KR20000076016A - 병원체 표적화를 위한 감광제 결합체 - Google Patents

Abstract

비항체성이고 쌍을 이루지 않는 친화성 표적부와 결합된 감광제 조성물을 포함하는 결합체 분자 및 상기 결합체를 제조하고 이용하는 방법이 기재되어 있다.

Description

병원체 표적화를 위한 감광제 결합체 {PHOTOSENSITIZER CONJUGATES FOR PATHOGEN TARGETING}

감염성 질병은 대체로 박테리아의 다중 항생제 내성 균주, 새로 발견된 바이러스성 질병, 및 광범위한 진균성 및 원충성 질병의 출현으로 인해, 미결의 문제로 남아있다.

진행된 치주위 질환은 다수의 구강 감염성 질병의 하나이며, 30세 이상에서의 치아 손실의 주요 원인이다. 치아 플라크내 박테리아 세포와 그 산물 사이의 상호작용 및 숙주의 방어 메커니즘으로부터 치주위 질병이 발생한다 [Antczak-Bouckoms, A., (1994), J. Dent. Educ. 58:625-640]. 현재의 치료는 비효율적일 수 있는 플라크와 박테리아의 기계적 제거[Unsal E. et al., (1995), J. Periodontol. 66:47-51] 또는 박테리아의 내성을 유발할 수 있는 항생제 치료[Olsvic, B. et al., (1995), J. Clin, Periodontol. 22:391-396]에 주로 의존하고 있다.

광역학적 치료법(PDT)은 구강 박테리아와 국소적 감염 및 위장관 감염의 박테리아를 제거하는 흥미있는 방법으로서 제안되었는데, 그 이유는 이들 부위가 상대적으로 빛에 접근하기 쉽기 때문이다. 예를 들어, 섬유 광학은 치아 포켓에 빛을 전달하는 데 이용할 수 있다 [Wilson, M., (1993), J. Appl. Bacteriol 75:299-306].

본 발명은 감광제와 표적부를 포함하는 결합체(conjugate) 및 그 결합체의 사용 방법에 관한 것이다.

도1는 다른 전하의 클로린 e6 폴리리신 결합체를 합성하기 위한 제1반응의 도식이다. 화살표 1은 디시클로헥실카르보디이미드 및 디메틸 설폭시드의 존재하에 클로린 e6, 분자 I과 N-히드록시숙신이미드를 반응시켜 클로린 e6-NHS 에스테르, 분자 Ⅱ를 형성하는 것을 나타낸다.

도2는 분자 Ⅱ와 폴리-L-리신, 분자 Ⅳ를 반응시켜 폴리-L-리신 클로린 e6, 분자 Ⅲ을 형성시키는 반응 2의 도식이다.

도3는 히스타틴-5의 각 리신 잔기의 ε-아미노기에 각각 결합된 4개의 클로린 e6기를 가진 히스타틴-5-클로린 e6 결합체의 화학 구조를 나타내는 도식이다.

도4는 DMSO 중에서 분자 Ⅲ을 아세트산 무수물 또는 숙신산 무수물과 반응시켜 2종의 분자 Ⅴ를 형성하는 반응을 나타내는 도식으로서, 클로린 e6 폴리리신 아세트산 아미드 중성 결합체에 있어서 R기는 -COCH₃을 나타내고, 클로린 e6 폴리리신 숙신산 아미드에 대해 R기는 -COCH₂CH₂COOH를 나타내고; 분자 Ⅲ은 더 이상 아실화되지 않기 때문에 Ⅴ에서 R기는 -H이다.

도5는 히스타틴-5 16 아미노 잔기 단편을 가진 양이온, 중성 및 음이온성 클로린 e6 폴리리신 결합체를 합성하기 위한 제1반응의 도식이다. 이는 DMSO 중에서 분자 Ⅴ, 폴리리신-클로린 e6과 N-숙신이미딜-3-[2-피리딜디티올] 프로피오네이트 (SPDP)를 반응시켜 폴리리신-클로린 e6-SPDP, 분자 Ⅵ를 생성하는 것을 도시하는 반응 4 및 DMSO 중에서 분자 Ⅵ을 아세트산 무수물 또는 숙신산 무수물과 반응시켜 아세틸 및 숙시닐 유도체(분자 Ⅶ내의 R은 각각 나타냄)를 생성하는 것을 도시하는 반응 6에 의해 설프히드릴 반응성 작용기, 2-피리딜-디티오-3-프로피오닐을 함유하는 분자의 합성에 의한다.

도6는 분자 Ⅶ 과 사람 히스타틴-5의 16 아미노산 잔기 단편의 분자를 추가로 반응시켜 결합체를 합성시키는 것을 나타내는 도식이다. 이는 반응 6에서 히스타틴-5 단편과 SATA를 반응시켜 SATA-히스타틴-5 단편, 분자 Ⅸ를 생성하고, 이어서 반응 7에서 분자 Ⅸ는 히드록실아민에 의해 탈보호되어 히스티틴-5 단편, 분자 Ⅹ에 결합되고 탈보호된 SATA를 생성하는 것이 의한다.

도7는 폴리리신-클로린 e6 분자 및 아세틸 각각에 결합된 분자 Ⅹ와 분자 Ⅶ 유도체를 반응시켜 분자 ⅩI을 생성하는 반응 8을 나타내는 도식이다. 상기 분자 ⅩI에서, R은 양전하를 갖는 비아실화 결합체에 대해서는 -H를 나타내고, 중성 아세트산 아미드에 대해서는 -COCH₃를 나타내고, 음전하를 갖는 숙신산 아미드에 대해서는 -COCH₂CH₂COOH를 나타낸다.

도8은 클로린 농도(μM)의 함수로서, 원을 연결하는 완전한 라인에 의해 도시된 양이온성 결합체의 섭취, 사각셩을 연결하는 대시 선에 의해 도시된 숙시닐화 결합체의 섭취, 및 완전한 원형을 연결하는 도트 선에 의해 도시된 중성 아세틸화 결합체의 섭취와 함께 포르피로모나스 진지발리스에 의한 세포 단백질 mg당 10-8 mol의 클로린 e6에서 3개의 폴리리신 클로린 e6 결합체의 섭취에 대한 그래프이다.

도9는 도8의 범례에서 기재된 각각의 결합체를 나타내는 기호와 함께, 클로린 농도(pM)의 함수로서, 햄스터 볼의 주머니 판상 세포의 암세포에 의해 세포 단백질 mg당 10-11 mol의 클로린 e6에서 3개의 클로린 e6 결합체의 섭취에 대한 그래프이다.

도10는 빛의 영향력의 함수로서, 도8의 범례에서 표지된 기호에 따라 클로린 e6 결합체를 이미 부착한 세포, 포토프린Ⅱ를 부착한 추가의 세포 샘플(x 기호를 연결하는 대시 선으로 도시됨)및 벤조포르피린 유도체를 부착한 다른 세포 샘플(완전한 삼각형을 연걸하는 굵은 대시 선으로 도시됨)을 파장 630 내지 710 nm의 빛으로 조사한 후 P. 진지발리스의 생존에 대한 그래프이다.

도11은 빛의 영향력의 함수로서, 도8의 기호로 표지된 클로린 e6 결합체를 이미 가지고 있는 세포를 파장 630 내지 710 nm의 빛으로 조사한 후 HCPC-1 햄스터의 판상 세포 암세포의 생존에 대한 그래프이다.

발명의 개요

본 발명자는 감광제에 대한 표적부로서 지금까지 사용되지 않았던 분자류가 감광제를 표적화하는 데 사용될 수 있다는 것을 발견했다.

따라서, 본 발명은 예를 들어 NPM-폴리펩티드와 같은 쌍을 이루지 않는 멤버 (non-pair member; NPM) 부분과 결합된 감광제를 포함하는 결합체 분자를 특징으로 한다.

표적부가 폴리펩티드를 포함하는 구체예 중에서, 표적부는 선형, 분지형 또는 시클릭 폴리펩티드일 수 있다.

바람직한 구체예에서, 표적부는 소형 항-미생물성 펩티드(SAMP)를 포함한다. 히스타틴, 디펜신, 세크로핀, 마가이닌, 그람 양성 박테리오신 및 펩티드 항생제는 SAMP일 수 있다. 바람직한 구체예에서, 표적부는 박테리아성, 진균성, 동물성, 예를 들어 포유 동물(예: 사람), SAMP 또는 그 활성 단편 또는 유사체를 포함한다.

바람직한 구체예에서, 표적부는 디펜신, 또는 그것의 활성 단편 또는 유사체를 포함한다. 예를 들어, 디펜신은 예를 들어 HNP-1, -2, -3, 또는 -4와 같은 사람 디펜신; 예를 들어 GPNP와 같은 기니 피그 디펜신; 예를 들어 토끼 NP-1, -2, -3A, -3B, 또는 5와 같은 토끼 디펜신; 예를 들어, 래트 NP-1, -2, -3, 또는 -4와 같은 래트 디펜신; 뮤린 크립틴; 소의 과립구 박테네신 또는 인돌리시딘; 또는 소의 정액 플라스민일 수 있다.

바람직한 구체예에서, 표적부는 곤충에서 유래된 SAMP, 또는 그 활성 단편 또는 유사체, 예를 들어 멧누에 나방, 땅벌, 과일파리, 또는 다른 곤충에서 유래된 세크로핀, 꿀벌에서 유래된 아피대신, 또는 과일파리에서 유래된 아드로핀을 포함한다.

바람직한 구체예에서, 표적부는 양서류에서 유래된 SAMP, 또는 그것의 활성 단편 또는 유사체, 예를 들어, 마가이닌, PGLA, XPF, LPF, CPG, PGQ 봄비닌, 봄비닌과 유사한 펩티드 BLP-1, -2, -3 또는 -4, 또는 브레비닌을 포함한다.

바람직할 구체예에서, 표적부는 무척추동물의 SAMP, 또는 그것의 활성 단편 또는 유사체, 예를 들어 호오스슈 게의 타키플레신 Ⅰ, Ⅱ 또는 Ⅲ, 또는 폴리페뮤신 Ⅰ 또는 Ⅱ을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 표적부는 어류에서 유래된, 예를 들어 파르닥신이다.

바람직한 구체예에서, 표적부는 박테리오신, 더 바람직하게는 그람 양성 박테리오신, 또는 그것의 활성 단편 또는 유사체, 예를 들어 니신, 서브틸린, 에피데르민, 갈리데르민, 살리바린 또는 락티신을 포함한다.

바람직한 구체예에서, 표적부는 펩티드 항생제, 또는 그것의 활성 단편 또는 유사체, 예를 들어 티로시딘, 또는 바시트라신을 포함한다.

바람직한 구체예에서, 표적부는 히스타틴, 또는 그것의 활성 단편 또는 유사체, 예를 들어 히스타틴-1 내지 -8, 바람직하게는 경구 히스타틴-1, -3을 포함한다. 바람직한 구체예에서 표적부로는 히스타틴-5 잔기 13-24, 또는 그에 상응하는 다른 히스타틴의 잔기를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 표적부는 내부 복제물을 포함하도록 조작된 히스타틴 분자를 포함한다.

바람직한 구체예에서, 표적부는 다당류 표적에 친화성이 있는 폴리펩티드, 예를 들어 렉틴을 포함한다. 예를 들어, 렉틴은 잡초, 콩, 뿌리, 나무 껍질, 해초, 진균, 박테리아 또는 무척추동물 렉틴일 수 있다. 바람직한 구체예에서, 표적부는 식물 폴리펩티드, 예를 들어 재크 콩의 렉틴(예: 콘카나발린 A), 또는 렌즈 콩의 렉틴(예; 렌즈 쿨리나리스)를 포함한다.

바람직한 구체예에서, 표적부는 타액성 폴리펩티드, 또는 그것의 활성 단편 또는 유사체를 포함한다. 타액성 폴리펩티드의 예로서 히스타틴(예를 들어, 히스타틴-1 내지 -8, 또는 더 바람직하게는 히스타틴-1, -3, 또는 -5)이 포함된다. 바람직한 구체예에서, 표적부는 히스타틴-5 잔기 13-24, 또는 다른 히스타틴의 상응하는 잔기를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 표적부는 내부 복제물을 포함하도록 조작된 히스타틴 분자를 포함한다.

바람직한 구체예에서, 표적부는 그람 음성 박테리오신, 예를 들어 콜리신 B, 콜리신 E1, 또는 콜리신 Ia를 포함한다.

바람직한 구체예에서, 표적부는 박테리아적으로 정교한 폴리펩티드, 예를 들어 니신, 서브틸린, 에피데르민, 갈리데르민, 살리바린 또는 락티신을 포함한다.

바람직한 구체예에서, 표적부는 분자, 예를 들어 항체 또는 수용체 리간드 쌍의 멤버외에 펩티드를 포함한다.

바람직한 구체예에서, 결합체는 PM, 항체, 효소, 호르몬, 세포 표면의 수용체, 또는 세포 표면의 수용체에 대한 리간드를 포함하지 않는다. 예를 들어, 결합체는 이들과 결합(예를 들어, 공유적 또는 비공유적으로 결합)하지 않는다.

바람직한 구체예에서, 표적부는 펩티드내 아미노산 잔기의 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 % 이상이 하나의 아미노산 잔기, 예를 들어 양 전하를 갖는 아미노산(예: 리신 잔기, 아르기닌 잔기 또는 오르니틴 잔기)인 펩티드를 포함한다. 특히 바람직한 표적부는 폴리아미노산, 예를 들어 폴리리신, 폴리아르기닌 또는 폴리오르니틴이다.

바람직한 구체예에서, 표적부는 양이온성이고; 분자당 +1, +2 또는 +3의 총 양전하를 가지며; +4이상의 총 양전하를 가지며; 양으로 양전하를 갖는 아미노산 잔기, 예를 들어 리신을 포함하며; 2, 3, 4개 또는 그 이상 양전하를 갖는 아미노산 잔기, 예를 들어 리신, 아르기닌 또는 오르니틴 잔기를 포함한다.

바람직한 구체예에서, 표적부는 음이온성이고; 분자당 -1, -2, 또는 -3의 총 음전하를 가지며; -4이상의 총 음전하를 가지며; 음으로 음전하를 갖는 아미노산 잔기, 예를 들어 아르파르트산 또는 글루탐산을 포함하며; 2, 3, 4개 또는 그 이상 음전하를 갖는 아미노산 잔기, 예를 들어 글루탐산을 포함하며; 10, 20, 30, 40, 또는 50% 이상 음전하를 갖는 아미노산 잔기, 예를 들어 아스파르트산 또는 글루탐산을 포함한다.

바람직한 구체예에서, 표적부는 거의 중성의 전하를 띄고; 중성 아미노산 잔기가 50, 60, 70, 80 또는 90% 이상인 아미노산 잔기(예: 세린, 트레오닌, 알라닌, 메티오닌, 시스테인 또는 발린)를 포함한다.

바람직한 구체예에서, 표적부는 분자량이 1200, 1800, 2400, 3000, 6000, 10,000, 25,000, 50,000, 100,000 또는 200,000 달톤 이상이다. 바람직한 구체예에서, 표적부는 분자량이 250,000, 150,000, 60,000, 25,000, 10,000, 8,000 또는 6,000 달톤 미만이다. 특히 바람직한 구체예에서, 표적부는 300 내지 1800, 600 내지 2,400, 1200 내지 6,000, 5,00 내지 8,000, 8000 내지 15,000, 15,000 내지 30,000, 35,000 내지 70,000, 70,000 내지 150,000, 또는 150,000 내지 300,000 달톤이다.

바람직한 구체예에서, 표적부는 길이가 3, 6, 12, 18, 24, 30, 60, 100, 250, 500, 1,000, 또는 2,5000 잔기 이상인 펩티드를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 표적부는 길이가 3,000, 1,500, 700, 300, 150, 100, 80, 60, 40, 30, 또는 15 잔기 미만인 펩티드이다. 특히 바람직한 구체예에서, 표적부는 길이가 6 내지 15, 12 내지 18, 18 내지 30, 20 내지 40, 30 내지 60, 80 내지 120, 150 내지 300, 300 내지 600, 800 내지 1,200 또는 2,000 내지 3,000 잔기의 펩티드를 포함한다.

바람직한 구체예에서, 표적부는 표적 유기체, 예를 들어 스타필로코쿠스 아우레우스, 클렙시엘라뉴모니아, 칸디다 알비칸스, 레슈마니아 도노바니, 또는 기아르디아 람블리아의 투과성 벽에서 공극을 형성하는 단백질을 포함한다,

바람직한 구체예에서, 표적부는 저밀도 지단백, 고밀도 지단백 또는 매우 저밀도의 지단백을 포함한다

바람직한 구체예에서, 친화성 선택 또는 선별을 위해 표적 유기체의 표면 분자를 사용하여 표적부를 선택했다. 예를 들어, 표적부는 화학적 또는 파지 디스플레이(phage display library)중에서 선택되었다.

바람직한 구체예에서, 표적부는 폴리리신 분자를 포함한다, 폴리리신은 길이가 6 내지 15, 12 내지 18, 18 내지 30, 20 내지 40, 30 내지 60, 80 내지 120, 150 내지 300, 300 내지 600, 800 내지 1,200 또는 2,000 내지 3,000 잔기일 수 있다.

바람직한 구체예에서, 표적부는 그것의 전하(예: 폴리아미노산의 하나 이상의 아미노산 잔기의 측쇄 전하)를 변화시키기 위해 화학적으로 변형된, 폴리아미노산과 같은 폴리펩티드를 포함한다. 예를 들어, 전하를 띠는 측쇄의 하나 이상, 또는 약 10, 25, 50, 75, 90, 또는 100%는 변형될 수 있다. 변형된다는 것은 음의 측쇄(예: 글루탐산 또는 아스파르트산)가 양 또는 중성 전하를 갖게 되고, 양전하를 갖는 측쇄(예: 리신, 아르기닌 또는 오르니틴)는 음 또는 중성 전하를 갖게 되는 것을 의미한다. 예를 들어, 폴리리신의 하나 이상의 측쇄가 중성 또는 음전하를 갖게 할 수 있다.

바람직한 구체예에서, 감광제는 적절한 에너지 레벨 및 파장에서 전자기 조사를 흡수하여 단일 밴드(singlet) 산소를 생성하고; 감광제는 포르피린 또는 포르피린 유도체를 포함하고; 감광제는 클로린 e6 또는 클로린 유도체를 포함한다.

바람직한 구체예에서, 결합체는 주쇄(backbone)의 멤버를 추가로 포함한다. 이러한 구체예에서, 주쇄는 감광제 및 표적부 모두에 결합된다. 또한, 주쇄 자체는 표적부, 예를 들어 폴리리신일 수 있다.

바람직한 구체예에서, 결합체 분자는 표적 유기체에 친화성을 가지고 있다. 표적 유기체는, 예를 들어 미생물(예: 박테리아 세포, 진균 세포, 원충 세포, 뉴모시스티스 카리니의 세포), 바이러스, 기생충 또는 절지 동물일 수 있다.

세포가 박테리아 세포인 바람직한 구체예에서, 박테리아 세포는 스타필로코쿠스, 스트렙토코쿠스, 엔테로코쿠스, 마이코박테리움, 슈도모나스, 살모넬라, 시겔라, 에스케리키아, 에르위니아, 클렙시엘라, 보렐리아, 트레포네마, 캄필로박터, 헬리코박터, 보르데텔라, 네이세리아, 레지오넬라, 렙토스피라, 세르풀리나. 마이코플라스마, 박테로이데스, 클렙시엘라, 예르시니아, 클라미디아, 비브리오, 악티노바실러스, 포르피리아, 헤모필러스, 파스퇴렐라, 펩토스트렙토코쿠스, 리스테리아, 프로피오니박테리움, 마이코박테리음, 코리네박테리움 또는 데르마토필러스 세포일 수 있다.

세포가 진균 세포인 바람직한 구체예에서, 세포는 칸디다 또는 아스페르질루스 세포일 수 있다.

바람직한 구체예에서, 유기체는 뉴모시스티나 카리니이다.

표적 유기체가 원충 세포인 바람직한 구체예에서, 세포는 엔타모에바, 토소플라스마, 기아르디아, 레슈마니아, 크립토스포리듐 또는 시스토소마이다.

표적 유기체기 바이러스인 바람직한 구체예에서, 바이러스는 HIV, HTLV, 간염 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 리노바이러스, 파필로마 바이러스, 홍역 바이러스, 헤르페스 바이러스, 로타바이러스, 파르보바이러스, 시타코시스 바이러스, 또는 에볼라 바이러스이다.

표적 유기체가 절지 동물인 바람직한 구체예에서, 절지 동물은 기생 진드기이다.

표적 유기체가 기생충인 바람직한 구체예에서, 기생충은 선충류 또는 흡충류이다.

바람직한 구체예에서, 표적부는 구강 박테리아 종, 예를 들어 포르피로모나스 (박테로이데스) 진지발리스이다.

다른 측면에서, 본 발명은 쌍을 이루지 않는 멤버(NPM) 표적부에 결합된 감광제 및 약학적 허용 담체를 포함하는 결합체 분자를 특징으로 한다.

다른 측면에서, 본 발명은 구강 박테리아 종에 대해 친화성이 있는, 쌍을 이루지 않는 멤버(NPM) 폴리펩티드부를 포함하는 표적부에 결합된 감광제를 포함하는 결합체 분자를 특징으로 한다.

표적부가 폴리펩티드를 포함하는 바람직한 구체예에서, 표적부는 선형, 분지형 또는 원형 폴리펩티드이다.

특히 바람직한 구체예에서, 표적부는 폴리리신 분자를 포함한다. 폴리리신은 길이가 6 내지 15, 12 내지 18, 18 내지 30, 20 내지 40, 30 내지 60, 80 내지 120, 150 내지 300, 300 내지 600, 800 내지 1,200, 또는 2,000 내지 3,000 잔기일 수 있다.

바람직한 구체예에서, 표적부는 그것의 전하(예: 폴리아미노산의 하나 이상의 아미노산 잔기의 측쇄 전하)를 변화시키기 위해 화학적으로 변형된, 폴리아미노산과 같은 폴리펩티드를 포함한다. 예를 들어, 전하를 갖는 측쇄의 하나 이상, 또는 약 10, 25, 50, 75, 90, 또는 100%는 변형될 수 있다. 변형된다는 것은 음의 측쇄(예: 글루탐산 또는 아스파르트산)가 양 또는 중성 전하를 갖게 되고, 양전하를 갖는 측쇄(예: 리신, 아르기닌 또는 오르니틴)는 음 또는 중성 전하를 갖게 되는 것을 의미한다. 예를 들어, 폴리리신의 하나 이상의 측쇄가 중성 또는 음전하를 갖게 할 수 있다.

바람직한 구체예에서, 감광제는 적절한 에너지 레벨 및 파장에서 전자기 조사를 흡수하여 단일 밴드(singlet) 산소를 생성하고; 감광제는 포르피린 또는 포르피린 유도체를 포함하고; 감광제는 클로린 e6 또는 클로린 유도체를 포함한다.

바람직한 구체예에서, 결합체는 주쇄의 멤버를 추가로 포함한다. 이러한 구체예에서, 주쇄는 감광제 및 표적부 모두에 결합된다. 또한, 주쇄 자체는 표적부, 예를 들어 폴리리신일 수 있다.

바람직한 구체예에서, 결합체는 폴리리신에 접합된 클로린 e6, 예를 들어 분자량이 약 1,000 내지 3,000인 폴리리신에 접합된 1 또는 2 내지 20개의 클로린 e6 분자를 포함한다.

바람직한 구체예에서, 결합체는 히스타틴 폴리펩티드, 또는 그것의 활성 단편 또는 유사체에 접합된 클로린 e6, 예를 들어 히스타틴-5 폴리펩티드에 접합된 1 또는 2 내지 4개의 클로린 e6 분자를 포함한다.

바람직한 구체예에서, 결합체는 폴리리신의 주쇄, 예를 들어 하나의 히스타틴-5 폴리펩티드에 연결된 1 내지 4개의 폴리리신 쇄(MW 1,000 내지 3,000 달톤, 각각은 1 또는 2 내지 20 개의 클로린 e6 분자를 함유함), 또는 폴리리신 쇄(MW 1,000 내지 3,000, 1 또는 2 내지 16개의 클로린 e6 분자를 함유함)에 연결된 1 내지 4개의 히스타틴-5 폴리펩티드에 접합된, 클로린 e6 및 히스타틴 폴리펩티드, 또는 그것의 활성 단편 또는 유사체를 포함한다.

바람직한 구체예에서, 표적 유기체가 구강 박테리아 종, 예를 들어 포르피로모나스 (박테로이데스) 진지발리스이다.

바람직한 구체예에서, 결합체는 PM, 항체, 효소, 호르몬, 세포 표면의 수용체, 또는 세포 표면의 수용체에 대한 리간드를 포함하지 않는다. 예를 들어, 결합체는 이들과 결합(예를 들어, 공유적 또는 비공유적으로 결합)하지 않는다.

바람직한 구체예에서, 표적부는 타액성 폴리펩티드, 또는 그것의 활성 단편 또는 유사체를 포함한다. 타액성 폴리펩티드는 히스타틴, 예를 들어 히스타틴-1 내지 -8, 더 바람직하게는 히스타틴-1, -3, 또는 -5를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 표적부는 히스타틴-5 잔기 13-24 또는 그에 상응하는 다른 히스타틴의 잔기를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 표적부는 내부 복제물을 포함하도록 조작된 히스타틴 분자를 포함한다.

다른 측면에서, 본 발명은 바람직하지 않은 유기체의 존재를 특징으로 하는 질병에 대해 피검체를 치료하는 방법을 특징한다. 이 방법은 하기 단계를 포함한다:

NPM 표적부와 결합된 감광제를 함유하는 결합체, 예를 들어 본원에 기재된 결합체를 피검체에 투여하는 단계;

감광제에 의한 세포 독성 효과를 제공하기 위해 적절한 파장의 에너지를 피검체에 조사하는 단계;

그에 따라, 바람직하지 않은 유기체의 존재를 특징으로하는 질병에 대해 피검체를 치료하는 단계.

바람직한 구체예에서, 바람직하지 않은 유기체는, 예를 들어 미생물(예: 박테리아 세포, 진균 세포, 원충 세포, 뉴모시스티스 카리니의 세포), 바이러스, 기생충 또는 절지 동물일 수 있다.

바람직하지 않은 세포가 박테리아 세포인 바람직한 구체예에서, 박테리아 세포는 스타필로코쿠스, 스트렙토코쿠스, 엔테로코쿠스, 마이코박테리움, 슈도모나스, 살모넬라, 시겔라, 에스케리키아, 에르위니아, 클렙시엘라, 보렐리아, 트레포네마, 캄필로박터, 헬리코박터, 보르데텔라, 네이세리아, 레지오넬라, 렙토스피라, 세르풀리나. 마이코플라스마, 박테로이데스, 클렙시엘라, 예르시니아, 클라미디아, 비브리오, 악티노바실러스, 포르피리아, 헤모필러스, 파스퇴렐라, 펩토스트렙토코쿠스, 리스테리아, 프로피오니박테리움, 마이코박테리음, 코리네박테리움 또는 데르마토필러스 세포일 수 있다.

바람직한 구체예에서 박테리아 세포가 포르피로모나스 (박테로이데스) 진지발리스; B. 진지발리스(포르피로모나스 진지발리스로 알려져 있음)를 포함하는 박테로이데스 종, 에이케넬라 코로덴스, 푸소박테리움 뉴클레아툼, 울리넬라 렉타, 유박테리움 종, 프레보텔라 (박테로이데스) 인테르메디아, 박테로이데스포르시투스, 카프노사이토파자 종, 악티노바실러스 악티노마이세탐코미탄스 및 스트렙토코쿠스 뮤탄스일 수 있다.

박테리아 세포가 트레포네마 세포인 바람직한 구체예에서, 질병은 참호성 구강염, 백반성 피부병, 편주 질환이다. 다른 구체예에서, 질병은 농가진 또는 낭종성 좌창이다.

바람직하지 않은 유기체가 진균 세포인 바람직한 구체예에서, 세포는 칸디다 또는 아스페르질루스 세포일 수 있다. 바람직한 구체예에서, 유기체는 뉴모시스티스 카리니이다.

바람직하지 않은 유기체가 원충 세포인 바람직한 구체예에서, 세포는 엔타모에바, 토소플라스마, 기아르디아, 레슈마니아, 크립토스포리듐 또는 시스토소마이다.

바람직하지 않은 유기체가 바이러스인 바람직한 구체예에서, 바이러스는 HIV, HTLV, 간염 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 리노바이러스, 파필로마 바이러스, 홍역 바이러스, 헤르페스 바이러스, 로타바이러스, 파르보바이러스, 시타코시스 바이러스, 또는 에볼라 바이러스이다.

표적 유기체가 절지 동물인 바람직한 구체예에서, 절지 동물은 기생 진드기이다.

표적 유기체가 기생충인 바람직한 구체예에서, 기생충은 선충류 또는 흡충류이다. 기생충이 선충류인 바람직한 구체예에서, 선충류는 사상충증(filariasis)을 가진 피검체에서 발견된다.

바람직한 구체예에서, 표적 유기체는 구강 박테리아 종, 예를 들어 포르피로모나스 (박테로이데스) 진지발리스이다.

바람직한 구체예에서, 결합체는 PM, 항체, 효소, 호르몬, 세포 표면의 수용체, 또는 세포 표면의 수용체에 대한 리간드를 포함하지 않는다. 예를 들어, 결합체는 이들과 결합(예를 들어, 공유적 또는 비공유적으로 결합)하지 않는다.

다른 측면에서, 본 발명은 바람직하지 않은 유기체의 존재를 특징으로 하는 구강 질환에 대해 피검체를 치료하는 방법을 특징으로 한다. 이 방법은 하기 단계를 포함한다:

쌍을 이루지 않는 멤버 표적부에 결합된 감광제를 함유하는 결합체, 예를 들어 본원에 기재된 결합체를를 피검체에 투여하는 단계;

감광제에 의한 세포 독성 효과를 제공하기 위해 적절한 파장의 에너지를 피검체에 조사하는 단계;

이에 따라, 바람직하지 않은 유기체의 존재를 특징으로하는 질환에 대해 피검체를 치료하는 단계.

바람직한 구체예에서, 이 방법은 바람직하지 않은 유기체에 감염된 피검체의 병소에 결합체를 국소적으로 투여하는 것을 포함한다. 결합체는, 통상적으로 구강 표면, 치은, 치주위 조직, 치주 포켓, 염증으로 특정화된 영역, 병소, 치아 또는 치은의 열구 또는 결점, 치아 우식, 치과 또는 다른 치료중에 생긴 것과 같은 천공(cut) 또는 절개부, 또는 상처와 같은 부위로 국소 투여될 수 있다. 다른 구체예에서, 이 방법은 전신 투여, 예를 들어 섭취 또는 주사를 포함한다. 다른 구체예에서, 이 방법은 피하 전달, 예를 들어 피하 주사를 포함한다. 다른 구체예에서, 방법은 바람직하지 않은 유기체로 감염된 부위 또는 이와 근접한 부위에 국소적으로 주사하는 것을 포함한다.

바람직한 구체예에서, 방사선은 레이저 조사이거나, 또는 섬유 광학 장치를 사용하여 전달된다.

바람직한 구체예에서, 피검체는 바람직하지 않은 유기체(예: 바람직하지 않은 박테리아, 진균, 바이러스 또는 원충과 같은 미생물)의 존재를 특징으로 하는 구강의 질병을 앓고 있다. 이 질병은, 유기체에 의해 감염되거나, 그렇지 않은 경우 질병에 의해 영향을 받은 치아, 치은(예: 치주위 조직), 혀, 편도, 목젖, 구강의 내면, 또는 이하선 중 임의의 하나일 수 있다.

바람직한 구체예에서, 질병은 감염성 구강 질병이다.

바람직한 구체예에서, 피검체는 치주위 질병, 예를 들어 치주염 또는 치주증; 함몰 치은; 급성 궤양성 치은염; 만성 치은염; 치주위 농양; 연소성 치주염; 임신성 치은염; 치관주위염; 감염성 구내염; 수암; 화농성 파라티티스(paratitis); 하악골 또는 상악골의 급성 또는 만성 골수염; 치수염 또는 치근단주위의 감염증을 앓고 있다.

바람직한 구체예에서, 피검체는 구강의 진균 감염증, 예를 들어 방선균증, 히스토플라스마증, 조균증, 아르페르질루스증, 효모균증, 스포로트리쿰증, 분아진균증 또는 파라콕시디오이드진균증을 앓고 있다.

다른 바람직한 구체예에서, 피검체는 구강의 칸디다 감염증(예: 칸디다증, 백반창, 만성 칸디다증 및 칸디다성 백반증)을 포함하는 구강 효모균 감염증, 또는 원발성 헤르페스성 구내염 또는 구순포진을 포함하는 바이러스성 감염증을 앓고 있다.

바람직한 구체예에서, 피검체는 구강의 질병을 앓고 있는 것 이외에 면역 질환, 예를 들어 후천성 또는 선천성 면역 질환을 앓고 있다. 특히 바람직한 구체예에서, 피검체는 AIDS를 앓고 있거나 또는 HIV 양성이다.

바람직한 구체예에서, 바람직하지 않은 유기체는 구강 박테리아 종, 예를 들어 포르피로모나스 (박테로이데스) 진지발리스; B. 진지발리스(현재 포르피로모나스 진지발리스로 알려져 있음)를 포함하는 박테로이데스 종, 에이케넬라 코로덴스, 푸소박테리움 뉴클레아툼, 울리넬라 렉타, 유박테리움 종, 프레보텔라 (박테로이데스) 인테르메디아, 박테로이데스 포르시투스, 카프노사이토파자 종, 악티노바실러스 악티노마이세탐코미탄스 및 스트렙토코쿠스 뮤탄스이다.

바람직한 구체예에서, 결합체의 표적부는 타액성 폴리펩티드, 또는 그것의 활성 단편 또는 유사체를 포함한다. 타액 폴리펩티드의 예로서 히스타틴(예를 들어, 히스타틴-1 내지 -8, 또는 더 바람직하게는 히스타틴-1, -3, 또는 -5)이 포함된다. 바람직한 구체예에서, 표적부는 히스타틴-5 잔기 13-24, 또는 다른 히스타틴의 상응하는 잔기를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 표적부는 내부 복제물을 포함하도록 조작된 히스타틴 분자를 포함한다.

특히 바람직한 구체예에서, 표적부는 폴리리신 잔기를 포함한다.

바람직한 구체예에서, 표적부는 그것의 전하(예: 폴리아미노산의 하나 이상의 아미노산 잔기의 측쇄 전하)를 변화시키기 위해 화학적으로 변형된, 폴리아미노산과 같은 폴리펩티드를 포함한다. 예를 들어, 전하를 갖는 측쇄의 하나 이상, 또는 약 10, 25, 50, 75, 90, 또는 100%는 변형될 수 있다. 변형된다는 것은 음의 측쇄(예: 글루탐산 또는 아스파르트산)가 양 또는 중성 전하를 갖게 되고, 양전하를 갖는 측쇄(예: 리신, 아르기닌 또는 오르니틴)가 음 또는 중성 전하를 갖게 되는 것을 의미한다. 예를 들어, 폴리리신의 하나 이상의 측쇄가 중성 또는 음전하를 갖게 할 수 있다.

바람직한 구체예에서, 결합체는 PM, 항체, 효소, 호르몬, 세포 표면의 수용체, 또는 세포 표면의 수용체에 대한 리간드를 포함하지 않는다. 예를 들어, 결합체는 이들과 결합(예를 들어, 공유적 또는 비공유적으로 결합)하지 않는다.

바람직한 구체예에서, 감광제는 적절한 에너지 레벨 및 파장에서 전자기 조사를 흡수하여 단일 밴드(singlet) 산소를 생성하고; 감광제는 포르피린 또는 포르피린 유도체를 포함하고; 감광제는 클로린 e6 또는 클로린 유도체를 포함한다.

다른 측면에서, 본 발명은 바람직하지 않은 유기체의 존재를 특징으로 하는 치주위 질병에 대해 피검체를 치료하는 방법을 특징으로 한다. 이 방법은 하기 단계를 포함한다:

NPM 표적부에 결합된 감광제를 함유하는 결합체, 예를 들어 본원에 기재된 결합체를 피검체의 치주위 조직에 투여하는 단계;

감광제에 의한 세포 독성 효과를 제공하기 위해 적절한 파장의 에너지를 피검체에 조사하는 단계;

그에 따라, 바람직하지 않은 유기체의 존재를 특징으로하는 질병에 대해 피검체를 치료하는 단계.

바람직한 구체예에서, 이 방법은 바람직하지 않은 유기체에 감염된 피검체의 부위에 결합체를 국소적으로 투여하는 것을 포함한다. 결합체는, 치은, 치주위 조직, 치주 포켓, 염증으로 특정화된 영역 또는 병소에 국소적으로 투여될 수 있다. 다른 구체예에서, 방법은 전신 투여, 예를 들어 섭취 또는 주사를 포함한다. 다른 구체예에서, 방법은 피하 전달, 예를 들어 피하 주사를 포함한다. 다른 구체예에서, 방법은 바람직하지 않은 유기체로 감염된 부위 또는 이와 근접한 부위에 국소적으로 주사하는 것을 포함한다.

바람직한 구체예에서, 피검체는 치주염 또는 치주증; 함몰 치은; 급성 궤양성 치은염; 만성 치은염; 치주위 농양; 연소성 치주염; 임신성 치은염을 앓고 있다.

바람직한 구체예에서, 피검체는 치주위 질환을 앓고 있는 것 이외에 면역 질환, 예를 들어 후천성 또는 선천성 면역 질환을 앓고 있다. 특히 바람직한 구체예에서, 피검체는 AIDS를 앓고 있거나 또는 HIV 양성이다.

바람직한 구체예에서, 바람직하지 않은 유기체는 구강 박테리아 종, 예를 들어 포르피로모나스 (박테로이데스) 진지발리스; B. 진지발리스(현재 포르피로모나스 진지발리스로 알려져 있음)를 포함하는 박테로이데스 종, 에이케넬라 코로덴스, 푸소박테리움 뉴클레아툼, 울리넬라 렉타, 유박테리움 종, 프레보텔라 (박테로이데스) 인테르메디아, 박테로이데스 포르시투스, 카프노사이토파자 종, 악티노바실러스 악티노마이세탐코미탄스 및 스트렙토코쿠스 뮤탄스이다.

바람직한 구체예에서, 결합체의 표적부는 타액성 폴리펩티드, 또는 그것의 활성 단편 또는 유사체를 포함한다. 타액 폴리펩티드의 예로서 히스타틴(예를 들어, 히스타틴-1 내지 -8, 또는 더 바람직하게는 히스타틴-1, -3, 또는 -5)이 포함된다. 바람직한 구체예에서, 표적부는 히스타틴-5 잔기 13-24, 또는 다른 히스타틴의 상응하는 잔기를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 표적부는 내부 복제물을 포함하도록 조작된 히스타틴 분자를 포함한다.

특히 바람직한 구체예에서, 표적부는 폴리리신 분자를 포함한다.

바람직한 구체예에서, 표적부는 그것의 전하(예: 폴리아미노산의 하나 이상의 아미노산 잔기의 측쇄 전하)를 변화시키기 위해 화학적으로 변형된, 폴리아미노산과 같은 폴리펩티드를 포함한다. 예를 들어, 전하를 갖는 측쇄의 하나 이상, 또는 약 10, 25, 50, 75, 90, 또는 100%는 변형될 수 있다. 변형된다는 것은 음의 측쇄(예: 글루탐산 또는 아스파르트산)가 양 또는 중성 전하를 갖게 되고, 양전하를 갖는 측쇄(예: 리신, 아르기닌 또는 오르니틴)가 음 또는 중성 전하를 갖게 되는 것을 의미한다. 예를 들어, 폴리리신의 하나 이상의 측쇄가 중성 또는 음전하를 갖게 할 수 있다.

바람직한 구체예에서, 결합체는 PM, 항체, 효소, 호르몬, 세포 표면의 수용체, 또는 세포 표면의 수용체에 대한 리간드를 포함하지 않는다. 예를 들어, 결합체는 이들과 결합(예를 들어, 공유적 또는 비공유적으로 결합)하지 않는다.

바람직한 구체예에서, 감광제는 적절한 에너지 레벨 및 파장에서 전자기 조사를 흡수하여 단일 밴드(singlet) 산소를 생성하고; 감광제는 포르피린 또는 포르피린 유도체를 포함하고; 감광제는 클로린 e6 또는 클로린 유도체를 포함한다.

다른 측면에서, 본 발명은 바람직하지 않은 유기체의 존재를 특징으로 하는 구강의 질병에 대해 후천성 면역 질환을 가지고 있는 피검체를 치료하는 방법을 특징으로 한다. 바람직한 구체에에서, 바람직하지 않은 유기체는 후천성 면역 질환의 원인이 되는 유기체와 다르다. 후천성 면역 질환은 예를 들어 AIDS 또는 HIV 감염증일 수 있다.

이 방법은 하기 단계를 포함한다:

NPM 표적부와 결합된 감광제를 포함하는 결합체, 예를 들어 본원에 기재된 결합체를 피검체에게 투여하는 단계;

감광제에 의해 세포 독성 효과를 나타내기에 적절한 파장의 에너지를 피검체에 조사하는 단계;

그에 따라, 바람직하지 않은 유기체의 존재를 특징으로 하는 질병을 치료하는 단계.

바람직한 구체예에서, 이 방법은 바람직하지 않은 유기체에 감염된 피검체의 부위에 결합체를 국소적으로 투여하는 것을 포함한다. 결합체는 통상, 예를 들어 구강 표면, 치은, 치주위 조직, 치주 포켓, 염증으로 특정화된 영역, 병소, 치아 또는 치은의 열구 또는 결점, 치아 우식, 치과 또는 다른 치료중에 생긴 천공(cut) 또는 절개부, 또는 상처에 국소 투여될 수 있다. 다른 구체예에서, 이 방법은 전신 투여, 예를 들어 섭취 또는 주사를 포함한다. 다른 구체예에서, 이 방법은 피하 전달, 예를 들어 피하 주사를 포함한다. 다른 구체예에서, 방법은 바람직하지 않은 유기체로 감염된 부위 또는 이와 근접한 부위에 국소적으로 주사하는 것을 포함한다.

바람직한 구체예에서, 방사선은 레이저 조사이거나, 또는 섬유 광학 장치를 사용하여 전달된다.

바람직한 구체예에서, 바람직하지 않은 유기체는 예를 들어 미생물(예: 바람직하지 않은 박테리아, 진균, 바이러스 또는 원충)이다. 이 질병은, 유기체에 의해 감염되거나 그렇지 않은 경우 질병에 의해 영향을 받은 치아, 치은(예: 치주위 조직), 혀, 편도, 목젖, 구강의 내면, 또는 이하선 중 임의의 하나일 수 있다.

바람직한 구체예에서, 질병은 감염성 구강 질병이다.

바람직한 구체예에서, 피검체는 치주위 질병, 예를 들어 치주염 또는 치주증; 함몰 치은; 급성 궤양성 치은염; 만성 치은염; 치주위 농양; 연소성 치주염; 임신성 치은염; 치관주위염; 감염성 구내염; 수암; 화농성 파라티티스; 하악골 또는 상악골의 급성 또는 만성 골수염; 치수염 또는 치근단주위의 감염증을 앓고 있다.

바람직한 구체예에서, 피검체는 구강의 진균 감염증, 예를 들어 방선균증, 히스토플라스마증, 조균증, 아르페르질루스증, 효모균증, 스포로트리쿰증, 분아진균증 또는 파라콕시디오이드진균증을 앓고 있다. 다른 바람직한 구체예에서, 피검체는 구강의 칸디다 감염증(예: 칸디다증, 백반창, 만성 칸디다증 및 칸디다성 백반증)을 포함하는 구강 효모균 감염증, 또는 원발성 헤르페스성 구내염 또는 구순포진을 포함하는 바이러스성 감염증을 앓고 있다.

바람직한 구체예에서, 바람직하지 않은 유기체는 구강 박테리아 종, 예를 들어 포르피로모나스 (박테로이데스) 진지발리스; B. 진지발리스(현재 포르피로모나스 진지발리스로 알려져 있음)를 포함하는 박테로이데스 종, 에이케넬라 코로덴스, 푸소박테리움 뉴클레아툼, 울리넬라 렉타, 유박테리움 종, 프레보텔라 (박테로이데스) 인테르메디아, 박테로이데스 포르시투스, 카프노사이토파자 종, 악티노바실러스 악티노마이세탐코미탄스 및 스트렙토코쿠스 뮤탄스일 수 있다.

바람직한 구체예에서, 결합체의 표적부는 타액성 폴리펩티드, 또는 그것의 활성 단편 또는 유사체를 포함한다. 타액 폴리펩티드의 예로서 히스타틴(예를 들어, 히스타틴-1 내지 -8, 또는 더 바람직하게는 히스타틴-1, -3, 또는 -5)이 포함된다. 바람직한 구체예에서, 표적부는 히스타틴-5 잔기 13-24, 또는 다른 히스타틴의 상응하는 잔기를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 표적부는 내부 복제물을 포함하도록 조작된 히스타틴 분자를 포함한다.

특히 바람직한 구체예에서, 표적부는 폴리리신 분자를 포함한다.

바람직한 구체예에서, 표적부는 그것의 전하(예: 폴리아미노산의 하나 이상의 아미노산 잔기의 측쇄 전하)를 변화시키기 위해 화학적으로 변형된, 폴리아미노산과 같은 폴리펩티드를 포함한다. 예를 들어, 전하를 갖는 측쇄의 하나 이상, 또는 약 10, 25, 50, 75, 90, 또는 100%는 변형될 수 있다. 변형된다는 것은 음의 측쇄(예: 글루탐산 또는 아스파르트산)가 양 또는 중성 전하를 갖게 되고, 양전하를 갖는 측쇄(예: 리신, 아르기닌 또는 오르니틴)는 음 또는 중성 전하를 갖게 되는 것을 의미한다. 예를 들어, 폴리리신의 하나 이상의 측쇄가 중성 또는 음전하를 갖게 할 수 있다.

바람직한 구체예에서, 결합체는 PM, 항체, 효소, 호르몬, 세포 표면의 수용체, 또는 세포 표면의 수용체에 대한 리간드를 포함하지 않는다. 예를 들어, 결합체는 이들과 결합(예를 들어, 공유적 또는 비공유적으로 결합)하지 않는다.

바람직한 구체예에서, 감광제는 적절한 에너지 레벨 및 파장에서 전자기 조사를 흡수하여 단일 밴드(singlet) 산소를 생성하고; 감광제는 포르피린 또는 포르피린 유도체를 포함하고; 감광제는 클로린 e6 또는 클로린 유도체를 포함한다.

다른 구체예에서, 본 발명은 결합체 분자를 제조하는 방법을 포함하는데

상기 방법은 하기 단계를 포함한다:

예를 들어, 폴리펩티드 주쇄와 같은 주쇄를 공급하는 단계;

상기 주쇄와 감광제를 예를 들어 공유 결합적으로 결합시키는 단계;

주쇄와 본원에 기재된 표적부를 예를 들어, 공유 결합적으로 결합시키는 단계.

다른 바람직한 구체예에서, 결합 반응은 감광제의 활성화된 에스테르기를 포함한다. 더 바람직한 구체예에서, 주쇄의 아미노기는 친핵제로서 반응하여 감광제 활성 에스테르로부터 이탈기를 제거한다. 바람직한 구체예에서, 표적부는 결합제(coupling agent)에 의해 주쇄에 결합된다.

바람직한 구체예에서, 결합체는 PM, 항체, 효소, 호르몬, 세포 표면의 수용체, 또는 세포 표면의 수용체에 대한 리간드를 포함하지 않는다. 예를 들어, 결합체는 이들과 결합(예를 들어, 공유적 또는 비공유적으로 결합)하지 않는다.

바람직한 구체예에서, 본 발명은 바람직하지 않은 유기체를 제거하기 위한 키트를 특징으로 한다. 이 키트는 표적부에 결합된 감광제 및 사용 설명서를 포함한다.

바람직한 구체예에서, 결합체는 PM, 항체, 효소, 호르몬, 세포 표면의 수용체, 또는 세포 표면의 수용체에 대한 리간드를 포함하지 않는다. 예를 들어, 결합체는 이들과 결합(예를 들어, 공유적 또는 비공유적으로 결합)하지 않는다.

광역학적 치료법은 적절한 파장의 광과 함께 광 활성 화합물 또는 감광제를 사용하여 세포 독성 효과를 나타내는 것을 포함한다. 감광제의 표적 특이성을 증가시키기 위해, 광감제를 표적부에 결합시킬 수 있다. 본 발명의 방법 및 결합체는 NPM-표적화 감광제를 사용하는 것을 특징으로 한다. NPM은 효율적이고 비용절감적인 방식으로 감광제를 표적에 전달할 수 있다. 본 발명의 조성물은 (ⅰ) 광이 박테리아의 세포벽을 통해 확산될 수 있는 독성 산소 종을 생성하므로, 이들이 박테리아를 사멸시키기 위해 흡수될 필요는 없다는 점, (ⅱ) 독성 산소 종의 생성이 박테리아를 박멸하고 상처의 치유를 증진시키는 데 조력할 수 있는 숙주 면역 반응을 자극하는 데 국소적인 효과를 나타낼 수 있다는 점, (ⅲ) 이들이 광에 노출된 부위에서만 세포 독성성 반응을 나타낸다는 점에서 유용하다.

별도의 한정이 없다면, 본원에 사용된 모든 기술적이고 과학적인 용어는 본 발명이 속한 기술의 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 지닌다. 본원의 방법 및 물질과 유사하거나 동등한 것은 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질은 다음에 기재되어 있다. 본원에 언급된 공보, 특허 출원, 특허 및 다른 참고 문헌 모두는 참고로 포함된 것이다. 또한, 물질, 방법 및 실시예는 단지 예시적이고, 본 발명을 제한하는 것은 아니다.

발명의 상세한 설명

본원에 사용된 감광제는 적절한 파장의 전자기 에너지, 일반적으로 적절한 파장의 빛을 조사하였을 때 세포 독성 효과를 나타내는 물질을 의미한다.

본원에 사용된 용어인 펩티드, 폴리펩티드 및 단백질은 다른 설명이 없는 한, 상호교환적으로 사용된다. 본원에 기재된 방법 및 조성물에 사용되는 펩티드, 폴리펩티드 및 단백질은 재조합형, 천연의 자원에서 정제되거나, 또는 화학적으로 합성될 수 있다. 예를 들어, 박테리아 단백질 또는 박테리아로부터 유래된 단백질의 사용을 참고하면, 재조합적으로 생산된 분자, 천연의 자원에서 정제된 분자 또는 화학적으로 합성된 분자의 사용을 포함한다.

본원에 사용된 쌍을 이루지 않는 멤버(NPM)는 표적부에 결합하는 분자, 예를 들어 폴리펩티드이다. 표적부는 단백질, 핵산, 지질, 다당류, 또는 이들의 조합인 구조일 수 있다. 항체, 수용체, 호르몬, 성장 인자, 신경전달물질 및 효소는 NPM 폴리펩티드가 아니며, 본원에서는 쌍을 이루는 멤버(PM)으로 언급된다. NPM은 NPM과 그 결합부와의 상보적인 관계를 나타내지 않는다. 상보적인 관계는 결합한 두 개의 실체(entity)가 하나의 실체상에 위치하는 "대향" 작용기의 능력을 토대로 한 형상, 외형 및 전하의 상보적인 조합을 가지는 것을 의미하며, 상기 하나의 실체는 다른 실체상에 위치하는 "대향" 작용기와 비공유적 결합을 형성하여 다수의 비공유적 상호작용을 가진 2개의 실체를 결합시킬 수 있다. 환언하면, NPM은 표적부의 형상, 외형 및 전하 패턴과 상보적인 형상, 외형 및 전하 패턴의 조합을 함유하지 않을 것이다. 일반적으로, NPM은 PM(전술한 PM)보다 표적 친화성이 낮을 것이다. 표적에 대한 NPM의 전형적인 친화성은 mM 내지 1μM의 Km 수치이다. PM 결합의 이탈, 예를 들어 생체내에서 기질로부터 효소의 이탈은 추가적인 단백질의 결합, 또는 공유 결합의 분리 또는 형성을 필요로 하는 경우가 많다. 시험관내에서 PM 쌍이 증식되어 극도의 열 또는 pH에 의해 구성 성분으로 분리되는 경우가 많다.

본 발명의 방법은 본 발명의 목적을 위해 사용되는 결합 특성외에 PM 작용을 가진 표적부를 사용할 수 있다. 예를 들어, LDL 분자는 PM-형 리간드로서 아포 B/E 종류의 LDL 수용체에 결합하고, 산화되거나 또는 변형된 LDL 분자는 PM-형 리간드로서 마크로파지 스캐빈지(scavenge) 수용체에 결합한다. 그러나, LDL 분자는 본원에 기재된 PM 작용이 아닌, 그람 음성 표면 성분에 대해 NPM 형 친화성을 추가로 가지고 있다. PM 상호작용은 단지 하나 또는 소수의 동족 분자를 인지하기 위한 일반적으로 높은 특이성 및 통상적으로 μM 내지 pM 범위의 Km 수치를 가진 높은 친화성을 특징으로 한다.

본원에 기재된 표적 유기체는 질병을 유발하거나 또는 악화시키는 유기체를 의미한다.

본원에 기재된 "피검체"라는 용어는 바람직하지 않은 유기체, 즉 광역학적 치료에 대한 표적 유기체를 운반하는 생존하는 동물 또는 사람을 의미한다. 피검체가 면역 결핍일 수 있다, 피검체는 사람 및 사람을 제외한 포유 동물(예: 개, 고양이, 돼지, 소, 양, 염소, 말, 래트 및 마우스)를 포함하는 포유 동물일 수 있다. 피검체는 이전에 화학요법 또는 항생제 요법에 의해 치료되었다.

본원에 사용된 "자연 발생적인"은 자연에 존재하는 분자를 의미한다. 비자연 발생적인 분자는 사람의 개입이 없이는 발생되지 않는 구조를 가진 분자를 의미한다.

본원에 사용된 소형 항미생물성 펩티드(SAMP)라는 용어는 길이가 60 아미노산 잔기 미만의 펩티드를 의미한다. 이러한 조건을 만족시키는 히스타틴, 디펜신, 세크로핀, 마가이닌, 그람 음성 박테리오신 및 펩티드 항생제는 SAMP이다, 다수의 SAMP는 길이가 20 내지 40 아미노산 잔기이다. SMAP는 자연 발생적인 펩티드이며, 광범위한 유기체에 의해 만들어진다. SAMP는 NPM이다. 다수의 SMAP가 광범위한 항미생물 활성을 가지는데, 예를 들어 하나 이상의 종을 사멸시킬 수 있고, 일부 경우에 있어서는 관계가 먼 종, 예를 들어 그람 음성과 그람 양성 박테리아 종을 사멸할 수 있다.

본원에 사용된, 폴리펩티드의 활성 단편 또는 그것의 유사체는 그 폴리펩티드의 항미생물활성 또는 표적 유기체에 대한 친화성의 20% 이상을 보유하는 폴리펩티드이다. 폴리펩티드의 유사체는 그 폴리펩티드와 50% 이상, 더 바람직하게는 60, 70, 80 또는 90% 이상 서열의 상동성을 공유한다.

본원에 사용된 타액 폴리펩티드는 피검체에 의해 생성되고 피검체의 타액에서 발견되는 폴리펩티드를 의미한다. 대부분의 폴리펩티드는 이하선에서 생성된다.

본원에 사용된 폴리펩티드 항생제는 선형 또는 원형 올리고펩티드, 또는 그것의 활성 단편 또는 유사체로서, 박테리아 또는 진균류에 대해 항생 활성을 보유하며 티오에스테르 결합에 의해 부착된 다중 단백질 결합체 상에서 효소적으로 합성된다. 펩티드 항생제는 D 아미노산과 같은 비-리보솜 아미노산을 포함할 수 있고 락트산 또는 발레린산의 에스테르와 같은 비-아미노산 잔기를 포함할 수 있다.

감광제

감광제는 적절한 파장의 전자기 에너지, 통상 적절한 파장의 빛을 조사하였을 때 세포 독 효과를 나타내는 물질이다.

다수의 감광제가 단일 밴드 산소를 생성한다. 적절한 에너지 레벨 및 파장의 전자기 조사시, 이러한 감광제 분자는 활성형으로 전환된다. 활성형은 대기의 O₂와 반응하여, 감광제가 비활성화 상태로 붕괴되었을 때 단일 밴드 산소를 생성할 수 있다. 단일 밴드 산소는 반응성이 크고, 인접한 표적 생성물에 대해 독성을 나타낸다.

이것의 3중 밴드 활성화 상태의 반감기는 충분히 지속되어(예: 수 마이크로초동안) 이웃하는 분자와 상호작용하여 세포 독성성 종을 생산할 수 있어야 한다.

감광제 조성물은 높은 양자 수율을 가진 적절한 파장의 전자기 에너지를 효율적으로 흡수하여 감광제의 활성형을 효율적으로 생산해야 한다. 조사 후, 표적 유기체에 대한 독성은 실질적으로 증가되어야 하는데, 바람직하게는 10배, 100배 또는 1000배 이상으로 증가된다. 감광제는 낮은 백그라운드 독성, 즉 적절한 파장의 에너지로 조사하지 않았을 때 낮은 독성을 나타내어야 한다.

감광제의 기타 바람직한 특성은 적절한 용매중의 높은 용해도와 안정성을 포함한다. 예를 들어, 감광제는 그것을 표적부 또는 주쇄에 결합시키기 위해 사용되는 조건하에서 가용성이어야 한다. 바람직한 용해성은, DMSO, 물, 에탄올 또는 물고 DMSO 또는 에탄올의 혼합물중의 용해도를 제외하고(예를 들어, DMSO:H₂O 또는 에탄올:물에서의 용해도는 5%, 10% 또는 15%가 유용할 수 있음), 반응에 대해 선택된 조건에 따라 달라질 수 있다. 용해도는 수용매중 또는 에탄올:물 용매중에서 50 μg/ml, 100 μg/ml, 500 μg/ml, 1mg/ml 또는 10 mg/ml인 것이 바람직하다.

표적부와 결합된 경우, 생성된 감광제:표적부 결합체는 생리학적 조건하, 적절한 담체 및 부형제를 함유하는 수용매, 또는 리포좀과 같은 다른 전달 시스템 중에서 용해될 수 있어야 한다. 본 발명의 분자는 용액중에 유리된 감광제;표적부 조성물로서 전달될 수 있을 것이고, 리포좀, 펩티드/중합체에 결합되거나 또는 세정제를 함유하는 제제를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 제제의 형태로 송달될 수 있다.

본 발명의 조성물은 연속적이거나 주기적인 조사(조사 과정에서 본 조성물의 각각의 분자가 단일 밴드 산소를 수회 생성하면서, 반복적으로 활성 상태로 여기되는 것이 바람직함)에 의한 1회 이상의 치료과정에서 안정해야 한다. 감광제 결합체 분자의 안정성은 37℃, 생리학적 조건하에서 1시간, 30분, 15분 또는 적어도 1분동안 활성 형태로 분자의 10%, 50%, 90%, 95%, 또는 99%의 생존율이 바람직하다.

감광제는 헤마토포르피린 HCl 및 헤마토포르피린 에스테르와 같은 헤마토포르피린(Dobson, J. and m. Wilson, Archs. Oral Biol. 37:883-887); 디헤마토포르피린 에스테르(Wilson, M. et al., 1993, Oral Microbiol. Immunol. 8:182-187); 헤마토포르피린 Ⅸ(Russell et al., 1991, Can J. App. Spectros. 36:103-107, available from Porphyrin Products, Logan, UT) 및 그것의 유도체; 3,1-메소 테트라키스 (o-프로피온아미도페닐) 포르피린; 본원의 클로린과 테트라(히드록시페닐)포르피린 시리즈의 박테리오클로린, 및 합성 디포르피린과 디클로린과 같은 히드로포르피린; o-치환된 테트라페닐 포르피린(피켓 펜스 포르피린); 클로린 e6 모노에틸렌디아민 모노아미드(CMA Goff, B.A. et al., 1994, 70:474-480, available from Porphyrin Products, Logan, UT); 클로린 e6의 모노-1 아스파르틸 유도체, 및 클로린 e6의 모노- 그리고 디-아스파르틸 유도체; 헤마토포르피린 혼합물 포토프린 Ⅱ(Quardra Logic Technologies, Inc., Vancouver, BC, Canada); 벤조포르피린 모노산 고리 A(BPD-MA), 테트라시아노에틸렌 부가물, 디메틸 아세틸렌 디카르복실레이트 부가물, 디엘스-알더 부가물 및 모노산 고리 "a" 유도체를 포함하는 벤조포르피린 유도체(BPD); 나프탈로사아닌(Biolo, R., 1994, Photochem. and Photobiol. 5959:362-365); Zn(Ⅱ)-프탈로사이닌(Shopora, M. et al., 1995, Laser in Medical Science 10:43-46); 톨루이딘 블루 0(Wilson, M. et al., 1993, Lasers in Medical Sci. 8:69-73); 알루미늄 설폰화 및 디설폰화 프탈로시아닌 이비드.; 및 금속 치환체를 함유하지 않고 변화시킨 다른 치환체를 가진 프탈로시아닌; 테트라설페이트 유도체; 설폰화 알루미늄 나프탈로시아닌; 메틸렌 블루(이비드.); 나일 블루; 크리스탈 바이올렛; 아주르 β클로라이드; 및 로즈 벵골(Wilson, M., 1994, Intl. Dent. J. 44:187-189)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 다수의 감광제가 문헌(Wilson, M. et al., 1992, Curr. Micro. 25:77-81) 및 문헌(Okamoto, H. et al., 1992, Lasers in Surg. Med. 12:450-485)에 개시되어 있다.

다른 가능한 감광제 조성물은 피로페오포비드 화합물과 같은 페오포비드; 안트라센디온; 안트라피라졸; 아미노안트라퀴논; 펜옥사진 염료; 페노치아진 유도체; 양이온성 셀륨 및 텔루르-피릴륨 유도체를 포함하는 칼코제나피릴륨 염료; 베르딘; 옥타에틸푸르푸린 및 에티오푸르푸린의 주석과 아연 유도체를 포함하는 푸르푸린; 벤조나프토포르피라진; 양이온성 이미늄염; 및 테트라사이클린을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

결합체내에 사용되는 감광제의 적합성은 본원에 기재된 방법 또는 당업자에게 공지된 방법에 의해 정해질 수 있다.

표적 분자를 산화시키는 감광제의 효능은 그 유용성의 척도이다. 감광제에 의한 표적 분자의 산화 효능은 시험관내에서 측정될 수 있다. 기질의 에로서 4-니트로소 N,N-디메틸아닐린(RNO; Hasan, T. et al., 1987, Proc. AACR 28:395 Abstr. 1,568) 및 트립토판 또는 히스티딘(Lambert, C.R. et al., 1986, Photochem. Photobiol. 44:595-601)을 포함한다. 이 분석법에서 기재를 "표백"하는 시험 감광제의 활성은 분광학적으로 모니터할 수 있다. 이러한 화학적 분석법의 장점은 추정되는 다수의 감광제 조성물을 동시에 선별할 수 있다는 점이다. 변화될 수 있는 파라미터로는 감광제 농도, 기질 농도, 방사선의 최적 강도 및 방사선의 최적 파장을 포함한다. 플라스틱 다중웰 접시, 자동 멀티피펫 및 직결식 분광 평판 판독기를 포함하는 고처리량 기법을 사용할 수 있다. 바람직하지 않은 시험 물질로서, 예컨대 방사선조사 처리되지 않은 조건하에서 높은 기준치를 나타내거나, 비효율적인 에너지 흡수 또는 반응 전위를 나타내는 조성물은 동정하여 제거할 수 있다.

이러한 기준 형태 및 활성 형태의 세포독성에 대하여 감광제를 평가하는 경우에는 1종 이상의 모델 표적 유기체의 세포를 사용하여 시험관내 분석법으로 실시할 수 있다. 즉, 방사선 조사된 감광제 및 방사선 조사되지 않은 감광제 존재하에 유기체를 사멸시키는 효율을 측정하고 처리되지 않은 대조 세포 시료의 생존률과 비교한다. 이 분석법은 자동화할 수 있다. 이때, 콜로니 형성 단위(CFU) 또는 세포 증식의 수치를 사용하려면 영양 배지에 첨가된 시료의 항온처리와, 이에 수반되는 콜로니 형성을 위한 적당한 일정 증식 기간이 필요할 수 있다.

모델 표적 유기체의 세포 생존은 생화학적 방법, 예컨대 DNA 합성 분석법으로 모니터할 수도 있다. 이 방법에서 시험 감광제의 효율은 3중 수소처리된 티미딘과 같은 표지된 DNA 전구체에 노출되기도 하는 모델 유기체의 세포 시료에 대한 효과를 통해 측정할 수 있다. 그 다음, 세포를 수집하고, 세척하여 병입되지 않은 전구체를 제거한 후, DNA 합성 양의 척도인 전구체 흡수와 산 불용성 침전물 중의 혼입 정도를 모니터한다. 또한, 전술한 바와 같이 자동화될 수도 있는 이 분석법에서 방사선조사된 감광제 조성물의 존재 효과는 정량적으로 용이하게 측정되어 정량될 수 있다. 대조용의 방사선조사 처리되지 않은 세포와 미처리 세포에서, DNA 합성은 세포 증식의 함수로서 지수적으로 증가한다. 추정상, 성공적인 신규 감광제의 존재를 나타내는 양성 결과는 감광제 존재하에 방사선조사 처리된 세포에서 DNA 합성이 정지된 것이다.

적합한 모델 표적 유기체는 에세리치아 콜리(Escherichia coli), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus) 및 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)이다. 감광제 활성의 적합한 양성 대조군은 톨루이딘 블루 O이다.

다수의 시험 물질을 선별해야 하는 경우에는, 시험관내 선별인 제1 단계와 세포를 사용하는 제2단계로 구성된 2 단계 선별 방법을 사용하는 것이 바람직할 수 있다.

방사선 조사

소정 화합물에 대한 적당한 파장의 방사선 조사는 다양한 방법으로 실시할 수 있다. 이 방법으로는 레이저, 비레이저 또는 광대역 광 조사를 포함하되, 이것에 국한되는 것은 아니다. 방사선조사는 적당한 파장의 광을 체외 또는 관절내 생성시켜 얻을 수 있다. 본 발명에 사용된 광은 섬유 광학 기구, 관절경검사 기구 또는 투시 기구를 비롯하여 광의 필요 전력을 전달할 수 있는 모든 장치를 사용하여 조사할 수 있다. 구강으로 광을 전달하는 경우에는 치주 포켓에 삽입된 가요성 섬유 광학체를 사용하거나, 경치은 조명(치은의 평균 두께는 5 내지 7 ㎜임)을 통해 실시할 수 있다. 박테리아를 불활성화시키는데 필요로 되는 광원은 경제적인 다이오드 레이저 또는 결맞지 않은 광원일 수 있다.

결합 방법

본 명세서에 사용된 "결합제"라는 용어는 표적부에 감광제를 결합하거나 "주쇄" 또는 "가교"부에 감광제 또는 표적부를 결합할 수 있는 시약을 의미한다. 이 성분을 생리적 조건하에서 조사 및 처리에 필요한 시간 동안 안정하게 결합시킬 수 있다면, 어떤 결합이라도 적합하지만, 특히 공유 결합이 바람직하다. 2 성분간의 결합은 감광제를 표적부에 직접 결합시키는 경우와 같이 직접 결합이거나, 또는 감광제를, 예컨대 주쇄에 결합되어 있는 중간체에 결합시키고 이 중간체를 표적부에 결합시키는 경우와 같이 간접 결합일 수 있다. 결합제는 온도, pH, 염, 용매계 및 감광제, 주쇄(존재하는 경우), 표적부의 화학적 안정성을 실질적으로 유지시키는 기타 다른 반응물의 조건하에서 기능적이어야 한다.

결합제는 결합된 성분에 결합제 원소를 첨가함이 없이 성분을 결합시킬 수 있는 것이다. 기타 다른 결합제는 결합된 성분에 결합제 원소를 첨가하는 것이다. 예컨대, 결합제는 동종이작용성 또는 이종이작용성인 가교제일 수 있는데, 이 가교제의 1종 이상의 원자 성분은 조성물에 포함될 수 있다. 가교제가 아닌 결합제는 결합 반응 동안 완전히 제거되어, 분자 생성물은 감광제, 표적부 및 주쇄부(존재하는 경우) 만으로 구성될 수 있다.

많은 결합제는 아민 및 카르복실레이트와 반응하여 아미드를 형성하거나, 또는 알코올 및 카르복실레이트와 반응하여 에스테르를 형성한다. 결합제는 당해 기술분야에 공지되어 있다[예컨대, M.Bodansky, "Principles of Peptide Synthesis", 2nd ed.(본 명세서에 참조 인용됨) 및 T.Greene and P.Wuts, "Protective Groups in Organic Synthesis", 2nd Ed, 1991, John Wiley, NY]. 결합제는 성분 부를 안정하게 결합해야 하지만, 감광제나 표적부의 변성이나 불활성화가 거의 없게 해야 한다.

본 발명의 감광제 결합체는 다음 실시예에 기재되거나 당해 기술 분야에 공지된 방법을 사용하여 감광제를 표적부에 결합시켜 제조할 수 있다. 공유 접합을 위하여 가교제를 비롯한 각종 가교제를 사용할 수 있다. 가교제의 예로는 N,N'-디시클로헥실카르보디이미드(DCC; 피어스 제품), N-숙신이미딜-S-아세틸티오아세테이트(SATA), N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(SPDP), 오르토-페닐렌디말레이미드(ο-PDM) 및 설포숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트(설포-SMCC)를 포함한다. 예컨대, 문헌[Karpovsky et al. J.Exp.Med. 160:1686, 1984; 및 Liu, MA et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 82:8648, 1985]을 참조하라. 다른 방법으로는 문헌[Paulus, Behring Ins. Mitt., No. 78, 118-132, 1985; Brennan et al., Science 229:81-83, 1985 및 Glennie et al., J.Immunol., 139:2367-2375, 1987]에 기재된 것을 포함한다. 펩티드 및 단백질용의 다수의 결합제, 완충액, 용매 및 사용 방법은 본 명세서에 참고 인용되는 피어스 케미칼 컴패니의 카탈로그, T-155 내지 T-200쪽(1994)[미국 일리노이주 61105 록포드 노스 메리디안 로드 3747; 피어스 유럽 비.브이., 네덜란드 비에이 오우드 베저랜드 3260 피.오.박스 1512 소재]에 기재되어 있다.

DCC는 유용한 결합제이다(미국 일리노이주 록랜드에 소재하는 피어스 제품 #20320). DCC는 DMSO(피어스 제품 #206.32) 중에서 클로린 e6에 대한 알코올 NHS의 결합을 촉진하여, 폴리리신에 가교될 수 있는 활성화된 에스테르를 만든다. DCC(N,N'-디시클로헥실카르보디이미드)는 일반적으로 펩티드 합성에 가교제로서 사용되는 카르복시 반응성 가교제로서, 분자량은 206.32이다. 다른 유용한 가교제는 1차 아민 및 설프히드릴기와 함께 사용되는 이종이작용성 가교제인 SPDP(피어스 #21557)이다. SPDP는 분자량이 312.4이고, 스페이서 아암의 길이는 6.8 옹스트롬이며, NHS-에스테르 및 피리딜디티오기와 반응적이고, 추가 반응시 이 제제가 제거되면 주쇄 또는 표적 부에 감광제가 직접 결합될 수 있는 절단성 가교제를 생성한다. 다른 유용한 접합제는 2 단계 가교 동안 차단된 SH기를 도입시키되, 히드록실아민-HCl(피어스 #26103)에 의해 차단기가 제거되는 SATA(피어스 #26102), 및 아민과 설프히드릴에 대해 반응성인 설포-SMCC(피어스 #22322)를 포함한다. 또한, 기타 다른 가교제 및 결합제는 피어스 케미칼 컴패니(미국 일리노이주 록포드 소재)로부터 입수용이하다. 단백질을 다른 단백질이나 다른 조성물, 예컨대 단백질을 금속 이온 표지화하기 위한 킬레이트 또는 리포터 기에 접합시키기 위한 또 다른 화합물 및 공정, 구체적으로 중간체로서 쉬프 염기를 포함하는 화합물 및 공정은 EPO 243,929 A2(1987.11.4에 공개)에 개시되어 있다.

카르복실기를 포함하는 감광제는 사전형성된 반응성 에스테르(예컨대, N-히드록시 숙신이미드 에스테르) 또는 카르보디이미드 매개 반응에 의해 동일계에서 접합된 에스테르에 의해 표적 폴리펩티드 중의 리신 ε-아미노기에 결합될 수 있다. 이와 유사하게, 아미노기와 반응하는 설포닐 클로라이드로 변형될 수 있는 설폰산기 함유 감광제도 사용될 수 있다. 카르복실기를 보유한 감광제는 동일계내 카르보디이미드 방법에 의해 폴리펩티드 상의 아미노기에 결합될 수 있다. 또한, 감광제는 세린이나 트레오닌 잔기의 히드록실기 또는 시스테인 잔기의 설프히드릴기에 결합될 수도 있다.

결합체 성분을 결합하는 방법, 예컨대 항균 폴리펩티드에 폴리아미노산 사슬 보유 감광제를 결합하는 방법에는 이종이작용성 가교 시약을 사용할 수 있다. 이 시약은 제1 사슬 중의 작용성기를 제2 사슬 중의 다른 작용성기에 결합시킨다. 이 작용성기들은 일반적으로 아미노, 카르복시, 설프히드릴 및 알데히드이다. 이외에도, 이와 같은 기 및 다른 조성의 구조와 반응하여 이들을 함께 접합시키는 다수의 과돌연변이된 적당한 부들이 있다. 예컨대, 피어스의 카탈로그와 문헌[Merrifield, R.B., et al. Ciba Found Symp. 186:5-20, 1994]을 참조하기 바란다.

감광제:표적부 결합체의 생성 및 정제는 당해 기술 분야에 공지된 방법으로 실시할 수 있다. 결합 반응의 수율은 정제 마지막 단계에서 크로마토그래피 분획으로부터 용출되는 생성물을 분광분석기로 측정하여 얻을 수 있다. 결합되지 않은 감광제 및 감광제를 포함하는 반응 생성물의 존재 및 그 다음 특정 파장 및 소멸 계수에서 광을 흡수하는 감광제부의 물리적 성질은 그 파장이나 유사 파장에서의 흡광도를 통해 모니터할 수 있다. 표적부 또는 주쇄에 1종 이상의 감광 분자가 결합하게 되면, 세파덱스 G50, G100 또는 G200이나, 다른 유사 매트릭스(파마시아-바이오테크, 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재)를 적절히 선택하여 사이징 겔 크로마토그래피할 때 용출된 분획들의 용출 프로파일에 나타나는 흡광도 피크가 이동된다. 사이징 겔, 예컨대 세파덱스 겔은 감광제가 비드와 상호작용하기에 너무 커서 배제된 물질 부피 이상의 분획에 용출되는, 즉 결합되지 않은 출발 감광제 조성물이 분획화 비드와 약간 상호반응하고 이에 수반하여 약간의 정도만이 지연되는 겔로 적절히 선택할 수 있다. 정확하게 유용한 겔은 결합되지 않은 감광제의 분자량으로부터 정확하게 추정할 수 있다. 다른 성분 부에 결합된 감광제 조성물의 성공적인 반응 생성물은 일반적으로 특징적인 고분자량이어서, 크로마토그래피 비드와 경미한 정도로 상호작용하며, 따라서 결합되지 않은 감광제 기질을 포함하는 분획보다 먼저 용출된 분획에서 나타난다. 반응되지 않은 감광제 기질은 일반적으로 출발 물질의 특징적인 분획에서 나타나고, 각 반응의 수율은 고분자량 물질의 피크 크기와, 특징적인 출발 물질의 피크의 감소를 통해 측정될 수 있다. 생성물 분획의 피크 면적은 몰소멸계수를 사용하여 수율의 크기로 바꾼다.

생성물은 적절한 생성물 피크의 면적을 적분하는 NMR을 사용하여 여러 결합제에 의한 상대적 수율을 측정하므로써 분석할 수 있다. 폴리아미노산에 결합된 후에는 감광제 흡광도가 수 nm 적색 방향으로 이동되는 것으로 관찰되었다. 단백질과 같이 보다 큰 성분의 부에 결합시킨 경우에도, 유리 감광제의 흡광도에 비하여 같은 방향으로 약 3 내지 5 nm의 이동을 나타내는 바와 같이, 유사한 이동 정도를 나타낼 것이다. 0.1 M NaOH/1% SDS에서 관련 최대 흡광도와 소멸 계수는 클로린 e6의 경우 400 nm 및 150,000 M^-1㎝^-1이고, 벤조포피린 유도체의 경우 430 nm 및 61,000 M^-1㎝^-1이었다.

주쇄부

본 발명에 기재된 감광제:표적부 결합체는 감광제가 히스타틴과 같은 표적부에 직접 결합되어 있는 것을 포함한다. 기타 다른 본 발명에 기재된 감광제:표적부 결합체는 폴리아미노산과 같은 "주쇄" 또는 "가교"부를 포함하고, 이 주쇄는 감광제와 표적부에 모두 결합된다. 주쇄 자체가 표적부, 예컨대 폴리리신일 수 있다(실시예 4 및 도 10과 11을 참조하라).

감광제부 및 표적부와의 결합체에 주쇄를 포함시키면 주쇄 당 결합되는 표적부와 감광제를 더 많은 화학량론 범위로 얻을 수 있는 것을 비롯하여 많은 장점을 제공할 수 있다. 주쇄가 표적 유기체에 대한 고유 친화성을 보유하는 경우, 조성물의 친화성은 주쇄에 결합시 증가될 수 있다. 1가지 조성물로 표적될 수 있는 유기체의 특정 범위는 단일 감광제-주쇄 조성물에 2종 이상의 상이한 표적부를 결합시키면 확대될 수 있다.

주쇄부의 특성 및 형태를 위해 본 발명의 화합물 및 방법에 유용한 펩티드는 L-, D, 라세미 DL- 또는 혼성 I- 및 D-아미노산 조성물의 동종- 및 이종-중합체일 수 있고, 정해진 또는 임의의 혼합 조성물 및 서열일 수 있는 폴리아미노산을 포함한다. 혼합 D 및 L 아미노산 잔기를 갖는 자연발생적 펩티드의 예에는 박티트라신과 티로시딘이 포함된다. 이들 펩티드는 특정 자연 펩티드 다음에 형성될 수 있으며 파지 디스플레이의 기법과 선택된 표적에 결합을 증진시키기 위한 선택에 의해 최적화될 수 있고, 고친화성의 선택된 펩티드는 특성화되고, 그 다음 합성적으로 제조된다. 예를 들어, 용해성, 응집성 감소, 및 소수성 범위의 변형을 위해 작용기의 추가 변형이 도입될 수 있다. 비펩티드 주쇄의 예에는 DNA, RNA 및 펩티드 핵산, 폴리사카라이드 및 스타치, 펙틴, 키틴, 셀룰로스 및 헤미메틸화된 셀룰로스와 같은 유도체, 포리에틸렌 글리콜(PEG) 및 PEG 스타 중합체와 같은 합성 중합체, 덱스트린 유도체, 폴리비닐 알콜, N-(2-히드록시프로필)-메타크릴아미드 공중합체, 폴리(DL-글리콜산-락트산) 및 이런 종류의 화합물의 성분을 함유하는 조성물과 같은 핵산과 핵산 유도체가 포함된다.

결합체 전하의 변형

결합체의 성분의 전하를 변형시킴으로써 표적 생물을 위한 결합체의 친화성을 조절할 수 있다.

크기 및 전하(양성, 중성, 및 음성)를 변형시켜 폴리-L-리신 클로린 e6과 같은 결합체를 만들수 있다. 예를 들어, 아세틸, 석시닐로 캡화된 폴리리신의 자유 NH2 군, 또는 최종 조성물의 전하를 변화시키기 위한 다른 R군과 같이. 등전성 포커싱(isoelctric focusing)(IEF)에 의해 본 발명의 결합체의 순 전하를 결정할 수 있다. 이 기법은 양쪽성 시스템(합성 완충 성분)의 사용에 의해 공급 전압을 사용하여 체질(sieving)하지 않은 아크릴아미드 또는 아가로스겔에서 pH 구배를 발생시킨다. 전하를 갖는 폴리펩티드를 겔에 적용하는 경우 전하를 띄지 않게 되고 나아가 더이상 이동할 수 없는 위치에 따라 그것들은 그 겔의 보다 높은 pH 또는 보다 낮은 pH 영역으로 이동할 수 있을 것이다. 일련의 공지된 IEF 표지 단백질의 위치를 기준으로 이 위치를 결정할 수 있다.

폴리아미노산에 대한 극성 전하 그룹의 결합 및 평면 방향족 테트라피롤 고리들 사이의 소수성 인력 때문에, 이들 결합체는 박테리아 세포벽과 상호작용할 수 있는 pH 의존성 형태로 맞춰질 수 있다. 또한, 히스타틴 및 관련 폴리펩티드는 히스타틴과 폴리리신 클로린 e6 분자사이의 디설파이드 공유 결합을 유도하는 2종류의 헤테로 2기능성 시약을 적용시켜 하나 이상의 리신 잔기를 함유한다. 각종 병인성 구강 박테리아에 대한 감광제의 적용 농도, 시간 및 최적 조성을 결정할 수 있다.

표적 부위

표적 부위의 바람직한 특성은 이하를 포함한다: 하나 이상의 바람직하지 않은 표적 유기체에 대한 특이성, 그런 유기체에 대한 결합성 및 친화성, 그리고 결합 반응의 조건에 대한 안정성 및 사용하는 기관 또는 조직의 생리성. 특이성은 좁게 한정시킬 필요는 없으며, 예를 들어, 그람 양성 박테리아와 같은 광범위한 표적 유기체에 대해 친화성을 갖는 표적화 분자가 바람직할 수 있다.

본 발명의 결합체 분자 내로 혼입시킬 경우, 표적부는 피검체의 세포에 대해 독성이 없어야 한다.

표적부는 자연 발생적 단백질 및 펩티드의 서열, 이 펩티드의 변이체 및 생물학적 또는 화학적으로 합성된 펩티드로부터 선택할 수 있다. 하나 이상의 표적 유기체에 대해 친화성을 갖는 자연 발생적 펩티드는 예를 들어, 증가된 친화성 또는 특이성과 같은 원하는 성질을 갖는, 개별적으로 또는 관련 펩티드의 라이브러리의 구성원으로 합성될 수 있는 부가 펩티드로부터 서열을 제공할 수 있다. 그런 펩티드는 표적 유기체에 대한 친화성을 기초로 선택할 수 있다.

본 발명의 화합물 및 방법에 유용한 표적 유기체에 대해 친화성을 갖는 자연 발생적 펩티드는 예를 들어, 히스타틴, 예를 들어, 박테리오신과 같은 미생물적으로 정교화된 단백질과 같은 타액 단백질, 생성 균주와 밀접하게 관련된 종류를 구속 및/또는 죽이는 펩티드; 및 포유 동물에 의해 생성되는 디펜신과 같은 동물종에 의해 생성되는 단백질 및 나방 및 양서류에 의해 각각 생성되는 세로핀 및 마가이닌을 포함한다.

히스타틴, 디펜신, 세로핀 및 마가이닌은 작은 크기의 특성(일반적으로 약 30개의 아미노산 잔기 및 10개 내지 50개의 잔기), 항미생물성 활성에 광범위한 특이성 및 표적 유기체에 대해 낮은 친화성을 공유하는, 천연에서 널리 발견되는 폴리펩티드류의 예이다.

감광제 표적부로서 히스타민을 사용하면 숙주 조직을 무해하게 유지시키면서 박테리아 세포에 대해 광 민감화제를 표적화시킨다. 히스타틴은 박테리아 및 칸디다균의 살균 성질을 갖고 통상의 사람 타액으로 구성된 히스타딘이 풍부한 양이온성 폴리펩티드과이다(Oppenheim, G.G. 등, J. Biol. chem. 263:7472-747, 1988). 작용 메카니즘은 알파-나선형의 조합 및 박테리아 세포벽에서 극성 헤드 그룹사이에 그것들이 삽입되도록 하는 양이온 전하와 관련된 것으로 생각된다(Raj, P.A. 등, J. Biol. Chem. 269:9610-9619, 1994).

구강 살균제로서 이용하여 히스타틴을 유용하게 사용할 수 있지만, 그들의 작용은 일정 시간에 걸쳐 일어나고, 감염 부위에서 히스타틴을 유지시키는 겔과 같은 제형 전달 운반체의 문제를 일으킨다. 하지만, 구강 박테리아의 광역학적 불활성은 오직 박테리아표적화된 감광제의 구강 세정제에 적용하는 것과 같이 간단한 적용을 필요로 할 수 있다. 박테리아는 평균 포유류의 세포보다 50 내지 100배 더 작고 광역학적 치료법의 메카니즘은 조직에서 매우 짧은 확산 거리를 갖는 단일 밴드 산소(단일 밴드 산소에 대해 50nm 이하)와 같은 분자 종의 생성과 관련된 것으로 생각되기 때문에, 박테리아에 대한 보통 수준의 민감화제 선택성을 세포 독성에서 높은 수준의 선택성을 갖게 하는 것으로 볼 수 있다. 사람 및 실험 동물에서 낮은 레벨의 PDT는 거대파지 및 림프구와 같은 숙주 면역 시스템의 성분을 활성화시키는 것으로 보이며, 이 활성화된 숙주 세포는 박테리아를 파괴시키고 질병에 의해 파괴된 조직의 재생을 돕는 역할을 할 것이다.

각 히스타닌-1, -3, 및 -5는 38, 32 및 24 잔기 각각의 총 폴리펩티드 길이에서 히스티딘의 7개의 잔기를 포함한다. 히스타틴은 예를 들어, 칸디다 병원체에 대한 항진균 활성과 같은 많은 활성을 갖는다( U.S.P.N. 5,486,503). 히스타틴-5 잔기 13-24의 재조합 복제는 증진된 칸디다균 살균 활성을 갖는 펩티드를 생성한다(Zuo, F. 등, Gene 161:87-91, 1995). 히스타틴-5는 구강 박테리아 종 포르피로모나스(Bacteroides) 진지발리스에 의해 생성된 트립신 유사 프로테아제의 억제제이다. 이 프로타아제는 치주의 질병의 조직 파괴와 관련되어 있다(Nishikata, M. 등, Biochem. Biophys. Res. Comm. 174:625-630, 1991). 약 3,600 히스타틴-5 분자가 서열 10-6 M상에서 Kd와 P. 진지발리스를 결합시킨다(Murakami, Y. 등, FEMSMicrobiol. Letts. 82:253-256, 1991).

히스타틴-5 및 -8은 P. 진지발리스 및 S. 미티스가 함께 응집하는 것을 억제하며(Murakami, Y. 등, Inf Immun. 53:3284-3286, 1991), 이는 이미 구강 조직에 결합된 그람 양성 박테리아에 대한 P. 진지발리스의 부착성을 조절할 수 있다.

히스타틴-5는 적어도 구강 박테리아 종 P. 진지발리스(Colon, J.O. 등, J. Dent. Res. 72 IADR Abstr.:322, Abstr. 1751) 및 악티노미세스 비스코수스, A. 나에스룬디, 및 A. 오돈톨리티쿠스(Kalpidis, C.D. 등, op.cit. 71:305, Abstr. 1595)에 대해 살균 활성을 갖는다. 후자의 종류에 대한 직접적인 항미생물 활성은 수용체 없이 악티노미세스 세포의 접합성에 대한 활성을 나타낸다. 히스타틴-5의 합성 펩티드는 P.(B) 진지발리스 헤마글루티닌의 강력한 억제제이다(Murakami, Y. 등, Archs. Oral. Biol. 35:775-777). 이 합성 펩티드는 강력한 양이온성이며(22개의 잔기 중에 6 His, 4 Lys, 및 3 Arg를 포함), 상피 조직, 타액 박막, 및 그람 양성 세에 대한 P. 진지발리스에 대한 결합 도메인으로서 작용할 수 있다.

C- 또는 N-말단에서 화학적으로 캡화되어 있고 예를 들어, Ag, Cu, Zn 또는 Sn과 같은 금속과 착물을 이루고 있는 히스타틴은 프라그 방지, 충치 방지, 입냄새 방지제, 탈취제, 개인 위생제 등과 같은 항미생물적 적용 범위에 적합하다(유럽 특허 출원 721 774 A2).

박테리아에 의해 생성된 단백질이며 다른 균주 및 박테리아 종을 죽이는(Jack, R.W.등, Microbiol. Rev. 59:171-200, 1995) 박테리오신을 표적부로서 사용할 수 있다. 그람 양성 박테리오신의 예로는 식품 보존에 대해 적용하기 위한 식품 및 약품청에 의한 GRAS 규정에 따른(일반적으로 안전한 것으로 간주됨) 락토코쿠스 락티스에 의해 생성된 니신이 있다.

박테리오신 니신, 서브틸린, 에피더민, 갈리더민, 살리바린 및 락티신은 란티오닌(Lan) 또는 트레오--메틸란티오닌(MeLan)으로서 공지된 티오에테르-결합된 잔기를 형성하는 탈수된 세린 또는 트레오닌과 연결되는 하나 이상의 시스테인 잔기내에 박테리오신으로서 정의되는 그람 양성 박테리오신의 "란티바이오틱"류를 예시한다. 이것들은 세포를 생성함으로써 항미생물성 펩티드에서 발견되는 후-전사성 변형이다. 란티바이오틱은 18-24 잔기의 리더 펩티드 서열을 포함하며, 이는 약 22-35 잔기의 활성 항미생물성 펩티드를 얻기 위해 절단된다. 생성 박테리아종의 성장 및 박테리오신의 제조 및 정제는 당업자에 의해 수행될 수 있는 공지된 공정및 기법에 의해 수행된다. 예를 들어, Yang, R. 등, Appl 및 Env. Microbiol 58:3355-3359, 1992에는 생성된 세포상에 흡착을 최적화 시키고 상당히 풍부해진 박테리오신 분획물의 선택적인 용리를 위해 낮은 pH를 사용함으로써 락트산 박테리아의 4가지 속(屬)의 각각으로부터 박테리오신을 정제하는 방법이 기재되어 있다. 락토코쿠스 락티스에 의해 생성된 박테리오신 니신의 돌연변이체 형성, 바실루스 서브틸리스에 의해 생성된 서브틸린의 돌연변이체 형성은 모계 야생형 보다 바람직한 성질을 갖는다(Liu, W. 및 N. Hansen, J, Biol. Chem. 267:25, 078-25, 085, 1992). 적절한 유전자의 분리 및 바람직한 돌연변이를 수행하는 균주의 선택과 돌연변이화 방법은 Maniatis, T. 등, 1982, Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 및 연속 제2판, Sambrook, J.등, 1989에 기재되어 있다.

각종 동물에 의해 항미생물성 펩티드를 제조한다(Saberwal, G. 및 R. Nagaraj, Biochim. Biophys. Act. 1197:109-131, 1994 참조). 세크로피아 나방에 의해 제조된 세크로핀 과의 펩티드를 예로 들 수 있다. 몇몇 세크로핀은 37개의 잔기를 포함하며, 이중 6개가 리신이다. 세크로핀은 그람 양성 및 그람 음성 박테리아 모두에 대해 활성이 있다. 다른 곤충에 의해 생성된 펩티드는 아피데신(꿀벌로부터), 안드로핀(과일 해충으로부터) 및 범블벌, 과일해충 및 기타 곤충으로부터의 세로핀과 구성원을 포함한다.

디펜신은 사람을 포함하는 포유류에 의해 생성되며, 일반적으로 길이가 약 29-34 잔기이고, 마가이닌(약 23잔기)은 크세노푸스 라에비스와 같은 양서류에 의해 생성된다. 사람(HNP-1, -2, -3 및 -4), 기니아 피그(GPNP), 토끼(NP-1, -2, -3A, -4 및 -5) 및 래트 (NP-1, -2, -3 -4)로부터 생성된 디펜신은 상당한 수의 상동부위를 공유한다. 디펜신은 mM 범위에서 최소 억제 농도로 그람 양성 박테리아 또는 그람 음성 박테리아 및 균류에 대해 항미생물성 활성을 가질 수 있다. 토끼 NP-1 및 NP-2는 이 과의 다른 것들 보다 강력한 살균제이다. 기타 포유류성 항미생물성 펩티드에는 뮤린 크립트딘, 소과 과립성 백혈구 박테네신 및 인돌리시딘, 소정액으로부터의 세미날플라스민을 포함된다. 추가적인 양서류성 항미생물제에는 PGLA, XPE, LPF, CPG, PGQ, 봄비니아 바리에가타로부터의 봄비닌, B. 오리엔탈리스로부터의 봄비닌 유사 펩티드 BLP-1, -2, -3 및 -4, 및 라나 에스큘렌타로부터의 브레비닌이 포함된다. 호르스슈 크렙과 같은 무척추동물은 타키플레신(I, II 및 III) 및 폴리페뮤신(I 및 II)과 같은 항미생물성 펩티드의 공급원이 될 수 있다.

항미생물성 제제의 이런 과의 펩티드는 일반적으로 양이온성이고 광범위한 항미생물성 스펙트럼을 가질 수 있으며, 항박테리아성 및 항진균성 활성을 모두 갖는다. 양성 전하를 갖는 잔기의 첨가는 항미생물성 특이 활성을 몇배 증진시킬 수 있다. 양성 전하는 허용가능한 유기체의 막안으로 상기 펩티드를 삽입시키는 것을 돕는 것으로 생각되는데, 이런 상황에서 펩티드 분자는 공극을 형성할 수도 있고 이온 유출 및 기타 신진대사를 일으킬 수 있다. 예를 들어 모세 혀넙치(Moses sole fish) 뉴로톡신 33 잔기 펩티드 파르닥신의 구조 연구는 석시닐화된 파르닥신이 변형되지 않은 프르닥신보다 더욱 서서히 적혈구 및 모델 막안으로 삽입된다는 것을 나타낸다(Shai, Y J.Biol. Chem. 265:20, 202-20, 209, 1990). 양성 전하를 갖는 마가이닌 분자는 이 콜라이의 신진대사 및 미토콘드리온의 전기적 포텐셜 모두를 붕괘시킬 수 있다(Westerhoff, H.V. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. 86:6597-6601, 1989).

예를 들어, 세크로핀-멜리틴 하이브리드 및 합성 데난티오머와 같은 신규 펩티드는 항미생물 활성을 갖는다(Merrifield, R.B. 등, "Antimicrobial peptides", "Ciba Foundation Symp. 186, John Wiley, Chichester, pp. 5-26, 1994). 이런 합성 세크로핀-멜리틴 펩티드의 하나는 미코박테리아 스메그마티스에 대해 리팜핀에 비해 5배의 활성이 있다.

표적화부는 예를 들어, 폴리사카라이드에 대해 친화성을 갖는 렉틴 단백질의 하나와 같은, 특정 표적 유기체에 대해 친화성을 갖는 식물 단백질일 수 있다.

표적화부는 그렇게 양전하를 갖는 아미노산 잔기의 실질적인 일부를 포함하는, 폴리리신, 폴리아르기닌, 폴리니틴과 같은 합성 펩티드 및 합성 헤테로폴리펩티드일 수 있다. 재조합 유기체에서 생물학적으로 생성하거나 또는 화학적으로 그런 펩티드를 합성할 수 있는데, 이 경우 표적 펩티드는 예를 들어, N-말단 잔기와 같은 큰 단백질의 일부로서 생성되거나 그런 큰 단백질로부터 절단될 수 있다. 그것들이 표적 유기체에 대해 충분한 친화성을 갖는 경우, "주쇄" 및 "가교"부로서 적합한 폴리펩티드도 표적 부위로서 적합하다. 따라서, 기재된 고려 사항은 표적부의 고려 사항에도 적합하다. 본 명세서에 기재된 각종 방법으로 표적부를 합성하고 선택하거나 풍부하게 할 수 있다.

표적부는 펩티드 조성물에 제한될 필요는 없지만, 렉틴, 폴리사카라이드, 스테로이드 및 유기금속 조성물일 수 있다. 표적부는 뮤코폴리사카라이드와 같은 당과 아미노산으로 구성된 조성물로 이루어질 수 있다. 유용한 표적부는 저밀도 지단백질과 같이, 자연상태에서 일부는 지질이고 일부는 펩티드일 수 있다. 혈청 지단백질 특히 고밀도 및 저밀도 지단백질(HDL 및 LDL)은 박테리아 표면 단백질과 결합할 수 있다(Emancipator, K. 등, Infect. Immun. 60:596601, 1992). HDL 및 특히 재구성된 HDL은 시험관내 및 생체내 양쪽에서 박테리아성 폴리사카라이드를 중화시킨다(Wurfel MM 등, J. Exp. Med. 181:17431754, 1995). 내생 LDL은 엔도톡신 및 그람 양성 감염의 치사 효과에 대해 보호할 수 있다(Netea, M. 등, J. Clin. Invest. 97:1366-1372, 1996). 당해 기술분야에서 공지된 분자 생물학의 방법으로 박테리아성 표면 성분에 대한 지단백질의 적절한 결합 구조를 확인할 수 있으며, 본 발명의 감광제 조성물에서 표적부로서 지단백질의 결합 구조를 사용할 수 있다.

펩티드 표적부 후보체의 생성 및 스크리닝

본 발명자는 높은 친화성 리간드 쌍의 멤버 및 항체 이외의 예를 들어, 펩티드와 같은 분자를 표적 유기체에 대해 감광제를 표적하는데 사용할 수 있다는 것을 발견했다. 본 명세서에 개시된 표적부를 변형시키고 정제하거나 또는 새로운 표적부를 발견하는데 하기 방법을 사용할 수 있다.

일단 합당한 친화성의 표적부의 예가 제공되며, 당업자는 단편 또는 유사체를 제조하고 친화성 또는 특이성의 변형을 위해 새롭게 제조된 구조를 테스트하여 개시된 구조(예를 들어, 폴리리신 폴리펩티드의 구조)를 변형시킬 수 있다. 단편 및 유사체를 제조하고 테스트하는 방법의 예는 하기에서 논의된다. 예를 들어, 히스타틴 또는 저밀도 지단백질과 같은 폴리펩티드의 표적부이며, 그 각각이 하나 이상의 박테리아 종의 세포에 대해 결합 친화성을 갖는, 공지된 자연 발생적 폴리펩티드 또는 단백질의 단편 및 유사체를 만드는데 이 방법들을 사용할 수 있다.

단편 생성

예를 들어, 재조합적으로, 단백질 가수분해적 절단에 의해, 또는 화학적 합성에 의해서와 같이 여러 방법으로 단백질의 단편을 제조할 수 있다. 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 한 말단 또는 양쪽 말단으로부터 하나 이상의 뉴클레오티드를 제거함으로써 폴리펩티드의 내부 단편 또는 말단 단편을 생성할 수 있다. 돌연변이화된 DNA 의 발현은 폴리펩티드 단편을 생성한다. "말단-니블링" 프로세싱 엑소뉴클레아제로 절단시키면 단편의 배열을 암호화하는 DNA를 생성할 수 있다. 또한, 단백질의 단편을 암호화하는 DNA는 무작위 전단, 제한적 절단 또는 전술된 방법의 조합에 의해 생성할 수 있다.

또한 통상의 메리필드 고체상 f-Moc 또는 t-Boc 화학과 같은 당해 기술분야에 공지된 기법을 사용하여 단편을 화학적으로 합성할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 펩티드는 임의적으로 단편들의 오버랩 없이 원하는 길이의 단편으로 분할되거나 또는 원하는 길이의 오버랩핑 단편으로 분할될 수 있다.

유사체 생성 : 임의 방법에 의한 변형된 DNA 및 펩티드 서열의 제조

무작위 방법

단백질 또는 단백질의 특정 도메인이나 부위를 암호화하는 DNA의 무작위 돌연변히화에 의해 단백질의 아미노산 서열 변이체를 제조할 수 있다. 유용한 방법으로는 PCR 돌연변이화 및 포화 돌연변이화를 들 수 있다. 또한 한 세트의 변성된 올리고뉴클레오티드 서열을 합성시켜 무작위 아미노산 서열 변이체의 라이브러리를 제조할 수 있다(변이체의 라이브러리에서 단백질을 스크리닝하는 방법은 본 명세서에 나타나 있지 않음).

PCR 돌연변이화

PCR 돌연변이화에서, DNA의 클론된 단편내로 임의의 돌연변이체를 도입시키기 위해, 감소된 Taq 폴리머라제 fidelity를 사용했다(Leung 등, 1989, Technique 1:11-15).이것은 무작위 돌연변위를 도입하는 매우 강력하고 상대적으로 빠른 방법이다. 예를 들어, 5:1의 dGTP:dATP 비율을 이용하고 PCR 반응에 Mn2+를 첨가하여, Taq DNA 폴리머라제에 의한 DNA 합성의 fidelity를 감소시키는 조건하에서, 돌연변이화된 DNA 부위를 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 이용하여 확대시킨다. 확대된 DNA 단편의 풀은 적절한 클로닝 벡터내로 삽입되어 무작위 돌연변이 라이브러리를 제공한다.

포화 돌연변이화

포화 돌연변이화는 클론된 DNA 단편내로 다수의 단일 염기 치환체를 빠르게 도입시키는 것을 허용한다(Mayers 등, 1985, Science 229:242). 이 기법은 예를 들어, 시험관내에서 단일 가닥 DNA의 화학적 처리 또는 조사에 의해 돌연변이체를 생성하고, 상보적 DNA 가닥을 합성하는 것을 포함한다. 그 처리의 엄격성을 조절하여 돌연변이 주파수를 조절할 수 있으며 필수적으로 가능한 모든 염기 치환체를 얻을 수 있다. 이 공정은 돌연변이 단편에 대한 유전적 선택과 관련이 없기 때문에, 양쪽 중성 치환체 뿐만 아니라 기능이 변형된 치환체가 얻어진다. 포인트 돌연변이체의 분포는 전환된 서열 요소쪽으로 편향되어 있지 않다.

변성 올리고뉴클레오티드

또한 한 세트의 변성 올리고뉴클레오티드 서열로부터 상동체의 라이브러리를 생성할 수도 있다. 변성 서열의 화학적 합성은 자동 DNA 합성기에서 수행할 수 있으며, 적절한 발현 벡터내로 합성 유전자를 결찰시킬 수도 있다. 변성 올리고뉴클레오티드의 합성은 당해 기술분야에 공지되어 있다(예를 들어, Narang, SA (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura 등 (1981) Recombinant DNA, Proc 3판 Cleveland Sympos. Macromolecules, ed. AG Walton, Amsterdam: Elsevier 273-289; Itakura 등 (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura 등 (1984) Science 198:1056; Ike 등 (1983) Nucleic Acid Res. 11:477 참조) 다른 단백질의 전개에 관련해서 이런 기법이 사용된다(예를 들어, Scott (1990) Science 249:386-390; Robert 등 (1992) PNAS 89:2429-2433; Devlin 등 (1990) Science 249:404-406; Cwirla 등 (1990) PNAS 87:6378-6382; 및 미국 특허 제5,223, 409호, 제5,198,346호 및 제5, 096,815호 참조).

유사체의 생성: 직접 돌연변이화에 의한 변형된 DNA 및 펩티드 서열의 제조

특이적 부위에 특이적 서열 또는 돌연변이체를 제공하는데 무작위적이지 않거나 또는 직접적인 돌연변이화 기법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 단백질의 공지된 아미노산 서열 잔기의 결실체, 삽입체 또는 치환체와 같은 변이체를 만드는데 이들 기법을 사용할 수 있다. 예를 들어, (1) 먼저 보존된 아미노산으로 그리고 수행된 결과에 좌우되는 보다 과격한 선택체로 치환시키고 (2) 표적 잔기를 결실시키고, 또는 (3) 동일한 잔기들 또는 지정된 부위에 인접한 다른 클라스를 삽입시키거나 또는 옵션 1-3을 재조합시켜, 개별적으로 또는 연속적으로 돌연변이 부위를 변형시킬 수 있다.

알라닌 스캐닝 돌연변이화

알라닌 스캐닝 돌연변이화는 돌연변이화를 위한 바람직한 위치 또는 도메인인, 원하는 단백질의 임의의 잔기 또는 부위를 확인하는데 유용한 방법이다( Cunningham and Wells. Science 244:1081-1085, 1989). 알라닌 스크리닝에서, 표적 잔기의 잔기 또는 군을 확인하고(예를 들어, Arg, Asp, His, Lys 및 Glu와 같이 전하를 갖는 잔기) 중성적으로 또는 음전하를 갖는 아미노산(가장 바람직하게는 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 대체시킨다. 아미노산의 대체는 아미노산과 세포 안팎의 주위 수성 환경의 상호작용에 영향을 줄 수 있다. 치환체에 대한 기능적인 선택성을 예시하는 이들 도메인은 치환체의 부위에서 또는 부위를 위해 또 다른 변이체를 도입시킴으로서 정제된다. 따라서, 아미노산 서열 변형을 도입시키는 부위가 예정되는 경우에도, 돌연변이의 성질 그 자체가 결정될 필요는 없다. 예를 들어, 주어진 부위에서 돌연변이의 성능을 최적화시키기 위해, 표적 코돈 또는 부위에서 알라닌 스캐닝 또는 무작위 돌연변이화가 수행될 수 있고, 발현된 목적하는 단백질의 소단위 변이체는 원하는 활성의 최적 조합을 위해 스크리닝된다.

올리고뉴클레오티드-매개된 돌연변이화

올리고뉴클레오티드 매개된 돌연변이화는 DNA의 치환, 결실 및 삽입 변이체를 제조하는 유용한 방법이다(예를 들어, Adelman 등, DNA 2:183, 1983 참조). 간단히 말해서, DNA 주형에 대해 돌연변이를 암호하하는 올리고뉴클레오티드를 하이브라이드시켜서 원하는 DNA를 변형시킨다. 그 주형은 목적하는 단백질의 변형되지 않은 또는 야생형 DNA 서열을 포함하는 플라스미드 또는 박테리오파지의 한가닥 형태이다. 하이브라이드화시킨 후에, 올리고뉴클레오티드 프라이머를 혼입시키고, 목적하는 단백질 DNA에서 선택된 변형을 위해 코드하는 주형의 전체 제2의 상보적 가닥을 합성하기 위해 DNA 폴리머라제를 사용한다. 일반적으로, 길이가 적어도 25 뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드를 사용한다. 최적 올리고뉴클레오티드는 돌연변이를 위한 뉴클레오티드 코딩의 한면상에서 주형에 완전히 상보적인 12 내지 15 뉴클레오티드를 가진다. 이것은 그 뉴클레오티드가 단일 가닥 DNA 주형 분자에 대해 적절히 하이브라이드시킨다는 것을 보증한다. (Crea 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75:5765, 1978)에 기재된 바와 같은 당해 기술 분야에 공지된 기법을 사용하여 올리고뉴클레오티드를 쉽게 합성할 수 있다.

카세트 돌연변이화

변이체를 제조하는 또다른 방법인 카세트 돌연변이화는 Well 등(Gene, 34: 315, 1985)에 기재된 기법에 기초를 두고 있다. 출발 물질은 돌연변이되는 단백질 소단위체 DNA를 포함하는 플라스미드(또는 다른 벡터)이다. 돌연변이되는 단백질 소단위체 DNA에서 코돈이 확인된다. 확인된 돌연변이 부위의 각 면상에 독특한 제한 엔도뉴클라아제 부위가 있어야만 한다. 그런 제한 부위가 존재하지 않으면, 목적하는 단백질 소단위체 DNA의 적절한 위치에서 이것들을 도입시키기 위해, 전술된 올리고뉴클레오티드 매개된 돌연변이화 방법을 사용하여 이것들을 생성할 수 있다. 제한 부위가 플라스미드 내로 도입된 후에, 플라스미드는 이 부위에서 절단되어 그것들을 선형화시킨다. 목적하는 돌연변이체를 포함하는, 제한 부위들 사이의 DNA 서열을 암호화하는 2중 가닥 올리고뉴클레오티드를 표준 공정을 사용하여 합성한다. 두 가닥을 각각 합성하고 나서 표준 기법을 사용하여 함께 하이브라이드시킨다. 이 2중 가닥된 올리고뉴클레오티드를 카세트로 명명한다. 이 카세트는 선형화된 플라스미드 말단과 비교될 수 있는 3' 및 5' 말단을 갖도록 설계되며, 플라스미드에 직접 결합될 수 있다. 현재 이 플라스미드는 돌연변이화된 목적하는 단백질 소단위체 DNA 서열을 함유한다.

조합성 돌연변이화

예를 들어, 1군의 상동체 또는 정열된 다른 관련 단백질의 아미노산 서열과 같은 돌연변이체를 생성하기 위해, 바람직하게는 고도의 상동성이 되도록 촉진시키기 위해 조합성 돌연변이화를 이용할 수도 있다. 정열된 서열의 주어진 위치에서 나타나는 모든 아미노산은 조합성 서열의 변성 세트를 만들기 위해 선택될 수 있다. 핵산 레벨에서 조합성 돌연변이화에 의해 변이체의 변화된 라이브러리가 생성되고 변화된 유전자 라이브러리에 의해 암호화된다. 예를 들어, 합성 올리고뉴클레오티드의 혼합물는 잠재적 서열의 변형 세트가 개별 펩티드로서 또는 변성 서열의 세트를 포함하는 거대 융합 단백질 세트로서 발현될 수 있도록 유전자 서열내로 효소적으로 결합될 수 있다.

펩티드 단편 또는 상동체의 라이브러리를 스크리닝하는 일차적 고성능 처리 (High-Throughput) 방법

생성된 유전자 생성물을 스크리닝하기 위해 당해 기술 분야에 여러 기법이 공지되어 있다. 종종 큰 라이브러리를 스크리닝하기 위한 기법은 복제 발현 벡터내로 관심있는 핵산을 클로닝하고, 그 결과 생성된 벡터의 라이브러리로 적절한 세포를 형질전환시키고, 예를 들어, 이 경우, 표적 유기체에 또는 표적 유기체의 표면 성분에 결합시키는 것과 같이, 원하는 활성의 검출 조건하에서 유전자를 발현시키는 것을 포함하는데, 그 생성물이 검출되는 유전자를 암호화하는 벡터의 분리를 상대적으로 용이하게 한다. 후술된 각 기법은 예를 들어, 무작위 돌연변이화 기법에 의해 만들어진 다수의 서열을 스크리닝하기 위해 고성능 처리 분석법을 이용할 수 있다.

라이브러리 디스플레이

스크리닝 분석에 대한 하나의 빛에 접근법으로, 세포 또는 바이러스 입자의 표면상에 후보 펩티드를 나타내고, 그 생성물을 통해 적절한 표적 유기체 단백질을 결합시키는 특정 세포 또는 바이러스 입자의 능력을 "패닝 분석"으로 검출한다. 예를 들면, 유전자 라이브러리를 박테리아 세포의 표면막 단백질에 대해 유전자내로 클론시킬 수 있고 그 결과 생성된 융합 단백질을 패닝으로 검출할 수 있다(Ladner 등, WO 88/06630; Fuchs 등, (1991) Bio/Technology 9:1370-1371; 및 Goward (1992) TIBS 18:136-140). 유사한 방식으로, 잠재적으로 기능성 펩티드 상동체를 평가하기 위해 검출가능하게 표지된 리간드를 사용할 수 있다. 리간드 결합 활성을 유지하는 상동체를 검출하기 위해 예를 들어, 표적 유기체와 같은 형광적으로 표지된 리간드를 사용할 수 있다. 형광적으로 표지된 리간드의 사용은 형광 현미경 또는 세포의 형태를 볼 수 있는 곳에서 세포를 시각적으로 검사하고 분리할 수 있게 하며, 형광성-활성화된 세포 분리기에 의해 분리할 수 있게 한다.

유전자 라이브러리는 바이러스 입자의 표면상에서 융합 단백질로서 발현될 수 있다. 예를 들어, 사상(filamentous) 파지 시스템에서, 외국 펩티드 서열은 감염성 파지의 표면상에서 발현될 수 있고, 따라서 2개의 중요한 이익을 얻을 수 있다. 먼저, 밀리리터당 1013 파지 이상 농도의 웰에서 친화성 매트릭스에 적용될 수 있기 때문에, 많은 파지가 한번에 스크린될 수 있다. 둘째로, 각 감염성 파지가 그 표면상에서 유전자 생성물을 나타내기 때문에, 특정 파지가 낮은 수득율로 친화성 매트릭스로부터 회수되는 경우, 그 파지는 또다른 감염 부위에 의해 확대될 수 있다. 거의 동일한 E. 콜라이 사상 M13, fd 및 fl의 그룹은 대부분 파지 디스플레이 라이브러리에 사용된다. 바이러스 입자의 궁극적인 포장을 파괴하지 않으면서 융합 단백질을 생성하기 위해 파지 gⅢ 또는 gⅧ 코드(coat) 단백질을 사용할 수 있다. 외부 에피토프는 이 에피토프가 결핍시키는 과량의 파지로부터 회복된 그런 에피토프를 보유하는 필 및 파지의 NH2 말단에서 발현될 수 있다(Ladner 등, PCT 공보 WO90/02909; Garrard 등, PCT WO 92/09690; Marks 등, (1992) J. Biol. Chem. 267: 16007-16010; Griffiths 등, (1993) EMBOJ 12:175-734; Clackson 등, (1991) Nature 352:624-628; 및 Barbas 등, (1992) PNAS 89:4457-4461).

통상적인 접근법은 펩티드 융합 파트너로서 이 콜라이의 말토스 수용체를 사용한다(Charbit (1986) EMBO 5, 3029-3037). 올리고뉴클레오티드를 LamB를 암호화하는 플라스미드내로 삽입시켜 단백질의 여분세포성 루감광제의 하나 내로 융합된 펩티드를 제조한다. 이 펩티드는 예를 들어, 항체와 같은 리간드에 결합될 수 있고, 세포를 동물에 투여할 때 면역 반응을 유도할 수 있다. 예를 들어, OmpA (Schorr 등, (1991) Vaccines 91, pp. 387-392), PhoE (Agterberg 등 (1990) Gene 88, 37-45) 및 PAL (Fuchs 등 (1991) Bio/Tech9, 1369-1372)과 같은 다른 세포 표면 단백질 뿐만 아니라, 큰 박테리아의 표면 구조체가 펩티드 디스플레이를 위한 운반체로 제공된다. 펩티드는 필린으로 융합될 수 있고, 단백질은 유전 정보의 박테리아 상호간의 교환을 위한 필러스-관을 형성하기 위해 중합된다(Thiry 등, (1989) Appl. Environ. Microbiol. 55, 984-993). 다른 세포와의 상호작용에 있어서의 그들의 역할때문에, 필러스는 여분세포 환경에 대해 펩티드의 제시를 위한 유용한 지지체를 제공한다. 펩티드 디스플레이에 사용되는 또 다른 큰 표면 구조체는 박테리아성 모티브 기관, 편모이다. 소단위체 단백질 편모에 대한 펩티드의 융합은 숙주 세포상에 펩티드 복제물의 두꺼운 배열을 제공한다(Kuwajima (1988) Bio/Tech. 6, 1080-1083). 또한, 다른 박테리아 종의 표면 단백질은 펩티드 융합 파트너로서 제공된다. 예로는 스타필로코쿠스 단백질 A 및 네이세리아의 외막 IgA 프로타아제를 포함한다 (Hansson 등, (1992) J. Bacteriol. 174. 42394245; Klauser 등, (1990) EMBO J. 9, 1991-1999).

전술된 사상 시스템과 LamB 시스템에서, 펩티드와 그것의 암호화 DNA 사이의 물리적 결합은 그 표면상에 펩티드를 운반하는 입자(셀 또는 파지)내에 DNA를 함유함으로써 일어난다. 펩티드의 포획화는 그 안에 입자와 DNA를 가둔다. 또 다른 장치는 펩티드와 DNA 사이의 결합을 형성하기 위해 DNA-결합 단백질 LacI를 사용한다(Cull 등, 1992, PNAS USA 89:1865-1869). 이 시스템은 그것의 3'-말단에 올리고뉴클레오티드 클로닝 위치를 갖는 LacI 유전자를 함유하는 플라스미드를 사용한다. 아라비노즈에 의해 조절된 유도하에서, LacI 펩티드 융합 단백질을 제조한다. 이 융합은 LacO 작용기(LacO)로 알려진 짧은 DNA 서열에 결합시키기 위한 LacI의 자연적인 능력을 유지한다. 발현 플라스미드 상에 LacO의 두 복제물을 설치함으로써 LacI-펩티드 융합을 그것을 암화화한 플라스미드에 단단히 결합시킨다. 각 세포에서 플라스미드는 오직 단일 올리고뉴클레오티드 서열만을 함유하며 각 세포는 오직 단일 펩티드 서열만을 발현시키기 때문에, 그 펩티드는 그 합성을 지시한 DNA 서열과 특이적이고 안정적으로 연관된다. 라이브러리의 세포는 완만하게 분해되고 펩티드-DNA 결합체는 고정된 수용체의 매트릭스에 노출되어 활성 펩티드를 함유하는 결합체를 회복시킨다. 이와 관련된 플라스미드 DNA는 펩티드 리간드의 동일성을 결정하기 위한 DNA 서열화 및 확대를 위해 세포내로 도입된다. 그 방법의 실질적인 유용성의 예시로서, 도데카펩티드의 무작위의 큰 라이브러리가 만들어지고 오피오이드 펩티드 디노르핀 B에 대해 발생된 단일클론성 항체상에서 선택되었다. 펩티드의 코호르트가 회수되었고, 이 모두는 디노르핀 B의 6-잔기 부분에 해당하는 일치 서열과 관련되었다(Cull 등, (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89-1869).

이 장치는 때때로 펩티드-온-플라스미드로 일컬어진다. 파지 디스플레이 방법과는 중요한 두가지 점에서 다르다. 첫째, 펩티드는 융합 단백질의 C-말단에 부착되고, 카르복시 말단기가 없는 펩티드로서 라이브러리 구성원을 나타낸다. 사상 코트 단백질 pⅢ와 pⅧ는 모두 그것들의 C-말단기를 통해 파지에 정착하고 게스트 펩티드는 외부로 연장되는 N-말잔 도메인내에 위치한다. 몇몇 형태에서는 융합 단백질의 아미노 말단에서 우측에 파지 디스플레이된 펩티드가 존재한다(Cwirla 등, (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 6378-6382). 두번째 차이는 라이브러리에 실질적으로 존재하는 펩티드의 개체군에 영향을 주는 생물학적 바이어스 세트이다. LacI 융합 분자는 숙주 세포의 세포질에 한정된다. 파지 코트 융합체는 전사과정동안 세포질에 노출되지만 페리플라스믹 구획내로 내막을 통해 빠르게 분비되어, 펩티드를 함유하는 N-말단기를 갖는, 그것의 C-말단 소수성 도메인에 의한 막에 정착되고, 파지 입자내로 조립체를 준비하는 동안 페리플라슴내로 돌출된다. LacI의 펩티드 및 파지 라이브러리는 다른 단백질 가수분해 활성에 대한 노출 결과로서 상당히 다를 수 있다. 파지 코트 단백질은 내막 및 단일 펩티다제를 가로지르는 운반및 파지 내로 혼입시키기 위한 준비 과정을 필요로 한다. 임의의 펩티드는 이 과정에서 해로운 효과를 끼치며 라이브러리에서 하부에 제시된다(Gallop 등, (1994) J. Med. Chem. 37(9):1233-1251). 이들 특정 바이아스는 LacI 디스플레이 시스템에서의 요인이 아니다.

무작위 재조합 라이브러리에서 구할 수 있는 소형 펩티드의 수는 무한하다. 10⁷-10⁹독립 클론의 라이브러리는 항상 준비되어 있다. 1011 재조합체 만큼 큰 라이브러리가 형성되지만, 이 크기는 클론 라이브러리에 대한 실질적인 한계에 접근한다. 라이브러리 크기에서의 이런 제한은 숙주 박테리아 세포내로 무작위 단편을 함유하는 DNA를 형질전환시키는 단계에서 일어난다. 이런 한계를 극복하기 위해, 폴리솜 결합체에서 발생기의 펩티드의 디스플레이에 기초한 시험관내 시스템이 최근 개발되었다. 이 디스플레이 라이브러리 방법은 최근 구입가능한 파지/파지미드 또는 플라스미드 라이브러리보다 큰 크기의 3-6 정렬된 라이브러리를 생성할 수 있는 잠재성을 갖는다. 또한, 라이브러리의 구성, 펩티드의 발현 및 스크리닝은 완전히 세포가 없는 형태로 이루어진다.

이 방법의 한 적용에서, 10¹²데카펩티드를 암호화하는 분자 DNA 라이브러리가 구성되었고 라이브러리는 전사/번역 시스템이 콜라이 S30에서 발현되었다. mRNA 상의 리보좀을 멈추게 하기 위한 조건을 선택해서, 폴리좀에서 RNA의 실질적인 비율의 축적을 일으키고 그들의 암호화 RNA와 결합된 발생기의 펩티드를 함유하는 결합체를 얻는다. 폴리좀은 친화성이 되기에 충분히 강건하며, 보다 일반적인 재조합 펩티드 디스플레이 라이브러리가 스크린될 때와 같은 방식으로 고정된 수용체상에서 정제된다. 결합된 결합체로부터 RNA가 회수되고, cDNA로 전환되며 PCR에 의해 확대되어 합성 및 스크리닝의 다음 단계를 위한 주형이 생성된다. 폴리좀 디스플레이 방법은 파지 디스플레이 시스템과 결합될 수 있다. 스크리닝의 다음 몇 단계에서 폴리좀의 풍부한 풀로부터 cDNA가 파지미드 벡터내로 클론되었다. 이 벡터는 코트 단백질과 융합된 펩티드를 디스플레이하는, 펩티드 발현 벡터로서 그리고 펩티드의 확인을 위한 DNA 서열화 벡터로서 작용한다. 파지상에서 폴리좀 유도된 펩티드를 발현시킴으로서, 이 형태에서 친화성 선택 절차를 계속하거나 파지 ELISA에서 결합 활성 또는 완결 파지 ELISA에서 결합 특이성을 위해 개별 클론상에서 펩티드를 분석할 수도 있다(Barret 등, (1992) Anal. Biochem 204, 357-364). 활성 펩티드의 서열을 확인하기 위해 파지미드 숙주에 의해 생성된 DNA를 서열화한다.

2차 스크린

전술된 고성능 처리 분석 다음에 생물학적 존재에 대한 적절한 친화성을 갖는 분자를 확인하고, 풍부화하고 선택하기 위해 2차 스크린을 할 수 있다. 2차 스크린은 관심있는 중합체를 결합시키기 위한 표적부의 능력에 좌우된다. 전술된 1차 스크린 중 하나를 통해 분리된 펩티드 단편의 그룹으로부터 리간드를 확인하기 위해서 예를 들어, 관심있는 표적 유기체의 표면 단백질 또는 탄수화물을 사용할 수 있다. 예를 들어, 바이러스 병원체으로부터의 정제된 단백질, 이 물질의 제조를 위해 특이적으로 얻어진 재조합 유기체로부터 얻어진 것과 같은 매우 순수한 물질을 사용하거나 세포벽 또는 박막 제제와 같은 표적 유기체의 미정제 제제를 사용할 수 있으며, 표적 유기체의 열-불화성화되거나 포르말린 처리된 제제도 사용할 수 있다.

하기에 예는 2가지의 표적화 물질로서, 광범위한 박테리아 종에 대해 친화성을 가지며 또한 부가 표적부의 결합을 위한 주쇄로서 작용하는 양전하를 갖는 폴리아미노산인 폴리리신과 구강 박테리아의 여러 종에 대해 친화성을 갖는 타액성 단백질 히스타틴을 들 수 있다. 이 물질은 각각 예를 들어 M13 파지 디스플레이 벡터의 유전자 Ⅲ의 헥산내로 핵산 서열을 혼입시키는 것과 같이 본 명세서에 기재된, 파지 디스플레이 라이브러리에 대한 공정에서 출발 물질로서 사용할 수 있다(예를 들어, Scott 등 (1990) Science 249:386-390; Roberts 등, (1992) PNAS 89:2429-2433; Devlin 등(1990) Science 249:404-406; Cwirla 등 (1990) PNAS 87:6378-6382; 또한 미국 특허 제5,223,409호, 제5,198, 346호 및 제5,096,815호). 이런 경우, 파지 라이브러리의 풍부화를 위한 표적 물질은 박테리아 세포벽 분획물일 수 있으며, 표준 단백질분해효소 억제제의 존재하에 냉각 상태에서 표적 유기체를 음파처리하고, 세포질로부터 세포벽을 분리하기 위해 저속 원심분리시키며, 파지 라이브러리 결합 선택의 몇 단계에서 사용하기 위한 완충액에서 벽 물질을 재현탁시켜 분리할 수 있다. 공정은 미국 특허 제5,223,409호에 상세히 기재되어 있다. 2회 내지 3회 선별후에, 출발 물질 보다 상당히 증진된 표적 세포벽에 대한 친화성 히스타틴 변이체 또는 폴리아미노산 서열을 보유하는 파지를 분리할 수 있다. 이 향상된 변이체의 서열은 표준 DNA 서열 공정에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 그 펩디드는 표준 펩티드 합성 방법에 의해 다량 제조할 수 있다. 따라서, 단편 및 유사체를 생성하고 표적 유기체에 대해 증진된 친화성을 테스트하기 위해 본 명세서에 기재된 공정은 당해 기술 분야에 공지되어 있다.

표적 유기체

본 발명의 조성물 및 방법에 의해 표적화되는 유기체는 예를 들어, 사람 및 동물내에서, 정화되어지는 물질상에서 또는 농작물상에서와 같이 임의의 광접근가능한 표면상에서 또는 광접근가능한 영역에서 발견된다. 사람 및 동물의 경우에, 표피, 구강, 협공, 공동, 귀, 폐, 비뇨기관 및 위장관의 감염은 빛에 접근하기 쉽다. 표피 감염은 박테리아성, 진균성 바이러스성 및 동물에서 유래하는 바람직하지 않은 유기체를 포함하며 피하 감염은 특히, 예를 들어 원충, 기생충 또는 기생충성 진드기에 의해 유발되는 국소적 병소을 포함하며, 이들 감염은 광접근가능성이 있다. 급성 맹장염과 같은 복강 감염은 적어도 복강경을 통해 광접근가능성이 있다. 발톱의 피부사상균증과 같이 장기간의 항진균 치료 또는 항생제에 대해 내성있는 각종 피부 감염은 본 발명의 조성물을 사용하여 PDT에 적합하다.

본 발명의 조성물 및 방법을 적용하는 주된 분야는 예를 들어, 잇몸과 같은 구강 질환 및 감염이다. 본 발명의 방법은 특히 예를 들어 치주위 질환과 같은 구강 감염성 질환의 치료에 유용하다. 치주위 질환 감염의 포켓은 구강의 표면의 몇 밀리리터내에서 발생하기 때문에, PDT는 스캘링의 전통적인 물리적 방법 및 이 질환을 위한 항생제 치료에 대해 상당한 장점을 제공한다. 표적 구강성의 바람직하지 않은 유기체에는 예를 들어, B. 진지발리스(현재 포르피로모나스 진지발리스로 알려진), 에이케넬라 코로덴스, 푸소박테리아 뉴클레아튬, 월리넬라 렉타, 유박테리아 종, 프레보텔라(박테로이데스) 인터미디어, 박테로이데스포르시투스, 카프노시토파자 종, 악티노바실루스 악티노미세탐코미탄스 및 스트렙토코쿠스 뮤턴스와 같은 다수의 박테리아성 및 진균성 종이 포함된다.

폐 감염은 각종 박테리아 속 및 종과 함께 발생하며, 이에는 미코박테리아 투베르쿨로시스의 클래시컬 투베르쿨로시스, 방광 섬유종 환자 사망의 일차적 원인인 슈도모나스, 클레브시엘라가 포함되며 또한 각종 바이러스 균주와 함께 발생할 수도 있다. 각종 진균 및 기생충은 폐의 기회적 병원체이고 프뉴모시스티스 카리니 감염은 면역타협된 AIDS 환자의 흔한 사망 원인이다. 폐의 병원체가 고전적인 항생 치료에 대해 내성이 증가됨에 따라, 본 발명의 조성물을 갖는 PDT로 내성있는 미생물적 메카니즘에 독립적인 이런 바람직하지 않은 유기체를 제거하는 대안적인 방법을 제공한다. 추가적인 표피 감염 및 더 깊은 조직의 감염은 화상, 찰흔, 절상 및 천공 상처에 의해 발생한다.

본 발명의 조성물을 갖는 PDT는 독성 쇼크 빠르게 진행될 수 있는 총탄에 의한 상처에 의해 수반되는 그런 잠재적인 감염 부위의 살균에 유용하며, 바람지하지 않은 유기체를 제거하거나 감소시키기 위해 그 부위를 치료하는데 유용하다. 상처, 특히 화상에서 감염의 주요 원인은 그람 음성 호기성 박테리아 슈도모나스이다. 이 유기체는 상처 치유를 지연시키는 엑소톡신을 생성한다. 다중-항생제 내성 P.아에루기노사 균주는 특히, 대형 병원의 화상 관련 부서에서 중요한 문제가 되고 있다. 또한 슈도모나스는 각막의 격발성 감염을 일으킨다. 스타필로코쿠스 아우레우스와 이 콜라이는 감염된 상처에서 가장 흔한 2가지 박테리아이다.

바람직하지 않은 표적 유기체의 다른 부위는 비뇨기관, 복강 관, 내귀 및 외귀, 비강 및 위장 관을 포함한다.

또한 중피 및 내피 조직의 바람직하지 않은 표적 유기체 증식의 감염 부위는 최소한의 침투 기법에 의해 PDT로 접근하기 쉽다.

표적 유기체는 세포성 또는 바이러스성일 수 있다. 바람직하지 않은 표적 유기체일 수 있는 바이러스에는 하나 이상의 핵산 분자의 성분 및 하나 이상의 단백질 종류를 포함하는 임의의 병원체 형태가 포함되며 또한 피막화된 바이러스도 포함된다. 세포인 표적 유기체에는 하나 이상의 경계 세포막이 포함되고 에너지를 생성하고 핵산을 합성할 수 있으며, 리보좀성 단백질을 합성할 수 있다. 세포는 단세포성 또는 다세포성일 수 있으며, 상기 단세포성 유기체는 원핵 생물성 또는 진핵 생물성 유기체일 수 있다.

원핵 생물성 표적 유기체는 박테리아일 수 있으며, 이 박테리아는 그람 음성 또는 양성일 수 있거나 세포벽이 결핍된 것이다. 특이성 균주의 세포 또는 박테리아종의 세포가 균주를 흡수하는지 또는 오직 상대 균주와 함께 염색되는지 여부에 기초하여, 독특한 박테리아의 그람 균주 기재는 당업자에게 공지되어 있다. 본 발명의 표적 유기체인 박테리아는 호기성, 혐기성, 통성혐기성 또는 미호기성일 수 있다. 본 발명의 스피로헤테스에는 보렐리아 및 트레포네마 속이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 이 마지막 속에는 참호성 구강염, 백반성 피부병, 편주 질환과 관련된 여러 종류가 포함되며, 백반성 피부병과 편주 질환은 열대성 피부 감염이다. 표적 유기체로서 적당한 그람 음성 나선형/진동형 운동성 박테리아 속에는 캄필로박터와 헬리코박터가 포함된다. 그람 음성 호기성 및 미호기성 간균과 구균에는 보르데텔라, 네이세리아, 및 레지오넬라 속이 포함된다. 통성 혐기성 그람 음성 간균에는 슈도모나스, 살모넬라, 시젤라, 에르위니아, 엔테로박터, 에스케리키아, 비브리오, 헤모필루스, 악티노바실루스 클레브시엘라 및 살모넬라가 포함된다. 본 발명의 표적 유기체로서 중요한 박테리아 군은 그람 양성 구균으로, 스타필로코쿠스와 스트렙토코쿠스, 소아 피부 질환 농가진을 포함하는 여러 감염의 원인으로 알려진 스트렙토코쿠스의 균주와 일반적으로 "살을 먹는 박테리아"로 불리는 스타필로코쿠스의 몇몇 균주를 들 수 있다. 그람 양성 간균에는 본 발명의 방법 및 조성물에 의한 치료에 적합한 리스테리아 종이 포함된다.

고정된 세포벽이 결핍된 것 중 감광제 조성물 치료에 적합한 박테리아로는 미코플라스마 속이 있다. 악티노미세테 군에는 본 발명의 표적 유기체로 적합한 미코박테리아의 몇몇 종이 포함된다. 본 발명의 결합체 분자로 처리될 수 있는 추가적인 박테리아 속에는 엔테로코쿠스, 렙토스피라, 세르풀리나, 미코플라스마, 박테리오데스, 예르시니아, 클라미디아, 비브리오, 악티노바실러스, 포르피로모나스, 헤모필루스, 파스테우렐라, 펩토스트렙토코쿠스, 프로피오니박테리아, 코리네박테리아 및 더마토필루스가 포함된다. 당업자는 이것들과 본 명세서에서 열거되지 않은 기타 박테리아 군도 본 발명의 조성물에 적합한 표적 박테리아로서 인식할 수 있을 것이다.

본 발명의 조성물에 의해 표적화될 수 있는 바이러스에는 아데노바이러스, 헤르페스바이러스, 폭스바이러스 및 레트로바이러스가 포함되나 이에 제한되지는 않는다. 대표적인 진균성 표적 유기체 속에는 크립토코쿠스, 블라스토미세스, 파라코시디오이데스, 칸디다, 아스페르길루스, 미세토마가 포함되지만 이에 제한되지는 않으며, 여러 피부진균증을 일으키는 기타 속이 포함된다.

본 발명의 진핵 생물성 유기체에는 단세포성 원충과 진균성 병원체 및 기생충이 포함되며, 이들은 생존 사이클 중에 다중세포 상태를 가질 수 있다. 피검체의 기생충 감염은 본 발명의 방법 및 조성물로 치료하기에 적합하다. 창자 및 비뇨기관을 감염시키거나 콜로니화시키는 흔한 기생충에는 아모에박, 플라겔라테스 및 네말로데스가 포함된다. 또한 트레마토데스, 세스토데스, 실리아테스, 코시디안 및 미크로스포리디아성 기생충으로 인한 감염이 이 관에서 발생할 수 있다. 레이스마니아 및 온코세르카 속의 구성원들은 피부 궤양을 일으키고, 아칸타모에바 속은 눈의 각막 상처에서 발견될 수 있다. 리이스마니아 도노바니는 열대성 궤양 피부 질환 칼라 아자르를 일으키는데, 이는 본 발명의 방법 및 조성물로 치료하기에 적합하다. 본 발명의 조성물에 의한 표적화에 적합한 창자 관에는 엔타모에바, 기아르디아, 크립토스포리디아, 및 미크로스포르디아, 핀웜 속(屬) 및 헬민트 속(屬)이 포함된다. 폐 조직은 프뉴모시스티스 카리니, 보다 드믈게는 엔타모에바, 트레마토데스 또는 세스토데스 같은 아메바를 포함할 수 있다. 비뇨기관은 트리코모나스 및 스키스토소마로 감염될 수 있으며, 본 발명의 조성물로 치료하기에 적합하다.

바이러스성, 원핵 생물성 및 진핵 생물성 표적 유기체는 병원체와 기생충에 제한되지 않으며 절지 동물과 같은 고등 생물을 포함할 수 있다. 표적 유기체는 동물성 병원체 및 기생충에 제한되지 않으며 식물성 페스트를 포함할 수 있다.

이에 열거된 것들은 적합한 표적 유기체의 주요 그룹에 대한 본 발명의 적용을 예시하기 위해 사용되지만, 열거된 종, 속, 과, 목, 강에 본 발명이 제한되는 것은 아니다.

약학적 조성물

본 발명의 화합물은 국소적 투여, 및 외귀와 같은 각종 외부 조직 또는 경구 투여 또는 폐 세척에 의한 것과 같이 외부 투여에 의해 접근하기 쉬운 조직에 투여하기 위해 제조된 결합체 분자를 포함한다. 본 명세서에서 언급된 예는 본 명세서에 열거된 본 발명의 결합체 감광제 조성물의 성질, 또는 특정 투여 경로, 및 추가적인 경로에 관해 제한하려는 의도는 없다. 본 발명의 또다른 구체예에서, 감광제 조성물을 조합형 치료법, 즉 다른 제제와 결합하여 투여할 수 있다. 예를 들어, 조합형 치료법에는 하나 이상의 감광제를 갖는 본 발명의 조성물, 하나 이상의 항생제 치료 또는 기타 통상적인 치료가 포함될 수 있다.

수용성 용매에 다소 불용성인 감광제 결합체를 리포좀에서 투여하거나 기간 방출 형태로 적용할 수 있으며, 조명기와 비조명기를 교대로 갖는 섭생법을 간헐적으로 사용하여 조명을 투여할 수 있다. 심사숙고된 다른 섭생법은 기간 방출형 제형에 적합한 저도 조명의 연속 기간이다.

본 명세서에 사용된, "약학적 허용 담체"는 생리학적으로 상용가능한 임의의 모든 용매, 분산 매질, 피복, 항박테리아성 및 항진균성 제제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 약학적 활성 물질에 대한 이런 매질 및 제제의 사용은 당해 기술 분야에 잘 공지되어 있다. 바람직하게도, 상기 담체는 경구, 정맥내, 근내, 피하적, 비경구적, 척수 또는 상피 투여(예를 들어, 주사 또는 주입에 의해)에 적합하다. 투여 경로에 따라, 산 및 상기 화합물을 불활성화시킬 수 있는 기타 자연 조건으로부터 활성 화합물을 보호하기 위해 물질내에서 화합물을 피복할 수 있다.

또한 본 발명의 결합체를 비경구적으로 투여할 수 있다. 본 명세서에 사용된 " 비경구적 투여"라는 용어는 통상 주사를 사용하여, 경구 및 국소 투여이외의 투여 방식을 의미하는 것으로, 정맥내, 근내, 동맥내, 초내, 피막내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 경기관, 피하 , 표피하, 피막하, 지주막하, 척수내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입이 포함되나 이에 제한되지는 않는다.

당해 기술 분야에 공지된 여러 방법으로 본 발명의 조성물을 투여할 수 있다. 당업자에게 이해될 수 있는 바와 같이, 투여 경로 및/또는 방식은 목적하는 결과에 따라 달라질 수 있다. 조절 방출 제제와 같이, 빠른 방출에 대해 상기 화합물을 보호할 수 있는 담체와 함께 활성 화합물을 제조할 수 있으며, 이에는 이식물, 경피성 패치 및 미세캡슐화된 전달 시스템이 포함된다. 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리안하이드라이드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산과 같은 생분해성, 생화합성 중합체를 사용할 수 있다. 이런 제형의 많은 제조 방법이 특허되어 있거나 당업자에게 일반적으로 공지되어 있다. 예를 들어, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978 을 참조 하라.

최적의 원하는 반응(예를 들어, 치료 반응)을 제공하기 위해 투여량 섭생을 조절한다. 예를 들어, 단일 환괴를 투여할 수도 있고, 기간에 걸쳐 몇개로 분할된 투여량으로 투여하거나 치료 상황의 위급성에 따라 투여량을 비율대로 감소시키거나 증가시킬 수도 있다.

당업자는 필요한 약학 조성물의 효과적인 양을 결정하고 규정할 수 있다. 예를 들어, 공지된 또는 신규한 감광제 조성물의 투여량을 원하는 치료 효과를 수행하기 위해 필요한 것보다 낮은 레벨로 시작하여 원하는 효과가 얻어질 때까지 투여량을 점차 증가시킬 수 있었다.

다른 구체예

의학적 기구 및 치과 기구, 열감성 필터, 투시기의 표면, 음파장치 프로브 및 광접근가능성이 있고 바람직하지 않은 유기체를 운반하는 임의의 기타 표면과 같은 정제된 무유기체에 본 발명의 조성물을 사용할 수 있다. 이들 장치 중 다수가 오토클레이브될 수 없으므로, 이 경우 본 발명의 조성물 및 방법이 정제에 유용할 수 있다.

본 발명의 방법 및 조성물을 주쇄와 결합되거나 결합되지 않은 하나 이상의 감광제, 하나 이상의 표적 부위, 결합제 또는 교차결합제, 완충액 및 사용을 위한 도구들을 포함하는 키트 내로 혼입시킬 수 있다. 키트의 사용자는 선택된 특정 바람직하지 않은 유기체에 적용시키기 위해 적절한 표적 부위를 선택할 수 있다. 2이상의 표적 부위가 감광제 주쇄에 결합될 수 있으므로, 광범위한 원하지 않는 유기체를 단일 생성물을 적용시켜 제거하거나 실질적으로 감소시킬 수 있다.

본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 예시되며, 이는 또다른 제한으로 해석되어서는 안된다. 본 명세서를 통해 인용된 모든 참고자료, 계류중인 특허 출원, 특허의 내용은 표현상 참고로서 인용된다.

실시예 1. 변화하는 전하를 갖는 폴리리신-클로린 e6 결합체의 제조

무수 디메틸설폭사이드(DMSO)중에서 디시클로헥실카르보디이미드 1.5 당량 및 N-히드록시 숙신이미드(NHS) 1.5 당량을 도 1의 분자 I인 클로린 e6 1 당량 또는 다른 감광제와 반응시켜 도 1의 분자 II인 NHS-에스테르를 형성함으로써, 감광제인 클로린 e6의 N-히드록시 숙신이미드(NHS)를 제조하였다. 감광제인 클로린 e6를 사용하여 실시예들에서 사용하기 위해 제조한 재료들에 대해 설명한 절차는 벤조포르피린 유도체 또는 임의의 카르복실 보유 테트라피롤 감광제의 에스테르의 제조에 대해서도 적합하다. 실온하에 암실에서 24 시간 동안 항온처리한 후, NHS 에스테르를 추가 사용을 위해 나누어서 동결시켰다. L 또는 D의 광학적 형태를 가지며 일정 범위의 분자량(분자량 40,000 내지 60,000, 폴리-리신 유리 염기 22,000 내지 33,000에 해당함)을 갖는 폴리-리신(도 2의 분자 III) 히드로브로마이드 (HBr, 50 ㎎)를 50 ㎖의 무수 DMSO에 용해시키고, N-에틸모르폴린(1 ㎖)를 첨가하였다. 이 용액에 감광제-NHS 에스테르(25 ㎎)를 함유하는 무수 DMSO(1 ㎖)를 첨가하였다. 이 용액을 실온하에 암실에서 24 시간 동안 항온처리하여 도 2 및 또한 도 3에 도시한 분자 III인 폴리리신 클로린 e6를 합성하였다.

전하의 변환은 다음과 같이 수행하였다.

폴리리신상의 양전하를 중화하기 위해 분자를 아실화제인 아세트산 무수물과 반응시켰다. 폴리리신 클로린 e6 결합체(도 4의 분자 III)의 시료를 과량의 아세트산 무수물(무수 DMSO 0.5 ㎖중에 용해된 100 ㎎)로 처리하여 무전하의 중성 아세트산 아미드 결합체를 생성시켰다. 생선되는 분자는 전하를 띠지 않았다. 다른 전하를 갖는 분자를 생성시키기 위해 상기 조건을 변화시킬 수 있다. 따라서, 다양한 가능성을 만들고 시험할 수 있으며, 특정 결합체 또는 표적 유기체에 이용하기에 최선인 것을 선택할 수 있다.

폴리리신상의 양전하를 음전하로 전환시키기 위해, 분자를 아실화제인 숙신산 무수물과 반응시켰다. DMSO중의 폴리리신 클로린 e6 시료를 과량의 숙신산 무수물(무수 DMSO 0.5 ㎖중에 용해된 100 ㎎)로 처리하여 숙신산 아미드를 생성시키고, 양전하를 갖는 아미노기를 음전하를 갖는 카르복실산기로 전환시켰다. 생성된 분자는 모든 리신이 음전하로 전환된 것이었다. 다른 전하를 갖는 분자를 생성시키기 위해서는 상기 조건을 변화시킬 수 있다. 따라서, 다양한 가능성을 만들고 시험할 수 있으며, 특정 결합체 또는 표적 유기체에 이용하기에 최선인 것을 선택할 수 있다.

실온하에 암실에서 24 시간 동안 접합된 분자 및 아실화되고 전하가 변화된 결합체를 항온처리한 후, 용액을 정확한 분자량 한계를 갖는 투석 튜브로 옮겨 DMSO에 내성이 있는 투석 재료를 사용하여 폴리리신을 투석하고, 10 mM 인산 완충액(pH 7)을 3회 변화시켜 24 시간 동안 투석하였다. 도 4는 분자 V를 나타내는데, 여기서는 클로린 e6 폴리리신 아세트산 아미드 중성 결합체의 경우 R기가 COCH₃이고, 클로린 e6 폴리리신 숙신산 아미드의 경우에는 R기가 -COCH₂CH₂COOH이다.

실시예 2. 변화하는 전하를 갖는 히스타틴-클로린 e6 결합체의 제조

0.1 M Na₂CO₃완충액 2 ㎖에 히스타틴-5(10 ㎎)를 용해시키고, 실시예에서 설명한 대로 제조한 클로린 e6 N-히드록시숙신산 아미드5 ㎎을 함유하는 DMSO 0.1 ㎖와 혼합하였다. 암실에서 실온하에 24 시간 동안 항온처리하여 반응을 더 계속하고, 그 용액을 PBS 10 ℓ에 대해 3회 투석하였다. 생성된 녹색 침전물을 0.1 M Na₂CO₃완충액(pH 10.5) 2 ㎖에 용해시켰다.

흡수 스펙트럼 측정에 의하면, 클로린 e6의 400 ㎚에서의 소광 계수가 결합체 형성에 의해 변화되지 않고, 즉 1.5 ×10⁵M^-1㎝^-1이고, 투석후 잔존하는 클로린 e6은 모두 히스타틴에 공유적으로 부착되는 것으로 가정하면, 히스타틴-5 펩티도쇄 하나당 4개의 클로린 e6 분자가 부착되는 것으로 측정되었다. 히스타틴-5는 염기성이지만, 결합체는 산성으로 확인되었는데, 그 이유는 리신 아미노기가 클로린상의 두 개의 카르복실기로 대체되었기 때문이다. 그 구조를 도 3에 나타낸다.

히스타틴 대 클로린 e6의 비는 반응에서의 두 화학종의 비를 변화시킴으로써 다양하게 할 수 있다.

실시예 3. 변화하는 전하를 갖는 히스타틴-폴리리신-클로린 e6 결합체의 제조.

실시예 1에서 언급한 폴리리신-클로린 e6의 DMSO 용액을 DMSO중의 N-숙신이미딜-3-[2-피리딜디티오프로피오네이트](SPDP) 용액으로 처리하여 도 5의 분자 VI인 폴리리신 클로린 e6-SPDP를 형성하였다. 생성량은 폴리리신의 분자량에 따라 달라지나, 중합체 쇄 하나당 약 3 내지 4 당량이어야 한다. 반응물은 실온하에 암실에서 24 시간 동안 항온처리하였다. 폴리리신-감광제-SPDP 용액을 상기와 같이 투석하였다.

히스타틴(또는 하나 이상의 리신 잔기를 보유하는 기타 폴리펩티드, 5 ㎎)을 2 ㎖의 인산염 완충액(1 mM EDTA를 함유하는 SATA, 50 mM, pH 7.5)에 용해시키고, 도 6의 반응 6에 나타낸 바와 같이 실온에서 1 시간 동안 N-숙신이미딜-S-티오아세테이트(DMSO중에 용해된 0.5 ㎎, 100 ㎕)로 처리하여 도 6의 분자 IX인 SATA-히스타틴을 생성시켰다. 그 후, 이 펩티드 용액을 히드록실아민 염산염 0.5 mM, EDTA 25 mM 및 인산나트륨 50 mM(pH 7.5)을 함유하는 용액 200 ㎕로 처리하고, 실온에서 2시간 동안 항온처리하여 도 6의 분자 X인 탈보호된 SATA 유도체를 생성시켰다. 이 용액을 P4 칼럼에서 탈염시키고, 10 mM EDTA를 함유하는 인산염 완충액(50 mM, pH 7.5)으로 용출시켰다. 그 결과 유리 티올기를 보유하는 펩티드가 생성되었다.

다음, 도 5의 분자 VII로서 양성, 중성 또는 음성의 전하를 띨 수 있는 폴리리신 클로린 e6의 유리 티올기 유도체를 보유하는 펩티드를 펩티드와 폴리리신의 상대 분자량 비로 실온에서 24 시간 동안 SPDP와 반응시켰다. 그 후, 도 7에 도시한 펩티드-폴리리신-클로린 e6 결합체를 함유하는 생성물을 세파덱스 G50 칼럼상에서 정제하였다.

실시예 4. 감광제인 클로린 e6 결합체의 흡수

그람 음성 박테리아로서 치태(齒笞, dental plaque)에서 가장 흔한 종중의 하나인 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis) 381을 헤민 1%, 비타민 K 1% 및 양 혈액 5%를 함유한 트립티카제 소이 아가(TSA, Tripticase Soy Agar)에서 주 단위로 계대 배양하여 유지하였다. 실험 목적상, 이 미생물은 N₂80%, CO₂10%를 함유한 소실에서 35℃에서 48 시간 동안 혐기적으로 증식시키고, 원심분리에 의해 수집하고, 헤민 1% 및 비타민 K 1%를 함유한 트립티카제 소이 브로스(TSB)에 재현탁시켰다. 세포들을 초음파 처리에 의해 분산시키고, 파스퇴르 피펫을 통한 통과를 반복하였다. 1 ㎖ 튜브를 사용하여 분광계(파장 600 ㎚, 이 파장에서 O.D. 1은 10⁸세포/㎖를 생성함)에서 세포수를 측정하여 각 실험의 경우 적합한 박테리아수를 얻었다(흡수 연구의 경우 10⁹세포/㎖이고, 방사선조사 연구의 경우는 10⁸세포/㎖임).

햄스터의 협낭 인상 세포암 세포주(HCPC-1, Hamster cheek pouch squamous cell carcinoma cell line) 세포를 사용하였다(참조문헌: Odukoya 등, JNCI 71:6, 1253-1258, 1983). 세포들을 열에 의해 불활성화된 태내 송아지 혈청(FCS, 깁코사) 10%, 페니실린 G 100 단위/㎖ 및 스트렙토마이신(미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마사) 100 ㎍/㎖로 보충한 글루코스(뉴욕주 그랜드 아일랜드 소재의 깁코사) 함량이 높은 둘베코의 변형된 이글 배지(DMEM)에서 증식시켰다. 배지를 2 내지 3일마다 교환하고, 트립신-EDTA를 사용하여 주 단위로 계대 배양하였다. 가습된 공기 95%, CO₂5% 대기에서 37℃하의 성장 배지 12 ㎖를 함유한 10 ㎝-직경의 배양 접시에서 모든 세포를 유지하였다.

다음과 같은, 폴리리신과 양전하, 음전하 및 중성인 클로린 e6(분자량 1,000 내지 3,000)의 본 발명의 감광성 결합체를 사용하였다: 폴리리신 클로린 e6(양이온성, 아실화되지 않은 것); 숙시닐화된 폴리리신 클로린 e6(음이온성, 폴리리신-클로린 e6-succ); 및 아세틸화된 폴리리신 클로린 e6(중성, 폴리리신-클로린 e6-ac). 합성 방법은 실시예 1에서 설명한 바 있다. 다른 언급이 없으면, 박테리아 및 동물 세포의 성장 및 유지에 사용된 모든 배지, 완충액, 용액 및 유리 기구는 멸균된 것이다.

P. 진지발리스의 현탁 시료(10⁹세포/㎖)는 실온하의 암실에서 1분 동안 1, 5 및 10 ㎛의 클로린 e6 당량(TSB에서의 최종 농도)의 감광제와 함께 3종류로 항온배양하였다. 세포 현탁액을 원심분리하고, 감광제 함유 상청액을 흡인하고, 박테리아를 멸균된 PBS 1 ㎖로 1회 세척하였다. 세포들을 0.1 M NaOH/1% 도데실 황산 나트륨(SDS) 1.5 ㎖에 재현탁시키고, 24 시간 이상 항온 배양하여 균질 용액을 얻었다.

각각의 세포 추출물의 형광은 형광분광계(뉴저지주 에디슨 소재의 스펙스 인더스트리즈사의 모델 플루오로맥스)로 측정하였다. 여기 파장은 400 ㎚였고, 세포 현탁액의 방출 스펙트럼은 580 내지 700 ㎚에서 기록하였다. 각 세포 추출물의 단백질 함량은 검정 곡선을 작도하기 위한 단백질 표준으로서 0.1 M NaOH/1% SDS에 용해된 소 혈청 알부민을 사용하여 변형된 로우리 방법(Markwell M.A. 등, Anal. Biochem. 87:206, 1978)에 의해 측정하였다. 결과는 세포 단백질 1 ㎎당 얻어진 클로린 e6의 몰수로 표현하였다.

지수 증식기의 HCPC-1 세포를 트립신으로 처리하고, 혈구계를 사용하여 계수하였다. 24-웰 배양판의 각 웰에 FCS 10%를 함유하는 성장 배지 1 ㎖중의 10⁵개 세포를 파종하고, 하루밤 동안 항온배양하여 세포들을 부착시키고 지수 증식을 재개시켰다. 결합체를 다음과 같이 3종으로 웰에 첨가하였다. 배지를 제거하여 FCS 10% 및 지시된 농도의 결합체를 함유하는 배지로 대체하고, 평판을 1분 동안 항온처리하였다. 접합 용액을 웰로부터 흡인하고, 세포들을 멸균된 PBS 1 ㎖로 1회 세척한 다음, 트립신-EDTA와 10분 동안 항온배양하였다. 생성된 세포 현탁액을 원심분리하고, 트립신 상청액을 흡인하고 펠렛을 0.1 M NaOH/1% SDS에 용해시켰다. 각 세포 추출물의 형광은 상기한 바와 같이 측정하였다.

농도의 함수로서의 결합체의 흡수량은 P. 진지발리스 및 HCPC-1 세포에 대해 각각 도 8 및 도 9에 도시한다(이들 도면에서 종좌표는 50의 배수로 달라짐). 클로린 e6 결합체의 흡수량은 용량에 의존하였다. P. 진지발리스 세포 및 HCPC-1 세포는 각각의 농도에서 음이온성 및 중성 결합체에 비해 양이온성 결합체를 각각 2 배 및 2 내지 4배 더 많이 축적하였다. 이들 감광제 결합체가 포유류 세포에 대한 것에 비해 고도의 선택도로 박테리아내로 축적되는 것을 관찰하였다.

실시예 5. e6 결합체의 광독성

포유류 세포를 유지하면서 박테리아를 사멸시키는 상기 결합체의 효능 및 선택도를 확립하기 위해, 3종의 결합체를 두개의 널리 사용되는 임상 감광제인 포토프린 II 및 벤조포르피린 유도체(BPD)(브리티시 콜럼비아 밴쿠버 소재의 QLT 포토세라퓨틱스 인코포레이티드사)와 비교하였다. 감광제 팽창(bulk) 고체를 1 mM의 DMSO에 용해시키고 TSB에서 희석하였다.

P. 진지발리스 세포 현탁핵(10⁸/㎖)을 각 결합체의 5 ㎛ 클로린 e6 등가물, 포토프린 II 및 BPD와 실온하의 암실에서 1분 동안 2종류로 항온배양하였다. 세포들을 원심분리하고, 멸균된 PBS로 1회 세척하고, 새로운 TSB 1 ㎖를 첨가하였다. 본 실시예에서, P. 진지발리스 및 HCPC-1 세포의 세포 단백질 1 ㎎당 클로린 e6 흡수량의 비는 양이온성, 음이온성 및 중성 결합체의 경우에 각각 46:1, 60:1 및 22:1이었다.

박테리아 현탁액을 12-웰 평판에 첨가하고, 이들 감광제 조성물의 최대 흡수율을 나타내는 범위의 파장 630 내지 710 ㎚에서 광을 방출하는 광방출 다이오드 어레이를 사용하여 실온하의 암실에서 광을 조사하였다. 복사조도 65 mW/㎠에서 플루언스 0 내지 25 J/㎠를 사용하여 웰을 아래로부터 노출시켰다. 조명중에는 평판들을 덮어서 배양물의 멸균성을 유지하였다. 적합한 웰의 조명후에, 각 웰의 내용물의 연속 희석물을 TSB중에 제조하고, 100 ㎕의 2개 분취물을 혈액 아가 평판 표면상에 도말하였다. 평판상의 콜로니수를 계수하여, 조사 시간과 동일한 시간 동안 실온하의 암실에 감광제와 항온처리한 비조사된 대조군에서 얻은 콜로니수를 나누어 각 웰에서의 생존 분율을 계산하였다. 다른 대조군은 감광제 및 광으로 처리하지 않고 암실에서 실온하에 항온배양한 박테리아 및 감광제의 멤버하에 광에 노출시킨 세포들이었다.

FCS 10%를 함유하는 성장 배지 100 ㎕의 분취물중 2 ×10⁴개의 HCPC-1 세포를 96-웰 평판에 파종하고, 70%가 응집될 때까지 24 시간 동안 배양하였다. 각 평판에서 얻은 6개의 웰을 5 μM의 각각의 감광제와 항온처리하고, 실시예 3에서 설명한 조건을 이용하여 광을 조사하였다. 조명후에, 세포들은 새로운 배지와 37℃에서 24 시간 동안 항온배양하였다. 대조군 세포들은 실시예 3에서와 동일한 조건하에 항온배양하였다. 생세포의 미토콘드리아내 탈수소효소 활성을 평가하는 방법인 MTT-미세배양 테트라졸륨 분석법(Mosmann T.J. Immunol. Methods 65, 55-63, 1983)을 사용하여 광 조사 24 시간후에 세포 생존율을 측정하고, 생존 분율은 처리된 세포의 570 ㎚ 흡광도를 비조사된 대조군의 흡광도로 나누어서 계산하였다.

도 10 및 도 11은 결합체가 포유류 세포에 비해 P. 진지발리스에 대해 높은 선택도로 광독성임을 나타내고 있다. 양이온성 결합체인 폴리리신-클로린 e6는 박테리아의 99.9%와 HCPC-1 세포의 2% 미만을 사멸시켰다. 중성 결합체인 폴리리신-클로린 e6-ac은 박테리아의 90% 이상을 사멸시키고, HCPC-1 세포는 사멸시키지 않은 것으로서 그 결합체의 높은 선택도도 나타나 있다. 음이온성 결합체인 폴리리신-클로린 e6-succ는 P. 진지발리스의 생존율의 66%의 감소를 초래하였고, HCPC-1 세포들은 이 감광제에 의해 사멸되지 않았다.

대조적으로, PFII 및 BPD는 HCPC-1 세포를 사멸시키고 P. 진지발리스는 사멸시키지 않은 BPD를 제외하고는 지시된 농도에서 사멸을 나타내지 못했다.

실시예 6. 동물 상처 모델에서의 생체내 연구

감염된 창상은 외과용 메스를 사용하여 마우스의 등 피부상에 3 ㎝의 절개부를 만드는 것으로써 발생시켰는데, 이후, 절개부에 박테리아종을 10⁷내지 10⁸c.f.u.로 접종하였다. 감염된 열상(burn)은 문헌[Stevens, E.J. 등, J. Burn. Care Rehabil. 15, 232-235, 1994]에 기재된 바와 같이 발생시켰다. 박테리아종 또는 비접합된 클로린 e6중 어느 하나에 대해 형성되는 결합체를 병소 주위부로 또는 정맥내로 주사하였다. 결합체의 용량, 광 및 주사와 조명 사이의 간격을 조직적으로 변화시켰다. 치료에 대한 반응은 창상 및 열상의 치료 속도를 관찰함으로써 평가하였다. 조직 시료(2 ㎜의 펀치 생검물)를 치료후 간격을 두고 취하여 박테리아의 양을 측정하고, 조직병리학적 평가용 슬라이드를 제공하였다. 창상내 박테리아 콜로니화는 c.f.u./조직 g을 확립하고, 루시퍼라제에 의해 형질감염된 피. 에어루지노사 박테리아 균주를 광학적으로 점검하여 정량적으로 측정하였다.

기타 실시 양태

물리적인 매개변수값, 예컨대, 아미노산 잔기의 분자량 또는 갯수가 제시되는 경우에, 그 값은 그 값을 나타내는 모든 또는 거의 모든 분자의 군집, 즉 그 값이 군집에 대한 그 매개변수에 대한 평균 또는 형식값을 나타내는 분자의 군집을 설명할 수 있다. 물리적인 매개변수의 상세한 특징, 예컨대, 잔기수 또는 분자량에 의한 펩티드 또는 단백질 중합체의 크기는 잔기수 또는 분자량에서의 일정 정도의 이질성의 가능성, 예컨대, 그러한 중합체의 화학적 합성 공정에서 발생하는 이질성 및 추가 사용하기 전에 정제 공정에 의해 감소시킬 수 있으나 일반적으로 완전히는 제거할 수 없는 이질성의 가능성을 포함할 수 있다. 따라서, 예컨대, 10개의 리신 잔기를 포함하는 것으로 나타난 폴리리신의 제제는 이 길이의 분자 80%, 90%, 95%, 99% 또는 99.9%와, 예컨대, 9개 또는 8개 잔기, 보다 드물게는 11개 또는 12 잔기를 갖는 나머지 분자 20%, 10%, 5%, 1% 또는 0.1%로 구성될 수 있다.

본원에 기재한 결합체는 상기 논의한 하나 이상의 부를 혼합 군집으로 대체함으로써 합성할 수 있다. 예컨대, 단일 감광제 부분의 순수 제제를 주쇄 또는 표적화 부분 기질의 혼합물을 함유하는 반응 혼합물에 첨가하여 표적화 부분의 혼합물에 또는 주쇄 또는 표적화 부분 화학적 실체의 혼합물에 접합된 단일 유형의 감광제 부분을 포함하는 결합체를 생성시킬 수 있다.

본원에 기재한 결합체와 관련하여 혼합물은 사용하기 전에 결합체의 제제내에 포함될 수 있다. 예컨대, 바람직하지 않은 유기체의 혼합물에 이용할 목적의 제제는 2종 이상의 결합체의 혼합물, 즉 각각의 결합체가 하나 이상의 바람직하지 않은 유기체에 대해 최적의 친화도를 가짐으로써 다수의 표적 유기체가 감소되거나 또는 제거될 수 있는 결합체의 혼합물로서 제조할 수 있다.

본 발명은 또한 단편, 바람직하게는 생물학적 활성 단편 또는 히스타틴의 유사체, 예컨대, 히스타틴-5를 포함한다. 생물학적 활성 단편 또는 유사체는 히스타틴 서열의 특징인 임의의 생체내 또는 시험관내 활성을 갖는 것이다. 특히 바람직한 단편은 예컨대, 신규 합성, 단백질 분해에 의한 분할 또는 또 다른 스플라이싱 (splicing) 현상에 의해 생성될 수 있는 활성 단편이다. 히스타틴 같은 펩티드는 종종 일정 범위의 생리학적 성질을 나타내고, 그러한 성질은 분자의 다른 부분에 영향을 끼칠 수 있기 때문에, 유용한 히스타틴 단편 또는 히스타틴 유사체는 히스타틴 활성에 대한 임의의 생물학적 분석에서 생물학적 활성을 나타내는 것이다. 상기 단편 또는 유사체는 임의의 생체내 또는 시험관내 히스타틴 분석에서 전길이의 자연 발생적 히스타틴의 활성의 20% 이상을 갖는 것이 가장 바람직한 것이다.

유사체는 아미노산 서열에 있어서 또는 서열과 관련되지 않는 방식에 있어서 또는 그 둘다에서 자연 발생적 히스타틴과는 상이할 수 있다. 비-서열 변형에는 히스타틴의 생체내 또는 시험관내 화학적 유도 반응이 포함된다. 비-서열 변형으로는 아세틸화, 메틸화, 인산화, 카르복실화 또는 글리코실화에서의 변화가 있다.

바람직한 유사체로는 1, 2, 3, 4 또는 5개 이상의 보존적 아미노산 치환 및/또는 히스타틴의 생물학적 활성을 제거하지는 않는 1, 2, 3, 4 또는 5개 이상의 비보존적 아미노산 치환, 결실 또는 삽입에 의해 야생형 서열과는 상이한 서열을 갖는 히스타틴(또는 그 생물학적 활성 단편)이 있다. 보존적 치환으로는 통상 하나의 아미노산을 유사한 특성을 갖는 다른 아미노산으로 치환하는 것, 예컨대, 다음과 같은 범위내의 치환이 있다: 발린, 글리신; 글리신, 알라닌; 발린, 이소루이신, 루이신; 아스파라긴산, 글루탐산; 아스파라긴, 글루타민; 세린, 트레오닌; 리신, 아르기닌; 및 페닐알라닌, 티로신. 다른 보존적 치환은 아래 표로부터 얻을 수 있다.

본 발명의 범위내의 다른 유사체는 펩티드 안정성을 증가시키는 변형을 가진 것들이 있는데, 이러한 유사체는 예컨대, 펩티드 서열에 하나 이상의 비펩티드 결합(펩티드 결합을 대체하는)을 포함할 수 있다. 상기 유사체에는 자연 발생적 L-아미노산, 예컨대, D-아미노산 또는 비자연 발생적 또는 합성 아미노산, 예컨대, β또는 γ아미노산을 포함하는 유사체 및 고리형 유사체도 포함된다.

본원에서 사용한 "단편"이란 히스타틴 유사체에 적용할 경우 통상 생물학적 활성, 예컨대, 전길이의 분자의 결합 활성의 20% 이상을 부여하기에 충분한 길이를 가진 것을 의미한다. 바람직한 실시 양태에서, 단편은 12개 잔기 또는 그 이상의 길이를 갖는다. 히스타틴의 단편은 본원에 기재한 방법 및 당업자에게 알려진 방법으로 생성시킬 수 있다. 후보 단편이 히스타틴의 생물학적 활성을 나타내는 능력은 당업자에게 알려진 방법 및 본원에 기재한 방법으로 평가할 수 있다.

히스타틴 폴리펩티드를 얻기 위해서는, 종래 기술의 방법을 사용하여 히스타틴을 암호화하는 DNA를 발현 벡터내로 도입시키고, 이 벡터를 목적 단백질의 발현에 적합한 세포내로 도입시키고, 펩티드를 회수 및 정제할 수 있다. 히스타틴 펩티드는 보다 큰 단백질에의 융합체로서 생체내에서 생성되고, 세포 추출물로부터 초기 정제후에 단편으로 분할되는 것이 바람직하다. 히스타틴 펩티드는 예컨대, 펩티드 합성기 상에서 화학적으로 합성하는 것이 바람직하다.

보존적 아미노산 복제물

아미노산	코드	하기 중 하나로 대체
알라닌	A	D-Ala, Gly, beta-Ala
아르기닌	R	D-Ala, Lys, D-Lys, homo-Arg, D-homo-Arg, Met, Ile, D-Met, D-Ilc, Orn, D-Orn
아스파라긴	N	D-Asn, Asp, D-Asp, Glu, D-Glu, Gln, D-Gln
아스파르트산	D	D-Asp, D-Asn, Asn, Glu, D-Glu, Gln, D-Gln
시스테인	C	모체에 없으므로 사용하기에 바람직하지 않다.
글루타민	Q	D-Gln, Asn, D-Asn, Glu, D-Glu, Asp, D-Asp
글루탐산	E	D-Glu, D-Asp, Asp, Asn, D-Asn, Gln, D-Gln
글리신	G	Ala, D-Ala, Pro, D-Pro, β-Ala Acp
이소류신	I	D-Ile, Val, D-Val, Leu, D-Leu
류신	L	D-Leu, Val, D-Val, Leu, D-Leu
리신	K	D-Lys, Arg, D-Arg, homo-Arg, D-homo-Arg, Ile, D-Ile, Orn, D-Orn
메티오닌	M	모체에 없으므로 사용하기에 바람직하지 않다.
페닐알라닌	F	D-Phe, Tyr, D-Thr, L-Dopa, His, D-His, Trp, D-Trp, 트랜스-3,4, 또는 5-페닐프롤린, 시스-3,4 또는 5-페닐프롤린
프롤린	P	D-Pro,L-1-티오아졸리딘-4-카르복실산, D- 또는 L-1-옥사졸리딘-4-카르복실산
세린	S	D-Ser, Thr,D-Thr, allo-Thr, 포스포세르
트레오닌	T	D-Thr, Ser, D-Ser, 포스포세르, allo-Thr, Val, D-Val
티로신	Y	D-Thy, Phe, D-Phe, L-Dopa, His, D-His
발린	V	D-Val, Leu, D-Leu, Ile, D-Ile

바람직한 히스타틴-1 유사체에서 R은 다음과 같다:

R1은 asp이거나 또는 삭제된다.

R2는 ser 또는 포스포세린이거나 또는 삭제된다.

R3는 his이거나 또는 삭제된다.

R4는 ala이거나 또는 삭제된다.

R5는 lys 또는 arg 또는 glu 또는 asp이다.

R6은 arg 또는 lys이다.

R7은 his이다.

R8은 his이다.

R9는 gly 또는 ala이다.

R10은 tyr 또는 phe이다.

R11은 lys 또는 arg이다.

R12는 arg 또는 lys이다.

R13은 lys 또는 arg이다.

R14는 phe 또는 tyr이다.

R15는 his이다.

R16은 glu 또는 asp이다.

R17은 lys 또는 arg이다.

R18은 his이다.

R19는 his이다.

R20은 ser 또는 thr 또는 포스포세르이다.

R21은 his이거나 또는 삭제된다.

R22는 arg 또는 lys이거나 또는 삭제된다.

R23은 gly 또는 glu 또는 asp이거나 또는 삭제된다.

R24는 tyr 또는 phe이거나 또는 삭제된다.

R25는 pro 또는 arg 또는 lys이거나 또는 삭제된다.

R26은 phe 또는 tyr 또는 leu 또는 ile이거나 또는 삭제된다.

R27은 phe 또는 tyr 또는 leu 또는 ile 또는 thr 또는 ser이거나 또는 삭제된다.

R28은 gly 또는 ala이거나 또는 삭제된다.

R29는 asp 또는 glu이거나 또는 삭제된다.

R30은 phe 또는 tyr 또는 leu 또는 ile이거나 또는 삭제된다.

R31은 gly 또는 ala이거나 삭제된다.

R32는 삭제되거나 ser 또는 thr 또는 포스포세르이다.

R33은 삭제되거나 또는 asn 또는 gln이다.

R34는 삭제되거나 또는 tyr 또는 phe이다.

R35는 삭제되거나 또는 leu 또는 ile 또는 tyr 또는 phe이다.

R36은 tyr 또는 phe 또는 leu 또는 ile 또는 삭제된다.

R37은 삭제되거나 또는 asp 또는 glu이다.

R38은 삭제되거나 또는 asn 또는 gln이다.

바람직한 히스타틴-3 유사체에서 R은 다음과 같다:

R1은 asp이거나 또는 삭제된다.

R2는 ser 또는 포스포세린이거나 또는 삭제된다.

R3는 his이거나 또는 삭제된다.

R4는 ala이거나 또는 삭제된다.

R5는 lys 또는 arg 또는 glu 또는 asp이다.

R6은 asp 또는 lys이다.

R7은 his이다.

R8은 his이다.

R9는 gly 또는 ala이다.

R10은 tyr 또는 phe이다.

R11은 lys 또는 arg이다.

R12는 arg 또는 lys이다.

R13은 lys 또는 arg이다.

R14는 phe 또는 tyr이다.

R15는 his이다.

R16은 glu 또는 asp이다.

R17은 lys 또는 arg이다.

R18은 his이다.

R19는 his이다.

R20은 ser 또는 thr 또는 포스포세르이다.

R21은 his이거나 또는 삭제된다.

R22는 arg 또는 lys이거나 또는 삭제된다.

R23은 gly 또는 glu 또는 asp이거나 또는 삭제된다.

R24는 tyr 또는 phe이거나 또는 삭제된다.

R25는 arg 또는 lys이거나 또는 삭제된다.

R26은 삭제되거나 또는 ser 또는 thr 또는 포스포세르이다.

R27은 삭제되거나 또는 asn 또는 gln이다.

R28은 삭제되거나 또는 tyr 또는 phe이다.

R29는 삭제되거나 또는 leu 또는 ile 또는 tyr 또는 phe이다.

R30은 tyr 또는 phe 또는 leu 또는 ile이거나 또는 삭제된다.

R31은 삭제되거나 또는 asp 또는 glu이다.

R32는 삭제되거나 또는 asn 또는 gln이다.

바람직한 히스타틴-5 유사체에서 R은 다음과 같다:

R1은 asp이거나 또는 삭제된다.

R2는 ser 또는 포스포세린이거나 또는 삭제된다.

R3는 his이거나 또는 삭제된다.

R4는 ala이거나 또는 삭제된다.

R5는 lys 또는 arg 또는 glu 또는 asp이다.

R6은 asp 또는 lys이다.

R7은 his이다.

R8은 his이다.

R9는 gly 또는 ala이다.

R10은 tyr 또는 phe이다.

R11은 lys 또는 arg이다.

R12는 arg 또는 lys이다.

R13은 lys 또는 arg이다.

R14는 phe 또는 tyr이다.

R15는 his이다.

R16은 glu 또는 asp이다.

R17은 lys 또는 arg이다.

R18은 his이다.

R19는 his이다.

R20은 ser 또는 thr 또는 포스포세르이다.

R21은 his이거나 또는 삭제된다.

R22는 arg 또는 lys이거나 또는 삭제된다.

R23은 gly 또는 glu 또는 asp이거나 또는 삭제된다.

R24는 tyr 또는 phe이거나 또는 삭제된다.

바람직한 구체예에서 표적부에는 히스타틴, 또는 활성 단편 또는 예를 들어, 히스타틴-1 내지 히스타틴-8, 바람직하게는 히스타틴-1, 히스타틴-3 또는 히스타틴-5과 같은 그 유사체가 포함된다. 바람직한 구체예에서 표적부에는 예를 들어, 히스타틴-5와 같은 히스타틴의 단편이 포함된다. 바람직한 구체예에서 표적부에는 히스타틴-5 잔기 13-14 또는 다른 히스타틴에서 유래한 이에 상응하는 잔기가 포함된다. 바람직한 구체예에서 표적부에는 내적 복제를 포함하기 위해 설계된 히스타틴 분자를 포함한다.

본 발명은 상세한 설명과 관련되어 기재되어 있지만, 상기 설명은 본 발명을 예시하는 것이며 본 발명의 범위를 제한하는 것이 아니고, 첨부된 청구 범위의 범위에 의해 한정되는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명의 범위내에서 다른 측면, 잇점 및 변형이 가능하다는 것은 본 발명이 속하는 분야의 당업자에게 명백할 것이다.

Claims (56)

1. 표적 유기체에 대해 친화성을 갖는 쌍을 이루지 않는 멤버 표적부와 결합된 감광제를 포함하는 결합체 분자.
2. 제1항에 있어서, 상기 표적 유기체가 박테리아성 세포인 결합체 분자.
3. 제1항에 있어서, 상기 표적부가 양이온성 펩티드를 포함하는 결합체 분자.
4. 제3항에 있어서, 상기 표적부가 폴리리신을 포함하는 결합체 분자.
5. 제1항에 있어서, 상기 표적부가 히스타틴을 포함하는 결합체 분자.
6. 제5항에 있어서, 상기 히스타틴이 히스타틴-5인 결합체 분자.
7. 제5항에 있어서, 상기 히스타틴이 히스타틴-1 또는 히스타틴-3인 결합체 분자.
8. 제1항에 있어서, 상기 표적부가 소형 항미생물성 펩티드를 포함하는 결합체 분자.
9. 제1항에 있어서, 상기 표적부가 히스타틴, 디펜신, 세크로핀, 마가이닌, 그람 양성 박테리오신 및 펩티드 항생물질로 구성된 군 중에서 선택된 폴리펩티드를 포함하는 결합체 분자.
10. 제1항에 있어서, 상기 감광제가 포르피린인 결합체.
11. 제1항에 있어서, 상기 결합체가 상기 표적부와 상기 감광제가 결합된 주쇄 분자를 추가로 포함하는 결합체.
12. 제1항의 결합체 분자 및 약학적 허용 담체를 포함하는 조성물.
13. 구강 박테리아 종에 대해 친화성을 갖는 쌍을 이루지 않는 멤버 폴리펩티드 부분을 포함하는 표적부와 결합된 감광제를 포함하는 결합체 분자.
14. 제13항에 있어서, 상기 표적부가 히스타틴을 포함하는 결합체 분자.
15. 제14항에 있어서, 상기 표적부가 히스타틴-5인 결합체 분자.
16. 제14항에 있어서, 상기 표적부가 히스타틴-1 또는 히스타틴-3인 결합체 분자.
17. 제14항에 있어서, 상기 감광제가 포르피린인 결합체.
18. 제13항에 있어서, 상기 표적부와 상기 감광제가 결합된 주쇄 분자를 추가로 포함하는 결합체.
19. 바람직하지 않은 유기체의 존재를 특징으로 하는 질병에 대해 피검체를 치료하는, 하기 단계를 포함하는 방법:

    NPM 표적부와 결합된 감광제를 함유하는 결합체를 피검체에 투여하는 단계;

    감광제에 의한 세포 독성 효과를 제공하기 위해 적절한 파장의 에너지를 피검체에 조사하는 단계;

    그에 따라, 바람직하지 않은 유기체의 존재를 특징으로하는 질병에 대해 피검체를 치료하는 단계.
20. 제19항에 있어서, 상기 바람직하지 않은 유기체가 박테리아성 세포, 진균성 생물, 원충성 세포, 프뉴모시스티스 카리니의 세포, 바이러스, 기생충 및 절지 동물로 구성된 군중에서 선택되는 방법.
21. 제19항에 있어서, 상기 조사원(照射原)이 레이저인 방법.
22. 제20항에 있어서, 상기 바람직하지 않은 유기체가 박테리아인 방법.
23. 제22항에 있어서, 상기 박테리아가 인후 및 편도선을 포함하는 구강, 공동 (sinus), 귀, 코, 복강, 표피상, 폐 또는 혈액 중에 위치하는 방법.
24. 제23항에 있어서, 상기 박테리아가 상처 부위에 위치하는 방법.
25. 제20항에 있어서, 상기 바람직하지 않은 유기체가 프뉴모시스티스 카리니인 방법.
26. 제20항에 있어서, 상기 질환 뿐만 아니라. 상기 피검체가 후천성 면역 질환을 앓는 방법.
27. 제20항에 있어서, 상기 질환이 치주위 질환인 방법.
28. 바람직하지 않은 유기체의 존재를 특징으로 하는 구강 질환에 대해, 피검체를 치료하는, 하기 단계를 포함하는 방법:

    쌍을 이루지 않는 멤버 표적부와 결합된 감광제를 함유하는 결합체를 피검체에 투여하는 단계;

    감광제에 의한 세포 독성 효과를 제공하기 위해 적절한 파장의 에너지를 피검체에 조사하는 단계;

    이에 따라, 바람직하지 않은 유기체의 존재를 특징으로하는 질환에 대해 피검체를 치료하는 단계.
29. 제28항에 있어서, 상기 방법이 바람직하지 않은 유기체로 감염된 피검체의 부위에 상기 결합체를 국소적으로 투여하는 것을 포함하는 방법.
30. 제28항에 있어서, 상기 결합체를 치주위 조직에 투여하는 방법.
31. 제28항에 있어서, 상기 조사원(照射原)이 레이저인 방법.
32. 제28항에 있어서, 상기 바람직하지 않은 유기체가 박테리아인 방법.
33. 제32항에 있어서, 상기 바람직하지 않은 유기체가 구강 박테리아 종인 방법.
34. 제32항에 있어서, 상기 종이 포르피로모나스(박테로이데스) 진지발리스인 방법.
35. 제26항에 있어서, 상기 결합체의 표적부가 타액성 폴리펩티드를 포함하는 방법.
36. 제35항에 있어서, 상기 결합체의 표적부가 히스타틴인 방법.
37. 제28항에 있어서, 상기 결합체의 표적부가 폴리리신인 방법.
38. 제28항에 있어서, 상기 감광제가 포르피린인 방법.
39. 제28항에 있어서, 상기 결합체가 히스타틴 표적부 및 포르피린 감광제가 결합된 폴리리신 주쇄를 추가로 포함하는 방법.
40. 제28항에 있어서, 상기 질환 뿐만 아니라, 상기 피검체가 후천성 면역 질환을 앓는 방법.
41. 제28항에 있어서, 상기 질환이 치주위 질환인 방법.
42. 하기 단계를 포함하는 결합체 분자의 제조 방법:

    폴리펩티드 주쇄를 공급하는 단계;

    상기 폴리펩티드 주쇄와 감광제를 공유 결합적으로 결합시키는 단계;

    표적 유기체에 대해 친화성을 갖는 쌍을 이루지 않는 멤버 표적부와 상기 폴리펩티드 주쇄를 공유 결합적으로 결합시켜 상기 결합체 분자를 형성하는 단계.
43. 제42항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 폴리리신인 방법.
44. 제42항에 있어서, 상기 감광제가 포르피린 또는 포르피린 유도체인 방법.
45. 제44항에 있어서, 상기 포르피린이 클로린 e6 또는 클로린 유도체인 방법.
46. 제42항에 있어서, 상기 표적부가 히스타틴을 포함하는 방법.
47. 후천성 면역 질환의 원인이 되는 유기체 이외의 상기의 바람직하지 않은 유기체의 존재를 특징으로 하는 구강 질환에 대해, 후천성 면역 질환을 갖는 피검체를 치료하는, 하기 단계를 포함하는 방법:

    NPM 표적부와 결합된 감광제를 함유하는 결합체를 피검체에 투여하는 단계;

    감광제에 의한 세포 독성 효과를 제공하기 위해 적절한 파장의 에너지를 피검체에 조사하는 단계;

    이에 따라, 바람직하지 않은 유기체의 존재를 특징으로하는 질환에 대해 피검체를 치료하는 단계.
48. 제47항에 있어서, 상기 바람직하지 않은 유기체가 구강 박테리아 종인 방법.
49. 제48항에 있어서, 상기 종이 포르피로모나스(박테로이데스) 진지발리스인 방법.
50. 제47항에 있어서, 상기 결합체의 표적부가 타액성 폴리펩티드를 포함하는 방법.
51. 제50항에 있어서, 상기 결합체의 표적부가 히스타틴을 포함하는 방법.
52. 제47항에 있어서, 상기 결합체의 표적부가 폴리리신을 포함하는 방법.
53. 제47항에 있어서, 상기 감광제가 포르피린인 방법.
54. 제47항에 있어서, 상기 결합체가 히스타틴 표적부와 포르피린 감광제가 결합된 폴리리신 주쇄를 추가로 포함하는 방법.
55. 제47항에 있어서, 상기 후천성 면역 질환이 AIDS인 방법.
56. 제47항에 있어서, 상기 구강 질환이 치주위 질환인 방법.