KR20010012875A

KR20010012875A - 약물 전달과 조직 처리를 위한 반-교차침투성 또는교차침투성 중합체

Info

Publication number: KR20010012875A
Application number: KR1019997010841A
Authority: KR
Inventors: 로버트에스. 레인저; 제니퍼에이치. 엘리스에프; 크리스티 안세스; 드렉 심스
Original assignee: 유니버시티 테크놀로지 코포레이션; 자밀라 제트. 허벡; 메사추세츠 인스티튜트 오브 테크놀로지; 데이비드 제이. 글라스; 더 제너럴 하스피탈 코포레이션
Priority date: 1997-05-23
Filing date: 1998-05-22
Publication date: 2001-02-26
Also published as: WO1998052543A1; CA2290743C; EP1011633A1; CA2290743A1; JP4343274B2; AU726890B2; US6224893B1; AU7595698A; JP2002503230A; NZ501339A; KR100537907B1

Abstract

조직 처리와 약물 전달을 위한 구성물질은 2가지 이상의 중합체 용액에 기초해 발전해 왔는데, 이 중합체들은 필요한 환자의 한 위치에 주입되어 반-교차침투성 또는 교차침투성 중합체 망을 형성한다. 이 중합체들은 그들 자신들에는 교차연결되지만 서로에게는 교차연결되지 않는다. 결과의 점성 용액은 방출이나 조직 형성이 있을 때까지 주입 위치에서 생물학적 활성 분자나 세포를 보유한다.

교차 침투 중합체 망을 형성하는 중합체-세포 현탁액으로 행해진 연구의 결과로 중합체 용액이 외인성 활성종, 전형적으로는 전자 방사선, 가급적 광에 노출되는 상황에서 생성할 수 있다. 연구는 광이 피부, 체액(활액과 같은)과 막을 투과하고 중합체 용액을 중합(화)시킬 것이다라는 것을 보여준다. 이 중합체 용액은 이온 또는 공유 교차 결합되어 하이드로겔, 반-교차침투성 중합체 망 또는 교차침투성 중합체 망을 형성할 수 있다.

Description

약물 전달과 조직 처리를 위한 반-교차침투성 또는 교차침투성 중합체{SEMI-INTERPENETRATING OR INTERPENETRATING POLYMER NETWORKS FOR DRUG DELIVERY AND TISSUE ENGINEERING}

선천성 결손(증)

특히, 요생식기 영역에서 많은 선천성 결손(증)은 수술 교정을 필요로 한다. 예에는 환류와 요실금의 치료가 있다.

매사추세츠 공대의 WO 94/25080은 주사를 통한 분리된 세포를 전달하기 위하여 투여할 수 있는 폴리사카라이드-세포 구성물질의 사용을 설명하고 있는데, 이것은 벌킹 약물로써 효과적인 새로운 조직을 형성한다. 설명되어 있는 이 중합체는, 아이러니컬하게도, 이온력, 온도, PH, 또는 이것들의 혼합체의 기능을 교차연결한다. 레프로제너시스에 의한 WO 96/40304는 투여된 중합체-세포 현탁액의 카테테르을 이용한 광중합화에 따른 공유 교차연결에 의해서 또는 수술동안 생성된 중합성 하이드로겔의 유사한 적용을 설명한다.

두개골 외형 이상형

두개골 외형 이상형은 외상성, 선천성 또는 심미성인가에 상관없이 교정을 위한 침입성 수술 기술을 필요로 한다. 또한 확대를 필요로 하는 이상형은 이질 인공삽입물을 필요로 하는데, 이 삽입물은 감염이나 정출되는 문제다 있다. 이들 결점과 불규칙성의 교정은 계속해서 힘들고 논란이 있는 문제로 남아있다(Sins, et al., reported in plastic Reconstructive Surgery 98:845(1996)).투여되는 폴리에틸렌 옥사이드-세포 현탁액로부터 신규한 연골의 형성은 이 기술이 성형외과에도 사용될 수 있다는 가능성을 제공했다.

연골 표면의 대체나 회복

노화 인구, 특히, 관절에 무리를 주는 스포츠나 직업에 있는 사람들은 연골의 회복이나 대체를 위한 재활 과정을 갖고 있지 않다. 앤스로스카픽 수술은 찢어진 연골을 제거하는데 사용될 수 있지만 고침투성이며 고통스런 수술이 거의 연골 조직이 남지않은 관절의 회복이나 대체를 위해 필요하다. 대개의 경우에, 인공삽입 기술은 인접한 관절 표면의 자유움직임을 정상적으로 가능하게 하는 연 연골 표면의 파괴이후에 전체 관절을 대체하기 위하여 사용되어야 한다. Vacanti. et al에게 부여된 U.S. Patent No. 5,514,378에서 설명되었듯이, 연골세포가 뿌려진 합성 중합성 망상 조직을 이용해 새로운 관절 표면을 만드는 것이 제안되었는데, 이 연골 세포들은 중합체가 분해되어 감에 따라, 새로운 연골을 생성한다. 비록 이것이 장래성은 있지만, 씨가 뿌려진 망상조직은 여전히 수술을 통해 이식되어야 한다.

투여될 수 있는 중합체-세포 구성물질을 향상해야 할 필요가 있는데, 이 구성물질들은 생상보성이고 분리된 세포를 주입을 통해 전달하기 위하여 생분해성이다. 주입이후 중합체-세포 현탁액을 공유 교차연결시키는 좀더 약한 침투 방법의 필요성이 있다.

따라서, 본 발명의 목적은 인공 중합체의 교차침투망에 기초하여 세포 조직과 연골 구조를 형성할 수 있도록 세포의 주입을 위한 방법과 구성물질을 제공하는 것이다.

또 다른 본 발명의 목적은 비-세포 물질을 포함한 세포 조직과 연골 구조를 형성할 수 있도록 향상된 구성물질을 제공하는 것인데, 이 비세포 물질들은 분해되고 제거되면서 병리학적 그리고 화학적으로 자연 생성된 조직이나 연골과 동일한 조직과 연골을 남긴다.

또 다른 본 발명의 목적은 주입이후, 새로운 조직의 형성을 위해 중합체-세포 현탁액을 공유 교차연결시키기 위한 구성물질과 방법을 제공하는 것이다.

발명의 요약

미국 정부는 ARO08387 NIH Fellowship 23464를 Robert S. Langer에게 허여함에 있어 특정한 권리를 가지고 있다.

이 출원은 U.S. Serial No. filed April 11, 1997, Express Mail Label No. EM290166797US에 우선권을 주장한다.

본 발명은 일반적으로 중합성 반-상호침투와 상호침투 중합체 망 구성물질과 광교차연결가능 하이드로겔을 의료치료, 특히, 관절 표면화와 성형외과와 약물의 전달에 사용하는 분야에 관한다.

도1은 감광성 기폭약과 자외선하의 기간 동안 중합체 비율(A)와 중합체 용액의 중합체 메트릭스 전환 비율(B)을 그래픽적으로 설명한다.

도2는 쥐 피부층의 피하하에서 중합성 용액의 광 중합체 비율(A), 피하와 지방하에서 중합성 용액의 광중합체 비율(B), 그리고 피하, 지방 그리고 근육하에서 광중합체 비율(C)을 이 층을 통과하는 광의 투과율에 기초하여 그래픽적으로 설명한다.

도3은 1,000과 3,400분자량의 중합체에 대하여 중합체의 평행 팽창 체적에 대한 숙신산(SAD)의 효과를 그래픽적으로 설명한다.

도4는 장시간(여러 날)동안 중합체로부터 혈정 알부민의 방출에 대한 숙신산 농도(17%, 43%, 51%, 그리고 0% SAD)의 효과를 그래픽 적으로 설명한다.

도5는 여러 날 동안 중합체로부터 로오다민의 방출에 대한 숙신산 농도(19%와 21% SAD)의 효과를 그래픽적으로 설명한다.

생상보성 중합체 골격을 이용한 조직 처리의 기술은 병든, 결손된 또는 손상된 조직에 대한 기관 대체물의 형성을 비롯해 성형수술과 관절 회복 또는 대체에 현재 사용되고 있는 인공 삽입물의 대안 물질을 만드는 방법으로 잠재성이 있다.

교차침투망("IPN")은 두 개의 구성성분과 교차 연결되어 있으나 서로에게는 그렇지 않은 망으로 정의된다. 전술된 것과 같이 한 구체내에서 인공 또는 천연 중합체의 반-교차 침투망이 손상된 세포를 위한 중합성 지지물로 사용된다. 반-교차 침투 망은 두 개의 독립된 구성 성분을 포함하는 용액으로 정의되는데, 여기서 한 구성성분은 교차 연결된 중합체이고 다른 구성성분은 비-교차 연결된 중합체다. 교차 연결된 중합체는 반-교차침투 망 구성물질의 대략 10∼90% 중량을 차지한다.

반-교차침투 중합체망은 가급적 친수성 중합체로부터 준비된다. 한 구체예에서 중합체 망에는 활성종과 상호 교차성 그룹 또는 이온적으로 상호교차성 그룹을 가진 친수성 중합체, 그리고 활성종과 이온적으로 교차결합성 그룹이 없는 친수성 중합체가 있다.

두 번째 구체예에서 세포는 중합체 용액에서 현탁되는데 이 용액은 활성 종 발생에 의해 가급적 광감성화에 의해 교차 결합될 수 있다. 이 현탁액은 새로운 조직이 형성될 위치에 주입된다. 광이 이때 피부 외부에 조사되어 주입된 중합체를 교차 연결하게 된다.

이 방법은 중합체와 광시폭약(세포에 해롭지 않는 농도에서 중량당 0.1%미만, 중량당 0.05∼0.01%시폭약 선호)의 혼합물이 누드 쥐의 피부에 조사된 1과 3mwatt/㎠ 사이의 광 당량에 노출된 직후에 교차 연결된다는 발견에 기초한다. 비록 여기서는 원칙적으로 피부 외부에 광의 투여에 대해서 논의되었지만 이것은 조직에 인접한 혈관내의 카테테르로부터 조직을 통해 부가된 광에도 동등히 적용될 수 있는데 이 조직에 중합체 세포 현탁액이 주입되거나 또는 주입된 중합체-세포 현탄액으로 회복되거나 대체될 연골 표면에 인접한 활액 공간에 주입된다.

중합체 구성 물질

중합체 구성 물질은 WO 96/40304에서 논의된 것과 같이 공유 교차결합 중합체로만 이루어지는데, 효과적이지만 비-독성인 광시폭약과 병용되면 외부 소스에 의해 제공된 광 또는 공유성 또는 이온성 또는 친수성 중합체의 혼합물을 이용해 교차 결합이 가능해지는데, 이 중합체들이 방사선에 노출될 때 여기서 현탁된 세포를 가지는 반-교차침투망이 형성된다.

이온 교차연결성 그리고 친수성 중합체

여기서 사용된 "친수성 중합체"는 0∼50。C사이의 온도에서 수용액당 적어도 10g/l의 용해도를 가전 중합체로 정의된다. 수용액에는 적은 양의 수용성 유기용매(디메틸술폭사이드, 디메틸포름아마이드, 알코올, 아세톤, 그리고 글리메스)가 포함된다.

적절한 친수성 중합체에는 폴리(에틸렌글리콜), 폴리(에틸렌 옥사이드), 부분적 또는 완전히 가수분해된 폴리(비닐 알코올), 폴리(비닐피롤리던),폴리(애틸옥사클린), 폴리(에틸렌옥사이드)-코-폴리(프로필렌 옥사이드) 블락 공동중합체(폴록사머와 메록사폴), 폴록사마인, 카르복시에틸 셀룰로스와 같은 합성 중합체, 그리고 하이드록시에틸 셀룰로스와 메틸하이드록시프로필 셀룰로스와 같은 하이드록시알킬레이트화된 셀룰로스, 그리고 폴리펩티트 같은 천연 중합체, Ficoll 폴리수크로스, 히알우론산, 덱스트란, 헤파란술페이트, 촌드로이틴 술페이크, 헤파린, 또는 알기네이트 같은 다당류 또는 탄수화물, 그리고 젤라틴, 콜라겐, 알부민 또는 오발부민 또는 공중중합체 또는 이것들의 혼합물과 같은 단백질이 있다.

여기서 사용된 것과 같이 "셀룰로스"에는 셀룰로스와 전술된 형태의 유도체가 있다. "덱스트란"에는 덱스트란과 이것의 유사한 유도체가 있다.

하이드로 겔을 형성하는데 이용될 수 있는 물질에는 조작된 알기네이트가 포함된다. 알기네이트는 헤초로부터 분리된 탄수화물 중합체인데, 이것은 W0 94/25080의 실시예에서 설명된 것과 같이 칼슘과 같은 이가 양이온에 노출시킴으로써 교차연결되어 하이드로겔을 형성하게 된다. 알기네이트는 실온, 물에서 이가 양이온의 존재하에 이온적으로 교차 연결되어 하이드로겔 메트릭스를 형성하게 된다. 하이드로겔을 형성하는데 있어 향상된 능력을 가진 조작된 알기네이트 유도체가 합성될 수 있다. 시폭 물질로써 알기네이트를 이용하는 것은 이것이 하나 이상의 소스로부터 가능하고 좋은 순도와 특성으로 가능하기 때문에 이롭다. 여기서 사용된 조작된 알기네이트라는 용어는 변형된 하이드로겔 특성을 가진 화학적으로 변경된 알기네이트를 의미한다. 자연 발생 알기네이트는 좀더 빨리 분해하는 알기네이트 중합체 유도체를 만들기 위하여 화학적으로 변형될 수 있다. 예를 들면, 알기네이트는 화학적으로 겔성 올리도당 블락의 좀더 소형 블락을 만들기 위해 화학적으로 절단된다. 그리고 선형 공동 중합체는 다른 선별된 성분(예 락트산 or E-카프로락탐)으로 형성될 수 있다.

결과의 중합체에는 이온적으로 촉매된 겔화가 가능한 알기네이트 블락, 그리고 합성 디자인에 따라 좀더 급성 분해를 낳는 올리고에스테르 블락이 있다. 다른 방법으로는 만누로닉산과 글루로닉산의 비율이 경화겔을 만들지 못하는 경우에 알기네이트 중합체가 사용될 수 있는데 이것은 소수성, 물-불안전 체인(예 ε-카프로락탐의 과합체)으로부터 파생된다.

또한 겔란 검과 같은 박테리아 다당, 그리고 카라기난과 같은 식물 다당을 포함해 일가 양이온에 노출되면 겔아되는 다당류는 전술된 알기네이트의 교차결합에 가능했던 것과 동일한 방법으로 교차 연결되어 하이드로겔을 생성할 수 있다. 일가 양이온의 존재하에 겔이 되는 다당은 가령 나트륨의 생리학적 수준을 구성하는 용액에 노출되자마자 하이드로겔을 형성한다. 하이드로겔 전구체 용액은 마니톨과 같은 비이온물질로 삼투압적으로 조절되어 투여후 겔을 형성할 수 있다.

강한 점성액이거나 또는 틱스트리픽하고 장시간 걸쳐 구조의 느린 변화를 통해 겔을 형성하는 다당이 또한 유용하다. 예를 들면 헤이겔과 같이 지속성을 가진 주입 가능 겔을 형성하는 히알우론산이 사용될 수 있다. 변형된 히알우론산 유도체가 특히 유용하다. 여기서 사용된 것과 같이 히아우론산은 자연적이고 화학적으로 변형된 히알우론산을 의미한다. 변형된 히알우론산은 교차결합과 생분해의 비율과 정도를 조정하기 위하여 선별된 화학 변이를 가지도록 디자인되고 합성될 수 있다. 예를 들면 프로피우산 또는 벤질산과 같은 상대적으로 소수성 그룹으로 에스테르화되어 중합체를 좀더 소수성이고 겔-형성하게 만들도록 변형된 히알우론산 또는 전자전이 자가-집합을 증진하기 위하여 아민이 이식된 히알우론산이 디자인되고 합성될 수 있다. 변형된 히알우론산은 압력하에서는 흐르지만 압력이 없을 때 겔 같은 구조물을 유지한다는 점에서 합성될 수 있다. 히알우론산과 히알우론산 유도체는Genzyme, Cambridge, MA and Fidia, Italy로부터 가능하다.

다른 중합성 하이드로겔 전구체에는 Pluonics^TM또는 Tetronics^TM과 같은 폴리에틸렌 옥사이드-폴리프로필렌 글리콜 블락 공동중합체가 있는데 이들은 Steinleitner et al.,Obstetrics ＆ Gynecology, 77:48=52(1991)와 Steinleitner et al.,Fertility and Sterility, 57:305-308(1992)에서 기술된 것과 같이 수소 결합이나 온도 변화에 의해 교차 결합된다. 이용될 수 있는 다른 물질에는 섬유소, 콜라겐과 젤라틴과 같은 단백질이 있다. 중합체 혼합물도 사용될 수 있다. 가령 혼합되자마자 수소결합에 겔이 되는 폴리에틸렌 옥사이드와 폴리아크릴의 혼합물이 사용될 수 있다. 한 구체예에서 5% w/w 폴리아크릴산용액과 5% w/w 폴리에틸렌 옥사이드(폴리에틸렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌) 100,000의 혼합물이 결합되어 빠르면 수초내에 겔을 형성할 수 있다.

극성 측쇄를 가진 수용성 중합체는 반대 극성을 가진 이온, 중합체가 산성 측쇄그룹을 가지면 양이온 또는 중합체가 염기성 측쇄 그룹을 가지면 음이온을 함유한 수용액으로 중합체를 반응시키면 교차결합될 수 있다. 하이드로겔을 형성하는 산성측쇄그룹을 가진 중합체의 교차결합을 위한 양이온의 예는 나트륨과 같은 일가 양이온 칼슘같이 이가 양이온 그리고 구리, 칼슘, 알루미늄, 마그네슘, 스트론티움, 바륨 그리고 틴과 같은 다가 양이온 그리고 알킬암모니움염과 같은 디트라 또는 테트라 기능성 유기 이온이 있다.

이들 양이온염의 수용액이 중합체 부가되어 연한 고팽창 하이드로겔과 막이 만들어진다. 양이온의 농도가 높을수록 또는 원자가가 높을수록 중합체의 상호교차 정도로 증대된다. 또한 중합체는 효소적으로(예 트롬빈을 지닌 섬유소) 교차 연결될 수 있다.

적절한 이온 교차결합 그룹에는 페놀, 아마인, 이민, 아마이드, 카르복실산, 술폰산과 인산염그룹이 있다. 지방족 히드록시 그룹은 여기서 공개된 반응성 그룹으로 고려되지 않는다. 카르복실레이트, 술포네이트 그리고 인산염 이온과 같은 음극성 그룹은 칼슘이온과 같은 양이온과 교차 결합할 수 있다. 칼슘이온과 알기네이트의 교차연결은 이런 형의 이온 교차연결의 전형이다. 암모니움 이온과 같은 양극성그룹은 카르복실레이트, 술포네이트 그리고 인산염 이온과 같은 음극성 그룹과 교차결합할 수 있다. 가급적 음극성 이온은 하나이상의 카르복실레이트, 술포네이트 또는 인산염 그룹을 가진다.

순응성이 있는 하이드로겔을 형성할 수 있는 변형된 알기네이트와 다른 음이 중합체가 세포를 캡슐로 싸는데 사용된 구체예에서 하이드로겔이 적절한 양이온과 중합체를 교차연결함으로써 생산되고 하이드로겔 결합력은 양이온이나 중합체의 농도를 증가시킴에 따라 증가한다. 적게는 0.001M의 농도에서 알기네이트가 교차결합되는 것이 밝혀졌다. 더 높은 농도는 염의 독성에 의해 제한된다.

하이드로겔을 형성하는 중합체의 교차 결합을 위한 선호되는 음이온에는 저분자량 다카르복실산, 예를 들면 테레프탈산, 술페이트 이온 그리고 카르보네이트 이온과 같은 일가, 이가 또는 삼가 음이온이다. 양이온에서 기술된 것과 같이 이들 음이온 염의 수용액이 중합체에 부가되어 연한 고팽창 하이드로 겔과 막이 형성된다.

다양한 다중 양이온이 중합체 하이드로겔을 반-투과성 표면막으로 복합시켜 안정화시키는데 사용된다. 사용될 수 있는 물질의 예에는 아마인이나 이민 그룹과 같은 기본 반응 그룹을 가진 3,000∼100,000사이의 폴리에틸렌이민과 폴리리신과 같은 선호되는 분자량을 가진 중합체가 있다.

이들은 상업적으로 이용 가능하다. 한 다중 양이온은 폴리(L-리신)이다: 합성 폴리아민의 예는: 폴리에틸렌 이민, 폴린(비닐아민), 그리고 폴리(알릴 아민)이다. 다당, 치토산과 같은 천연 다중양이온도 있다.

중합체 하이드로겔위에 기본 표면 그룹과의 반응에 의해 반-투과성 막을 형성하는데 사용될 수 있는 다중음이온에는 아크릴산, 메타크릴산, 그리고 아크릴산 유도체의 중합체와 공동 중합체, 술포네이트된 폴리스틸렌 그리고 카르복실산 그룹을 가진 폴리스틸렌과 같은 펜던트 SO₃H를 가진 중합체가 있다. 이들 중합체는 활성종 중합성 이온 교차결합성 그룹을 보유하도록 변경될 수 있다. 친수성 중합체가 이들 그룹을 포함하도록 변형하는 방법은 당업자에게 잘 공지되어 있다.

중합체는 내재적으로 생분해성이지만 저분해성(분해의 예상에 대한)이면서도 유출이 가능한 충분히 적은 분자량이 선호된다. 인간(또는 이용될 수 있는 다른 종)에서 유출이 가능한 최대 분자량은 중합체 형에 따라 다르긴 하지만 대략 20,000달톤이하일 것이다. 사용되기는 하지만 내재적 생분해성 때문에 폴리펩티드, 폴리누클레오티드, 그리고 분해서 다당을 포함한 수용성 천연 중합체와 합성 대체물 또는 유도체등은 일반적 사용 목적으로는 덜 선호된다.

중합체는 분자량이 적어도 600이상, 2000 좀 더 선호되고 가장 선호되는 것은 적어도 3000이상 되는 단일블락일 수 있다. 다른 방법으로는 중합체는 다른 그룹이 결합하는 두 개 이상의 수용성 블락일 수 있다. 이런 결합그룹에는 생분해성 결합, 중합성 결합, 또는 둘 모두가 포함될 수 있다. 예를 들면, 말레산, 푸알산, 그리고 아코니틱산과 같은 비포화 다칼그복실산과 같은 비포화 다카르복실산은 폴리에틸렌 글리콜과 같은 하이드록시 그룹을 함유한 친수성 중합체로 에스테르화되거나 폴록사인과 같은 아민 그룹을 함유한 친수성 중합체로 아미드화될 수 있다.

공유 교차 연결성 중합체 용액

공유 교차연결성 히이드로겔 전구체도 역시 유용하다. 예를 들면, 치토산과 같은 수용성 폴리아민은 폴리에틸렌 글리콜 디이소티오시아나이트과 같은 수용성 디이소티오시아나이트와 교차연결될 수 있다. 이소티오시아나이트는 아민(예, 폴리에틸렌 글리콜 디알데하이드)과 반응해 화학적으로 교차연결된 겔을 형성하게 된다. 아민(예, 폴리에틸렌 글리콜 디알데하이드)과 알데하이드 반응역시 사용될 수 있다. 가수분해된 수용성 중합체역시 사용될 수 있다.

다른 방법으로는, 급성 시폭약과 접촉한 직후 급성 반응에 의해 교차연결되는 대체물을 포함하는 중합체가 사용될 수 있다. 예를 들면, 광화학적으로 교차연결될 수 있는 에틸렌화된 비포화 그룹을 포함한 중합체가 WO93/17669에서 공개된 것과 같이 사용될 수 있는데, 이것의 공개는 여기 참고문헌에 포함되어 있다. 이 구체예에서, 적어고 하나의 수용성 부분, 생분해성 부분, 그리고 두 개 이상의 자유 급성-중합체화 부분을 보유한 수용성 고분자 물질이 제공된다. 이 고분자 물질은 광감성 화학물질이나 광에 누출됨으로써 생성된 자유 기근에 중합가능 부분의 노출에 의해 중합체화된다. 이런 고분자 물질의 예에는 PEG-올리고아크릴-아크릴레이트가 있는데, 여기서 아크릴레이트는 에오신 염료와 같은 급성 시폭계를 사용하거나, 또는 자외선과 가시광선에 잠시동안의 노출을 통해서 중합체화된다. 또한, 광화학적으로 교차연결될 수 있는 치나모일 그룹을 포함한 수용성 중합체가 Matsuda et al., ASAID Trans., 38:154-157(1992)에서 공개된 것과 같이 사용될 수 있다.

"활성종 중합가능성 그룹"이란 용어는 부가적 공유 결합을 형성해 활성종에 노출된 직후 중합체 교차연결을 야기하는 능력을 가진 반응성 기능 그룹으로 정의된다. 활성종에는 자유 기근, 양이온, 그리고 음이온에 있다. 적절한 자유 급성 중합가능 그룹에는 비닐 에테르, 알릴 그룹, 비포화 모노카르복실산, 비포화 디카르복실산, 그리고 비포화 트리카르복실산과 같은 에틸렌화된 비포화 그룹이 있다. 비포화 모노카르복실산에는 아크릴산, 메타크릴산과 크로톤산이 있다. 비포화 디카르복실산에는 말레산, 푸말산, 이타콘산, 메사콘산 또는 시트라콘산이 있다. 한 구체예에서, 활성종 중합가능 그룹은 친수성 중합체의 하나이상의 말단에 위치한다. 또 다른 구체예에서, 활성종 중합가능 그룹은 개개의 블락을 구성하는 친수성 중합체를 가진 블락 공동중합체내에 위치한다. 선호되는 중합가능 그룹에는 아크릴레이트, 디아크릴레이트, 올리고아크릴레이트, 디메틸아크릴레이트, 올리고메타아크릴레이트, 그리고 다른 생물학적으로 가능한 광중합성 그룹이 있다. 아크릴레이트는 가장 선호되는 활성종 중합가능 그룹이다.

일반적으로, 중합체는 물이나, 버퍼 염 용액, 또는 수용성 알코올 용액과 같은 수용액에서 적어도 부분적으로 수용성을 띤다. 전술된 다른 중합체의 합성을 위한 방법이 당업자에게 공지되어 있다(참고. Concise Encyclopedia of Polymer Science and Polymeric Amines and Ammonium Salts, E. Goethals, editor (Pergamen Press, Elmsford, NY 1980)). 폴리(아크릴 산)와 같은 많은 중합체가 상업적으로 이용가능하다. 자연발생 또는 합성 중합체는 당업자에게 가능하고 in March, "Advanced Organi Chemistry," 4th Edition, 1992, Wiley-Interscience Publication, New York에서 기술된 것과 같이 화학반응을 이용해 변형될 수 있다.

가급적, 활성종이나 교차연결성 그룹을 포함한 친수성 중합체는 적어도 1.02 중합가능 또는 교차연결가능 그룹을 평균적으로 보유하고, 더 선호되는 것은 각각이 두 개 이상의 중합가능 또는 교차연결가능 그룹을 평균적으로 보유하는 것이다. 각각의 중합성 그룹이 체인으로 중합하기 때문에, 교차연결된 하이드로겔이 중합체당 하나보다 좀더 많은 반응성 그룹(즉, 평균적으로 대략 1.02 중합가능 그룹) 중합가능을 이용해 생산될 수 있다. 하지만, 더 높은 퍼센트가 선호되고 우수한 겔이 중합체 혼합물에서 얻어질 수 있는 데, 이 혼합물내 대개의 또는 모든 분자가 두 개 이상의 반응성 이중 결합을 가진다. 친수성 중합체의 전형인 폴록사민은 네 개의 팔을 가지고 있어서 점진적으로 네 개의 중합성 그룹을 가지도록 변형될 수 있다.

광시폭약

중합화는 광시폭약을 사용해 시작되는 것이 좋다.

자외선에 노출위에 활성종을 발생시키는 광시폭약은 당업자에게 잘 공지되어 있다. 활성종은 또한 상대적으로 약한 방식으로 특정 염료와 화학 복합물의 광 흡수로부터 형성될 수 있다.

이들 그룹은 자외선에 노출된 직후 활성종을 발생시키는 광시폭약을 사용해 또는, 가급적, 장파 자외선(LWUV)또는 가시광선을 사용해 중합화될 수 있다. LWUV와 가시광선이 자외선보다 조직과 다른 생물학적 물질에 적은 손상을 주기 때문에 선호되고 있다. 적절한 시폭약은 세포독성없이 많아야 수분 그리고 수초가 선호되는 짧은 시간동안, 고분자 물질의 중합화를 시작하는데 사용될 수 있다.

염료와 아민과 같은 보조촉매제의 가시또는 LWUV 광에 대한 노출을 퉁해 활성종이 생성된다. 염료에 의한 광흡수가 염료가 트리플렛 상태를 가지도록 하고, 이 트리플렛 상태는 연이어 아민과 반응해 중합화를 시작하는 활성종을 형성한다. 중합화는 가장 선호되는 장파 자외선 범위 또는 가시광선내의 200-700㎚사이 파장, 또는 320㎚이상, 그리고 가장 선호되는 365와 514㎚의 광의 방사에 의해 개시될 수 있다.

수많은 염료가 광중합화를 위해 사용될 수 있다. 적절한 염료는 당업자에게 잘 공지되어 있다. 선호되는 염료에는 에리티로신, 필록시민, 로즈 벤갈, 티오닌, 캠폴퀴논, 에틸 이오신, 이오신, 메틸렌 블루, 리보플라빈, 2,2-디메틸-2-페닐아세톤페논, 2-메톡시-2-페닐아세토페논, 2,2-디메톡시-2-페닐 아세토페논, 다른 아세토페논 유도체, 그리고 캠폴퀴논이 있다. 적절한 보조촉매제에는 N-메틸 디에타노아민, N,N-디메틸 벤질아민, 트리에타놀 아민, 트리에틸아민, 디벤질아민, N-벤질에타노아민과 같은 아민이 있다. 트리에타놀아민이 선호되는 보조촉매제다.

이들 중합체 용액의 광중합화는 중합체와 광시폭약의 혼합물(세포에 독성이되지 않는 농도로, 중량당 0.1%미만, 중량 퍼센트 시폭약당 0.05와 0.01% 사이 가장 선호)이 누드 쥐의 피부에 부가되는 1과 3 mWatts/㎠사이 광당량에 노출된 직후 교차연결될 것이다.

도1은 중합화 비율에 비교할 때 시간동안의 중합체 용액의 전환의 정도를 보여준다.

세포의 소스

세포는 공여체로부터, 공여된 세포의 배양된 세포로부터, 또는 기존의 세포 배양 계통으로부터 직접적으로 얻어질 수 있다. 제출된 구체예에서, 동일종의 그리고 가급적 면역학적으로 소개된 세포가 환자나 밀접한 친지로부터 생체검사에 의해 얻어지는데, 이들은 표준 조건을 이용한 배양에서 군집되도록 성장하고 필요에 따라 이용된다. 면역학적으로 분명한 개체의 인간 근육세포와 같이 면역반응을 분명하게 나타내는 세포가 사용되면, 수용체는 스테로이드나 사이클로스포린과 같은 면역억제제의 계획을 이용해 필요에 따라 면역억제될 수 있다. 하지만, 가장 선호되는 구체예에서, 세포는 공여체로부터 직접적으로 얻어진 후, 세척되고 중합체 물질과 병용하여 직접적으로 이식된다. 이 세포는 조직배양의 분야에 지식을 가진 자에게 공지된 기술을 이용해 배양된다. 생체검사를 통해 얻어진 세포는 수확되고 배양된 후 오염 세포를 제거하기 위하여 필요에 따라 사멸된다. 연골세포와 근육세포의 분리는 WO94/25080에서 나타나 있는데, 이것의 공개는 여기에 포함되어 있다.

세포 부착과 생존은 스캐닝 전자 현미경, 조직학, 그리고 방사성 동위원소로의 양적 평가를 이용해 평가될 수 있다. 이식된 세포의 기능은 위의 기술과 기능 분석을 병용하여 결정될 수 있다. 예를 들면, 간세포의 경우에, 생체내 간의 기능 연구가 캐뉼러를 수용체의 공통 담관속으로 위치시킴으로써 실행될 수 있다. 담즙이 증강내에서 수거될 수 있다. 담즙 색소가 P-글루쿠로니다제로 처리되거나 처리되지 않고 디아조트화된 아조디필롤 에틸란티라니레이트와 반응하여 아조디필롤로 전환된 뒤 유도되지 않은 테트라필롤을 찾는 고압 액 크로마토그래피나 엷은 막 크로마토그래피에 의해 분석될 수 있다. 이중 결합되고 단일 결합된 빌리루빈이 또한 결합된 담즙 색소의 알칼린메탄놀화 이후 엷은 막 크로마토그래피에 의해 결정될 수 있다. 일반적으로, 기능하는 이식된 간세포의 숫자가 증가할수록, 결합하는 빌리루빈의 수준이 증가할 것이다. 알부민 생산과 같은 간단한 간 기능 시험이 혈액 샘플에서 시행될 수 있다.

유사한 기관 기능 연구가 이식이후 세포 기능의 정도를 결정하기 위하여 필요한 당업자에게 공지된 기술을 이용해 시행될 수 있다. 가령, 췌장의 도세포가 간세포를 이식하기 위하여 특이적으로 사용된 것과 유사한 방식으로 당뇨를 치료하기위한 인슐릴의 적절한 분비에 의한 글루코스 조절을 성취하기 위하여 사용될 수 있다. 다른 내분비 조직이 또한 이식될 수 있다. 단백질 분석을 이용한 연구뿐만 아니라 표지된 글루코스를 이용한 연구가 중합체 골격위의 세포 집단을 정량화하기 위하여 시행될 수 있다. 세포 집단의 이들 연구는 적절한 세포 집단이 어떤 것인가를 결정하기 위한 세포 기능 연구화 연관될 수 있다. 언골세포의 경우에, 기능은 주변 결부된 조직을 위한 적절한 구조적 서포트를 제공하는 것으로 정의된다.

이 기술은 유전적으로 조작된 세포를 포함해 다중 세포유형을 대규모 세포의 효율적인 전달을 위해 그리고 새로운 조직이나 조직 대응물을 창조하는 목적을 위한 이식편의 증진을 위해 삼-차원 골격내에서 제공하는데 사용될 수 있다. 새로운 조직이나 조직 대응물이 숙주 면역계를 배제해 성장하는 동안, 이것은 또한 세포 이식의 면역보호를 위하여 사용될 수 있다. 전술된 것과 같이 이식될 수 있는 세포이 예에는 연골세포와 연골을 형성하는 다른 세포, 골세포와 뼈를 구성하는 다른 세포, 근육세포, 섬유세포, 기관 세포가 있다. 여기서 사용된 것과 같이 "기관 세포"에는 간세포, 도세포, 내장 기원의 세포, 신장으로부터 유래된 세포, 그리고 물질을 합성하고 분비하고 대사하는 역할을 하는 다른 세포가 있다.

중합체 현탁액에 부가된 생물학적 활성 물질

중합체 용액은 약물전달을 위해 사용될 수 있다. 중합체 용액으로 통합되는 물질의 예에는 단백질, 다당류, 핵산 분자, 그리고 합성 유기 또는 비유기 분자가 있다. 이들은 치료요법, 예방, 또는 진단 목적을 위해 유용하다. 약물에는 항생제, 항바이러스제, 화학치료 약물, 항-혈관형성 약물, 호르몬, 혈관흐름에 영향을 주는 약물, 항-염증제, 그리고 많은 일상적으로 사용되는 다른 것들이 포함될 수 있다.

중합성 메트릭스는 체액인자와 결합하여 세포 이식과 이식편을 증진할 수 있다. 가령, 중합성 메트릭스는 항-혈관형성 약물, 항생제, 항염증제, 생장인자, 분화를 유도하는 복합물, 세포배양의 분야에 지식을 가진 자에게 공지된 다른 인자와 병용될 수 있다.

예를 들면, 체액 인자가 이식체의 형성이나 이식 이전에 세포-중합체 현탁액과 느린-방출 형태로 혼합될 수 도 있다. 다른 방법으로는 하이드로겔이 분리된 세포 현탁액과 병용되기 전에 체액인자나 신호 인지 서열과 결합하도록 변형될 수 도 있다.

이온성 그리고 공유성 교차연결 중합체의 혼합

제출된 구체예에서, 중합체 용액이 두 개 이상의 중합체로 구성되는데, 이것들은 교차연결해 반-교차침투망을 형성한다. 가령, 혼합물에는 제출된 구체예에서 공유 교차연결 중합체 중량당 10과 40%사이의 범위내에서 이온적으로 교차연결가능한 PEO, 그리고 디아메타크릴화된 PEO가 있다. 다른 방법으로는 두 개의 공유 교차연결 중합체의 혼합물이 그들은 교차연결된 단일성중합체를 형성하지만 서로에게는 그렇지 못하다는 원칙하에 선택ㆍ사용될 수 있다. 반-교차침투성망의 이점은 비-교차연결된 중합체의 확산이 유리한 분해 성질을 제공할 수 있고 기계적 성질, 특히 성형수술에서 사용을 위한 성질을 강화할 수 있다는 것이다.

세포 현탁액

가급적, 중합체는 수용액에서(0.1M 인삼염 칼륨 용액이 선호, 물리학적 PH) 중합체 하이드로겔을 형성하는 농도에 분해되는 것이 좋다. 분리된 세포는 중합체 용액에서 1과 50 million cells/㎖(10과 20 million cells/㎖사이 선호)사이의 농도에 현탁된다.

이식의 방법

제출된 구체예에서, 전달되는 분자나 세포가 중합체 용액과 혼합되고 하이드로겔을 형성하는 중합체의 교차연결이전에 분자나 세포를 이식하기 적당한 위치로 직접 주입된다.

분자 또는 세포가 주입되는 위치는 분자의 필요량이나 세포수가 그러하듯이 개개의 필요에 따라 결정된다. 기관 기능을 가진 세포, 예를 들면, 연골세포나 도세포를 위해, 이 혼합물은 장간막, 피하조직, 복막, 프로페리토니얼 부분, 근육내 부분에 주입될 수 있다. 연골의 형성을 위하여, 세포는 연골형성이 필요한 위치로 주입된다. 주입되는 용액을 형성하기 위해 외부틀이 사용될 수 있다. 다른방법으로는 중합화의 비율을 조절함으로써, 점토가 형성되는 것과 같이 세포-하이드로겔 주입 이식물이 형성될 수 있다. 다른 방법으로는, 혼합물이 틀에 주입되어, 하이드로겔이 굳어지고, 물질이 이식되게 된다.

현탁액이 주사기나 바늘을 이용해 직접 확장성 약물이 필요한 특정위치(다시 말하면, 선천성 또는 후천성 질병으로 인한 또는 외상, 화상등에 뒤이은 근육 비활동성 위축에서 보이는 것과 같은 연골 조직 기형)에 주입될 수 있다. 이것의 예에는 신경 손상에 이차적인 근육 비활동성 위축을 가진 환자의 상위 토르소부위에 현탁액이 주입되는 것이다.

현탁액은 또한 선천적인 또는 후천적인, 또는 외상이나 화상에 뒤이은 뼈 또는 연골 결손과 같은 경질 조직 결손을 위한 확장성 약물로써 주입될 수 있다. 이것의 예는 화상에 뒤이은 뼈 이상이 존재하는 두개골을 둘러싼 부분에 주입되는 것이다. 이런 경우의 주입은 국부적 또는 전신 마취하에서 바늘이나 주사기를 이용해 필요한 부위에 직접적으로 이루어질 수 있다.

현탁액은 바늘을 교정관내에 위치시키거나, 투입되는 확장성물질로 동일물을 폐쇄해 환자를 불임으로 만드는 것과 같은 직접 촉진에 의해 경치로 주입될 수 있다. 현탁액은 캐테테르를 통하여 또는 투시기, 소노그래픽, 컴퓨터 단층조영술, 자기 공명상 또는 다른 형태의 방사성 가디언스를 지닌 바늘을 통하여 주입될 수 있다. 이것에 의해 확장성 약물이 필요한 신체내의 특정 기관이나 다른 조직 부위에 혈관접근이나 경피 접근방식으로 이 물질의 위치나 주입이 가능해 해진다.

또한 이 물질은 어떤 복강내, 복강외 또는 흉부 기관에 복강경이나 또는 흉부경에 의해 주입될 수 있다. 예를 들면, 이 현탁액은 위식도 역류를 치료하기 위해 위식도 접합점의 부위에 주입될 수 있다. 이것은 위식도 부위의 식도부분에 흉부경으로 또는 위식도 부위의 위부분에 복강경으로 이 물질을 주입해 실행된다.

이 물질은 방광뇨관역류를 치료하는데 사용될 수 있다. 역류의 내강경 치료를 위한 사용과 더불어 주입가능 자가조직성 근육세포계가 다른 의학 상태, 예를 들면, 요실금과 직장실금, 음성장애, 성형 복구, 그리고 주입가능 영구 생보성 물질이 필요한 경우의 치료에 적용될 수 있다. 주입을 통하여 분리된 세포를 전달하는 주입가능 중합체를 사용하는 방법은 WO 94/25080에 예로써 설명되어 있다.

역류와 실금의 치료를 위한 세포-중합체 현탁액의 사용과 더불어, 이 현탁액은 복구 수술을 포함한 생상보성 영구 주입가능 물질이 필요한 경우 신체내 어느 곳이나 적용될 수 있다. 현탁액은 내강경으로, 예를 들면, 음성장애 치료를 위한 성대로의 주입을 위한 후두경의 사용을 통해서, 또는 환자 불임을 위한 방법으로 난관으로의 주입을 위한 자궁경의 사용을 통해서, 또는 직장 괄약근 부위내에 물질을 주입해 괄약근 부위에 저항을 증가시키고 환자가 배설 억제하도록 하기 위해 직장경을 통해서 투입될 수 있다.

이 기술은 다른 목적으로 사용될 수 있다. 예를 들면, 맞춤-틀된 세포 이식체가 삼차원 조직 결손에 사용될 수 있다. 예를 들면, 인간 귀의 틀이 만들어 질 수 있고 연골세포 하이드로겔 복제물이 상실된 귀를 복구하도록 만들어져 이식될 수 있다. 세포는 주입을 통하여 전달될 수 있는 삼 차원 구조의 형태로 이식될 수 있을 것이다.

활성종 발생기의 응용

광중합성 중합체를 이용한 제출된 구체예에서, 광이 중합체 현탁액이 주입된 조직의 외부에 부가된다. 생물학적 활성 분자나 세포는 활성종 발생기, 가급적 광활성화에 의해 교차연결될 수 있는 중합체 현탁액에서 현탁된다. 이 현탁액은 새로운 조직이 생성되거나 약물이 방출되는 위치에 주입된다. 광은 이때 주입된 중합체를 교차연결하기 위하여 피부의 외면에 부가된다. 이 방법은 중합체와 광시폭약(세포에 독성이 되지 않은 농도에서, 중량당 0.1% 미만으로, 중량 퍼센트 시폭약당 0.05과 0.01%사이가 더욱 선호)의 혼합물이 누드 쥐의 피부에 부가된 1과 3mWatt/㎠사이의 광 당량에 노출된 직 후 교차연결할 것이다. 비록 원칙적으로 피부외부의 광 소스의 투여에 관해 원칙적으로 논의되긴 했지만, 이것은 조직을 통해, 예를 들면, 중합체 현탁액이 주입된 조직에 인접한 혈관내, 또는 주입된 중합체-세포 현탁액으로 회복되거나 대체되는 연골 표면에 인접한 체액공간내 키테테르로부터 부가된 광에도 똑 같이 적용될 수 있는 것으로 해석되어야 한다.

침투의 깊이는 광중합화를 야기하기 위하여 사용된 광 파장에 의해 조절될 수 있다. 가령, 가시광선은 자외선보다 더 깊이 조직속으로 침투한다. 조직을 통한 침투는 마이크로부터 1㎝까지 다양한데, 1㎝는 가시광선일 경우에 발생한다. 제출된 구체예에서, 200에서 700㎚ 파장의 방사선이 활성을 만들고 망을 중합화하기 위하여 사용된다.

최소 0.01 mW/㎠ 강도가 중합화를 유도하기 위해 필요하다. 최대 광 강도는 방사선 파장에 따라 1부터 1000mW/㎠까지 다양하다. 더 높은 광 강도는 단파 자외선보다 더 적은 조직/세포 손상을 일으키는 더 긴 파장의 가시광선에 노출될 수 있다. 치아에 사용될 때는 블루 광(470-490㎚)이 임상적으로 100에서 400mW/㎠의 강도에서 사용된다.

방사선의 강도는 중합체-세포 현탁액의 주입의 경우에 세포 노출을 최소화하기 위해 조절된다. 누드 쥐에서. 세포는 1에서 3 mW/㎠ UVA 광에 노출되었다. 이것이 조직을 통과할 때 조직의 두께와 방사선 강도의 감소를 인식함으로써, 세포가 노출되는 광 강도를 예상하고 조절할 수 있다. 세포-중합체 현탁액을 활성종과 중합체의 형성하기 위하여 필요한 최소 강도의 광에 노출시키는 것이 바람직하다.

언급된 참고문헌의 방법은 당업자의 기술과 일반적 지식범위내 수준을 암시한다. 필요한 정도에 따라, 참고문헌이 여기에 포함되어 있다.

적절한 경우, 다음의 정의가 사용된다.

여기서 사용되는 "전자 방사선"은 X-레이, 자외선, 가시광선, 적외선, 극적외선, 마이크로파와 방사성-파장을 포함하나 여기에 한정되지는 않는 전자 스펙트럼의 에너지파을 의미한다.

여기서 사용되는 "가시 광선"은 적어도 대략 4.0 x 10^-5㎝의 파장을 가진 에너지파를 의미한다.

여기서 사용되는 "자외선"은 적어도 대략 1.0 x 10^-5㎝에서 7.0 x 10^-5㎝미만의 파장을 갖는 에너지파를 의미한다.

여기서 사용되는 "적외선"은 적어도 대략 1.0 x 10^-5㎝에서 4.0 x 10^-5㎝미만의 파장을 갖는 에너지파를 의미한다.

여기서 사용되는 "청색광"은 적어도 대략 4.5 x 10^-5㎝ 에서 4.9 x 10^-5㎝미만의 파장을 갖는 에너지파를 의미한다.

여기서 사용되는 "방사선 소스"는 방사성 소스를 의미한다(위에서 정의된 것과 같이). 예에는 전등, 태양, 청색등, 그리고 자외선등이 있다.

본 발명은 다음의 실시예를 참고하면 더욱 이해될 것이다.

실시예1: 생체외 실험

생체외 실험이 중합화 비율과 피부, 지방 그리고 근육아래의 중합화 깊이에 대한 양적 데이터를 획득함으로써 이루어졌다.

먼저, 광 강도가 피부에서 측정되었다. 피부가 쥐로부터 수확되었고, 광중합화가 피하지방이 없는상태, 피하지방이 있는 상태 그리고 피하지방과 근육이 있는 상태에서 시험되었다.

표1. 쥐 피부의 다른 수준의 광감도와 광투과에 대한 파장의 효과에 대한 실험적 측정

광 강도가 결정된 후에, 다양한 두께 피부층하의 광중합화를 유도하기 위한 능력이 평가되었다. 양 말단(Shearwater Polymers, Huntsville, AL)에 메타크릴레이트 그룹으로 캡슐된 폴리(에틸렌 글리콜)(MW 3400, Polysciences, Warrington, PA)가 U.S. Patent No. 5,567,435 to Hubbel et al에서 설명된 것과 같이 자외선 청색광과 가시광선으로 중합화 되었다. 광칼로리 메타 액세스(Perkin Elmer, Norwalk, CT)가 설치된 분화 스캐닝 칼로리메타가 피부층 아래에서 광중합하고 중합화 비율을 얻기 위하여 사용되었다.

도2는 피하하에서(A), 피하와 지방하에서(B), 그리고 피하와 지방과 근육(C)하에서 중합가능 용액의 광중합화의 비율을 예견하고 있다. 그래서, 중합화 시간이 광의 파장, 주입 깊이, 입사광의 강도, 그리고 시폭약 형태와 농도에 따라, 수초에서 수분까지 변할 수 있다. 심지어 최소한의 광전송(예, 피부 표면에 100mW/㎠, 근육내 층에서 대략 0.6mW/㎠)으로도 중합화가 발생한다. 근본적으로, 중합화는 주입된 중합체 용액에 도달하는 광 강도가 적어도 0.01mW/㎠이상 일 때 가능하다. 광 희석의 주요 영향은 중합화 시간의 증가와 중합화 비율의 감소이다.

실시예2: 생체내 실험

누드 쥐에서 실시예 1에서 설명한 것과 같이 DMA를 함유한 중합가능 용액이 피하를 통해 주입되었고 4분당 3-5mW/㎠의 강도로 매질 배드로부터 UVA광에 노출되었다. 결과의 하이드로겔은 촉진되었고 액체에서 고체로 중합화가 결정되었다. 광에 노출되지 않은 조절체는 중합화하지 않았다. 중합화를 더욱 활실히 하기 위하여 쥐는 희생되어 하이드로겔과 주변 피부와 조직이 절제되었다. 중합화가 물에서 하이드로겔을 팽창시킴으로써 확인되었다.

실시예3: 약물 전달 운반체

숙신산과 폴리(에틸렌 옥사이드)그리고 디메타아크릴레이트(PEOD)의 메타아크릴레이트된 혼합 무수물의 동상이 하이드로겔의 방출확대를 위해 유용하다. 이것이 PEO망의 교차연결 밀도를 증가시킨다. PEO의 메타아클릴레이트에 결합하는 에스테르 결합에 더하여, 불안전 무수물 결합이 결과로 발생한 하이드로겔에 존재해 가수분해가 일어나는 기작과 비율을 증가시킨다.

이 예는 광중합화된 숙신산 무수물/PEO 중합체의 생성과 이 중합체로부터 복합물의 방출을 설명한다. 이 예는 다음: A)숙신산과 중합가능 메타아크릴레이트 그룹의 혼합, B)숙신 디메타아클릴레이트와 PEOD의 중합가능 용액과 방출 복합물의 혼합, C)팽창 시험, D)장시간 방출측정으로 나뉘어 진다. PEOD는 1,2-(디하이드록시에틸렌)비사크릴아마이드와 디앨릴-탈탈디아마이드로 또한 공동겔화 된다.

A. 숙신 디메타아크릴레이트(SAD) 만들기

숙신산은 무수물성 디메틸 술폭사이드(DMSO, Aldrich, Steizenhofen, Germany)에서 용해되었고 가도한 메타클릴 무수물이(Aldrich, Steizenhofen, Germany)가 부가되었다. 반응 혼합물은 아르곤으로 불순물이 제거되었고 40℃에서 24h동안 가열되었다. 반응 혼합물은 실온으로 냉각되었고 10 ×이상의 에테르에 부가되어 침전된다. 침전물은 진공필터되었고 진공하에서 건조되었다.

적외선 분광경이 숙신산 카르복실산 그룹의 대체를 관측하는데 사용되었다. 미타아크릴 무수믈과 반을 전후 숙신산의 적외선 분광의 비교를 통해 3100㎝^-1를중심으로해서 광범위한 산 피크의 소멸(즉, 숙신산 카르복실산 그룹의 소멸을 보여주는)이 발견되었다.

B. 중합가능 용액에서 방출 복합물의 혼합

MW's 1000(Polysciences, Warrington, PA) and 3400 (Shearwater Polymers, Huntsville, AL)의 PEOD가 중합가능 용액으로 사용되었다. 다양한 퍼센터의 PEOD와 숙신 디메타아크릴레이트(SAD)가 물에서 용해된 후 대략 100㎎ 중합가능 용액을 이용해 50/50%w/v중합가능 용액이 형성되었다. 40%이상의 숙신 디메타아크릴레이트를 함유한 중합가능 용액은 SAD형성하기 위한 광중합화 이전 2-4초 동안 핫 평판위에서 가열된다.

소 혈청-알부민(BSA, Sigma, Steizenhofen, Germany)이 50/50% w/v 중합가능 용액에 부가되고 볼텍스되었다. 중합체 용액은 연이어 3mL PBS내에 HPK(급성 광활성 시폭약)존재하에서 대략 10초동안 자외선(EFOS 울트라큐어)에 노출되었다.

이 겔이 37℃에서 배양되었다. 다양한 시점에서 PBS가 제거되고 3㎖ 신규 PBS가 부가되는 동안 동결되었다. 로다민이 유사한 방식으로 캡슐화되었다.

C. 팽창 체적의 측정

평균 팽창 체적,Q,은 하이드로겔의 교차연결 밀도와 관련되어 있다. 하이드로겔의 교차밀도가 높을수록, 이 망이 흡수할 수 있는 물(또는 다른 용매)의 체적은 적어진다. 겔이 3mL 인산염 버퍼의 살린(PBS)에서 팽창하였다. 팽창 중량이 증가하였고 2시간후 안정화되었다. 평형 팽창 체적,Q,가 이틀째 팽창 중량을 이용해 계산되었다.

Q가 MW 3400 and MW 1000의 PEOD를 사용해서 하이드로겔에서 0에서 70% SAD범위로 측정되었다. 예상한 것과 같이, SAD 농도가 증가함에 따라, Q는 감소한다. 더 적은 MW PEOD(1000)에서 합성된 하이드로겔은 더 작은 Q를 가졌다(도3).

D. 복합물의 방출 측정

알부민의 조절된 방출에 대한 SAD 하이드러겔 농도를 변화시키는 효과가 연구되었다. BSA의 수준이 마이크로-BSA 분석법(Pierce)을 이용해 정량되었고 방출이 형광측정법에 의해 관찰되었다. 도4는 40일 동안 0, 15, 17, 43 그리고 51% SAD를 가진 하이드로겔의 방출 모양을 보여준다. 첫 10일동안은 모든 겔이 급속한 방출을 보였다. 10일 시점에서 방출된 알부민의 퍼센트는 SAD에 따라 달랐다. 43과 51% SAD 겔은 캡슐화된 알부민의 단지 25%만 방출한 반면에 0% SAD는 50%를 방출했다. 10일 후 0% SAD겔은 매우 낮은 수준의 알부민을 방출한 반면에, SAD를 가진 겔은 40일동안 하루당 평균 1%알부민을 방출했다.

로다마인(MW 479)가 초기 10일 동안의 급속 방출기간동안 소량의 분자를 연구하기 위하여 사용되었다. 20% SAD를 가진 하이드로겔은 이 기간동안 캡슐화된 로다마인의 70-90%를 방출했다.

그래서 디메타아크릴레이트 숙신산과 폴리(에틸렌 옥사이드)의 공동겔은 하이드로겔을 방출하는데, 이 겔은 로다마인과 알부민과 같은 분자를 천천히 방출할 수 있다. 하이드로겔에서 숙신산의 농도를 변하시키는 것은 추가적으로 하이드로겔 팽창과 방출 특성을 조절하기 위한 하나의 방법이다.

실시예4: 생체내외에서 조적처리

이 실시예에서, 조직처리를 위한 광중합가능 용액의 사용이 생체내외에서 연구되었다. 생체내외의 연구를 위하여 돼지의 무릎, 엉덩이와 어깨 관절로부터 관절 연골이 뼈를 기초하기 위하여 절개되고, 조그만 조각으로 잘려진 후, 콜라게나제와의 배양에 의해 분리되었다. 연골세포가 분화 원심분리에 의해 분리되었다. 분리된 연골 조직이 세척된 후 세포수가 혈색소계를 이용해 결정되었다.

A. 생체외

중합체 PEO와 PEOD는 생체내에서 사용될 수 있고 좋은 생상보성을 보여주지만 시폭약의 생상보성이 소 연골세포를 사용해 시험관내에서 시험되었다. 비록 시폭약 PEOD가 치아사용을 승인받긴 했지만, 이 시폭약은 광중합화를 개시하면서 생성된 기근의 독성을 확인하기 위하여 중합체가 없는 상태에서 시험되었다. PEOD는 기근에 대해 강한 반응성을 띠기 때문에, 중합체가 부족하면 모든 기근이 세포를 손상시킬 수 있다(최악의 경우). 세 개의 시폭약 농도(0.1, 0.05 그리고 0.01% (w/w))가 시험되었다.

소 어깨에서 분리된 연골세포는 37℃, 5% CO₂에서생체외 세포 배양 배지(DMEM)내에서 계속 유지되었다. 세포는 대략 일주일마다 사멸되었다. 여덟 개의 웰 조직에서 웰당 대략 10,000 세포가 뿌려졌다. 1-하이드록시사이클로헥실-페닐-케톤(HPK)가 DMEM에 부가되어 0.1, 0.05 그리고 0.01%(w/w)농도에 도달하였다. 세포가 급성 세포 독성 가능성을 조사하기 위하여 시폭약의 존재하에 24시간 동안 배양되었다. 세포는 이후 광활성 시폭약을 활성화시키기 위하여 3분 동안 UVA 방사선(2mW/㎠)에 노출되었다.

광활성 시폭약 농도의 광에 노출전 세포에 대한 효과를 결정하기 위하여, 세포가 0% (w/w), 0.1% (w/w), 0.05% (w/w), 그리고 0.01% (w/w)에 노출되었다. 시폭약이 광에 노출전 독성을 보이지 않는다는 것을 보인 모든 경우에 차이점은 거의 발견되지 않는다.

4일동안 광에 노출이후 세포에 대한 광활성 시폭약의 효과가 세포를 0% (w/w), 0.1% (w/w), 0.05% (w/w), 그리고 0.01% (w/w)의 농도에 노출시킴으로써 결정되었다. 세포는 형태학적으로 그리고 4일 동안의 세포 증식과 관련하여 비교되었다. 생체내에서 중합화를 위해 필요한 것(1-3mW/㎠에서 3분)과 비슷한 광 노출이후 광범위한 세포사멸이 0.1% 시폭약 농도에서 관측된다. 다양한 손상이 0.05%에서 관찰되고 조절세포와 0.01%세포사이에서는 형태학적으로 어떤 손상도 관찰되지 않는다. 광노출 4일후 0.01% 그리고 조절세포가 유사한 증식을 보였다.

더 많은 분석이 조절세포 a)시폭약이나 UVA에 노출되지 않은 세포, b)단지 UVA만 노출된 세포, 그리고 C) 0.01% PHK 존재하의 UVADP 노출된 세포가 만들어졌다. 어떤 광이나 광활성 시폭약에도 노출되지 않을 때, 광에만 노출될 때, 0.01% 광과 시폭약에 노출된 때, 그리고 광노출후 24시간일 때의 광활성 시폭약의 셀에 대한 효과가 결정되었다. 이런 시폭약의 투여량은 증식이나 형태학상의 변화를 일으키지 않는 것으로 보인다.

B. 생체내에서

조직처리를 위한 중합체 골격의 생분해성의 시간은 중요하다. 정확한 기작을 이해할 필요는 없지만, 증식하는 세포가 증식하고 조직을 형성하기 위해서는 공간을 필요로 하고 어린 세포는 형태를 유지하기 위하여 기계적 힘으로부터 보호를 필요로 한다는 것이 일반적으로 믿어지고 있다. 연골세포가 단독으로 또는 PEG와 함께 주입될 때 단지 일주일 후에 새 연골세포를 형성한다. 그런 이유로 급속하게 분해되거나 조직처리 골격을 부식시키는 것이 바람직하다.

공간이 증식하는 조직을 위하여 필요할 때, 구조적 서포터가 피부를 포함한 주변 조직의 다양한 기계적 힘을 유지하기 위하여 필요하다. 빠르게 분해하는 구성성분을 가진 골격과 주입될 수 있는 구조적 원형을 보전하기 위한 골격의 필요성으로 인해 반-교차침투망(반-IPN)이 사용되게 되었다.

이 실시예에서, 사용된 중합체가 광의 존재하에서 공유 반응하여 다공성망을 형성하는 35% PEOD로 구성되었다. 나머지 65%는 화학적으로 망을 형성하지 않지만 반-JPN을 형성하는 PEOD에 의해 형성된 망내에 사로잡히는 PEO MW 100,000로 구성되었다.

이 시스템은 두배의 분해를 제공한다. PEO는 확산되어 망을 형성할 수 있지만 공유연결된 PEOD는 PEOD 체인이 방출되어 유출되기 전에 에스테르 결합을 깨뜨려야 한다. 이런 화학적 분해는 느리지만 새 연골조직에 의한 에스터라제와 같은 효소의 생산에 의해 가속화될 수 있다.

생체내 연구를 위하여, 연골세포가 원심분리되었고 900㎖내 50 x 10⁶세포 농도가 되도록 부피가 증가되었다. 비메타아클레이트화된 중합체에 대한 메타아클레이트화된 중합체(Shearwater Science, Huntsville, AL)의 35% 비율이 사용되었다. 70 mg의 PEOD(molecular weight 3400, Shearwater Polymers, Huntsville, AL)와 130 mg PEO(molecular weight 100,000 Sigma Chemical, Steizenhofen, Germany)가 세포(50 x 10⁶)의 900㎖와 배지 그리고 1㎎/㎖ PHK의 100㎖내에 분해되어 20% 중합체 용액을 형성하였다.

흉선이 제거된 세 마리의 암컷쥐(Massachusetts General Hospital, Boston, MA)가 메톡시플루란으로 마취되었고 0.1ml 또는 중합체/연골세포 용액이 22 게이지 바늘을 이용해 피하를 통해서 네 개의 부위로 주입되었다. 이 세포가 주입과 트랜스더말 중합화를 이겨낸다는 것을 보여줄 필요가 있었다. 누드 쥐는 두 번 아래에서 전술된 것과 같은 세포/중합체 이식체내의 것들과 유사한 주입법을 통해 주입되었다. 이 쥐는 이후 UVA 방사선을 방출하는 등 아래에 놓였다. 쥐는 3분동안 방사선측정에 의해 측정된 것과 같이 1-3mW/㎠의 광 강도를 받았다. 중합체/연골세포 구성체가 중합화 진행과정을 관찰하기 위하여 촉진되었다.

쥐는 일주, 이주 그리고 삼주 마다 한 마리씩 희생되었고 네 개의 구성체가 제거되고 10% 인산염 버퍼의 포말린내에 24시간동안 고착되었다. 견본이 파라핀으로 처리된 부분에 끼워 넣어졌다. 이 부분은 연이어 헤마톡실린과 이오신(H＆E)과 사파린 O로 표준 조직학 기술에 따라 염색되었다.

쥐당 네 개의 구성체가 1,2 그리고 3주에 수확되었다. 일주일후 이식체의 H＆E 염색과 Safranin O 염색에서 증식하는 연골세포의 섬이 관찰된다. Safranin O 염색에서 분화된 연골세포의 산물인 GAG의 생산이 보인다. 2주에는, 세포가 새 연골조직의 것과 유사한 홍염기성 조직에 의해 둘러싸인다. Safranin O염색에서 1주에 비교하여 좀 더 많아진 GAG의 생산이 보인다.

변형과 변이가 앞으로의 상세한 설명에서 당업자에게 명확해 질 것이다. 이런 변형과 변이는 첨부된 청구항의 범위내에서 다루어 질 것이다.

Claims

활성종에 노출이후 생체내에서 교차침투성 중합체망 또는 반-교차침투성 중합체망을 형성하는 주입가능 중합체 현탁액에 있어서, 서로에게는 교차연결하지 않는 두 개의 중합체로 구성되며, 활성종에 노출이후 중합체망내에 갇힌 생물학적 활성 분자나 세포와 병용되는 것을 특징으로 하는 주입가능 중합체 현탁액.
제 1항에 있어서, 망을 형성하는 중합체가 두 개의 중합체로 구성되는데, 이 중합체들이 그들끼리는 공유교차연결되지만 하나의 교차침투성 중합체망을 형성하는 다른 중합체와는 교차연결하지 않는 것을 특징으로 하는 현탁액.
제 1항에 있어서, 비-공유 교차연결성 중합체를 가진 용액에 공유교차연결성 중합체가 구성되는데, 이 두 중합체가 교차연결하지 않지만 전자방사선에 노출된 후, 반-교차침투성망을 형성하는 것을 특징으로 하는 현탁액.
제 1항에 있어서, 망이 생분해성 중합체로 구성되는 것을 특징으로 하는 현탁액.
제 1항에 있어서, 자유 기근에 노출된 직후 교차연결성 말단기를 가진 공유 교차연결성 중합체로 이루어지는 것을 특징으로 하는 현탁액.
제 1항에 있어서, 이온적으로 교차연결가능한 비-공유교차연결성 중합체로 이루어지는 것을 특징으로 하는 현탁액.
제 3항에 있어서, 공유교차연결성 중합체가 중량당 10-40%사이의 중량 퍼센터내에 존재하는 것을 특징으로 하는 현탁액.
치료가 필요한 환자에게 중합체 구성물질을 형성하기 위한 방법에 있어서, 활성종에 노출되자 마자 하이드로겔, 교차침투성 망 또는 비-교차침투성 망을 형성하는 중합체 용액내 생물학적 활성분자나 세포의 현탁액을 환자에게 주입하는데, 이 현탁액이 조직이나 체액을 통과한 이후 중합체를 효과적으로 교차연결하는 주입된 현탁액과 다른 소스로부터 얻은 활성종에 노출되는 것을 특징하는 방법
중합체 현탁액이 이온적으로 교차연결된 하이드로겔을 형성하는 제 8항에 따른 방법에 있어서, 중합체를 이온적으로 교차연결하는 활성종의 효과적 농도와 병용하여 조직이 형성되는 위치에 이 중합체 용액을 주입하는 것을 특징으로 하는 방법.
중합체 현탁액이 공유 교차연결된 하이드로겔을 형성하는 제 8항에 따른 방법에 있어서, 중합체를 공유교차연결하는 활성종의 효과적 농도에 노출된 후 조직이 형성되는 위치에 이 중합체 용액을 주입하는 것을 특징으로 하는 방법.
중합체 현탁액이 하나의 교차침투성 중합체 망을 형성하는 제 8항에 따른 방법에 있어서, 자기들끼리는 공유 교차연결되나 하나의 교차침투성 중합체망을 형성하는 다른 중합체와는 교차연결되지 않는 두 개의 중합체로 구성되고, 조직이 형성되는 위치에 이 중합체 현탁액을 주입하고, 이 현탁액을 중합체를 교차연결하는 활성종에 노출시키는 것을 특징으로 하는 방법.
중합체 현탁액이 전자방사선에 노출된 이후 반-교차침투성 중합체를 형성하는 비-공유 교차연결성 중합체를 가진 용액에서 공유 교차연결성 중합체를 구성하는 제 8항에 따른 방법에 있어서, 두 개의 중합체가 서로에게 연결되지 않고, 조직이 형성되는 위치에 이 중합체 현탁액을 주입하고, 이 현탁액을 중합체를 교차연결하는 활성종에 노출시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제 8항에 있어서, 중합체가 활성층에 노출된 직후 교차연결되고 활성종이 주입된 중합체 현탁액을 전자방사선에 노출시킴으로써 만들어지는 것을 특징으로 하는 방법.
제 13항에 있어서, 전자방사선이 X-레이, 초음파, 그리고 광으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 8항에 있어서, 활성종이 활성종 시폭약으로 이루어진 중합체-세포 현탁액을 광에 노출시킴으로써 제공되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 14항에 있어서, 광이 피부 외부에 부가되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 14항에 있어서, 광이 중합체-세포 현탁액이 주입되는 위치에 인접한 혈관 내부로부터 가해지는 것을 특징으로 하는 방법.
제 14항에 있어서, 광이 인접한 관절속으로 주입되는 혈액 공간내의 중합체-세포 현탁액에 가해지는 것을 특징으로 하는 방법.
활성종에 노출이후 생체내에서 교차침투성 중합체 망 또는 반-교차침투성 망을 형성하는 중합체 현탁액을 주입하는 것으로 이루어지는 생물학적 활성 분자나 세포의 전달을 위한 방법에 있어서, 중합체 용액이 자기들끼리는 공유교차연결되나 하나의 교차침투성 막을 형성하는 다른 중합체와는 교차연결하지 않는 두 개의 중합체로 이루어진 용액이나 비-공유 교차연결성 중합체와 병용하여 하나의 공유 교차연결성 중합체를 형성하지만 활성종에 노출되어도 교차연결되지 않는 이 두 개의 중합체로 이루어진 용액으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 19항에 있어서, 중합체 용액을 주입하고 교차침투성 중합체 망이나 반-교차침투성 중합체 망을 형성하기 위하여 상당한 양의 활성종에 이 용액을 노출시키는 것을 특징으로 하는 방법.