KR20010081888A - 상피세포 성장인자를 유효성분으로 하는 안정한 약제학적조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 상피세포 성장인자(epidermal growth factor, EGF)를 유효성분으로 하고, 카르복시 비닐 폴리머를 기제로 포함하는 EGF 조성물에 관한 것이다. 본 발명자들은 산성 고분자인 카르복시 비닐 폴리머를 기제로 사용하여 EGF 제제를 제조하는 경우에 셀룰로오즈 계열의 고분자나 중성 고분자보다 EGF의 충분한 효과를 발휘함과 동시에, 수용액에서 EGF의 안정성을 증가시킴을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 카르복시 비닐 폴리머를 기제로 사용하여 제조된 생물학적 및 물리화학적으로 안정한 EGF 조성물은 안과 제제나 피부 외용제로서 난치성 궤양 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

상피세포 성장인자를 유효성분으로 하는 안정한 약제학적 조성물{Stable Pharmaceutical Composition Comprising Epidermal Growth Factor as an Active Ingredient}
본 발명은 상피세포 성장인자(epidermal growth factor, EGF)를 유효성분으로 함유하는 안정한 약제학적 조성물에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 생물학적으로 활성을 갖는 EGF 및 수용액에서 EGF의 안정성을 현저히 증가시키는 카르복시 비닐 폴리머를 기제로 포함하는 EGF 조성물에 관한 것이다.
EGF는 종래 유로가스트론(urogastrone)으로 알려진, 53개의 아미노산과 3개의 이황화물(disulfide) 결합을 갖는 분자량 6045의 폴리펩타이드로서, 상피세포와 간엽(messenchymal) 세포를 포함한 각종 세포들에 대해 유사분열 촉진, 세포성장 촉진 및 위산분비 억제 등의 활성이 있어, 피부 또는 각막의 상처 치료제 또는 위궤양 치료제로 사용할 수 있는 것으로 알려져 있다(참조: 미합중국 특허 제 140998호; Carpenter,Experimental Cell Research,164:1-10, 1986). 그러나, EGF를 실제 상처부위에 적용하였을 때에는 시험관내에서의 우수한 상피세포 분화촉진 기능에 비하여 아주 미미한 상처치유의 심각한 단점이 있어, EGF를 이용한 피부 또는 각막의 상처 치료용 외용제의 개발에 어려움을 겪어 왔다.
전기한 바와 같이, EGF를 생체에 직접 적용하는 경우에 상처치유 효과를 충분히 나타내지 못하는 이유는 EGF가 생물학적으로 불안정할 뿐 아니라, 물리화학적으로도 불균질하므로 치료효과를 감소시키고 분해산물에 의한 알레르기가 발생되기 때문이다: 즉, EGF는 상온에서 특히, 수분의 존재하에서 매우 불안정하고, 상처부위에서 세포가 DNA를 합성하도록 유도하기 위하여 8 내지 12시간 정도의 잠복기(lag time)가 필요한데 반하여, EGF의 반감기는 약 1시간 정도로 매우 짧아서 목적하는 효과를 나타낼 수 없으며, EGF는 순수한 폴리펩타이드이므로 장기보관시 실온에서 뿐만 아니라, 심지어 냉장보관 상태에서도 물리화학적 변화가 일어나고, EGF를 피부에 적용하면 상처부위에 존재하는 단백질 분해효소에 의하여 EGF가 변성 분해, 응집 및 침전되는 과정으로 인하여 생물학적 활성을 상실하기 때문이다(참조: Manning et al.,Pharmaceutical Res., 6:903-917, 1989).
상술한 EGF의 단점 중 생물학적 불안정을 극복하고 충분한 치료효과를 나타내기 위하여, 상처 회복에 가장 중요한 최초의 며칠 동안 EGF를 상처부위에 수시로 적용하여 유효농도가 지속적으로 유지되도록 해 주어야 함이 보고되어(참조: Franklin et al.,J. Lab. Clin. Med., 108:103-108, 1986), 이에 따라 현재까지 EGF를 상처부위에 지속적으로 공급할 수 있는 서방성 제제를 개발하고자 하는 연구들이 진행되어 왔다. 이러한 연구결과로, 중성 인지질과 음으로 하전된 인지질 및 콜레스테롤을 사용하여 EGF를 상처부위에 지속적으로 공급하는 EGF/리포좀 겔 제제가 제시되었고(참조: 미합중국 특허 제 4944948호), 약제학적으로 허용되는 다양한 수용성 또는 팽윤성 폴리머들을 기제로 이용하여 EGF를 지속적으로 방출할 수 있는 수성 제제가 개발되었다(참조: 유럽특허 제 312208호). 그러나, 이들 문헌들은 EGF를 12시간 이상 지속적으로 방출하는 방법을 제시하고는 있으나, EGF 제제로서의 보관 중 장기 안정성이 확보되지 않는 단점이 있어 산업적으로 생산하기에는 부적합한 단점을 내포하고 있다. 따라서, EGF가 약제로서 충분한 치료효과를 나타내기 위해서는, 장기간 동안 생물학적 활성이 유지되어야 할 뿐만 아니라, 순도 및 균질성 등의 물리화학적 안정성을 유지해야 할 필요성이 끊임없이 요구되었다.
이러한 물리화학적 안정성을 유지하여 EGF 활성의 감소를 막기 위한 방법으로, 피부 또는 안과용 크림의 조성물로 EGF와 1 내지 10%의 계면활성제, 5 내지 45%의 지방질 및 0.3 내지 0.8%의 방부제로 된 조성물이 개시되었고(참조: 유럽 특허공개 제 205051호), EGF에 수용성 셀룰로오스 중합체를 첨가한 EGF 함유 안정화 조성물(참조: 유럽 특허공개 제 267015호; 미합중국 특허 제 4717717호) 뿐만 아니라, EGF에 약제학적으로 허용되는 아연 등의 금속 양이온을 첨가하여 아연과 EGF가 이온결합을 이루어 수용액 중에서의 EGF의 분해를 막아 안정성을 증가시킬 수 있음이 개시되었다(참조: 유럽 특허공개 제 398,615호; 미합중국 특허 제 5130298호).
그러나, 상술한 특허에서 언급된 안정화제를 첨가하였을 때에도, 4℃ 보관시 2개월 정도의 안정성만을 보장할 수 있으므로, 실제 피부외용제로서 제제화하여 상처에 직접 적용할 경우 상처치유 효과가 충분히 나타나지 못하고 있거나, 제제의 안정성이 낮아서 실제 산업화에 적용하기 어려운 실정이다. 따라서, 특별한 치료제가 없는 피부궤양이나 각막 손상 같은 난치성 병변에 효과적으로 사용될 수 있는 EGF를 충분한 치료효과가 발휘되면서, 보관시에 안정하게 EGF를 보호하고, 적용시에는 담체로부터 상처부위로 신속하게 이행되는 제제를 개발하여야 할 필요성이 끊임없이 대두되었다.
이에, 본 발명자들은 생체에 적용시 충분한 치료효과를 나타내면서, 안정성을 가진 EGF 외용제를 개발하고자 예의 연구노력한 결과, EGF를 유효성분으로 하고 산성 고분자인 카르복시 비닐 폴리머를 기제로 사용하여 EGF로 피부외용제를 제조하는 경우에, 종래의 기술에서 기제로 사용되었던 셀룰로오즈 계열의 고분자나 중성 고분자보다 EGF의 효과가 충분히 발휘함과 동시에 뛰어난 안정성을 확보할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명은 EGF를 유효성분으로 하고 카르복시 비닐 폴리머를 기제로 포함하여, EGF의 생물학적 및 물리화학적으로 안정한 EGF 조성물을 제공하는 것이다.
이하, 본 발명의 유효성분으로서 EGF와 기제로서 카르복시 비닐 폴리머를 포함하는 안정한 EGF 조성물을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.
본 발명의 EGF를 유효성분으로 하는 안정한 약제학적 조성물은 EGF를 유효성분으로 하고, 카르복시 비닐 폴리머를 기제로 포함한다. 본 발명의 조성물에 있어서 활성성분인 EGF로는 천연형 EGF 및 재조합 EGF중 어느 것이나 사용가능하며, 조성물 중의 EGF의 함량은 EGF가 약리적으로 유효하게 작용할 수 있도록 바람직하게는 전체 제제의 함량에 대하여 0.01 내지 1,000㎍/g, 보다 바람직하게는 1 내지 100㎍/g를 함유하는 것이 적합하다. 이때, 조성물의 pH는 수용액에서 EGF가 변성되지 않으면서 용해된 상태로 유지될 수 있도록 하기 위하여, 4 내지 8까지 범위가 적당하나 5 내지 7사이로 조정하는 것이 안정성 측면에서 더욱 바람직하다.
한편, 본 발명에서 기제로 사용되는 카르복시 비닐 폴리머는 분자량 1 ×106내지 4 × 106정도의 호모폴리머이고, 아크릴산과 아릴슈크로오즈가 교차된 것으로 1% 수용액에 분산시 pH 2.5 내지 3.0을 나타내는 산성 고분자이며, 낮은 농도에서도(1% 이하) 넓은 범위의 점도를 가지므로 경구용 현탁제나 로숀, 크림 및 겔제에 널리 사용되고 있는 기제이다. 또한, 상술한 기제는 카보머 934, 카보머 934P, 카보머 940, 카보머 941 또는 카보머 947P와 같이 그 종류에 상관없이 56.0 내지 68.0%의 카르복실산기를 포함하며, 전체 조성물 중량에 대하여 0.001 내지 50 중량 %, 바람직하게는 0.005% 내지 25 중량%, 보다 바람직하게는 0.01 내지 10 중량%를 사용한다.
상기에서 제조된 EGF 조성물은 활성성분인 EGF 및 기제인 카르복시 비닐 폴리머 이외에 통상적으로 사용되는 약제학적 첨가제, 예를 들면 안정화제, 부형제,등장화제, 보습제, pH 조정제 등을 추가로 함유할 수 있다.
본 발명자들은 상술한 카르복시 비닐 폴리머를 이용하여 제조한 EGF제제와 그 외의 다른 고분자를 기제로 사용한 EGF 제제를 4℃ 및 25℃에서 6개월간 보관하면서 안정성 시험을 실시하였다. 이때, 대조군으로 10mM 인산 완충액에 용해시킨 EGF를 사용하여 제제의 안정성을 시험하였고, 함량 분석은 ELISA법을 이용하였다. 그 결과, 놀랍게도 카르복시 비닐 폴리머를 함유하는 제제의 경우에 넓은 농도 범위에서 다른 기제에 비교하여 월등한 안정성을 보였을 뿐만 아니라, 인산완충액에 용해시킨 EGF 보다도 우수한 안정성을 보였다. 이러한 결과는 카르복시 비닐 폴리머 기제의 함량에 상관없이 EGF를 안정화시킬 수 있어서, 사용 목적에 맞게 기제로서 점도를 조정하여 사용하거나, 안정화제로서 소량 첨가하여도 EGF를 탁월하게 안정화시킬 수 있음을 제시한다.
본 발명에서 제조된 EGF 조성물은 치료 목적에 따라 안과 제제나 피부 외용제로서 난치성 궤양 치료제로 응용될 수 있고, 필요에 따라 동결건조하여 보관하였다가, 용제에 용해시켜 사용할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 0.1% 카보머 점안제제의 제조
EGF 0.5 mg
카보머 934P 0.1 g
만니톨 5 g
파라옥시안식향산메틸 0.04g
파라옥시안식향산프로필 0.01g
수산화나트륨 적당량
주사용증류수 적당량
총량 100 g
상기 처방을 지정된 비율의 양만큼 사용하여 통상적인 제조방법에 의해 제조하였다. 즉, 만니톨과 파라옥시안식향산메틸 및 파라옥시안식향산프로필을 적당량의 주사용 증류수에 용해시킨 후, 카보머 934P(BFGoodrich, U.S.A.)를 교반하여 분산시키고, 수산화나트륨으로 pH를 조절하여 멸균한 다음, 주사용증류수에 용해시킨 EGF(Daewoong Pharm., Korea)의 여과 멸균액을 혼합하여, 총량 100g으로 제조하였다.
실시예 2: 10mM 인산완충액의 제조
EGF 0.5 mg
인산일수소나트륨 0.14 g
염화나트륨 0.88 g
20% 인산용액 적당량
총량 100 g
상기 처방을 지정된 비율의 양만큼 사용하여 통상적인 제조방법에 의해 제조하였다. 즉, 인산수소나트륨과 염화나트륨을 적당량의 주사용 증류수에 용해시키고, 20% 인산용액으로 pH를 조절하여 멸균한 액에, 주사용 증류수에 용해시킨 EGF의 여과 멸균액을 혼합하여, 총량 100g으로 제조하였다.
실시예 3: 0.5% 카르복시메틸셀룰로오즈 나트륨(CMC) 점안제제의 제조
EGF 0.5 mg
카르복시메틸셀룰로오즈 나트륨(CMC) 0.5 g
소르비톨 5.47 g
파라옥시안식향산메틸 0.05 g
수산화나트륨 적당량
주사용증류수 적당량
총량 100 g
상기 처방을 지정된 비율의 양만큼 사용하여 통상적인 제조방법에 의해 제조하였다. 즉, 소르비톨과 파라옥시안식향산메틸을 지정된 양만큼 주사용 증류수에용해시킨 다음, 카르복시메틸셀룰로오즈 나트륨(Koreanginseng Product Co., Korea)을 교반하여 분산시키고, 수산화나트륨으로 pH를 조절한 후 멸균하여, 주사용증류수에 용해시킨 EGF의 여과 멸균액을 혼합하여, 총량 100g으로 제조하였다.
실시예 4: 1% 카보머 외용제제의 제조
EGF 5 mg
카보머 934P 1 g
파라옥시안식향산메틸 0.2 g
프로필렌글리콜 20 g
수산화나트륨 적당량
주사용증류수 적당량
총량 100 g
상기 처방을 지정된 비율의 양만큼 사용하여 통상적인 외용제 제조방법에 의하여 제조하였다. 즉, 파라옥시안식향산메틸을 적당량의 주사용 증류수에 용해시키고, 카보머 934P를 교반하여 분산시킨 후 수산화나트륨으로 pH를 조정한 다음, 프로필렌글리콜을 혼화하여 가열 멸균하였다. 여기에 주사용 증류수에 용해시킨 EGF의 여과 멸균한 액을 혼합하여, 총량 100g으로 제조하였다.
실시예 5: 15% 폴록사머 외용제제의 제조
EGF 5 mg
폴록사머 407 15 g
파라옥시안식향산메틸 0.2g
인산일수소나트륨 272.18 mg
염화나트륨 666.22 mg
인산 적당량
프로필렌글리콜 20 g
주사용증류수 적당량
총량 100 g
상기 처방을 지정된 비율의 양만큼 사용하여 통상적인 제조방법에 의해 제조하였다. 즉, 인산일수소나트륨, 염화나트륨 및 인산을 상기 비율의 양을 사용하여 인산염완충액을 제조하고, 방부제인 파라옥시안식향산 메틸을 용해시킨 다음, 폴록사머 407(BASF, Germany)을 가하고 교반하여 분산시킨다. 이어, 프로필렌글리콜을 혼화하고 활성성분인 EGF를 가하여 총 100g의 제제를 제조하였다.
실시예 6: 점안제의 안정성 시험
실시예 1에서 제조된 카보머 점안제의 안정성 시험을 위하여, EGF 안정화 작용이 있는 것으로 알려진 실시예 2의 카르복시메틸셀룰로오즈 제제와 비교하여 4℃ 또는 25℃에서 보관하면서 2, 4, 8 및 18주의 시간 변화에 따라 제제의 함량 변화량을 측정하였다. 이때, 실시예 2의 10mM의 인산완충액에 용해시킨 시료를 표준액으로 삼고, EGF 함량은 Quantikine EGF ELISA kit(R&D, U.S.A.)을 사용하여 ELISA법으로 정량하였다.
표 1은 4℃에서의 EGF 점안제의 안정성을 표준액과 비교한 결과를 나타내며, 표 2는 25℃에서의 EGF 점안제의 안정성을 표준액과 비교한 결과를 나타낸다.
표 1에서 보듯이, 4℃ 조건에서 인산완충액의 함량은 8주째에 약 10%까지 저하되었으나, 카보머 제제와 카르복시메틸셀룰로오즈 제제는 8주까지 함량의 저하가 없었다. 하지만, 4℃ 조건에서 18주 보관하였을 경우 인산완충액 및 카보머 제제의 함량은 8주째까지 변화가 없는데 비하여, 카르복시메틸셀룰로오제제의 경우는 18주째에 87.3%로 EGF의 함량이 저하되었다.
4℃에서의 EGF 점안제의 안정성
시 료 초 기 4℃
2 주 4 주 8 주 18 주
실시예 10.1% 카보머 제제 100±2.5 99.2±3.2 102.0±4.3 103.7±1.2 101.6±3.5
실시예 210mM 인산완충액 제제 100±1.9 98.4±5.4 96.8±14.0 91.6±10.3 92.5±5.9
실시예 30.5% 카르복시메틸 셀룰로오즈 나트륨 제제 100±2.1 104.9±3.4 99.7±6.0 102.7±2.3 87.3±3.1
아울러, 표 2에서 보는 바와 같이, 동일한 제제를 25℃에서 보관할 경우 인산완충액제제는 2주째에 20%의 함량 저하가 일어나며, 카르복시메틸셀룰로오즈 제제의 경우에도 4주부터 함량이 저하되기 시작하여 계속적인 EGF의 함량 저하를 보이는데 비하여, 놀랍게도 카보머 제제의 경우에는 8주까지도 함량의 저하가 거의 관찰되지 않으며 상온에서 18주 보관하였을 때 약 13%의 함량저하를 나타내므로, 카보머 제제의 경우 상온 보관시에도 EGF의 안정성을 월등히 증가시킴을 확인할 수 있었다.
25℃에서의 EGF 점안제의 안정성
시 료 초 기 25℃
2 주 4 주 8 주 18 주
실시예 10.1% 카보머 제제 100±2.5 98.2±2.5 101.8±2.4 101.8±2.4 87.6±5.2
실시예 210mM 인산완충액 제제 100±1.9 81.6±3.6 88.4±6.9 81.3±1.7 72.5±3.3
실시예 30.5% 카르복시메틸 셀룰로오즈 나트륨 제제 100±2.1 93.5±6.5 88.4±0.2 78.5±2.7 48.7±9.3
실시예 7: 외용겔제의 안정성 시험
실시예 4에서 제조된 카보머 외용겔제의 안정성 시험을 위하여, 중성폴리머로 수용액에서의 투전항수를 낮추어서 단백질의 안정화에 기여하여 외용제의 기제로 널리 사용되는 프록사머 외용제와 비교하여, 4℃ 또는 25℃에 보관하면서 18주 동안 외용겔제의 함량변화를 측정하였다. 이때, 10 mM 인산완충액에 용해시킨 액을 표준액으로 비교하고, EGF 함량은 Quantikine EGF ELISA kit(R&D, U.S.A.)을 사용하여 ELISA법으로 정량하였다.
표 3은 4℃에서의 외용겔제의 안정성을 나타내며, 표 4는 25℃에서의 외용겔제의 안정성을 나타낸 것이다. 표 3에서 보듯이, 카보머나 폴록사머제제 모두 8주간의 냉장 보관시에는 함량의 저하가 거의 관찰되지 않은데 비하여, 18주에 폴록사머 제제는 약 10%의 함량 저하를 나타내었다. 그러나, 표 4의 25℃에서의 안정성 시험 결과를 보면 1% 카보머 제제의 경우 18주째까지 함량의 저하가 관찰되지 않았으나 폴록사머제제나 인산완충액 제제는 모두 8주째에 20%의 함량 저하가 나타나고 18주째에도 계속해서 함량의 저하가 나타났으며, 그 정도는 폴록사머 제제가 더 컸다. 점안제의 경우에서 보듯이, 폴리머를 기제를 사용할 경우 시간이 경과될수록 함량저하의 정도가 인산완충액보다 증가하며, 그 원인은 폴리머가 장기보관시에는 EGF의 분해를 더욱 촉진하기 때문이다. 따라서, 카보머를 기제로 사용한 제제의 경우만이 EGF의 안정성을 월등히 향상시킴을 확인할 수 있었다.
4℃에서의 EGF 외용겔제의 안정성
시 료 초 기 4℃
2 주 4 주 8 주 18 주
실시예 210mM 인산완충액제제 100±1.9 98.4±5.4 96.8±14.0 91.6±10.3 92.5±5.9
실시예 41% 카보머 제제 100±1.8 104.5±14.2 102.3±2.6 101.2±0.8 100.3±2.3
실시예 515% 플록사머 제제 100±2.8 103.5±9.3 95.7±0.8 94.2±4.2 90.5±4.5
25℃에서의 EGF 외용겔제의 안정성
시 료 초 기 25℃
2 주 4 주 8 주 18 주
실시예 210mM 인산완충액 제제 100±1.9 81.6±3.6 88.4±6.9 81.3±1.7 72.5±3.3
실시예 41% 카보머 제제 100±1.8 107.3±2.0 92.5±0.5 101.8±2.4 99.5±4.5
실시예 515% 플록사머 제제 100±2.8 90.3±41.4 79.5±5.0 78.5±2.7 66.4±2.6
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 생물학적으로 활성인 EGF에 카르복시 비닐 폴리머를 기제로 함유하여 생물학적, 물리화학적 안정성을 유지하는 안정한 EGF 조성물을 제공한다. 본 발명의 안정한 EGF 조성물은 안과 제제나 피부 외용제로서 난치성 궤양 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (8)

  1. 생물학적 활성이 있는 상피세포 성장인자(EGF)를 유효성분으로 하고, 카르복시 비닐 폴리머를 기제로 포함하는 안정한 EGF 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    생물학적 활성이 있는 EGF는 천연형 또는 재조합 단백질 형태로 제조된
    것을 특징으로 하는
    안정한 EGF조성물.
  3. 제 1항에 있어서,
    생물학적 활성이 있는 EGF는 전체 제제에 대하여 농도가 0.01 내지
    1000㎍/g인 것을 특징으로 하는
    안정한 EGF 조성물.
  4. 제 1항에 있어서,
    pH가 4 내지 8인 것을 특징으로 하는
    안정한 EGF 조성물.
  5. 제 1항에 있어서,
    카르복시 비닐 폴리머는 카보머 934, 카보머 934P, 카보머 940, 카보머
    941 또는 카보머 947P인 것을 특징으로 하는
    안정한 EGF 조성물.
  6. 제 1항에 있어서,
    카르복시 비닐 폴리머는 전체 제제에 대하여 농도가 0.001 내지 50
    (w/w)%인 것을 특징으로
    하는
    안정한 EGF 조성물.
  7. 제 1항에 있어서,
    외용제인 것을 특징으로 하는
    안정한 EGF 조성물.
  8. 제 1항에 있어서,
    점안제인 것을 특징으로 하는
    안정한 EGF 조성물.
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