KR20010040430A - 돌연변이형 허피스 심플렉스 바이러스 및 그의 용도 - Google Patents

돌연변이형 허피스 심플렉스 바이러스 및 그의 용도 Download PDF

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이안 멕베드
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Abstract

본 발명은 기능적인 ICP27 유전자를 가지고 있고, 적어도 기능적인 ICP4 및 ICP34.5 유전자가 결여되어 있는 허피스 심플렉스 바이러스(Herpes simplex virus)를 제공한다. 또한, 본 발명은 적어도 하나 이상의 기능적인 ICP4 및 ICP34.5 유전자가 결여된 허피스 심플렉스 바이러스의 포유류의 신경계의 질환 또는 부상의 치료를 위한 용도를 제공한다.

Description

돌연변이형 허피스 심플렉스 바이러스 및 그의 용도{Mutant Herpes Simplex Viruses and Uses Thereof}
HSV는 이들의 신경 친화적인 생활방식과 세포의 수명 내내 신경세포에 머물러 있을 수 있는 능력때문에, 신경계에 적합한 벡터로서 제안되어 왔다. 그러나, 야생형의 HSV는 병원성이 매우 강하기 때문에, 대부분의 다른 바이러스 벡터와 같이 어떤 방식을 사용하든 해서 반드시 불활성화시켜야 한다. HSV의 병원성 효과는 바이러스의 용균성(lytic) 감염에 의한 것으로, HSV를 벡터로 이용하기 위해서는 용균성 주기(lytic cycle)를 해제시켜, 무증상의 잠복감염을 유지할 수 있도록 하는 돌연변이를 가지는 균주의 개발이 필요하다.
따라서, 생체에서 시험될 수 있는 HSV의 벡터가 제작되었는데, 이는 배양시 성장을 위해 반드시 보충되어야 하는 필수적인 속발성 초기 유전자(immediate early(IE) gene; 이하, "IE 유전자"라 함)인 ICP4(참조: Dobson et al., Neuron, 5:353-360, 1990; Chiocca et al., New Biol., 2:736-739, 1990)를 결실시켜 제작한 것이다. ICP4는 용균 감염시 바이러스의 초기와 후기 유전자의 전사 활성(transcriptional activation)을 위해 필요하다. 그리하여, 이 유전자가 결여된 바이러스는 쉽게 세포를 감염시키지만 용균적으로 성장하지 못한다. 또한, 다른 필수적인 유전자는 ICP27로 이 유전자의 산물은 세포독성이 매우 강한데, 이는 허피스 RNA가 번역되도록 하는 pre-mRNA의 스플라이싱(splicing)을 저해하여 대개는 스플라이싱이 일어나지 않는 ICP27유전자의 이차적인 역할에 기인한 것이다. ICP27에만 결실이 있거나(참조: Reef Hardy ＆ Sandri-Goldin, J. Virol., 68:7790-7799, 1994; Rice ＆ Knipe, 1990) 또는 ICP27과 ICP4가 모두 결실된(참조: US-A-5, 658, 724) HSV균주가 만들어졌다.
돌연변이는 또한, IE 유전자인 ICP0, ICP6, 타이로신 인산화효소(tyrosine kinase), US5 또는 VMW65와 같은 비필수 유전자에서도 만들어졌는데, 이들 유전자는 생체내에서 완전한 병원성을 가지기 위해서는 필요하나, 배양상에서의 성장에는 필요없는 유전자이다(참조: Coffin ＆ Latchman, Herpes simplex virus-based vectors, In: Latchman DS(ed) Genetic manipulation of the nervous system. Academic Press: London, 99-114, 1996). 이러한 종류의 돌연변이는 결실된 유전자 부분이 성장을 위해 따로 보충될 필요는 없다는 장점을 제공하는데, 이러한 결실은 종종 증식하는 동안 바이러스와 세포주의 상보적 서열간의 상동 재조합에 의해 비병원성 표현형이 야생형 표현형으로 전환되는 경우를 유발한다고 보고된 바 있다. 그러나, 이러한 경우의 각각에 대해서, 비필수 유전자의 돌연변이는 높은 농도로 바이러스를 접종하였을 때 생체내에서 복제 차단을 극복하기 때문에 바이러스 복제를 완전히 방해하지는 못한다.
소위 신경독성(neurovirulence)인자라고 불리우는 ICP34.5는 생체내 신경독성을 위해서는 절대적으로 필요하나, 배양상의 증식을 위해서는 불필요하며(참조: Chou et al., Science, 250:1262-1266, 1990), 또한 ICP34.5에 발생하는 돌연변이는 HSV를 불활성화시키는데 있어서 미묘한 기작을 제공한다. ICP34.5는 신경세포에서 증식성 감염(productive infection)에 대한 일반적인 숙주의 반응을 저해한다고 생각되었고, 이는(ICP34.5가 없는 경우) 세포사멸을 야기시켜 초기에 감염된 세포에게만 제한시키는 결과를 나타낸다. ICP34.5는 이러한 반응을 극복하여 완전한 용균성 복제가 일어나는 것을 가능하게 한다. 그리하여, ICP34.5가 없을 때, 어떤 이유에서든 무능력하게 된 바이러스가 감염을 다시 일으킬 수 있게 된다면, ICP34.5 돌연변이의 방어적인 숙주반응을 통해 적은 수의 세포에서만 바이러스의 복제를 제한할 것이 확실하다.
그러나, 단일 결함(single defect)을 가지고 있는 바이러스를 결과적으로 인간에 사용하기에 충분할 정도로 안전하다고 생각하지는 않는 것 같다. 비필수적인 유전자의 불활성화와 더불어 복제를 완전히 막아 줄 수 있는 필수적인 IE 유전자의 불활성화에 의한 추가적인 안정성과 높은 농도의 접종이 이루어져야 할 것이다.
발명의 요약
본 발명자들은 적어도 ICP4 및 ICP34.5를 불활성화시키는 돌연변이(선택적으로 VMW65 및/또는 vhs를 불활성화시키는 돌연변이도 포함)가 ICP34.5 단독; ICP34.5 및 VMW65; 또는 ICP34.5, VMW65 및 vhs에 돌연변이가 발생한 바이러스 균주에 비해 독성이 감소되어 나타나고, ICP4만 단독으로 결실된 바이러스에 비해 더 안정하다는 것을 발견하였다. 그러나, 이러한 고도의 돌연변이를 갖는 균주들은 ICP4를 보충하는 세포주를 이용하여 바이러스의 원종(stock) 형성을 가능하게 하므로, 여전히 배양상에서 효율적으로 증식할 수 있다. 게다가, 본 발명의 이러한 HSV균주들은 이종의 유전자들을 포유류 세포로의 전달에 적절한 벡터라는 것을 보여주었다.
그리하여, 본 발명은 기능적인 ICP27유전자를 가지고 있고 적어도 기능적인 ICP4 및 ICP34.5 유전자가 결여된 HSV를 제공한다. 바람직하게는, 전기 HSV는 ICP34.5 유전자 외에 하나 또는 그 이상의 기능적인 비필수 유전자가 결여된 바이러스를 말한다. 예를 들어, 전기 기능적인 비필수 유전자는 VMW65, vhs, ICP0, ICP6 및 TK로부터 선택될 수 있고, 이러한 비필수 유전자의 2개 또는 심지어는 3개가 불활성화될 수도 있다.
특히, 생체내에서 독성을 감소시키기 위하여 본 발명에서는 IE 유전자의 발현을 감소시키고, IE 유전자 산물에 의해 조절되는 다른 유전자의 발현 수준을 낮추기 위하여 HSV의 비필수 유전자 VMW65를 불활성화시키는 돌연변이를 삽입하였다. 게다가, 본 발명자들은 virion host shut-off(vhs) 단백질을 암호화하는 유전자가 결실된 HSV를 만들었다. Vhs단백질은 비리온에 있는 단백질로서, 야생형 바이러스의 감염에 의해 더 빠른 속도로 생성되는 바이러스 RNA의 번역을 유리하게 하도록 숙주의 mRNA를 불안정하게 하여 단백질 합성을 저해한다.
결과적으로, 본 발명의 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 HSV는 또한 기능적인 vhs유전자 및/또는 기능적인 VMW65유전자가 결여되었다(VMW65의 전사-활성화 기능을 제거하는 전기 VMW65 유전자에 돌연변이에 기인함). 특히, 본 발명의 바람직한 바이러스는 전사-활성화 기능을 제거하는 VMW65유전자의 돌연변이에 의해 기능적인 ICP4, ICP34.5, vhs 및 VMW65 유전자가 결여된 바이러스이다.
예를 들어, 본 발명의 HSV는 파킨슨 질환(parkinson's disease), 척추 손상 또는 발작, 또는 눈, 심장 또는 골격 근육의 질환, 또는 악성 종양을 포함하는 신경 계통의 질환 또는 손상을 치료하기 위해 치료 유전자를 전달하는데 사용된다. 본 발명은 또한 포유류 세포에서 유전자의 기능을 연구하는 방법에 관한 것이고, 예를 들어, 세포의 기능장애를 보상하는 유전자를 확인하거나 야생형 또는 돌연변이형 포유류 세포에서의 돌연변이 유전자의 발현 효과를 연구하는데 필요한 방법과 관련되어 있다. 특히, 본 발명의 방법들은 질병과 관련된 유전자의 기능적 연구을 위해 사용될 수도 있다.
또한, 본 발명은 이종의 유전자를 보유하는 HSV를 제공한다. 본 발명에서 이종 유전자라함은 HSV 게놈에서 발견되지 않은 어떠한 유전자도 다 포함한다는 것을 의미한다. 이종 유전자는 야생형 유전자의 어떠한 대립 형질의 변이체이거나 또는 돌연변이 유전자일 수도 있다. 이종 유전자는 바람직하게는 포유류 세포에서, 바람직하게는 중추 또는 말초 신경계의 세포, 또는 눈, 심장, 골격근육의 세포, 좀 더 바람직하게는 중추 또는 말초 신경계의 세포에서 이종 유전자의 발현을 허용하는 조절서열(control sequence)에 연관되어 있다. 그리하여, 본 발명의 HSV는 그것이 발현될 포유류 세포로 이종 유전자를 전달하는 데 사용될 것이다. 이러한 벡터는 예를 들어, 유전자 치료, 생체외 분석방법, 또는 HSV 유전자 조절의 연구 등 다양한 방면에서 유용하다.
바람직하게는, 이종 유전자가 세포 독성을 나타내거나 전구체 형태의 프로드러그(prodrug)를 세포 독성 화합물로 변환시킬 수 있는 폴리펩타이드를 포함하는 치료에 유용한 폴리펩타이드를 암호화한다.
본 발명은 또한 인간과 동물의 치료에 사용할 수 있는 이종 유전자를 전달하는 HSV를 제공한다. 예를 들어, 이러한 바이러스는 파킨슨 질환, 척추 손상 또는 발작 또는 눈, 심장 또는 골격근육 질환, 또는 악성종양을 포함하는 신경계통의 질환 또는 손상을 위한 치료에 사용될 수 있다.
본 발명의 HSV은 또한 세포의 기능 장애를 보상하는 유전자를 확인하거나 야생형 또는 돌연변이형의 포유류 세포에서 발현되는 돌연변이 유전자의 효과에 대한 연구와 같이 포유류 세포에서 유전자의 기능을 연구하는 방법으로 사용될 수 있고, 또한 특히 질병과 관련있는 유전자의 기능적 연구를 위하여 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 ICP27 유전자는 원상태 및/또는 기능적으로 유지된다면 HSV의 ICP34.5와 ICP4 유전자를(선택적으로, VMW65 및/또는 vhs유전자를 포함할 수 있음) 기능적으로 불활성화시키기 위해 상기의 HSV 유전자를 변형하는 것을 포함하는 방법으로 본 발명의 HSV를 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명은 허피스 심플렉스 바이러스(Herpes simplex virus; 이하, 'HSV'라 함)를 비병원성으로 만드는 불활성화된 돌연변이를 가지는 돌연변이형 HSV에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 그러한 돌연변이형 HSV의 유전자 치료(gene therapy)와 유전자의 기능을 분석하기 위한 방법에 사용하기 위한 용도에 관한 것이다.
A. 바이러스 균주
본 발명의 HSV는 예를 들어 HSV1 또는 HSV2, 또는 그것의 파생체(derivative), 바람직하게는 HSV1의 파생체에서 얻어진 것이다. 파생체는 HSV1과 HSV2 균주의 DNA를 함유하고 있는 인터 타입(inter-type) 재조합체를 포함한다. 파생체는 바람직하게는 HSV1 또는 HSV2 게놈과 적어도 70%의 서열 상동성(sequence homology)을 가져야하고, 좀 더 바람직하게는 적어도 80%, 가장 바람직하게는 적어도 90내지 95%의 서열 상동성을 가져야한다. 본 발명의 바이러스를 얻기 위해 사용된 다른 유도체들은 이미 ICP4, ICP34.5, VMW65 또는 vhs에 돌연변이를 가지고 있는 균주를 포함하는데, 예를 들어 ICP34.5에 돌연변이를 가지고 있는 1716 균주(참조: MacLean et al., J. Gen. Virol., 72:632-639, 1991), R3616 및 R4009 균주(참조: Chou ＆ Roizman, Science, 250:1262-1266, 1990)와 ICP4에 결실이 있는 d120 균주(참조: Deluca et al., J. Virol., 71:558-570, 1985)를 사용하였다. 이러한 균주의 사용은 본 발명의 돌연변이 HSV균주를 만드는데 필요한 단계를 감소시킬 것이다.
다양한 HSV 유전자를 설명하는데 사용되는 전문용어는 코핀 ＆ 랫치맨(Coffin ＆ Latchman)의 출판물(참조: Coffin ＆ Latchman, Genetic manipulation of the nervous system, Academic Press: London, 99-114, 1996)에서 찾을 수 있다.
B. 상보적인(complementing) 세포주
본 발명의 바이러스는 E5 세포(참조: DeLuca et al., J. Virol., 56:558-570, 1985) 또는 B4 세포(참조: 실시예 1), 바람직하게는 B4 세포와 같이 ICP4를 발현하는 세포주에서 증식된다. ICP4-발현 세포주는, 예를 들어 Vero나 BHK 세포와 같은 포유류 세포에 상기의 세포에서 발현될 수 있는 기능적인 HSV ICP4유전자를 를 가지는 벡터, 바람직하게는 플라스미드 벡터와, 예를 들어 네오마이신 (neomycin) 저항성과 같이 선택적 표지를 암호화하는 벡터, 바람직하게는 플라스미드 벡터의 코-트랜스팩팅(co-transfecting)에 의해 제조된다. 선택적 표지를 가지는 클론들은, 예를 들어 당업자들에게 알려진 방법을 사용하여, ICP4-HSV균주의 생장을 지탱하는 ICP4유전자의 능력에 기초하여 어느 클론이 기능적인 ICP4를 발현하는지를 결정하기 위해 좀 더 선별된다.
ICP4-돌연변이 HSV균주를 기능적인 ICP4를 가지는 균주로 전환(reversion)시키지 못하는 세포주는 상기에 설명한 바에 의해 생성되는데, 기능적인 ICP4유전자를 포함하는 벡터는 ICP4-돌연변이 바이러스에 남아 있는 염기서열과 중복되는 염기서열을 함유하지 않아야 한다.
C. 돌연변이 방법
ICP4, ICP34.5, vhs 및 HSV의 다른 유전자들은 당업계분야에 잘 알려진 몇 가지의 방법에 의해 기능적으로 불활성화된다. 예를 들어, 이들은 결실, 치환 또는 삽입, 바람직하게는 결실에 의해 기능적으로 불활성화된다. 결실은 유전자의 부분이나 전체를 제거하는 것이다. 예를 들어, 단 하나의 뉴클레오타이드 결실은 프레임 쉬프트(frame shift)를 야기시킨다. 그러나, 바람직하게는 예를 들어 적어도 전체 암호화(coding) 및 비암호화(non-coding) 염기서열의 25%, 보다 바람직하게는 적어도 50%이상의 결실이 만들어진다(또는, 선택적으로는, 절대 개념으로 볼 때 적어도 10개 뉴클레오타이드, 좀 더 바람직하게는 적어도 100개 뉴클레오타이드, 가장 바람직하게는 1000개의 뉴클레오타이드). 특히, 전제 유전자와 측면 서열(flanking sequence)의 일부를 제거하는 방법이 선호된다. 삽입될 서열은 아래에 설명할 이종 유전자를 포함하는데, 특히 이종 유전자를 ICP4에 삽입하는 방법이 선호된다. VMW65 유전자의 경우에는 이들이 필수적인 구조 단백질을 암호화하기 때문에 전체 유전자를 결실할 수 없으나, 전사적으로 IE 유전자를 활성화시키는 VMW65의 기능을 제거하기 위해 크기가 작은 불활성화 삽입이 만들어진다(참조: Ace et al., J. Virol., 63:2260-2269, 1989; Smiley ＆ Duncan, J. Virol., 71:6191-6193, 1997, 또는 비슷한 효과를 나타내는 다른 돌연변이들).
HSV의 돌연변이는 당업자들에게 잘 알려진 상동 재조합 또는 선택적으로는, 선형화된 HSV게놈 DNA에 직접 연결, 또는 당업자들에게 알려져 있거나 발견된 다른 어떠한 수단에 의해서 만들어진다. 예를 들어, HSV 게놈 DNA를 상동 HSV 염기서열을 측면에 갖고 있는 돌연변이 염기서열를 포함하는 벡터, 바람직하게는 플라스미드 벡터와 같이 트랜스펙션(transfection)한다. 돌연변이된 염기서열은 결실, 삽입 또는 치환을 포함하는데, 이들은 모두 일반적인 방법으로 만들어진다. 삽입을 위해 lacZ같은 선택적 표지 유전자가 사용되는데, 이는 이 유전자의 베타-갈락토시다제(β-galactosidase)활성 측정법에 의해 재조합 바이러스를 선별할 수 있기 때문이다.
D. 이종 유전자와 프로모터들
본 발명의 돌연변이 HSV균주들은 HSV 게놈에 존재하지 않은 이종 유전자를 전달하도록 변형되었다. "이종 유전자(heterologous gene)"라는 용어는 HSV게놈에서 발견되지 않은 다른 종류의 유전자를 포함하는데, 주로 야생형 유전자의 대립형질 변이체(allelic variant), 또는 돌연변이 유전자를 말한다. "유전자(gene)"라는 용어는 적어도 전사될 수 있는 핵산을 포함하도록 의도되어 졌으므로, mRNA, tRNA 및 rRNA를 암호화하는 서열이 이 정의안에 포함된다. 핵산은, 예를 들어, RNA, DNA 또는 그것의 유사체들이다. 이들 염기서열은, 예를 들어, 프로모터에 대해 그 방향성이 센스(sense) 또는 안티센스(anti-sense)로 존재하는데, 안티센스 구조물(anti-sense construct)은 잘 알려진 방법에 의해 세포에서 유전자의 발현을 저해하는데 사용된다. mRNA를 암호화하는 염기서열은 자연적으로 또는 그 밖의 다른 방법에 의하여 번역되는 암호화 염기서열과 연결된 5' 및/또는 3'의 전사는 되나 번역되지 않은 측면서열의 일부 또는 전부를 선택적으로 포함한다. 추가적으로, 이는 예를 들어, 전사 정지신호(transcriptional stop signal), 폴리아데닐레이션 사이트(polyadenylation site) 및 하류 인핸서 요소(downstream enhancer element)와 같이 전사되는 염기서열과 정상적으로 관련된 전사 통제 염기서열를 포함한다.
이종 유전자는, 예를 들어, HSV 서열이 측면에 있는 이종 유전자를 전달하는 플라스미드 벡터와 HSV균주의 상동성 재조합에 의해 HSV 게놈으로 삽입될 수 있다. 이종 유전자는 당업계에 잘 알려진 클로닝 방법을 이용하여, HSV 염기서열을 포함하는 적당한 플라스미드 벡터에 삽입할 수 있다. 이종 유전자가 여전히 바이러스의 증식을 가능하게 한다면, HSV 게놈의 어떠한 자리에도 삽입될 수 있다. 특히, 이종 유전자가 필수 유전자인 ICP4에 삽입되는 것이 바람직하다.
이종 유전자의 전사되는 염기서열은 포유류 세포에서 중추와 말초 신경계의 세포에서 이종 유전자의 발현을 허용하는 조절 서열에 작동 가능하도록 연관되는 것이 바람직하다. "작동 가능하도록 연관되는(operably linked)"이라는 용어는 병치상태(juxtaposition)를 말하며, 이는 그 구성 요소들이 서로서로 원래 의도되어진대로 기능을 수행하도록 허용하는 관계에 있음을 의미한다. 암호화 염기서열에 "작동 가능하도록 연관된" 조절 서열은 조절 서열과 양립할 수 있는 조건하에서 암호화 염기서열이 발현될 수 있게 하는 방식으로 연결된다.
조절 서열은 이종 유전자의 발현을 가능하게 하는 프로모터 및 전사의 종결을 위한 신호를 포함한다. 프로모터는 포유류 세포에서, 바람직하게는 인간 세포에서 기능을 발휘할 수 있는 프로모터들로부터 선택된다. 프로모터는 진핵 유전자의 프로모터 염기서열로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 이는 이종 유전자의 발현을 가능케 하는 세포, 바람직하게는 포유류의 중추 또는 말초 신경계 세포의 게놈으로부터 유래한 프로모터이다. 이러한 진핵 프로모터들은, 그것이 조직에 상관없이 항상 일정하게(β-actin 및 tubulin의 프로모터들) 또는 선택적으로는, 조직-특이적 방식(tissue-specific manner)으로(피루베이트 인산화효소(pyruvate kinase)와 같은 유전자의 프로모터들)으로 작용하는 프로모터들이다. 또한, 그들은, 예를 들어, 스테로이드 호르몬 수용체(steroid hormone receptor)에 결합하는 프로모터 같이 특별한 자극에 반응하는 프로모터들이다. 또한, 말로니 뮤린 루케미아 바이러스의 긴 말단 반복 배열(Moloney Murine Leukemia Virus Long Terminal Repeat:MMLV LTR)이나 HSV 유전자의 프로모터 같은 바이러스 프로모터가 사용된다.
HSV LAT 프로모터 및 LAT 프로모터 부분의 요소(element)를 포함하고 있는 프로모터들이 특히 바람직한데, 이는 잠복기 동안 이종 유전자의 장기간 발현 (long-term expression)을 가능하게 하기 때문이다. 특히, 그 자체로는 프로모터 역할을 할 수 없으면서, 어떠한 프로모터에 연관된 LAT P2 및 하나의 이종유전자로서 근본적으로 구성된 발현 카세트(expression cassette)가 바람직하다 (참조: WO 98.30707).
"장기간 발현"(long-term expression)이라는 용어는 HSV가 심지어 잠복 기간에 들어간 후에도 본 발명의 HSV로 감염된 세포에서 이종 유전자가 발현된다는 것을 의미한다. 바람직하게는, 이는 적어도 2주간 계속되고, 보다 바람직하게는 적어도 감염 후에 1달 내지 2달간 계속되며, 가장 바람직하게는 세포의 일생 동안 계속된다.
발현 카세트는 전기의 HSV LAT P2부분과는 같은 방향으로, 1차 프로모터 및 1차 이종 유전자(first heterologous gene)와는 반대 방향으로 작용 가능하도록 연관된 2차 프로모터와 2차이종 유전자(second heterologous gene)를 추가로 포함하는데, 여기서 말하는 2차 프로모터와 2차 이종유전자는 1차 프로모터와 1차 이종 유전자와 동일하거나 또는 다른 것이다. 그리하여, 반대 방향으로 제조된 프로모터/이종유전자 쌍은 단일 LAT P2부분의 측면에 존재하게 되면서, 동일하거나 다른 프로모터에 의해 유도되는 동일하거나 다른 이종 유전자쌍의 장기간 발현을 가능하게 한다. 게다가, 1차 이종 유전자의 산물은 적당한 생리 조건하에서 2차 이종 유전자의 발현을 조절할 수 있고, 그의 반대의 경우도 일어날 수 있다.
발현 카세트는 당 업자들에게 잘 알려진 일반적인 클로닝 방법을 사용하여 만들어진다(참조: Sambrook et al., Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, 1989). 추가적으로 이러한 발현 카세트를 포함하는 특정한 HSV균주는 실시예에서 명시한다.
본 발명에서 LAT P2 부위는 HSV1 17+균주의 HSV1 뉴클레오타이드 118866 내지 120219(참조: GenBank HE1CG; PstI부터 BstXI까지), 이 부분의 절편 또는 유도체를 말하며, 이는 HSV2균주 및 다른 종류의 HSV1균주의 상동적인 부분을 포함하는 데, 이들이 연결된 프로모터가 장기간 발현을 할 수 있도록 돕는다. 또한, 유도될 수 있는 프로모터의 사용은 세포의 생장 기간 동안 이종 유전자의 발현을 조절할 수 있기 때문에 유용하다. 유도적(inducible)이라는 것은 프로모터를 사용시 수득되는 발현 수준을 조절할 수 있다는 것을 의미한다. 예를 들어, 한 종류 이상의 이종 유전자가 HSV게놈에, 다시 말해서 HSV 게놈의 동일 장소에 또는 서로 다른 장소에 삽입되는 바람직한 실시태양에서, 삽입되는 프로모터는 전에 기술된 바와 같이(참조: Gossen ＆ Bujard, 1992, Gossen et al., 1995), tet repressor/VP16 전사 활성인자 융합 단백질(transcriptional activator fusion protein)과 반응하고, 이종 유전자의 발현을 조절할 수 있는 프로모터를 포함한다. 제 2의 프로모터는 tet repressor /VP16 융합 단백질의 발현을 추진시킬 수 있는 강력한 프로모터(예, CMV IE 프로모터)로 구성된다. 그리하여, 이 실시예에서 1차 이종 유전자의 발현은 테트라사이클린(tetracycline)의 존재 유무에 의존한다. 본 발명의 실시 태양에서는 한 종류 이상의 프로모터/이종 유전자의 발현 수준을 조절하기 위해서 그 발현 수준이 조절되는 한 종류 이상의 프로모터/이종 유전자를 HSV게놈안에 삽입시킬 수 있는데, 이를 통해 테트라사이클린 또는 조절 가능한 프로모터로부터 발현수준을 조절할 수 있는 물질을 투여함으로써 다양한 유전자의 발현 수준의 조절을 가능하게 한다.
게다가, 이러한 프로모터들 중 일부는, 인핸서 염기서열(enhancer sequence, LAT 부분의 구성 요소 포함)같은 조절 염기서열의 첨가에 의해 변형될 수 있다. 위에서 기술한 둘 또는 그 이상의 다른 프로모터들로 이루어진, 예를 들어 MMLV LTR/LAT 퓨전 프로모터(참조: Lokensgard et al., J. Virol., 68:7148-7158) 또는 LAT부분의 구성요소들로 이루어진 프로모터와 같은 키메릭 프로모터(chimeric promoter)가 사용된다.
이종 유전자는, 예를 들어, 세포 분열의 조절에 관련된 단백질, 예를 들어 신경친화 성장 요소(neurotrophic growth factor: 뇌에서 유래된 신경항성 인자(brain-derived neurotrophic factor), glial cell에서 유래된 신경향성 인자, NGF, NT3, NT5 및 GAP43), 사이토카인(α, β 또는 γ-인터페론, IL-1, IL-2를 포함하는 인터루킨, 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor), 또는 인슐린 유사 성장 인자(insulin-like growth factor) I 또는 II), 단백질 인산화 효소(protein kinase, 예를 들어 MAP kinase), 단백질 탈인산화효소(protein phosphatase) 및 전기 단백질에 대한 세포 수용체를 포함하는 마이토젠 생장 요소(mitogenic growth factor)를 암호화한다. 이종 유전자는 또한, 예를 들어, 아미노산 생합성이나 분해(예를 들어 티로신 가수분해 효소); 퓨린 또는 피리미딘 생합성 또는 분해; 도파민(dopamine)과 같은 신경 전달 물질(neurotransmitter)의 생합성 또는 분해; 또는, 그러한 경로의 조절에 관련되어 있는, 예를 들어 단백질 인산화 효소 및 탈인산화 효소와 같은 세포 대사 경로에 관련된 효소를 암호화한다. 또한, 이종 유전자는, 예를 들어, Brn3 family(Brn3a, Brn3b, Brn3c를 포함하여); Rb 또는 p107과 같은 포켓 단백질(pocket protein); 막 단백질(예를 들어, rhodopsin); 구조 단백질(예를 들어, dystrophin); hsp27, hsp65, hsp70 및 hsp90과 같은 열 처리 단백질(heat shock protein) 등의 전사 요소(transcription factor) 또는 그들의 조절에 관련된 단백질을 암호화한다.
바람직하게는, 이종 유전자는 치료용 또는 그들의 기능이나 기능의 결여가 질환의 진행에 중요한 폴리펩타이드를 암호화한다. 예를 들어, 전기에 기술한 단백질들 중에서, 티로신 가수분해효소(tyrosine hydroxylase)는 파킨슨 질환의 치료에 사용되고, 로돕신(rhodopsin)은 눈 질환에 사용되며, 디스트로핀(dystrophin)은 근위축증 치료에 사용되고, 열 처리 단백질은 허혈성(ischaemic) 스트레스와 관련된 심장과 뇌의 질환을 치료하는데 사용된다. 치료 목적을 위해 사용되는 폴리펩타이드는 리신(ricin)과 같은 세포 독성 폴리펩타이드나, 바이러스에 대한 효소 전구체 요법(virus-directed enzyme prodrug therapy) 또는 유전자에 대한 효소 전구체 요법(gene-directed enzyme prodrug therapy) 등에 사용하기 위해 전구체 프로드러그를 세포 독성 물질로 변환 시키는 효소를 포함한다. 후자의 경우에, 효소는 효소가 세포 표면으로 유도될 수 있도록 적당한 신호 염기서열(signal sequence)을 가져야 하는데, 전기 서열은 바람직하게는 세포막에 고착되어 있는 동안 효소를 세포 표면의 바깥쪽에 노출시킬 수 있도록 해야 한다. 이러한 효소들로는 WO 93/08288에 개시되어 있는 대장균의 질소환원효소(nitroreductase)와 같은 세균성 질소환원효소 또는 카르복시펩티다제(carboxypeptidase), 특히 WO 88/07378에 개시되어 있는 카르복시펩티다제인 CPG2를 포함한다. 또 다른 종류의 효소들은 EP-A-415731를 참조함으로써 찾아볼 수 있다. 적당한 프로드러그는 니트로겐 머스타드 프로드러그(nitrogen mustard prodrug) 및 본 명세서의 참조에 포함되어 있는 WO 88/07378, WO 89/10140, WO 90/02729 및 WO 93/08288에 서술되어 있는 다른 종류의 화합물을 포함한다.
이종 유전자들은 또한 백신으로 사용될 수 있는 항원성 폴리펩타이드를 암호화한다. 바람직하게는 이러한 항원성 폴리펩타이드는 세균 또는 바이러스, 또는 종양과 같은 병원성 생물로부터 유래한 것이다.
또한, 이종 유전자는 표지 유전자(예를 들어, 베타-갈락토시다제 또는 녹색 형광 단백질(GFP)) 또는 유전자 산물이 다른 유전자의 발현을 조절하는 유전자(예를 들어, 위에서 설명한 tet repressor/VP16 전사 활성인자 융합 단백질을 포함하는 전사 조절 인자)를 포함한다.
유전자 요법과 이외의 다른 치료에 사용하기 위하여는, 다양한 유전자의 투여를 필요로 한다. 다양한 유전자의 발현은 다양한 조건에서의 치료에 - 예를 들어, 다수의 신경향성 인자를 사용하여 - 유용하다. HSV는 다른 바이러스 벡터 체계와는 달리 팩키징능력이 제한되지 않기 때문에 특히 적당하며, 그리하여 다양한 이종 유전자들이 그것의 게놈안에 수용될 수 있다. 예를 들어, 이러한 것을 가능하게 하는 적어도 2가지의 방법이 있다. 예를 들어, 한 종류 이상의 이종 유전자와 이와 관련된 조절 서열을 특정한 HSV균주에 삽입할 수 있다. 또한, 중앙에 위치해 있는 LAT P2 인자로부터 서로 반대 방향으로 멀리 떨어져 마주보고 있는 프로모터를 쌍을 동일하거나 서로 다른 프로모터에 사용할 수 있는데, 이러한 프로모터들은 전기에서 설명한 바와 같이 이종 유전자(동일하거나 또는 서로 다른 이종 유전자)의 발현을 촉진시킨다.
E. 투여
본 발명의 돌연변이 HSV는 치료를 필요로 하는 사람이나 동물에게 치료 유전자를 전달하는데 사용된다. 본 발명의 돌연변이 HSV를 사용한 치료 유전자의 전달은 파킨슨 질환, 신경계통의 질환, 척추 손상, 발작 또는 신경 교종(glioma)같은 악성 종양의 치료에 사용된다.
유전자 치료를 위한 투여방법의 하나는 전기에서 설명한 바와 같이 본 발명의 돌연변이 HSV 게놈에 치료 유전자를 삽입하고, 전기에서 수득된 재조합 바이러스를 약제학적으로 허용되는 담체나 희석제와 조합하여 약제학적인 조성물을 만드는 것이다. 적당한 담체와 희석제는 인산 완충 식염수(phosphate-buffered saline)같은 등장 식염 용액을 포함한다. 조성물은 비경구적, 근육내, 정맥내, 피하, 안내(intraocular) 또는 피부(transdermal) 투여를 위해 조제된다.
약제학적 조성물은 전기의 방식으로 투여되며 유전자 요법을 위한 치료 유전자를 함유하고 있는 돌연변이 바이러스는 적당한 곳에서 세포에 삽입된다. 예를 들어, 유전자 치료의 대상이 중추 또는 말초 신경계통일 때, 조성물은 시냅스의 말단이 모여있는 곳에 투여된다. 약제학적 조성물은 일반적으로 입체 공간적인(stereotaxic) 접종에 의해 뇌에 투여된다. 약제학적 조성물이 눈에 투여될 때에는, 망막 밑(sub-retinal)에 투여하는 것이 일반적으로 사용되는 방법이다.
투여될 바이러스의 양는 104내지 1010pfu의 범위이고, 보다 바람직하게는 106내지 107pfu의 범위이다. 접종할 때는, 전형적으로 1 내지 10ul의 바이러스를 약제학적으로 허용되는 적당한 담체나 희석제를 사용하여 투여된다.
투여 경로와 투여량은 당 업계의 전문의들이 환자 및 상태를 고려해서 적절한 투여 경로와 투여량을 결정할 수 있기 때문에, 이는 단지 하나의 지침일 뿐이다.
F. 분석 방법
본 발명의 돌연변이 HSV는 또한 과학적 연구를 위한 방법에도 사용된다. 그리하여, 본 발명의 추가적인 관점은 포유류 세포에서, 생체내(in vivo) 또는 생체외(in vitro)적으로 유전자의 기능을 분석하는 방법에 관한 것이다. 이종 유전자의 기능은 다음과 같은 단계를 포함하는 방법에 의해 결정된다:
(a) 본 발명의 돌연변이 HSV에 이종 유전자를 도입하는 단계;
(b) 전기에서 수득된 바이러스를 포유류의 세포주에 도입하는 단계; 및
(c) 전기의 포유류 세포에서 전기의 이종 유전자의 발현 효과를 결정하는 단계.
예를 들어, 세포주가 세포 분열시 온도-민감성 결함(temperature-sensitive defect)을 가지고 있을 때, 본 발명에 의한 이종 유전자를 포함하는 HSV균주를 전기의 결함이 있는 세포주와 제한된 온도에서도 생장하는 세포주에 도입할 때, 당 업자들은 이종 유전자가 세포 분열시 결함을 보상할 수 있을지에 관해 쉽게 결정할 수 있을 것이다. 유사하게, 다른 알려진 방법을 적용하여 이종 유전자의 발현이 포유류 세포주에서 관찰 가능한 돌연변이 표현형을 수정할 수 있는지를 알아볼 수 있다.
또한, 이러한 절차는 유전자에 의해서 암호화되는 단백질의 어떤 부분이 돌연변이 표현형의 복구에 관여하는지를 확인하기 위한 이종 유전자의 체계적인 돌연변이 유발을 수행하는데 이용될 수 있다.
이러한 방법은 또한, "유전자 완전 결실(gene knock-out)"을 갖고 있는, 예를 들어 쥐와 같은, 동물에게도 사용될 수 있다. 야생형 이종 유전자를 본 발명의 돌연변이 HSV균주를 사용균 동물에 도입할 수 있고, 동물에서의 효과를 당업계에 알려진 행동학적, 조직적 또는 생화학적인 분석을 통해 결정할 수 있다. 선택적으로는, 돌연변이 이종 유전자를 야생형 또는 "특정 유전자가 완전히 결실된"(gene knock-out) 동물에 도입하여 질병-관련 병리현상이 유도되는지를 결정할 수 있다. 이것의 한가지 예로, 프리온(prion)을 암호화하는 유전자를 사용하여 설치류의 중추 신경계에 크루쯔필드-자콥(Creutzfeld-Jacob) 및 다른 프리온형 질병을 유도할 수 있다. 다른 질병의 모델은 알츠하이머 질환, 모터 뉴론 질환(motor neuron disease) 또는 파킨슨 질병을 포함할 수도 있다.
HSV 게놈의 수용 능력이 커서 적어도 2종류의 다른 이종 유전자를 세포에 도입할 수 있기 때문에, 둘 또는 그 이상의 유전자 산물의 상호관계에 대한 연구도 가능하다.
그리하여, 본 발명의 방법들은 특히 질병 관련 유전자의 기능적 연구를 위해 사용할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 돌연변이 바이러스의 제조
바이러스
ICP34.5의 두 카피(copy) 모두에 결실이 있는(참조: MacLean et al., J. Virol., 72:632-639, 1991) 1716균주 및 VMW65 유전자가 기능적으로 불활성화되어 있는 1814균주(참조: Ace et al., J. Virol., 63:2260-2269, 1989)를 3mM HMBA를 첨가한 BHK세포와 같이 배양하여(co-cultivation), VMW65 유전자의 전사-활성 작용이 기능적으로 불활성화된 돌연변이를 갖는 ICP34.5 결실 돌연변이 바이러스를 생성하였다. 형성된 플라크의 게놈구조는 당업자에게 잘 알려진 방법으로 분석하고(분리한 게놈 DNA의 제한효소 처리와 서던 블롯팅(southern blotting)), 1814 및 1716균주의 돌연변이를 모두 가지고 있는 바이러스를 5회의 플라크 정제를 통하여 수득하였으며, 이를 바이러스 균주 1764(virus strain 1764)라고 명명하였다. 1814균주 돌연변이 또는 VMW65의 트랜스-활성화 기능(trans-activating activity)에 영향을 미치는 다른 돌연변이를 함유하고 있는 바이러스의 생장은 바이러스가 생장할 동안 배지에 헥사메틸렌 비스아세타마이드(hexamethylene bisacetamide)를 첨가함으로써, 향상시킬 수 있다(참조: Mcfarlene et al., J. Gen. Virol., 73:285-292, 1992).
Vhs/ICP34.5/VMW65 결실 돌연변이 바이러스는 플라스미드 pR15와 HSV 1764균주 DNA의 상동 재조합에 의해 제조되는데, ICP34.5, VMW65 및 vhs유전자가 결실되고, vhs의 코딩 부위에 삽입된 말로니 뮤린 루케미아 바이러스의 긴 말단 반복 (Moloney murine leukemia virus long terminal repeat:'MMLV LTR'라 함) 프로모터(참조: Shinnick et al., Nature, 293:543-548, 1981)에 의해 발현되는 lacZ를 가지고 있는 1764/pR15 바이러스가 제조되었다. 플라스미드 pR15은 MMLVLTR/lacZ/pA 카세트를 vhs유전자의 특이한 NruI 자리에 삽입하여 제조하였다. 그리하여, HSV1균주 17＋ 게놈의 KpnI-i 제한절편(restriction fragment)을 플라스미드 pAT153(Northumbria Biologicals Ltd.)의 PstI자리에 클로닝하였다.
두 카피의 ICP4를 1716균주와 1764/pR15균주로부터 제거하였는데, 이는 정제한 1716균주 또는 1764/pR15의 게놈 DNA와 플라스미드 p△4/GFP의 상동 재조합에 의해 제조되었다. p△4/GFP는 ICP4 측면서열(뉴클레오타이드 123,459-126,774 [Sau3aI-Sau3aI]와 뉴클레오타이드 131,730-134,792[SphI-KpnI]로서, 이는 이 컨스트럭트(construct)가 만들어진 벡터인 pSP72[Promega]로부터 유래한 XbaI 및 SalI 부위에 의해 서로 분리되어 있음)을 사용하여 제조하였다. ICP34.5의 코딩 부위를 포함하고 있는 약 0.8kb의 NotI 절편(뉴클레오타이드 124,945-125,723)은 1716균주 또는 1764/pR15 균주와의 상동 재조합 동안에 ICP34.5 결실의 복구를 방지하기 위해 제거하였다. CMV/GFP/pA카세트는 p△4/GFP의 특별한 XbaI자리에 삽입하여 제작하였다. CMV유전자는, 처음에 pEGFPN1(Clontech)의 AgeI 과 NotI 자리에서 절단하여 pcDNA3(Invitrogen)의 EcoRI과 NotI의 자리 사이에 삽입하여 pcDNA3GFP를 제조하였다. 그 후, ICP4 측면서열 부위의 NruI과 BbsI 자리에 삽입하기 위하여, pcDNA3GFP로부터 CMV/GFP/pA 카세트를 절단하였다. 그런 다음, p△4/GFP를 전기에서 설명한 바와 같이, 상동 재조합에 의해 1716균주와 1764/pR15균주에 도입하고, 형광 현미경으로 GFP를 발현하는 플라크를 선별하여 B4세포에서 플라크를 정제함으로써(아래에 설명함), 1716/△4 균주와 1764/pR15△4 균주를 제조하였다. 플라크 정제를 통해 분리된 바이러스는 ICP4를 발현하지 못하는 BHK세포에서 증식성 감염(productive infection)을 일으키지 못한다.
바이러스 균주 17+/△4는 17＋균주의 게놈 DNA와 NotI절편 제거에 의해 ICP34.5가 결실되지 않은 ICP4 측면서열을 포함하는 플라스미드를 사용하지 않은 것을 제외하고는 상기와 동일한 방법으로 제조하였다.
뉴클레오타이드 숫자는 HSV1균주 17＋의 서열를 나타낸다(참조: GenBank no HE1CG).
상보적인 세포주를 이용한 돌연변이 HSV균주의 생장
ICP4가 결실된 바이러스의 생장을 허용하는 상보적인 세포주(B4)는 플라스미드 pICP4 DNA와 네오마이신 저항성 플라스미드 pMamNeo(Invitrogen)를 BHK세포에 코-트랜스펙션(co-transfection)하고, 네오마이신 저항성 클론을 선별하여 제조되었다. 플라스미드 pICP4는 HSV1 게놈의 DdeI-SphI절편(뉴클레오타이드 126,764-131,730)을 포함하는데, 전기 절편은 pSP72 (Promega)의 EcoRV와 SphI 사이에 클로닝된 ICP4코딩부위와 프로모터를 포함한다.
HSV1 ICP4 결실 돌연변이의(B4) 생장에 상당히 허용적인 클론이 바이러스 증식을 위해 선택되어졌다.
실시예 2: 본 발명의 HSV1 균주를 이용한 비-신경세포(non-neuronal cell)의 생체외 감염
세포 배양시 지속성(persistence)을 측정하기 위하여, 1998년 사마니고(Samaniego) 등이 사용한 방법과 유사한 방법으로, 본 발명의 HSV균주는 높은 M.O.I.(multiplicity of infection)로 베로(vero)세포로 검사되었다. 유전자 발현을 재자극 시킬수 있는 바이러스 게놈의 지속성은 바이러스의 세포에서의 세포 독성의 정도를 나타내는 지표를 제공한다. 본 발명에서는 베로세포를 1764/pR15△4, 1716/△4 및 17+/△4 각각의 균주에 대하여 20MOI로 24웰 플레이트(24well plate)에서 감염시키고, 전기 세포를 나머지 실험 기간동안 34℃/5% CO2에서 배양하였다. 시간에 따라 GFP 형광을 관찰하고, 배양한 세포를 다양한 시간대에(2일, 1주, 2주 및 1달) 20MOI의 HSV균주 z△MN＋(ICP27 유전자에 lacZ가 삽입되어 있음; 참조: Howard et al., Gene Therapy, 5:1137-1157, 1998)를 사용하여 중복감염(superinfection)시켰다.
이러한 실험을 통해서, 각각의 바이러스에 대하여 2일 후에 관찰할 때, 비록 1716/△4과 17+/△4로 감염된 배지에서는 세포독성의 징후가 분명하였으나(정상 세포의 형태가 일부 없어지는 것이 발견되었음), 각각의 배지에 있어서 세포의 95%이상이 강한 형광을 나타내었다. 1764/pR15△4로 감염된 세포의 경우, 비록 일시적으로 세포 분열의 비율이 감소되기는 하였지만, 세포 모양이 감염되지 않은 기준 세포와 동일하여, 이 바이러스의 독성이 감소되었음을 시사하였다. 감염 후, 1주일 및 그 이후의 1달 까지의 시간동안, 비 중복감염된 세포(non-superinfected)는 각각의 경우에 GFP형광이 감소함을 보여주었다. 그러나, 1주일 후에 중복감염시켰을 때는, 모든 경우에 있어 바이러스 z△MN＋의 감염에 의해 어느 정도 까지는 이러한 형광이 재자극되는 반면, 2주와 1달 후에 중복 감염시켰을 경우는 GFP의 형광이 처음에 1764/pR15△로만 감염된 세포에서 상당히 재자극되어, 다시 한번 이 바이러스의 독성이 감소되었음을 증명하였다.
실시예 3: 본 발명의 HSV1 균주를 사용한 프라이머리(primary) 신경 세포의 생체내 감염
본 발명의 HSV균주의 생체외 독성을 확인하기 위하여, 소장 신경세포(7일된 Sprague-Dawley 쥐(rat)의 장에서 유래되었음 - 참조: Saffrey et al., Cell and Tissue Culture Research, 265:527-534, 1991)의 프라이머리 세포를 사용하여 실험하였다. 이러한 세포는 96웰 마이크로타이터 디쉬(96 well microtitre dish)에 웰 당 2x106pfu 단위로 바이러스를 처리할 때, 1716, 1764, 17+/△4 또는 1764/pR15에 비해 1764pR△4를 처리하였을 경우 배양 3일 후에도 생존 능력(트립판 블루 염색을 사용하여 평가) 및 신경 세포 형태의 유지 정도가 상당히 향상되었음을 보여주었다. 그리하여, 감염시킨지 3일 후에, 1764/pR15의 경우 20%, 17+/△4의 경우 35%에 비해, 1764/pR15△4의 경우는 80%의 세포가 신경원 세포과정(neuronal process)이 유지되었다.
1764/pR15△4, 17+/△4 또는 1764/pR15을 사용했을 때 생존한 세포의 90% 이상이 표지 유전자 활성을 보여(사용한 바이러스에 따라 lacZ 및/또는 GFP), 생체외에서 바이러스 벡터을 이용한 유전자 전달이 효과적임을 제시하였다. 사용한 다른 바이러스에 비해 독성이 상당히 감소된 1764/pR15△4 바이러스는, 특히 장기간 발현을 필요로 하는 생체내에서의 벡터로 유용하게 이용될 수 있다.
ICP34.5와 ICP4 모두가 제거된 바이러스는 ICP4만 단독으로 결실된 것에 비해 상당히 향상된 안정성을 제공하는데, 이는 ICP34.5 유전자가 배양에서 바이러스의 생장을 위해 첨가될 필요가 없고, 그리하여 바이러스 생장동안 돌연변이가 어떠한 상황에서도 복구될 수 없기 때문이다. 그리하여, 비록 ICP4가 바이러스 생장동안 재조합에 의해 복구되더라도, 형성되는 바이러스는 여전히 ICP34.5가 결실되어 있고, 그리하여 생체내에서 벡터로 사용하는데 있어 여전히 안정하다. ICP34.5만 단독으로 결실된 바이러스는 생체내 조건에서 실험 동물의 뇌로 주사될 때(참조: Chou et al., Science, 250:1262-1266, 1990) 비신경독성(non-neurovirulent)적이다. 게다가 VMW65 및 vhs의 불활성 돌연변이는 독성을 더욱 감소시킨다.
실시예 4: 생체내에서 유전자 전달
1764/pR15△4, 1716/△4 및 17+/△4 균주의 생체내 유전자 전달 효율을 평가하기 위하여, 스프래그-다울리(Sprague-Dawley) 쥐의 뇌의 줄무늬층에(striatum) 입체공간적(steriotaxic) 접종법으로 5 x 107pfu/㎖의 각 바이러스 원종(stocks)을 5㎕씩 접종하는데, 헤밀톤 시린지(Hamilton syringe)에 연결된 울트라마이크로펌프 (ultramicropump, World Precision Instruments)와 마이크로필(microfil) 바늘 (World Precision Instruments)을 사용하여 10분 동안 접종하였다. 쥐를 접종한 후, 2일, 2주 및 한달 후에 희생시켜, 2%의 파라포름알데하이드가 용균되어 있는 인산염 완충액에 관류(perfusion)하여 고정시키고, 절단하여 형광 현미경으로 GFP 발현정도를 검사하여, 유전자 전달 정도를 평가하였다.
접종 2일 후에는, 모든 바이러스의 경우에 접종 주위의 많은 세포들에게서 높은 수준의 GFP 발현이 보여졌다. 그리하여, 초기 유전자 전달 효율은 ICP4만 결여된 바이러스와 ICP4및 ICP34.5 모두가 결여된 바이러스의 경우에서 비슷하게 나타났다. 그리하여, ICP34.5의 결실은 비록 이러한 바이러스가 ICP4만 단독으로 결실된 바이러스에 비해 안정성이 향상되었다는 장점이 있지만, 벡터로서 ICP4가 결실된 바이러스의 효율성을 감소시키지는 못하였다. 그러나, 접종 2주일 후에는 1716/△4와 17+/△4로 접종한 동물에서는 비교적 적은 수의 GFP+ve 세포가 관찰되고, 1764/pR15△4로 접종된 경우에는 상당히 많은 수의 GFP+ve 세포가 보여지는 것으로 보아, 이 바이러스의 독성이 감소되었음을 확실히 증명하였다. 접종 1달 후에는 1716/△4와 17+/△4로 접종한 세포에서는 GFP+ve세포가 전혀 관찰되지 않았고, 1764/pR15△4로 접종한 세포에서는 소량의 GFP+ve세포가 남아 있어 이점을 다시 한번 증명하였다(이 경우 GFP는 CMV IE프로모터에 의해 유도됨). X-gal로 염색했을 때, 1764/pR15△4로 동물에 접종하여 한달 후에 얻은 뇌의 조각(slice)은 GFP+ve세포에서보다 파란색으로 염색된 세포(lacZ 활성 표시)가 상당히 많이 관찰되었는데, 이는 아마도 여기서 lacZ의 발현을 추진하는데 사용된 프로모터의 활성을 반영하고, 전기 프로모터가 이전에 HSV 잠복기간동안 생체내에서 유전자의 발현을 위해 사용되었던 프로모터(참조: Lokensgard et al., J. Virol., 68: 7148-7158, 1994)와 비슷하다는 것을 시사한다.
참조문헌
Coffine RS, Latchman DS. Herpes simplex virus-based vectors. In: Latchman DS(ed). Genetic manipulation of the nervous system. Academic Press: London, 1996, pp99-114.
MacLean AR et al. Herpes simplex virus type I deletion variants 1714 and 1716 pinpoint neurovirulence related sequences in Glasgow strain 17+ between immediate early gene I and the 'a' sequence. J. Gen. Virol. 1991; 72:632-639.
Shinnick TM et al. Nucleotide sequence of Moloney murine leukemia virus. Nature 1981; 292:543-548.
Morgenstern JP and Land H. A series of mammalian expression vectors and characterisation of their expression of a reporter gene in stably and transiently transfected cells. NAR 1990; 18: 1068.
Ace C et al. Construction and characterisation of a herpes simplex virus type I mutant unable to transinduce immediate early gene expression. J. Virol. 1989; 63:2260-2269.
McFarlane M, Daksis JI, Preston CM. Hexamethylene bisacetamide stimulates herpes-simplex virus immediate early gene-expression in the absence of trans-induction by VMW65. J. Gen. Virol. 1992; 73:285-292.
Reef Hardy, W and Sandri-Goldin RM. Herpes simplex virus inhibits host cell splicing and regulatory protein ICP27 is required for this effect. J. Virol. 1994; 68:7790-7799.
Dobson, AT et al. A latent, non-pathogenic HSV1-derived vector stably expresses β-galactosidase in mouse neurons. Neuron 1990; 5:353-360.
Chou, J., Kern, ER, Whitley, RJ and Roizman, B. Mapping of herpes simplex virus-1 neurovirulence to ICP34.5, a gene nonessential for growth in culture. Science 1990; 250:1262-1266.
Chiocca, AE et al. Transfer and expression of the lacZ gene in rat brain neurons by herpes simplex virus mutants. New Biol. 1990; 2:736-739.
Chou. J. and Roizman, B. The ICP34.5 gene of herpes simplex virus I precludes neuroblastoma cells from triggering total shutoff of protein synthesis characteristic of programmed cell death in neuronal cells. PNAS 1992; 89: 3266-3270.
Chou, J., Poon, APW, Johnson, J. and Roizman B. Differential response fo human cells to deletions and stop codons in the ICP34.5 gene of herpes simplex virus. J. Virol. 1994; 68:8304-8311.
DeLuca NA et al. J. Virol. 1985; 56:558-570.
Lokensgard JR et al. J. Virol. 1994; 68:7148-7158.
Saffrey et al., Cell and Tissue Culture Research. 1991; 265:527-534.
Smiley JR and Duncan J, J. Virol. 1997; 71:6191-6193.
Howard MK et al. Gene Therapy 1998; 5: 1137-1147.
Samaniego LA et al. J. Virol. 1998; 72:3307-3320.

Claims (27)

  1. 기능적인 ICP27 유전자를 가지고 있고, 최소한 기능적인 ICP4 유전자와 ICP34.5 유전자가 결여된 허피스 심플렉스 바이러스(Herpes simplex virus, HSV).
  2. 제 1항에 있어서,
    ICP34.5 유전자 외에 하나 또는 그 이상의 기능적인 비필수(non-
    essential) 유전자가 추가적으로 결여된 것을 특징으로 하는
    허피스 심플렉스 바이러스.
  3. 제 2항에 있어서,
    기능적인 vhs 유전자가 결여된 것을 특징으로 하는
    허피스 심플렉스 바이러스.
  4. 제 2항 또는 제 3항에 있어서,
    VMW65 유전자의 전사-활성 기능(transcriptional-activation
    activity)을 제거하는 전기 유전자의 돌연변이에 의해 기능적인 전기
    유전자가 결여되는 것을 특징으로 하는
    허피스 심플렉스 바이러스.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서,
    결실 또는 삽입에 의해 기능적인 ICP4, ICP34.5 및/또는 비필수 유전
    자가 결여되는 것을 특징으로 하는
    허피스 심플렉스 바이러스.
  6. 기능적인 ICP27 유전자를 가지고 있고, VMW65 유전자의 전사-활성 기능을 제거하는 VMW65 유전자의 돌연변이에 의해, 기능적인 ICP4, ICP34.5, vhs 및 VMW65 유전자가 결여되는 것을 특징으로 하는 허피스 심플렉스 바이러스.
  7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서,
    HSV1 균주, HSV2 균주 또는 이들의 유도체로부터 선택되는 것을
    특징으로 하는
    허피스 심플렉스 바이러스.
  8. 제 7항에 있어서,
    균주는 HSV1 균주인 것을 특징으로 하는
    허피스 심플렉스 바이러스.
  9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서,
    적어도 하나의 이종(heterologous) 유전자를 전달하는 것을
    특징으로 하는
    허피스 심플렉스 바이러스.
  10. 제 9항에 있어서,
    이종 유전자는 포유류 세포에서 이종 유전자의 발현을 허용하도록,
    조절서열(control sequence)에 작동 가능하게 연관되는 것을
    특징으로 하는
    허피스 심플렉스 바이러스.
  11. 제 10항에 있어서,
    포유류 세포는 포유류의 중추 또는 말초 신경계 세포인 것을 특징으로
    하는
    허피스 심플렉스 바이러스.
  12. 제 10항에 있어서,
    포유류 세포는 포유류의 안구, 심장 또는 골격근의 세포인 것을
    특징으로 하는
    허피스 심플렉스 바이러스.
  13. 제 9항 내지 12항 중 어느 한 항에 있어서,
    이종 유전자는 치료용도의 폴리펩타이드를 암호화하는 것을
    특징으로 하는
    허피스 심플렉스 바이러스.
  14. 제 13항에 있어서,
    유전자는 세포독성을 갖는(cytotoxic) 폴리펩타이드를 암호화하는
    것을 특징으로 하는
    허피스 심플렉스 바이러스.
  15. 제 13항에 있어서,
    유전자는 전구체 프로드러그(prodrug)를 세포독성 화합물로 전환시킬
    수 있는 폴리펩타이드를 암호화하는 것을 특징으로 하는
    허피스 심플렉스 바이러스.
  16. 제 10항 내지 13항 중 어느 한 항에 있어서,
    이종 유전자는 세포분열의 조절에 관련된 단백질을 암호화하는 유전
    자, 대사경로에 관련된 효소, 전사인자(transcription factor) 및
    열 처리(heat shock) 단백질로부터 선택되는 것을 특징으로 하는
    허피스 심플렉스 바이러스.
  17. 제 10항에 있어서,
    포유류 세포로 이종 유전자의 전달에 사용되는 것을 특징으로 하는
    허피스 심플렉스 바이러스.
  18. 제 10항 내지 17항 중 어느 한 항에 있어서,
    인간 또는 동물의 치료방법에 사용되는 것을 특징으로 하는
    허피스 심플렉스 바이러스.
  19. 제 18항에 있어서,
    포유류의 신경계에 발생한 질환 또는 부상의 치료에 사용되는 것을
    특징으로 하는
    허피스 심플렉스 바이러스.
  20. 제 10항 내지 제 17항 중, 어느 한 항의 허피스 심플렉스 바이러스의 인간 또는 동물의 치료에 사용하기 위한 약물의 제조를 위한 용도.
  21. 제 20항의 허피스 심플렉스 바이러스의 포유류의 신경계에 발생한 질환, 또는 부상의 치료에 대한 용도.
  22. 제 10항 내지 17항 중 어느 한 항의 허피스 심플렉스 바이러스와 약제학적으로 허용되는 담체나 희석제를 포함하는 약제학적 조성물.
  23. 포유류 세포에서 이종 유전자의 기능을 연구하기 위한, 다음의 각 단계를 포함하는 방법:
    (a) 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항의 허피스 심플렉스 바이러스에 이종 유전자를 도입하는 단계;
    (b) 전기 수득된 허피스 심플렉스 바이러스를 포유류 세포에 도입하는 단계; 및,
    (c) 전기 포유류 세포에서 전기 이종 유전자의 발현 효과를 결정하는 단계.
  24. 제 23항에 있어서,
    이종 유전자는 질병의 발병에 관련된 야생형 또는 돌연변이 유전자인
    것을 특징으로 하는
    방법.
  25. 제 23항 또는 24항에 있어서,
    포유류 세포는 기능 장애를 가지고 있고, 이종 유전자는 야생형이며,
    이종 유전자의 발현 효과는 세포 기능을 위한 분석법으로 결정되는
    것을 특징으로 하는
    방법.
  26. 제 23항 또는 24항에 있어서,
    포유류 세포는 돌연변이에 의해 불활성화된 하나 또는 그 이상의 내재
    성(endogenous) 유전자를 갖는 것을 특징으로 하는
    방법.
  27. ICP27유전자의 원래 상태 및/또는 기능이 유지되는 경우, 허피스 심플렉스 바이러스의 최소한 ICP4와 ICP34.5 유전자를 변형하여, 기능적으로 불활성화시키는 단계를 포함하는 제 1항 허피스 심플렉스 바이러스를 제조하는 방법.
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Families Citing this family (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9801930D0 (en) 1998-01-29 1998-03-25 Univ London Mutant herpes simplex viruses and uses thereof
GB0009079D0 (en) * 2000-04-12 2000-05-31 Neurovex Ltd Herpes viruses for immune modulation
GB9930418D0 (en) 1999-12-22 2000-02-16 Neurovex Ltd Replication incompetent herpes virus vectors
GB9930419D0 (en) * 1999-12-22 2000-02-16 Neurovex Ltd Replication incompetent herpes virus vectors
AU2695101A (en) 2000-01-21 2001-07-31 Biovex Ltd Virus strains
US20040229362A1 (en) * 2003-05-15 2004-11-18 Alberto Epstein Method for producing non-pathogenic helper virus-free preparations of herpes virus amplicon vectors, the helper virus & the cells used in this method, the corresponding genetic tools, as well as the applications of these non-pathogenic amplicon vectors
GB0317511D0 (en) * 2003-07-25 2003-08-27 Biovex Ltd Viral vectors
US7897146B2 (en) 2003-11-17 2011-03-01 Crusade Laboratories Limited Treatment using herpes simplex virus
US20070003520A1 (en) 2003-11-17 2007-01-04 Brown Susanne M Mutant viruses
GB0326798D0 (en) * 2003-11-17 2003-12-24 Crusade Lab Ltd Methods for generating mutant virus
GB0408103D0 (en) * 2004-04-08 2004-05-12 Crusade Lab Ltd Novel herpes simplex viruses
ATE418346T1 (de) * 2004-04-08 2009-01-15 Sangamo Biosciences Inc Zusammensetzungen zur behandlung von neuropathischen und neurodegenerativen erkrankungen
US20060023160A1 (en) * 2004-08-02 2006-02-02 Cartier Jon P Lens structure and method of making the same
US20100008944A1 (en) * 2005-07-29 2010-01-14 President And Fellows Of Harvard College Herpes simplex virus mutant and uses therefore
KR102649583B1 (ko) * 2013-07-17 2024-03-20 유니버시티 오브 피츠버그-오브 더 커먼웰쓰 시스템 오브 하이어 에듀케이션 효율적인 유전자 전달 적용을 위한 비독성 hsv 벡터 및 이의 생산을 위한 보완 세포
CN105219738A (zh) * 2015-09-21 2016-01-06 北京神源德生物科技有限公司 重组单纯疱疹病毒及它感染和制备它的宿主细胞以及它们的应用
CN105219739A (zh) * 2015-09-21 2016-01-06 北京神源德生物科技有限公司 重组单纯疱疹病毒及它感染和制备它的宿主细胞以及它们的应用
WO2017176336A1 (en) * 2016-04-08 2017-10-12 Krystal Biotech, LLC Compositions and methods for the treatment of wounds, disorders, and diseases of the skin
KR20230051602A (ko) 2016-04-15 2023-04-18 알파인 이뮨 사이언시즈, 인코포레이티드 Icos 리간드 변이체 면역조절 단백질 및 그의 용도
NZ746934A (en) 2016-04-15 2023-11-24 Alpine Immune Sciences Inc Cd80 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
KR102323872B1 (ko) * 2016-04-22 2021-11-08 임비라 컴퍼니 리미티드 암치료용 종양 용해성 단순 헤르페스 바이러스(oHSV) 절대 벡터 및 그 구조체의 구조
WO2018022946A1 (en) 2016-07-28 2018-02-01 Alpine Immune Sciences, Inc. Cd155 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
US11471488B2 (en) 2016-07-28 2022-10-18 Alpine Immune Sciences, Inc. CD155 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
US11834490B2 (en) 2016-07-28 2023-12-05 Alpine Immune Sciences, Inc. CD112 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
CN106318915B (zh) * 2016-09-21 2020-02-18 重庆宇珩生物科技有限公司 重组单纯疱疹病毒HSV-hTERTp_ICP4_LungCA-GFP及诊断试剂盒
CN110352245A (zh) 2016-10-20 2019-10-18 高山免疫科学股份有限公司 可分泌变体免疫调节蛋白和工程化细胞疗法
CA3052473A1 (en) 2017-02-09 2018-08-16 Indapta Therapeutics, Inc. Engineered natural killer (nk) cells and compositions and methods thereof
RS64870B1 (sr) 2017-03-16 2023-12-29 Alpine Immune Sciences Inc Imunomodulatorni proteini varijante pd-l1 i njihove upotrebe
SG11201907769XA (en) 2017-03-16 2019-09-27 Alpine Immune Sciences Inc Cd80 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
CN110809581A (zh) 2017-03-16 2020-02-18 高山免疫科学股份有限公司 Pd-l2变体免疫调节蛋白及其用途
EP4219540A3 (en) 2017-10-10 2023-12-06 Alpine Immune Sciences, Inc. Ctla-4 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
TW201925223A (zh) 2017-10-18 2019-07-01 美商艾爾潘免疫科學有限公司 變異型icos 配位體免疫調節蛋白及相關組合物及方法
WO2019136179A1 (en) 2018-01-03 2019-07-11 Alpine Immune Sciences, Inc. Multi-domain immunomodulatory proteins and methods of use thereof
EP3775236A1 (en) 2018-04-12 2021-02-17 Krystal Biotech, LLC Compositions and methods for the treatment of autosomal recessive congenital ichthyosis
US10786438B2 (en) 2018-04-27 2020-09-29 Krystal Biotech, Inc. Recombinant nucleic acids encoding cosmetic protein(s) for aesthetic applications
WO2019241758A1 (en) 2018-06-15 2019-12-19 Alpine Immune Sciences, Inc. Pd-1 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
EP3856761A1 (en) 2018-09-24 2021-08-04 Krystal Biotech, Inc. Compositions and methods for the treatment of netherton syndrome
EP3884041A2 (en) 2018-11-21 2021-09-29 Indapta Therapeutics, Inc. Methods for expansion of natural killer (nk) cell subset and related compositions and methods
WO2020113141A2 (en) 2018-11-30 2020-06-04 Alpine Immune Sciences, Inc. Cd86 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
CN113454105A (zh) 2019-02-08 2021-09-28 克里斯托生物技术股份有限公司 用于递送cftr多肽的组合物和方法
US20230190801A1 (en) 2020-04-22 2023-06-22 Indapta Therapeutics, Inc. Natural killer (nk) cell compositions and methods for generating same
US20240299540A1 (en) 2021-02-05 2024-09-12 Iovance Biotherapeutics, Inc. Adjuvant therapy for cancer
CN117412986A (zh) 2021-04-02 2024-01-16 克里斯托生物技术股份有限公司 用于癌症疗法的病毒载体

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5665362A (en) * 1990-09-25 1997-09-09 Cantab Pharmaceuticals Research Limited Viral vaccines
US6010908A (en) * 1992-08-21 2000-01-04 The Regents Of The University Of California Gene therapy by small fragment homologous replacement
US5658724A (en) * 1992-07-31 1997-08-19 University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education Herpes simplex virus strains deficient for the essential immediate early genes ICP4 and ICP27 and methods for their production, growth and use
AU6964596A (en) 1995-09-11 1997-04-01 Arch Development Corporation Materials and methods for treating neurodegenerative diseases and for screening for candidate apoptosis inhibitors and inducers
GB9615794D0 (en) * 1996-07-26 1996-09-04 Medical Res Council Mutant herpes simplex virus strains and uses thereof
GB9700411D0 (en) 1997-01-10 1997-02-26 Univ London Eukaryotic gene expression cassette and uses thereof
GB9801930D0 (en) 1998-01-29 1998-03-25 Univ London Mutant herpes simplex viruses and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
EP1049769A2 (en) 2000-11-08
WO1999038955A3 (en) 1999-09-23
GB0020940D0 (en) 2000-10-11
CA2319669A1 (en) 1999-08-05
AU2291199A (en) 1999-08-16
US6719982B1 (en) 2004-04-13
IL137531A0 (en) 2001-07-24
GB9801930D0 (en) 1998-03-25
WO1999038955A2 (en) 1999-08-05
HK1035378A1 (en) 2001-11-23
GB2353529A (en) 2001-02-28
CN1295612A (zh) 2001-05-16
JP2002501742A (ja) 2002-01-22
GB2353529B (en) 2003-01-15
BR9907283A (pt) 2000-10-24
AU749017B2 (en) 2002-06-13

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Burton et al. Virus-based vectors for gene expression in mammalian cells: herpes simplex virus
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