KR20010071939A - 세균의 균체성분을 유효성분으로 하는 암면역요법용 제제 - Google Patents
세균의 균체성분을 유효성분으로 하는 암면역요법용 제제 Download PDFInfo
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Abstract
면역부활작용을 갖는 세균의 균체성분을 유효성분으로 하고, 기본적으로 오일상 물질, 계면활성제, 및 안정화제를 함유하는, 암면역요법제로서 사용할 수 있는 수중오일형 에멀젼제제 및 그 제조방법을 제공한다.
Description
미생물 사균, 세균의 세포벽 골격성분 (Cell Wall Skeleton, 이하, CWS 라 약칭), 무라밀 디펩티드 (MDP), 리포다당 (LPS), 만난 (mannan), 글루칸 및 이들의 유도체 등의 세균의 균체성분 (경우에 따라서는 재조합 DNA 법에 의해 생산되는 것을 포함함) 은, 면역부활작용을 가지며, 예를 들면 실험적 종양계 및 인간 암의 면역요법에 있어서 항종양활성을 나타내는 것이 알려져 있다. 게다가, 균체성분이, 균질기 등의 분산·유화기에 의해 오일상 물질중에 분산되고, 또한 계면활성제 용액으로 유화되어 수중오일형 에멀젼으로 제제화된 경우에, 상기 면역부활작용에 의한 항종양효과나 감염방어효과가 잘 발휘되는 것이 알려져 있다 (Cancer Res., 33, 2187-2195(1973), J.Nat.Cancer Inst., 48, 831-835(1972), J.Bacteriol., 94, 1736-1745(1967), Gann, 69, 619-626(1978), J.Bacteriol., 92, 869-879(1966)).
그러나, 상기 수중오일형 에멀젼제제는, 이하에 서술하는 이유로 상업적 생산이 곤란하며, 최근, 그 유용성이 점점 높이 평가되고 있음에도 불구하고 (Proc. Japan Acad., 70, Ser.B205-209(1994); Proc. Japan Acad., 74, Ser.B20550-55(1998)), 시장에 안정공급할 수 없다는 과제가 있었다. 본 발명은, 수중오일형 에멀젼제제의 상업적 생산을 곤란하게 하고 있는 여러 가지 장해를 극복하여, 상기 과제를 해결한 것이다. 이하, 순서대로 그 장해와 그것을 극복한 수단에 대해 서술한다.
일반적으로, 수중오일형 에멀젼제제는, 시간의 경과에 따른 변화가 크고, 모두 오일상, 및 수상의 2 상으로 분리되게 되어 있다. 그래서 종래부터, 에멀젼의 안정화를 위해, ① 미립자화, ② 분산매와 분산질의 비중차를 감소시킴, ③ 고분자 등을 첨가하여 분산매의 점도를 상승시킴, 등의 방법을 취해 왔다. 그러나, 모두 변화에 요하는 시간을 연장할 뿐, 최종적으로는 오일상, 수상의 2 상으로 분리되어 버린다.
특히, 균체성분을 유효성분으로 하는 수중오일형 에멀젼제제의 경우, CWS를 함유함에 의한 에멀젼의 불안정화가 보이고, 며칠이 지나면 불용성 응집물의 생성이 확인되게 되므로, 결국 사용 직전(用時) 조제에 의해 수중오일형 에멀젼제제를 조제하는 것 이외의 방법이 없었다. 이 점을 해소하기 위해, 당알콜이나 당류를 이용한 동결건조에 의한 제제화가 시도되고 있지만 (일본 특허공보 소 63-1291 호), 이 선행기술의 제제품에서도, 동결건조 직후 및 1 개월 정도의 보존으로 평균 입자경, 입도분포의 변화가 크게 확인되어, 실용화에 견딜 수 있는 안정성의 대폭적인 개선을 달성하기에는 이르지 못했다.
본 발명은, 면역부활작용을 갖는 세균의 균체성분을 유효성분으로 하고, 기본적으로 오일상 물질, 계면활성제, 및 안정화제를 함유하는, 암면역요법제로서 사용할 수 있는 수중오일형 에멀젼제제 및 그 제조방법에 관한 것이다.
다음에서, 도면에 대해 간단히 설명한다.
도 1 은 실시예 1.1 에 의해 얻어진 수중오일형 에멀젼의 동결건조 전과 동결건조 직후에 재분산한 것의 평균 입자경 및 입자경 분포를 나타낸 것이다.
도 2 는 실시예 1.2 에 의해 얻어진 수중오일형 에멀젼의 동결건조 전과 동결건조 직후에 재분산한 것의 평균 입자경 및 입자경 분포를 나타낸 것이다.
도 3 은 참조예 1.1 에 의해 얻어진 수중오일형 에멀젼의 동결건조 전과 동결건조 직후에 재분산한 것의 평균 입자경 및 입자경 분포를 나타낸 것이다.
도 4 는 50 ℃ 에서 보존한 제제를 재분산한 에멀젼의 탁도 (상대흡광도) 의 경시적인 변화를 나타낸 것이다 (시험예 1.2).
도 5 는 25 ℃ 에서 보존한 제제를 재분산한 에멀젼의 탁도 (상대흡광도) 의 경시적인 변화를 나타낸 것이다 (시험예 1.2).
도 6 은 50 ℃ 에서 보존한 제제를 재분산한 에멀젼의 평균 입자경 및 입자경 분포의 경시적인 변화를 나타낸 것이다 (시험예 1.3).
도 7 은 25 ℃ 에서 보존한 제제를 재분산한 에멀젼의 평균 입자경 및 입자경 분포의 경시적인 변화를 나타낸 것이다 (시험예 1.3).
도 8 은 5 ℃ 에서 보존한 제제를 재분산한 에멀젼의 평균 입자경 및 입자경 분포의 경시적인 변화를 나타낸 것이다 (시험예 1.3).
도 9 는 참조예 1.1 의 제제에 대한 평균 입자경 및 입자경 분포의 경시적인 변화를 나타낸 것이다.
도 10 은 참조예 2.3 에 기재된 오일상 물질을 포함하지 않는 제제품군의 렉틴 응집반응시험의 결과를 나타낸다.
도 11 은 실시예 2.1 에 기재한 에탄올 용매 분산개량법 제제품의 렉틴 응집반응 시험의 결과를 나타낸다.
도 12 는 실시예 2.2 에 기재한 제제품의 렉틴 응집반응 시험의 결과를 나타낸다.
도 13 은 실시예 3.1 의 제제품의 응집반응 평가결과를 나타낸다.
도 14 는 실시예 3.2 의 제제품의 응집반응 평가결과를 나타낸다.
도 15 는 참조예 2.2 에 기재한 공지 조제법의 개량법 제제품의 렉틴 응집반응 시험의 결과를 나타낸다.
도 16 은 참조예 2.1 에 기재한 공지 조제법 제제품의 렉틴 응집반응 시험의 결과를 나타낸다.
본 발명자들은, 예의 연구를 거듭한 결과, 균체성분을 유효성분으로 하는 수중오일형 에멀젼제제에 적절한 안정화제를 첨가함으로써, 그 제제를 안정적으로 동결건조할 수 있고, 보존안정성을 향상시킬 수 있음을 발견하였다. 즉, 본 발명의 수중오일형 에멀젼제제의 동결건조제제는, 물 등의 적당한 분산용매에 의한 재분산을 실시한 경우, 동결건조전과 동일한 정도의 평균 입자경, 입자경 분포 또는 탁도 (상대흡광도) 를 유지할 수 있다. 또, 본 발명의 동결건조제제를, 예를 들어 장기보존한 후, 동일하게 물 등의 적당한 분산용매에 재분산한 경우에서도, 동결건조전과 동일한 정도의 평균 입자경, 입자경 분포 또는 탁도 (상대흡광도) 를 유지할 수 있다.
즉, 본 발명에 관한 제 1 과제해결법의 요지는 다음과 같이 나타난다.
(1) 세균의 균체성분, 오일상 물질, 계면활성제 및 안정화제를 함유하고, 하기의 특징을 갖는 수중오일형 에멀젼을 동결건조처리하여 얻어지는 안정화 동결건조제제:
(a) 유적(油滴) 중에, 세균의 균체성분을 함유하고
(b) 단일 피크형의 입자경 분포에서 유적이 수용액중에 분산되고,
(c) 동결건조 전후에서의 수용액중의 유적의 입자경 분포 및 탁도의 변화가 크지 않다.
(2) 수용액의 탁도의 변화가 동결건조전의 탁도의 50 % 이하인 상기 (1) 에기재된 안정화 동결건조제제.
(3) 세균의 균체성분이 BCG-CWS 이며, 오일상 물질이 스쿠알렌인 상기 (1) 또는 (2) 에 기재된 안정화 동결건조제제.
(4) 안정화제가 아미노산 또는 요소인 상기 (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 기재된 안정화 동결건조제제.
(5) 안정화제가 글리신인 상기 (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 기재된 안정화 동결건조제제.
(6) 세균의 균체성분, 오일상 물질, 계면활성제 및 안정화제를 함유하고, 하기의 특징을 갖는 수중오일형 에멀젼을 동결건조처리하는 것으로 이루어지는 안정화 동결건조제제의 제조법:
(a) 유적중에, 세균의 균체성분을 함유하고
(b) 단일 피크형의 입자경 분포에서 유적이 수용액중에 분산되고,
(c) 동결건조 전후에서의 수용액중의 유적의 입자경 분포 및 탁도의 변화가 크지 않다.
(7) 수용액의 탁도의 변화가 동결건조전의 탁도의 50 % 이하인 상기 (6) 에 기재된 안정화 동결건조제제의 제조법.
(8) 세균의 균체성분이 BCG-CWS 이며, 오일상 물질이 스쿠알렌인 상기 (6) 또는 (7) 에 기재된 안정화 동결건조제제의 제조법.
(9) 안정화제가 아미노산 또는 요소인 상기 (6) 내지 (8) 중 어느 하나에 기재된 안정화 동결건조제제의 제조법.
(10) 안정화제가 글리신인 상기 (6) 내지 (8) 중 어느 하나에 기재된 안정화 동결건조제제의 제조법.
세균의 균체성분을 유효성분으로 하는 수중오일형 에멀젼제제의 상업적 생산을 곤란하게 하고 있는 또 하나의 장해는, 그 면역부활작용을 유지한 채, 대량생산하는 것이 매우 곤란하다는 것이다.
즉, 수중오일형 에멀젼의 종래 공지의 사용 직전 조제의 제제방법 (J.Nat.Cancer Inst. 48, 831-835(1972), J.Bacteriol, 92, 869-879(1966), Gann, 69, 619-626(1978)) 을 개량하고, 공업적 제조법을 확립하기 위해, 먼저 처음에, 사용하는 오일상 물질의 양이 물에 비해 매우 적다는 것에 의한, 균체성분의 오일상 물질중에의 균일한 분산의 곤란성을 해결하기 위해, BCG-CWS 의 조 물질을 등장액에 분산시키고, 이어서 오일상 물질을 첨가하여 분산하고, 계면활성제를 첨가하여 유화시키는 수중오일형 에멀젼제제의 제조법이 시도되었다. 이 초기검토 제제품에서는, 입도분포나, 현미경하에서의 상태가 공지의 사용 직전 조제의 제제와 비교하여 거의 동일함에도 불구하고, 생물활성 (마우스의 종양증식 억제활성) 은 비활성화되었다. 또, 오일상 물질을 제거한 제제품에서도, 생물활성은 동일하게 비활성화되었다.
이와 같이, 세균의 균체성분을 유효성분으로 하는 제제의 생물학적인 유용성은, 제제내용이나 제제법에 의존하여 큰 영향을 받는 것이다. 이것은, 세균의 균체성분의 수용액 또는 수현탁액을 단독으로 투여해도 유효한 면역부활작용을 나타내지 않고 항종양효과나 감염방어효과를 얻을 수 없지만, 세균의 균체성분이 균질기 등의 분산기에 의해 오일상 물질에 분산되고, 또한 계면활성제 용액으로 유화되어 수중오일형 에멀젼으로 제제화된 경우에는, 항종양효과나 감염방어효과가 발휘된다 (Cancer Resarch, 33, 2187-2195(1973), J.Nat.Cancer Inst., 48, 831-835(1972), J.Bacteriol., 94, 1736-1745(1967), Gann, 69, 619-626(1978), J.Bacteriol., 92, 869-879(1966)) 는 점에서도 수긍할 수 있는 것이다.
본 발명자들은, 유효한 면역부활작용을 유지하고, 대량 스케일로 상기 수중오일형 에멀젼제제를 제조하기 위해서는, 균체성분을 오일상 물질로 잘 피복하는 것이 필요하며, 그를 위해서는 유기용매를 분산보조용매로서 사용하는 것이 적절하다는 것을 발견하였다. 즉, 본 발명에서는, 면역부활작용을 갖는 균체성분을 오일상 물질과 유기용매로 이루어지는 분산보조용매의 혼합액중에서 분산시킴으로써, 사용하는 오일상 물질의 양이 적음에 의한 분산공정의 곤란성을 극복할 수 있었다. 이와 같이, 분산공정에서 유기용매로 이루어지는 보조용매를 사용함으로써, 제조공정중의 전체 용량의 제어가 가능해지며, 또 보조용매의 용량을 최종 제제의 용량 정도로 함으로써, 제조의 전공정을 통하여, 1 종류의 분산유화기기로 제조하는 것이 가능해졌다. 이들에 의해, 균체성분을 유효성분으로 하는 수중오일형 에멀젼제제의 제조에 관하여 대량 스케일이 용이해지며, 의약품으로서의 개발에 길이 열리게 되었다. 후술하는 바와 같이, 균체성분이 오일상 물질로 충분히 피복되어 있는지의 여부는 렉틴의 첨가에 의한 응집반응의 유무에 의해 알 수 있다.
즉, 본 발명에 관한 제 2 과제해결법의 요지는 다음과 같이 나타난다.
(1) 이하의 공정을 함유하는 것을 특징으로 하는, 세균의 균체성분이 오일상 물질로 피복되고, 렉틴을 이용한 응집반응이 음성을 나타내는 수중오일형 에멀젼제제의 제조법:
(a) 세균의 균체성분, 오일상 물질, 및 유기용매로 이루어지는 분산보조용매의 혼합액을 교반하여 세균의 균체성분을 분산하고,
(b) 분산보조용매를 증류제거함으로써, 세균의 균체성분을 오일상 물질로 피복한 유적을 형성한 후,
(c) 계면활성제를 함유하는 수용액을 첨가하여 유화시킨다.
(2) 세균의 균체성분이 BCG-CWS 또는 노카르디아·루브라(Nocardia rubra) 의 CWS 인 상기 (1) 에 기재된 수중오일형 에멀젼제제의 제조법.
(3) 세균의 균체성분이 BCG-CWS 이며, 오일상 물질이 스쿠알렌인 상기 (1) 에 기재된 수중오일형 에멀젼제제의 제조법.
(4) 분산보조용매가 에탄올 또는 톨루엔인 상기 (1), (2), 또는 (3) 에 기재된 수중오일형 에멀젼제제의 제조법.
(5) 유적이 약 100 ㎛ 이하의 입자경으로 잘 분산되어 있는, 상기 (1), (2), (3) 또는 (4) 에 기재된 수중오일형 에멀젼제제의 제조법.
상기 제 2 과제해결법에 의해, 면역부활작용을 유지한 채, 세균의 균체성분을 유효성분으로 하는 수중오일형 에멀젼제제의 대량생산이 가능해졌지만, 그 제조과정에 있어서, 무시할 수 없는 양의 균체성분이 에멀젼화 되지 않고, 불용성 물질로서 유화·분산기기 등에 부착함을 알 수 있다. 이것은, 균체성분의 유효이용이라는 면에서는, 큰 문제였다.
본 발명자들은, 오일상 물질로 충분히 피복된 세균의 균체성분, 구체적으로는 BCG-CWS 를 이용하여 유화, 제제화의 검토를 예의 진행한 결과, 수중오일형 에멀젼제제 조제후에 에멀젼이 되지 않고 유화·분산기기의 기벽 등에 잔존하는 불용성 물질은, 균체성분을 분산한 오일상 물질이 기벽 등에 강고하게 부착하는 성질을 갖는 것이 원인임을 발견하고, 또 계면활성제가 이 부착을 촉진하는 것도 동시에 발견하였다. 그래서, 사용하는 계면활성제의 농도를 연구하고, 또한 유화공정을 조유화(粗乳化)와 본 유화(本乳化)의 2 단계로 나누어 실시함으로써, 유화되지 않고 불용물로서 잔존하는 균체성분의 양을 격감시키는 것에 성공하였다. 즉, 최초의 조유화에서는, 균체성분의 부착을 촉진하지 않는 저농도의 계면활성제를 사용하여 천천히 교반하여 유화시키고, 그 후 적절히 원하는 입도분포를 얻기 위해 필요한 최저한도의 계면활성제를 첨가하여 용액 전체의 계면활성제의 농도를 조절하고, 강하게 교반함으로써 원하는 유화제제를 제작한다는 2 단계 유화방법이 매우 유효하다는 것을 발견한 것이다. 이러한 본 발명의 제조법에서 얻어진 수중오일형 에멀젼제제에서는, 불용물로서 기벽에 부착하여 잔존하는 균체성분은 거의 없고, 사용된 균체성분이 거의 유화된 제제중에 함유되어 있음이 밝혀졌다. 즉, 수중오일형 에멀젼제제중의 균체성분의 함량은, 유화전의 주입량과 거의 같은 값을 나타냄이 밝혀졌다.
따라서, 본 발명에 관한 제 3 과제해결법의 요지는 다음과 같이 나타난다.
(1) 이하의 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는, 수중오일형 에멀젼제제의제조법:
(a) 세균의 균체성분, 오일상 물질, 및 분산보조용매의 혼합액을 교반하여 세균의 균체성분을 분산하고,
(b) 분산보조용매를 증류제거한 후,
(c) 계면활성제를 함유하는 수용액을 첨가하여 다음 2 단계 유화를 실시한다:
i) 저농도의 계면활성제를 함유하는 수용액을 첨가하여 천천히 교반하여 조유화를 실시하고,
ii) 적절히, 원하는 입도분포를 얻기 위해, 조유화 용액의 계면활성제 농도를 조정하여 강하게 교반하여 본유화를 실시한다.
(2) 2 단계 유화에 있어서, 조유화에 사용되는 저농도의 계면활성제 수용액의 계면활성제의 함량이 오일상 물질의 10 % 이하인 것을 특징으로 하는, 상기 (1) 에 기재된 수중오일형 에멀젼제제의 제조법.
(3) 계면활성제가 폴리소르베이트 80 (Tween80) 인, 상기 (1) 또는 (2) 에 기재된 수중오일형 에멀젼제제의 제조법.
(4) 세균의 균체성분이 BCG-CWS 또는 노카르디아·루브라의 CWS 인, 상기 (1), (2) 또는 (3) 에 기재된 수중오일형 에멀젼제제의 제조법.
(5) 세균의 균체성분이 BCG-CWS 이며, 오일상 물질이 스쿠알렌인, 상기 (1), (2), (3) 또는 (4) 에 기재된 수중오일형 에멀젼제제의 제조법.
이하, 본 발명에 대해 상술한다.
본 발명의 제 1 양태는, 면역부활작용을 갖는 균체성분, 오일상 물질, 계면활성제, 안정화제 등으로 이루어지는 수중오일형 에멀젼을 동결건조처리하여 얻어지는 안정적인 암면역요법용 제제이다.
본 발명에서의 면역부활작용을 갖는 균체성분으로는, 미생물 사균이나 미생물 유래의 CWS, 무라밀 디펩티드 (MDP), 리포다당 (LPS), 만난, 글루칸 및 이들의 유도체 등을 들 수 있다. 미생물 사균의 예로는, 인간형 결핵균의 사균 등을 들 수 있다. CWS 의 유래 미생물로는, 미코박테리아속 (Mycobacteriaceae), 노카르디아속 (Nocardiaceae), 코리네박테리아속 (Corynebacteriaceae) 등을 들 수 있다. 그 중에서도 바람직한 것으로는, 미코박테리아속 소형 결핵균인 BCG 및 노카르디아·루브라를 들 수 있다. 이들 CWS 는, 물리적으로 세균을 분쇄한 후, 제(除)핵산, 제(除)단백, 탈지 등의 정제공정을 거쳐 불용성 잔류물로서 얻어지고, 그 제법 자체는 공지이다 (J.Nat.Cancer Inst.,52,95-101(1974)). 균체성분의 농도는, 수중오일형 에멀젼제제에 있어서 0.1 ∼ 10 mg/ml 인 것이 바람직하다.
본 발명에서의 오일상 물질로는, Immunology,27,311-329(1974) 에 기재되어 있는 광물 오일, 동식물 오일을 들 수 있다. 광물 오일로는, 유동 파라핀, 바이올 (Bayol F), 드라케올 (Drakeol)-6VR 등을 들 수 있다. 식물 오일로는, 땅콩 오일, 참기름, AD-65 (땅콩 오일과 아르라셀과 알루미늄모노스테아레이트의 혼합물) 등을 들 수 있다. 동물 오일로는, 스쿠알렌, 스쿠알렌과 같은 테르페노이드 유도체 등을 들 수 있다. 그 중에서도 바람직한 것으로서, 드라케올 6VR,스쿠알렌 등을 들 수 있다.
오일상 물질의 농도는, 수중오일형 에멀젼제제에 있어서 0.01 ∼ 30 % w/w 의 범위가 적당하지만, 0.01 ∼ 10 % w/w 가 바람직하고, 0.01 ∼ 5.0 % w/w 가 보다 바람직하다.
본 발명에서의 계면활성제로는, 의약품 제제에 사용되는 계면활성제라면 특별히 제한되는 것은 아니다. 예컨대 인 지질, 비이온성 계면활성제 등을 들 수 있다. 인 지질로는, 포스파티딜 아민, 포스파티딜 에탄올아민, 포스파티딜 이노시톨, 포스파티딜 세린, 스핑고미엘린, 레시틴 등을 들 수 있다. 또, 수소첨가된 인 지질도 사용할 수 있다. 비이온성 계면활성제로는, 폴리에틸렌글리콜, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유 유도체, 폴리옥시에틸렌 피마자유 유도체, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트 (폴리소르베이트 20), 폴리옥시에틸렌 소르비탄모노팔미테이트 (폴리소르베이트 40), 폴리옥시에틸렌 소르비탄모노스테아레이트 (폴리소르베이트 60), 폴리옥시에틸렌 소르비탄모노올레이트 (폴리소르베이트 80) 등의 폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산에스테르류 및 소르비탄모노라우레이트 (Span 20), 소르비탄 모노팔미네이트 (Span 40), 소르비탄 모노스테아레이트 (Span 60), 소르비탄 모노올레이트 (Span 80) 등의 소르비탄 지방산 에스테르류 등을 들 수 있다. 바람직한 계면활성제로는, 난황 포스파티딜 아민, 난황 레시틴, 대두 레시틴, 폴리소르베이트 80 를 들 수 있다. 보다 바람직한 것으로, 폴리소르베이트 80 를 들 수 있다.
계면활성제의 농도는, 수중오일형 에멀젼제제에 있어서 0.01 ∼ 10 % w/w 의범위가 적당하지만, 0.01 ∼ 5.0 % w/w 가 바람직하다. 이들 계면활성제는 한 종류에 한하지 않고, 적절히 여러 종류를 조합하여 사용할 수 있다.
본 발명에서의 안정화제로는, 다당류, 아미노산, 단백질, 요소, 염화나트륨을 들 수 있다. 다당류로는, 덱스트란, 전분, 말토덱스트린, 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 알긴산나트륨 등을 바람직한 것으로서 들 수 있다. 아미노산으로는, 알라닌, 글리신, 프롤린 등의 중성 아미노산이 바람직하고, 보다 바람직한 중성 아미노산으로서, 글리신을 들 수 있다. 단백질로는, 알부민, 젤라틴, 콜라겐 등을 바람직한 것으로서 들 수 있다. 이들 안정화제는 한 종류에 한하지 않고, 적절히 여러 종류를 조합하여 사용할 수 있다.
안정화제의 농도는, 수중오일형 에멀젼제제에 있어서 0.1 ∼ 20 % w/w 의 범위가 적당하지만, 0.1 ∼ 10 % w/w 가 바람직하다.
본 발명에 관한 동결건조제제를 재분산하기 위해 사용되는 분산용매는, 에멀젼 입자의 분산매체가 되는 것이며, 주사용 수 (주사용 증류수), 생리식염수 등을 들 수 있는데, 주사가능한 분산용매라면 특별히 한정되지 않는다.
본 발명에서는, 동결건조품을 건조 케이크로서 형성시키기 위해, 필요에 따라 부형제를 첨가할 수 있다. 또, 부형제는 등장화제로서의 역할을 겸하는 경우가 많다. 부형제로는, 당류, 아미노산, 요소, 염화나트륨 등을 바람직한 것으로 들 수 있다. 당류로는 단당류, 이당류, 당알콜을 들 수 있다. 단당류로는, 글루코스, 프룩토스 등, 이당류로는, 말토스, 락토스, 트레할로스, 수크로스 등, 당알콜로는, 만니톨, 소르비톨 등을 들 수 있다. 아미노산으로는, 알라닌,글리신 등을 들 수 있다. 이들 부형제는 한 종류에 한하지 않고, 적절히 여러 종류를 조합하여 사용할 수 있다.
부형제의 농도는, 수중오일형 에멀젼제제에 있어서 0.1 ∼ 30 % w/w 의 범위가 적당하지만, 1 ∼ 20 % w/w 가 바람직하다.
기타, 의약품 제제에 사용할 수 있는 산화방지제, 방부제, 등장화제, 완충제 등을 필요에 따라 필요한 단계에서 첨가할 수 있다. 첨가농도로는 수중오일형 에멀젼제제에 있어서 10 % w/w 이하로 충분한 경우가 많다.
본 발명의 동결건조제제는, 동결건조전 및, 재분산후의 수중오일형 에멀젼에 있어서, 단일 피크형의 입자경 분포를 나타내고, 탁도 (상대흡광도) 변화가 크지 않은 것이 바람직하고, 동결건조전의 탁도의 50 % 이하의 변화인 것이 보다 바람직하다. 또, 평균 입자경은 0.1 ∼ 20 ㎛ 의 범위에 있고, 바람직하게는 1 ∼ 10 ㎛ 이며, 보다 바람직하게는 1 ∼ 5 ㎛ 이다.
본 발명에 있어서, 「단일 피크형의 입자경 분포를 나타내고」란, 유화가 충분히 이루어져, 개개의 유적 입자가 물성상 안정되어 있다는 것을 의미하고, 예를 들면, 동결건조 전후에 있어서도 동결건조후에도 동결건조전의 평균 입자경에서 크게 벗어나지 않고, 동일한 분포를 나타낸다는 것이다. 또, 역으로 2 상 이상의 피크를 갖는 입자경 분포란, 에멀젼의 응집, 합일이 진행되고 있는 상태에 있다는 것이며, 안정된 에멀젼 상태가 아님을 의미한다.
평균 입자경, 입자분포, 탁도는 예를 들면 정적 광산란 입도분포 측정장치 (SALD3000, 시마즈세이사꾸쇼샤 제조, 이하 동일) 를 사용하여 측정할 수 있다.
본 발명은 또, 상기 동결건조제제의 제조법도 제공하는 것이다. 그 제조법은, 먼저 동결건조전에 세균의 균체성분, 오일상 물질, 계면활성제, 부형제, 안정화제 등으로 이루어진 수중오일형 에멀젼을 조제한다. 이러한 수중오일형 에멀젼은, 예를 들어 상기 농도의 오일상 물질에, 동일하게 상기 농도의 균체성분을 첨가하고, 계면활성제, 부형제, 안정화제 및 기타 첨가제의 수용액을 추가로 첨가한 후, 예를 들어 Potter-Elvehjem 형 균질기, 호모믹서, 초음파 균질기, 마이크로플루이다이저 (상품명), 나노마이저 (상품명), 울티마이저 (상품명), 만톤-가우린 균질기형 고압 호모디나저 등의 분산, 유화기에 의해, 상기 평균 입자경을 갖는 수중오일형 에멀젼이 되기까지 유화처리를 실시한다. 제조상의 상황에 따라서는, 수중오일형 에멀젼을 조제한 후, 부형제, 안정화제 등의 첨가제를 첨가해도 된다.
이어서, 얻어진 수중오일형 에멀젼을 동결건조처리하고, 마지막으로 통상은 바이알 내부를 질소치환하고, 밀봉하여 동결건조제제를 얻는다.
본 발명의 동결건조제제는, 물 등의 적당한 분산용매의 첨가에 의해 신속하게 재분산하고, 이렇게 하여 동결건조전과 동일한 정도의 평균 입자경, 입자경 분포 또는 탁도를 갖는 수중오일형 에멀젼이 재구축된다. 분산용매의 액량은, 용도에 따라 다르며, 특별한 제한은 없지만, 동결건조전의 액량의 0.5 ∼ 2 배량의 범위라면 된다.
본 발명의 제 2 양태는, 세균의 균체성분, 오일상 물질, 및 유기용매로 이루어지는 분산보조용매의 혼합액을 사용하는 것을 특징으로 하는, 수중오일형 에멀젼제제의 제조방법이다.
본 발명의 제조방법에서는, 먼저 면역부활작용을 갖는 균체성분, 오일상 물질 및 분산보조용매의 혼합액을 분산·유화기기로 처리한 후, 분산보조용매를 증류제거한다. 증류제거후의 잔류물에, 계면활성제나 안정화제 등을 함유하는 등장액을 첨가하여 분산·유화기기로 처리하고, 원하는 면역부활활성을 유지한 수중오일형 에멀젼을 제조한다.
본 발명에서 사용되는 세균의 균체성분, 특히 BCG-CWS 나 노카르디아·루브라의 CWS 는, 물이나 유기용매에 불용이며, 오일상 물질에도 용해되지 않는 것이다. 특히 오일상 물질은, 매우 소량이며 점성이 있기 때문에, 균체성분을 직접, 균일하게 항상적으로 분산하는 것은 매우 곤란하였다. 그러나, 후에 제거가능한 유기용매를 분산보조용매로서 사용함으로써, 오일상 물질에 직접 분산하는 경우와 비교하여, 균일한 분산액을 용이하게 항상적으로 얻는 것이 가능해졌다. 즉, 유기용매는 후에 제거하는 것이 가능하므로 대량으로 사용가능하며, 점성도 낮기 때문에, 분산기기를 이용하여 용이하게 균일한 분산액을 항상적으로 조제할 수 있다. 그리고, 그 상태에서 유기용매를 제거함으로써, 균체성분이 균일하게 분산된 오일상 물질을 얻을 수 있는 것이다.
이와 같이, 유기용매로 이루어지는 분산보조용매를 사용함으로써, 잘 분산되며, 오일상 물질로 충분히 피복된 상기 균체성분을 안정적으로 얻을 수 있게 되었다. 예를 들어, 분산보조용매가 없는 종래법에서는, 포터 (Potter) 형 균질기를 사용하면, 오일이 소량이기 때문에, 매회 균일하게 항상적으로 양호한 분산액을 조제하는 것이 곤란했던 데 비해, 분산보조용매를 이용함으로써, 항상적으로 양호한 분산액을 조제할 수 있게 되었다. 이와 같이, 본 발명의 제조방법에 의해, 균체성분을 오일로 충분히 피복시킨 양호한 분산액을 조제한다는 과제를 공업적으로 해결할 수 있다.
게다가, 분산보조용매를 적절히 선택함으로써, 분산보조용매 증류제거후의 상기 균체성분의 입자경이 세밀하게 잘 분산된 것을 조제하는 것이 가능해져, 눈으로 조립자(粗粒子)가 전혀 보이지 않는 것을 조제할 수 있게 되었다 (눈으로 검지되는 조립자는 통상 약 100 ㎛ 이상의 입자경을 갖는 것이다).
원하는 균체성분이 오일상 물질로 충분히 피복되어 있는지의 여부는, 후술하는 렉틴 등을 사용하는 응집반응을 이용하여 확인할 수 있다.
본 발명에서 사용가능한 분산보조용매는, 질소기류하, 가열 또는 감압하 등에서 간단히 증류제거 가능한 유기용매를 들 수 있다. 바람직한 유기용매로는, ICH 의 잔류 용매 지침에 기재된 2 군, 3 군의 용매를 들 수 있다. 보다 바람직한 용매로서, 예컨대 톨루엔 등의 방향족 탄화수소, 예컨대 시클로헥산 등의 지방족 탄화수소, 예컨대 디클로로메탄, 클로로포름, 트리클로로에틸렌 등의 할로겐화 탄화수소, 예컨대 에탄올, 이소프로판올 등의 저급 알콜, 예컨대 아세트산에틸 등의 아세트산 에스테르, 예컨대 에틸에테르 등의 에테르류, 예컨대 아세톤 등의 케톤 용매를 들 수 있다. 더욱 바람직한 용매로는, 에탄올, 이소프로판올 등의 저급 알콜, 클로로포름 등의 할로겐화 탄화수소, 톨루엔 등의 방향족 탄화수소를 들 수 있다. 가장 바람직한 것으로는, 에탄올, 클로로포름 및 톨루엔을 들 수 있다.
용매를 증류 제거하기 위한 가열온도는, 용매의 비점, 증기압에 따라 적절히 선택할 수 있다. 또, 고온이 되면 균체성분의 비활성화가 발생하기 때문에, 비활성화가 발생하지 않는 100 ℃ 이하의 온도가 바람직하다. 바람직하게는 80 ℃ 이하이고, 70 ℃ 이하에서 실시하는 것이 더욱 바람직하다.
이 제조방법에서 사용가능한 수용액은 앞서 서술한 에멀젼 입자의 분산매체가 되는 것으로, 생리식염수 등의 등장액 및 주사용 수 (주사용 증류수) 등을 포함하지만, 주사가능한 분산용매라면 특별히 한정되지는 않는다. 또, 수용액을 등장으로 하기 위한 등장화제로는 당류, 아미노산, 요소, 염화나트륨 등을 들 수 있다. 당류로는 단당류, 이당류, 당알콜을 들 수 있다. 단당류로는 글루코스, 플룩토스 등, 이당류로는 말토스, 락토스, 트레할로스, 수크로스 등, 당알콜로는 만니톨, 소르비톨 등을 들 수 있다. 아미노산으로는, 알라닌, 글리신 등을 포함한다. 이들 등장화제는 한 종류로 한정되지 않고, 적절히 여러 종류를 조합하여 사용할 수 있다. 또, 등장화제의 농도는, 수중오일형 에멀젼제제에서 0.1 ∼ 30 %w/w 의 범위가 적당하며, 1 ∼ 20 %w/w 이 바람직하다.
기타, 의약품제제로 사용할 수 있는 산화방지제, 방부제, 완충제 등을 필요에 따라 첨가할 수 있다. 첨가농도로는 수중오일형 에멀젼제제에 있어서 10 %w/w 이하로 충분한 경우가 많다.
본 발명의 제 3 양태는, 세균의 균체성분, 오일상 물질 및 분산보조용매를 혼합하여 균체성분을 분산하고, 분산보조용매를 증류 제거한 후, 2 단계 유화를 실시하는 것을 특징으로 하는 수중오일형 에멀젼제제의 제조방법이다. 즉, 분산보조용매를 증류 제거한 후, 오일상 물질로 충분히 피복된 균체성분에, 우선 저농도의 계면활성제를 함유하는 수용액을 첨가하여 분산·유화기기로 서서히 교반하면서 조유화처리를 실시하고, 이어서 원하는 입도 분포를 얻기 위해 계면활성제를 추가로 첨가하여 용액전체의 계면활성제의 농도를 조정하고, 분산·유화기로 강하게 교반함으로써 원하는 수중오일형 에멀젼을 제조하는 것이다.
이 2 단계 유화법에 의해, 사용한 세균의 균체성분을 거의 정량적으로 수중오일형 에멀젼제제에 포함할 수 있다.
2 단계 유화의 최초 조유화공정에서는, 계면활성제 농도가 오일상 물질의 약 10 % 이상이 되면 기구류 등으로의 균체성분의 부착이 강하게 되는 경향이 있기 때문에, 여기서 사용되는 계면활성제의 농도는 오일상 물질의 약 10 % 이하인 것이 바람직하다. 계면활성제의 사용량은, 바람직하게는 오일상 물질의 0.2 ∼ 8 % 의 범위이고, 보다 바람직하게는 오일상 물질의 1 ∼ 8 % 의 범위이다. 따라서, 조유화공정에서 사용되는 저농도의 계면활성제를 함유하는 수용액이란 계면활성제의 함유량으로 사용하는 오일상 물질의 약 10 % 이하의 값을 나타내는 수용액을 말한다. 단, 조유화공정에서 사용되는 계면활성제의 농도는, 본 유화공정에서 사용되는 농도를 넘지 않는다.
이어서, 본 유화공정에서 사용되는 계면활성제는, 원하는 입도 분포를 얻기 위해 필요 최소한도의 양을 사용하는 것이 필요하다. 따라서, 경우에 따라서는 조유화공정시의 그대로, 또는 경우에 따라서는 최초의 조유화공정에서 사용된 계면활성제 농도보다 높은 농도로 용액 전체의 농도를 조정한다. 용액전체의 계면활성제 농도의 조정에 사용되는 계면활성제 용액의 농도로는 소량으로 조정을 행할 수 있으면 되고, 예컨대 폴리소르베이트 80 이라면 약 5 ∼ 약 15 % 농도의 수용액을 사용할 수 있다. 한편, 본 유화공정에서는 용액 전체의 계면활성제의 양이 오일상 물질의 약 10 % 이상일 필요가 있고, 바람직하게는 오일상 물질의 약 10 ∼ 약 20 % 의 범위의 양이 되도록, 보다 바람직하게는 오일상 물질의 약 15 ∼ 약 20 % 의 범위의 양이 되도록 계면활성제의 함량을 조정한다. 이렇게, 본 유화공정에서의 계면활성제 농도의 조정은, 원하는 입도 분포를 갖는 에멀젼을 조제할 수 있도록 계면활성제 농도를 조정하는 것이다.
또, 본 유화공정 후에 적절히 필요에 따라 추가로 계면활성제를 첨가하여 보다 고함량의 계면활성제 용액으로 조정할 수도 있으며, 이 때 추가로 유화기에 의한 교반을 행함으로써 입도 분포를 예리하게 하는 것도 가능하다. 이들 수용액에는 필요에 따라 적절히 안정화제 및 등장화제를 첨가할 수도 있다. 또, 이들 계면활성제는 한 종류에 한정되지 않고, 적절히 여러 종류를 조합하여 사용할 수 있다.
유화를 위한 교반조건은, 온화한 교반조건으로는 예컨대 IKA ULTRA-TURRAXT-25 (샤프트드라이브 S25KV-25F) 를 사용한 경우, 회전수 5000 ∼ 7000 rpm 으로 유화하는 것을 들 수 있다. 또, 강한 교반조건으로는 회전수 10000 ∼ 25000 rpm 으로 유화하는 것을 들 수 있다. 유화의 온도로는 고온이 바람직하나, 수분의 증발 등을 고려하면 40 ∼ 80 ℃ 정도가 적당하다. 단, 사용하는 계면활성제가 폴리옥시에틸렌을 결합한 것인 경우, 그 영점 (cloud point) 을 고려한 온도를 설정하는 것이 바람직하다.
유화의 시간은, 조제하는 에멀젼의 입도 분포를 입도 분포 측정기로 측정하면서, 원하는 입도 분포가 달성되도록 적절히 선택할 수 있다.
본 발명의 제 1 양태에서 서술한 동결건조제제를 용매에 분산하여 얻어지는 수중오일형 에멀젼제제, 및 제 2 및 제 3 양태에서 서술한 방법으로 제조된 수중오일형 에멀젼제제는, 당연히 면역부활작용을 가지고 있지 않으면 안된다. 이를 위해, 기술한 바와 같이 세균의 균체성분이 충분히 오일상 물질로 피복되어 있을 필요가 있으며, 피복이 충분한가 아닌가의 여부는 렉틴에 의한 균체성분의 응집반응을 이용하여 검정할 수 있다.
이 검정법은 렉틴과 균체성분의 당쇄 (아라비노갈락탄) 와의 사이에서 기능하는 상호작용을 이용한 것으로, 균체성분이 충분히 피복되어 있다는 것은, 즉 당쇄도 마찬가지로 충분히 피복되어 있다는 것으로서, 당쇄가 충분히 피복되어 있으면 상기의 상호작용이 발생하지 않는다. 즉, 응집반응이 음성을 나타내는 경우, 주성분은 충분히 피복되어 있게 된다. 또, 균체성분이 오일상 물질로 충분히 피복되어 있기 때문에 면역부활작용에 의한 항종양 효과 및 감염방어 효과가 발휘됨을 특징으로 하고 있어, 렉틴 응집반응에 음성을 나타내는 것을 지표로 하여 생물활성의 유무가 판정가능하게 된다.
여기서 말하는 응집반응이란 형광현미경, 또는 위상차현미경에 의해 눈으로 균체성분의 응집이 확인가능한 것이다. 예컨대 BCG-CWS 수중오일형 에멀젼제제에서 응집반응을 나타내는 것은, 렉틴을 첨가하면 도 15 에 나타낸 바와 같이 에멀젼의 응집이 눈으로 보아 확인 가능하게 된다. 따라서, 응집반응이 양성인 경우는 이러한 응집덩어리가 생기는 것을 말한다. 반대로 음성이란 이러한 응집덩어리가 생기지 않고, 오일상 물질로 피복된 균체 성분이 거의 평균하여 분산되어 있는 것을 말한다.
응집반응의 확인방법으로는, 본 발명에 관한 에멀젼제제와 렉틴 (콘카나발린 A) 용액을 피펫팅으로 혼합하고, 25 ℃ 에서 30 분 이상 방치한 다음, 위상차현미경 등을 사용하여 응집반응의 유무를 확인하는 것을 들 수 있다. 이 결과는 예컨대 도 10, 15 에 나타낸 바와 같이 오일상 물질을 포함하지 않는, 균체성분만의 제제품 (오일프리: 참조예 2.3) 및, 공지 조제법의 개량법 (참조예 2.2) 의 경우에는 응집반응이 발생한다. 한편, 균체성분이 오일상 물질로 충분히 피복되어 있는 에멀젼제제의 경우에는, 도 12 ∼ 14 에 나타낸 바와 같이 응집반응이 발생하지 않는다 (실시예 2.2, 3.1, 3.2). 이렇게 하여 응집반응의 유무를 관찰함으로써 오일상 물질에 의한 피복의 정도를 구분할 수 있다.
본 발명의 방법으로 제조되는 수중오일형 에멀젼제제는, 분산용매에 재분산한 제 1 양태의 동결건조제제도 포함하며, 주사 등 비경구적으로 투여할 수 있다. 투여형태는 치료 목적 등에 따라 상이하지만, 특별히 제한되는 것은 아니다. 통상 사용되는 투여형태로는 예컨대 피하투여 또는 피내투여용 주사제를 들 수 있다.
투여량, 투여회수는 대상으로 하는 질환, 환자의 증상, 연령, 체중, 성별 등에 따라 상이하지만, 비경구투여의 경우 특히 주사제로서 사용하는 경우에는, 통상은 성인에 대해 주 1 회 또는 4 주 1 회의 투여로 1 회당 0.1 ∼ 200 ㎍ 의 범위, 바람직하게는 1 ∼ 100 ㎍ 의 범위에서 투여할 수 있다.
다음에서, 실시예, 참조예, 시험예를 들어서 본 발명의 3 양태를 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들에 의해 하등 한정되는 것이 아니다.
실시예 1.1
균체성분으로 미코박테리아속 BCG 균 유래의 CWS (BCG-CWS) 4 mg 을 오일상 물질로서의 스쿠알렌 20 ㎕ (0.5 %w/w) 에 Potter-Elvehjem 형 균질기를 사용하여분산하고, 그 후 0.2 %w/w 폴리소르베이트 80/300 mm (2.3 %w/w) 글리신 수용액 4 ㎖ 을 첨가하여 유화함으로써 면역부활작용을 갖는 수중오일형 에멀젼을 얻는다.
이 수중오일형 에멀젼을 4 ㎖ 의 바이알에 0.5 ㎖ 씩 분주하고, 동결건조를 실시하여 본 발명의 동결건조제제를 얻는다. 동결건조는, 교와식 동결건조기기 (G-1, 교와신꾸샤 제조) 를 사용하여 실시한다.
실시예 1.2
안정화제로서, 글리신 대신에 요소를 사용하는 것을 제외하곤 실시예 1.1 과 동일한 방법으로 하여 수중오일형 에멀젼 및 그 동결건조제제를 얻는다.
실시예 1.3
균체성분으로 BCG-CWS 1 g 을 사용하여, 스쿠알렌 32 g 과 톨루엔 300 ㎖ 의 혼합액에 첨가하고, 진탕 또는 초음파에 의해 실온에서 분산한다. 그 후 질소기류하에서 60 ℃ 로 가열하여 톨루엔을 증류 제거한다. 이어서 0.02 %w/w 폴리소르베이트 80/4.5 % 글리신 수용액 1.8 L 를 첨가하고, 균질기를 사용하여 조유화를 실시하며, 또 200 ㎖ 의 10 %w/w 폴리소르베이트 80 을 추가한 다음, 본 유화를 실시하여 수중오일형 에멀젼을 얻는다.
이 수중오일형 에멀젼을 바이알에 0.5 ㎖ 씩 분주하고, 동결건조를 실시하여 본 발명의 동결건조제제를 얻는다. 동결건조는 교와식 동결건조기기 (G-1, 교와신꾸샤 제조) 를 사용하여 실시한다.
참조예 1.1
안정화제로서 글리신 대신에 선행기술 (일본 공개특허공보 소63-1291 호) 에기재된 당알콜인 만니톨을 사용하는 것을 제외하곤 실시예 1.1 과 동일한 방법으로 수중오일형 에멀젼 및 그 동결건조제제를 얻는다.
실시예 1.1, 1.2 및 참조예 1.1 에서 사용한 구성성분 및 그 양을 표 1 에 나타낸다.
| 실시예 1.1 | 실시예 1.2 | 참조예 1.1 | |
| 균체성분 | 미코박테리아속(屬) BCG 균 유래의 CWS (BCG-CWS) 4 mg | 미코박테리아속(屬) BCG 균 유래의 CWS (BCG-CWS) 4 mg | 미코박테리아속(屬) BCG 균 유래의 CWS (BCG-CWS) 4 mg |
| 오일상 성분 | 스쿠알렌20 ㎕ (0.5 %w/w) | 스쿠알렌20 ㎕ (0.5 %w/w) | 스쿠알렌20 ㎕ (0.5 %w/w) |
| 계면활성제 및안정화제 | 0.2 %w/w 폴리소르베이트 80/300 mM (2.3 %w/w) 글리신 수용액 4 ㎖ | 0.2 %w/w 폴리소르베이트 80/300 mM (2.3 %w/w) 요소 수용액 4 ㎖ | 0.2 %w/w 폴리소르베이트 80/300 mM (2.3 %w/w) 만니톨 수용액 4 ㎖ |
실시예 1.1, 1.2 및 참조예 1.1 에서 얻어진 동결건조 전의 수중오일형 에멀젼과 동결건조 직후 재분산하여 얻어진 수중오일형 에멀젼의 흡광도, 평균 입자경, 입자경 분포를 정적광산란 입도 분포 측정장치 (SALD 3000, 시마즈세이사꾸쇼샤 제조, 이하 동일) 에 의해 측정한다. 동결건조 직후의 재분산 수중오일형 에멀젼은, 동결건조품을 주사용 증류수 0.5 ㎖ 에 의해 재분산한 것이다.
결과를 표 2 에 나타낸다.
| 평균 입자경 | 입도 분포 변화* | 흡광도 (상대치) | ||
| 동결건조전 | 동결건조 직후 | 동결건조직후/동결건조전 | ||
| 실시예 1.1 | 2.7 ㎛ | 2.6 ㎛ | A | 0.95 |
| 실시예 1.2 | 2.1 ㎛ | 2.5 ㎛ | A | 0.90 |
| 참조예 1.1 | 2.6 ㎛ | 2.8 ㎛ | B | 0.15 |
*: 입도 분포 변화 평가판정
A = 입도 분포 변화 적음, B = 입도 분포 변화 있음
안정화제로 글리신을 사용한 실시예 1.1, 요소를 사용한 실시예 1.2 에서는 도 1 및 도 2 에서 나타낸 바와 같이 동결건조 전후를 비교한 경우, 평균 입자경, 입자경 분포에 거의 변화가 없어, 동결건조 전의 수중오일형 에멀젼을 복원할 수 있다. 또, 흡광도에도 차이가 발견되지 않으며, 탁도의 변화가 거의 없다.
한편, 안정화제에 선행기술 (일본 공개특허공보 소 63-1291 호) 에 기재되어 있는 당알콜인 만니톨을 사용한 참조예 1.1 에서는, 도 3 에 나타낸 바와 같이 단일피크형 입자경 분포가 붕괴되고 말아, 흡광도에도 차이가 발견된다.
시험예 1.1 생물활성시험
실시예 및 참조예에 기재한 제제를 물에 의해 재분산한 수중오일형 에멀젼에 대해 마우스 종양 전이 모델계에 의해 생물활성을 비교하여, 동결건조처리에 의해 본 발명에 관한 제제의 생물활성이 저하되지 않는 것을 확인했다.
8 주령의 BALB/C 마우스 20 마리의 꼬리정맥으로 2.5 ×104개/마리의 Colon 26-M3.1 종양세포를 투여하고, 1 군에 5 마리씩 4 군으로 나눈다. 24 시간 후, 제 1 군은 어느 것도 투여하지 않고 콘트롤로 한다. 제 2 군은, BCG-CWS 를 포함하지 않는 것을 제외하고는 실시예 1.1 과 동일한 수중오일형 에멀젼 100 ㎖ 을 동량의 0.2 % 폴리소르베이트 80/300 mM 글리신 수용액으로 희석한 샘플을 꼬리정맥으로 투여한다. 제 3 군은, 실시예 1.1 에 기재한 동결건조 처리전의 수중오일형 에멀젼 100 ㎖ 을 동량의 0.2 % 폴리소르베이트 80/300 mM 글리신 수용액으로 희석한 샘플을 꼬리정맥으로 투여한다. 제 4 군은, 실시예 1.1 의 동결건조제제를 주사용 증류수 0.5 ㎖ 로 재분산하여 얻어지는 수중오일형 에멀젼 100 ㎕ 를 동량의 0.2 % 폴리소르베이트 80/300 mM 글리신 수용액으로 희석한 샘플을 꼬리정맥으로 투여한다. 2 주 후, 개흉하여, 폐를 적출한 후, 폐에 전이한 종양소 수를 계산하여 비교한다. 결과는 표 3 에 나타낸 바와 같다.
| 전이억제율 (%) (대대조군 1) | |
| 제 1 군 (콘트롤) | - |
| 제 2 군 (BCG-CWS 비함유제제) | 0 |
| 제 3 군 (실시예 1.1: 동결건조전의 에멀젼제제) | 52* |
| 제 4 군 (실시예 1.1: 동결건조제제) | 51* |
* : p < 0.01, 제 1 군과의 비교에 의한 t-검정을 실시
동결건조 전후에서 생물활성의 저하는 인정되지 않으며, 본 발명의 동결건조제제의 유용성이 나타난다.
시험예 1.2 안정성 시험 1 (비교실험)
실시예 1.1 에서 얻어진 본 발명의 동결건조제제 및 참조예 1.1 에서 얻어진 동결건조제제를 50 ℃ 및 25 ℃ 에서 2 주간, 1 개월, 2 개월 및 3 개월 보존한 후 재분산하여 수중오일형 에멀젼의 상대 흡광도를 측정하고, 탁도변화를 경시적으로 조사한다. 결과는, 표 4, 표 5 및 도 4, 도 5 에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 동결건조제제는 어느 온도에서도 장기간 보존 후의 흡광도가 동결건조전과 동일 정도의 값을 나타내어, 우수한 안정성을 나타낸다.
| 동결건조전 | 동결건조후 | 50 ℃×2W | 50℃×1M | 50 ℃×2M | 50 ℃×3M | |
| 실시예 1.1 | 1.00 | 0.95 | 0.95 | 0.98 | 1.02 | 0.98 |
| 참조예 1.1 | 1.00 | 0.37 | 0.26 | 0.27 | -** | -** |
| 동결건조전 | 동결건조후 | 25 ℃×2W | 25℃×1M | 25 ℃×2M | 25 ℃×3M | |
| 실시예 1.1 | 1.00 | 0.95 | 0.96 | 0.93 | 0.95 | 0.98 |
| 참조예 1.1 | 1.00 | 0.37 | 0.21 | 0.21 | -** | -** |
**: 검출한계치 이하이기 때문에 측정불능
시험예 1.3 안정성 시험 2 (입자경 분포 변화 측정실험)
실시예 1.1 에서 얻어진 본 발명의 동결건조제제를 5, 25 및 50 ℃ 에서 보존하고, 1 개월 후 또는 3 개월 후에 재분산하여, 평균 입자경, 입자경 분포의 변화를 경시적으로 조사한다. 결과는 표 6, 및 도 6, 7, 8 에 나타낸 바와 같다.
| 보존온도 | 평균 입자경 (㎛) | |||
| 동결건조전 | 동결건조직후 | 1 M | 3 M | |
| 5 ℃ | 2.7 | 2.6 | 2.2 | 2.3 |
| 25 ℃ | 2.7 | 2.6 | 2.2 | 2.4 |
| 50 ℃ | 2.7 | 2.6 | 2.4 | 2.6 |
본 발명의 동결건조제제는 5, 25 및 50 ℃ 의 어느 온도에 있어서도, 그 평균 입자경, 입자경 분포의 현저한 변화를 나타내지 않고, 우수한 안정성을 나타낸다.
시험예 1.4 안정성 시험 3 (입자경 분포 변화 측정실험)
참조예 1.1 에서 얻어진 동결건조제제를 25 및 50 ℃ 에서 보존하고, 1 개월 후 재분산하여, 평균 입자경 및 입자경 분포의 변화를 조사한다. 결과는 표 7 및 도 9 에 나타낸 바와 같다.
| 보존온도 | 평균 입자경 (㎛) | ||
| 동결건조전 | 동결건조 직후 | 1 M | |
| 25 ℃ | 2.6 | 2.8 | 1.9 |
| 50 ℃ | 2.6 | 2.8 | 1.4 |
선행기술 (일본 공개특허공보 소 63-1291 호) 에 안정화제로서 기재되어 있는 당알콜인 만니톨을 사용한 경우, 25 ℃, 50 ℃ 중 어느 것도 1 개월에서 평균 입자경 및 입자경 분포에 현저한 변화가 인정된다.
시험예 1.5 항종양 활성 평가
기니아 피그 종양 Line 10 간암 세포를 strain 2 계통의 기니아 피그의 복강에 통과시킨다. 복강 이식후 11 일째의 기니아 피그의 복수를 채취하여, 2 ×107개 세포/㎖ 의 세포농도가 되도록 HBSS 에 현탁한다.
실시예 1.3 에서 얻어진 BCG-CWS 동결건조제제 및 전파체 (vehicle) 를, 바이알에 5 ㎖ 의 주사용 증류수를 첨가하고, 바로 약 30 초간 격심하게 교반하여 재구성한다. 바이알에서 1 ㎖ 를 셀럼튜브에 분리 채취하고, 추가로 1 ㎖ 의 1 %w/w 폴리소르베이트 80 을 첨가하여 등장액으로 한다. 이 BCG-CWS 제제 및 전파체 각각 0.8 ㎖ 과 0.4 ㎖ 의 Line 10 종양 세포를 혼합하여, 37 ℃ 에서 10 분간 인큐베이션한다.
1 군을 5 마리의 기니아 피그로 하여 기니아 피그 복측부의 털을 바리캉을 사용하여 깎고, 26 G 주사바늘과 1 ㎖ 시린지를 사용하여, 종양 세포와 BCG-CWS 제제 혼합액 150 ㎕ 을 1 군 5 마리의 모르모트 복측에 피내 이식한다. 이 150 ㎕ 중에는 1 ×106개의 종양 세포와 18.5 ㎍ 의 BCG-CWS 원약을 함유하고 있다.
종양 이식 35 일후의 종양의 생착저지 활성에 의해 BCG-CWS 의 항종양 효과를 평가한다. 그 결과 HBSS 및 전파체를 종양세포 현탁액에 혼합하여 접종한 군은 전 개체에서 종양의 생착이 보였지만, BCG-CWS 제제를 혼합한 군은 5 마리 중 3 마리의 동물에서 종양생착저지가 인정된다.
| 처리 | 생착저지개체수/1 군의 개체수 |
| HBSS | 0/5 |
| 전파체 | 0/5 |
| BCG-CWS | 3/5 |
본 발명에 의해 제공되는 동결건조제제는 장기적으로 안정적인 제제로서, 물 등의 적당한 분산용매에 의해 재분산함으로써 항종양 활성을 유지한 수중오일형 에멀젼제제로 복원할 수 있다. 본 발명의 동결건조제제는 항종양 효과 및 감염방어 효과 등, 면역부활작용을 갖는 균체성분의 효능의 범위에서 사용할 수 있어, 환자자신의 면역력을 높일 수 있다. 그 결과, 암, 감염증 등의 치료에 유효한 치료제 또는 예방제로서 사용할 수 있다.
실시예 2.1 (분산보조용매: 에탄올)
균체성분으로 BCG-CWS 4 ㎎ 을 사용하여, 스쿠알렌 20 ㎕ (0.5 %w/w) 과 에탄올 4 ㎖ 의 혼합액에 첨가하고, 진탕 또는 초음파에 의해 실온에서 분산한다. 그 후 질소기류하에서 60 ℃ 로 가열하여 에탄올을 증류 제거한다. 이어서 0.2 %w/w 폴리소르베이트 80/5 % 만니톨 수용액 4 ㎖ 을 첨가하고, Potter-Elvehjem 형 균질기를 사용하여 약 1000 rpm/5 분간의 유화를 실시한 다음, 60 ℃, 30 분 가온살균하여 수중오일형 에멀젼을 얻는다.
실시예 2.2 (분산보조용매: 톨루엔)
실시예 2.1 에서 분산보조용매로서 사용된 에탄올 대신에 톨루엔을 사용하는 것을 제외하곤 실시예 2.1 과 동일한 방법으로 조제하여, 원하는 수중오일형 에멀젼을 얻는다.
참조예 2.1 (공지조제법: Cancer Research, 33, 2187-2195 (1973) 등)
균체성분으로 BCG-CWS 4 ㎎ 과 스쿠알렌 20 ㎕ (0.5 %w/w) 을 Potter-Elvehjem 형 균질기에 첨가하여 분산하고, 그 후 0.2 %w/w 폴리소르베이트 80/5 % 만니톨 수용액 4 ㎖ 를 첨가하여, 동일한 균질기로 유화한 다음, 60 ℃, 30 분 가온하여, 수중오일형 에멀젼을 얻는다.
참조예 2.2 (공지제조법의 개량법)
균체성분으로 BCG-CWS 4 ㎎ 과 증류슈 2 ㎖ 를 Potter-Elvehjem 형 균질기에 첨가하고 분산하여, 약제를 함유하는 분산액을 조제한다. 이 분산액 2 ㎖ 와10 % 만니톨 수용액 2 ㎖ 를 첨가하여 혼합하고, 스쿠알렌 20 ㎕ (0.5 %w/w) 을 첨가하여 동 균질기로 분산한다. 또, 10 % 폴리소르베이트 80 수용액 80 ㎕ 를 첨가하여, 동일한 균질기로 유화한 다음, 60 ℃, 30 분 가온 살균하여, 수중오일형 에멀젼을 얻는다.
참조예 2.3 (오일프리 공지제조법)
균체성분으로 BCG-CWS 4 ㎎ 과 0.2 %w/w 폴리소르베이트 80/5 % 만니톨 수용액 4 ㎖ 을 Potter-Elvehjem 형 균질기에 첨가하여 분산·유화를 실시한 다음, 60 ℃, 30 분 가온 살균하여 수중오일형 에멀젼을 얻는다.
시험예 2.1 생물활성 시험
실시예 2.1 ∼ 2.2 및 참조예 2.1 ∼ 2.3 에 기재한 수중오일형 에멀젼에 대해 마우스 종양 전이 모델계에 의해 생물활성을 비교하여, 제제방법의 차이에 의한 생물활성의 변화를 확인한다.
8 주령의 BALB/C 마우스 5 마리를 1 군으로 사용한다. 마우스의 꼬리정맥으로 2.5 ×104개/마리의 Colon 26-M3.1 종양세포를 투여하고, 투여한 지 24 시간 후에 실시예 및 참조예의 제제품을 BCG-CWS 로서 100 ㎍ /200 ㎕/ 마우스의 비율로 투여한다. 2 주간 후, 개흉하여, 폐를 적출한 후, 폐에 전이한 종양소수를 계산하여, 콘트롤 처리하지 않은 마우스와의 비교를 실시한다. 결과는 표 9 에 나타낸다.
| 제제품 | 렉틴과의 응집반응 | 마우스폐암전이 억제효과 (%) |
| 미처리 | 0 | |
| 실시예 2.1 | -- | 56 |
| 실시예 2.2 | -- | 37 |
| 참조예 2.1 | -- | 52 |
| 참조예 2.2 | ++ | 0 |
| 참조예 2.3 | ++ | 6 |
주) 표 중, -- 는 응집반응이 음성, ++ 는 응집반응이 양성인 것을 나타낸다.
시험예 2.2 오일에 의한 균체성분의 피복시험
실시예 2.1, 2.2 또는 참조예 2.1, 2.2, 2.3 에서 얻어진 제제품 (BCG-CWS 농도로서 1 ㎎/㎖) 200 ㎕ 를 사용하여, 콘카나발린 A 용액 (콘카나발린 A 의 농도로서 1 ㎎/㎖: 0.2 mM) 50 ㎕ 을 첨가하고, 25 ℃ 에서 30 분 이상 유지한다. 반응액을 위상차현미경으로 관찰하여, 응집반응의 유무를 확인한다. 그 결과를 표 9, 도 10 ∼ 12, 15, 16 에 나타낸다.
표 9, 도 10 ∼ 12, 15, 16 에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 제조방법에 의해 얻어지는 제제품은 공지조제법에 의해 얻어진 제제품과 동등한 생물활성을 갖는 것임이 분명하다.
실시예 3.1
균체성분으로 BCG-CWS 100 mg 을 스쿠알렌 400 ㎎ 과 톨루엔 30 ㎖ 의 혼합액을 첨가하고, 진탕 또는 초음파에 의해 2 ∼ 5 분간 분산한다. 그 후, 질소기류하에서 50 ℃ 로 가열하여 톨루엔을 증류 제거한다. 이어서 0.02 %w/w 폴리소르베이트 80 수용액 100 ㎖ 를 첨가하고, IKA ULTRA-TURRAXT-25 형 균질기 (S25KV-25F) 를 사용하여, 7000 rpm 에서 10 분간 65 ℃ 에서 조유화를 실시한다.그 후, 10 %w/w 폴리소르베이트 80 수용액 600 ㎕ 을 첨가하고, IKA ULTRA-TURRAXT-25 형 균질기를 사용하여 15000 rpm 에서 5 분간 65 ℃ 에서 본 유화를 실시한다. 본 유화 후, 다시 10 %w/w 폴리소르베이트 80 수용액 1200 ㎕ 을 첨가하고, IKA ULTRA-TURRAXT-25 형 균질기를 사용, 7000 rpm 10 초간 유화를 실시하여, 수중오일형 에멀젼을 얻는다.
실시예 3.2
균체성분으로 BCG-CWS 500 mg 을 스쿠알렌 2 g 과 톨루엔 50 ㎖ 의 혼합액을 첨가하고, 진탕 또는 초음파에 의해 2 ∼ 5 분간 분산한다. 그 후, 질소기류하에서 50 ℃ 로 가열하여 톨루엔을 증류 제거한다. 이어서 0.02 %w/w 폴리소르베이트 80 수용액 500 ㎖ 를 첨가하고, IKA ULTRA-TURRAXT-25 형 균질기 (S25KV-25F) 를 사용하여, 7000 rpm 10 분간 65 ℃ 에서 조유화를 실시한다. 그 후, 10 %w/w 폴리소르베이트 80 수용액 3 mℓ 을 첨가하여, IKA ULTRA-TURRAXT-25 형 균질기를 사용하여 15000 rpm 10 분간 65 ℃ 에서 본 유화를 실시한다. 본 유화 후, 다시 10 %w/w 폴리소르베이트 80 수용액 6 mℓ 을 첨가하고, IKA ULTRA-TURRAXT-25 형 균질기를 사용, 15000 rpm 에서 5 분간 유화를 실시하여, 수중오일형 에멀젼을 얻는다.
실시예 3.3
균체성분으로 BCG-CWS 500 mg 을 스쿠알렌 20 g 과 톨루엔 300 ㎖ 의 혼합액을 첨가하고, 진탕 또는 초음파에 의해 15 분간 분산한다. 그 후, 질소기류하에서 60 ℃ 로 가열하여 톨루엔을 증류 제거한다. 이어서 0.02 %w/w 폴리소르베이트 80/10 % 글리신 수용액 900 ㎖ 를 첨가하고, 호모믹서를 사용하여 7000 rpm 에서 10 분간 조유화를 실시하고, 다시 17 ㎖ 의 10 %w/w 폴리소르베이트 80 수용액을 첨가한 후, 12000 rpm 10 분간 본 유화를 실시한다. 본 유화 후, 다시 10 %w/w 폴리소르베이트 80 수용액 83 ㎖ 을 첨가하고, 호모믹서를 사용, 3000 rpm 에서 5 분간 혼합을 실시하여, 수중오일형 에멀젼을 얻는다.
참조예 3.1 (일단계 유화법, 분산용매없음)
균체성분으로 BCG-CWS 4 ㎎ 과 스쿠알렌 20 ㎕ (0.5 %w/w) 를 Potter-Elvehjem 형 균질기에 첨가하여 분산하고, 그 후 0.2 %w/w 폴리소르베이트 80 수용액 4 ㎖ 을 첨가, 동일한 균질기로 유화하여, 수중오일형 에멀젼을 얻는다.
참조예 3.2 (일단계 유화법, 분산용매: 톨루엔)
스쿠알렌 400 ㎎ 을 함유하는 톨루엔 30 ㎖ 에 균체성분으로 BCG-CWS 100 ㎎ 을 첨가하고, 초음파에 의해 분산한다. 질소환류에 의해 톨루엔을 제거한 다음, 0.2 %w/w 폴리소르베이트 80 수용액 100 ㎖ 을 첨가하고, 유화기 (IKA T-25/S25KV25F 샤프트 사용) 에 의해 15000 rpm, 5 분, 70 ℃ 에서 유화하여, 수중오일형 에멀젼을 얻는다.
시험예 3.1 (BCG-CWS 원약의 제제품 중에 포함율)
실시예 3.1, 참조예 3.1, 3.2 의 제제품 200 ㎕ 를 시험관에 취하고, 5 % 페놀 수용액 200 ㎕ 를 첨가하여 교반한다. 진한 황산 1 ㎖ 를 추가로 첨가하여 교반한 후, 실온에서 30 분 이상 방치하여, 490 nm 에서 흡광도를 측정한다.얻어진 흡광도로부터 미리 제작한 검량선을 기초로 BCG-CWS 원약의 양을 계산한다 (생화학실험강좌 4 당질의 화학 하(下) p.370, Methods in Enzymology, 8, 93).
그 결과를 다음의 표 10 에 나타낸다.
| 제제 제조방법 | 제제중의 원약의 양 (대 주입치 %) |
| 참조예 3.1 | 49 |
| 참조예 3.2 | 16 |
| 실시예 3.1 | 113 |
| 실시예 3.2 | 119 |
이 표에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 제조법에 의해 얻어진 제제품의 원약 포함율은 거의 정략적인 것으로 생각된다. 이렇게, 본 발명의 제조방법에 의해 제조중의 불용성 물질의 발생을 억제할 수 있어, 원약의 손실을 적게 할 수 있음이 분명해진다.
시험예 3.2 BCG-CWS 원약의 제제품 중의 포함율
실시예 3.3 의 제제품 중의 BCG-CWS 원약의 포함율을, 시험예 3.1 에 기재한 방법으로 측정한다. 그 결과, 제제중의 원약의 양 (대 주입치 %) 은 109 % 이다.
시험예 3.3 생물활성 시험
실시예 3.1 ∼ 3.2 및 참조예 3.1 ∼ 3.2 에 기재한 제제를 물에 의해 재용해한 수중오일형 에멀젼에 대해 마우스 종양 전이 모델계에 의해 생물활성을 비교하여, 제제방법의 차이에 의한 생물활성의 변화를 확인할 수 있다.
8 주령의 BALB/C 마우스 5 마리를 1 군으로 사용한다. 마우스의 꼬리정맥으로 2.5 ×104개/마리의 Colon 26-M3.1 종양세포를 투여하고, 24 시간 후에 실시예 및 참조예의 제제품을 BCG-CWS 로서 100 ㎍ /200 ㎕/ 마우스의 비율로 투여한다. 2 주간 후, 개흉하여, 폐를 적출한 후, 폐에 전이한 종양소수를 계산하여 비교를 실시하면, 본 발명의 제제품은 모두 생물활성을 나타낸다.
본 발명의 제조방법은, 함유되는 균체성분의 유효한 면역부활작용을 유지하고, 또 대량 스케일로 생산이 가능한 제조방법이다. 최근 재평가가 진행되고 있는 면역부활요법, 특히 BCG-CWS 를 사용하는 단독요법은 더욱 우수한 효과를 올리고 있어, 본 발명의 제조방법에 의해 처음으로 의약품으로서 유효한 면역부활작용을 유지한 제제품을 제공할 수 있게 되었다.
Claims (20)
- 세균의 균체성분, 오일상 물질, 계면활성제 및 안정화제를 함유하고, 이하의 특징을 갖는 수중오일형 에멀젼을 동결건조처리하여 얻어지는 안정화 동결건조제제:(a) 유적중에, 세균의 균체성분을 함유하고(b) 단일 피크형의 입자경 분포에서 유적이 수용액중에 분산되고,(c) 동결건조 전후에서의 수용액중의 유적의 입자경 분포 및 탁도의 변화가 크지 않다.
- 제 1 항에 있어서, 수용액의 탁도의 변화가 동결건조전의 탁도의 50 % 이하인 안정화 동결건조제제.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 세균의 균체성분이 BCG-CWS 이며, 오일상 물질이 스쿠알렌인 안정화 동결건조제제.
- 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 안정화제가 아미노산 또는 요소인 안정화 동결건조제제.
- 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 안정화제가 글리신인 안정화동결건조제제.
- 세균의 균체성분, 오일상 물질, 계면활성제 및 안정화제를 함유하고, 이하의 특징을 갖는 수중오일형 에멀젼을 동결건조처리하는 것을 포함하는 안정화 동결건조제제의 제조법:(a) 유적중에, 세균의 균체성분을 함유하고(b) 단일 피크형의 입자경 분포에서 유적이 수용액중에 분산되고,(c) 동결건조 전후에서의 수용액중의 유적의 입자경 분포 및 탁도의 변화가 크지 않다.
- 제 6 항에 있어서, 용액의 탁도의 변화가 동결건조전의 탁도의 50 % 이하인 안정화 동결건조제제의 제조법.
- 제 6 항 또는 제 7 항에 있어서, 세균의 균체성분이 BCG-CWS 이며, 오일상 물질이 스쿠알렌인 안정화 동결건조제제의 제조법.
- 제 6 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 안정화제가 아미노산 또는 요소인 안정화 동결건조제제의 제조법.
- 제 6 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 안정화제가 글리신인 안정화동결건조제제의 제조법.
- 이하의 공정을 함유하는 것을 특징으로 하는, 세균의 균체성분이 오일상 물질로 피복되고, 렉틴을 이용한 응집반응이 음성을 나타내는 수중오일형 에멀젼제제의 제조법:(a) 세균의 균체성분, 오일상 물질, 및 분산보조용매의 혼합액을 교반하여 세균의 균체성분을 분산하고,(b) 분산보조용매를 증류제거함으로써, 세균의 균체성분을 오일상 물질로 피복한 유적을 형성한 후,(c) 계면활성제를 함유하는 수용액을 첨가하여 유화시킨다.
- 제 11 항에 있어서, 세균의 균체성분이 BCG-CWS 또는 노카르디아·루브라의 CWS 인 수중오일형 에멀젼제제의 제조법.
- 제 11 항에 있어서, 세균의 균체성분이 BCG-CWS 이며, 오일상 물질이 스쿠알렌인 수중오일형 에멀젼제제의 제조법.
- 제 11 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 분산보조용매가 에탄올 또는 톨루엔인 수중오일형 에멀젼제제의 제조법.
- 제 11 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 유적이 약 100 ㎛ 이하의 입자경이 되도록 분산되어 있는, 수중오일형 에멀젼제제의 제조법.
- 이하의 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는, 수중오일형 에멀젼제제의 제조법:(a) 세균의 균체성분, 오일상 물질, 및 분산보조용매의 혼합액을 교반하여 세균의 균체성분을 분산하고,(b) 분산보조용매를 증류제거한 후,(c) 계면활성제를 함유하는 수용액을 첨가하여 다음 2 단계 유화를 실시한다:i) 저농도의 계면활성제를 함유하는 수용액을 첨가하여 천천히 교반하여 조유화를 실시하고,ii) 적절히, 원하는 입도분포를 얻기 위해, 조유화 용액의 계면활성제 농도를 조정하여 강하게 교반하여 본유화를 실시한다.
- 제 16 항에 있어서, 2 단계 유화에 있어서, 조유화에 사용되는 저농도의 계면활성제 수용액의 계면활성제의 함량이 오일상 물질의 10 % 이하인 것을 특징으로 하는, 수중오일형 에멀젼제제의 제조법.
- 제 16 항 또는 제 17 항에 있어서, 계면활성제가 폴리소르베이트 80(Tween80) 인, 수중오일형 에멀젼제제의 제조법.
- 제 16 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서, 세균의 균체성분이 BCG-CWS 또는 노카르디아·루브라의 CWS 인, 수중오일형 에멀젼제제의 제조법.
- 제 16 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서, 세균의 균체성분이 BCG-CWS 이며, 오일상 물질이 스쿠알렌인, 수중오일형 에멀젼제제의 제조법.
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