KR20000035802A - 미세조립된 모세관 전기영동 칩상에 집적된 전기화학적 검출기 - Google Patents

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Abstract

미세조립된 모세관 전기영동 칩은 모세관내에서 분리된 분자들을 검출하기 위한 박막형 전기화학 검출기를 포함한다.

Description

미세조립된 모세관 전기영동 칩상에 집적된 전기화학적 검출기 {ELECTROCHEMICAL DETECTOR INTEGRATED ON MICROFABRICATED CAPILLARY ELECTROPHORESIS CHIPS}
관련출원
본 출원은 1996년 8월 26일자 출원된 미국 출원번호 08/703,394호의 일부 계속출원이다.
전기화학적 검출기는 액체 크로마토그래피 및 모세관 전기영동(CE)에 사용되어 왔다. 전기화학적 검출기는 매우 민감하며, 통상적으로 nL 내지 pL 범위의 통상적인 체적을 갖는 10-16내지 10-19분자의 샘플을 측정할 수 있다[에윙, 에이. 지.; 메사로스, 제이. 엠.; 개빈, 피. 에프. 등의 마이크로칼럼 분리에서의 전기화학적 검출, 66, 527A-536A, (1994); 뵈겔, 피. 디.; 발드윈 알. 피. 등의 액체 크로마토그래피 및 모세관 전기영동에 있어서 동 전극에 대한 전기화학적 검출, 아메리칸 라이보레이토리, 28(2), 39-45, (1996)]. 전기화학적 방법은 또한, DNA의 검출[시게나가, 엠. 케이.; 박, 제이. 더블유.; 쿤디, 케이. 씨.; 지메노, 씨. 제이.; 아메스, 비. 엔. 등의 비보(vivo) 산화성 DNA에 있어서 손상, 전기화학적 검출방법을 갖는 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 DNA 및 소변에서 8-하이드록시-2'-디옥시구아노신의 측정, 효소학에서의 방법, 186, 521-530, (1990) : 다께나까, 에스. ; 울토, 에이치. ; 노드 에이치.; 이하라, 티.; 다까기, 엠., 등의 전기화학적 검출법을 갖는 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 펨토몰 레벨에 있는 타겟 DNA 서열의 DNA 탐침-검출, 어낼리시스 바이오케미컬, 218, 436-443, (1994) : 존스톤, 디. 에이치.; 글라스글로우, 디. 씨.: 쏩, 에이치. 에이치., 등의 DNA와 금속 복합물 사이의 전자전달을 사용하여 뉴클리오베이스의 솔벤트 에쎄서빌러티의 전기화학적 측정, 제이. 엠. 케이칼 사이언스, 117, 8933-8938, (1995)], 단세포[올레피로빅츠, 티.엠.; 에윙, 에이. 지., 등의 2 및 5㎛ 직경 모세관에서의 모세관 전기영동법, 싸이토플라드마 분석에의 적용: 어낼리시스 케미컬, 62, 1872-1876, (1995): 피헬 케이.; 지에, 에스.; 요르겐슨, 제이. 더블유.; 화이트만, 알. 엠. 등의 고립된 매스트 셀에 있는 히스타민 및 5-하이드록시트립타민의 전기화학적 검출], 및 단일 분자[팬, 에프.-알. 에프.; 바드, 에이. 제이. 등의 단일 분자의 전기화학적 검출, 사이언스, 267, 871-874, (1995)]를 검출하는데에도 사용되어 왔다. 이러한 전기화학적 검출기의 작동은 통상적으로 사용, 상대, 및 기준 전극이라 불리는 3개의 전극을 사용하는 것을 기본으로 한다. CE 분리물을 검출하는데 사용되어온 전기화학적 검출기는 3가지 방식, 즉 온-칼럼(on-column)방식 [후앙, 엑스.; 팡, 티.-케이. 제이.; 골든, 엠. 제이.; 재러, 알. 엔., 등의 모세관 영역 전기영동을 위한 온-컬럼식 전도율 검출기, 애널리스트 케미컬, 59, 2747-2749, (1987), 여기에서는 검출기 전극이 모세관내에 놓여있다.], 엔드-칼럼 방식 [후앙, 엑스.; 재러, 알. 엔.; 슬로스, 에스.; 에윙, 에이. 지.등의 , 모세관 영역 전기영동을 위한 엔드-칼럼식 검출, 애널리스트 케미컬, 63, 189-192, (1991); 첸, 엠.-씨.; 후앙, 에이치.-제이.의 모세관 전기영동으로 엔드-칼럼식 암페로메트릭 검출을 위한 전기화학 전지, 여기에서는 전극들이 분리 모세관의 단부에 직접 놓인다.], 및 오프-칼럼 방식 [올레피로빅츠, 티. 제이.; 에윙, 에이. 제이.등의 2 및 5 ㎛ 직경 모세관내의 모세관 전기영동: 사이토플라즈마 분석에의 적용, 애널리스트 케미컬, 62, 1872-1876, (1990); 오쉐, 티.제이.; 그린하겐, 알. 디.; 룬테, 에스. 엠.; 룬테, 씨. 이.; 스미쓰, 엠. 알.; 라딕, 디. 엠.; 와따나베, 엔.등의 온-칼럼식 나피온 조인트를 사용하는 전기화학적 검출에 의한 모세관 전기영동, 제이. 크로마토그래피, 593, 305-312, (1992); 우, 디.; 레그니어, 에프. 이.; 린헤어스, 엠. 씨. 등의 모세관 전기영동내의 전기화학적 및 분광측정식 검출을 사용한 알카리 인산염의 전기영동적 간섭에 의한 미세-분석, 제이. 크로마토그래피 비. 657, 357-363, (1994), 여기에서 전극들은 접지된 다공 유리튜브에 의해 전기영동 전압과 전기적으로 절연되어 있다.]이 있다. CE 분리물의 온-칼럼식 전기화학적 검출은 모세관 튜브내에 레이저에 의해 천공된 정반대 방향의 구멍을 통해 두개의 백금 와이어를 고정시킴으로써 수행되어 왔다. 이러한 구성은 제작 및 정렬에 어려움이 있으며, 분리 칼럼의 고전압 영역내에 검출전극을 위치시키는데 어려움이 있다. 이러한 구성은 분리 칼럼에 수 ㎸의 전압을 가하는 동안에 작은 전류 또는 전압을 검출하고자 하는 것이다. 기계적 불안정성 및 전극 정렬의 불완전함은 주위환경에의 상당한 전기적 픽업 또는 변동을 초래하여 소정 신호의 검출을 매우 어렵게 한다. 전극 근처에 고 전압 및 상당한 전기영동 전류가 존재하면 표유 신호를 유발할 수 있다. 엔드-칼럼 및 오프-칼럼식 검출형태는 전기영동 전압의 영향을 최소화하기 때문에 중요하다. 엔드-칼럼식 검출형태에서는 가능한한 전기영동 채널의 단부에 검출전극을 가깝게 위치시켜 가능한한 접지전위에 가깝게 검출을 수행하는 것이 바람직하다. 그러나, 이는 통상적인 제조기술로 수행하는 것이 매우 어렵다. 전극은 모세관의 단부에 매우 정밀하게 놓여져야 한다. 전극의 위치선정에 있어서의 오차는 전극이 개구로부터 너무 멀리 떨어져 있는 경우에 해석신호의 손실을, 전극이 분리 칼럼내에 위치되는 경우에 고전압의 픽업을 유발한다. 게다가, 전극위치 또는 전극대 전극 간극의 변동은 배경신호 생성소음에 있어서의 여러 변동을 초래한다. 통상적으로, 상기 검출기의 조립에는 미세 조종기와 현미경을 사용해야 한다. 또한, 오프-칼럼방식의 접지식 다공 유리튜브와 분리 및 검출 모세관의 연결에 의해 전기절연을 실현하는 것도 조립 및 작동의 어려움이 있으며 접합도 기계적으로 불안정하여 오차를 초래할 수 있다. 일예로서, 슬래터와 와트(슬래터, 제이. 엠.; 와트, 이. 제이. 등의 모세관 전기영동 분석에 사용하기 위한 온-칩 마이크로본드 에레이 전기화학적 검출기, 1994, 119, 2303-2307)가 기판상에 전극을 사진석판술에 의해 조립했지만, 완전히 집적된 분리 및 검출 장치를 제조하지 못했으므로 검출기를 통상적인 원통형 모세관에 결합시키는것이 불완전했다.
따라서, 집적 박막 전기화학적 검출기를 구비한 미세조립된 모세관 전기영동 칩이 필요하며, 전기영동은 관련 전기영동 및 검출기 장치에 용이하게 연결될 수 있어야 한다.
본 발명은 미세조립된 모세관 전기영동 칩상에 집적된 분리 및 검출 모듈 부품으로서의 전기화학적 검출기 및 상기 전기화학적 검출기의 제조방법에 관한 것이며, 특히 미세조립된 모세관내에 정밀하게 위치될 수 있는 박막형 전기화학적 검출기의 설계에 관한 것이다.
본 발명의 전술한 목적 및 기타의 목적은 첨부도면과 관련한 다음의 상세한 설명으로 보다 분명히 이해될 수 있을 것이다.
도 1은 종래기술에 따른 미세조립된 모세관 전기영동 칩을 도시하는 도면이며,
도 2는 도 1의 2-2선에 따라 취한 단면도이며,
도 3은 본 발명을 구현한 미세조립된 모세관 전기영동 칩의 사시도이며,
도 4는 도 3의 4-4 영역의 확대도이며,
도 5는 도 4의 5-5선에 따라 취한 단면도이며,
도 6은 도 5의 6-6선에 따라 취한 단면도이며,
도 7은 도 3 및 도 4에 도시된 전기화학 전극의 다른 실시예를 도시하는 단면도이며,
도 8은 도 7의 8-8선에 따라 취한 단면도이며,
도 9는 도 7의 9-9선에 따라 취한 단면도이며,
도 10은 검출기의 다른 실시예에 따른 확대도이며,
도 11은 집적식 전기화학 검출기를 구비한 모세관 전기영동 칩상에 분리된 노르에피네프린과 에피네프린의 일렉트로페로그램이며,
도 12a 내지 도 12c는 3개의 연속적인 실험을 위한 집적식 전기화학 검출기를 구비한 모세관 전기영동 칩으로 얻은 노르에피네프린 분리물의 일렉트로페로그램이며,
도 13a 내지 도 13c는 분리 및 주입 채널에 대한 박막 접점을 포함하는 집적식 전기화학 검출기를 구비한 미세조립된 모세관 전기영동 칩의 사시도이며,
도 14는 도 13b의 14-14영역의 확대도이며,
도 15는 주입 및 분리 채널에 리드와 집적식 전기화학 검출기를 포함하는 기판의 사시도이며,
도 16은 도 15의 16-16선에 따라 취한 단면도이며,
도 17은 도 16의 화살표 방향을 따라 취한 확대도이며,
도 18은 분리채널을 따라 형성된 복수의 전기화학 검출전극을 도시하는 부분 확대도이며,
도 19는 본 발명에 따른 전기화학 분리 및 분석 시스템에 모세관 전기영동 칩을 결합시키기 위한 장치의 블록 다이어그램이며,
도 20은 본 발명의 또다른 실시예에 따른 미세조립된 모세관 전기영동 칩의 평면도이며,
도 21은 검출전극 및 기준전극를 도시하는 도 20의 21-21 구역의 확대도이며,
도 22 및 도 23은 사용전극과 기준전극 사이의 이격거리에 대한 효과를 나타내는 도면이며,
도 24는 신경전달물질의 모세관 전기영동 분리 및 검출을 도시하는 도면이며,
도 25는 간접 전기화학 검출법을 사용하는 칩내에서의 분리 및 검출을 도시하는 도면이다.
본 발명의 목적은 전술한 종래기술의 단점을 극복할 수 있는, 미세조립된 평탄 유리칩상의 모세관 전기영동을 위한 전기화학적 검출기를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 가해진 전기영동 전자기장과의 간섭효과를 최소화한, 미세전기화학적 검출기를 구비한 미세조립된 모세관 전기영동 칩을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 재현가능하고 정확하고 편리하게 위치되며 튼튼하고 민감한 검출기 전극을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 전극이 접지전위에 가깝게 위치한 모세관 단부에 정확하고 안정하게 위치됨으로써 고 전기영동 전위로부터의 픽업이 면제된 검출기 전극을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 적은 비용으로 정밀하게 제조될 수 있는 전기영동 전극과 집적박막형 전기화학 전극을 구비한 미세조립된 모세관 전기영동 칩을 제공하는 것이다.
본 발명의 전술한 목적 및 기타의 목적은 적어도 길다란 분리채널과 상기 채널과 함께 분리 모세관을 형성하도록 기판에 접착된 커버판을 갖는 기판을 포함하는 형태의 미세조립된 모세관 전기영동 칩상에 전기화학 검출기를 집적시킴으로써 달성될 수 있다. 박막형 전기화학 검출기는 채널의 한 단부 근처에 있는 채널 내측으로 연장하는 얇고 좁은 전극에 기판 또는 커버판상에 조립된다.
도 1 및 도 2는 종래기술에 따라 형성된 미세조립된 모세관 전기영동(CE) 칩을 도시한다. 모세관 채널은 사진석판술 및 화학적 에칭에 의해 부식된 유리기판(11)상에 형성된다. 이러한 공정은 울리 등의 "미세조립된 모세관 에레이 전기영동 칩을 사용한 초고속 DNA성분의 분리", Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA., 91, 11348-11352(19994)에 설명되어 있다. 적하 또는 플러그 주입에 의해 샘플을 채널내측으로 주입하기 위한 분리채널(12)과 주입채널(13)과 관련해서는 상기 문헌에 설명되어 있다. 일예로서, 모든 채널(12)은 8㎛의 깊이로 에칭되며, 분리채널은 100㎛의 폭을 가지며, 주입 채널은 50㎛의 폭을 가진다. 상기 분리채널은 길이가 46mm이며, 주입지점으로부터 전기화학 검출기까지의 거리는 39mm이다. 상기 주입채널은 길이가 22mm이며, 샘플반입 지점으로부터 주입영역까지의 거리는 12mm이다. 상부면(14)은 부식된 유리기판상에 접착되어 분리기질로 채워진 모세관을 형성한다. 상부면(14)은 분리채널의 단부 및 주입 채널의 단부에 시약 저장기를 제공하는 천공구멍(1-4)을 포함한다.
종래기술에 있어서, 미세조립된 모세관 채널내의 전기영동 DNA성분은 외부 레이저를 사용하는 크고 불편한 고비용 시스템과 광학 시스템, 광전자 증폭관 등에 의해 검출된다. 이제까지, 광학 검출시스템을 미세조립된 CE 칩상으로 이동시키는 것은 불가능했다. 이와 유사하게, 중공 실리카 모세관 내에서 수행된 종래의 모세관 전기영동 분리물의 전기화학적 검출이 다양한 외부 전극 및 검출기에 의해 수행되지만, 그러한 검출기는 단일 미세조립 기술에 의해 CE 전기영동 칩 시스템내에서 결코 이동되지 못했다.
본 발명의 일 실시예에 따라, 전기화학 검출기용 백금 전극이 상부 또는 커버판의 부식된 기판에 접착되기 전에 RF 스퍼터링 및 사진석판술에 의해 기판 또는 상부판에 조립된다. 전극은 접지전극에 가까운 곳에 있는 분리칼럼의 단부에 정확히 위치될 수 있어서, 값싼 전기화학 전극을 안전하고 용이하게 제작할 수 있게 한다. 다른 적합한 전극재료는 금, 크롬, 탄소 및 그 이외에 상당히 불활성이고 용이하게 도포되는 전도성 재료들이다.
도 3 내지 도 6을 참조하면, CE 칩이 박막 백금전극과 함께 도시되어 있다. 상기 전극은 기준전극(21), 사용전극(22), 및 박막 전도체(21a,22a,23a)에 의해 외부회로에 연결된 상대전극(23)(도시않음)을 포함한다. 상기 기판은 전극과 박막 전도체가 도 6에 도시한 바와같이 삽입됨으로써 상부판(14)이 기판에 대해 효율적으로 밀봉될 수 있도록 적합하게 부식된다. 상기 기준 및 사용전극은 분자들이 이격된 전극을 지나서 이동할 때처럼 분자들이 산화 환원 반응(redox reation)을 하거나 전류를 안내할 때 전류나 전압을 검출하도록 구성되고 분리된 단부를 갖는 채널내측으로 연장하는 좁은 부분을 포함한다. 전극은 전기 측정회로에 대한 전기접점을 제공하도록 커넥터(도시않음) 내측으로의 삽입을 위해 칩의 엣지로 연장하는 보다 넓은 박막 리드(21a,22a,23a)에 연결된다. 채널 내측으로 연장하는 사용 및 기준전극중 좁은 부분의 노출영역을 제한하도록 상기 전극들은 SiO2와 같은 절연 유전체막으로 피복될 수 있다. 이는 전극(21,22)이 절연막(24)에 의해 피복되어 있는 도 7 내지 도 9에 도시되어 있다. 일예로서, 백금전극 RF 스퍼터링을 사용하여 피복되며 그 전극의 두께는 3000Å이다. 사용 및 기준 전극은 (전극 사이의 전위차를 최소화하기 위해)채널의 반대편에 정확하게 정렬된 20㎛ 폭을 갖는 백금전극이며 채널 내측으로 20㎛의 간격을 유지하면서 40㎛ 연장된다(도 4 참조). 100㎛ 채널은 분리채널의 체적을 증대시키도록 단부에서 1000㎛로 확대된다. 사용전극 및 기준전극은 폭넓어진 지점으로부터 20㎛ 떨어진 지점에 놓인다. 상대전극은 2mm의 폭을 가지며 채널단부의 확대된 부분으로 연장된다. 이러한 설계의 장점은 검체가 여전히 밀집되어 있지만 온-칼럼 방식으로 검출을 수행하는 채널의 접지단부에 매우 근접(20㎛)하여 작동함으로써 전기영동 전압의 영향을 최소화한다는 점이다. 세심한 정렬후에, 백금 전극을 갖는 부식된 바닥판 또는 기판(11)은 0.8㎜의 구멍(1-4)을 갖는 상부 유리판(14)에 가열접착된다. 검출기 전극도 도 10에 도시한 바와같이 채널의 단부에 인접되게 형성된다. 검출기 전극(21b,22b)은 단부가 노출되도록 절연막(25)에 의해 피복된다. 실시예의 설명에서 칫수를 한정하였지만, 채널 폭과 깊이는 1 내지 2000㎛이며, 전극 폭은 1 내지 2000㎛이고 전극 간극은 1 내지 5000㎛이지만, 바람직하게 채널의 폭과 깊이는 1 내지 500㎛, 전극 폭은 1 내지 500㎛, 전극 간격은 1 내지 500㎛ 범위이다.
전술한 조립방법 및 설계의 장점은 (ⅰ) 사용 및 기준 전극이 전기영동 전압과의 픽업 및 간섭이 최소화되고 분리된 구역에서의 검체농도가 여전히 높은 분리채널의 개구를 막 지나서 또는 개구 인근에 용이하고 정확하게 위치될 수 있다. 이러한 정밀한(미크론) 정렬은 집적된 미세조립 장치에서만 가능하다. (ⅱ) 채널내의 전극은 전기영동 치수에 있어서 매우 작다. 이는 채널내의 동일한 지점에서 도 18에서와 같이 (상기 죤 크기에 비해)여러 개의 전극을 용이하게 위치시킬 수 있게 한다는 점에서 유리하다. 또한, 폭넓은 전극은 더 많은 전기영동 전압성분을 샘플링함으로써 전기분해 거품을 생성하는 경향이 있으므로 유리하다. 이러한 효과는 전극 몸체(선단은 제외)를 절연층으로 피복함으로써 감소될 수 있다. 그러한 얇은 전극은 집적장치상에 사진석판술에 의해서만 가능하게 제조될 수 있다. 결국, 정밀하고 미소한 간극이 형성되어 각각의 검출기는 동일한 기능을 하며 유사한 감도와 탐침범위를 가진다. 미소한 간극을 형성할 수 있는 능력은 전극 사이의 전도 및 용량성 용액의 유효체적이 작아지므로 낮은 백그라운드를 제공한다. 미소한 간극을 갖는 검출기를 제조할수 있는 능력은 단지 미소한 양의 샘플만을 필요로하고 매우 높은 전기영동 해상력을 갖는 좁은 분리채널의 제작 및 검출을 가능하게 하므로 유리하다.
상기 채널은 검출지점에 있는 또는 조금 지난 지점에 있는 단부에서 넓어진다. 이는 검출기 죤 뒤쪽으로 검체가 확산되는 결과로 분리물내의 제 1 죤이 백그라운드를 상승시키므로 중요하다. 커다란 체적을 제공하도록 검출기를 지나 큰 채널을 가짐으로써, 초기 죤은 상대전극 주위의 다량의 용액에 의해 효과적으로 희석되어 다음 대역의 검출을 위한 백그라운드를 상승시키게 된다. 또한, 상기 넓은 구역은 커다란 횡단면으로 인해 낮은 저항을 가진다. 이는 검출기로부터 상대전극으로의 전압강하가 훨씬 커서 검출기에서의 표유전압과 픽업 및 백그라운드를 더욱 감소시킴을 의미한다. 보다 큰 체적을 제공하도록 채널을 넓히는 것이외에도 깊이의 증가도 고려해야 한다.
두개의 신경전달물질인 에피네프린과 노르에피네프린의 모세관 죤 전기영동 분리는 전술한 예에서 주어진 치수를 갖는 CE 마이크로칩을 사용하여 울리, 에이. 티.; 마티즈, 알. 에이. 등의 "미세조립된 모세관 에레이 전기영동 칩을 사용한 초고속 DNA 성분 분리", 프로세스 국립 아카데미 사이언스, USA, 91, 11348-11352, (1994); 및 울리, 에이. 티.; 마티즈, 알. 에이. 등의 "미세조립된 모세관 에레이 전기영동 칩을 사용한 초고속 DNA 시퀘엔싱", 애널리스트 케미컬, 67, 3670-3680, (1995)에 설명된 방법에 따라 일반적으로 수행된다. NaOH로 pH 5.6,으로 조절되고 20%(v/v) 2-프로판으로 완화된 2-(N-몰포리노) 에탄설폰산(MES)의 30mM 용액이 완충제로 사용되었다. 에피네프린 및 모레피네프린(시그마, 스톤 루이스)의 스톡 용액(10 μM)이 0.01M 과염소산으로 준비되었다. 샘플은 MES 완충제에서 소정의 농도로 연속적으로 희석되었다. 샘플을 저장기(3)내에 놓은 후, 샘플들은 20초동안 저장기(1,3) 사이에 90 V/㎝로 주입되었으며 대략 주입체적은 40pL로 계산되었다. 분리는 저장기(2,4) 사이에 45 V/㎝로 수행되었다. 전기영동 전류는 통상적으로 0.3㎂이다.
내셔날 인스투르먼트 NB-MIO-16XL-18I/O를 갖춘 매킨토시 컴퓨터가 전압설정, 데이터 저장 및 3 개의 전극전위를 조절하는데 사용되었다. 사용전극(22)은 기준전극(21)에 대해 +0.5로 바이어스 되었으며, 상대전극(23)은 회로를 완성하는데 사용되었다. 전위측정기는 분자들이 기준전극과 사용전극 사이의 간극을 통해 이동할 때 산화 환원 반응을 경험하는 분자들에 의해 발생된 전류를 측정한다. 미소 전류(< 1 pA)는 채널내에 커다란 직류 전기영동 전류(0.3 ㎂)가 존재하는 경우에도 검출될 수 있다. 이와는 달리, 미소전류는 교류 전위를 갖는 사용전극을 바이어스시킴으로써 검출될 수 있다[스미쓰. 디. 이.; 레이무쓰, 더블유. 에이치. 등의 가역 전극 프로세스를 갖는 제 2 고주파 교류전류 폴라로그래피, 애널리스트 케미컬, 33, 482-485, (1961)]. 로크-인 증폭기가 직류 전기영동 전류로부터의 신호를 구별하는데 사용될 수 있다. 실험이전에, 전극은 20분 동안 전극에 가해진 사인파 전위(Vp-p=0.5V)를 갖는 1 M H2SO4를 사용하여 세정되었다.
도 11은 집적된 전기화학 검출기를 갖는 미세조립된 CE칩상에 형성된 두 개의 신경전달물질인 에피네프린과 노르에피네프린의 분리를 도시한다. 노르에피네프린과 에피네프린은 각각 2.6분과 3.4분에서 검출되었으며 피크들은 베어스라인 위에 그려졌다. 분리시간은 짧은 대략 3분이었다.
도 12a 내지 도 12c는 연속시간으로 0.48nM 에피네프린의 주입 및 검출을 나타낸다. 이러한 실험의 실행을 위한 이동시간의 재현성이 우수하다. 신호세기의 재현성은 1.5 비율이내이고 대부분의 변수는 후의 주입으로부터 제거될 수 있다.
박막 검출전극을 사용하는 것이외에도, 박막 접점이 칩의 엣지로부터 분리 및 주입 채널(12,13)의 단부로 형성될 수 있다. 이는 칩(30)이 소켓(31)내측으로 삽입될 수 있게 하여(도 19), 전기영동 및 검출 전극(32), 예를들어 전술한 형태의 프로세서에 대한 전기접점을 제공한다. 상기 프로세서는 분리채널 내측으로의 샘플의 스택 또는 플러그 주입을 제어하고 분리채널에 대한 전기영동 전압을 인가하는데 사용될 수 있다. 게다가, 상기 프로세서는 디스플레이 또는 프린트아웃(33)을 제공하도록 검출기에 대한 전압 및 산화 환원 전류를 인가할 수 있다.
도 13 및 도 14를 참조하면, 박막 리드(36,37,38)는 주입 채널의 단부 및 분리 채널 또는 칼럼의 단부에 연결된 것으로 도시되어 있다. 채널 타단부에 대한 박막접점도 도시되어 있다. 상기 박막리드는 기판의 엣지(39)에서 종결된다. 박막 리드는 모든 저장기내에 세심하게 놓여 리드에서의 전류흐름으로 인한 가수분해 기포가 인접채널로 진입하지 못하도록 채널의 단부로부터 멀리 떨어져 있다. 이를 위해 도 14에 주입 채널의 한 단부만이 도시되어 있다. 상기 칩은 샘플분석을 수행하기 위해 소켓 내측으로 삽입된다. 박막 리드가 사진석판술 및 스퍼터링에 의해 형성된 후에, 커버(14)는 리드가 접촉될 수 있도록 단부에서 이격된 기판에 접착된다.
다른 예에서, 박막 리드(36a,37a,38a,40a)는 기판의 바닥에 형성될 수 있으며, 도 15 내지 도 17에서 리드는 접점(41)을 통해 부식채널의 바닥으로 상기 채널로부터 이격되어 있다.
상이한 하프-셀 전위를 갖는 종류들 사이의 구별은 사용전극에서 상이한 바이어스 전압에 걸친 스위핑을 실시하거나 도 18에 도시한 바와같이 다중 바이어스 전압에서 사용전극 및 기준전극 다중 쌍(21-1,21-2,21-3; 22-1,22-2,22-3)을 사용함으로써 달성될 수 있다.
집적된 전기화학적 검출기를 갖는 모세관 전기영동(CE) 칩의 다른 설계방식이 도 20 및 도 21에 도시되어 있다. 분리채널과 주입채널 모세관(46,47)은 표준 사진석판술, 습식 화학에칭, 및 가열 접착방법을 사용하여 미세조립된다. 도 21은 전기화학적 검출시 분리 전기장의 효과를 최소화하는데 사용된, 사진석판술에 의해 형성된 채널패턴을 도시한다. 상기 분리채널은 사용전극 바로전에서 약 50㎛로부터 1000㎛로 확대되며, 배출 채널의 감소저항이 검출영역내의 전기장을 낮춘다. 10㎛폭의 박막 사용전극(49)은 기판 표면상에 형성된 이중 박막 리드(51)를 가지며 전극의 단부에 연결되도록 배출채널의 엣지 아래로 연장한다. 전극은 1mm 폭의 배출채널 내측으로 30㎛ 이격되어 있다. 미세조립 기술은 분리채널의 단부를 조금 지난 배출채널내에 사용전극(49)을 정확하고 안정하고 위치시킬 수 있게 하므로 이러한 칩의 설계에 특히 유리하다. 도 10의 실시예에서 설명한 바와같이, 배출채널내의 사용전극의 위치선정으로 검출기가 전기영동 전압으로 해제될 수 있게 하며 분리채널내에서의 분석과 관련된 문제점을 제거한다.
기준전극(53)은 접근 구멍(52)내에 놓인다. 이러한 전극은 배출채널의 바닥 또는 상부에 형성된 얇은 전극일 수 있다. 사용전극(49)과 접근구멍(52) 사이의 간극은 집적된 전기화학 검출기의 성능에 커다란 효과를 끼친다. 도 22와 도 23은 접근구멍으로부터 분리물 상에 있는 사용전극까지의 거리에 대한 효과를 나타낸다. 도 22에서, 접근 구멍의 엣지는 사용전극으로부터 600㎛였으며 300, 350, 400 및 450 V에서의 1 mM 도파민의 전기영동 분리물이 도시되어 있다. 주입(90초)은 접지전위로 모든 다른 저장기를 유지하면서 주입 폐저장기에 -120 V를 인가함으로써 수행되었다. 분리는 분리전압(Vs)이 고-전압 저장기에 인가될 때 발생되었으며, 0.75 Vs가 샘플 및 주입 폐저장기에 인가되었으며, 검출 저장기는 지면에 유지되었다. 샘플은 분리 완충액[25 mM 2-(N-몰포리노), 에탄설폰산, 1 mM Cl-, pH 5.7]에서 용해되었다. +800 mV의 기준전극에서 검출되었다. 도 23에서, 접근 구멍엣지는 사용전극으로부터 300㎛였고 600, 800, 1000 및 1200에서 1 mM 도파민의 전기영동 분리가 도시되어 있다. 주입 및 분리 조건은 전술한 바와 동일했다.
이격거리가 600㎛였던 도 22에서, 이격거리가 300㎛였던 도 23에 비해 더 많은 간섭이 발생되었다. 600㎛의 이격거리를 갖는 칩내의 300 V(V/㎝)에서의 도파민의 분리는 평탄한 베이스라인을 나타냈다. 50 V의 증분으로 450 V(90 V/㎝)까지 Vs를 증가시키면 신호의 감소와 베이스라인의 경사를 초래한다. 구멍대 전극의 간극이 300㎛인 칩에 있어서, Vs의 효과는 훨씬 더 적어 보다 높은 Vs에서 더 빠른 분리를 가능하게 하며, 200 V의 증분으로 Vs를 증가시켜도 Vs가 1200 V(240V/㎝)에 도달할 때까지 신호와 베이스라인의 경사도에 커다란 변화를 초래하지 않는다. 검출 백그라운드에 대한 이러한 Vs의 효과는 (Vs에 의해 결정된)사용전극 위의 완충제 전위와 전위측정기에 의해 사용전극에 설정된 전위와의 차이에 의한 것으로 생각된다. 이러한 결과를 기초로하여, 다음 실험을 위해 Vs=800 V이고 구멍대 전극의 간극이 300㎛인 칩을 사용했다.
이들 장치에 특성을 부여하기 위해, 도 23과 동일한 조건을 갖는 집적된 전기화학 검출기를 구비한 미세조립된 CE 칩내에 있는 신경전달물질의 검출과 모세관 죤의 전기영동 분리를 먼저 수행했다. 그 결과가 도 24에 도시되어 있으며 상기 도면의 곡선들은 다음과 같은 분리물을 나타낸다. 즉, A는 1 mM 도파민의 분리물이며, B는 1 mM 에피네프린의 분리물이며, C는 1 mM 카테콜의 분리물이며, D는 1 mM 도파민(1), 에피네프린(2), 및 카테콜(3)의 분리물이다. 문자 E는 도파민(△), 에피네프린(), 및 카테콜()의 주입농도의 함수로서 분리물의 피크높이를 나타낸다. 직선상의 지점들은 3번의 분리로 얻은 평균 신호를 나타낸다. 분석은 전기삼투압 유동을 가능하게 하는 비코팅 채널내에서 수행되었다.
이러한 분리에 있어서 이론적인 판의 수는 도파민, 에피네프린 및 카테콜 각각에 대해 21000, 17000 및 12000였다. 농도함수로서의 3성분 각각으로부터의 신호는 도 24e에 도시한 바와같이 10 내지 1000μM 범위내에서 선형이었다. 블랭크 런에서 55 내지 70초의 신호(1.5pA) 표준편차를 사용하여, 도파민에 대해서는 3.7μM, 에피네프린에 대해서는 6.5μM, 카테콜에 대해서는 12μM의 검출한계(신호대 소음=2)를 결정했다. 약 18 pL 주입체적을 기초로한 도파민 온-칼럼의 검출한계는 CE내의 전기화학 검출에 대한 예상 범위내인 66원자몰이었다.
이러한 CE칩의 일반적인 적용가능성은 전기화학적 활성도를 높이고 다른 유생분자들을 검출함으로써 개선될 수 있다. 이러한 방향으로의 제 1 단계로서, 간접적인 전기화학적 검출방법[에프. 포렛 및 피. 보켓의 개선된 전기영동 3, 273(1989)]을 사용하여 전기화학적 활성 삽입시약인 Fe(phen)3 2+(phen=1,10-펜안트로린)을 갖는 미세조립된 CE칩내의 DNA 분리 및 검출을 위한 방법을 전개했다. 분리 완충제내의 자유 Fe(phen)3 +2로부터의 일정한 백그라운드 전류는 DNA-Fe(phen)3 +2복합물이 검출영역을 통해 이동할 때 감소되며, DNA의 통행은 백그라운드 전류에의 일시적인 침지에 의해 표시될 수 있다.
도 25a는 ΦΧ174 HaeⅢ 리스트릭션 다이제스트(1 ng/μL)의 분리를 나타낸다. 도 25b는 1:200 희석율을 갖는 (변성된)살모넬라 PCR생성물과 500 pg/μL ΦΧ174 HaeⅢ 리스트릭션 다이제스트의 분리를 나타낸다. 피크 포인트업을 갖는 일렉트로페로그램을 나타내도록 도 25a 및 도 25b에서 전류 축선이 바뀌어 있다. (20초간)주입은 샘플 저장기를 접지상태로 다른 두 개의 저장기를 부상상태로 유지하면서 주입 폐저장기에 +120 V를 인가하며 수행되었다. 분리는 검출 저장기를 접지상태로 다른 두 개의 저장기를 부상상태로 유지하면서 고 전압 저장기에 -800 V를 인가하며 수행되었다. +800 ㎷ vs. 기준전극에서 검출되었다. 상기 분리기질은 0.75% 하이드록시에틸셀룰로스, 40 mM 3-아세테이트, 1 mM EDTA, 1 mM Cl-, 1 μM Fe(phen)3 2+, pH=8.3을 포함한다. DNA 샘플은 0.1mM 3-Cl-, 0.01mM EDTA, pH=8.2로 준비되었다. 채널 표면에서는 전기삼투압 유동을 억제하도록 선형 폴리아크릴아미드가 파생된다.
도 25b는 상기 미세장치들이 PCR생성물의 크기를 잴수 있는 감도 및 해상도를 가지며 살모넬라로부터의 159 bp 앰플리콘이 161 bp vs. ΦΧ174 HaeⅢ 피크로 분류된다는 것도 입증하고 있다. (비-스태킹 상태하에서)전기영동 완충제내에 용해된 50 ng/μL ΦΧ174 HaeⅢ의 주입으로 603 bp 대역에 대해 190 pA의 신호를 발생한다. 이전의 주입 플러그 길이 330㎛로부터 계산된 125 pL의 주입 체적에 근거하여, 603 bp 부산물 700 fg(1.8 원자몰)이 주입됨에 따라 검출한계(신호대 소음=2)는 상기 부산물에 대해 28 젭토몰이었다. 이러한 결과들은 집적된 전기화학 검출기가 통상적인 형광 검출방법에 필적하는 고감도 생화학 분석에도 사용될 수 있음을 나타낸다. 게다가, 직접적인 라벨링 방법과 다중 전위 전기화학 검출기의 사용으로 인해 다중-파장 형광 검출법과 유사하게 다중 전기화학적 검출을 가능하게 한다.
화학 및 생화학적 검체의 검출을 위한 다수의 전기화학적 라벨은 건장진단과 병원균 검출을 포함한 다양한 적용예에 사용될 수 있다. 레이아웃과 패키징을 개선함으로써 장치를 완전하게 미세조립할 수 있으므로, 검출 및 컴퓨터 회로가 칩상에 집적된 화학 분석용 마이크로프로세서의 제작도 가능해진다. 이러한 개선에 의해, 집적식 마이크로분석 장치는 대기권 밖을 포함한 다양한 우주공간에 있는 생물학적 흔적의 조사에도 가능하다.
주입 및 분리채널에 대한 박막 접점 및 다양한 박막 검출기 전극이 채널에 대해 정확히 위치된 상부 커버판상에 이와는 다른 형태로 형성될 수 있다는 것도 분명하다.
따라서, 미세조립된 CE 칩상에 개선된 집적식 전기화학 검출기가 제공되었다. 이는 다양한 관련 및 유용한 검체를 포함한다. 예를들어, CE상의 전기화학 검출기는 산화 환원 반응성을 갖는 다수의 검체에 사용될 수 있다. 미세조립된 칩 및 전기화학적 칩은 작동자가 직접 간섭하지 않고도 위험물질들을 원거리에서 분석하는데 사용될 수 있다. 본 발명은 DNA의 완전한 통합및 미세조립된 칩상의 다른 검체들과 관련한 중요한 발전환다.

Claims (27)

  1. 길다란 분리채널을 갖는 기판을 구비한 형태의 미세조립된 모세관 전기영동 칩에 있어서,
    분자들이 박막전극을 지날 때 분자들을 검출하도록 구성된 상기 분리채널의 단부 근처에 있는 하나 이상의 박막 필름 사용전극 및 상기 사용전극으로부터 이격된 기준전극을 갖는 집적식 전기화학 검출기를 포함하는 것을 특징으로 하는 미세조립된 모세관 전기영동 칩.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 기준전극은 박막 전극인 것을 특징으로 하는 미세조립된 모세관 전기영동 칩.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 박막전극들은 단부가 좁으며, 상기 좁은 단부들은 전기영동 칩내부에 또는 상기 채널의 단부 또는 채널을 조금 지난 곳에 검출영역을 형성하도록 서로로부터 이격되게 연장하는 것을 특징으로 하는 미세조립된 모세관 전기영동 칩.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 박막 검출기 전극은 전극단부들 근처의 한 지점으로 연장하는 절연막으로 덮여 있는 것을 특징으로 하는 미세조립된 모세관 전기영동 칩.
  5. 제 3항에 있어서, 상기 채널은 1 내지 500㎛의 폭을 가지며, 상기 좁은 단부는 1 내지 500㎛의 폭을 가지며, 상기 박막전극 단부 사이의 간극은 1 내지 500㎛인 것을 특징으로 하는 미세조립된 모세관 전기영동 칩.
  6. 제 3항에 있어서, 상기 채널은 1 내지 2000㎛의 폭을 가지며, 상기 좁은단부는 1 내지 2000㎛의 폭을 가지며, 상기 박막 전극들 사이의 간극은 1 내지 2000㎛인 것을 특징으로 하는 미세조립된 모세관 전기영동 칩.
  7. 제 3항에 있어서, 한 단부에 있는 채널은 대 체적부분으로 전환되고 상기 박막 전극은 대 체적부분으로의 전환부에 또는 전환부의 근처에 놓이는 것을 특징으로 하는 미세조립된 모세관 전기영동 칩.
  8. 제 3항에 있어서, 다중 전위 전기화학 검출을 수행하도록 상기 채널의 단부 근처에 배열된 복수의 이격된 전극을 포함하는 것을 특징으로 하는 미세조립된 모세관 전기영동 칩.
  9. 제 2항에 있어서, 상기 박막 전극으로부터 상기 칩의 엣지로 연장하는 박막 리드를 포함하는 것을 특징으로 하는 미세조립된 모세관 전기영동 칩.
  10. 제 1항에 있어서, 상기 기준전극은 박막 사용전극으로부터 1 내지 500㎛ 이격되어 있는 것을 특징으로 하는 미세조립된 모세관 전기영동 칩.
  11. 제 1항에 있어서, 상기 기준전극은 박막 사용전극으로부터 1 내지 1000㎛ 이격되어 있는 것을 특징으로 하는 미세조립된 모세관 전기영동 칩.
  12. 길다란 분리채널을 갖는 기판, 및 상기 기판에 장착되어 채널 커버판에 분리채널을 형성하는 커버판을 포함하는 형태의 미세조립된 모세관 전기영동 칩에 있어서,
    상기 분리채널은,
    상기 모세관을 따라 분리전압을 인가하기 위해 모세관의 각각의 단부에 있는 박막 수단, 및
    분자들이 상기 박막 전극을 지날 때 분자들을 검출하도록 채널의 단부 근처에 위치된 하나 이상의 박막 사용전극과 상기 사용전극으로부터 이격된 기준전극을 갖는 전기화학 검출기를 포함하는 것을 특징으로 하는 미세조립된 모세관 전기영동 칩.
  13. 제 12항에 있어서, 상기 기준전극은 박막 전극인 것을 특징으로 하는 미세조립된 모세관 전기영동 칩.
  14. 제 13항에 있어서, 상기 박막전극들은 단부가 좁으며, 상기 좁은 단부들은 전기영동 칩내부에 검출영역을 형성하도록 서로로부터 이격되게 연장하는 것을 특징으로 하는 미세조립된 모세관 전기영동 칩.
  15. 제 14항에 있어서, 상기 박막 검출기 전극은 전극단부들 근처의 한 지점으로 연장하는 절연막으로 덮여 있는 것을 특징으로 하는 미세조립된 모세관 전기영동 칩.
  16. 제 14항에 있어서, 상기 채널은 1 내지 500㎛의 폭을 가지며, 상기 좁은 단부는 1 내지 500㎛의 폭을 가지며, 상기 박막전극 단부 사이의 간극은 1 내지 500㎛인 것을 특징으로 하는 미세조립된 모세관 전기영동 칩.
  17. 제 14항에 있어서, 상기 채널은 1 내지 2000㎛의 폭을 가지며, 상기 좁은단부는 1 내지 2000㎛의 폭을 가지며, 상기 박막 전극들 사이의 간극은 1 내지 2000㎛인 것을 특징으로 하는 미세조립된 모세관 전기영동 칩.
  18. 제 13항에 있어서, 한 단부에 있는 채널은 대 체적부분으로 전환되고 상기 박막 전극은 상기 전환부로부터 대 체적부분으로 500㎛ 이하로 이격되게 놓인 것을 특징으로 하는 미세조립된 모세관 전기영동 칩.
  19. 제 13항에 있어서, 다중 전위 전기화학 검출을 수행하도록 상기 채널의 단부 근처에 배열된 복수의 이격된 전극을 포함하는 것을 특징으로 하는 미세조립된 모세관 전기영동 칩.
  20. 제 13항에 있어서, 상기 박막 전극으로부터 칩의 한 엣지로 연장하는 박막리드를 포함하는 것을 특징으로 하는 미세조립된 모세관 전기영동 칩.
  21. 제 10항에 있어서, 상기 채널은 대 체적부분으로 전환되며 상기 박막 사용전극은 전환부분으로부터 500㎛ 이내로 상기 대 체적부분 내에 위치하는 것을 특징으로 하는 미세조립된 모세관 전기영동 칩.
  22. 제 10항에 있어서, 상기 채널은 대 체적부분으로 전환되며 상기 박막 사용전극은 전환부분으로부터 2000㎛ 이내로 상기 대 체적부분 내에 위치하는 것을 특징으로 하는 미세조립된 모세관 전기영동 칩.
  23. 길다란 분리채널과 주입채널을 갖는 부식된 유리기판, 및 상기 기판에 장착되어 채널에 분리 모세관을 형성하는 커버판을 포함하는 형태의 미세조립된 모세관 전기영동 칩에 있어서,
    상기 분리 모세관은,
    상기 칩의 엣지로부터 분리 및 주입 채널의 단부로 연장하는 박막 리드, 및
    분자가 박막전극을 지날 때 분자를 검출하도록 구성된 채널단부 근처에 박막전극을 갖는 전기화학 검출기를 포함하는 것을 특징으로 하는 미세조립된 모세관 전기영동 칩.
  24. 제 23항에 있어서, 상기 박막전극들은 단부가 좁으며, 상기 단부들은 전기영동 칩내부에 또는 상기 채널의 단부 또는 채널을 조금 지난 곳에 검출영역을 형성하도록 서로로부터 이격되게 연장하는 것을 특징으로 하는 미세조립된 모세관 전기영동 칩.
  25. 제 23항에 있어서, 상기 채널은 1 내지 500㎛의 폭을 가지며, 상기 좁은 단부는 1 내지 500㎛의 폭을 가지며, 상기 박막전극 단부 사이의 간극은 1 내지 500㎛인 것을 특징으로 하는 미세조립된 모세관 전기영동 칩.
  26. 제 23항에 있어서, 상기 채널은 1 내지 2000㎛의 폭을 가지며, 상기 좁은단부는 1 내지 2000㎛의 폭을 가지며, 상기 박막 전극들 사이의 간극은 1 내지 2000㎛인 것을 특징으로 하는 미세조립된 모세관 전기영동 칩.
  27. 제 23항에 있어서, 상기 채널은 보다 넓은 채널부로 전환되며 상기 박막전극은 상기 채널 전환부로부터 조금 이격되어 있는 것을 특징으로 하는 미세조립된 모세관 전기영동 칩.
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