JPH09504860A

JPH09504860A - タンパク質相互作用の阻害

Info

Publication number: JPH09504860A
Application number: JP7502154A
Authority: JP
Inventors: ヨセフアブラッチ; キアン−フェンツァン; マークエスマーシャル
Original assignee: General Hospital Corp
Current assignee: General Hospital Corp
Priority date: 1993-06-11
Filing date: 1994-06-10
Publication date: 1997-05-13
Also published as: US5763571A; CA2163905A1; US5582995A; US5736337A; WO1994029727A1; EP0706657A4; EP0706657A1; DE706657T1; US5767075A

Abstract

(57)【要約】化合物をRafに接触させ、該化合物のRafへの結合能を決定することによる、抗増殖化合物を評価する方法、および、RasとRafとの接触を減少させる化合物を投与することによる、動物における細胞増殖を抑制する方法が開発された。

Description

【発明の詳細な説明】タンパク質相互作用の阻害連邦政府支援研究に関する記載本発明は「糖尿病、消化器疾患、腎臓病国立研究所（National Institutes of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases）」から与えられた「DK41513」および「DK41762」において、政府の支援を受けている。政府は本発明において一定の権利を有する。発明の背景本発明は、シグナル伝達に関する。 ras遺伝子は、ハーベイ（Harvey）ラット肉腫ウイルス(rasH)、およびクリスティン（Kirsten）ラット肉腫ウイルス(rasK)のがん遺伝子として発見された。ヒトにおいて、細胞性ras遺伝子(c-ras)における特徴的な変異が多くの型のがんに関連している。Rasを構造的に活性な状態にするこれらの変異対立遺伝子は、マウスの細胞株NIH 3T3のような細胞を培地中で形質転換させることが示されている。 ras遺伝子産物は、グアニン三リン酸(GTP)およびグアニン二リン酸(GDP)に結合し、そしてGTPをGDPへと加水分解する。活性型であるのは、RasのGTP結合状態である。補助分子であるGTPase活性化タンパク質(GAP)もまた、Rasに結合しGTP の加水分解を促進する。rasがん原遺伝子は、高等真核細胞において受容体型および非受容体型チロシンキナーゼにより開始される成長および分化シグナルを伝達するためには、完全に機能するraf-1がん原遺伝子を必要とする。活性型Rasは c-raf-1がん原遺伝子の活性化に必要であるが、RasがRaf-1タンパク質(Ser/Thr) キナーゼを活性化する生化学的機序はよくわかっていない。発明の要約ジンクフィンガードメイン含有タンパク質は、他のタンパク質と直接相互作用できることが見出されている。学説として確立されてはいないが、相互作用はジンクフィンガードメインを介して起こると考えられている。（以前は、ジンクフィンガードメインは、ジンクフィンガードメイン含有タンパク質と核酸同士の相互作用において主に活性を有すると考えられていた。）例えば、「Ras」および「Rafの調節性アミノ末端非触媒性ジンクフィンガー含有ドメイン」との間の直接の相互作用が見出されている。したがって、本発明は、例えば、ジンクフィンガードメイン含有タンパク質、がん遺伝子タンパク質、細胞性がん遺伝子タンパク質、またはがん原遺伝子タンパク質の、Rafアミノ末端非触媒性ジンクフィンガードメインへの結合能、シグナル伝達阻害性、細胞増殖阻害性、細胞周期を変化させる能力、またはがん遺伝子タンパク質あるいはがん遺伝子タンパク質基質などの他のタンパク質への結合能のような生化学的活性を阻害する能力について、化合物を評価する方法に特徴を有する。本方法は、化合物をジンクフィンガードメイン含有タンパク質、がん原遺伝子または細胞性がん遺伝子タンパク質に接触させること、そして化合物のタンパク質への結合能を決定することを含む。ジンクフィンガードメイン含有タンパク質の例としてはシグナル伝達タンパク質、シグナル伝達タンパク質の例としてはがん遺伝子タンパク質、がん遺伝子タンパク質の例としてはRafやRafのRa s結合性断片、RafのRas結合性断片の例としてはRafのアミノ末端非触媒性断片、 Rafのアミノ末端非触媒性断片としてはRasの残基1-257[Ras(1-257)][MEHIQGAWKT ISNGFGFKDAVFDGSSCISPTIVQQFGYQRRASDDGKLTDPSKTSNTIRVFLPNKQRTVVNVRNGMSLHDCL MKALKVRGLQPECCAVFRLLHEHKGKKARLDWNTDAASLIGEELQVDFLDHVPLTTHNFARKTFLKLAFCDI CQKFLLNGFRCQTCGYKFHEHCSTKVPTMCVDWSNIRQLLLFNPSTIGDSGVPQLPSLTMRRMRESVSRMPV SSQHRYSTPHAFTFNTSSPSSEGSLSQRQRS（配列番号：1）]またはRafの残基152-168[Ra f(152-168)][CDICQKFLLNGFRCQTC（配列番号：2）]が挙げられる。好ましくは、断片はRafの残基1-149[Raf(1-149)][MEHIQGAWKTISNGFGFKDAVFDGSSCISPTIVQQFGYQ RRASDDGKLTDPSKTSNTIRVFLPNKQRTVVNVRNGMSLHDCLMKALKVRGLQPECCAVFRLLHEHKGKKAR LDWNTDAASLIGEELQVDFLDHVPLTTHNFARKTFLKL（配列番号：6）]を含むペプチドであり、より好ましくは、断片は、Rafの残基51-131[Raf(51-131)][PSKTSNTIRVFLPNK QRTVVNVRNGMSLHDCLMKALKVRGLQPECCAVFRLLHEHKGKKARLDWNTDAASLIGEELQVDFL（配列番号:8）]を含むペプチド、Rafの残基51-149[Raf(51-149)][PSKTSNTIRVFLPNKQRT VVNVRNGMSLHDCLMKALKVRGLQPECCAVFRLLHEHKGKKARLDWNTDAASLIGEELQVDFLDHVPLTTHN FARKTFLKL（配列番号：7）]を含むペプチド、Rafの残基112-143[Raf(112-143)][ LDWNT DAASLIGEELQVDFLDHVPLTTHNFAR（配列番号:9）]を含むペプチド、Rafの残基88-10 5[Raf(88-105)][VRGLQPECCAVFRLLHEH（配列番号:10）]を含むペプチドであり、最も好ましくは、断片は、Rafの残基91-105[Raf(91-105)][LQPECCAVFRLLHEH（配列番号:11）]を含むペプチドである。化合物のタンパク質への結合親和性は、上記の性質のうちの一つまたは複数に関連している。好ましい態様として、結合は、ジンクフィンガードメイン含有タンパク質へ結合することが既知な第二のタンパク質での溶離により決定する。例えば、RasまたはRasのRaf結合性断片がRafへ結合した化合物の溶離に用いられる。タンパク質へ結合しそれによりタンパク質／化合物相互作用を阻害できる抗体、イオン性あるいは非イオン性の界面活性剤、カオトロピック剤、またはpHあるいは塩濃度の変化などを用いたその他の方法もまた、候補化合物を溶離するのに用いられうる。もう一つの面として、本発明の特徴は、例えば、ジンクフィンガードメイン含有タンパク質、がん遺伝子タンパク質、細胞性がん遺伝子タンパク質、またはがん原遺伝子タンパク質の、シグナル伝達阻害性、細胞増殖阻害性、細胞周期を変化させる能力、またはがん遺伝子タンパク質あるいはがん遺伝子タンパク質基質などの他のタンパク質への結合能のような生化学的活性を阻害する能力について、化合物を評価する方法にある。本方法は、化合物を以下のようなタンパク質、がん原遺伝子または細胞性がん遺伝子タンパク質に接触させること、そして化合物のシグナル伝達タンパク質への結合能を決定することを含む。タンパク質の例としてはシグナル伝達タンパク質、シグナル伝達タンパク質の例としてはがん遺伝子タンパク質、がん遺伝子タンパク質の例としてはRasやRasのRaf結合性断片、RasのRaf結合性断片の例としては、Rasの残基1-186[Ras(1-186)][MTEYKLVVVGA GGVGKSALTIQLLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGQEEYSAMRDQYMRTGEGFLCVF AINNTKSFEDIHQYREQIKRVKDSDDVPMVLVGNKCDLAARTVESRQAQDLARSYGIPYIETSAKTRQGVED AFYTLVREIRQHKLRKLNPPDESGPQCMSCKC（配列番号：3）]、Rasの残基32-40[Raf(32- 40)][YDPTIEDSY（配列番号：4）]またはRasの残基37-51[EDSYRKQVVIDGETC（配列番号：12）][Ras(37-51)]が挙げられる。化合物のシグナル伝達タンパク質への結合親和性は、上記の性質のうちの一つまたは複数に関連している。好ましい態様として、結合は、シグナル伝達タンパク質へ結合することが既知な第二のタンパク質での溶離により決定する。例えば、RafまたはRafのRas結合性断片がRasへ結合した化合物の溶離に用いられる。シグナル伝達タンパク質へ結合する抗体、イオン性あるいは非イオン性の界面活性剤、カオトロピック剤、またはpHあるいは塩濃度の変化などを用いたその他の方法もまた、候補化合物を溶離するのに用いられうる。本発明はまた、候補化合物をRafまたはその断片、およびRasまたはその断片と接触させ、そして該化合物のRas/Raf結合を阻害する能力を決定することにより、化合物の細胞増殖を阻害する能力を評価する方法を提供する。化合物存在下におけるRafまたはその断片、例えばRafの残基1-50[MEHIQGAWKTISNGFGFKDAVFDGSSC ISPTIVQQFGYQRRASDDGKLTD（配列番号：19）][Raf(1-50)]、Rafの残基41-55[RASD DGKLTDPSKTS（配列番号：20）][Raf(41-55)]、のリン酸化が化合物非存在下の場合と比較して増加している場合は、該化合物が細胞増殖を阻害するということを示している。好ましくはRafリン酸化はシグナル伝達タンパク質を介して行われ、より好ましくはシグナル伝達タンパク質はプロテインキナーゼA(PKA)であり、最も好ましくはRafは43位のセリン残基においてリン酸化される。本発明の特徴は、Raf活性化または細胞増殖を阻害するRapタンパク質の能力を模倣する能力について化合物を評価することにある。本方法は、化合物をRafまたはRafの残基1-257やRafの残基152-168などのRafのRap結合性断片、がん原遺伝子タンパク質、または細胞性がん遺伝子タンパク質に接触させること、そして化合物のRafまたはその断片への結合能を決定することを含む。化合物のRafまたは RafのRap結合性断片への結合親和性は、上記の性質のうちの一つまたは複数に関連している。好ましい態様として、結合はRapまたはRapのRaf結合性断片での溶離により決定する。Rafへ結合する抗体、イオン性あるいは非イオン性の界面活性剤、カオトロピック剤、またはpHあるいは塩濃度の変化などを用いたその他の方法もまた、候補化合物を溶離するのに用いられうる。前段落に記述したスクリーニング法は、抗がん遺伝子活性または腫瘍サプレッサー活性を有する候補化合物の同定に用いることができる。Rapは、野生型Rafに結合はするが活性化はさせないため、Ras活性のアンタゴニストとして作用する。RafのRap結合性配列へ結合する化合物の同定は、Rasとエフェクタードメイン（アミノ酸残基32-40）が等しくそしてRasシグナル伝達経路を阻害し培養細胞において形質転換フェノタイプを抑制することが示されているRapポリペプチドの活性を模倣することができる可能性が高い。もう一つの面として、本発明の特徴は、例えば、ジンクフィンガードメイン含有タンパク質、がん遺伝子タンパク質、細胞性がん遺伝子タンパク質、またはがん原遺伝子タンパク質の、ジンクフィンガードメインへの結合能、シグナル伝達阻害性、細胞増殖阻害性、細胞周期を変化させる能力、またはがん遺伝子タンパク質あるいはがん遺伝子タンパク質基質などの他のタンパク質への結合能のような生化学的活性を阻害する能力について、化合物を評価する方法にある。本方法は、化合物をジンクフィンガードメイン含有タンパク質およびあらかじめ選択したタンパク質に接触させること、そしてあらかじめ選択したタンパク質のジンクフィンガードメイン含有タンパク質との結合を化合物が阻害する能力を決定することを含む。結合を阻害する能力は、ジンクフィンガードメイン含有タンパク質とあらかじめ選択したタンパク質との相互作用を阻害し、そしてそれにより上記の性質に影響を与える、化合物の能力に関連している。好ましい態様として、ジンクフィンガードメイン含有タンパク質は、Raf、がん遺伝子または細胞性がん遺伝子などのがん遺伝子タンパク質のような一次シグナル伝達タンパク質であり、あらかじめ選択したタンパク質は、ジンクフィンガードメイン含有タンパク質により活性化などの生化学的活性の変化を受けるタンパク質であり、あらかじめ選択したタンパク質は、Ras、がん原遺伝子タンパク質、または細胞性がん遺伝子タンパク質などのがん遺伝子タンパク質のような二次シグナル伝達タンパク質であり、あらかじめ選択したタンパク質は、ジンクフィンガードメイン含有タンパク質によりリン酸化または脱リン酸化される基質であり、一次シグナル伝達タンパク質はRasまたはRasのRaf結合性断片、例えばRas の残基1-186またはRasの残基32-40であり、あらかじめ選択したタンパク質はRaf またはRafのRas結合性断片、例えばRafの残基1-257またはRafの残基152-168である。もう一つの面として、本発明の特徴は、化合物の細胞増殖阻害性を評価することにある。本方法は、化合物をRafまたはRafの残基1-257やRafの残基152-168などのRafのRas結合性断片に接触させること、化合物をRasまたはRasの残基1-186 やR asの残基32-40などのRasのRaf結合性断片に接触させること、そしてRasまたはRa sのRaf結合性断片の、RafまたはRafのRas結合性断片への結合を阻害する化合物の能力を決定することを含む。結合を阻害する能力は、化合物の細胞増殖阻害性に関連している。もう一つの面として、本発明の特徴は、ジンクフィンガードメイン含有タンパク質とあらかじめ選択したタンパク質との相互作用を阻害する能力について、候補化合物をスクリーニングする方法にある。本方法は以下のことを含む。(a)lac Z遺伝子などのレポーター遺伝子に結合したGAL4結合部位を提供すること。(b)ジンクフィンガードメイン含有タンパク質またはその生化学的活性を有する断片へ結合したGAL4結合ドメインを提供すること（ここでの「生化学的活性を有する」とはあらかじめ選択したタンパク質に結合できるという意味である）。(c)あらかじめ選択したタンパク質またはその生化学的活性を有する断片へ結合したGAL4 トランス活性化ドメインIIを提供すること（ここでの「生化学的活性を有する」とはジンクフィンガードメイン含有タンパク質に結合できるという意味である）。(d)候補化合物を投与すること。および(e)レポーター遺伝子の発現をモニターすること。またこのとき発現の減少を、候補化合物がジンクフィンガードメイン含有タンパク質とあらかじめ選択したタンパク質との相互作用を阻害するということの指標とする。上記の例において、ジンクフィンガードメイン含有タンパク質はGAL4結合ドメインと結合し、あらかじめ選択したタンパク質はGAL4トランス活性化ドメインII と結合する。本発明のスクリーニング法においては、ジンクフィンガードメイン含有タンパク質とGAL4トランス活性化ドメインとの結合、あらかじめ選択したタンパク質とGAL4結合ドメインとの結合もまた起こる。好ましい態様として、ジンクフィンガードメイン含有タンパク質は、Raf、がん原遺伝子タンパク質または細胞性がん遺伝子タンパク質などのがん遺伝子タンパク質のような一次シグナル伝達タンパク質であり、あらかじめ選択したタンパク質は、ジンクフィンガードメイン含有タンパク質により生化学的活性の変化を受けるタンパク質、またはRas、がん原遺伝子タンパク質、あるいは細胞性がん遺伝子タンパク質などのがん遺伝子タンパク質のような二次シグナル伝達タンパク質、またはジンクフィンガードメイン含有タンパク質によりリン酸化または脱リン酸化される基質であり、一次シグナル伝達タンパク質はRasまたはRasのRaf結合性断片である。もう一つの面として、本発明は、RasとRafの相互作用を阻害することのできる化合物の有効量を投与することにより、動物における有害細胞の増殖を阻害する方法にある。さらにもう一つの面として、本発明の特徴は、哺乳類、例えばヒトなどにおける有害細胞の増殖を阻害する方法にある。本方法は、RasまたはRasのRaf結合性断片の有効量を動物に投与し、そしてペプチドがRasとRafの相互作用を阻害することを含む。好ましい態様として、断片は、Ras(1-186)のアミノ酸配列を含むペプチド、またはRas(32-40)のアミノ酸配列を含むペプチド、またはRas(37-51)のアミノ酸配列を含むペプチドである。もう一つの面として、本発明の特徴は、哺乳類、例えばヒトなどにおける有害細胞の増殖を阻害する方法にある。本方法は、RafまたはRafのRas結合性断片の有効量を動物に投与し、そしてペプチドがRasとRafの相互作用を阻害することを含む。好ましい態様として、断片はRaf(1-257)、Raf(152-168)、Raf(1-149)、Raf(51 -149)、(51-131)、Raf(112-143)、Raf(88-105)、Raf(91-105)のアミノ酸配列を含むペプチド、またはRaf(91-105)のアミノ酸配列の中の少なくとも4個の連続アミノ酸を含む断片である。好ましくは、Rafペプチドはリン酸化されていない。本発明はまた、リン酸化されたRafまたはその断片を投与することにより、細胞増殖を阻害する方法を含む。断片は、43位のセリンにおいてリン酸化されたリン酸化ペプチドでありうる。好ましくは、断片はRaf(1-50)のアミノ酸配列を含み、より好ましくは、Raf(41-55)のアミノ酸配列を含む。本発明はまた、RasとRafの相互作用を阻害することができ、そしてRafのアミノ酸配列と少なくとも80％の配列相同性を有する少なくとも4個以上のアミノ酸を含むペプチドを含む。好ましい態様として、Rafのアミノ酸配列は、Raf(1-149 )、Raf(51-149)、Raf(112-143)、Raf(88-105)、またはRaf(91-105)のアミノ酸配列である。RasとRafの相互作用を阻害する能力を有し、Raf(91-105)のアミノ酸配列と少なくとも95％の配列相同性をもつ4個から15個のアミノ酸を含むペプチドもまた、本発明の範囲内である。好ましくは、ペプチドはRaf(91-105)のアミノ酸配列と100％の配列相同性を有する。「相同性」とは、本明細書で用いているように、二つのポリマー分子、例えば二つのペプチドの間のサブユニットの配列の類似性を指す。二つの分子両方におけるサブユニット部位が同じモノマーサブユニットにより占められている場合、例えば二つのペプチドの各々の部位がセリンにより占められている場合、それらはその部位において相同である。二つの配列の間の相同性は、同等または同一である部位の数の直接の関数である。例えば、二つのペプチドの部位の半分（例えば、10サブユニットの長さのポリマーで5つの部位）が同一である場合、その二つの配列は50％相同である。部位の90％、例えば10個のうち9個が同一である場合は、二つの配列は相互に90％の配列相同性を有する。例として、アミノ酸配列 VRGLQPおよびHAFLQPは相互に50％の配列相同性を有する。もう一つの面として、本発明は、RasとRafの相互作用を阻害することができ、 Rasのアミノ酸配列と少なくとも80％の配列相同性を有する少なくとも4個以上のアミノ酸を含むペプチドを含む。好ましい態様として、Rasのアミノ酸配列は、R as(32-40)またはRas(37-51)のアミノ酸配列である。RasとRafの相互作用を阻害する能力を有し、Ras(37-51)のアミノ酸配列と少なくとも95％の配列相同性をもつ4個から15個のアミノ酸を含むペプチドもまた、本発明の範囲内である。好ましくは、ペプチドはRas(37-51)のアミノ酸配列と100％の配列相同性を有する。本発明はまた、抗体の調製を含む。抗体は好ましくはRas(32-40)を含むペプチドに特異的に結合する抗体を主要に含むモノクローナル調製物である。好ましい態様として、調製物は、Rasの残基32-40の領域外のエピトープに結合する抗体を含まない。本発明は、本発明の抗体を投与することにより、動物、例えばヒトなどの哺乳類における不要な細胞の増殖を阻害する方法を含む。抗体の調製、好ましくはRafに結合したRasを含む複合体に特異的に結合し、単独のRasまたはRafには結合しないモノクローナル抗体の調製、および抗体、例えばRas/Raf複合体に結合するモノクローナル抗体を投与することにより、ヒトなどの哺乳類などの動物における有害細胞の増殖を阻害する方法もまた、本発明の範囲内である。もう一つの面として、本発明の特徴は、例えばジンクフィンガードメイン含有タンパク質と第二のタンパク質との結合、例えばRafまたはRafのRas結合性断片とRasの相互作用を阻害する抗増殖化合物のような化合物を精製し、ジンクフィンガードメイン含有タンパク質への結合親和性により該化合物を単離する方法にある。ジンクフィンガードメイン含有タンパク質の例としては、シグナル伝達タンパク質があり、シグナル伝達タンパク質の例としては、がん遺伝子タンパク質、がん原遺伝子タンパク質、または細胞性がん遺伝子タンパク質がある。好ましい態様として、第二のタンパク質はシグナル伝達タンパク質、例えばRasなどのがん遺伝子タンパク質、がん原遺伝子タンパク質、または細胞性がん遺伝子タンパク質であり、あらかじめ選択したタンパク質は、ジンクフィンガードメイン含有タンパク質によりリン酸化または脱リン酸化される基質であり、一次シグナル伝達タンパク質は、Ras、またはRasの残基1-186やRasの残基32-40などのRasのRa f結合性タンパク質であり、そしてあらかじめ選択したタンパク質は、Raf、またはRafの残基51-149、Rafの残基51-131、Rafの残基112-143、Rafの残基88-105、R afの残基91-105などのRafのRas結合性タンパク質である。もう一つの面として、本発明の特徴は、抗増殖化合物を精製する方法にある。本方法は、化合物を、Ras、またはRasの残基1-186、Rasの残基32-40、Rasの残基 37-51などのRasのRaf結合性断片と接触させること、そしてRasまたはRasのRaf結合性断片への結合親和性により化合物を単離することを含む。本発明は、本発明のタンパク質、ペプチド、そして抗体の精製調製物を含む。精製調製物とは、本明細書において用いているように、乾燥重量で少なくとも5 ％が本発明のタンパク質、ペプチド、または抗体である調製物をさす。本明細書において用いているように、ジンクフィンガードメインという用語は、亜鉛原子を配位させるための二つ好ましくは三つの離れたシステイン残基により形成される金属配位構造、例えばアミノ酸配列CXXCXXXXXXXXXCXXC（配列番号：5）により形成される構造をさす。本発明のペプチド、タンパク質、および抗体は、受容体伝達性および非受容体伝達性シグナル伝達を変化させ、細胞の異常増殖を阻害する。本発明のスクリーニング法は、抗増殖および腫瘍サプレッサー活性を有する化合物を同定するように設計された、単純、迅速、そして効率の良い方法である。本発明のペプチドおよび抗体、そして本発明のスクリーニング法を用いることにより同定された化合物は、腫瘍や自己免疫疾患のようなシグナル伝達の不正な制御または異常細胞増殖により特徴づけられる疾患を患う、ヒト患者を含む動物を治療するのに使用されうる。本発明のその他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および請求の範囲により明らかにする。詳細な説明まず、図面について簡単に説明する。図面図１は、GST-Raf[1-257]/Ras-GTP-γ-³²P複合体の形成における、RasのGTP結合型およびGDP結合型の間の競合を示す線グラフである。濃度を増加させながらR as-GTPまたはRas-GDPをRas/GST-Raf[1-257]共沈殿試験に添加し、複合体形成の阻害を決定した。各曲線は、3つの異なる実験を示している。図２は、GSTに融合したc-Raf-1の短縮型との会合による、Ras-GTP-γ-³²Pの共沈殿を示す棒グラフである。10pmolのGSTまたはGST-[Raf]タンパク質をRas-GTP- γ-³²Pと共にインキュベートし、次にグルタチオン−セファロースによりタンパク質複合体を沈殿させ、チェレンコフ検出器により検出した。各棒は、3つの異なる実験を代表する一つの実験からの二つの値の平均を表す。図３は、GST-Raf競合性タンパク質による、GAP活性化Ras-GTP加水分解の競合阻害を示す線グラフである。c-Raf-1のN末端の6つの異なる欠失変異体の相対的な結合親和性を、Ras結合の競合により測定した。GST-Rasを濃度を増加させながら標準のGAP-Ras-GTPase試験に添加した。Rafタンパク質のRasへの結合は、Ras とGAPの生産的な相互作用を阻害する。各曲線は、3つから5つの異なる実験を平均したものである。図４Ａは影の部分が主要な構造的特徴である、全長c-Raf-1タンパク質の図である。CR1は、二つの推定ジンクフィンガーおよびRas相互作用部位を含むRasの調節性N末端を表す。CR2も、セリンとスレオニンの重リン酸化により特徴づけられる調節性領域である。CR3は、タンパク質の触媒性キナーゼドメインである。図４Ｂは、Ras-GTPへの高親和性結合を示す、c-Raf-1のN末端内の小ドメインの位置を示す図である。RafのN末端ドメイン内の欠失を、大腸菌におけるGST融合体としての相対的な安定性、Rasを共沈殿させる能力、およびRas-GTPへの相対的な親和性と共に示した。図５は、短縮GST-Rafタンパク質のプロテインキナーゼA(PKA)リン酸化を示す棒グラフである。GSTおよびいくつかのGST-Raf融合タンパク質への放射能の取り込みは、ニトロセルロース結合試験により測定した。融合タンパク質においてc- Raf-1のセリン43が無傷である場合にのみ、特異的リン酸化が検出された。各棒は、3つの異なる実験を代表する一つの実験からの二つの値の平均を表す。図６は、c-Raf-1のセリン43のリン酸化が、Rasとc-Raf-1の短縮N末端断片との相互作用を阻害することを示す棒グラフである。0.1mM ATPの存在下、非存在下において、PKAをGST、GST-Raf[1-149]、GST-Raf[51-149]、またはGST-Raf[1-149 ;S43D]とともに１時間インキュベートし、その後Ras-GTPとの複合体形成を測定した。GSTからの値を、バックグラウンド値として差し引いた。GST-Raf[1-149] のみが、PKA依存リン酸化により阻害された。5つ以上の実験において、GST-Raf[ 1-149]について観察された阻害の量は、40-60％であった。その他のタンパク質については、PKA依存阻害は観察されなかった。図７は、合成ペプチドによるRas/Raf複合体形成の阻害を示す棒グラフである。図８は、Rafの残基91-105を含む合成ペプチドによる、Ras/Raf複合体形成の阻害を示す線グラフである。図９は、変異組換え体Rafペプチドの収率を示す棒グラフである。図１０は、変異組換え体RafペプチドへのRas結合を示す棒グラフである。図１１は、5つのオーバーラップするRasペプチドの位置、および各ペプチドによるRas/Raf相互作用の阻害を示す図である。GST融合タンパク質の構築 RasまたはRafのようなポリペプチドの発現、精製そして固体への固定化を促進するため、GST融合タンパク質が作成されうる。GST融合タンパク質をコードするキメラ遺伝子は、ペプチドまたはペプチド断片をコードするDNAをGSTのカルボキシル末端をコードするDNAへ融合させることにより構築されうる（例えば「Smith et al.,1988,Gene 67:31」参照）。融合構築体は例えば大腸菌XA90のような適当な発現系に形質転換され、GST融合タンパク質の発現はイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)により誘導されうる。GST融合タンパク質の精製得られた構築体を適当な発現系に形質転換させた後、IPTGの誘導により可溶性細胞タンパク質の主要な構成成分として融合タンパク質が生成する。融合タンパク質は、グルタチオンアフィニテイクロマトグラフィーによる精製を含む、当業者に知られた方法により精製されうる。生成物の精製はゲル電気泳動などの当業者に知られた方法により確認できる。Rasの固定化GST-Rafへの結合 GST融合タンパク質は、当業者に知られた方法により、グルタチオンセファロースなどのマトリックス物質に結合したグルタチオンと結合させられる。RafのRas結合性断片およびRasのRaf結合性断片 Rafに結合するRasの断片（またはRasに結合するRafの断片）は、当業者に知られた方法により作成されうる。例えば、Raf結合性であると推定されるRas断片を発現するDNA断片は（本明細書の記述に従い）GSTと融合させられ、融合タンパク質はグルタチオン−セファロースへの結合により固定化され、そして融合タンパク質のRafまたはその断片への結合能が決定される。インビトロのRafのRasへの直接の結合野生型Ras、および12位のバリンがグリシンに置き換わったRasH(V12GrasH)は、GTP依存的にRaf-1のアミノ末端調節性セグメントへ特異的に結合する。RasのR af(1-257)への結合は、Rasに結合したグアニルヌクレオチドの性質に強く依存する。GTPγSまたはGDPβSを同程度に負荷したV12GrasHをGST-Raf融合タンパク質と共にインキュベートした。GTPγS結合型の同濃度のRasペプチドをインキュベートした場合と比較して、GDPβS-Rasペプチドは有意に少なくRaf(1-257)により保持された。このように、GTPを負荷した活性型のRasは、Raf(1-257)に対して実質的に高い見かけの親和性を示す。実験は、以下のように行った。raf-1遺伝子産物は、ATP結合性部位、カルボキシ末端触媒性ドメイン、そしてCR1およびCR2と名付けられたアミノ末端調節性ドメインを有する。グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）融合タンパク質を、最初の257アミノ酸残基を含むc-raf-1断片[Raf(1-257)]、および168位におけるシステイン残基がセリン残基に置き換わった変異体断片[Raf(1-257,C₁₆₈→S)] をコードするDNA配列をクローニングすることにより作成した。単独のGSTを対照として用いた。融合タンパク質およびGSTを同濃度で、様々な量のGTPγS負荷V12 GrasHに添加した。GSTγS-V12GrasHのGST単独への結合は検出されなかったのに対し、V12GrasHは用量依存的にGST-Raf(1-257)に結合した。GSTγS-V12GrasＨはまた変異体GST-Raf(1-257 C₁₆₈→S)にも結合したが、実験したいずれのRas濃度においても、野生型Raf(1-257)と比較して、同量の変異体Raf(1-257,C₁₆₈→S)により保持されたRasの量は有意に少なかった。不完全なプロセシングを受けたRasタンパク質はRafアミノ末端ドメインに結合することができる Rasは、そのカルボキシ末端において、C₁₈₆におけるS-ファルネシル化、C₁₈₆ の後におけるタンパク分解、C₁₈₆カルボキシ末端のカルボキシメチル化、そして一つまたは複数の上流のシステインにおけるパルミトイル化、を含む一連の連続的な翻訳後修飾を受ける(Hancock,J.F.et al.,Cell 57,1167-1177(1989))。スポドプテラフルギペルダ(Spodoptera frugiperda/Sf9)細胞で発現させた場合、ras Hペプチドの約10％が膜機能に関連し、そしてこれの相当部分がパルミトイル化されていることが示されており、このことはRasペプチドが完全にプロセシングされたということを示す。バキュロウイルスのrasHの細胞質型はパルミトイル化されていないが、いくつかの分子はファルネシル化されていることがある(Page, M.J.et al.,J.Biol.Chem.264,19147-19156(1989))。Sf9細胞からの組換え体V12G rasHポリペプチドの膜由来型および細胞質型を、GST-Raf(1-257)への結合能に関して比較した。Rasペプチドは、各々精製し、³⁵S-GTPγSを約1.0の化学量となるように負荷させた。およそ同じ濃度および類似の条件において、Rasの細胞質型および膜由来型はいずれも、変異体GST-Raf(1-257 C₁₆₈→S)よりGST-Raf(1-257) に効率よく結合した。これらのデータは、Rasペプチドの完全なプロセシングはR asのRafアミノ末端への結合にとって不可欠ではないということを示している。インビトロの直接結合実験を以下のように行った。グルタチオン−アガロースビーズ上に固定化されたGST、GST-Raf(1-257)、およびGST-Raf(1-257,C₁₆₈→S) を、GTPγSを負荷したバキュウロウイルスの組換え体細胞質型V12GrasH、または GDPβSを負荷した同量のRasペプチドと共にインキュベートした。また、Rasを添加しない実験を同時に行った。4℃で6時間攪拌した後、グルタチオン−アガロースビーズを洗浄し、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE)により、その後パン-Rasモノクローナル抗体-2(オンコジーンサイエンス社/Oncogene Science)を用いたイムノブロッテイングによりRasペプチドの結合を分析した。膜沈殿物または細胞質から部分的に精製したバキュロウイルスの組換え体V12G rasHをRasペプチドの濃度がおよそ等しくなるようにし、同時にGTPγSを負荷し、グルタチオンアガロースに固定化した、対照としてのGST-インスリン受容体基質-1(IRS-1)、GST-Raf(1-257)またはGST-Raf(1-257,C₁₆₈→S)と共にインキュベートした。4℃で6時間攪拌した後、ビーズを洗浄し、Rasペプチドの結合を分析した。組換え体Rasペプチド組換え体Rasペプチドの作成のため、単層に成長したSf9細胞に、5X感染多重度 (MOI)で、V12GrasHをコードする組換え体バキュウロウイルスを感染させた。感染の65から72時間後、「Mizuno,T.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88,6442-64 46(1991)」に従って細胞を集め、超音波処理をし、そして100,000xgで1時間遠心分離した。膜沈殿物および細胞質中のRasペプチドは、いずれも30mM n-オクチルグルコシドを用いて「Mizuno,T.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88,6442-6446(1991)」に従い、モノQ(MonoQ)陰イオン交換クロマトグラフィーを使って各々精製した。³⁵ S-GTPγS結合の最大点は、イムノブロッテイングにより検出したRasペプチドに相当した。両調製物（20mM Tris-HCl,pH8,5mM MgCl₂,1mM EDTA,1mM DTT,30mM n-オクチルグルコシド,約0.25M NaCl中、-80℃で保存）は、およそ10％の純度であった。 Rasのヌクレオチド負荷は、所望のペプチド濃度に希釈し、そして等量の2Xロード用緩衝液(0.1M Tris-HCl pH 7.5,15mM EDTA,1mg/ml BSA,2mM DTT,1mM GTPγS またはGTPβS)に添加することにより行った。37℃で15分後、MgCl₂を最終濃度12 .5mMで添加し、Rasペプチドを氷上に置いた。これらの条件下でのRasの³⁵S標識グアニルヌクレオチド負荷は、GTPγSおよびGTPβS両方で約1.0の化学量となった。模擬のGTP/GDP負荷反応を、RasをRas保存用緩衝液に置き換える以外はすべて同じ成分により行った。組換え体GST-Ras融合タンパク質 Raf-1のアミノ酸残基1-257をコードするDNA配列は、各々野生型およびC₁₆₈→S 変異型の配列をコードするプラスミドRSV-C4およびRSV-PM17(Bruder,J.T.,Hedec ker,G.&Rapp,U.R.Genes Dev.6,545-556(1992))を鋳型として用いて、ポリメラーゼチェーン反応(PCR)により作成した。c-DNAをEcoRIおよびSalI部位においてpGE X-KG(Guan,K.L.and Dixon J.E.,Anal Biochem.192,262-267(1991))に挿入し、そして配列決定をして変異体および適切なインフレーム挿入を確認した。GST-Raf 融合タンパク質およびGSTポリペプチドは、グルタチオンアガロースで精製し、そして「50mM Tris-HCl pH7.5,0.15M NaCl,1mM DTT,1.0% TritonX-100（緩衝液A ）」中のグルタチオン(12.5mM)で溶離した。緩衝液Aに対する透析により、グルタチオンを溶離した融合タンパク質から除去した。GST-Raf(1-257)およびGST-Ra f(1-257,C₁₆₈→S)は、染色ポリアクリルアミドゲル上では区別できなかった。組換え体ペプチドの約50％が、全長融合タンパク質として回収された。精製したGS TおよびGST-Raf融合タンパク質を各々、7mgペプチド/ml結合ビーズの濃度のグルタチオンアガロースと共に、4℃で30分攪拌しながらインキュベートした。ビーズを4Xで洗浄し、緩衝液Aに50％の懸濁液になるよう再び懸濁させた。50μlのグルタチオンアガロース懸濁液を、80μlのGTPγS負荷細胞質型Ras、80μlの模擬G TP負荷反応液、または20μlのGTP負荷Rasと60μlの模擬GTP負荷反応液との混合液と混合した。同時に、80μlのGDPβS負荷Ras、80μlの模擬GDP負荷反応液、または20μlのGDPβS負荷Rasと60μlの模擬GDP負荷反応液との混合液を、50μlのグルタチオンアガロースビーズ懸濁液に添加した。最終濃度で「0.2％ BSA,5mM MgCl₂,25mM ZnCl₂ pH7.5」を含む緩衝液A(0.6ml)をすべてのチューブに添加した。懸濁液は、4℃で6時間攪拌し、緩衝液Aで5回洗浄し、ドデシル硫酸ナトリウム (SDS)で溶離し、SD S-PAGEを行った。ポリビニリデンジフロリド(PVDF)膜へ転写した後、膜をパンRa sモノクローナル抗体-2（オンコジーンサイエンス社）を用いてイムノブロッテイングし、増幅化学発光法（アマシャム社）を用いて検出した。膜由来型および細胞質型Ras調製物を、Rasペプチド濃度がおよそ等しくなるように希釈し、同時にイムノブロッテイング、ゲル染色、GSTγS負荷により試験し、そして上記のように固定化GST融合タンパク質と共にインキュベートした。GST -IRS-1融合タンパク質をGSTの代わりに対照として用いた。Ras標準ペプチドは、「オンコジーンサイエンス社」より購入した。Raf(1-257)のc-rasH GTPase活性阻害 Raf(1-257)は、c-rasH GTPase活性のRas-GAPによる活性化を阻害する。Rasの触媒するγ³²P-GTPの加水分解の固有速度定数は、組換え体GST-Raf(1-257)により変化しない。対照的に、p120 Ras-GAPがRas GTPaseを活性化する能力は、Ras- GAPとほぼ等しい濃度で添加したGST-Raf(1-257)により強力に阻害されうる。しかしGST単独では効果がない。同濃度の変異体GST-Raf(1-257,C₁₆₈→S)は、野生型GST-Raf(1-257)ペプチドより有意に少なくRas-GAPを阻害する。組換え体GST、GST-Raf(1-257)、およびGST-Raf(1-257,C₁₆₈→S))がc-rasH GTP ase活性を変化させる能力を、Ras-GAPの非存在下および存在下で決定した。GTPa se活性は、濾過後にc-rasHに結合していたγ³²P-GTPから推定した。これらの実験において、上記のバキュロウイルスの膜V12GrasHの場合と同様に、バキュロウイルスの組換え体c-rasHを発現させ、Sf9細胞の膜沈殿物から精製した。氷上で、0.1mlのRas保存用緩衝液中のc-rasH(約10μg/ml)を0.3mlの「60m M Tris-HCl,pH7.5,5mM EDTA,0.7mg/ml BSA,1.5mM DTT,4mM ATP,0.142μM γ³²P- GTP(4-6x10⁵cpm/pmole)」と混合することにより、c-rasHにγ³²P-GTPを負荷した。1時間後、50μlの135mM MgCl₂を添加した。c-rasHのα³²P-GTP負荷を同条件下で行った。そして、「25mM Tris-HCl,pH7.5,5mM MgCl₂,3mM ATP,1mM DTT」中でゲル濾過することによりα³²P-GTP-c-rasHを未結合のヌクレオチドから分離し、氷上で保存した。バキュロウイルスの組換え体全長ヒトGAPタンパク質を、「25m M Tris-HCl,pH7.5,1mM EGTA,5mM MgCl₂,1mM DTT（GAP緩衝液）およびプロテアーゼ阻害剤」中でホモジナイズすることによりSf9細胞から抽出した。透明にした上清を、GAP用緩衝液で平衡化したファーストQ(FastQ)セファロースでの陰イオン交換クロマトグラフィーにかけ、0.4MまでのNaCl勾配で溶離した。GAPを、フィルター結合試験における放射能標識Rasペプチドを用いて検出した。Ras-GAPのピーク画分を50 ％(NH₄)₂SO₄で沈殿させ、トリス(Tris)を「25mM 2-[N-モルホリノ]エタンスルホン酸(MES)pH6.5」に置き換えた修飾GAP緩衝液に対して透析し、MES-GAP緩衝液でモノS(MonoS)陽イオン交換クロマトグラフィーにかけた。ピーク画分を一つにまとめ、20％グリセロールを含むMES-GAP緩衝液に対して透析した。4μlのGAP(0.0 3μg/ml)またはMES-GAP緩衝液を、4μlのGST、GST-Raf(1-257)またはGST-Raf(1- 257,C₁₆₈→S）（各々緩衝液A中に0.1mg/ml）と混合した。反応は、20μlのγ³²P -GTP負荷c-rasHを添加することにより開始した。30℃で15分後、1mlの「25mM Tr is-HCl pH8,0.1M NaCl,30mM MgCl₂,2mM DTTおよび1mg/ml BSA」を含む停止用溶液を添加した。混合液を、BA85ニトロセルロースフィルターで濾過し、4mlの停止用溶液で3回洗浄し、そしてフィルターに保持された³²P標識ヌクレオチドを分析した。³²P標識ヌクレオチドの同定は、ポリエチレンイミン(PEI)セルロース板を「0.75M KPO4,pH3.65」で展開し、TLCにより分析した。2-ハイブリッド酵母発現系におけるRafのRasへのin situ（インサイチュ）結合タンパク質−タンパク質相互作用は、転写アクチベーターの活性を再構成した 2-ハイブリッド発現系を用いてin vivo（インビボ）で同定できる。酵母GAL4タンパク質は、機能的に区別されるドメインを含む。一つのドメインはDNA結合を担い、その他は転写の活性化を担う。2-ハイブリッド発現系において、2-ハイブリッドタンパク質をコードするプラスミドを酵母に導入する。ハイブリッドタンパク質の一つは、第一のタンパク質に融合したGAL4 DNA結合ドメインを含み、もう一方は、第二のタンパク質に融合したGAL4活性化ドメインを含む。もし二つのタンパク質同志が相互作用することができるなら、Gal4結合部位を含むプロモーターからの転写を活性化する能力、GAL1からの上流の活性化配列(U AS_G)が、レポーター遺伝子の発現を導くように再構成される。複数のRas変異体のタンパク質−タンパク質相互作用を、そのような相互作用が酵母発現系においてGAL4タンパク質のトランス活性化機能を再構成する能力により検出した(Durfee,T.et al.Genes Develop.7,555-569(1993))。c-Raf(1-257) およびc-Raf(1-257,C₁₆₈→S)変異体をコードするcDNA配列をpMA424プラスミド(Chi en C.T.,Bartel P.L.,Sternglanz,R.,Fields,S.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88, 9578-9582(1991))に挿入し、GAL4アミノ酸残基1-147（GAL4 DNA結合ドメイン）をコードするDNA配列へインフレームで融合させた。 pACTは、アミノ酸768-881（GAL4 トランス活性化ドメインII）に相当するcDNA 配列をコードするベクターである(Kitayama,H.,Matsuzaki,T.,Ikawa,Y.& & Noda ,M.Cell 56,77-84(1989))。lacZレポーター遺伝子の発現を駆動させる（Gallの上流活性化配列からの）Gal4結合部位を含む酵母株における、pMA424 Raf(1-257 )またはpMA424 Raf(1-257,C₁₆₈→S)とpACTの共発現は、lacZ発現を全く活性化しなかった。V12GrasHペプチドをコードするDNA配列とpACTGAL4トランス活性化ドメインとのインフレームでの融合により、野生型Raf(1-257)配列との共発現において強力なlacZ発現を示すいくつかのコロニーが出現したが、変異体Raf(1-257, C₁₆₈→S)ではそのようなコロニーは出現しなかった。野生型、変異体Raf-1アミノ末端いずれのトランスフェクションにおいても、r as配列の発現に対する形質転換効率の減少がみられた。完全にプロセシングを受けたRasカルボキシ末端は、前述のin vitro（インビトロ）のRaf(1-257)とRasとの間の相互作用にとって重要ではないようであるため、pACTのV12GrasH DNA配列を修飾しカルボキシ末端の4アミノ酸残基を除去した(△CT)。この短縮により、r aS配列をコードするpACTの成長阻害効果が完全に除去された。これらの条件下において、V12GrasH △CTと野生型Raf(1-257)との共発現は強力にlacZのGAL4駆動発現を再構成し、一方V12GrasH △CTと変異体Raf(1-257,C₁₆₈→S)との共発現ではlacZは非常に微弱にしか発現しないということは明白である。pMA424のRaf(1- 257)DNA配列をpACTIIに置き換え、rasまたはrap-1b挿入を含むpMA424と共形質転換した場合にも、lacZ発現について似たようなパターンが得られる。 Rap 1a(Pizon,V.et al.Oncogene 3,201-204(1988))および1b(Pizon,V.,Lerose y,L.,Chardin,P.&Tavitian,A.Nucleic Acids Res.16,7719(1988))ポリペプチド（残基4-106は相互に等しい。）は、エフェクタードメイン(アミノ酸残基32-40) がRasと等しい低分子GTP結合タンパク質である。Rap-1a(Krev-1)は、NIH 3T3細胞においてv-rasKにより誘導された形質転換フェノタイプのサプレッサーとして同定された(Kitayama,H.,Matsuzaki,T.,Ikawa,Y.& & Noda,M.Cell 56,77-84(1989) )。Rap 1a自体には、形質転換させる性質はない。Rap-1bは、アフリカツメガエル卵母細胞(Xenopus oocyte)(Campa,M.J.et al.Biochem.Biophys.Res.Comm.174, 1-5(1991))におけるRasの作用のアンタゴニストであることが示されている。Rap -1のエフェクタードメイン内の変異により、Ras形質転換の阻害剤として作用する能力が損なわれる(Kitayama,H.,Matsuzaki,T.,Ikawa,Y.& Noda,M.Proc.Natl.A cad.Sci.U.S.A.87,4284-4288(1990))。これらの観察は、Rap-1a/1bおよびRasの同一エフェクタードメインにより共通のRasエフェクターに結合できるかもしれないということを示し、そして実際にRap-1aは高い親和性でRas-GAPに結合する( Hata,P.et al.J.biol.Chem.265,7104-7110(1990);Frech,M.et al.Science 249,1 69-171(1990))。しかしながら、明らかに、Rap-1aに関連したRasの残基32-40は活性化させることができず、そして実際にRasシグナル伝達経路を阻害する。これらの性質を考慮し、V12Grap-1bおよびV12Gpar-1b△CTはRaf(1-257)と強力に相互作用しlacZ発現を活性化するが、変異体Raf(1-257,C₁₆₈→S)との相互作用は検出されないということは注目すべきことである。 Rasの野生型Rafアミノ末端配列への結合が変異体Rafに対するものよりも勝っているということは、in vitroの直接結合実験でみられた結果を確証する。野生型Raf(1-257)および変異体Raf(1-257,C₁₆₈→S)が、Rasエフェクタードメインの内部または周辺に変異を含む一連のV12GrasH△CT構造と相互作用する能力は、酵母でGAL4依存lacZ発現を再構成することにより評価される（表１）。 Rasエフェクタードメインは、形質転換およびp120 Ras-GAPへのRasの結合に必須な領域として同定されている。この領域内の変異は、例えばヌクレオチド結合、加水分解、膜局在化などの、Ras固有の生化学的活性を変化させないことが示されている。NIH 3T3細胞におけるRasのGAPへの結合およびRasの形質転換活性を失わせることが知られているエフェクタードメイン内の変異[D₃₈→N、P34(△34) の欠失、D₃₈→A]を含む二つのV12GrasH△CT（表１）(Marshall,M.S.et al.Molec .Cell Biol.11,3999-4004(1991);Marshall,M.S.& Hettich,C.A.Oncogene 8,425- 431(1993))のRaf(1-257)との相互作用に関して検討した。両エフェクター変異体は、野生型、変異体raf-1配列いずれとの共発現においてもlacZ発現を活性化することが完全にできなかった（表１）。 Rasエフェクタードメインに近接したRasの残基26、27、30、31および45の変異により、RasのRas-GAPへの親和性は穏和に減少するかまたは全く減少しないにも関わらず、Rasの形質転換活性は減少することが示されている。V12GrasH△CT配列に挿入されたこれらの残基における変異の、lacZとRaf(1-257)の共発現の活性化に対する効果を、表１に示した。D₄₅→E変異は、Ras-GAPや神経繊維腫症(neur ofibromatosis)−1型遺伝子産物(NF1)への結合、およびRas GTPaseのGAP活性化に対する正常な感受性は強化するにも関わらず、Ras形質転換活性は大いに減少させることが知られている(Marshall,M.S.& Hettich,C.A.Oncogene 8,425-431(1 993))。V12GrasH△CT配列に挿入されたD₄₅→E変異により、V12GrasH△CTのlacZ とRaf(1-257)の共発現を活性化する能力が著しく減少した。Rasの残基N₂₆→GおよびN₂₇→Iという変異もまた、GAPへの結合や反応性は変化させない一方、Rasの形質転換活性を実質的に減少させる（しかしD₄₅→Eよりはいくらか穏やかである。）（表１）(Marshall,M.S.et al.Molec.Cell Biol.11,3999-4004(1991);Marsh all,M.S.& Hettich,C.A.Oncogene 8,425-431(1993))。G₂₆I₂₇変異のV12GrasH△C Tへの挿入は、Raf(1-257)との共発現におけるlacZ発現の活性化を実質的に減少させるが、D₄₅→Eより程度は低い（表１）。Rasの残基のD₃₀→EおよびE₃₁→Kという変異は、RasのGAPへの結合およびRasの形質転換活性を比例的に80-90％減少させる（表１）（Marshall,M.S.et al.Molec.Cell Biol.11,3999-4004(1991);Ma rshall,M.S.& Hettich,C.A.Oncogene 8,425-431(1993))。E₃₀K₃₁ V12GrasH△CT 構築体では、lacZのRaf(1-257)との共発現を活性化する能力が穏和に減少する。酵母での2-ハイブリッド系を用いたタンパク質−タンパク質相互作用の検出は、以下のように行った。インフレームでGAL4(1-147)をコードする配列と融合したRaf(1-257)またはRaf(1-257,C₁₆₈→S)DNA配列を含むベクターpMA424(Chien C. T.,Bartel P.L.,Sternglanz,R.,Fields,S.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88,9578- 9582(1991))を、対照として挿入配列を含まないpACTIIベクター、またはGAL4トランス活性化ドメインIIとインフレームで融合したV12GrasH、V12GrasH△CT、マウスrap1bまたはrap1b△CTをコードするDNA配列を含むpACTIIベクターと共に酵母に共形質転換した。選択培地上での培養の3日後、コロニーを5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトピラノシド(X-gal)を含む選択培地にレプリカし、そして3 日後に写真を撮影した。 Raf(1-257)およびRaf(1-257,C₁₆₈→S)をコードするDNA配列は、鋳型としてプラスミドRSV-C4およびRSV-PM17(Bruder,J.T.,Heidecker,G.& Rapp,U.R.Genes De v.6,545-556(1992))を各々用いてPCRにより調製した。5'末端は、EcoRI部位においてGAL4(1-147)をインフレームで挿入して構築した。pMA424 SalI部位を、raf 配列の３’末端に用いた。リーデイングフレームおよびC₁₆₈→S変異は、DNA配列決定により確認した。 pACTIIへ挿入されたV12GrasHおよびrap1b配列をPCRを用いて作出し、BamH1およびXho1部位を用いてGAL4トランス活性化ドメインII配列をインフレームで挿入した。△CT構築体は、RasおよびRap1bのカルボキシ末端の４アミノ酸をコードするDNA配列を欠いていた。rap1b DNA配列は、マウスT細胞c DNAライブラリーを用いてPCRにより単離した。「Ausubel,F.M.et al.in Current Protocols in Molecular Biology,Chapter 13,(Wiley Interscience,New York, 1990)」に従い、熱ショックの前に形質転換混合物に10％DMSOを添加するという修正を加えて、酵母株GGY1::171にpMA424およびpACTIIベクター構築体を形質転換させた。形質転換体は、「Durfee,T.et al.Genes Develop.7,555-569(1993);C hien C.T.Bartel P.L.,Sternglanz,R.,Fields,S.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88 ,9578-9582(1991)」に従いSDHis^-Leu^-プレート上で3日間培養し、その後X-galを含むプレートに転写し、次に72時間後に青いコロニーを計数した。 V12GrasH△CTとRaf(1-257)との間の相互作用を減少させるRasエフェクタードメインの変異を、以下のように分析した。上記のように、変異体ras配列は、pMV 7中にコードされた同種の配列(Marshall,M.S.et al.Molec.Cell Biol.11,3999-4 004(1991);Marshall,M.S.& Hettich,C.A.Oncogene 8,425-431(1993))を鋳型として用いてPCRにより作成した。各pACTII-ras構築体は、DNA配列決定により確認した。Raf(1-257)をコードするベクターpMA424を、挿入配列を持たないpACTIIベクター、V12GrasH△CTを含むpACTIIベクター、または基本のV12GrasH△CTに変異： D₄₅→E、D₃₈→N、△34、D₃₈→A、N₂₆H₂₇→GI、およびD₃₀E₃₁→EKが導入されたra s構築体を含むpACTIIベクターと共に酵母に共形質転換した。選択培地上での培養の3日後、コロニーをX-galを含む選択培地にレプリカし、そして3日後青いコロニーを計数した。同じ一揃いのpACTII V12GrasH△CT変異体の、pMA424 Raf(1-257,C₁₆₈→S) との共形質転換も同時に行った。これらの形質転換体のX-galプレート上での培養では、青いコロニーは検出されなかった。表１において、上記のように選択したクローンのβ−ガラクトシダーゼ活性を定量し、そしてこの活性を既知の形質転換活性およびp120 Ras-GAPとNF1のRas変異体への結合と比較した。酵母におけるRas-Raf相互作用およびNIH 3T3細胞におけるRasの形質転換能に対するRasエフェクタードメインの変異の分析を、以下のように行った。Raf(1-257)をコードするpMA424をV12GrasH△CT変異体をコードするpACTIIと共に酵母に共形質転換した。選択培地上での培養の3日後、プレートを掻き取り、各画分の等分したものを液体選択培地中でOD₆₀₀が0.8になるまで培養した。全細胞懸濁液を透過性にし、そしてo-ニトロフェニルβ-D-ガラクトシドを用いてβガラクトシダーゼ活性を3つの同じ試料について試験した（Ausubel ,F.M.ら、分子生物学の最新プロトコル、第13章、(ウイリーインターサイエンス (Wiley Interscience)社、ニューヨーク、1990)）。NIH 3T3細胞における形質転換効率、およびNF1/GAPへの相対的な結合性は、「Marshall,M.S.& Hettich,C.A. Oncogene 8,425-431(1993)」を参考とした。形質転換のデータは全長V12GrasHポリペプチドに関するものであり、NF1/GAP結合性はc-rasペプチドに関するものである。表１のデータは、Rasエフェクタードメイン変異体の、NIH 3T3細胞を形質転換させる能力、およびRafアミノ末端調節性ドメインとの相互作用によりlacZ発現を活性化する能力との間に強い相関が存在することを示している。Ras-Raf複合体 in vitroで精製ペプチドを用いて、そしてin situでGAL4 DNA結合性およびトランス活性化ドメインの物理的な再構成による酵母発現系を用いて測定した、これらの発見は、RafおよびRasが相互に直接結合することができるということを証明する。Ras結合に参加するRafドメインは、Rafアミノ末端調節性領域であり、R afと上流活性化因子との相互作用にとって重要であることが知られている構造、 Rasシステインフィンガーが完全であることが、同様にin situのRafとRasとの直接的な結合にとって重要である。Rasの完全なエフェクタードメインがRafとの相互作用にとって必要であり、Rasのエフェクタードメインの内部および周辺の変異は Ras形質転換活性を減少させ、同時にin situのRasのRafと相互作用する能力を減少させる（表１）。Raf(1-257)のc-rasHへの結合はRas GTPaseの速度を変化させないが、Ras-GAPによるRas GTPaseの活性化は阻害する。このことは、Rafおよび GAPポリペプチド両方がRasエフェクタードメインへ競合的に結合するということと一致する。S-ファルネシル基を含むRasカルボキシ末端は、Ras-Raf相互作用にとって重要ではないようである。Rap-1bもまた、Rafアミノ末端ドメインと強力に相互作用し、Rap-1aとRas-GAPで起こるような非生産的なRap-1b/Raf複合体の生成によりRasとRap-1a/bとの間の見かけの拮抗機構を提供する(Quillam,L.A.et al.Molec.Cell Biol.10,29012908(1990))。 RafがRasに対するマイトジェニックな反応の必須な下流エフェクターであるという重要な証拠を考慮すると、本データはRaf-1キナーゼがRasペプチドの直接の標的であるということを示している。本明細書に記述したRas-Raf相互作用はおそらく、in situのRasによるRaf-1キナーゼ活性化の第一段階を反映している。スクリーニング法本発明は、RasとRafの相互作用を阻害する能力に関して、候補化合物をスクリーニングすることにも用いることができる。一つのスクリーニング法として、上記の2-ハイブリッド発現系がin vivoのRas -Raf相互作用を阻害できる化合物のスクリーニングに使用されうる。この系では、lacZのようなレポーター遺伝子に結合したGAL4結合部位を、候補化合物の存在下および非存在下で、Ras断片に結合したGAL4結合ドメインおよびRaf断片に結合したGAL4トランス活性化ドメインIIと接触させる。レポーター遺伝子の発現をモニターし、その発現の減少を、候補化合物のRasとRafの相互作用阻害の指標とする。もう一つのスクリーニング法として、RafまたはRafのRas結合性断片を候補化合物に接触させ、そして候補化合物のペプチドへの結合を決定することにより、候補化合物の抗増殖活性を評価することができる。RafまたはRafのRas結合性断片は、例えばGST-Raf融合タンパク質をグルタチオンを含むポリマービーズに結合させるなどの、当業者に知られた方法を用いて固定化されうる。化合物のRaf ペプチドへの結合は、化合物がシグナル伝達経路を阻害し、それにより細胞増殖を阻害する能力に関連する。共沈殿競合法もまた、Rasまたは断片およびそれらの変異体の、Rafおよび断片およびそれらの変異体への相対的な結合親和性を測定するのに用いられうる（実施例1-5を参照）。様々な候補化合物の結合に対する阻害または減少の効果もまた、このような競合試験により測定することができる。候補化合物は、RasまたはRasのRaf結合性断片へ結合する能力によりスクリーニングすることができる。同様に、抗増殖活性を有する化合物を同定するため、 RafまたはRafのRap結合性断片に結合する能力により、上記のように化合物をスクリーニングすることができる。もう一つのスクリーニング法として、RasもしくはRasのRaf結合性断片またはR afもしくはRafのRas結合性断片のような、Ras-Raf結合性複合体の成分の一つを固定化する。ペプチドは、プラスチックマイクロタイタープレートへの吸着、またはGST融合タンパク質のグルタチオンを含むポリマービーズへの特異的結合などの、当業者に知られた方法を用いて固定化することができる。例えば、GST-Ra f(1-257)は、グルタチオン−セファロースビーズに結合させることができる。そして固定化ペプチドを、候補化合物の存在下および非存在下で、それが結合する標識ペプチド（この場合Ras）と接触させる。それから、未結合のペプチドを除去し、複合体を可溶化して結合した標識ペプチドの量を決定する分析をする。結合の減少は、候補化合物がRasとRafの相互作用を阻害するということの指標である。本発明は、Rasの残基1-186、Rasの残基32-40、Rafの残基1-257またはRafの残基152-168に結合する化合物のスクリーニングに限定されない。当業者は、RasまたはRapに結合することができるRaf断片を選択することにより、候補の阻害性または結合性化合物のスクリーニングのための、適当なRafのRasまたはRap結合性断片を同定することができる。同様に、スクリーニング法に用いられるRasの断片は、そのRafへの結合能力により同定されうる。上記のスクリーニング法を改変したものが、既に形成されたRas-Raf相互作用を阻害することができる別のクラスの候補化合物をスクリーニングするのに用いられうる。この例においては、RafまたはそのRas結合性断片に結合したRasまたはそのRaf結合性断片を上記のように固定化し、候補化合物に接触させる。候補化合物による複合体の解離は、候補化合物がRasとRafの相互作用を妨害または阻害する能力に関連する。抗体 RafのRas結合性ペプチド、RasのRaf結合性ペプチド、およびRas-Raf複合体に対する抗体もまた、有用である。RasおよびRafのドメインに結合する特異的な抗体は、二つのペプチド間の相互作用およびその他のリガンドとの相互作用を阻害するために使用できる。複合体に結合する抗体も、細胞増殖を導くシグナル伝達経路における複合体の相互作用を阻害する治療において用いられうる。このような抗体は、疾患の表れであるかもしれない、RasやRafの異常な発現または異常な複合体の形成を測定する診断においても用いられうる。これらの抗体は、がん遺伝学の研究、または受容体型および非受容体型シグナル伝達経路の研究にも用いられよう。本発明のペプチドおよびRas-Raf複合体は、標準的なプロトコルを用いたポリクローナル抗血清の作成のために動物に免疫する抗原としても使用できる。特異的な抗原に対する抗体は、例えばオクタロニー二重拡散法や酵素結合イムノソルベント法(ELISA)などの、当業者に知られた数種の方法のうちどれを用いても検出できる。二重拡散法においては、抗原と抗体を、ガラスプレート表面のアガロースなどの基質中の離れたウェルに置く。両ウエルの内容物は、あらゆる方向に基質内を拡散する。拡散した抗原および抗原特異的な抗体が出会う部位に、沈降線が形成される。ELISAは、プラスチックプレート内のウェルなどの基質を、精製抗原でコートすることを含む。それから、試験すべき血清をそのウェルに添加する。もし存在すれば、抗原特異的抗体がウェルをコートしている抗原に結合する。未結合の物質を洗浄除去し、抗原特異的な一次抗体に対する二次抗体に結合させた、西洋わさびペルオキシダーゼやアルカリフォスファターゼなどのマーカー酵素を過剰に加え、未結合の物質を洗浄除去する。最後に酵素の基質をウェルに加え、酵素の触媒する変換を抗原の存在の指標としてモニターする。モノクローナル抗体を作成するには、免疫した動物からの抗体産生細胞を（不死化させる融合パートナーとの融合などにより）不死化し、モノクローナル抗体を産生させる。モノクローナル抗体産生ハイブリドーマはそれから、上記のような抗体結合性によりスクリーニングされる。本発明には、完全なモノクローナルまたはポリクローナル抗体だけでなく、免疫学的に活性な抗体断片をも用いることができる。その例としては、Fabもしくは(Fab)₂断片、抗体重鎖、抗体軽鎖、遺伝子工学により作成した一本鎖Fv分子またはキメラ抗体が挙げられ、キメラ抗体の例としては、マウス抗体の結合特異性を含むが残りの部分はヒト由来であるような抗体が挙げられる。ペプチド療法本発明の方法は、有害な細胞増殖により特徴づけられる疾患の治療においても有用である。本発明は、ペプチドもしくはペプチド断片またはそのアナログを投与することにより、Ras-Raf相互作用を阻害する方法を提供する。「断片」という用語は、ペプチドについて用いる場合、鎖長が普通少なくとも 10アミノ酸であり、通常は約20連続アミノ酸、好ましくは少なくとも40連続アミノ酸、より好ましくは50連続アミノ酸、そして最も好ましくは少なくとも60から 80もしくはそれ以上の連続アミノ酸である。このようなペプチドは、タンパク質のタンパク分解、断片のde novo（デノボ）合成、または遺伝子工学的手法などの、当業者に知られた方法により作成されうる。アナログは、アミノ酸配列、配列に影響しない修飾、またはその両方によりRa sおよびRafと異なる。好ましいアナログの含むペプチドの配列と野生型の配列（すなわち、天然ペプチドの相同的な部分の配列）との相違は、例えば1個のアミノ酸の、性質が類似している別のアミノ酸への置換（例えばバリンからグリシン、アルギニンからリジンなど）のような、好ましくは1個、2個、もしくは3個の保存アミノ酸の置換、またはペプチドの生化学的活性を失わせることがない１個または複数個の非保存アミノ酸の置換、欠失、もしくは挿入のみによる。表2に、多くの保存アミノ酸置換を列挙した。（通常は一次配列を変化させない）修飾は、アセチル化やカルボキシル化などの、in vivoまたはin vitroのペプチドの修飾を含む。例えば哺乳類の糖付加酵素、糖脱離酵素などの糖付加に影響を与える酵素にペプチドをさらすことにより、ペプチドの合成およびプロセシングの間またはそれ以降のプロセシング過程における糖付加のパターンを修飾することによる、糖付加の修飾もまた含まれる。リン酸化チロシン、リン酸化セリン、またはリン酸化スレオニンなどのリン酸化アミノ酸残基を有する配列も含まれる。本発明は、一つまたは複数のペプチド結合を、ペプチダーゼによる分解に非感受性の別の型の共有結合（擬ペプチド）に置き換えたアナログも含む。患者への注入後にペプチドのタンパク分解が問題となるような場合には、特に感受性の高いペプチド結合を非感受性の結合に置き換えることにより、ペプチドは安定性を増しそれにより治療薬としての有用性が増大する。このような擬ペプチドおよびそれをペプチドに組み込む方法は、当業者によく知られている。L-アミノ酸残基の置換も、ペプチドのタンパク分解に対する感受性を減ずるための標準的な方法である。t-ブチルオキシカルボニル(t-butyloxycarbonyl)、アセチル(acetyl)、セイル(theyl)、スクシニル(succinyl)、メトキシスクシニル(methoxysuccinyl) 、スベリル(suberyl)、アジピル(adipyl)、アゼライル(azelayl)、ダンシル(dan syl)、ベンジルオキシカルボニル(benzyloxycarbonyl)、フルオレニルメトキシカルボニル(fluorenylmethoxycarbonyl)、メトキシアゼライル(methoxyazelayl) 、メトキシアジピル(methoxyadipyl)、メトキシスベリル(methoxysuberyl)、および2,4-ジニトロフェニル(2,4-dinitrophenyl)のようなアミノ末端保護基もまた、有用である。ペプチドの荷電したアミノまたはカルボキシ末端の保護にはさらに、ペプチドを疎水性の細胞膜を細胞内に通過させ易くするという利点もある。血液脳関門の透過性を改善するためのこれらのペプチドの修飾もまた、有用である。ペプチドは、（例えば、コレステリル基のようなかさ高い脂肪親和性基のエステル化などにより）脂肪親和性を増加させたり、関門の脳側における保持を強める分解性の「標的体」部分を供給するように変化させることができる(Bodor et al.,Science 1992,vol.257,pp.1698-1700)。また、血液−脳関門の鉄輸送におけるトランスフェリン受容体の役割を探求するために、ペプチドをトランスフェリン受容体に特異的な抗体に結合させることができる(Friden et al.,Science ,1993,Vol.259,pp.373-377)。ペプチドは、生理食塩水のような薬剤学的に許容される担体中で、患者に対して静脈注射により投与されうる。リポソームを介した輸送などの、ペプチドの細胞内輸送の標準的な方法が使用できる。このような方法は、当業者によく知られている。本発明の製剤は、静脈注射、皮下注射、筋肉内注射、および腹腔内注射のような非経口の投与法に有用である。 RasとRafの相互作用の遮断は受容体を介した免疫細胞の活性化を阻害するため、本方法は、全身性エリテマトーデス(SLE)、1型糖尿病およびリウマチ様関節炎のような自己免疫疾患の患者の免疫反応の抑制にも有用である。本方法を用いた免疫反応の抑制は、同種移植片または異種移植片受容者の、移植臓器の拒絶を防止するための治療にもまた有用である。ペプチドの細胞内への治療のための投与は、遺伝子治療を用いても達成されうる。遺伝子治療においては、異種のペプチドをコードする配列に結合した作用型のプロモーターを含む核酸が、核酸をトランスフェクトした細胞にペプチドを高レベルに発現させるために用いられる。本発明のペプチドをコードするDNAまたは単離した核酸は、標準的なベクターおよび／または遺伝子輸送系により患者の細胞内に導入される。好適な遺伝子輸送系には、リポソーム、受容体による輸送系、裸のDNA、そしてヘルペスウイルス、レトロウイルス、およびアデノウイルスなどのウイルスベクターが含まれる。薬剤学的に許容される担体とは、例えば生理的食塩水のような、動物への投与に好適な生物学的に適合する媒体である。治療的に有効な量は、治療を受けた動物に臨床的に望まれる結果をもたらすことができる本発明の核酸の量である。当業者によく知られているように、ある患者への投与量は、患者の体積、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与の時間と経路、一般的な健康、および併用薬物、を含む数多くの要因に依存する。本発明の化合物の投与量は多様であるが、遺伝子治療の場合、静脈注射の好ましい投与量は約10⁶から10²² コピーの核酸分子である。Rasへの結合に関わるRafタンパク質ドメイン以下の実施例1-5に述べるように、RasがRafを認識し相互作用する機序を決定した。結合試験および競合的共沈殿試験を、多様なRas変異体のRafのアミノ末端ペプチドへの相対的な結合親和性を測定するために用いた。RasのGTP結合型およびがん遺伝子型は、Ras-DGPおよびエフェクターループ変異体の最大35倍の親和性でRafと相互作用することが見いだされた。意外なことに、エフェクターループに隣接するRas活性化残基の置換により、酵母の2-ハイブリッド法を用いて測定すると、Ras形質転換活性およびRas-Raf相互作用が減少するにもかかわらず、in vit roでのRasのRafへの結合能は変化しない。従って、これらのエフェクタードメイン隣接残基のin situのRas-Raf相互作用における重要性は、Ras-Raf結合性相互作用へ直接関わることではない。これらのRas残基は、Ras-Raf複合体の親和性の増大またはRafキナーゼの活性化の誘導に寄与する、第3の因子と相互作用するのかもしれない。c-Raf-1アミノ末端の欠失解析により、ジンクフィンガー領域を含む1-257断片よりわずかに大きい親和性でRasに結合する、残基1-149からなる安定な結合性断片が明らかになった。c-Raf-1の残基1-131からなる小さいが不安定な断片もまた、Rasに結合するが親和性は小さくなる。最初の50アミノ酸を除去するとRasとの相互作用の親和性が上昇するが、最初の70残基を欠失するとRas -GTPとの複合体が形成されなくなる。cAMP依存プロテインキナーゼによりRaf[1- 149]断片のセリン43をリン酸化するとRas結合性が実質的に減少し、このことはc AMPによるRas-Raf経路の抑制は必ずc-Raf-1調節性ドメインの最初の149アミノ酸を介して起こり、全長Rafタンパク質を必要とはしないということを示している。これらのデータは、c-Raf-1のセリン43のリン酸化が残基1-50を含むタンパク質断片によるc-Raf-1のRas結合性部位の遮断を誘導するという、PKA依存的な抑制のモデルを提供する。RasとRafの相互作用を阻害する化合物部位特異的突然変異およびペプチド阻害剤を用いたRafおよびRasタンパク質の結合表面の調査により、あるペプチド、例えばRafの残基88-105、112-143および Rasの残基32-51がタンパク質の相互作用に必須であることが示された。このようなペプチドは、in vitroおよびin vivoのRas/Raf相互作用を阻害する治療用化合物を合成するためのモデルとして用いられうる。このようなモデル化技術は、合成化学の当業者に知られている。例えば、Rafの残基88-105、112-143およびRasの残基32-51の領域にわたるオーバーラップした短いアミノ酸のセットを合成し、阻害活性をスクリーニングすることができる。Ras-Raf相互作用を阻害することが確認されたペプチドは、それから高次構造の類似したアナログの合成のための原型として用いることができる。アナログに含まれるペプチド結合に対して、治療に好適な強力で安定な非ペプチド阻害剤にするための修飾または置換を行っても良い。 Rasの結晶構造は当業者に知られており、結合性残基37-51の実際の高次構造の推定に用いられうる。同様に、Raf結晶およびRas/Raf共晶のX-線結晶解析像もまた、Rafの残基91-105、123-137およびRasの残基37-51にわたる各ペプチドの阻害性構造の予測に用いることができる。阻害活性を有することが見いだされている、43位にリン酸化セリンを含むRafペプチド、Raf(1-50)、Raf(41-55)などの修飾ペプチドもまた、阻害性化合物の合成のためのモデルとして使用できる。Raf由来の阻害性ペプチドの構造は、相互作用性のあるペプチド構造の重要な面を模倣した小さい非ペプチド化合物を案出するためにも用いられうる。それからこれらの候補化合物の阻害活性は、本発明の方法を用いて確認できる。ペプチド-Rasおよびペプチド-Rafの共晶を、X-線結晶解析および核磁気共鳴解析を用いて分析し、その結合状態における阻害性ペプチドの構造を決定することができる。阻害性ペプチドは、タンパク質と相互作用するペプチドの局所環境に関するデータを供給する、例えば円二色性、蛍光、電子スピン共鳴などの、物理化学的手法によっても特徴決定することができる。それから、各ペプチドの阻害性高次構造を模倣した化合物を作成するために、上記のような合成化学的手法が用いられうる。実施例１：RasのGST-Rafへの結合親和性を決定するための定量的共沈殿競合試験本発明の方法を実施するために用いる以下の試薬は、市販されているものを容易に入手できる。制限酵素、ベント(vent)ポリメラーゼ、およびDNAリガーゼはニューイングランドバイオラブ(New England Biolabs)社(ベヴァリー、マサチューセッツ州)より購入した。GTP-γ-³²PおよびATP-γ-³²P（特異的活性4500PCi/m mol）は、ICNバイオメデイカルス(ICN Biomedicals)社より購入した。グルタチオン−セファロース、セファデックスG-75およびPD-10カラムは、ファルマシア社から購入した。NTA-アガロースは、キアゲン(Qiagen)社より購入した。セントリコン-10マイクロ濃縮器は、アミコン社より購入した。IPTGはベテスダリサーチラボラトリーズ(Bethesda Research Laboratories)社(ゲテルスブルグ(Gaithe rsburg)、メリーランド州)より購入した。その他のすべての化学試薬、およびcAMP依存プロテインキナーゼの触媒性サブユニットは、シグマケミカル社(セントルイス、ミズーリ州)より購入した。 c-Ha-Rasを大腸菌で発現させ、モノQ陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて精製した。数例においては、Rasタンパク質はセファデックスG-75を用いたサイズ排除クロマトグラフィーによりさらに精製した。Rasは以下のプロトコルにより、放射能標識をしたGTPに結合させた。132pmol Rasおよび44pmol GTP-γ-³² P（特異的活性(4500Ci/mmol)を0.1mlの「25mM Tris-HCl,pH 7.5,2nM EDTA,1mM D TT,および100g/ml BSA（交換用緩衝液）」に添加し、30℃で20分インキュベートした。交換は、反応液を氷上に置くことにより停止させた。Rasタンパク質をセントリコン-10マイクロ濃縮器中で濃縮し、未結合のグアニンヌクレオチドを過剰の氷冷した「20mM Hepes,pH 7.4,および1mM MgCl₂」で2回洗浄することにより除去した。まず各々の融合タンパク質を、大腸菌株RRllaci^qを30℃で増殖することにより作成した。一部の融合タンパク質のみが可溶型または安定型で作成されることが直ちに観察された。GST-Raf(1-257)対照を全長融合タンパク質として得るのは困難であったが、カルボキシ末端にヒスチジンタグを付加することによりニッケル −アガロースアフィニテイクロマトグラフィーを用いて全長タンパク質を精製することが可能となった。GST-Raf(1-149)およびGST-Raf(51-149)およびGSTが、大腸菌株RRllaci^qでの発現により得られた。DH5α大腸菌株をまず37℃でOD₅₆₀が0. 5になるまで培養し、それから20℃に移してOD₅₆₀が0.8になるまで培養することにより、これらのタンパク質は可溶型として発現した。融合タンパク質の生産を開始させるため、0.5mM IPTGで1時間培養液を誘導した。GST-Raf(1-257)6XH以外のタンパク質はすべて、グルタチオン−セファロースビーズで精製した。「50mM Tris-HCl,pH7.5,0.15M NaCl,5％グリセロールおよび1mM DTT」に対して透析することにより、グルタチオンを除去した。タンパク質は、-80℃で凍結保存した。GST-Raf(1-257)6XHタンパク質については、製品説明書に従いNTA-アガロースアフィニテイクロマトグラフィーで精製し、透析し、そして上記のように保存した。 Ras-Raf共沈殿試験は、以下のように行った。GST-Raf(1-257)とRas-GTP-γ-³² Pとの間の複合体形成は、0.03mlの「20mM Hepes,pH 7.4,1mM MgCl₂,1mg/ml BSA, および0.3％Triton X-100」中の12nM Ras-GTP-γ-³²Pに4μM GST-Raf(1-257)を添加することにより検出した。15分間インキュベートした後、「50mM Tris-HCl, pH7.5,150mM NaCl,1mM DTT,1％Triton X-100,0.2％BSA,および10mM MgCl₂（結合用緩衝液）」に懸濁した0.2mlの12.5％グルタチオン−セファロースビーズ溶液を添加し、混合液を4℃で30分攪拌した。攪拌後、0.5mlの結合用緩衝液を添加し、次にグラスファイバーフィルター(ミリポア GF/F)で濾過した。フィルターを1 .0mlの結合用緩衝液で4回洗浄し、それから共沈殿したRas-GTP-γ-³²Pの量をチェレンコフ検出器で測定した。バックグラウンド値は、GST-Raf(1-257)の代わりにGSTのみを用いて決定し、各試料の値から差し引いた。共沈殿試験に各タンパク質を濃度を増加させながら添加することにより、非放射能標識のRas-GTPおよびRas-GDPの相対的な結合親和性を決定した。Ras-GTP-γ-³²PのGST-Raf(1-257) への結合を50％減少させるのに必要な競合剤Rasの濃度は、競合剤タンパク質によるRaf結合のIC₅₀値を与える。Ras-GTP加水分解の固有速度は、競合試験の過程において10％以下であり、測定結合定数に対して有意な影響は及ぼさなかった。沈殿したRas-GTP-γ-³²Pのパーセント数は、各GST-Raf(1-257)調製物で約5-10％であった。異なるGST-Raf変異体によるRasの競合的共沈殿については、10pmolの GSTまたはGST-Rafタンパク質をRas-GTP-γ-³²Pとともにインキュベートし、沈殿させ、上記のように定量した。正常Rasおよびc-Raf-1の解離定数は、c-Raf-1タンパク質の精製N末端断片によるRas-GTP/GAP相互作用の競合的阻害により計算した。この試験は、Rafおよび、がん遺伝子またはGTPase機能やGAP結合能を欠いているエフェクター変異体Rasタンパク質の間の競合的阻害の測定には無効であることが観察された。これらの型のRasタンパク質のc-Raf-1のアミノ末端に対する相対的親和性を比較するため、定量的Ras-Raf結合試験を行った。正常Rasタンパク質のGST-Raf融合タンパク質への結合は、GST-Rafとインキュベートする前にRasにGTP-γ-³²Pを負荷することにより検出した。二つのタンパク質を混合した後、GST-Raf/Ras複合体をグルタチオン−セファロースに結合させ、GST融合タンパク質を沈殿させた。GST-Rafと共沈殿したRas-GST-γ-³²Pの量を、ビーズに結合した放射能量を定量することにより測定した。各変異体Rasタンパク質に対する相対的な結合親和性は、タンパク質に非放射能のGTPを負荷することにより得られた。放射能を負荷していないRasタンパク質を、Raf/Ras-GTP-γ-³²P結合性相互作用の競合剤として、濃度を増加させながら共沈殿試験に加えた。Ras-GTP-γ-³²P共沈殿の阻害を阻害剤濃度の関数としてプロットすることによりIC₅₀が得られ、それをRafに対する相対的な結合親和性を比較するために用いることができる。本方法は、c-Raf-1調節性領域（アミノ酸1-257）と、GTPまたはGDPに結合した野生型のRasとの間の相互作用の評価に用いることができる（図１を参照）。Ras -GTPは、本試験において約9μMのIC₅₀値で競合した。300μMまでの濃度のRas-GD Pでは弱い阻害しか検出されず、このことはRasの活性型および非活性型の結合親和性に少なくとも35倍の差が存在することを示している。これは、先に行ったRa s-Raf相互作用のGTP-依存の定量試験と一致する。精製GSTタンパク質は、Ras-DG PとRas-GTPいずれにも結合しなかった。Ras-GTPの9μMのIC₅₀値は、GAP競合試験で通常見られる150nMのK_D値より有意に大きかった。本試験においては、用いたG ST-Raf(1-257)が高濃度(4μM)であったために、50％の阻害に達するまでにより多い量の競合剤を必要とした。この違いにより、より高いIC₅₀値が得られたが、本試験の感受性および再現性が増加したため、結合が弱いRas変異体の検出が可能となった。ナノモル単位のGST-Raf(1-257)を用いた実験ではRas-GSTのIC₅₀濃度が200nMに減少し、これはGAP競合の結果と極めてよく一致している。実施例２：異なるRasタンパク質のc-Raf-1調節性領域に対する相対的な結合親和性の測定共沈殿競合試験を用いて、がん遺伝子型Ras[V12]-GTPおよびRas[Leu61]-GTPタンパク質のGST-Raf(1-257)との相対的な結合定数を決定した（表３を参照）。いずれのRasのがん遺伝子型も、正常なRas-GTPと類似した親和性でRaf(1-257)に結合した。Ras[Leu61]のIC₅₀値は7μMであり、一方Ras[V12]はわずかに大きい親和性で結合した(IC₅₀値は4μM)。7つのRasエフェクター変異体のGTP-結合型のGST- Raf(1-257)への相対的なin vitroの結合親和性を測定し、NIH 3T3細胞における各変異体のバリン12対立遺伝子の既知の形質転換効率と比較した。表３は、様々なRasタンパク質のGST-Raf(1-257)への相対的な結合親和性を示している。グアニンヌクレオチドを結合させたRasタンパク質によるRas-Raf共沈殿の競合の平均IC₅₀濃度は、3つから5つの別々の実験からの標準的な誘導を表す。値はRas-GTPに対して標準化し、各変異体について既知の形質転換効率と比較した。いくつかの予想外の例外もあるが、エフェクター変異体の大半でRafの相互作用が減少した。形質転換を起こさないRas変異体、Ras[△34A38]およびRas[S35] のIC₅₀値はそれぞれ200μM以上および180μMであったが、形質転換を起こさない Ras[E45]変異体は野生型に近い親和性で結合した(IC₅₀は21μM)。形質転換が減少したRas[N33]、Ras[N38]、およびRas[G26I27]変異体のIC₅₀値は、それぞれ210 μM、300μM以上、および10μMであった。穏やかに形質転換を起こすRas[E20K31 ]タンパク質は、Rafにわずかにしか結合しなかった(IC₅₀値は226μM)。各Rasエフェクター変異体の相対的な結合親和性は、形質転換試験で用いたバリン12型ではなく、各タンパク質のグリシン12型を用いて決定したため、Ras[G26I27]およびRas[E45]変異体についてバリン12型の結合値を測定した。IC₅₀に有意な差は見られなかった(±5μM)。100mM KClを添加しても、これらの試験の結果に影響はなかった。共沈殿競合試験によりGST-Rafに見られた相対的結合親和性は、生物学的に特異的な相互作用分析を用いて、Ras-GTP、Ras-GDP、Ras[V12]-GTP、Ras[ △34A38]-GTP、Ras[N38]-GTPおよびRas[E45]-GTPタンパク質について独立に確認した。正常な放射能ラベルしたRasとRasタンパク質を放射能ラベルしていないGST-Ra f(1-257)融合タンパク質との複合体形成の競合は、様々な型のRasについて正確に段階的な相対的結合親和性を示した。in vitroの結合試験により、RasのGTP結合型はGDP結合型よりも強くRaf(1-257)と結合することが示され、そして共沈殿競合試験により、結合親和性の差は少なくとも35倍であるということが示された。十分に高い濃度のRas-GDPを競合のIC₅₀値を導き出すために得ることは不可能であるが、GTP結合型およびGDP結合型の間の結合親和性の差は、約100倍であると推定された。この推定は、Ras-GTPおよびRas-GDPとGAPおよびNF1タンパク質との見かけの解離定数における差と類似している。実施例３：in vitroのRas-GTPとの複合体形成と競合する最小c-Raf-1断片の同定 GTP-Raf(1-257)発現プラスミド、pGEX-KGC4から小さい内部HindIII制限断片を除去し、短縮c-Raf-1のコード領域を下流の停止コドンとインフレームで再び連結させることにより、Raf(1-149)欠失変異体を構築した。標準的な組換え体DNA プロトコルは以下の通りである。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いて、pGEX-KG C4ベクターを鋳型としてc-Raf-1の相当するコード領域を増幅することにより、G ST-Raf(1-131)、(51-149)、および(71-149)構築体を作成し、次にpGEX-KGベクター（ファルマシア社）へサブクローニングした。c-Raf-1[S43D]変異体を、プロメガ変換部位キット(Promega Altered Sited kit)を用いて作成した。変異およびクローンが完全であることは、シーケナーゼ(SEQUENAZE)(米国バイオケミカル社/United Stated Biochemical Corp.)でDNA配列決定することにより確認した。 PCRおよび制限断片欠落を組み合わせることにより、GST-Raf(1-257)融合タンパク質の4つのサブ断片を作成し、続いてそれをRafのアミノ酸1および257から短縮した。c-Raf-1の残基1-149、1-131、51-149、および71-149をコードするこれらの欠失変異体をGSTに融合させた。上記で論じたように、GST-Raf(1-131)およびGST-Raf(71-149)融合タンパク質は不安定であり大量に得ることは難しいことが見いだされているが、それはこれらの欠失は調節性セグメントのドメインの折りたたみを阻害するかもしれないということを示している。各GST-Raf融合タンパク質について、グルタチオン−セファロースとの共沈殿によりRas-GTP-γ-³²Pとの複合体形成能を分析した（図２参照）。残基1-149、5 1-149、および1-131を含むGST-Raf融合タンパク質は推定ジンクフィンガー領域を欠いているが、ジンクフィンガー含有GST-Raf(1-257)6XHタンパク質と同様にR as-GTPと複合体を形成する。c-Raf-1の最初の50アミノ酸の欠失では、共沈殿するRasの量が増加さえする。しかし最初の70アミノ酸を除去すると、Ras-GTPとの安定な相互作用は完全に失われる。これらの結果は、単一濃度のGST-Rafタンパク質に基づいているため、Rasと短縮Rafタンパク質との間の相互作用について定性的なデータしか提供しない。GAP の競合的阻害によりRas-Raf結合親和性を定量的に測定できるGAP競合試験を用いることにより、各短縮Rafタンパク質のRas-GTPへの結合親和性に関してさらに定量的な測定を行った。 GAP競合試験は、「0.2nM Ras-GTP-γ-³²P,20mM Hepes,pH7.4,1mM MgCl₂,および1mg/ml BSA」を含む0.05mlの反応容量に、GST-Rafタンパク質またはGSTを濃度を増加させながら添加することにより行った。この反応液を2分間30℃で予温し、そしてGAP(702-1044)を添加することにより反応を開始した。³²P-γ-GTPの50 ％の加水分解を活性化させることができる量に相当する各試験で用いたGAPの量は、試験の条件下でRasに結合した。30℃でのインキュベーションの10分後、0.2 mlの冷えた50mM NaH₂PO₄中の5％活性炭を添加することにより反応を停止した。G TPase活性化は活性炭の含まれない画分中の遊離の³²Pの量を測定することにより決定し、競合剤非存在下における活性のパーセント数として表した。GAP(702-10 44)非存在下において得られた値を0％対象値として用いた。Ras-GTPase活性のGA Pによる活性化を50％阻害するのに必要な競合タンパク質の濃度(IC₅₀)を、相対的な親和性の値として用いた。標準のRas-GTP-γ-³²P/GAP反応液にGST-Rafタンパク質を濃度を増加させながら添加し、GTP加水分解のGAPによる活性化を50％阻害する競合剤の濃度を決定した。IC₅₀値は複合体の見かけの解離定数を反映する。代表的な競合曲線を図３に示す。共沈殿のデータと一致して、GST-Raf(51-149)はRas結合のもっとも強い競合剤であるということが示されたが(IC₅₀は12nM)、GST-Raf(1-257)6XHおよびGST -Raf(1-149)タンパク質はあまり強く競合しなかった(IC₅₀は各々115および76nM) 。共沈殿の結果には反映されていないか、GST-Raf(1-131)タンパク質はわずかにしかRas結合に競合しなかった(IC₅₀は1,100nM)。GST-Raf(71-149)では最高濃度でも微弱な競合しか観察されず、精製GSTは全く競合しなかった。これらの結果の要約を、図４Ｂに標準偏差と共に示す。 Rasにおけるがん遺伝子型変異体は、すでにGAPおよびNF1への結合親和性に特異的に影響を与えることが示されている。Ras[L61]変異体は野生型Rasより50〜1 00倍強くGAPおよびNF1に結合するが、Ras[V12]変異体ではGTPase活性化タンパク質への親和性が減少した。これらの二つのがん遺伝子型Rasタンパク質のc-Raf-1 に対する相対的な親和性を決定し、正常なRasとほとんど同じであることが示された。この結果は、Rafは、GAPおよびNF1との生産的な相互作用に重要であることがわかっているRasのスイッチ2領域（アミノ酸60-76）とは相互作用しないということを示している。正常Rasとがん遺伝子型Rasとの間にRafに対する親和性の違いがないということは、いずれの型のRasも同一の機構でRafを活性化するのかもしれないということを示している。完全なエフェクターループ（残基32-40）および近接する活性化残基(26、27、 30、31、および45)を含むRasタンパク質のみが、細胞内の環境でc-Raf-1と効率よく複合体を形成することができる。in vitroで精製タンパク質を用いると、Ra sの33、35、および38位のエフェクター変異により、Rasおよびc-Raf-1タンパク質の結合が遮断されるかまたは大きく減少した。しかし、エフェクターループに近接する26/27および45位の変異はin vitroの結合に影響を与えないにも関わらず、これらの変異体は2-ハイブリッド系においてc-Raf-1(1-257)とよく複合体を形成した。形質転換を起こすRas[E30K31]変異体は、2-ハイブリッド系では部分的に相互作用するが、精製した成分を用いたときRaf結合能を欠損していることが示された。これらの違いは以下のように説明される。細胞を基本とした酵母2- ハイブリッド試験におけるRas-Raf相互作用の分析により、この系においてみられる複合体形成は様々なRasエフェクター変異体が細胞を形質転換する能力を調べた哺乳類実験とよく相関することが示された。広範な遺伝学的および生化学的な分析により示されたようにRafがRasの生理学的なエフェクターであるなら、酵母細胞におけるタンパク質修飾または溶解の状態が、哺乳類細胞内と同様なタンパク質−タンパク質相互作用を起こさせるのに適当であるということが結論できる。このような修飾には、Ste20pのような保存されたプロテインキナーゼによるリン酸化、脂質への結合、またはRasタンパク質に結合したGDPとGTPの比さえも含まれる。このモデルは、S.セレビシエ(S.Cerevisiae)における哺乳類のRasおよびc-Raf-1の共発現がc-Raf-1キナーゼ活性の活性化を導くという観察により証明される。酵母2-ハイブリッド系および競合試験からのデータを考え合わせると、タンパク質内に存在する完全なジンクフィンガーはin vivoのRas-Raf結合において役割を果たし、おそらく適切な制御を媒介するということが示される。細胞内のRaf タンパク質に両ジンクフィンガーが存在する場合それらは機能し、またそうでない場合タンパク質構造がゆがめられRas結合が阻害されるのかもしれない。一方、完全にその領域を欠失したRafの短縮型は、このような高次構造の変化により影響を受けない。 GST-Raf短縮型の分析は、安定でかつ高親和性でRas-GTPに結合することができる99アミノ酸ドメイン（残基51-149）を明確にすることを可能にした。c-Raf-1 の残基1-131は結合に十分であるが、親和性は残基1-149と比較して少なくとも10 倍は減少している。さらに、残基132-149を除去すると融合タンパク質の安定性は深刻に損なわれる。c-Raf-1の残基51-149をもつ融合タンパク質を生成するN末端の短縮により、実際Ras-GTPへの親和性がGST-Raf(1-149)タンパク質と比較して6倍増加する。これらのデータは、N末端の50アミノ酸は負の調節機能を有しその除去により調節が解除されるということを示している。次の20アミノ酸(71-14 9)の欠失により、Ras結合能を欠いた不安定なタンパク質が生成する。c-Raf-1(5 1-149)断片においてみられる高度の安定性およびRasに対する親和性の増加は、構造決定および生化学的特徴決定において単離したRas結合性ドメインが利用できることを示している。実施例４：cAMP依存プロテインキナーゼAによる短縮Raf(1-149)のセリン43のリン酸化は、Rasの相互作用を阻害する精製GSTおよびGST-Raf融合タンパク質について、cAMP依存PKAの触媒性サブユニットに対する基質となりうるかどうかを試験した。「20mM Tris-HCl,pH7.5,1mM EGTAおよび5mM MgCl₂」の0.02mlの反応容量で0.02mCiのATP-γ-³²Pの存在下で、約10pmolの各タンパク質を0.2ユニットの精製PKA触媒性サブユニットとともに30 ℃で30分間インキュベートした。放射能リン酸の取り込みは、ニトロセルロースフィルター結合試験により検出し、SDS-PAGEおよびオートラジオグラフィーにより確認した。「0.1mM ATP,20mM Tris-HCl,pH7.5,EGTAおよび5mM MgCl₂」を含む0.0 1ml反応容量で、10pmolのタンパク質を5ユニットのPKA触媒性サブユニットとともに30℃で一時間インキュベートすることにより、同じタンパク質の化学量に近い非放射能リン酸でのリン酸化が得られた。標識反応に続き、放射能標識Rasタンパク質を添加し、リン酸化GST-RafおよびRas-GTPの共沈殿を測定した。精製PKA触媒サブユニットを、ATP-γ-³²Pの存在下で、GST、GST-Raf(1-257)6X H、GST-Raf(1-149)、GST-Raf(51-149)およびGST-Raf[1-149;S43D]とともにインキュベートした。c-Raf-1の最初の50残基を含むRaf融合タンパク質だけをリン酸化した。セリン43のアスパラギン酸への変異によりPKAによる特異的リン酸化が阻害され、このことはこの残基がc-Raf-1 N末端の主要なリン酸受容部位であるということを確証している。c-Raf-1の小断片がPKAによりリン酸化されうるということを確立し、全長タンパク質と比較したリン酸化c-Raf-1 N末端断片によるRas 結合の阻害を決定した。GST-Raf(1-149)、GST-Raf(51-149)およびGST-Raf[1-149 ;S43D]をATPの存在下、非存在下でPKAとともにあらかじめインキュベートし、Ra s-GTP-γ-³²Pとの複合体形成を試験した。GST-Raf(1-149)タンパク質は、PKAによるリン酸化の後のRas結合を再現的に阻害することがわかった（図６参照）。阻害のレベルはすべての実験で常に40％を上回っていた。43位のセリンを欠いた GST-Raf融合タンパク質は、PKAおよびATPとインキュベートしたときRas結合に影響を与えなかった。セリン43のアスパラギン酸への置換はその部位におけるリン酸化セリンに類似しているかもしれないが、GST-Raf[1-149;S43D]変異体ではRas 結合が6倍減少していることが示された。Ras-GAP競合試験における競合のIC₅₀値は、野生型タンパク質の76nMに対し500nMであった。これらのデータは、c-Raf-1のセリン43がcAMP依存PKAの調節性基質残基であるということを確証している。この残基のリン酸化は、c-Raf-1のRas-GTPへの親和性を有意に減少させる。このようなリン酸化は、cAMPがRas経路を競合的阻害する一つの機構であるかもしれない。リン酸特異的なステアリン酸阻害の主要決定基は、149アミノ酸の調節性小ドメインにあることが明らかになった。c-Raf-1の最初の50アミノ酸の除去がRasへの親和性を増加させるという観察に基づき、セリン43位のリン酸化は、c-Raf-1のRas結合部位にわたるペプチドフラップを折りたたむ高次構造の変化をもたらすという可能性が高いといえる。このモデルでは、リン酸化セリン43の存在はこの領域のRas結合部位への親和性を強化する。50アミノ酸のPKA調節性セグメントは、c-Raf-1のみに見られA-Ra fまたはB-Rafには見られず、このことはこの調節がRaf-1アイソフォームに特有のものであるということを示している。c-Raf-1はRafファミリーのうちの遍在するメンバーであり、PKA調節はほとんどの細胞型に存在する可能性が高い。実施例５：接触エピトープスキャンによるc-Raf-1とRas-GTPとの間の相互作用部位の同定接触エピトープスキャンにより、RafのRas-GTPとの相互作用の別々の部位が、 c-Raf-1の調節性領域に位置することが明らかになった。この手法のために、c-R af-1の99残基のRas結合性ドメインの15アミノ酸セグメントに相当するオーバーラップする19のペプチドを合成した。各ペプチドについて、Rasへのペプチド結合の指標として、そのRas-GTPとGST-Raf(1-257)との間の複合体形成を競合的に阻害する能力を試験した。各予想接触エピトープの寄与は、c-Raf-1調節性領域のアラニンスキャン突然変異でも調査した。Ras相互作用の主要な部位は残基88 から105の間に位置し、第二の低親和性部位は残基112から143の間の領域に位置した。Rasエフェクター領域の接触エピトープスキャンにより、アミノ酸37-51に相当するペプチドでRas-Raf相互作用の阻害が最大になることが明らかとなった。高親和性でのRasへの結合を示すc-Raf-1のもっとも小さい断片は、残基51から 149までである。エピトープスキャン分析は、抗原ペプチドの一次構造に由来する大きな一セットの連続的なオーバーラップしたペプチドで行われる。この断片を鋳型として用いて、残基41から152までのc-Raf-1配列にわたる19ペプチドを合成した。すべてのペプチドは、マルチピンペプチド合成法(Multipin peptide synthesis proced ure)(REP)を用いて、キロンミモトープペプチド系(Chiron Mimotopes Peptide S ystems)により合成した。すべてのペプチドをアセチル化し、C末端はアミドで終わる。ペプチドセットの純度はおよそ70％であると推定される。ペプチドは、簡単に超音波処理することにより、脱気した室温のジメチルホルムアミドに濃度が 2nMになるように懸濁した。各ペプチドは、15アミノ酸の鎖長であり、各々近傍のペプチドを持つおよそ10 アミノ酸のオーバーラップを有する。すべてのペプチドについて、Ras結合決定基と類似し、標準化したRas-Raf共沈殿における競合剤としてはたらく能力を試験した。非特異的効果は、GSTまたはRas[N38]エフェクター変異体を用いた同一の試験により除外した。 10％DMFに希釈した各ペプチドを共沈殿試験に濃度を増加させながら添加することにより、各ペプチドのRasとRafの共沈殿を阻害する能力を測定した。Ras-GT P- γ-³²PのGST-Raf(1-257)への結合を50％減少させるのに必要な競合剤Rasの濃度は、競合ペプチドによるRaf結合のIC₅₀値を提供する。試験中に10％DMFが存在することは何の影響も及ぼさない。初期濃度200mMを用い、6つのRafペプチドが特異的にかつ再現的にRas-Raf複合体形成を20％以上阻害するのが観察された（図７）。ほとんどの競合的ペプチドがc-Raf-1の残基91-105を含んでいた。このペプチドによるRas-Raf複合体形成の阻害は、濃度依存的でありIC₅₀は73μMであった（図８）。Rafのこの領域の機能的な重要性は、後期D-raf活性および目の細胞死に影響を与えるキイロショウジョウバエのD-raf^C110変異により強調される。この変異は、91-105ペプチドにより定義される接触エピトープに近接する、ヒトc-Raf-1の89位のアルギニンからロイシンへの置換に相当する。二つのオーバーラップペプチドにはRas-Raf結合の阻害がほとんど見られないため、エピトープはおそらく10アミノ酸より大きい。しかし、近接する86-100および96-112ペプチドは溶液中で適当な高次構造をとることができなかった可能性がある。アルギニン89を含む80-94ペプチドはわずかに阻害した。別の、しかしより広いRas相互作用部位が、Raf残基111-151について予測されている。このRaf領域にわたる5つのペプチドはすべて、穏やかにRas-Raf相互作用を阻害するのが観察された。この結果は、アミノ酸111から151でコードされる Ras相互作用の広い領域、またはオーバーラップペプチド中の重要な残基の小さいクラスターの存在を示している。この観察を確証するように、Raf(1-137)の結合親和性は、Ras相互作用に対するこの領域の補助機能を強調するRaf(1-149)と比べて10倍減少していることが示された。弱くRas-Raf相互作用を阻害するのが観察された他の2つのペプチドは、41-55 および46-60ペプチドである。これは、プロテインキナーゼAによるRaf-1[S43]のリン酸化の後のRas結合の阻害における、c-Raf-1のN末端のこの領域の調節機能を示すデータを確証する（実施例４参照）。他のペプチドで阻害が保存されていないということは、それらが表すRafの領域が接触エピトープではないということの決定的な証拠にはならない。それらは、分子集団内で溶液中で天然の高次構造をとることができないか、またはRasの表面上での適合性が減少しているという可能性がある。例えば、66-80ペプチドは試験のための希釈で凝集するのが観察され、G ST-Raf非存在下ですらRas-GTPおよびRas[N38]-GTP両方を非特異的に沈殿させる。対照として、各ペプチドの、Ras-GTPとGSTタンパク質のバックグラウンド沈殿量に対する効果を決定した。いずれの競合ペプチドも、非特異的相互作用に応じるRas-GTPの量に対して何の影響も及ぼさず、このことは競合がRas-Raf複合体形成に対して特異的であるということを示している。観察結果に対するもう一つの可能性は、ペプチドによるRas GTPaseの活性化である。Ras-GTPの欠損が、Rafに結合することができるRasタンパク質の量を減少させる。この可能性は、いずれの競合ペプチドが存在しても、GTPaseの有意な増加は検出されなかったという理由で排除した。接触エピトープスキャン分析からのデータは、c-Raf-1の99アミノ酸のRas結合ドメイン内の元々存在するアラニン、プロリン、グリシンを除くすべての残基がアラニンに置換したRafのアミノ末端断片、Raf(1-149)の結合実験により確認した。変異は、プロメガ変換部位キットを用いてc-Raf-1で行った。変異とクローンが完全であることは、シーケナーゼ（米国バイオケミカル社）でDNA配列決定することにより確認した。変異は、EcoRIからHinDIIIまでの制限断片としてpGEX -KG発現ベクターにサブクローニングした。得られた遺伝子融合体は、ポリリンカー内の偶然の停止コドンで翻訳が停止する、GST-Raf(1-257)融合タンパク質の発現を提供する。突然変異プロトコルは、各変異体において3つから４つの近接コドンをアラニンをコードするように変化させることにより単純化した。このように、わずか24 の異なる変異体により全領域を遺伝学的にスキャンすることができた。各変異体はGST-Raf(1-149)融合タンパク質として大腸菌で発現させ、そしてタンパク質の安定性およびRas結合能を評価した。タンパク質安定性は、得られた可溶性変異体GST-Rafタンパク質を野生型GST-Rafと比較することにより推定した。収率が低いのは、ペプチドが適切に折りたたまれず、それに続き凝集または分解してしまうことを示す。等しい培地量から得られたタンパク質の収率のパーセント数を、図９に示す。変異の半数以上が80％以上の可溶性タンパク質の減少を引き起こし、このことは構造的な安定性が失われたことを示す。これらの変異体の多くは、おそらくドメイン内部の「折りたたみ」に関わる、高度に保存された疎水性アミノ酸を欠いていた。いくつかのタンパク質については低収率であったにもかかわらず、各変異体についてRas共沈殿試験を行うのに十分な量の可溶性タンパク質が得られた。それから、各変異体Rafタンパク質のRas結合能を正常なGST-Raf(1-149)と比較し、図１０にまとめた。12の変異体で、Ras相互作用の減少が見られた。これらの12以外では、88-91および100-103変異体のみが、タンパク質の安定性に有意な影響を与えることなくRas結合を阻害した。表面接触エピトープは、タンパク質の折りたたみおよび熱安定性に最小の寄与をし、Rasとの相互作用の強化に最大の寄与をすることが推測される。この推測は、Rafの残基91-105が高親和性のRas結合部位であるとする接触エピトープスキャンデータにより補強される。88-91変異体は、元々キイロショウジョウバエでRaf機能にとって重要であると同定されたアルギニン89の置換を含んでいる。残基64-67、84-87および96-99の変異は、穏やかにタンパク質の構造を不安定にする一方Ras結合を阻害し、このこともRas-Raf 相互作用において役割を果たしているという可能性を示している。残りの非結合変異体は、構造的が激しく損なわれており、タンパク質の結合における変異残基の関係に関して明確な結論を下すことは難しい。しかし、タンパク質の安定性の減少は、必ずしもRas結合の欠如をもたらすわけではない。低収率の92-95変異体は、野生型GST-Rafよりも多くRasに結合した。124-127および12 8-131変異体の領域でオーバーラップする４ペプチドはRas-Raf相互作用を阻害したため、残基124-131により定義される領域内のアミノ酸はRas結合および安定性両方にとって重要である可能性が高い。GST-Raf(1-149)から残基132-149の欠失によりRasに対する親和性はわずか4倍しか減少せず、131以降のC末端残基のRas 相互作用における役割は小さいということを示している。 Rasタンパク質中のRaf結合部位を突き止めることを試みて、Rasの残基17-51にわたりオーバーラップする小さい5ペプチドを合成した（図１１参照）。Rafペプチドの場合と同様の方法により、各々のRas由来ペプチドについてRas-Raf結合の競合的阻害を測定した。5ペプチドすべてが再現的に複合体の形成を阻害したが、C末端由来のペプチドが最も強い競合剤であった。Ras37-51ペプチドが最も有効性が高く、阻害のIC₅₀値は100μＭであった。以前の実験で類似のペプチドをRas-GAP相互作用の競合剤として用いた場合、逆勾配の阻害が観察された(Schaber,D.et al.,Proteins:Structure,Function an d Genetics 6:306-315(1989))。よりC末端側のペプチド（Ras23-37または31-43 ）は全く競合しないのに対して、N末端由来のRasペプチド（残基17-32）はRas/G AP相互作用の強力な競合剤であった。同様の結果がRasペプチドで観察され、図１１に示したように、Ras17-31ペプチドのみがGAP相互作用についてRasと競合する。これらの結果はRas-タンパク質相互作用の遺伝学的解析と一致し、これによりRasタンパク質のオーバーラップするが、別々の領域が、GTPaseにより活性化されるタンパク質相互作用、およびエフェクタータンパク質の結合および活性化に関わっていることが示される。この区別は、GAPまたはニューロフィブロミンによる正常Rasの調節には干渉しない、Ras-Raf結合の阻害が行われうるということを示している。これらのデータは、c-Raf-1のRas結合性ドメイン内の二つの主要な部位が、Ra fのRas-GTPとの相互作用に関わっているということを示している。主要な接触表面は、残基88と103との間に局在する。この領域は、Raf-GTP結合の特異性に寄与し、さらに残基124から131を中心とした残基111から149により定義される表面上で起こる相互作用を安定化させる。これらの領域は、Rasエフェクター領域、すなわち残基26から48と直接的に相互作用している。核となるエフェクターループは、相互作用を安定化するように作用する周辺の残基、特に41から51とともに特異性を提供すると考えられる。Ras（グルタミン酸30、アスパラギン酸33、およびアスパラギン酸38）およびc-Raf-1（リジン84、リジン87およびアルギニン89 ）両方において、必須な相補性のある帯電した残基が保存されているということは、保存された静電相互作用がRas-Rafタンパク質相互作用にとって重要であるということを示している。 Ras結合は、Rafキナーゼを直接には活性化しないが、細胞膜における他の細胞性因子との協調的相互作用により最終的にキナーゼの活性化が導かれる。Rafキナーゼの活性化におけるRas-GTPの役割は、主に細胞膜融合タンパク質としての役割である。Rasとの相互作用は、Ras形質転換細胞におけるRaf活性化の不可欠な段階である。比較的小さいペプチドを用いた相互作用部位の同定および位置決定により、例えば阻害ペプチドを構造のモデルとしたペプチドなどの、阻害ペプチドおよび合成的に由来する化合物は、Ras-Raf相互作用を阻害しそれによりRaf活性化を阻害するための治療剤として用いられうる。細胞増殖は、細胞内シグナル伝達の成功の賜である。Ras-Raf結合の阻害は、R asシグナル伝達経路に沿った細胞内シグナルの伝達を遮断し、そしてそれにより細胞増殖を阻害する。本明細書に述べたデータは、本発明の組成物および方法を用いてRas-Raf相互作用を阻害することが、有害細胞の増殖により特徴づけられるがんおよびその他の疾患の治療のための確実な方法であることを示している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＡ６１Ｋ 38/00 ＡＤＵ 9284−4ＣＡ６１Ｋ 39/395 ＥＣ０７Ｋ 7/08 9051−4Ｃ 48/00 14/47 ＺＮＡ 9162−4ＢＣ１２Ｎ 15/00 ＡＣ１２Ｎ 1/19 9051−4ＣＡ６１Ｋ 37/02 ＡＤＵ 15/09 9051−4ＣＡＢＧＧ０１Ｎ 33/53 9051−4ＣＡＢＡ // Ａ６１Ｋ 39/395 9051−4ＣＡＢＣ 48/00 9051−4ＣＡＤＰ (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (72)発明者アブラッチヨセフアメリカ合衆国マサチューセッツ州ブルックリンセントポールストリート 277 (72)発明者ツァンキアン−フェンアメリカ合衆国マサチューセッツ州ケンブリッジパールストリート＃２ 249 (72)発明者マーシャルマークエスアメリカ合衆国インディアナ州キャメルスプルースコート 1519

Claims

【特許請求の範囲】１.化合物の結合能を化合物が細胞増殖を阻害するということの指標として、化合物をRafまたはそのRas結合性断片に接触させ、化合物のRafまたはそのRas結合性断片への結合能を決定することを含む、抗増殖化合物を評価する方法。２.断片が配列番号：１のアミノ酸配列を含むペプチドである、請求の範囲１記載の方法。３.断片が配列番号：６のアミノ酸配列を含むペプチドである、請求の範囲２記載の方法。４.断片が配列番号：７のアミノ酸配列を含むペプチドである、請求の範囲３記載の方法。５.断片が配列番号：９のアミノ酸配列を含むペプチドである、請求の範囲４記載の方法。６.断片が配列番号：１０のアミノ酸配列を含むペプチドである、請求の範囲５記載の方法。７.断片が配列番号：１１のアミノ酸配列を含むペプチドである、請求の範囲６記載の方法。８.断片が、配列番号：１１のアミノ酸配列の中の少なくとも４個の連続したアミノ酸を含むペプチドである、請求の範囲７記載の方法。９.断片が、配列番号：９のアミノ酸配列の中の少なくとも４個の連続したアミノ酸を含むペプチドである、請求の範囲５記載の方法。１０.化合物の結合能を化合物が細胞増殖を阻害するということの指標として、化合物をRasまたはそのRaf結合性断片に接触させ、化合物のRasまたはそのRaf結合性断片への結合能を決定することを含む、抗増殖化合物を評価する方法。１１.断片が配列番号：３のアミノ酸配列を含むペプチドである、請求の範囲１０記載の方法。１２.断片が配列番号：４のアミノ酸配列を含むペプチドである、請求の範囲１１記載の方法。１３.断片が配列番号：１２のアミノ酸配列を含むペプチドである、請求の範囲１０記載の方法。１４.化合物をRafまたはRafのRap結合性断片に接触させ、化合物のRafまたはその断片への結合能を決定することを含む、抗増殖化合物を評価する方法。１５.化合物非存在化における結合と比較した化合物存在下における結合の減少を、化合物が細胞増殖を阻害するということの指標として、RafまたはそのRas結合性断片をRasまたはそのRaf結合性断片に接触させ、化合物の、RasまたはそのR af結合性断片とRafまたはそのRas結合性断片との結合を阻害する能力を決定することを含む、抗増殖化合物を評価する方法。１６.化合物非存在化におけるリン酸化と比較した化合物存在下におけるリン酸化の増加を、化合物が細胞増殖を阻害するということの指標として、RafまたはそのRas結合性断片をRasまたはそのRaf結合性断片に接触させ、化合物の、RasまたはそのRaf結合性断片とRafまたはそのRas結合性断片との結合を阻害する能力を決定することを含む抗増殖化合物を評価する方法。１７.Rafまたはその断片がシグナル伝達タンパク質によりリン酸化される、請求の範囲１６記載の方法。１８.シグナル伝達タンパク質がプロテインキナーゼAである、請求の範囲１７記載の方法。１９.Rafまたはその断片が43位のセリンにおいてリン酸化される、請求の範囲１８記載の方法。２０.化合物をRafまたはRafのRas結合性断片に接触させ、化合物をRasまたはRasのRaf結合性断片に接触させ、化合物の、細胞増殖阻害能と関連している、RasまたはそのRaf結合性断片とRafまたはそのRas結合性断片との結合を阻害する能力を決定すること、を含む、化合物の細胞増殖阻害能を評価する方法。２１.(a)レポーター遺伝子に結合したGAL4結合部位を供給すること、 (b)(i)RafまたはそのRas結合性断片、(ii)RasまたはそのRaf結合性断片、のいずれかに結合したGAL4結合性ドメインを供給すること、 (c)GAL4結合ドメインがRafもしくはそのRas結合性断片に結合している場合、RasもしくはそのRaf結合性断片に結合したGAL4トランス活性化ドメインII、またはGAL4結合ドメインがRasもしくはそのRaf結合性断片に結合している場合、Raf もしくはそのRas結合性断片に結合したGAL4トランス活性化ドメインII、を供給すること (d)候補化合物を投与すること、 (e)発現の減少を、候補化合物がRasのRafへの結合を阻害するということの指標として、レポーター遺伝子の発現をモニターすること、を含む、候補化合物を、RafまたはそのRas結合性断片のRasまたはそのRaf結合性断片への結合を阻害する能力により、スクリーニングする方法。２２.RasとRafの相互作用を阻害することができる化合物の有効量を投与することを含む、動物における有害細胞の増殖を阻害する方法。２３.RasとRafの相互作用を阻害することができる、RasまたはRasのRaf結合性断片の有効量を投与することを含む、動物における有害細胞の増殖を阻害する方法。２４.断片が配列番号：３のアミノ酸配列を含むペプチドである、請求の範囲２３記載の方法。２５.断片が配列番号：４のアミノ酸配列を含むペプチドである、請求の範囲２４記載の方法。２６.断片が配列番号：１２のアミノ酸配列を含むペプチドである、請求の範囲２４記載の方法。２７.RasとRafの相互作用を阻害することができる、RafまたはそのRas結合性断片の有効量を投与することを含む、動物における有害細胞の増殖を阻害する方法。２８.Ras結合性断片のアミノ酸配列が、配列番号：１により規定される、請求の範囲２７記載の方法。２９.Ras結合性断片のアミノ酸配列が、配列番号：６により規定される、請求の範囲２８記載の方法。３０.Ras結合性断片のアミノ酸配列が、配列番号：７により規定される、請求の範囲２９記載の方法。３１.断片が配列番号：９のアミノ酸配列を含むペプチドである、請求の範囲３０記載の方法。３２.断片が配列番号：１０のアミノ酸配列を含むペプチドである、請求の範囲３１記載の方法。３３.断片が配列番号：１１のアミノ酸配列を含むペプチドである、請求の範囲３２記載の方法。３４.断片が、配列番号：１１のアミノ酸配列の中の少なくとも４個の連続したアミノ酸を含むペプチドである、請求の範囲３３記載の方法。３５.断片が、配列番号：９のアミノ酸配列の中の少なくとも４個の連続したアミノ酸を含むペプチドである、請求の範囲３１記載の方法。３６.ペプチドがリン酸化されていない、請求の範囲２７の方法。３７.RasとRafの相互作用を阻害する、リン酸化されたRafまたはその断片の有効量を動物に投与することを含む、動物における有害細胞の増殖を阻害する方法。３８.リン酸化されたRafまたはその断片が43位にリン酸化セリンを含む、請求の範囲３７の方法。３９.断片が配列番号：１９のアミノ酸配列を含むペプチドである、請求の範囲３８の方法。４０.断片が配列番号：２０のアミノ酸配列を含むペプチドである、請求の範囲３８の方法。４１.Rafのアミノ酸配列に対して少なくとも80％の配列相同性を有し、少なくとも４個以上のアミノ酸を含む、RasとRafの相互作用を阻害する能力を有するペプチド。４２.アミノ酸配列が配列番号：６である、請求の範囲４１のペプチド。４３.アミノ酸配列が配列番号：７である、請求の範囲４２のペプチド。４４.アミノ酸配列が配列番号：９である、請求の範囲４３のペプチド。４５.アミノ酸配列が配列番号：１０である、請求の範囲４４のペプチド。４６.アミノ酸配列が配列番号：１１である、請求の範囲４５のペプチド。４７.配列番号：１１のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列相同性を有し、4個から15個のアミノ酸を含む、RasとRafの相互作用を阻害する能力を有するペプチド。４８.8個から15個のアミノ酸を含む、請求の範囲４７のペプチド。４９.配列番号：１１のアミノ酸配列に対して100％の相同性を有する、請求の範囲４７のペプチド。５０.配列番号：９のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列相同性を有し、4個から15個のアミノ酸を含む、RasとRafの相互作用を阻害する能力を有するペプチド。５１.8個から15個のアミノ酸を含む、請求の範囲５０のペプチド。５２.配列番号：９のアミノ酸配列に対して100％の相同性を有する、請求の範囲５０のペプチド。５３.Rasのアミノ酸配列に対して少なくとも80％の配列相同性を有し、少なくとも4個以上のアミノ酸を含む、RasとRafの相互作用を阻害する能力を有するペプチド。５４.アミノ酸配列が配列番号：４である、請求の範囲５３のペプチド。５５.アミノ酸配列が配列番号：１２である、請求の範囲５４のペプチド。５６.配列番号：12のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列相同性を有し、4個から15個のアミノ酸を含む、RasとRafの相互作用を阻害する能力を有するペプチド。５７.8個-15個アミノ酸を含む、請求の範囲５６のペプチド。５８.配列番号：12のアミノ酸配列と100％の相同性を有する、請求の範囲５６のペプチド。５９.化合物をRafまたはRafのRas結合性断片に接触させること、およびRafまたはRas結合性断片への結合能により化合物を単離すること、を含む抗増殖化合物を精製する方法。６０.ペプチドが配列番号：１０のアミノ酸配列を含む、請求の範囲５９の方法。６１.化合物をRasまたはRasのRaf結合性断片に接触させること、およびRasまたはRaf結合性断片への結合能により化合物を単離すること、を含む抗増殖化合物を精製する方法。６２.断片が配列番号：12のアミノ酸配列を含む、請求の範囲６１の方法。