KR20000068468A - 항전이 활성이 높고 출혈 위험이 감소되는 반합성 설파미노헤파 - Google Patents

Abstract

에스케리키아 콜리 K5 다당류를 탈아세틸화한 후 황산무수물/트리에틸 아민첨가생성물을 이용하여 약 5의 반응물/다당류비(SO₃당량/이용가능한 OH기 당량)로 0℃에서 0.25 내지 2시간 동안 황산화하여 얻을 수 있는 설파미노헤파로산설페이트는 항전이 활성이 높고 항응고 활성이 낮은 것으로 발견되었다.

Description

항전이 활성이 높고 출혈 위험이 감소되는 반합성 설파미노헤파로산설페이트 {SEMI-SYNTHETIC SULPHAMINOHEPAROSANSULPHATES HAVING HIGH ANTI-METASTATIC ACTIVITY AND REDUCED HAEMORRHAGIC RISK}

전이는 1차 암 부위로부터 암종 세포가 박리되어 혈류에서 파종되고, 혈관벽에 부착되어 혈관외 공간으로 이동하여 성장하는 것으로 이루어지는 과정이다.

상기의 현상 특히, 혈관벽에의 부착은 황산헤파란(HS) 다당류에 의해 조절되는 것으로 여겨진다. 일부의 항응고제들 가운데서 황산헤파란과 상사성을 나타내는 헤파린(HEP)이 항전이제로서 가능성이 있는 것으로 테스트되어 왔다. 참고문헌 ["Heparin and Related Polysaccharides"(D.A. Lane 등 발행)에 실린, I. Vlodavsky등: "Modulation of neovascularization and metastasis by species of heparin", Plenum Press, New York 1992, 317-327]. 상기의 약제들 가운데서 헤파린은 항전이제로서 특히 활성이 있지만, 항응고 활성이 높기 때문에 출혈의 위험이 있으므로, 감소된 항응고 활성을 가지는 헤라린과 유사한 물질을 찾는데 특히 관심이 모아지고 있다. 참고문헌[D.J.Tyrrell등: "Therapeutic uses of heparin beyond its traditional role as anticoagulant", TIPS 16, 198-204, 1995].

본 발명은 항전이제(anti-metastatic agent)로서 설파미노헤파로산설페이트 (sulphaminoheparosamsulfates)의 사용에 관한 것이다.

본 발명에 따라, 본 발명의 발명자들은 설파미노헤파로산설페이트(SAHS)류 (B. Casu 등: "Heparin-like compounds prepared by chemical modification of capsular polysaccharide from E. coli K5", Carbohydr. Res. 263, 271-284(1994) 참조)에 속하는 일부의 반합성 황산헤파린은 놀랍게도 헤파린 보다 더 낮은 정도의 생체내 항응고활성을 가짐에도 불구하고, 헤파린과 동등한 생체내 항전이 활성을 가짐을 발견하였다.

더욱 구체적으로, 본 발명의 발명자들은, 5,000 내지 40,000의 분자량을 갖으며 에스케리키아 콜리(Escherichia coli)K5 다당류를 탈아세틸화한 후 황산 무수물/트리메틸아민 첨가생성물을 이용하여 약 5의 반응물/다당류비(SO₃당량/이용가능한 OH 기 당량)로 0℃에서 0.25 내지 2시간동안 황산화하여 얻을 수 있는 SAHS(SAHS-B로 명명함)만이 대표적인 헤파린과 동등한 항전이 활성을 나타내는 반면에, 다른 실험조건에 따라 제조한 SAHS는 헤파린 또는 SAHS-B 보다 현저하게 더 낮은 항전이 활성을 가짐을 발견하였다.

또한, 본 발명의 발명자들은 5000이하의 분자량을 갖는 SAHS-B의 분획 (fraction)은 저분자량을 갖는 상응하는 헤파린보다 더 높은 상당한 항전이 활성을 유지함을 발견하였다.

따라서, 반합성 SAHS-B 헤파로산설페이트는 출혈위험이 감소되는 항전이제인 것으로 판단된다.

이를 위하여, SAHS-B는 통상의 방법 및 부형제를 사용하여 적당한 제약 조성물로 제형화될 수 있다.

이러한 조성물은, 몇몇의 인자들에 명백히 의존하긴 하지만 일반적으로 1 내지 1,000mg의 SAHS-B의 투여량으로 전이의 예방 또는 치료를 위하여 하루에 한번이상 투여될 수 있다.

SAHS는 이미 발표된 바와 같이 에스케리키아 콜리(Escherichia coli)K5 균주의 세포막 성분인 K5 다당류로부터 얻어져 왔다(B. Casu 등, 1994년, loc. cit.; PCT/EP94/01660호 참조). 특히, 이러한 K5 다당류는 하기의 도식으로 간략히 기술되는 바와 같이 선택적으로 탈아세틸화 및 N-황산화된 후 O-황산화되어, 상이한 종류의 SAHS-B, SAHS-C, SAHS-A의 SAHS가 얻어진다.

제 1 단계는 K5 다당류(K5-PS)의 히드라진 분해에 의한 N-탈아세틸화로 이루어진다. 얻어지는 생성물(헤파로산, AH)은 황산 무수물/트리메틸아민 첨가생성물 (TMA/SO₃)에 의해 N-황산화되어, 설파미노헤파로산(SAH)이 얻어진다. 화살표 근처의 번호들은 순서대로, 반응온도(℃), 반응물/다당류 비(SO₃당량/이용가능한 히드록시기 당량) 및 반응시간(hr)을 나타낸다.

SAHS, 헤파린 및 다른 기준되는 황산화된 다당류의 항전이 활성을, B16B16 흑색종 세포를 폐에 전이증식하는 방법을 사용하여 테스트하였다. 참고문헌[N. Casella등, Thromb. Haem. 73, 964(1995)]. 암종의 헤마틱 파종(haematic dissemination)에 대한 억제 활성을 갖는 약제들의 효과를 테스트하는데 특히 적합한 상기의 전이증식 방법은 쥐에게 쥐의 흑색종 세포를 정맥내 주사한 후 폐에 형성되는 암종 군체의 수를 구하는 것으로 이루어진다. B16B16 흑색종 세포를 사용하였다. 이러한 세포를 습도 조건 및 37℃로 CO₂(5%) 인큐베이터내에서 10%의 태아성 소 혈청을 갖는 DME에서 배양하였다. 이러한 세포를 일주일에 두 번 분할하여, 0.25% 트립신/0.05% EDTA로 처리하였다. 테스트하기 위한 다당류를 생리학적 용액 또는 인산염(PBS)완충액에 적당한 희석도로 용해시켜, 즉석에서 사용하였다. PBS에 희석된 B16B16 흑색종 세포(10⁵/0.1ml/쥐)를 0.2㎖/쥐의 최종 용적으로, 20g의 평균 중량을 갖는 C57B16 쥐 꼬리의 측면 정맥내로 주사하였다. 이러한 쥐들을, 암종 세포의 주사 후 12-16일 후에 죽이고, 폐를 꺼내고 Buoin용액에 고정시켜서, 황색 바탕상에 흑색 덩어리로 나타내어지는 표면상의 전이성 소결절을 계산했다. 이어서, 처리된 쥐의 폐의 소결절의 수와 무처리 쥐의 폐의 소결절의 수 사이의 비를 구했다.

각각의 실험은 최소한 5마리, 보통은 8-10마리의 쥐를 대상으로 실시하였다. 몇몇의 실험에서 발견된 전이의 억제%를 하기의 개개의 실시예 및 표 1에서 기록하였다.

실시예 1

A,B 및 C 타입의 SAHS의 제조 및 항전이 활성.

상이한 항전이 활성을 갖는 일부의 설파미노헤파로산설페이트를 제조하기 위한 표준 과정을 아래에 설명한다.

생성물을 다음문헌[Casu등, loc. cit., 1994]에서 설명된 바와 같이, 평균 분자량(겔 여과에 의함), 황산화도(전기전도도법에 따라 측정된 황산기/카르복시기몰비로 표시됨), 및 황산기의 분포(¹H¹³C NMR 분광법에 따라 측정됨)에 관하여 특성화했다. 아래에 기술한 과정은 약 100%의 N-황산화도 및 25% 이상의 6-0-황산화도를 갖는 SAHS에 적용된다. 출발 K5 다당류는 이태리 특허 출원 제 M191A000659 호에서 설명된 바와 같이 적당히 제조될 수 있다. 괄호안의 것들은 양을 나타낸다.

1a) N-탈아세틸화

K5 다당류(100mg) 및 황산히드라진(138mg)을 무수히드라진(1.38mg)에 용해시키고 밀폐관내에서 질소 분위기하에 96℃로 5시간 동안 유지시킨다. 상기 용액을 회전 증발기에서 건조시키고, 그 반응 생성물을 증류수에 용해시키고 pH를 37% HC ℓ을 이용하여 4로 조정한다. pH를 NaOH 2N을 이용하여 9로 맞추고 초산나트륨으로 포화된 4배 용적의 에탄올을 부가한다. 얻어지는 침전물을 여과하고, 증류수에 용해시켜서 그 용액을 증류수(매일 3x2 ℓ; 컷오프 14,000D)를 이용하여 3일간 투석한 다음, 동결 건조시킨다.

1b) N-황산화

상기 1a)에서와 같이 얻은 다당류(100mg)를 증류수에 녹이고, 고체 중탄산 나트륨을 부가하여 그 용액의 pH를 9로 조정하고 온도를 55℃까지 상승시킨다. 이 온도에서, 혼합물을 교반하면서 100mg의 트리메틸아민/삼산화황 첨가생성물 (TMA/SO₃)을 부가한다. 4시간 후 동등한 양의 상기 첨가생성물을 부가하고, 전체 24시간 동안 반응시킨다. N-황산화된 다당류를 상기에 설명한 바와 같이 회수한다.

1c) O-황산화

상기 1b)에서와 같이 얻은 다당류(100mg)를 증류수(20㎖)에 용해시키고, 그용액을 실온에서 Amberlite IR-120 H⁺컬럼에 통과시킨다.

이러한 컬럼을 다른 20㎖의 증류수로 씻고 용리액을 수거하여, 그 용리액을 에탄올에 용해된 10% 트리부틸아민(w/v)(3㎖)을 이용하여 pH 5.5로 조정했다. 과량의 트리부틸아민을 디에틸 에테르(40㎖)을 이용하여 제거하고 동결 건조시켰다.

이렇게 얻어진 생성물(188.2mg)을 무수 디메틸 포름아미드(33㎖)에 용해시키고, 15㎖의 무수 디메틸포름아미드에 용해된 피리딘/삼산화황 첨가생성물(Py/SO₃, 아래에 제시된 양)을 부가한 다음, 그 반응 혼합물을 아래에 제시된 온도 및 시간동안 유지시킨다.

상이한 타입의 SAHS를 얻기 위하여 상이한 반응온도, 상이한 양의 황 첨가생성물 및 상이한 반응시간을 이용하였다.

특히, A타입의 SAHS는 460mg의 피리딘/SO₃를 사용하여 0℃에서 1시간 동안 반응시킬 때 얻어졌다. 이 생성물(G 1524-3; 평균 분자량 11,700; 황산기/카르복시기 몰비 1.8)은 0.5mg/쥐의 투여량일 때 17.5%의 전이 억제에 해당하는 항전이 활성을 나타냈는데, 동일한 테스트에 있어서 비교용 헤파린은 97.5%의 억제를 나타냈고, 돼지 췌장으로부터 얻은 황산헤파린은 54.8%의 억제를 나타냈다.

B타입의 SAHS는 765mg의 황 첨가생성물을 사용하여 0℃에서 0.25-2시간(바람직하게 1시간)동안 반응시키고 그 생성물을 상기 1b)에서 설명된 바와 같이 다시 N-황산화시킬 때 얻어졌다.

대표적인 최종 생성물(G1669;평균분자량 25,700; 황산기/카르복시기 몰비 2.2)은 92.7%의 전이억제에 해당하는 항전이 활성(0.5mg/쥐의 투여량일 때)을 나타냈다.

C타입의 SAHS는 7.650mg의 황 첨가생성물을 이용하여 25℃에서 1시간 동안 반응실킬 때 얻어졌다. 이 생성물(G1524/3; 평균분자량 10,800; 황산기/카르복시기 몰비 2.8)은 8.8%의 전이 억제에 상응하는 항전이 활성(0.5mg/쥐의 투여량일 때)을 나타냈다.

실시예 2

타입B의 SAHS의 항전이 활성.

세 가지의 투여량(0.5; 0.2 및 0.1mg/쥐)일 때, 실시예 1에서 설명된 바와 같이 제조한 SAHS-B(생성물 G1669)의 항전이 활성 테스트를 반복하였다. 상기와 동일한 투여량일 때 전이의 억제는 각각 78.5%, 62.5% 및 20.5였는데, 기준되는 헤파린은 각각 95.5%, 91.3% 및 80.3%의 억제를 나타냈다.

실시예 3

타입 B의 SAHS의 항전이 활성.

0.5mg/쥐의 투여량일 때, 실시예 1에서 설명된 바와 같이 제조한 타입 B의 SAHS의 항전이 활성 테스트를 반복하였다. 그 결과, 98.5%의 전이 억제가 나타났다. 상기와 동일한 투여량일 때, 기준 헤파린은 98.5%의 억제를 나타냈고, 저 분자량을 갖는 과황산화된 헤파린은 91.0%의 억제를 나타냈다.

실시예 4

상이한 분자량을 갖는 타입 B의 SAHS 분획의 제조 및 항전이 활성.

타입 B의 SAHS(특히 실시예 1에서 설명된 바와 같이 제조한 제제 G1668)의 시료를 Sephadex 겔 크로마토그래피에 의해 분별한 후, 유사한 황산기/카르복시기비(2,2-2,3) 및 상이한 분자량을 가지는데 특징이 있는 아래와 같은 세 개의 분획을 단리했다: G1668a(평균분자량 38,200), G1668cl(22,700) 및 G1668bl(3,200). 0.5mg/쥐의 투여량일 때 상기 세 개의 분획의 항전이 활성은 97-98%로서 서로 유사한 것으로 밝혀졌는데, 이는 실시예 1에서 설명한 바와 같이 제조한 분별되지 않은 SAHS-B제제(G1783)와 유사한 것으로 확인되었다. 동일한 실험에 있어서, 기준되는헤파린은 95-97%의 억제를 나타냈다.

실시예 5

저분자량의 SAHS-B의 항전이 활성.

다른 천연 및 과황산화된 글리코사미노글리칸과의 비교.

저분자량을 갖는 G1668bl분획(실시예 4에서 설명한 바와 같이 얻어짐)의 항전이 활성은 83.6%의 전이 억제에 상응하는 것으로 확인되었다.

동일한 테스트에 있어서, 기준되는 헤파린은 92.8%의 억제를 나타냈고, 저분자량을 갖는 과황산화된 헤파린(ssLMWHS)은 46.4%의 억제를, 그리고 데르마탄 설페이트 4,6-디셀페이트(DS4,6s)는 65.32%의 억제를 나타냈다.

실시예 6

SAHS-B의 항전이 활성

SAHS-B의 제제(생성물 G1668, 특히, 실시예 1에서 설명된 바와 같이 반응시켜서 얻음)는 0.5mg/쥐의 투여량일 때 98.5%의 전이 억제에 해당하는 항전이 활성을 나타냈다. 동일한 테스트에 있어서, 기준 헤파린은 98.5%의 억제를 나타냈다.

실시예 7

저투여량일 때 저분자량 SAHS-B분획의 항전이 활성.

실시예 4에서 설명된 저분자량의 G1669cl 분획은 0.1mg/쥐의 투여량일 때, 41.0%의 전이 억제에 해당하는 항전이 활성을 나타냈다.

상기와 동일한 투여량일 때, 분별되지 않은 기준 헤파린은 91.1%의 억제를 나타냈다.

실시예 8

매우 저투여량일 때 저분자량 SAHS-B 분획의 항전이 활성.

실시예 4에서 설명된 저분자량의 G1668cl 분획은 0.02mg/쥐의 투여량일 때, 24%의 전이 억제에 해당하는 항전이 활성을 나타냈다. 상기와 동일한 투여량일 때, 기준 헤파린은 30%의 전이 억제를 나타냈다.

실시예 9

SAHS-B의 항응고활성.

쥐에 있어서 APTT 값의 연장으로 측정되는 G1668 생성물의 항응고 활성(0.5 mg/쥐의 투여량으로 정맥내 주사; 그룹당 4마리의 쥐를 대상으로 실험)은 주사후, 1시간, 2시간 및 4시간 후 각각 300이하, 44.9 및 39.9인 것으로 확인되었다.

기준 헤파린의 항응고 활성은 300이하, 300이하 및 37.6이었다. 무처리 제제의 항응고 활성값은 일반적으로 28.5이다.

본 발명은 출혈위험이 감소되는 암세포의 항전이제(anti-metastatic agent)로 효과적으로 사용될 수 있음

Claims (4)

1. 5,000 내지 40,000의 분자량을 가지며, 에스케리키아 콜리 K5 다당류를 탈아세틸화한 후 황산 무수물/트리메틸아민 첨가생성물을 이용하여 약 5의 반응물/다당류 비(SO₃당량/이용 가능한 OH기 당량)로 0℃에서 0.25 내지 2시간 동안 황산화하여 얻을 수 있는 설파미노헤파로산설페이트의 항전이제 제조에의 사용.
2. 제 1항에 있어서, 상기 설파미노헤파로산설페이트는 5,000이하의 분자량을 가지는 사용.
3. 제 1항 또는 2항에 있어서, 상기 설파미노헤파로산설페이트는 헤파린의 황산화도와 실제적으로 동등한 황산화도(약 2.2의 황산기/카르복시기 몰비)를 가지는 사용.
4. 에스케리키아 콜리 K5 다당류를 탈아세틸화한 후 황산무수물/트리에틸 아민첨가생성물을 이용하여 약 5의 반응물/다당류비(SO₃당량/이용가능한 OH기 당량)로 0℃에서 0.25 내지 2시간 동안 황산화하여 얻을 수 있는 설파미노헤파로산설페이트의, 항전이제로서의 사용.