KR20000023600A - 유방암의 진단 및 치료를 위한 비알씨에이1 조성물 및 방법 - Google Patents

유방암의 진단 및 치료를 위한 비알씨에이1 조성물 및 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 유방암 및 관련 암의 진단 및 치료와 관련된 방법 및 조성물에 관한 것이다. 본 발명에는 생체내 및 실험관내에서 BRCA1 유전자 산물을 검출하기 위한 조성물 및 방법과 항-BRCA1 항체를 사용하여 세포내 BRCA1 단백질의 비정상적 국재화를 진단하는 방법이 기재되어 있다. 또한, 본 발명에는 BRCA1 유전자 산물의 세포 핵으로의 적절한 전위시 작용하는 BRCA1 관련 단백질의 확인 방법이 기재되어 있다.

Description

유방암의 진단 및 치료를 위한 비알씨에이1 조성물 및 방법{BRCA1 Compositions and methods for the diagnosis and treatment of breast cancer}
1. 발명의 배경
본 출원은 이의 전체 내용이 본원에 참조로서 구체적으로 혼입된, 1996년 7월 8일자 미국 특허원 제60/015,863호의 연속 출원이다. 미국 정부는 국립 암 연구소로부터의 인가번호 제DA57317호, 제CA58318호, 제P50-CA58183호 및 제O59-CA58183호에 따라 본 발명의 권리 일부를 가진다.
1.1 발명의 분야
본 발명은 일반적으로 분자생물학 분야에 관한 것이다. 더욱 특히, 본원의 특정한 양태는 유방암의 진단 및 치료를 위한 BRCA1 조성물 및 방법을 포함하는 방법 및 조성물에 관한 것이다. 각종 약리학적 및 면역학적 목적에 유용한 방법 및 조성물이 기술되어 있다.
1.2 관련 기술의 설명
1.2.1 유방암
유방암은 개발도상국의 여성에게서 가장 통상적으로 발병하는 치명적인 암이다. 유방암의 병인은 숙주의 생리학적 상태에 존재하는, 유전적, 호르몬성 및 식이 인자의 복합 상호작용이다. 유방 종양의 광범위한 유전적 분석은 당해 질환과 관련된 유전자의 발현중에 확인된 몇몇 변이체를 가진다. 분자 수준에서, 빈번히 관찰되는 유전자 증폭[참조: Escot et al., 1986, Lidereau et al., 1988, Slamon et al., 1987, van de Vijver et al., 1987, Varley et al., 1988]에 추가하여, 유방 종양의 성장은 변이가 하나 이상의 퇴행성 유전자를 차단하지 못하는 결과인 것으로 생각된다. 2개의 유전자 종류가 퇴행성 위치의 불활성화에 사용되고, 변이 대립형질의 동종접합체의 감소는 면역원성의 본질적인 단계인 것으로 제안되었다.
염색체 1q, 3p. 11p, 13q, 17p 및 17q를 포함하는, 사람 게놈의 6개의 상이한 영역에서 이형접합체의 손실(Loss of heterozygosity: LOH)은 1차 유방암에서 높은 비율로 관찰되고[참조: Ali et al., 1987, Chen et al., 1989, Devilee et al., 1990, Devilee et al., 1989, Lundberg et al., 1987, Mackay et al., 1988a, Mackay et al., 1988b, Futreal et al., 1992], 종양 조직에서의 이러한 대립형질 손실은 효능있는 종양 억제 유전자의 위치를 시사한다. 최근에, 염색체 17q상의 가계 유방암 및 난소암 유전자 BRCA1의 클로닝[참조: Miki et al., 1994]이 가져온 거대한 흥분은 산발성 유방암에서 유전자의 변이체를 발견하지 못함으로써 다소 진정되었다[참조: Futreal et al., 1994, Friedman et al., 1994, Shattuck-Eiders et al., 1995]. BRCA1은 45% 이상의 부위-특이적 유전성 유방암 및 80%의 여성 유방암 및 난소암과 관련되어 있으나[참조: Easton et al., 1993], 산발성 유방암은 BRCA1 변이체를 전혀 포함하지 않는 것으로 발견되었고 산발성 난소암의 약 10%만이 BRCA1 변이체를 포함하는 것으로 발견되었다[참조: Futreal et al., 1994, Hosking et al., 1995, Merajver et al., 1995].
따라서, 전체 유방암의 약 95%[참조: Claus et al., 1991]를 차지하는 산발성 유방암의 병인에 있어서 BRCA1의 작용은 의문이 제기되었다[참조: Vogelstein et al., 1994]. 이것은 변이체가 가계 및 산발성 암에서 발견되는, RB 및 p53과 같은 대부분의 다른 종양 억제제와 대조된다[참조: Bookstein and Lee, 1991, Levine et al., 1991].
종양 억제 유전자에 관한 확립된 개념과 반대되는 이들 발견의 한가지 설명은 BRCA1이 가계 유방암[참조: Boyd, 1995; Castilla et al., 1994] 및 이들의 부분집합에서만 불활성됨을 시사하는데, 이는 염색체 13q12-13상의 BRCA2를 포함하는 다른 유방암 유전자[참조: Wooster et al., 1994; 1995]가 상이한 유전적 위치로 맵핑되었기 때문이다. 암의 병원성은 다단계 과정이고, 또다른 경로가 결과적으로 동일하거나 유사한 결과를 유도할 수 있다. 전례에는 동일한 형태의 암에 대한 상이한 경로를 위해 빌름스 종양(Wilm's tumor) 및 유전성 신생 결장직장암에 존재한다는 것이다[참조: Vogelstein et al., 1994].
예를 들어, WT1 종양 억제 유전자의 대립형질 모두의 불활성화는 산발성 빌름스 종양이 아니라, 데니스-드래쉬 증후군(Denys-Drash syndrome)의 일부로서 발생하는 유전성 빌름스 종양의 실질적인 균형에 중요한 것으로 밝혀졌다[참조: Pelletier et al., 1991; Coppes et al., 1993]. 산발성 결장암이 아닌 가계 결장암에서 DNA 미스매취 회복 유전자의 불활성화에 대한 유사한 관찰은 msh2 변이에 의해 생성된 "변이체 표현형"에 의해 설명될 수 있다[참조: Cleaver, 1994; Vogelstein et al., 1994]. 그러나, msh2 변이체가 없어도, 종양원성에서의 유사한 단계는 비록 덜 빈번하거나 빠르지 않더라도 발생할 수 있다.
1.2.2. BRCA1의 역할
가계 유전암 및 난소암 유전자 BRCA1[참조: Miki et al., 1994]의 클로닝은 유전암 연구에서 획기적인 사건이었다. 그럼에도 불구하고, BRCA1이 45% 이상의 부위 특이적 유전성 유방암 및 유방암과 난소암을 갖는 80%의 유방암과 관련되었으나[참조: Easton et al., 1993], 산발성 유방암은 BRCA1 변이체를 전혀 포함하지 않는 것으로 발견되었고 산발성 난소암의 약 10%만이 BRCA1 변이체를 포함하는 것으로 발견되었다[참조: Miki et al., 1994; Futreal et al., 1994; Friedman et al., 1994; Shattuck-Eiders et al., 1995; Hosking et al., 1995, Merajver et al., 1995]. 따라서, 이와 같은 신생물의 약 95%를 차지하는 산발성 유방암의 병인성에서 BRCA1의 일반적인 작용[참조: Claus et al., 1991]은 오늘날까지 증명되지 않았다[참조: Boyd, 1995; Castilla et al. 1994].
BRCA1 상보성 유전자는 예상된 구조가 NH2-말단 및 산성 COOH-말단 도메인과 인접한 2개의 징크 핑거 도메인(zinc figer domain)을 포함하는 1863개 아미노산 단백질을 암호화하는데, 이는 BRCA1 단백질이 전사 인자일 것이라는 생각을 유도한다[참조: Miki et al., 1994; Vogelstein and Kinzler, 1994].
이의 분리[참조: Miki, et al., 1994]후 1년 6개월 경과하여, 유전성 유방암의 약 50%를 유발하는 사람 염색체 17q21상의 유전자는 수수께끼를 남겼다. BRCA1에서의 변이체가 유전성 유방암 및 난소암과 명백히 관련되었으나, 어떠한 산발성 유전자도 BRCA1 변이체를 포함하는 것으로 발견되지 않았고 산발성 난소암의 단지 10%만이 BRCA1 변이체를 포함하는 것으로 발견되었다[참조: Futreal et al., 1994; Hosking et al, 1995; Merajver et al., 1995]. 오히려, BRCA1은 특발성 암에서 핵내의 정상 위치에서 세포질로 잘못 위치하여 작용적으로 불활성화되는 것으로 제안되었다[참조: Chen et al., 1995]. 말단부착된 외인성 야생형 BRCA1이 유방암 세포주에서 유사하게 잘못 위치되기 때문에, 이에 기인하는 결점은 아마 핵에 대한 BRCA1의 해독에 요구되는 단백질내에 존재한다[참조: Chen et al., 1996].
BRCA1은 산성 잔기에 풍부한 N-말단 및 C-말단 단편에 인접한 RING 핑거의 존재에 기초하여 전사 인자인 것으로 생각되었다[참조: Miki et al., 1994]. 이것은 BRCA1의 보고된 핵 국재화와 일치한다. 그러나, BRCA1이 전사 인자라는 직접적인 증거는 아직까지 존재하지 않았다. 특정부 하이브리드화 데이터는 세포 성장 및 분화에 중요한 역할을 담당할 수 있음을 제시하였는데, 이는 성장하는 마우스 배 전체에서 특히 높은 활성으로 발현되는 것으로 일반적으로 생각되는 BRCA1 mRNA가 증식 및 분화가 빠른 조직과 상호관련되는 것으로 밝혀졌기 때문이다[참조: Lane et al., 1995; Marquis et al., 1995]. 이와 일치하여, 마우스에서 BRCA1의 동형접합체 결실은 초기 배아 형성에 치명적이다[참조: Gowen et al., 1996; Chia-Yang Liu et al.] 이러한 발견이 BRCA1의 효능있는 역할을 제시할지라도, 분자 수준에서 BRCA1 작용의 상세한 특성화는 시험관내의 작용을 검정하기 위한 잘 특성화된 항체 및 충분히 정제된 단백질의 부족으로 제한되었다. 따라서, BRCA1의 크기 및 세포 위치에 관한 문헌은 모순이 있어 왔다. 두 그룹은 BRCA1이 220kDa 핵 단백질인 것으로 제시하였으나[참조: Chen et al., 1995; Scully et al., 1996], 유사한 항체를 사용한 다른 그룹은 BRCA1이 190kDa 분리된 단백질인 것으로 제안하였다[참조: Gudas et al., 1995; Jensen et al., 1996].
1.2.3 유방암의 가계 유전
염색체 17q21상에 위치하는 BRCA1은 가계 유방암 및 난소암의 약 50%를 유발하는 것으로 광범위하게 생각되고 있다. 징크 핑거 모티브 및 산성 활성화 도메인의 존재에 기초하여, BRCA1은 전사 인자인 것으로 생각되었다[참조: Miki et al., 1994]. 그러나, 오늘날까지 유전자 활성화 또는 억제 작용을 보고한 문헌은 없었다. BRCA1은 세포 성장 및 분화에 중요한 역할을 담당할 수 있는데, 이는 이의 mRNA가 성장하는 배에서 광범위하게 발현되기 때문이며, 특히 세포가 신속히 증식 및 분화하고 있는 조직에서 발현되기 때문이다[참조: Lane et al., 1995; Marquis et al., 1995]. 2가지의 변형된 대립형질을 갖는 여성에 대한 보고 사례에도 불구하고[참조: Boyd et al., 1995], 마우스에서 BRCA1 유전자의 호모접합성 결핍은 초기 배형성에 치명적이다[참조: Gowan et al., 1996; Liu et al., 1996]. cdk2 키나제에 의한 발현 수준 및 포스포릴화는 세포 주기중에 조절된다[참조: Chen et al., 1996]. 일반적으로, 이 데이터는 세포 증식 및 분화의 조절에 있어서 BRCA1의 역할과 일치한다.
1.2.4 BRCA1의 종양 억제 작용
종양 억제 유전자로서, BRCA1의 변이체가 유전성 유방암 및 난소암과 명백히 관련되지만, 산발성 종양에서는 좀처럼 발견되지 않는다는 것은 역설적이다[참조: Miki et al., 1994; Futreal et al. 1994; Hosking et al., 1995]. 한가지 제안은 유전적으로 손상되지 않을지라도 BRCA1이 산발성 유전암 세포내의 핵에서 세포질성 보체로 잘못 위치하여 작용상 불활성화될 수 있다는 점이다[참조: Chen et al., 1995; 1996]. 그러나, 문제는 에피토프-말단부착된 외인성 야생형 BRCA1 단백질이 또한 2개 이상의 유방암 세포주에서 세포질성이기 때문에 핵 수송, 유지 또는 세포질 유폐(confinement)에 있다[참조: Chen et al., 1996].
BRCA1은 약 220kDa의 분자량을 갖기 때문에, 아마 핵 국재화 시그날 수용체와의 직접적인 작용 또는 다른 NLS-함유 단백질과의 간접적인 작용에 의해 세포질로부터 핵으로 활성적으로 이동하는 것으로 생각된다[참조: Hicks and Rikhel, 1995; Dingwall and Laskey, 1991]. 핵 공극 복합체를 통한 친핵성 단백질의 직접적인 유입은 에너지[참조: Newmeyer and Forbes, 1988; Richardson et al., 1988] 및 세포질성 수용체 복합체, 임포르틴-α 및 임포르틴-β가 결합[참조: Corlich et al., 1994; 1995]하는 수송 기질내에 위치하는 핵 국재화 서열(NLS)[참조: Dingwall et al., 1982; Kalderon et al., 1984]을 요구한다. GTP-결합 단백질, RNA는 핵 공극 복합체를 통해 기질-수용체 복합체의 에너지-의존성 전위를 매개한다[참조: Moore and Blobel, 1993]. 전위후, 임포르틴-β는 핵 엔벨로프의 내측면에 인접하여 복합체로부터 분리되는 반면, 임포르틴-α는 이의 작용 부위에 기질을 수반한다[참조: Golich et al., 1995].
본 발명자[참조: Chen et al., 1995; 1996] 및 기타 연구자[참조: Scully et al., 1996]가 보고한 핵 국재화와 반대로, BRCA1이 분비된 단백질임을 나타내는 공개된 문헌이 있다[참조: Jensen et al., 1996]. 단백질의 아세포 위치는 이들 작용의 본질적인 형태이기 때문에, 정상 세포 및 암세포에서 BRCA1의 위치에 관한 데이터를 확립하는 것이 중요하다. 보다 중요하게는, BRCA1의 아세포 격실화(compartemntation)가 또한 유방 종양원성에 대한 이의 역할과 관려하여 중요한 문제이다.
1.3 선행 기술의 결점
따라서, 선행 기술에서 부족한 것은 유방암의 진단 및 치료를 향상시키기 위한 신규한 방법 및 조성물이다. 또한, 부족한 것은 정상 및 의심스런 암성 세포에서 BRCA1 단백질의 아세포 국재화를 측정하는 방법 및 조성물이다. 또한, 세포 핵으로 BRCA1 유전자 산물의 정확한 국재화에 관여하는 특이적 BRCA1 관련된 단백질을 포함하는 방법 및 조성물이 요구되고 있다.
2. 발명의 요약
본 발명은 유방암의 진단 및 치료에 사용하기 위한 신규한 조성물 및 방법을 제공함으로써 선행 기술에 내재한 하나 이상의 이러한 과제 및 다른 과제를 극복한다.
한가지 양태에 있어서, 본 발명은 세포내에 BRCA1 단백질 또는 펩타이드를 국재화하는 방법을 제공한다. 이 방법은 일반적으로 면역 복합체를 형성시키기에 효과적인 조건하에 BRCA1 또는 BRCA1-관련된 단백질 또는 펩타이드에 특이적으로 결합하는 표지된 항체와 세포를 접촉시키는 단계; 및 세포에서 면역 복합체의 위치를 측정하는 단계를 포함한다. 이러한 복합체가 세포의 세포질내에 위치하는 경우에는 세포의 전이 또는 1차 암이 나타난다. 이러한 정보는 암, 특히 유방암 및 난소암을 초기에 검출하고 스크리닝하는데 유용한데, 본 발명자들은 BRCA1 단백질의 세포질 아세포 국재화와 상호관련됨을 밝혀냈다. 바람직하게는, 세포는 특히 사람의 유방암 또는 난소암 세포이다.
본 발명의 추가의 목적은 샘플내에서 유방암 또는 난소암 세포를 확인하는 방법이다. 당해 방법은 일반적으로 암에 걸린 것으로 의심이 가는 난소 또는 유방 종양 세포를 수득하는 단계 및 종양 세포에서 BRCA1 단백질 또는 펩타이드의 아세포 위치를 측정하는 단계를 포함한다. 상술된 바와 같이, 세포의 세포질로 BRCA1 단백질 또는 펩타이드의 아세포 국재화는 본 발명자들에 의해 암의 존재를 나타내는 것으로 입증되었다.
또한, 암에 대한 난소 또는 유방 세포의 감수성을 예상하는 방법을 제공한다. 당해 방법은 일반적으로 세포질내로 국재화된 BRCA1 또는 BRCA1-관련된 단백질 또는 펩타이드를 세포내에서 확인하는 단계를 포함하는데, 이때 세포질내에 단백질 또는 펩타이드의 존재는 암에 대한 세포의 감수성을 나타낸다.
2.1 핵산 조성물
본 발명은 BRCA1-관련된 단백질(BAP)를 암호화하는 핵산 서열을 제공한다. 본원에 사용된 바와 같이, BAP 유전자는 BRCA1-관련된 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 의미한다. BAP 유전자를 암호화하는 바람직한 핵산 서열은 서열 1의 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이다. BAP 암호화 유전자는 샘플마다 핵산 서열이 상이할 수 있으나, 핵산 서열의 변이는 엄격한 하이브리드화 조건하에 각 샘플의 BAP를 암호화하는 서열간의 하이브리드화를 방해하지 않을 것으로 예상된다.
본원에 사용된 바와 같이, BAP의 균주 변이체는 서열 1의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열과 엄격한 하이브리드화 조건하에 하이브리드화하는 핵산 서열에 의해 전체 또는 부분적으로 암호화된 모든 폴리펩타이드를 의미한다.
본 발명에 있어서, BAP는 또한 서열 1의 BAP 단백질에 대해 생성된 항체와 면역학적으로 반응성인 폴리펩타이드를 의미하는 것으로 이해된다.
마찬가지로, BRCA1은 BRCA1 및 BRCA1-유사 유전자 산물과 면역학적으로 반응성인 항체를 유도할 수 있는 폴리펩타이드를 의미하는 것으로 이해되며, BAP는 서열 1의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열에 의해 암호화된 BAP와 면역학적으로 반응성인 항체를 유도할 수 있는 폴리펩타이드를 의미하는 것으로 이해된다.
본원에 사용된 바와 같이, BAP의 활성 단편은 통상의 기술, 예를 들어 첨가, 결실, 또는 치환에 의해 변형되지만, 이의 활성 단편이 본원에 기술된 바와 같은 본 발명에 따른 BAP 항원성과 동일한 구조 및 작용을 실질적으로 나타내는 BAP를 포함한다.
BAP와 관련하여, 본 발명은 실질적으로 모든 세균 공급원으로부터 분리될 수 있고 전체 게놈성 DNA가 없으며 BAP-유사 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA 단편에 관한 것이다. BAP-유사 종을 암호화하는 DNA 단편은 단백질, 폴리펩타이드, 아단위, 작용 도메인 등을 암호화하는 것으로 증명할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "DNA 단편"은 특정한 종의 전체 게놈성 DNA가 없게 분리된 DNA 분자를 의미한다. 따라서, BAP를 암호화하는 DNA 단편은 BAP를 함유하는 DNA 단편을 의미하며, 암호화 서열은 또한 DNA 단편이 수득되는 종의 전체 게놈성 DNA가 없게 분리되거나 정제된다. 용어 "DNA 단편"에는 DNA 단편 및 이러한 단편의 소형 단편, 및 또한 예를 들어 플라스미드, 코스미드, 파지미드(phagemid), 파지, 바이러스 등을 포함하는 재조합 벡터가 포함된다.
유사하게는, 분리된 또는 정제된 BAP 유전자를 포함하는 DNA 단편은 BAP 암호화 서열 및, 특정한 양태에서 실질적으로 다른 천연 발생 유전자로부터 분리된 조절 서열 또는 단백질 암호화 서열을 포함하는 DNA 단편을 의미한다. 이러한 관점에서, 용어 "유전자"가 작용성 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드 암호화 단위로 언급하기 위해 사용된다. 본 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 자명한 바와 같이, 이러한 작용성 용어는 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 발현하거나 발현하는데 적용할 수 있는 게놈성 서열, 외부-게놈성 및 플라스미드-암호화된 서열 및 소형의 작제된 유전자 단편 모두를 포함한다. 이러한 단편은 천연적으로 분리되거나, 사람의 손으로 합성에 의해 변형될 수 있다.
"실질적으로 다른 암호화 서열로부터 분리된"은 목적하는 유전자, 이 경우에 BAP 암호화 유전자가 DNA 단편의 암호화 영역의 중요한 부분을 형성하고 DNA 단편이 대부분의 천연 발생 암호화 DNA, 예를 들어 큰 염색체 단편 또는 다른 작용성 유전자 또는 폴리펩타이드 암호화 영역을 함유하지 않는다는 것을 의미한다. 물론, 이것은 본래의 분리된 DNA 단편을 의미하고, 사람의 손에 의해 단편에 첨가된 유전자 또는 암호화 영역을 배제하지 않는다.
또한, 아미노산 및 핵산 서열은 추가의 N- 또는 C-말단 아미노산 또는 5' 또는 3' 서열과 같은 추가의 잔기를 포함할 수 있고, 또한 당해 서열이 단백질 발현이 관여하는 생물학적 단백질 활성의 유지를 포함하는 상술된 기준에 부합되는 한 본질적으로 본원에 기술된 서열중 하나에 기재된 바와 같을 수 있는 것으로 이해할 수 있다. 말단 서열의 첨가는 특히 예를 들어 암호화 영역의 5' 또는 3' 부분을 플랭킹하는 각종 비-암호화 서열을 포함하거나 각종 상부 또는 하부 조절 또는 구조 유전자를 포함할 수 있는 핵산 서열에 적용된다.
물론, 본 발명은 서열 1에 기술된 서열과 상보성 또는 본질적으로 상보성인 DNA 단편을 포함한다. "상보성" 핵산 서열은 왓슨-크릭 상보성 표준 법칙(Watson-Crick complementarity rules)에 따라 염기쌍을 형성할 수 잇는 서열이다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "상보성 서열"은 실질적으로 상보성인 핵산 서열을 의미하는데, 이는 상술된 바와 같은 동일한 뉴클레오타이드 비교에 의해 평가되거나 본원에 기술된 바와 같은 비교적 엄격한 조건하에 서열 1의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 단편과 하이브리드화할 수 있는 것으로 정의된다.
본 발명의 핵산 단편은 암호화 서열 자체의 길이와 무관하게 다른 DNA 서열, 예를 들어 프로모터, 폴리아데닐화 시그날, 추가의 제한 효소 부위, 대량 클로닝 부위, 기타 암호화 단편 등과 배합함으로써 이의 전체 길이를 상당히 변화시킬 수 있다. 따라서, 제조의 용이성 및 목적하는 재조합 DNA 프로토콜의 사용에 의해 바람직하게 제한되는 전체 길이에 따라 임의의 길이를 갖는 핵산 단편을 사용할 수 있는 것으로 생각된다. 예를 들면, 서열 1의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 단편과 동일하거나 상보성인 연속한 짧은 스트레치, 예를 들어 약 14개 뉴클레오타이드를 포함하고 길이가 약 10,000 또는 약 5,000개 염기쌍(일부 경우에는 약 3,000개의 단편이 바람직하다)인 핵산 단편을 제조할 수 있다. 전체 길이가 약 2,000, 약 1,000, 약 500, 약 200, 약 100 및 약 50개 염기쌍 길이(모든 중간체 길이를 포함함)인 DNA 단편이 유용할 것으로 생각된다.
이러한 맥락에서 용어 "중간체 길이"는 200-500; 500-1,000; 1,000-2,000; 2,000-3,000; 3,000-5,000; 5,000-10,000개 범위 이하의 모든 정수를 포함하고 약 12,001, 12,002, 13,001, 13,002 등의 서열을 포함하여, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 등; 21, 22, 23 등; 30, 31, 32 등; 50, 51, 52, 53 등; 100, 101, 102, 103 등; 150, 151, 152, 153 등과 같은 인용된 범위 사이의 모든 길이를 의미한다.
또한, 본 발명은 본원에 기술된 특정한 핵산 또는 아미노산 서열로 제한되지는 않는다. 따라서, 재조합 벡터 및 분리된 DNA 단편에는 BAP 암호화 영역 자체, 기본적인 암호화 영역에서 선택된 변형물 또는 변화물을 포함하는 암호화 영역을 다양하게 포함하거나, 이들은 BAP 암호화 영역을 포함하는 보다 큰 폴리펩타이드를 암호화하거나, 변이체 아미노산 서열을 갖는 생물학적으로 작용이 동일한 단백질 또는 펩타이드를 암호화할 수 있다.
경우에 따라, 예를 들어 BAP 암호화 영역이 정제 또는 면역화 목적과 같은 목적하는 작용을 갖는 다른 단백질 또는 펩타이드와 동일한 발현 단위내에서 정렬되는 경우, 융합 단백질 및 펩타이드(예를 들어, 각각 친화 크로마토그래피 및 효소 표지 암호화 영역에 의해 정제될 수 있는 단백질)를 제조할 수 있다.
재조합 벡터는 본 발명의 추가의 양태를 형성한다. 특히 유용한 벡터는, 전체 길이의 단백질 또는 보다 작은 펩타이드를 암호화하든지간에, DNA 단편의 암호화 부분이 프로모터의 조절하에 위치하는 벡터인 것으로 생각된다. 프로모터는 BAP 유전자와 천연적으로 결합된 프로모터의 형태일 수 있는데, 이는 본원에 기술된 조성물과 관련하여 예를 들어 재조합 클로닝 및/또는 PCRTM기술을 이용하여 암호화 단편의 상부에 위치한 5' 비-암호화 서열을 분리하여 수득할 수 있기 때문이다.
다른 양태에 있어서, 특정한 잇점이 재조합 또는 이종 프로모터의 조절하에 암호화 DNA 단편을 위치시켜 수득될 수 있을 것으로 생각된다. 본원에 사용된 바와 같이, 재조합 또는 이종 프로모터는 이의 천연 환경에서 BAP 유전자와 정상적으로 결합하지 않은 프로모터를 의미한다. 이러한 프로모터에는 다른 유전자와 정상적으로 결합된 BAP 프로모터, 및/또는 임의의 세균, 바이러스, 진핵생물 또는 포유동물 세포로부터 분리된 프로모터가 포함될 수 있다. 물론, 발현을 위해 선택된 세포 유형, 유기체, 또는 동물에서 DNA 단편의 발현을 효과적으로 유도하는 프로모터를 사용하는 것이 중요하다. 단백질 발현을 위한 프로모터 및 유형별 세포 배합물의 용도는 일반적으로 분자생물학 분야의 기술자에게 공지되어 있다[문헌참조: Sambrook et al., 1989]. 사용되는 프로모터는 비유도성이거나 유도성이며 적합한 조건하에서 사용되어 도입된 DNA 단편을 고농도로 발현시킴으로써 재조합 단백질 또는 펩타이드를 대량생산하는데 유리하다.
본 발명의 핵산 단편의 원핵 발현은 당해 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 수행될 수 있으며 tac, trp, lac, lacUV5 또는 T7로 제공되는 발현 벡터 및 프로모터 서열을 포함할 수 있다. 진핵세포에서 BAP, BAP형, BRCA1 또는 BRCA1형 단백질을 발현시키는 경우, 다수의 발현 시스템이 유용하고 당해 기술분야에 공지되어 있다. 고농도의 발현에 사용하기 위해 고려되는 예시적인 진핵 프로모터 시스템은 피치아(Phicha) 발현 벡터 시스템이다(Pharmacia LKB Biotechnology).
재조합 BAP, BRCA1 및/또는 관련된 펩타이드를 제조하기 위한 발현 양태와 관련하여 보다 긴 DNA 단편이 가장 바람직하게는 완전한 BAP 또는 BRCA1 또는 작용성 도메인, 에피토프, 리간드 결합 도메인, 서브유니트 등과 함께 흔히 사용될 수 있다고 사료된다. 그러나 항-BAP 또는 항-BRCA1 항체를 합성하기 위해 사용될 수 있는 바와 같이 BAP 또는 BRCA1 펩타이드 또는 에피토프성 코어 영역을 발현시키는 보다 짧은 DNA 단편의 사용이 또한 본 발명의 범위내에 속한다. 길이에 있어서 약 15 내지 약 100개의 아미노산, 보다 바람직하게는 약 15 내지 약 50개의 아미노산을 갖는 펩타이드 항원을 암호화하는 DNA 단편이 특히 유용한 것으로 사료된다.
또한 BAP 유전자 및 DNA 단편은 동물 또는 생성된 전이성 동물내에서 체세포 발현과 관련하여 사용될 수 있다. 또한 이러한 양태에서, 특히 완전한 길이 또는 BAP 활성 단백질을 발현시키는 재조합 벡터의 사용이 고려되고 있다. 특히 동물내 BAP 전이유전자의 발현이 수동적인 면역화 방법 및 특정 유방암의 치료에 사용하기 위한 항 BAP 항체를 제조하는데 유용한 것으로 고려되고 있다.
2.2 BAP 및 BRCA1의 재조합 발현
본원에 사용된 바와 같이 용어 "가공된" 또는 "재조합" 세포는 BAP 또는 BRCA1을 암호화하는 유전자와 같은 재조합 유전자가 도입된 세포를 언급한다. 따라서 가공된 세포는 재조합적으로 도입된 유전자를 포함하지 않는 천연 세포와는 구별된다. 따라서 가공된 세포는 인위적으로 도입된 유전자 또는 유전자들을 갖는 세포이다. 재조합적으로 도입된 유전자는 단일 구조 유전자, 구조 유전자 및 플랭킹 DNA를 포함하는 전체 게놈성 클론 또는 프로모터, 조절 성분, 또는 구조 유전자 그차제의 상부 및/또는 하부에 위치하는 유전자를 포함할 수 있는 오페론 또는 또 다른 작용성 핵산 단편 또는 흥미있는 특정 구조 유전자와 천연적으로 연합되지 않은 유전자 형태일 수 있다.
상기 유전자 하나 이상을 재조합체에 도입하는 경우 가공을 위해 선택된 세포 유형의 유전자를 효과적으로 발현시키는 프로모터의 조절하에 있도록 유전자를 도입시키는 것이 중요하다. 일반적으로 흥미있는 유전자를 지속적(일정하게)으로 발현시키는 프로모터를 사용하는 것이 요망된다. 보통 사용되는 비유도성 진핵 프로모터는 바이러스성 프로모터(예: 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, 라우스 살코마 롱-터미날 리피트(Rous sarcoma long-terminal repeat: LTR) 서열 또는 SV40 어얼리 유전자 프로모터)를 포함한다. 이들 비유도성 프로모터를 사용하여 도입된 유전자를 고농도로 일정하게 발현시킬 수 있다. 본 발명자가 흥미있는 도입된 유전자의 발현 농도가 상이한 클론 또는 상이한 균주 또는 세균으로부터 추출된 유전자에 따라 다양할 수 있다는 것을 인지하고 있다. 따라서, 특정 재조합 유전자의 발현 농도는 각각의 형질감염 실험으로부터 유도된 상이한 클론을 평가함으로써 선택될 수 있다. 일단 세포주가 선택되면 비유도성 프로모터가 목적하는 농도의 발현이 계속적으로 유지될 수 있도록 한다. 또한 가공에 사용되는 세포 유형에 특이적인 프로모터[예: 인슐린종 세포주의 인슐린 프로모터 또는 하수체 전엽 프로모터]를 사용할 수 있다.
본원에 기술된 재조합 GST-BRCA1△BglII 융합된 유전자는 부다페스트 조약하에 기탁번호 ATCC 98100의 이. 콜라이(E. Coli) DH5αTMF로 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁되었다.
2.3 면역검정 키트
추가의 양태에서, 본 발명은 면역검정 방법 및 이와 연합된 키트에 관한 것이다. 본 발명의 단백질 또는 펩타이드를 사용하여 이와 반응하는 항체를 검정하거나 본 발명에 따라 제조된 항체를 검정하고 BAP 또는 BRCA1 펩타이드를 검정할 수 있다. 또한 키트는 적합한 경우 항원 또는 항체 정제에 사용될 수 있다.
일반적으로 바람직한 면역 검정 방법은 BAP 또는 BRCA1-반응 항체를 포함하는 것으로 의심되는 샘플(예: 환자의 생물학적 샘플)을 수득하고 면역복합체(1차 면역복합체)를 형성시키는데 효과적인 조건하에서 샘플을 우선 BAP 또는 BRCA1 펩타이드와 접촉시킴을 포함한다. 형성되는 임의의 1차 면역복합체를 존재를 검정한다.
(1차)면역복합체를 형성시키는데 효과적인 조건하에서 BAP 또는 BRCA1 펩타이드와 선택된 샘플의 접촉은 일반적으로 단순히 단잭질 또는 펩타이드 조성물을 샘플에 첨가하는 것이다. 이어서 첨가된 항원이 면역 복합체를 형성하는 충분한 시간, 예를 들어 샘플내 존재하는 임의의 항체와 결합하는 충분한 시간동안 혼합물을 반응시킨다. 이후에, 일반적으로 조직 단편, ELISA 플레이트, 도트 블롯 또는 웨스턴 블롯과 같은 샘플 조성물을 세척하여 비특이적으로 결합된 항원 종을 제거하여 면역 복합체내에서 특이적으로 결합하는 종만을 검출한다.
면역복합체 형성 검정은 당해 기술분야에 공지되어 있고 당해 기술자에게 공지된 수많은 방법을 적용함으로써 성취된다. 1차 면역 복합체의 검정은 일반적으로 효소 태크(예: 알카린 포스파타제, 우레아제, 양고추냉이 퍼옥시다제 및 글루코즈 옥시다제)를 포함하여 방사능, 형광성, 생물학적 또는 효소적 표지와 같은 표지 또는 마커를 기초로한 것이다. 사용되는 특정 항원 그 자체를 검정될 수 있는 표지와 연결시킬 수 있으며 이것은 단순히 상기 표지를 검출하여 조성물에 존재하는 결합된 항원의 양을 결정하는 것이다.
또한, 1차 면역 복합체는 검출될 수 있는 표지와 연결되고 제 1 단백질 또는 펩타이드에 대해 결합 친화성을 갖는 제2 결합 리간드를 사용함으로써 검출될 수 있다. 2차 결합 리간드 그 자체는 흔히 2차 항체로 명명될 수 있는 항체이다. 1차 면역 면역 복합체를 2차 면역 복합체를 형성시키는데 충분한 시간동안 효과적인 조건하에서 표지된 2차 결합 리간드 또는 항체와 접촉시킨다. 일반적으로 2차 면역 복합체를 세척하여 비특이적으로 결합한 표지된 2차 항체를 제거하고 잔류하는 결합된 표지를 검출한다.
진단목적을 위해 실질적으로 흥미있는 항체를 포함하는 것으로 의심되는 임의의 샘플을 사용한다. 예시적인 샘플은 환자로부터 수득된 임상 샘플(예: 혈액 또는 혈청 샘플, 뇌척수액, 활액 또는 기관지 폐포액, 귀 면봉액, 객담, 중이액 또는 요 샘플)이 사용될 수 있다. 추가로 상기 양태는 하이브리도마 선별에 있어서 적정 항체 샘플과 같은 비임상적 샘플에 적용될 수 있다. 또한 임상적 샘플은 가축으로부터 유래될 수 있고 소, 양 및 염소와 같은 가축 동물을 포함할 수 있다. 고양이, 개 및 말 유래의 샘플은 본 원에 기술된 방법에 따라 사용될 수 있다.
관련된 양태에서, 본 발명은 샘플내 BAP 또는 BRCA1-특이적인 항체의 존재를 검출하는데 사용될 수 있는 키트를 제조하는 것이다. 통상 말하자면, 본 발명에 따른 키트는 면역 검출시약과 함께 적합한 단백질 또는 펩타이드 및 단백질 또는 펩타이드 및 시약을 접촉시키는 장치를 포함한다.
면역검출 시약은 전형적으로 BAP 또는 BRCA1 펩타이드와 연합된 표지 또는 2차 결합 리간드와 연합된 표지를 포함한다. 예시적인 리간드는 제1 BAP 또는 BRCA1 펩타이드 또는 항체에 대한 2차 항체 또는 연합된 표지를 갖는 바이오틴 또는 아비딘(또는 스트렙트아비딘)을 포함할 수 있다. 사람 항체에 대해 결합 친화성을 갖는 항체에 연결된 검출가능한 표지는 제1 시약이 사람 샘플로부터 반응성 항체와 결합하는데 사용되는 BAP 또는 BRCA1 펩타이드인 프로토콜을 위해 고려될 수 있다. 물론 상기한 바와 같이 다수의 예시적인 표지가 당해분야에 공지되어 있고 모든 상기 표지는 본 발명과 연계되어 사용될 수 있다. 키트는 완전히 결합된 형태, 중간체 형태 또는 키트의 사용자에 의해 결합될 분리된 잔기로서 항원 또는 항체-표지 결합체를 포함할 수 있다.
용기 장치는 일반적으로 하나 이상의 바이알, 시험 튜브, 플라스크, 유리병, 주사기 또는 또 다른 용기(항원이 위치하고 바람직하게 적당히 할당됨) 장치를 포함한다. 제2 결합 리간드가 제공되는 경우 키트는 또한 일반적으로 제2 바이알 또는 리간드 또는 항체가 위치할 수 있는 또 다른 용기를 포함한다. 본 발명의 키트는 또한 전형적으로 상업적 규모로 폐쇄된 공간에 바이알을 포함하는 장치, 예를 들어, 목적하는 바이알이 유지되는 주사 또는 블로우 성형된 플라스틱 용기를 포함한다.
BRCA1(αBRCA1Bgl)에 대한 mAbs를 생산하는, 본원에 기술된 하이브리도마 BRCA16B4는 부다페스트 조약하에 기탁번호 ATCC HB-12146로 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁되었다. 상기 항체의 이소타입은 IgG1,κ이다. 본 발명에 유용한 것으로 간주되는 BRCA1에 특이적인 또 다른 항체는 섹션 5에 상세히 기술된 αBRCA1N 및 αBRCA1을 포함한다.
2.11 백신 제형 및 조성물
B 세포 및/또는 T 세포 반응의 자극을 개선시키거나 변형시킬 수 있는 또 다른 부형제, 담체 또는 희석제와 함께 혼합된 면역학적 유효량의 BRCA1 또는 BRCA1 연합된 단백질 또는 상기 혼합물의 안정성을 촉진시키는 면역학적 불활성 염, 유기산 및 염기, 탄수화물등을 포함하는 약제학적으로 허용되는 조성물로 사람 또는 동물에게 BRCA1 또는 BRCA1 연합된 단백질을 투여하는 것이 바람직할 것으로 예상된다. 흔히 보조제로서 언급되는 면역자극성 부형제는 알루미늄염(흔히 알룸으로서 언급됨), 단순하거나 복잡한 지방산 및 스테롤 화합물, 생리학적으로 허용되는 오일, 중합체성 탄수화물, 화학적으로 또는 유전학적으로 변형된 단백질 독소 및 다양하게 입자화되거나 유화된 이의 배합물을 포함할 수 있다. BRCA1-유래 펩타이드, 또는 하나 이상의 BAP를 이들 혼합물내에 제형화될 수 있고 하나 이상이 존재하는 경우 각각의 변형물은 투여당 약 0.0001 내지 1.0 mg 또는 보다 바람직하게 0.001 내지 0.1mg, 또는 더욱 바람직하게 0.1mg이하로 포함하는 것으로 예상된다.
또한 약화된 미생물이 가공되어 재조합 BRCA1 유전자 산물 또는 BRCA1 연합된 단백질을 발현할 수 있고 그 자체가 본 발명을 위한 전달 비히클이 될 수 있는 것으로 사료된다. 약화된 미생물종, 예를 들어, 마이코박테리움(Mycobacterium) 및 특히 엠. 보비스(M. bovis), 엠, 스메그마티스(M. smegmatis) 또는 BCG가 특히 바람직하다. 또한 프로스, 폴리오, 아데노 및 또 다른 바이러스 및 세균[예: 살모넬라(Salmonella) 또는 쉬겔라(Shigella)종]이 본 원에 기술된 방법 및 조성물과 연계하여 사용될 수 있다.
흔히 유전학적 면역화로서 언급되는 네이키드(naked) DNA 기술은 감염 미생물로부터 보호하기 위해 적합한 것으로 밝혀졌다. 상기 DNA 단편은 네이키드 DNA 및 플라스미드 DNA을 포함한 다양한 형태로 사용될 수 있고 비경구, 점막 및 소위 마이크로프로젝틸(microprojectile) 기초 "유전자-건(gene-gun)" 접종을 포함하는 다양한 방법으로 투여될 수 있다. 상기 면역화 기술에서 본 발명의 BRCA1 또는 BAP 유전자 핵산 조성물의 사용은 상기 단백질에 대한 항체의 제형에 유용한 것으로 제안되었다.
당해 기술분야의 기술자는 백신화 섭생의 적절한 투여 스케줄이 많게는 5 내지 6회, 바람직하게는 3 내지 5회, 또는 심지어 보다 바람직하게 1 내지 3회에 걸쳐 적게는 2 내지 4주 또는 길게는 5년 내지 10년, 때로는 보다 긴 간격으로 면역원을 투여할 수 있다는 것을 인지하고 있다.
2.12 형질전환된 숙주 세포 및 재조합 벡터
본 발명의 특정 양태는 재조합 펩타이드 및 천연 또는 부위 특이적으로 돌연변이된 BRCA1 또는 BRCA1-연합된 단백질 에피토프를 포함하는 특정 펩타이드 에피토프의 클로닝 및 발현을 위한 플라스미드 벡터의 용도에 관한 것이다. 재조합 벡터의 작제, 숙주 세포의 형질전환 및 재조합 단백질의 발현은 당해 기술분야에 널리 공지되어 있다. 원핵 숙주는 본 발명의 펩타이드 조성물의 발현을 위해 바람직하다. 바람직한 원색 숙주의 예는 이. 콜라이 및 특히 이. 콜라이 균주 ATCC 69791, BL21(DE3), JM101, XL1-BlueR, RR1, LE392, B, P1176(ATCC 31537) 및 W3110(F-, λ-, 프로토트로픽, ATCC273325)이다. 또한 또 다른 엔테로박테리아세애(Enterobacteriaceae)종[예: 살모넬라 타이피무리움(Salmonella typhimurium) 및 세라티아 마르세스센스(Serratia marcescens)]종 또는 다양한 슈도모나스(Pseudomonas)종을 포함하는 또 다른 그람 음성 숙주가 본원에 기술된 유전학적 작제물을 재조합 발현시키기 위해 사용될 수 있다.
일반적으로 숙주 세포와 혼입할 수 있는 종으로부터 유래된 레프리콘 및 조절 서열을 포함하는 플라스미드 벡터가 이들 숙주와 연계하여 사용될 수 있다. 통상적으로 벡터는 복제 부위를 함유하고 형질전환된 세포의 표현형 선별을 제공할 수 있는 마커 서열을 함유한다. 예를 들어, 이. 콜라이는 전형적으로 pBR322 또는 이의 변형체중 하나[문헌: Bolivar et al., 1977]와 같은 벡터를 사용하여 형질전환될 수 있다. pBR322는 앰피실린 및 테트라사이클린 저항성을 나타내는 유전자를 포함하며 형질전환된 세포를 확인하기 위해 용이한 수단을 제공한다. pBR322, 이의 변형체 또는 또 다른 미생물 플라스미드 또는 박테리오파지는 또한 내생 단백질의 발현을 위해 미생물에 의해 사용될 수 있는 프로모터를 함유하거나 함유되도록 변형될 수 있다.
추가로, 숙주 미생물과 혼입할 수 있는 레프리콘 및 대조구 서열을 포함하는 파지 벡터는 이들 숙주와 연계하여 형질전환 벡터로서 사용될 수 있다. 예를 들어, λGEMTM-11과 같은 박테리오파지를 사용하여 이. 콜라이 LE392와 같은 민감한 숙주 세포를 형질전환시키는데 사용될 수 있는 재조합 벡터를 작제할 수 있다.
재조합 DNA 작제물에 가장 널리 사용되는 프로모터는 β-락타마제(페니실린아제) 및 락토즈 프로모터 시스템[문헌참조: Chang et al., 1978; Itakura et al., 1977; Goeddel et al., 1979] 또는 트립토판(trp) 프로모터 시스템(문헌참조: Goeddel et al., 1980)을 포함한다. 재조합 및 천연 프로모터의 사용은 당해 기술자에게 널리 공지되어 있고 기술자가 본 발명의 조성물을 제조할 목적으로 특정 재조합 벡터 및 발현 시스템을 작제할 수 있도록 공개되어 있다.
추가로, 원핵에서의 바람직한 양태의 발현 뿐만아니라 효모와 같은 진핵 미생물이 본원에 기술된 방법과 연계하여 사용될 수 있다. 다수의 다른 종이 진핵 발현 시스템을 위해 사용될 수 있다 할지라도 진핵 미생물중에서 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 또는 일반적인 베이커(baker) 효모가 가장 일반적으로 사용된다. 사카로마이세스에서 발현시키기 위해 예를 들어, 플라스미드 YRp7이 보통 사용된다[문헌참조: Stinchcomb et al., 1979; Kingsman et al., 1979; Tschemper et al., 1980]. 상기 플라스미드는 트립토판으로 성장할 능력이 결실된 효모의 돌연변이 균주[예: ATCC No. 44076 또는 PEP4-1(Jones, 1977)]에 대한 선택 마커를 제공하는 trpL 유전자를 포함한다. 효모 숙주 세포 게놈의 특징으로서 trpL 부위의 존재는 트립토판 부재하에서 성장하는 형질전환체를 검출하기 위해 유효한 환경을 제공한다.
효모 벡터에서 적합한 프로모터 서열은 3-포스포글리세레이트 키나제(참조: Hitzeman et al.,1980) 또는 또 다른 글루코즈 분해 효소(참조: Hess et al., 1968; Holland et al., 1978)(예: 에놀라제, 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 데카복실라제, 포스포프럭토키나제, 글루코즈-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나제, 트리오즈포스페이트 이소머라제, 포스포글루코즈 이소머라제 및 글루코키나제)에 대한 프로모터를 포함한다. 적합한 발현 플라스미드를 작제하는데 이들 유전자와 연합된 종결 서열이 또한 발현 벡터 3'에 연결되어 mRNA을 폴리아데닐화를 제공하도록 발현되고 종결을 유도한다. 증식 조건에 의해 조절되는 전사에 있어서 추가의 잇점을 갖는 또 다른 프로모터는 알콜 데하이드로게나제 2, 이소시토크롬 C, 산 포스파타제, 질소 대사와 연관된 분해 효소 및 상기 언급한 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제 및 말토즈 및 갈락토즈 이용에 관여하는 효소의 프로모터 영역이다. 효모 혼입할 수 있는 프로모터, 복제 오리진 및 종결 서열을 포함하는 임의의 플라스미드 벡터가 적합하다.
미생물 뿐만 아니라 다세포 미생물로부터 유래된 세포 배양물이 기술된 방법에서 숙주로서 사용될 수 있다. 원칙적으로, 임의의 상기 세포 배양물은 척추동물 또는 무척추동물로부터 유래된 것일 수 있다. 그러나 척추동물세포가 가장 큰 관심이 되고 있으며 배양물(조직 배양물)내 척추동물 세포의 증식이 최근해에 일상적인 방법이 되고 있다. 상기 유용한 숙주 세포주의 예는 VERO 및 Hella 세포, 중국 햄스터 난세포(CHO)주 및 W138, BHK, COS-7,293 및 MDCK 세포이다. 상기 세포에 대한 발현 벡터는 필요한 경우 복제 오리진, 발현될 유전자의 전방에 위치한 프로모터와 함께 필수 리보솜 결합 부위, RNA 스플라이싱 부위, 폴리아데닐화 부위 및 전사 종결 서열을 포함한다.
포유동물 세포에 사용하기 위해 발현 벡터상의 조절 기능을 위해 흔히 바이러스 물질이 제공된다. 예를 들어, 통상적으로 사용되는 프로모터는 폴리오마, 아데노바이러스 2 및 가장 흔한 시미안 바이러스 40(SV 40)로부터 유래된 것이다. SV40 바이러스의 어얼리 및 레이트 프로모터(early and late promotor)는 모두가 SV40 바이러스성 복제 오리진을 포함하기 때문에 특히 유용하다[참조: Fiers et al., 1978]. 바이러스성 복제 오리진에 위치한 Bg/I 부위를 향한 HindIII로부터 연장된 약 250bp 염기쌍 서열이 포함되는 경우 보다 작거나 보다 큰 SV40 단편이 또한 사용될 수 있다. 추가로, 또한 상기 조절 서열이 숙주 세포 시스템과 혼입할 수 있는 경우 목적하는 유전자 서열과 통상적으로 연합된 프로모터 또는 조절 서열을 사용하는 것이 바람직하다.
복제 오리진은 SV40 또는 또 다른 바이러스원(예: 폴리오마, 아데노, VSV, BPV)으로부터 유래되는 바와 같은 외생 오리진을 포함하도록 작제하거나 숙주 세포 염색체 복제 메카니즘에 의해 제공될 수 있다. 벡터가 숙주 세포 염색체와 통합되는 경우 후자는 충분하다.
추가로 SDS/PAGE 겔 분석에서 통상적으로 사용되는 쿠마시 브릴리안트 블루 염색 방법의 검출 한계 이하의 양으로 존재할 수 있거나 이의 존재가 유사한 분자량의 불활성 폴리펩타이드에 의해 마스크될 수 있다는 것이 이해될 수 있다. 본 발명의 통상적인 수행에 필요한 것은 아니지만 또 다른 검출 기술이 흥미로운 특정 폴리펩타이드를 가시화하는데 사용될 수 있는 것으로 사료된다. 면역학을 기본으로하는 기술(예: 본원에 기술된 효소적으로-, 방사능 표지- 또는 형광성 태크된 항체)이 특히 이러한 관점에서 사용될 수 있다고 사료된다. 또한 본 발명의 펩타이드는 1차 항체에 대해 친화성을 갖는 2차 항체와 배합된 본 발명의 항체를 사용함으로써 검출될 수 있다. 이러한 2차 항체는 효소적으로- 또는 방사능 표지된 또는 형광적으로- 또는 콜로이드성 골드-태크될 수 있다. 상기 2단계 2차 항체 기술의 표지화 및 검출을 위한 수단은 당해 기술분야에 널리 공지되어 있다.
도면은 본 명세서의 일부를 구성하고 추가로 본 발명의 특정 일면을 입증하는데 포함된다. 본 발명은 본원에 제공된 특정 양태의 상세한 설명과 함께 하나 이상의 이들 도면을 참조함으로써 보다 잘 이해될 수 있다.
도 1A. 완전한 길이의 BRCA1 cDNA를 작제하는데 사용되는 3개의 오버래핑 cDNA를 나타내는 도식. GST 융합 단백질을 제조하는데 사용되는 BRCA1 cDNA의 3개의 영역이 또한 명시된다.
도 1B. 사람 세포내 220kDa 단백질로서 BRCA1의 확인.35S-메티오닌 표지된 전체 세포 추출물(1 x 107세포/레인)을 과량의 예비면역된 혈청(레인 1) 또는 항-BRCA1 폴리클로날 항체(레인 2 내지 7)로 면역침전시킨다. 레인 2, 4 및 6: 일단계 면역 침전물. 레인 3, 5 및 7: 이중 면역첨전. 회색 화살촉: 잠재적인 동시 침전된 단백질.
도 2A. 시험관내 해독된 BRCA1과 HBL100 세포의 BRCA1의 이동상의 비교. 레인 1, 2: 항-BRCA1과 침전된 HBL100 세포(1 x 107/레인) 유래의 BRCA1. 레인 2에서 추출물을 면역침전 하기전에 CIP로 처리한다. 레인 3, 4 및 5: 3개의 항혈청으로 면역침전된 시험관내 해독된 BRCA1(1/20번째의 총 산물).
도 2B. 바큘로바이러스 유래 BRCA1과 HBL100 세포의 BRCA1의 이동상의 비교. 레인 1, 2: HBL100 세포(0.5 x 106/레인). 레인 3: 감염되지 않은 SF9 세포. 레인 4 내지 7: 감염된 SF 9 세포. 레인 1 및 4: 예비면역 혈청과 면역 침전됨. 레인 2, 3 및 5: 항-BRCA1과 면역침전됨. 레인 6: 항-BRCA1Bgl과 면역침전됨. 레인 7: 항-BRCA1N과 면역침전됨. 면역 침전물은 웨스턴 블롯팅에 의해 검출되고 항-BRCA1 모노클로날 MAb 6B4을 사용하여 프로브됨.
도 3A. BRCA1 발현 및 포스포릴화는 세포 주기 의존적이다. 동조배양된 T24 세포의 추출물을 분액화시키고 SDS-PAGE로 분리하며 웨스턴 블롯팅하고 하기와 같이 프로브화한다. 상부 패널: 항 BRCA1 항혈청을 사용하는 BRCA1에 대해 프로브되는 1 x 107세포/레인. 중간 패널: MAb 11D7을 사용하는 p110RB에 대해 프로브되는 1 x 106세포/레인. 하부 패널: 항-N5-3을 사용한 p84에 대해 프로브된 5 x 105세포/레인. 레인 1(U) 동조배양되지 않은 세포; 레인 2(G1) 1시간후 방출; 레인 5(G24) 24시간후 방출; 레인 6(G33) 33시간후 방출; 노코다졸(8시간동안 0.4㎍/ml)로 처리된 레인 7(M) 세포.
도 3B. BRCA1 발현 및 포스포릴화는 세포 주기 의존적이다. BRCA1의 포스포릴화. 상기 기술한 바와 같은 동조배양된 T24 세포(2 x 106/레인)를 포스페이트 비함유 배지에서 4시간동안 300 uCi32P 오르토-포스페이트로 펄스시키고 용균 완충액에 수거하고 항 BRCA1으로 면역침전시킨다. 레인 8; 예비면역 혈청과의 면역침전. 레인 9 내지 14; 항 BRCA1과 면역침전. 상기 도면에서 상부 및 하부 패널은 동일한 겔의 상이한 노출이다.
도 3C. BRCA1 발현 및 포스포릴화는 세포 주기 의존적이다. 검정되는 시간에 동조배양된 세포의 FACS 검정은 세포 주기의 다양한 단계에서 세포의 분포를 나타낸다.
도 3D, 도 3E, 도 3F, 도 3G, 도 3H, 도 3I, 도 3J, 도 3K, 도 3L, 도 3M, 도 3N, 도 3O. BRCA1 발현 및 포스포릴화는 세포 주기 의존적이다. 세포 주기 진행동안에 BRCA1에 대한 면역형광 염색. 도 3D, 도 3F, 도 3H, 도 3J, 도 3L, 도 3N: DNA에 대한 DAPI 염색. 도 3E, 도 3G, 도 3I, 도 3K, 도 3M, 도 30: 1차로서 항-BRCA1 항체 및 2차로서 FITC 결합된 양-항-마우스 항체를 사용하는 BRCA1에 대한 간접적인 면역형광염색. 도 3D, 도 3E: 11시간후 방출(G11); 도 3F, 도 3G: 24시간후 방출(G24); 도 3H, 도 3I: 33시간후 방출(G33); 도 3J, 도 3K: 중기; 도 3L, 도 3M: 말기; 도 3N, 도3O; 세포 재진입 G1.
도 4. 다양한 사이클린 의존적 키나제에 의한 BRCA1의 포스포릴화. HBL100 세포의 추출물을 도시된 바와 같이 다양한 항-사이클린/사이클린-의존적 키나제 항체로 침전시킨다. 침전물을 [γ-32P]ATP의 존재하에 키나제 완충액중에서 반응시킴에 이어서 세척하고 분해시킨다. 수득한 상등액을 항-BRCA1을 사용하여 재침전시키고 SDS-PAGE로 분리하고 겔을 건조시키며 자동방사선 사진을 찍는다.
도 5A. BRCA1의 확인. 이배체 사람 유방 상피 세포(HBL100, 약 1 x 107세포/레인)를35S-메티오닌(레인 1 내지 6)[32P]인산(레인 7 및 8)과 반응시킨다. 용균물로부터 단백질을 과량의 예비면역된 마우스 혈청(레인 1, 4 및 8) 또는 마우스 폴리클로날 항-BRCA1(레인 2)으로 면역침전시키고 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분리하고 자동방사선 사진을 찍는다. 화살촉은 항-BRCA1 혈청으로 동시 면역침전되는 단백질을 나타낸다. 면역침전된 단백질을 항 BRCA1으로부터 분리시키고 다시 동일한 과량의 항체로 면역침전시켜 단지 BRCA1(레인 3)을 가시화한다. 동일한 단백질을 2개의 상이한 항체, 항-BRCA1(레인 5) 및 C 20(레인 6)으로 면역침전시킨다. [32P]포스페이트로 라벨된 하나의 단백질 종이 또한 항-BRCA1(레인 7)으로 면역침전되지만 예비면역 혈청(레인 8)으로는 침전되지 않는다.
도 5B. 정상적인 유방 상피 세포 및 유방암 세포주에서의 완전한 길이의 BRCA1의 검출. 확립된 세포주를 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션으로부터 수득한다. 흉막 삼출액의 악성 세포를 환자로부터 분리한 즉시 50:50의 햄스 F-12-둘베코 이글스 변형 배지(DMEM)로 세척하고 계대배양 없이 동일한 배지 및 50% 태아 소 혈청(FCS) 및 10% 디메틸 설폭사이드중에서 액체 질소중에 동결시킨다. 면역 염색을 위해 고정시키기 전에 세포를 세척하고 햄스 F-12-DMEM 및 10% FCS에서 12시간동안 플레이팅한다. 확립된 세포주에 대해 기술된 바와 같이 생존세포가 고정되는 글래스 커버 슬립상으로 사이토스펀(cytospun)시킨다. 사람 유방 세포주(5 x 106세포/레인)를 [32P]인산으로 표지시킨다. 레인 1, 예비 면역 마우스 혈청에 의해 면역 침전된 HBL100 용균물. 항-BRCA1에 의해 면역침전된 레인 2 내지 11의 세포 용균물: 레인 2, T47D; 레인 3. MCF7; 레인 4, MB468; 레인 5, MB175-7; 레인 6, MB-361; 레인 7 MB-231; 레인 8. MB-435S; 레인 9, MB415; 레인 10, HS578T; 및 레인 11, HBL100. 본 발명가의 종양 뱅크내에서 무작위로 선별되고 포르말린 고정되며 파라핀 봉매된 유방암 생검의 5㎛ 두께의 단편을 아비딘-바이오틴 고추냉이 퍼옥시다제 복합체(ABC)의 변형된 방법[참조: Hsu et al., 1981]으로 면역염색시킨다. 항-BRCA1을 1:100의 희석비로 사용한다. BRCA1에 대해 어떠한 세포질 또는 핵 면역염색을 나타내지 않는 침투성 유방암의 2가지 경우가 핵 증식 항원 MiB1에 대해 양성 면역 염색을 나타낸다.
도 5C. 완전한 길이의 BRCA1을 유방과는 다른 조직으로부터 유래된 종양 세포주에서 발현시킨다. 사람 세포주(~2 x 106/레인)를 대사적으로35S-메티오닌으로 표지시킨다. 하나의 용균물을 예비면역 혈청(레인 1)으로 면역침전시키고 나머지를 항-BRCA1(레인 2 내지 12)으로 면역침전시킨다. 세포주: 레인 1 및 2, T24[방광의 전이 세포 암종(TCC)]; 레인 3, 5637(TCC 방광); 레인 4, DU145(전립선 암종); 레인 5, CAOV3(난소 암종); 레인 6, RD(횡문근육종), 레인 7, HCT116(결장 암종); 레인, SW620(결장 암종); 레인 9, C411(경관 암종); 레인 10, MS751(경관 암종), 레인 11, SAOS-2(골육종); 및 레인 12, U2OS(골육종).
도 6A. 정상 유방 세포 및 유방암 세포에서의 BRCA1의 국재화. HBL100 세포의 분획화. 세포(1.5 x 107)를35S-메티오닌으로 표지시킨다; 5 x 106세포를 분획화시키지 않고(전체 또는 T, 레인 1) 및 잔류 세포를 핵(N, 레인 2), 세포질(C, 레인 3) 및 막(M, 레인 4) 분획으로 분리시킨다[참조: Chen et al., 1995; Abrans et al, 1982]. 분획 과정의 조절을 위해 p110RB를 핵 분포에 대한 마커로서 사용하고 GST를 세포질 분포에 대한 마커로서 사용한다. 소분획물을 GST 비드와 반응시키고 SDS-PAGE로 분리하며 코마시 블리리안트 블루로 염색하여 예상되는 26-KDa 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST) 밴드를 가시화시킨다.
도 6B, 도 6C, 도 6D, 도 6E, 도 6F, 도 6G, 도 6H, 도 6I.
정상 세포 및 유방암 세포에서의 BRCA1의 국재화. 간접적인 면역형광 염색으로 온전한 HBL100 세포의 핵중의 BRCA1의 검출. 핵을 표시하기 위한 DAPI 염색(도 6B, 도 6D, 도 6F, 도 6H); 동일한 세포의 면역형광 염색(도 6C, 도 6E, 도 6G, 도 6I); 간접적인 면역형광 과정이 문헌[참조: Durfee et al., 1994]에 기술되어 있다. 간략하게, 커버 슬립상에서 성장한 세포를 인산 완충액 식염수(PBS)중의 4% 포름알데하이드 및 0.1% 트리톤 X-100R으로 고정시키며 물중에 0.05% 사포닌으로 투과시킨다. 고정된 세포를 PBS중의 10% 정상 염소 혈청 및 0.5% NP-40R로 차단시키고 마우스 폴리클로날 항-BRCA1 1차 항혈청(1:1000 희석)과 반응시키며 세척하고 마우스 면역글로불린 G에 대한 플루오레신 태크된 염소 항체와 반응시킨다. 2차 항체 반응의 종료후에 4,6-디아미디노-2-페놀인돌 프로피듐 요오다이드(DAPI)의 한방울을 10분동안 세포에 첨가하여 DNA를 염색시킨다. 이어서 세포를 가시화하고 형광 현미경하에서 사진 촬영한다. 1차 항체로서 예비면역 혈청(도 6B 및 도 6C); 1차 항체로서 항-BRCA1(도 6D 및 도 6E), GST 항원으로 미리 흡착된 항-BRCA1(도 6F 및 도 6G); GST-BRCA1 융합 단백질로 예비 흡착된 항-BRCA1(도 6H 및 도 6I).
도 6J, 도 6K, 도 6L, 도 6M, 도 6N, 도 6O, 도 6P, 도 6Q.
정상 세포 및 유방암 세포중의 BRCA1의 국재화. 유방과는 다른 조직으로부터 유래된 세포주의 핵중의 BRCA1의 검출. DAPI 염색(도 6J, 도 6L, 도 6N, 도 6P); BRCA1 염색(도 6K, 도 6M, 도 6O, 도 6Q); DU145(전립선 암종)세포(도 6J 및 도 6K); RAT2 섬유아세포(도 6L 및 도 6M); T24(TCC 방광)세포(도 6N 및 도 6O); CV1(원숭이 신장 상피)세포(도 6P 및 도 6Q).
도 7A, 도 7B, 도 7C, 도7D, 도 7E, 도 7F, 도 7G, 도 7H, 도 7I, 도 7J, 도 7K, 도 7L, 도 7M, 도 7N, 도 7O, 도 7P.
정상세포 및 유방암 세포에서의 BRCA1의 국재화. 유방암 세포에서의 BRCA1의 세포질 국재화. 유방암 세포주 T47D(도 7A 내지 도 7H); 유방암 세포주 MCF7(도 7K 및 도 7L), 1차 악성 삼출물 #22550로부터의 세포(도 7M, 도 7N); 1차 분출물 #23159(도 7O, 도 7P), DAPI 염색(도 7A, 도 7C, 도 7E, 도 7G, 도 7I, 도 7K, 도 7M, 도 7O); 1차 항체로서 예비면역된 혈청(도 7B); 폴리클로날 항-BRCA1 1차 항혈청(도 7D); GST로 예비 흡착된 항-BRCA1(도 7F); GST-BRCA1 융합 단백질과 재흡착된 항-BRCA1(도 7H); 글루타티온-S-트랜스퍼라제와 재흡착된 항-BRCA1 1차 항체(도 7I 내지 도 7P). 확대 배율은 도 7B 내지 도 7D에서 동일하다.
도 8A. 면역퍼옥시다제 방법에 의한 BRCA1에 대한 1차 유방암 단편. 본 발명가의 종양 뱅크내에서 무작위로 선별되고 포르말린 고정되며 파라핀 봉매된 유방암 생검의 5㎛ 두께의 단편을 아비딘-바이오틴 고추냉이 퍼옥시다제 복합체(ABC)의 변형된 방법[참조: Hsu et al., 1981]으로 면역염색시킨다. 항-BRCA1을 1:100의 희석비로 사용한다. BRCA1에 대해 어떠한 세포질 또는 핵 면역염색을 나타내지 않는 침투성 유방암의 2가지 경우가 핵 증식 항원 MiB1에 대해 양성 면역 염색을 나타낸다. BRCA1은 세포질 및 핵 모두에 위치한다.
도 8B. 면역퍼옥시다제 방법에 의한 BRCA1에 대한 1차 유방암 단편. 본 발명가의 종양 뱅크내에서 무작위로 선별되고 포르말린 고정되며 파라핀 봉매된 유방암 생검의 5㎛ 두께의 단편을 아비딘-바이오틴 고추냉이 퍼옥시다제 복합체(ABC)의 변형된 방법[참조: Hsu et al., 1981]으로 면역염색시킨다. 항-BRCA1을 1:100의 희석비로 사용한다. BRCA1에 대해 어떠한 세포질 또는 핵 면역염색을 나타내지 않는 침투성 유방암의 2가지 경우가 핵 증식 항원 MiB1에 대해 양성 면역 염색을 나타낸다. BRCA1이 세포질에만 위치한다.
도 8C. 면역퍼옥시다제 방법에 의한 BRCA1에 대한 1차 유방암 단편. 본 발명가의 종양 뱅크내에서 무작위로 선별되고 포르말린 고정되며 파라핀 봉매된 유방암 생검의 5㎛ 두께의 단편을 아비딘-바이오틴 고추냉이 퍼옥시다제 복합체(ABC)의 변형된 방법[참조: Hsu et al., 1981]으로 면역염색시킨다. 항-BRCA1을 1:100의 희석비로 사용한다. BRCA1에 대해 어떠한 세포질 또는 핵 면역염색을 나타내지 않는 침투성 유방암의 2가지 경우가 핵 증식 항원 MiB1에 대해 양성 면역 염색을 나타낸다. BRCA1 염색 부재. 모든 단편에 작고 둥글며 암신호는 임파구 및 기질 세포 핵이다. 최초 확대 배율. x 400
도 9. NLS 결실 돌연변이 작제물을 나타낸다. PCR 기본 돌연변이에 의한 각각의 변화와 함께 BRCA1내 3개의 추정되는 NLS 모티프의 위치 및 서열을 나타내는 도식. 나타낸 바와 같이 이들 작제물은 FLAG 에피토프와 프레임내에서 CMV 메이저-레이트 프로모터의 조절하에 삽입된 cDNA를 고농도로 발현시키는 pCEP4 벡터로 클론시킨다.
도 10. 효모 "원-하이브리드(one-hybrid)" 시스템을 사용한 BRCA1내의 트랜스-활성화 도메인의 확인. 나타낸 BRCA1의 다양한 단편이 GAL4 DNA 결합 도메인의 프레임내로 융합되고 효모 벡터 pAS에서 발현된다. 이들 작제물을 이어서 GAL4를 함유하는 효모 균주 Y153으로 형질감염시킨다. 반응성 b-갈락토시다제 리포터 유전자 b-갈락토시다제 활성을 형질전환체를 플레이트상에 도말하고 콜로니 리프트 검정을 수행하여 정성적으로 결정하거나 CPRG 검정에 의해 정량적으로 결정한다. 이들 검정은 본 발명가에 의해 전위에 기술되어 있다[문헌참조: Durfee, et al., 1993].
도 11. 효모 투-하이브리드 스크린내 미끼로서 사용되는 BRCA1의 영역을 나타내는 도식. BRCA1의 추정되는 Zn-핑거, NLS 모티프 및 트랜스 활성화 도메인이 BRCA1 cDNA에 대해 도식적으로 묘사된다. 하기에 효모 투-하이브리드 스크린내에서 미끼로서 사용되는 2개 영역의 위치를 나타낸다. 이들 영역은 효모 발현 벡터 pAS의 Gal4 DNA-결합 도메인의 프레임내로 클로닝한다. 바(bar)상의 숫자는 서열내 아미노산의 위치를 나타낸다.
4. 예시적 양태의 설명
4.1. BAP 또는 BRCA1에 대한 치료 및 진단용 키트
적합한 용기 장치내에 약제학적으로 허용되는 제제로 본 발명의 BAP 또는 BRCA1 조성물을 함유하는 치료학적 키트는 본 발명의 또 다른 양태를 제공한다. BAP 또는 BRCA1 조성물은 천연 BAP 또는 BRCA1, 절단된 BAP 또는 BRCA1, 부위 특이적으로 돌연변이된 BAP 또는 BRCA1 또는 BAP 또는 BRCA1 암호화된 펩타이드 에피토프 또는 천연 BAP 또는 BRCA1, 절단된 BAP 또는 BRCA1, 부위 특이적으로 돌연변이된 BAP 또는 BRCA1 또는 BAP 또는 BRCA1 암호화된 펩타이드 에피토프에 결합하는 또 다른 항체일 수 있다. 또 다른 양태에서, BAP 또는 BRCA1 조성물은 천연 BAP 또는 BRCA1, 절단된 BAP 또는 BRCA1, 부위 특이적으로 돌연변이된 BAP 또는 BRCA1 또는 BAP 또는 BRCA1 암호화된 펩타이드 에피토프를 암호화하는 핵산 단편일 수 있다. 상기 핵산 단편은 DNA 또는 RNA일 수 있고 천연, 재조합 또는 돌연변이되지 않은 핵산 단편일 수 있다.
키트는 BAP 또는 BRCA1 조성물을 함유하는 단일 용기 장치를 포함할 수 있다. 용기 장치는 경우에 따라 BRCA1 또는 BAP 조성물과 연합된 약제학적으로 허용되는 살균된 부형제 및 임의로 검출성 표지 또는 조영제를 포함할 수 있다. 제제는 젤라틴성 조성물, 예를 들어, 콜라겐성 BRCA1 또는 BAP 조성물 형태일 수 있거나 보다 유동적인 형태임에도 불구하고 신체로 투여되는 즉시 겔형 조성물을 형성하는 형태일 수 있다. 이들 경우에, 용기 장치 그 자체는 주사기, 피펫 또는 상기 유형의 장치일 수 있고 이로부터 BRCA1 또는 BAP 조성물은 특정 부위에 적용될 수 있다. 그러나, 단일 용기 장치는 건조되거나 동결건조된 BRCA1 또는 BAP 조성물의 혼합물을 포함할 수 있고 사용전에 예비 습윤화를 필요로 하거나 필요로 하지 않을 수 있다.
또한, 본 발명의 키트는 각각의 성분에 대해 별개의 용기 장치를 함유할 수 있다. 각각의 경우에, 하나의 용기는 살균된 DNA 용액 또는 동결건조된 형태중 하나로서 BAP 또는 BRCA1 조성물을 포함할 수 있고 또 다른 용기는 그 자체가 살균된 용액으로 예비습윤화되거나 되지 않을 수 있거나 젤라틴성, 액상 또는 또 다른 주사가능한 형태일 수 있는 매트릭스를 포함한다.
또한 키트는 살균된 약제학적으로 허용되는 완충액, 희석액 또는 용매를 포함하는 제2 또는 제3 용기 장치를 포함한다. 상기 용액은 BAP 또는 BRCA1 성분을 신체에 적용하기에 적합한 형태, 예를 들어, 국소 제제, 또는 경구, 비경구 또는 정맥내 형태로 제형화하는데 요구될 수 있다. 그러나 키트의 모든 성분이 건조 형태(동결건조된 형태)로 제공되어 체액과 접촉시 "습윤화"될 수 있어야만 한다는 것을 주지해야만 한다. 따라서 몇몇 유형의 약제학적으로 허용되는 완충액 또는 용매가 본 발명의 키트에는 필요하지 않다. 또한 키트는 약제학적으로 허용되는 검출성 조영제 또는 조성물을 포함하는 제2 또는 제3 용기를 포함할 수 있다.
일반적으로 용기 장치는 바이알, 시험 튜브, 플라스크, 유리병, 주사기 또는 또 다른 용기 장치와 같은 용기일 수 있고 여기에 키트의 조성물이 위치할 수 있다. 매트릭스 및 유전자 성분은 또한 보다 소형의 용기에 분취될 수 있고 이것은 요망된다. 본 발명의 키트는 도한 상업적 규모의 폐쇄된 공간내에 각각의 용기, 예를 들어, 요망되는 바이알 또는 주사기를 보유한 주입 또는 블로우 성형 플라스틱 용기를 포함하는 장치를 포함할 수 있다.
용기의 수에 관계없이, 본 발명의 키트는 또한 궁극적인 매트릭스-유전자 조성물을 동물 체내에 위치시키는 것을 보조하는 장치를 포함하거나 이와 함께 팩키징될 수 있다. 상기 기구는 주사기, 피펫, 쪽집게 또는 임의의 의학적으로 승인된 전달 수송체일 수 있다.
4.2 친화 크로마토그래피
친화 크로마토그래피는 일반적으로 리간드 또는 항체와 같은 물질에 의한 단백질의 인식을 근거로 한 것이다. 칼럼 물질은 결합 분자, 예를 들어, 활성화된 염료를 불용성 매트릭스에 공유적으로 커플링시킴으로써 합성될 수 있다. 이어서 칼럼 물질은 용액으로부터 목적하는 물질을 흡수한다. 다음, 결합이 일어나지 않는 조건으로 변화시켜 기질을 용출시킨다. 성공적인 친화성 크로마토그래피를 위한 조건은 다음과 같다:
1) 매트릭스는 특이적으로 목적하는 분자를 흡착해야만 한다.
2) 또 다른 오염물은 비흡착된 상태로 남는다.
3) 리간드는 이의 결합력을 변화시킴없이 커플링되어야만 한다.
4) 리간드는 매트릭스에 충분히 단단하게 결합해야만 하고,
5) 파괴되지 않으면서 목적하는 분자를 용출시키는 것이 가능해야만 한다.
본 발명의 바람직한 양태는 매트릭스가 BAP 또는 BRCA1 또는 또 다른 BAP 또는 적합한 매트릭스(예: 세파로즈 CL6B 또는 CL4B)에 공유적으로 커플링된 BAP 또는 BRCA1중 하나로부터 유래된 펩타이드 에피토프를 포함하는 용액으로부터 항체를 정제하기 위한 친화성 크로마토그래피 방법이다. 상기 매트릭스는 본 발명의 항체와 직접 결합하고 염, GuHCl, pH 또는 우레아와 같은 용출제를 사용하여 적절한 농도 구배로 용출시킴으로써 분리된다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양태는 BAP, BRCA1 또는 용액으로부터의 관련된 펩타이드 에피토프의 정제를 위한 친화성 크로마토그래피 방법이다. 매트릭스는 본 발명의 아미노산 조성물에 직접 결합하고 상기 기술한 바와 같은 적합한 완충액으로 용출시킴으로써 분리된다.
4.3 핵산 수송 및 DNA 형질감염시키는 방법
특정 양태에서, 본원에 기술된 핵산 단편을 사용하여 적합한 숙주 세포를 형질감염시키는 방법이 고려되고 있다. 세포로 DNA를 도입하기위한 기술은 당해 기술분야에 널리 공지되어 있다. 핵산 단편을 세포로 전달하기 위한 4개의 일반적인 방법이 기술되어 있다:
(1) 화학적 방법(Graham and Van der Eb, 1973).
(2) 미세주입(Capecchi, 1980), 일렉트로포레이션(Wong and Neumann, 1982; Fromm et al., 1985) 및 유전자 건(Yang et al., 1990)과 같은 물리적 방법.
(3) 바이러스성 벡터(Clapp, 1993; Eglitis and Anderson, 1988) 및
(4) 수용체 매개 기작(Curiel et al., 1991; Wagner et al., 1992).
4.4 리포좀 및 나노캅셀
특정 양태에서, 본 발명가는 숙주세포로 특정 펩타이드 또는 핵산 단편을 도입하기 위해 리포좀 및/또는 나노캅셀의 사용을 고려한다. 상기 제제는 본원에 기술된 핵산, 펩타이드 및/또는 항체를 도입하기 위해 바람직할 수 있다. 리포좀의 형성 및 사용은 일반적으로 당해 기술분야, 예를 들어, 세포간의 세균 감염 및 질환의 표적화된 항생제 치료에 리포좀 및 나노캅셀의 사용을 기술하고 있는 문헌[참조: Couvreur et al., 1977]에 공지되어 있다. 최근에 리포좀은 개선된 혈청 안정성 및 순환 하프 타임을 갖도록 개발되었다[문헌참조: Gabizon and Papahadjopoulos, 1988; Allen and Choun, 1987].
일반적으로 나노캅셀은 안정하고 재생할 수 있는 방법으로 화합물을 포집할 수 있다[문헌참조: Henry-Michelland et al., 1987]. 세포간의 중합체성 오버로딩으로인한 부작용을 회피하기 위해 상기 초미세 입자(0.1㎛ 정도의 크기)는 생체에서 분해될 수 있는 중합체를 사용하여 제조되어야 한다. 이들 조건을 충족시키는 생분해성 폴리알킬-시아노아크릴레이트 나노입자가 본 발명에 사용되도록 고려되고 상기 입자는 문헌[참조; Couvreur et al., 1977; 1988)에 기술된 바와 같이 용이하게 제조될 수 있다.
리포좀은 수성 매질에서 분산되는 인지질로부터 형성되고 자발적으로 다중라멜라 중심 이중층 비히클[또한 다중라멜라 비히클(MLV)로서 언급됨]을 형성한다. MLV는 일반적으로 직경 25nm 내지 4㎛을 갖는다. MLV를 초음파 파쇄하여 코어에 수용액을 포함하는, 직경 200 내지 500Å의 보다 작은 단일 라멜라 비히클(SUV)을 형성한다.
문헌[참조: Couveur et al.(1988)]에 기술된 정보 뿐만 아니라 하기의 정보는 리포좀 제형을 제조하는데 사용될 수 있다. 인지질은 지질과 물의 몰비에 따라 물중에 분산되는 경우 리포좀 이외의 다양한 구조를 형성할 수 있다. 낮은 비율에서 리포좀은 바람직한 구조이다. 리포좀의 물리적 성질은 pH, 이온강도 및 2가 양이온의 존재에 따라 다양하다. 리포좀은 이온성 및 극성 물질에 대해 낮은 침투성을 나타내고 승온에서 상전이하여 이의 침투성이 현저하게 변화된다. 상 전이는 겔 상태로서 공지된 밀접하게 팩킹되고 정돈된 구조로부터 유체 상태로서 공지된 느슨하게 팩킹되고 덜 정돈된 구조로 변화하는 것을 포함한다. 이것은 특징적인 상 전이 온도에서 일어나고 이온, 슈가 및 약물의 침투성이 증가하게 된다.
리포좀은 4개의 상이한 기작을 통해 세포와 상호작용한다: 대식세포 및 호중구와 같은 세망내피 시스템의 식세포에 의한 엔도사이토시스; 약한 비특이적인 소수성 또는 정전력 또는 세포 표면 성분과의 특이적인 작용에 의한 세포 표면으로의 흡착; 리포좀의 지질 이중층의 플라즈마 막으로의 삽입에 의한 플라즈마 세포 막과의 융합과 동시에 리포좀 내용물의 세포질로의 방출; 및 리포좀 내용물과는 상관없이 리포좀 지질의 세포막 또는 아세포 막으로의 수송 또는 이와 반대되는 경우. 흔히 어떠한 기작이 작용하고 동시에 작동될 수 있는가를 결정하기란 난이하다.
4.5 BAP, BRCA1 및 항 BAP 또는 항-BRCA1 항체를 제조하기 위한 방법
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩타이드와 면역반응하는 항체를 고려한다. 상기 기술된 바와 같이 본 발명에 따른 BRCA1 및 BRCA1 유래 에피토프 펩타이드 또는 BAP 및 BAP 유래 에피토프성 펩타이드의 용도중 하나는 항체를 합성하는 것이다. 본 명세서 전반에 걸쳐 언급된 항체는 전체 폴리클로날 및 모노클로날 항체(mAb)를 포함하고 이의 일부, 단독으로 또는 또다른 잔기와 결합된 항체를 포함한다. 항체 부위는 Fab 및 F(ab)2단편 및 일본쇄 항체를 포함한다. 항체는 적합한 실험실 동물에서 생체내 또는 재조합 DNA 기술을 사용한 시험관내에서 제조될 수 있다. 바람직한 양태에서, 항체는 폴리클로날 항체이다.
간략하게, 폴리클로날 항체는 동물을 본 발명의 폴리펩타이드를 포함하는 면역원으로 면역화시키고 상기 면역화된 동물로부터 항혈청을 수거함으로써 제조된다. 광범위한 종의 동물이 항혈청을 제조하기 위해 사용될 수 있다. 전형적으로, 항-혈청을 제조하기 위해 사용되는 동물은 토끼, 마우스, 랫트, 햄스터 또는 기니아 피그이다. 비교적 큰 용량의 혈액 때문에 폴리클로날 항체를 제조하기 위해 토끼가 바람직하다.
BRCA1 및 BRCA1-유래 에피토프 또는 또 다른 BAP 및 BAP 유래 에피토프에 특이적인 폴리클로날 및 모노클로날 항체는 일반적으로 당해 기술분야에 공지된 바와 같이 통상적인 면역화 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 본원에 기술된 특정 BRCA1 및 BAP의 항원성 에피토프를 포함하는 조성물이 하나 이상의 실험동물 예를 들어, 토끼 또는 마우스를 면역화하는데 사용되어 BAP 또는 BRCA1 펩타이드에 대해 특이적인 항체를 제조할 수 있다. 폴리클로날 항혈청은 항체 합성 기간동안 단순히 동물로부터 방혈하고 전혈로부터 혈청 샘플을 제조함으로써 수득될 수 있다.
폴리클로날 항체의 제조에 사용되는 면역원 조성물의 양은 면역원의 특성 및 면화를 위해 사용되는 동물에따라 다양하다. 면역원을 투여하는데 다양한 경로(피하내, 근육내, 피내, 정맥내 및 복강내)가 사용될 수 있다. 폴리클로날 항체의 제조는 면역화에 따른 다양한 위치에서 면역화된 동물로부터 혈액을 수거함으로써 검색될 수 있다. 2차 부스터 주입이 주어질 수 있다. 부스팅 및 역가측정 방법은 적합한 역가가 성취될 때까지 반복된다. 목적하는 수준의 면역이 성취된 경우 면역화된 동물로부터 혈액을 채취하고 혈청을 분리하며 저장하고/하거나 mAb(하기)를 제조하는데 동물을 사용할 수 있다.
본 발명에 의해 제공되는 중요한 특징중 하나는 항체의 특이성에 있어서 비교적 균질한 폴리클로날 혈청이다. 전형적으로, 폴리클로날 항혈청은 상이한 클론, 예를 들어, 상이한 계열의 B-세포로부터 유래된다. mAb는 대조적으로 "모노"로서 언급되는 공통되는 B-세포 전구체와 함께 항체 생산 세포로부터 유래된 것으로서 정의한다.
펩타이드가 폴리클로날 혈청을 제조하기 위한 항원으로서 사용되는 경우 완전한 항원이 사용된다면 혈청의 클로날 성질이 상당히 덜 변형된다는 것을 예상할 수 있다. 불행하게도 에피토프의 불완전한 단편이 제공되는 경우 펩타이드는 다중(및 아마도 비천연) 형태를 가질 수 있다. 결과로서 심지어 짧은 펩타이드가 비교적 다수의 특이성을 갖는 폴리클로날 항혈청을 제조할 수 있고 불행하게도 항혈청은 고유 분자와 작용하지 않거나 약하게 작용한다.
본 발명에 따른 폴리클로날 항혈청은 완전하고 온전한 에피토프를 갖는 것으로 예상되는 펩타이드에 대해 제조된다. 따라서 이들 에피토프는 면역학적인 면에서 보다 안정하고 면역 시스템을 위한 보다 일관된 면역학적 표적물을 제조할 수 있는 것으로 사료된다. 상기 모델하에, 상기 펩타이드에 반응하는 다수의 잠재적인 B-세포 클론이 상당히 소량이고 수득한 혈청의 균질성이 보다 높아진다. 다양한 양태에서, 본 발명은 클로날리티(clonality), 예를 들어, 동일 분자의 결정인자와 반응하는 클론의 %가 적어도 80%이다. 심지어 보다 높은 클로날리티 90% 또는 95% 이상이 예상된다.
mAb를 수득하기 위해 또한 처음에 실험 동물, 흔히 바람직하게는 마우스를 BRCA1-함유 조성물로 면역화한다. 이어서 항체를 합성하는 충분한 기간후에 동물의 비장 또는 림프 세포 집단을 수득한다. 비장 또는 림프 세포를 이어서 사람 또는 마우스 골수종 균주와 같은 세포주와 융합시켜 항체 분비 하이브리도마를 생산할 수 있다. 이들 하이브리도마를 분리하여 각각의 클론을 수득하고 목적하는 펩타이드에 대한 항체를 제조하는 클론을 검색할 수 있다.
면역화에 이어서 비장세포를 형질구종 세포와 함께 표준 융합 프로토콜을 사용하여 제거하고 융합하여 BAP 또는 BRCA1에 대한 mAb를 분비하는 하이브리도마를 제조한다. 선택된 항원에 대한 mAb를 생산하는 하이브리도마는 ELISA 및 웨스턴 블롯 방법과 같은 표준 기술을 사용하여 확인된다. 하이브리도마 클론을 이어서 액체 배지에 배양할 수 있고 배양 상등액을 정제하여 BAP- 또는 BRCA1-특이적 mAb를 제공한다.
본 발명의 mAb는 또한 ELISA 및 웨스턴 블롯 방법과 같은 면역화학적 공정 뿐만아니라 면역침전, 면역세포학적 방법등 BAP 또는 BRCA1에 특이적인 항체를 사용할 수 있는 방법과 같은 또 다른 과정에 적용시키기에 유용한 것으로 밝혀졌다. 특히 BAP 또는 BRCA1 항체는 면역흡착 프로토콜에 사용되어 천연 또는 재조합 BAP, BRCA1 또는 BAP- 또는 BRCA1-유래 펩타이드 종 또는 합성 또는 이의 천연 변형물을 정제하는데 사용될 수 있다.
본원에 기술된 항체는 항체 클로닝 프로토콜에 사용되어 또 다른 종 또는 미생물로부터 BAP 또는 BRCA1을 암호화하는 cDNA 또는 유전자를 수득하거나 BAP 또는 BRCA1과 상당히 동질인 단백질을 확인할 수 있다. 이들은 또한 억제 연구에 사용되어 세포, 조직 또는 전체 동물내에서 BAP 또는 BRCA1의 효과를 분석할 수 있다. 항-BRCA1 또는 항-BAP 항체는 또한 면역 국재화 연구에 사용되어 상이한 생리학적 조건하에서 BRCA1 또는 BAP 단백질의 분포를 분석할 수 있다. 상기 항체는 예를 들어, 항체 친화성 칼럼을 사용하여 천연 또는 재조합 BAP 또는 BRCA1을 정제하는데 사용하는 것이 특히 유용하다. 모든 상기한 면역학적 기술의 시행 방법은 본 발명의 기술된 내용을 기초로 당해 기술분야의 기술자에게 공지되어 있다.
4.5 BAP 또는 BRCA1의 재조합 발현
BAP 또는 BRCA1 핵산 단편을 발현하는 재조합 클론은 정제된 재조합 BRCA1(rBRCA1), 정제된 rBRCA1-유래 펩타이드 항원 또는 또 다른 정제된 재조합 BAP(rBAP), 정제된 rBAP 유래 펩타이드 항원 및 상당한 양의 돌연변이 또는 변이 재조합 단백질종을 제조하는데 사용될 수 있다. 선택된 항원 및 이의 변형물이 유방암을 진단하고 치료하는데 상당한 용도를 갖는 것으로 제안되었다. 예를 들어, rBAP, rBRCA1, 이의 펩타이드 변형물 및/또는 상기 rBAP 또는 rBRCA1에 대한 항체가 면역검정에 사용되어 생체내 BAP 또는 BRCA1의 위치를 검출하거나 유방암 세포를 치료하는데 백신 또는 면역치료제로서 사용될 수 있다.
추가로, DNA 돌연변이와 같은 기술을 적용하여 본 발명은 변형되거나 단순화된 단백질 구조를 갖는 소위 "제2 세대"분자를 용이하게 제조할 수 있다. 제 2 세대 단백질은 전형적으로 완전한 길이의 항원에 공통적인 하나 이상의 특성, 예를 들어, 특정 항원/면역원 에피토프 코어 서열과 같은 성질을 공유한다. 에피토프 서열은 펩타이드 또는 암호화된 DNA 서열 정보에 대한 지식을 통해 제조된 비교적 작은 분자상에 제공될 수 있다. 상기 변이 분자는 단백질 구조의 선택된 면역원성/항원 영역으로부터 유래될 뿐만아니라 추가로 또는 이와는 달리 천연 서열에 대한 유사성 또는 심지어 차이를 기초로 선택된 하나 이상의 기능적으로 동등한 아미노산을 포함할 수 있다.
4.7 항체 조성물 및 이의 제형
항체를 제조하고 특징화하기 위한 방법은 본원에 참조로서 인용된 문헌[참조: Harlow and Lane(1988)]에 공지되어 있다. 일반적으로 mAb를 제조하기 위한 방법은 폴리클로날 항체를 제조하기 위한 방법과 동일한 순서에 따라 개시한다. 간략하게, 폴리클로날 항체는 동물을 본 발명에 따른 면역원성 조성물로 면역화시키고 면역화된 동물로부터 항혈청을 수거함으로써 제조된다. 광범위한 동물종이 항혈청을 제조하기위해 사용될 수 있다. 전형적으로 항혈청의 제조를 위해 사용되는 동물은 토끼, 마우스, 랫트, 햄스터, 기니아 피그 또는 염소이다. 비교적 큰 용량의 혈액으로 인해 폴리클로날 항체를 제조하기 위해서는 토끼가 바람직하다.
당해 분야에 공지된 바와 같이, 주어진 조성물은 면역원성에 있어서 다양할 수 있다. 따라서 펩타이드 또는 폴리펩타이드 면역원을 담체에 연결시킴으로써 숙주 면역 시스템을 부스트할 필요가 있다. 예시적인 바람직한 담체는 키홀 림페트 헤모시아닌(Keyhole limpet hemocyanin: KLH) 및 소 혈청 알부민(BSA)이다. 난알부민, 마우스 혈청 알부민 또는 토끼 혈청 알부민과 같은 또 다른 알부민은 또한 담체로서 사용될 수 있다. 폴리펩타이드를 담체에 결합시키기 위한 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있고 글라타르알데하이드, m-말레이미도벤조일-N-하이드록시숙신이미드 에스테르, 카보디이미드 및 비스-비아조타이즈드 벤지딘을 포함한다.
mAb는 본원에 참조로서 인용된 미국 특허 제4,196,265호에 예시된 바와 같은 널리 공지된 기술을 사용하여 용이하게 제조된다. 전형적으로, 상기 기술은 적합한 동물을 선택된 면역원 조성물, 예를 들어, 정제된 또는 부분적으로 정제된 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드로 면역화시킴을 포함한다. 면역화 조성물을 항체 생산 세포를 자극시키는데 효과적인 방법으로 투여된다. 마우스 및 랫트와 같은 설치류가 바람직한 동물이지만 토끼, 양 또는 개구리 세포를 사용할 수 있다. 랫트의 사용은 임의의 장점을 제공할 수 있으나(Goding, 1986) 마우스가 바람직하고 이중에서 BALB/c 마우스가 가장 바람직하며 이것은 가장 일상적으로 사용되고 일반적으로 안정한 융합의 높은 가능성을 제공한다.
면역화에 이어서 항체를 생산하는데 잠재력을 갖는 체세포, 특히 B-임파구(B-세포)를 mAb 합성 프로토콜에 사용하기 위해 선별한다. 이들 세포를 생검된 비장, 편도 또는 임파선 또는 말초 혈액 샘플로부터 수득할 수 있다. 비장 세포 및 말초 혈액 세포가 바람직한데 그 이유는 전자는 분열하는 형질아구 단계에 있는 항체 생산 세포의 풍부한 공급원이고 후자는 말초 혈액이 용이하게 채취할 수 있기 때문이다. 가끔, 일련의 동물이 면역화되고 가장 높은 항체 역가를 갖는 동물의 비장을 제거하여 비장을 주사기로 균질화시켜 비장 임파구를 수득한다. 전형적으로 면역화된 마우스의 비장은 약 5 x 107내지 약 2 x 108임파구를 포함한다.
면역화된 동물로부터 항체 생산 B 임파구를 이어서 면역화된 동물과 동일한 종의 하나인 영구적인 골수종 세포의 세포와 융합시킨다. 하이브리도마 생산 융합 과정에 사용하는데 적합한 골수종 세포주는 바람직하게 비항체 생산성이고 높은 융합 효율 및 단지 목적하는 융합된 세포(하이브리도마)의 증식을 지지하는 특정 선택 배지에서 증식할수 없도록하는 효소 결핍을 갖는다.
다수의 골수종 세포중 하나를 사용할 수 있고 이것은 당해 기술분야의 기술자에게 공지되어 있다[참조문헌: Goding, 1986; Campbell. 1984). 예를 들어, 면역화된 동물이 마우스인 경우 P3-X63/Ag8, X63-Ag8.563, NS1/1Ag41, Sp210-Ag14, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7 및 S194/5XXO Bul을 사용할 수 있고 랫트인 경우에는 R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F 및 4B210을 사용할 수 있고 U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2 및 UC729-6은 사람 세포 융합과 관련하여 모두 유용하다.
하나의 바람직한 뮤린 골수종 세포는 세포주 기탁 번호 GM3573을 요구함으로써 기탁기관(NIGMS Human Genetic Mutant Cell Depository)으로부터 용이하게 구입할 수 있는 NS-1 골수종 세포주(또한 P3-NS-1-Ag4-1)이다. 사용될 수 있는 또 다른 마우스 골수종 세포주는 8-아자구아닌-저항성 마우스 뮤린 골수종 SP2/0 비생산 세포주이다.
항체 생산 비장 또는 임파선 세포 및 골수종 세포의 하이브리드를 제조하기 위한 방법은 일반적으로 2:1의 비율로 골수종 세포와 함께 체세포를 혼합함을 포함하고 이때 비율은 세포막의 융합을 촉진하는 제제 또는 제제들(화학적 또는 전기적)의 존재하에 약 20:1 내지 약 1:1로 다양할 수 있다. 센다이 바이러스를 사용하는 융합 방법은 문헌[참조: Kohler and Milstein, 1975; 1976]에 기술되어 있고 37%(v/v) PEG와 같은 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 사용한다[문헌참조: Grefter et al.(1977)]. 전기적으로 유도된 융합 방법의 사용이 또한 적절하다[참조: Goding, 1986).
통상적으로 융합 과정은 낮은 빈도수( 약 1 x 10-6내지 약 1 x 10-8)로 생존 하이브리드를 생산한다. 그러나 이것은 선택배지에서 배양함으로써 융합된 생존 하이브리드가 융합되지 않은 모세포(특히, 정상적으로 계속적으로 증식을 계속하는 융합되지 않은 골수종 세포)로부터 분화됨으로써 문제를 일으키지 않는다. 일반적으로 선택 배지는 조직 배양 배지에서 뉴클레오타이드의 신생 합성을 차단하는 제제를 포함하는 배지이다. 예시적인 바람직한 제제는 아미노프테린, 메토트렉세이트 및 아자세린이다. 아미노프테린 및 메톡트렉세이트는 퓨린 및 피리미딘 모두의 신생 합성을 차단시키는 반면에 아자세린은 단지 퓨린 합성만을 차단한다. 아미노프테린 또는 메토트레세이트를 사용하는 경우 배지에 뉴클레오타이드 공급원으로서하이포산틴 및 티미딘(HAT 배지)을 보충한다. 아자세린이 사용되는 경우 배지에 하이포산틴을 보충한다.
바람직한 선택 배지는 HAT이다. 뉴클레오타이드 살비지(salvage) 경로만이 작동할 수 있는 세포만이 HAT 배지에서 생존할 수 있다. 골수종 세포는 살비지 경로의 주요 효소(예: 하이포산틴 포스포리보실 트랜스퍼라제(HPRT)에 결함이 있고 이들은 생존할 수 없다. B-세포는 상기 경로를 작동할 수 있으나 배양물에서 제한된 수명을 갖고 일반적으로 약 2주 이내에 사멸한다. 따라서, 선택 배지에서 생존할 수 있는 유일한 세포는 골수종 및 B-세포로부터 형성된 하이브리도마이다.
상기 배양은 하이브리도마 집단을 제공하며 이로부터 특이적인 하이브리도마가 선별된다. 전형적으로 하이브리도마의 선별은 미세역가 플레이트내에서 단일 클론 희석으로 세포를 배양함으로써 수행되고 이어서 목적하는 반응성에 대해 각각의 클론 상등액(약 2 내지 3주)을 시험한다. 검정(방사능 면역검정, 효소 면역검정, 세포독성 검정, 플라크 검정 및 도트 면역결합 검정등)은 민감하고 단순하며 신속해야만 한다.
이어서 선별된 하이브리도마를 연속적으로 희석하고 각각의 항체-생산 세포주로 클로닝시키고 이어서 클론을 무한적으로 증식시켜 mAb를 수득할 수 있다. 세포주는 2개의 기본적인 방법으로 mAb 생산에 사용될 수 있다. 하이브리도마의 샘플을 최초 융합에 대한 체세포 및 골수종 세포를 제공하도록 사용된 유형의 조직적합성 동물에 주입(흔히 복강으로)할 수 있다. 주입된 동물은 융합된 세포 하이브리드에 의해 생산되는 특이적인 mAb를 분비하는 종양이 발생한다. 동물의 체액(예: 혈청 또는 복수액)을 채취하여 고농도의 mAb를 제공한다. 각각의 세포주를 또한 시험관내에서 배양할 수 있고 mAb가 천연적으로 배지로 분비되는 경우 이로부터 mAb가 고농도로 용이하게 수득될 수 있다. 상기 방법에 의해 생산된 mAb를 경우에 따라 여과, 원심분리 및 HPLC 또는 친화성 크로마토그래피와 같은 다양한 크로마토그래피 방법으로 정제할 수 있다.
4.8 면역검정
주지된 바와 같이, 본 발명의 천연 및 합성 펩타이드 및 펩타이드 에피토프는 백신 개발과 병행하여 반응성 항체를 검출하기위한 면역검정에서 항원과 같은 면역원으로서 사용될 수 있음이 밝혀졌다. 우선 면역검정에 있어서, 이의 가장 단순하고 직접적인 의미에서 본 발명의 바람직한 면역검정은 당해 기술분야에 공지된 바와 같이 다양한 유형의 효소 연결된 면역흡착 분석(ELISA)을 포함한다. 그러나 BRCA1 유래 단백질 및 펩타이드의 용도는 상기 분석에 제한되지 않으며 또 다른 유용한 양태는 RIA 및 또 다른 비효소 연결된 항체 결합 검정 및 과정을 포함한다는 것을 용이하게 인지할 수 있다.
바람직한 ELISA 분석에서, BAP, rBAP, BRCA1, rBRCA1을 포함하는 단백질 또는 펩타이드 또는, BAP 또는 BRCA1-유래 단백질 항원 서열이 선택된 표면, 바람직하게는 단백질 친화성을 나타내는 표면(예: 폴리스티렌 미세역가 플레이트의 웰)상에 고정화시킨다. 세척하여 불완전하게 흡착된 물질을 제거한후에 일반적으로 시험 항혈청에 대해 항원적으로 중성인 것으로 공지된 비특이적 단백질(예: 소 혈청 알부민(BSA) 또는 카제인)을 웰상에 결합시키거나 피복시키는 것이 요망된다. 이것은 고정화 표면상의 비특이적 흡착 부위을 차단시킴으로써 표면상에 항혈청의 비특이적 결합이 일어나는 공간을 감소시킬 수 있다.
항원 물질을 공간을 감소시키기위해 비반응성 물질로 피복된 웰에 결합시키고 세척하여 결합되지 않은 물질을 제거한후에 고정화 표면을 항혈청 또는 임상적인 또는 생물학적 추출물과 접촉시켜 면역 복합체(항원/항체)형성을 유도하는 방법으로 시험한다. 바람직하게 상기 조건은 항혈청을 BSA, 소 감마 글로불린(BGG) 및 인산 완충 염수(PBS)/트윈R과 같은 희석제로 희석함을 포함한다. 이들 첨가된 항원은 또한 비특이적 공간을 감소시키는데 일조한다. 층을 이루는 항혈청을 예를 들어 2 내지 4시간동안 바람직하게는 약 25℃ 내지 27℃상의 온도에서 배양한다. 배양한후에 항혈청 접촉된 표면을 세척하여 비면역복합된 물질을 제거한다. 바람직한 세척 과정은 PBS/트윈R과 같은 용액 또는 붕산 완충액으로 세척함을 포함한다.
시험 샘플과 결합된 항원간에 특이적인 면역복합체가 형성됨에 이어서 세척한 후에 복합체를 제1 항체에 대해 특이성을 갖는 제2 항체에 부착시킴으로써 형성된 면역복합체의 존재와 양을 결정한다. 물론 시험 샘플은 전형적으로 사람 기원일 수 있고 제2 항체는 바람직하게 사람 항체에 대해 특이성을 갖는 항체일 수 있다. 검출 방법을 제공하기 위해 제2 항체는 바람직하게 연합된 검출성 표지(예: 효소 표지)을 가지며 이것은 적당한 색소성 기질과 반응하는 즉시 색도의 변화와 같은 신호를 발생시킨다. 따라서, 예를 들어, 항혈청 결합 표면을 일정시간동안 면역복합체 형성을 일으키는 조건(PBS-트윈R과 같은 PBS-함유 용액중에서 실온에서 2시간동안 배양)하에서 우레아제 또는 퍼옥시다제-결합된 항사람 IgG와 접촉시키고 배양시키는 것이 요망된다.
제2 효소 태크된 항체를 배양함에 이어서 세척하여 결합되지 않은 물질을 제거한후에 라벨의 양을 색소성 기질, 예를 들어 우레아 및 브로모크레졸 퍼플 또는 2,2'-아지노-디-(3-에틸-벤즈티아졸린)-6-설폰산(ABTS) 및 효소 표지로서 퍼옥시다제인 경우 H2O2와 같은 색소성 기질과 반응시켜 정량한다. 색 변화 정도를 가시 스펙트럼 분광광도계로 측정하여 정량한다.
ELISA는 본 발명과 연계되어 사용될 수 있다. 그러한 ELISA 검정에서, 본 발명의 항원 서열을 포함하는 단백질 또는 펩타이드를 선별된 표면, 바람직하게는 폴리스티렌 미세역가 플레이트의 웰과 같은 단백질 친화도를 갖는 표면상에 고정화시킨다. 세척하여 불완전하게 흡착된 물질을 제거한후에 일반적으로 시험 항혈청에 대해 항원적으로 중성인 것으로 공지된 비특이적 단백질(예: 소 혈청 알부민(BSA), 카제인 또는 분유)을 웰상에 결합시키거나 피복시키는 것이 요망된다. 이것은 고정화 표면상의 비특이적 흡착 부위을 차단시킴으로써 표면상에 항혈청의 비특이적 결합이 일어나는 공간을 감소시킬 수 있다.
4.9 면역침전
본 발명의 항-BRCA1 및 항-BAP 항체가 면역침전에 의한 BRCA1 및 BAP 항원을 추출하는데 특히 적합하다. 면역침전은 표적 항원 성분을 복합체 혼합물로부터 분리함을 포함하고 미량의 단백질을 분리하거나 추출하는데 사용된다.
또 다른 양태에서 본 발명의 항체는 밀접하게 병렬된 2개의 항원에 대해 유용하다. 이것은 특히 항원의 국재화 농도(예: 효소-기질 쌍)를 증가시키는데 유용하다.
4.10 웨스턴 블롯
본 발명의 조성물은 면역 블롯 또는 웨스턴 블롯 검정에 매우 유용한 것으로 밝혀졌다. 항-BRCA1 및 항-BAP 항체를 고체 지지체 매트릭스(예: 니트로셀룰로즈, 나일론 도는 이의 배합물)사에 고정화된 단백질의 확인을 위해 고친화성 1급 시약으로서 사용될 수 있다. 면역침전과 연계하여 겔 전기영동에 이어서 이들을 항원의 검출에 사용되는 2급 시약이 백그라운드를 일으키는 것에 대해 항원을 검출하는데 사용하기 위한 1단계 시약으로서 사용될 수 있다. 이것은 특히 연구된 항원이 면역글로불린이고(세균 세포 벽 성분과 결합하는 면역글로불린의 사용을 배제함), 연구된 항원이 검출제와 교차 반응하거나 이들이 교차 반응 신호로서 비교적 동일한 분자량으로 이동하는 경우에 특히 유용하다. 웨스턴 블롯과 연계된 면역학적 기초 검출 방법(독소 잔기에 대한 효소적-, 방사 표지- 또는 형광적으로-태크된 2차 항체를 포함)은 상기 관점에서 특히 유용한 것으로 사료된다.
4.11 백신
본 발명은 능동 및 수동 면역화 양태로 사용하기 위한 백신을 고려한다. 백신으로서 사용하기에 적합한 것으로 제안된 면역원성 조성물은 본원에 기술된 신규 면역원성 단백질 및/또는 펩타이드 에피토프로부터 직접적으로 용이하게 제조될 수 있다. 바람직하게는 항원성 물질을 광범위하게 투석시켜 목적하지 않은 작은 분자량의 분자를 제거하고/하거나 목적하는 비히클로 보다 용이한 제형화를 위해 동결건조시킨다.
활성 성분으로서 펩타이드 서열을 포함하는 백신의 제조는 본원에 참조로서 인용된 미국 특허 제4,608,251호; 제4,601,903호; 제4,599,231호; 제4,599,230호; 제4,596,792호 및 제4,578,770호에 예시된 바와 같이 당해 기술분야에서 널리 이해되고 있다. 전형적으로 상기 백신은 주사용, 액상 용제 또는 현탁제중 하나, 용액내 또는 현탁액내에 적합한 고체 형태로서 제조되고 주입되기 전의 액체를 또한 제조할 수 있다. 제제는 또한 유화될 수 있다. 활성 면역원성 성분은 흔히 약제학적으로 허용되고 활성 성분과 혼입될 수 있는 부형제와 혼합된다. 적합한 부형제는 예를 들어, 물, 식염수, 덱스트로즈, 글리세롤, 에탄올 및 이의 배합물이다. 추가로 경우에 따라 백신은 소량의 보조 물질(예: 습윤제 또는 유화제, pH 완충제 또는 백신의 효능을 증가시키는 보조제를 포함할 수 있다.
BAP, BRCA1 또는 BRCA1 유래 단백질 및/또는 천연 또는 변형된 에피토프 펩타이드를 포함하는 조성물은 또한 사람 백신을 기본으로 할 수 있다. 필수적으로 내독소가 제거된 상기 조성물의 제제는 공개된 방법에 따라 수행될 수 있는데 예를 들어 미국 특허 제4,271,147호(본원에 참조문헌으로서 인용됨)는 백신으로 사용하기 위해 나이제리아 메닌기티디스(Nissera meningitidis)의 제조방법을 기술하고 있다.
BAP, BRCA1, BRCA1 유래 및 BAP 유래 에피토프 기초 백신은 통상적으로 주사에 의해 비경구적으로, 예를 들어, 피하내 또는 근육내로 투여될 수 있다. 또 다른 투여 방법에 적합한 추가의 제제는 좌제 및 몇몇 경우에는 경구용 제제를 포함한다. 좌제를 위해 통상적인 결합제 및 담체가 예를 들어, 폴리알칼렌 글리콜 또는 트리글리세리드를 포함할 수 있다; 상기 좌제는 활성 성분을 0.5% 내지 10% 바람직하게는 1 내지 2%의 범위로 포함하는 혼합물로부터 형성될 수 있다. 경구용 제제는 보통 사용되는 부형제, 예를 들어, 약제학적 등급의 만니톨, 락토즈, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 셀룰로즈 및 탄산마그네슘 등을 포함한다. 이들 조성물은 용제, 현탁제, 정제, 환제, 캅셀제, 서방성 제제 또는 산제의 형태를 포함하고 활성 성분 10 내지 95%, 바람직하게는 25 내지 70%를 포함한다.
단백질을 중성 또는 염 형태로서 백신으로 제형화될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 염은 산 부가염(펩타이드의 유리 아미노 그룹과 형성됨) 및 무기산(예: 염산 또는 인산) 또는 유기산(예: 아세트산, 옥살산, 타르타르산 및 만델산등)과 함께 형성된 염을 포함한다. 유리 카복실 그룹과 형성된 염은 또한 무기염, 예를 들어, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 수산화제일철, 및 유기염, 예를 들어, 이소프로필아민, 트리메틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘 및 프로카인등으로부터 유래될 수 있다.
백신은 투여 제제와 혼입할 수 있는 방법으로 투여될 수 있고 상기 용량이 치료학적으로 효과적이고 면역원성일 수 있다. 투여량은 예를 들어, 항체를 합성하는 환자의 면역 시스템의 능력, 및 요망되는 보호 정도를 포함하여 치료될 환자에 따라 다양하다. 활성 성분의 정확한 투여량은 능숙한 전문의에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 그러나 적합 투여 범위는 백신당 수백 mg의 활성 성분이다. 초기 투여 및 부스터 샷(shots)을 위해 적합한 섭생은 다양하지만 초기 투여에 이어서 접종 또는 또 다른 투여에 의해 예시된다.
투여 방법은 광범위하게 다양할 수 있다. 백신 투여를 위한 통상적인 어떠한 방법도 적용될 수 있다. 이들은 생리학적으로 허용되는 고체 염기 또는 생리학적으로 허용되는 분산제로서의 경구 투여 또는 주사에 의한 비경구 투여를 포함하는 것으로 사료된다. 백신의 용량은 투여 경로에 따라 다양하며 숙주의 크기에 따라 다양하다.
백신에 대한 보조 효과를 성취하기 위한 다양한 방법은 통상적으로 인산 완충 식염수중에 0.05 내지 0.1% 용액으로서 사용되고 0.25%용액으로서 사용되는 슈가(CarbopolR)의 합성 중합체와 혼합된 수산화알루미늄 또는 포스페이트(알룸)와 같은 제제의 사용 및 각각 30초 내지 2분동안 약 70℃ 내지 약 101℃에 이르는 온도 범위로 열처리하여 백신내 단백질을 응집시킴을 포함한다. 펩신 처리된 알부민에 대한 F(ab) 항체를 재활성화 시킴에 의한 응집, 씨. 파르붐(C. parvum)과 같은 세균 또는 그람 음성 세균의 내독소 또는 리포폴리사카라이드 성분간의 혼합물, 만니드 모노올리에이트(Aracel-ATM)와 같은 생리학적으로 허용되는 오일 비히클중의 유액 또는 차단 성분으로서 사용되는 퍼플루오로카본(Fluosol-DATM)의 20% 용액과의 유액이 사용될 수 있다.
많은 경우에, 통상 6회 백신화를 초과하지 않고 보다 통상적으로는 4회 백신화를 초과하지 않으며 바람직하게는 1회 이상, 통상적으로는 약 3회 백신화를 포함하여 백신을 다중 투여하는 것이 요망된다. 통상적으로 백신화는 2 내지 12주 간격, 보다 통상적으로는 3 내지 5주 간격일 수 있다. 1 내지 5년 간격, 보통은 3년의 간격으로 주기적인 부스터를 수행하여 보호 수준의 항체를 유지하는 것이 요망되다. 면역화에 이어서 상등액 항원에 대한 항체를 검정할 수 있다. 검정은 통상적인 표지(예: 라디오뉴클리드, 효소 및 형광제등)과 같은 표지로 수행될 수 있다. 이들 기술은 널리 공지되어 있고 다양한 특허, 예를 들어, 미국 특허 제3,791,932호; 제4,174,384호 및 제3,949,064호에 이들 유형의 검정이 예시되어 있다.
물론, DNA 백신화에 대한 신규 기술의 관점에서, 실질적으로 모든 상기 백신화 섭생은 DNA 벡터 및 작제물과 함께 사용하기에 적합한 것으로서, 본원에 참조로서 인용된 문헌[참조: Ulmer et al(1993), Tang et al(1992), Cox et al(1993), Fyran et al(1993), Wang et al.(1993a;1993b) and Whitton et al.(1993)]에 기술되어 있다. 근육내 및 정맥내 주사를 포함하여 비경구 투여의 DNA 투여 뿐만아니라 또한 점막 백신화가 고려되며 이것은 DNA 조성물을 외비공 또는 기관으로 투여함으로써 성취될 수 있다. 특히 유전자-건(gene-gun)이 면역화량의 DNA를 표피로 효과적으로 전달시키는데 사용될 수 있다[참조: Fynan et al., 1993].
4.12 약제학적 조성물
본원에 기술된 약제학적 조성물은 예를 들어, 불활성 희석제 또는 동화될 수 있는 식용 담체와 함께 경구적으로 투여될 수 있거나 이들은 경질 또는 연질 젤라틴 캅셀에 밀봉될 수 있거나 이들은 정제로 압착될 수 있거나 이들은 직접적으로 음식물에 혼입될 수 있다. 치료학적 경구 투여를 위해 활성 화합물은 부형제와 혼입될 수 있고 섭취가능한 정제, 협측 정제, 트로키제, 캅셀제, 엘릭시르제, 현탁제, 시럽제 및 웨이퍼제 형태로 사용된다. 상기 조성물 및 제제는 활성 화합물 0.1% 이상을 함유해야만 한다. 물론 조성물 및 제제의 %는 다양할 수 있고 편리하게는 단위중량당 약 2 내지 60%일 수 있다. 상기 치료학적으로 유용한 조성물중의 활성 화합물의 양은 적합한 용량이 수득될 수 있도록 한다.
정제, 트로키제, 환제 및 캅셀제등은 또한 하기의 성분을 포함할 수 있다: 결합제(예: 트라가칸트 고무, 아카시아, 옥수수 전분 또는 젤라틴); 부형제(인산이칼슘); 붕해제(예: 옥수수 전분, 포테이토 전분 및 일긴산등); 윤할제(예: 마그네슘 스테아레이트); 감미제(예: 슈크로즈, 락토즈 또는 사카린)이 첨가될 수 있거나 풍미제(예: 페파민트, 동록유 또는 체리향)가 첨가될 수 있다. 투여 단위 형태가 캅셀제인 경우 이것은 상기 유형의 성분 및 액상 담체를 포함할 수 있다. 다양한 또 다른 물질이 피복물로서 존재하거나 투여 단위의 물리적 형태를 변형시키기 위해 존재할 수 있다. 예를 들어, 정제, 환제 또는 캅셀제는 쉘락, 슈가 또는 이 모두 제피될 수 있다. 엘릭시르 시럽은 감미제로서 활성 화합물 슈크로즈, 방부제로서 메틸 및 프로필파라벤, 및 염료 및 체리 또는 오렌지향과 같은 풍미제를 포함할 수 있다. 물론, 어떠한 투여 단위 형태를 제조하는데 사용되는 임의의 물질은 약제학적으로 순수해야만 하고 사용되는 용량에서 상당히 비독성이어야만 한다. 추가로, 활성 화합물은 서방성 제제 및 제형화제로 혼입될 수 있다.
활성 화합물은 또한 비경구적으로 또는 복강내로 투여될 수 있다. 유리 염기 또는 약리학적으로 허용되는 염으로서 활성 화합물의 용액은 계면활성제(예: 하이드록시프로필셀룰로즈)와 적당히 혼합된 물중에서 제조될 수 있다. 분산제는 또한 글리세롤, 액상 폴리에틸렌 글리콜, 이의 혼합물 및 오일중에서 제조될 수 있다.
주사용으로 적합한 약제학적 형태는 살균된 액상 용제 또는 분산제 및 살균된 주사용 용제 또는 분산제를 임시 제조하기 위한 산제를 포함한다. 모든 경우에 상기 제형은 살균되어야만 하고 용이한 주사를 위해 유동성이 있어야만 한다. 제조 및 저장 조건하에 안정해야만 하고 세균 및 진균류와 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존되어야만한다. 담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예: 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액상 폴리에틸렌 글리콜등), 적합한 이의 혼합물 및 식물성유를 포함하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 제피제(예: 레시틴)를 사용하고 분산제의 경우에 요구되는 입자 크기를 유지하며 계면활성제를 사용함으로써 적당한 유동성을 유지할 수 있다. 다양한 항세균제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산 및 티메로살 등에 의해 미생물의 작용을 예방할 수 있다. 많은 경우에, 등장제(예: 슈가, 염화 나트륨)를 포함하는 것이 바람직하다. 흡착 지연제(예: 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴) 조성물을 사용함으로써 주사용 조성물의 흡착을 지연시킬 수 있다.
살균된 주사 용제는 적당한 용매중에서 필요량의 활성 화합물을 상기 열거한 다양한 기타 성분들과 함께 혼입함에 이어서 필요에 따라 여과 살균함으로써 제조된다. 일반적으로 분산제는 기본적인 분산 매질 및 상기 나열한 것중에서 요구되는 성분들을 포함하는 살균된 비히클로 살균된 다양한 활성 성분을 혼입시킴으로써 제조된다. 살균된 주사용 용제를 제조하기 위한 살균된 산제의 경우에 바람직한 제조 방법은 진공 건조 및 동결 건조 기술로서 이를 통해 활성 성분 및 전위에 살균 여과된 용액으로부터 추가의 목적하는 성분을 수득한다.
본원에 사용된 바와 같이 "약제학적으로 허용되는 담체"는 일부 및 모든 용매, 분산매질, 제피제, 항세균제 및 항진균제, 등장제 및 흡착지연제 등을 포함한다. 약제학적 활성 물질에 대한 상기 매질 및 제제의 사용은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 지금까지 약제학적 활성 물질에 대한 임의의 통상적인 매질 또는 제제가 활성 성분과 혼입할 수 없다는 것을 제외하고는 치료학적 조성물중에는 사용될 수 있다고 사료된다. 보조 활성 성분은 또한 조성물중에 혼입될 수 있다.
경구 예방을 위한 폴리펩타이드는 부형제와 함께 혼입될 수 있고 비소화성 구강세척액 및 치약의 형태로 사용될 수 있다. 구강세척액은 필요량의 활성 성분을 적당한 용매[예: 붕소화나트륨 용액(도벨 용액)]중에 혼입시킴으로써 제조될 수 있다. 또한 활성 성분은 붕소화 나트륨, 글리세린 및 중탄산칼륨을 포함하는 방부제 세척액에 혼입될 수 있다. 또한 활성 성분은 겔, 호상제, 산제 및 슬러리를 포함하는 치약중에 분산될 수 있다. 활성 성분은 치료학적 유효량으로 물, 결합제, 마모제, 풍미제, 발포제 및 보습제를 포함할 수 있는 호상제 치약에 첨가될 수 있다.
문장 "약제학적으로 허용되는"은 사람에게 투여되는 경우 알레르기 또는 유사한 부적당한 반응을 일으키지 않은 분자 실체 및 조성물을 언급한다. 활성 성분로서 단백질을 포함하는 수성 조성물의 제조는 당해 분야에 널리 이해되고 있다. 전형적으로 상기 조성물은 주사 용제, 액상 용제 또는 현탁제, 용제 또는 현탁제에 적합한 고체 형태로서 제조되고 주사전위의 액제가 또한 제조될 수 있다. 제제는 또한 유화될 수 있다.
조성물은 중성 또는 염 형태로 제형화될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 염은 무기산(예: 염산 또는 인산) 또는 유기산(예: 아세트산, 옥살산, 타르타르산 및 만델산등)과 함께 형성되는 산 첨가염(단백질의 유리 아미노 그룹과 형성됨)을 포함한다. 유리 카복실 그룹과 형성된 염은 또한 무기 염기(예: 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 수산화제일철) 및 유기 염기(예: 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘 및 프로카인)로부터 유래될 수 있다. 제형화되는 즉시 용제를 투여 제제와 혼입할 수 있는 방법 및 치료학적 유효량을 투여될 수 있다. 제제는 다양한 투여 형태(예: 주사 용제 및 약물 방출 캅셀제등)로 용이하게 투여된다.
수용액중의 비경구 투여를 위해 예를 들어, 용액은 경우에 따라 적당히 완충되어야만 하고 우선 액상 희석제는 충분한 식염수 또는 글루코즈와 등장성이어야만 한다. 이들 특정 수성 용제는 특히 정맥내, 근육내, 피하 및 복강내 투여에 적합하다. 이와 관련하여 사용될 수 있는 살균된 수성 매질은 본 발명의 기술을 기초로 당해 분야의 기술자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 하나의 용량은 NaCl 등장 용액 1ml중에 용해될 수 있고 피하주입액 1000ml에 첨가되거나 제안된 주입 부위에 주사될 수 있다[문헌참조: "Remington's Pharmaceutical Science" 15th Edition, pages 1035-1038 and 1570-1580]. 용량에 있어서 약간의 변화는 근본적으로 치료될 환자의 증상에 따라 다양하다. 투여 책임자는 어떠한 경우에 각각의 환자에 대한 적당한 투여량을 결정할 수 있다. 더욱이, 사람 투여에 대해 제제는 생물 표준 FDA 사무국에 요구되는 살균성, 발열성, 일반적인 안정성 및 순도 표준을 충족시켜야만 한다.
4.13 에피토프성 코어 서열
본 발명은 또한 단백질 또는 펩타이드 조성물에 관한 것이다. 전체 세포 및 또 다른 펩타이드가 제거되고 이것은 정제된 단백질 또는 펩타이드를 함유하며 본 발명의 하나 이상의 항체와 면역학적으로 교차 반응하는 에피토프가 도입된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "하나 이상의 항-BRCA1 항체와 면역학적으로 교차 반응하는 에피토프를 도입한다는 것"은 BAP 또는 BRCA1 폴리펩타이드내에 위치한 에피토프와 유사한 1차, 2차 또는 3차 구조를 포함하는 펩타이드 또는 단백질 항원을 의미한다. 유사성 정도는 일반적으로 BAP 또는 BRCA1 폴리펩타이드에 대한 모노클로날 또는 폴리클로날 항체가 교차 반응 펩타이드 또는 단백질 항원과 결합하고 반응하거나 이를 인지할 수 있는 정도가 된다. 다양한 면역검정 방법(예: 웨스턴 블롯팅, ELISA 및 RIA등)이 상기 항체와 연계되어 사용될 수 있고 이러한 방법은 당해 분야의 기술자에게 공지되어 있다.
백신에 사용하기 적합하고 BAP 또는 BRCA1 또는 BRCA1형 유전자 산물 및/또는 이의 기능성 등가물로부터 유래된 바와 같은 BAP 또는 BRCA1 에피토프의 확인은 비교적 간단한 문제이다. 예를 들어, 본원에 참조문헌으로 인용되고 친수성을 바탕으로 아미노산 서열로부터 에피토프의 확인 및 제조에 관해 교시하고 있는 미국 특허 제4,554,101호에 교시된 바와 같이 호프(Hopp)의 방법을 사용할 수 있다. 또한 또 다른 다양한 문헌에 기술된 방법 및 이를 바탕으로하는 소프트웨어 프로그램이 에피토프 코어 서열을 확인하는데 사용될 수 있다[문헌참조: Jameson and Wolf, 1988; Wolf et al., 1988; 미국 특허 제4,554,101호]. 이들 에피토프 코어 서열의 아미노산 서열은 이어서 펩타이드 합성 또는 재조합 기술을 통해 펩타이드로 용이하게 혼입될 수 있다.
본 발명에 따라 사용하기 위해 바람직한 펩타이드는 일반적으로 길이에 있어서 약 5 내지 25개의 아미노산 정도이고 보다 바람직하게는 약 8 내지 약 20개 정도이다. 보다 짧은 항원 펩타이드 서열이 특정 상황, 예를 들어, 백신의 제조 또는 면역 검출 검정에서 유리할 수 있다. 예시적인 장점은 제조 및 정제의 수월함, 비교적 저렴한 비용 및 생산물의 개선된 재생산성 및 유리한 생분포이다.
본 발명의 특별한 장점은 변형되고/되거나 연장된 에피토프/면역성 코어 서열을 포함하여 BAP, BAP와 관련되거나 BRCA1과 관련된 서열에 대한 "유니버셜(universal)" 에피토프 펩타이드를 수득케하는 합성 펩타이드를 제조함으로써 실현될 수 있다는 것이다. 이들 영역은 동물내 T-세포 또는 B-세포 자극을 촉진시키고 상기 동물에서 특이적인 항체 생산을 유발하는 것으로 제안되었다.
본원에 사용된 바와 같이 에피토프 코어 서열은 이와 상보적인 비교적 짧은 아미노산이고 따라서 BAP 또는 BRCA1 에피토프-특이적 항체상에 항원 결합 부위와 결합한다. 추가로 또는 이와는 달리, 에피토프 코어 서열은 본 발명의 펩타이드 조성물에 대한 항체와 교차 반응하는 항체를 유발시킨다. 본원에 기술된 내용에 있어서 용어 "상보적"이라는 것은 서로간에 인력을 나타내는 아미노산 또는 펩타이드를 의미한다. 따라서, 본 발명의 특정 에피토프 코어 서열은 경쟁력 또는 목적하는 단백질의 항원의 결합이 상응하는 단백질에 대한 항혈청으로 대체될 수 있는 능력으로서 작동적으로 정의될 수 있다.
일반적으로, 폴리펩타이드 항원의 크기는 확인된 코어 서열 또는 서열을 포함할 수 있을 만큼 충분히 크다면 특별히 중요하다고 사료되지 않는다. 본 발명에 의해 예상되는 가장 작은 유용한 코어 서열은 일반적으로 길이에 있어서 약 5개의 아미노산 정도, 바람직게는 8 또는 25개 정도의 서열을 갖는 것이다. 따라서 크기는 일반적으로 본 발명에 따라 제조된 가장 작은 펩타이드 항원에 상응한다. 그러나 항원의 크기는 기본적인 에피토프 코어 서열을 포함하는 한 목적하는 경우 보다 클 수 있다.
본원에 참조문헌으로 인용되고 친수성을 바탕으로 아미노산 서열로부터 에피토프의 확인 및 제조에 관해 교시하고 있는 미국 특허 제4,554,101호에 교시된 바와 같이 당해 분야의 기술자에게 공지되어 있다. 더욱이, 수많은 컴퓨터 프로그램이 단백질의 항원 부분을 예상하는데 유용하다[문헌참조: Jarneson and Wolf, 1988; Wolf et al., 1988]. 컴퓨터화된 펩타이드 서열 검정 프로그램(예: DNA StarRsoftware, DNAStar, Inc., Madison, WI)은 또한 본 발명에 따른 합성 BRCA1 펩타이드 및 펩타이드 동족체를 디자인하는데 유용할 수 있다. 본 발명에 의해 제공된 펩타이드는 백신 또는 BAP, BRCA1 및 BAP- 또는 BRCA1-암호화 유전자의 검출 또는 BAP, BRCA1 또는 BRCA1과 같은 유전자 산물의 검출용 면역제제로서 사용하기 위해 이상적인 대상이다. 이와 관련하여, 특별한 장점은 에피토프/면역원성 코어 서열을 포함하는 합성 펩타이드를 제조함으로써 실현될 수 있다. 이들 에피토프 코어 서열은 폴리펩타이드 또는 T 세포 모티프를 포함하는 것들의 친수성 및/또는 이동 영역으로서 확인될 수 있다. 상기 영역은 B 세포 또는 T 세포 자극을 가장 잘 촉진하여 특이적인 항체 생산을 유발하는 것으로써 당해 분야에 공지되어 있다.
단백질 또는 펩타이드가 단백질 또는 펩타이드가 기술된 펩타이드의 에피토프 하나 이상과 면역학적으로 교차 반응하거나 이의 생물학적 기능성 등가물임을 확인한다는 것은 간단한 문제이다. 이것은 용이하게 특이적 검정[예: 단순 제안된 에피토프 서열] 또는 보다 일반적인 검색[예: 무작위로 합성된 합성 펩타이드 또는 단백질 단편의 풀]을 사용하여 용이하게 결정될 수 있다. 검색 검정은 등가물 항원 또는 교차 반응성 항체를 확인하는데 사용될 수 있다. 어떠한 경우에도 원리는 항체와 항원간의 결합 부위에 대한 경쟁을 기본으로 한다는 점에서 동일하다.
사용될 수 있는 적합한 경쟁 검정은 면역조직화학적 검정을 기초로 한 프로토콜, ELISAs, RIA, 웨스턴 또는 도트 블롯팅 등을 포함한다. 경쟁 검정중 하나에 있어서 결합 성분중 하나, 즉 일반적으로 공지된 성분(예: BRCA1-유래 펩타이드), 또는 공지된 항체가 검출할만한 표지로 표지되고 일반적으로 표지되지 않은 채로 남아있는 시험 성분은 상응하는 반응성 항체 또는 항원에 결합하는 표지의 양을 감소시킬 수 있는 능력에 대해 시험된다.
예시적인 양태로서, BAP 또는 BRCA1 및 임의의 시험 항원간에 경쟁 연구를 수행하기 위해 우선 검출 표지(예: 바이오틴 또는 효소적, 방사능 또는 형광성 표지) 로 BAP 또는 BRCA1을 표지하여 후속적으로 확인할 수 있다. 또 다른 시험 항원과 함께 표지된 항원을 반응시켜 다양한 비율(예: 1:1, 1:10 및 1:100)로 조사되고 혼합 후에 이어서 혼합물을 본 발명의 항체에 첨가한다. 바람직하게 공지된 항체는 ELISA 플레이트에 부착시킴으로써 고정화된다. 항체에 결합하는 혼합물의 능력은 특이적으로 결합한 표지의 존재를 검출함으로써 결정된다. 상기 값은 어떠한 가능성의 경쟁(시험)항원이 반응에 포함되지 않은 대조구값과 비교된다.
분석은 하이브리드화를 기초로하는 면역학적 검정중 하나이고 반응성 항원은 이의 표지를 검출시키는 방법, 예를 들어, 비오티닐화된 항원의 경우에 스트렙아비딘을 사용하거나 효소적 표지와 연계된 색소성 기질을 사용하거나 단순히 방사능 또는 형광성 표지는 단순히 검출함으로써 검출된다. BRCA1으로서 동일한 항체에 결합하는 항원은 예를 들어, 효과적으로 결합 경쟁을 할 수 있고 따라서 검출된 표지의 양의 감소에서 입증되는 바와 같이 BRCA1의 결합을 상당히 감소시킨다.
임의의 시험 항원의 부재하에 표지된 항원(예: BAP 또는 BRCA1 조성물)의 반응성은 대조적으로 높은 값이다. 경쟁이 발생하고 결합이 감소되는 경우 대조적으로 낮은 값은 표지된 항원과 과량의 표지되지 않은 BAP 또는 BRCA1 항원을 반응시킴으로써 수득된다. 시험 항원의 존재하에 표지된 항원 반응성의 상당한 감소는 교차 반응, 예를 들어, 동일한 항체에 대해 결합 친화성을 갖는 시험 항원을 지적한다. 본원에서 "상당한 감소"는 결합에 있어서 재생성(일정하게 관찰됨) 감소로서 정의된다.
본원에 기술된 펩티딜 화합물 뿐만 아니라, 또한 발명자는 또 다른 입체적으로 유사한 화합물이 펩타이드 구조의 주요 부분과 유사하게 제조될 수 있다. 펩티도모사체로서 언급될 수 있는 상기 화합물은 본 발명의 펩타이드와 동일한 방식으로 사용되고 또는 또한 기능성 등가물이다. 구조적 기능성 등가물의 합성은 당해 분야의 기술자에게 공지된 모델링 및 화학적 디자인 기술로 성취될 수 있다. 모든 상기 입체적으로 유사한 작제물은 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 사료된다.
에피토프 서열 또는 이의 서열내의 항원성 에피토프를 포함하는 펩타이드의 합성은 통상적인 고체상 방법[시판되는 펩타이드 합성기(Applied Biosystems Model 430A Peptide Synthesizer)의 사용]과 같은 통상적인 합성 기술을 사용하여 용이하게 성취된다. 상기 방식으로 합성된 펩타이드 항원을 이어서 선결된 양으로 분취하고 통상적인 방식으로 저장[예: 수성 용제 또는 심지어 보다 바람직하게는 산제 또는 사용전 동결건조된 상태]된다.
일반적으로, 펩타이드의 관계적인 안정성으로 인해 이들은 보다 장기간(예: 6개월 이상)동안 항원 능력의 상실 또는 감소없이 실질적으로 수용액중에서 용이하게 저장될 수 있다. 그러나, 연장된 액상 저장이 고려되는 경우 일반적으로 트리스 또는 인산 완충액을 포함하여 약 pH 7.0 내지 약 7.5로 유지되도록 하는 제제를 포함하는 것이 요망된다. 더욱이 미생물 증식을 억제하는 제제(예: 나트륨 아지드 또는 메트티오레이트)를 포함되도록하는 것이 요망된다. 액체 상태중에서 연장된 저장을 위해 4℃, 또는 보다 바람직하게는 동결된 상태로 용액을 저장하도록 하는 것이 요망된다. 물론 펩타이드가 동결건조되거나 분말된 상태로 저장되는 경우 사용전에 선결된 양의 물(바람직하게는 증류수) 또는 완충액으로 재수화될 수 있는 계량된 분취액으로 무한적으로 저장될 수 있다.
4.14 부위-특이적 돌연변이
부위-특이적 돌연변이는 기술된 DNA의 특이적 돌연변이를 통해 각각의 펩타이드 또는 생물학적 기능성 등가물 단백질 또는 펩타이드의 제조에 유용한 기술이다. 당해 분야의 기술자에게 공지된 기술은 추가로, 예를 들어, 전위에 고려된 것중 하나 이상을 도입하거나 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열 변화 DNA에 도입함으로써 서열 변이체를 제조하고 시험할 수 있는 용이한 능력을 제공한다. 부위-특이적 돌연변이는 목적하는 돌연변이의 DNA의 서열을 암호화하는 특이적 올리고뉴클레오타이드 뿐만 아니라 충분한 수의 인접한 뉴클레오타이드를 사용하여 돌연변이체를 제조할 수 있도록 하여 충분한 크기의 프라이머 서열 및 서열 복합체를 제공하여 분리된 결실 연결체의 양 측면상에 안정한 이본쇄가 형성되도록 한다. 전형적으로 길이에 있어서 약 14 내지 약 25개의 뉴클레오타이드의 프라이머가 바람직하고 서열 연결부의 양 측면상에 약 5 내지 약 10개의 잔기가 변환된다.
일반적으로, 부위-특이적 돌연변이 기술은 다양한 공보에 예시된 바와 같이 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 평가되는 바와 같이 전형적으로 기술은 일본쇄 및 이본쇄 형태로 존재하는 파지 벡터를 사용한다. 부위-지시된 돌연변이에 유용한 전형적인 벡터는 M13 파지와 같은 벡터를 포함한다. 이들 파지는 용이하게 구입될 수 있으며 이의 용도는 일반적으로 당해 분야의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 이본쇄 플라스미드는 또한 일상적으로 부위 지시된 돌연변이에서 사용되고 이것은 목적하는 유전자를 플라스미드로부터 파지로 이동시키는 단계를 필요로 하지 않는다.
일반적으로, 본 발명에 따른 부위-지시된 돌연변이는 우선적으로 목적하는 펩타이드를 암호화하는 DNA 서열을 이의 서열내에 포함하는 일본쇄 벡터를 수득하거나 이본쇄 벡터의 2개의 쇄를 분리함으로써 수행된다. 목적하는 돌연변이된 서열을 함유하는 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 일반적으로 합성된다. 이어서 상기 프라이머는 일본쇄 벡터와 어닐링되고 이. 콜라이 폴리머라제 I 클레노우 단편과 같은 DNA 합성 효소로 합성하여 완전한 돌연변이 함유 쇄를 합성한다. 따라서 하나의 쇄가 돌연변이되지 않은 고유 서열을 암호화하고 또 두번째 쇄는 목적하는 돌연변이를 함유하는 헤테로듀플렉스(hetero duplex)가 형성된다. 상기 헤테로듀플렉스 벡터를 사용하여 이. 콜라이 세포와 같은 적당한 세포를 형질전환시키는데 사용하고 돌연변이된 서열 배열을 함유하는 재조합 벡터를 함유하는 클론을 선별한다.
부위 지시된 돌연변이를 사용하는 선택된 펩타이드-암호화 DNA 단편의 서열 변이체의 제조는 잠재적으로 유용한 종을 생산하는 수단으로서 제공되고 펩타이드의 서열 변이체 및 이들을 암호화하는 DNA가 수득될 수 있는 또 다른 방법이 있기 때문에 이에 한정되는 것으로서 해석되지 않는다. 예를 들어, 목적하는 펩타이드 서열을 암호화하는 재조합 벡터는 돌연변이원(예: 하이드록실아민)로 처리되어 서열 변이체를 수득할 수 있다. 이들 방법 및 프로토콜에 관한 세부 사항은 본원에 참조로서 인용된 문헌[참조: Maloy et al., 1994; Segal, 1976; Prokop and Bajpai, 1991; Kuby, 1994; and Maniatis et al., 1982]에 기술되어 있다.
부위 지시된 돌연변이에 대한 PCRTM에 기초한 쇄 오버랩 연장(SOE)[참조: Ho et al., 1989]은 특히 본 발명의 핵산 조성물의 부위 지시된 돌연변이를 위해 특히 바람직하다. PCRTM의 기술은 본원에 기술된 바와 같이 당해 분야의 기술자에게 널리 공지되어 있다. SOE 방법은 상보적인 쌍의 내부 프라이머(B 및 C)가 사용되어 적당한 뉴클레오타이드 변화를 야생형 서열에 도입하는 2단계 PCRTM프로토콜을 포함한다. 2개의 분리된 반응에서 플랭킹 PCRTM프라이머 A(제한 부위가 올리고로 도입됨) 및 프라이머 D(제한 부위가 올리고로 도입됨)는 각각 프라이머 B 및 C와 연계되어 사용되어 PCRTM산물 AB 및 CD를 합성한다. PCRTM산물을 아가로즈 겔 전기영동으로 정제하고 2개의 오버랩핑 PCRTM단편 AB 및 CD는 플래킹 프라이머 A 및 K와 배합되고 2차 PCRTM반응에 사용된다. 증폭된 PCRTM산물은 아가로즈 겔로 정제하고 적당한 효소로 분해하여 발현벡터내로 연결되고 이. 콜라이 JM101, XL 1-BlueTM(Stratagene, La Jolla, CA), JM105 또는 TG1(Carter et al., 1985)세포로 형질전환된다. 클론을 분리하고 돌연변이를 분리된 플라스미드의 서열을 분석하여 확인한다. 고유 BRCA1 유전자 서열부터 시작하여 적합한 클론 및 서브클론을 제조하고 이로부터 부위 특이적 돌연변이를 수행할 수 있다.
4.15. 생물학적 기능성 등가물
변형 및 변화가 본 발명의 펩타이드 구조에 만들어질 수 있으며 이들을 암호화하고 목적하는 특징을 갖는 단백질 또는 펩타이드를 암호화하는 DNA 단편을 수득한다. 하기에 등가물 또는 심지어 개선된 제2세대 분자를 제조하기 위해 단백질의 아미노산을 변화시킴을 바탕으로하는 문제가 논의된다. 표 1에 따라 아미노산 변화는 DNA 서열의 코돈을 변화시켜 성취될 수 있다.
예를 들어, 특정 아미노산은 상호작용하는 결합 능력의 감지할만한 상실없이, 예를 들어, 기질 분자상의 결합부위 또는 항체의 항원 결합 영역과 같은 단백질 구조에서 다른 아미노산으로 대체될 수 있다. 이것은 단백질의 상호활성 능력이고 고유 성질이기 때문에 단백질의 생물학적 기능 활성, 특정 아미노산의 대체가 단백질 구조 및 이의 DNA 암호 서열에 만들어질 수 있으며 동일한 성질을 갖는 단백질을 수득한다. 따라서 본 발명가는 기술된 조성물의 펩타이드 서열 또는 생물학적 기능 또는 활성의 감지할 만한 손실없이 상기 펩타이드를 암호화하는 상응하는 DNA 서열이 다양하게 변화될 수 있다는 것을 고려한다.
아미노산 코돈
알라닌시스테인아스파르트산글루탐산페닐알라닌글라이신히스티딘이소루신라이신류신메티오닌아스파라긴프롤린글루타민아르기닌세린트레오닌발린트립토판타이로신 Ala A GCA GCC GCG GCUCys C UGC UGUAsp D GAC GAUGlu E GAA GAGPhe F UUC UUUGly G GGA GGC GGG GGUHis H CAC CAUIle I AUA AUC AUULys K AAA AAGLeu L UUA UUG CUA CUC CUG CUUMet M AUGAsn N AAC AAUPro P CCA CCC CCG CCUGln Q CAA CAGArg R AGA AGG CGA CGC CGG CGUSer S AGC AGU UCA UCC UCG UCUThr T ACA ACC ACG ACUVal V GUA GUC GUG GUUTrp W UGGTyr Y UAC UAU
이러한 변화를 생성하는데 있어서, 아미노산의 수치료 지수(hydropathic index)는 고려할 수 있다. 단백질에 대한 상호작용성 생물학적 작용을 부여하는데 있어서 수치료 아미노산 지수의 중요성은 일반적으로 본 기술분야에 알려져 있다[참조: Kyte and Doolittle, 1982, 본원에서 참조로 혼입됨]. 아미노산의 상대적인 수치료 특성은 예를 들어 효소, 기질, 수용체, DNA, 항체, 항원 등과 같은 다른 분자와 단백질의 상호작용을 차례로 정의하는 생성 단백질의 2차 구조에 기여하는 것으로 인식된다. 각각의 아미노산은 이들의 소수성 및 전하 특성에 기초하여 수치료 지수가 지정되었다[참조: Kyte and Doolittle, 1982]. 이소류신(+4.5); 발린(+4.2); 류신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스틴(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글리신(-0.4); 트레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 티로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파르테이트(-3.5); 아스파라긴(-3.5); 리신(-3.9) 및 아르기닌(-4.5).
특정한 아미노산이 유사한 수치료 지수 또는 스코어를 갖는 다른 아미노산으로 치환되어도 유사한 생물학적 활성을 갖는 단백질이 생성된다는 것, 즉 생물학적으로 작용상 동등한 단백질이 수득된다는 것이 본 기술분야에 공지되어 있다. 이러한 변화를 생성하는데 있어서, 수치료 지수가 ±2 이내인 아미노산의 치환이 바람직하고, ±1 이내인 것이 특히 바람직하며, ±0.5 이내인 것이 더욱 특히 바람직하다. 또한, 유사한 아미노산의 치환이 친수성에 기초하여 효과적으로 생성될 수 있다는 것이 본 기술분야에 공지되어 있다. 본원에 참조로서 혼입된 미국 특허 제4,554,101호는 이의 인접한 아미노산의 친수성에 의해 제어되는 단백질의 최대 국지 평균 친수성이 단백질의 생물학적 특성과 상호 관련된다는 것을 언급한다.
미국 특허 제4,554,101호에 상세히 기술된 바와 같이, 하기 친수성 값이 아미노산 잔기에 대해 지정되어 있다: 아르기닌(+3.0); 리신(+3.0); 아스파르테이트(+3.0±1); 글루타메이트(+3.0±1); 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글리신(0); 트레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5±1); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 류신(-1.8); 이소류신(-1.8); 티로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5); 트립토판(-3.4). 아미노산은 유사한 친수성 값을 갖는 또다른 아미노산으로 치환되어 생물학적으로 동등한 단백질, 특히 면역학적으로 동등한 단백질을 수득할 수 있음이 이해된다. 이러한 변화에 있어서, 친수성 값이 ±2 이내인 아미노산의 치환이 바람직하고, ±1 이내인 것이 특히 바람직하며, ±0.5 이내인 것이 보다 특히 바람직하다.
상기 개설된 바와 같이, 아미노산 치환은 일반적으로 예를 들어 이들의 소수성, 친수성, 전하, 크기 등과 같은 아미노산 측쇄 치환체의 상대적인 유사성에 기초한다. 각종 상기 특징을 고려한 예시적인 치환은 본 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 공지되어 있으며, 아르기닌 및 리신; 글루타메이트 및 아스파르테이트; 세린 및 트레오닌; 글루타민 및 아스파라긴; 및 발린, 류신 및 이소류신이 포함된다.
4.16 핵 수송
핵 수송은 다단계 공정이다. 세포질내에서 합성법에 따라, 활성 국재화 서열(NLS)을 함유하는 단백질은 핵으로 수송되는데, 핵 엔벨로프내의 공극 복합체를 통해 유입된다[참조: Silver, 1991]. 다수의 단백질이 관여하는 이러한 공정에는 몇가지 중요한 단계가 있다. 첫째, 유입되는 단백질의 NLS가 인지되지 않으면 안된다. 둘째, 당해 단백질은 핵 공극 복합체로 유도된다. 셋째, 공극 복합체는 이들 단백질의 선택적 유입을 중재한다. 또한, 특이적 시그날과의 반응으로 핵 수송을 위해 이들을 방출하는 다른 단백질에 의해 세포질내에서 구속하는 단백질의 일부 예가 있다. NF-kB/IkB 및 Hsp90/글루코코르티코이드 수용체 상호작용은 이러한 조절의 전형이다[참조: Sanchez et al., 1985; Ghosh and Baltimore, 1990]. 또한, 단백질의 포스포릴화 상태는 이의 국재화에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들면, 효모 전사 인자 PHO4는 PHO850-PHO85-사이클린-CDK 복합체에 의해 포스포릴화되는 경우 핵으로의 전위를 차단한다[참조: O'Neill et al., 1996]. 선행의 유방 종양 세포에서 잘못된 BRCA1의 위치는 이들 단계중의 어느 하나에서의 실수로 기인할 수 있다. 그러나, 이들이 생존성이기 때문에, 대부분의 핵 수송 시스템은 이들 종양 세포에서 불완전한 것 같지는 않다. 가장 유사하게는, 이의 NLS, 또는 BRCA1의 NLS를 특이적으로 인식하는 단백질을 노출시키기 위해 BRCA1의 변형에 요구되는 단백질과 같은 민감성 조절제는 적절히 작용하지 않을 수도 있다.
4.17 약어
cdk = 사이클린 의존성 키나제
CIP = 송아지 장 알칼리 포스파타제
GST = 글루타티온-S-트랜스퍼라제
IP = 면역침전
FACS = 형광-활성화된 세포 부류
BSA = 소 혈청 알부민
p.c. = 중절 후
EGF = 상피 성장 인자
SDS = 나트륨 도데실 설페이트
PAGE = 폴리아크릴아미드 겔 전기영동
5. 실시예
하기 실시예는 본 발명의 바람직한 양태를 입증하기 위해 포함된 것이다. 하기 실시예에 기재된 기술은 본 발명의 실시에서 잘 작용하도록 본 발명자에 의해 발견된 기술을 나타내고 이의 실시를 위해 바람직한 양식을 구성하는 것으로 간주될 수 있다는 것을 본 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 알아야 한다. 그러나, 당해 분야의 숙련가는 본 기술 내용에 비추어 본 발명의 정신 및 범주를 벗어나지 않고도 많은 변화가 기술되어 있는 특정 양태에서 만들어 질 수 있고 유사한 결과를 수득할 수 있음을 인식해야 한다.
5.1 실시예 1
BRCA1 핵 포스포단백질의 특성화
본 실시예는 상이한 영역의 BRCA1 단백질에 특이적인 폴리클로날 항혈청의 분리 및 특성화를 기술한다. 이들은 BRCA1이 사람 세포에서 220kDa 포스포단백질이고 세포 주기 의존성 방식으로 발현 및 포스포릴화되며 정상 세포의 핵으로 국재화됨을 확인하기 위하여 사용된다.
5.1.1 재료 및 방법
5.1.1.1 사람 BRCA1에 특이적인 항체의 생성
마우스 폴리클로날 항혈청은 면역원으로서 세균에서 발현된 정제된 GST-BRCA1 융합-단백질을 사용하여 상술된 바와 같이 제조한다[참조: Durfee et al., 1994]. 2개의 항혈청(각각 아미노산 341 내지 748 및 762 내지 1315에 대해 생성된 항-BRCA1Bgl 및 항-BRCA1)이 본원에 기술되어 있다. 제3의 항혈청(항-BRCA1N)은 BRCA1의 처음 302개 아미노산을 암호화하는 GST 융합-단백질을 사용하여 제조한다. 모노클로날 항-BRCA1 항체(MAb 6B4)는 표준 방법에 의해 GST-BRCA1Bgl에 대해 생성된다[참조: Harlow and Lane, 1988].
5.1.1.2 완전한 길이의 BRCA1 cDNA의 생성
완전한 길이의 BRCA1 cDNA는 사람 cDNA 라이브러리를 프로빙하기 위해 엑손 11의 PCR-생성된 단편을 사용하여 수득한다[참조: Zhu, et al., 1995]. 전체 cDNA를 함께 암호화하는 3개의 중첩 클론이 확인되었다. 이어서, 이들 클론내의 편리한 제한 부위를 사용하여 pBSK(Stratagene, La Jolla, CA)에서 완전한 길이의 클론(도 1A 참조)을 수집한다.
5.1.1.3 시험관내 전사 및 해독
시험관내 해독된 BRCA1은 제조업자의 지시에 따라 TNT 망상적혈구-용해질 전사 및 해독 키트(Promega, Madison, WI)를 사용하여 cDNA로부터 제조한다. 전체 반응 용적 1/20을 이용하여 면역침전을 수행한다.
5.1.1.4 면역침전, IP/웨스턴 및 웨스턴 분석
BRCA1에 대한 3개의 폴리클로날 항혈청을 사용한 면역침전은 1:1000으로 희석한 각종 항혈청을 사용하여 표준 프로토콜(Chen et al., 1989)에 따라 수행한다. 면역침전후, 6.5% 폴리아크릴아미드 겔상에서 단백질을 분리한다.35S-메티오닌(메티오닌-유리 배지중에서 90분 동안 300μCi)가 표지된 단백질을 자동방사그라프에 의해 검출한다. IP/웨스턴 연구를 위해, 면역침전물을 ImmobilonTM막(Millipore, Bedford, MA)으로 옮기고, 표준 공정(Durfee et al., 1994)에 따라 1:1000으로 희석한 MAb 6B4로 프로빙한다. 이중 면역침전을 처음에 기술된 바와 같이 수행한다. 웨스턴 분석에 의한 p110RB 및 p84의 검출을 위해, 각각 MAb 11D7 및 항-N5-3을 문헌[참조: Durfee, et al., 1994]에 기술된 바와 같은 1차 항체로서 사용한다. 면역침전전에 송아지 장 알칼리 포스파타제를 사용한 추출물의 처리는 문헌[참조: Zhu, et al., 1995]에 기술된 바와 같이 수행한다.
5.1.1.5 간접 면역형광
간접 면역형광은 문헌[참조: Chen. et al., 1995; Durfee, et al., 1994]에 기술된 바와 같이 수행한다.
5.1.1.6 곤충 세포에서 BRCA1의 생성
개시 메티오닌 코돈의 5'에 인접한 작제된 NotI 부위를 갖는 완전한 길이의 BRCA1 cDNA를 NotI 및 SmaI 부위를 사용하여 pAcHLT-B(Pharmingen, San Diego, CA)내로 아클로닝함으로써, 바쿨로바이러스 폴리헤드린 프로모터로부터 발현된 폴리-히스티딘 부착된 BRCA1을 제조한다. 이 작제물을 제조업자의 프로토콜에 따라 BaculoGold 바이러스 DNA(Pharmingen)과 함께 SF9 세포(MD Rockville 소재의 ATTC로부터 입수)내로 공동-형질감염시킨다. 5일 후, 배양 배지를 수집하고, 제조업자의 프로토콜에 따라 플라크 검정을 수행한다. 1주일 후, 재조합 플라크를 확인하여 수집한다. 이어서, 감염된 SF9 세포로부터 발현된 단백질을 정제하기 위해 니켈-친화성 크로마토그래피를 사용하여 일부 플라크-정제된 바이러스를 BRCA1 생성에 대해 스크리닝한다. 정제된 BRCA1은 Coomassie Brilliant Blue 염색 또는 MAb 6B4를 사용한 웨스턴 블롯팅에 의해 검출한다.
5.1.1.7 FACS 분석
세포(5×105)를 트립신화시켜 70% 차가운 에탄올에 고정시키고, PBS로 세척한 다음 200㎍/ml RNase A 및 20㎍/ml 프로피디움 요오다이드를 함유하는 PBS 1ml에서 30분 동안 37℃로 재현탁시킨다. 유동 혈구측정 분석은 FACSCaliur 유동 혈구측정기(Becton-Dickinson, San Jose. CA)를 사용하여 수행한다.
5.1.1.8 키나제 분석
세포를 문헌[참조: Chen, et al., 1989]에 기술된 바와 같이 Lysis 250 완충액에 용해시키고, 추출물을 각종 사이클린 및 사이클린 의존성 키나제[CDC2, CDK2, CDC4, 사이클린 D, 사이클린 E, 및 사이클린 A: 모두 CA Santa Cruz 소재의 Santa Cruz Biotech사로부터 구입한다]에 대한 항체로 면역침전시킨다. 침전물을 세척한 다음 50㎕ CDC2 완충액(75mM HEPES, pH 7.5, 100mM MgCl2, 25mM EGTA, 3mM DTT, 1㎍/ml BSA)에 재현탁시키고, 10μCi [γ-32P] ATP의 존재하에 30분 동안 30℃에서 항온처리한다. 이어서, 반응물을 차가운 키나제 완충액으로 1회 세척하고, 복합체를 분리하여 문헌[참조: Chen, et al., 1995]에 기술된 바와 같이 항-BRCA1으로 재면역침전시킨다. 생성된 침전물을 SDS-PAGE에 의해 분리하고, 겔을 건조시켜 X-선 필름에 노출시킨다.
5.1.2 결과
5.1.2.1 독특한 BRCA1 영역에 대한 항체 조성물
마우스 폴리클로날 항혈청을 면역원으로서 상이한 영역의 BRCA1 단백질을 암호화하는 GST 융합-단백질을 사용하여 사람 BRCA1에 대해 제조한다(도 1A에 도식적으로 도시됨). 도 1B(레인 2, 4 및 6)에 도시된 바와 같이, 3개의 독립적인 항혈청 각각은35S-메티오닌-표지된 HBL100(사람 유방 상피) 세포의 완전한 세포 용해물로부터 220kDa의 분자량을 갖는, 이중 밴드로서 유동하는, 단백질을 면역침전시킨다. 이 단백질은 예비면역 혈청을 사용할 때에 관찰되지 않았다(도 1B, 레인 1). 일부 다른 단백질은 BRCA1과 공-면역침전되었기 때문에, 각 항혈청의 특이성은 1차 침저물을 변성시켜 임의의 단백질 복합체를 분쇄시킨 다음 동일한 항체로 재-면역침전시키는 이중 면역침전 프로토콜(Chen, et al., 1995)을 사용하여 추가로 확인한다. 보다 엄격한 이러한 프로토콜은 3개의 모든 항혈청에 의한 220kDa 이중선만을 검출시켰는데(도 1B, 레인 3, 5 및 7), 이는 이중선만이 3개의 독립적인 항혈청에 의해 특이적으로 인식되고 그것이 BRCA1이라는 것을 강력히 시사한다. 1단계 면역침전에서 검출된 다른 밴드의 대부분이 또한 예비면역 혈청으로 관찰되었고, 따라서 비-특이적인 것 같다. 그러나, 220kDa 이중선에 추가하여 일부 밴드는 예비면역 혈청으로 검출되지 않았다. 이들은 BRCA1과의 복합체를 형성하는 단백질일 수 있다. 강력한 이들 대부분, 예를 들어 110kDa에서의 밴드는 3개의 모든 항혈청으로 공-면역침전된다(도 1B).
220kDa 단백질이 BRCA1임을 추가로 확인하기 위하여, BRCA1에 대한 완전한 길이의 cDNA를 제조한다. 이것을 사용하여 유전자 산물의 시험관내 해독을 유도한 후, 3개의 항혈청으로 면역침전시킨다. 도 2A에 도시된 바와 같이, 3개의 모든 항혈청은 전체 세포 용해물에서 검출된 보다 낮은 이중선 밴드와 함께 이동하는 시험관내 해독 혼합물로부터 220kDa 단백질을 인식한다(도 2A, 레인 1, 3, 4 및 5). 상부 밴드는 방사활성 포스페이트를 도입하기 위해 제시하였으며, 이는 BRCA1의 포스포릴화 형태일 수 있음을 시사한다[참조: Chen, et al., 1995]. 이와 일치하여, 면역침전전에 송아지 장 알칼리 포스파타제(CIP)를 사용한 세포 용해물의 처리에 의해 빠르게 이동하는 본래의 이중선 밴드와 동일한 이동성을 갖는 단일 밴드가 생성된다(도 2A, 레인 2).
5.1.2.2 바쿨로바이러스 시스템내의 220kDa 단백질인 BRCA1
시험관내 해독된 생성물이 전사물의 크기에 기인하여 보다 소량으로 생성되기 때문에, BRCA1용의 바쿨로바이러스-기본 발현 시스템을 제조하여, 니켈-친화성 크로마토그래피를 사용하여 용이하게 정제될 수 있는 대량의 완전한 길이의 BRCA1을 제조한다. 일부 플라크-정제된 재조합 바이러스를 분석한 결과, 감염된 SF9 세포의 용해물로부터 니켈-친화성 크로마토그래피에 의해 분리될 수 있는 220kDa 단백질을 생성하는 것으로 밝혀졌다. 이 단백질은 비감염된 SF9 세포의 용해물에서는 검출되지 않는다. 감염된 SF9 세포의 추출물을 각각의 항혈청을 사용하여 면역침전시키고, 항-BRCA1 모노클로날 항체 MAb 6B4으로 웨스턴 블롯을 프로빙함으로써 면역침전된 단백질을 검출하며, HBL 100 세포로부터 내인성 BRCA1과 공동-이동하는 220kDa 단백질을 검출한다(도 2B). 이 단백질은 비감염된 세포에서 또는 예비면역 혈청을 사용한 면역침전에 의해 검출되지 않는다. BRCA1에 대한 6B4 모노클로날 항체가 모든 면역침전물에서 220kDa 단백질을 인식한다는 것은 3개의 항혈청 모두가 BRCA1인 동일한 220kDa 단백질을 인식한다는 결론을 강력히 지지한다.
5.1.2.3 세포 주기를 따르는 BRCA1의 발현
마우스에서 높은 수준의 BRCA1 mRNA 발현은 분화와 결합하여 급속히 증식되는 조직과 상호관련되는 것으로 밝혀졌다[참조: Lane, et al., 1995; Marquis, et al., 1995]. 따라서, 이것은 BRCA1 발현이 세포 주기 단계에 따라 달라질 수 있다는 근거가 된다. 이러한 가능성을 조사하기 위하여, BRCA1의 발현을 동조된 T24 방광 암 세포에서 분석한다. 이들 세포는 편리하게는 접촉 억제에 의해 G0 단계에서 정지되고, 신선한 배지에서 저밀도로 재도말하면 매우 높은 동조성을 나타낸다. 도 3A는 밀도 정지로부터 T24 세포의 방출에 따른 각종 시간에서 제조되거나 노코다졸(8시간 동안 0.4㎍/ml)을 사용하여 M-파지에서 정지된 T24 세포로부터 제조된 추출물을 사용한 BRCA1용의 IP/웨스턴을 도시한다. FACS 분석에 의해 측정된, 각 시점에서의 세포 주기 분포 프로파일은 도 3B에 제시한다. 동일한 추출물에서 Rb의 포스포릴화 상태는 세포 주기 진행의 또다른 지시제로서 사용되고(도 3B, 가운데 패널), p84의 염색(도 3A, 하부 패널)은 로딩의 정량에 사용된다. BRCA1은 비동조된 세포(레인 1)에서 용이하게 검출되었으나, 초기 G1 단계에서 매우 낮은 수준으로 발현되어 발현후 18시간이 경과할 때까지 웨스턴 블롯팅에 의해 검출할 수 없었다(레인 4). 이것은 후기 G1 단계에 상응하는데, 이는 당해 세포가 FACS 분석에 의해 2N DNA 함량을 가지지만, Rb는 이미 포스포릴화되었기 때문이다(도 3B, 레인 4). 세포가 S-상으로 들어가게 됨에 따라, BRCA1 발현은 최대까지 용이하게 증가한다(도 3A, 레인 5, 6). 발현 수준이 M-상에서 다소 감소될지라도, 이는 전반적으로 높게 유지된다(레인 7).
5.1.2.4 세포 주기중의 BRCA1의 면역염색
세포 주기 진행과 병행하여 BRCA1 발현 수준에서 변화가 제공되는 경우, 면역염색에서의 차이를 검출할 수 있는지를 측정하는 것은 흥미로운 것이다. 이를 수행하기 위해, T24 세포를 밀도 정지에 의해 G0 단계에서 다시 정지시킨 다음 낮은 밀도에서 커버슬립상에 재도말함으로써 동조 세포 주기에 들어가도록 자극한다. 여러 가지 시간에서 세포를 고정시키고, 간접 면역형광에 의한 BRCA1 발현 및 DAPI를 사용한 DNA를 위해 문헌[참조: Chen et al., 1995; Durfee et al., 1994]에 이미 기술된 바와 같이 염색한다. 결과는 도 3D 내지 도 3O에 제시되어 있다. 방출후 11시간 경과하여, BRCA1을 상동성 핵 오염으로 검출할 수 있다(도 3D 및 도 3E). 세포가 S-상(방출후 24 및 33시간)으로 진행됨에 따라, 염색은 강화되고(IP/웨스턴 데이터와 일치함) 반점이 생기게 된다(도 3F, 도 3G, 도 3H, 도 3I). 유사분열하는 동안, BRCA1 염색은 이들이 중기 플레이트(도 3J 및 도 3K)상에 정렬된 다음 제거(도 3L 및 도 3M)됨에 따라 염색체를 에워싸는 것처럼 보인다. 세포가 G1 단계로 들어감에 따라, 약한 상동성 핵 염색은 회복(도 3N 및 도 3O)되는데, 이는, 초기 G1 단계(도 3A)에서는 웨스턴 블롯에 의해 검출할 수 없을지라도, BRCA1이 세포 주기 전반에 걸쳐 발현됨을 확인시켜 준다.
5.1.2.5 세포 주기 의존성인 BRCA1의 포스포릴화
도 2A에 도시된 바와 같이, BRCA1은 생체내에서 포스포릴화됨으로써, 면역침강에 의해 220kDa 이중선에서 저- 및 과-포스포릴화된 종 모두가 검출된다. 세포 주기 진행에 대한 이러한 포스포릴화의 의존성은 G0 정지로부터의 방출 또는 노코다졸 정지에 따른 각종 시점에서32P 오르토 포스페이트를 사용하여 펄스-표지화 동조화된 T24 세포에 의해 조사된다. 이어서, 세포 추출물을 항-BRCA1으로 면역침전시킨다. 이러한 분석으로 이의 발현과 병행하는 세포 주기 의존성 방식으로 BRCA1이 포스포릴화되는 것으로 나타났으며, 이는 중기/후기 G1에서 입증되고 S-상에서 최대로 상승한 다음 M-상 전반에 걸쳐 상승된 상태로 유지된다(도 3A 및 도 3D 내지 도 3O).
5.1.2.6 특이적 사이클릭-의존성 단백질 키나제에 의한 BRCA1 포스포릴화
BRCA1 포스포릴화는 세포 주기-의존성이기 때문에, 임의의 공지된 세포 주기-의존성 단백질 키나제가 BRCA1을 포스포릴화시킬 수 있는지를 측정하였다. 이를 수행하기 위해, 세포 용해물을 각종 CDK 및 사이클린에 대해 유도된 항체로 면역침전시킨다. 이어서, 침전물을 [γ-32P]ATP의 존재하에 키나제 완충액에서 항온처리한다. 마지막으로, 침전물을 세척하고, 분리시키며, 항-BRCA1 항체로 면역침전시킨다. 이어서, 생성된 침전물을 SDS-PAGE에 의해 분리하고, 겔을 건조시켜 자동방사선사진을 찍는다. 도 4에 제시된 전형적인 연구 결과는 BRCA1이 사이클린 D 및 A(이들 모두는 cdk2와 복합체화된다)에 의해 포스포릴화됨을 제시한다. 이것은 중기 G1에서 BRCA1 포스포릴화의 개시 및 S-상중에 이의 연속된 포스포릴화와 일치한다.
5.3 논의
BRCA1에 특이적인 항혈청을 특성화하고, 이를 사용하여 정상 세포에서 BRCA1 발현을 분석한다. 결과는 BRCA1이 정상 세포에서 220kDa 핵 포스포단백질이라는 선행 관찰을 확인 및 부연 설명해준다. BRCA1 단백질의 3개의 상이한 영역에 대해 생성된 폴리클로날 항혈청은 모두 전체 세포 용해물에서 220kDa 단백질을 특이적으로 인식하는 것으로 나타났다. 면역염색은 BRCA1이 정상 세포에서 핵 단백질이라는 선행의 관찰을 재확인시켜 준다[참조: Chen et al., 1995]. 220kDa 단백질이 사실상 완전한 길이의 BRCA1임을 확인함으로써, 바쿨로바이러스 시스템을 사용하여 발현시킨 시험관내 해독된 BRCA1 및 재조합 BRCA1 모두는 HBL100 세포의 BRCA1과 공동-이동하는 것으로 밝혀졌다. 사람 세포에 있어서, BRCA1은 이중선으로 이동하며, 상부의 이중선 밴드는 BRCA1의 포스포릴화된 형태이다. 220kDa 크기는 완전한 길이의 BRCA1에 대한 예상된 분자량과 완전히 일치하고, 선행 데이터와 일치한다[참조: Chen et al., 1995; Scully et al., 1996]. 다른 연구자들은 스쿨리 등과 동일한 면역원에 대해 생성된 항체를 사용한 190kDa 단백질의 검출을 보고하였다[참조: Scully et al., 1996; Gudas et al., 1995; Jensen et al., 1996]. BRCA1은 또다른 스플라이싱을 겪는 것으로 보고되어 있고[참조: Miki et al., 1994], 190kDa 종이 일부 세포 유형에서 발현된 BRCA1의 스플라이싱된 또다른 변이체일 수 있다. 그러나, 동일한 크기의 단백질은 완전한 길이의 BRCA1 cDNA를 발현하는 레트로바이러스로 형질감염시킨 세포에서 또한 검출된다[참조: Holt et al., 1996]. 동일한 저자 그룹은 또한 분자량이 180kDa인 바쿨로바이러스-유도된 재조합 BRCA1을 기술한다[참조: Jensen et al., 1996]. 본 발명에 있어서, 바쿨로바이러스 유도된 BRCA1은 HBL100 세포로부터 BRCA1과 공-이동되는 220kDa 단백질로서 발현된다. 이러한 220kDa 단백질이 3개의 독립된 기준: 니켈-친화성 크로마토그래피, 3개의 독립적인 BRCA1-특이적 항혈청을 사용한 면역침전, 및 BRCA1-특이적 모노클로날 항체를 사용한 웨스턴 블롯팅에 의해 검출될 수 있다는 사실은 이러한 단백질이 정확하게 합성되지 않을 것 같다.
이러한 차이점에 대해서는 3가지의 설명이 가능하다. 첫째, 바쿨로바이러스를 사용한 단백질의 생성은 동질 재조합에 의해 바이러스 게놈내로 목적하는 cDNA의 도입이 요구된다. 이는 부정확한 재조합이 불완전한 단백질을 생성할 수 있고; 복수 플라크-정제된 바이러스가 정제될 수 있으며; 이들 모두는 220kDa 단백질을 생성할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 둘째, BRCA1은 단백질분해 퇴화에 감수성이고 경우에 따라 완전한 길이의 220kDa 단백질에 추가하여 저분자량 퇴화 생성물이 관찰된다는 것이 주목된다. 이러한 두 번째 가능성은 또한 사람 세포 추출물에서 190kDa 단백질의 검출로 설명할 수 있다. 마지막으로, 다른 연구에 사용된 펩타이드 항혈청은 BRCA1에 특이적이지 않지만, EGF 수용체와 같은 일부 다른 단백질에 특이적일 수 있다.
일련의 몇몇 증거는 BRCA1이 적어도 마우스에서 세포 성장의 조절 및 측정에 중요한 역할을 담당한다는 것을 시사한다. BRCA1 널접합(nullzygout) 마우스는 난 실린더 성장 단계(p.c. 5 내지 6일)에서 사망하는데, 이는 초기 세포 운명 결정에서 BRCA1의 역할을 시사한다[참조: Chia-Yang Liu, et al., 1996].
BRCA1이 사람에서 유사한 역할을 가지는지는 불분명하다. 발생상 정상 여성은 BRCA1의 대립형질 모두에서 생식세포계 넌센스 변이를 함유하는 것으로 기술되어 있다[참조: Boyd et al., 1995]. 사람에서는 BRCA1과 또다른 단백질간에 작용상 중복될 수 있고, 상이한 변이체가 상이한 효과를 가질 수 있다. 이와 관련하여, 동형접합체-널(null) 개체는 광범위하게 연구된 아쉬케나치 유대인 모집단(Ashkenazi Jewish population)중에서 발견자 BRCA1 변이에 기인하여 유방 및 난소암의 빈도가 높다고 보고되어 있음에 주목할 가치가 있다[참조: Friedman et al., 1995]. 특정부 하이브리드화 연구는 초기 마우스 배에서 편재성 BRCA1 발현을 나타내고, 사춘기중에 유방 상피에서 관찰될 뿐만 아니라 이러한 발현 시간은 급속히 성장 및 분화하는 조직에서 최고인 BRCA1 발현과 일치한다[참조: Gowen et al., 1996; Scully et al., 1996]. 이들 관찰과 일치하여, BRCA1은 세포 주기-의존성 방식으로 발현되는 것으로 밝혀졌다. 초기의 발현은 제한 시점에서 또는 제한 시점 직전에서 중기-G1 단계에서 검출된다. 발현은 S-상 단계에 최대를 나타낸 다음, M-상 단계 전반에 걸쳐 고도로 유지되어 G1 단계에서 다시 낮은 수준으로 저하된다. 세포가 G1 단계를 통과하여 S-상 단계로 들어감에 따라서 관찰되는 발현 증가와 일치하여, BRCA1은 cdk2와 복합체화된 사이클린 D 및 A 모두에 의해 명백히 포스포릴화된다. 이의 합성과 병행하여 BRCA1이 포스포릴화된다는 것은 포스포릴화된 종이 활성 형태의 단백질일 수 있고 이의 활성이 사이클린-의존성 키나제에 의해 조절된다는 것을 시사한다. 이와 일치하여, BRCA1내에는 2개의 컨센수스 cdk 포스포릴화 부위가 존재한다.
5.2 실시예 2-BRCA1 항체의 제조
BRCA1을 특성화하기 위하여, 본 발명자들은 BRCA1 엑손 11의 3' 부위에 암호화된 아미노산을 함유하는 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST)-BRCA1 융합 단백질을 생성시킴에 의해 BRCA1에 대한 폴리클로날 항체(항-BRCA1)를 생성시켰다.
5.2.1 융합 단백질
글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST)-BRCA1 융합 작제물을 창조하기 위하여, PCRTM을 사용하여 WI 38 세포(사람 이배체 폐 세포) 게놈성 DNA로부터 2개의 엑손 BRCA1 단편을 증폭시킨다. 약 1.9kb의 단편을 공개된 BRCA1 서열, 즉 BglII 부위의 상부인 BRCA9[5'-TTGCAAACTGAAAGATCTGTAGAGAGT-3'](서열 2) 및 BamHI 부위의 하부인 BRCA7[5'-TTCCAAGCCCGTTCCTCTTTCTTCCAT-3'](서열 3)에 따라 합성된 2개의 27개-뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 증폭시킨다. 이후, 증폭된 게놈성 DNA를 BglII 및 BamHI로 분해시켜 762번 코돈 내지 1315번 코돈의 1.8kb 단편을 생성시킨다. 이 단편을 정제하고 GST 발현 벡터 pGEX-2T내로 아클로닝시켜 pGST-BRCA1을 생성시킨다. 제2 플라스미드인 GST-BRCA1-Bgl을 생성시키기 위해, 245번 코돈에서 시작하는 다른 27개-뉴클레오타이드 프라이머인 BRCA8[5'-GATTTGAACACCACTGAGAAGCGTGCA-3'](서열 4) 및 프라이머 BRCA9를 사용하여 엑손 11의 거의 모두를 포함하는 3.2kb 단편을 증폭시킨다. 다음, 이 단편을 BglII로 분해하여 341번 코돈 내지 748번 코돈의 1.2kb 단편을 생성시키고 이를 변형된 pGEX-2T내로 아클로닝시킨다.
2개의 융합 단백질 각각을 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)내에서 발현시키고 마우스내에서 항원으로 사용하기 위해 글루타티온-세파로즈 비드로 정제한다. 이후, 면역화시킨 마우스로부터의 혈청을 GST 친화 칼럼상에 예비흡착시킨다. 제1 GST-BRCA1 단백질에 대해 상승된 혈청을 도면에 예시된 모든 연구에 사용한다. 예비면역 혈청을 동일한 마우스로부터 입수하여 동일하게 희석시켜 사용한다. 항-BRCA1 혈청은35S-메티오닌에 의해 대사적으로 표지된 HBL100 사람 이배체 상피 세포내 220kDa 분자량 단백질에 특이적으로 면역침전된다(참조: 도 5A). 이 단백질은 대략 1863개 아미노산 서열로부터 예측된 크기에서 이주한다(참조: Miki et al., 1994). 항-BRCA1 혈청이 BRCA1이외에 5개 이상의 단백질과 공침전되므로, 변성을 포함하는 이중 면역침전을 수행하여 단지 220kDa 단백질만을 검출한다(참조: 도 5A, 레인 3). 면역침전은 레티노블라스토마 단백질에 대해 앞서 기술한 바와 같이(참조: Chen et al., 1989), HBL세포를35S-메티오닌으로 표지시키고, 이들을 분해-250 완충액으로 분해시키며, 항-BRCA1으로 면역침전시킴에 의해 수행한다.
면역침전된 단백질을 변성 완충액[20mM 트리스-HCl(pH 7.4), 50mM NaCl, 1% SDS 및 5mM 디티오트레이톨]중에서 5분동안 비등시키고, 상이한 세제[20mM 트리스 HCl(pH 7.4), 50mM NaCl, 1% NP-40 및 1% 데옥시콜레이트]를 함유하는 분해-50 완충액으로 10배 희석시키며, 동일한 완충액중에서 항-BRCA1에 의해 재면역침전시킨다. 다음 이러한 이중 면역침전된 단백질을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)에 의해 분해시키기 전에 분해-250 완충액으로 세척한다.
2개의 추가의 폴리클로날 항체를 동일한 연구에 사용한다. COOH-말단 근처의 에피토프에 대해 지시된 C20 및 엑손 11의 5' 부위이상에 의해 암호화된 서열을 갖는 융합 단백질에 대해 상승된 BRCA1-Bgl이 제1 항체로서 동일한 단백질로 확인된다(참조: 도 5A, 레인 6). BRCA1의 1843번 내지 1862번의 아미노산에 상응하는 합성 펩타이드에 대해 상승된 토끼 폴리클로날 항체 C20을 산타 크루즈 바이오테크놀로지 인코포레이티드(Santa Cruz Biotechnology, Inc.)로부터 입수한다. 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST)-BRCA1 융합 작제물을 생성시키는데 있어서는, PCRTM을 사용하여 WI 38 세포(사람 이배체 폐 세포) 게놈성 DNA로부터의 2개의 엑손 BRCA1 단편을 증폭시킨다. 약 1.9kb의 단편을 공개된 BRCA1 서열, 즉 BglII 부위의 상부인 BRCA9[5'-TTGCAAACTGAAAGATCTGTAGAGAGT-3'](서열 2) 및 BamHI 부위의 하부인 BRCA7[5'-TTCCAAGCCCGTTCCTCTTTCTTCCAT-3'](서열 3)에 따라 합성된 2개의 27개-뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 증폭시킨다. 이후, 증폭된 게놈성 DNA를 BglII 및 BamHI로 분해시켜 762번 코돈 내지 1315번 코돈의 1.8kb 단편을 생성시킨다. 이 단편을 정제하고 GST 발현 벡터 pGEX-2T내로 아클로닝시켜 pGST-BRCA1을 생성시킨다.
제2 플라스미드인 GST-BRCA1-Bgl을 생성시키기 위해, 245번 코돈에서 시작하는 다른 27개-뉴클레오타이드 프라이머인 BRCA8[5'-GATTTGAACACCACTGAGAAGCGTGCA-3'](서열 4) 및 프라이머 BRCA9를 사용하여 엑손 11의 거의 모두를 포함하는 3.2kb 단편을 증폭시킨다. 다음, 이 단편을 BglII로 분해하여 341번 코돈 내지 748번 코돈의 1.2kb 단편을 생성시키고 이를 변형된 pGEX-2T내로 아클로닝시킨다. 2개의 융합 단백질 각각을 에스케리키아 콜라이내에서 발현시키고 마우스내에서 항원으로 사용하기 위해 글루타티온-세파로즈 비드로 정제한다. 이후, 면역화시킨 마우스로부터의 혈청을 GST 친화 칼럼상에 예비흡착시킨다. 제1 GST-BRCA1 단백질에 대해 상승된 혈청을 도면에 예시된 모든 연구에 사용한다. 예비면역 혈청을 동일한 마우스로부터 입수하여 동일하게 희석시켜 사용한다. 예비면역 혈청을 동일한 마우스로부터 입수하여 동일하게 희석시켜 사용한다. 이중 면역침전에서의 각각의 단계를 상이한 폴리클로날 항체를 사용하여 수행하는 경우 동일한 결과가 수득된다.
이들 면역학적 결과들은 220kDa 단백질이 BRCA1 유전자 생성물임을 입증한다. [32P]인산으로 표지된 HBL100 세포로부터의 분해물의 면역침전물을 단지 단일의 더욱 느리게 이주하는 종류(레인 7)만을 함유하므로 BRCA1가 포스포단백질임을 나타낸다.
BRCA1는 HBL100 세포주와 같이 정상의 상피 세포내에서만 존재하는 것이 아니라 시험한 모든 유방암 세포주내에서도 존재한다(참조: 도 5B). 이것은 단백질이32P 표지 및 약 220kDa에서 겔내로 이주하는 모든 항-BRCA1을 사용한 면역침전에 의해서 확인되므로 이들 세포내에서 매우 밀접하게 발현되는 것으로 여겨진다. 즉, BRCA1은 모든 유방암 세포주내에서 트렁케이션(truncation)에 의해 돌연변이되는 것이 아니다. 유방이외의 조직에서 기원한 종양 세포주에서, BRCA1은 유방암 세포주에서보다 더욱 풍부한 것으로 여겨지며, 이것은35S-메티오닌을 사용한 표지에 의해 방광, 경부, 결장 및 기타 암 세포내에서 더욱 용이하게 검출될 수 있다(도 5C).
5.2.2 BRCA1의 아세포적 국재화
BRCA1의 아세포적 국재화(subcellular localization)를 측정하기 위해, 본 발명자들은 HBL100 세포를 핵, 세포질 및 막 성분으로 분획화하였다(참조: Chen et al., 1994, Abrams et al., 1982). BRCA1은 정상 세포내에서는 주로 핵에서 검출된다(참조: 도 6A). 또한, HBL100, 몇 개의 다른 정상 세포주 및 유방 또는 난소이외의 조직으로부터 기원한 종양 세포를 포함하는 완전한 세포의 간접적인 면역염색에서 BRCA1는 핵에 국재화된다(참조: 도 6B 내지 도 6Q; 표 2). 이와 대조적으로 BRCA1은 시험한 거의 모든 유방암 세포주의 세포질내에서 주로 검출된다(참조: 도 6J 내지 도 6Q; 표 2). 유방암에서 확립된 17개의 세포주중 14개의 세포주에서, BRCA1 염색은 기본적으로 세포질 염색이다. 2개의 다른 유방암 세포주의 경우에는, 핵 및 세포질 염색이 동일한 세포에서 관측된다. 원래 뇌 전이로부터 기원한 하나의 세포주, 즉 MDA-MB361(참조: Cailleau et al., 1978)는 2개의 뚜렷한 세포 집단을 함유하는데, 즉, BRCA1이 핵에 국재화된 더욱 크고 더욱 이종인 세포의 덜 풍부한 분획 및 BRCA1이 세포질에 국재화된 더욱 작고 더욱 동종인 세포의 더욱 풍부한 분획. 몇 개의 동일한 세포주 내에서의 세포 분획화에 의해 유사한 결과가 수득된다. 이들 결과는 BRCA1이 대부분의 유방 및 난소암 세포주의 세포질내에 비정상적으로 국재화되어 있음을 제시한다.
다음, 악성종양 늑막 삼출액 및 유방암 환자의 생검 분획으로부터의 제1 세포를 실험한다. 17명의 상이한 환자로부터 입수한 제1 악성 종양 삼출액 세포의 모두에서, BRCA1는 또한 주로 세포질내에 국재화되어 있다(참조: 도 7N 및 도 7P; 표 2). 현탁액중에서 생장한 다른 종양 세포(즉, 백혈병 세포주인 CEM, HL60 및 Molt4) 또는 늑막으로의 전이된 세포(K562 및 U937)는 주로 핵내에서 염색된다(참조: 표 2).
배양물내 및 악성 종양 늑막 삼출액으로부터의 유방 종양 세포는 모든 이미 진행된 전이암으로부터 기원한다. BRCA1이 또한 제1 종양에 비정상적으로 국재화되어 있는지를 측정하기 위해, 본 발명자들은 동일한 폴리클로날 항-BRCA1 혈청을 사용하여 조직 분획내 세포를 염색하였다. BRCA1의 완전한 국재화 또는 부분적인 국재화가 대부분의 유방암 세포의 세포질내에서 발견되었다(참조: 도 8A, 도 8B 및 도 8C). 50개의 생검중, BRCA1 염색은 6개(12%)에서는 세포질에서, 34개(68%)에서는 세포질 및 핵에서 가변적인 정도로 및 10개(20%)에서는 주로 핵에서 염색되었으며, 2개(4%)에서는 염색되지 않았다(표 2). 이들 결과는 제1 유방 종양 및 인접한 전이암에서 BRCA1의 비정상적인 아세포성 국재화를 입증한다. BRCA1의 완전한 잘못된 국재화(mislocation)은 말기 단계의 유방암에서 더욱 일반적인 것으로 여겨지지만, 그럼에도 불구하고 무작위적인 조사에서는 대부분의 종양에서 가변적인 정도로 일어나는 것으로 여겨진다. BRCA1이 없는 4%의 종양 모두는 계통적 경우에서 존재할 수 있으며, 이러한 퍼센트는 모든 종류의 유방암에서 BRCA1 돌연변이의 유사하고 작은 발생과 일치한다(참조: Claus et al., 1991). 도 8C에서 종양으로부터의 기질 세포와 호중구에서 BRCA1에 대한 염색은 핵에서 일어나는 반면, 동일한 분획에서 유방암 세포는 동일한 과정에 의해 전혀 염색되지 않는다는 것을 주목하라.
세포주들, 즉 악성 늑막 삼출액 및 조직 생검 분획으로부터의 제1 종양 세포에서 BRCA1의 아세포적 국재화
조직 또는종양의 기원 경우(n) BRCA1 국재화 BRCA1 부재
핵 세포질 핵 및 세포질 모두
확립된 세포주
정상 섬유아세포 2 2 0 0 0
신장 상피 1 1 0 0 0
방광암 3 3 0 0 0
경부암 2 2 0 0 0
백혈병 또는 임파구 4 4 0 0 0
골육종 2 2 0 0 0
전립선암 1 1 0 0 0
횡문근육종 2 2 0 0 0
유방 상피 1 1 0 0 0
유방 아데노암 18 1 15 2 0
난소암 3 1 2 0 0
악성 종양 삼출액
유방 아데노암 17 0 17 0 0
난소암 8 0 8 0 0
백혈병 또는 임파구 2 2 0 0 0
고정 조직 분획
여과시킨 임파구 50 50 0 0 0
유방암 50 8 6 34 2
BRCA1 아미노산 서열은 통상적인 이부분으로된 핵 국재화 시그날(NLSs)(참조: Miki et al., 1994)을 갖지 않지만, 2개 이상의 다른 추정적인 NLS(참조: Boulikas, 1994)를 함유한다. 이들 시그날, 즉 419번 내지 427번 아미노산인 NKLKRKRRP(서열 5) 및 609번 내지 615번 아미노산인 NRLRRKS(서열 6)은 에스트로겐, 프로게스테론 및 기타 스테로이드 호르몬 수용체 분자에서 발견되는 서열과 유사하다(참조: Boulikas, 1994; Arriza et al., 1987; Danielsen et al., 1986; Green et al., 1986; Kastner et al., 1990; laudet et al., 1991). 주로 세포질성 국재화로부터 핵으로의 활성화 및 재분배를 위해, 스테로이드 호르몬 수용체는 이들의 리간드에 대한 결합, 구조적 변화 및 아마도 이량체화를 필요로 한다(참조: Forman and Samuels, 1990; Jensen, 1991). BRCA1은 기타 핵 단백질을 지닌 패신저(passenger)로서, 세포질내에서 이를 고정시키는 단백질로부터의 해리에 의해 또는 자체의 고유한 잠재적 NLS이 노출되도록 변형된 후에, 유사한 방식으로 핵에 정상적으로 국재화될 수 있다. 유사한 수송 기작이 SV40 거대 T 항원 및 c-Fos를 포함하는 다른 전사 인자에 대해 입증된바 있다(참조: Schneider et al., 1988; Roux et al., 1990; Moll et al., 1991). BRCA1의 합성 부위로부터 핵내 작용 부위로의 이의 수송 경로에 포함된 분자의 돌연변이는 많은 특발성 유방암에서 동일한 결정적인 단백질을 불활성화시키는 변형된 방법일 수 있다.
5.3 실시예 3
핵 수송 시그날 수용체의 임포르틴-α 소단위와 상호작용하는 BRCA1의 서열
BRCA1 유전자 생성물은 대부분의 유방암 세포의 세포질내에 비정상적으로 국재화되어 있는 핵 포스포단백질이다. BRCA1 단백질의 핵 수송에 대한 강력한 기작을 추정하기 위한 시도로서, 고도로 하전된 염기성 잔기인503KRKRRP508(서열 7) 606PKKNRLRRKS651(서열 8) 및651KKKKYN656(서열 9)를 강력한 핵 국재화 시그날(NLS)로서 확인하였다. 이들 3개의 영역을 각각503KLP3508,607KLS615및651KLA656로 연속하여 돌연변이시킨다. 야생형 및 돌연변이된 단백질을 플랙 에피토프로 태크(tag)하고, 사람 DU145 세포내에서 발현시키며, M2 모노클로날 항체로 검출한다. DU145 세포에서는 KLP 돌연변이체가 핵에 국재화되지 못한 반면, KLS 돌연변이체는 일시적인 핵 국재화와 함께 주로 세포질에 국재화된다. KLN 단백질은 항상 핵내에 국재화된다.
일관되게, NLS 수용체 복합체 성분인, hSRP1α(임포르틴-α)는 미끼로서 BRCA1을 사용하는 효모 2개-하이브리드 스크리닝에서 확인된다. BRCA1 및 임포르틴-α사이의 상호작용 특이성은 또한503KRKRRP508(서열 7) 및606PKKNRLRRKS651(서열 8) 영역이 이러한 상호작용에 대해 임계적이나651KKKKYN656(서열 9)는 이러한 상호작용에 대해 임계적이지 않음을 밝힘으로써 추가로 입증된다. 유방암 세포내 내인성 BRCA1의 세포질적 잘못된국재화가 세포의 결핍성에 기인하는지의 여부를 측정하기 위하여, 플랙 에피토프로 태크된 야생형 BRCA1 단백질을 6개의 유방암 세포주내에서 비정규적으로 발현시킨다. 이 분석은 6개 모두에서, 이 단백질이 이들 세포의 세포질에 국재화됨을 입증하고 있다. 대조적으로, 4개의 비-유방암 세포주 내에서의 발현은 핵 국재화를 초래한다. 이들 데이터는 유방암 세포내에서 BRCA1 단백질의 잘못된 국재화가 NLS 수용체-중재된 핵 도입 경로에 포함된 세포 기구에 있어서의 결손에 기인할 수 있음을 제시한다.
5.3.1 실험 공정
5.3.1.1 세포 배양 및 DNA 형질감염
사람 세포주 DU145(전립선암), T24(방광암), T47D, ZR75, MB231, MB468, MDA330, MCF7(유방암), HBL100(SV40으로 사멸되지 않은 정상의 유방 상피 세포) 및 CV1(원숭이 신장 세포주)를 37℃의 습도가 조절된 10% CO2-함유 대기내에서 10%의 열-불활성화시킨 태 송아지 혈청(Hyclone Laboratories, Inc. 제조원)이 보충된 둘베코 이글스 변형 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium: DMEM; Life Technologies, Inc.)내 플라스틱 표면위에서 생장시킨다. 60%의 합치로 생장시킨 세포의 10cm-디쉬 각각을 인산칼슘법(참조: Kingston, 1994)을 사용하여 10㎍의 플라스미드 DNA로 형질감염시킨다. 인산칼슘 침전물을 배양 배지내에 6 내지 8시간동안 둔다. 이후, 배지를 제거하고 세포에 신선한 배지를 재공급한다.
5.3.1.2 NLS 돌연변이유발
BRCA1의 3개의 추정적인 핵 국재화 서열내에 돌연변이를 도입시키기 위하여, PCRTM법을 사용한다. 요약하면, HindIII 제한 부위(하기 밑줄친 부위)를 갖는 다음의 외부 프라이머 및 내부 프라이머를 사용하여 각각의 NLS 서열의 프레임내 결실 및 류이신 잔기의 도입을 유발시킨다. NLS 돌연변이 모두에 대해 사용된 외부 프라이머는 5'-GATTTGAACACCACTGAGAAGCGTGCA-3'[BRCA1 cDNA의 745번 내지 771번](서열 4) 및 5'-CTTTAAGGACCCAGGTGGGCAGAGAA-3'[2791번 내지 2765번](서열 10)이다. KLP 돌연변이를 위해 다음의 내부 프라이머를 사용한다. 1A: 5'-CCTTTTAAGCTTTAATTTATTTGTGAAGGGGACGCTC-3'[1521번 내지 1495번](서열 11) 및 1B 5'-CCTTAAAGCTTCCTACATCAGGCCTTCATCCTGA-3'(서열 12). KLS 돌연변이를 위해 다음 내부 프라이머를 사용한다. 2A 5'-CTCCCAAGCTTAGGTGCTTTTGAATTGTGGATATTT-3'[1830번 내지 1806번](서열 13) 및 2B 5'-CCTCCCAAGCTTTCTTCTACCAGGCATATTCATGCGC-3'[1854번 내지 1879번](서열 14). KLN 돌연변이를 다음 내부 프라이머를 사용하여 생성시킨다: 3A 5'-CCTCCCAAGCTTTATCTCTTCACTGCTAGAACAACT-3'[1962번 내지 1939번](서열 15) 및 3B 5'-CCTCCCAAGCTTAACCAAATGCCAGTCAGGCACAGC-3'[1978번 내지 2101번](서열 16).
완전한 길이의 BRCA1 cDNA를 함유하는 플라스미드 BSK-BRCA1a(참조: Chen et al., 1996)를 내부 및 외부 프라이머의 쌍 각각을 사용하는 PCRTM증폭에 대한 주형으로 사용한다. 수득되는 DNA 단편을 겔 정제하고 N-말단 cDNA 단편에 대해 AflII 및 HindIII로 절단하고 C-말단 cDNA 단편에 대해 KpnI 및 HindIII로 절단한다. 다음 N- 및 C-말단 단편을 사용하여 pBSK-BRCA1a내 AflII/KpnI 단편을 교환시킨다. NLS 부위 각각에서 HindIII 부위의 연결로 프레임내 결실 및 루이신 잔기의 경우 CTT 코돈의 첨가가 일어난다. pBSK-BRCA1-KLP, KPS 및 KLN으로부터의 AflII/KpnI 단편을 사용하여 발현 벡터 pCEP-플랙BRCA1(참조: Chen et al., 1996)내 유사한 단편을 교환시켜 pCEP-플랙BRCA1KLP, pCEP-플랙BRCA1KLS및 pCEP-플랙BRCA1KLN을 생성시킨다.
5.3.1.3 일시적 발현 및 면역염색
세포를 에피토프-(플랙, Kodak, IBI) 태크된 NLS 돌연변이 단백질의 발현을 위해 CEP-플랙BRCA1KLP, pCEP-플랙BRCA1KLS또는 pCEP-플랙BRCA1KLN을 형질감염시키고 플랙 태크된 야생형 BRCA1을 위해 pCEP-플랙BRCA1을 형질감염시킨다. 재플레이팅시켜 커버슬립상에서 30시간동안 생장시킨 후에, 세포를 고정시키고 앞서 기술한 공정(참조: Mancini et al., 1994)을 사용하여 M2 플랙 mAb(Kodak, IBI 제조원)로 간접적으로 면역염색시킨다. Zeiss AxiophotTM형광 현미경에 부착된 Hammnmatsu Color Chilled 3CCD 카메라를 사용하여 현미경 사진을 획득한다. 상 파일을 Adobe PhotoshopR을 사용하여 나타내기 위해 계수적으로 처리한다.
5.3.1.4 면역침전 및 웨스턴 블롯
BRCA1 단백질을 마우스 항-BRCA1-Bg1 항체(참조: Chen et al., 1995)를 사용하여 기술한 바와 같이(참조: Chen et al., 1995) 면역침전시킨다. SDS/PAGE 에피토프-태크된 BRCA1 단백질을 항-플랙 M2 mAB(Kodak, IBI 제조원)를 사용하는 웨스턴 블롯에서 검출하고 내인성 BRCA1을 BRCA1-BgI 항체를 사용하여 검출한다(참조: Chen et al., 1995).
5.3.1.5 BRCA1 활성화 도메인의 확인
BRCA1의 활성화 도메인의 확인은 GAL1(UASG)의 상부 활성화 서열내 GAL4-결합 부위를 갖는 프로모터의 조절하에 lacZ 수용체를 함유하는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 균주 Y153내에서 효모 1-하이브리드 검정에 의해 수행한다(참조: Durfee et al., 1993). 도2A 및 도2B의 BRCA1 결실 작제물은 pAS(참조: Durfee et al., 1993)내 GAL4(참조: Keegan et al., 1986; Ma and PCashne, 1987)의 DNA-결합 도메인을 편리한 제한 부위를 사용하여 pBSK-BRCA1a(참조: Chen et al., 1996a)로부터 수득한 cDNA 단편내로 해독적으로 융합시킴에 의해 수득한다. β-갈락토시다제 활성은 앞서 기술한 바와 같이(참조: Durfee et al., 1993), 콜로니 색상으로 측정하고 검정시 키오로페닐 레드β-갈락토피라노사이드를 사용하여 적량한다.
5.3.1.6 효모 2개-하이브리드 스크리닝
사람 B 임파구로부터 제조된 cDNA 라이브러리를 앞서 기술한 바와 같이(참조: Durfee et al., 1993) 스크리닝한다. pAS-BRCA3.5(참조: 도2A 및 도2B)로부터의 단백질은 "미끼"로서 확보하며, 이는 플라스미드 pAS(참조: Durfee et al., 1993)내 GAL4 DNA-결합 도메인에 융합된 BRCA1의 1번 내지 1142번 아미노산으로 이루어져 있다(참조: Keegan et al., 1986; Ma and PCashne, 1987).
BRCA1의 NLS와 임포르킨-α-효모 균주 Y153사이의 상호작용을 pAS-BRCA3.5, pAS-KLP, pAS-KLS 또는 pAS-KLN 및 pACT-임포르틴220-259(참조: 도 3A)으로 함께 형질감염시키고 기술된 바와 같이(참조: Durfee et al., 1993) β-갈락토시다제 활성에 대해 검정한다. 임포르틴-α 발현을 위해 220번 내지 529번 아미노산을 암호화하는 cDNA를 pACT내 GAL4(참조:Keegan et al., 1986; Ma and PCashne, 1987)의 활성화 도메인에 융합시킨다(참조: Durfee et al., 1993). pAS-KLP, pAS-KLS, 매드 pAS-KLN은 pBSK-BRCA1-KLP, KLS 및 KLN으로부터의 BRCA11-1142cDNAs를 pAS내 GAL4의 DNA-결합 도메인에 융합시킴에 의해 작제한다(참조: Durfee et al., 1993). β-갈락토시다제 활성을 상술한 바와 같이 검정한다.
5.3.2 결과
5.3.2.1 BRCA1내 핵 국재화 서열
BRCA1 핵 수송 연구를 개시하기 위하여 NLS 모티프를 확인한다. 아미노산 서열을 분석함으로써 BRCA1내에서 3개의 가능한 핵 국재화 서열을 발견하였다. 이들 고도로 하전된 염기성 잔기의 3개 영역은 503-KRKRRP-508(서열 7), 606-PKKNRLRRKS-615(서열8) 및 651-KKKKYN-656(서열 9)이다(참조: 도 9). 이들 서열이 핵 국재화에 작용성인지를 측정하기 위하여 각각의 부위에서 프레인내 결실 및 류이신 잔기의 첨가가 일어나는 PCRTM돌연변이유발을 수행한다. 돌연변이된 단백질 각각을 플라스미드 pCEP-플랙BRCA1KLP, pCEP-플랙BRCA1KLS및 pCEP-플랙BRCA1KLN내 N-말단 플랙 에피토프(Kodak, IBI)를 함유하는 융합체로서 DU145 세포내에서 발현시킨다. 이들 연구에서 완전한 길이의 태크 단백질의 발현을 입증하기 위하여, 침전 및 검출용 항-BRCA1 및 항-플랙 M2 항체를 사용하여 IP 웨스턴을 수행한다. 완전한 길이의 내인성 BRCA1과 동일한 이동성을 갖는 플랙-태크된 BRCA1 단백질이 발현된다.
각각의 돌연변이된 단백질 및 야생형 단백질 각각의 아세포성 국재화는 항-플랙 M2 mAB(참조: Kodak, IBI)를 사용한 면역염색에 의해 측정한다. 앞서의 연구와 일관되게, 야생형 플랙-BRCA1 단백질은 핵내에 국재화된다. 651-KLN-656 돌연변이 또한 핵에 국재화되며 이는 잔기 651-KKKKYN-656(서열 9)이 플랙-BRCA1KLN의 핵 수송에 중요하지 않음을 나타낸다. 대조적으로 503-KLP-508 및 607-KLS-615 돌연변이 모두는 플랙-BRCA1KLP및 플랙-BRCA1KLS의 세포질 국재화를 초래하며, 이는 이러한 염기성 잔기 모두가 핵 도입에 중요하다는 것을 나타낸다. 이들 연구 진행 동안에, 과발현된 경우 플랙-BRCA1KLS이 일부 예에서 핵에 국재화됨에 주목하라. 이러한 돌연변이된 단백질이 과발현되는 경우 때때로의 핵 염색은 KLP 돌연변이를 사용하여 간측되는 것이라기 보다는 세포질성 핵 수용체에 대한 약간의 높은 친화성의 결과일 수 있다. 플랙-태크된 BRCA1KLP은 핵내에서 전혀 관측되지 않는 것은 명확하다.
5.3.2.2 BRCA1-상호작용 단백질의 확인
BRCA1의 핵 수송은 다른 세포 단백질과의 상호작용을 필요로 한다. 본 발명자들은 효모 2개-하이브리드법을 사용하여 BRCA1-상호작용 단백질을 암호화하는 유전자를 클로닝하였다. BRCA1은 전사 인자인 것으로 제안되어 있으므로(참조: Miki et al., 1994), 전사 활성을 갖는다. 이러한 활성의 존재는 2개-하이브리드 검정을 혼돈시킬 수 있다. BRCA1내 강력한 전사 도메인을 작용적으로 확인하기 위햐여, BRCA1 단백질의 각종 도메인을 플라스미드 pAS내 GAL4(참조: 도 2A 및 도 2B)의 DNA-결합 도메인과 프레임내 융합시킨다(참조: Durfee et al., 1993). 이들 융합 단백질이 활성화 도메인을 함유하는 경우, 이들은 Y153 균주내로 형질감염된 후 GAL4 UASG-반응성 β-갈락토시다제 리포터(참조: Durfee et al., 1993)를 활성화시킬 것이다. 이러한 분석을 통해 본 발명자들은 강력한 활성화 도메인이 1142번 내지 1646번 아미노산 사이에 위치함을 확인하였다(참조: 도 2A 및 도 2B). 이들 활성화 도메인은 BRCA1의 1번 내지 1142번 아미노산만을 함유하는 BRCA3.5(참조: 도 2A 및 도 2B)내에서 결실되어 있다. 다음 BRCA3.5를 앞서 기술한 바와 같이(참조: Durfee et al., 1993) BRCA1-상호작용 단백질 스크리닝용 미끼로서 pAS 벡터의 GAL4 DNA-결합-도메인에 융합시킨다. 4개의 상이한 클론이 확인되어 서열분석된다. 다음 GenBankTM과 비교한 결과, 본 발면자들은 1개는 신규하며, 1개는 특성화되지 않은 징크 핑거 도메인-함유 단백질과 동질이며 2개의 나머지 서열은 이미 클로닝된 cDNA와 동질임(참조: 표3)을 발견하였다. 흥미롭게도, hBRCA21의 서열은 또한 임포르틴-α(참조: Gorlich et al., 1994) 또는 카리오페린-α(참조: Radu et al., 1995)로서 공지된 핵 국재화 시그날 수용체 hSRP1α의 것과 동일하다.
BRCA1-상호작용 단백질을 암호화하는 클론의 요약
5.3.2.3 임포르틴-α와 BRCA1 NLS의 상호작용
BRCA1의 NLS와 hSRP1α의 강력한 상호작용을 시험하고 BRCA1의 작용성 NLS에 관해 추가로 입증하기 위하여, 효모 2개-하이브리드 검정을 사용한다. 이 시도는 효모-2개 하이브리드 시스템내 BRCA11-1142과 상호작용하여 GAL4 UASG-반응성 β-갈락토시다제 유전자를 활성화시키는 hSRP1α/임포르틴-α의 능력의 장점을 취한다. 이 검정에서는 야생형 BRCA1 아미노산 서열 1번 내지 1142번을 가진 pAS-BRCA3.5 또는 pAS 발현벡터(pAS-KLP, pASKLS 및 pASKLN)내로 클로닝된, 돌연변이된 NLS 서열, KLP, KLS 및 KLN을 함유하는 동일한 영역을 사용한다.
BRCA11-1142와 상호작용하는 것으로 공지된 220번 내지 529번 아미노산으로부터의 임포르틴-β의 영역을 pACT내 GAL4의 활성화 도메인에 해독적으로 융합시킨다(참조: Durfee et al., 1993). 2개-하이브리드 검정에서, 야색형 BRCA11-1142를 암호화하는 pAS-BRCA3.5의 발현은 청색 콜로니를 형성하며 네가티브 대조군, 즉 형질감염되지 않은 Y153 세포의 것보다 β-갈락토시다제 활성에 있어 100배 증가되어 있다. 핵내로 전위하는 플랙-BRCA1KLN의 능력과 일치하여, pAS-KLN 의 검정 또한 청색 콜로니를 형성하며 β-갈락토시다제 활성에 있어 150배 증가되어 있다. 핵내로 도입될 플랙-BRCA1KLP의 불능과 일치하여, BRCA11-1142내 이러한 돌연변이는 백색 콜로니를 형성하며 백그라운드보다 β-갈락토시다제 활성의 증가가 없다. 흥미롭게도, pAS-KLS의 발현은 백그라운드보다 β-갈락토시다제 활성에 있어 10배 증가된 것으로 입증된다. 앞서 주목한 바와 같이 활성에 있어서의 이러한 증가는 플랙-BRCA1KLS이 과발현되는 경우 때때로의 핵 국재화를 나타내는 이러한 돌연변이에 대한 면역염색 데이터와 일치한다.
5.3.2.4 유방암 세포에서 BRCA1 세포질 국재화
앞서, 본 발명자들은 플랙-태크된 BRCA1을 함유하는 발현 플라스미드를 2개의 유방암 세포주인 T47D 및 MB468과 하나의 불멸화된 비-유방 상피세포주인 HBL10내로 형질감염시켰다. 플랙-태크된 BRCA1 단백질은 T47D 및 MB468 세포의 세포질에서 및 HBL100 세포의 핵에서 항-플랙 M2 모노클로날 항체를 사용한 면역염색에 의해 발견되었다. 이러한 관측을 확인하고 완전한 길이의 플랙-태크된 BRCA1 단백질의 발현을 입증하기 위하여, 본 발명자들은 표 4에 나타낸 4개의 비-유방암 세포와 6개의 유방암 세포주를 사용한 본 연구를 반복하였다. 플랙-BRCA1의 핵 국재화는 정상의 원숭이 신장 세포 CV1 및 DU145, T24 및 HBL100 세포에서 관측된다(참조: 표 4). 대조적으로, 이러한 단백질의 세포질 국재화는 ZR75 및 MB231과 MB468, MDA330 및 MCF7 유방 종양 세포에서 관측된다(참조: 표 4). 이러한 데이터는 유방암 세포내 BRCA1 단백질에 대한 변형된 수송 또는 보유 시스템을 제안한다.
BRCA1 염색 결과의 요약
5.3.3 토의
BRCA1 단백질의 효율적인 핵 수송에 있어 중요한 503번 내지 508번과 606번 내지 615번의 하전되고 염기성인 아미노산의 2개 영역의 확인은 이러한 개념을 지지한다. 이들 2개의 모티프간의 거리는 뉴클레오플라스민의 2개 부분으로 된 부위를 분리하는 10개 이상의 많은 아미노산이다(참조: Robbins et al., 1991). BRCA1내 NLSs의 구조 및 작용은 폴리오마 거대 T 항원(참조: Richardson et al., 1986), 인플루엔자 A 바이러스 NS1 단백질(참조: Greenspan et al., 1988) 및 아데노바이러스 DNA-결합 단백질(참조: Morin et al., 1989)에서의 것들과 같이 2개의 NLS가 더욱 멀리 떨어져 있는 다른 핵 단백질과 유사하다. 본 발명자들이 비록 세포질로부터 핵으로 BRCA1의 전위에 있어 다른 서열들이 또한 요구된다는 가능성을 밝혀내지 못했다하더라도, 503번 내지 508번에서의 NLS는 이러한 과정에 있어 필수적이다.
이러한 관측은 BRCA1내 503번 내지 508번에서 NLS의 돌연변이에 있어 임포르틴-a와의 상호작용이 완전히 파괴되어 있음을 보여주는 결과에 의해 지지된다. BRCA1내 606번 내지 615번에서의 NLS는 덜 중요한데, 왜냐하면, 이러한 NLS의 돌연변이가 BRCA1의 핵 도입을 완전히 감소시키지 못하기 때문이다. BRCA1이 작용성 NLS를 갖는 핵 단백질임을 나타내는 본 발명자들의 연구는 단백질이 막-결합되어 분비됨을 나타내는 보고(참조: Jensen et al., 1996)와는 약간의 차이가 있다. 이러한 모순은 혼돈을 가져오지만 상피 성장 인자 수용체에 대한 펩타이드 항혈청의 가교-반응성에 의해 설명될 수 있다(참조: Wilson et al., 1996).
BRCA1 단백질에 특이적인 마우스 폴리클로날 항체를 사용하여, 본 발명자들은 진행된 유방암 세포의 세포질내에 풍부하게 존재하는 220kDa 핵 단백질임을 일관되게 발견하였다(참조: Chen et al., 1995; Chen et al 1996b). 그러나, 스쿨리 등(참조: Scully et al., 1996)은 220kDa BRCA1 단백질이 일부 유방암 세포주의 핵내에 존재함을 보고하였다. 비록 이러한 모순에 대한 정확한 이유가 명확치는 않다고 해도, 덜 특이적인 항체, 강력한 면역염색물, 또는 이들 모두의 가능성을 배제할 수 없다. 비정규적 위치에서 발현되는 에피토트-태크된 BRCA1 단백질에 의해서 및 특이적인 항-플랙 M2 모노클로날 항체를 사용하여, 본 발명자들은 BRCA1에 대한 고도로 특이적인 항체를 수득하는데 있어서의 난제를 우회하였다. 이러한 완전히 상이한 시도를 통해, 유방암 세포내에서 발현된 야생형 플랙-태크된 BRCA1은 세포질내에 존재한다. 이 결과는 또한 유방암 세포내 잘못된 위치가 BRCA1 자체의 돌염변이에 기인하는 것이 아님을 제시한다. 오히려, 변형된 국재화는 아마도 BRCA1의 핵 수송 수준에서 세포내 변형 결과인 것으로 여겨진다.
이와 관련하여, BRCA1이 임포르틴-핵 수송 수용체 복합체의 소단위와 상호작용한다는 본원의 증명은 중요한 단서가 될 수 있다. 그러나, 임포르틴-α 소단위 또는 임포르틴-기질 복합체에 관한 문제, 즉 왜 이것은 유방 상피 세포내에서 증식하는가?, 이러한 사실은 BRCA1에 대한 임포르틴-α의 예상되지 않은 특이성을 나타내는 것인가? 및 BRCA1의 작용에 있어서의 결손이 세포질 또는 핵내에 잔존하는 것은 아닐까? 하는 문제가 존재할 수 있다. 핵 공극 복합체를 통과하는 전위가 일어날 경우, 임포르틴-α는 핵 작용 영역으로 수송 기질을 동반하는 것으로 보고되어 있다(참조: Gorlich et al., 1995b). 핵내에서 임포르틴-α로부터 해리된 BRCA1과 관련된 문제가 존재하는 경우, 아마도 BRCA1 단백질은 핵으로부터 즉시 배출되어 세포질 국재화를 나타낼 것이다. 정상 세포 및 유방암 세포를 사용하는 고를리히 등(참조: Gorlich et al., 1995b)에서의 연구와 유사한 공동-국재화 연구는 이러한 가능성에 초점을 맞추고 있다.
다른 가능성은 유방암 세포내에서, BRCA1의 핵 수송의 조절에 있어서의 문제가 존재한다는 것이다. 핵 전위를 조절하는 공지된 기작(참조: 참조 문헌 12 및 13)은 다음과 같다: (a) 포스포릴화/데포스포릴화, 즉 c-rel 및 v-jun과 사이클린 B-Cdk 복합체 및 펜듈린과 같은 세포 주기-조절된 단백질; (b) 도르살(dorsal), 즉 NF-KB, 글루코코르티코이드 수용체 및 주기성 단백질에서 관측된 바와 같은 NLS의 차폐에 의한 세포질 보유 또는 (c) 핵 공극 복합체 수준에서의 더욱 일반적인 조절. 이들 조절 시스템중 어느것에서 유전 산물내 혼란은 유방 상피 세포내 BRCA1의 세포질 국재화를 집중적으로 초래할 수 있다. 2개-하이브리드 스크리닝에서 확인된 다른 BRCA1-상호작용 단백질의 일첨가 유방암 세포에서 이러한 종류의 규칙을 갖는다는 가능성이 시험중에 있다.
흥미롭게도, 유방암 및 기타 유형의 암 세포내에서 핵 종양 억제 단백질의 세포질로의 잘못된 위치에 대한 다른 보고가 있다. 27개 경우의 유방암을 시험한 것 중, 37%는 p53에 대해 세포질 염색을 입증하였으며, 이에 의한 서열분석은 야생형임을 나타내었다(참조: Moll et al. 1992). 다른 연구에서, 야생형 p53은 집적된 사람 파필로마바이러스-18 또는 -16을 갖는 사람 경부암 세포주의 세포질내에 위치하는 것으로 밝혀졌다(참조: Liang et al., 1993). 이들 연구 모두는 정상의 p53의 종양 억제 작용이 일부 경우에 세포질적 잘못된 위치에 의해 비활성화될 수 있음을 제시한다(참조: Moll et al. 1992; Liang et al., 1993). 이들 데이터는 BRCA1에 대한 본 발명자들의 관측과 유사하며 유방암 세포내 아세포적 구획의 공통적인 변형을 제시하는 것으로 여겨진다. 이 경우, 아마도 BRCA1 및 p53은 다른 핵 조절 단백질과 함께 이들 세포의 세포질내에 유지될 수 있으며, 이의 복합 효과는 이들의 종양형성에 기여할 수 있다.
5.4 실시예 4
정확한 BRCA1 국재화에 요구되는 특이적 단백질의 확인
강력한 고유 트랜스-활성화 작용이 배제된 BRCA1의 단편을 프레임내에서 GTal4 DNA-결합 도메인과 융합시킨다. 이들을 사용하여 cDNA 라이브러리를 스크리닝하고 Gal4 반응성 β-갈락토시다제 유전자를 함유하는 호모 균주를 사용하여 Gal 4 활성화 도메인에 융합시킨다. 이들 클론들을 다음 기준에 따라 분석한다. 첫째, 이들이 유방암내 흔한 LOH를 겪는 것으로 공지된 염색체 영역에 맵핑되는지의 여부. 둘째, 유전자내 거대 규모의 결실에 BRCA1이 잘못 위치한 종양 세포주로부터의 DNA의 서던 분석에 의해 검출되는지의 여부. 그리고 셋째, 이들 유전자내 더욱 미세한 돌연변이가 RT PCRTM-기준 일본쇄 구조적 다형성(RT-PCTTM/SSCP) 검정에 의해 종양 세포주내에서 검출될 수 있는지의 여부. 돌연변이가 발견된 유전자들은 BRCA1의 핵으로의 전위에 관여하는 유전자의 강력한 후보물질이다.
첫째로, 야생형 BRCA1 또는 NLS 모티프를 상실하고 있는 돌연변이 단백질과공동-면역침전되는 단백질의 패턴을 비교한다. 둘째로, 정상 세포로부터의 추출물내에서 야생형 BRCA1과 공동-면역침전되거나 유방 종양 세포주의 추출물내에서는 야생형 BRCA1과 공동-면역침전되지 않는 단백질을 비교한다. 다음 BRCA1 핵 수송의 이들 후보 중재자들을 암호화하는 유전자를 표준 공정에 의해 클로닝한다.
상호작용 특이성을 확증하고 확인된 단백질이 결합되어 있는 BRCA1의 영역을 추가로 정의하기 위하여, 실험관내 결합 및 생체내 공동-면역침전 검정을 야생형 BRCA1, NLS-결손 돌연변이체 및 BRCA1의 다른 영역을 암호화하는 결실 돌연변이체를 사용하여 수행한다.
5.5 실시예 5
유방 종양 세포의 핵 내로 내인성 또는 비정규 장소에서 발현된 BRCA1의 BAPs 레스큐(rescue) 수송의 발현
목적 2에서 확인된 유전자가 유방암 세포내 BRCA1 국재화에 있어 결핍성을 보충할 수 있는지를 측정하기 위해서는, 완전한 길이의 cDNA를 클로닝하는 것이 필요하다. 또한, 항체는 단백질 산물에 대해 상승되어 이들이 검출되도록 한다. 확인된 유전자내 돌연변이가 종양 세포주내 BRCA1의 잘못된위치에 관여하는 경우, 이들 항체를 또한 종양 샘플을 스크리닝하는데 사용한다.
확인된 cDNA를 테트라사이클린-유도성 프로모터의 조절하에 유방암 세포주내에서 발현시켜 발현이 배양 배지내에서 테트라사이클린의 존재에 의해 조절되도록 한다. 이것은 이들 단백질의 발현에 기인한 독성 효과를 강력하게 피할 수 있다. 내인성 및/또는 외인성 야생형 BRCA1의 국재화에 있어서 이들의 발현의 효과를 면역형광성 및 세포 분획화 검정에 의해 모니터한다.
5.6 실시예 6
진행된 유방 종양 세포내에서 BRCA1의 잘못된 국재화의 일반적인 원인이 되는 결핍성 수송
야생형 BRCA1을 정상 세포주 및 유방 종양 세포주내에서 발현시킬 수 있다. 단백질이 유방 종양 세포내에서 핵으로 이동하지 못하는 경우, 이러한 사실은 BRCA1 자체에서의 돌연변이라기 보다는 진행된 유방 종양 세포가 BRCA1에 대해 결핍성 수송 과정을 가짐을 제시한다.
이러한 예는 결핍성 핵 수송 시스템이 진행된 유방 암 세포내에서 BRCA1 단백질의 잘못된 위치의 일반적인 원인이라는 사실을 확인하기 위해 고안된 것이다. 이것은 BRCA1가 잘못 위치하고 있는 15개의 추가 세포주내에서 BRCA1 국재화를 분석함으로써 수행한다. 초기에, 이들 작제물을 발현하고 있는 일시적으로 형질감염된 세포를 항-FLAG 항체를 사용한 간접적인 면역형광성 염색에 의해 단백질 국재화에 대해 분석한다. 연속하여, 앞서 기술한 바와 같이(참조: Chen et al., 1995), 국재화는 안정하게 형질감염된 세포주내에서 SDS-PAGE에 의한 외인성 단백질을 검출하기 위한 웨스턴 블롯팅 분석과 결합된 세포 분획화에 의해 확인할 수 있다. 상기 기술한 바와 같이, 핵-매트릭스 연관된 단백질인 p84(N5)를 핵 수송 작용을 위한 대조군으로서 사용한다. 불명화된 사람 유방 상피 세포(HBL100) 및 CV1 세포를 정상 BRCA1 국재화용 대조군으로서 사용할 수 있다.
3개의 NLS 모티프 각각에서 결실된 태크된 BRCA1 단백질을 작제하고 정상 세포내에서 발현시켜, BRCA1의 핵내로의 수송에 요구되는 모티프를 확인한다. 3개의 추정되는 NLS 모티프가 수송에 관여하지 않을 경우, 일련의 전신적 결실 돌연변이체를 생성시키고 단순히 시험하여 작용성 NLS 모티프를 정의할 수 있다. 일단 정의되면, NLS 돌연변이체를 목적 2에서 확인된 BRCA1-연관된 단백질을 스크리닝하기 위한 도구로서 사용하여 NLS와의 어떠한 상호작용 여부를 측정할 수 있다.
BRCA1의 NLS가 핵 도입에 중요한지를 측정하기 위하여, 본 발명자들은 각각 추정되는 NLS 모티프(아미노산 : 500번 내지 508번, 606번 내지 614번 및 650번 내지 655번)중 하나를 특이적으로 제거한 3개의 BRCA1 결실 돌연변이체를 작제한다. 이들을 FLAG 에피토프를 사용하여 pCEP4 벡터내로 프레임내 클로닝한다(참조: 도 9).
돌연변이체 단백질을 정상 세포내에서 일시적으로 발현시킬 수 있으며, 이들의 국재화는 항-FLAG 항체 M2(Kodak 제조원)를 사용하는 간접적-면역형광성에 의해 측정한다. NLS 모티프중 어느 하나는 핵으로의 BRCA1 수송을 촉진할 수 있다. 즉 이중 및 삼중 결실 돌연변이체를 또한 작제하여 이러한 가능성을 시험한다. Rb-관련된 단백질인 미토신(참조: Zhu, et al., 1995)의 NLS를 측정하는데 있어서의 앞서의 실험으로부터, 작용성 NLS 모티프를 측정하기 위한 규칙은 절대적이지 않으며, 강력한 NLS 후보물질 서열의 스펙트럼을 확장시키는 것이 필요할 수 있다. 이러한 경우, 일련의 전신적 BRCA1 결실 돌연변이체가 생성될 수 있으며 핵으로 수송하는 이들의 능력에 대해 시험할 수 있다. 이들 연구는 BRCA1의 핵 수송에 중요한 잔기를 확인하는데 유용하다.
5.7 실시예 7
정확한 BRCA1 국재화에 요구되는 특이적인 BAP
효모 2개-하이브리드 시스템은 총 25개의 Rb-관련된 단백질을 분리하는데 있어 매우 성공적이었다(참조: Durfee et al., 1993). 이러한 방법의 장점은 이것이 대사적 표지 효능, 면역침전되는 항체의 친화성 및 검정된 복합체의 반감기에 따른 공동-면역침전 검정보다 더욱 민감하다는 것이다.
BRCA1-관련된 당백질에 대한 2개의 스크리닝을 개시한다. 상기 언급한 바와 같이, BRCA1은 전사 인자이다. 이것은 추정되는 DNA-결합, 단백질의 N-말단 영역내 Zn-핑거 도메인, 3개의 추정적인 NLS 모티프 및 C-말단을 향한 강력한 산성 트랜스-작용 도메인의 존재에 기준한다. 효모 2개-하이브리드 검정의 특성은 미끼 단백질이 고유의 트랜스-작용 활성을 함유하지 않음을 요구한다. 즉, 본 발명자들은 첫번째로 이러한 활성을 함유하는 영역을 확인하기 위해 일련의 BRCA1 결실 돌연변이체를 스크리닝하였다. 도 10에 나타낸 바와 같이, C-말단을 향해 약 600개의 아미노산 영역이 강력한 트랜스-작용 활성을 함유한다. 따라서, 본 발명자들은 미끼로서 이러한 영역을 암호화하지 않는 BRCA1의 단편을 사용하여 관련된 단백질을 확인한다.
2개의 BRCA1 발현 플라스미드, 즉 pAS-BRCA2.5(아미노산 303번 내지 1142번) 및 pAS-BRCA3.5(아미노산 1번 내지 1142번)(참조: 도 11)를 작제한다. 이들은 효모 전사 인자 Gal4의 DNA-결합 도메인에 대한 서열[아미노산 1번 내지 147번; (Keegan et al., 1986)] 및 BRCA1 단백질의 부위사이에 하이브리드 분자를 생성시킨다. 이들 작제물을 사용하여 사람 β-임파구로부터의 cDNA 라이브러리를 스크리닝하고, 이를 Gal4 활성화 도메인 II[아미노산 768번 내지 881번;(참조: Maand Ptashne, 1987)]에 대한 서열을 함유하는 제2의 발현 플라스미드내로 클로닝한다. 마우스 배아 cDNA 라이브러리를 사용하는 추가의 스크리닝이 현재 진행중이다. Gal4-Gal80 상호작용으로 처음 입증되고(참조: Ma and Ptashne, 1988) 후에 일반화된 바와 같이(참조: Fields and Song, 1989), 효모내에서 발현된 2개의 단백질은 상호작용할 수 있고, 수득되는 복합체는 Gal1 유전자의 상부 활성화 서열로부터 기원한 Gal4-결합 부위를 함유하는 프로모터로부터 전사를 활성화시킬 수 있다. 앞서, 본 발명자들은 이러한 방법(참조: Durfee et al., 1993)을 통해 레티노블라스토마 단백질 T 항원-결합 도메인과 상호작용하는 명개의 주요 단백질을 성공적으로 확인하였다. 다음 이러한 방법은 새로운 단백질-단백질 상호작용을 확인하기 위한 강력한 기구로서 전체 위원회에 빠르게 확산되었다.
첫번째 스크리닝에서, 고 β-갈락토시다제 활성을 나타내는 총 4개의 클론을 선택한다. 이들 4개의 클론을 추가로 특성화한다(참조: 표5). 이들 클론중 하나(hBRCA21)는 제노푸스 단백질인 임포르틴의 사람 동족체로서 최근 확인된(참조: Gorlich et al., 1994; Weis et al., 1995), 사람 유전자 hSRP1a와 서열분석된 400bp 영역에 걸쳐 동일하다. 임포르틴/hSRP1a는 NLS 인식에 작용하여 Ran/TC4와 같은 다른 핵 도입 단백질과 협동하여 핵 공극 복합체에 대한 펩타이드를 함유하는 NLS의 결합을 촉진하며, 이후 이들은 핵 엔벨로프를 통해 전위된다(참조: Weis et al., 1995). 흥미롭게도, 모두 밀접하게 관련되어 있으며 단지 약간의 아미노산만 상이한 5개 이상의 형태의 임포르틴이 존재하는 것으로 여겨진다(참조: Gorlich et al., 1994). 이러한 서열은 서열분석된 400-bp 이상의 영역에 걸쳐 주요 형태와 동일하다. 그러나, 영역내에 명확이 존재할 수 있는 미세한 차이는 아직 서열분석되지 않았다. 몇 개의 밀접하게 관련된 임포르틴 분자의 존재는 각각 특이적인 소세트의 단백질의 핵 수송에 관여할 수 있다는 가능성을 높인다(참조: Gorlich et al., 1994).
효모 2개 하이브리드 시스템을 사용하여 분리한 클론
클론 CPRG 활성 cDNA 크기(kb) 반복된 검정 활성 크레노우 서열과의 유사성
hBRAP2 3000-6000 1.8 ++++ 에스. 세레비지아에 및 씨. 엘레간스내에서 보존된 서열과 동일
hBRAP12 790-850 1.2 +++ 특성화되지 않은 징크-핑거의 일부분
hBRAP14 220-240 1.1 ++ 신규 서열
hBRAP21 150-160 0.9 ++ 핵 국재화 시그날 수용체(hSRP1a/임포르틴)과 유사
공동-면역침전에 의한 BRCA1-관련된 단백질의 분석은 상술한 효모 2개-하이브리드 스크리닝에 대한 유용한 상보체를 제공한다. 이러한 방법은 효모 2개-하이브리드 시스템보다 2개의 현저한 장점을 갖는다. 첫째로, 이것은 BRCA1내 강력한 트랜스-활성화 도메인의 존재에 제한되지 않는다. 즉, 완전한 길이의 BRCA1과의 단백질 상호작용에 중점이 될 수 있다. 이것은 비록 BRCA1의 NLS와 상호작용하는 단백질내 결핍이 진행된 유방암에서 BRCA1의 잘못된 위치에 있어 주요 원인이라고 해도 이것은 BRCA1의 다른 영역과 상호작용하는 단백질이 이러한 과정에서, BRCA1내 구조적 변화를 유발시킴에 의해 다른 NLS 모티프를 달리 감출 수 있으므로, 중요하다.
즉, BRCA1의 다른 영역과는 상호작용하나, 효모 2개-하이브리드 스크리닝에서는 존재하지 않는 단백질은 BRCA1의 핵 수송에 중요할 수 있다. 예를 들어, PHO4에서 PHO80-PHO85-CDK의 작용(참조: O'Neill et al., 1996)과 유사하게, 세포질내에서 포스포릴화를 통해 BRCA1을 속박하거나 NF-kB상에서 IkB의 작용(참조: Ghosh and Baltimore, 1990)과 유사하게, NLS를 직접 차폐시킴에 의해 BRCA1을 속박하는 단백질은 BRCA1의 NLS에 필수적으로 결합할 필요가 없다. 이러한 방법의 두번째 장점은 이것이 효모 2개-하이브리드 스크리닝에서보다도 BRCA1 수송에 관련된 단백질에 대한 더욱 직접적인 고찰을 제공한다는 것이다.
분자량이 40, 41, 49, 95 및 140kDa인 5개 이상의 단백질을 HBL100 세포내에서 BRCA1을 사용하여 특이적으로 공동-면역침전시킨다. 추가의 분석은 다음을 포함한다: 첫째로, 정상 세포 및 유방 종양 세포내에서 야생형 BRCA1와 공동-면역침전하는 단백질을 비교할 수 있다. 이것은 BRCA1 도입에 강력하게 포함되고 종양 세포내에서 결핍성일 수 있는 상호작용 단백질을 확인하여야 한다. 둘째로, 정상 세포에서의 NLS 돌연변이체 및 야생형 BRCA1사이의 공동-면역침전된 단백질에 있어서의 차이가 측정된다. 이것은 BRCA1의 NLS와 특이적으로 상호작용하는 단백질을 확인하기 위해 수행한다. 이들과 함께, 이러한 결과들은 BRCA1 핵-도입에 중요한 단백질의 확인을 허용한다. 따라서, 효과적인 공동-면역침전을 보증하기 위해, 본 발명자들은 형질감염에 의해 세포내에서 FLAG-태크된 BRCA1 단백질을 과발현시켰다. 이 발현이 가질수 있는 어떠한 강력하게 독성인 효과도 피하기 위하여, 테트라사이클린-유도성 시스템을 사용할 수 있다. FLAG-태크는 단백질의 N-말단에 위치함으로써 BRCA1과 어떠한 상호작용 단백질 사이의 입체적 회피를 거의 유발하지 않기 때문에, 외인성 단백질을 표지하기 위한 편리한 취급을 제공한다. 또한, FLAG에 대한 고 친화성 모노클로날 항체(M2, Kodak 제조원)는 고도로 특이성이므로, 관련되지 않은 가교 반응성 단백질과의 공동 침전에 의한 오염 문제를 감소시킨다.
확인된 단백질을 암호화하는 유전자는 Rb-관련된 단백질을 클로닝하기 위해 실험실에서 이미 확립된 공정에 따라 클로닝할 수 있다(참조: Qian et al., 1993). 요약하면, 충분한 단백질을 공동-면역침전에 의해 정제하여 펩타이드 서열분석이 수행되도록 한다. 수득된 펩타이드 서열과 GenBank 데이터베이스의 비교는 유전자가 신규인지와 이들의 작용에 관한 추가의 단서를 제공할 수 있는지의 여부를 나타낸다. 신규한 유전자는 수득된 펩타이드 서열을 기준으로 축퇴된 올리고뉴클레오타이들을 사용하여 cDNA 라이브러리를 스크리닝함으로써 클로닝한다. 클로닝된 유전자 및 공동-면역침전된 단백질의 확인은 몇 개의 방법으로 확인한다. 첫째로, 공동-면역침전된 단백질의 SDS-PAGE 이동성 및 클로닝된 cDNA의 실험관내 전사된/해독된 산물을 비교한다. 둘째로, 클로닝된 유전자에 대한 항체를 생성시키고 면역침전/웨스턴 연구에서 BRCA1-관련된 단백질을 인지하는 이들의 능력에 대해 시험한다. 셋째로, 클로닝된 유전자와 BRCA1의 실험관내 및 생체내 상호작용을 수행한다.
5.8 실시예 8
LOXP-플랭킹된 BRCA1 유전자를 수반하는 트랜스게닉(transgenic) 마우스의 생성
통상의 유전자 표적화 기술(참조: Lee et al., 1992; Liu et al., 1996)을 사용하여 이러한 균주를 작제한다. 표적화 플라스미드는 Brca1[엑손 9, 10 및 11의 일부]를 함유하는 8.0kb HindIII-BamHI DNA 단편을 사용하여 작제한다. 첫번째로, pGEM-3-(참조: Gu et al., 1993)으로부터 기원한 단일의 loxP 부위를 EcoRI-링커를 사용하여 인트론 9내 유일한 SacI 부위내로 삽입시킨다. P12-neor[H. Gu, NH-I/NIAID로부터 수득]로부터 기원한 네오마이신 내성 카세트와 연결된 제2 세트의 loxP 부위를 인트론 10내 유일한 XhoI 부위내로 삽입한다. 수득되는 플라스미드를 Brcal-losP라고 지명한다.
pMC1-tk 카세트를 작제물의 5' 말단에 위치시켜 최종의 표적화 벡터, 즉 Brca1-loxP ko를 생성시킨다. 이 작제물을 앞서 기술한 바와 같이(참조: Lee et al., 1992; Liu et al., 1996), BamHI로 선형화시키고 ES 세포[E14-1의 초기 계대배양물(참조: Handyside et al., 1989)]내로 개별적으로 형질감염시킨다. G418 및 FIAU에 대해 이중으로 내성인 콜로니를 분리하고 이로부터 DNA를 서던 블롯팅에 의해 분석하여 동종 재조합으로부터 수득되는 Brca1-floxP 유전자의 부위 특이적인 통합을 함유하는 클론을 확인한다.
인트론 10내의 Neo 카세트의 존재는 RNA 프로세싱을 방해함으로써 Brca1 발현을 파괴할 수 있다. 이러한 가능성을 제거하기 위하여, 표적화된 ES 세포를 pIC-Cre(참조: Sternberg et al., 1981)로 형질감염시켜 Cre 리컴비나제의 일시적인 발현을 개시한다. 이러한 조건하에서, Cre-중재된 절개는 일부 세포에서 단지 1회 일어날 것으로 예견된다(참조: Gu et al., 1994). 3개의 가능한 재조합 현상이 존재하므로, 형질감염이후 100개 콜로니의 스크리닝을 사용하여 Neo 카세트는 결실하고 있으나 엑손 10은 결실하고 있지 않는 바람직한 재조합체를 생성시킨다.
loxP 부위가 바람직하게 교체된 ES 세포를 C57BL/6 플라스토사이트내로 독립적으로 주입하고, 이를 슈도-임신한 F1[CBA X C57BL/6] 암컷 포스터 마우스의 자궁에 이식시켜 키메라를 생성시킨다. 키메라성 수컷 마우스를 C57BL/6 암컷들과 역교배시켜 검라인 전달(germline transmission)을 시험한다. loxP 부위는 인트론 서열내로 삽입되므로, 이들은 내인성 Brca1 유전자에 영향을 미치는 것으로 예견되지는 않는다(참조: Gu et al., 1994). 거민 키메라(germline chimeras)를 사용하여 Brca1-loxp 이형접합체 및 동형접합체 트랜스게닉 세포주를 확립한다.
5.9 실시예 9
유선의 발달 및 작용에 있어서 BRCA1 결실의 효과 분석
마우스의 유방 상피 세포내 Brca1 유전자의 절개를 조건적으로 및 일시적으로 개시하는 능력은 이러한 유전자의 규칙을 시험하기 위한 독특한 기회로 존재할 것이다. 처녀에 있어서, WAP 프로모터에 의해 작용하는 트랜스유전자는 분비성 소와상 기포 구조의 약 30%에서 격렬한 자극동안에 임상적으로 활성화될 수 있다(참조: Robinson et al., 1995). 임신동안, WAP 트랜스겐의 분화 및 활성화를 위해 보충하는 소와상 기포의 수는 수유동안 15일경에 최대로 증가하기 시작한다(참조: Robinson et al., 1995). 상기 기술한 바와 같이, WAP 프로모터를 사용한 rtTA의 발현을 조절함에 의해, 수유 동안 또는 임신-중반이후 어느때나 여성에게 독시사이클린을 처리함으로써 Erca1 유전자의 동형접합체 절개를 개시할 수 있다. 독시사이클린 처리에 이어, 본 발명자들은 대조군 및 처리된 동물의 유선의 상세하고 포괄적인 조직학적 실험을 수행할 것이다. 또한, 본 발명자들은 내인성 유 단백질 유전자 발현과 같은 분화 마커의 실험을 포함시키는 것을 계획하고 있다.
이러한 시도에 대한 한가지 관심은 WAP 발현(참조: Robinson et al., 1995)에 의해 모니터된 바와 같이 소와상 기포 분비 단위의 발달에 있어서의 동시성이다. 예를 들어, Brca1 유전자가 수유 동안 분비 단위의 단지 30%의 상피 세포 대부분에서 결실되는 경우[Cre 발현 및 절개의 고 효능을 추정], 이것이 전체 유선의 발달에 어떻게 영향을 미치는가? 명백하게, 실험적으로 추정해야만 하는 결과를 예측하기란 매우 어렵다.
또한, 비록 비-발현되지만 분화된 세포에서와 같이 이들의 지속성에 대해 입증된 바가 있다고 해도[참조: Robinson et al., 1995 및 이 문헌에서의 참조문] 연속적인 이중수유 및 수유후 Brca1-1-세포의 파괴에 관한 관심이 있다. 임신동안 분비성 소단위의 보충이 증가하므로, 수유를 중단한 후 퇴화동안에 Brca1-1-세포의 파괴가 어떻게 일어나는지, 이러한 단계에서 유선이 발달해야 하는지 또는 이러한 문제에 대해, 작용성 Brac1 단백질 부재하의 효과가 이러한 과정에 어떻게 영향을 미치는지에 대해 완전히 알려져 있지 않다고 해도, 이것은 관심이 덜 될 수 있다.
5.10 실시예 10
BRAC1-LOXP 및 테트라사이클린-유도성 CRE 레컴비나제를 수반하는 이중 트랜스게닉 마우스의 생성
상기 기술한 바와 같이 Cre 레컴비나제을 고 발현하는 동형접합체 트랜스게닉 계통을 동형접합체 Brca1-loxP 마우스와 교배시킨다. 이것은 초기에는 WPA-rtTA; Cre 및 Brca1-loxP 모두에 대해 부과된 이형접합체를 생성한다. 다음 이들 F1이형접합체를 임신시켜 F2집단을 생성시키고 여기서 16마리의 마우스중 1마리가 대립형질 모두에 대해 동형접합체인 것으로 예측된다. 이들 동물의 임신은 F3세대에서 부과된 WPA-rtTA Cre/Brca1-loxP 동형접합체를 생성하며, 이들은 표적화된-절개 연구에 사용될 수 있다.
독시사이클린을 음료수[또는 달리는 피하로 서서히 방출되는 펠렛, Innovative Research of America 참조]를 통해 암컷 마우스에게 제공하여 Cre 레컴비나제의 발현을 유도한다. 초기에는 4점 시간을 독시사이클린 투여에 대해 사용한다; 즉, 수유기, 임신 말기[15일 내지 18일째] 및 수유 3일째. 앞서의 연구는 WAP 프로모터가 이들 시점에서 리포터 유전자 발현을 활성화시킬 수 있음을 나타낸다. 즉, 발명자들은 rtTA 발현이 이들 시기에 유도될 수 있음을 예측하였다(참조: Robinson et al., 1995). 데속시사이클린 처리를 사용하여, rtTA 는 Cre 레컴비나제의 발현을 활성화시켜야 하며, 결국 Brca1 엑손 10의 표적화된 절개를 촉매할 것이다. 네가티브 대조군은 독시사이클린을 처리하지 않은 한배 새끼의 암컷이다. Brca1 엑손 10이 Cre의 후속되는 유도를 결실한다는 사실을 확인하기 위하여, 각각의 처리 시점으로부터 마우스의 유선을 조직학적으로 절개한다. 다음 이것을 엑손 11의 C-말단 영역을 특이적으로 인지하는 BRCA1 항체를 사용한 표준 면역조직화학적 방법에 의해 Brca1에 대해 시험한다(참조: Chen et al., 1996b).
달리는, 앞서 기술한 바와 같이(참조: Liu et al., 1996), PCTTM분석에 이어 미세절개를 사용하여 엑손 10의 게놈성 결실에 대해 직접 스크리닝할 수 있다. 절개가 유도될 될 수 있음이 확인되면, 마우스 그룹을 하기 요약한 바와 같이, 유선의 발달 및 종양의 발생에 대해 확인한다.
독시사이클린을 WPArtTA; Cre/Brca1-loxP 암컷에게 처리한 후, 유방을 다음과 같이 실험용으로 준비한다. 수유동안 독시사이클린을 처리하거나 처리하지 않은 4개월짜리의 교배하지 않은 암컷에서, 조직[동물당 8개의 유방]을 나타낸 스케쥴에 따라 분석용으로 수집한다. 임신한 동물에 있어서는, 독시사이클린을 14일째에 시작하여 투여하고 기술된 스케쥴에 따라서 조직을 수집한다.
표준 조직학적 공정(참조: Liu et al., 1996)을 사용하여, 동물당 4개의 유방의 일련의 단편을 비정상적 유선 발달[즉, 도관성 트리(ductal tree) 또는 소와상 기포 구조] 및 대조군과 비교하여 분비성 단위 수에 있어서의 전체적인 증가 또는 감소에 대해 분석한다. Brca1 유전자의 결실을 확인하기 위하여, 미세절개 PCTTM을 개개의 소와상 기포 분비 단위에서 수행한다(참조: Liu et al., 1996). 동물당 2개의 유방을 이 분석용으로 제공한다. Brca1의 결실이 유선 발달을 방해한 경우, 본 발명자들은 유선 상피 세포의 비정상성이 조직화학적 연구에 의해 밝혀질 것으로 예상하였다. 일반적으로 사용된 분화의 마커, 특히 본 발명자들의 목적을 위한 마커는 유 단백질 유전자, 즉 β-카제인 및 WDNM1(임신 초기) 및 훼이 산성 단백질 및 α-락트알부민[임신 거의 말기 후반]이다(참조: Robinson et al., 1995). 동물당 2개의 유방은 면역조직화학적 연구[항체는 L. Hennighausen으로부터 입수할 수 있다, NIH-NIDDK] 또는 반응계내 하이브리드화용으로 제공된다.
5.11 실시예 11-종양 발달의 분석
비록 본 발명자들이 독시사이클린으로 처리된 암컷이 유방 종양으로 전개될 것이라고 예측했다해도, 종양 형성의 시간은 예측할 수 없다. 실험 동물이 독시루비신으로 처리하면, 이들 동물 및 처리되지 않은 대조군을 유방 종양에 대해 정규적으로 실험할 것이다. 종양이 전개되면, 조직을 조직학적으로 실험할 수 있다. 미세절개 PCRTM(참조: Liu et al., 1996) 및 BRCA1 항체를 사용한 면역조직화학을 사용하여(참조: Chen et al., 1996b) 종양이 BRCA1이 결실된 세포로부터 기원하는지를 입증한다. 종양 형성의 분석은 비처리된 대조군과 비교하여 종양으로 전개된 처리 동물의 퍼센트를 측정함으로써 확립할 수 있다. 분석이 고도로 및 이상적으로 되는데 필요한 유용한 모델이 되기 위해서는, 종양 형성이 Brca1 파괴에 이어 예측된 시간에 일어나야 한다. 유도된 동형접합체 결실의 빈도에 대해 종양 병소의 수를 비교하는 것이 또한 중요하다.
종양의 발생이 특성화되면, 종양 전개의 역학은 초기 결실 현상으로부터 명백한 종양이 관측되는 시간까지 몇몇 시점에 걸쳐 유방의 조직학적 실험을 위해 마우스를 참수시켜 측정할 수 있다. 이러한 방법에서는, 종양의 초기 단계에서부터 전이를 포함하는, 악성종양의 최종 단계에 이르기까지 종양 형성을 문서화하는 것이 가능하여야 한다. 이러한 시도는 Rb+/-마우스에서 멜라노트로픽 종양 형성의 역학을 문서화하는데 있어 최근에 성공적으로 사용되었다(참조: Nikitin and Lee, 1996).
5.12 실시예 12
BRCA1과HBRAP12의 상호작용
미끼로서 BRCA1(이의 활성화 도메인은 빠짐)을 사용한 효모 2개-하이브리드 스크리닝에서, 본 발명자들은 추정의 BRCA1 상호작용 단백질을 암호화하는 4개의 cDNA를 확인하였다(참조: 표 6).
BRCA1-상호작용 단백질을 암호화하는 클론의 요약
hBRAP12 단백질의 주요 아미노산 서열은 서열 1에 나타낸다. 주목할 만하게도, 이것은 서로 고도로 동질이지만 GenBank에서 공지된 징크 핑거 도메인을 포함하는 어떠한 다른 단백질과는 동질이 아닌 C2H2 부류의 8개 징크 핑거를 포함한다.
hBRAP12의 아세포적 국재화를 측정하기 위하여, 완전한 길이의 cDNA를 녹색 형광성 단백질에 해독적으로 융합시킨다. 융합 단백질의 아세포적 국재화는 CV1 및 HBL100 세포에서 핵에 존재한다.
hBRAP12가 핵 단백질이라는 사실은 BRCA1과의 상호작용과 일치한다. 실험관내 상호작용은 E2F-레티노블라스토마 단백질 상호작용에 이미 적용시킨바와 같이 GST 풀-다운 검정(pull-down assay)으로 확인할 수 있다(참조: Shan et al., 1992). BRCA1 및 hBRAP12사이의 실험관내 상호작용은 웨스턴 블롯팅과 결합된 상호간의 면역침전을 사용하여 추정한다(참조: Shan et al., 1992).
hBRAP12와 BRCA1의 상호작용은 2단계 수준에서 추정할 수 있다. 첫째로, 실험관내에서 연합하는 이들의 능력은 글루타티온-아가로즈 비드에 결합한 GST-hBRAP12의 능력, 표지된35S-메티오닌, 실험관내 해독된 BRCA1 또는 바큘로바이러스-제조된 BRCA1에 결합하는 GST-hBRAP12의 능력을 검정함으로써 측정한다(참조: Chen et al., 1996b). 네가티브 대조군은 GST뿐이다. 글루타티온 비드(참조: Chem et al., 1996b)에 결합된 GST-BRCAI 융합 단백질의 상이한 단편 및 실험관내 해독된 hBRAP12를 사용한 역 연구는 또한 앞서 기술된 바와 같이(참조: Shan et al., 1992) 수행한다. 둘째로, hBRAP12와 BRCA1의 생체내 상호작용은 hBRAP12에 대해 생성된 항체 및 BRCA1에 대해 유용한 항체(참조: Chen et al., 1995)를 사용하여 전체 세포 추출물(참조: Shan et al., 1992)의 공동-면역침전 검증에 의해 시험한다. BRCA1의 엑손 11내 2개의 상이한 에피토프에 대해 상승된 BRCA1에 대한 고도로 특이적인 모노클로날 항체를 또한 생체내 및 실험관내 결합 검정에 사용할 수 있다. hBRAP12에 대한 마우스 항혈청을 앞서 기술한 바와 같이(참조: Chen et al., 1995) 이. 콜라이내에서 발현된 GST-hBRAP12 융합 단백질을 사용하여 생성시킨다. 사용하기 전에, hBRAP12 항혈청을 GST-글루타티오닌 비드를 사용하여 예비흡착시킨다(참조: Chen et al., 1995). 공동-면역침전 검정은 내인성 단백질의 충분한 양을 공동-발현하는 세포를 사용하거나 태크(플랙)되거나 또는 태크되지 않은 BRCA1 및 hBRAP12에 대한 발현 벡터를 사용하여 공동-형질감염시킨 세포를 사용하여 수행한다.
본 목적을 달성하기 위하여, N- 및 C-말단과 징크-핑거 도메인을 포함하는 일련의 hBRAP12 결실 돌연병이체를 생성시키고 상기 기술한 바와 같이, 완전한 길이의 BRCA1에 결합하는 것에 대해 시험한다. 본 발명자들의 초기의 가설은 DNa-결합외에, 징크-핑거 도메인이 또한 BRCA1 상호작용에 중요할 것인가에 있었다. 어떠한 경우에도, 이러한 연구는 BRCA1에 대한 결합에 요구되는 hBRAP12의 영역을 측정하는데 효과적이어야 한다.
앞서의 단락에서 기술한 것과 유사한 방법을 사용하여, BRCA1의 결실 돌연변이체를 상기 기술한 바와 같이 실험관내 결합 검정에서 GST-hBRAP12와 상호작용하는 이들의 능력에 대해 검정할 수 있다. BRCA1의 RING-핑거 도메인은 이러한 상호작용에 중요한 것으로 여겨지며, CST-융합을 BRCA1의 야생형 N-말단 영역 또는 가계적 유방암 경우에서 발견되는 Cys61에서 Gly로의 결과를 가져오는 단일 점 돌연변이(T에서 G로의 치환)를 사용한 동일한 영역에 대해 제조한다(참조: Johannsson, et al., 1996). 이러한 돌연변이는 BRCA1의 RING-핑거 도메인을 파괴하며, 이것이 단백질-단백질 상호작용에 관여하는지의 여부는 hBRAP12와의 상호작용에 대해 네가티브이어야 한다.
hBRAP12가 DNA-결합 전사 인자일 경우, 이것은 특이적인 DNA 서열을 인지하여야 한다. 이러한 서열을 확인하기 위하여, 무작위적 서열 선택법 및 PCRTM(참조: Perkins et al., 1991; Blackwell and Weintraub, 1990)을 사용하여 BRCA1에 대한 컨센수스 DNA 결합 부위를 정의할 수 있다. 중요하게도, hBRAP12에 대한 동족 결합 부위의 확인은 기술한 바와 같은 hBRAP12 활성인자 작용의 작용성 시험을 허용한다. 이러한 동족 결합 부위의 확인은 또한 hBRAP12에 대한 하부 표적 유전자의 확인에 중요하다.
hBRAP12, hBRAP12-Z8(Zn 핑거 도메인 단독)△Zn-hBRAP12(Zn 핑거는 빠짐)를 암호화하는 상보적 DNA를 pGEX-3X 벡터를 사용하여 GST에 해독적으로 융합시킨다. 이들 작제물에 대한 cDNA를 표준 PCRTM및 클로닝 방법을 사용하여 생성시킨다. 이. 콜라이내에서 발현시킨 후, 세균 분해물을 글루타티온 아가로즈 비드와 함께 항온처리하고 강력하게 세척하여 비-특이적 결합 단백질을 제거한다. GST-hBRAP12, GST-hBRAP12-Z8및 △Zn-hBRAP12 단백질 결합을 적량화한 후, 각각의 비드를 사용하여 무작위적 서열 DNA 라이브러리를 스크리닝한다.
hBRAP12 결합 부위의 선택 및 증폭을 위하여, 무작위적 올리고뉴클레오타이드 10㎍을 ZnSO4및 비-특이적 경쟁자로서 100㎍/ml의 tRNA를 함유하는 결합 완충액내에서 10㎍의 GST-△Zn-hBRAP12 단백질과 결합된 비드와 함께 항온처리한다. 이러한 첫 번째 배양의 목적은 비-특이적으로 결합하는 DNA를 제거하는 것이다. 다음, GST-hBRAP12 및 GST-hBRAP12-Z8을 예비결합된 무작위적 DNA 라이브러리와 함께 항온처리한다. 저 염 완충액으로 완전히 세척한 후, DNA를 고 염 완충액(1.0M NaCl)으로 용출시키고 tRNA 담체의 존재하에 에탄올로 침전시킨다. 다음 회수된 DNA를 PCRTM증폭에 적용시키고 결합 방법을 4회 반복한다. 선택 및 PCRTM의 5번째 반복후, DNA를 BamHI 및 HindIII로 분해하고 15% 아크릴아미드 겔상에서 정제하고 pBSK 벡타(Stratagene 제조원)내로 연결시킨다. 무작위적 콜로니를 집어 표준 방법에 따라 플라스미드 DNA의 소 제제를 서열분석한다. 선택 과정은 겔 이동 분석(참조: Shan et al., 1992)을 사용하여 모니터할 것이다. 이를 수행하기 위해, PCTTM반응을 T4 폴리뉴클레오타이드 키나제를 사용하여32P-γATP로 말단-표지시킨 프라이머로 수행한다. 컨센수스 결합 부위에 의한 특이적 결합은 특이적 및 비-특이적 경쟁자 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 겔 이동 분석(참조: Shan et al., 1992) 및/또는 야생형 hBRAP12 또는 △Zn-hBRAP12 단백질을 사용하는 DNAaseI 풋프린팅(참조: Cao et al., 1988)으로 측정한다. 친화 정제에 대한 대체법은 전기영동적 이동 시프트를 사용하여 PCRTM에 의해 증폭된 DNA 단편(참조: Kinzler and Vogelstein, 1989; Caubin et al., 1994)을 분리한 후 선택하여 추가로 4회 증폭시키는 것이다. 수득되는 단편을 분해하고 상기 기술한 바와 같이, pBSK내로 연결시킨다.
상이한 방법에 의한 BRCA1 국재화 결과의 요약
5.13 실시예 13
HBRAP12로부터 기원한 BRCA1-관련된 단백질의 아미노산 서열
hBRAP12에 대한 완전한 길이의 cDNA를 하이브리드화 프로브로서 효모 2개-하이브리드 스크리닝으로부터 부분적 cDNA를 사용하여 사람 섬유아세포 라이브러리로부터 분리한다. 8개의 징크 핑거는 208번 잔기에서 개시하여 431번 잔기에서 종결된다. 각각의 핑거내 Cys 및 His 잔기는 굵은 글씨로 나타낸다.
hBRAP 주요 서열(서열 1)
참조문헌
하기 인용문헌 및 상기 인용문헌들은 본원에서의 인용을 위해 본원에서 참조로서 일부 도입된다.
본원에 기술되고 청구된 모든 성분들 및 방법은 본 기술 측면에서 과도한 실험없이 제조되어 실행될 수 있다. 본 발명의 성분들 및 방법이 바람직한 양태의 측면에서 기술되었다고 하더라도, 당해 분야의 숙련가들에게는 본 발명의 개념, 취지 및 영역으로부터 벗어남이 없이 본원에 기술된 조성, 방법 및 방법의 단계들 또는 단계들의 순서에 변화를 가할 수 있음이 명백할 것이다. 더욱 특히, 화학적 및 물리적 모두에서 관련된 특정 제제는 동일하거나 유사한 결과가 달성된다면 본원에 기술된 제제를 치환시킬 수 있음도 명백할 것이다. 당해 분야의 숙련가에게 명백한 이러한 유사한 치환 및 변형 모두는 첨부된 청구의 범위에 의해 정의되는 바오 같이 본 발명의 취지, 영역 및 개념내에 속하는 것으로 고려된다. 따라서, 하기 청구의 범위에 기술된 바와 같이 특허되어야 하는 배타적 권리도 존재한다.

Claims (49)

  1. 서열 1로부터의 인접한 아미노산 서열을 포함하는 BRCA1 관련 단백질 또는 펩타이드를 암호화하는 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
  2. 제1항에 있어서, 프로모터의 조절하에 위치하는 폴리뉴클레오타이드.
  3. 제1항에 있어서, 재조합 벡터를 추가로 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
  4. 제1항에 있어서, DNA 단편으로서 추가로 정의되는 폴리뉴클레오타이드.
  5. 제1항에 있어서, RNA 단편으로서 추가로 정의되는 폴리뉴클레오타이드.
  6. BRCA1 관련 단백질 또는 펩타이드를 암호화하는 DNA 단편을 포함하는 재조합 숙주 세포.
  7. 제6항에 있어서, 세균 숙주 세포로서 추가로 정의되는 재조합 숙주 세포.
  8. 제7항에 있어서, 세균 숙주 세포가 이. 콜라이인 재조합 숙주 세포.
  9. 제6항에 있어서, DNA 단편이 재조합 벡터의 수단에 의해 세포내로 도입되는 재조합 숙주 세포.
  10. 제6항에 있어서, DNA 단편을 발현하여 암호화된 BRCA1 관련 단백질 또는 펩타이드를 생성시키는 재조합 숙주 세포.
  11. 제6항에 있어서, 발현된 BRCA1 관련 단백질 또는 펩타이드가 서열 2로부터의 인접한 아미노산 서열을 포함하는 재조합 숙주 세포.
  12. (a) BRCA1 관련 단백질 또는 펩타이드 암호화 DNA 단편이 프로모터의 조절하에 위치하는 재조합 벡터를 제조하는 단계;
    (b) 단계(a)의 재조합 벡터를 재조합 숙주 세포내로 도입시키는 단계;
    (c) 암호화된 BRCA1 관련 단백질 또는 펩타이드가 발현되는데 효과적인 조건하에서, 단계(b)의 재조합 숙주 세포를 배양하는 단계 및
    (d) 발현된 BRCA1 관련 단백질 또는 펩타이드를 수집하는 단계를 포함하는, BRCA1 관련 단백질 또는 펩타이드를 암호화하는 DNA 단편을 사용하는 방법.
  13. (a) BRCA1 관련 단백질 또는 펩타이드를 암호화하는 것으로 예견되는 핵산 샘플을 수득하는 단계;
    (b) 실질적으로 상보적 핵산이 하이브리드화되는데 효과적인 조건하에서, 단계(a)의 핵산 샘플과 서열 1로부터의 인접한 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 접촉시키는 단계 및
    (c) 단계 (b)에서 형성된 하이브리드화된 상보적 핵산을 검출하는 단계를 포함하는, BRCA1 관련 단백질 또는 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 검출 방법.
  14. 제13항에 있어서, 접촉된 핵산 샘플이 세포내에 위치하는 방법.
  15. 제13항에 있어서, 핵산 샘플이 접촉전에 세포로부터 분리되는 방법.
  16. 제13항에 있어서, 핵산 샘플이 DNA인 방법.
  17. 제13항에 있어서, 핵산 샘플이 RNA인 방법.
  18. 제13항에 있어서, 폴리뉴클레오타이드가 검출가능한 표지를 추가로 포함하고 하이브리드화된 상보적 핵산이 이러한 표지를 검출함에 의해 검출되는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 핵산 단편이 방사효소 표지 또는 형광성 표지를 포함하는 방법.
  20. 적합한 용기 수단속에, BRCA1 관련 단백질 또는 펩타이드를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오타이드 및 검출 시약을 포함하는 핵산 검출 키트.
  21. 제23항에 있어서, 대조군으로 사용하기 위한 관련되지 않은 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함하는 핵산 검출 키트.
  22. 제20항에 있어서, 제한 효소를 추가로 포함하는 핵산 검출 키트.
  23. 제20항에 있어서, 서열 1로부터의 하나 이상의 인접한 아미노산 서열을 암호화하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 핵산 검출 키트.
  24. 제20항에 있어서, 검출 시약이 폴리뉴클레오타이드에 연결된 검출가능한 표지인 핵산 검출 키트.
  25. 서열 1로부터의 인접한 아미노산 서열 또는 서열 9 또는 서열 10의 서열을 갖는 핵 국재화 펩타이드 서열을 포함하는 정제된 BRCA1 관련 단백질 또는 펩타이드를 포함하는, 전체 세균 세포로부터 유리된, 단백질 또는 펩타이드 조성물.
  26. 제25항에 있어서, 서열 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 포함하는 조성물.
  27. 제25항에 있어서, 제12항의 방법에 의해 제조된 조성물.
  28. 하이브리도마 ATCC HB-12164에 의해 생산된 항체 또는 이러한 항체와 같이 동일한 에피토프에 결합하는 항체.
  29. 제28항에 있어서, αBRCA1, αBRCA1N 및 αBRCA16B4로 이루어진 그룹중에서 선택된 항체.
  30. 제29항에 있어서, 하이브리도마 ATCC HB-12146으로부터 수득된 항체.
  31. 제28항에 있어서, 검출가능한 표지에 연결된 항체.
  32. 제31항에 있어서, 방사활성 표지, 형광발색소 표지, 핵 자기 스핀 공명 표지, 바이오틴 또는 형광발색소 기질과 접촉시 착색 생성물을 생성시키는 효소에 연결된 항체.
  33. 제32항에 있어서, 알칼린 포스파타제, 과산화수소 또는 글루코즈 옥시다제 효소에 연결된 항체.
  34. 제28항에 있어서, 모노클로날 항체인 항체.
  35. 제28항에 있어서, 폴리클로날 항혈청인 항체.
  36. (a) BRCA1 단백질 또는 펩타이드를 함유하는 것으로 여겨지는 생물학적 샘플을 수득하는 단계;
    (b) 면역 복합체가 형성되기에 효과적인 조건하에서, 단계 (a)의 샘플을 BRCA1 단백질 또는 펩타이드에 결합하는 제1 항체와 접촉시키는 단계 및
    (c) 단계 (b)에서 형성된 면역 복합체를 검출하는 단계를 포함하는, 생물학적 샘플중에서 BRCA1 단백질 또는 펩타이드를 검출하는 방법.
  37. 적합한 용기 수단속에, BRCA1 단백질 또는 펩타이드, 또는 BRCA1 단백질 또는 펩타이드에 결합하는 제1 항체와 면역검출 시약을 포함하는 면역검출 키트.
  38. 제37항에 있어서, 면역검출 시약이 단백질, 펩타이드 또는 제1 항체에 연결된 검출가능한 표지인 면역검출 키트.
  39. 제37항에 있어서, 면역검출 시약이 단백질, 펩타이드 또는 제1 항체에 대한 결합 친화성을 갖는 제2 항체에 연결된 검출가능한 표지인 면역검출 키트.
  40. 제37항에 있어서, 면역검출 시약이 사람 항체에 대한 결합 친화성을 갖는 제2 항체에 연결된 검출가능한 표지인 면역검출 키트.
  41. 동물에게 면역학적 유효량의 BRCA1, BRCA1 관련 단백질 또는 펩타이드 조성물을 포함하는 약제학적 조성물을 투여함을 포함하는, 면역 반응을 생성시키는 방법.
  42. 면역 복합체가 형성되기에 효과적인 조건하에서, 세포를 BRCA1 단백질 또는 펩타이드에 특이적으로 결합하는 표지된 항체와 접촉시키는 단계 및 세포내에 이러한 면역 복합체의 위치를 측정하는 단계를 포함하는, 세포내에서 BRCA1 단백질 또는 펩타이드를 국재화시키는 방법.
  43. 제42항에 있어서, 복합체가 세포의 세포질내에 국재화되는 방법.
  44. 제43항에 있어서, 세포질에 대한 복합체의 국재화가 세포의 전이 또는 1차 암의 지표가 되는 방법.
  45. 제42항에 있어서, 세포가 사람 세포인 방법.
  46. 제45항에 있어서, 사람 세포가 유방 세포 또는 난소 세포인 방법.
  47. (a) 암으로 예견되는 난소 종양 세포 또는 유방 종양 세포를 수득하는 단계 및
    (b) BRCA1 단백질 또는 펩타이드의 아세포적 국재화를 종양 세포내에서 검출하는 단계를 포함하는, 세포의 세포질에 대한 BRCA1 단백질 또는 펩타이드의 아세포적 국재화가 암 세포 존재의 지표가 됨을 특징으로 하는, 유방암 세포 또는 난소암 세포의 확인 방법.
  48. 세포질적으로 위치한 BRCA1, 또는 BRCA1 관련 단백질 또는 펩타이드를 세포내에서 확인함을 포함하는, 세포질내에서 단백질 또는 펩타이드의 존재가 암에 대한 세포의 감수성(susceptibility)의 지표가 됨을 특징으로 하는, 난소 세포 또는 유방 세포의 암에 대한 감수성의 예측 방법.
  49. 서열 7, 서열 8 및 서열 9로 이루어진 그룹중에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열이 결핍된 변형된 BRCA1 단백질 또는 펩타이드 조성물.
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