MXPA99001910A - Detector electroquímico integrado en plaquetas de electrofóresis en un capilar microfabricado - Google Patents

Abstract

Una plaqueta de electrofóresis en un capilar microfabricado que incluye un detector electroquímico de película delgada integral para detectar moléculas separadas en el capilar.

Description

DETECTOR ELECTROQUÍMICO INTEGRADO EN PLAQUETAS DE ELECTROFÓRESIS EN UN CAPILAR MICROFABRICADO Solicitud Relacionada Esta solicitud es una continuación parcial del Ni de Serie 08/703,394 presentada el 26 de agosto de 1996. Breve Descripción de la Invención Esta invención se refiere en general a un detector electroquímico como componente de un módulo de separación y detección integrado en una plaqueta de electrofóresis en un capilar microfabricado y a un método para fabricar el detector electroquímico, y de manera más particular, al diseño de un detector electroquímico de película delgada que puede ser colocada con precisión en un capilar microfabricado. Antecedentes de la Invención La detección electroquímica ha sido empleada en la cromatografía líquida y en la electrofóresis de capilar (CE) . Se ha demostrado que la detección electroquímica es muy sensible y puede medir 10"ld a 10"19 moles de muestra con volúmenes de detección típicos desde nL a pL (Ewing, A. G. ; Mesaros, J. M. ; Gavin, P. F., Detección Electroquímica en Separaciones de Microcolumna, Química Analítica, 66 , 527A-536A, (1994); Voegel , P. D . ; Baldwin, R. P., Detección Electroquímica con Electrodos de Cobre en Cromatografía Líquida y Electrofóresis de Capilar, American Laboratory, 28 (2) , 39-45, (1996) ) . También se han utilizado métodos electroquímicos para detectar el ADN (Shigenaga, M. K. ; Park, J. . ; Cundy, K. C. ; Gimeno, C. J. ; Ames, B. N. , Daño del ADN Oxidativo In Vivo: Medición de 8-hidroxi-2 ' -deoxiguanosina en el ADN y Orina por medio de la Cromatografía Liquida de Alta Resolución con Detección Electroquímica, Métodos de Enzimología, 186, 521-530, (1990); Takenaka, S . ; Uto, H. ; Knodo, H. ; Ihara, T.; Takagi, M. , Sondas del ADN Activo Electroquímicamente Detección de las Secuencias del ADN Meta a Nivel de Femtomol mediante la Cromatografía Liquida de Alta Resolución con Detección Electroquímica, Bioquímica Analítica, 218, 436-443, (1994); Johnston, D. H. ; Glasglow, D. C; Thorp, H. H. , Mediciones Electroquímicas de la Accesibilidad a Solventes de Nucleobases Utilizando Transferencia de Electrones Entre el ADN y los Complejos Metálicos, Boletín de la Sociedad Norteamericana de Química, 117, 8933-8938, (1995)), células únicas (Olefirowicz, T. M. ; Ewing, A. G. , Electrofóresis Capilar en Capilares de 2 y 5 µM de Diámetro: Aplicación para Análisis Citoplásmico, Química Analítica, 62, 1872-1876, (1990); Pihel, K. ; Hsieh, S.; Jorgenson, J. . ; ightman, R.

M. , Detección Electroquímica de Histamina y 5- Hidroxitriptamina en Células Cebada Aisladas, Química Analítica, 67, 4514-4521, (1995) ) , e incluso moléculas únicas (Fan, F. R. F.; Bard, A. J. , Detección Electroquímica de Moléculas Únicas, Ciencia, 267, 871-874, (1995)). La operación de estos detectores electroquímicos se basa por lo general en el uso de tres electrodos denominados electrodos de trabajo, de conteo y de referencia. Existen tres configuraciones que han sido utilizadas para detectar las separaciones de CE: en la columna (Huang, X.; Pang, T. K. J. ; Gordon, M. J. ; Zare, R. N. , Detector de Conductividad en la Columna para Electrofóresis en la Zona Capilar, Química Analítica, 59, 2747-2749, (1987) , donde los electrodos del detector se colocan dentro del capilar; columna terminal (Huang, X.; Zare, R. N. ; Sloss, S.; Ewing, A. G. , Detección en la Columna Terminal para Electrofóresis en la Zona Capilar, Química Analítica, 63, 189-192, (1991); Chen, M. C; Huang, H. J. , Una Célula Electroquímica para la Detección Amperimétrica en la Columna Terminal en la Electrofóresis Capilar, Química Analítica, 67, 4010-4014, (1995)), donde los electrodos se colocan directamente en el extremo del capilar de separación; fuera de la columna (Olefirowicz, T. M. ; Ewing, A. G. , Electrofóresis Capilar en Capilares de 2 y 5 µM de Diámetro: Aplicación para Análisis Citoplásmico, Química Analítica, 62, 1872-1876, (1990); O'Shea, T. J. ; Greenhagen, R. D.; Lunte, S. M.; Lunte, C. E . ; Smyth, M. R. ; Radzik, D. M. ; Watanabe, N. , Electrofóresis Capilar con Detección Electroquímica Empleando una Unión de Nafion en la Columna, Boletín de Cromatografía, 593, 305-312, (1992); Wu, D . ; Regnier, F. E.; Linhares, M. C; Microensayo Mediado Electroforéticamente de Fosfatasa Alcalina utilizando Detección Electroquímica y Espectrofotométrica en la Electrofóresis Capilar, Boletín de Cromatografía B, 657, 357-363, (1994), donde los electrodos se aislan eléctricamente del voltaje de la electrofóresis por medio de un tubo de vidrio poroso puesto a tierra. La detección electroquímica de las separaciones de CE se ha realizado fijando dos alambres de platino a través de orificios opuestos diametralmente perforados por un láser en un tubo capilar. Esta estructura es muy difícil de manufacturar y alinear, y la colocación de los electrodos de detección dentro de la región de alto voltaje de la columna de separación es problemática. En este formato, estamos tratando de detectar pequeñas corrientes o voltajes mientras se aplican varios kV a la columna de separación. La inestabilidad mecánica y la mala definición de la alineación del electrodo pueden dar como resultado una absorción o fluctuación eléctrica significativa en el fondo, haciendo que la señal deseada sea muy difícil de detectar. La presencia de gradientes de alto voltaje y corrientes electroforéticas significativas en la columna cerca de los electrodos puede inducir señales parásitas . Los formatos de detección en la columna terminal y fuera de la columna son importantes porque disminuyen la influencia del voltaje de la electrofóresis. En el formato de la columna terminal, se desean colocar los electrodos de detección lo más cerca posible del extremo del canal de electrofóresis, de tal forma que la detección se lleve a cabo lo más cerca posible del potencial puesto a tierra. Esto es muy difícil de lograr con técnicas de manufactura convencionales . Los electrodos deben colocarse con precisión en mieras en el extremo del capilar. Cualquier error en la colocación provocará la pérdida de la señal analítica si los electrodos están demasiado alejados de la abertura o una absorción del voltaje alto si los electrodos se colocan dentro de la columna de separación. Además, las fluctuaciones en la colocación del electrodo o la abertura entre un electrodo y otro pueden provocar fluctuaciones severas en la señal de fondo que produce el ruido. Por lo general, se deben utilizar micromanipuladores y un microscopio para ensamblar el detector. Además, la ingeniería del aislamiento eléctrico mediante la conexión de los tubos capilares de separación y detección con un tubo de vidrio poroso puesto a tierra en el formato fuera de la columna es bastante difícil de ensamblar y operar, y la unión puede ser mecánicamente inestable y mal definida. En un caso, a pesar de que Slater y Watt (Slater, J. M. ; Watt, E. J. , Detector Electroquímico con Disposición de Microenlace en la Plaqueta para Uso en Análisis de Electrofóresis Capilar, 1994, 119, 2303-2307) fabricaron fotolitográficamente electrodos en un substrato, ya que no fabricaron un dispositivo de separación y detección totalmente integrado, se vieron forzados a utilizar las uniones mencionadas poco deseables para acoplar su detector a un capilar cilindrico convencional. Existe la necesidad de una plaqueta para electrofóresis en un capilar microfabricado con un detector electroquímico de película delgada integral y conductores de electrofóresis que puedan conectarse fácilmente a la electrofóresis eléctrica asociada y al aparato detector. Objetivos y Resumen de la Invención Un objetivo general de la presente invención es ofrecer un detector electroquímico para electrofóresis capilar en una plaqueta de vidrio plana microfabricada que supere las carencias antes mencionadas de la técnica previa. Otro objetivo de la presente invención es ofrecer una plaqueta de electrofóresis de un capilar microfabricado con un detector microelectroquímico que reduzca el efecto de interferencia de los campos de electrofóresis aplicados. Otro objetivo de la presente invención es ofrecer electrodos del detector colocados de manera reproducible, precisa y conveniente, resistentes y sensibles. Otro objetivo más de la presente invención es ofrecer electrodos del detector que estén colocados de manera precisa y estable en el extremo del capilar donde estén cerca del potencial conectado a tierra y por lo tanto, donde estén inmunes a la absorción desde los potenciales de electrofóresis altos.

Un objetivo más de la presente invención es ofrecer una plaqueta de electrofóresis de un capilar microfabricado con electrodos del detector electroquímico de película delgada integrada y electrodos de electrofóresis que puedan producirse de manera precisa y a bajo costo. Lo anterior y otros objetivos de la invención se logran integrando un detector electroquímico en una plaqueta de electrofóresis de un capilar microfabricado del tipo que incluye un substrato que posee por lo menos un canal de separación alargado y una cubierta protectora unida al substrato mencionado para formar con el canal mencionado un capilar de separación. Un detector electroquímico de película delgada se fabrica sobre la superficie del substrato mencionado o la cubierta protectora con electrodos angostos y delgados que se extienden dentro del canal mencionado cerca de un extremo del canal mencionado. Breve Descripción de las Ilustraciones Lo anterior y otros objetivos de la presente invención se comprenderán de manera más clara después de leer la siguiente descripción junto con las ilustraciones que la acompañan, de las cuales : La Figura 1 muestra una plaqueta de electrofóresis de un capilar microfabricado de acuerdo con la técnica anterior; La Figura 2 es una vista seccional tomada a lo largo de la línea 2-2 de la Figura 1; La Figura 3 es una vista en perspectiva de una plaqueta de electrofóresis de un capilar microfabricado que incorpora la presente invención; La Figura 4 es una vista ampliada de la región 4-4 del detector indicado de la Figura 3 ; La Figura 5 es una vista seccional tomada a lo largo de la línea 5-5 de la Figura 4; La Figura 6 es una vista seccional tomada a lo largo de la línea 6-6 de la Figura 5; La Figura 7 es una vista seccional que muestra otra forma de realización de los electrodos electroquímicos mostrados en las Figuras 3 y 4 ; La Figura 8 es una vista seccional tomada a lo largo de la línea 8-8 de la Figura 7; La Figura 9 es una vista seccional tomada a lo largo de la línea 9-9 de la Figura 7; La Figura 10 es una vista ampliada de otra forma de realización del detector; La Figura 11 es un electroferograma de norepinefriña y epinefrina separadas en una plaqueta de electrofóresis capilar con detección electroquímica integrada; Las Figuras 12A-12C son electroferogramas de separaciones de norepinefrina obtenidas con una plaqueta de electrofóresis capilar con detección electroquímica integrada para tres experimentos consecutivos; Las Figuras 13A-13B son vistas en perspectiva de una plaqueta de electrofóresis en un capilar microfabricado con detección electroquímica integrada que incluye conexiones de película delgada para los canales de separación e inyección: ' La Figura 14 es una vista ampliada de la sección 14-14 de la Figura 13B; La Figura 15 es una vista en perspectiva de un substrato que incluye un detector electroquímico integrado y conductores conectados a los canales de inyección y separación; La Figura 16 es una vista seccional tomada a lo largo de las líneas 16-16 de la Figura 15; La Figura 17 es una vista ampliada tomada a lo largo de la dirección de la flecha 17 de la Figura 16; La Figura 18 es una vista ampliada parcial que muestra una pluralidad de electrodos de detección electroquímica formados a lo largo del canal de separación; La Figura 19 es un diagrama de bloque de un aparato para unir una plaqueta de electrofóresis capilar dentro de un sistema global de separación y análisis electroquímico de acuerdo con la presente invención. La Figura 20 es una vista horizontal de una plaqueta de electrofóresis en un capilar fabricado de manera microfabricada de acuerdo con otra forma de realización de la presente invención. La Figura 21 es una vista ampliada del área 21-21 de la Figura 20 que muestra el electrodo de detección y el electrodo de referencia. Las Figuras 22 y 23 muestran el efecto de la distancia de separación entre el electrodo de trabajo y el electrodo de referencia. La Figura 24 muestra las separaciones de la electrofóresis capilar y la detección de neurotransmisores. La Figura 25 muestra la separación y la detección del ADN en una plaqueta utilizando la detección electroquímica indirecta. Descripción de las Formas de Realización Preferidas Las Figuras 1 y 2 muestran una plaqueta de electrofóresis de capilar (CE) microfabricado formada de acuerdo con la técnica anterior. Los canales del capilar se forman sobre un substrato de vidrio grabado 11 mediante fotolitografía y grabado químico. El proceso es descrito por Woolley y colaboradores, Separaciones de Fragmentos de ADN a Velocidad Ultra Alta Utilizando Plaquetas de Electrofóresis con Disposición de Capilar Microfabricado, Procedimientos de la Academia Científica Nacional, EUA, 91, 11348-11352 (1994) . El canal de separación 12 y el canal de inyección 13 para inyectar la muestra dentro del canal mediante una inyección escalonada o de relleno se describen en la referencia anterior. En un ejemplo, todos los canales se grabaron a una profundidad de 8 µm; los canales de separación eran de 100 µm de ancho, y los canales de inyección eran de 50 µm de ancho. Los canales de separación tenían 46 mm de longitud, con una distancia de 39 mm desde el punto de inyección hasta el detector electroquímico. Los canales de inyección tenían 22 mm de longitud con una distancia de 12 mm desde la introducción del punto de muestra hasta la región de la inyección. Una placa superior 14 estaba unida al substrato de vidrio grabado para formar los capilares que estaban llenos con una matriz de separación. La placa superior incluye orificios perforados 1-4 que suministran depósitos de reactivos a los extremos del canal de separación y los extremos del canal de inyección. En la técnica anterior, las separaciones del ADN electroforéticas en los canales del capilar microfabricado eran detectadas por sistemas voluminosos, inconvenientes y costosos que emplean rayos láser externos, sistemas ópticos, tubos de fotomultiplicador, etc. De esta forma, hasta ahora no ha sido posible integrar el sistema de detección óptica en una plaqueta de CE microfabricada. De manera similar, a pesar de que la detección electroquímica de separaciones de electrofóresis capilar convencionales realizadas en capilares de sílice poco profundos se ha llevado a cabo con una variedad de formatos de electrodo y detector externos, este detector nunca ha sido integrado dentro de un sistema de plaquetas de electrofóresis CE con una tecnología de microfabricación única.

De acuerdo con una forma de realización de la presente invención, los electrodos de platino para los detectores electroquímicos se fabrican sobre el substrato o la placa superior mediante desintegración RF y fotolitografía antes de unir la placa superior o la cubierta protectora al substrato grabado. Los electrodos pueden posicionarse con precisión en los extremos de la columna de separación donde están cerca del potencial puesto a tierra ofreciendo de esta manera un detector electroquímico estable, fácil de fabricar y poco costoso. Otros materiales adecuados del electrodo son el oro, cromo, carbono y otros materiales conductores depositados fácilmente y relativamente inertes. Refiriéndonos a las Figuras 3-6, se muestra una plaqueta de CE con electrodos de platino de película delgada. Los electrodos incluyen un electrodo de referencia 21, un electrodo de trabajo 22 y un electrodo de conteo 23 (no mostrado) conectados a un circuito externo por medio de conductores de película delgada 21a, 22a y 23a. El substrato de preferencia se graba de tal forma que los electrodos y los conductores de película delgada sean intercalados como se muestra en la Figura 6 mediante lo cual la placa superior 14 puede sellarse de manera efectiva al substrato. Los electrodos de referencia y de trabajo incluyen una porción angosta que se extiende dentro del canal con los extremos separados y adaptados para detectar la corriente o el voltaje como moléculas sometidas a reacciones redox, o para conducir la corriente a medida que migran a través de los electrodos espaciados. Los electrodos están conectados a conductores de película delgada más anchos 21a, 22a y 23a que se extienden hacia el borde de la plaqueta para su inserción dentro de un conector (no mostrado) para proporcionar una conexión eléctrica a los circuitos de medición eléctrica. Con el fin de limitar el área expuesta de las porciones angostas de los electrodos de trabajo y de referencia que se extienden dentro del canal, los electrodos pueden estar cubiertos por una película dieléctrica aisladora como el Si02. Esto se ilustra en las Figuras 7-9 donde los electrodos 21 y 22 están cubiertos por una película aisladora 24. En un ejemplo, los electrodos Pt fueron depositados utilizando la desintegración RF; el grosor de los electrodos era de 3000 A. Los electrodos de trabajo y de referencia eran electrodos Pt de 20 µm de ancho que estaban alineados de manera exacta en lados opuestos del canal (para reducir la diferencia del potencial entre los electrodos) y se extendían 40 µm dentro del canal, con un espaciamiento de 20 µm (consultar la Figura 4) . El canal de 100 µm se ensancha a 1000 µm en el extremo para incrementar el volumen del canal de separación. Los electrodos de trabajo y de referencia se colocaron a 20 µm desde el punto de ensanchamiento. ?l electrodo de conteo era de 2 mm de ancho y se extendía dentro de la porción ensanchada en el extremo del canal. La ventaja de este diseño es que reduce la influencia del voltaje de electrofóresis trabajando muy de cerca (20 µm) al extremo conectado a tierra del canal donde el analito sigue estando altamente concentrado, mientras continúa llevando a cabo la detección en la columna. Después de una alineación cuidadosa, la placa inferior grabada o el substrato 11 con los electrodos Pt se unió térmicamente a una placa de vidrio superior 14 con los orificios de 0.8 mm 1-4. Los electrodos del detector también pueden formarse de manera adyacente al extremo del canal como se muestra en la Figura 10. Los electrodos del detector 21b y 22b están cubiertos por una película aisladora 25 con los extremos expuestos. A pesar de que se han proporcionado dimensiones específicas para la forma de realización descrita, el ancho y la profundidad del canal puede ser enrte 1 - 2000 µm, el ancho del electrodo entre 1 -2000 µm y el espaciamiento del electrodo entre 1 - 5000 µm, pero de preferencia, el ancho y la profundidad del canal es entre 1 - 500 µm, el ancho del electrodo es de 1 - 500 µm, y el espaciamiento del electrodo es entre 1 - 500 µm. Las ventajas de esta fabricación y diseño son que (i) los electrodos de trabajo y de referencia pueden posicionarse de manera fácil y precisa cerca, en o justo detrás de la abertura del canal de separación donde la absorción y la interferencia del voltaje de electrofóresis son mínimas y donde la concentración del analito en la zona separada sigue siendo alta. Esta alineación precisa (mieras) es posible únicamente con un dispositivo microfabricado integrado. (ii) Los electrodos en el canal son muy pequeños en la dimensión de la electrofóresis. Esto tiene ventajas porque facilita la colocación de electrodos múltiples, Figura 18, en esencialmente (en comparación con el tamaño de la zona) el mismo punto en el canal. También tiene ventajas porque hemos observado que electrodos más anchos tienden a formar núcleos con las burbujas de la electrólisis, supuestamente porque muestrean más del gradiente del voltaje electroforético. Este efecto puede reducirse cubriendo el cuerpo del electrodo (no la punta) con una capa aisladora. Estos electrodos delgados pueden producirse únicamente a través de la fotolitografía en un dispositivo integrado. Por último, se desea tener una abertura del electrodo precisa y pequeña de tal forma que cada detector funcione de la misma forma y tenga una sensibilidad similar y volumen sondeado. La capacidad para fabricar una abertura pequeña producirá fondos bajos porque el volumen efectivo de la solución conductora y capacitiva entre el electrodo es pequeño. La capacidad de fabricar detectores con abertura pequeña también tiene ventajas porque permite la fabricación y detección de canales de separación angostos que requieren únicamente pequeñas cantidades de muestra y que tienen una resolución electroforética muy alta. Se observa que el canal se ensancha en el extremo justo después o en el punto de detección. Esto es importante porque evita que las primeras zonas en la separación se levanten del fondo como resultado de la difusión del analito de regreso a la zona del detector. Al tener un canal más grande fuera del detector para suministrar un volumen mayor, las primeras zonas se diluyen de manera efectiva por el volumen de solución mayor alrededor del electrodo de conteo, evitando de esta manera que se eleven del fondo para la detección de bandas subsecuentes . La sección ancha también tiene una resistencia baja debido a su gran sección transversal. Esto significa que la caída de voltaje desde el detector del electrodo de conteo será mucho menor reduciendo de esta manera adicionalmente los voltajes parásitos en el detector y la absorción en el fondo. Se apreciará que además del ensanchamiento del canal para suministrar un volumen mayor, la profundidad puede incrementarse . La separación de electrofóresis en la zona capilar de dos neurotransmisores, epinefrina y norepinefriña, se llevó a cabo utilizando una microplaqueta de CE con las dimensiones proporcionadas en los ejemplos anteriores, siguiendo en general los métodos delineados en Woolley y colaboradores (Wooley, A. T. ; Mathies, R. A. , Separaciones de Fragmentos de ADN a Velocidad Ultra Alta Utilizando Plaquetas de Electrofóresis con Disposición de Capilar Microfabricado, Procedimientos de la Academia Científica Nacional, EUA, 91, 11348-11352 (1994); Wooley, A. T.; Mathies, R. A., Secuenciamiento del ADN a Velocidad Ultra Alta Utilizando Plaquetas de Electrofóresis Capilar, Química Analítica, 67, 3676-3680, (1995)). Como solución tamponadora se utilizó una solución de 30 mM de ácido 2- (N-morfolino) etanosulfónico (MES) ajustado a un pH de 5.6 con NaOH y modificado con 20% (v/v) de 2-propanol. Las soluciones de reserva (10 µM) de epinefrina y norepinefriña (Sigma, St . Louis) fueron preparadas en 0.01 M de ácido perclórico. Las muestras se diluyeron en serie a la concentración deseada en la solución tamponadora de MES . Después de colocar la muestra en el depósito 3, las muestras se inyectaron aplicando 90 V/cm entre los depósitos 1 y 3 (Figura 3) durante 20 segundos y el volumen de inyección aproximado se calculó como 40 pL. Las separaciones se llevaron a cabo aplicando 45 V/cm entre los depósitos 2 y 4. Las corrientes de electrofóresis fueron por lo general de 0.3 µA. Se utilizó una computadora Macintosh equipada con un tablero de Entrada/Salida NB-MIO-16XL-18 de National Instruments para programar los voltajes, almacenar los datos y controlar el potenciostato de tres electrodos construido internamente. El electrodo de trabajo 22 se polarizó a +0.5 V en relación con el electrodo de referencia 21; el electrodo de conteo 23 se utilizó para completar el circuito. El potenciostato medía la corriente generada por las moléculas sometidas a reacciones redox a medida que migraban por la abertura entre los electrodos de referencia y de trabajo. Las corrientes pequeñas < 1 pA podían detectarse incluso en presencia de la corriente de electrofóresis DC mayor (0.3 µA) en los canales. Alternativamente, las corrientes pequeñas podían detectarse polarizando el electrodo de trabajo con un potencial AC (Smith, D. E.; Reinmuth, W. H. , Segunda Polarografía de Corriente Alterna Armónica con un Proceso de Electrodo Reversible, Química Analítica, 33, 482-485, (1961)). Posteriormente, podía utilizarse un amplificador sincronizado para distinguir la señal de la corriente de electrofóresis DC. Antes de los experimentos, los electrodos se limpiaron utilizando ÍM de H2S04 con un potencial de onda sinusoidal (Vp.p = 0.5V) aplicado a los electrodos durante 20 minutos. La Figura 11 muestra la separación de dos neurotransmisores, epinefrina y norepinefriña, realizada en la plaqueta de CE microfabricada con detección electroquímica integrada. La norepinefriña y la epinefrina se detectaron a 2.6 min. y 3.4 min., respectivamente, y los picos se resolvieron con la línea base. El tiempo de separación fue corto, aproximadamente de 3 minutos. Las Figuras 12A-12C presentan la inyección y la detección de 0.48 nM de epinefrina en tres tiempos consecutivos. La reproducibilidad de los tiempos de migración para estos recorridos es excelente. La reproducibilidad de la resistencia de la señal está dentro de un factor de 1.5, y la mayor parte de la variabilidad puede atribuirse a los residuos de las inyecciones posteriores . Además del uso de los electrodos de detección de película delgada, las conexiones de película delgada pueden realizarse desde la orilla de la plaqueta hasta los extremos de los canales de separación e inyección, 12 y 13. Esto permitiría posteriormente la inserción de la plaqueta 30 dentro del enchufe 31 (Figura 19) que proporciona una conexión eléctrica para la electrofóresis y la electrónica de la detección 32, por ejemplo, un procesador del tipo descrito anteriormente. El procesador puede utilizarse para controlar la inyección escalonada o de relleno de la muestra dentro del canal de separación y para aplicar los voltajes de electrofóresis al canal de separación. Además, el procesador puede aplicar voltajes al detector y analizar las corrientes de redox para proporcionar una pantalla o una impresión 33. Refiriéndonos a las Figuras 13 y 14, los conductores de la película delgada 36, 37 y 38 se muestran conectados a los extremos del canal de inyección y a un extremo del canal de detector o la columna. También se muestra una conexión de la película delgada 40 al otro extremo del canal. Los conductores de la película delgada terminan en la orilla 39 del substrato. Los conductores de la película delgada están colocados cuidadosamente en todos los depósitos de tal forma que queden alejados del extremo de los canales para que las burbujas de la hidrólisis provocadas por el flujo de la corriente en el conductor no entren al canal adyacente. Esto se ilustra en la Figura 14 para un extremo del canal de inyección. La plaqueta puede insertarse posteriormente dentro del enchufe para llevar a cabo el análisis de la muestra. Después de que los conductores de la película delgada se forman mediante fotolitografía y desintegración, la cubierta 14 se une al substrato espaciado desde el extremo para que los conductores puedan entrar en contacto. En otro ejemplo, los conductores de película delgada 36a, 37a, 38a y 40a pueden formarse en la parte inferior del substrato, Figuras 15-17, con el conductor a través de las conexiones 41 hasta el fondo de los canales grabados y espaciados desde los extremos del canal. La discriminación entre especies con potenciales de medias células diferentes, puede lograrse pasando por diferentes voltajes de polarización en el electrodo de trabajo o utilizando pares múltiples de electrodos de trabajo y de referencia 21-1, 21-2 y 21-3, y 22-1, 22-2 y 22-3 en voltajes polarizados múltiples como se muestra en la Figura 18. El diseño de otras plaquetas de electrofóresis capilar (CE) se presenta en las Figuras 20 y 21. Los capilares del canal de separación y el canal de inyección 46, 47 fueron microfabricados utilizando fotolitografía estándar, grabado químico húmedo y métodos de enlace térmico. La Figura 21 muestra el patrón del canal definido fotolitográficamente utilizado para reducir el efecto del campo eléctrico de separación en la detección electroquímica. El canal de separación ensanchado desde . 50 µm a 1000 µm justo antes del electrodo de trabajo 49; la resistencia disminuida del canal de salida redujo el campo eléctrico en la región de detección. Un electrodo de trabajo de película delgada de 10 µm de ancho 49 tenía conductores de película delgada doble 51 formados en ' la superficie del substrato y se extendían hacia abajo hasta la o.rüla del canal de salida para conectar los extremos del electrodo 49. El electrodo estaba espaciado a 30 µm dentro del canal de salida de 1 mm de ancho. La tecnología de la microfabricación tiene ventajas particulares para este diseño de plaqueta porque permite la colocación fácil, precisa y estable del electrodo de trabajo 49 en el canal de salida justo detrás del extremo del canal de separación. Tal como se explicó con respecto a la forma de realización de la Figura 10, el posicionamiento del electrodo de trabajo en el canal de salida desacopla el detector del voltaje de electrofóresis y elimina el problema de la electrólisis en el canal de separación. Un electrodo de referencia 53 se coloca en el orificio de acceso 52. Es obvio que este electrodo puede ser un electrodo de película delgada formado en la parte inferior o superior del canal de salida. Él espaciado entre el electrodo de trabajo 49 y el orificio de acceso 52 tiene un efecto substancial en el rendimiento del detector electroquímico integrado. Las Figuras 22 y 23 muestran el efecto de la distancia desde el orificio de acceso hasta el electrodo de trabajo en las separaciones. En la Figura 22, la orilla del orificio de acceso era de 600 µn desde el electrodo de trabajo y se muestran las separaciones de electrofóresis de la dopamina de 1 mM en 300, 350, 400 y 450 V. La inyección (90 segundos) se llevó a cabo aplicando -120V al depósito de desechos de la inyección mientras se mantenían todos los demás depósitos en el potencial puesto a tierra. La separación ocurrió cuando el voltaje de separación (Vs) se aplicó al depósito de alto voltaje, 0.75 Vs se aplicó a los depósitos de desechos de la inyección y la muestra, y el depósito de detección se mantuvo a tierra. Las muestras se disolvieron en la solución tamponadora de separación (25 mM de ácido 2- (N-morfolino) etanosulfónico, 1 mM Cl", pH 5.7) . La detección se realizó a +800 mV vs . el electrodo de referencia. En la Figura 23 la orilla del orificio de acceso era de 300 µm desde el electrodo de trabajo y se muestran las separaciones electroforéticas de lmM de dopamina a 600, 800, 1000 y 1200 V. Las condiciones de inyección y separación fueron las mismas que se describieron anteriormente . El la Figura 22 donde el espaciado era de 600 µm, el voltaje de separación (Vs) produjo más interferencia que en la Figura 23 donde el espaciado fue de únicamente 300 µm. Las separaciones de dopamina a 300 V (60 V/cm) en la plaqueta con un espaciado de 600 µm exhibieron una línea base plana. Al incrementar el Va en incrementos de 50 V a 450 V (90 V/cm) se dio como resultado una señal disminuida y una línea base inclinada. Para las plaquetas con el espaciado del orificio al electrodo de 300 µm, el efecto del Vs fue mucho menos pronunciado, permitiendo separaciones más rápidas a un Vs más alto, al incrementar el Vs en incrementos de 200 V se dio como resultado sólo cambios menores en la señal y la inclinación de la línea base hasta que el Vs alcanzó 1200 V (240 V/cm) . Este efecto del Vs en el fondo de la detección se debe probablemente a la diferencia entre el potencial en la solución tamponadora arriba del electrodo de trabajo (determinado por Vs) y el potencial programado en el electrodo de trabajo por el potenciostato. En base a los resultados, utilizamos una plaqueta con un espaciado del orificio al electrodo de 300 µm y un Vs = 800 V para experimentos subsecuentes. Para caracterizar estos dispositivos, primero llevamos a cabo las separaciones de electrofóresis de la zona capilar (Vs = 800 V) y la detección de neurotransmisores en una plaqueta de CE microfabricada con detección electroquímica integrada con las mismas condiciones que en la Figura 23. Los resultados se muestran en la Figura 24 donde las curvas representan las siguientes separaciones: A. Separación de 1 M de dopamina; B. Separación de 1 mM de epinefrina; C. Separación de 1 mM de catacol; y D. Separación de 330 µM de dopamina (1), epinefrina (2) y catacol (3) . La Figura E muestra la altura pico en las separaciones como una función de la concentración inyectada de dopamina (-_-) , epinefrina (X) y catacol (T) . Los puntos en el diagrama representan la señal media obtenida en 3 separaciones duplicadas. Los análisis se llevaron a cabo en canales sin recubrir para permitir el flujo electroosmótico . Los números de las placas teóricas en esta separación fueron de 21000, 17000 y 12000 para la dopamina, epinefrina y catacol, respectivamente. Las señal desde cada uno de los tres componentes como función de la concentración fue lineal en el rango de 10 a 1000 µM, como se muestra en la Figura 24E. Utilizando la desviación estándar de la señal (1.5 pA) desde 55-70 segundos en un recorrido en blanco, determinamos los límites de la detección (señal a ruido = 2) de 3.7 µM para la dopamina, 6.5 µM para la epinefrina y 12 µM para el catacol. El límite de detección de la dopamina en la columna, en base a un volumen de inyección calculado de 18 pL, fue de 66 attomoles, perfectamente dentro del rango esperado para la detección electroquímica en la CE. La aplicabilidad general de estas plaquetas de CE puede aumentarse desarrollando etiquetas activas electroquímicamente y detectando otras biomoléculas . Como primer paso en esta dirección, hemos desarrollado métodos para la separación y la detección del ADN en plaquetas de CE microfabricadas utilizando un enfoque de detección electroquímica indirecta (F. Foret y P. Bocek, Electrofóresis Avanzada, 3, 273 (1989)) con el reactivo de intercalación electroquímicamente activo, Fe (fen) (fen 1, 10-fenantrolina) . La corriente de fondo constante desde el Fe(fen)32+ libre en la solución tamponadora de separación disminuye cuando los complejos de Fe(fen)32+ del ADN migran a través de la región de detección, de tal forma que el paso del ADN es indicado por inclinaciones transitorias en la corriente de fondo. La Figura 25A muestra la separación de un digesto de restricción FX174 HaelII (1 ng/µL) , y la Figura 25B muestra la separación de una dilución de 1:200 de un producto PCR de Salmonella (sombreado) y 500 pg/µL del digesto de restricción FX174 ffaelll. El eje de la corriente ha sido invertido en las Figuras 25A y 25B para visualizar los electroferogramas con los picos apuntando hacia arriba. La inyección (20 segundos) se llevó a cabo aplicando +120 V al depósito de desechos de la inyección manteniendo al mismo tiempo el depósito de la muestra a tierra y con los otros dos depósitos flotando. La separación se llevó a cabo aplicando -800 V al depósito de alto voltaje manteniendo al mismo tiempo el depósito de la detección a tierra y con los otros dos depósitos flotando. La detección se realizó a +800 mV vs . el electrodo de referencia. La matriz de separación contenía 0.75% de hidroxietilcelulosa, 40 rriM de Tris-acetato, lmM de EDTA, lmM de Cl", y 1 µM de Fe(fen)32+, pH = 8.3. Las muestras de ADN se prepararon en 0.1 mM de Tris-Cl", 0.01 mM de EDTA, pH = 8.2. Las superficies del canal se derivaron con poliacrilamida lineal para suprimir el flujo electroosmótico. La Figura 25B demuestra además que estos microdispositivos tienen la sensibilidad y la resolución para medir los productos PCR; un amplicon de 159 bp de Salmonella se midió a 161 bp vs . los picos del FX174 HaelII. La inyección de 50 ng/µL de FX174 HaelII disueltos en una solución tamponadora de electrofóresis (bajo condiciones sin escalonamiento) produjo una señal de 190 pA para la banda de 603 bp. En base a un volumen de inyección de 125 pL calculado de nuestra longitud de relleno de inyección estimada de 330 µm, se inyectaron 700 fg (1.8 attomoles) del fragmento de 603 bp; por lo tanto, el límite de detección (señal a ruido = 2) fe de 28 zeptomoles para este fragmento. Estos resultados indican que las plaquetas de CE con detección electroquímica integrada pueden utilizarse para ensayos bioquímicos de alta sensibilidad que son competitivos con los métodos de detección de fluorescencia tradicionales. Además, el desarrollo de métodos de etiquetación directos y detectores electroquímicos de potencial múltiple deben permitir una detección electroquímica múltiple análoga a la detección de fluorescencia de longitud de onda múltiple . El desarrollo de diferentes etiquetas electroquímicas para la detección de analitos químicos y biológicos preparará el camino para una variedad de aplicaciones incluyendo el diagnóstico de cuidado de la salud y la detección de patógenos. Ahora que pueden microfabricarse dispositivos completos, mejorando la disposición y el empaque, incluso debe ser factible fabricar microprocesadores de análisis químico donde los circuitos de detección y de cómputo estén también integrados en la plaqueta. Con estas mejoras, los dispositivos de microanálisis integrados deben ser capaces de sondear firmas biológicas en una variedad de ubicaciones desafiantes, incluyendo incluso ambientes extraterrestres . Debe ser aparente que los diferentes electrodos del detector de película delgada y las conexiones de película delgada hacia el canal de inyección y de separación pueden fabricarse alternativamente en la cubierta protectora superior que entonces queda colocada con precisión con respecto a los canales. De esta manera, se ha suministrado un detector electroquímico integrado mejorado en una plaqueta de CE microfabricada. Esto abre camino a una variedad de analitos interesantes y útiles. Por ejemplo, la detección electroquímica en plaquetas de CE podría utilizarse para varios analitos que son activos en redox. Una plaqueta microfabricada y el detector electroquímico pueden utilizarse para el análisis remoto de sustancias peligrosas sin la necesidad de la intervención del operador. Esta invención es un paso importante hacia la integración completa del ADN y otros análisis en plaquetas microfabricadas .

Claims (16)

1. REIVINDICACIONES 1. Una plaqueta de electrofóresis en un capilar microfabricado del tipo que incluye un substrato con un canal de' separación alargado, medios para aplicar un voltaje de separación a lo largo del canal y electrodos para detectar moléculas a medida que migran a través de los electrodos, caracterizada porque la plaqueta de electrofóresis tiene por lo menos un electrodo de trabajo de película delgada que se extiende dentro del canal de separación mencionado en o cerca de un extremo del canal de separación mencionado; el electrodo de trabajo de película delgada mencionado está adaptado para detectar la corriente generada por las moléculas sometidas a una reacción de redox a medida que migran a través del electrodo de película delgada después de que han migrado por la longitud del canal; la porción del electrodo de película delgada mencionado se extiende dentro del canal mencionado, siendo éste angosto en la longitud del canal para reducir el voltaje de separación que sondea; y un electrodo de referencia espaciado desde el electrodo de trabajo para formar una región de detección entre ellos dentro del extremo del canal de electrofóresis o justo detrás del extremo.
2. 2. Una plaqueta de electrofóresis en un capilar microfabricado tal como se indica en la Reivindicación 1 en donde el electrodo de referencia es un electrodo de película delgada.
3. 3. Una plaqueta de electrofóresis en un capilar microfabricado tal como se indica en la Reivindicación 2 en donde los electrodos de película delgada son angostos en sus extremos y los extremos se extienden hacia afuera y están espaciados entre sí para formar una región de detección entre ellos dentro del extremo del canal de electrofóresis o justo detrás del extremo del mismo.
4. 4. Una plaqueta de electrofóresis en un capilar microfabricado tal como se indica en la Reivindicación 2 en donde el electrodo de trabajo de película delgada está cubierto con una película de aislamiento que se extiende hasta un punto cercano al extremo del electrodo.
5. 5. Una plaqueta de electrofóresis en un capilar microfabricado tal como se indica en la Reivindicación 2 en donde el canal mencionado tiene de 1-500 µm de ancho, el extremo angosto mencionado es de 1-500 µm de ancho y el espaciado entre el electrodo de película delgada y el electrodo de referencia es de 1-500 µm.
6. 6. Una plaqueta de electrofóresis en un capilar microfabricado tal como se indica en la Reivindicación 3 en donde el canal tiene de 1-2000 µm de ancho, los extremos angostos mencionados son de 1-2000 µm de ancho y el espaciado entre los extremos de los electrodos de película delgada es de 1-2000 µm.
7. 7. Una plaqueta de electrofóresis en un capilar microfabricado tal como se indica en la Reivindicación 1 ó 2 en donde el canal en uno de los extremos hace una transición a una porción de volumen mayor y el electrodo de trabajo de película delgada mencionado está colocado en o cerca de la transición al volumen mayor.
8. 8. Una plaqueta de electrofóresis en un capilar microfabricado tal como se indica en la Reivindicación 1 ó 2 que incluye una variedad de electrodos espaciados dispuestos cerca del extremo mencionado del canal mencionado para realizar una detección electroquímica potencial múltiple.
9. 9. Una plaqueta de electrofóresis en un capilar microfabricado tal como se indica en la Reivindicación 2 que incluye conductores de película delgada que se extienden desde los electrodos de película delgada mencionados hasta el borde de la plaqueta mencionada.
10. 10. Una plaqueta de electrofóresis en un capilar microfabricado tal como se indica en la Reivindicación 1 donde el electrodo de referencia mencionado está espaciado a 1-500 µm del electrodo de trabajo de película delgada.
11. 11. Una plaqueta de electrofóresis en un capilar microfabricado tal como se indica en la Reivindicación 1 donde el electrodo de referencia mencionado está espaciado a 1-2000 µm del electrodo de trabajo de película delgada.
12. 12. Una plaqueta de electrofóresis en un capilar microfabricado tal como se indica en la Reivindicación 7 en donde el canal hace una transición a una porción del canal de volumen mayor y el electrodo de película delgada mencionado está colocado a menos de 500 µm de la transición al volumen mayor.
13. 13. Una plaqueta de electrofóresis en un capilar microfabricado tal como se indica en la Reivindicación 1 ó 2 en donde el canal en uno de los extremos mencionados hace una transición a un volumen mayor y en donde el electrodo de película delgada está espaciado a menos de 500 µm de la transición al volumen mayor y el electrodo de referencia mencionado está dentro del volumen mayor mencionado.
14. 14. Una plaqueta de electrofóresis en un capilar microfabricado tal como se indica en la Reivindicación 13 en donde el electrodo de película delgada mencionado está dentro del volumen mayor.
15. 15. Una plaqueta de electrofóresís en un capilar microfabricado tal como se indica en la Reivindicación 14 en donde el electrodo de trabajo de película delgada mencionado está dentro de 500 µm de la transición.
16. 16. Una plaqueta de electrofóresis en un capilar microfabricado tal como se indica en la Reivindicación 14 en donde el electrodo de trabajo de película delgada mencionado está en el volumen mayor mencionado dentro de 2000 µm de la transición.