KR20010010192A

KR20010010192A - 영지버섯 세포외 다당체의 생산방법

Info

Publication number: KR20010010192A
Application number: KR1019990028932A
Authority: KR
Inventors: 이신영; 이규민
Original assignee: 이신영
Priority date: 1999-07-16
Filing date: 1999-07-16
Publication date: 2001-02-05
Also published as: KR100311317B1

Abstract

본 발명은 영지버섯 세포외 다당체의 생산방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는, 초기 액체배지내의 환경을 pH 2 내지 6으로 조절하고, 선택적으로 암모늄 이온을 첨가하는 영지버섯 균사체 생산공정과 이러한 균사체-함유 액체배지내의 환경을 pH 3 내지 7로 조절하여 보다 효율적으로 세포외 다당체를 생산하는 공정을 포함하는 2단계 pH 공정의 영지버섯 세포외 다당체의 생산방법에 관한 것이다. 이러한 본 발명에 따르면, 균사형태는 물론 액체배지내의 유변학적 특성을 최적화함으로써 영지버섯으로부터 보다 효율적으로, 그리고 보다 안정적으로 세포외 다당체를 생산할 수 있는 효과가 있음을 알 수 있다.

Description

영지버섯 세포외 다당체의 생산방법{Exo-polysaccharide production from submerged mycelial culture of Ganoderma lucidum}

본 발명은 영지버섯 세포외 다당체의 생산 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는, 초기 액체배지내의 환경을 pH 2 내지 6으로 조절하고, 선택적으로 암모늄 이온을 첨가하는 영지버섯 균사체 생산공정과 이러한 균사체-함유 액체배지내의 환경을 pH 3 내지 7로 조절하여 보다 효율적으로 세포외 다당체를 생산하는 공정을 포함하는 2단계 pH 공정의 영지버섯 세포외 다당체의 생산방법에 관한 것이다.

영지버섯(Ganoderma lucidum)은 다공균과 불로초속(Ganoderma)에 속하는 담자균으로, 그 자실체를 영지(靈芝)라고 하며, 이는 예로부터 고혈압, 이뇨, 강장, 강심, 위장치료 등에 대한 각종 약효가 있는 것으로 알려져 왔다. 이러한 영지의 생산방법으로는 그 동안 농가에서 주로 톱밥재배나 원목재배와 같은 고체배양법이 있으나, 이와 같은 고체배양법은 배양시간이 길고 많은 노동력이 요구되며, 자실체로부터 다당을 추출하는 공정이 매우 어려운 문제점이 있어 왔다. 따라서, 이와 같은 문제점을 개선시켜 항상 일정한 조건에서 배양이 가능하고, 품질이 균일한 균사체를 고효율 및 대량으로 얻을 수 있으며, 또 낮은 비용으로 생산할 수 있는 액체배양법이 최근에 와서 널리 시도되고 있다. 그러나, 이러한 액체배양법은 균사체로부터 영지버섯의 생리활성 성분인 다당류(항암활성 β-1,3-glucan)의 추출공정이 역시 매우 복잡하고 또한 수율이 매우 낮아 산업적 적용에는 제한이 있는 문제점이 있다. 또한, 하등균류에 대한 다양한 연구와는 달리, 액체배양시 가노더마 루시덤(Ganoderma lucidum) 균사체 등의 고등균류인 담자균류에 대하여는 형태 및 유변학적 특성에 대한 연구가 매우 미흡하였으며, 특히 이들과 세포외 다당체의 생산과의 상관성에 대하여는 전혀 보고된 바 없었다. 즉, 균사체 및 세포외 다당의 대량 생산을 위해서는 이들 관계를 규명하고, 조절, 제어하는 것이 중요하며, 특히 안정성 및 생산성을 더욱 증가시키기 위하여 배지조성 및 배양조건을 달리하여 배양하면서 형태변화나 유변학적 거동의 변화를 균체 농도 및 생성물과의 연계하여 조사할 필요가 있으며, 특히 pH를 비롯한 질소원이나 균사체의 형태나 유변학적 특성과 균사체의 생육 및 세포외 다당체 생산과의 상관성에 대해서는 아직 검토되지 않은 바, 이에 대한 연구의 필요성이 절실히 요구되고 있는 실정이다.

이에, 본 발명자들은 상기와 같은 문제점을 개선시키기 위하여 연구 노력한 결과, 균사체 생육조건과 세포외 다당체 생산조건의 최적 조건이 서로 상이함을 알고, 각각의 생산 목적물에 따라 액체배지내의 배양조건을 달리 최적화하여 배양함으로써, 보다 효율적으로 세포외 다당체를 수득할 수 있게 하여, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 주된 목적은 균사체 배양공정과 세포외 다당체 생산공정의 pH를 달리하는 2단계 pH 공정을 포함하는 영지버섯 세포외 다당체의 대량 생산방법을 제공하는 것이다.

도 1은 2단계 배양에서 액체배지내 pH를 3에서 5로 변화시킨 경우, 건조균체중량(MDW)에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.

도 2는 2단계 배양에서 액체배지내 pH를 3에서 5로 변화시킨 경우, 세포외 다당체(EPS)에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.

도 3은 배양 시작 6시간 후 배지내 pH를 3에서 6으로 변화시킨 경우, 건조균체중량(MDW) 및 세포외 다당체(EPS)에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.

도 4는 배양 시작 2일 후 배지내 pH를 3에서 6으로 변화시킨 경우, 건조균체중량(MDW) 및 세포외 다당체(EPS)에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.

도 5a는 암모늄이온 무첨가구에서 배지내 초기 pH에 따른 건조균체중량(MDW)을 나타낸 그래프이다.

도 5b는 암모늄이온 무첨가구에서 배지내 초기 pH에 따른 세포외 다당체(EPS)를 나타낸 그래프이다.

도 6a는 암모늄이온 무첨가구에서 배지내 일정 pH의 조절에 따른 건조균체중량(MDW)을 나타낸 그래프이다.

도 6b는 암모늄이온 무첨가구에서 배지내 일정 pH의 조절에 따른 세포외 다당체(EPS)를 나타낸 그래프이다.

도 7a는 암모늄이온 첨가구에서 배지내 초기 pH에 따른 건조균체중량(MDW)을 나타낸 그래프이다.

도 7b는 암모늄이온 첨가구에서 배지내 초기 pH에 따른 세포외 다당체(EPS)를 나타낸 그래프이다.

도 8a는 암모늄이온 첨가구에서 배지내 일정 pH의 조절에 따른 건조균체중량(MDW)을 나타낸 그래프이다.

도 8b는 암모늄이온 첨가구에서 배지내 일정 pH의 조절에 따른 세포외 다당체(EPS)를 나타낸 그래프이다.

도 9는 암모늄이온 첨가구에서 2단계 pH 배양공정(pH 3에서 6시간 후 pH 6으로의 변화)시 균사체 외부 형태의 경시 변화를 나타낸 것이다.

도 10은 암모늄이온 첨가구에서 2단계 pH 배양공정(pH 3에서 2일 후 pH 6으로의 변화)시 균사체 외부 형태의 경시 변화를 나타낸 것이다.

도 11은 2단계 pH 배양공정이 펠렛의 크기에 미치는 영향을 경시적으로 나타낸 그래프이다.

도 12는 암모늄이온이 첨가구의 배지내 pH에 따른 전체 균사체수 중 펠렛수의 비율에 대한 경시변화를 나타낸 그래프이다.

본 발명은 암모늄 이온을 첨가하여 pH 2 내지 6의 액체배지에서 균사체를 배양하는 공정 및 상기 공정에서 수득된 균사체를 pH 3 내지 7의 액체배지에서 배양하여 세포외 다당체를 생산하는 공정이 포함되는 영지버섯 세포외 다당체의 생산방법에 관한 것이다.

이와 같은 본 발명의 영지버섯 세포외 다당체의 대량생산 방법에 대하여 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

본 발명에 따른 제 1 공정은 균사체 생산공정을 나타내는 것으로, 다음과 같은 공정으로 이루어져 있다.

우선, 본 발명에서 목적으로 하는 영지버섯(Ganoderma)은 가노더마 루시덤(Ganoderma lucidum), 가노더마 아플라나텀(Ganoderma applanatum), 가노더마 츄게 (Ganoderma tsugae), 가노더마 네오-자포니쿰(Ganoderma neo-japonicum) , 또는 다공균과 불로초속에 속하는 담자균 모두를 포함한다. 이러한 균주를 pH 2 내지 6, 더욱 바람직하게는 pH 3 내지 4의 액체배지에 포함시켜 배양한다. 왜냐하면, 액체배지내의 pH 조건이 2 미만이면 배지내의 수소이온 농도가 너무 높아 균체의 생육이 저해될 뿐만 아니라, 세포외 다당체의 생성도 억제되는 문제점이 있으며, 반면 pH가 6을 초과하는 경우 역시 균체 생육이 억제되고 세포외 다당체 생성도 점차 감소하기 때문이다. 또한, 상기 액체배지의 pH는 배양 초기의 배지조건이거나 또는 배양공정 중에 NaOH를 첨가하여 일정하게 유지되도록 할 수도 있다. 이때, 상기 pH 조절용 NaOH를 너무 과량으로 사용하는 경우에는 균사체가 용균(Lysis)되어 감소하는 문제점이 있으므로 pH 7이 넘지 않는 양 이하로 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명에서 상기 액체배지는 0.01 내지 5 중량%의 암모늄이온을 선택적으로 함유할 수도 있다. 왜냐하면, 이들 암모늄이온의 첨가 유무가 배양액의 점조도지수나 유동지수 등의 배양 중의 유변학적 거동에 크게 영향을 미치기 때문이다.

본 발명에 따른 제 2 공정은 세포외 다당체 생산공정을 나타내는 것으로, 다음과 같은 공정으로 이루어져 있다.

상기 최적화된 공정에서 수득된 균사체를 함유한 배지에 NaOH를 첨가하여 상기 균사체 생산공정에서의 배지환경과는 다른 pH 3 내지 7, 더욱 바람직하게는 pH 5 내지 6의 액체배지에서 배양한다. 이때, 액체배지내의 pH가 3 미만이면 배양액의 겉보기 점도가 증가하고 균사체 호흡에 필요한 배양액중의 산소이동이 저하되는 문제가 있어 세포외 다당체의 생성을 저해하며, 반면 pH 7을 초과하는 경우 역시 균사체가 용균되는 문제가 있어 바람직하지 않은 문제점이 있기 때문이다. 또한, 상기 액체배지의 pH는 배양 초기의 배지조건이거나 또는 배양공정 중에 NaOH를 첨가하여 일정하게 유지되도록 하여 배양을 계속한다. 이때, 상기 pH 조절용 NaOH를 너무 과량 사용하는 경우에는 균사체가 용균(Lysis)되어 감소하는 문제점이 있어 pH 7이 넘지않는 량 이하로 사용하는 것이 바람직하다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의하여 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 이들 실시예 및 실험예에 의하여 본 발명의 범위가 한정되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 2단계 배양(1)

본 발명에서 사용한 균주는 가노더마 루시덤(Ganoderma lucidum) ASI 7004를 사용하였다. P.D.A.(potato dextrose agar) 평판배지에서 30℃로 7일간 배양한 후 4℃에서 보존하였고, 3개월마다 계대배양하면서 실험에 사용하였다. 이렇게 생육된 균사체를 직경 5mm의 스테인레스 스틸 파이프(stainless steel pipe)로 마이셀리움 디스크(mycelium disk)를 만든 다음, 이 디스크 4 내지 5개를 50㎖의 배지에 넣은 250㎖ 삼각 플라스크에 접종하였다. 30 ℃에서 7일간 배양한 다음, 다시 종균용 배지 50㎖를 함유한 250㎖의 삼각 플라스크에 5%(v/v)의 전배양액을 접종하였고, 30℃에서 100rpm으로 5일간 진탕 배양하였다. 그런 다음, 전배양액은 균질기(동양(주), 모델 0820)로 30초 동안 균질화시켜 본 배양의 접종용으로 사용하였고, 매 실험마다 새로이 배양하여 사용하였다. 이때, 종균배양에 사용한 전배양액의 배지는 손 등[참조: Sone, Y., Okuda, R., Wada, A., Kishida, A. and Misaki, A., Structures and Antitumor Activities of the Polysaccharides Isolated from Fruiting Body and the Growing Culture of Mycelium of Agricultural Biological Chemistry, 49(9), 2642 - 2650(1985)]이 사용한 가노더마 아플라나텀(Ganoderma applanatum)의 진탕 배양용 배지를 사용하였다. 본 배양에는 이 등[참조: Lee, S.Y., Kang, T.S. and Lee, M.C., Condition of Exo-polysaccharide Production from Submerged Mycelial Culture of Ganoderma lucidum by Using Air-lift Fermenter System, Kor. J. Biotechnol. Bioeng., 13(5), 1 ∼ 7(1998)]이 액체배양에 의한 세포외 다당체 생산의 최적배지로 보고한 배지[글루코스 60g/L, 효모 Ex. 6g/L, KH₂PO₄0.5g/L, (NH₄)₂HPO₄1g/L]로서 121 ℃에서 15분간 가압살균 후 사용하였고, 발효기(fermenter)는 상기 이 등이 자체 제작한 3L용량(working volume: 2L)의 에어-리프트 발효기(air-lift fermenter)로서 접종량 5%(v/v), 온도 30℃, 통기속도를 2.5vvm으로 고정하여 배양하였다. 이상에서 준비한 균주와 배지를 이용하고, 우선 액체배지내의 초기 pH를 NaOH를 사용하여 pH 3으로 조절하였다. 그리고, 이들을 각각 6, 18, 24, 48, 72시간 배양후 배지내의 pH를 6으로 변화시키고 계속하여 배양시켰다. 그리고, 이들 각각에 대하여 매 24시간마다 6일간 균사체 건조중량(mycelial dry weight, MDW)과 세포외 조다당(crude exo-polysaccharide, EPS)을 정량하였고, 그 결과를 다음 도 1에 요약하여 나타내었으며, 균사체 건조중량(MDW)은 최대 18.4g/L, 세포외 조다당(EPS)은 7.27g/L를 수득하였다. 이때, 사용한 균사체 건조중량 측정방법은 배양액을 10,000×g에서 15분간 원심분리하고 침전된 균사체를 여과지(filter paper; No. 2, Advantec)로 여과한 다음, 증류수로 2 내지 3회에 걸쳐 수세하였고, 70℃에서 24시간 건조한 후, 데시케이터(desiccator)에서 항량이 될 때까지 방치하면서 균사체의 건조중량을 측정하였고, 또한 세포외 다당은 배양액을 10,000×g에서 15분간 원심분리하여 균사체를 제거한 후 얻은 배양여액에 2배량의 아세톤을 가하여 침전물을 수득하고, 이를 70℃에서 24시간 건조한 다음 중량을 측정하여 정량하는 방법을 이용하였다.

실시예 2 : 2단계 배양(2)

암모늄이온 13 ㎎/L을 배지내에 첨가한 점과 배양시작 6시간만에 액체배지내의 pH를 6으로 조절하여 배양한 점을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 균사체 및 세포외 다당을 배양하였을 뿐만 아니라, 이들을 실시예 1과 동일한 방법으로 정량하고, 그 결과를 다음 도 3에 요약하여 나타내었으며, 균사체 건조중량(MDW)은 최대 8.23g/L, 세포외 조다당(EPS)은 20.04g/L를 수득하였다.

실시예 3 : 2단계 배양(3)

배양시작 2일만에 액체배지내의 pH를 6으로 조절하여 배양한 점을 제외하고는 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 균사체 및 세포외 다당을 배양하였을 뿐만 아니라, 이들을 실시예 1과 동일한 방법으로 정량하고, 그 결과를 다음 도 4에 요약하여 나타내었으며, 균사체 건조중량(MDW)은 최대 8.89g/L, 세포외 조다당(EPS)은 17.03g/L를 수득하였다.

이상의 실시예 2와 3의 결과를 살펴보면, 균사체의 생육은 배양 6시간 및 2일 이후에 pH를 변화시킨 경우 모두 배양 5일까지 증가한 후(8.23 및 8.89g/L) 감소하여 pH 조절의 경우와 유사하였으나, 도 1과 비교하여 볼 때 건조균체량은 81% 및 49%로 감소하였다. 특히, pH 3에서 6시간 배양한 후 pH를 6으로 변화시켰을 때, 최대의 세포외 다당(20.04g/L)을 생산할 수 있었으며, 일정하게 pH 6으로 조절하였을 경우인 실시예 5의 경우(15.71g/L) 보다도 약 1.28배의 다당 생산량의 증가를 얻었다. 두 가지 경우 모두, 배양 초기에 암모늄이온은 급격하게 소비되어 배양 3일 이후에는 거의 고갈되었고, 이 시점부터 글루코스가 급격하게 소비되었으며, 세포외 다당생산도 더욱 증가였다. 그러나, 균사체의 생육속도는 암모늄이온의 고갈로 감소하는 경향을 보였고, 과량의 NaOH의 첨가로 용균현상을 일으켜 건조균체량이 감소함을 보였다. 그러나, 암모늄이온이 고갈되는 시점부터 세포외 다당의 생성속도가 증가하여, 배양액 내 암모늄이온이 존재할 경우 다당생산이 억제됨을 알 수 있다.

실시예 4: 암모늄이온 무첨가구의 배지내 초기 pH의 영향

암모늄이온이 포함되지 않은 배지내의 초기 pH를 각각 3, 4, 5, 6으로 조절한 후 9일간 계속하여 배양하였으며, 매 12시간마다 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 균사체 건조중량(MDW)과 세포외 조다당(EPS)을 정량하였다. 그리고, 그 결과를 다음 도 5a, 도 5b 및 표 1에 요약하여 나타내었다.

실시예 5: 암모늄이온 무첨가구의 배지내 pH 조절의 영향

NaOH를 이용하여 액체배지내의 pH를 일정하게 조절한 점을 제외하고는 상기 실시예 4와 동일한 방법으로 9일간 계속하여 배양하였으며, 매 12시간마다 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 균사체 건조중량(MDW)과 세포외 조다당(EPS)을 정량하였다. 그리고, 그 결과를 다음 도 6a, 도 6b 및 표 2에 요약하여 나타내었다.

실시예 6: 암모늄이온 첨가구의 배지내 초기 pH의 영향

암모늄이온 1g/L을 액체배지내에 포함시킨 점을 제외하고는 상기 실시예 4와 동일한 방법으로 9일간 계속하여 배양하였으며, 매 12시간마다 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 균사체 건조중량(MDW)과 세포외 조다당(EPS)을 정량하였다. 그리고, 그 결과를 다음 도 7a, 도 7b 및 표 3에 요약하여 나타내었다.

실시예 7: 암모늄이온 첨가구의 배지내 pH 조절의 영향

NaOH를 이용하여 액체배지내의 pH를 일정하게 조절한 점을 제외하고는 상기 실시예 6과 동일한 방법으로 9일간 계속하여 배양하였으며, 매 12시간마다 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 균사체 건조중량(MDW)과 세포외 조다당(EPS)을 정량하였다. 그리고, 그 결과를 다음 도 8a, 도 8b 및 표 4에 요약하여 나타내었다.

이상의 실시예 4 내지 7에 대하여 살펴보면, 건조 균체량은 pH 조절 및 비 조절시의 첨가구에서 모두 무첨가구보다 높게 나타났고, 세포외 다당 생산량은 무첨가구에서 높게 나타났다. 또한, pH 조절시에 균체량은 대응하는 pH에서 비 조절 시보다 낮았으나, 다당의 생성량은 높았다. 최대의 세포외 다당 생산량은 pH 6으로 조절한 무첨가구에서 얻어졌으며, 그 양은 15.71g/L이었다. 또, 일정 pH 6으로의 조절시 암모늄이온 무첨가구는 첨가구보다 1.13배의 다당 생산 증가를 보였으나, 암모늄이온 첨가구에서의 다당 생성량은 pH를 조절하지 않았을 때보다 약 2.4배나 증가하였고, 무첨가구에서는 약 2.74배의 증가를 보였다. 따라서, 가노더마 루시덤의 세포외 다당 생산에는 pH 조절의 영향이 암모늄이온의 첨가 영향보다 더 효과적인 것으로 판단된다.

비교예 1: 암모늄이온 무첨가구의 배지내 초기 pH의 영향

액체배지내의 pH를 2로 조절한 점을 제외하고는 상기 실시예 4와 동일한 방법으로 9일간 계속하여 배양하였으며, 매 12시간마다 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 균사체 건조중량(MDW)과 세포외 조다당(EPS)을 정량하였다. 그 결과, 균사체 건조중량(MDW)은 0.8g/L, 세포외 조다당(EPS)은 1.70g/L을 수득하였다.

비교예 2: 암모늄이온 첨가구의 배지내 초기 pH의 영향

액체배지내의 pH를 2와 7로 조절한 점을 제외하고는 상기 실시예 6과 동일한 방법으로 9일간 계속하여 배양하였으며, 매 12시간마다 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 균사체 건조중량(MDW)과 세포외 조다당(EPS)을 정량하였다. 그리고, 그 결과를 다음 표 5에 요약하여 나타내었다.

비교예 3: 암모늄이온 첨가구의 배지내 pH 조절의 영향

액체배지내의 pH를 2로 조절한 점을 제외하고는 상기 실시예 7과 동일한 방법으로 9일간 계속하여 배양하였으며, 매 12시간마다 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 균사체 건조중량(MDW)과 세포외 조다당(EPS)을 정량하였다. 그 결과, 균사체 건조중량(MDW)은 3.09g/L, 세포외 조다당(EPS)은 2.13g/L을 수득하였다.

실험예 1: 균사형태(1)

암모늄이온 첨가구에 일정 pH 3에서 6시간 배양한 후 일정 pH 6으로 pH를 변화시켜 2단계 배양한 상기 실시예 2의 배양액내의 균사 형태 관찰을 위하여 시료 1㎖를 무작위로 취한 다음, 동량의 고정화 용액[13㎖ 40% 포름알데하이드(formaldehyde) + 5㎖ 글래셜 아세트산(glacial acetic acid) + 200㎖ 50%(v/v) 에탄올]으로 고정시켜 20배로 희석한 후, 슬라이드 글래스에 희석한 시료 0.5㎖를 분사하여 통기 건조하였고, 고급알콜(absolute alcohol)로 수세한 다음, 메틸렌 블루(methylene blue)로 염색하였다. 그리고, 이미지 캡쳐링 보드(image capturing board)를 사용하여 PC(Samsung, Pentium 100)에 연결한 이미지 분석시스템(Optimas Co., U.S.A)으로 균사체 형태를 분석하였고, 그 결과를 다음 도 9 및 도 11에 요약하여 나타내었다.

실험예 2: 균사형태(2)

암모늄이온 첨가구에 일정 pH 3에서 2일간 배양한 후 일정 pH 6으로 pH를 변화시켜 2단계 배양한 상기 실시예 3의 배양액내의 균사를 관찰한 점을 제외하고는 상기 실험예 1과 동일한 방법으로 시료를 준비하여 균사체 형태를 분석하였고, 그 결과를 다음 도 10 및 도 11에 요약하여 나타내었다.

이상의 실험예 1 및 실험예 2의 결과에 따르면, 배양 조건에 관계없이 균사체의 생육은 펠렛형태로 생육하였고, 배양 6시간 이후에 pH를 변화시킨 경우, 배양 말기에도 적정 크기와 일정한 빈도수의 펠렛을 유지하였다. 그러나, 배양 2일 이후에 pH를 변화시킨 경우에는 배양 중기부터 펠렛의 크기나 빈도수가 감소하였다. 영지버섯의 펠렛은 배양 초기에 크기가 증가한 후 배양 시간이 경과함에 따라 차차 감소하는 경향을 나타내었다. 특히, 세포외 다당생산이 최대이었던 배양 6시간 이후에 pH를 변화시킨 경우(1.7 ∼ 2.4mm)가 배양 2일 이후에 pH를 변화시킨 경우(0.99 ∼ 2.02mm)보다 펠렛의 평균 직경이 상대적으로 크게 생육하여, 세포외 다당생산에 있어서 적정한 크기와 빈도수의 펠렛을 유지하는 것이 유리한 것으로 판단되었다.

실험예 3: 배지내 pH 조절된 암모늄이온 첨가구의 펠렛 형태의 분포

암모늄이온 1g/L을 포함시킨 액체배지내에 NaOH를 사용하여 배지내의 pH를 일정하게 유지하도록 조절된 상기 실시예 7의 액체배지내의 균사 형태를 분석하여 다음 도 12에 전체 균사체에 대한 펠렛 형태의 분율로써 나타내었다. 그리고, 그 결과를 보면, 도 11에서 보는 바와 같이, 일정한 각 pH에서 배양 초기에는 모두 펠렛의 비율이 100%로 존재하였으나, 배양 3일 이후부터 감소하는 경향을 보여 배양 6일에는 펠렛이 차지하는 비율이 pH 6, pH 5, pH 4 및 pH 3에서 각각 48.5%, 24%, 10.4% 및 9.3%까지 감소하였다. 또한, pH에 따라서는 pH 6 〉 pH 5 〉 pH 4 〉 pH 3의 순으로 펠렛 비율이 감소하여 pH가 감소할수록 필라멘트비율이 높아지고, pH가 증가할수록 펠렛비율이 높아짐을 알 수 있었다. 따라서, 이러한 결과는 세포외 다당생산이 pH 6에서 최대이고, pH 3에서 최소이었던 도 8b와 비교하면, 균사체 농도는 펠렛 생육시 높고, 세포외 다당의 생성량은 필라멘트 생육시 높은 것으로 판단되었다. 또한, 다당 생산성이 높았던 pH 5 및 6에서의 배양액 내에 펠렛의 비율은 24% ∼ 48.5%로 펠렛과 필라멘트수의 비가 1 : 1 ∼ 3 일 때 세포외 다당의 생산이 높아지는 것으로 판단되었다.

실험예 4: 유변학적 특성(1)

암모늄이온을 포함하지 않은 pH 5의 액체배지에 균주를 배양하면서 배양액, 균사체 현탁액 및 배양여액에 대하여 매 24시간마다 8일간에 걸쳐 각각 점조도지수(K), 유동지수(n) 및 항복응력(τ_y) 값을 허쉘-벌크레이(Herschel-Bulkley) 식을 이용하여 선형최소자승법에 따라 구하였다. 그리고, 그 결과를 다음 표 6에 요약하여 나타내었다.

실험예 5: 유변학적 특성(2)

암모늄이온 1g/L을 액체배지내에 포함시킨 점을 제외하고는 상기 실험예 4와 동일한 방법으로 배양액, 균사체 현탁액 및 배양여액에 대하여 각각 점조도지수(K), 유동지수(n) 및 항복응력(τ_y) 값을 구하였고, 그 결과를 다음 표 6에 요약하여 나타내었다.

실험예 6: 유변학적 특성(3)

암모늄이온 7g/L을 액체배지내에 포함시킨 점을 제외하고는 상기 실험예 4와 동일한 방법으로 배양액, 균사체 현탁액 및 배양여액에 대하여 각각 점조도지수(K), 유동지수(n) 및 항복응력(τ_y) 값을 구하였고, 그 결과를 다음 표 6에 요약하여 나타내었다.

이상의 결과를 보면, 배양액의 점조도 지수 K는 NH₄ ⁺(-)〉 NH₄ ⁺(1g/L)〉 NH₄ ⁺(7g/L)의 순이었고, 유동지수는 NH₄ ⁺(7g/L)〉 NH₄ ⁺(1g/L)〉 NH₄ ⁺(-)의 순서로 암모늄이온의 첨가 유무와 배양 중 유변학적 거동이 크게 달라짐을 보였다. 이러한 결과를 형태관찰의 결과와 연계하여 살펴보면, 필라멘트형 생육이 주였던 암모늄이온 무첨가시의 배양 종료 후의 K값 및 n값은 각각 4.40Pa·Sⁿ및 0.40(-)인 반면, 펠렛 생육이 주였던 고농도 암모늄이온 첨가시의 배양 종료 후의 K값 및 n값은 각각 0.81Pa·Sⁿ및 0.72(-)로, 필라멘트 생육시의 K값이 매우 크고(약 5.5배), n값이 매우 작은 결과(약 0.6배)를 나타내었다. 즉, 동일한 균사체 농도에서 필라멘트 형태의 균사의 점조도지수 K값은 펠렛 형태의 K값보다 매우 크고, 유동지수 n 값은 필라멘트 형태의 균사가 펠렛 형태보다 낮게 나타난다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 균사체 배양공정과 세포외 다당체 생산공정의 pH를 달리하는 2단계 pH 공정을 포함하는 영지버섯 세포외 다당체 생산방법에 관한 것이다. 이러한 본 발명에 따르면, 균사형태는 물론 액체배지내의 유변학적 특성을 최적화함으로써 영지버섯으로부터 보다 효율적으로, 그리고 보다 안정적으로 세포외 다당체를 생산할 수 있는 효과가 있음을 알 수 있다.

Claims

암모늄 이온을 첨가하여 pH 2 내지 6의 액체배지에서 균사체를 배양하는 공정 및 상기 공정에서 수득된 균사체를 pH 3 내지 7의 액체배지에서 배양하여 세포외 다당체를 생산하는 공정이 포함되는 것을 특징으로 하는 영지버섯 세포외 다당체의 생산방법.
제 1 항에 있어서, 상기 영지버섯이 다공균과 불로초속(Ganoderma)에 속하는 담자균인 것을 특징으로 하는 영지버섯 세포외 다당체의 생산방법.
제 1 항에 있어서, 상기 균사체 배양공정용 액체배지의 pH가 3 내지 4인 것을 특징으로 하는 영지버섯 세포외 다당체의 생산방법.
제 1 항 또는 제 3 항에 있어서, 상기 균사체 배양공정용 액체배지는 0.01 내지 5 중량%의 암모늄이온을 함유하는 것을 특징으로 하는 영지버섯 세포외 다당체의 생산방법.
제 1 항에 있어서, 상기 세포외 다당체 생산공정용 액체배지의 pH가 5 내지 6인 것을 특징으로 하는 영지버섯 세포외 다당체의 생산방법.
제 1 항에 있어서, 상기 균사체 배양공정용 액체배지 및 세포외 다당체 생산공정용 액체배지는 배양공정 중에 pH가 일정하게 유지되는 것을 특징으로 하는 영지버섯 세포외 다당체의 생산방법.