KR20010037358A - Ｌ1 리파제를 생산하는 신균주 바실러스 스테아로써모필러스 Ｌ1(ＫＣＴＣ 8954Ｐ) 및 형질전환된 대장균 ＢＬ21(ＤＥ3)/ｐＳＬＥ2(ＫＣＴＣ 8955Ｐ)를 이용한 Ｌ1 리파제의 대량생산법 - Google Patents

Ｌ1 리파제를 생산하는 신균주 바실러스 스테아로써모필러스 Ｌ1(ＫＣＴＣ 8954Ｐ) 및 형질전환된 대장균 ＢＬ21(ＤＥ3)/ｐＳＬＥ2(ＫＣＴＣ 8955Ｐ)를 이용한 Ｌ1 리파제의 대량생산법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 온천수 주변토양으로부터 분리된 것으로 내열성 리파제활성능이 우수한 신균주 바실러스 스테아로써모필러스(Bacillus stearothermophilus) L1(KCTC 8954P) 및 이러한 신균주로부터 생산된 것으로 고온에서 안정한 내열성 L1 리파제 그리고, T7 프로모터를 이용하여 상기한 L1 리파제를 대량생산하는 형질전환된 대장균 BL21(DE3)/pSLE2(KCTC 8955P) 및 CM-세파로스(Sepharose) 컬럼과 DMEM-세파로스(Sepharose) 컬럼을 이용한 L1 리파제의 정제방법에 관한 것이다.

Description

Ｌ1 리파제를 생산하는 신균주 바실러스 스테아로써모필러스 Ｌ1(ＫＣＴＣ 8954Ｐ) 및 형질전환된 대장균 ＢＬ21(ＤＥ3)/ｐＳＬＥ2(ＫＣＴＣ 8955Ｐ)를 이용한 Ｌ1 리파제의 대량생산법{Discovery of Bacillus stearothermophilus L1(KCTC 8954P) producing a novel lipase and development of its efficient production method using Escherichia coli BL21(DE3)/pSLE2(KCTC 8955P)}
본 발명은 온천수 주변토양으로부터 분리된 것으로 내열성 리파제활성능이 우수한 신균주 바실러스 스테아로써모필러스(Bacillus stearothermophilus) L1(KCTC 8954P) 및 이러한 신균주로부터 생산된 것으로 고온에서 안정한 내열성 L1 리파제 그리고, T7 프로모터를 이용하여 상기한 L1 리파제를 대량생산하는 형질전환된 대장균 BL21(DE3)/pSLE2(KCTC 8955P) 및 CM-세파로스(Sepharose) 컬럼과 DMEM-세파로스(Sepharose) 컬럼을 이용한 L1 리파제의 정제방법에 관한 것이다.
리파제는 장쇄 트리글리세리드를 가수분해하여 다이글리세라이드(diglyceride), 모노글리세라이드(monoglyceride), 글리세롤(glycerol) 및 유리 지방산(free fatty acid)을 만드는 효소이다.
현재까지 많은 종류의 동물, 식물 및 미생물이 리파제를 생산하는 것으로 알려져 왔으며, 리파제의 생화학적 특성에 대한 연구와 리파제 유전자에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 리파제는 기질 특이성, 광학활성 특이성 및 위치 특이성 등의 독특한 특성을 갖고 있기 때문에 유리 지방산의 생산, 지방의 트랜스에스테르화, 유용한 에스테르 및 펩타이드의 합성을 촉매하는 산업적으로 매우 중요한 효소이다.
상기의 중요한 반응은 때때로 고온과 유기용매하에서 효과적으로 수행된다. 특히, 식품 산업에서 유리 지방산의 생산에 주로 이용되는 우지(beef tallow) 및 야자유(palm oil)는 보통의 효소 반응 온도에서는 고체 형태이기 때문에 효과적인 효소적 가공을 위해서는 고온에서 안정한 내열성 리파제가 필요하다. 또한 , 식품산업에서 안심하고 사용하기 위해서는 비독성 바실러스 유래의 효소의 사용이 유리하다.
그러나, 현재까지 개발된 내열성 리파제는 바실러스 써모카테룰라투스 (Bacillus thermocatenulatus)가 생산하는 리파제만 개발되었을 뿐, 효과적인 내열성 리파제에 대한 개발이 매우 미비한 실정이다.
이에, 본 발명자들은 유리 지방산의 생산, 지방의 트랜스에스테르화, 에스테르 및 펩타이드의 합성을 위해 유용하게 이용될 수 있고, 고온에서 안정한 내열성 리파제를 생산하는 균주를 탐색하고, 이러한 리파제를 대량생산하는 시스템을 개발함으로써, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 식품 산업에서 유리 지방산의 생산에 주로 이용되고 있는 실온에서 고체인 우지(beef tallow) 및 야자유(palm oil)의 효과적인 효소적 가공을 위해 고온에서 안정한 신규 내열성 리파제를 대량으로 제공하는데 그 목적이 있다.
도 1은 내열성 L1 리파제의 대량 생산용 재조합 플라스미드 pSLE2의 제조를 위한 모식도이다.
도 2는 형질전환된 대장균 BL21(DE3)/pSLE2에 IPTG를 처리한지 4시간 후에 대량생산된 L1 리파제 및 순수 정제된 리파제를 나타낸 사진이다.
도 3a는 L1 리파제의 열 안정성을 나타낸 그래프이고; 도 3b는 pH에 따른 L1 리파제의 활성을 나타낸 그래프이고; 도 3c는 L1 리파제의 pH 안정성을 나타낸 그래프이다.
도 4는 L1 리파제 및 캔디다 씰린드래씨이(Candida cylindracea) 리파제의 열안정성을 비교한 그래프이다.
본 발명은 신균주 바실러스 스테아로써모필러스(Bacillus stearothermophilus) L1 및 이로부터 생산되고 고온에서 안정한 내열성 L1 리파아제를 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 L1 리파제의 대량생산을 위해 형질전환된 대장균 BL21(DE3)/pSLE2 및 이로부터 생산된 리파제를 정제하는 방법을 특징으로 한다.
이와 같은 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명에서는 온천수 주변 토양을 시료로 하여 55℃에서 생육을 하고, 올리브유를 분해할 수 있는 리파제를 생산하는 바실러스 균주를 분리한 후, 분리된 균주의 형태학적 및 생화학적 특성을 통해 균주 동정을 실시하였다.
상기 분리된 신균주는 운동성의 간균 형태로 포자를 생성하였다. 또한, 신균주은 카탈라제 활성을 가지며, 글루코스를 산화하고, 전분을 가수분해하며, 7% NaCl에서는 생육하지 못하였다.
상기한 바와 같이, 신균주의 형태학적 및 생화학적 특성은 바실러스 에시도칼다리스(Bacillus acidocaldarius) 및 바실러스 스테아로써모필러스(Bacillus stearothermophilus)와 가장 유사하였다. 그러나, 생육을 위한 최저온도가 바실러스 에시도칼다리스(Bacillus acidocaldarius)의 생육 최저 온도보다 더 낮았고, 바실러스 에시도칼다리스(Bacillus acidocaldarius)는 산성 pH인 조건에서 잘 생육하는 반면에, 본 발명의 신균주는 중성 pH 조건에서 잘 생육하였다.
따라서, 본 발명의 신균주를 바실러스 스테아로써모필러스(Bacillus stearothermophilus)로 동정하였다.
또한, 상기 신균주로부터 생산되는 리파제를 암호화하는 유전자를 클로닝하고 염기배열로부터 아미노산 서열(U78785)을 유추한 결과, 29개의 아미노산으로 이루어진 신호 펩타이드 및 388개의 아미노산으로 이루어진 머추어(mature) 리파제로 구성되어 있음을 확인하였으며, 바실러스 써모카테룰라투스(Bacillus thermocatenulatus)가 생산하는 리파제와는 다른 신규 리파제로 인정되었다.
이에, 상기 신규 리파제를 생산하는 신균주를 바실러스 스테아로써모필러스(Bacillus stearothermophilus; 이하 'B. stearothermophilus'로 약함) L1으로 명명하고, 1999년 8월 18일자로 생명공학연구소 유전자은행에 기탁하고 수탁번호 KCTC 8954P를 부여받았다.
또한, 상기 신균주 바실러스 스테아로써모필러스(B. stearothermophilus) L1이 생산하는 리파제(이하 'L1 리파제'로 약함)의 특성을 조사한 결과, L1 리파제는 68℃에서 최적의 활성을 보이므로 고온에서 유리 지방산의 생산, 지방의 트랜스에스테르화, 에스테르 및 펩타이드의 합성 등에 매우 유용하게 이용될 수 있다. 또한, L1 리파제는 pH 5∼11의 넓은 범위에서 안정하고, 최적의 pH는 9∼10으로 나타났다.
특히, 식품 산업에서 유리 지방산의 생산에 주로 이용되고 있는 고체지방인 우지(beef tallow) 및 야자유(palm oil)의 효과적인 효소적 가공을 위해서는 고온에서 안정한 내열성 리파제가 필수적으로 요구되는데, L1 리파제는 상기와 같은 내열성을 갖고 있을 뿐만 아니라, 식품산업에서 널리 쓰이고 있는 비독성 바실러스 유래의 효소이기 때문에 산업적 유용성이 매우 크다.
따라서, 본 연구자들은 이와 같은 산업적 응용에 적합한 내열성 L1 리파제의 대량 생산을 위한 연구를 하였다.
즉, L1 리파제의 대량 생산을 위해 재조합 플라스미드를 제조한 후, 이러한 재조합 플라스미드를 대장균 BL21(DE3)에 형질 전환시킴으로써, 형질전환된 대장균 BL21(DE3)/pSLE2를 생명공학연구소 유전자은행에 1999년 8월 18일자로 기탁하여 KCTC 8955P를 부여받았다.
상기 형질전환된 대장균 BL21(DE3)/pSLE2를 이용하여 L1 리파제의 고발현 실험을 수행한 결과, 배양 4시간 후에는 세포내 L1 리파제의 양이 세포추출액의 리터당 132,000 U까지 증가하게 되었고, 이것은 원균주인 바실러스 스테아로써모필러스(B. stearothermophilus) L1보다 L1 리파제의 생산량이 132배 증가된 양이다.
또한, 본 발명은 형질전환된 대장균 BL21(DE3)/pSLE2으로부터 대량생산된 리파제의 효과적인 분리정제법을 확립하였다. 즉, CM-세파로스(Sepharose) 컬럼 및 DEAE-세파로스(Sepharose) 컬럼을 이용하여 L1 리파제를 순수분리하였고, 약 62%의 회수율을 보였다.
따라서, 상기의 형질전환된 대장균주를 이용한 대량발현 시스템의 리파제의 대량생산을 통하여 저가의 지방으로부터 고가의 유리지방산 생산 및 여러 가지 에스테르와 펩타이드의 합성 등에 매우 유용하게 응용되어 가격 경쟁력을 확보할 수 있다.
이하, 고온에서도 안정하게 지방을 가수분해하는 내열성 리파제를 생산하는 신균주 바실러스 스테아로써모필러스(B. stearothermophilus) L1, L1 리파제를 암호화하는 유전자 및 이러한 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드로 형질전환된 대장균 BL21(DE3)/pSLE2 및 대량생산된 L1 리파제의 정제방법에 관하여 다음의 실시예를 통하여 구체적으로 설명하는 바, 본 발명이 이들에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: L1 리파제 DNA의 클로닝 및 아미노산 서열 결정
신균주 바실러스 스테아로써모필러스(B. stearothermophilus) L1의 DNA를 제한효소 HindIII로 완전히 자른 후, 동일한 제한효소로 자르고 포스파타제(calf intestinal phosphatase)로 처리한 플라스미드 pUC19와 연결(ligation)하고, 이것을 수용성(competent) 대장균 RR1으로 형질전환하였다.
형질전환된 대장균 RR1을 암피실린(ampicillin)을 첨가한 TCN 플레이트(1% 트립톤, 0.5% 효모추출액, 0.5% NaCl, 1% 트리카프릴린(tricaprylin)(TCN), 20 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 0.5% 아라비아 고무(gum arabic) 및 1.5% 아가(agar))에 도말하고 37℃에서 24시간 배양한 후, TCN을 분해하여 투명환을 형성하는 콜로니(colony)를 얻었다. 상기 콜로니를 배양하여 플라스미드를 분리한 결과, 4.5 kb 크기의 삽입 DNA를 포함한 7.2 kb 크기의 플라스미드를 확인하고 pLIP1으로 명명하였다.
pLIP1을 대장균 RR1에 재형질 전환시킨 결과, 생성된 콜로니의 100%가 L1 리파제 활성을 나타내었다. pLIP1을 제한효소 HindIII와 NotI으로 자른 후, 동일한 제한 효소로 자른 pBluescript SK와 연결하고 대장균 RR1에 형질전환함으로써, 2.7 kb의 삽입 DNA가 포함된 pLIP2를 얻었다.
pLIP2의 2.7 kb 삽입 DNA의 염기서열분석은 시쿼네이즈 기기(Sequenase kit), M13 프라이머 및 역방향 프라이머를 사용하여 생거 다이디옥시 사슬 종결(Sanger dideoxy chain termination)방법으로 분석하였다. 맥몰리(MacMolly) 프로그램을 이용하여 서열 3 및 서열 4에 나타냈듯이, 1,254 bps(417개 아미노산)로 이루어진 L1 리파제의 개방 판독틀(open reading frame:ORF)를 찾았다. ORF는 29개의 아미노산으로 이루어진 신호 펩타이드 및 388개의 아미노산으로 이루어진 분자량이 43,125인 머추어(mature) L1 리파제로 구성되어 있다.
L1 리파제를 뷰티(Beauty) 프로그램을 이용하여 유전자은행에 있는 아미노산 서열과 비교 분석한 결과, 바실러스 써모카테눌라투스(Bacillus thermocatenulatus)가 생산하는 리파제(BTL2)와 23개의 아미노산이 다른 것으로 나타났다.
실시예 2: L1 리파제의 대량생산을 위한 재조합 플라스미드의 제조
L1 리파제를 대량으로 생산하기 위해서, 플라스미드를 도 1과 같이 제조하였다. L1 리파제 DNA를 포함하는 신균주 바실러스 스테아로써모필러스(B. stearothermophilus) L1 DNA를 주형 DNA로 하고, 합성된 서열 1 및 서열 2에 기재된 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. 제한효소 NdeI과 BamHI으로 합성된 DNA 양끝을 자른 후, 동일한 제한효소로 처리된 대량 생산용 벡터 pET-22b(+)와 함께 연결(ligation) 시킴으로써 대량 생산용 재조합 플라스미드 pSLE2를 제조하였다.
실시예 3: L1 리파제가 대량생산되는 형질전환된 대장균의 제조
재조합 플라스미드 pSLE2에는 강력한 T7 프로모터와 판독 신호가 내재되어 있어서, T7 RNA 중합효소 유전자를 갖고 있는 대장균 BL21(DE3)을 숙주로 사용하는 경우 원하는 L1 리파제의 대량 생산이 가능하다.
L1 리파제의 활성은 일정한 pH에서 올리브유가 L1 리파제에 의해 가수분해되어 생성되는 지방산의 양을 NaOH로 적정하는 pH 스태트(stat) 방법에 의해 측정하였고, 효소의 1 unit(U)은 분당 1μ㏖의 지방산을 생산하는 효소의 양으로 정의하였다.
재조합 플라스미드 pSLE2를 지니는 형질전환된 대장균 BL21(DE3)을 암피실린(100 ㎍/㎖)이 포함된 LB배지(1% 트립톤, 0.5% 효모추출액 및 0.5% NaCl)에서 OD 600 nm가 0.6으로 될 때까지 배양한 후, IPTG(최종농도 1 mM)를 배양액에 넣으면 세포내 리파제의 양이 급격하게 증가한다. IPTG를 가한 후, 균을 배양하면서 시간별로 세포내 리파제의 활성을 측정한 결과, 도 2와 같이 4시간 후에는 세포내 L1 리파제의 양이 세포 추출액의 리터당 132,000 U까지 증가하게 되었으며, SDS 전기영동상에서 분자량 43,000 위치에서 주 밴드가 나타났다.
따라서, 재조합 플라스미드 pSLE2로 형질전환된 대장균 BL21(DE3)를 대장균 BL21(DE3)로 명명하고, 이를 생명공학연구소 유전자은행에 1999년 8월 18일자로 기탁하여 수탁번호 8955P를 부여받았다.
신균주 바실러스 스테아로써모필러스(B. stearothermophilus) L1이 생산하는 L1 리파제는 TCN 플레이트상에서는 TCN을 분해하여 투명환을 형성하므로 활성을 감지할 수 있었으나, pH 적정 방법에 의해서는 활성이 측정되지 않을 정도의 양(1,000 U 미만/ℓ)이지만, 이에 비해 형질전환된 대장균 BL21(DE3)/pSLE2이 생산하는 L1 리파제의 양은 132배 이상 증가된 양이다.
실시예 4: L1 리파제의 분리 정제 방법
실시예 3에서 형질전환된 대장균 BL21(DE3)/pSLE2으로부터 대량생산된 L1 리파제를 다음과 같이 순수분리하였다.
즉, 10 mM의 포스페이트(pH 6.0) 완충액에 있는 형질전환된 대장균BL21(DE3)/pSLE2를 초음파 분쇄법으로 깬 후에, 원심분리하여 얻은 상층액을 CM-세파로스(Sepharose) 컬럼에 가한다. 염화칼륨염을 이용해서 L1 리파제를 용출시킨 후, 완충액을 10 mM Tris-HCl(pH 8.8)로 바꾸어 DEAE-세파로스(Sepharose) 컬럼에 가한 다음, 염화칼륨염을 이용하여 용출시켜 리파제를 순수분리하였다. 순수 분리된 L1 리파제의 올리브유에 대한 활성은 1,700 U/mg 이다.
형질전환된 대장균으로부터 내열성 L1 리파제의 정제
단계 전체 단백질 (㎎) 전체 활성(U) 특이적 활성(U/㎎) 정제(배) 회수(%)
세포 유리 추출물 876 128,000 146 1 100
CM-세파로스(Sepharose) 122 89,800 736 5.04 70.1
DEAE-세파로스(Sepharose) 47 79,600 1,690 11.6 62.2
실시예 5: L1 리파제의 특성
실시예 4에서 순수 분리한 L1 리파제의 특성을 다음과 같이 조사하였다.
1) L1 리파제의 특성 실험
순수 분리된 L1 리파제에 대해 pH 적정 방법으로 효소의 온도 및 pH의 영향을 조사하였다. 도 3a에 나타냈듯이, L1 리파제는 68℃에서 최적 활성을 보였고, 68℃ 이상에서는 효소활성이 급격히 감소되었다. 상기 특성은 30℃에서 최적 활성을 나타내는 반면, 55℃이상에서는 활성을 보이지 않는 식품 및 제약 산업에서 폭넓게 사용하고 있는 대표적인 시판용 캔디다 씰린드래씨이(Candida cylindracea) 리파제와 전혀 다른 특성이다(도 4).
따라서, L1 리파제는 전형적인 내열성 효소로 높은 온도에서 반응을 수행하는 다양한 생물전환 반응에 적합한 효소의 특성을 지니고 있다. 리파제의 열안정성을 측정하기 위해 각 온도에서 30분간 방치한 후, 50℃에서 효소활성을 측정한 결과, 칼슘 존재하에서 65℃까지 안정하였다.
pH를 달리하면서 리파제 활성을 측정한 결과, 도 3b에서 나타낸 바와 같이, 최적 pH가 9∼10으로 나타났으며, 다양한 pH에서 1시간 동안 방치한 후, 리파제의 잔존 활성을 측정한 결과, pH 5∼11의 넓은 범위에서 안정한 것으로 나타났다.
여러 가지 단백질 가수분해 효소 저해제로 사용되는 다이에틸 p-나이트로페닐 포스페이트(diethyl p-nitrophenyl phosphate)(E600), 페닐메틸설포닐 플루오라이드(phenylmethylsulfonyl fluoride)(PMSF), 에틸렌다이아민테트라아세트산(ethylenediaminetetraacetic acid)(EDTA) 및 요오드아세트아마이드(iodoacetamide)에 대한 L1 리파제의 활성 영향을 살펴본 결과, E600 및 요오드아세트아마이드(iodoacetamide)에 의해 약간 저해를 받았고, PMSF 및 EDTA에 의해서는 활성이 거의 저해 받지 않았다.
또한, 여러 가지 금속 이온의 영향을 살펴본 결과, 구리 이온 및 수은 이온을 제외하고는 대부분의 이온에 의해 활성이 저해되지 않았다.
한편, 계면활성제의 영향을 살펴본 결과, SDS에 의해서 가역적으로 활성이 저해되었고, 트리톤 X-100과 소듐 디옥시콜레이트(sodium deoxycholate) 같은 계면활성제에 의해서는 저해를 거의 받지 않았다.
2) L1 리파제를 이용한 트리글리세라이드, 천연 지방 및 천연 유지의 분해
트리글리세롤, 천연지방 및 천연유에 대한 L1 리파제의 상대 가수분해력
지방종류 상대 가수분해력 (%)
천연 지방 및 천연유 올리브유(olive oil) 100
야자유(palm oil) 152
우지(beef tallow) 150
코코넛유(coconut oil) 139
면실유(cotton seed oil) 138
콩기름(soybean oil) 119
옥수수유(corn oil) 109
맥아유(wheat germ oil) 87
땅콩기름(peanut oil) 75
아마인유(linseed oil) 64
트리글리세롤 트리아세틴(triacetin) 30
트리프로피오닌(tripropionin) 548
트리부티린(tributyrin) 480
트리카프로인(tricaproin) 210
트리카프릴닌(tricaprylin) 170
트리카프린(tricaprin) 210
트리라우린(trilaurin) 360
트리미리스틴(trimyristin) 240
트리팔미틴(tripalmitin) 240
트리스테아린(tristearin) 39
트리올레인(triolein) 100
트리리놀레인(trilinolein) 77
트리리놀렌인(trilinolenin) 93
L1 리파제는 상기 표 2에서와 같이 트리프로피오닌(tripropionin), 트리부티린(tributyrin) 및 트리라우린(trilaurin)에 대해 높은 가수분해력을 가졌고, 천연 지방 중 야자유나 우지 같은 고체지방을 잘 분해하였다. 상기 특성은 트리부티린(tributyrin)을 잘 가수분해하는 바실러스 써모카테룰라투스(Bacillus thermocatenulatus) 리파제와 다른 특성으로, L1 리파제의 아미노산 서열은 바실러스 써모카테룰라투스(Bacillus thermocatenulatus) 리파제와 유사하였지만, 기질 특이성이 다른 신규한 리파제임을 확인하였다.
상술한 바와 같이, 본 발명은 내열성 리파제를 생산하는 신균주 바실러스 스테아로써모필러스(B. stearothermophilus) L1 및 형질전환된 대장균 BL21(DE3)/pSLE2를 이용한 L1 리파제의 대량생산방법에 관한 것으로서, 본 발명자들이 대량생산방법을 개발하여 얻은 L1 리파제는 68℃에서 최적활성을 보이고, 실온에서 고체인 지방인 우지나 야자유에 대해 높은 가수분해 활성을 나타내므로, 이러한 저가의 지방으로부터 고가의 유리 지방산 생산 및 여러가지 에스테르와 펩타이드의 합성 등에 매우 유용하게 응용할 수 있는 효과가 있다.

Claims (6)

  1. L1 리파제를 생산하는 것임을 특징으로 하는 바실러스 스테아로써모필러스(Bacillus stearothermophilus) L1(KCTC 8954P).
  2. L1 리파제를 대량생산하는 것임을 특징으로 하는 대장균 BL21(DE3)/pSLE2(KCTC 8955P).
  3. 바실러스 스테아로써모필러스(Bacillus stearothermophilus) L1(KCTC 8954P) 또는 대장균 BL21(DE3)/pSLE2(KCTC 8955P)에 의해 생산된 것으로, 고온에서 안정한 내열성을 특징으로 하는 L1 리파제.
  4. 서열 3에 기재되어 있는 L1 리파제를 암호화하는 염기서열.
  5. 서열 4에 기재되어 있는 L1 리파제에 대한 아미노산 서열.
  6. 제 3 항에 있어서, 상기 L1 리파제는 CM-세파로스(Sepharose) 컬럼 및 DMEM-세파로스(Sepharose) 컬럼을 이용하여 분리되는 것임을 특징으로 하는 L1 리파제.
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