KR20200136648A - 아스퍼질러스 오라이제 효소액을 이용한 진세노사이드 컴파운드 케이 제조용 조성물 및 제조방법 - Google Patents

아스퍼질러스 오라이제 효소액을 이용한 진세노사이드 컴파운드 케이 제조용 조성물 및 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 아스퍼질러스 오라이제(Aspergillus oryzae) 균주를 질소원으로서, 옥수수 침지액 고형물(corn steep solid)를 포함하는 발현 배지에서 배양시킨 효소액을 포함하는 진세노사이드 컴파운드 케이 제조용 조성물 및 제조방법에 관한 것이다.

Description

아스퍼질러스 오라이제 효소액을 이용한 진세노사이드 컴파운드 케이 제조용 조성물 및 제조방법{COMPOSITION AND METHOD FOR PRODUCING GINSENOSIDE COMPOUND K USING ENZYME LIQUID OF ASPERGILLUS ORYZAE}
본 발명은 아스퍼질러스 오라이제(Aspergillus oryzae) 효소액을 진세노사이드 컴파운드 케이 제조용 조성물 및 제조방법에 관한 것이다.
인삼은 전통적으로 한방약에서 강심제나 이뇨제로 사용되어왔고, 그 중 인삼 내에 존재하는 사포닌을 일컫는 진세노사이드는 인삼의 여러 가지 유효성분 중에서 약리 작용을 하는 물질로 알려져 있다.
그 중 진세노사이드 컴파운드 케이는 인삼 내에 다량으로 존재하는 프로토파낙사다이올계 사포닌인 진세노사이드 Rb1, 진세노사이드 Rb2, 진세노사이드 Rc 및 진세노사이드 Rd로부터 글루코스, 아라비노스와 같은 당이 가수분해되어 체내에서 훨씬 흡수가 잘되는 형태가 되고, 항암, 항염증, 항알러지, 면역증강, UV에 의한 피부손상 회복 및 피부 노화 방지, 주름억제 등의 많은 효능에 대한 실험이 여러 논문으로 나타나있다.
현재까지 진세노사이드 컴파운드 케이의 고효율 생산기술로는 칼디셀룰로시럽터 베시(Caldicellulosiruptor bescii) 유래 재조합 유전자를 대장균에 삽입시켜 얻은 효소로 고효율의 진세노사이드 컴파운드 케이를 생산할 수 있는 생산 방법이 알려져 있으나, 유전자 조작으로 얻은 효소로 반응하여 생산하는 방법이기 때문에 식품에 이용하기에는 한계가 있고, 장내 세균과 같은 유산균을 이용하여 여러 진세노사이드가 함유되어 있는 복합체를 기질로 하여 진세노사이드 컴파운드 케이를 생산하는 경우 전환율이 낮은 문제점이 있기에, 식품에 이용할 수 있고 유산균보다 높은 수율로 진세노사이드 컴파운드 케이를 생산하는 곰팡이 효소를 사용하였다.
기존 곰팡이 효소를 이용한 방법으로는 트리코데르마 또는 페니실리움속에서 분리한 셀룰라제 또는 아스퍼질러스속에서 분리한 베타-갈락토시다제를 이용하여 프로토파낙사다이올(protopanaxadiol, PPD)계 사포닌이 주로 함유된 인삼근에서 분리한 조사포닌 분획과 인삼 추출엑스를 기질로 진세노사이드 컴파운드 케이를 제조하는 방법들이 보고 되어왔으나, 수율에 있어 한계가 있고 탄소원과 질소원을 달리하여 효소의 활성을 높이는 방법은 보고되고 있지 않다.
본 발명은 (a) 아스퍼질러스 오라이제(Aspergillus oryzae) 균주를 질소원으로서, 옥수수 침지액 고형물(corn steep solid)을 포함하는 발현 배지에서 배양하여 효소액을 수득하는 단계; 및 (b) 상기 수득한 효소액을 기질에 처리하는 단계를 포함하는 진세노사이드 컴파운드 케이의 제조방법 등을 제공하고자 한다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 (a) 아스퍼질러스 오라이제(Aspergillus oryzae) 균주를 질소원으로서, 옥수수 침지액 고형물(corn steep solid)을 포함하는 발현 배지에서 배양하여 효소액을 수득하는 단계; 및 (b) 상기 수득한 효소액을 기질에 처리하는 단계를 포함하는 진세노사이드 컴파운드 케이의 제조방법을 제공한다.
상기 (a) 단계에서 아스퍼질러스 오라이제(Aspergillus oryzae) 균주는 아스퍼질러스 오라이제(Aspergillus oryzae) 균주(KACC 40250)일 수 있다.
상기 (a) 단계에서 발현 배지는 탄소원으로서, 셀룰로오스(cellulose), 밀기울(wheat bran) 또는 사탕무 슬러지(sugar beet sludge)를 포함할 수 있다.
상기 (a) 단계에서 발현 배지는 KH2PO4, MgSO4·7H2O, CaCl2, FeSO4·7H2O, ZnSO4·7H2O, MnSO4·H2O 및 CoCl2·6H2O 를 추가로 포함할 수 있다.
상기 (a) 단계에서 효소액은 상기 아스퍼질러스 오라이제(Aspergillus oryzae) 균주의 세포 외 효소액일 수 있다.
상기 (b) 단계에서 기질은 인삼 추출물이거나; 진세노사이드 Rb1, 진세노사이드 Rb2, 진세노사이드 Rc 및 진세노사이드 Rd 로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 프로토파낙사다이올계 사포닌을 포함할 수 있다.
상기 (b) 단계에서 기질 내 프로토파낙사다이올계 사포닌의 농도는 0.5 mg/ml 내지 20 mg/ml일 수 있다.
상기 (b) 단계에서 처리는 pH 4.0~5.5 및 45~60℃ 조건에서 10 시간 내지 100 시간 동안 수행될 수 있다.
본 발명의 일 구현예로, 아스퍼질러스 오라이제(Aspergillus oryzae) 균주를 질소원으로서, 옥수수 침지액 고형물(corn steep solid)을 포함하는 발현 배지에서 배양시킨 효소액을 포함하는 진세노사이드 컴파운드 케이 제조용 조성물을 제공한다.
상기 발현 배지는 탄소원으로서, 셀룰로오스(cellulose), 밀기울(wheat bran) 또는 사탕무 슬러지(sugar beet sludge)를 포함할 수 있다.
상기 조성물 내 효소액의 농도는 1.0 mg/ml 내지 50.0 mg/ml일 수 있다.
본 발명에 따른 진세노사이드 컴파운드 케이의 제조방법은 (a) 아스퍼질러스 오라이제(Aspergillus oryzae) 균주를 질소원으로서, 옥수수 침지액 고형물(corn steep solid)을 포함하는 발현 배지(특히, 탄소원으로서, 사탕무 슬러지(sugar beet sludge))에서 배양하여 효소액을 수득하는 단계; 및 (b) 상기 수득한 효소액을 기질에 처리하는 단계를 포함하는바, 비용이 저렴한 탄소원 및 질소원을 이용하되, 기질 내 프로토파낙사다이올계 사포닌의 최적 가수분해를 통해 진세노사이드 컴파운드 케이를 높은 생산성 및 수율로 제조할 수 있다.
특히, 아스퍼질러스 오라이제(Aspergillus oryzae) 균주는 식품에 이용가능한 안전한 곰팡이인바, 상기와 같은 방법으로 제조된 진세노사이드 컴파운드 케이는 식품용으로 유용하게 활용될 수 있는 이점을 가진다.
도 1(a)는 발현 배지의 탄소원을 다양하게 하여 세포 외 효소액을 배양한 경우, 그 활성도를 나타낸 그래프이고, 도 1(b)는 발현 배지의 질소원을 다양하게 하여 세포 외 효소액을 배양한 경우, 그 활성도를 나타낸 그래프이다.
도 2는 세포 외 효소액의 온도 변화에 따른 활성도 및 안정성을 나타낸 그래프이다.
도 3은 세포 외 효소액의 pH 변화에 따른 활성도 및 안정성을 나타낸 그래프이다.
도 4(a) 및 (b)는 최적화된 발현 배지를 통해 배양된 세포 외 효소액을 인삼 뿌리 추출물 및 진토닌이 제거된 인삼 뿌리 추출물에 각각 처리한 경우, 진세노사이드 컴파운드 케이의 제조를 시간별로 나타낸 그래프이다.
본 발명자들은 아스퍼질러스 오라이제(Aspergillus oryzae) 효소액을 이용한 진세노사이드 컴파운드 케이를 제조함에 있어서, 이의 생산성 및 수율을 높이기 위한 방법을 연구하던 중, 아스퍼질러스 오라이제(Aspergillus oryzae) 효소액으로, 질소원 및 탄소원이 최적화된 발현 배지를 통해 아스퍼질러스 오라이제(Aspergillus oryzae) 균주를 배양하고, 이의 세포 외 효소액의 우수한 활성도를 확인한 다음, 프로토파낙사다이올계 사포닌을 포함하는 기질에 처리하여 진세노사이드 컴파운드 케이를 제조함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 명세서 내 "진세노사이드 컴파운드 케이(C-K)"라 함은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 의미하는 것으로, 종래부터 다양한 생리 활성이 보고된 바 있다:
[화학식 1]
Figure pat00001
진세노사이드 컴파운드 케이의 제조방법
본 발명은 (a) 아스퍼질러스 오라이제(Aspergillus oryzae) 균주를 질소원으로서, 옥수수 침지액 고형물(corn steep solid)을 포함하는 발현 배지에서 배양하여 효소액을 수득하는 단계; 및 (b) 상기 수득한 효소액을 기질에 처리하는 단계를 포함하는 진세노사이드 컴파운드 케이의 제조방법을 제공한다.
먼저, 본 발명에 따른 진세노사이드 컴파운드 케이의 제조방법은 아스퍼질러스 오라이제(Aspergillus oryzae) 균주를 질소원으로서, 옥수수 침지액 고형물(corn steep solid)을 포함하는 발현 배지에서 배양하여 효소액을 수득하는 단계[(a) 단계]를 포함한다.
상기 아스퍼질러스 오라이제(Aspergillus oryzae) 균주는 식품에 이용가능한 상업용 곰팡이로서, 자낭균류 누룩곰팡이속에 속한다. 상기 아스퍼질러스 오라이제(Aspergillus oryzae) 균주는 아스퍼질러스 오라이제(Aspergillus oryzae) 균주(KACC 40250)인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 구체적으로, 본 발명자들은 농촌진흥청 국립농원과학원(KACC)으로부터 분양받은 약 40종의 아스퍼질러스 오라이제(Aspergillus oryzae) 균주를 선별하는 과정에서, 가장 활성이 우수한 균주로서, 아스퍼질러스 오라이제(Aspergillus oryzae) 균주(KACC 40250)를 선택하였다.
상기 아스퍼질러스 오라이제(Aspergillus oryzae) 균주로부터 배양액을 수득하기 위해서는, 상기 균주를 평판배양하여 포자를 수득하는 단계; 상기 포자를 성장 배지에서 배양하여 균사를 활성화시키는 단계; 및 상기 성장 배지를 제거한 후, 상기 활성화된 균사를 발현 배지로 옮겨 배양하여 배양액을 수득하는 단계를 포함한다.
추가적으로, 상기 배양액으로부터 세포 외 효소액을 수득하기 위해서는, 상기 배양액을 여과하는 단계; 상기 여과액을 회수하여 황산암모늄을 첨가 및 혼합하여 효소 침전액을 수득하는 단계; 상기 효소 침전액을 투석막에 넣어 투석하는 단계; 및 센트리콘을 이용하여 남은 염을 추가 제거 및 농축하는 단계를 포함한다.
즉, 상기 아스퍼질러스 오라이제(Aspergillus oryzae) 효소액은 발현 배지를 통해 아스퍼질러스 오라이제(Aspergillus oryzae) 균주를 배양함으로써 수득될 수 있는데, 본 발명에서는 상기 발현 배지를 최적화시킨 것을 특징으로 한다.
상기 발현 배지는 질소원으로서, 옥수수 침지액 고형물(corn steep solid)을 포함하는 것을 특징으로 하는바, 진세노사이드 Rb1 또는 Rc를 진세노사이드 컴파운드 케이로 효과적으로 전환할 수 있다. 그밖에, 진세노사이드 Rb2를 진세노사이드 컴파운드 케이의 전단계인 진세노사이드 컴파운드 와이로 전환할 수 있다. 이때, 옥수수 침지액 고형물(corn steep solid)은 옥수수 전분을 제조하는 과정 중 침지 공정에서 배출되는 부산물로서, 비용이 저렴한 이점을 가질 뿐만 아니라, 가용성 단백, 젖산, 당류, 비타민, 무기물 등을 함유하고 있어 영양가가 아주 높아 사료에 첨가하거나 미생물 배지의 질소원으로 적합하다.
상기 발현 배지 내 옥수수 침지액 고형물(corn steep solid)의 농도는 5 g/L 내지 15 g/L일 수 있고, 8 g/L 내지 12 g/L인 것이 바람직하고, 9 g/L 내지 11 g/L인 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
반면, 질소원으로서, 펩톤(peptone), 효모 추출물(yeast extract) 또는 요소(urea)를 사용한 경우에는, 세포 외 효소액의 활성도가 낮아, 진세노사이드 Rb1 또는 Rc를 진세노사이드 컴파운드 케이로 전환하는 정도가 미미하다.
또한, 상기 발현 배지는 탄소원으로서, 셀룰로오스(cellulose), 밀기울(wheat bran) 또는 사탕무 슬러지(sugar beet sludge)를 포함할 수 있고, 사탕무 슬러지(sugar beet sludge)를 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 마찬가지로, 진세노사이드 Rb1 또는 Rc를 진세노사이드 컴파운드 케이로 효과적으로 전환할 수 있다. 그밖에, 진세노사이드 Rb2를 진세노사이드 컴파운드 케이의 전단계인 진세노사이드 컴파운드 와이로 전환할 수 있다. 이때, 사탕무 슬러지(sugar beet sludge)는 사탕무를 이용하여 설탕을 제조하는 공정에서 배출되는 부산물로서, 비용이 저렴한 이점을 가질 뿐만 아니라, 미생물 배지의 탄소원으로 적합하다.
상기 발현 배지 내 사탕무 슬러지(sugar beet sludge)의 농도는 15 g/L 내지 25 g/L일 수 있고, 18 g/L 내지 22 g/L인 것이 바람직하고, 19 g/L 내지 21 g/L인 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
반면, 탄소원으로서, 아라비노갈락탄(arabino-galactan)을 사용한 경우에는, 세포 외 효소액의 활성도가 낮아, 진세노사이드 Rb1 또는 Rc를 진세노사이드 컴파운드 케이로 전환하는 정도가 미미하다.
그밖에, 상기 발현 배지는 KH2PO4, MgSO4·7H2O, CaCl2, FeSO4·7H2O, ZnSO4·7H2O, MnSO4·H2O 및 CoCl2·6H2O 를 추가로 포함할 수 있는데, 구체적으로, KH2PO4 1~3 g/L, MgSO4·7H2O 0.1~1.0 g/L, CaCl2 0.1~1.0 g/L, FeSO4·7H2O 1.0~10.0 mg/L, ZnSO4·7H2O 0.5~5.0 mg/L, MnSO4·H2O 0.5~5.0 mg/L 및 CoCl2·6H2O 1.0~10.0 mg/L 를 추가로 포함할 수 있다.
한편, 상기 아스퍼질러스 오라이제(Aspergillus oryzae) 효소액은 전술한 바와 같이, 상기 아스퍼질러스 오라이제(Aspergillus oryzae) 균주의 세포 외 효소액일 수 있다.
다음으로, 본 발명에 따른 진세노사이드 컴파운드 케이의 제조방법은 상기 수득한 효소액을 기질에 처리하는 단계[(b) 단계]를 포함한다.
상기 기질은 인삼 추출물일 수 있고, 상기 인삼 추출물은 인삼의 뿌리, 열매, 줄기 또는 잎을 용매 추출한 것일 수 있다. 이때, 용매 추출은 물, C1 내지 C2의 저급 알코올 또는 이들의 혼합물을 용매로 하여 수행될 수 있고, 상기 저급 알코올은 에탄올 또는 메탄올일 수 있다.
한편, 상기 기질은 진세노사이드 Rb1, 진세노사이드 Rb2, 진세노사이드 Rc 및 진세노사이드 Rd 로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 프로토파낙사다이올계 사포닌을 포함할 수 있고, 진세노사이드 Rb1, 진세노사이드 Rc 및 진세노사이드 Rd 로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 프로토파낙사다이올계 사포닌을 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 기질 내 프로토파낙사다이올계 사포닌의 농도는 0.5 mg/ml 내지 20 mg/ml일 수 있고, 0.5 mg/ml 내지 10 mg/ml인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기 처리는 pH 4.0~5.5 및 45~60℃ 조건에서 10 시간 내지 100 시간 동안 수행될 수 있다. 상기 처리를 위한 pH 조건은 pH 4.0~5.0인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 구체적으로, 45℃의 온도에서 세포 외 효소액의 활성을 100%라 할 때, 45℃ 미만의 온도에서 상대적 활성이 70% 미만으로 감소할 수 있고, 24시간 이상 기질과 반응시 60℃를 초과하는 온도에서 상대적 활성이 40% 미만으로 감소할 수 있다. 이러한 pH 조건을 유지하기 위해서 반응용매로 완충용액을 사용할 수 있다.
또한, 상기 처리를 위한 온도 조건은 45~55℃인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 구체적으로, pH 4.5에서 세포 외 효소액의 활성을 100%라 할 때, pH 4.0 미만에서 상대적 활성이 30%로 감소할 수 있고, 24시간 이상 기질과 반응시 pH 4.5을 초과하는 pH에서 상대적 활성이 50% 미만으로 감소할 수 있다.
즉, 이러한 pH 및 온도 조건을 유지함으로써, 세포 외 효소액의 활성도가 높으면서도, 오랜 시간 반응에도 세포 외 효소액의 안정성을 유지할 수 있다. 따라서, 기질 내 프로토파낙사다이올계 사포닌의 최적 가수분해를 통해 최종적으로 진세노사이드 컴파운드 케이를 높은 생산성 및 수율로 제조할 수 있다.
또한, 상기 처리는 10 시간 내지 100 시간 동안 수행되는 것이 바람직하고, 30 시간 내지 100 시간 동안 수행되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
한편, 상기 처리를 통한 경우, 진세노사이드 컴파운드 케이 외에, 부산물로서, 진세노사이드 컴파운드 와이를 제조할 수 있다. 상기 진세노사이드 컴파운드 케이 및 상기 진세노사이드 컴파운드 와이의 몰비는 8:2 내지 9:1일 수 있다.
진세노사이드 컴파운드 케이 제조용 조성물
본 발명은 아스퍼질러스 오라이제(Aspergillus oryzae) 균주를 질소원으로서, 옥수수 침지액 고형물(corn steep solid)을 포함하는 발현 배지에서 배양시킨 효소액을 포함하는 진세노사이드 컴파운드 케이 제조용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 진세노사이드 컴파운드 케이 제조용 조성물은 아스퍼질러스 오라이제(Aspergillus oryzae) 균주를 질소원으로서, 옥수수 침지액 고형물(corn steep solid)을 포함하는 발현 배지에서 배양시킨 효소액을 포함하는데, 상기 발현 배지는 탄소원으로서, 셀룰로오스(cellulose), 밀기울(wheat bran) 또는 사탕무 슬러지(sugar beet sludge)를 포함할 수 있다.
상기 아스퍼질러스 오라이제(Aspergillus oryzae) 균주, 상기 발현 배지 및 상기 효소액에 대해서는 전술한바 있으므로, 중복 설명을 생략하기로 한다.
상기 조성물 내 효소액의 농도는 1.0 mg/ml 내지 50.0 mg/ml일 수 있고, 5.0 mg/ml 내지 50.0 mg/ml인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기 조성물은 기질에 처리하기 위한 것일 수 있다.
상기 기질은 인삼 추출물일 수 있고, 상기 인삼 추출물은 인삼의 뿌리, 열매, 줄기 또는 잎을 용매 추출한 것일 수 있다. 이때, 용매 추출은 물, C1 내지 C2의 저급 알코올 또는 이들의 혼합물을 용매로 하여 수행될 수 있고, 상기 저급 알코올은 에탄올 또는 메탄올일 수 있다.
한편, 상기 기질은 진세노사이드 Rb1, 진세노사이드 Rb2, 진세노사이드 Rc 및 진세노사이드 Rd 로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 프로토파낙사다이올계 사포닌을 포함할 수 있고, 진세노사이드 Rb1, 진세노사이드 Rc 및 진세노사이드 Rd 로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 프로토파낙사다이올계 사포닌을 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 기질 내 프로토파낙사다이올계 사포닌의 농도는 0.5 mg/ml 내지 20 mg/ml일 수 있고, 0.5 mg/ml 내지 10 mg/ml인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기한 바와 같이, 본 발명에 따른 진세노사이드 컴파운드 케이의 제조방법은 (a) 아스퍼질러스 오라이제(Aspergillus oryzae) 균주를 질소원으로서, 옥수수 침지액 고형물(corn steep solid)을 포함하는 발현 배지(특히, 탄소원으로서, 사탕무 슬러지(sugar beet sludge))에서 배양하여 효소액을 수득하는 단계; 및 (b) 상기 수득한 효소액을 기질에 처리하는 단계를 포함하는바, 비용이 저렴한 탄소원 및 질소원을 이용하되, 기질 내 프로토파낙사다이올계 사포닌의 효과적인 가수분해를 통해 진세노사이드 컴파운드 케이를 높은 생산성 및 수율로 제조할 수 있다.
특히, 아스퍼질러스 오라이제(Aspergillus oryzae) 균주는 식품에 이용가능한 안전한 곰팡이인바, 상기와 같은 방법으로 제조된 진세노사이드 컴파운드 케이는 식품용으로 유용하게 활용될 수 있는 이점을 가진다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 탄소원 및 질소원에 따른 진세노사이드 컴파운드 케이로의 전환 비교
본 발명에서는 아스퍼질러스 오라이제(Aspergillus oryzae) 효소액을 이용하여 진세노사이드 컴파운드 케이를 제조함에 있어서, 아스퍼질러스 오라이제(Aspergillus oryzae) 균주의 발현 배지를 최적화하였다.
구체적으로, 농촌진흥청 국립농원과학원(KACC)으로부터 분양받은 아스퍼질러스 오라이제(Aspergillus oryzae) 균주(KACC 40250)를 감자한천배지(Potato dextrose agar medium, PDA)에서 26℃에서 7일간 평판배양하였다. 평판배양된 접시(plate)내의 포자를 거즈에 걸러 회수하고 4㎖의 액상 감자배지(Potato dextrose medium, PDB)에 포자 농도가 1.0 X 106 spores/mL 농도로 희석한 포자액을 1 ㎖ 접종하고, 26℃ 및 150 rpm으로 24시간 동안 성장배양하였다. 성장배양으로 만들어진 성장배양액 내의 균사를 탄소원 및 질소원이 제외된 발현 배지로 세척하여 균사만 100㎖의 발현 배지에 옮긴 후, 26℃ 및 150 rpm으로 6일간 배양하였다.
이때, 발현 배지의 조성은 탄소원 20 g/L, 질소원 10 g/L, KH2PO4 2 g/L, MgSO4·7H2O 0.3 g/L, CaCl2 0.3 g/L, FeSO4·7H2O 5.0 mg/L, ZnSO4·7H2O 1.4 mg/L, MnSO4·H2O 1.3 mg/L 및 CoCl2·6H2O 3.7 mg/L 이다.
탄소원으로서, 셀룰로오스(cellulose)(㈜ 대정화금), 밀기울(wheat bran)(심즈펫), 아라비노갈락탄(arabino-galactan)(바이탈 뉴트리언츠 사) 및 사탕무 슬러지(sugar beet sludge)(중국 상하이 홀리메드켐 사)로 총 4가지를 사용하였고, 질소원으로서, 펩톤(peptone)(벡톤디킨슨 사), 옥수수 침지액 고형물(corn steep solid)(시그마 알드리치 사), 효모 추출물(yeast extract)(두체파 사) 및 요소(urea)(㈜ 대정화금)로 총 4가지를 사용하였다.
그 다음, 배양액을 와트만 여과지를 사용하여 여과한 후, 여과액을 회수하여 황산암모늄을 40 ~ 80 % 포화가 되도록 첨가하고 24시간 동안 혼합하여 효소 침전액을 수득하였다. 효소 침전액 내의 황산암모늄을 제거하기 위해 셀룰로오스 투석막을 이용하여 50 mM의 맥킬바인(Mcilvaine) 완충용액으로 24 시간 동안 투석하고, 센트리콘을 이용하여 남은 황산암모늄 추가 제거 및 농축을 진행하여 세포 외 효소액을 수득하였다.
그 다음, 세포 외 효소액 1.0 mg/ml 및 기질로서, 진세노사이드 Rb1, Rb2 및 Rc 0.4 mg/ml가 함유된 완충용액을 50℃ 및 pH 4.5에서 24시간 동안 반응시켜, 세포 외 효소액의 활성도를 측정하였다.
그 결과, 도 1(a)에 나타난 바와 같이, 탄소원으로, 셀룰로오스(cellulose), 밀기울(wheat bran) 및 사탕무 슬러지(sugar beet sludge)(특히, 사탕무 슬러지(sugar beet sludge))를 사용한 경우, 세포 외 효소액의 활성도가 높은 것으로 확인된다. 또한, 도 1(b)에 나타난 바와 같이, 질소원으로, 옥수수 침지액 고형물(corn steep solid)을 사용한 경우, 세포 외 효소액의 활성도가 특히 높은 것으로 확인된다.
한편, 기질로서, 진세노사이드 Rb1 및 Rc를 사용한 경우에는 진세노사이드 컴파운드 케이(C-K)로 전환되는 양상을 확인할 수 있었지만, 기질로서, 진세노사이드 Rb2를 사용한 경우에는 진세노사이드 컴파운드 케이의 전단계인 진세노사이드 컴파운드 와이(C-Y)로의 전환까지만 확인할 수 있었다.
따라서, 최적화된 발현 배지의 조성은 사탕무 슬러지(sugar beet sludge) 20 g/L, 옥수수 침지액 고형물(corn steep solid) 10 g/L, KH2PO4 2 g/L, MgSO4·7H2O 0.3 g/L, CaCl2 0.3 g/L, FeSO4·7H2O 5.0 mg/L, ZnSO4·7H2O 1.4 mg/L, MnSO4·H2O 1.3 mg/L 및 CoCl2·6H2O 3.7 mg/L 이다.
실시예 2: 세포 외 효소액의 온도 및 pH 변화에 따른 활성도 및 안정성 확인
본 발명에서는 최적화된 발현 배지를 통해 배양된 세포 외 효소액의 온도 및 pH 변화에 따른 활성도 및 안정성을 확인하였다.
(1) 세포 외 효소액에 대한 온도 효과 확인
세포 외 효소액에 대한 온도 효과를 확인하기 위해서, 세포 외 효소액 0.05 mg/ml 및 1mM 파라-니트롤페닐 글루코오스가 함유된 완충용액(pH 4.5)을 45℃ 내지 65℃의 범위에서 20분 동안 반응시킨 다음, Na2CO3를 첨가하여 반응을 종결시키고 450nm의 흡광도에서 흡광값을 측정하여 세포 외 효소액의 활성도(글리코시다아제 활성)를 확인하였다.
한편, 세포 외 효소액을 45℃ 내지 65℃의 범위에서 24시간 동안 방치한 후, 세포 외 효소액 0.05 mg/ml 및 1mM 파라-니트롤페닐 글루코오스가 함유된 완충용액(pH 4.5)을 60℃에서 20분 동안 반응시켰다. 그 다음, Na2CO3를 첨가하여 반응을 종결시키고 450nm의 흡광도에서 흡광값을 측정하여 세포 외 효소액의 안정성(글리코시다아제 활성)를 확인하였다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 세포 외 효소액의 활성도가 높은 온도는 60℃인 것으로 확인되나, 60℃에서 세포 외 효소액의 안정성은 45℃에서 세포 외 효소액의 안정성에 비해, 42% 정도로 크게 저하되는 양상이 나타났다. 따라서, 세포 외 효소액의 활성도가 높으면서도, 오랜 시간 반응에도 세포 외 효소액의 안정성을 유지하는 온도인 50℃가 최적 온도인 것으로 확인된다.
(2) 세포 외 효소액에 대한 pH 효과 확인
세포 외 효소액에 대한 pH 효과를 확인하기 위하여, 세포 외 효소액 0.05 mg/ml 및 1mM 파라-니트롤페닐 글루코오스가 함유된 완충용액을 50℃에서 pH 3.5 내지 5.5의 범위로 20분 동안 반응시킨 다음, Na2CO3를 첨가하여 반응을 종결시키고 450nm의 흡광도에서 흡광값을 측정하여 세포 외 효소액의 활성도(글리코시다아제 활성)를 확인하였다.
한편, 세포 외 효소액을 50℃에서 pH 3.5 내지 5.5의 범위로 24시간 동안 방치한 후, 센트리콘을 이용하여 pH를 4.5로 바꾼 다음, 세포 외 효소액 0.05 mg/ml 및 1mM 파라-니트롤페닐 글루코오스가 함유된 완충용액(pH 4.5)을 50℃ 에서 20분 동안 반응시켰다. 그 다음, Na2CO3를 첨가하여 반응을 종결시키고 450nm의 흡광도에서 흡광값을 측정하여 세포 외 효소액의 안정성(글리코시다아제 활성)를 확인하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 세포 외 효소액의 활성도 및 안정성이 높은 pH는 모두 4.5인 것으로 확인된다. pH가 4.5 미만인 경우, 세포 외 효소액의 활성도가 저하되는 양상을 보였고, pH가 4.5 를 초과하는 경우, 오랜 시간 반응에 세포 외 효소액의 안정성이 저하되는 양상을 보였다.
실시예 3: 세포 외 효소액을 이용한 진세노사이드 컴파운드 케이의 제조
본 발명에서는 최적화된 발현 배지를 통해 배양된 세포 외 효소액을 이용하여 진세노사이드 컴파운드 케이를 제조하였다.
먼저, 세포 외 효소액 5.0 mg/ml를 기질로서, 프로토파낙사다이올계 사포닌 1.0 mg/ml을 포함하는 인삼 뿌리 추출물에 처리함에 있어, 50℃ 및 pH 4.5에서 72 시간 동안 반응시켰다.
그 결과, 도 4(a)에 나타난 바와 같이, 72 시간 동안 반응 후, 진세노사이드 Rb1, Rc 및 Rd가 모두 진세노사이드 컴파운드 케이로 모두 전환되고, 진세노사이드 Rb2가 진세노사이드 컴파운드 와이로 전환되는 것으로 확인된다. 즉, 프로토파낙사다이올계 사포닌인 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc 및 Rd로부터 진세노사이드 컴파운드 케이로의 전환 수율이 85 몰%인 것으로 확인된다.
다음으로, 세포 외 효소액 25.0 mg/ml를 기질로서, 프로토파낙사다이올계 사포닌 1.0 mg/ml을 포함하되, 진토닌 10.0mg/ml가 제거된 인삼 뿌리 추출물에 처리함에 있어, 50℃ 및 pH 4.5에서 72 시간 동안 반응시켰다.
그 결과, 도 4(b)에 나타난 바와 같이, 72 시간 동안 반응 후, 진세노사이드 Rb1, Rc 및 Rd가 모두 진세노사이드 컴파운드 케이로 모두 전환되고, 진세노사이드 Rb2가 진세노사이드 컴파운드 와이로 전환되는 것으로 확인된다. 즉, 프로토파낙사다이올계 사포닌인 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc 및 Rd로부터 진세노사이드 컴파운드 케이로의 전환 수율이 87 몰%인 것으로 확인된다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (11)

  1. (a) 아스퍼질러스 오라이제(Aspergillus oryzae) 균주를 질소원으로서, 옥수수 침지액 고형물(corn steep solid)을 포함하는 발현 배지에서 배양하여 효소액을 수득하는 단계; 및
    (b) 상기 수득한 효소액을 기질에 처리하는 단계를 포함하는
    진세노사이드 컴파운드 케이의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 (a) 단계에서 아스퍼질러스 오라이제(Aspergillus oryzae) 균주는 아스퍼질러스 오라이제(Aspergillus oryzae) 균주(KACC 40250)인, 진세노사이드 컴파운드 케이의 제조방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 (a) 단계에서 발현 배지는 탄소원으로서, 셀룰로오스(cellulose), 밀기울(wheat bran) 또는 사탕무 슬러지(sugar beet sludge)를 포함하는, 진세노사이드 컴파운드 케이의 제조방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 (a) 단계에서 발현 배지는 KH2PO4, MgSO4 .7H2O, CaCl2, FeSO4 .7H2O, ZnSO4 .7H2O, MnSO4 . H2O 및 CoCl2 .6H2O 를 추가로 포함하는, 진세노사이드 컴파운드 케이의 제조방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 (a) 단계에서 효소액은 상기 아스퍼질러스 오라이제(Aspergillus oryzae) 균주의 세포 외 효소액인, 진세노사이드 컴파운드 케이의 제조방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 (b) 단계에서 기질은 인삼 추출물이거나; 진세노사이드 Rb1, 진세노사이드 Rb2, 진세노사이드 Rc 및 진세노사이드 Rd 로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 프로토파낙사다이올계 사포닌을 포함하는, 진세노사이드 컴파운드 케이의 제조방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 (b) 단계에서 기질 내 프로토파낙사다이올계 사포닌의 농도는 0.5 mg/ml 내지 20 mg/ml인, 진세노사이드 컴파운드 케이의 제조방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 (b) 단계에서 처리는 pH 4.0~5.5 및 45~60℃ 조건에서 10 시간 내지 100 시간 동안 수행되는 것인, 진세노사이드 컴파운드 케이의 제조방법.
  9. 아스퍼질러스 오라이제(Aspergillus oryzae) 균주를 질소원으로서, 옥수수 침지액 고형물(corn steep solid)을 포함하는 발현 배지에서 배양시킨 효소액을 포함하는 진세노사이드 컴파운드 케이 제조용 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 발현 배지는 탄소원으로서, 셀룰로오스(cellulose), 밀기울(wheat bran) 또는 사탕무 슬러지(sugar beet sludge)를 포함하는, 진세노사이드 컴파운드 케이의 제조용 조성물.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 조성물 내 효소액의 농도는 1.0 mg/ml 내지 50.0 mg/ml인, 진세노사이드 컴파운드 케이 제조용 조성물.
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