 치환이 있을 수 있다.
화학적 개질
본 발명의 한 실시형태에서, 약제는 화학적으로 개질된 약제일 수 있다.
본 발명의 약제의 화학적 개질은 약제와 표적 사이의 수소 결합 상호작용, 전하 상호작용, 소수성 상호작용, 반 데르 바알스 상호작용 또는 양극 상호작용을 향상시키거나 감소시킬 수 있다.
한 면에서, 확인된 약제는 다른 화합물의 개발을 위한 모델 (예를 들면 주형)로서 작용할 수 있다.
재조합 방법
대표적으로는 본 발명의 분석에 사용하기 위한 본 발명의 표적은 재조합 DNA 기술에 의해 제조될 수 있다.
cGMP의 상승작용
본 명세서에서 cGMP를 언급할 때 사용되는 용어 "상승작용시킨다"는 cGMP의 효능을 증가시키고, cGMP의 농도를 증가시키고, cGMP의 활성을 증가시키고, cGMP 분해도를 감소시키고, cGMP 억제도를 감소시키는 것 중의 어느 하나 이상을 포함한다.
상승작용 효과는 직접적인 효과일 수 있다. 별법으로, 상승작용 효과는 2차적인 효과 및(또는) 다운스트림 효과일 수 있다.
여기서, 바람직하게는 cGMP를 상승작용시키는 약제는 IcGMP및(또는) AMcGMP에 작용하며, 이 때 cGMP의 조절인자는, 약제가 cGMP를 향한 IcGMP및(또는) AMcGMP의 유해한 효과를 감소시키고 및(또는) 제거하고 및(또는) 차단하고 및(또는) 분산시키도록, cGMP에 대하여 부작용이 있다.
따라서, 본 발명은 1개 이상의 I:IcAMP및 1개 이상의 I:IcGMP의 혼합물을 포함한다.
한 면에서, I:IcGMP는 I:PDEcGMP이다.
I cAMP 및(또는) AM cAMP
본 발명자들은 cAMP가 성기 (질 또는 음핵)의 혈류량을 매개하고, cAMP 신호화를 향상시킴으로써 본 발명자들이 동물 모델에서 성기 (예를 들면 질 또는 음핵) 혈류량을 향상시킬 수 있음을 발견하였다. 따라서, cAMP 매개 혈관이완을 상승조절/향상시키는 약제는 FSAD의 치료에 효능이 있게 될 것이다. 용이하게 언급하기 위하여, 본 발명자들은 이들 물질을 IcAMP및(또는) AMcAMP로 언급한다. 여기서, IcAMP및 AMcAMP는 cAMP 농도 또는 활성에 부작용이 있다.
따라서, 약제는 I:IcAMP및(또는) I:AMcAMP중의 1종 이상일 수 있다.
약제는 이들 특성들 중 2개 이상을 나타낼 수 있는 단일 인자일 수 있다. 별법으로, 또는 추가로, 약제는 이들 특성들 중 1개 이상을 나타낼 수 있는 약제들의 혼합물일 수 있다.
IcAMP및 AMcAMP의 예로는 PDE(s), NPY 및 NEP 중의 1종 이상, 또는 이들과 관련된 임의의 성분이 있다. 관련된 성분은 예를 들면 수용체 및(또는) 보조인자일 수 있다.
따라서, 바람직하게는 약제는 I:PDEcAMP, I:NPY (때로는 NPYi로 기록됨),I:NPY Yn(때로는 NPY Yni로 기록됨) 및 I:NEP 중의 1종 이상일 수 있다.
마찬가지로, 약제는 이들 특성들 중 2개 이상을 나타낼 수 있는 단일 인자일 수 있다. 별법으로, 또는 추가로, 약제는 이들 특성들 중 1개 이상을 나타낼 수 있는 약제들의 혼합물일 수 있다.
I:I cAMP 및(또는) I:AM cAMP
본 발명에 따라 본 발명자들은 cAMP에 대한 IcAMP및(또는) AMcAMP의 유해한 효과를 감소시키고 및(또는) 제거하고 및(또는) 차단하고 및(또는) 분산시키고 및(또는) 막는 약제를 사용하여 FSAD를 피료하고 및(또는) 예방할 수 있음을 발견하였다. 약제는 심지어 IcAMP및(또는) AMcAMP에 의해 감소된 cAMP 농도를 회복시킬 수 있다. 편의상, 본 발명자들은 이들 물질을 I:IcAMP및(또는) I:AMcAMP로 언급한다. 여기서, I:IcAMP및(또는) I:AMcAMP는 cAMP 농도 또는 활성에 미치는 부작용을 예방하거나 감소시킨다.
따라서, 한 바람직한 면에서, 약제는 I:IcAMP및(또는) I:AMcAMP이고, 이 때 AMcAMP는 AMcAMP에 대한 유해효과가 있다.
바람직한 한 면에서, 약제는
I:PDEcAMP
I:PDEncAMP(여기서, n은 적절한 군 또는 아군을 나타냄)
I:NPY
I:NPY Yn(여기서, n은 적절한 군 또는 아군을 나타냄)
I:NEP
중의 1종 이상일 수 있다.
A cAMP
본 발명에 따라, 본 발명자들은 여성 성기에서 cAMP의 저농도 또는 저활성이 FSAD의 주요 원인들 중의 하나인 것을 발견하였다.
따라서, 약제는 U:AcAMP일 수 있다.
AcAMP의 예로는 VIP 및 AC, 또는 이와 관련된 임의의 성분이 있다. 관련 성분은 예를 들면, 수용체 및(또는) 보조인자일 수 있다.
따라서, 바람직하게는 약제는 A:AC, A:VIPr, A:VIPn, I:I:VIPr 또는 I:I:VIPn중의 1종 이상일 수 있다.
약제는 이들 특성들 중 2개 이상을 나타낼 수 있는 단일 인자일 수 있다. 별법으로는, 또는 추가로, 약제는 이들 특성들 중 1개 이상을 나타낼 수 있는 약제들의 혼합물일 수 있다.
U:A cAMP
다른 면에서, 바람직하게는, 표적은 cAMP 농도를 증가시키는 성분이다. 따라서, 약제는 U:AC일 수 있다.
예로서, 표적은 cAMP 그 자체 또는 AC 또는 VIP (또는 이들의 혼합물)일 수 있다.
따라서, 예로서, 약제는 U:AcAMP, A:AC, A:VIPr, A:VIPn, I:I:VIPr 또는 I:I:VIPn중의 1종 이상일 수 있다.
I:I cAMP 및(또는) I:M cAMP 및(또는) U:A cAMP 의 혼합물
다른 면에서, 본 발명의 약제는 cAMP 상승작용제들의 혼합물일 수도 있다. 예로서, 본 발명의 약제는
I:PDEcAMP
I:PDEncAMP
I:NPY
I:NPY Yn
I:NEP
U:AcAMP
A:AC
A:VIPr
A:VIPn
I:I:VIPr
I:I:VIPn
중의 2종 이상일 수 있다.
cAMP 유사물 및 I:I cAMP 및(또는) I:M cAMP 및(또는) U:A cAMP 의 혼합물
다른 면에서, 본 발명의 약제는 cAMP 유사물 및 1종 이상의 cAMP 상승작용제들의 혼합물일 수도 있다. 예로서, 본 발명의 약제는 cAMP 유사물 및 1종 이상의
I:PDEcAMP
I:PDEncAMP
I:NPY
I:NPY Yn
I:NEP
U:AcAMP
A:AC
A:VIPr
A:VIPn
I:I:VIPr
I:I:VIPn
일 수 있다.
억제제
본 명세서에서 본 발명의 약제에 대하여 사용된 용어 "억제제"는 cAMP를 향한 IcAMP및(또는) 유해한 McAMP의 유해효과를 감소시키고 및(또는) 제거하고 및(또는) 차단하고 및(또는) 예방할 수 있는 약제를 의미한다.
활성화제
본 명세서에서 본 발명의 약제에 대하여 사용된 용어 "활성화제"는 cAMP 및(또는) AcAMP의 작용을 증가시키고 및(또는) 생성시키고 및(또는) 차단하지 않고 및(또는) 상승시키고 및(또는) 보장할 수 있는 약제를 의미한다.
다른 활성 성분
다른 면에서, 본 발명의 약제는 1종 이상의 활성 성분, 예를 들면 cGMP를 상승작용시킬 수 있는 1종 이상의 약제와의 혼합물일 수 있다.
아미노산 서열
본 명세서에서 사용된 용어 "아미노산 서열"은 용어 "폴리펩티드" 및(또는) 용어 "단백질"과 같은 뜻이다. 몇몇 경우, 용어 "아미노산 서열"은 용어 "펩티드"와 같은 뜻이다. 몇몇 경우에, 용어 "아미노산"은 용어 "단백질"과 같은 뜻이다.
아미노산 서열은 적합한 공급원으로부터 단리되어 제조될 수 있거나 합성적으로 제조될 수 있거나 재조합 DNA 기술의 사용에 의해 제조될 수 있다.
한 면에서, 본 발명은 FSAD를 치료하기 위하여 cAMP를 상승작용시키기 위하여 아미노산 서열에 영향을 미칠 수 있는 1종 이상의 약제 및(또는) 그의 유도체의 확인을 위한 분석에서 표적으로 작용할 수 있는 아미노산 서열을 제공한다.
뉴클레오티드 서열
본 명세서에서 사용된 용어 "뉴클레오티드 서열"은 용어 "폴리뉴클레오티드"와 같은 뜻이다.
뉴클레오티드 서열은 게놈의 또는 합성 또는 재조합 기원의 DNA 또는 RNA일 수 있다. 뉴클레오티드 서열은 센스 또는 안티센스 가닥 또는 이들의 결합물을 나타내는지에 따라 두 가닥 또는 한 가닥일 수 있다.
몇몇 경우, 바람직하게는 뉴클레오티드 서열은 DNA이다.
몇몇 경우, 바람직하게는 뉴클레오티드 서열은 재조합 DNA 기술 (예를 들면 재조합 DNA)을 사용하여 제조된다.
몇몇 경우, 바람직하게는 뉴클레오티드 서열은 cDNA이다,
몇몇 경우, 바람직하게는 뉴클레오티드 서열은 이 경우에 대한 천연 발생 형태와 동일할 수 있다.
한 면에서, 본 발명은 cAMP를 상승작용시켜 FSAD를 치료하기 위하여 물질에 영향을 줄 수 있는 1종 이상의 약제 및(또는) 그의 유도체의 확인을 위한 분석 (예를 들면 이스트 투 하이브리드 분석)에서 표적으로 작용할 수 있는 물질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 제공한다.
수많은 상이한 뉴클레오티드 서열들이 유전자 코드의 디제너러시의 결과로 본 발명의 표적을 코딩할 수 있음을 당업계의 통상의 숙련인은 이해할 수 있을 것이다. 또한, 당업계의 통상의 숙련인은 통상적인 기술을 사용하여 본 발명의 표적이 발현되어야 하는 임의의 특정 숙주 유기체의 코돈 사용을 반영하면서 본 발명의뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 활성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 뉴클레오티드 치환체를 제조할 수 있음을 이해해야 한다. 따라서 첨부된 서열 목록에 열거된 뉴클레오티드 서열과 관련된 용어 "변이체", "동족체" 또는 "유도체"는 임의의 본 발명에 따른 기능적 표적 (또는 약제가 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열을 포함하는 경우 본 발명에 따른 약제)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 제공하는 서열로부터 또는 서열에 1개 (또는 그 이상의) 핵산이 치환, 변이, 변환, 대체, 결실 또는 첨가되는 것을 포함한다.
상기한 바와 같이, 서열 상동성에 관해서는, 바람직하게는 본 명세서의 서열 목록에 나타낸 서열에 대하여 75% 이상, 보다 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성이 있다. 보다 바람직하게는 95% 이상, 더욱 바람직하게는 98% 이상의 상동성이 있다. 뉴클레오티드 상동성 비교는 상기한 바와 같이 행할 수 있다. 바람직한 서열 비교 프로그램은 상기한 GCG 위스콘신 베스트피트(Wisconsin Bestfit) 프로그램이다. 결핍 스코어 매트릭스는 각 동일한 뉴클레오티드의 경우 10 및 각 불일치의 경우 -9의 일치값을 갖는다. 결핍 갭 생성 페널티는 -50이고, 결핍 갭 연장 페널티는 각 뉴클레오티드의 경우 -3이다.
본 발명은 또한 본 명세서에서 제공된 서열에 대하여 선택적으로 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 서열, 또는 이들의 임의의 변이체, 단편 또는 유도체, 또는 이들 중 임의의 것의 상보서열을 포함한다. 뉴클레오티드 서열은 바람직하게는 길이가 15개 이상의 뉴클레오티드이고, 보다 바람직하게는 길이가 20, 30, 40 또는 50 이상의 뉴클레오티드이다. 이들 서열은 예를 들면 진단 키트에서 프로브로서사용될 수 있다.
변이체/동족체/유도체
본 명세서에서 언급한 구체적인 아미노산 서열 및 뉴클레오티드 서열 외에, 본 발명은 그들의 변이체, 동족체 및 유도체의 사용을 포함한다, 여기서, 용어 "상동성"은 "동일성"과 동일할 수 있다.
본 문맥에서, 동종 서열은 적어도 75, 85 또는 90% 이상 동일할 수 있는, 바람직하게는 적어도 95 또는 98% 동일할 수 있는 아미노산 서열을 포함하는 것으로 사용된다. 특히, 상동성은 대표적으로는 활성을 위하여 필수적인 것으로 공지된 서열의 영역에 대하여 고려되어야 한다. 비록 상동성이 유사성의 면에서 고려될 수 있지만 (즉, 유사한 화학적 특성/기능을 갖는 아미노산 잔기), 본 발명의 문맥에서는 서열 동일상의 면에서 상동성을 표현하는 것이 바람직하다.
상동성은 육안으로 확인될 수 있으나, 보다 통상적으로, 용이하게 이용가능한 서열 비교 프로그램의 도움으로 확인될 수 있다. 상업적으로 유용한 이들 컴퓨터 프로그램은 두 개 이상의 서열 사이의 상동성%를 계산할 수 있다.
상동성 %는 연속 서열에 대하여 계산될 수 있고, 즉 한 서열은 다른 서열과 일렬을 이루고 한 서열 중의 각 아미노산을 다른 서열 중의 상응하는 아미노산과 한 번에 한 잔기씩 직접적으로 비교하였다. 이것을 "언갭트 (ungapped)" 정렬로 부른다. 대표적으로는, 이러한 언갭트 정렬은 단지 비교적 적은 수의 잔기에 대하여 수행한다.
비록 이것이 매우 간단하고 일정한 방법일지라도, 예를 들면 동일한 한 쌍의서열에서 한 개의 삽입 또는 결핍으로 인해 그 이후의 아미노산 잔기들이 정렬로부터 벗어나게 만든다는 것을 생각하지 못하게 하며, 따라서 전체적인 정렬이 수행된 경우 상동성%가 잠재적으로 크게 감소하게 된다. 결과적으로, 대부분의 서열 비교 방법은 전반적인 상동성 스코어에 부당하게 벌점을 가하지 않고서 가능한 삽입 및 결실을 고려할 수 있는 최적의 정렬을 생성시키도록 디자인된다. 이것은 국소적 상동성을 최대화시키기 위한 시도로 서열 정렬에 "갭"을 삽입시킴으로써 달성된다.
그러나, 보다 복잡한 이들 방법들은 정렬 중에 발생되는 각 갭에 "갭 페널티"를 부여하여, 동일한 수의 동일한 아미노산 경우, 가능한 한 적은 수의 갭을 갖는 서열 (2개의 비교 서열들 사이에 관련도가 보다 큰 것을 반영함)이 많은 수의 갭을 갖는 것보다 높은 스코어를 얻게 된다. 갭의 존재에 대해 비교적 높은 대가를 부여하고 갭 중의 각 연속 잔기들에 대해서는 보다 작은 페널티를 부여하는 "의사 갭 대가 (Affine gap costs)"가 대표적으로 사용된다. 이것은 가장 일반적으로 사용되는 갭 스코어링 시스템이다. 높은 갭 페널티는 물론 보다 적은 수의 갭을 갖는 최적화된 정렬을 생성시키게 된다. 대부분의 정렬 프로그램은 갭 페널티가 변화될 수 있도록 한다. 그러나, 서열 비교를 위하여 상기한 소프트웨어를 사용할 때 디폴트값을 사용하는 것이 바람직하다. GCG 위스콘신 베스트피트 팩키지 (하기 참조)를 사용할 때 아미노산 서열에 대한 디폴트 갭 페널티는 갭의 경우 -12 및 각 연장의 경우 -4이다.
그러므로 최대 상동성%의 계산은 먼저 갭 페널티를 고려한, 최적의 정렬의 생성을 필요로 한다. 이러한 정렬을 수행하기 위해 적합한 컴퓨터 프로그램은 GCG위스콘신 베스트피트 팩키지 [University of Wisconsin, U.S.A.; Devereuxet al., 1984, Nucleic Acids Research 12:387]이다. 서열 비교를 수행할 수 있는 다른 소프트웨어의 예로는 BLAST 팩키지 [Ausubelet al., 1999ibid- Chapter 18 참조], FASTA [Atschulet al., 1990, J. Mol. Biol., 403-410] 및 비교 도구의 GENEWORKS 스위트 (suite)를 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. BLAST 및 FASTA 모두 오프라인 및 온라인 조사로 입수할 수 있다 [Ausubelet al., 1999ibid- pages 7-58 to 7-60 참조]. 그러나 GCG 베스트피트 프로그램을 사용하는 것이 바람직하다. BLAST 2 시퀀스로 불리는 새로운 도구 역시 단백질 및 뉴클레오티드 서열을 비교하는데 사용할 수 있다 [FEMS Microbiol Lett 1999 174(2): 247-50; FEMS Microbiol Lett 1999 177(1): 187-8; 및 tatiana@ncbi.nlm.nih.gov 참조].
비록 최종 상동성%가 동일성의 면에서 측정될 수 있지만, 정렬 방법 그 자체는 대표적으로는 절대적인 쌍 비교에 기초하지 않는다. 대신에, 화학적 유사성 또는 진화 거리에 기초한 각 쌍별 비교에 대해 스코어를 할당하는 기준화된 유사성 스코어 매트릭스가 일반적으로 사용된다. 이러한 흔히 사용되는 매트릭스의 예는 BLOSUM62 매트릭스, 즉 프로그램의 BLAST 스위트에 대한 애초 매트릭스이다. GCG 위스콘신 프로그램은 일반적으로 대중적 디폴트값 또는 공급되는 경우 외주 심볼 비교표를 사용한다 [추가로 상세한 내용에 대해서는 사용자 매뉴얼 참조]. GCG 팩키지의 경우 대중적 디폴트값 또는 다른 소프트웨어의 경우 BLOSUM62와 같은 애초 매트릭스를 사용하는 것이 바람직하다.
일단 소프트웨어가 최적 정렬을 생성시키면, 상동성%, 바람직하게는 서열 동일성%를 계산할 수 있다. 소프트웨어는 대표적으로는 이것을 서열 비교의 일부로 행하고 수치적인 결과를 생성시킨다.
또한, 서열은 잠재성 변화를 생성시키고 기능적으로 등가의 물질을 생성시키는 아미노산 잔기의 결실, 삽입 또는 치환을 가질 수 있다. 계획적인 아미노산 치환은 물질의 2차적인 결합 활성이 보유되는 한 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및(또는) 양친매성의 유사성을 기초로 행해질 수 있다. 예를 들면, 음으로 하전된 아미노산으로는 아스파르트산 및 글루탐산을 들 수 있고, 양으로 하전된 아미노산으로는 라이신 및 아르기닌을 들 수 있고, 및 유사한 친수성 값을 갖는 전하를 갖지 않는 극성 헤드기들을 갖는 아미노산으로는 류신, 이소류신, 발린, 글리신, 알라닌, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 페닐알라닌 및 트로신을 들 수 있다.
보존적 치환은 예를 들면 하기 표에 따라 행해질 수 있다. 두번째 컬럼 중의 동일 블록내의 아미노산 및 바람직하게는 세번째 컬럼 중의 동일 라인 중의 아미노산들은 서로 치환될 수 있다.
지방족 비극성 GAP
ILV
극성 - 전하를 갖지 않는 CSTM
NQ
극성 - 하전된 DE
KR
방향족 HFWY
본 발명은 또한 동질성 치환 (치환 및 교환 모두 본 명세서에서는 기존의 아미노산 잔기의 별법의 잔기로의 상호교환을 의미하는 것으로 사용됨)이 일어날 수 있음, 즉 유사-대-유사 치환, 예를 들면 염기성 대 염기성, 산성 대 산성, 극성 대극성 등을 포함한다. 비동질성 치환, 즉 잔기의 한 군으로부터 다른 군으로의 비동질성 치환 또는 별법으로는 비천연 아미노산, 예를 들면 오르니틴 (이하 Z로 언급함), 디아미노부티르산 오르니틴 (이하 B로 언급함), 노르류신 오르니틴 (이하 O로 언급함), 피리일알라닌, 티에닐알라닌, 나프틸알라닌 및 페닐글리신 또한 포함한다.
하기하는 것들을 포함하는 비천연 아미노산에 의해 교환도 일어날 수 있다: 알파*및 알파-이치환된*아미노산, N-알킬 아미노산*, 락트산*, 천연 아미노산의 할로겐화물 유도체, 예를 들면 트리플루오로티로신*, p-Cl-페닐알라닌*, p-Br-페닐알라닌*, p-l-페닐알라닌*, L-알릴-글리신*, β-알라닌*, L-α-아미노 부티르산*, L-γ-아미노 부티르산*, L-α-아미노이소부티르산*, L-ε아미노 카프르산#, 7-아미노 헵탄산*, L-메티오닌 술폰#*, L-노르류신*, L-노르발린*, p-니트로-L-페닐알라닌*, L-히드록시프롤린#, L-티오프롤린*, 페닐알라닌 (Phe)의 메틸 유도체, 예를 들면, 4-메틸-Phe*, 펜타메틸-Phe*, L-Phe (4-아미노)#, L-Tyr (메틸)*, L-Phe (4-이소프로필)*, L-Tic (1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린-3-카르복실산)*, L-디아미노프로피온산#및 L-Phe (4-벤질)*. 표시 *는 상기한 내용을 위하여 (동질성 또는 비동질성 치환에 관한) 유도체의 소수성을 나타내는데 사용된 반면, #는 유도체의 친수성을나타내는데 사용되었고, #*는 양친매성 성질을 나타낸다.
변이 아미노산 서열은 글리신 또는 β-알라닌 잔기와 같은 아미노산 스페이서 외에, 서열들 중의 임의의 2개의 아미노산 잔기들 사이에 삽입될 수 있고 메틸, 에틸, 또는 프로필기와 같은 알킬기를 포함하는 적합한 스페이서기를 포함할 수 있다. 펩토이드 형태의 1개 이상의 아미노산 잔기가 존재하는 추가의 변이 형태는 당업계의 통상의 숙련인에 의해 잘 이해될 것이다. 의구심을 없애기 위하여, "펩토이드 형태"는 α-탄소 치환체 기가 α-탄소 이외의 잔기의 질소 원자 상에 있는 변이 아미노산 잔기를 말하는 데 사용된다. 펩토이드 형태의 펩티드를 제조하기 위한 방법들은 당업계, 예를 들면 문헌 [Simon RJ et al., PNAS (1992) 89(20), 9367-9371 and Horwell DC, Trends Biotechnol. (1995) 13(4), 132-134]에 공지되어 있다.
혼성화
본 발명은 또한 약제가 안티-센스 서열인 경우와 같이, 본 명세서에서 제공된 표적 서열에 혼성화할 수 있는 서열들의 사용을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "혼성화"은 "핵산의 한 가닥이 염기쌍 형성하기를 통해 상보적 가닥과 결합하게 되는 방법", 뿐만 아니라 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 기술로 수행될 때의 증폭 방법을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 제공된 뉴클레오티드 서열, 또는 그들의 상보서열에 선택적으로 혼성화할 수 있는 본 발명의 뉴클레오티드 서열은 일반적으로 20개 이상, 바람직하게는 25 또는 30개 이상, 예를 들면 40, 60 또는 100개 이상의 연속 뉴클레오티드들의 영역에 걸쳐 본 명세서에서 제공된 상응하는 상보적 뉴클레오티드 서열에 대하여 75% 이상, 바람직하게는 85 또는 90% 이상, 및 보다 바람직하게는 95% 또는 98% 이상의 상동성이게 된다. 본 발명의 바람직한 뉴클레오티드 서열은 본 발명의 서열 목록의 서열번호 2에 기재한 뉴클레오티드 서열에 대해 상동성인, 바람직하게는 본 발명의 서열 목록의 서열번호 2에 기재한 뉴클레오티드 서열에 대해 80 또는 90% 이상 및 보다 바람직하게는 95% 이상 상동성인 영역을 포함하게 된다.
용어 "선택적으로 혼성화할 수 있는"은 뉴클레오티드 서열이 프로브로서 사용될 때, 본 발명의 표적 뉴클레오티드 서열이 배경보다 상당히 높은 수준으로 프로브에 혼성하는 것으로 밝혀진 조건 하에서 사용되는 것을 의미한다. 다른 뉴클레오티드 서열들이, 예를 들면 스크리닝되는 게놈 DNA 라이브러리 또는 cDNA 중에 존재하기 때문에 배경 혼성화가 일어날 수 있다. 이러한 사건에서, 배경은 표적 DNA를 사용하였을 때 관찰되는 특이적 상호작용의 세기보다 10배 적은, 바람직하게는 100배 적은, 라이브러리의 비특이적 DNA 구성원과 프로브 사이의 상호작용에 의해 생성된 신호 수준을 암시한다. 상호작용의 세기는 예를 들면, 프로브를 예를 들면32P로 방사능표지시킴으로써 측정될 수 있다.
혼성화 조건은 버거 (Berger) 및 키멜 (Kimmel)의 문헌 [1987, Guide to Milecular Cloning Techniques, Methods in Enzymeology, Vol 152, Academic Press, San Diego CA]에 설명되어 있는 바와 같이, 핵산 결합 복합체의 용융 온도(Tm)에 기초하고, 아래에서 설명되는 바와 같이 정의된 "엄격도"을 부여한다.
최대 엄격도는 대표적으로 약 Tm-5 ℃ (프로브의 Tm보다 5 ℃ 아래)에서 발생되고; 높은 엄격도는 Tm보다 약 5 내지 10 ℃ 아래에서이고, 중간 엄격도는 Tm보다 약 10 내지 20 ℃ 아래에서이고, 및 낮은 엄격도는 Tm보다 약 20 내지 25 ℃ 아래에서이다. 당업계의 통상의 숙련인이 알 수 있는 바와 같이, 엄격도가 최대인 혼성화는 동일한 뉴클레오티드 서열들을 확인하거나 검출하는 데 사용될 수 있는 반면, 엄격도가 중간 (또는 낮은)인 혼성화는 유사하거나 연관된 폴리뉴클레오티드 서열들을 확인하거나 검출하는 데 사용될 수 있다.
바람직한 면에서, 본 발명은 엄격조건 (예를 들면, 65 ℃ 및 0.1 x SSC {1 x SSC = 0.15 M NaCl, 0.015 M Na3시트레이트 pH 7.0) 하에서 본 발명의 뉴클레오티드 서열에 혼성될 수 있는 뉴클레오티드 서열들을 포함한다. 본 발명의 뉴클레오티드 서열이 이중 가닥일 경우, 개별적으로 또는 혼합된 2개의 가닥들 모두 본 발명에 포함된다. 뉴클레오티드 서열이 단일 가닥일 경우, 그 뉴클레오티드 서열의 상보적 서열도 본 발명의 영역 내에 포함됨을 알아야 한다.
본 발명의 서열과 100% 상동성이지는 않지만, 본 발명의 영역 내에 속하는 뉴클레오티드 서열들은 수많은 방법으로 얻어질 수 있다. 본 명세서에서 기재한 서열들의 다른 변이체들도 예를 들면 광범위의 공급원으로부터 제조된 DNA 라이브러리를 프로빙함으로써 얻어질 수 있다. 또한, 포유동물 세포 (예를 들면, 래트, 마우스, 소 및 영장류 세포) 중에 발견되는 다른 바이러스/박테리아 또는 세포 동족체, 특히 세포 동족체들이 얻어질 수 있고, 이러한 동족체 및 그들의 단편들은 일반적으로 본 명세서의 서열 목록에 나타낸 서열들에 선택적으로 혼성될 수 있다. 상기 서열들은 다른 동물 종으로부터 얻은 게놈 DNA 라이브러리, 또는 다른 동물 종으로부터 제조한 cDNA 라이브러리를 프로빙시키고, 상기 라이브러리를 본 명세서에서 기재한 뉴클레오티드 서열 전체 또는 일부분을 포함하는 프로브로 중간 내지 높은 엄격조건 하에서 프로빙시켜 얻을 수 있다. 본 발명의 뉴클레오티드 서열 및(또는) 아미노산의 종 동족체 및 대립유전자 변이체를 얻는 데 유사한 고려사항들이 적용된다.
변이체 및 균주/종 동족체는 또한 본 발명의 서열 내에 보존성 아미노산 서열을 코딩하는 변이체 및 동족체 내의 서열을 표적으로 하도록 디자인된 프라이머를 사용하게 되는 변성 PCR를 사용하여 얻을 수 있다. 보존성 서열은 예를 들면, 수 개의 변이체/동족체로부터의 아미노산 서열들을 정렬시킴으로서 예측할 수 있다. 서열 정렬은 당업계에 공지된 컴퓨터 프로그램을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들면 GCG 위스콘신 파일업 프로그램이 널리 사용된다. 변성 PCR에 사용된 프라이머들은 1개 이상의 변성 위치를 함유하게 되고, 공지된 서열에 대한 단일 서열 프라이머로 서열을 클로닝시키는데 사용된 것보다 낮은 엄격조건에서 사용되게 된다.
별법으로는, 상기 뉴클레오티드 서열들은 특성화된 서열, 예를 들면 본 발명의 서열 목록 중의 서열번호 2에 기재된 뉴클레오티드 서열의 부위 유래 돌연변이 유발에 의해 얻을 수 있다. 이것은 예를 들면 유클레오티드 서열들이 발현되는 특정 숙주 세포에 대한 코돈 선호도를 최적화시키기 위해 서열에 대한 침묵 코돈 변화가 필요한 경우에 유용할 수 있다. 제한 효소 인식 부위를 도입시키거나 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 단백질의 활성을 변화시키기 위해 다른 서열 변화가 요망될 수 있다.
본 발명의 뉴클레오티드 서열들을 사용하여 프라이머, 예를 들면 PCR 프라이머, 별법의 증폭 반응용 프라이머, 프로브, 예를 들면 방사능 또는 비방사능 표지를 사용하는 통상적인 방법에 의해 표식 표지로 표지시킨 프로브를 생성시킬 수 있거나 뉴클레오티드 서열들을 벡터 내로 클로닝시킬 수 있다. 상기 프라이머, 프로브 및 다른 단편들은 길이가 적어도 15, 바람직하게는 적어도 20, 예를 들면 적어도 25, 30 또는 40 뉴클레오티드일 것이고, 본 명세서에서 사용된 본 발명의 뉴클레오티드 서열이라는 용어에 역시 포함된다.
본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열, 예를 들면 DNA 폴리뉴클레오티드 및 프로브들은 재조합에 의해, 합성에 의해 또는 당업계의 통상의 숙련인이 사용할 수 있는 임의의 수단에 의해 생성될 수 있다. 이들은 표준 기술에 의해 클로닝될 수도 있다.
일반적으로, 프라이머들은, 한 번에 한 개의 뉴클레오티드씩 소정의 핵산 서열의 단계별 제조를 포함하는, 합성 방법에 의해 생성되게 된다. 자동화 기술을 사용하여 이를 달성하기 위한 기술들은 당업계에서 용이하게 입수할 수 있다.
보다 긴 뉴클레오티드 서열들은 일반적으로 재조합 수단을 사용하여, 예를 들면 PCR (중합효소 연쇄 반응) 클로닝 기술을 사용하여 제조되게 된다. 이것은클로닝되는 것이 바람직한 표적 서열의 영역에 인접하는 한 쌍의 프라이머들 (예를 들면, 약 15 내지 30 뉴클레오티드)을 제조하고, 프라이머를 동물 또는 인간 세포로부터 얻은 mRNA 또는 cDNA와 접촉시키고, 소정의 영역의 증폭을 초래하는 조건 하에서 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 수행하고, 증폭된 단편을 단리시키고 (예를 들면, 아가로스 겔 상에서 반응 혼합물을 정제시킴으로써), 및 증폭된 DNA를 회수하는 것을 포함한다. 프라이머들은 증폭된 DNA가 적합한 클로닝 벡터 내로 클로닝될 수 있도록 적합한 제한 효소 인식 부위를 함유하도록 디자인될 수 있다.
유전자 코드의 고유 디제너러시 때문에, 실질적으로 동일한 또는 기능적으로 등가의 아미노산 서열을 코딩하는 다른 DNA 서열들을 사용하여 표적 서열들을 클로닝하고 발현시킬 수 있다. 당업계의 통상의 숙련인이 이해할 수 있는 바와 같이, 자연적으로 발생하지 않는 코돈을 갖는 표적 서열들을 생성시키는 것이 유리할 수 있다. 특정 원핵 또는 진핵 숙주에 의해 선호되는 코돈 [Murry Eet al(1989) Nuc Acids Res 17:477-508]이 예를 들면 바람직한 특성, 예를 들면 자연적으로 발생되는 서열로부터 생성된 전사체보다 반감기가 더욱 긴 재조합 RNA 전사체를 생성시키거나 표적 발현 속도를 증가시키기 위해 선택될 수 있다.
발현 벡터
표적을 발현시키기거나 표적으로 사용하기 위한 뉴클레오티드 서열은 재조합 복제가능한 벡터 내로 삽입될 수 있다. 벡터를 사용하여 상용성이 있는 숙주 세포 중에 및(또는) 숙주 세포로부터 뉴클레오티드 서열을 복제시키고 발현시킬 수 있다. 발현은 프로모터/인헨서 및 다른 발현 조절 신호를 포함하는 조절 서열을 사용하여 조절될 수 있다. 원핵 프로모터 및 진핵 세포 중에서 기능적인 프로모터가 사용될 수 있다. 조직 특이적 또는 자극 특이적 프로모터가 사용될 수 있다. 상기한 2개 이상의 상이한 프로모터들로부터의 서열 요소들을 포함하는 키메릭 프로모터도 사용될 수 있다.
숙주 재조합 세포에 의해 뉴클레오티드 서열의 발현에 의해 생성된 단백질은 사용된 서열 및(또는) 벡터에 따라 분비되거나 세포내에 함유될 수 있다. 코딩 서열은 특정 원핵 또는 진핵 세포막을 통해 물질 코딩 서열들의 분비를 지시하는 신호 서열을 갖도록 디자인될 수 있다.
융합 단백질
표적 아미노산 서열은 예를 들면 추출 및 정제를 돕기 위하여 융합 단백질로서 생성될 수 있다. 융합 단백질 파트너의 예로는 글루타치온-S-트랜스퍼라제 (GST), 6xHis, GAL4 (DNA 결합 및(또는) 전사 활성화 영역) 및 β-갈락토시다제를 들 수 있다. 융합 단백질 서열의 제거가 가능하도록 관심을 갖는 단백질 서열 및 융합 단백질 파트너 사이에 단백질분해성 절단 부위를 포함하는 것 역시 편리할 수 있다. 바람직하게는 융합 단백질은 표적의 활성을 방해하지 않는다.
융합 단백질은 본 발명의 물질에 융합된 항원 또는 항원 결정자를 포함할 수 있다. 이 실시형태에서는, 융합 단백질은 면역계의 일반화된 자극을 제공한다는 점에 있어서 보조제로서 작용할 수 있는물질을 포함하는 자연적으로 발생되지 않는 융합 단백질일 수 있다. 항원 또는 항원 결정자는 물질의 아미노 또는 카르복시 말단에 부착될 수 있다.
본 발명의 다른 실시형태에서는, 아미노산 서열이 융합 단백질을 코딩하는 이종성 서열에 연결될 수 있다. 예를 들면, 펩티드 라이브러리를 물질 활성에 영향을 미칠 수 있는 약제에 대하여 스크리닝하는 경우, 상업적으로 입수가능한 항체에 의해 인식되는 이종성 에피토프를 발현시키는 키메릭 물질을 코딩하는 데 유용할 수 있다.
항체
본 발명의 한 실시형태에서, 본 발명의 약제는 항체일 수 있다. 또한, 별법으로, 본 발명의 표적은 항체일 수 있다. 또한, 별법으로, 본 발명의 표적을 검출하기 위한 수단이 항체일 수 있다.
항체는 표준 기술에 의해, 예를 들면 본 발명의 물질을 이용한 면역화에 의해 또는 상 표시 라이브러리를 사용하여 생성될 수 있다.
본 발명의 목적상, 용어 "항체"는 다르게 언급하지 않는 한, 다중클론, 단일클론, 키메라, 단일 사슬, Fab 단편, Fab 발현 라이브러리에 의해 생성된 단편 뿐만 아니라 이들의 유사물을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 상기 단편들은 표적 물질에 대한 그들의 결합 활성을 보유하는 전체 항원의 단편, Fv, F(ab') 및 F(ab')2단편 뿐만 아니라 단일 사슬 항체 (scFv), 융합 단백질 및 항체의 항원 결합 부위를 포함하는 다른 합성 단백질을 포함한다. 또한, 항체 및 그들의 단편은 인간화 항체일 수 있다. 중화 항체, 즉 물질 폴리펩티드의 생물학적 활성을 억제하는 것이 진단 및 치료에 특히 바람직하다.
다중클론 항체가 요망되는 경우, 선택된 포유동물 (예를 들면, 마우스, 토끼, 염소, 말 등)을 확인된 약제 및(또는) 본 발명의 물질로부터 얻을 수 있는 에피토프(들)를 함유하는 면역원성 폴리펩티드로 면역화시킨다. 숙주 종에 따라, 다양한 보조제들을 사용하여 면역학적 반응을 증가시킬 수 있다. 이러한 보조제들로는 프로인트보조액, 무기 겔, 예를 들면 수산화알루미늄 및 계면활성제, 예를 들면 리소레시틴, 플루로닉 폴리올, 폴리음이온, 펩티드, 오일 유화액, 열쇠구멍 림펫 헤모시아닌, 및 디니트로페놀을 들 수 있으나, 이들로 제한되지는 않는다. BCG [바실리 칼메테-구에린 (Bacilli Calmette-Guerin)] 및 코리네박테륨 파르붐 (Corynebacterium parvum)은 전신 방어를 자극하기 위하여 면역학적으로 손상된 개체에 정제된 물질 폴리펩티드를 투여하는 경우에, 사용될 수 있는 잠재적으로 유용한 인간 보조제이다.
면역시킨 동물로부터의 혈청을 수집하여 공지된 방법에 따라 처리하였다. 확인된 약제 및(또는) 본 발명의 물질로부터 얻을 수 있는 에피토프에 대한 다중클론 항체를 함유하는 혈청이 다른 항원에 대한 항체를 함유하는 경우, 다중클론 항체들은 면역친화성 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 다중클론 항혈청을 생성시키고 가공하기 위한 기술은 당업계에 공지되어 있다. 또한, 상기 항체가 제조될 수 있도록 하기 위하여, 본 발명은 동물 또는 인간에서 면역원으로 사용하기 위해 다른 폴리펩티드에 합텐화된 본 발명의 폴리펩티드 또는 그의 단편들을 제공한다.
본 발명의 물질 및(또는) 확인된 약제로부터 얻을 수 있는 에피토프에 대해유도된 단일클론 항체는 또한 당업계의 통상의 숙련인에 의해 용이하게 생성될 수 있다. 하이브리도마에 의해 단일클론 항체를 제조하는 일반적인 방법이 공지되어 있다. 중요한 항체-생성 세포주는 세포 용합에 의해 생성될 수 있고, 또한 다른 기술, 예를 들면 종양 DNA를 사용한 B 임파구의 직접적인 형질전환 또는 엡스타인-바르 (Epstein-Barr) 바이러스를 사용한 형질감염에 의해서도 생성될 수 있다. 궤도 에피토프에 대해 생성된 단일클론 항체의 패널들을 각종 특성에 대하여, 즉 동형물질 및 에피토프 친화력에 대하여 스크리닝할 수 있다.
본 발명의 물질 및(또는) 확인된 약제에 대한 단일클론 항체는 배양물 중의 연속 세포주에 의해 항체 분자의 생성을 제공하는 임의의 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 이들로는, 쾰러 및 밀스타인 (Koehler and Milstein)이 처음 설명한 하이브리도마 기술 (1975 Nature 256:495-497), 인간 B-세포 하이브리도마 기술 [Kosboret al(1983) Immunol Today 4:72; Coteet al(1983) Proc Natl Acad Sci 80:2026-2030] 및 EBV-하이브리도마 기술 [Coleet al(1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R Liss Inc, pp 77-96]을 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 또한, "키메릭 항체"의 제조를 위해 개발된 기술, 적절한 항원 특이성 및 생물학적 활성을 갖는 분자를 얻기 위하여 사람의 항체 유전자에 대한 생래트 항체 유전자의 스플라이싱이 사용될 수 있다 [Morrisonet al(1984) Proc Natl Acad Sci 81:6851-6855; Neubergeret al(1984) Nature 312:604-608; Takedaet al(1985) Nature 314:452-454]. 별법으로는, 단일 사슬 항체의 생성에 대해 설명된 기술 (US 특허 No. 4,946,779)을 사용하여 단일 사슬항체에 특이적인 물질을 생성시킬 수 있다.
본 발명의 물질 및(또는) 확인된 약제로부터 얻을 수 있는 에피토프에 대하여 유도된, 단일클론 및 다중클론 항체가 진단에 특히 유용하고, 중화된 것이 수동 면역요법에 유용하다. 특히, 단일클론 항체를 사용하여 항-개별특이형 항체를 발생시킬 수 있다. 항-개별특이형 항체는 이에 대한 보호를 필요로 하는 물질 및(또는) 약제의 "내부 상"을 갖는 면역글로불린이다.
항-개별특이형 항체를 발생시키기 위한 기술이 당업계에 공지되어 있다. 이들 항-개별특이형 항체도 치료에 유용할 수 있다.
항체들은 또한 임파구 집단 중에서의 생체내 생성을 유도함으로써, 또는 올란디 (Orlandi) 등 (1989, Proc Natl Acad Sci 86: 3833-3837) 및 윈터 및 밀스타인 (Winter D and Milstein C) (1991; Nature 349:293-299)이 발표한 바와 같이 고 특이성 결합 약제의 패널 또는 재조합 면역글로불린 라이브러리를 스크리닝함으로써 생성될 수 있다.
물질에 대해 특이성 결합 부위를 함유하는 항체 단편들도 생성될 수 있다. 예를 들면, 상기 단편들로는, 항체 분자의 펩신 소화에 의해 생성될 수 있는 F(ab')2단편 및 F(ab')2단편들의 디술파이드 결합을 감소시킴으로써 생성될 수 있는 Fab 단편을 들 수 있으나, 이들로 제한되지는 않는다. 별법으로는, Fab 발현 라이브러리를 구축하여 바람직한 특이성을 갖는 단일클론 Fab 단편의 신속하고 용이한 확인을 가능하게 할 수 있다 [Huse WDet al(1989) Science 256:1275-1281].
리포터
광범위의 리포터들이 본 발명의 분석 방법 (뿐만 아니라 스크린)에 사용될 수 있으며, 편리하게 겸출할 수 있는 신호를 제공하는 (예를 들면, 분광분석법에 의해) 리포터가 바람직하다. 예로서, 리포터 유전자는 흡광 특성을 변화시키는 반응을 촉매하는 효소를 코딩할 수 있다.
리포터 분자의 예로는 β-갈락토시다제, 인버타제, 그린 형광 단백질, 루시페라제, 클로람페니콜, 아세틸트랜스퍼라제, β-글루쿠로니다제, 엑소-글루카나제 및 글루코아밀라제를 들 수 있으나, 이들로 제한되지는 않는다. 별법으로는, 방사능표지된 또는 형광 꼬리-표지된 뉴클레오티드를 미완성 전사체 내로 삽입시킨 다음 올리고뉴클레오티드 프로브에 결합되었을 때 확인할 수 있다.
한 바람직한 실시형태에서, 리포터 분자의 생성은 예를 들면 β-갈락토시다제와 같은 리포터 유전자 생성물의 효소 활성에 의해 측정된다.
예를 들면, 단백질에 특이성인 다중클론 또는 단일클론 항체를 사용하는 것과 같은, 표적의 발현을 검출하고 측정하기 위한 다양한 프로토콜들이 당업계에 공지되어 있다. 예로서 효소결합 항체면역 측정법 (ELISA), 방사면역분석시험 (RIA) 및 형광 활성화 세포 선별 (FACS)을 들 수 있다. 폴리펩티드 상의 2개의 비간섭 에피토프에 반응성인 단일클론 항체를 사용하는 2개의 부위 단일클론 기재 면역분석이 바람직하지만, 경쟁 결합 분석이 사용될 수 있다. 이들 및 다른 분석법들이 특히 문헌 [Hampton Ret al(1990, Serological Methods, A Laboratory Manual,APS Press, St Paul MN) 및 Maddox DEet al(1983, J Exp Med 15:8121 1]에 기재되어 있다.
다양한 표지 및 접합 기술들이 당업계의 통상의 숙련인에게 공지되어 있으며, 다양한 핵산 및 아미노산 분석에 사용될 수 있다. 표지된 혼성화 또는 표적 폴리뉴클레오티드를 검출하기 위한 PCR 프로브를 생성시키기 위한 방법으로는, 올리고표지화, 닉 번역, 말단-표지화 또는 표지된 뉴클레오티드를 사용하는 PCR 증폭을 들 수 있다. 별법으로는, 코딩 서열 또는 그의 임의의 일부분을 mRNA 프로브를 생성시키기 위해 벡터 내로 클로닝시킬 수 있다. 이러한 벡터들은 당업계에 공지되어 있으며, 상업적으로 입수가능하고, 적절한 RNA 중합효소, 예를 들면 T7, T3 또는 SP6 및 표지된 뉴클레오티드의 첨가에 의해 RNA 프로브를 시험관내 합성시키는 데 사용할 수 있다.
수많은 회사, 예를 들면 파마시아 바이오테크 (Pharmacia Biotech; Piscataway, NJ), 프로메가 (Promega; Medison, WI) 및 유에스 바이오케미칼 코포레이션 (US Biochemical Corp; Cleveland, OH)이 시판되는 키트 및 이들 방법에 대한 프로토콜을 공급하고 있다. 적합한 리포터 분자 또는 표지들로는, 이들 방사성뉴클리드, 효소, 형광, 화학발광, 또는 색소 생산제 뿐만 아니라 기질, 보조인자, 억제제, 자성 입자 등을 들 수 있다. 상기 표지들의 사용을 설명하는 특허들로는 US-A-3817837; US-A-3850752; US-A-3939350; US-A-3996345; US-A-4277437; US-A-4275149 및 US-A-4366241을 들 수 있다. 또한, 재조합 면역글로불린을 US-A-4816567에 나타낸 바와 같이 제조할 수 있다.
입상 분자의 발현을 정량화하기 위한 추가의 방법들로는 방사능표지 (Melby PCet al1993 J Immunol Methods 159:235-44) 또는 비오티닐화 (Duplaa Cet al1993 Anal Biochem 229-36) 뉴클레오티드, 대조군 핵산의 동시증폭 및 실험 결과들이 그 위에 내연장된 표준 곡선을 들 수 있다. 다수개의 샘플들의 정량화는, 관심을 갖는 올리고머가 다양한 희석율로 제공되고 분광계 또는 열량계 반응이 신속한 정량화를 제공하는 ELISA 포맷으로 분석을 시행함으로써 가속화될 수 있다.
비록 마커 유전자 발현의 존재/부재가 관심을 갖는 유전자 역시 존재한다는 것을 암시할지라도, 유전자의 존재 및 발현은 확인되어야 한다. 예를 들면, 뉴클레오티드 서열이 마커 유전자 서열 내에 삽입되는 경우, 이를 함유하는 재조합 세포는 마커 유전자 기능의 부재에 의해 확인될 수 있다. 별법으로는, 마커 유전자는 단일 프로모터의 조절 하에 표적 코딩 서열과 함께 세로로 1열이 되게 위치할 수 있다. 유도 또는 선별에 반응하는 마커 유전자의 발현 또한 일반적으로 표적의 발현을 나타낸다.
별법으로는, 표적에 대한 코딩 서열을 함유하고 표적 코딩 영역을 발현시키는 숙주 세포는 당업계의 통상의 숙련인에게 공지되어 있는 각종 방법에 의해 확인될 수 있다. 이들 방법으로는, DNA-DNA 또는 DNA-RNA 혼성화 및, 핵산 또는 단백질의 검출 및(또는) 정량화를 위한 막-기재, 용액-기재 또는 칩-기재 기술을 포함하는 단백질 생물학적 정량 또는 면역분석 기술을 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다.
cAMP 활성/농도에 대한 일반적인 분석
표적 약제가 cAMP를 상승작용시킬 수 있는 능력은 표적 농도의 두드러진 증가 또는 감소를 측정함으로써 확인될 수 있다. 또한, 별법으로, 표적 약제가 cAMP를 상승작용시킬 수 있는 능력은 cAMP 농도의 두드러진 증가를 측정함으로써 확인될 수 있다. 예로서, 스미스 (Smith) 등의 문헌 (1993; Appl. Biochem. Biotechnol. 41: 189-218)의 기술을 채택할 수 있다. 또한 cAMP를 측정하기 위한, 상업적으로 입수가능한 면역분석 키트가 있다 [예를 들면, 아머샴 인터내셔날 (Amersham International, Arlington Heights, IL) 및 듀퐁 (DuPont, Boston, MA)]. 적합한 cAMP 분석에 대한 세부내용은 실험 단락에 제공된다.
스크린
적절한 표적들 중의 1종 이상, 예를 들면 아미노산 서열 및(또는) 뉴클레오티드 서열을 각종 약물 스크리닝 기술들 중의 임의의 것에서 PcAMP를 확인하는 데 사용될 수 있다. 상기 시험에 사용된 표적은 용액 중에서 자유로울 수 있고, 고상 지지체에 부착되고, 세포 표면 상에서 운반되거나 세포내에 위치할 수 있다. 표적은 동물 모델 내에 있을 수 있는데, 이 때 상기 표적은 외인성 표적 또는 유도된 표적일 수 있다. 동물 모델은 비인간 동물 모델일 것이다. 표적 활성의 전폐 또는 시험되는 약제와 표적 사이의 결합 착제의 형성이 측정될 수 있다.
약물 스크리닝을 위한 기술들은 1984년 9월 13일에 공고된 제이슨 (Geysen)의 유럽 특허 출원 84/03564에 기재된 방법에 기초할 수 있다. 요약하면, 많은 수의 상이한 작은 펩티드 시험 화합물을 고상 지지체, 예를 들면 플라스틱 핀 또는일부 다른 표면 상에서 합성시킨다. 펩티드 시험 화합물을 적합한 표적 또는 그의 단편과 반응시키고, 세척시켰다. 이어서, 예를 들면 당업계에 공지된 방법들을 적절하게 채택하여 결합된 인자를 검출하였다. 정제된 표적은 또한 약물 스크리닝 기술에 사용하기 위하여 플레이트 상에 직접적으로 코팅될 수 있다. 별법으로는, 비-중성화 항체를 사용하여 펩티드를 붙잡아 고상 지지체 상에 고정화시킬 수 있다.
본 발명은 또한 표적과 결합할 수 있는 중성화 항체가 표적에 대한 결합에 대하여 시험 화합물과 특이적으로 경쟁하는, 경쟁 약물 스크리닝 분석법의 사용을 꾀한다.
다른 스크리닝 기술은 물질에 대한 적합한 결합 친화력을 갖는 약제의 고처리량 스크리닝 (HTS)을 제공하며, WO 84/03564에 상세하게 기재된 방법에 기초한다.
본 발명의 분석 방법들이 시험 화합물의 소규모 및 대규모 스크리닝 모두 및 정량적 분석에 적합할 것으로 예상된다.
따라서, 본 발명은 적합한 표적을 cAMP를 상승작용시키는 약제와 접촉시킨 다음 cAMP의 활성 및(또는) 농도를 측정하는 것을 포함하는, cAMP를 상승작용시키는 약제를 확인하는 방법에 관한 것이기도 하다.
본 발명은 또한 적합한 표적을 여성 성기에서 cAMP를 선택적으로 상승작용시키는 약제와 접촉시킨 다음 cAMP의 활성 및(또는) 농도를 측정하는 것을 포함하는, 여성 성기에서 cAMP를 선택적으로 상승작용시키는 약제를 확인하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 적합한 표적을 cAMP를 상승작용시키는 약제와 접촉시킨 다음 표적의 활성 및(또는) 농도를 측정하는 것을 포함하는, cAMP를 상승작용시키는 약제를 확인하는 방법에 관한 것이기도 하다.
본 발명은 또한 적합한 표적을 여성 성기에서 cAMP를 선택적으로 상승작용시키는 약제와 접촉시킨 다음 표적의 활성 및(또는) 농도를 측정하는 것을 포함하는, 여성 성기에서 cAMP를 선택적으로 상승작용시키는 약제를 확인하는 방법에 관한 것이다.
바람직한 면에서, 본 발명의 스크린은 적어도 하기하는 단계들을 (이와 동일한 연속 순서로 수행할 필요는 없음) 포함한다: (a) 후보 약제가 관련 활성 (예를 들면, PDEII 및(또는) NEP, 예를 들면 개 신장으로부터 얻은 NEP의 조절)을 갖는지를 확인하기 위하여 시험관내 스크린을 수행하는 단계, (b) 상기 후보 약제의 선택성을 확인하기 위하여 (예를 들면 본 명세서에서 제공된 분석 프로토콜을 사용하여, 상기 약제가 역시 ACE 억제제인지를 알아보기 위하여), 1개 이상의 선택성 스크린을 수행하는 단계, 및 (c) 상기 후보 약제를 사용하여 생체내 스크린 (예를 들면, 기능성 동물 모델을 사용하여)을 수행하는 단계. 대표적으로는, 상기 후보 약제가 스크린 (a) 및 스크린 (b)를 통과하는 경우, 스크린 (c)를 수행한다.
진단
본 발명은 또한 FSAD의 소인에 대한 검출용 진단 조성물 또는 키트를 제공한다. 이와 관련하여, 조성물 또는 키트는 시험 샘플 중에 1종 이상의 표적이 존재함 (또는 심지어는 부재함)을 나타낼 수 있는 인자를 포함하게 된다. 바람직하게는, 시험 샘플을 여성 성기 또는, 그의 또는 그로부터 얻은 분비물로부터 얻는다.
예로서, 진단 조성물은 본 명세서에서 언급한 뉴클레오티드 서열 또는 그의 변이체, 동족체, 단편 또는 유도체, 또는 뉴클레오티드 서열들 중의 어느 하나의 일부 또는 전체에 혼성화할 수 있는 서열 중의 어느 하나를 포함할 수 있다.
질환의 진단용 기준을 제공하기 위하여, 표적으로부터 정상 또는 표준값을 설정하여야 한다. 이것은 동물이거나 인간인 정상 개체로부터 얻은 체액 또는 세포 추출물을 당업계에 공지되어 있는 복합체 형성에 적합한 조건 하에서 표적에 대한 항체와 혼합시킴으로써 수행될 수 있다. 표준 복합체 형성량은 공지된 양의 항체를 공지된 농도의 정제된 표적과 합한 양의 대조물의 일련의 희석물과 비교함으로써 정량화될 수 있다. 이어서, 정상 샘플로부터 얻은 표준값을 잠재적으로 FSAD에 걸린 개체의 샘플로부터 얻은 값과 비교할 수 있다. 표준과 개체 값 사이의 편차가 질환 상태의 존재를 확정짓는다.
표적 그자체 또는 그의 임의의 일부분은 진단 및(또는) 치료 화합물에 대한 기준을 제공할 수 있다. 진단용의 경우, 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 사용하여 FSAD가 관련될 수 있는 상태, 장애 또는 질환에서 유전자 발현을 검출 및 정량화할 수 있다.
표적 코딩 폴리뉴클레오티드 서열을 표적의 발현으로부터 알 수 있는 FSAD의 진단에 사용할 수 있다. 예를 들면, 표적을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 표적 발현에 있어서의 이상을 검출하기 위하여, 생검 또는 부검으로부터 얻은 조직또는 생체액의 PCR 분석 또는 혼성화에 사용될 수 있다. 상기 정성적 또는 정량적 방법들의 형태에는 서던 또는 노던 분석, 도트 블롯 또는 다른 막-기재 기술; PCR 기술; 딥 스틱, 핀 또는 칩 기술; 및 ELISA 또는 다른 다수개의 샘플 형식 기술이 포함될 수 있다. 이들 기술 모두는 당업계에 공지되어 있으며, 사실상 많은 상업적으로 입수가능한 진단 키트의 기본이다.
상기 분석들은 특정 치료 처리 섭생법의 효능을 평가하도록 맞춰질 수 있으며, 동물 연구에, 임상학적 시도에 또는 개별 환자의 치료를 모니터하는 데 사용될 수 있다. 질환의 진단용 기준을 제공하기 위하여, 표적 발현에 대한 정상 또는 표준 프로필을 설정하여야 한다. 이것은 동물이거나 인간인 정상 개체로부터 얻은 체액 또는 세포 추출물을 혼성화 또는 증폭에 적합한 조건 하에서 표적 또는 그의 일부분과 혼합시킴으로써 수행될 수 있다. 표준 혼성화는 공지된 양의 정제된 표적이 사용된 동일 실험으로 행한 양의 대조군의 일련의 희석물과 정상 개체로부터 얻은 값을 비교함으로써 정량화될 수 있다. 정상 샘플로부터 얻은 표준값을, 잠재적으로 표적 코딩 서열의 발현과 관계있는 장애 또는 질환에 걸린 개체로부터 얻은 샘플로부터 얻은 값과 비교할 수 있다. 표준과 개체 값 사이의 편차가 질환 상태의 존재를 확정짓는다. 질환이 확정되면, 기존의 치료제를 투여하여 치료 프로필 또는 값을 생성시킬 수 있다. 최종적으로, 값들이 정상 또는 표준 패턴을 향해 진전되거나 정상 또는 표준 패턴으로 되돌아가는지를 평가하기 위하여 분석을 규칙적인 기준으로 반복할 수 있다. 연속적인 치료 프로필을 사용하여 수 일 또는 수 개월의 기간에 걸친 치료의 효능을 나타낼 수 있다.
따라서, 한 면에서, 본 발명은 예를 들면 FSAD 상태에서의 표적 농도를 검출하고 정량화시키는 데 진단적으로 사용될 수 있는 항-표적 항체를 생성시키기 위한, 표적 폴리펩티드 또는 그의 변이체, 동족체, 단편 또는 유도체의 사용에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 양의 대조군으로 사용될 수 있는 정제된 표적 및 항-표적 항체를 포함하는, 세포 및 조직에서 표적을 검출하기 위한 진단용 분석법 및 키트를 제공한다. 상기 항체를 용액-기재, 막-기재 또는 조직-기재 기술에 사용하여 표적 단백질의 발현 또는 결실 또는 그의 변이체, 동족체, 단편 또는 유도체의 발현과 관계있는 임의의 질환 상태 또는 장애를 검출할 수 있다.
분석 방법
진단 조성물 및(또는) 방법 및(또는) 키트는 다음의 것을 포함하지만 이들로 제한되지는 않는 기술에 사용될 수 있다: 경쟁적 및 비-경쟁적 분석, 방사면역분석, 생체발광 및 화학발광 분석, 형광계 분석, 샌드위치 분석, 면역방사능 분석, 도트 블롯, ELISA를 포함하는 효소 결합 분석, 미세적정 플레이트, 뇨 또는 혈액의 신속한 모니터를 위한 항체 코팅된 스트립 또는 딥스틱, 면역조직화학 및 면역세포화학.
예로서, 면역조직화학 키트는 또한 성기 조직에서 NEP, PDE 또는 NPY 활성의 존재 확인에 사용될 수 있다. 이 면역조직화학 키트는 연구 및 임상학적 목적으로 사용될 수 있는 광 및 전자 현미경을 사용하여 조직 부분 및 배양된 세포 중에서의 NEP, PDE 또는 NPY의 존재 확인을 가능하게 한다. 이러한 정보는 FSD, 예를 들면FSAD의 검출 및(또는) 예방 및(또는) 치료에서 진단 및 가능하게는 치료 목적에 유용할 수 있다. 각 키트에 대하여, 분석법의 범위, 감응성, 정확도, 신뢰성, 특이성 및 재현가능성이 설정된다. 변위 또는 활성의 표준 곡선 상의 20%, 50% 및 80% 지점에서 분석내 및 분석간 변화량이 설정된다.
프로브
본 발명의 다른 면은 표적 코딩 영역 또는 밀접하게 관련된 분자, 예를 들면 대립유전자를 코딩하는, 게놈 서열을 비롯한 폴리뉴클레오티드 서열을 검출 (특히 선택적으로 선별할 수 있는 검출)할 수 있는 PCR 프로브 또는 핵산 혼성화를 제공하는 것이다. 대립유전자의 특이성, 즉, 프로브가 매우 보존적인, 보존적인 또는 비-보존적인 영역으로부터 유도되었는지 여부, 및 혼성화 또는 증폭의 엄격도 (높은, 중간 또는 낮은)이 프로브가 단지 자연적으로 발생되는 표적 코딩 서열 또는 관련 서열만을 확인하는지를 결정할 수 있을 것이다. 관련 핵산 서열의 검출을 위한 프로브는 표적군 구성원의 보존적 또는 매우 보존적인 뉴클레오티드 영역으로부터 선택되고, 상기 프로브는 변성 프로브의 풀 중에 사용될 수 있다. 동일한 핵산 서열의 검출을 위하여, 또는 최대의 특이성이 요구되는 경우, 핵산 프로브는 표적 뉴클레오티드의 비보존적 뉴클레오티드 영역 또는 독특한 영역으로부터 선택된다. 본 명세서에서 사용된 용어 "비보존적 핵산 영역"은 본 명세서에서 기재한 표적 코딩 서열에 대해서 특이적이고 관련군 구성원 중에서는 발생되지 않는 뉴클레오티드 영역을 말한다.
US-A-4683195, US-A-4800195 및 US-A-4965188에 기재된 바와 같은 PCR은 표적 서열에 기초한 올리고뉴클레오티드를 위한 추가 용도를 제공한다. 상기 올리고머들은 일반적으로 화학적으로 합성되지만, 이들은 재조합원으로부터 생성되거나 효소적으로 생성될 수 있다. 올리고머는 일반적으로 특이성 유전자 또는 조건의 확인을 위한 최적화된 조건 하에서 사용된, 센스 방향 (5'→3')인 것과 안티센스 방향 (3'←5')인 것의 2개의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 동일한 2개의 올리고머, 포개진 올리고머들의 세트 또는 올리고머들의 변성 풀이 밀접하게 관련된 DNA 또는 RNA 서열의 검출 및(또는) 정량화를 위한 보다 덜 엄중한 조건 하에서 사용될 수 있다.
표적에 대한 핵산 서열 또한 내인성 게놈 서열을 지도화하기 위한 상기한 바와 같은 혼성화 프로브를 생성시키는 데 사용될 수 있다. 서열은 공지된 기술을 사용하여 특정 염색체 또는 염색체의 특정 영역으로 지도화될 수 있다. 이들로는, 염색체 스프레드에 대한 원래 위치에서의 혼성화 [Verma et al (1988) Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York City], 흐름-분류된 염색체 제제 또는 인공 염색체 구성물, 예를 들면 YAC, 세균 인공 염색체 (BAC), 세균 PI 또는 단일 염색체 cDNA 라이브러리를 들 수 있다.
염색체 제제의 원래 위치에서의 혼성화 및 물리적 지도화 기술, 예를 들면 설정된 염색체 마커를 사용한 연결 분석은 유전자 지도를 연장시키는 데 있어서는 쓸모가 없다. 유전자 지도의 예들은 문헌 [Science 1995; 270:410f and 1994; 265:1981f]에서 찾아볼 수 있다. 비록 인간의 특정 염색체의 수 또는 암 (arm)이 공지되어 있지 않더라도, 종종 다른 포유동물 종의 염색체 상에서 유전자의 위치와관련된 마커들을 나타낼 수 있다. 새로운 서열들은 물리적인 지도화에 의해 염색체 암 또는 그의 일부에 부여될 수 있다. 이것은 위치 클로닝 또는 다른 유전자 발견 기술을 사용하여 질환 유전자에 대해 연구하는 연구자들에게 가치있는 정보를 제공한다. 일단 질환 또는 증후군이 유전자 연결에 의해 특정 게놈 영역으로 대략적으로 위치하게 되면, 그 영역에 대한 임의의 서열 지도화가 추가의 연구를 위한 관련 또는 조절 유전자를 나타낼 수 있다. 본 발명의 뉴클레오티드 서열은 또한 정상, 보균자 또는 감염된 개체들 사이의 전좌, 역위 등에 기인한 염색체 위치의 차이를 검출하는 데 사용될 수 있다.
숙주 세포
본 발명과 관련하여 용어 "숙주 세포"는 본 발명의 약제에 대한 표적을 포함할 수 있는 임의의 세포들을 포함한다.
따라서, 본 발명의 추가의 실시형태는 본 발명의 표적이거나 표적을 발현시키는 폴리뉴클레오티드로 형질전환된, 또는 형질감염된 숙주 세포를 제공한다. 바람직하게는, 상기 폴리뉴클레오티드는 표적이 되어야 하거나 표적을 발현시켜야 하는 폴리뉴클레오티드의 발현 및 복제를 위한 벡터 중에 운반된다. 세포들은 상기 벡터에 적합하도록 선택되게 되며, 예를 들면 원핵 (예를 들면, 세균), 진균, 효모 또는 식물 세포일 수 있다.
그람음성균인 대장균 (E. coli)이 이종성 유전자 발현을 위한 숙주로서 널리 사용된다. 그러나, 많은 양의 이종성 단백질은 세포내에 축적되기 쉽다. 후속되는 대장균 세포내 단백질 벌크로부터 소정의 단백질의 정제는 때때로 어려울 수 있다.
대장균과 대조적으로, 바실러스 (Bacillus) 속의 세균들은, 단백질을 배지내로 분비시키는 그들의 능력 때문에 이종 숙주로서 매우 적합하다. 숙주로서 적합한 다른 세균들은 스트렙토마이세스 (Streptomyces) 속 및 슈도모나스 (Pseudomonas) 속의 세균들이다.
본 발명에 따른 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 성질 및(또는) 발현된 단백질의 추가 처리에 대한 요망성에 따라, 진핵 세포, 예를 들면 효모 또는 다른 진균류가 바람직할 수 있다. 일반적으로, 효모 세포들은 조작하기가 보다 용이하기 때문에 진균 세포보다 바람직하다. 그러나, 몇몇 단백질들은 효모 세포로부터 거의 분비되지 않거나, 또는 몇몇 경우에는 적절하게 처리되지 않는다 (예를 들면 효모 중에서의 과당부가반응). 이들 경우에는 다른 진균 숙주 유기체가 선택되어야 한다.
본 발명의 영역 내에서 적합한 발현 숙주의 예로는 진균류, 예를 들면 아스페르길러스 (Aspergillus) 종 (예를 들면, EP-A-0184438 및 EP-A-0284603에 기재되어 있는 것) 및 트리코데르마 (Trichoderma) 종; 세균류, 예를 들면 바실러스 종 (예를 들면 EP-A-0134048 및 EP-A-0253455에 기재되어 있는 것), 스트렙토마이세스 종 및 슈도모나스 종; 및 효모, 예를 들면 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces) 종 (예를 들면 EP-A-0096430 및 EP-A-0301670에 기재되어 있는 것) 및 사카로마이세스 (Saccharomyces) 종을 들 수 있다. 예로서, 대표적인 발현 숙주는 아스페르길러스 니게르 (Aspergillus niger), 아스페르길러스 니게르 변종 투비게니스(Aspergillus niger var. tubigenis), 아스페르길러스 니게르 변종 아와모리 (Aspergillus niger var. awamori), 아스페르길러스 아쿨레아티스 (Aspergillus aculeatis), 아스페르길러스 니둘란스 (Aspergillus nidulans), 아스페르길러스 오르브자 (Aspergillus orvzae), 트리코데르마 리제이 (Trichoderma reesei), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 바실러스 리체니포르미스 (Bacillus licheniformis), 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 (Bacillus amyloliquefaciens), 클루이베로마이세스 락티스 (Kluyveromyces lactis) 및 사카로마이세스 세레비지아 (Saccharomyces cerevisiae)로부터 선택될 수 있다.
적합한 숙주 세포, 예를 들면 효모, 진균 및 식물 숙주 세포들의 사용은, 본 발명의 재조합 발현 생성물에 최적의 생물학적 활성을 부여할 필요가 있을 때 후번역 변형 (예를 들면, 미리스톨화, 절단, 당부가반응, 지질화 및 티로신, 세린 또는 트레오닌 포르포릴화)을 제공할 수 있다.
유기체
본 발명과 관련하여 용어 "유기체"는 본 발명에 따른 표적 및(또는) 그로부터 얻어지는 생성물을 포함할 수 있는 임의의 유기체를 포함한다. 유기체의 예로는 진균, 효모 또는 식물을 들 수 있다.
본 발명과 관련하여 용어 "유전자도입 유기체"는 본 발명에 따른 표적 및(또는) 얻어진 생성물을 포함하는 임의의 유기체를 포함한다.
숙주 세포/숙주 유기체의 형질전환
앞에서 언급한 바와 같이, 숙주 유기체는 원핵 또는 진핵 유기체일 수 있다.적합한 원핵 숙주의 예로는 대장균 및 바실러스 서브틸리스를 들 수 있다. 원핵 숙주의 형질전환에 대한 내용은 당업계에 잘 문서화되어 있다 [예를 들면, Sambrooket al(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press) 및 Ausubelet al., Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons, Inc. 참조].
원핵 숙주가 사용된다면, 뉴클레오티드 서열은 형질전환 전에 적합하게 변형되어야 한다 (예를 들면 인트론의 제거에 의해).
다른 실시형태에서, 유전자도입 유기체는 효모일 수 있다. 이와 관련하여, 효모는 또한 이종 유전자 발현용 비히클로서 널리 사용되어 왔다. 사카로마이세스 세레비지아 종은 그의 이종 유전자 발현용 용도를 포함하여 산업적 이용의 역사가 길다. 사카로마이세스 세레비지아에서 이종 유전자의 발현은 구디 (Goodey) 등의 문헌 (1987, Yeast Biotechnology, D R Berry et al, eds, pp 401-429, Allen and Unwin, London) 및 킹 (King) 등의 문헌 (1989, Molecular and Cell Biology of Yeasts, E F Walton and G T Yarronton, eds, pp 107-133, Blackie, Glasgow)에 설명되어 있다.
몇 가지 이유로, 사카로마이세스 세레비지아가 이종 유전자 발현에 매우 적합하다. 첫째, 인간에게 비병원성이며 특정 내독소를 생성시킬 수 없다. 둘째, 다양한 목적을 위한 수 세기 동안의 상업적인 개발에 따라 안전한 사용의 역사가 길다. 이것은 폭넓은 대중적 허용성을 이끌어 냈다. 세째, 이 유기체에 대해 행해진 집중적인 상업적 이용 및 연구는 사카로마이세스 세레비지아의 유전학 및 생리학 뿐만 아니라 대규모 발효 특성에 대한 풍부한 지식을 가져왔다.
사카로마이세스 세레비지아에서 이종 유전자 발현 및 생성물의 분비에 대한 원리에 관한 설명은 문헌 [E Hinchcliffe E Kenny 1993, "Yeast as a vehicle for the expression of heterologous genes", Yeasts, Vol. 5, Anthony H Rose and J Stuart Harrison, eds, 2nd edition, Academic Press Ltd.]에 제공되어 있다.
통합 벡터를 포함하여, 몇 가지 타입의 효모 벡터가 이용될 수 있으며, 이들은 그들의 보존을 위하여 숙주 게놈과의 재조합을 필요로 하고, 플라스미드 벡터를 자율적으로 복제한다.
유전자도입 사카로마이세스를 제조하기 위하여, 본 발명의 뉴클레오티드 서열을 효모에서의 발현을 위해 디자인된 구성물 내로 삽입시킴으로서 발현 구성물이 제조된다. 이종 발현에 사용된 몇가지 타입의 구성물이 개발되어 있다. 구성물은 본 발명의 뉴클레오티드 서열에 융합된 효모 중에서 활성인 프로모터를 함유하며, 일반적으로 효모 기원의 프로모터, 예를 들면 GAL1 프로모터가 사용된다. 일반적으로 효모 기원의 프로모터, 예를 들면 SUC2 신호 펩티드를 코딩하는 서열이 사용된다. 효모에서 활성화된 터미네이터로 발현 시스템이 끝난다.
효모방 형질전환을 위하여, 몇가지 형질전환 프로토콜이 개발되어 있다. 예를 들면, 본 발명의 유전자도입 사카로마이세스는 힌넨 (Hinnen) 등의 문헌 (1978, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 75, 1929), 벡스 (Beggs, J D) 등의 문헌 (1978, Nature, London, 275, 104); 및 이토 (Ito, H) 등의 문헌 (1983, J Bacteriology 153, 163-168)의 내용에 따라 제조할 수 있다.
형질전환된 효모 세포는 각종 선별 마커를 사용하여 선별한다. 형질전환에 사용된 마커들 중에는, 다수개의 영양요구 마커, 예를 들면 LEU2, HIS4 및 TRP1, 및 우성의 항생물질 내성 마커, 예를 들면 아미노글리코시드 항생물질 마커, 예를 들면 G418이 있다.
다른 숙주 유기체는 식물이다. 유전적으로 변형된 식물을 구성하는 데 기본적인 원리는 삽입된 유전 물질의 안정적인 보존을 얻기 위하여 유전 정보를 식물 게놈 내에 삽입시키는 것이다. 유전 정보를 삽입시키기 위한 몇 가지 기술이 존재하는데, 2가지 중요한 원리는 유전 정보의 직접적인 도입 및 벡터 시스템의 사용에 의한 유전 정보의 도입이다. 일반적인 기술에 대한 설명은 포트리쿠스 (Potrykus)의 문헌 (Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42:204-225) 및 크리스토우 (Christou)의 문헌 (Agro-Food-Industry-Hi-Tech March/April 1994 17-27)에서 찾아볼 수 있다. 식물 형질전환에 대한 추가의 기술은 EP-A-0449375에서 찾아볼 수 있다.
따라서, 본 발명은 표적이거나 표적을 발현시켜야 하는 뉴클레오티드 서열로 숙주 세포를 형질전환시키는 방법을 제공한다. 뉴클레오티드 서열로 형질전환된 숙주 세포를 세포 배지로부터 코딩된 단백질의 회수 및 발현에 적합한 조건 하에서 배양할 수 있다. 재조합 세포에 의해 생성된 단백질은 사용된 벡터 및(또는) 서열에 따라 분비되거나 세포내에 함유될 수 있다. 당업계의 통상의 기술자들이 알 수 있는 바와 같이, 코딩 서열을 함유하는 발현 벡터는 특정 원핵 또는 진핵 세포 막을 통한 코딩 서열의 분비를 지시하는 신호 서열이 있도록 디자인될 수 있다. 다른 재조합 구성물이 가용성 단백질의 정제를 용이하게 하는 폴리펩티드 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 대한 코딩 서열을 포함시킬 수 있다 [Kroll DJet al(1993) DNA Cell Biol 12:441-53].
제약 조성물
본 발명은 또한 치료 유효량의 본 발명의 약제 및 제약학상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제 (그들의 혼합물을 포함)를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
제약 조성물은 인체 및 수의학 의약품에서 인간 또는 동물용일 수 있으며, 대표적으로는 임의의 1종 이상의 제약학상 허용되는 희석제, 담체 또는 부형제를 포함하게 된다. 치료용으로 허용되는 담체 또는 희석제는 제약 업계에 공지되어 있으며, 예를 들면, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro edit. 1985)]에 기재되어 있다. 제약학적 담체, 부형제 또는 희석제의 선택은 의도한 투여 경로 및 표준 제약 관례에 관하여 선택될 수 있다. 제약 조성물은 담체, 부형제 또는 희석제로서 (또는 그 외에) 임의의 적합한 결합제(들), 윤활제(들), 현탁제(들), 코팅제(들), 용해제(들)을 포함할 수 있다.
방부제, 안정제, 염료 및 심지어는 풍미제가 제약 조성물 중에 제공될 수 있다. 방부제의 예로는 벤조산나트륨, 소르브산 및 p-히드록시벤조산의 에스테르를 들 수 있다. 항산화제 및 현탁제도 사용될 수 있다.
상이한 전달 시스템에 따라 상이한 조성물/제제 필요조건이 있을 수 있다. 예로서, 본 발명의 제약 조성물은 미니-펌프를 사용하여 또는 점막 경로에 의해, 예를 들면 흡입용 비강 스프레이 또는 에어로졸 또는 섭취할 수 있는 용액으로 또는, 조성물이 예를 들면 정맥내, 근육내 또는 피하 경로에 의해 전달되도록 주사가능한 형태로 제형화된 비경구로 전달되도록 제형화될 수 있다. 별법으로, 제제는 2가지 경로 모두에 의해 전달되도록 디자인될 수 있다.
약제가 위장 점막을 통해 점막으로 전달되는 경우, 위장관을 통한 이동 동안에 안정하게 유지될 수 있어야 하고, 예를 들면 산 pH에서 단백질 분해에 대해 저항성이고, 안정해야 하며, 담즙의 세정 효과에 대해 내성이어야 한다.
적절할 경우, 제약 조성물은 흡입에 의해, 좌약 또는 페사리의 형태로, 로션, 용액, 크림, 연고 또는 살포제의 형태로 국소적으로, 피부 패치의 사용에 의해, 전분 또는 락토오스와 같은 부형제를 함유하는 정제의 형태로, 또는 단독 또는 부형제와 함께 캡슐로 또는 포낭으로 경구로, 또는 풍미 또는 착색제를 함유하는 엘릭시르, 용액 또는 현탁액의 형태로 투여될 수 있거나 이들은 비경구로, 예를 들면 정맥내로, 근육내로 또는 피하로 주사될 수 있다. 비경구 투여의 경우, 조성물은 다른 물질, 예를 들면 용액을 혈액과 등장성으로 만들기 위하여 충분한 염 또는 단당류를 함유할 수 있는 멸균 수용액의 형태로 가장 잘 사용될 수 있다. 구강 또는 설하 투여의 경우, 조성물은 통상적인 방식으로 제형화될 수 있는 정제 또는 로젠지의 형태로 투여될 수 있다.
몇몇 실시형태의 경우, 본 발명의 약제는 또한 시클로덱스트린과 함께 사용될 수 있다. 시클로덱스트린은 약물 분자와 봉입 및 비봉입 복합체를 형성하는 것으로 알려져 있다. 약물-시클로덱스트린 복합체의 형성은 약물 분자의 용해도, 용해속도, 생체내 이용성, 및(또는) 안정성을 변화시킬 수 있다. 약물-시클로덱스트린 복합체는 일반적으로 대부분의 투여단위 형태 및 투여 경로에 유용하다. 약물과의 직접적인 복합체 형성에 대한 별법으로, 시클로덱스트린은 보조 첨가제로서, 예를 들면 담체, 희석제 또는 용해제로서 사용될 수 있다. 알파-, 베타- 및 감마-시클로덱스트린이 가장 일반적으로 사용되며, 적합한 예들은 WO-A-91/11172, WO-A-94/02518 및 WO-A-98/55148에 기재되어 있다.
바람직한 실시형태에서, 본 발명의 약제들은 전신적으로 (예를 들면, 경구로, 구강으로, 설하로), 보다 바람직하게는 경구로 전달된다.
따라서, 바람직하게는 약제는 경구 전달용으로 적합한 형태이다.
몇몇 실시형태의 경우, 바람직하게는 약제는 (사용중에) 중추 신경계에 작용하지 않는다.
몇몇 실시형태의 경우, 바람직하게는 약제는 (사용중에) 말초적으로 작용한다.
투여
용어 "투여된다"란 바이러스성 또는 비바이러스성 기술에 의한 전달을 포함한다. 바이러스성 전달 메카니즘은 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 및 바쿨로바이러스 벡터를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 비바이러스성 전달 메카니즘은 지질 매개 형질감염, 리포좀, 면역리포좀, 리포펙신, 양이온 안면 암피필 (CFA) 및 이들의 혼합물을 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다.
본 발명의 약제는 단독으로 투여될 수 있지만, 일반적으로 제약 조성물로서(예를 들면, 약제가 의도한 투여 경로 및 표준 제약 관례를 고려하여 선택된 적합한 제약학상 허용되는 부형제, 희석제 또는 담체와의 혼합물일 때) 투여된다.
예를 들면, 약제는 즉각적인, 지연된, 변형된, 지속적인, 펄스된 또는 조절된 방출 투여를 위하여 풍미 또는 착색제를 함유할 수 있는 정제, 캡슐, 포낭, 엘릭시르, 용액 또는 현탁액의 형태로 (예를 들면 경구로 또는 국소적으로) 투여될 수 있다.
정제는 부형제, 예를 들면 미결정질 셀룰로스, 락토오스, 구연산 나트륨, 탄산나트륨, 이염기성 인산칼슘 및 글리신, 붕해제, 예를 들면 전분 (바람직하게는 옥수수, 감자 또는 타피오카 전분), 글리콜산 전분 나트륨, 크로스카르멜로스 나트륨 및 특정 복합 실리케이트, 및 과립화 결합제, 예를 들면 폴리비닐피롤리돈, 히드록시프로필메틸셀룰로스 (HPMC), 히드록시프로필셀룰로스 (HPC), 슈크로오스, 젤라틴 및 아라비아검을 함유할 수 있다. 추가로, 윤활제, 예를 들면 스테아르산마그네슘, 스테아르산, 글리세릴 베헤네이트 및 활석이 포함될 수 있다.
유사한 타입의 고체 조성물은 또한 젤라틴 캡슐 중에서 충전제로서 사용될 수도 있다. 이와 관련하여 바람직한 부형제로는 락토오스, 전분, 셀룰로오스, 유당, 또는 고분자량 폴리에틸렌 글리콜을 들 수 있다. 수성 현탁액 및(또는) 엘릭시르의 경우, 약제는 각종 감미제 또는 풍미제, 착색 물질 또는 염료와, 유화 및(또는) 현탁제와 및 희석제, 예를 들면 물, 에탄올, 프로필렌 글리콜 및 글리세린, 및 이들의 혼합물과 합해질 수 있다.
투여 (전달)용 경로로는 경구 (예를 들면, 정제, 캡슐로서 또는 섭취가능한용액으로서), 국소, 점막 (예를 들면, 흡입용 비강 스프레이 또는 에어로졸), 비강, 비경구 (예를 들면 주사가능한 형태에 의해), 위장관, 척수내, 복강내, 근육내, 정맥내, 자궁내, 안내, 피부내, 두개내, 기관내, 질내, 뇌실내, 뇌내, 피하, 눈으로(초자체내 또는 안방내 포함), 경피, 직장, 구강, 질, 경막외의, 설하 중의 1종 이상을 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다.
모든 약제들이 반드시 동일한 경로에 의해 투여될 필요는 없음을 알아야 한다. 마찬가지로, 조성물이 1종 이상의 활성 성분을 포함한다면, 이들 성분들은 상이한 경로에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 약제가 비경구로 투여된다면, 이러한 투여의 예로는 약제를 정맥내, 동맥내, 복강내, 수막강내, 실내, 요도내, 흉골내, 두개내, 근육내 또는 피하로 및(또는) 관주 기술을 사용하여 투여하는 것을 포함한다.
비경구 투여의 경우, 약제는 다른 물질, 예를 들면 혈액과 등장성으로 만들기 위하여 충분한 염 또는 포도당를 함유할 수 있는 멸균 수용액의 형태로 가장 잘 사용된다. 수용액은 필요에 따라 적절하게 완충된다 (바람직하게는 3 내지 9의 pH로). 멸균 조건 하에서의 적합한 비경구 제제의 제조는 당업계의 통상의 숙련인에게 공지된 표준 제약 기술에 의해 용이하게 달성된다.
나타낸 바와 같이, 본 발명의 약제는 비강내로 또는 흡입에 의해 투여될 수 있으며, 편리하게는 적합한 분사제, 예를 들면 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 히드로플루오로알칸, 예를 들면1,1,1,2-테트라플루오로에탄 (HFA 134ATM) 또는 1,1,1,2,3,3,3-헵타플루오로프로판 (HFA 227EATM), 이산화탄소 또는 다른 적합한 가스의 사용과 함께 가압 용기, 펌프, 스프레이 또는 연무기로부터의 에어로졸 스프레이 제공 또는 건조 분말 흡입기의 형태로 전달된다. 가압 에어로졸의 경우, 투여 단위는 계량된 양을 전달하기 위한 밸브를 제공함으로써 결정될 수 있다. 가압 용기, 펌프, 스프레이 또는 연무기는 예를 들면 용매로서 에탄올 및 분사제의 혼합물을 사용하고, 추가로 윤활제, 예를 들면 소르비탄 트리올레에이트를 함유할 수 있는 활성 화합물의 용액 또는 현탁액을 함유할 수 있다. 흡입기 또는 공기흡입기 중에 사용하기 위한 캡슐 및 카트리지 (예를 들면 젤라틴으로부터 제조됨)는 적합한 분말 기재, 예를 들면 락토오스 또는 전분 및 약제의 분말 혼합물을 함유하도록 제형화될 수 있다.
별법으로는, 본 발명의 약제는 좌약 또는 페사리의 형태로 투여될 수 있거나 겔, 히드로겔, 로션, 용액, 크림, 연고 또는 살포제의 형태로 국소적으로 가해질 수 있다. 본 발명의 약제는 또한 예를 들면 피부 패치의 사용에 의해 피부로 또는 경피로 투여될 수 있다. 이들은 또한 폐 또는 직장 경로에 의해 투여될 수 있다. 이들은 또한 안 경로에 의해 투여될 수도 있다. 눈에 사용하기 위해서는, 화합물은 등장성의 pH 조절된 멸균 염수 중의 미분화된 현탁액으로서 또는 바람직하게는 등장성의 pH 조절된 멸균 염수 중의 용액으로서 임의로 방부제, 예를 들면 염화벤질알코늄과 함께 제형화될 수 있다. 별법으로, 이들은 와셀린과 같이 연고로 제형화될 수 있다.
피부에 국소적으로 도포하는 경우, 본 발명의 약제는 예를 들면 광유, 유동 파라핀, 백색 와셀린, 프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌, 폴리옥시프로필렌 화합물, 유화 왁스 및 물 중의 1종 이상과의 혼합물 중에 현탁되거나 용해된 활성 화합물을 함유하는 적합한 연고로 제형화될 수 있다. 별법으로는, 예를 들면 광유, 소르비탄 모노스테아레이트, 폴리에틸렌 글리콜, 유동 파라핀, 폴리소르베이트 60, 세틸 에스테르 왁스, 세테아릴 알콜, 2-옥틸도데카놀, 벤질 알콜 및 물 중의 1종 이상과의 혼합물 중에 현탁되거나 용해된 적합한 로션 또는 크림으로서 제형화될 수 있다.
본 발명의 조성물은 직접적인 주사에 의해 투여될 수 있다.
몇몇 적용의 경우, 바람직하게는 약제는 경구로 투여된다.
몇몇 적용의 경우, 바람직하게는 약제는 국소적으로 투여된다.
투여량
대표적으로는, 의사가 각 개인에 가장 적합한 실제 투여량을 결정하게 된다. 임의의 특정 환자에 대한 특정 투여량 및 투여 빈도수는 변화될 수 있으며, 사용된 특정 화합물의 활성, 대사 안정성 및 그 화합물의 작용 길이, 연령, 체중, 일반적인 건강상태, 성별, 식이요법, 투여 방식 및 시기, 배출 속도, 약물 혼합물, 특정 질환의 심흥분 및 개별 진행중인 치료법을 포함하는 각종 인자들에 의존하게 된다. 본 발명의 약제 및(또는) 제약 조성물은 1일 1 내지 10회, 예를 들면 1일 1회 또는 2회의 섭생법에 따라 투여될 수 있다.
인간 환자에 대한 경구 및 비경구 투여의 경우, 약제의 1일 투여량은 단일또는 분할 투여에 의할 수 있다.
필요에 따라, 약제는 0.01 내지 30 mg/kg 체중, 예를 들면 0.1 내지 10 mg/kg 체중, 보다 바람직하게는 0.1 내지 1 mg/kg 체중의 투여량으로 투여될 수 있다. 자연적으로, 본 명세서에서 언급된 투여량은 평균적인 경우의 예이다. 물론 보다 높거나 보다 낮은 투여량 범위가 요구되는 개별적인 경우들이 있을 수 있다.
제제
본 발명의 약제는 예를 들면 1종 이상의 적합한 담체, 희석제 또는 부형제와의 혼합에 의해, 당업계에 공지된 기술을 사용하여 제약 조성물로 제형화될 수 있다.
다음은 제제의 몇몇 비제한적인 예를 나타낸다.
제제 1: 하기하는 성분들을 사용하여 정제가 제조된다:
중량/mg
약제 250
셀룰로스, 미결정질 400
이산화규소, 흄드 10
스테아르산 5
합계 665
성분들을 혼합하고 압착시켜 각각 중량이 65 mg인 정제를 형성시킨다.
제제 2: 정맥내 제제는 다음과 같이 제조될 수 있다:
약제 100 mg
등장성 염수 1,000 ml
제약학상 활성 염
본 발명의 약제는 제약학상 허용되는 염으로서 투여될 수 있다. 대표적으로는, 제약학상 허용되는 염은 적절할 경우, 소정의 산 또는 염기를 사용하여 용이하게 제조될 수 있다. 염은 용액으로부터 침전되어 여과에 의해 수집될 수 있거나 용매의 증발에 의해 회수될 수 있다.
동물 시험 모델
생체내 모델을 사용하여 FSAD를 치료하기 위한 치료제 또는 치료법을 연구 및(또는) 디자인할 수 있다. 모델은 성적 흥분 반응을 나타내는 각종 파라미터들에 대한 각종 도구/유도 화합물의 효과를 고찰하는 데 사용될 수 있다. 이들 동물 시험 모델은 본 발명의 분석법으로서 또는 분석에 사용될 수 있다. 동물 시험 모델은 비인간 동물 시험 모델이다.
사용될 수 있는 맥관형성적 여성 성기능장애 (FSAD)에 대한 수많은 동물 모델이 이용가능하다.
예로서, 침입성 동물 모델을 참고로 할 수 있다 (예를 들면 Parket al., 1997 참조). 여기서, 질 및 음핵 혈액동력학적 반응은 정상 및 동맥경화증 암컷 토끼에서의 골반 신경 자극에 따라 직접적으로 기록될 수 있다. cAMP 상승작용제, 예를 들면 혈관확장제, 예를 들면 NPY 길항제 또는 VIP 효능제의 생체내 효과는 정상 또는 FSAD 동물에서 살펴볼 수 있다.
추가의 예로는 비침입성 동물 모델을 참고로 할 수 있다 (예를 들면, the review of Goldsteinet al., 1998; Laan et al., 1998 참조). 여기서, 펄스파 도플러 초음파촬영술은 질 및 음핵 동맥에서의 혈류량 변화를 검출할 수 있는 수단을 제공한다. 이 모델은 혈관확장제의 약물학적 투여 동안 맥관형성 효과를 조사하는데 사용될 수 있다.
사용될 수 있는 다른 비침입성 기술로는 질 점막 충혈의 정량적 척도를 제공하는 질 광혈량계, 및 일정한 온도로 유지된 질내 프로브로부터 멀어지는 열 전달량을 측정함으로써 질 혈류량 변화가 기록될 수 있다는 원리에 기초한, 질 열 청소율 기술을 들 수 있다.
성적 흥분의 동물 모델
본 발명자들의 연구에서 본 발명자들은 성적 흥분의 생리학의 확고한 재현가능한 모델을 개발하였다. 이 모델은 마취시킨 토끼를 사용하고, 심혈관 파라미터들을 일상적으로 기록하면서 성기 혈류량을 모니터하기 위하여 레이저 도플러 기술을 사용한다. 본 발명자들은 시험 약제의 존재하에 및 부재하에 VIP의 관주 또는 골반 신경 자극에 의해 유도된 질 (및 음핵) 혈류량의 작은 변화를 측정할 수 있다.
본 발명자들은 본 발명자들의 동물 모델이 임상적 데이타를 직접적으로 반영하는 것으로 생각한다. 따라서, 이 모델을 사용하여 FSAD 치료를 위한 후보 약제를 연구, 예를 들면 질 또는 음핵 혈류량의 향상을 측정할 수 있다.
여성 성적 흥분의 생리학적 측정
본 발명에 따라, 수많은 상이한 기술이 음핵 및 질 혈류량을 측정하는 데 사용될 수 있다. 예로서, 질 광혈량계, 질 열 청소 기술, 음핵 및 질 대비-향상 MRI, 음핵/외음부 레이저 도플러 펄스 영상화, 및 음핵 초음파촬영술을 사용할 수 있다.
질 윤활의 정량화는 또한 당업계에 공지된 기술에 의해, 예를 들면 (a) 자극 전 및 후에 질 탐폰의 중량을 칭량하고 및 (b) 질액의 pH를 측정함으로써 측정될 수 있다. 후자의 면에 관해서는, 질 내의 정상적인 정지 산 매질은 성적 자극 동안 액체의 누출이 일어날 때 혈액 pH에 근접함에 따라 보다 알칼리성으로 된다.
PDE (포스포디에스테라제)
본 발명의 한 면에 따라, PcAMP표적은 PDE (포스포디에스테라제)이다.
시클릭 뉴클레오티드, 예를 들면 cAMP 및 cGMP가 중요한 세포내 2차 메신저임이 공지되어 있다. 시클릭 뉴클레오티드 포스포디에스테라제 (다르게는 PDEs로 공지되어 있음)는 시클릭 뉴클레오티드의 분해를 촉매하고, 이렇게 함으로써 시클릭 뉴클레오티드의 농도를 조절하는 세포 성분들 중의 하나인 효소 군이다.
최근 수년 동안에, 적어도 7개의 PDE 효소 (예를 들면 PDEI-PDEVII), 뿐만 아니라 이들 효소의 많은 아형들이 기질 친화력 및 보조인자 요구조건을 기준하여 정의되었다 [Beavo JA and Reifsnyder DH, Trends Pharmacol. Sci. 11:150 (1990); Beavo J, In: Cyclic Nucleotide Phosphodiesterases: Structure, Regulation and Drug Action., Beavo J and Housley MD (Eds.). Wiley: Chichester, pp. 3-15 (1990)].
PDE의 예로는 Ca2+/칼모듈린 의존성 PDE인 PDEI; cAMP 및 cGMP 자극된 PDE인 PDEII; cGMP에 의해 억제되는 PDE인 PDEIII; 고친화력 cAMP-특이성 PDE인 PDEIV; 및 cGMP 특이성 PDE인 PDEV를 들 수 있다. PDEI 등은 때때로 PDE 타입 I 등, 또는PDE 타입 1 등으로 불린다.
각 PDE 군은 2개 이상의 동종형을 함유할 수 있다 (즉, 2개 이상의 PDE 동종효소가 있을 수 있다). 예로서, 드로소필라 둔스 (DrosophilaDunce) 유전자의 동족체인 포유동물 PDE IV [Chen CNet al., Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) 83:9313 (1986)]는 래트에서 4개의 동종형이 있는 것으로 알려져 있다 [Swinnen JVet al., Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) 85:5325 (1989)]. 인간의 PDE는 또한 동종형으로 발생하며 스플라이스 변이체가 있는 것으로 알려져 있다. 예를 들면, 단세포로부터의 PDEIV의 한 인간 동종형의 클로닝은 1990년에 [Livi GPet al., Mol. Cell. Bio., 10:2678 (1990)] 보고되었다. 추가의 예로서, 다른 연구자들은 PDEIV의 3개의 스플라이스 변이체들을 독립적으로 클로닝하였는데, 이들을 이제 hPDEIV-B1, hPDEIV-B2, 및 hPDEIV-B3으로 표시하였다.
시클릭 뉴클레오티드 포스포디에스테라제에 대한 지식은 또한 US-A-5932423 및 US-A-5932465에서 발견될 수도 있다.
추가의 시클릭 뉴클레오티드 포스포디에스테라제, 즉 CN PCDE8에 관한 지식은 WO-A-97/35989에서 찾아볼 수 있다. WO-A-97/35989에 따르면, CN PCDE8에는 2개의 동종효소가 있는데, 이들은 CN PCDE8A 및 CN PCDE8B로 표시되었다. 용어 "동종효소"느 때때로 당업계에서 "동종형"으로 언급된다.
WO-A-97/35989에 따르면, 상이한 PDE의 많은 억제제들이 확인되어 있고, 몇몇은 임상학적 평가를 행하고 있다. 예를 들면, PDEIII 억제제는 항혈전증제로서, 항고혈압제로서 및 울혈성 심부전증의 치료에 유용한 강심약제로서 개발되고 있다.PDEIII 억제제인 롤리프람은 우울증의 치료에 사용되어 왔고, PDEIII의 다른 억제제들은 소염제로서의 평가가 행해지고 있다. 롤리프람은 또한 시험관내에서 HIV-1 복제를 향상시키는 것으로 나타난 리포폴리사카라이드 (LPS)에 의해 유도된 TNF-알파를 억제하는 것으로 나타났다. 그러므로, 롤리프람은 HIV-1 복제를 억제할 수 있다 [Angelet al., 1995 AIDS 9:1137-44]. 추가로, TNF 알파 및 베타 및 인터페론 감마의 생성을 억제하는 그의 능력에 기초하여, 롤리프람은 뇌척수염의 치료에, 다발성 경화증에 대한 실험 동물 모델 [Sommeret al, 1995 Nat Med 1:244-248]에 효과적인 것으로 나타났으며, 만발성 운동장애의 치료에 효과적일 수 있다 [Sasakiet al, 1995 Eur J Phamacol 282:71-76].
WO-A-97/35989에 따르면, 기관지 천식 및 다른 호흡 질환의 치료에 사용된 테오필린, 및 간헐성 파행증 및 당뇨병 유도 말초 혈관 질환의 치료에 사용된 펜톡시필린과 같은 비특이적 PDE 억제제들도 있다. 테오필린은 기도 평활근 기능에 작용할 뿐만 아니라 염증성 또는 면역조절능으로 작용하는 것으로 생각되며[ Banneret al1995 Respir J 8:996-1000], 이 때 CN PDE cAMP 및 cGMP 가수분해 [Banneret al1995 Monaldi Arch Chest Dis 50:286-292]를 모두 억제시킴으로써 작용하는 것으로 생각된다. 역시 TNF-알파 생성을 막는 것으로 알려진 펜톡시필린은 HIV-1 복제를 억제할 수 있다 [Angelet al상기함]. CN PDE 억제제 목록이 상기한 문헌 [Beavo 1995]에 제공되어 있다.
PDE의 선택적 억제제, 뿐만 아니라 그들의 동종효소 및 그들의 아형이 부작용은 보다 적으면서 보다 효과적인 치료법을 유도하게 될 것이라고 제시되어 있다.예를 들면, 문헌 [Wieshaar RE et al, (J. Med. Chem., 28:537 [1985], Giembycz MA (Biochem. Pharm., 43:2041 [1992] 및 Lowe JA and Cheng JB (Drugs of the Future, 17:799-807 [1992])]의 내용을 참조할 수 있다.
따라서, 몇몇 적용의 경우 개별 타입의 PDE의 선택적 억제가 있는 것이 바람직하다.
PDE에 대한 배경 기술은 빅터 에이. 맥쿠식 (Victor A. McKusick) 등에 의해 http://www3.ncbi.nlm.nih.gov/Omim/searchomim.htm.에 제공되어 있다. PDE2 또는 cGMP-자극된 PDE에 관한 다음 정보는 그 원문으로부터 발췌된 것이다.
"시클릭 뉴클레오티드는 호르몬, 빛 및 신경전달물질과 같은 세포외 신호에 대한 각종 세포 반응을 매개하는 2차 메신저로서 작용한다. 시클릭 뉴클레오티드 포스포디에스테라제 (PDEs)는 시클릭 뉴클레오티드의 세포 농도를 조절함으로써 신호 전달체계에 한 역할을 한다. 포유동물 세포는 그들의 기질 친화력 및 그들의 보조인자 및 억제 약물에 대한 선택적 감응성에 기준하여 적어도 7개의 군과 구별되는 다수개의 PDE를 함유한다. 이들 군은 (I) Ca2+/칼모듈린 의존성 PDE; (II) cAMP 및 cGMP 자극된 PDE; (III) cGMP 억제된 PDE; (IV) cAMP-특이성 PDE; (V) cGMP 특이성 PDE; (VI) 광수용체 PDE; 및 (VII) 고친화성 cAMP특이성 PDE. 아미노산 서열로부터, 이들 모든 PDE 군들이 군들 사이에 서열 동일성이 약 30%인, 촉매작용 영역으로 생각되는 관련 영역을 함유한다는 것이 분명하다. 동일한 군의 구성원들은 보다 밀접하게 관련되어 있으며, 이들은 전체 코딩 영역에 걸쳐 60 내지80% 서열 동일성을 공유한다.
미카엘리 (Michaeli) 등 (1993)은 내인성 cAMP PDE 유전자들, 즉 PDE1 및 PDE2가 모두 결핍된 사카로마이세스 세레비지아 (Saccharomyces cerevisiae)에서 결점의 보충에 의해 cAMP 포스포디에스테라제를 코딩하는 cDNA의 단리를 위한 고감응성 기능 스크린을 구축하였다. cAMP 특이성 PDE를 코딩하는 3개의 별도의 인간 유전자들에 상응하는 cDNA의 3개의 군을 인간의 신경교아세포종 cDNA 라이브러리로부터 이 기능 스크린을 사용하여 단리하였다. 유전자들 중의 2개는 드로소필라 '둔스' cAMP-특이성 PDE와 밀접하게 관련되어 있다. 미카엘리 등 (1993)이 HCP1로 언급한 제3의 유전자는 신규한 cAMP-특이성 PDE를 코딩하였다. HCP1은 모든 시클릭 뉴클레오티드 PDE의 촉매작용 영역의 서열과 관련되어 있는 아미노산 서열을 갖는다. 그러나, cAMP-특이성 PDE 군의 다른 특성들을 공유하지 않는 것이 고친화성 cAMP 특이성 PDE이다. HCP1의 PDE 활성은 cGMP 또는 cGMP-억제가능한 PDE의 다른 억제제에 민감하지 않았다. HCP1의 생화학 및 약물학적 특성은, 이것이 이전에 발견되지 않은 시클릭 뉴클레오티드 PDE군의 구성원임을 미카엘리 등 (1993)이 제시하였고, 그들은 이것을 VII군으로 명명하였다. 노던 블롯 분석은 인간 골격근에서 고농도의 HCP1 RNA가 존재함을 나타냈다.
체세포 하이브리드 세포주의 서던 블롯 분석에 의해, 밀라토비치 (Milatovich) 등 (1994)은 HCP1 위치를 염색체 8로 지도화하였고, 염색체 8의 상이한 영역들을 함유하는 체세포 하이브리드 세포주의 연구에 의해, 그들은 그것을 8q13-q22로 지역화시켰다. 한 (Han) 등 (1998)은 원래 위치에서의 혼성화에서 형광에 의해 PDE7A 유전자를 8q13으로 지도화하였다. 종간 역교차 분석에 의해, 이들은 마우스 PDE7A 유전자를 염색체 3의 인접 영역으로 지도화하였다."
PDE2에 대한 배경 기술은 제니퍼 피. 맥케 (Jennifer P. Macke) 등에 의해 http://www3.ncbi.nlm.nih.gov/Omim/searchomim.htm.에 제공되어 있다. cGMP-자극된 PDE2에 관한 다음 정보는 그 원문으로부터 발췌된 것이다.
"로스만 (Rosman) 등 (1997)은 인간의 PDE2A에 상응하는 cDNA를 클로닝하였다. PDE2A 유전자는 106 kD의 예측 분자량을 갖는 941 아미노산 폴리펩티드를 코딩한다. 단백질 서열은 소 및 래트 PDE2A 서열과 90% 동일하다. 노던 브롯 분석은 PDE2A가 시험한 인간의 조직 중에서 다양한 농도로 4.2-kb mRNA로 발현되었으며, 뇌에서 발현이 최대임을 보여주었다. 발현 연구는 PDE2A가 cAMP 및 cGMP를 가수분해시키고 PDE2A-특이성 억제제 EHNA에 의해 억제됨을 밝혔다."
PDE에 대한 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열은 문헌에서 입수할 수 있다. 일부 서열들이 본 명세서에서 제공된 서열 목록에 제공되어 있다.
한 면에서, PDE 표적은 하기하는 PDE 효소들 중의 1종 이상으로부터 선택된다: PDEcAMP1, PDEcAMP2, PDEcAMP3, PDEcAMP4, PDEcAMP7 및 PDEcAMP8.
보다 바람직한 면에서, PDE 표적은 하기하는 PDE 효소들 중의 1종 이상으로부터 선택된다: PDEcAMP1, PDEcAMP2, PDEcAMP3 및 PDEcAMP4.
바람직하게는, 본 발명의 경우 PDE 표적은 적어도 PDE 2이다.
I:PDE
상기한 바와 같이, 약제는 I:PDE로서 작용할 수 있는 임의의 적합한 약제일 수 있다.
그러므로 본 발명의 이러한 면의 광범위한 면은 다음에 관한 것이다:
a) 제약학상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 임의로 혼합되고 I:PDE인 약제를 포함하는, FSD (바람직하게는 FSAD) 치료에 사용하기 위한 (또는 사용시의) 제약 조성물;
b) FSD (바람직하게는 FSAD) 치료용 의약 (예를 들면 제약 조성물)의 제조에 사용되는, I:PDE인 약제의 용도;
c) 제약학상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 임의로 혼합되고 I:PDE인 약제를 FSD (바람직하게는 FSAD)를 앓는 여성에게 전달시키는 것을 포함하는, FSD (바람직하게는 FSAD)를 앓는 여성의 치료 방법;
d) 제약학상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 임의로 혼합되고 I:PDE인 약제를 포함하는, 성기 (예를 들면 질 또는 음핵) 혈류량을 증가시키는 데 사용하기 위한 (또는 사용시의) 제약 조성물;
e) 성기 (예를 들면 질 또는 음핵) 혈류량 증가용 의약 (예를 들면 제약 조성물)의 제조에 사용되는, I:PDE인 약제의 용도;
f) I:PDE를 여성에게 전달시키는 것을 포함하는, 여성을 FSD (바람직하게는 FSAD)에 대해 치료하거나 FSD (바람직하게는 FSAD)를 예방하는 방법.
본 발명의 다른 면들은 다음을 포함한다:
A) FSAD를 앓는 여성의 성기에서 cAMP를 상승작용시킬 수 있고 제약학상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 임의로 혼합되고 I:PDE인 약제를 포함하는, FSAD 치료에 사용하기 위한 (또는 사용시의) 제약 조성물;
B) FSAD 치료용 의약 (예를 들면 제약 조성물)의 제조에 사용되는, FSAD를 앓는 여성의 성기에서 cAMP를 상승작용시킬 수 있고, I:PDE인 약제의 용도;
C) 여성의 성기에서 cAMP를 상승작용시킬 수 있고 여성의 성기에서 cAMP의 상승작용을 야기시킬 수 있는 양이며, 제약학상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 임의로 혼합되고 I:PDE인 약제를 FSAD를 앓는 여성에게 전달시키는 것을 포함하는, FSAD를 앓는 여성의 치료 방법;
D) I:PDE인 약제가 cAMP를 직접적으로 또는 간접적으로 상승작용시키는지를 확인하는 것을 포함하고, 상기 약제 존재 하에 cAMP의 상승작용이 FSA, 특히 FSAD의 치료에 유용할 수 있음을 나타내는 것인, FSD, 특히 FSAD의 치료에 사용될 수 있는 약제를 확인하기 위한 분석 방법;
E) 여성의 성기에서 cAMP 신호화를 향상시킬 수 있고 제약학상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 임의로 혼합되고 I:PDE인 약제를 포함하는, 성기 (예를 들면 질 또는 음핵) 혈류량을 증가시키는 데 사용하기 위한 (또는 사용시의) 제약 조성물;
F) 성기 (예를 들면 질 또는 음핵) 혈류량 증가용 의약 (예를 들면 제약 조성물)의 제조에 사용되는, 여성의 성기에서 cAMP 신호화를 향상시킬 수 있고 I:PDE인 약제의 용도;
G) 성기 (예를 들면, 질 또는 음핵) 혈류량 증가를 야기시키도록 여성의 성기에서 cAMP 신호화를 향상시킬 수 있고 I:PDE인 약제를 여성에게 전달시키는 것을 포함하는, 여성의 치료 방법.
I:PDE의 예들은 EP-A-091133 및 EP-A-0771799에 기재되어 있다.
바람직하게는, I:PDE는 I:PDE2이다. 따라서, 바람직한 예의 화합물은 EP-A-0771799에 제공된 것이다.
편의상, EP-A-0771799의 청구항 1항을 지금 반복하여 기재하였다:
화학식 1을 갖는 퓨린-6-온 유도체 및 호변이성질체 및 이들의 염:
상기 식 중,
R1은 수소 또는 8개 이하의 탄소 원자를 포함하는 직쇄 또는 분지쇄 알킬을 나타내고,
R2는 4개 이하의 탄소 원자를 포함하는 직쇄 또는 분지쇄 아실, 또는 임의로 히드록실, 아지도 또는 화학식 -NR3R4또는 -OSO2R5가 있는 기에 의해 치환된 최대 8개의 탄소 원자를 포함하는 직쇄 또는 분지쇄 알킬을 나타내고,
R3및 R4는 동일하거나 상이하며, 3 내지 6개의 탄소 원자를 포함하는 시클로알킬, 수소, 포르밀, 또는 임의로 각각 6개 이하의 탄소 원자를 포함하는 직쇄 또는 분지쇄 알콕시 또는 알콕시카르보닐에 의해 또는 화학식 -(CO)a-NR6R7가 있는 기에 의해 치환된 6개 이하의 탄소 원자를 포함하는 직쇄 또는 분지쇄 알킬을 나타내고,
a는 0 또는 1의 수이고,
R6및 R7은 동일하거나 상이하며, 수소, 포르밀, 히드록실, 페닐, 또는 임의로 히드록실 또는 5개 이하의 탄소 원자를 포함하는 직쇄 또는 분지쇄 알콕시에 의해 치환된 6개 이하의 탄소 원자를 포함하는 직쇄 또는 분지쇄 알킬을 나타내거나, 또는
R3및(또는) R4는 6개 이하의 탄소 원자를 포함하는 직쇄 또는 분지쇄 알콕시카르보닐, 카르복실, 또는 임의로 히드록실 또는 4개 이하의 탄소 원자를 포함하는 직쇄 또는 분지쇄 알콕시에 의해 치환된 6개의 탄소 원자를 포함하는 직쇄 또는 분지쇄 아실을 나타내거나, 또는
R3및(또는) R4는 화학식 -(CO)b-T-NR8R9, -CO-R10, -SO2R11또는 -SO2NR12R13가 있는 잔기를 나타내고,
b는 a에 대하여 상기에서 기재한 의미를 갖고, 그와 동일하거나 상이하고,
T는 5개 이하의 탄소 원자를 포함하는 직쇄 또는 분지쇄 알킬을 나타낼 수 있거나 b0일 때에는 결합을 나타낼 수 있고,
R8및 R9는 상기에서 R6및 R7에 대하여 기재한 의미를 갖고 그와 동일하거나 상이하고,
R10은 임의로 N 관능기 상에서 4개 이하의 탄소 원자를 포함하는 직쇄 또는 분지쇄알킬, 알콕시 또는 알콕시카르보닐, 카르복실, 벤질옥시카르보닐 또는 히드록실에 의해 치환될 수 있는, S, N 및(또는) O로부터 선택된 3개 이하의 헤테로원자를 포함하는 포화된, 부분적으로 불포화된 또는 불포화된 5- 내지 7-원 헤테로환을 나타내고,
R11은 5개 이하의 탄소 원자를 포함하는 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 벤질 또는 페닐을 나타내고,
R12및 R13은 동일하거나 상이하며, 수소, 페닐 또는 6개 이하의 탄소 원자를 포함하는 직쇄 또는 분지쇄 알킬을 나타내거나, 또는
R3및 R4는 질소 원자와 함께, 임의로 카르보닐, 5개 이하의 탄소 원자를 포함하는 직쇄 또는 분지쇄 알콕시카르보닐, 또는 5개 이하의 탄소 원자를 포함하는 직쇄 또는 분지쇄 알킬 (이것은 다시 히드록실, 카르복시 또는 각각 6개 이하의 탄소 원자를 포함하는 직쇄 또는 분자쇄 아실, 알콕시 또는 알콕시카르보닐에 의해 치환될 수 있음)에 의해 치환될 수 있는, S, N 및(또는) O 또는 -NR14잔기로부터 선택된 3개 이하의 헤테로원자를 포함할 수 있는 포화된, 부분적으로 불포화된 또는 불포화된 5- 내지 6-원 헤테로환을 형성하고,
R14는 수소, 카르보닐 또는 각각 5개 이하의 탄소 원자를 포함하는 직쇄 또는 분지쇄 알킬 또는 알콕시카르보닐을 나타내고, 및
R5는 페닐 또는 5개 이하의 탄소 원자를 포함하는 직쇄 또는 분지쇄 알킬을 나타내고,
A는 각각 6개 이하의 탄소 원자를 포함하는 직쇄 또는 분지쇄 알킬렌 또는 알케닐렌을 나타내고,
D 및 L은 동일하거나 상이하고, 6 내지 10개의 탄소 원자를 포함하는 아실, 또는 임의로 할로겐, 히드록시, 니트로, 트리플루오로메틸, 카르복시, 각각 6개 이하의 탄소 원자를 포함하는 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 알콕시 또는 알콕시카르보닐에 의해, 또는 화학식 -(V)c-NR15R16및(또는) -OR17에 의해 3회 이하까지 동일하게 또는 상이하게 치환된, S, N 및(또는) O로부터 선택된 3개 이하의 헤테로원자를 포함하는, 임의로 벤조축합된 5- 내지 7-원의 방향족 헤테로환을 나타내고,
c는 0 또는 1의 수이고,
V는 화학식 -CO 또는 -SO2가 있는 잔기를 나타내고,
R15및 R16은 동일하거나 상이하고 상기에서 R3및 R4에 대하여 기재한 의미를 갖고,
R17은 수소, 8개 이하의 탄소 원자를 포함하는 직쇄 또는 분지쇄 알케닐, 또는 임의로 히드록실, 카르보닐 또는 5개 이하의 탄소 원자를 포함하는 직쇄 또는 분지쇄 알콕시카르보닐에 의해 3회 이하까지 동일하게 또는 상이하게 치환된 최대 8개의 탄소 원자를 포함하는 직쇄 또는 분지쇄 알킬; 및(또는) 환들이 임의로 6 내지 10개의 탄소 원자를 포함하는 아릴에 의해 또는 S, N 및(또는) O로부터 선택된 3개 이하의 헤테로원자를 포함하는, 임의로 벤조축합된 5- 내지 7-원 방향족 헤테로환에 의해 치환되고, 이것은 다시 임의로 할로겐, 히드록실, 니트로, 카르복실, 트리플루오로메틸 또는 각각 5개 이하의 탄소 원자를 포함하는 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 알콕시 또는 알콕시카르보닐에 의해 또는 화학식 -(V')d-NR18R19가 있는 기로 2회 이하까지 동일하게 또는 상이하게 치환되고,
d는 a에 대하여 상기에서 기재한 의미를 갖고, 그와 동일하거나 상이하고,
R18및 R19는 상기에서 R3및 R4에 대하여 기재한 의미를 갖고 그와 동일하거나 상이하고,
V'는 상기에서 V에 대하여 기재한 의미를 갖고 그와 동일하거나 상이하고, 및(또는) 임의로 5개 이하의 탄소 원자를 포함하는 직쇄 또는 분지쇄 아실에 의해 치환되고, 임의로 5개 이하의 탄소 원자를 포함하는 직쇄 또는 분지쇄 알콕시에 의해 또는 화학식 -NR20R21이 있는 기에 의해 치환된, 아래에서 D에 대히여 기재한 고리계를 나타내고,
R20및 R21은 상기에서 R3및 R4에 대하여 기재한 의미를 갖고 그와 동일하거나 상이하고,
E는 화학식 -CH2-Y-Z가 있는 잔기를 나타내고,
Y는 결합 또는 산소 또는 황 원자 또는 -NH기를 나타내고,
Z은 5개 이하의 탄소 원자를 포함하는 직쇄 또는 분지쇄 알킬 사슬을 나타내고,
D는 화학식
이 있는 잔기를 나타낸다.
바람직한 I:PDE는 하기 구조로부터 선택된다:
NEP (중성 엔도펩티다제)
본 발명의 한 면에 따르면, PcAMP표적은 NEP이다.
NEP에 대한 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열은 문헌에서 입수할 수 있다. 일부 서열들이 본 명세서에서 제공된 서열 목록에 기재되어 있다.
한 면에서, NEP는 NEP (EC 3.4.24.11) (또한 엔케팔리나제 또는 엔도펩티다제-2로 알려짐)이다. 여기서, 본 발명자들은 NEP EC 3.4.24.11 mRNA를 발견하였고인간 및 토끼 질 내에서 단백질을 발현시켰다.
여기서, 본 발명자들은 FSAD를 앓는 여성을 포함하는 여성에서는, VIP가 NEP EC3.4.24.11에 의해 분해되는 것으로 생각한다. 따라서, NEP 억제제들은 흥분 동안에 방출된 VIP의 내인성 혈관이완 효과를 상승작용시키게 된다. 이것은 예를 들면, 향상된 질 충혈을 통해 FSAD의 치료를 이끌게 된다. 본 발명자들은 NEP EC 3.4.24.11의 선택적 억제제들이 골반 신경에 의해 자극되고 VIP에 의해 유도된 성기 (예를 들면 질 또는 음핵) 혈류량 증가를 향상시키는 것을 보여주었다. 또한, 그 선택적 NEP 억제제들은 단리된 질 벽의 VIP 및 신경-매개 이완을 향상시킨다.
NEP에 대한 배경 기술은 빅터 에이. 맥쿠식 (Victor A. McKusick) 등에 의해 http://www3.ncbi.nlm.nih.gov/Omim/searchomim.htm.에 제공되어 있다. NEP에 관한 다음 정보는 그 원문으로부터 발췌된 것이다.
"일반적인 급성 임파구 백혈병 항원은 인간의 급성 임파구 백혈병 (ALL)의 진단에 있어서 중요한 세포 표면 마커이다. ALL인 경우의 85%를 나타내는 프레-B 표현형 백혈병 세포 상에 존재한다. CALLA는 백혈병 세포로 한정되지 않지만, 그러나 다양한 정상 조직 상에서 발견된다. CALLA는 신장에 특히 풍부한 당단백질인데, 여기서 기부 세관의 쇄자연 상에 및 사구 상피 상에 존재한다. 레타르트 (Letarte) 등 (1988)은 CALLA를 코딩하는 cDNA를 클로닝하여 cDNA로부터 유추된 아미노산 서열이, 엔케팔리나제로도 알려져 있는 인간의 막-관련 중성 엔도펩티다제 (NEP; EC 3.4.24.11)의 아미노산 서열과 동일함을 보여주었다. NEP는 소수성 잔기중의 아미노 측에서 펩티드를 절단시키고, 글루카곤, 엔케팔린, 물질 P, 뉴로텐신,옥시토신 및 브라디키닌을 포함하는 몇 가지 펩티드 호르몬을 불활성화시킨다. cDNA 형질감염 분석에 의해, 쉽 (Shipp) 등 (1989)은 CALLA가 이미 엔케팔리나제로 불리는 형태의 기능성 중성 엔도펩티다제임을 확인하였다. 바커 (Barker) 등 (1989)은 100-kD 타입 II 트랜스막 당단백질을 코딩하는 CALLA 유전자가 세포 표면 CALLA를 발현시키는 암 중에서 재배열되지 않는 45 kb보다 큰 단일 복제물 중에 존재한다는 것을 입증하였다. 유전자는 체세포 하이브리드의 연구에 의해 인간의 염색체 3에 위치하였고, 현장 혼성화는 위치를 3q21-q27로 지역화시켰다. 트랜-패터슨 (Tran-Paterson)) 등 (1989)은 또한 인간-설치류동물 체세포 하이브리드로부터 얻은 DNA의 서던 블롯 분석에 의해 유전자를 염색체 3에 부여하였다. 디아다미오 (D'Adamio) 등 (1989)은 CALLA 유전자가 80 kb보다 크게 걸쳐 있고, 24개의 엑손들로 이루어져 있음을 입증하였다."
I:NEP
상기한 바와 같이, 약제는 I:NEP로서 작용할 수 있는 임의의 적합한 약제일 수 있다.
그러므로 본 발명의 이러한 면의 광범위한 면은 다음에 관한 것이다:
a) 제약학상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 임의로 혼합되고 I:NEP인 약제를 포함하는, FSD (바람직하게는 FSAD) 치료에 사용하기 위한 (또는 사용시의) 제약 조성물;
b) FSD (바람직하게는 FSAD) 치료용 의약 (예를 들면 제약 조성물)의 제조에 사용되는, I:NEP인 약제의 용도;
c) 제약학상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 임의로 혼합되고 I:NEP인 약제를 FSD (바람직하게는 FSAD)를 앓는 여성에게 전달시키는 것을 포함하는, FSD (바람직하게는 FSAD)를 앓는 여성의 치료 방법;
d) 제약학상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 임의로 혼합되고 I:NEP인 약제를 포함하는, 성기 (예를 들면 질 또는 음핵) 혈류량을 증가시키는 데 사용하기 위한 (또는 사용시의) 제약 조성물;
e) 성기 (예를 들면 질 또는 음핵) 혈류량 증가용 의약 (예를 들면 제약 조성물)의 제조에 사용되는, I:NEP인 약제의 용도;
f) I:NEP를 여성에게 전달시키는 것을 포함하는, 여성의 FSD (바람직하게는 FSAD)에 대해 치료하거나 FSD (바람직하게는 FSAD)를 예방하는 방법.
본 발명의 다른 면들은 다음을 포함한다:
A) FSAD를 앓는 여성의 성기에서 cAMP를 상승작용시킬 수 있고 제약학상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 임의로 혼합되고 I:NEP인 약제를 포함하는, FSAD 치료에 사용하기 위한 (또는 사용시의) 제약 조성물;
B) FSAD 치료용 의약 (예를 들면 제약 조성물)의 제조에 사용되는, FSAD를 앓는 여성의 성기에서 cAMP를 상승작용시킬 수 있고, I:NEP인 약제의 용도;
C) 여성의 성기에서 cAMP를 상승작용시킬 수 있고 여성의 성기에서 cAMP의 상승작용을 야기시킬 수 있는 양이며 제약학상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 임의로 혼합되고 I:NEP인 약제를 FSAD를 앓는 여성에게 전달시키는 것을 포함하는, FSAD를 앓는 여성의 치료 방법;
D) I:NEP인 약제가 cAMP를 직접적으로 또는 간접적으로 상승작용시키는지를 확인하는 것을 포함하고, 상기 약제 존재 하에 cAMP의 상승작용이 FSA, 특히 FSAD의 치료에 유용할 수 있음을 나타내는 것인, FSD, 특히 FSAD의 치료에 사용될 수 있는 약제를 확인하기 위한 분석 방법;
E) 여성의 성기에서 cAMP 신호화를 향상시킬 수 있고 제약학상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 임의로 혼합되고 I:NEP인 약제를 포함하는, 성기 (예를 들면 질 또는 음핵) 혈류량을 증가시키는 데 사용하기 위한 (또는 사용시의) 제약 조성물;
F) 성기 (예를 들면 질 또는 음핵) 혈류량 증가용 의약 (예를 들면 제약 조성물)의 제조에 사용되는, 여성의 성기에서 cAMP 신호화를 향상시킬 수 있고 I:NEP인 약제의 용도;
G) 성기 (예를 들면, 질 또는 음핵) 혈류량 증가를 야기시키도록 여성의 성기에서 cAMP 신호화를 향상시킬 수 있고 I:NEP인 약제를 여성에게 전달시키는 것을 포함하는, 여성의 치료 방법.
I:NEP를 확인하고 및(또는) 연구하기 위한 적합한 분석 시스템에 대한 상세한 내용은 하기 단락에서 제공된다.
I:NEP는 하기하는 참고 문헌들 중에 논의되어 있다:
Pathol. Biol., 46(3), 1998, 191;
Current Pharm. Design, 2(5), 1996, 443;
Biochem. Soc. Trans., 21(3), 1993, 678;
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TiPS, 11, 1990 245;
Pharmacol. Rev., 45(1), 1993, 87;
Curr. Opin. Inves. Drug, 2(11), 1993, 1175;
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Cardiovasc. Drug Rev., (1996), 14(2), 166;
Gen. Pharmacol., (1996), 27(4), 271;
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Exp. Opin. Ther. Patents (1996), 6(11), 1147.
I:NEP는 아래 문서들 중에 기재되어 있다:
EP-509442A;
US-192435;
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EP-599444B;
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EP-544620A;
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DE-19510566;
DE-19638020;
EP-830863;
JP-98101565;
EP-733642;
WO9614293;
JP-08245609;
JP-96245609;
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J. Med. Chem. 1993, 36, 2420;
JP-95157459;
Bioorg. Med. Chem. Letts., 1996, 6(1), 65.
바람직한 I:NEP는 하기 문서들 중에 기재되어 있다:
EP-A-0274234;
JP-88165353;
Biochem. Biophys. Res. Comm., 1989, 164, 58;
EP-629627-A;
US-77978;
Perspect. Med. Chem. (1993), 45;
EP-358398-B.
I:NEP의 바람직한 예들은 하기 구조로부터 선택된다.
보다 바람직한 I:NEP들은 하기 구조로부터 선택된다.
이들 화합물들을 실험 단락 (하기됨)에 제공된 기술에 따라 제조하였다. 이들 화합물들을 본 발명에 따른 약제인지를 시험하여 cAMP를 상승작용시키는 데 유용함을 발견하였고, 따라서 FSAD의 치료에 유용하다. 이들 화합물에 관한 실험 데이타 중의 일부를 실험 단락 (하기됨)에 제공한다.
NEP 분석
개, 래트, 토끼 및 인간 신장 피질로부터 가용성 (NEP) 중성 엔도펩티다제의 제조 및 분석
가용성 NEP를 신장 피질로부터 얻어, NEP 기질 Abz-D-Arg-Arg-Leu-EDDnp이 분해되어 그의 형광 생성물인 Abz-D-Arg-Arg를 생성시키는 속도를 측정함으로써 활성을 분석하였다.
실험 방법
1. 재료
모든 물은 이중 탈이온화시켰다.
1.1 조직
인간 신장 IIAM (Pennsylvania, U.S.A.)
래트 신장
토끼 신장
개 신장
1.2 균질화 매질
100 mM 만니톨 및 20 mM 트리스 @ pH 7.1
트리스 (Fisher T/P630/60) 2.42 g을 물 1 리터 중에 희석시키고 pH를 6M HCl을 사용하여 실온에서 7.1로 조절하였다. 여기에 만니톨 (Sigma M-9546) 18.22g을 첨가하였다.
1.3 트리스 완충액 (NEP 완충액)
50 mM 트리스 pH 7.4 (Sigma T2663) 50 ml를 물 950 ml 중에 희석시켰다.
1.4 기질 (Abz-D-Arg-Arg-Leu-EDDnp)
SNPE로부터 배열되도록 제조하고, -20℃에서 분말로 저장하였다. 기질을 크리스 완충액 중에 부드럽게 재현탁시킴으로써 2 mM 모액을 제조하였는데, 이 때 와류시키거나 초음파처리해서는 안된다. 2 mM 모액의 600 μl 분취액을 -20℃에서 최대 1 개월 동안 저장하였다 [Medeiros, M.A.S., Franca, M.S.F. et al., (1997), Brazilian Journal of Medical and Biological Research, 30, 1157-1162].
1.5 총 생성물
100% 기질 대 생성물로의 전환률에 상응하는 샘플을 플레이트 상에 포함시켜 기질 전환율%을 측정할 수 있도록 하였다. 2 mM 기질 1 ml를 효소 모액 20 μl와 함께 37 ℃에서 24 시간 동안 인큐베이션시켜 전체 생성물을 생성시켰다.
1.6 정지 용액
포스포르아미돈 (Sigma R7385) 300 μM 모액을 NEP 완충액 중에서 구성시키고 -20 ℃에서 50 μl 분취액 중에 저장하였다.
1.7 디메틸 술폭시드 (DMSO)
1.8 염화마그네슘 - MgCl2·6H2O (Fisher M0600/53)
1.9 검정의 96웰 편평한 바닥의 분석 플레이트 (Costar 3915)
1.10 탑시일(Topseal) A (Packard 6005185)
1.11 원심분리관
2. 구체적인 장치
2.1 소르발 (Sorvall) RC-5B 원심분리기 (SS34 GSA 회전자, 4 ℃로 예비냉각시킴)
2.2 브라운 (Braun) 미니프라이머 믹서
2.3 벡크만 (Beckman) CS-6R 원심분리기
2.4 플루오스타 갤럭시 (Fluostar galaxy)
2.5 웨스바트 (Wesbart) 1589 진탕 인큐베이터
3. 방법
3.1 조직 제조
3.2 개, 래트, 토끼 및 인간의 NEP를 문헌 [Booth, A.G. & Kenny, A.J. (1974), Biochem. J. 142, 575-58]으로부터 채택한 방법을 사용하여 신장 피질로부터 얻었다.
3.3 냉동시킨 신장을 실온에서 해동되도록 하여 피질을 수질로부터 해부하였다.
3.4 피질을 미세하게 절단시키고 브라운 미니프라이머 (2.2)를 사용하여 약 10배의 균질화 완충액 (1.2) 중에서 균질화시켰다.
3.5 염화마그네슘 (1.8) (20.3 mg/gm 조직)을 균질화물에 첨가하여 빙수조에서 15분 동안 교반하였다.
3.6 균질화물을 벡크만 원심분리기 (2.3) 중에서 12분 동안 1,500g (3,820 rpm)에서 원심분리시킨 후, 상등액을 새로운 원심분리 관으로 비우고 펠렛은 버렸다.
3.7 상등액을 소르발 원심분리기 (2.1) 중에서 12분 동안 15,000g (12,100 rpm)에서 원심분리시키고 상등액을 버렸다.
3.8 잔류하는 펠렛의 윗부분 상의 엷은 핑크색 층을 제거하여 염화마그네슘을 함유하는 균질화 완충액 (조직 1 g당 완충액 5 ml 중의 MgCl 9 mg) 중에 재현탁시켰다.
3.9 현탁액을 벡크만 원심분리기 (2.3) 중에서 12분 동안 2,200g (4,630 rpm)에서 원심분리시킨 후, 펠렛을 버렸다.
3.10 상등액을 소르발 원심분리기 (2.1)를 사용하여 12분 동안 15,000g (12,100 rpm)에서 원심분리시키고 상등액을 버렸다.
3.11 최종 펠렛을 염화마그네슘을 함유하는 균질화 완충액 (조직 1 g당 완충액 5 ml 중의 MgCl 9 mg) 중에 재현탁시켰다. 브라운 미니프라이머 (2.2)를 사용하여 균질한 현탁액을 얻었다. 이어서 이것을 100 μl 분취액 중에서 동결시켜 NEP 활성에 대하여 분석하였다.
4.0 NEP 활성의 측정
앞에서 분취한 NEP의 활성을, 그의 NEP 특이적 펩티드 기질을 분해시킬 수 있는 능력에 의해 측정하였다.
4.1 4% DMSO/NEP 완충제 용액을 제조하였다 (NEP 완충제 96 ml 중의 DMSO 4ml).
4.2 기질, 전체 생성물, 효소 및 포스포르아미돈 모액을 얼음 상에 정치시켜 해동시켰다.
4.3 4% DMSO/NEP 완충제 용액 50 μl를 각 웰에 첨가하였다.
4.4 2 mM 기질 모액을 1:40으로 희석시켜 50 μM 용액을 제조하였다. 50 μM 기질 100 μl를 각 웰에 첨가하였다 (최종 농도 25 μM).
4.5 일정 범위의 희석율을 갖는 효소 50 μl를 첨가하여 반응을 개시시켰다 (일반적으로 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600 및 1:3200이 사용된다). NEP 완충제 50 μl를 블랭크 웰에 첨가하였다.
4.6 2 mM 전체 생성물을 1:80으로 희석시켜 25 μM 용액을 제조하였다. 25 μM 생성물 200 μl를 새로운 플레이트의 첫 4개의 웰에 첨가하였다.
4.7 플레이트를 진탕 인큐베이터 중에서 37 ℃에서 60분 동안 인큐베이션시켰다.
4.8 300 μM 포스포르아미돈 모액을 1:100으로 희석시켜 300 nM로 만들었다. 300 nM 포스포르아미돈 100 μl를 첨가하여 반응을 중지시키고, 진탕 인큐베이터 중에서 37 ℃에서 20분 동안 인큐베이션시킨 후 플루오스타 (ex320/em420) 상에서 판독하였다.
5. NEP 억제 분석
5.1 기질, 전체 생성물, 효소 및 포스포르아미돈 모액을 얼음 상에 정치시켜 해동시켰다.
5.2 화합물 모액을 100% DMSO 중에서 구성하여 NEP 완충제 중에서 1:25로 희석하여 4% DMSO 용액을 제조하였다. 모든 추가의 희석은 4% DMSO 용액 중에서 행한다 (NEP 완충제 96 ml 중의 DMSO 4 ml).
5.3 화합물 50 μl를 두 번 96 웰 플레이트에 첨가하고, 4% DMSO/NEP 완충제 용액 50 μl를 대조군 및 블랭크 웰에 첨가하였다.
5.4 2 mM 기질 모액을 NEP 완충제 중에서 1:40으로 희석시켜 50 μM 용액을 제조하였다 (1개의 플레이트에 대하여 완충제 10.73 ml에대하여 2 mM 기질 275 μl이면 충분하다).
5.5 효소 모액을 NEP 완충제 중에서 희석시켰다 (활성 체크로부터 결정됨).
5.6 2 mM 전체 생성물 모액을 NEP 완충제 중에서 1:80으로 희석시켜 25 μM 용액을 제조하였다. 200 μl를 별개의 플레이트의 제1 4개의 웰에 첨가하였다.
5.7 300 μM 포스포르아미돈 모액을 1:100으로 희석시켜 300 nM 모액으로 만들었다 (완충제 10.99 ml에 대하여 포스포르아미돈 11 μl).
5.8 96 웰 플레이트 중의 각 웰에 다음을 첨가하였다
96 웰 플레이트에 첨가되는 시약
화합물/DMSO 트리스 완충제 기질 NEP 효소 전체 생성물
샘플 화합물 2 μl 50 μl 100 μl 50 μl 없음
대조군 DMSO 2 μl 50 μl 100 μl 50 μl 없음
블랭크 DMSO 2 μl 100 μl 100 μl 없음 없음
전체 DMSO 2 μl 없음 없음 없음 200 μl
5.9 NEP 효소를 첨가하여 반응을 개시시킨 후 진탕 인큐베이터 중에서 37 ℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다.
5.10 300 nM 포스포르아미돈 100 μl를 첨가하여 반응을 중지시키고, 진탕 인큐베이터 중에서 37 ℃에서 20분 동안 인큐베이션시킨 후 플루오스타 (ex320/em420) 상에서 판독하였다.
6. 계산
NEP 효소의 활성을 화합물의 존재 및 부재하에 확인하고 백분율로 표시한다.
% 대조군 활성 (효소의 전환):
억제제에 의한 % 활성:
대조군의 %로서 표시된 활성:
S자형 투여량 반응 곡선은 엑셀 (Excel)의 랩스테이츠 피트-커브 (LabStats fit-curve)를 이용하여 계산된 % 활성 (대조군의 %) 대 화합물 농도 및 IC50값에 에 적용된다.
NPY (뉴로펩티드 Y)
본 발명의 한 면에 따라서, 추가 표적은 NPY 또는 그의 관련 수용체 중의 하나인 PcAMP표적이다.
NPY 및 그의 수용체에 대한 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열은 문헌에서 찾아볼 수 있다. 일부 서열은 본원에 제공된 서열 목록에 기재되어 있다.
본 발명자는 뉴로펩티드 Y (NPY)가 혈관활성 장 펩티드 (VIP) 매개 혈관이완에 대해 억제 조절 영향을 미친다는 것을 발견하였다. 따라서, NPY 수용체의 억제 결과 골반 신경 및 VIP 매개 성기 (예를 들면, 질 또는 음핵) 혈류량이 증가된다. 이것은 임상적으로 질 및 (또는) 음핵 충혈의 증가를 유도할 것이며, 그것은 궁극적으로 혈장 누출을 통한 증가된 윤활 및 증가된 질 탄력을 유도할 것이다. 그러므로, FSAD의 치료에 적합한 표적은 NPY 또는 그의 관련된 수용체 중의 하나이다.
따라서, 바람직한 한 면에서, 추가 약제는 NPY Y1Y2또는 Y5길항제, 바람직하게는 경구 NPY Y1Y2또는 Y5길항제이다. 이 약제는 성기 (예를 들면, 질 또는 음핵) 혈류량을 증가시키고 윤활을 증가시킴으로써 FSAD를 치료할 것이다.
그러므로, VIP 유도 혈류량 증가의 NPY 매개 길항 작용은 효능있는 치료 표적에 의해 여성의 성기 경로 내의 혈류량이 영향받을 수 있음을 나타낸다. 이러한 길항 작용이 일어나게 하는 메카니즘은 아마 NPY Y1수용체 유도 Gi/o활성화를 통하는 것이다. 다른 생리학적 시스템에서, NPY Y1수용체는 혈관수축을 매개하고 교감 신경전달물질 방출을 억제하는 데 영향을 미쳐왔다 (Lundberg et al., 1996; NPY Y2효과는 배제될 수 없음). 본 발명자는 여성 성기 경로에서 NPY가 VIP 방출 또는 교감 신경전달을 직접 억제하는 아데닐레이트 시클라아제의 직접 억제를 통해 혈관이완을 억제한다고 생각한다.
나타낸 바와 같이, PcAMP표적은 NPY 수용체 중의 하나이다.
NPY의 신경 방출은 질 혈관층의 VIP 유도 혈관이완을 조절한다. 이것은 아마도 NPY Y1수용체가 관련된 전시냅스성 메카니즘을 통해 일어나긴 하지만 후시냅스상 작용 방식이 배제될 수는 없다. NPY 길항제는 질 혈관층의 VIP 유도 혈관확장을 상승작용시킬 것이다. 임상적으로, 이것은 질 벽 충혈을 통한 증가된 질 윤활 및 탄력을 유도할 것이다.
본 발명자에 의해 수행된 NPY 수용체 발현 연구는 인간 질 내의 NPY Y1Y2및 Y5수용체 아형을 확인하였다.
그러므로, 한 면에서 PcAMP표적은 NPY Y1Y2및 Y5수용체 아형 중의 하나 이상이다.
NPY 및 그의 관련된 수용체에 대한 배경 기술은 빅터 에이. 맥쿠식 (Victor A. McKusick) 등에 의해 http://www3.ncbi.nlm.nih.gov/Omim/searchomim.htm.에 제공되어 있다. NPY에 관한 다음 기재 내용은 그 원문으로부터 발췌된 것이다.
"뉴로펩티드 Y (NPY)는 포유 동물 신경계에서 풍부하고 널리 퍼져있는 펩티드이다. 이것은 펩티드 YY에 대한 서열 상동성 및 췌장 폴리펩티드 (PNP; 167780)에 대한 아미노산 및 뉴클레오티드 서열의 50% 이상의 상동성을 나타낸다. NPY는 36 아미노산 펩티드이다. 민쓰 (Minth) 등(1984)은 크롬친화성 세포종의 mRNA로부터 개시되는 NPY 유전자를 클로닝하였다. 다께우찌 (Takeuchi) 등 (1985, 1986)은 크롬친화성 세포종 및 췌장 내분비 종양으로부터 각각 NPY 및 PNP 유전자의 cDNA 클론을 분리하였다. 그들은 인간-마우스 체세포 하이브리드의 염색체 지정 패널로부터 게놈 DNA를 분석하기 위해 상기 cDNA 프로브를 이용하여 유전자가 같은 염색분체에 여러개 얹혀있는지 여부를 시험하였다. 그 연구는 7pter-7q22 상에 NPY가, 17p11.1-17qter 상에 PNP가 있는 것으로서, 같은 염색분체에 여러개 얹혀있지 않음을 나타내었다. 무스 스프레투스, 베이하리 (Mus spretus, Bahary) 등 (1991)은 역교잡의 연구에 의해 마우스 염색체 6에 상동성 NPY 유전자의 위치를 염색체 상에서 확인하였다. 마우스 염색체 6이 인간 7q에 상동성을 갖기 때문에, 인간의 NPY 유전자는 부위 7cen-q22에 위치할 것이다. 메이슬러 (Meisler) 등 (1987)은 낭포성 섬유증 (219700) 및 뉴로펩티드 Y에 대한 위치 사이의 밀접한 결합을 제외하였다. 테렝기 (Terenghi) 등 (1987)은 현장 혼성화 기술에 의해 생검 수술 표본 및 사후의 대뇌에서의 뇌 피질의 신경단위 내의 NPY를 코딩하는 mRNA의 분포를 확인하였다. 그들은 정상적인 성인 피질 신경단위에서의 NPY 유전자 전사 및 발현의 일치하는 정위화를 나타내었다. 베이커 등 (1995)은 형광 현장 혼성화에 의해 NPY 유전자가 7p15.1 상에 위치하고 단일 카피로 존재한다는 것을 밝혀냈다. 그들은 NPY가 예를 들면, 인간과 상어 사이에 3개의 아미노산 만이 차이가 나는, 알려진 가장 잘 보존된 펩티드 중의 하나라고 언급하였다. 뉴로펩티드 Y는 에너지 균형의 조절에 관련된 신경조절인자이며 ob/ob 마우스의 시상하부에서 과다 생성된다. 렙틴 (164160) 결핍에 대한 반응에서의 NPY의 역할을 확인하기 위해, 에릭슨(Erickson) 등 (1996)은 NPY가 결핍된 ob/ob 마우스를 발생시켰다. NPY의 부재하에, ob/ob 마우스는 감소된 음식 섭취 및 증가된 에너지 소모 때문에 덜 살찌며, 당뇨병, 불임증 및 소마토트로핀 결핍에 의해 아주 심하게 영향받지는 않는다. 이 결과는 NPY가 렙틴 결핍의 중추 신경계 작동인자임을 나타내는 것으로 해석된다. 알콜을 선호하게 선택적으로 생육된 래트의 유전자 결합 분석은 NPY 유전자를 포함한 염색체 부위를 확인하였다 (Carr 등, 1998). 알콜을 선호하는 래트는 알콜을 선호하지 않는 래트와 비교하여 몇개의 뇌 영역에서의 NPY 농도가 더 낮았다. 그러므로, 티일레 (Thiele) 등 (1998)은 표적화된 유전자 파괴의 결과로서 NPY가 완전히 결핍된 마우스에 의해 알콜 소모를 연구하였다 (Erickson 등, 1996). 그들은 NPY 결핍된 마우스가 야생형 마우스에 비해 6%, 10% 및 20% (부피) 에탄올을 함유하는 용액의 증가된 소모를 나타냄을 발견하였다. NPY 결핍된 마우스는 또한 에탄올에 의해 유도된 잠으로부터 더욱 빨리 회복되는 것으로 보여지는 바와 같이 에탄올의 진정제/수면제 효과에 덜 민감하긴 하지만, 혈장 에탄올 농도는 대조군의 것과 크게 다르지 않다. 대조적으로, 일반적으로 표지된 NPY 유전자를 발현하는 신경단위에서 그것을 과도발현한 유전자도입 마우스는 에탄올을 덜 선호하며 대조군 보다 에탄올의 진정/수면 효과에 덜 민감하다. 이들 데이타는 알콜 소모 및 내성이 뇌의 NPY 농도에 반대로 관련되어 있다는 직접적인 증거를 제공하였다. 비만의 진행되는 유전자 기초 연구의 일부로서 카르보넨 (Karvonen) 등 (1998)은 pre-pro-NPY의 신호 펩티드 일부에서 잔기 7의 류신이 프롤린으로 치환된 1128T-C 다형현상을 확인하였다. 이 다형현상은 비만 또는 에너지 대사와 관련이 없지만, 정상체중 및 비만 필란드인 및 비만 네덜란드인 둘다에서 높은 혈청 총 및 LDL 콜레스테롤 농도와 많이 일치하게 관련이 있다. 우시투파 (Uusitupa) 등 (1998)은 필란드인 14%에서 pro7 다형현상이 있지만, 네덜란드인에서는 6% 만이 그러한 현상을 나타내는 것으로 밝혀냈다. NPY의 pro7이 있는 대상은 이러한 유전자 변이가 없는 대상 보다 평균 0.6 내지 1.4 mmol/L 혈청 총 콜레스테 농도가 더 높았다. 혈청 콜레스테롤 농도에 대한 pro7 NPY의 영향을 정상 체중 네덜란드인에서는 발견할 수 없었기 때문에, 비만인이 유전자 변이의 영향에 더 민감할 수 있음을 추정할 수 있다. NPY에서 pro7이 있을 가능성은 8 mmol/L과 동일하거나 총 혈청 콜레스테롤이 더 높은 비만 대상에서 50 내지 60% 만큼 높을 수 있다고 계산되었다. 적어도 필란드인에서는 NPY의 pro 형태가 혈청 콜레스테롤 농도에 영향을 미치는 가장 강한 유전인자 중의 하나이다 (Allen and Bloom (1986); Dockray (1986); Maccarrone and Jarrott (1986); Minth et al. (1986) 참조)."
나타낸 바와 같이, NPY 및 그의 관련된 수용체에 대한 배경 기술은 빅터 에이. 맥쿠식 등 (ibid)에 의해 제공되었다. NPYR1에 관한 다음 내용은 그 원문으로부터 발췌된 것이다.
"뉴로펩티드 Y (NPY; 162640)는 포유동물 신경계에서 가장 풍부한 뉴로펩티드 중의 하나이며, 정신운동 활성, 음식 섭취, 중추신경 내분비 조절에 대한 영향 및 심혈관계에 대한 유력한 혈관활성 영향을 포함한 광범위한 중요한 생리학적 활성을 나타낸다. NPY의 2가지 주요 아형 (Y1 및 Y2)은 약리학적 기준에 의해 정의되었다. NPY Y1 수용체는 뇌, 비장, 소장, 신장, 고환, 태반 및 대동맥 평활근을포함한 각종 조직에서 확인되었다. Y2 수용체는 주로 중추신경계에서 발견된다. 헤르조그 (Herzog) 등 (1992)은 G 단백질 결합된 수용체 거대족의 성분으로 확인된 인간 NPY 수용체를 코딩하는 cDNA의 클로닝을 보고하였다. 차이니스 햄스터 난소 (CHO) 또는 인간 태아 신장 세포에서 발현될 때, 수용체는 특징적인 리간드 특이성을 나타내었다. 신장 세포주에서, 수용체는 시클릭 AMP 축적의 억제를 매개한 백일해 독소 민감성 G 단백질에 결합되었다. 한편, CHO 세포주에서, 그 수용체는 아데닐레이트 시클라아제의 억제에는 관련되지 않았지만, 세포내 칼슘의 상승에는 관련되었다. 따라서, NPY 수용체의 2차 메신저 결합은 G 단백질의 특정 레퍼토리 및 그 세포형에 존재하는 작동인자 시스템에 의존하는 세포형 특이적이었다. 라르해머 (Larhammar) 등 (1992)은 뉴로펩티드 Y 수용체를 단독으로 클로닝하고 특징화하였다. 헤르조그 (Herzog) 등 (1993)은 인간 NPY Y1 수용체 유전자의 분자 조직화 및 조절을 확인하였다. 대부분의 G 단백질 결합된 수용체 유전자의 인접한 구조와 대조적으로, 그들은 NPY Y1 수용체 유전자가 3 엑손을 가짐을 발견하였다. 그들은 또한 유전자의 첫번째 인트론에서 공통적인 Pstl 다형현상을 확인하였다. 그들은 고분해 형광 현장 혼성화에 의해 4q31.3-q32에 유전자를 정위화하였다. 헤르조그 (Herzog) 등 (1997)은 NPY1R 및 NPY5R (602001) 유전자는 염색체 4q31-q32의 같은 위치에 존재한다는 것을 발견하였다. 2개의 유전자는 공유하는 프로모터 영역으로부터 반대 방향으로 전사된다. Y1 수용체 유전자의 다르게 스플라이싱된 5-프라임 엑손 중의 하나는 Y5 수용체의 코딩 서열의 일부이다. 헤르조그 (Herzog) 등 (1997)은 유전자 중복에 의해 2개의 유전자가 형성되고 그것이 동격으로 발현될 수있다는 비일반적인 배열을 제안하였다. 루쯔 (Lutz) 등 (1997)은 종간 특이성 역교잡 분석에 의해 인간 염색체 4q의 원위 영역에 상응하는, 마우스 염색체 8 및 3 상의 보존된 결합기에 각각 Npy1r 및 Npy2r 유전자의 위치를 염색체 상에서 확인하였다."
나타낸 바와 같이, NPY 및 그의 관련된 수용체에 대한 배경 기술은 빅터 에이. 맥쿠식 등 (ibid)에 의해 제공되었다. NPYR2에 관한 다음 내용은 그 원문으로부터 발췌된 것이다.
"G 단백질 결합된 수용체군을 통한 뉴로펩티드 Y (NPY) 신호는 뇌 및 교감신경 신경단위에 존재한다. 적어도 3가지 타입의 뉴로펩티드 Y 수용체는 약리학적 기준, 조직 분포 및 코딩 유전자의 구조에 기초하여 정의된다 (162641 및 162643 참조). 로즈 (Rose) 등 (1995)은 인간 타입 2 수용체, NPY2R에 대해 cDNA의 COS 세포에서의 발현 클로닝을 보고하였다. 형질감염된 세포는 NPY (162640), 펩티드 YY (PYY; 600781) 및 아미노산 13 내지 36을 포함한 NPY의 단편에 대해 고친화력을 나타내었다. 예측된 381-아미노산 단백질은 G-단백질 결합된 수용체의 7 트랜스멤브레인 도메인 특징을 가지며 인간 Y1 수용체 (NPY1R; 162641)와 31%만 동일하다. 4 kb mRNA는 신경계의 몇개의 영역으로부터 얻은 조직 샘플의 노던 블롯 상에서 검출되었다. 제랄드 (Gerald) 등 (1995)은 방사표지된 PYY 결합 분석을 이용하여 인간 해마 cDNA 발현 라이브러리로부터 인간 Y2 수용체에 상응하는 cDNA를 클로닝하였다. 그들은 COS-7 세포 내에 Y2 유전자를 발현하였고 Y2 수용체가 PYY, NPY 및 췌장 폴리펩티드 (PP; 167780) 호르몬에 (최고 내지 최저 친화력으로) 결합한다는것을 밝힌 호르몬 결합 분석을 수행하였다. 암머 (Ammar) 등 (1996)은 타입 2 NPY 수용체를 코딩하는 인간 유전자를 클로닝하고 특징화하였다. 전사는 게놈 서열의 9 kb에 확대되며 2 엑손에 코딩된다. 타입 1 NPY 수용체 유전자에서와 같이, NPY2R의 5-프라임 비번역된 영역은 4.5-kb 교차 서열에 의해 차단된다. 암머 (Ammar) 등 (1996)은 설치류-인간 세포 혼성체의 서던 분석에 이어 형광 현장 혼성화 (FISH)에 의해 NPY2R 유전자가 NPY1R 유전자를 함유하는 동일한 영역 4q31에 위치한다는 것을 입증하였으며, 이는 이들 아형이 그의 구조적인 차이에도 불구하고 유전자 중복에 의해 발생될 수 있음을 의미하는 것이다. 루쯔 (Lutz) 등 (1997)은 종간 역교잡 분석에 의해 인간 염색체 4q의 원위 부위에 상응하는, 마우스 염색체 8 및 3 상의 보존된 결합기에 각각 Npy1r 및 Npy2r 유전자의 위치를 염색체 상에서 확인하였다."
본 발명에 따른 추정 또는 실제 약제가 NPY에 결합할 수 있는지를 확인하기 위한 분석은 WO-A-98/52890호 (96 페이지, 2 내지 28행 참조)에 기재되어 있다.
I:NPY
상기한 바와 같이, 약제는 I:NPY (종종, NPY 길항제로서 언급됨)로서 작용할 수 있는 임의의 적합한 약제일 수 있다.
그러므로, 본 발명의 이러한 면의 광범위한 면은 다음에 관한 것이다:
a) 제약학상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 임의로 혼합되고, I:NPY인 약제를 포함하는, FSD (바람직하게는 FSAD)의 치료에 사용하기 위한 (또는 사용시의) 제약 조성물;
b) FSD (바람직하게는 FSAD)의 치료용 의약 (예를 들면, 제약 조성물)의 제조에 사용되는, I:NPY인 약제의 용도;
c) 제약학상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 임의로 혼합되고, I:NPY인 약제를 FSD (바람직하게는 FSAD)를 앓고 있는 여성에게 전달시키는 것을 포함하는, FSD (바람직하게는 FSAD)를 앓고 있는 여성의 치료 방법;
d) 제약학상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 임의로 혼합되고, I:NPY인 약제를 포함하는, 성기 (예를 들면, 질 또는 음핵) 혈류량을 증가시키는 데 사용하기 위한 (또는 사용시의) 제약 조성물;
e) 성기 (예를 들면, 질 또는 음핵) 혈류량 증가용 의약의 제조에 사용되는, I:NPY인 약제의 용도;
f) I:NPY를 여성에게 전달시키는 것을 포함하는, 여성을 FSD (바람직하게는 FSAD)에 대해 치료하거나 FSD (바람직하게는 FSAD)를 예방하는 방법.
본 발명의 다른 면은 다음과 같은 것을 포함한다:
A) FSAD를 앓고 있는 여성의 성기에서 cAMP를 상승작용시킬 수 있고, 제약학상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 임의로 혼합되고, I:NPY인 약제를 포함하는, FSAD의 치료에 사용하기 위한 (또는 사용시의) 제약 조성물;
B) FSAD의 치료용 의약 (예를 들면, 제약 조성물)의 제조에 사용되는, FSAD를 앓고 있는 여성의 성기에서 cAMP를 상승작용시킬 수 있고, I:NPY인 약제의 용도;
C) 여성의 성기에서 cAMP를 상승작용시킬 수 있고, 여성의 성기에서 cAMP의상승작용을 일으키는 양이고, 제약학상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 임의로 혼합되고, I:NPY인 약제를 여성에게 전달시키는 것을 포함하는 FSAD를 앓고 있는 여성의 치료 방법;
D) 약제가 cAMP를 직접 또는 간접적으로 상승작용시킬 수 있는지를 확인하는 단계를 포함하고; 상기 약제의 존재 하에 cAMP의 상승작용이 그 약제가 FSD, 특히 FSAD의 치료에 유용할 수 있음을 나타내는 것이며 상기 약제가 I:NPY인, FSD, 특히 FSAD를 치료하는 데 사용될 수 있는 약제를 확인하기 위한 검정 방법.
E) 여성의 성기에서 cAMP 신호화를 향상시킬 수 있으며, 제약학상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 임의로 혼합되고, I:NPY인 약제를 포함하는, 여성의 성기 (예를 들면, 질 또는 음핵) 혈류량을 증가시키는 데 사용하기 위한 (또는 사용시의) 제약 조성물;
F) 여성의 성기 (예를 들면, 질 또는 음핵) 혈류량 증가용 의약 (예를 들면, 제약 조성물)의 제조에 사용되는, 여성의 성기에서 cAMP 신호화를 향상시킬 수 있으며, I:NPY인 약제의 용도;
G) 성기 (예를 들면, 질 또는 음핵) 혈류량을 증가시키도록 여성의 성기에서 cAMP 신호화를 향상시킬 수 있으며, I:NPY인 약제를 여성에게 전달시키는 것을 포함하는 여성의 치료 방법.
I:NPY(특히, NPY 길항제)는 다음 검토 문헌에 논의되어 있다:
I:NPY(특히, NPY 길항제)는 다음 서류에 기재되어 있다:
WO 98/07420호
WO 94/00486호
WO 96/22305호
WO 97/20821호
WO 97/20822호
WO 96/14307호
JP 07267988호
WO 96/12489호
US 5552422호
WO 98/35957호
WO 96/14307호
WO 94/17305호
EP 0614911호
WO 98/40356호
EP 0448765호
EP 0747356호
WO 98/35941호
WO 97/46250호
EP 0747357호
I:NPY의 바람직한 예는 다음 화학식으로부터 선택된다. 이들 화합물은 본 발명에 따른 약제로서 시험되고 cAMP를 상승작용시키는 데 유용한 것으로 밝혀졌으며, 따라서 FSAD의 치료에 유용하다. 이들 화합물에 관한 실험 데이타의 일부는실험 단락 (아래)에 기재되어 있다.
VIP (혈관활성 장 펩티드)
본 발명의 한 면에 따라서, PcAMP표적은 VIP 또는 그의 관련된 수용체 중의 하나이다. 현재의 분류법/학명은 이들을 VPAC1, VPAC2 및 PACAP로서 언급한다.
VIP 및 그의 수용체에 대한 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열은 문헌에 기재되어 있다. 일부 서열은 본원의 서열 목록에 기재되어 있다.
본 발명자는 VPAC1 및 VPAC2가 인간 및 토끼 질에 존재한다는 것을 밝혀냈다. PACAP는 토끼 및 인간 질 둘다에 없다.
VIP는 질 벽에 위치하는 혈관층의 신경 유도 질 혈관확장의 원인이 되는 성적 흥분 중에 방출되는 주요 내인성 신경전달물질이다. 이들 혈관활장 효과는 아데닐레이트 시클라아제 활성화 및 cAMP 생성에 의해 매개된다. 이론에 기초한 것은 아니지만, 이 효과는 VIP 수용체 아형 VPAC1, VPAC2또는 PACAP (뇌하수체 아데닐레이트 시클라아제 활성화 펩티드) 수용체를 통해 매개될 수 있다. VPAC2및 PACAP 수용체는 CNS에서 가장 넓게 발현되며 그 수용체는 뇌하수체에서 발현됨에도 불구하고 폭넓은 생물학적 기능을 갖지 못하는 것으로 보인다.
본 발명의 약제는 VIP를 상승작용시킬 수 있고 (또는) VIP 유사물 또는 그의 유사체로서 작용할 수 있다. 그 약제는 성적 흥분 중에 방출되는 내인성 VIP의 혈관이완 효과를 가능하게 하고 (또는) 모방할 것이다. 그 약제는 또한 질 평활근의 VIP 유도 이완에 대한 추가의 효과를 가질 수도 있다. 이것은 질 벽 충혈을 통한 질 윤활 및 탄력을 증가시키지만, 임상적으로는 FSAD 치료를 유도할 것이다. 이 실시형태에서, 그러나, 유사물 또는 유사체는 상기 논의된 바와 같이 VIP의 부작용이 없을 것이다.
VIP 및 그의 관련된 수용체에 대한 배경 기술은 빅터 에이. 맥쿠식 (VictorA. McKusick) 등에 의해 http://www3.ncbi.nlm.nih.gov/Omim/searchomim.htm.에 제공되어 있다. VIP에 관한 다음 내용은 그 원문으로부터 발췌된 것이다.
"원래 돼지 십이지장으로부터 분리된 28 아미노산 펩티드인 혈관활성 장 펩티드 (VIP)는 위장 조직 뿐만 아니라 아마 신경전달물질로서 신경 조직에도 존재하며, 다양한 생물학적 작용을 나타낸다. VIP가 글루카곤, 세크레틴 및 위장 억제 펩티드 (GIP)에 대해 유사성을 나타내기 때문에, 그것은 글루카곤-세크레틴 족의 성분으로서 간주되어 왔다. VIP (프레프로-VIP)를 코딩하는 mRNA의 주요 번역 생성물은 20 달톤의 분자량을 갖는다. 이또 (Itoh) 등 (1993)은 인간 VIP를 코딩하는 mRNA에 상보적인 DNA 서열을 클로닝하여 VIP 전구체가 VIP 뿐만 아니라 아미노말단 히스티딘 및 카르복시말단 메티오닌을 갖는 PHM27로 불리우는 27 아미노산의 신규 펩티드를 함유한다는 것을 발견하였다. 그것은 돼지 장으로부터 분리된 PHI17과 2 아미노산이 다르며, PHI27은 그의 명칭이 나타내는 바와 같이 카르복시말단 이소류신을 갖는다. 린더 (Linder) 등 (1987)은 VIP 및 PHM27에 대한 인간 유전자를 분리하였으며 래트의 각종 조직에서 그의 발현을 연구하였다. 하인즈-에리안 (Heinz-Erian) 등 (1985)은 VIP 뉴로펩티드에 의한 낭포성 섬유증 환자의 한선의 불완전한 개혁은 감소된 함수량 및 낭포성 섬유증을 특징화하는 염화물 및 다른 이온에 대한 상피의 상대적인 불투과성에 대한 기본적인 메카니즘일 수 있다는 것을 제안하였다. 이 가정을 시험하기 위하여, 고제스 (Gozes) 등 (1987)은 "후보 유전자"법을 채택하였다. 보드너 (Bodner) 등 (1985)은 VIP 및 PHM27이 인접 엑손에 의해 코딩된다는 것을 밝혀냈다. 고제스 (Gozes) 등 (1987)은 6q21-qter에서VIP 유전자의 존재를 검출하기 위하여 PHM-27을 코딩하는 게놈 단편을 사용하였다. 따라서, 그들은 낭포성 섬유증의 주요 원인에 대한 후보 물질로서의 결함있는 VIP 유전자 (염색체 7에 의해 코딩됨)를 제거하였다. 고제스 등 (1987)은 현장 혼성화 기술에 의해 VIP 유전자의 위치를 6q24로 하였다. 이것은 6q22에 위치하는 MYB의 부위 (189990)에 VIP를 두었다. 고제스 등 (1987)은 신경 조직에서 2 유전자 사이의 기능적인 관계를 연구하였다. 그들은 3일된 래트의 해마에서 MYB mRNA의 예리한 최대를 관찰하였으며, 바로 전에는 8일된 래트의 이 부분에서 일어나는 VIP mRNA의 최대를 나타내었다. 오마리 및 카그노프 (Omary and Kagnoff) (1987)는 인간 결장 선암종 세포주에서 VIP에 대한 핵 수용체를 발견하였다. 고또 (Gotoh) 등 (1988)은 분류된 염색체에 대한 유전자의 분자 클로닝된 단편의 스팟 블롯 혼성화에 의해 VIP의 위치를 염색체 6으로 정하였다. 이러한 정위화는 현장 혼성화에 의해 6q26-q27로 다시 정해졌다."
나타낸 바와 같이, VIP 및 그의 관련된 수용체에 대한 배경 기술은 빅터 에이. 맥쿠식 등 (ibid)에 의해 제공되었다. VIPR1 또는 VPAC1에 관한 다음 텍스트는 그 원문으로부터 발췌된 것이다.
"혈관활성 장 펩티드 (VIP; 192320)는 중추신경계의 콜린 전시냅스성 신경단위에서 또한 다양한 조직을 신경 분포시키는 말초 펩티드 신경단위에서 주로 발견되는 옥타코사머 신경내분비 매개인자이다. 면역 기능을 갖는 많은 신경내분비 펩티드 중에서 VIP는 B 및 T 세포 둘다에 직접 영향을 미치는 그의 능력에 의해 구별된다. 신경, 호흡, 위장 및 면역 세포의 독특한 서브셋은 아데닐레이트 시클라아제를 활성화할 수 있는 구아닌 뉴클레오티드 결합 (G) 단백질과 관련이 있는 VIP에 대한 특정의 고친화력 수용체가 있다. 리베르트 (Libert) 등 (1991)은 갑상선 cDNA로부터 선택적인 증폭 및 클로닝을 하여 G 단백질 결합된 수용체 족의 4개의 신규 수용체를 얻었다. 이들 중의 하나인 RDC1은 스리드하란 (Sreedharan) 등 (1991)에 의해 VIP 수용체로서 확인되었다. 리베르트 등 (1991)은 현장 혼성화에 의해 VIPR 유전자의 위치가 2q37임을 확인하였다. 나중의 정보는 2q37에 위치한 유전자가 사실상 VIP 수용체 유전자였다는 것을 의심스럽게 만든다 (Vassart, 1992). 스리드하란 (Sreedharan) 등 (1991)에 의해 GPRN1로 정해지고 2q37로 맵핑된 서열은 웬거 (Wenger) (1993)에 의해 VIP를 결합시키지 않는 것으로 밝혀졌다. 스리드하란 등 (1995)은 진정한 타입 I VIP 수용체 유전자를 분리하였으며 형광 현장 혼성화에 의해 그것을 소세포 폐암과 관련된 부위의 3p22 밴드에 그것을 위치시켰다. 하시모토 (Hashimoto) 등 (1999)은 종간 역교잡 분석에 의해 인간 염색체 3p와 같은 염색분체에 여러개의 유전자가 얹혀있는 상동성을 나타내는 부위인 염색체 9의 원위 영역에서 마우스 Vipr1 유전자의 위치를 확인하였다. 스리드하란 등 (1993)은 인간 장 VIP 수용체 유전자를 클로닝시켰으며 아미노산 서열이 래트 폐 VIP 수용체와 84% 동일성을 나타내는 것으로 추론하였다. 쿠비누 (Couvineau) 등 (1994)은 인간의 공장 상피세포 cDNA 라이브러리로부터 2 VIPR cDNA 클론을 분리하였다. 하나는 다른 G 단백질 결합 수용체와 같이 460 아미노산으로 이루어지고 7개의 추정 트랜스멤브레인 도메인을 갖는 VIP 수용체를 코딩한다. 다른 것은 C-말단 부위에서 428 아미노산에 대해 기능적인 VIP 수용체와 100% 상동성을 나타내지만, 완전히 서로 다른 67 아미노산 N-말단 도메인을 함유하는 495-아미노산 VIP 수용체 관련된 단백질을 코딩한다. COS-7 세포에서 발현될 때, 제2 단백질은 방사 요오드화된 VIP에 결합하지 않지만, 그것은 면역형광 연구에 의해 평가되는 바와 같이 혈장 멤브레인에서 정상적으로 집중된다. 타입 II PACAP 수용체 (PACAP 수용체의 다른 타입에 대한 102981 참조)로도 불리우는 타입 I VIP 수용체는 스피드하란 등 (1995)에 의해 약 22 kb로 확대되고 13 엑손 (42 내지 1400 bp 범위) 및 12 인트론 (0.3 내지 6.1 kb 범위)으로 구성되는 것으로 밝혀졌다. 스피드하란 등 (1995)은 또한 그 유전자의 프로모터 및 5 프라임 플랭킹 부위를 특징화하였다."
나타낸 바와 같이, VIP 및 그의 관련된 수용체에 대한 배경 기술은 빅터 에이. 맥쿠식 등 (ibid)에 의해 제공되었다. VIPR2 또는 VPAC2에 관한 다음 텍스트는 그 원문으로부터 발췌된 것이다.
"혈관활성 장 펩티드 (VIP; 192320) 및 뇌하수체 아데닐레이트 시클라아제 활성화 폴리펩티드 (PACAP; 102980)는 신경전달물질 및 신경내분비 호르몬으로서 기능하는 상동성 펩티드이다. VIP 및 PACAP에 대한 수용체가 상동성을 갖긴 하지만, 그들은 그의 기질 특이성 및 발현 패턴이 서로 다르다 (VIPR1 (192321) 및 ADCYAP1R1 (102981) 참조). 스보보다 (Svoboda) 등 (1994)은 VIP 수용체 중에서 보존된 서열을 기초로 한 프라이머를 사용하여 엄격도가 약한 PCR을 수행하였다. 그들은 림프구 cDNA 라이브러리로부터 인간 VIP2 수용체 유전자를 클로닝하였다. 이 유전자는 래트 VIP2 수용체와 86% 동일성을 갖는 438 아미노산 폴리펩티드를 코딩하였다. 그들은 차이니스 햄스터 난소 세포에서 인간 VIP2 수용체를 발현시켰으며 그것이 PACAP-38, PACAP-27, VIP 및 헬로더민에 결합하고, 이들 임의의 펩티드에 대한 수용체의 결합이 아데닐레이트 시클라아제를 활성화시킨다는 것을 발견하였다. 펩티드 결합은 GTP에 의해 억제되는 것으로 밝혀졌다. 아다무 (Adamou) 등 (1995)은 인간 태반 cDNA 라이브러리로부터 VIP2 수용체 유전자를 클로닝하였다. 노던 블롯팅은 VIPR2가 골격근에서 고도로 또한 심장, 뇌, 태반 및 췌장에서 낮은 정도로 4.6 kb 및 2.3 kb의 2 전사체로서 발현됨을 밝혀냈다. 맥케이 (Mackay) 등 (1996)은 인간 염색체 7q36.3에 VIPR2 유전자의 위치를 확인하기 위해 형광 현장 혼성화를 이용하였다. 전전뇌 타입 3 (HPE3; 142945)가 있는 환자로부터 유래된 세포주에 의한 또다른 맵핑은 VIPR2 유전자가 HPE3 최소 기준 영역 내에 있다는 것을 밝혀냈다. 맥케이 등 (1996)은 VIPR2가 HPE3 표현형에 기여할 수 있긴 하지만, 그것이 원인이 되는 유일한 인자가 아니라는 것을 명시하였다."
AC (아데닐레이트 시클라아제)
본 발명의 한 면에 따라서, PcAMP표적은 AC이다.
AC에 대한 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열은 문헌에서 찾아볼 수 있다.
VIP가 세포내 cAMP 농도의 상승 및 이후의 아데닐레이트 시클라아제의 활성화를 통한 혈관이완을 유도하는지를 확인하기 위하여, 본 발명자들은 VIP 자극 중의 질 cAMP 농도를 측정하였으며, cAMP/아데닐레이트 시클라아제 경로를 활성화하는 효과를 모방하기 위해 아데닐레이트 시클라아제 활성화제인 포르스콜린을 사용하였다.
이 연구에서, 본 발명자들은 VIP 처치 및 포르스콜린 처치가 분리된 질 조직에서의 세포내 cAMP 농도를 상승시킨다는 것을 발견하였다.
본 발명자는 또한 포르스콜린이 성적 흥분의 동물 모델에서 질 혈류량을 증가시킨다는 것을 발견하였다.
또한, 본 발명자는 포르스콜린이 분리된 질에서 이완을 유도한다는 것을 발견하였다.
AC에 대한 배경 기술은 빅터 에이. 맥쿠식 (Victor A. McKusick) 등에 의해 http://www3.ncbi.nlm.nih.gov/Omim/searchomim.htm.에 제공되어 있다. AC에 관한 다음 내용은 그 원문으로부터 발췌된 것이다.
"아데닐일 시클라아제 (EC 4.6.1.1)는 ATP의 시클릭 AMP로의 형질변형을 촉매한다. 효소 활성은 몇가지 호르몬에 의해 조절되며 다른 폴리펩티드는 신호를 수용체로부터 촉매 성분으로 형질도입하는 데 참여한다. 자극 또는 억제 수용체 (Rs 및 Ri)는 GPTase 활성을 나타내는 G 단백질 (Gs 및 Gi)과 상호작용하며 그들은 아데닐일 시클라아제의 촉매 서브유닛의 활성을 조절한다. 파르마 (Parma) 등 (1991)은 그들에 의해 HBAC1로 부호화된 인간 뇌 아데닐일 시클라아제에 상응하는 cDNA를 클로닝하였다. 스텐겔 (Stengel) 등 (1992)은 인간 뇌 cDNA 프로브를 이용하여 중기 염색체 확대에 대한 현장 혼성화에 의해 그 유전자가 8q24.2 상에 위치함을 나타내었다. 고도의 상동유전자 ADCY2 (103071)는 동일한 방법으로 5p15.3으로 지정되었다."
일반적인 재조합 DNA 방법론 기술
일반적으로 본원에 언급된 기술은 당업계에 공지되어 있긴 하지만, 특히 샘브룩 등의 문헌 (Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1989) and Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4thEd, John Wiley & Sons, Inc.)을 참고로 할 수 있다. PCR은 US-A 4683195, US-A 4800195 및 US-A 4965188에 기재되어 있다.
요약
요약하면, 본 발명은 다음에 관한 것이다:
1. FSD, 특히 FSAD를 앓고 있는 여성의 성기에서 cAMP를 상승작용시킬 수 있고, 제약학상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 임의로 혼합되는 약제를 포함하는, FSD, 특히 FSAD의 치료에 사용하기 위한 (또는 사용시의) 제약 조성물;
2. FSD, 특히 FSAD의 치료용 의약 (예를 들면, 제약 조성물)의 제조에 사용되는, FSD, 특히 FSAD를 앓고 있는 여성의 성기에서 cAMP를 상승작용시킬 수 있는 약제의 용도;
3. FSD, 특히 FSAD를 앓고 있는 여성의 성기에서 cAMP를 상승작용시킬 수 있고, 여성의 성기에서 cAMP의 상승작용을 일으키는 양이고, 제약학상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 임의로 혼합되는 약제를 여성에게 전달시키는 것을 포함하는, FSD, 특히 FSAD를 앓고 있는 여성의 치료 방법;
4. 약제가 cAMP를 직접 또는 간접적으로 상승작용시킬 수 있는지를 확인하는 단계를 포함하고; 상기 약제의 존재하의 cAMP의 상승작용이 그 약제가 FSD, 특히FSAD의 치료에 유용할 수 있음을 나타내는 것인, FSD, 특히 FSAD를 치료하는 데 사용될 수 있는 약제를 확인하기 위한 검정 방법.
다른 실시형태에서, 본 발명은 다음에 관한 것이다:
5. FSD, 특히 FSAD를 앓고 있는 여성을 치료할 수 있으며, 제약학상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 임의로 혼합되고, 다음 중의 하나 이상으로부터 선택되는 약제를 포함하는, FSD, 특히 FSAD의 치료에 사용하기 위한 (또는 사용시의) 제약 조성물:
cAMP 유사물
I:PDEcAMP
I:PDEncAMP
I:NPY
I:NPY Yn
I:NEP
U:AcAMP
A:AC
A:VIPr
A:VIPn
I:I:VIPr
I:I:VIPn
PcAMP
6. FSD, 특히 FSAD의 치료용 의약 (예를 들면, 제약 조성물)의 제조에 사용되는, FSD, 특히 FSAD를 앓고 있는 여성을 치료할 수 있으며, 다음 중의 하나 이상으로부터 선택되는 약제의 용도;
cAMP 유사물
I:PDEcAMP
I:PDEncAMP
I:NPY
I:NPY Yn
I:NEP
U:AcAMP
A:AC
A:VIPr
A:VIPn
I:I:VIPr
I:I:VIPn
PcAMP
7. FSD, 특히 FSAD를 앓고 있는 여성을 치료할 수 있으며, 제약학상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 임의로 혼합되고, 다음 중의 하나 이상으로부터 선택되는 약제를 여성에게 전달시키는 것을 포함하는, FSD, 특히 FSAD를 앓고 있는 여성의 치료 방법:
cAMP 유사물
I:PDEcAMP
I:PDEncAMP
I:NPY
I:NPY Yn
I:NEP
U:AcAMP
A:AC
A:VIPr
A:VIPn
I:I:VIPr
I:I:VIPn
PcAMP
8. 추정 약제가 다음 중의 하나 이상으로서 작용할 수 있는지를 확인하는 단계를 포함하고;
cAMP 유사물
I:PDEcAMP
I:PDEncAMP
I:NPY
I:NPY Yn
I:NEP
U:AcAMP
A:AC
A:VIPr
A:VIPn
I:I:VIPr
I:I:VIPn
PcAMP
그 추정 약제가 다음 중의 하나 이상으로서 작용할 수 있다면,
cAMP 유사물
I:PDEcAMP
I:PDEncAMP
I:NPY
I:NPY Yn
I:NEP
U:AcAMP
A:AC
A:VIPr
A:VIPn
I:I:VIPr
I:I:VIPn
PcAMP
그 약제는 FSD, 특히 FSAD의 치료에 유용할 수 있는 것인, FSD, 특히 FSAD를 앓고 있는 여성을 치료하는 약제를 확인하기 위한 검정 방법.
다른 실시형태에서, 본 발명은 다음에 관한 것이다:
9. 여성의 성기에서 cAMP 신호화를 향상시킬 수 있으며, 제약학상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 임의로 혼합되는 약제를 포함하는, 성기 (예를 들면, 질 또는 음핵) 혈류량을 증가시키는 데 사용하기 위한 (또는 사용시의) 제약 조성물;
10. 여성의 성기 (예를 들면, 질 또는 음핵) 혈류량 증가용 의약 (예를 들면, 제약 조성물)의 제조에 사용되는, 여성의 성기에서 cAMP 신호화를 향상시킬 수 있는 약제의 용도;
11. 여성의 성기 (예를 들면, 질 또는 음핵) 혈류량을 증가시키도록 여성의 성기에서 cAMP 신호화를 향상시킬 수 있는 약제를 여성에게 전달시키는 것을 포함하는 여성의 치료 방법.
본 발명은 이제 다음 도면들을 참고로 예시의 목적으로만 설명될 것이다.
상세히 살펴보면,
도 1: - 골반 신경의 전기 자극은 성적 흥분의 마취된 토끼 모델에서 질 혈류량의 빈도수 의존성 증가를 유도한다. 자극 빈도수를 증가시키는 것은 혈류량의 더 큰 증가를 유도한다. 변화는 레이저 도플러 기술을 이용하여 모니터하였다.
도 2: - 혈관활성 장 펩티드 (VIP)는 성적 흥분의 마취된 토끼 모델에서 질 혈류량의 증가를 유도한다. 도 2a는 질 혈류량이 VIP의 관주 (정맥내 볼루스)에 의해 농도 의존 방식으로 어떻게 증가되는 가를 예시한다. 도 2b는 VIP의 2회 반복 관주가 혈류량의 유사한 증가를 나타냄을 입증한다. 반응 기간도 또한 유사함에 주목한다. 모든 변화는 레이저 도플러 기술을 이용하여 모니터하였다.
도 3: - 혈관활성 장 펩티드 (VIP)는 성적 흥분의 마취된 토끼 모델에서 평균 동맥 혈압을 저하시킨다. 이 그래프는 마취된 토끼에서 평균 동맥압에 대해 질 혈류량을 연구하는데 이용되는 혈관활성 약제 및 자극 파라미터가 미치는 전형적인 효과를 예시한다. 이러한 관찰된 효과는 시험된 모든 동물에서 보여지는 전형적인양식이다. VIP가 평균 동맥 혈압의 상당한 저하를 유도하였지만, 골반 신경 자극, 헵살린의 대조군 관주 또는 PDEcAMP또는 NEP의 억제제는 혈압에 영향을 미치지 않았다. VIP 관주와 관련된 혈압 저하는 또한 심박동수의 큰 증가와 관련이 있다.
도 4: - cAMP/아데닐레이트 시클라아제 경로의 활성화는 질 조직에서의 VIP 매개된 혈관이완 및 평활근 이완을 모방한다. 도 4a는 포르스콜린 (40 nmol/㎏ 정맥내 볼루스, a cAMP 유사물)의 관주는 질 혈류량의 상당한 증가를 유도하는 것을 나타낸다. 반응의 진폭 및 기간은 VIP (20.0 ㎍/㎏ 정맥내 볼루스)에 의해 유도된 것과 유사하다. 흥미롭게도, 혈류량에 대한 효과는 질 외벽에 대해 더 긴 작용 기간을 갖는다. 모든 변화는 레이저 도플러 기술을 이용하여 모니터하였다. 도 4b는 VIP (0.1 μM) 및 포르스콜린 (10 μM) 둘다가 cAMP의 세포내 농도를 래트 질 내의 기저 농도 이상으로 상당히 상승시키는 것을 나타낸다. 도 4c는 포르스콜린이 IC50~300 nM로 미리 수축된 (1 μM 페닐에프린) 래트 질 조각의 강력한 이완을 유도한다는 것을 나타낸다. 모든 변화는 생체내 레이저 도플러 기술, 생화학적 cAMP 효소 면역검정법 또는 시험관내 조직 이완을 이용하여 정량화하였다.
도 5: - VIP의 관주는 음핵 혈류량을 증가시키며, cAMP/아데닐레이트 시클라아제 경로의 활성화는 성적 흥분의 마취된 토끼 모델에서 VIP 매개된 음핵 혈관이완을 모방한다. VIP (60-200 ㎍/㎏)의 관주는 농도 의존성 음핵 혈류량 증가를 유도한다. 음핵 혈류량의 115% 증가는 VIP의 200 ㎍/㎏ 정맥내 관주 후에 관찰되었다. 음핵 혈류량에 대한 VIP의 효과는 cAMP 유사물 포르스콜린 (FSK, 40 nmol/㎏정맥내 볼루스)의 관주에 의해 모방될 수 있다. 음핵 혈류량의 156% 증가는 포르스콜린의 40 nmol/㎏ 정맥내 관주 후에 관찰되었다. 모든 증가는 대조군 관주 (헵살린)로부터 상당히 상승되었다. 반응의 진폭은 VIP (200 ㎍/㎏, 정맥내 볼루스)에 의해 유도된 것과 유사하며 도 2 및 4에서 질 혈류량에 대해 관찰된 것과 비교할 만 하다. 모든 변화는 생체내 레이저 도플러 기술을 이용하여 정량화하였으며, 비히클 관주 (헵살린)와 비교할 때 상당히 증가되었다.
도 6: - NEP EC 3.4.24.11의 선택적 억제제는 성적 흥분의 마취된 토끼 모델에서 골반 신경 자극된 (PNS) 질 혈류량의 증가를 향상시킨다. 15분 간격의 반복 PNS는 질 혈류량의 재현가능한 증가를 유도한다 (백색 막대). NEP 억제제의 투여 (회색 막대)는 시간에 따른 대조군 자극 중에 또는 비히클 대조군 (빗금 막대)에서 관찰된 증가에 비해 가장 적은 자극 빈도수 (예를 들면, 4 ㎐)에 의해 유도된 질 혈류량의 최대 증가를 향상시켰다. 다음의 투여량 의존성 증가는 0.3 ㎎/㎏ 정맥내 관주가 40% 증가를; 1.0 ㎎/㎏ 정맥내 관주가 91% 증가를 유도하였음을 관찰하였다 (평균 n = 3). NEP 억제제는 기저 수준 (비자극된) 질 혈류량에 효과가 없다 (데이타는 나타내지 않음). 모든 변화는 레이저 도플러 기술을 이용하여 모니터하였다.
도 7: - NEP EC 3.4.24.11의 선택적 억제제는 성적 흥분의 마취된 토끼 모델에서 VIP 유도 질 혈류량의 증가를 향상시킨다. 30분 간격의 VIP의 반복 관주는 질 혈류량의 재현가능한 증가를 유도한다 (도 2b 참조). NEP 억제제는 이러한 증가가 예를 들면 6.0 ㎍/㎏의 VIP의 가장 적은 투여량에 의해 유도될 때 증가된 혈류량의 진폭을 크게 하고 기간을 연장시킨다. 질 혈류량의 최대 증가를 유도하는 VIP의 투여량, 예를 들면 60 ㎍/㎏에서, NEP 억제제는 증가된 혈류량의 기간 만을 연장시킨다. NEP 억제제 존재 하에 VIP 유도 증가는 막힌 삼각형으로 표시되고 대조군 VIP 반응은 비어있는 삼각형으로 표시된다. 헵살린의 대조 관주는 반응의 진폭에 대해 효과가 없다. 모든 변화는 레이저 도플러 기술을 이용하여 모니터하였다.
도 8: - PDEcAMP타입 2의 선택적 억제제는 성적 흥분의 마취된 토끼 모델에서 골반 신경에 의해 자극된 (PNS) 질 혈류량의 증가를 향상시킨다. 15분 간격의 반복 PNS는 질 혈류량의 재현가능한 증가를 유도한다 (백색 사각형). PDEcAMP타입 2 억제제의 투여는 시간에 따른 대조군 자극 (비어있는 사각형) 중에 관찰된 증가에 비해 가장 적은 자극 빈도수 (검정 사각형; 4 ㎐)에 의해 유도된 질 혈류량의 최대 증가를 향상시켰다. PDE2 억제제의 관주 (500 ㎍/㎏)는 질 혈류량의 86.8 ± 21.9% 증가를 유도하였다 (평균 ± sem n = 2). 모든 변화는 레이저 도플러 기술을 이용하여 모니터하였다.
도 9: - PDEcAMP타입 2의 선택적 억제제는 성적 흥분의 마취된 토끼 모델에서 VIP 유도 질 혈류량의 증가를 향상시킨다. 30분 간격의 VIP의 반복 관주는 질 혈류량의 재현가능한 증가를 유도한다 (도 2b 참조). 선택적인 PDEcAMP타입 2 억제제 (25 ㎍/㎏ 정맥내 볼루스)는 VIP (60 ㎍/㎏ 정맥내 볼루스)에 의해 유도된 증가된 질 혈류량의 기간을 연장시킨다. PDEcAMP억제제의 존재 하에 VIP 유도 증가는 막힌 삼각형으로 표시되고 대조군의 VIP 반응은 비어있는 삼각형으로 표시된다. 헵살린의 대조군 관주는 반응의 진폭에 대해 효과가 없다. 모든 변화는 레이저 도플러 기술을 이용하여 모니터하였다.
도 10: - NPY Y1 수용체의 선택적 길항제는 성적 흥분의 마취된 토끼 모델에서 골반 신경 자극된 (PNS) 질 혈류량의 증가를 향상시킨다. 15분 간격의 반복 PNS는 질 혈류량의 재현가능한 증가를 유도한다 (데이타는 나타내지 않음). NPY Y1 길항제의 투여 (회색 막대)는 시간에 따른 대조군 자극 중에 또는 비히클 대조군 (빗금 막대)에서 관찰된 증가에 비해 가장 적은 자극 빈도수 (예를 들면, 4 ㎐)에 의해 유도된 질 혈류량의 최대 증가를 향상시켰다. 다음의 투여량 의존성 증가는 0.01 ㎎/㎏ 정맥내 관주가 15.8 ± 19.6% 증가를; 0.03 ㎎/㎏ 정맥내 관주가 35.1 ± 17.17% 증가를; 0.10 ㎎/㎏ 정맥내 관주가 60.1 ± 16.9% 증가를; 0.3 ㎎/㎏ 정맥내 관주가 91.9 ± 27.4% 증가를 유도하였음을 관찰하였다 (평균 ± sem n = 3). NPY Y1 길항제는 기저 수준 (비자극된) 질 혈류량에 대해 효과를 나타내지 않았다 (데이타는 나타내지 않음). 모든 변화는 레이저 도플러 기술을 이용하여 모니터하였다.
도 11은 본 발명의 약제가 내인성 cAMP 농도를 증가시킴으로써 질 혈류량을 증가시키는데 매우 유용하다는 것을 나타내는 본원에 제공된 데이타의 일부에 대한 요약 그래프를 제공한다.
도 12: - NEP EC 3.4.24.11의 선택적인 억제제는 성적 흥분의 마취된 토끼 모델에서 골반 신경에 의해 자극된 (PNS) 음핵 혈류량의 증가를 향상시킨다. NEP 억제제의 투여 (회색 막대)는 시간에 따른 대조군 자극 중에 또는 비히클 대조군 (빗금 막대)에서 관찰된 증가에 비해 가장 적은 자극 빈도수 (예를 들면, 4 ㎐)에 의해 유도된 음핵 혈류량의 최대 증가를 향상시켰다. 다음의 투여량 의존성 증가는 1.0 ㎎/㎏ 정맥내 관주가 131% 증가를 유도하였음을 관찰하였다 (평균 n = 3). NEP 억제제는 기저 수준 (비자극된) 음핵 혈류량에 대해 효과를 나타내지 않았다. 모든 변화는 레이저 도플러 기술을 이용하여 모니터하였다.
cAMP 활성/농도를 측정하기 위한 검정
바이오트랙 (Biotrak) cAMP 효소 면역검정법 (EIA) 키트 (Amersham Life Sciences RPN 225)을 이용한 질 조직 샘플로부터의 cAMP의 측정
cAMP 농도는 질 조직 샘플에서 EIA에 의해 측정된다. EIA는 제한량의 cAMP 특이적 항체에 대한 비표지된 cAMP 및 일정량의 퍼옥시다아제 표지된 cAMP의 경쟁을 기준으로 한 것이다.
1. 재료
모든 재료는 특별한 언급이 없으며 아머샴 라이프 사이언스 (Amersham Life Science) cAMP EIA 키트 (RPN 225)에 의해 공급된 것이다.
1.1 마이크로타이터 플레이트 - 당나귀 항-토끼 IgG로 코팅된 96 웰 플레이트
1.2 분석 완충액 - 재구성시 0.02% 소 혈청 알부민 및 0.5% 보존제를 함유하는 0.05 M 아세트산 나트륨 완충액 pH 5.8. 병의 함유물을 3 x 15 ㎖ 증류수 세척액을 이용하여 눈금있는 실린더로 옮긴다. 다음에, 최종 부피를 500 ㎖로 조절한다.
1.3 cAMP 표준액 (아세틸화 방법을 위한 것). 재구성시 0.02% 소 혈청 알부민 및 0.5% 보존제를 함유하는 0.05 M 아세테이트 완충액 pH 5.8 중의 10.24 pmol/㎖의 cAMP. 사용하기 위해 표준액을 분석 완충액 2.5 ㎖에 용해시킨다.
1.4 항혈청. 재구성시 0.02% 소 혈청 알부민 및 0.5% 보존제를 함유하는 0.05 M 아세테이트 완충액 pH 5.8 중의 항-cAMP 항체. 사용하기 전에, 항체를 분석 완충액 11 ㎖로 희석하고 함유물을 용해하기 위해 약하게 거꾸로 하여 혼합한다.
1.5 cAMP 접합체. 재구성 시에 0.02% 소 혈청 알부민 및 0.5% 보존제를 함유하는 0.05 M 아세테이트 완충액 pH 5.8 중의 cAMP 고추냉이 퍼옥시다아제. 사용하기 전에, 용액을 분석 완충액 11 ㎖로 희석하고 함유물을 용해하기 위해 약하게 거꾸로 하여 혼합한다.
1.6 세척 완충액. 재구성 시에 0.05% (v/v) 트윈 (Tween) (상표명) 20을 함유하는 0.01 M 포스페이트 완충액 pH 7.5. 병의 함유물을 3 x 15 ㎖ 증류수 세척액을 이용하여 눈금있는 실린더로 옮긴다. 다음에, 최종 부피를 500 ㎖로 조정한다.
1.7 TMB 기질. 20% (v/v) 디메틸포름아미드 중의 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (TMB)/과산화수소.
사용하기 위한 준비
1.8 아세틸화 시약. 2 ㎖ 아세트산 무수물, 4 ㎖ 트리에틸아민, 필요에 따라 준비됨.
1.9 황산 (1M). 1M 황산을 18M 저장물 (BDH)로부터 준비한다. 산 1.11 ㎖를 증류수 18.8 ㎖에 첨가한다.
2. 특정 장치
2.1 일회용 5 ㎖ 유리 시험관
2.2 분광광도 플레이트 리더 (스펙트라 맥스 190)
2.3 마이크로타이터 플레이트 진탕기 (Luckham R100)
3. 방법
· 조직 샘플 준비. 조직을 생리학적 염 용액, 예를 들면 효능제, cAMP 유사물 등의 5 ㎖ 샘플 중에서 적절한 예비 처리법으로 처리한다. 처리한 후에, 샘플을 액체 질소에 급속 동결시키고 해머를 사용하여 분쇄한다. 그 분말을 원심분리관에 긁어 넣고 0.5 M 빙냉 과염소산 (PCA) 1 ㎖를 첨가한다. 샘플을 와동 혼합하고 얼음 위에 1시간 동안 둔다.
· 조직 샘플로부터 cAMP 추출. 샘플을 4 ℃에서 5분 동안 10000 g에서원심분리시킨다. 상등액을 제거하고 다른 원심분리관에 넣는다. 펠렛을 -80 ℃에서 단백질 분석을 위해 둔다. 다음에, 상등액 샘플을 K3PO4를 이용하여 pH~6으로 중화시킨다. 4 ℃에서 5분 동안 10000 g에서 원심분리시킨다. 상등액을 회수하고 물로 포화된 디에틸 에테르 5 부피 (5 ㎖)로 4회 세척한다. 상부의 에테르 층은 각각의 세척 후에 폐기되어야 한다. 수층을 짧고 얇은 유리관에 옮기고 60 ℃에서 질소 증기 하에 건조시킨다. 건조된 추출물을 분석 완충액 1 ㎖에 용해시키고 필요하다면 냉장고에 저장한다 (또는 냉동될 수 있음).
· 저장물 시약을 실온으로 평형화한 후 가공 용액을 제조한다.
· cAMP 표준액을 표지된 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256 및 512 fmol 유리관에서 제조한다. 이것은 512 fmol 표준액을 제외하고는 모든 유리관에 분석 완충액 1 ㎖를 첨가함으로써 이루어진다. 아세틸화 표준액 (10.24 pmol/㎖) 1 ㎖를 2개의 최고 표준액 (256 및 512 fmol)에 첨가한다. 256 fmol 표준액을 와동시키고 1 ㎖를 128 fmol 표준액에 옮긴다. 용액 1 ㎖를 폐기하여 2 fmol 표준액이 될 때 까지 이것을 계속한다. 분석 완충액 1 ㎖를 함유하는 제로 표준액 관을 설치한다.
· 조직 추출 샘플을 (필요시에) 얼음 위에서 해동시키고 표지된 유리관에서 100 중의 1로 (10 ㎕ 샘플을 990 ㎕ 분석 완충액으로) 희석한다.
· 모든 표준액 및 샘플 중의 cAMP를 와동시키기 직전에 관의 측면을 따라 첨가되는 통풍 후드 중의 아세틸화 시약 100 ㎕를 첨가하여 아세틸화시킨다.
· 모든 표준액 및 샘플 50 ㎕를 96 웰 플레이트의 적절한 웰에 첨가하고, 분석 완충액 150 ㎕를 비특정의 결합 (NSB) 웰에 첨가한다.
· 3 내지 5 ℃에서 2시간 동안 인큐베이션시키기 전에 블랭크 (B) 및 NSB를 제외한 모든 웰에 항혈청 100 ㎕를 첨가한다.
· 인큐베이션시킨 후에, 3 내지 5 ℃에서 1시간 동안 더 인큐베이션시키기전에 B를 제외한 모든 웰에 cAMP-퍼옥시다아제 접합체 100 ㎕를 첨가한다.
· 플레이트를 거꾸로 뒤집어 회전시켜 비우고 각 웰을 세척 완충액 400 ㎕로 4회 세척하기 전에 흡수지 상에 블롯팅시킨다. 그 후, 임의의 잔류 세척 완충액을 제거하기 위하여 각 세척 플레이트를 재블롯팅시킨다. 그 다음으로, TMB 200 ㎕를 즉시 모든 웰로 분배한다.
· 1M 황산 100 ㎕를 모든 웰에 첨가하기 전에 플레이트를 실온에서 30분 동안 플레이트 진탕기 상에 놓는다. 광학 밀도를 30분 내에 450 ㎚에서 스펙트라 맥스 190 상에서 읽는다.
4. 표준
각 분석에서 다음의 표준 관을 설치한다:
4.1 분석 완충액 중의 표준액을 첨가한다
공지량의 cAMP를 분석 완충액에 가하여 분석 효능을 확인한다. 투여량 반응 곡선 중간에 있는, 분석 중 35 fmol/웰과 동등한 분석 완충액에 cAMP 70 pmol/㎖를 첨가한다.
표준액 1 ㎖ 까지: - 68.4 ㎕ 521 fmol/웰 표준
931.6 ㎕ 분석 완충액
4. 화합물의 플레이트에 대한 효과
기능 연구에 사용된 화합물이 96 웰 플레이트에 어떠한 효과를 나타내는지 또는 cAMP의 결합에 영향을 미치는지를 확인하기 위해 표준을 설정한다.
이것은 다음을 포함한다:
· 플레이트에 직접적으로 미치는 화합물의 효과를 평가하기 위해 분석 완충액에만 화합물을 첨가한다.
· 플레이트에 대한 cAMP의 결합에 미치는 화합물의 효과를 평가하기 위해 기본 농도의 cAMP를 함유하는 혈장에 화합물을 첨가한다.
5 nM 농도의 화합물을 각 표준액에 첨가한다. 과거에 관주 말기의 총 약물 농도가 약 150 내지 300 nM였기 때문에 5 nM이 선택된다. 샘플은 분석하기 전에 1:100으로 희석되므로, 5 nM은 관주 말기에 예상된 총 약물 농도 보다 더 큰 것을 참작한다.
5. 계산
스펙트라 맥스 플레이트 리더는 450 ㎚에서 광학 밀도 (OD)를 읽는다.
표준 곡선은 스펙트라 맥스 상에서 cAMP fmol/웰 (x 축)에 대해 %B/Bo (y 축)을 플롯팅함으로써 작성된다.
각 샘플 및 표준액에 대한 %B/Bo (% 결합력)은 다음과 같이 계산된다:
Bo = 제로 표준액 (방법 3.2 참조)
%B/Bo =
fmol/웰 부피는 각 샘플에 대해 표준 곡선으로부터 직접 읽을 수 있다. 각 쌍의 샘플의 평균을 취하기 전에 수치를 pmol/㎖로 전환시킨다.
fmol/웰에서 pmol/㎖로의 수치의 전환
fmol에서 pmol로 = 1000으로 나눔
웰 부피 = 50 ㎕ ... 이므로
샘플이 1/100으로 희석되면 전체 = 1 x 1000/1000 x 100/50 = 2
따라서, 모든 fmol/웰 수치는 2가 곱해져셔 pmol/㎖가 된다.
동물 시험 모델
시클릭 아데노신-3',5'-모노포스페이트 (cAMP)의 효과를 상승작용시키면 성적 흥분의 마취된 토끼 모델에서 질 혈류량의 증가가 일어난다
1.0 목적
1. 여성의 성적 흥분된 동물 모델을 개발하고 확인하기 위한 것이다.
2. 마취된 토끼에서 질 혈류량의 조절의 원인이 되는 메카니즘(들)을 확인하기 위한 것이다.
3. 질 및 음핵 혈류량의 증가를 위한 효과있는 방법을 확인하기 위한 것이다.
4. 질 평활근의 이완의 기초가 되는 메카니즘(들)을 연구하고 질 이완의 향상을 위한 효과있는 강화를 가능하게 하는 방법을 인정하기 위한 것이다.
2.0 도입
정상적인 성적 흥분 반응은 성적 흥분 중에 관찰되는 수많은 생리학적 반응으로 이루어진다. 질, 음순 및 음핵 충혈과 같은 이러한 변화는 성기 혈류량의 증가의 결과이다. 충혈은 혈장 누출을 통한 증가된 질 윤활, 증가된 질 탄력 (질 평활근의 이완) 및 질 및 음핵 민감성의 증가를 유도한다.
여성 성적 흥분 질환 (FSAD)은 폐경 전, 무렵 및 후 (±HRT) 여성의 40% 까지가 겪고 있는 만연된 성적 질환이다. FSAD의 주요 결과는 질 윤활의 부족 및 만족스러운 성적 감각의 부족으로서 나타나는 질 충혈 또는 팽윤의 감소이다. 이차적인 결과는 감소된 성욕, 성교 중의 고통 및 오르가즘에 도달하는데 있어서의 어려움을 포함한다. FSAD의 가장 공통적인 원인은 감소된 질, 음순 및 음핵 충혈에 이르게 하는 감소된 성기 혈류량이다 (Park, 1997; Goldstein, 1998; Berman, 1999a, Werbin, 1999).
본원에 설명한 바와 같이, 본 발명은 FSAD를 앓고 있는 여성에서 성기 혈류량을 증가시킴으로써 정상적인 성적 흥분 반응을 회복시키거나 상승작용시키는 수단을 제공한다.
본 발명자는 연구에서 성기 혈류량의 작은 변화를 측정하기 위한 레이저 도플러 기술을 이용하여 질 혈관이완의 매개인자로서 cAMP (시클릭 아데노신-3',5'-모노포스페이트)를 확인하였다. 본 발명자는 또한 VIP 대사의 억제제 (NEP EC3.4.24.11 억제제)를 이용하여 골반 신경 자극 (즉, 성적 흥분) 중에 관찰된 성기 혈류량의 증가가 VIP에 의해 매개된다는 것을 입증하였다. 이것은 성적 흥분의 동물 모델을 개발하고 데이타가 여성 성적 흥분 중에 관찰된 생리학적 변화를 반영함을 입증하는 것을 포함한다. 그 모델은 성기 혈류량, 예를 들면 cAMP에 의해 매개된 혈관이완의 직접 또는 간접적인 상승작용을 증가시키는 메카니즘을 확인하고 인정하는 데 이용되었다.
3.0방법
3.1 마취 방법
암컷 뉴질랜드 토끼 (~2.5 ㎏)를 메데토미딘 (도미토 (Domitor)(등록상표)) 0.5 ㎖/㎏ (근육내) 및 케타민 (베타라 (Vetalar) (등록상표)) 0.25 ㎖/㎏ (근육내)의 혼합물로 미리 처리하였다. 토끼를 호흡 부피이 약 18-20 ㎖이고 최대 기도 압력이 10 ㎝ H2O이며 분당 30-40 호흡의 호흡 속도로 유지되는 호흡기에 연결된 프로텍스(portex)(상표명) 되접히지 않는 기관내 관 3 ID를 사용하여 기관절개하였다. 다음에, 이소플루란에 연결하여 마취시키고 2 ℓ/분에서 O2로 호흡을 계속시켰다. 우측 가장자리 귀 정맥에 23G 또는 24G 카테터를 사용하여 카뉼레 삽입시키고, 유산을 가한 링거액을 0.5 ㎖/분으로 관류시켰다. 토끼를 침습 수술 중에 3% 이소플루란으로 유지하고 마취를 유지하기 위해 2%로 저하시켰다.
3.2 용기의 카뉼레 삽입
토끼의 왼쪽 서혜부 면을 면도하고 넓적다리를 따라 약 5 ㎝ 길이로 수직 절개하였다. 대퇴부 정맥 및 동맥을 노출시키고, 분리하고 약물 및 화합물을 관주하기 위해 PVC 카테터 (17G)로 카뉼레 삽입시켰다. 카뉼레 삽입을 대퇴부 동맥에 대해 반복하고, 카테터를 복대동맥에 도달하도록 10 ㎝ 깊이로 삽입하였다. 이 동맥 카테터를 혈압을 기록하기 위해 고울드 (Gould) 시스템에 연결하였다. 혈액 가스 분석을 위한 샘플을 동맥 카테터를 통해 취하였다. 수축 및 확장 압력을 측정하고, 평균 동맥압을 수학식 (확장 x 2 + 수축) ÷ 3을 이용하여 계산하였다. 심박동수를 펄스 산소계 및 포-네-마 (Po-ne-mah) 데이타 준비 소프트웨어 시스템(Ponemah Physiology Platform, Gould Instrument Systems Inc)을 통해 측정하였다.
3.3 골반 신경의 자극
복부 중선 절개를 복강에 실시하였다. 절개는 치골 바로 위 약 5 ㎝ 길이로 이루어졌다. 지방 및 근육을 신체의 강(腔) 아래로 흐르는 하복부 신경이 드러나도록 무디게 절개해냈다. 치골 위에 있는 대퇴부 정맥 및 동맥이 손상되지 않도록 하기 위해 치골 벽의 측면 곡선에 가까이 유지하는 것이 중요하다. 좌골 및 골반 신경은 더 깊이 있어 토끼의 등쪽을 더 절개한 후에 위치한다. 일단 좌골 신경이 확인되면, 골반 신경의 위치는 쉽게 확인된다. 골반 신경이란 용어는 넓게 적용되며, 이 주제에 관한 해부학 책에서는 그 신경을 충분히 상세하게 확인할 수가 없다. 그러나, 그 신경의 자극은 질 및 음핵 혈류량, 및 골반 영역의 신경분포의 증가를 일으킨다. 골반 신경을 주위 조직으로부터 제거하고 하바드 (Harvard) 양극 자극 전극을 신경 주위에 놓았다. 그 신경을 조금 들어올려 약간의 장력을 주고, 전극을 그 위치에 고정하였다. 경 파라핀유 약 1 ㎖를 신경 및 전극 주위에 놓았다. 이것은 신경에 대해 보호 윤활제로서 작용하고 전극의 혈액 오염을 방지한다. 전극을 그래스 에스88 스티뮬레이터 (Grass S88 Stimulator)에 연결하였다. 골반 신경을 다음 파라미터시퀀스여 자극하였다: 5V, 펄스 폭 0.5 ms, 자극 기간 10초 및 빈도수 범위 2 내지 16 ㎐. 신경이 15 내지 20분 마다 자극될 때 재현가능한 반응이 얻어졌다.
빈도수 반응 곡선은 가장 밑의 반응으로서 사용하기 위한 최적 빈도수, 일반적으로는 4 ㎐를 확인하기 위해 각 실험의 개시시에 확인하였다. 연속 15분 자극 주기를 가능하게 하는 하바드 22 관주 펌프를 사용하여 대퇴부 정맥을 통해 시험될 화합물(들)을 관주하였다.
3.4 레이저 도플러 프로브의 위치 결정
치골의 미부에서 복부 중선 절개를 실시하여 치골면을 노출시켰다. 음핵의 피막이 노출되도록 연결 조직을 제거하여 벽을 소혈관으로부터 제거하였다. 다른 연결 조직을 제거하여 질 외벽도 노출시켰다. 레이저 도플러 플로우 프로브를 질에 3 ㎝ 삽입하여 프로브 축의 절반이 여전히 보이게 하였다. 제2 프로브를 위치시켜 그것이 음핵 외벽 바로 위에 놓이도록 하였다. 이 프로브들의 위치는 신호가 얻어질 때 까지 조정하였다. 제2 프로브를 질 외벽 위의 혈관 표면 바로 위에 놓았다. 두 프로브를 클램프로 위치 고정시켰다.
질 및 음핵 혈류량을 포-네-마 (Po-ne-mah) 데이타 획득 소프트웨어 (Ponemah Physiology Platform, Gould Instrument Systems Inc)를 사용하여 유량계로부터 직접 또는 고울드 종이 기록기 트레이스로부터 간접적으로 수치로 기록하였다. 실험의 개시시에 보정을 실시하였다 (0-125 ㎖/분/100 g 조직).
3.5 혈관활성 장 펩티드 (VIP)의 관주
관주된 VIP (Bachem, H-3775)의 투여량은 2.0, 6.0, 20.0, 60.0 ㎍/㎏ (정맥내)이었으며, 0.5 ㎖의 염수 중에 관주하였다. 대퇴부 정맥으로 3 방향 꼭지를 통해 500 ㎕/분으로 관주되는 하바드 22 펌프를 사용하여 VIP를 관주하였다. VIP 관주 후에, 카테터를 헤파린화된 염수 (헵살린)로 플러쉬시켜 VIP가 카테터에 남아있지 않도록 하였다.
VIP 관주를 이용하는 실험을 위해, 재현가능한 반응이 얻어질 수 있도록 하기 위하여 초기 감지 투여량 반응 곡선 (2-60 ㎍/㎏)이 필요하였다. 헵살린의 초기 관주 (50UI/㎖)는 음성 대조군으로서 작용하도록 관주하였다.
3.6 억제제의 관주
NEP (중성 엔도펩티다아제 EC3.4.24.11) 억제제, 포스포디에스테라아제 타입 5 (PDE5) 억제제 및 NPY Y1 길항제를 염수 또는 5% 포도당 용액 (관주용 물 1.8 ㎖ 중의 50% 포도당 200 ㎕)에서 만들었다. PDEcAMP억제제를 40% 에탄올 용액 (관주용 물/에탄올 1.8 ㎖ 중의 50% 포도당 200 ㎕)에 용해시켰다. 억제제 및 비히클 대조군을 VIP와 동일한 속도로 관주하였다. NEP 억제제는 VIP 투여량 반응 곡선 전에 30분 동안 두었고, NEP 억제제, NPY Y1 수용체 길항제 및 PDEcAMP억제제는 골반 신경 자극 전에 15분 동안 두었다.
3.7 분리된 토끼 질에서의 평활근 이완의 측정
3.7 (a) 토끼 질 시험관내 준비: - 암컷 뉴질랜드 백색 토끼 (2.0-3.0 ㎏)를 경부 탈구시켜 죽였다. 복강을 열고 질을 절개하였다. 조직 조각을 37 ℃에서 유지되고 95% O2/5% CO2로 가스 관주되는 크렙스 (Krebs) 중탄산염 완충액 중에 1.5 g의 초기 정지 장력에서 편조 실크 봉합 (6/0 게이지)으로 5 ㎖의 염수로 세척된 기관 챔버 (웨슬리 사)에 길이 방향으로 올려놓았다. 각 조직 조각의 상부 결찰사를 10 g 용량의 강제 배치 변환기에 부착하고 등장력의 변화를 DART 시험관내 데이타수집 시스템을 이용하여 측정 및 기록하였다. 조직을 1.5시간 동안 평형화되도록 두고 크렙스로 규칙적으로 세척하였다.
3.7 (b) 토끼 질의 혈관활성 장 펩티드 유도된 이완: 각 조직을 1 μM 조 농도의 페닐에프린을 이용하여 수축시켰다. 수축 반응이 안정한 수준기에 도달할 때 (~15분), VIP를 로그 단위로 기관 챔버에 누적 첨가하여 0.1 내지 100 nM의 농도로 만들었다. 이완 반응을 각 농도의 VIP를 첨가한 지 5분 후에 측정하였으며; 최대 이완은 이때에 이루어졌다. 다음에, 조직에 시험 약제 (예를 들면, NEP 또는 PDE 억제제) 또는 DMSO 비히클 (시간 맞추어진 대조군)을 관주하였다.
3.7 (c) VIP 이완 실험에 대한 데이타의 분석: - 각 VIP 농도 이완-반응 곡선의 경우에, VIP에 의해 유도된 이완 반응을 최대 페닐에프린에 의해 유도된 수축의 백분율로서 표시하였다. 그 다음, 이 수치를 로그 VIP 농도에 대해 플롯팅하고 S자형 곡선을 적용하였다. 곡선 적용을 위하여, 최소 이완 반응을 0%로 한정하고 최대 이완 반응은 자유롭게 적용되도록 하였다. 페닐에프린 수축을 50% 이완시키는 데 필요한 VIP의 농도 (EC50 PE)를 측정하였다.
3.7 (d) 토끼 질의 전기장 자극된 이완: - 토끼 질 조각을 단락 3.7 (a)에 기재한 바와 같이 제조하였다. 조직 조각을 약 4 ㎝ 떨어져 있는 기관 챔버의 상부 및 하부에 위치한 2개의 백금 전극 사이에 장착하였다. 각 조직을 1 μM 조 농도의 페닐에프린을 이용하여 수축시켰다. 수축 반응이 안정한 수준에 도달할 때 (15분), 조직에 예비 처리 전기장 자극 (EFS)에 의해 유도된 이완 곡선을 적용하였다. 이것은 0.5 밀리 초 펄스 폭의 10초 연속으로 전달되는 2, 4, 8 및 16 ㎐의 일련의 빈도수를 이용하여 40-60 볼트 사이에서 수행하였다. 조직을 각 빈도수 사이에 (5분) 기저선 예비수축 장력으로 반환되도록 하고 이완 반응의 크기를 기록하였다.
예비 처리 EFS 반응 곡선의 완결 후에, 모든 조직을 15분 동안 세척하여 조직이 기저선 장력으로 반환되도록 하였다. 그후에, 조직에 시험 약제 (예를 들면, NEP 또는 PDE 억제제, 질산 산화물 신타아제 [NOS] 억제제) 또는 DMSO 비히클 (시간 맞추어진 대조군)을 관주하였다. 화합물 또는 비히클의 첨가 후 15분에, 조직을 페닐에프린 (1 μM)으로 재수축시키고 EFS에 의해 유도된 이완 반응 곡선을 상기한 바와 같이 결정하였다.
EFS 실험을 위하여, 크렙스를 아트로핀 (10 μM) 및 구아네티딘 (150 μM)으로 보충하여 질의 임의의 콜린성 또는 아드레날린성 신경분포를 완전히 파괴하였다.
3.8 분리된 토끼 질의 cAMP 농도 측정
바이오트랙 (Biotrak) cAMP 효소 면역검정법 (EIA) 키트 (Amersham Life Sciences RPN 225)를 이용하여 질 조직 추출물로부터 cAMP 농도를 측정하였다. 분리된 질 조직 샘플을 시험 약제 (예를 들면, 포르스콜린 또는 VIP)로 처리하였다. 5분 후에, 샘플을 액체 질소로 급속 동결시키고, 균질화시키고 cAMP를 추출하였다. cAMP 농도는 EIA로 측정하였다. EIA는 제한량의 cAMP 특이적 항체에 대한 비표지된 cAMP 및 일정량의 퍼옥시다아제 표지된 cAMP 사이의 경쟁을 기준으로 한 것이다.
3.9 분리된 토끼 질의 포스포디에스테라아제 (PDE) 활성 측정
인간 질 벽 사이토졸 추출물은 에이비에스 인크. (ABS Inc.; Delaware) (공급자 41 및 60살)로부터 얻었다. PDE 동위효소를 모노-Q 음이온 교환 크로마토그래피로 분리하고 그의 기질 선택성, 입체성이 다른 조절인자 및 선택적인 억제제에 대한 민감성을 기준으로 특징화하였다. 특이적 PDE 동위효소 항체를 이용하여 웨스턴 분석법을 실시하여 인간 질 내의 PDE 발현을 검출하였다.
모든 데이타는 평균 ± s.e.m.으로서 기록하였다. 스튜던츠 (Student's) t-시험을 이용하여 상당한 변화를 확인하였다.
4.0 결과 및 논의
4.1 성적 흥분의 동물 모델
본 발명자는 연구에서 성적 흥분의 생리기능에 대한 확고한 재현가능 모델을 개발하였다. 이들 마취된 토끼 모델을 이용하여, 본 발명자는 레이저 도플러 기술을 이용하여 성기 혈류량의 작은 변화를 측정할 수 있다. 골반 신경의 자극은 성적 흥분의 신경 효과를 모방하는 데 이용된다.
본 발명자는 골반 신경의 자극이 질 및 음핵 혈류량의 빈도수 의존성 증가를 유도한다는 것을 발견하였다 (도 1 참조). 질벽 내 또는 외에 기록된 질 혈류량의 증가는 상당한 것이었다. 골반 신경의 자극은 2 ㎐에서 10.3 ± 1.8, 4 ㎐에서 20.0 ± 4.6, 8 ㎐에서 36.8 ± 4.8, 16 ㎐에서 46.6 ± 4.7 ㎖/분/100g 조직 (n=4) (15-20 V, 0.5 ms, 10s)의 평균 최대 질 혈류량 상승 및 2 ㎐에서 14.7 ±3.6, 4 ㎐에서 29.4 ± 1.4, 8 ㎐에서 69.7 ± 2.1의 음핵 혈류량 증가를 유도하였다. 이들 수치는 성적 흥분의 인간 연구 및 동물 모델에서 이미 관찰된 것과 유사한 진폭의 것이다 (Berman, 1999a; Park, 1997).
본 발명자는 골반 신경의 가장 적은 자극의 결과 성기 혈류량의 재현가능한 증가가 일어난다는 것을 발견하였다 (예를 들면, 15분 마다 4 ㎐의 자극은 8.50 ± 0.10 ㎖/분/100g 조직 n=8의 질 혈류량의 평균 증가를 일으키고 13.65 ± 0.86 ㎖/분/100g 조직 n=11의 음핵 혈류량의 평균 증가를 일으킴). 이러한 재현성은 최대 5시간 동안 유지된다. 본 발명자는 a) 성기 충혈을 매개하는 내인성 혈관활성 약제/메카니즘의 동일성, 및 b) 질 및(또는) 음핵 혈류량을 증가시키는 데 효능이 있을 수 있는 약물의 영향을 연구하기 위해 이들 반응의 재현성을 이용할 수 있다.
본 발명자는 마취된 토끼에서 골반 신경 자극과 관련이 있는 심혈관 부작용이 없다는 것을 발견하였다 (도 3 참조).
성기 혈류량은 증가된 동맥 혈액 공급을 통해 성적 흥분 (Berman, 1999) 중에 증가된다 - 질 동맥, 자궁 동맥의 질 줄기, 내부 외음부 동맥 및 중간 직장 동맥의 중간 줄기는 모두 질 및 음핵에 혈액을 공급하는 데 관련이 있다. S2/S4 척추 부위로부터 나온 골반 신경은 여성 질을 신경분포시키며 더 낮은 질, 음핵 및 관련 혈관으로 끝나는 줄기가 있다. 본 발명자는 골반 신경을 자극함으로써 성적 흥분 중에 관찰된 혈류량 효과, 즉 동맥 성기 혈류량의 증가를 모방할 수 있다. 흥미롭게도, 증가된 동맥 혈류량은 모세관 조직이 혈액으로 충혈되게 하는 정맥 흡인법에 의해 반영되지 않는다. 질 충혈은 증가된 혈장 누출을 통해 질 윤활을 유도하며, 이것은 성적 흥분 중에 관찰된 제1 골반 반응 중의 하나이다. 골반 신경 자극 시에 또는 성적 흥분 중에 방출되는 신경전달물질은 현재 확인되지 않는다. 질 및 음핵의 혈관계 및 미세혈관계를 신경 분포시키는 뉴로펩티드 및 다른 신경전달 후보 물질을 함유하는 신경은 면역조직화학적으로 확인되었다. 이 연구는 칼시토닌 유전자 관련 펩티드 (CGRP), 뉴로펩티드 Y (NPY), 질산 산화물 신타아제 (NOS), 물질 P 및 혈관활성 장 펩티드 (VIP)는 모두 인간 질 및 음핵을 신경지배하는 신경에 존재한다 (Hoyle, 1996; Burnett, 1997; Hauser-Kronberger, 1999).
4.2 성적 흥분의 마취된 토끼 모델의 확인
본 발명자는 이 모델을 이용하여 발생된 혈류량 데이타를 성적 흥분의 인간 모델에서 관찰된 것으로 해석하기 위하여, 미리 행해진 임상 연구에서 발생된 질 혈류량 및 심혈관 데이타와 본 발명자의 데이타를 직접 비교하였다.
본 발명자는 VIP 관주가 성적 흥분의 토끼 모델에서 다음의 효과를 나타낸다는 것을 발견하였다:
· 외인성 VIP (정맥내 볼루스)는 질 혈류량의 상당한 농도 의존성 증가를 유도한다 (도 2a 참조). 이러한 증가는 질벽 내 또는 외에 기록된 기저 혈류량 수치 이상으로 상당히 상승된다. 질 혈류량은 VIP의 정맥내 투여 (60 ㎍/㎏)에 의해 24.7 ± 3.6 ㎖/분/100g 조직 만큼 상당히 증가된다. 혈류량은 관주 후 약 11분 동안 기저 수준 이상으로 상승된 상태로 남아있었다. 더 낮은 투여량, 예를 들면 6.0 ㎍/㎏은 7.5 ± 1.3 ㎖/분/100g 조직 만큼의 혈류량 상승의 더 작은 증가를 유도하였으며 혈류량은 관주 후 7분 동안 상승되었다.
· 유사한 투여량의 VIP의 반복 관주 (30분 간격의 정맥내 관주)는 질 혈류량의 상당한 수준의 재현가능한 증가를 유도한다 (도 2b 참조).
· VIP (정맥내)은 심박동수를 증가시키며 평균 동맥 혈압을 감소시킨다 (도 3 참조). VIP (정맥내)는 6.0 ㎍/㎏에서 13.2 ± 0.7 mm Hg의 평균 동맥 혈압의 상당한 감소 및 분 당 16 ± 4 박동의 심박동수의 상당한 증가를 일으켰다.
이 동물 모델은 건강한 지원자에게 VIP를 관주할 때 관찰된 임상적 데이타, 즉 증가된 질 혈류량, 억제된 혈압 및 상승된 심박동수를 직접적으로 반영한다. 그러므로, 이 모델은 성적 흥분 중에 일어나는 생리학적 변화의 기초가 되는 메카니즘(들)을 연구하고 또한 질 혈류량의 증가 및 그에 따른 FSAD의 치료를 위한 새로운 방법을 확인하는 데 이용될 수 있다.
4.3VIP는 cAMP/아데닐레이트 시클라아제 경로의 자극을 통한 질 혈류량의 변화를 유도한다
오테센 (Ottesen) 및 공동 연구가들은 VIP가 건강한 지원자에서 질 혈류량의 증가 및 윤활을 유도한다는 것을 입증하였다. 그러나, VIP가 그 메카니즘에 의해 그의 효과를 발휘하는지는 불분명하다. 문헌에는, cGMP/구아닐레이트 시클라아제 (Ashur-Fabian, 1999), 일산화탄소/헴 옥시게나아제 (Fan, 1998) 및 cAMP/아데닐레이트 시클라아제 (Schoeffter, 1985; Gu, 1992; Foda, 1995)를 포함한 다른 2차 메신저 시스템을 통해 신호화하는 VIP의 많은 예가 있다. 이것은 자궁 동맥에서 VIP의 이완 효과가 질산 산화물의 방출에 의해 어떻게 설명될 수 있는지를 언급하는 최근의 보고에 의해 예증된다 (Jovanovic, 1998). 흥미롭게도, 또한 VIP가 남성비뇨생식 기능에서 NO/cGMP를 조절한다는 증거가 있으며 (Kim, 1994), VIP (0.5 μM)에 의한 인간 질 평활근 세포 배양물의 처치가 cAMP 농도를 상승시키지 못한다는 직접적인 증거가 있다 (Traish, 1999 ibid).
이 연구에서, 본 발명자는 VIP가 세포내 cAMP농도의 상승을 통해 혈관이완을 유도함을 밝혀냈다. 본 발명자는 일련의 기능적 실험을 수행함으로써 세포내 cAMP 농도를 생화학적으로 측정하는 것 이외에 혈류량 및 평활근 이완을 측정하였다. 본 발명자는 cAMP/아데닐레이트 시클라아제 경로를 활성화하는 효과를 모방하기 위해 아데닐레이트 시클라아제 또는 cAMP 유사물의 활성화제인 포르스콜린을 사용하였다. VIP 및 포르스콜린은 질 혈류량 및 이완에 대한 생리학적 흥분 효과 면에서 동일한 효과를 나타낸다.
VIP (20 ㎍/㎏) 및 포르스콜린 (40 nmol/㎏)은 각각 13.2 및 12.7 ㎖/분/100 ㎎ 조직의 질 혈류량의 상당한 증가를 유도한다 (도 2a 및 4a 참조). VIP 및 포르스콜린에 의해 유도된 이러한 진폭의 변화는 크게 다르지 않다. 이러한 증가는 질벽 내 또는 외에 기록된 기저 수준의 질 혈류량 수치 이상으로 상당히 증가된다.
VIP (0.1 μM) 및 포르스콜린 (10 μM)은 둘다 분리된 질 조직에서 세포내 cAMP 농도를 기저 수준 이상으로 상당히 증가시켰다 (도 4b 참조).
VIP (0.1 μM) 및 포르스콜린 (10 μM)은 기저 수준 농도를 276 nM에서 각각 156% 및 238% 상승시켰다. 이 백분율의 차이는 사용된 VIP 및 포르스콜린의 농도 차이를 반영한다. 예를 들면, VIP는 0.1 μM 농도에서 미리 수축 및 분리된 질을 약 80% 정도 이완시키고 이때 10 μM 포르스콜린은 분리된 조직을 완전히 이완시키는데 충분하다.
또한, 본 발명자는 VIP 및 포르스콜린이 각각 18.8 ± 0.6 nM 및 320 ± 20 nM의 EC50값으로 분리된 질 조직에서 이완을 유도한다는 것을 나타내었다 (도 4c 참조).
이들 데이타는 VIP가 cAMP/아데닐레이트 시클라아제 경로를 통해 질 혈관이완을 유도한다는 것을 입증하는 것이므로, 이 모델은 골반 신경 자극, 즉 성적 흥분이 VIP의 방출/cAMP/아데닐레이트 시클라아제 경로의 활성화를 유도하는지를 연구하는데 이용될 수 있다. 또한, 성적 흥분 중에 예를 들면 cAMP 신호화를 직접 또는 간접적으로 향상시킴으로써 질 혈류량을 증가시키는 방법이 연구될 수도 있다.
4.4 cAMP가 질 혈관이완의 매개인자이다
성적 흥분 중에 질 혈류량의 증가의 원인이 되는 신경전달물질 및 2차 메신저 후보 물질은 현재 확인되지 않았다. 지금까지, 연구가들은 질산 산화물 (NO)/cGMP 경로를 집중적으로 연구하였다. 본 발명자는 본 발명에 따라서 1) cAMP/아데닐레이트 시클라아제 경로가 VIP 유도 질 혈류량의 증가를 유도하고; 2) VIP가 성적 흥분 중에 방출되는 내인성 신경전달물질이고; 3) 내인성으로 방출된 VIP가 cAMP의 상승을 통해 그의 혈관이완 효과를 유도한다는 것을 입증하였다.
질 벽 이완의 원인이 되는 신경전달물질은 현재 확인되지 않았다. 본 발명자는 VIP가 골반 신경의 자극시 방출되는 신경전달물질이고 cAMP가 VIP 매개 혈관이완을 매개함을 밝혀냈다. VIP의 대사를 억제하거나 cAMP 신호화를 직접 향상시키는 약제, 예를 들면 각각 NEP 억제제 또는 PDEcAMP억제제는 골반 신경에 의해 자극된 질 혈류량의 증가를 향상시킨다 (하기 단락 참조).
연구에서, 본 발명자는 VIP 유도 질 이완에서 NO의 역할을 배제할 수 있음을 발견하였다. 효능있고 선택적인 PDE 타입 5 억제제는 분리된 질 평활근의 VIP 유도 이완에 대해 최소의 효과를 나타낸다 (VIP에 의해 유도된 이완의 30% 증가; 표 2 참조).
분리된 토끼 질의 VIP 매개 이완 증가
선택적인 투여량의 PDE 억제제 VIP 유도된 이완의 증가 백분율
PDEcAMP타입 1 210%
PDEcAMP타입 2 130%
PDEcAMP타입 3 220%
PDEcAMP타입 4 160%
PDEcGMP타입 5 효과 없음 (30%)
대조군 - 비히클 효과 없음
상기 표는 미리수축된 질 평활근의, VIP 유도 이완에 대한 EC50의 증가 백분율을 예시하였다 (1 μM 페닐에프린). PDEcAMP타입 1, 2, 3 및 4의 선택적인 억제제는 모두 VIP 매개 이완에 대해 상당히 상승작용하는 반면, PDEcGMP타입 5의 선택적인 억제제 또는 비히클 대조군은 VIP 매개 이완에 대해 효과가 없었다.
본 발명자는 또한 VIP가 분리된 질 평활근의 EFS 유도된 이완에 대해 부분적으로 원인이 되는 내인성 NANC (비아드레날린성, 비콜린성) 신경전달물질이라는 것을 밝혀냈다. 높은 투여량의 질산 산화물 신타아제 억제제 (L-NOARG, 300 μM)만이 EFS 유도 이완을 50% 억제한다. VIP의 NEP 유도 대사를 억제하고 따라서 VIP 신호화를 향상시킬 NEP 억제제 (1 μM)는 EFS에 의해 유도된 비질산 산화물 NANC 이완을 증가시킨다. 본 발명자는 NO 및 VIP가 둘다 질 벽의 평활근 긴장 상태를 조절한다는 것을 밝혀냈다. 치료학적으로 NO/cGMP 및(또는) VIP/cAMP 매개된 신호화를 향상시키는 약제로 질 평활근의 이완을 증가시킬 수 있을 것이다.
4.5VIP가 cAMP 경로를 통한 음핵 혈관이완을 유도한다
성적 흥분 중에 음핵 혈류량의 증가의 원인이 되는 신경전달물질 및 2차 메신저 후보 물질은 현재 확인되지 않았다. 질 혈류량에 대한 현재의 연구와 일치하여, 연구가는 질산 산화물 (NO)/cGMP 경로를 추측하고 연구를 집중해왔다. 신경단위를 함유하는 VIP가 음핵 조직에서 보이긴 하지만, VIP가 음핵 혈류량/충혈을 매개하는 데 역할을 한다는 보고는 없다 (Hauser-Kronberger et al., 1999).
이 연구에서, 본 발명자는
1. VIP의 관주가 음핵 혈류량을 증가시키고;
2. cAMP/아데닐레이트 시클라아제 경로가 VIP 유도 음핵 혈류량의 증가를 매개하고;
3. VIP가 성적 흥분 중에 방출되는 내인성 음핵 신경전달물질임을 입증한다.
1. VIP의 관주 (60-200 ㎍/㎏, 정맥내 볼루스)가 음핵 혈류량의 농도 의존성 증가를 유도한다 (도 5). 음핵 혈류량의 115% 증가가 200 ㎍/㎏의 VIP의 정맥내 관주 후에 관찰되었다. 이것은 대조군 관주로부터 상당히 상승되었다 (헵살린).
2. 음핵 혈류량에 대한 VIP의 효과는 cAMP 유사물 포르스콜린 (40 nmol/㎏ 정맥내 볼루스, 도 5)의 관주에 의해 모방될 수 있다. 음핵 혈류량의 156% 증가는 40 nmol/㎏의 포르스콜린의 정맥내 관주 후에 관찰되었다. 이것은 대조군 관주로부터 상당히 상승되었다 (헵살린). 반응의 진폭은 VIP (200 ㎍/㎏, 정맥내 볼루스)에 의해 유도된 것과 유사하고 도 2 및 4에서 질 혈류량에 대해 관찰된 것과 비교할 만 하다.
3. 임상적으로 적절한 투여량의 NEP EC 3.4.24.11의 선택적인 억제제는 골반 신경에 의해 자극된 음핵 혈류량의 증가를 상당히 향상시킨다 (도 12 참조). NEP 억제제는 비히클 대조군 증가에 비해 최대 131% 까지 음핵 혈류량의 최대 증가를 향상시켰다.
이들 데이타는 VIP가 음핵 혈류량/혈관이완을 증가시킬 수 있고 이것이 cAMP/아데닐레이트 시클라아제 경로의 활성화에 의해 모방될 수 있음을 입증한다. NEP EC 3.4.24.11의 억제제 (VIP 대사의 원인이 됨)가 골반 신경에 의해 자극된 음핵 혈류량의 증가를 향상시킨다는 발견은 VIP가 골반 신경 자극/성적 흥분 중에 방출되는 신경전달물질임을 입증한다.
4.6성기 혈류량은 직접 또는 간접적으로 cAMP 농도를 상승시키는 약제에 의해 증가된다
FSAD는 감소된 성기 혈류량과 관련이 있으며 이것으로부터 야기될 수 있다. 이 질환을 치료하는 효과있는 방법은 성기 혈류량을 증가시키는 것과 관련이 있다. cAMP가 성기 혈관이완의 매개인자이며 cAMP의 상승이 신경으로부터 방출된 VIP에의해 야기된다는 것이 입증되었으므로, 본 발명자는 cAMP 신호화가 향상되면, 그 결과로서 성기 혈류량이 증가될 것이고, 따라서 성기 혈류량이 정상 수준으로 회복되고 FSAD가 치료되는 것으로 생각한다.
아주 바람직한 면에서, 본 발명자는 cAMP 매개된 혈관이완을 직접 또는 간접적으로 상승시키기 위해 3개의 표적 - PDEcAMP억제제, 예를 들면 PDEcAMP타입 2 억제제, NEP (EC 3.4.24.11) 억제제 및 뉴로펩티드 Y Y1 (NPY Y1) 수용체 길항제를 선택하였다.
4.6.1 중성 엔도펩티다아제 (NEP EC 3.4.24.11) 억제제
NEP EC 3.4.24.11은 VIP를 물질 대사시키므로 VIP 매개된 생물학적 활성을 종결한다. NEP 억제제는 성적 흥분 중에 방출되는 VIP의 내인성 혈관이완 효과를 상승작용시킬 것이다. 이것은 성기 충혈을 증가시키는 임상적 효과를 가질 것이다.
NEP EC 3.4.24.11 정위화 또는 질 조직에서 그의 기능적인 역할 또는 성적 흥분에서 그의 역할을 보고한 선행 문헌은 없었다.
임상적으로 적절한 투여량의 NEP EC 3.4.24.11의 선택적인 억제제는 골반 신경 자극된 질 혈류량의 증가를 상당히 향상시킨다 (도 6 참조).
NEP 억제제는 시간에 따른 대조군 증가에 비해 최대 53%까지 질 혈류량의 최대 증가를 상승시켰다. 이러한 가장 적은 자극 빈도수 (예를 들면, 4 ㎐)의 증가는 투여량 의존적이었다; 예를 들면 0.1 ㎎/㎏ (정맥내)은 35.0 ± 7.6% 증가를 유도하였고; 0.3 ㎎/㎏ (정맥내)은 42.6 ± 27.7% 증가를 유도하였고; 1.0 ㎎/㎏ (정맥내)은 52.8 ± 32.5% 증가를 유도하였다. NEP 억제제는 기저 수준 (비자극된) 질 혈류량에 대해서는 효과를 나타내지 않았다. 그러므로, 본 발명의 약제는 성욕 없이, 즉 cAMP 신호화를 직접 증가시켜 흥분을 유도하기 보다는 cAMP 신호화를 상승작용시킴으로써 흥분을 향상시킨다.
임상적으로 적절한 투여량의 NEP EC 3.4.24.11의 선택적인 억제제는 골반 신경에 의해 자극된 음핵 혈류량의 증가를 상당히 향상시킨다 (도 12 참조). NEP 억제제는 비히클 대조군 증가에 비해 최대 131%까지 음핵 혈류량의 최대 증가를 상승시켰다. NEP 억제제는 기저 수준 (비자극된) 질 혈류량에 대해서는 효과를 나타내지 않았다. 이것은 본 발명의 약제가 성욕 없이, 즉 cAMP 신호화를 직접 증가시켜 흥분을 유도하기 보다는 cAMP 신호화를 상승작용시킴으로써 흥분을 향상시킬 것이라는 생각을 더욱 뒷받침하는 것이다.
임상적으로 적절한 투여량의 NEP EC 3.4.24.11의 선택적인 억제제는 시간에 따른 대조군에 비해 VIP 유도된 질 혈류량의 증가를 향상시킨다. VIP의 준최대 투여량 (예를 들면, 6.0 ㎍/㎏)에서, 최대 증가 (95±6%) 및 증가 기간의 연장 (약 140% - 7 내지 17분 이상; 도 7 참조)에서 상당한 상승작용을 한다. NEP 억제제는 최대 혈류량 증가를 나타내는 VIP의 투여량과 혼합될 때 VIP 유도된 질 혈류량의 상승 기간을 상당히 연장시킨다 (약 80% 기간 증가 - 11 내지 20분).
임상적으로 적절한 투여량의 NEP 억제제는 분리된 조직에서 VIP 유도되고 신경에 의해 매개된 이완을 상당히 증가시킨다. VIP에 대한 EC50은 선택적인 NEP 억제제 (1 μM)의 존재하에 18.8 ± 0.6 nM에서 2.9 ± 0.3 nM로 상당히 감소된다. NEP 억제제의 효과는 농도 의존적이다.
NEP EC 3.4.24.11 mRNA 메시지 및 단백질은 발현되고 노던 및 웨스턴 분석에 의해 인간 및 토끼 질에서 확인되었다.
4.6.2 포스포디에스테라아제 (PDE) 억제제
cAMP는 cAMP 가수분해 PDE, 즉 PDEcAMP에 의해 분해된다. PDEcAMP억제제는 흥분 중에 방출되는 cAMP의 내인성 혈관이완 효과를 상승작용시킬 것이다. 이것은 질 충혈을 증가시키는 임상 효과를 나타내야 한다.
PDEcAMP정위화 또는 질 조직에서 이들 동종효소의 기능적인 역할 또는 성적 흥분에서 이들의 역할을 보고한 선행 문헌은 없었다. 본 발명자는 인간 및 토끼 질의 PDE 프로필링에 의해 다음 PDEcAMP1, 2, 3, 4, 7 & 8 동종효소가 존재함을 밝혀냈다. 이들 PDEcAMP의 억제제는 질 혈류량을 증가시키고 (또는) 질 평활근을 이완시키기 위한 효능있는 약제를 나타낸다.
임상적으로 적절한 투여량의 PDEcAMP타입 2 억제제의 선택적인 억제제는 골반 신경에 의해 자극된 질 혈류량의 증가를 상당히 향상시킨다 (도 8 참조). PDEcAMP타입 2 억제제 (500 ㎍/㎏; 정맥내)는 시간에 따른 대조군 (＠4㎐)에서 관찰된 증가에 비해 질 혈류량의 최대 증가를 86.8 ± 21.9% 정도 향상시켰다.
선택적인 PDEcAMP타입 2 억제제는 VIP (60 ㎍/㎏)에 의해 유도된 질 혈류량 최대 증가의 기간을 100% 이상 연장시켰다 (50% 진폭에서 측정됨; 도 9 참조). 선택적인 PDEcAMP타입 2 억제제는 VIP 자극에 의해 유도된 혈류량의 최대 증가를 상당히 향상시킨다 (약 15 ± 3% [200 ㎍/㎏]).
선택적인 PDEcAMP타입 2 억제제는 VIP에 의해 유도된 최대 질 혈류량 증가의 기간을 100% 이상 연장시켰다 (50% 진폭에서 측정됨; 도 8 참조). 선택적인 PDEcAMP타입 2 억제제는 골반 신경 자극에 의해 유도된 혈류량의 최대 증가를 상당히 향상시킨다 (4 ㎐에서 약 15 ± 3% [200 ㎍/㎏]).
PDEcAMP억제제는 미리 수축 및 분리된 질 평활근의 VIP 유도 이완을 증가시킨다 (1 μM 페닐에프린; 표 2 참조). PDEcAMP타입 1, 2, 3 및 4의 선택적인 억제제는 모두 VIP 매개 이완을 상당히 상승작용시킨다 (VIP EC50값의 상승작용 210% ＠ 76 nM, 130% ＠ 8 nM, 220% ＠ 3.4 μM 및 160% ＠ 686 nM). 이들 억제제는 대상이 되는 특정 PDEcAMP에 대해 선택적인 것으로 알려진 투여량으로 투여되었다. PDEcGMP타입 5의 선택적인 억제제 또는 비히클 대조군은 VIP 매개 이완에 대해 가시적인 효과가 없었다.
4.6.3 NPY Y1 수용체 길항제
NPY는 VIP에 의해 매개된 혈관이완에 대해 억제 영향을 미치며 NPY Y1 수용체 길항제는 흥분 중에 방출된 내인성 VIP의 혈관이완 효과를 용이하게 할 것이다. 이것은 질 충혈을 증가시키는 임상적 효과를 가질 것이다.
NPY 수용체 정위화 또는 질 조직에서 이들 수용체에 대한 기능적인 역할 또는 성적 흥분에서 그의 역할을 보고한 선행 문헌은 없었다.
NPY 수용체 발현 연구는 노던 및 웨스턴 분석에 의해 NPY Y1Y2및 Y5수용체 아형이 인간 및 토끼 질에 존재한다는 것을 확인하였다.
임상적으로 적절한 투여량의 NPY Y1의 선택적인 억제제는 골반 신경에 의해 자극된 질 혈류량의 증가를 상당히 향상시킨다 (도 10 참조). NPY Y1 길항제는 시간에 따른 대조군 증가에 비해 최대 92%까지 질 혈류량의 최대 증가를 상승시켰다. 이러한 준최대 자극 빈도수 (예를 들면, 4 ㎐) 증가는 투여량 의존적이었다; 예를 들면 0.01 ㎎/㎏ (정맥내)은 15.8 ± 19.6% 증가를 유도하였고; 0.03 ㎎/㎏ (정맥내)은 35.1 ± 17.17% 증가를 유도하였고; 0.10 ㎎/㎏ (정맥내)은 60.1 ± 16.9% 증가를 유도하였고; 0.3 ㎎/㎏ (정맥내)은 91.9 ± 27.4% 증가를 유도하였다 (평균 ± sem n = 3). NPY Y1 길항제는 기저 수준 (비자극된) 질 혈류량에 대해 효과를 나타내지 않았다. 이는 NPY Y1이 성욕 없이, 즉 cAMP 신호화를 직접 증가시킴으로써 흥분을 유도하기 보다는 cAMP 신호화를 상승작용시킴으로써 흥분을 증가시킬 것이라는 본 발명자의 견해를 보강하는 것이다.
4.7 cAMP를 증가시키거나 질 혈류량을 증가시키는 약제의, 마취된 토끼에서 평균 동맥 혈압에 대한 효과
FSAD에 대한 경구 요법에 대한 연구에서는, 관련된 심혈관 부작용, 예를 들면 혈압 또는 심박동수에 대한 효과가 없는 것이 바람직하다. 본 발명자는 연구에서 VIP의 관주가 평균 동맥 혈압을 상당히 감소시키고 (도 3 참조) 심박동수를 상당히 증가시킨다는 것을 발견하였다. 그러므로, 아주 바람직한 면에서 약제는 VIP가 아니다. 그러나, 골반 신경 자극 및 PDEcAMP및 NEP의 억제제는 혈압에 대해 효과가 없었다. VIP (정맥내)는 6.0 ㎍/㎏에서 13.2 ± 0.7 mm Hg의 평균 동맥 혈압의 상당한 감소 및 분 당 16 ± 4 박동의 심박동수로 상당한 증가를 일으켰다. VIP (정맥내)는 60.0 ㎍/㎏의 높은 투여량에서 14.7 ± 1.37 mm Hg의 평균 동맥 혈압의 상당한 감소를 일으켰으며 이것은 분당 111 ± 30 박동의 심박동수로 상당한 증가와 관련이 있으며, 그 후에 이것은 8.5 ± 1.4 mm Hg 만큼 평균 동맥 혈압을 증가시켰다.
시험된 화합물
상기 언급된 일련의 화합물은 본 발명에 따라서 시험되며 본 발명에 따라서 효과적인 것으로 밝혀졌다 - 즉, 그것은 FSD, 특히 FSAD를 치료하기 위해 PcAMP로서 작용할 수 있다.
이들 화합물은 다음의 것을 포함한다:
화학식 Ia의 화합물 ("FIa") - 즉 5-[4-(디에틸아미노)벤질]-1-메틸-3-프로필-6,7-디히드로-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-7-온. FIa는 EP-A 0911333호 (그의 실시예 50)에 교시된 바에 따라서 제조될 수 있다.
화학식 II의 화합물 ("FII") - 즉 9-(1-아세틸-4-페닐부틸)-2-[(3,4-디메톡시페닐)메틸]-1,9-디히드로-6H-퓨린-6-온. FII는 EP-A 0771799호 (그의 실시예 100)에 교시된 바에 따라서 제조될 수 있다.
화학식 III의 화합물 ("FIII") - 즉 밀리논 (Milrinone). FIII은 시판되는 제품이다.
화학식 IV의 화합물 ("FIV") - 즉 롤리프람 (Rolipram). FIV는 시판되는 제품이다.
화학식 V의 화합물 ("FV") - 즉 시클로헥산카르복실산, 3-[[[1-(2-카르복시-4-펜테닐)시클로펜틸]카르보닐]아미노]-1-에틸 에스테르. FV는 EP-A 0274234호 (그의 실시예 300)에 교시된 바에 따라서 제조될 수 있다.
화학식 VI의 화합물 ("FVI") - 즉 시클로헥산카르복실산, 3-[[[1-(2-카르복시-4-펜테닐)시클로펜틸]카르보닐]아미노]-. FVI은 EP-A-0274234호 (그의 실시예 379)에 교시된 바에 따라서 제조될 수 있다.
특히, FIa, FII, FIII 및 FIV는 PDEcAMP억제제이다. FIa는 I:PDEI이고, FII는 I:PDEII이고, FIII은 I:PDEIII이고, FIV는 I:PDEIV이다.
이들 화합물에 대한 데이타는 이전의 실시예 단락에서 위에 기재되어 있다 - 예를 들면 표 2 참조.
입증된 바와 같이, 이들 PDEcAMP억제제는 VIP에 의해 유도된 분리 조직의 이완을 향상시킨다.
선택적인 I:PDEII인 FII는 임상적으로 적절한 투여량에서 VIP에 의해 유도된 질 혈류량의 증가를 향상시킨다.
FII는 또한 임상적으로 적절한 투여량에서 골반 신경에 의해 자극된 질 혈류량의 증가를 향상시킨다.
FV 및 FVI은 NEP EC 3.4.24.11의 선택적인 억제제이다.
이전의 실시예 단락에서 위에 제시된 데이타는 FVI에 대한 것이다. 그러나, FV에 대해서 유사한 결과가 얻어졌다.
입증된 바와 같이, FV 및 FVI은 임상적으로 적절한 투여량에서 VIP에 의해 유도된 질 혈류량의 증가를 향상시킨다.
FV 및 FVI은 또한 임상적으로 적절한 투여량에서 골반 신경에 의해 자극된 질 혈류량의 증가를 향상시킨다.
FV 및 FVI은 또한 임상적으로 적절한 투여량에서 분리된 조직의 VIP 유도 및고 신경 매개 이완을 향상시킨다.
시험되어 효과적인 것으로 증명된 추가의 화합물은 다음과 같은 것을 포함한다:
2-[(1-{[(1-벤질-6-옥소-1,6-디히드로-3-피리디닐)아미노]카르보닐}시클로펜틸)메틸]-4-메톡시부탄산 (F57)
2-{[1-({[3-(2-옥소-1-피롤리디닐)프로필]아미노}카르보닐시클로펜틸]-메틸}-4-페닐부탄산 (F58)
(+)-2-{[1-({[2-(히드록시메틸)-2,3-디히드로-1H-인덴-2-일]아미노}카르보닐)시클로펜틸]-메틸}-4-페닐부탄산 (F59)
2-[(1-{[(5-메틸-1,3,4-티아디아졸-2-일)아미노]카르보닐}시클로펜틸)메틸]-4-페닐부탄산 (F60)
시스-3-(2-메톡시에톡시)-2-[(1-{[(4-{[(페닐술포닐)아미노]카르보닐}시클로헥실)아미노]카르보닐}시클로펜틸)메틸]프로판산 (F61)
(+)-2-{[1-({[2-(히드록시메틸)-2,3-디히드로-1H-인덴-2-일]아미노}카르보닐)시클로펜틸]-메틸}펜탄산 (F62)
(+)-2-[(1-{[(5-에틸-1,3,4-티아디아졸-2-일)-아미노]카르보닐}시클로펜틸)메틸]펜탄산 (F63)
2-({1-[(3-벤질아닐리노)카르보닐]시클로펜틸}메틸)펜탄산 (F64)
2-[(1-{[(1-벤질-6-옥소-1,6-디히드로-3-피리디닐)아미노]카르보닐}시클로펜틸)메틸]-펜탄산 (F65)
2-{[1-({[(1R,3S,4R)-4-(아미노카르보닐)-3-부틸시클로헥실]아미노}카르보닐)-시클로펜틸]메틸}펜탄산 (F66)
F57-66 화합물 각각은 I:NEP이다.
화합물 F57-66의 합성
다음 설명에서, 제조예는 중간체의 합성이고, 실시예는 본 발명의 화합물 각각의 합성이다.
실시예 1
2-[(1-{[(1-벤질-6-옥소-1,6-디히드로-3-피리디닐)아미노]카르보닐}시클로펜틸)메틸]-4-메톡시부탄산 (F57)
제조예 1 (1/62)로부터 얻은 벤질 에스테르 (850 ㎎, 1.64 mmol) 및 40% 수성 에탄올 (21 ㎖) 중의 차콜 상의 5% 팔라듐 (250 ㎎)의 혼합물을 30 psi 및 실온에서 30분 동안 수소화시켰다. 반응 혼합물을 하이플로 (Hyflo)(등록상표)를 통해 여과시키고, 여액을 감압 하에 증발시켰다. 잔류 발포체를 용출제로서 디클로로메탄:메탄올 (97:3)을 사용하여 실리카 겔 상에서 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 백색 발포체로서 표제 화합물 550 ㎎을 얻었다 (79%);1H NMR (DMSO-d6, 300 MHz) d: 1.24-2.17 (m, 12H), 2.18-2.31 (m, 1H), 3.07 (s, 3H), 3.21 (t, 2H), 5.08 (s, 2H), 6.63 (d, 1H), 7.23-7.41 (m, 5H), 7.72 (d, 1H), 8.24 (s, 1H). 분석 실측치: C, 67.46; H, 7.18; N, 6.24. C24H30N2O5이론치 C, 67.58; H, 7.09; N, 6.57%.
실시예 2
2-{[1-({[3-(2-옥소-1-피롤리디닐)프로필]아미노}카르보닐시클로펜틸]-메틸}-4-페닐부탄산 (F58)
제조예 3 (3/67)로부터 얻은 벤질 에스테르 (780 ㎎, 1.55 mmol) 및 에탄올:물 (90:10 부피비) 중의 차콜 상의 10% 팔라듐 (100 ㎎)의 혼합물 (30 ㎖)을 60 psi H2압력 하에 실온에서 1.5시간 동안 수소화시켰다. 촉매를 여과하고, 여액을 감압 하에 증발시켜 백색 발포체로서 표제 화합물 473 ㎎을 얻었다 (74%);1H NMR (CDCl3, 300 MHz) d: 1.26-1.77 (m, 10H), 1.78-2.46 (m, 11H), 2.49-2.70 (m, 2H), 2.95-3.36 (m, 4H), 6.92-7.38 (m, 5H); 분석 실측치: C, 64.05; H, 7.73; N, 6.22. C24H34N2O4;0.75H2O 이론치 C, 65.88; H, 7.83; N, 6.40%.
실시예 3
(+)-2-{[1-({[2-(히드록시메틸)-2,3-디히드로-1 H -인덴-2-일]아미노}카르보닐)시클로펜틸]-메틸}-4-페닐부탄산 (F59)
AD 컬럼과, 용출제로 헥산:이소프로판올:트리플루오로아세트산(70:30:0.2)을 사용하는 표준 HPLC 방법으로 2-{[1-({[2-(히드록시메틸)-2,3-디히드로-1H-인덴-2-일]아미노}카르보닐)시클로펜틸]-메틸}-4-페닐부탄산 (WO 9110644)를 정제하여 실시예 3의 표제 화합물을 얻었다 (99.5%)(오차 배제); [α]D= +9.1°(에탄올에서 c=1.76).
실시예 4
2-[(1-{[(5-메틸-1,3,4-티아디아졸-2-일)아미노]카르보닐}시클로펜틸)메틸]-4-페닐부탄산 (F60)
제조예 4 (4/70)로부터 얻은 벤질 에스테르 (187 ㎎, 0.39 mmol) 및 에탄올 (20 ㎖) 중의 차콜 상의 10% 팔라듐 (80 ㎎)의 혼합물을 60 psi에서 18시간 동안 수소화시켰다. Tlc 분석 결과 출발 물질이 잔류함을 나타내었으므로 차콜 상의 10% 팔라듐 (100 ㎎)을 추가로 첨가하고, 반응을 5시간 동안 더 계속하였다. 다시 Tlc 분석한 결과 출발 물질이 잔류함을 나타내었으므로 촉매 (100 ㎎)을 추가로 첨가하고, 수소화를 18시간 동안 계속하였다. 혼합물을 아르보셀 (Arbocel)(등록상표)을 통해 여과하고, 여액을 감압 하에 농축시키고, 디클로로메탄과 공비시켰다. 바이오타게 (Biotage)(등록상표) 컬럼과, 용출제로 디클로로메탄:메탄올 (95:5)을사용하는 실리카 상에서 크로마토그래피로 조 생성물을 정제하여 투명 오일로서 표제 화합물 80 ㎎을 얻었다 (53%);1H NMR(CDCl3, 300 MHz) d: 1.51-1.89 (m, 9H), 2.03 (m, 1H), 2.20 (m, 1H), 2.40 (m, 2H), 2.60 (m, 5H), 7.15-7.30 (m, 5H); LRMS: m/z 387.8 (MH+).
실시예 5
시스-3-(2-메톡시에톡시)-2-[(1-{[(4-{[(페닐술포닐)아미노]카르보닐}시클로헥실)-아미노]카르보닐}시클로펜틸)메틸]프로판산 (F61)
디클로로메탄 (5 ㎖) 및 트리플루오로아세트산 (5 ㎖) 중의 제조예 8 (8/66)로부터 얻은tert-부틸 에스테르 (446 ㎎, 0.75 mmol)의 용액을 실온에서 18시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축시키고, 잔류물을 디클로로메탄과 공비시키고, 다음에 톨루엔과 공비시키고, 마지막으로 에테르와 공비시켜 백색 발포체로서 표제 화합물 385 ㎎을 얻었다 (95%);1H NMR (CDCl3, 400 MHz) d: 1.48-2.17 (m, 18H), 2.40 (s, 1H), 2.66 (s, 1H), 3.37 (s, 3H), 3.50-3.70 (m, 6H);3.94 (s, 1H), 6.10 (d, 1H), 6.59 (s, 1H), 7.55 (t, 2H), 7.61 (m, 1H), 8.02 (d, 2H), 9.11 (s, 1H); 분석 실측치: C, 54.88; H, 6.90; N, 5.04. C26H38N2O8S;1.7H2O 이론치 C, 57.97; H, 7.11; N, 5.20%.
실시예 6
(+)-2-{[1-({[2-(히드록시메틸)-2,3-디히드로-1H-인덴-2-일]아미노}카르보닐)시클로펜틸]-메틸}펜탄산 (F62)
AD 컬럼과, 용출제로 헥산:이소프로판올:트리플루오로아세트산 (90:10:0.1)을 사용하는 HPLC로 2-{[1-({[2-(히드록시메틸)-2,3-디히드로-1H-인덴-2-일]아미노}카르보닐)시클로펜틸]-메틸}펜탄산 (WO 9110644)를 더욱 정제하여 실시예 6의 표제 화합물을 얻었다 (99%)(오차 배제); [α]D= +10.4°(에탄올에서 0.067).
실시예 7
(+)-2-[(1-{[(5-에틸-1,3,4-티아디아졸-2-일)아미노]카르보닐}시클로펜틸)메틸]펜탄산 (F63)
AD 컬럼과, 용출제로 헥산:이소프로판올:트리플루오로아세트산 (85:15:0.2)을 사용하는 HPLC로 제조예 18 (18/실시예 4)로부터 얻은 산 (824 ㎎)을 정제하여 백색 발포체로서 실시예 7의 표제 화합물 386 ㎎을 얻었다 (99%)(오차 배제);1H NMR(CDCl3, 400 MHz) δ: 0.90 (t, 3H), 1.38 (m, 6H), 1.50-1.79 (m, 9H), 2.19 (m, 1H), 2.30 (m, 1H), 2.44 (m, 1H), 2.60 (m, 1H), 2.98 (q, 2H), 12.10-12.27 (bs, 1H); LRMS: m/z 338 (MH-); 및 [α]D= +3.8°(c=0.1, 메탄올).
실시예 8
2-({1-[(3-벤질아닐리노)카르보닐]시클로펜틸}메틸)펜탄산 (F64)
물 (10 ㎖) 및 에탄올 (40 ㎖) 중 차콜 상의 5% 팔라듐 (130 ㎎)과 제조예 10 (10/53)으로부터 얻은 벤질 에스테르 (1.3 ㎎, 2.47 mmol)의 혼합물을 30 psi 및 실온에서 2시간 동안 수소화시켰다. 반응 혼합물을 아르보셀 (등록상표)을 통해 여과시키고, 여액을 감압 하에 농축시키고, 잔류물을 디클로로메탄으로 처리하였다. 잔류 검을 에테르로 처리하고, 다음에 헥산으로 처리하고, 50 ℃에서 건조시켜 고체로서 표제 화합물 0.79 g(81%)을 얻었다;1H NMR (CDCl3, 300 MHz) d: 0.95 (t, 3H), 1.24-1.51 (m, 3H), 1.58-1.80 (m, 7H), 1.88 (dd, 1H), 2.15 (m,2H), 2.24 (m, 1H), 2.48 (m, 1H), 4.00 (s, 2H), 6.98 (d, 1H), 7.24 (m, 6H), 7.40 (m, 3H); 분석 실측치: C, 75.48; H, 7.76; N, 3.59. C25H31NO3;0.25H2O 이론치 C, 75.44; H, 7.98; N, 3.51%.
실시예 9
2-[(1-{[(1-벤질-6-옥소-1,6-디히드로-3-피리디닐)아미노]카르보닐}-시클로펜틸)메틸]-펜탄산 (F65)
생성물을 용출제로서 에틸 아세테이트를 사용하여 실리카겔 상에서 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제한 것을 제외하고는, 제조예 19 (19/실시예 21)에 기재된 것과 유사한 방법에 따라 제조예 13(13/56)으로부터 얻은 벤질 에스테르로부터 51%의 수율로 백색 발포체로서 표제 화합물을 얻었다;1H NMR (CDCl3, 300 MHz) d: 0.96 (t, 3H), 1.28-1.80 (m, 12H), 2.01 (m, 1H), 2.30-2.52 (m, 2H), 5.02 (dd, 2H), 6.60 (d, 1H), 7.27 (m, 5H), 7.70 (s, 1H), 8.34 (s, 1H); 분석 실측치: C, 69.52; H, 7.41; N, 6.51. C24H30N2O4;0.25H2O 이론치 C, 69.45; H, 7.41; N, 6.75.
실시예 10
2-{[1-({[(1R,3S,4R)-4-(아미노카르보닐)-3-부틸시클로헥실]아미노}카르보닐)-시클로펜틸]메틸}펜탄산 (F66)
제조예 14 (14/실시예 1)에 기재된 것과 유사한 방법에 따라 상응하는 tert-부틸 에스테르로부터 제조된 화학식 ic의 화합물, 즉 r1이 프로필인 화학식 i의 화합물을 제조하였다 (여기서, 임).
<화학식 Ic>
제조예 1 (1/62)
벤질 2-[(1-{[(1-벤질-6-옥소-1,6-디히드로-3-피리디닐)아미노]카르보닐}시클로펜틸)-메틸]-4-메톡시부타노에이트
옥살릴 클로라이드 (0.26 ㎖, 3.0 mmol)를 디클로로메탄 (20 ㎖) 중의 1-{2-[(벤질옥시)카르보닐]-4-메톡시부틸}시클로펜탄카르복실산 (EP 274234) (1.0 g, 3.0 mmol) 및 N,N-디메틸포름아미드 (2 방울)의 빙냉 용액에 첨가하고 반응물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 용액을 감압 하에 농축시키고 잔류물을 디클로로메탄 (3 x 10 ㎖)과 공비시켰다. 생성물을 디클로로메탄 (20 ㎖)에 용해시키고 빙조에서 냉각시켰다. 제조예 2 (2/28)로부터 얻은 아민 (600 ㎎, 3 mmol) 및 N-메틸모르폴린 (0.6 ㎖, 5.45 mmol)을 첨가하고 반응물을 실온에서 18시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축시키고, 물과 에테르 사이에 분배시켰다. 유기층을 염산 (2N), 중탄산 나트륨 용액, 다음에 물로 세척하고, 황산 마그네슘 상에서 건조시킨 후 감압 하에 증발시켰다. 용출제로 에틸 아세테이트:헥산 (90:10)을 사용하는 실리카 겔 상에서 중압 컬럼 크로마토그래피로 잔류하는 녹색 고체를 정제하여 표제 화합물 880 ㎎(57%)을 얻었다;1H NMR (CDCl3, 300 MHz) d: 1.37-2.28 (m, 12H), 2.46-2.64 (m, 1H), 3.20 (s, 3H), 3.31 (m, 2H), 4.97 (dd, 2H), 5.08 (dd, 2H), 6.57 (d, 1H), 7.12 (m, 1H), 7.18-7.48 (m, 10H), 8.08 (d, 1H).
제조예 2 (2/28)
5-아미노-1-벤질-2(1H)-피리디논
1-벤질-5-니트로-1H-피리딘-2-온 (Justus Liebigs Ann. Chem. 484; 1930; 52) (1.0 g, 4.35 mmol), 및 진한 염산 (14 ㎖) 중의 과립화된 주석 (3.5 g, 29.5 mmol)의 혼합물을 90 ℃에서 1.5시간 동안 가열하였다. 냉각된 용액을 물로 희석시키고, 탄산 나트륨 용액을 이용하여 중화시키고, 에틸 아세테이트 (총 250 ㎖)로추출하였다. 합한 유기 추출물을 여과하고, 황산 마그네슘 상에서 건조시킨 후 감압 하에 증발시켜 담녹색 (시간이 경과함에 따라 청색으로 바뀜) 고체로서 표제 화합물 440 ㎎(51%)을 얻었다;1H NMR (CDCl3, 250 MHz) δ: 4.12-4.47 (bs, 2H), 5.00 (s, 2H), 6.31 (d, 1H), 6.86 (s, 1H), 7.07 (m, 1H), 7.14-7.42 (m, 5H).
제조예 3 (3/67)
벤질 2-{[1-({[3-(2-옥소-1-피롤리디닐)프로필]아미노}카르보닐시클로펜틸]-메틸}-
4-페닐부타노에이트
1-(3-디메틸아미노프로필)3-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드 (1.06 g, 5.53 mmol), 1-히드록시벤조트리아졸 히드레이트 (0.60 g, 4.44 mmol) 및 4-메틸모르폴린 (0.56 g, 5.54 mmol)을 실온에서 무수 디클로로메탄 (15 ㎖) 중의 1-{2-[(벤질옥시)카르보닐]-4-페닐부틸}시클로펜탄-카르복실산 (EP 274234) (1.5 g, 3.94 mmol)의 냉각 용액에 첨가한 후 N-(3-아미노프로필)-2-피롤리돈 (0.56 g, 3.94 mmol)을 순차적으로 첨가하고, 반응물을 실온에서 18시간 동안 교반하였다. 이 혼합물을 물, 2N 염산, 중탄산나트륨 포화수용액으로 세척하고, 황산 마그네슘 상에서 건조시킨 후 감압 하에 증발시켰다. 용출제로 에틸 아세테이트:펜탄 (50:50)을사용하는 실리카 겔 상에서 컬럼 크로마토그래피로 잔류 황색 오일을 정제하여 투명한 검으로서 표제 화합물 800 ㎎(40%)을 얻었다;1H NMR (CDCl3, 300 MHz) d: 1.37-2.20 (m, 16H), 2.34-2.58 (m, 5H), 2.92-3.46 (m, 6H), 5.07 (d, 1H), 5.18 (d, 1H), 6.98-7.47 (m, 10H).
제조예 4 (4/70)
벤질 2-[(1-{[(5-메틸-1,3,4-티아디아졸-2-일)아미노]카르보닐}시클로펜틸)메틸]-4-페틸부타노에이트
제조예 5 (5/68)에 기재된 것과 유사한 방법에 따라 1-{2-[(벤질옥시)카르보닐]-4-페닐부틸}시클로펜탄-카르복실산 (EP 274234) 및 2-아미노-5-메틸-1,3,4-티아디아졸로부터 74%의 수율로 표제 화합물을 투명 오일로서 얻었다;1H NMR (CDCl3, 400 MHz) d: 1.58-1.76 (m, 7H), 1.83-1.98 (m, 3H), 2.03 (m, 1H), 2.20 (m, 1H), 2.35 (m, 1H), 2.44 (m, 3H), 2.65 (s, 3H), 5.02 (dd, 2H), 7.00 (d, 2H), 7.15 (m, 1H), 7.19 (m, 2H), 7.35 (m, 5H); LRMS: m/z 478.7 (MH+).
제조예 5 (5/68)
벤질 2-{[1-({[3-(메틸아미노)-3-옥소프로필]아미노}카르보닐)시클로펜틸]메틸}-4-페닐부타노에이트
1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드 (122 ㎎, 0.64 mmol), 1-히드록시벤조트리아졸 히드레이트 (86 ㎎, 0.64 mmol) 및 4-메틸모르폴린 (173 μl, 1.59 mmol)을 실온에서 N,N-디메틸포름아미드 (5 ㎖) 중의 1-{2-[(벤질옥시)카르보닐]-4-페닐부틸}시클로펜탄-카르복실산 (EP 274234) (202 ㎎, 0.53 mmol)의 냉각 용액에 첨가한 후 제조예 6 (6/23)으로부터 얻은 아민 히드로클로라이드 (146 ㎎, 1.06 mmol)를 첨가하고 반응물을 90 ℃에서 18시간 동안 교반하였다. 냉각 용액을 감압 하에 농축시키고 잔류물을 물 (20 ㎖)과 에틸 아세테이트 (100 ㎖) 사이에 분배시켰다. 층을 분리하고, 유기층을 물 (3 x 30 ㎖), 염수 (25 ㎖)로 세척하고, 건조시키고 (MgSO4) 감압 하에 증발시켜 투명 오일을 얻었다. 용출제로 디클로로메탄:메탄올 (98:2)를 사용하는 실리카 겔 상에서 컬럼 크로마토그래피로 조생성물을 정제하여 무색 오일로서 표제 화합물 162 ㎎(67%)을 얻었다;1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 1.38-1.53 (m, 2H), 1.53-1.96 (m, 8H), 2.02 (m, 2H), 2.27 (t, 2H), 2.46 (m, 3H), 2.76 (d, 3H), 3.44 (m, 2H), 5.13 (s, 2H), 5.79(bs, 1H), 6.38 (m, 1H), 7.06 (d, 2H), 7.18 (m, 1H), 7.22 (m, 2H), 7.38 (m, 5H); LRMS: m/z 465.5 (MH+).
제조예 6 (6/23)
3-아미노-N-메틸프로판아미드 히드로클로라이드
에탄올 (300 ㎖) 중 차콜 상의 5% 팔라듐 (800 ㎎)과 제조예 7 (7/13)로부터 얻은 벤질 카르바메이트 (7.92 g, 33.5 mmol)의 혼합물을 50 psi 및 실온에서 4시간 동안 수소화시켰다. 반응 혼합물을 아르보셀 (Arbocel)(등록상표)을 통해 여과하고, 에탄올로 세척한 후, 1N 염산 (36.9 ㎖, 36.9 mmol)을 모은 여액에 첨가하였다. 이 용액을 감압 하에 증발시키고 잔류물을 디클로로메탄과 공비시켜 무색 발포체로서 표제 화합물 4.66 g을 얻었다;1H NMR (DMSOd6, 300 MHz) δ: 2.46 (t, 2H), 2.60 (s, 3H), 2.95 (m, 2H), 7.98-8.16 (m, 2H).
제조예 7 (7/13)
벤질 3-(메틸아미노)-3-옥소프로필카르바메이트
디클로로메탄 (200 ㎖) 중의 N-[(벤질옥시)카르보닐]-β-알라닌 (10 g, 44.8 mmol), 메틸아민 히드로클로라이드 (3.33 g, 49.28 mmol), 1-히드록시벤조트리아졸히드레이트 (6.05 g, 44.8 mmol), 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드 (10.3 g, 53.76 mmol) 및 N-메틸모르폴린 (11.33 ㎖, 103 mmol)의 혼합물을 실온에서 18시간 동안 교반하였다. 생성된 침전물을 여과하여 제거하고 무색 발포체로서 목적 생성물을 얻고, 여액을 감압 하에 증발시켰다. 에틸 아세테이트:헥산 (90:10 내지 100:0)의 용출 구배를 이용하는 실리카 겔 상에서 컬럼 크로마토그래피로 잔류물을 정제하여 추가 생성물 7.96 g(총 75%)을 얻었다;1H NMR (CDCl3, 300 MHz) δ: 2.42 (t, 2H), 2.80 (s, 3H), 3.50 (m, 2H), 5.21 (s, 2H), 5.49 (bs, 1H), 5.63 (bs, 1H), 7.36 (m, 5H); 분석 실측치: C, 60.68; H, 7.00; N, 11.95. C12H16N2O3이론치 C, 61.00; H, 6.83; N, 11.86%.
제조예 8 (8/66)
시스-tert-부틸 3-(2-메톡시에톡시)-2-[(1-{[(4-3[(페닐술포닐)아미노]카르보닐}-시클로
헥실)아미노]카르보닐}시클로펜틸)메틸]프로파노에이트
N,N'-디시클로헥실카르보디이미드 (199 ㎎, 0.97 mmol), 4-디메틸아미노피리딘 (118 ㎎, 0.97 mmol) 및 벤젠술폰아미드 (152 ㎎, 0.97 mmol)을 디클로로메탄 (12 ㎖) 및 N,N-디메틸포름아미드 (0.5 ㎖) 중의 제조예 9 (9/63)로부터 얻은 산의 빙냉 용액(400 ㎎, 0.878 mmol)에 첨가하고, 반응물을 실온에서 20시간 동안 교반하였다. 혼합물을 감압 하에 농축시키고, 잔류물을 냉각 에틸 아세테이트 중에 현탁시켰다. 생성된 불용성 물질을 여과하고, 여액을 염산 (1N) 및 물로 세척한 후 황산 마그네슘 상에서 건조시킨 다음 감압 하에 증발시켰다. 디클로로메탄:메탄올 (95:5 내지 90:10)의 용출 구배를 이용하는 실리카 겔 상에서 컬럼 크로마토그래피로 조 생성물을 정제하여 백색 발포체로서 표제 화합물 480 ㎎(92%)을 얻었다;1H NMR (CDCl3, 400 MHz) d: 1.44 (s, 9H), 1.63 (m, 13H), 1.80 (m, 2H), 1.88 (m, 1H), 1.98 (m, 2H), 2.36 (m, 1H), 2.57 (m, 1H), 3.38 (s, 3H), 3.40 (m, 1H), 3.51 (t, 2H), 3.58 (m, 3H), 3.95 (m, 1H), 5.92 (d, 1H), 7.56 (m, 2H), 7.62 (m, 1H), 8.05 (d, 2H), 8.75 (bs, 1H); LRMS: m/z 618 (MNa+)
제조예 9 (9/63)
4-{[(1-{3-tert-부톡시-2-[(2-메톡시에톡시)메틸]-3-옥소프로필}시클로펜틸)-카르보닐]아미노}시클로헥산카르복실산
물 (10 ㎖) 및 에탄올 (50 ㎖) 중 차콜 상의 10% 팔라듐 (250 ㎎)과 벤질 4-{[(1-{3-tert-부톡시-2-[(2-메톡시에톡시)메틸]-3-옥소프로필}시클로펜틸)카르보닐]아미노}시클로헥산카르복실레이트 (EP 274234)의 혼합물을 50 psi 및 실온에서 18시간 동안 수소화시켰다. 반응 혼합물을 솔카플록 (Solkafloc)(등록상표)을 통해 여과하고, 여액을 감압 하에 농축시키고 잔류물을 톨루엔 (3x)과 공비시킨 후, 다음에 디클로로메탄 (3x)과 공비시켜 표제 화합물 2.0 g을 얻었다 (96%);1H NMR (CDCl3, 300 MHz) d: 1.48 (s, 9H), 1.53-1.84 (m, 14H), 1.94-2.10 (m, 5H), 2.60 (m, 2H), 3.40 (s, 3H), 3.41-3.63 (m, 5H), 3.96 (m, 1H), 5.90 (bd, 1H).
제조예 10 (10/53)
하기 화합물을 제조예 12 (12/52)에 기재된 것과 유사한 방법에 따라 제조예11 (11/3)로부터 얻은 산 염화물 및 적절한 아민으로부터 제조하였다.
상기 식에서,
제조예 11 (11/3)
벤질 2-{[1-(클로로카르보닐)시클로펜틸]메틸}펜타노에이트
옥살릴 클로라이드 (1.15 ㎖, 13.2 mmol)를 무수 디클로로메탄 (20 ㎖) 중의 1-{2-[(벤질옥시)카르보닐]펜틸}시클로펜탄카르복실산 (EP 274234) (2.0 g, 6.3 mmol)의 빙냉 용액에 첨가하고, 이 용액을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축시키고 잔류물을 디클로로메탄 (3 x)과 공비시켜 황금색 오일로서 표제 화합물 2.1 g을 얻었다;1H NMR (CDCl3, 300 MHz) d: 0.88 (t, 3H), 1.28 (m, 2H), 1.43 (m, 2H), 1.63 (m, 6H), 2.00 (m, 1H), 2.08-2.35 (m, 3H),2.44 (m, 1H), 5.15 (s, 2H), 7.28 (m, 5H).
제조예 12 (12/52)
벤질 2-({1-[(3-피리디닐아미노)카르보닐]시클로펜틸}메틸)펜타노에이트
트리에틸아민 (0.11 ㎖, 0.78 mmol)을 디클로로메탄 (3 ㎖) 중의 제조예 11 (11/3)로부터 얻은 산 염화물 (200 ㎎, 0.60 mmol)과 2-아미노피리딘 (61 ㎎, 0.65 mmol)의 혼합물에 첨가하고, 반응물을 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 혼합물을 감압 하에 증발시키고, 잔류물을 중탄산나트륨 용액 (5 ㎖)과 에틸 아세테이트 (20 ㎖) 사이에 분배시키고, 층을 분리하였다. 유기층을 황산 마그네슘 상에서 건조시키고 감압 하에 증발시켜 검을 얻었다. 용출제로 에틸 아세테이트를 사용하는 실리카 겔 상에서 컬럼 크로마토그래피로 조생성물을 정제하여 표제 화합물 130 ㎎을 얻었다;1H NMR (CDCl3, 400 MHz) d: 0.82 (t, 3H), 1.21 (m, 3H), 1.40 (m, 1H), 1.43-1.72 (m, 6H), 1.81 (d, 1H), 1.98 (m, 1H), 2.18 (m, 1H), 2.24 (m, 1H), 2.46 (m, 1H), 4.98 (m, 2H), 7.20-7.38 (m, 6H), 7.42 (s, 1H), 8.06 (d, 1H), 8.35 (d, 1H), 8.56 (s, 1H).
제조예 13 (13/56)
하기 화합물을 제조예 12 (12/52)에 기재된 것과 유사한 방법에 따라 제조예11 (11/3)로부터 얻은 산 염화물 및 적절한 아민으로부터 제조하였다.
상기 식에서,
제조예 14 (14/실시예 1)
2-({1-[(1,3-벤조디옥솔-5-일아미노)카르보닐]시클로펜틸}메틸)펜탄산
트리플루오로아세트산 (5 ㎖)을 디클로로메탄 (5 ㎖) 중의 제조예 15 (15/34)로부터 얻은tert-부틸 에스테르 (130 ㎎, 0.31 mmol)의 용액에 첨가하고, 이 용액을 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축시키고 잔류물을 톨루엔 및 디클로로메탄과 공비시켜 무색 오일로서 표제 화합물 112 ㎎을 얻었다;1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 0.83 (t, 3H), 1.22-1.40 (m, 3H), 1.50-1.72 (m, 8H), 1.95 (m, 1H), 2.10 (m, 2H), 2.19 (m, 1H), 4.30 (m, 2H), 5.93 (s,2H), 5.99 (bs, 1H), 6.74 (m, 3H); LRMS: m/z 380 (MH-).
제조예 15 (15/34)
하기 화합물을 제조예 17 (17/33)에 기재된 것과 유사한 방법에 따라서 제조예 16 (16/1)로부터 얻은 산 및 적절한 아민 화합물로부터 제조하였다.
상기 식에서,
제조예 16 (16/1)
1-[2-(tert-부톡시카르보닐)-4-펜틸]-시클로펜탄 카르복실산
무수 에탄올 (200 ㎖) 중 차콜 상의 10% 팔라듐 (2 g)과 1-[2-(tert-부톡시카르보닐)-4-펜테닐]-시클로펜탄 카르복실산 (EP 274234) (23 g, 81.5 mmol)의 혼합물을 30 psi 및 실온에서 18시간 동안 수소화시켰다. 반응 혼합물을 아르보셀 (Arbocel)(등록상표)을 통해 여과하고, 여액을 감압 하에 농축시켜 황색 오일을 얻었다. 용출제로 에틸 아세테이트:펜탄 (40:60)을 사용하는 실리카 겔 상에서 컬럼 크로마토그래피로 조생성물을 정제하여 투명 오일로서 목적 생성물 21 g(91%)을 얻었다;1H NMR (CDCl3, 0.86 (t, 3H), 1.22-1.58 (m, 15H), 1.64 (m, 4H), 1.78 (dd, 1H), 2.00-2.18 (m, 3H), 2.24 (m, 1H); LRMS: m/z 283 (M-H)-.
제조예 17 (17/33)
tert-부틸 2-{[1-({[1-(히드록시메틸)시클로펜틸]아미노}카르보닐)-시클로펜틸]메틸}펜타노에이트
1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드 (41 ㎎, 0.21 mmol), 1-히드록시벤조트리아졸 히드레이트 (27 ㎎, 0.2 mmol), N-메틸모르폴린 (35 μl, 0.31 mmol) 및 마지막으로 1-아미노-1-시클로펜탄메탄올 (25 ㎎, 0.22 mmol)을 N,N-디메틸포름아미드 (3 ㎖) 중의 제조예 16 (16/1)으로부터 얻은 산 (150 ㎎, 0.53 mmol) 용액에 첨가하고, 반응물을 90 ℃에서 18시간 동안 교반하였다. 냉각된 용액을 에틸 아세테이트 (90 ㎖)로 희석시키고, 물 (3 x 25 ㎖), 염수 (25 ㎖)로 세척하고, 황산 마그네슘 상에서 건조시킨 후 감압 하에 증발시켰다.용출제로 에틸 아세테이트:펜탄 (30:70)을 사용하는 실리카 겔 상에서 크로마토그래피로 조생성물을 정제하여 표제 화합물 38 ㎎(57%)을 얻었다;1H NMR (CDCl3, 400 MHz) d: 0.88 (t, 3H), 1.29 (m, 3H), 1.41-1.78 (m, 26H), 1.78-1.98 (m, 4H), 2.04 (m, 1H), 2.26 (m, 1H), 3.59 (dd, 1H), 3.70 (dd, 1H), 4.80 (t, 1H), 5.81 (s, 1H); LRMS: m/z 380 (MH+).
제조예 18 (18/실시예 4)
하기 화학식의 화합물을 제조예 14 (14/실시예 1)에 기재된 것과 유사한 방법에 따라서 상응하는tert-부틸 에스테르로부터 제조하였다.
<화학식 Ic>
상기 식에서,
제조예 19 (19/실시예 21)
2-({1-[(3-벤질아닐리노)카르보닐]시클로펜틸}메틸)펜탄산
물 (10 ㎖) 및 에탄올 (40 ㎖) 중 차콜 상의 5% 팔라듐 (130 ㎎)과 제조예 10 (10/53)으로부터 얻은 벤질 에스테르 (1.3 ㎎, 2.47 mmol)의 혼합물을 30 psi 및 실온에서 2시간 동안 수소화시켰다. 반응 혼합물을 아르보셀 (Arbocel)(등록상표)을 통해 여과하고, 여액을 감압 하에 농축시킨 후 잔류물을 디클로로메탄으로 처리하였다. 잔류 검을 에테르로, 다음에 헥산으로 처리하고, 50 ℃에서 건조시켜 고체로서 표제 화합물 0.79 g(81%)을 얻었다;1H NMR (CDCl3, 300 MHz) δ: 0.95 (t, 3H), 1.24-1.51 (m, 3H), 1.58-1.80 (m, 7H), 1.88 (dd, 1H), 2.15 (m, 2H), 2.24 (m, 1H), 2.48 (m, 1H), 4.00 (s, 2H), 6.98 (d, 1H), 7.24 (m, 6H), 7.40 (m, 3H); 분석 실측치: C, 75.48; H, 7.76; N, 3.59. C25H31NO3;0.25H2O 이론치 C, 75.44; H, 7.98; N, 3.51%.
ACE 검정
돼지 및 인간 신장 피질로부터 가용성 안지오텐신 전환 효소 (ACE)의 제조 및 검정
가용성 ACE 활성을 신장 피질로부터 얻고, 그의 형광 생성물 Abz-Gly을 생성시키는 ACE 기질 Abz-Gly-p-니트로-Phe-Pro-OH의 분해 속도를 측정하여 분석한다.
1. 재료
모든 물은 이중 탈이온시킨다.
1.1 인간 신장 IIAM (미국 펜실바니아주) 또는
영국 인간 조직 은행 (UK HTB)
1.2 돼지 신장 ACE 시그마 (A2580)
1.3 균질화 완충액-1
100 mM 만니톨 및 20 mM 트리스 ＠ pH 7.1
2.42 g 트리스 (피셔 T/P630/60)를 물 1 리터에 희석하고 실온에서 6M HCl을 사용하여 pH를 7.1로 조절한다. 여기에, 18.22 g 만니톨 (시그마 M-9546)을 첨가한다.
1.4 균질화 완충액-2
100 mM 만니톨, 20 mM 트리스 ＠ pH 7.1 및 10 mM MgCl2·6H2O (피셔 M0600/53)
균질화 완충액 1 (1.4) 500 ㎖에 MgCl21.017 g을 첨가한다.
1.5 트리스 완충액 (ACE 완충액)
50 mM 트리스 및 300 mM NaCl ＠ pH 7.4
50 mM 트리스 pH 7.4 (시그마 T2663) 50 ㎖ 및 NaCl (피셔 S/3160/60) 17.52 g을 물에서 1000 ㎖ 이하로 만든다.
1.6 기질 (Abz-D-Gly-p-니트로-Phe-Pro-OH)(바켐 (Bachem) M-1100)
ACE 기질을 분말로서 -20 ℃에 저장한다. 2 mM 저장물을 ACE 완충액 중에서 서서히 기질을 재현탁하여 제조하고, 이것은 와동되거나 초음파 처리될 필요가 없다. 2 mM 저장물의 400 μl 분취량은 1개월까지 -20 ℃에서 저장한다.
1.7 전체 생성물
기질에서 생성물로의 100% 전환에 상응하는 샘플을 플레이트 상에 포함시켜 기질 전환%를 확인할 수 있다 (계산 참조). 37 ℃에서 24시간 동안 효소 저장물 20 μl와 함께 2 mM 기질 1 ㎖를 인큐베이션시켜 전체 생성물을 형성한다.
1.8 정지 용액
0.5 M EDTA (프로메가 CAS[6081/92/6])를 ACE 완충액에서 1:250 희석하여 2 mM 용액을 만든다.
1.9 디메틸 술폭시드 (DMSO)
1.10 염화 마그네슘 - MgCl2·6H2O (피셔 M0600/53)
1.11 블랙 96 웰 편평 바닥 분석 플레이트 (코스타 (Costar) 3915 또는 Packard (팩커드))
1.12 탑실 A (팩커드 6005185)
1.13 원심분리관
2. 특정 장치
2.1 소르발 RC-5B 원심분리기 (SS34 GSA 로우터, 4 ℃로 미리 냉각)
2.2 브라운 미니프라이머 믹서
2.3 벡크만 CS-6R 원심분리기
2.4 BMG 플루오스타 갤럭시 (Fluostar Galaxy)
2.5 웨스바트 (Wesbart) 1589 진탕 인큐베이터
3. 방법
3.1 조직 제조
3.2 문헌 (Booth, A.G. & Kenny, A.J. (1974) Biochem. J. 142, 575-581)으로부터 채택된 방법을 이용하여 신장 피질로부터 인간 ACE를 얻는다.
3.3 냉동 신장을 실온에서 해동시키고 피질을 수질로부터 절개해 낸다.
3.4 피질을 미세하게 자르고 브라운 미니프라이머 (2.2)를 사용하여 약 10배의 균질화 완충액-1 (1.4)에서 균질화시킨다.
3.5 염화 마그네슘 (1.11) (20.3 ㎎/조직 gm)을 균질화물에 첨가하고 얼음-물 조에서 15분 동안 교반하였다.
3.6 벡크만 원심분리기 (2.3)에서 균등질을 1,500 g (3,820 rpm)으로 12분 동안 원심분리시킨 후 상등액을 새로운 원심분리관으로 이동시키고, 펠렛을 폐기한다.
3.7 상등액을 소르발 (Sorvall) 원심분리기 (2.1)에서 15,000 g (12,100 rpm)으로 12분 동안 원심분리시키고 상등액을 폐기한다.
3.8 남은 펠렛의 상부 위의 엷은 핑크색층을 제거하고 균질화 완충액-2 (1.5) (조직 1g 당 5 ㎖ 완충액)에 재현탁한다.
3.9 벡크만 원심분리기에서 현탁액을 2,200 g (4,630 rpm)으로 12분 동안 원심분리한 후 펠렛을 폐기한다.
3.10 상등액을 소르발 원심분리기를 사용하여 15,000 g (12,100 rpm)으로 12분 동안 원심분리시키고 상등액을 폐기한다.
3.11 최종 펠렛을 균질화 완충액-2 (조직 1g 당 0.5 ㎖ 완충액)에 재현탁한다. 균질 현탁액을 브라운 미니프라이머를 사용하여 얻는다. 다음에, 이것을 100 μl 분취량씩 동결하고, 상기 분취량은 NEP 활성 측정에 사용한다.
4.0 ACE 활성 측정
미리 분취된 ACE의 활성을 ACE 특이적 펩티드 기질을 분해하는 능력으로 측정한다.
돼지 ACE (1.2)를 해동시키고 ACE 완충액 (1.6)에 0.004 U/μl로 재현탁한 후, 이것을 50 μl 분취량씩 동결시킨다.
4.1 4% DMSO/ACE 완충액을 만든다 (96 ㎖ ACE 완충액 중의 4 ㎖ DMSO)
4.2 기질 (1.7), 전체 생성물 (1.8) 및 효소 (1.1, 1.2, 1.3)를 얼음 위에 두어 해동시킨다.
4.3 4% DMSO/ACE 완충액 50 μl를 각 웰에 첨가한다.
4.4 2 mM 기질 저장물을 1:100으로 희석하여 20 μM 용액을 만든다. 20 μM 기질 100 μl를 각 웰에 첨가한다 (분석 중의 10 μM 최종 농도).
4.5 효소 희석액 50 μl를 첨가하여 반응을 개시한다 (일반적으로 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600 및 1:3200이 이용된다). ACE 완충액 50 μl를 블랭크 웰에 첨가한다.
4.6 2 mM 전체 생성물을 1:200으로 희석하여 10 μM 용액을 만든다. 10 μM 생성물 200 μl를 새로운 플레이트의 처음 4개의 웰에 첨가한다.
4.7 플레이트를 37 ℃, 진탕 인큐베이터에서 60분 동안 인큐베이션시킨다.
4.8 ACE 완충액 중의 100 μl 2 mM EDTA를 첨가하여 효소 반응을 중지시키고 37 ℃, 진탕 인큐베이터에서 20분 동안 인큐베이션시킨 후 BMG 플루오스타 갤럭시 (ex320/em420) 상에서 읽는다.
5. ACE 억제 검정
5.1 기질, 전체 생성물 및 효소 저장물을 얼음 위에 두어 해동시킨다.
5.2 화합물 저장물은 100% DMSO 중에서 만들고 ACE 완충액 중에서 1:25로 희석하여 4% DMSO 용액을 얻는다. 모든 추가 희석을 4% DMSO/ACE 완충액 중에서 실시한다 (ACE 완충액 96 ㎖ 중의 DMSO 4 ㎖).
5.3 화합물 50 μl를 96 웰 플레이트에 2회 첨가하고 4% DMSO/ACE 완충액 50 μl를 대조군 및 블랭크 웰에 첨가한다.
5.4 단계 5.2 및 5.3을 손으로 또는 팩키드 멀티프로브 로봇을 이용하여 실시한다.
5.5 2 mM 기질 저장물을 ACE 완충액 중에서 1:100로 희석하여 20 μM 용액을 만든다 (분석 중의 10 μM 최종 농도)(10.89 ㎖ 완충액에 첨가된 2 mM 기질 110 μl는 하나의 플레이트에 대해 충분하다).
5.6 활성 체크 (4.0)로부터 확인되는 바와 같이, 효소 저장물을 ACE 완충액에 희석시킨다.
5.7. 2 mM 전체 생성물 저장물을 ACE 완충액에 1:200로 희석하여 10 μM 용액을 만든다. 200 μl를 다른 플레이트의 처음 4개의 웰에 첨가한다.
5.8 0.5 mM EDTA 저장물을 1:250로 희석하여 2 mM 저장물을 만든다 (44 μl EDTA 대 10.96 ㎖ ACE 완충액).
5.9 96 웰 플레이트의 각 웰에 하기 시약을 첨가한다:
<표 1>
96 웰 플레이트에 첨가된 시약
화합물/DMSO 트리스 완충액 기질 ACE 효소 전체 생성물
샘플 2 μl 화합물 50 μl 100 μl 50 μl 없음
대조군 2 μl DMSO 50 μl 100 μl 50 μl 없음
블랭크 2 μl DMSO 100 μl 100 μl 없음 없음
전체 2 μl DMSO 없음 없음 없음 200 μl
5.10 분석에 사용된 최고 농도의 각 화합물 50 μl를 전체와 동일한 96 웰 플레이트에 중복 첨가한다. ACE 완충액 150 μl를 첨가하여 임의의 화합물 형광성을 확인한다.
5.11 ACE 효소를 첨가하여 반응을 개시한 후 37 ℃, 진탕 인큐베이터에서 1시간 동안 인큐베이션시킨다.
5.12 2 mM EDTA 100 μl를 첨가하여 효소 반응을 중지시키고 37 ℃, 진탕 인큐베이터에서 20분 동안 인큐베이션시킨 후 BMG 플루오스타 갤럭시 (ex320/em420)로 읽다.
6. 계산
ACE 효소의 활성을 화합물의 존재 및 부재 하에 측정하고 백분율로 표시한다.
FU = 형광 단위
(i)% 대조군 활성 (효소의 전환):
(ii)억제제에 의한 % 활성:
(iii)대조군의 %로서 표시된 활성:
또는
(iv) % 억제 = 100 - % 대조군
(v) 형광 화합물의 경우에, 화합물 (5.10)을 함유하는 블랭크의 평균 FU를 % 활성을 계산하는데 사용되는 화합물 수치의 평균 FU로부터 뺀다.
S자형 투여량 반응 곡선은 엑셀 (Excel)의 랩스테이츠 피트-커브 (LabStats fit-curve)를 이용하여 계산된 % 활성 (대조군의 %) 대 화합물 농도 및 IC50값에 에 적용된다.
결론
본 발명자는 여성의 성적 흥분 중에 관찰되는 생리학적 흥분 반응을 반영하며 인간 지원자에게서 얻어진 임상 데이타를 직접 반영하는 동물 모델을 개발하였다. 이 모델은 골반 신경 자극 또는 혈관활성 신경전달물질에 의해 유도되는 질 및 음핵 혈류량의 작은 변화를 기록하는 레이저 도플러 기술을 이용한다. 성적 흥분 중에는, 골반 신경으로부터 증가된 신경분포에 의해 성기 혈류량이 증가된다. 동물 모델에서 관찰된, 골반 신경 자극된 질 및 음핵 혈류량 증가는 여성의 성적 흥분, 즉 충혈 중에 관찰된 내인성 혈관 효과를 나타낸다. 그러므로, 이 모델은 처음에 질 및 음핵 혈류량의 조절에 관련된 메카니즘을 확인하고, 두번째로 성기 혈류량의 증가를 위한 새로운 방법을 확인하는 데 이용될 수 있다.
이 연구는 VIP가 성기 혈류를 매개하는 것을 나타내고 성기 혈관이완 (및 질 벽 이완)을 조절하는 매개인자/2차 메신저로서 cAMP를 확인하는 생체내, 시험관내 및 생화학적 기술을 성공적으로 조합하여 이용하였다. 본 발명자는 이 동물 모델을 이용하여 VIP의 관주 융합이 질 및 음핵 혈류량의 증가를 유도한다는 것을 입증하였다. 본 발명자는 또한 VIP 대사의 억제제 (예를 들면, NEP EC3.4.24.11 억제제)를 이용하여 골반 신경 자극 (즉, 성적 흥분) 중에 관찰된 성기 혈류량의 증가가 VIP에 의해 매개됨을 입증하였다. 이전에 VIP가 건강한 지원자의 질 혈류량을 증가시키는 것으로 밝혀졌지만 그 세포 메카니즘은 확인되지 않은 반면, 본 발명자는 성기 혈류량의 VIP 매개 증가가 조직 cAMP의 상승에 의한 것임을 밝혀냈다. 또한, 본 발명자는 성기 혈류량이 cAMP 유사물에 의해 직접적으로, 또는 PDEcAMP타입 2 억제제 또는 NPY Y1 수용체 길항제에 의해 cAMP 농도를 상승시킴으로써 간접적으로 증가될 수 있다는 것을 입증하였다.
FSAD의 주요 원인은 감소된 성기 혈류량이며 이것은 감소된 질, 음순 및 음핵 충혈로서 그 자체를 나타낸다. FSAD를 앓고 있는 여성의 치료는 정상적인 성적 흥분 반응의 회복에 의해 이루어질 수 있다. 이것은 성기 혈류량을 증가시킴으로써 달성될 수 있다. 본 발명의 FSAD의 치료법은, 예를 들면 NEP (EC 3.4.24.11)의 억제제, cAMP 가수분해 PDE 억제제 또는 NPY 수용체 길항제에 의한 내인성 cAMP 신호화를 간접적으로 또는 직접적으로 상승작용시켜 성기 혈류량을 증가시킴으로써 질 충혈/윤활 및 음핵 충혈/민감화를 상승작용시키는 것이다. 이것은 심혈관 부작용 없이 정상적인 흥분 반응을 회복하거나 상승작용시키는 전체 효과를 나타낼 것이다. 성적 흥분/충혈은 단순히 성적 충동 없이 유도된다기 보다는 외부적으로 투여된 미량의 혈관활성 약제, 예를 들면 VIP에 의한 경우에 증가될 것이다.
그러므로, 요약하면 본 발명은 특히
FSD, 바람직하게는 FSAD를 앓고 있는 여성의 성기에서 cAMP를 상승작용시킬 수 있고, 제약학상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 임의로 혼합되는 약제를 포함하는, FSD, 바람직하게는 FSAD의 치료에 사용하기 위한 (또는 사용시의) 제약 조성물;
FSD, 바람직하게는 FSAD의 치료용 의약의 제조에 사용되는, FSD, 바람직하게는 FSAD를 앓고 있는 여성의 성기에서 cAMP를 상승작용시킬 수 있는 약제의 용도;
FSD, 바람직하게는 FSAD를 앓고 있는 여성의 성기에서 cAMP를 상승작용시킬 수 있고, 여성의 성기에서 cAMP의 상승작용을 일으키는 양이고, 제약학상 허용되는담체, 희석제 또는 부형제와 임의로 혼합되는 약제를 여성에게 전달시키는 것을 포함하는 여성 (예를 들면, FSD, 바람직하게는 FSAD를 앓고 있는 여성)의 치료 방법에 관한 것이다.
이러한 실시형태에서, 약제는 바람직하게는 I:PDE, I:NEP, I:NPY 중 하나 이상이다.
아주 바람직한 실시형태에서, 본 발명은 특히
FSD, 바람직하게는 FSAD를 앓고 있는 여성의 성기에서 cAMP를 상승작용시킬 수 있고, 제약학상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 임의로 혼합되고, 경구로 전달되는 약제를 포함하는, FSD, 바람직하게는 FSAD의 치료에 사용하기 위한 (또는 사용시의) 제약 조성물;
FSD, 바람직하게는 FSAD의 치료용 의약의 제조에 사용되는, FSD, 바람직하게는 FSAD를 앓고 있는 여성의 성기에서 cAMP를 상승작용시킬 수 있고, 경구로 전달되는 약제의 용도;
FSD, 바람직하게는 FSAD를 앓고 있는 여성의 성기에서 cAMP를 상승작용시킬 수 있고, 여성의 성기에서 cAMP의 상승작용을 일으키는 양이고, 제약학상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 임의로 혼합되고, 경구로 전달되는 약제를 여성에게 전달시키는 것을 포함하는, 여성 (예를 들면, FSD, 바람직하게는 FSAD를 앓고 있는 여성)의 치료 방법에 관한 것이다.
이러한 실시형태에서, 약제는 바람직하게는 I:PDE, I:NEP, I:NPY 중 하나 이상이다.
추가의 아주 바람직한 실시형태에서, 본 발명은 특히
FSD, 바람직하게는 FSAD를 앓고 있는 여성의 성기에서 cAMP를 상승작용시킬 수 있고, 제약학상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 임의로 혼합되고, 내인성 cAMP를 상승작용시키는 약제를 포함하는, FSD, 바람직하게는 FSAD의 치료에 사용하기 위한 (또는 사용시의) 제약 조성물;
FSD, 바람직하게는 FSAD의 치료용 의약의 제조에 사용되는, FSD, 바람직하게는 FSAD를 앓고 있는 여성의 성기에서 cAMP를 상승작용시킬 수 있고, 내인성 cAMP를 상승작용시키는 약제의 용도;
FSD, 바람직하게는 FSAD를 앓고 있는 여성의 성기에서 cAMP를 상승작용시킬 수 있고, 여성의 성기에서 cAMP의 상승작용을 일으키는 양이고, 제약학상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 임의로 혼합되고, 내인성 cAMP를 상승작용시키는 약제를 여성에게 전달시키는 것을 포함하는, 여성 (예를 들면, FSD, 바람직하게는 FSAD를 앓고 있는 여성)의 치료 방법에 관한 것이다.
이러한 실시형태에서, 약제는 바람직하게는 I:PDE, I:NEP, I:NPY 중 하나 이상이다.
또다른 아주 바람직한 실시형태에서, 본 발명은 특히
FSD, 바람직하게는 FSAD를 앓고 있는 여성의 성기에서 cAMP를 상승작용시킬 수 있고, 제약학상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 임의로 혼합되고, 경구로 전달되고 내인성 cAMP를 상승작용시키는 약제를 포함하는, FSD, 바람직하게는 FSAD의 치료에 사용하기 위한 (또는 사용시의) 제약 조성물;
FSD, 바람직하게는 FSAD의 치료용 의약의 제조에 사용되는, FSD, 바람직하게는 FSAD를 앓고 있는 여성의 성기에서 cAMP를 상승작용시킬 수 있고, 경구로 전달되고 내인성 cAMP를 상승작용시키는 약제의 용도;
FSD, 바람직하게는 FSAD를 앓고 있는 여성의 성기에서 cAMP를 상승작용시킬 수 있고, 여성의 성기에서 cAMP의 상승작용을 일으키는 양이고, 제약학상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 임의로 혼합되고, 경구로 전달되고 내인성 cAMP를 상승작용시키는 약제를 여성에게 전달시키는 것을 포함하는 여성 (예를 들면, FSD, 바람직하게는 FSAD를 앓고 있는 여성)의 치료 방법에 관한 것이다.
이러한 실시형태에서, 약제는 바람직하게는 I:PDE, I:NEP, I:NPY 중 하나 이상이다.
이들 실시형태에서, 약제는 바람직하게는 I:PDE2, I:NEP (여기서, NEP는 EC 3.4.24.11임), I:NPY1 중 하나 이상이다.
이들 실시형태에서, 약제는 바람직하게는 선택적인 I:PDE2, 선택적인 I:NEP (여기서, NEP는 EC 3.4.24.11임), 선택적인 I:NPY1 중 하나 이상이다.
상기 명세서에 언급된 모든 공보는 본원에 포함되는 것으로 한다. 당업계의 숙련인은 발명의 영역 및 취지를 벗어나지 않고서 본 발명의 기재된 방법 및 시스템의 각종 변형 및 변화가 이루어질 수 있음을 알 수 있을 것이다. 본 발명이 특정의 바람직한 실시형태와 연관되어 설명되었지만, 청구된 본 발명은 이러한 특정 실시형태에 부적절하게 제한되어서는 안된다. 사실상, 생화학 및 생물공학 또는 관련 분야의 숙련인에게 명백한 본 발명을 실시하기 위한 방식의 각종 변형은 다음청구범위의 영역 내에 포함된다.
약어
FSD = 여성 성기능장애
FSAD = 여성 성적 흥분 이상
cAMP = 환상 아데노신-3',5'-모노포스페이트
cGMP = 환상 구아노신-3',5'-모노포스페이트
PcAMP= cAMP의 상승인자
PcGMP= cGMP의 상승인자
AcAMP= cAMP의 활성화제
AcGMP= cGMP의 활성화제
AMcAMP= cAMP의 역조절인자
AMcGMP= cGMP의 역조절인자
IcAMP= cAMP의 억제제
IcGMP= cGMP의 억제제
I:IcAMP= cAMP의 억제제의 억제제
I:IcGMP= cGMP의 억제제의 억제제
I:AMcAMP= cAMP의 역조절인자의 억제제
I:AMcGMP= csGMP의 역조절인자의 억제제
U:AcAMP= cAMP의 활성화제의 상승 조절인자
U:AcGMP= cGMP의 활성화제의 상승 조절인자
AC = 아데닐레이트 시클라아제
A:AC = AC의 활성화제
NEP = 중성 엔도펩티다아제
I:NEP = NEP의 억제제
VIP = 혈관활성 장 펩티드
VIPr = VIP의 수용체 (VIPR로서 표시될 수 있음)
VIPn= VIP의 수용체 아형 (예를 들면, VIPR1, VIPR2)
A:VIPr = VIPr의 활성화제
A:VIPn= VIPn의 활성화제
I:VIPr = VIPr의 억제제
I:VIPn= VIPn의 억제제
I:I:VIPr = VIPr의 억제제의 억제제
I:I:VIPn= VIPn의 억제제의 억제제
PDE = 포스포디에스테라아제
PDEn = PDE 족 (예를 들면, PDE1, PDE2 등)
PDEcAMP= cAMP 가수분해 PDE
PDEcGMP= cGMP 가수분해 PDE
I:PDE = PDE의 억제제
I:PDEcAMP= cAMP 가수분해 PDE의 억제제
I:PDEncAMP= cAMP 가수분해 PDE 족의 억제제
NPY = 뉴로펩티드 Y
NPYr = NPY의 수용체 (NPYR로서 표시될 수 있음)
NPY Yn= NPY의 Yn수용체 아형 (예를 들면, NPY Y1)(예를 들면, NPYR1)
I:NPY = NPY의 억제제
I:NPY Yn= NPY Yn의 억제제 (여기서, n은 NPY 수용체 아형을 나타냄)
kDa = 킬로달톤
bp = 염기쌍
kb = 킬로염기쌍
본 발명의 FSAD의 치료법은 예를 들면 NEP (EC 3.4.24.11)의 억제제, cAMP 가수분해 PDE 억제제 또는 NPY 수용체 길항제에 의한 내인성 cAMP 신호화를 간접적으로 또는 직접적으로 상승작용시켜 성기 혈류량을 증가시킴으로써 질 충혈/윤활 및 음핵 충혈/민감화를 상승작용시키는 것이다. 이것은 심혈관 부작용 없이 정상적인 흥분 반응을 회복하거나 상승작용시키는 전체 효과를 가질 것이다.

Claims (13)

  1. 여성 성기능장애(FSD), 바람직하게는 여성 성적 흥분장애(FSAD)를 앓고 있는 여성의 성기에서 cAMP를 상승작용시킬 수 있고 제약학상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 임의로 혼합되는 약제를 포함하는, FSD, 바람직하게는 FSAD의 치료에 사용하기 위한 (또는 사용시의) 제약 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 약제가 성기 (예를 들면, 질 또는 음핵) 혈관이완의 매개인자인 제약 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 조성물이 경구 투여용인 제약 조성물.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 cAMP가 내인성 cAMP인 제약 조성물.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 조성물이 성적 자극 전 또는 도중에 가해지는 제약 조성물.
  6. 약제가 cAMP를 직접 또는 간접적으로 상승작용시킬 수 있는지를 확인하는 단계를 포함하고; 상기 약제 존재시에 cAMP의 상승작용이 나타나면 그 약제가 FSD, 특히 FSAD의 치료에 유용할 수 있음을 나타내는 것인, FSD, 특히 FSAD를 치료하는데 사용될 수 있는 약제를 확인하는 검정 방법.
  7. (a) 제6항에 따른 검정을 수행하는 단계;
    (b) cAMP를 직접 또는 간접적으로 상승작용시킬 수 있는 1종 이상의 약제를 확인하는 단계; 및
    (c) 1종 이상의 확인된 약제를 정량 제조하는 단계를 포함하는 방법.
  8. 제6항에 따른 검정 방법에 의해 확인된 약제.
  9. 제8항에 따른 약제를 포함하는, FSD, 바람직하게는 FSAD를 치료하기 위한 경구 투여용 의약.
  10. 분리된 여성 샘플이 여성의 성기에서 cAMP의 농도 또는 활성에 직접 또는 간접적인 영향을 미치는 인자를 함유하는지, 또 그 인자를 FSD, 바람직하게는 FSAD를 일으킬 정도의 양으로 함유하는지를 확인하는 데 사용될 수 있는, 분리된 여성 샘플에서 상기 인자를 검출하기 위한 수단을 포함하는 진단 조성물 또는 키트.
  11. 동물의 골반 신경 자극에 따른 동물의 성기 (예를 들면, 질 또는 음핵) 혈류량 변화를 측정하는 수단을 포함하는 마취된 암컷 동물을 포함하는, FSD, 바람직하게는 FSAD를 치료할 수 있는 약제를 확인하는 데 이용되는, 인간이 아닌 동물 모델.
  12. 제11항의 인간이 아닌 동물 모델에 약제를 투여하는 단계; 및 상기 동물의 성기 (예를 들면, 질 또는 음핵)에서 있을 수 있는 cAMP의 상승작용 및(또는) 혈류량의 증가를 측정하는 단계를 포함하는, FSD, 바람직하게는 FSAD를 치료하기 위해 cAMP를 직접 또는 간접적으로 상승작용시킬 수 있는 약제를 확인하는 검정 방법.
  13. 제12항에 따른 검정 방법에 의해 확인된 약제.
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