KR20000016301A - 혈관 형성 억제에 유용한 방법 및 조성물 - Google Patents

혈관 형성 억제에 유용한 방법 및 조성물

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KR20000016301A
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피터 브룩스
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빙검 더글라스 에이.
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Abstract

본원에는 비트로넥틴 αⅴβ3길항제를 사용하여 특정 조직에서 혈관 형성을 억제하는 방법, 특히 αⅴβ3길항제를 함유하는 치료학적 조성물을 사용하여 염증 발생된 조직 및 종양 조직 및 전이물에서의 혈관 형성을 억제하는 방법이 기술되어 있다.

Description

혈관 형성 억제에 유용한 방법 및 조성물
인테그린(integrin)은 세포외 매트릭스 단백질을 결합하는 것으로 공지된 세포내 수용체의 한 부류이므로, 일반적으로 세포 유착 사건으로 지칭되는 세포-세포 및 세포-세포외 매트릭스 상호작용을 매개한다. 그러나, 수많은 인테그린과 특정 인테그린을 결합시키는 리간드가 문헌에 기술되어 있긴 하지만, 이들 수많은 인테그린의 생물학적 기능은 여전히 파악하기가 어렵다. 인테그린 수용체는 α 및 β아단위로 형성된 비공유 이종이량체성 당단백질 복합체의 구조적 특징을 공유하고 있는 특정 계열의 단백질로 구성된다.
비트로넥틴과 우선적으로 결합되는 본래의 특징을 따서 명명된 비트로넥틴 수용체는 현재 αⅴβ1, αⅴβ3및 αⅴβ5로 명명된 3가지 상이한 인테그린을 지칭하는 것으로 공지되어 있다[참조:Horton,Int. J. Exp. Pathol., 71:741-759(1990)]. αⅴβ1은 피브로넥틴 및 비트로넥틴에 결합된다. αⅴβ3은 피브린, 피브리노겐, 라미닌, 트롬보스폰딘, 비트로넥틴, 폰 빌레브란트 인자, 오스테오스폰틴 및 골 시알로프로테인 Ⅰ을 포함하여 수많은 각종 리간드에 결합된다. αⅴβ5는 비트로넥틴에 결합된다. 이들 3가지 인테그린이 조직에서의 수많은 세포내 상호작용에 의존된다는 특이적 세포 유착 역할이 아직도 연구중에 있지만, 상이한 생물학적 기능을 지닌 상이한 인테그린이 존재한다는 것은 명백하다.
많은 인테그린에 대한 리간드에서 중요한 하나의 인식 부위는 아르기닌-글리신-아스파르트산(RGD) 트리펩티드 서열이다. RGD는 앞서 비트로넥틴 수용체 인테그린에 대해 동종된 모든 리간드에서 발견된다. 이러한 RGD 인식 부위는 상기 RGD 서열을 함유하는 폴리펩티드("펩티드")에 의해 모사될 수 있으며 이러한 RGD 펩티드는 인테그린 기능에 대한 공지된 억제제이다. 그러나, 이러한 RGD 펩티드의 서열과 구조에 따라서, 억제의 특이성이 표적 특이적 인테그린으로 변화될 수 있다는 것을 인지하는 것이 중요하다.
RGD 인식 부위에 관한 논의는 문헌[참조:Pierschbacher et al.,Nature, 309:30-33(1984), and Pierschbacher et al.,Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81:5985-5988(1984)]을 참조하기 바란다. 다양한 인테그린 특이성을 지닌 각종 RGD 폴리펩티드 역시 문헌[참조:Grant et al.,Cell, 58:933-943(1989), Cheresh et al.,Cell, 58:945-953(1989), Aumailley et al.,FEBS Letts., 291:50-54(1991), and Pfaff et al.,J. Biol. Chem., 269:20233-20238(1994) 및 미국 특허 제4,517,686호, 제4,578,079호, 제4,589,881호, 제4,614,517호, 제4,661,111호, 제4,792,525호, 제4,683,291호, 제4,879,237호, 제4,988,621호, 제5,041,380호 및 제5,061,693호]에 기술되어 있다.
혈관 형성(angiogenesis)은 새로이 발생되는 혈관을 특정 조직 내로 성장시키는 것과 연관이 있는 조직 혈관화의 한 과정이며 신생혈관화로 지칭되기도 한다. 이러한 과정은 내피 세포와 평활근 세포의 침윤에 의해 매개된다. 이러한 과정은 다음 3가지 방식, 즉 혈관이 미리 존재하는 혈관으로부터 성장할 수 있거나, 혈관의 신규한 발생이 전구체 세포로부터 야기될 수 있거나(맥관형성) 또는 존재하는 작은 혈관의 직경이 확대될 수 있는 방식 중의 어느 한 방식으로 진행될 수 있다[참조:Blood et al.,Bioch. Biophys. Acta, 1032:89-118(1990)]. 각종 내피 세포는 비트로넥틴 수용체(αⅴβ3또는 αⅴβ5), 콜라겐 유형 Ⅰ 및 Ⅳ 수용체(α1β1), 라미닌 수용체(α2β1), 피브로넥틴/라미닌/콜라겐 수용체(α3β1) 및 피브로넥틴 수용체(α5β1)를 포함하여 5가지 이상의 RGD-의존적 인테그린을 함유하는 것으로 공지되어 있다[참조:Davis et al,J. Cell. Biochem., 51:206-218(1993)]. 평활근 세포는 α5β1, αⅴβ3, 및 αⅴβ5을 포함하여 6가지 이상의 RGD-의존적 인테그린을 함유하는 것으로 공지되어 있다.
혈관 형성은 신생아 성장에 중요한 과정이지만, 상처 치유와 조직 염증, 관절염, 종양 성장, 당뇨병성 망막증, 망막의 신생혈관화에 의한 퇴화성 반점 및 기타 질환을 포함하는 각종 임상 질환의 발병학 측면에서 중요하다. 이와 같이 혈관 형성과 연관된 임상학적 증상들은 혈관 형성 질환으로서 지칭된다[참조:Folkman et al.,Science, 235:442-447(1987)]. 혈관 형성은 일반적으로 다 자라거나 성숙한 조직에서는 존재하지 않지만, 상처 치유와 황체 성장 주기에서는 발생된다[참조:Moses et al.,Science, 248:1408-1410(1990)].
혈관 형성을 억제시키는 것이 종양 성장을 억제하는데 유용한 치료법이 될 수 있다고 제안된 바 있다. 혈관 형성의 억제는 (1) bFGF(염기성 섬유아세포 성장 인자) 등의 "혈관 형성 분자"의 방출을 억제시키고 (2) 항-βbFGF 항체를 사용함으로써 혈관 형성 분자를 중화시키며 (3) 혈관 형성 자극에 대한 내피 세포 반응을 억제함으로써 수행할 수 있다고 제안되었다. 이러한 후자 방법은 주목을 받어왔으며 문헌[Folkman et al.,Cancer Biology, 3:89-96(1992)]에는 콜라게나제 억제제, 기저막 턴오버 억제제, 지혈성 스테로이드, 진균성-유도된 혈관 형성 억제제, 혈소판 인자 4, 트롬보스폰딘, 관절염 약물(예:D-페니실라민 및 골드 티오말레이트), 비타민 D3동족체, 알파-인터페론, 및 혈관 형성을 억제하는데 사용되는 기타 억제제를 포함하여 여러 가지 내피 세포 반응 억제제가 기술되어 있다. 제안된 부가의 혈관 형성 억제제에 관해서는 문헌[참조:Blood et al.,Bioch. Biophys. Acta., 1032:89-118(1990), Moses et al.,Science, 248:1408-1410(1990), Ingber et al.,Lab. Invest., 59:44-51(1988), 및 미국 특허 제5,092,885호, 제5,112,946호, 제5,192,744호 및 제5,202,352호]를 참조하기 바란다. 상기 문헌에 기술된 어떠한 혈관 형성 억제제도 αⅴβ3의 억제에 표적을 맞추지는 않았다.
비트로넥틴 수용체 αⅴβ3을 억제하는 RGD-함유 펩티드가 또한 공지되어 있다[참조:Aumailley et al.,FEBS Letts., 291:50-54(1991), Choi et al.,J. Vasc. Surg., 19:125-134(1994), Smith et al.,J. Biol. Chem., 265:12267-12271(1990), and Pfaff et al.,J. Biol. Chem., 269:20233-20238(1994)]. 그러나, 혈관 형성에 있어서의 인테그린 αⅴβ3의 역할은 본 발명 이전까지는 결코 제시되거나 확인된 적이 없었다.
예를 들면, 문헌[Hammes et al.,Nature Med., 2:529-53(1996)]에서는 본 발명의 발견 사실이 확인되었다. 구체적으로 언급하면, 상기 문헌에는 사이클릭 RGDfV(이의 구조 및 기능은 본원이 기초로 하고 있는 우선권 주장 출원에 이미 기술되어 있다)을 포함하여 사이클릭 펩티드가 저산소증 유도된 망막성 신생혈관화의 마우스 모델에서 망막성 신생혈관화를 억제시킨다고 기술되어 있다. 본 발명 뿐만 아니라 우선권 주장 출원을 뒷받침해주고 있는 별개의 연구에 있어서, 문헌[Luna et al.,Lab. Invest., 75:563-573(1996)]에는 산소 유도된 허혈성 망막증의 마우스 모델에서 망막성 신생혈관화를 억제하는데 부분적으로 유효한 2개의 특정한 사이클릭 메틸화 RGD-함유 펩티드가 기술되어 있다. 이와는 달리, 본 발명의 펩티드는 본원에서 기술된 마우스 모델에서 신생혈관화를 거의 완전히 억제시키는 것으로 나타났다.
각종 인테그린 α 또는 β 아단위에 대하여 면역특이적인 모노클로날 항체를 사용하여 시험관내에서 세포 유착을 억제하는 것은 미세혈관성 내피 세포를 포함한 각종 세포 유형의 세포 유착에서의 αⅴβ3과 관련이 있다[참조:Davis et al.,J. Cell. Biol., 51:206-218(1993)]. 또한, 문헌[Nicosia et al.,Am. J. Pathol.,138:829-833(1991)]에는 콜라겐 겔에서 배양된 랫트 대동맥으로부터의 "미세혈관"의 형성을 시험관내에서 억제시키기 위한 RGD 펩티드 GRGDS의 용도가 기술되어 있다. 그러나, 콜라겐 겔 배양물에서 "미세혈관"의 시험관내 형성을 억제시키는 것은 특정 조직에서 혈관 형성을 억제하기 위한 모델이 아닌데, 이는 이러한 미세혈관 구조가 모세관 성장과 동일한 것으로 보여지지 않거나 또는 콜라겐 겔 배양물에서의 미세혈관의 형성이 관절염 조직, 종양 조직 또는 혈관 형성의 억제가 요망되는 질환 조직과 같은 본래의 조직으로의 신생혈관성 성장과 동일한 것으로 보여지지 않기 때문이다.
혈관 형성이 발생되기 위해서는, 내피 세포가 먼저 분해되어 침입과 전이물 형성 동안 종양 세포에 의해 사용된 것과 유사한 방식으로 혈관 기저막을 지나야만 한다.
본 발명자들은 혈관 형성이 혈관성 인테그린과 세포외 매트릭스 단백질 간의 상호작용에 의해 좌우된다고 앞서 보고한 바 있다[참조:Brooks et al.,Science, 264:569-571(1994)]. 더욱이, 혈관 형성 세포의 프로그램된 세포 사멸[어팝토시스(apoptosis)]이 이러한 상호작용에 의해 개시되며, 이는 혈관성 인테그린 αⅴβ3의 특정 혈관 형성에 의해 억제될 수 있다고 보고하였다[참조:Brooks et al.,Cell, 79:1157-1164(1994)]. 보다 최근에, 본 발명자들은 비트로넥틴 수용체(αⅴβ5)에 대한 매트릭스 메탈로프로테이나제-2(MMP-2)의 결합을 αⅴβ5길항제를 사용하여 억제시킴으로써 이러한 프로테이나제의 효소적 기능을 억제한다고 보고하였다[참조:Brooks et al.,Cell, 85:683-693(1996)].
본원에 보고된 연구 이외에, 본 출원인은 혈관 형성이 세포 유착 억제제를 사용하여 특정 조직에서 억제될 수 있다는 것을 입증한 어떠한 문헌도 발견하지 못하였다. 특히, αⅴβ3기능이 조직에서의 혈관 형성에 요구되거나 αⅴβ3길항제가 조직에서 혈관 형성을 억제시킬 수 있다는 사실이 다른 어떠한 사람에 의해서도 앞서 입증된 바가 없다.
발명의 간단한 설명
본 발명의 명세서는 조직에서의 혈관 형성에는 인테그린 αⅴβ3이 요구되며 αⅴβ3의 억제제가 혈관 형성을 억제할 수 있다는 것을 입증해주고 있다. 본원 명세서에는 또한 αⅡbβ3또는 αⅴβ1과 같은 인테그린의 길항제는 혈관 형성을 억제하지 못하는 것으로 기술되어 있는데, 이는 아마도 이들 인테그린이 혈관 형성 발생에 필수적인 것이 아니기 때문일 것이다.
따라서, 본 발명은 혈관 형성 억제량의 αⅴβ3길항제를 포함하는 조성물을 특정 조직에 투여하는 것을 포함하여, 이러한 조직에서의 혈관 형성을 억제하는 방법에 관한 것이다.
처리될 조직은 신생혈관화가 발생되는 병든 조직과 같이 혈관 형성의 억제가 요망되는 어떠한 조직일 수 있다. 이러한 조직의 예로는 염증 발생된 조직, 고체 종양, 전이물, 재발협착증(restenosis)이 진행되는 조직 및 기타 조직이 있다.
본 발명의 방법에 사용하기 위한 αⅴβ3길항제는 αⅴβ3와 결합될 수 있고 천연 리간드와 결합하는 αⅴβ3의 능력을 경쟁적으로 억제시킬 수 있다. 바람직하게는, 이러한 길항제는 다른 인테그린에 비해 αⅴβ3에 대해서 특이성을 나타낸다. 특히 바람직한 양태에 있어서, αⅴβ3길항제는 αⅴβ3에 대한 피브리노겐 또는 기타 RGD-함유 리간드의 결합을 억제시키지만, αⅡbβ3에 대한 피브리노겐의 결합은 실질적으로 억제시키지 않는다. 바람직한 αⅴβ3길항제는 융합 폴리펩티드, 사이클릭 또는 선형 폴리펩티드, 유도체화된 폴리펩티드, αⅴβ3와 면역반응되는 모노클로날 항체, αⅴβ3의 유기 모사체 또는 이들의 작용성 단편일 수 있다.
본 발명은 일반적으로 의약 분야에 관한 것이며, 보다 구체적으로는 비트로넥틴 수용체 αⅴβ3의 길항제를 사용하여 조직의 혈관 형성을 억제하는 방법 및 이를 위한 조성물에 관한 것이다.
본 명세서의 한 부분을 형성하는 도면에 있어서,
도 1A 내지 1D는 정상적인 피부와 과립화 조직으로 명명된 상처 치유가 진행되고 있는 피부에서의 인테그린 아단위 β3및 β1의 조직 분포도이다. β3및 β1에 대한 항체와의 면역조직화학은 실시예 3A에 기술된 바와 같이 수행한다. 도 1A 및 1B는 각각 정상적인 피부와 과립화 조직에서의 항-β3의 면역반응성을 도시한 것이다. 도 1C 및 1D는 각각 정상적인 피부와 과립화 조직에서의 항-β1의 면역반응성을 도시한 것이다.
도 2A 내지 2D는 정상적인 피부와 과립화 조직으로 명명된 상처 치유가 진행되고 있는 피부에서 β3및 β1인테그린 아단위를 각각 결합시키는 폰 빌레그란트 인자 및 라미닌 리간드의 조직 분포도이다. 폰 빌레그란트 인자에 대한 항체(항-vWF) 및 라미닌에 대한 항체(항-라미닌)와의 면역조직화학은 실시예 3B에 기술된 바와 같이 수행한다. 도 2A 및 2B는 각각 정상적인 피부와 과립화 조직에서의 항-vWF의 면역반응성을 도시한 것이다. 도 2C 및 2D는 각각 정상적인 피부와 과립화 조직에서의 항-라미닌의 면역반응성을 도시한 것이다.
도 3A 내지 3D는 방광암, 결장암, 유방암 및 폐암의 조직 생검법에 있어서 각각 비트로넥틴 인테그린 수용체 αⅴβ3의 조직 분포도이다. αⅴβ3에 대한 LM609 항체와의 면역조직화학은 실시예 3C에 기술된 바와 같이 수행한다.
도 4는 처리되지 않은 10일생 병아리 배아에서 혈관이 결여된 본 발명의 CAM의 전형적인 현미경사진을 도시한 것이다. 이의 제조는 실시예 5B에 기술되어 있다.
도 5A 내지 5C는 본 발명의 CAM 제제에서 인테그린 β1및 αⅴβ3의 조직 분포도를 나타낸 것이다. 도 5A는 CAST, 즉 항-β1항체를 이용한 면역형광 면역 반응성에 의해 탐지된 바와 같이, 처리되지 않은 10일생 CAM 제제에서 β1아단위의 분포도를 나타낸 것이다. 도 5B는 LM609, 즉 항-αⅴβ3항체를 이용한 면역형광 면역 반응성에 의해 탐지된 바와 같이 처리되지 않은 10일생 CAM 제제에서 αⅴβ3수용체의 분포도를 나타낸 것이다. 도 5C는 LM609, 즉 항-αⅴβ3항체를 이용한 면역형광 면역 반응성에 의해 탐지된 바와 같이, bFGF 처리된 10일생 CAM 제제에서 αⅴβ3수용체의 분포도를 나타낸 것이다. 이러한 처리 및 결과는 실시예 5C에 기술되어 있다.
도 6은 실시예 6A에 기술된 바와 같이 bFGF 처리된 10일생 CAMs 및 처리되지 않은 10일생 CAMs에서의 αⅴβ3와 β1의 상대적 발현의 정량화를 막대 그래프로 나타낸 것이다. 평균 형광 세기는 Y 축에 플롯하고 인테그린 프로필은 X 축에 플롯한다.
도 7A 내지 7C는 처리되지 않은 10일생 CMA, bFGF 처리된 CAM, 및 TNFα처리된 CAM 각각의 외관을 나타낸 것이며 이의 결과 및 과정이 실시예 6A에 기술되어 있다.
도 8A 내지 8E는 실시예 7A1)에 기재된 바와 같이 10일생 CAM에서 bFGF-유도된 혈관 형성에 대한 국부적 항체 처리의 효과를 도시한 것이다. 도 8A는 혈관이 전혀 없는 처리되지 않은 CAM 제제를 도시한 것이다. 도 8B는 미리 bFGF 처리에 의해 혈관계를 제거시킨 영역 내로 새로운 혈관계의 침윤을 도시한 것이다. 도 8C, 8D 및 8E는 각각 β1(항-β1; CAST), αⅴβ5(항-αⅴβ5; P3G2) 및 αⅴβ3(항-αⅴβ3; LM609) 에 대한 항체의 효과를 도시한 것이다.
도 9A 내지 9C는 실시예 7E2)에 기재된 바와 같이 종양에 의해 유도된 혈관 형성에 대한 합성 펩티드 66203의 정맥내 주사 효과를 도시한 것이다. 도 9A는 종양 유도로부터 발생된 혈관 형성에 대한 대조군 펩티드(대조군 펩티드 종양)로의 정맥내 처리의 억제 효과의 결여를 도시한 것이다. 펩티드 66203(사이클릭 RGD 종양)의 정맥내 주사에 의한 상기 혈관 형성의 억제가 도 9B에 도시되어 있다. 종양-처리된 곳과 인접한 영역에 펩티드 66203을 정맥내 주입한 후 예비로 존재하는 성숙한 혈관에 대한 억제 효과 또는 세포독성의 결여가 도 9C에 도시되어 있다(사이클릭 RGD 인접한 CAM).
도 10A 내지 10C는 실시예 7B1)에 기재된 바와 같이 성장 인자 유도된 혈관 형성에 대한 정맥내 투여 효과를 도시한 것이다. 도 10A는 항체 처리에 노출되지 않은(대조군) bFGF-유도된 혈관 형성을 도시한 것이다. 도 10B에 도시된 바와 같이 유사한 제제를 항-αⅴβ5P3G2로 처리하는 경우에는 어떠한 혈관 형성의 억제도 발생되지 않았다. 도 10C에 도시된 바와 같이 항-αⅴβ3항체 LM609로의 처리시 혈관 형성의 억제가 발생되었다.
도 11A 내지 11C는 실시예 7C에 기술된 바와 같은 항-인테그린 항체를 국부 투여한 후의 배아성 혈관 형성에 대한 효과를 도시한 것이다. 혈관 형성은 6일생 CAM을 도 11A 및 11B에 도시된 항-β1및 항-αⅴβ5항체로 각각 처리하여서는 억제되지 않는다. 이와는 달리, 항-αⅴβ3항체 LM609로 처리하면 도 11C에 도시된 바와 같이 혈관 형성이 억제되었다.
도 12는 실시예 7D1)에 기재된 바와 같이 CAM 제제에서 종양을 유입시키는 혈관 수를 정량화한 것이다. 이의 그래프는 Y 축에 플롯된 바와 같이, CAST(항-β1), LM609(항-αⅴβ3) 또는 P3G2(항-αⅴβ5)를 국부 투여한 후의 혈관 수를 나타낸 것이다.
도 13A 내지 13D는 실시예 9A1)a에 기재된 바와 같이 처리시킨지 7일 후의 습윤 종양 중량과 초기 종양 중량을 비교한 것이다. 각 바는 그룹 당 5개 내지 10개 종양의 평균 ±S.E.을 나타낸다. 종양은 사람 흑색종(M21-L)(도 13A), 췌장암(Fg)(도 13B), 폐암(UCLAP-3)(도 13C) 및 후두암(HEp3)(도 13D) CAM 제제로부터 유도된 것이고 PBS, CSAT(항-β1) 또는 LM609(항-αⅴβ3)로 정맥내 처리된 것이다. 그래프는 CSAT(항-β1), LM609(항-αⅴβ3) 또는 PBS(X 축에 지시된 바와 같음)를 정맥내 투여한 후의 종양 중량(Y 축에 플롯되어 있는 바와 같음)을 나타낸 것이다.
도 14A 및 14B는 P3G2(항-αⅴβ5)(도 14A) 및 LM609(항-αⅴβ3)(도 14B)로 처리되고, 실시예 9A1)b에 기재된 바와 같이 헤마톡실린 및 에오신으로 염색된 종양의 조직학적 단면도이다. 도 14A에 도시된 바와 같이, 대조군 항체(P3G2)로 처리된 종양은 핵분열 형상(화살촉) 뿐만 아니라 종양 지질 전반에 걸친 다중 혈관(화살표)에 의해 지시된 바와 같이, 활성적으로 분할된 살아있는 수많은 종양 세포를 나타내었다. 이와는 달리, 도 14B에 있어서, LM609(항-αⅴβ3)로 처리된 종양에서는 살아있는 종양 세포 또는 혈관이 거의 탐지되지 않았다.
도 15A 내지 15E는 실시예 9A2)에 기재된 바와 같은 펩티드로 처리된 M21L 종양에 상응하는데, 이는 다음과 같다: 도 15A, 대조군 사이클릭 RAD 펩티드(69601); 도 15B, 사이클릭 RGD 펩티드(66203); 도 15C, 사이클릭 RGD 펩티드(66203)로 처리된 동일한 배아로부터 취한 인접한 CAM 조직 및 도 15D에서의 대조군 RAD(69601) 또는 도 15E에서의 사이클릭 RGD 펩티드(66203)로 처리된 고배율(13x)의 종양. 도 15D 는 RAD 대조군 펩티드(69601) 처리된 종양으로부터의 정상적인 혈관을 도시한 것이다. 도 15E는 사이클릭 RGD 펩티드(66203) 처리된 종양으로부터의 파열된 혈관의 예를 도시한 것이다(화살표).
도 16A 내지 16E는 실시예 10에 기재된 바와 같이 생체내 래빗 안구 모델 검정에서 혈관 형성의 억제제에 의한 혈관 형성의 억제를 나타낸 것이다. 도 16A 및 16B는 bFGF 및 mAb P1F6(항-αⅴβ5)의 존재 하에서 래빗 안구의 혈관 형성을 도시한 것이다. 도 16C, 16D 및 16E는 bFGF 및 mAb LM609(항-αⅴβ3)의 존재 하에서 래빗 안구의 혈관 형성의 억제를 도시한 것이다.
도 17은 실시예 11에 기재된 바와 같이 생체내 마우스:사람 키메릭 마우스 모델이 어떠한 방식으로 발생되는지를 보여주는 플로우 챠트이다. SCID 마우스로부터의 일정 분획의 피부를 사람 신생아 피부로 대체시키고 4주 동안 치료되게 한다. 이러한 이식체를 치료시킨 후, 상기 사람 피부에 사람 종양 세포를 접종한다. 다음 4주간 동안, 사람 피부로부터 사람 종양 내로 성장하는 사람 혈관계를 지닌 사람 종양을 포함한 측정 가능한 수준의 종양이 정착되었다.
도 18은 FACS 분석에 의해 측정되고 실시예 12에 기재된 바와 같이, mAb-처리된 및 펩티드 처리된 CAM으로부터 유도되고 아포프 태그로 염색시킨 단일 세포의 비율(%)을 도시한 것이다. 블랙 및 스티플형 막대는 각각 본 검정을 수행하기 24시간 및 48시간 전에 처리된 배아로부터의 세포를 나타낸 것이다. 각 바는 3회 실험의 평균치 ±S.E.이다. CAMs를 mAb LM609(항-αⅴβ3), 또는 CSAT(항-β1) 또는 PBS로 처리한다. CAMs를 또한 사이클릭 펩티드 66203(사이클릭-RGDfV, 펩티드 203으로 지시됨) 또는 대조군 사이클릭 펩티드 69601(사이클로-RADfV, 펩티드 601로 지시됨)로 처리한다.
도 19A 및 19B는 실시예 12C에 기재된 바와 같이, CSAT(항-β1)(도 19A) 또는 LM609(항-αⅴβ3)로 처리되고, 아포프 태그 및 프로피듐 요오다이드로 염색시키며 FACS에 의해 분석된 배아로부터의 CAMs의 단일 세포 현탁물의 조합된 결과를 도시하고 있다. Y축은 수많은 세포에서 아포프 태그 염색(어팝토시스)을 나타내고 X축은 프로피듐 요오다이드 염색(DNA 함량)을 나타낸다. 가로선은 아포프 태그 염색에 대한 음성 게이트(negative gate)를 나타낸다. 좌측 및 우측 패널은 각각 CSAT(항-β1)(도 19A) 또는 LM609(항-αⅴβ3) 처리된 배아로부터의 CAM 세포를 지시한다. 각 조건 당 대략 8,000 사건을 분석함으로써 세포 주기 분석을 수행한다.
도 20A 내지 20C는 CSAT(항-β1) 처리된 배아로부터의 CAM 조직을 나타낸 것이고 도 20D 내지 20F는 실시예 12C에 기술된 바와 같이 제조된 LM609(항-αⅴβ3)로부터의 CAM 조직을 나타낸 것이다. 도 20A 및 20D는 아포프 태그로 염색시키고 D.I.C 영상 위에 겹쳐 놓은 형광체(FITC)에 의해 가시화된 조직을 도시한 것이다. 도 20B 및 20E는 mAb LM609(항-αⅴβ3)로 염색시키고 형광체(로다민)에 의해 가시화된 동일한 조직을 도시한 것이다. 도 20C 및 20F는 아포프 태그와 LM609 모두로 염색시킨 동일한 조직의 합병된 영상을 나타내며, 여기서 황색 염색은 공-국재화를 나타낸다. 바는 좌측 및 우측 패널에서 각각 15 및 50㎛를 나타낸다.
도 21은 실시예 4A에 기재된 바와 같이 펩티드 85189를 이용한 세포 부착 검정의 억제 결과를 도시한 것이다. 이러한 펩티드 길항제의 효과는 X축에 플롯된 바와 같이 0.001 내지 100μM의 투여량 범위에 걸쳐 평가한다. 600nm의 광밀도(O.D.)에서 측정된 세포 부착을 Y축에 플롯한다. 비트로넥틴-(파선) 대 라미닌-(실선) 피복된 표면에 대한 세포 부착을 측정한다.
도 22A 및 22B는 닭 MMP-2의 일련의 cDNA 서열을 두 번째 선에 나타낸 추론된 아미노산 서열과 함께 도시한 것이다. 세 번째 및 네 번째 선은 각각 실시예 4A에 기재된 바와 같은 사람 및 마우스 MMP-2의 추론된 아미노산 서열을 나타낸다. 닭 cDNA 서열이 암호화된 아미노산 서열과 함께 서열 29에 열거되어 있으며 이러한 암호화된 아미노산 서열 역시 서열 30에 별도로 제시되어 있다. 음수로서 도 22A에 나타낸, 5' 비해독된 영역 및 프로엔자임 서열을 암호화하는 영역의 첫 번째 뉴클레오티드의 넘버링은 실제적으로, 이러한 숫자 보다 더 긴 것으로 보이는 후자를 만드는 서열 목록에서 1번으로서 제시되지만; 이러한 뉴클레오티드 서열은 상기 넘버링을 제외하고는 길이와 서열이 상기 목록에 제시된 바와 동일한 숫자이다. 따라서, MMP-2 단편을 증폭시키는데 사용하기 위한 프라이머에서와 같이, 본원 명세서에서 닭 또는 사람 MMP-2에 대한 뉴클레오티드 위치에 관한 참조는 서열 목록에 열거된 바가 아니고 상기 숫자로 지시된 바와 같은 뉴클레오티드 위치를 기준으로 한 것이다.
도 23은 실시예 4B에 추가로 기재된 바와 같이, 억제제의 존재하 및 부재하에서 αⅴβ3와 결합하기 위한 요오드화 MMP-2의 고체상 수용체 결합 검정을 막대 그래프 형태로 나타낸 결과이다. 이러한 데이트를 각종 효능있는 억제제 및 대조군에 대하여 결합된 CPM으로서 Y축에 플롯시킨다.
도 24는 실시예 4B에 추가로 기재된 바와 같이, MMP-2 억제제의 존재 하에서 인테그린 수용체 αⅴβ3및 αⅡbβ3에 대한 닭 유도된 MMP-2 조성물의 특이도를 도시한 것이다. 이러한 데이터는 도 23의 범례에 기술된 바와 같이 표시된다.
도 25는 실시예 7A3)에 기재된 바와 같이 bFGF-유도된 혈관 형성에 대한 닭 MMP-2(410-637) GST 융합 단백질의 효과를 도시한 것이다. 도 25A 내지 25B 및 25C 내지 25D는 각각, 대조군(비-MMP-2 단편 함유 융합 단백질) 및 MMP-2 단편 GST 융합 단백질 효과를 도시한 것이다.
도 26 및 27은 모두 실시예 7A3)에 기재된 바와 같이, bFGF-처리된 CAMs에 대한 닭 MMP-2(410-637) GST 융합 단백질(표지된 CTMMP-2) 대 대조군(RAP-GST 또는 GST-RAP)의 효과의 혈관 형성 지수(분기점 측정치)를 막대 그래프 형태로 도시한 것이다. X축 상의 별도의 처리에 대하여 Y축 상에 혈관 형성 지수를 플롯한다.
도 28은 실시예 7B 및 14DP 기재된 바와 같이, X축 상의 bFGF 단독, 및 펩티드 69601 또는 66203 및 유기 화합물 96112, 96113 및 96229로의 bFGF-처리된 CAMs를 포함한 각종 처리에 대하여 Y축 상에 플롯된 분기점에 대한 효과로 측정된 바와 같이 bFGF-유도된 혈관 형성에 대한 펩티드 및 유기 화합물의 효과를 도시한 것이다.
도 29는 실시예 7B2)에 추가로 기재된 바와 같이 bFGF-유도된 혈관 형성을 억제하는 것에 대한 펩티드 85189의 용량 반응성을 그래프로 도시한 것이며, 여기서 분기점 수가 X축 상의 배아에 투여된 펩티드 양에 대하여 Y축에 플롯된다.
도 30은 실시예 7B2)에 기재된 바와 같이 CAM 검정에서 bFGF-유도된 혈관 형성에 있어서 펩티드 66203(표지된 203) 및 85189(표지된 189)의 억제 활성을 도시한 것이다. 대조군은 bFGF-처리된 CAMs에 펩티드를 전혀 포함하지 않았으며 펩티드 69601(표지된 601)을 포함하였다. 이러한 데이터는 도 27에 대한 범례에 기술된 바와 같이 플롯된다.
도 31A-31L은 실시예 7B3)에 추가로 기재된 바와 같이, 24시간부터 시작하여 72시간에 종결되는 시간 동안 처리되지 않은 CAM 제제에 대한 각종 처리의 효과를 도시한 것이다. 표지된 비처리된, bFGF, bFGF + MAID(닭 MMP-2(2-4) GST 융합 단백질로 노출시킨 다음 처리된 bFGF) 및 bFGF + 대조군(bFGF 처리시킨 다음 닭 MMP-2(10-1) 처리시킴) 처리 카테고리에 대한 사진이 도 31A-C, 31D-F, 31G-I 및 31J-L에 각각 도시되어 있다.
도 32, 33 및 34는 각각, 실시예 9A에 추가로 기재된 바와 같이 대조군 펩티드 69601 및 길항제 85189에 대한 정맥내 노출 후 UCLAP-3, M21-L 및 FgM 종양에 대한 종양 중량 감소를 도시한 것이다. 이러한 데이터는 X축 상의 펩티드 처리에 대하여 Y축 상에 종양 중량을 플롯하여 표시한다.
도 35는 실시예 11B에 추가로 기재된 바와 같이 키메릭 마우스:사람 모델에서 흑색종 종양 성장에 대한 펩티드 및 항체의 효과를 도시한 것이다. 평가된 펩티드로는 대조군 69601(표지된 601) 및 길항제 85189(표지된 189)가 있다. 시험된 항체는 LM609이다. 종양 용적(㎣)을 X축 상의 각종 처리에 대하여 Y축 상에 플롯하였다.
도 36A 및 36B는 각각 실시예 11C에 추가로 기재된 바와 같이, 10, 50 및 250㎍의 1회 주사 용량 범위에 걸쳐 M21L 종양의 용적과 습윤 중량을 감소시키는데 있어서, 대조군 펩티드 69601과 비교한 길항제 85189(표지된 189)의 효과를 도시한 것이다.
도 37A 및 37B는 실시예 11C에 추가로 기재된 바와 같이 2가지 상이한 처리 섭생을 갖는 마우스:사람 모델에서 M21L 종양 용적을 억제시키는데 있어서, 대조군 펩티드 69601(점선과 빈 사각형으로 표지된 601)에 대한 길항제 펩티드 85189(실선과 검정색 원으로 표지된 189)의 효능을 도시한 것이다. 종양 용적(㎣)을 X축 상의 일 수에 대하여 Y축 상에 플롯하였다.
도 38 내지 42는 실시예 13에 추가로 기재된 바와 같이 유기 분자 αⅴβ3길항제의 각종 화학적 합성을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 43 및 44는 실시예 14에 추가로 기재된 바와 같이 CAM 검정에서 bFGF-유도된 혈관 형성에 대한 각종 유기 분자의 효과를 도시한 것이다. 도 43에서는 X축 상의 250㎍/ml로 사용된 각종 화합물에 대한 분기점을 Y축에 플롯하였고, 도 44에서는 X축 상의 100㎍/ml로 사용된 각종 화합물에 대한 분기점을 Y축에 플롯하였다.
A.정의
아미노산 잔기: 아미노산은 폴리펩티드를 이의 펩티드 연결부에서 화학적 분해(가수분해)시킬 때 형성된다. 본원에 기술된 아미노산 잔기는 바람직하게는 "L" 이성체 형태이다. 그러나, "D" 이성체 형태의 잔기가 L-아미노산 잔기를 대체할 수 있는데, 이는 목적하는 작용성이 폴리펩티드에 의해 보유되어야 한다. NH2는 특정 폴리펩티드의 아미노 말단에 존재하는 유리 아미노 그룹을 지칭한다. COOH는 특정 폴리펩티드의 카복시 말단에 존재하는 유리 카복시 그룹을 지칭한다. 표준 폴리펩티드 명명법(문헌 J. Biol. Chem., 243:3552-59(1969)에 기재되고 37 CFR §1.822(b)(2)에 채택됨)을 유지하면서, 아미노산 잔기에 대한 약어가 다음 표에 제시된다:
표
부호 아미노산
1-문자 3-문자
YGFMASILTVPKHQEZWRDNBCX TyrGlyPheMetAlaSerIleLeuThrValProLysHisGlnGluGlxTrpArgAspAsnAsxCysXaa 티로신글리신페닐알라닌메티오닌알라닌세린이소루이신루이신트레오닌발린프롤린리신히스티딘글루타민글루탐산Glu 및/또는 Gln트립토판아르기닌아스파르트산아스파라긴Asn 및/또는 Asp시스테인공지되지 않음/기타
또한, 다음 약어는 아래와 같은 의미를 갖는다:
BOC 3급 부틸옥시카보닐
DCCI 디사이클로헥실카보디이미드
DMF 디메틸포름아미드
OMe 메톡시
HOBt 1-하이드록시벤조트리아졸
본원에서 모든 아미노산 잔기 서열은 이의 좌측 및 우측 배향이 통상적인 아미노 말단 대 카복시 말단의 방향으로 표시된다는 것을 인지해야 한다. 더욱이, 아미노산 잔기 서열의 초기 또는 말단에 있는 데쉬(-)는 하나 이상의 아미노산 잔기의 추가의 서열에 대한 펩티드 결합을 지시한다는 것을 인지해야 한다.
폴리펩티드: 이는 연속된 아미노산 잔기의 알파-아미노 그룹과 카복시 그룹 사이의 펩티드 결합에 의해 서로 연결된 일련의 선형 아미노산 잔기를 지칭한다.
펩티드: 본원에서 사용된 바와 같은 펩티드는 폴리펩티드에서와 같이 서로 연결된 약 50개 이하의 일련의 선형아미노산 잔기를 지칭한다.
사이클릭 펩티드: 이는 전형적인 펩티드에서와 같이 몇몇 아미드 결합을 포함하는 헤테로 원자 환 구조를 갖는 화합물을 지칭한다. 이러한 사이클릭 펩티드는 선형 펩티드의 N-말단이 이러한 선형 펩티드의 말단 카복실레이트와 아미드 결합을 형성하는 "헤드 대 테일" 폐환된 선형 폴리펩티드일 수 있거나 이는 중합체가 호모데틱(homodetic) 또는 헤테로데틱(heterodetic)이고 아미드 결합 및/또는 환을 폐환시키는 기타 결합, 예를 들면, 디설파이드 브릿지, 티오에스테르, 티오아미드, 구아니디노 등의 결합을 포함하는 환 구조를 함유할 수 있다.
단백질: 이는 폴리펩티드에서와 같이 서로 연결된 50개 이상의 일련의 선형 아미노산 잔기를 지칭한다.
융합 단백질: 이는 전형적인 펩티드 결합에 의해 작동적으로 연결된("융합된") 2가지 이상의 상이한 폴리펩티드 영역을 함유하는 폴리펩티드를 지칭하며, 여기서 2가지 영역은 천연 상태에서는 융합된 상태로 발견되지 않는 펩티드에 해당된다.
합성 펩티드: 이는 천연 단백질 또는 이의 단편을 함유하지 않는, 펩티드 결합에 의해 함께 연결되고 화학적으로 생성된 아미노산 잔기 쇄를 지칭한다.
B.일반적인 고찰
본 발명은 일반적으로 혈관 형성이 특정한 비트로넥틴 수용체 αⅴβ3에 의해 매개되며 αⅴβ3기능 억제가 혈관 형성을 억제한다는 발견에 관한 것이다. 이러한 발견은 혈관 형성이 각종 질병의 진행 과정에 관여하기 때문에 중요하다. 혈관 형성을 억제함으로써, 질병에 개입하여 이의 증상을 완화시키며 몇몇 경우에는 이러한 질병을 치료할 수 있다.
새로운 혈관의 성장이 특정 질병과 연관된 병리학의 한 원인이거나 이에 기인된 것인 경우, 혈관 형성을 억제시키는 것이 이러한 질병의 유해한 효과를 저하시킬 것이다. 이러한 질병의 예로는 류마티스성 관절염, 당뇨병성 망막증, 염증 질환, 재발협착증 등이 있다. 유해한 조직의 성장을 지지하기 위하여 새로운 혈관 성장이 요구되는 경우, 혈관 형성을 억제시키는 것이 이러한 조직에 대한 혈액 공급을 감소시킴으로써 혈액 공급 요구에 의존된 조직 질량의 감소를 가져올 것이다. 이의 예에는 종양을 수 밀리미터 이상의 두께로 성장시키고 고형 종양 전이를 정착시키기 위해서는 신생 맥관형성이 지속적으로 요구되는 종양의 성장이 포함된다.
본 발명의 방법은 부분적으로는 효과적인데, 이는 상기 치료법이 혈관 형성에 대해 고도로 선택적이고 다른 생물학적 진행 과정에 대해서는 그렇지 않기 때문이다. 본 실시예에 나타낸 바와 같이, 단지 새로운 혈관 성장만이 실재적인 αⅴβ3를 함유하므로, 당해 치료 방법은 성숙한 혈관에 대해서는 불리한 영향을 미치지 않는다. 더욱이, αⅴβ3는 정상적인 조직에서는 광범위하게 분포되어 있지 않고, 오히려 새로운 혈관에서 선택적으로 발견되는데, 이로써 당해 치료가 새로운 혈관 성장만을 선택적으로 표적으로 할 수 있다는 것이 확실해진다.
αⅴβ3만을 억제시키면 혈관 형성을 효과적으로 억제시킬 것이라는 본 발견에 의해, 잠재적으로 고 특이성을 지니므로 비교적 독성이 낮은 치료학적 조성물을 개발할 수 있게 되었다. 따라서, 본 발명이 하나 이상의 인테그린을 억제시키는 능력을 지니고 있는 펩티드계 시약의 사용에 관해 기술하고 있긴 하지만, 당업자는 αⅴβ3를 보다 선택적으로 억제시키므로 αⅴβ3에 의해 매개된 것 이외의 기타 생물학적 진행 과정을 억제시키는 것과 관련된 부작용을 지니고 있지 않는 기타 시약을 고안할 수 있다.
예를 들면, 본 발명의 교시로 나타낸 바와 같이, αⅴβ3기능을 억제시키는데 대해 유사하게 선택적인 αⅴβ3과의 면역반응에 대해 고도로 선택적인 모노클로날 항체를 제조하는 것이 가능하다. 또한, 본원에 추가로 기술되는 바와 같이, RGD-함유 펩티드가 αⅴβ3의 억제에 대해 선택적이 되도록 고안할 수 있다.
본 발명의 발견 이전에는, 혈관 형성 자체, 및 혈관 형성에 의존적인 어떠한 진행 과정도 αⅴβ3의 생물학적 기능을 길항시키는 시약의 사용에 의해 생체내에서 억제될 수 있다는 사실이 전혀 공지된 바 없다.
C.혈관 형성을 억제하기 위한 방법
본 발명은 특정 조직에서의 혈관 형성을 억제함으로써, 혈관 형성에 의존하는 상기 조직에서의 사건들을 억제하는 방법을 제공해준다. 일반적으로, 본 발명의 방법은 혈관 형성 억제량의 αⅴβ3길항제를 포함하는 조성물을 조직 내로 투여하는 것을 포함한다.
앞서 언급된 바와 같이, 혈관 형성은 "성장", 맥관형성 또는 혈관 확장을 포함한 조직의 신생혈관화와 연관된 각종 진행 과정을 포함하며, 이들 진행 과정 모두는 αⅴβ3의 발현에 의해 매개되고 이에 의존적이다. 외상 치유, 황체 형성 및 배 형성을 예외로 하면, 대부분의 혈관 형성 진행과정은 질병 진행과정과 연관이 있기 때문에, 본 발명의 치료학적 방법을 사용하는 것은 이러한 질병에 대해 선택적이며 유해한 부작용을 지니고 있지 않는 것으로 여겨진다.
혈관 형성이 중요한 것으로 여겨지는 혈관 형성 질환으로 지칭된, 염증성 질환(예를 들면, 면역 및 비-면역성 염증, 만성적 관절 류마티즘 및 건선), 부적절하거나 부적당한 혈관의 침입과 연관된 질환(예를 들면, 당뇨병성 망막증, 신생혈관성 녹내장, 재발협착증, 아테롬성 동맥경화증에서의 모세관 증식 및 골다공증) 및 암 관련 질환(예를 들면, 고형 종양, 고형 종양 전이, 섬유성 혈관종, 수정체 뒤의 섬유증식증, 혈관종, 카포시 육종 및 종양 성장을 지지하기 위해 신생혈관화를 필요로 하는 기타 암)을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 각종 질병이 있다.
따라서, 질병에 걸린 조직에서 혈관 형성을 억제시키는 방법은 이러한 질병의 증상을 완화시키며 질병에 따라서 질병을 치료하는데 기여할 수 있다. 한 양태에 있어서, 본 발명은 조직 내에서 혈관 형성 자체의 억제를 고려한다. 조직 내에서의 혈관 형성의 정도, 및 따라서 본 발명의 방법에 의해 달성된 억제 정도는 각종 방법, 예를 들면, 면역조직화학에 의해 αⅴβ3-면역 양성적으로 미숙한 발생기 혈관을 탐지하기 위해 본 실시예에 기재된 바와 같은 방법에 의해 평가할 수 있다.
본원에 기술된 바와 같이, 피부, 근육, 장기, 연결 조직, 관절, 뼈 및 혈관 형성 자극시 혈관을 침입할 수 있는 기타 조직을 포함한 어떠한 각종 조직, 또는 유기화된 조직으로 구성된 기관도 질병 상태에서 혈관 형성을 지지할 수 있다.
따라서, 하나의 관련된 양태에 있어서, 치료하고자 하는 조직은 염증 발생된 조직이고 억제시킬 혈관 형성은 염증 발생된 조직의 신생혈관화가 일어나는 염증 발생된 조직 혈관 형성이다. 이러한 부류에서, 본 발명의 방법은 만성적 관절 류마티즘에 걸린 환자에서와 같은 관절염 조직, 면역 또는 비-면역성 염증 조직, 건선 조직 등에서 혈관 형성을 억제하는 것을 고려하고 있다.
본 발명의 많은 양태에서 치료된 환자는 바람직하게는 사람 환자이지만, 본 발명의 원칙은 본 발명이 모든 포유동물(이는 용어 "환자"에 포함되는 것으로 간주된다)에 대해서 유효하다는 것을 지시하고 있다는 것을 인지해야 한다. 이러한 맥락에서, 포유동물은 혈관 형성과 연관된 질병을 치료하고자 하는 모든 포유동물 종, 특히 농업용 및 가축용 포유동물 종을 포함하는 것으로 이해된다.
또 다른 관련 양태에 있어서, 치료하고자 하는 조직은 당뇨병성 망막증, 퇴화성 반점 또는 신생혈관성 녹내장 등의 망막성 질병이 있는 환자의 망막 조직이고 억제시키고자 하는 혈관 형성은 망막 조직의 신생혈관화가 이루어지는 망막 조직 혈관 형성이다.
부가의 관련 양태에 있어서, 치료하고자 하는 조직은 고형 종양, 전이물, 피부암, 유방암, 혈관종 또는 섬유성혈관종 및 기타 암에 걸린 환자의 종양 조직이고 억제시키고자 하는 혈관 형성은 종양 조직의 신생혈관화가 이루어지는 종양 조직 혈관 형성이다. 본 발명의 방법에 의해 치료될 수 있는 전형적인 고형 종양 조직으로는 폐, 췌장, 유방, 결장, 후두, 난소 및 기타 조직이 있다. 예시적인 종양 조직 혈관 형성 및 이의 억제가 본 실시예에 기술되어 있다.
종양 조직 혈관 형성의 억제가 특히 바람직한 양태인데, 이는 신생혈관화가 종양 성장에 있어서 중요한 역할을 하기 때문이다. 종양 조직의 신생혈관화가 이루어지지 않으면, 이러한 종양 조직은 필요한 영양분을 획득하지 못하여, 느리게 성장하고 추가의 성장을 중지하며 퇴화되고 결국에는 괴사되어 종양을 사멸시키게 된다.
달리 언급하면, 본 발명은 본 발명의 방법에 따라서 종양 혈관 형성을 억제시킴으로써 종양 신생혈관화를 억제하는 방법을 제공해준다. 유사하게, 본 발명은 혈관 형성-억제 방법을 실시함으로써 종양 성장을 억제하는 방법을 제공해준다.
당해 방법은 또한 전이물의 형성에 대하여 특히 유효한데, 이는 (1) 전이물의 형성에는 전이성 암 세포가 1차 종양을 떠날 수 있도록 1차성 종양의 신생혈관화가 필요하고 (2) 전이물이 2차 부위에 정착하기 위해서는 이러한 전이물의 성장을 지지해주기 위한 신생혈관화가 필요하기 때문이다.
관련 양태에 있어서, 본 발명은 고형 종양에 대하여 지시되고 전이물의 정착을 제어하기 위한 통상적인 화학치료법과 같은 기타 치료법과 연계하여 본 발명의 방법을 실시하는 것을 고려하고 있다. 혈관 형성 억제제의 투여는 전형적으로 화학치료 동안 또는 후에 수행하지만, 화학치료 후 종양 조직이 이러한 조직에 혈액 공급물과 영양분을 제공함으로써 회복하기 위한 혈관 형성을 유도함으로써 독성물 공격에 반응하게 될 시점에서 혈관 형성을 억제하는 것이 바람직하다. 또한, 전이에 대한 예방책으로서 고형 종양을 제거시킨 외과적 수술 후에 혈관 형성 억제 방법으로 투여하는 것이 바람직하다.
본 발명의 방법이 종양 신생혈관화의 억제에 적용되는 한, 당해 방법은 또한, 종양 조직 성장 억제, 종양 전이물 형성 억제 및 정착된 종양 퇴화에 적용할 수 있다. 본 실시예는 본 발명의 αⅴβ3길항제를 단일 정맥내 투여하면 정착된 종양이 퇴화된다는 것을 입증해주고 있다.
재발협착증은 혈관형성술의 성공을 방해하는 경피 트랜스루미날 관성 혈관형성술의 특정 부위에서의 평활근 세포(SMC) 이동 및 증식 과정이다. 재발협착증 동안의 SMC의 이동 및 증식은 본 방법에 의해 억제되는 혈관 형성의 과정으로 간주될 수 있다. 따라서, 본 발명은 혈관형성술을 받은 환자에서 본 발명의 방법에 따라서 혈관 형성을 억제함으로써 재발협착증을 억제하는 것을 고려하고 있다. 재발협착증을 억제하기 위하여, 당해 αⅴβ3길항제를 전형적으로는 이러한 혈관형성술 과정을 수행한 후 약 2 내지 약 28일 동안, 더욱 전형적으로는 상기 혈관형성술 과정을 수행한 후 처음 14일 동안 투여한다.
특정 조직에서의 혈관 형성을 억제하므로 또한 혈관 형성-관련된 질병의 치료 방법을 실시하기 위한 당해 방법은 혈관 형성이 발생되거나 발생될 위험이 있는 특정 조직을, αⅴβ3이 이의 천연 리간드에 결합하는 것을 억제시킬 수 있는 치료학적 유효량의 αⅴβ3길항제를 포함하는 조성물과 접촉시키는 것을 포함한다. 따라서, 당해 방법은 본 발명의 αⅴβ3길항제를 함유하는 치료학적 유효량의 생리학적으로 허용되는 조성물을 특정 환자에게 투여하는 것을 포함한다.
αⅴβ3길항제 투여량 범위는 본원에 추가로 기재된 바와 같이, 이러한 길항제의 형태 및 이의 효능에 좌우되며, 이는 혈관 형성 및 혈관 형성에 의해 매개된 질병 증상을 완화시키는 목적하는 효과를 야기시키기에 충분히 큰 양이다. 이러한 투여량은 해로운 부작용, 예를 들면, 과점조도 증상, 폐수종, 울혈성 심장마비 등을 유발시킬 정도로 큰 양이면 안 된다. 일반적으로, 투여량은 환자의 연령, 상태, 성별 및 질병 상태에 따라 다양할 것이며 당해 분야의 숙련인은 이러한 투여량을 결정할 수 있다. 투여량은 또한 어떠한 합병증이 발생되는 경우에도 개개 의사마다 조정될 수 있다.
치료학적 유효량은 치료하고자 하는 조직에서의 혈관 형성을 측정 가능한 수준으로 억제시키는데 충분한 αⅴβ3길항제의 양, 즉 혈관 형성-억제량이다. 혈관 형성의 억제는 본원에 기술된 바와 같은 면역조직화학에 의해 또는 당해 분야의 숙련인에게 공지된 기타 방법에 의해 동일 반응계내에서 측정할 수 있다.
αⅴβ3길항제가 αⅴβ3모사체, RGD-함유 펩티드, 항-αⅴβ3모노클로날 항체 또는 이들의 단편의 형태를 취할 수 있는 한은, 이러한 길항제의 효능과 이에 따른 "치료학적으로 유효한" 양이 다양할 수 있다는 것을 인지해야 한다. 그러나, 본 발명의 검정법에서 제시된 바와 같이, 당해 분야의 숙련인은 본 발명의 여러 후보 αⅴβ3길항제의 효능을 용이하게 평가할 수 있다.
αⅴβ3길항제의 효능은 본원에 모두 기재된 바와 같은, CAM 검정, 생체내 래빗 안구 검정, 생체내 키메릭 마우스:사람 검정 및 기타 검정에서 혈관 형성을 억제시키고 또한 αⅴβ3에 대한 천연 리간드의 결합을 억제함으로써 혈관 형성을 억제시키는 것을 포함한 각종 방법으로 측정할 수 있다.
바람직한 αⅴβ3길항제는 0.5마이크로몰(μM) 미만, 바람직하게는 0.1μM 미만, 더욱 바람직하게는 0.05μM 미만의 길항제 농도의 용액 중에서 αⅴβ3에 대한 천연 리간드, 예를 들면, 피브리노겐 또는 비트로넥틴의 결합을 실질적으로 억제시키는 능력을 지니고 있다. "실질적으로"란 용어는 피브리노겐 결합의 50% 이상의 감소가 αⅴβ3길항제의 존재 하에서의 억제에 의해 관찰되었다는 것을 의미하며 50% 억제는 본원에서 IC50값으로 지칭된다.
보다 바람직한 αⅴβ3길항제는 다른 인테그린에 비해 αⅴβ3에 대해 선택성을 나타낸다. 따라서, 바람직한 αⅴβ3길항제는 αⅴβ3에 대한 피브리노겐 결합은 실질적으로 억제시키지만, 또 다른 인테그린, 예를 들어, αⅴβ1, αⅴβ5또는 αⅡbβ3에 대한 피브리노겐의 결합은 실질적으로 억제시키지 못한다. 특히 바람직한 것은 또 다른 인테그린에 대한 피브리노겐 결합을 억제시키는 IC50활성치와 비교해서 αⅴβ3에 대한 피브리노겐 결합을 억제시키는 IC50활성치가 10배 내지 100 정도 더 낮은 αⅴβ3길항제이다. 인테그린에 대한 피브리노겐 결합을 억제시키는 IC50활성치를 측정하기 위한 검정의 예가 본 실시예에 기재되어 있다.
모노클로날 항체 형태의 본 발명에 따른 αⅴβ3길항제의 치료학적 유효량은 전형적으로 생리학적으로 허용되는 조성물로 투여될 때 약 0.01 내지 약 100㎍/ml, 바람직하게는 약 1㎍/ml 내지 약 5㎍/ml 및 통상적으로는 약 5㎍/ml의 혈장 농도를 달성하기에 충분한 양이다. 달리 언급하면, 이러한 투여량은 1일 또는 수일 동안 1일 수회 투여분에서 약 0.1 내지 약 300mg/kg, 바람직하게는 약 0.2 내지 약 200mg/kg, 가장 바람직하게는 약 0.5 내지 약 20mg/kg으로 다양할 수 있다.
당해 길항제가 모노클로날 항체의 단편 형태인 경우, 투여량은 완전한 항체의 질량과 비교한 단편의 질량을 기준으로 하여 용이하게 조정할 수 있다. 바람직한 혈장 농도(몰)는 약 2마이크로몰(μM) 내지 약 5밀리몰(mM), 바람직하게는 약 100μM 내지 약 1mM 항체 길항제이다.
폴리펩티드 형태 또는 기타 유사한 크기의 작은 분자인 αⅴβ3모사체 형태의 본 발명에 따른 αⅴβ3길항제의 치료학적 유효량은 전형적으로, 생리학적으로 허용되는 조성물로 투여될 때 약 0.1 내지 약 200㎍/ml, 바람직하게는 약 1㎍/ml 내지 약 150㎍/ml의 혈장 농도를 달성하기에 충분한 폴리펩티드의 양이다. 1몰 당 약 500g의 질량을 갖는 폴리펩티드를 기준으로 하면, 바람직한 혈장 농도(몰)는 약 2마이크로몰(μM) 내지 약 5밀리몰(mM), 바람직하게는 약 100μM 내지 약 1mM 폴리펩티드 길항제이다. 달리 언급하면, 체중 당 이러한 투여량은 1일 또는 수일 동안 1일 수회 투여분에서 약 0.1 내지 약 300mg/kg, 바람직하게는 약 0.2 내지 약 200mg/kg으로 다양할 수 있다.
본 발명의 모노클로날 항체 또는 폴리펩티드는 주사하거나 시간이 지남에 따라 서서히 주입함으로써 비경구적으로 투여할 수 있다. 치료하고자 하는 조직이 전형적으로 전신 투여에 의해 체내에서 발작할 수 있으므로 대부분 치료학적 조성물을 정맥내 투여함으로써 치료할 수 있긴 하지만, 표적된 조직이 표적 분자를 함유할 가능성이 많은 기타 조직 및 운반 수단이 고려된다. 따라서, 본 발명의 모노클로날 항체 또는 폴리펩티드는 정맥내, 복강내, 근육내, 피하, 강내, 경피 투여할 수 있으며 연동 수단에 의해 운반될 수 있다.
본 발명의 모노클로날 항체 또는 폴리펩티드를 함유하는 치료학적 조성물은 통상적으로 단위 용량을 주사하는 것과 같이 정맥내 투여한다. 본 발명의 치료학적 조성물을 참조로 하여 사용된 경우의 용어 "단위 용량"은 피검자에 대한 1회 투여량으로 적합한 물리적으로 벌개의 단위을 지칭하며, 각 단위는 요구되는 희석제, 즉 담체 또는 비히클과 함께 목적하는 치료 효과를 가져다주는 것으로 산정된 예정량의 활성 물질을 함유한다.
본 실시예에 제시된 바와 같은 하나의 바람직한 양태에 있어서, αⅴβ3길항제는 단일 용량으로 정맥내 투여된다.
당해 조성물은 투여량 제형 및 치료학적 유효량과 상용성인 방식으로 투여된다. 투여될 양과 시간은 치료하고자 하는 피검자, 활성 성분을 활용하는 피검자 시스템의 능력 및 목적하는 치료 효과도에 좌우된다. 투여될 활성 성분의 정확한 양은 개업의의 판단에 따라 결정되며 각 개인마다 다르다. 그러나, 전신 적용에 적합한 투여량 범위가 본원에 기술되어 있고 이는 투여 경로에 좌우된다. 적합한 투여 섭생이 다양할 수 있지만, 초기 투여 후 1시간 이상 간격으로 반복된 용량을 연속적으로 주입하거나 기타 투여하는 것이 전형적이다. 또 다른 방법으로는, 생체내 치료에 대해 구체화된 범위의 혈중 농도를 유지하기에 충분하게 연속적으로 정맥내 주입하는 것이 고려된다.
본 실시예에 입증된 바와 같이, 혈관 형성의 억제 및 종양 퇴화는 길항제와 초기 접촉한지 7일 후 정도로 빨리 일어난다. 길항제에 추가로 또는 연장해서 노출시키는 것은 7일 내지 6주, 바람직하게는 14일 내지 28일 동안이다.
관련 양태에 있어서, 본 실시예는 αⅴβ3의 억제와 αⅴβ3을 보유하는 신생혈관계에서의 어팝토시스의 유도간의 관계를 입증해준다. 따라서, 본 발명은 또한, 특정 조직의 신생혈관계에서의 어팝토시스를 억제하는 방법을 고려하고 있다. 이러한 방법은 모든 조직 및 이에 대해 기재된 상태에서 실질적으로 혈관 형성 억제에 관해 본원에 기술된 바와 같이 실시한다. 인지할 만한 유일한 차이는 효과 타이밍인데, 어팝토시스는 신속하게, 전형적으로는 길항제와 접촉한지 약 48시간 후에 나타나는 반면, 혈관 형성의 억제 및 종양 퇴화는 본원에 기술된 바와 같이 보다 느리게 나타난다. 이러한 차이는 투여 시간 측면에서의 치료 섭생, 및 목적하는 효과에 영향을 미친다. 전형적으로, 신생혈관계의 어팝토시스에 대한 투여는 24시간 내지 약 4주간 일 수 있지만, 48시간 내지 7일이 바람직하다.
D.치료학적 조성물
본 발명은 본원에 기술된 치료 방법을 실시하는데 유용한 치료학적 조성물을 고려하고 있다. 본 발명의 치료학적 조성물은 생리학적으로 허용되는 담체를, 활성 성분으로서 상기 담체 중에 용해되거나 분산된, 본원에 기술된 바와 같은 αⅴβ3길항제와 함께 함유한다. 바람직한 양태에 있어서, 치료학적 αⅴβ3길항제 조성물은 치료 목적으로 포유동물 또는 사람 환자에게 투여될 때 면역원성이 아니다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "약제학적으로 허용되는", "생리학적으로 허용되는" 및 이의 문법상 변형체는 이들 용어가 조성물, 담체, 희석제 및 시약을 지칭하기 때문에, 상호교환적으로 사용되며 상기 물질이 구토, 현기증, 배탈 등의 바람직하지 못한 생리학적 부작용을 야기시키지 않으면서 포유동물에게 투여될 수 있다는 것을 의미한다.
용해되거나 분산된 활성 성분을 함유하는 약리학적 조성물의 제조는 당해 분야에 널리 공지되어 있고 제형화 근거한 것으로 제한할 필요는 없다. 전형적으로, 이러한 조성물은 액상 용제 또는 현탁제와 같이 주사 가능한 제제로서 제조하지만, 사용하기에 앞서 액체 중의 용제 또는 현탁제에 적합한 고체 형태로 제조할 수 있다. 이러한 제제를 유화시킬 수도 있다.
활성 성분을 약제학적으로 허용되고 이러한 활성 성분과 상용성인, 본원에 기재된 치료 방법에 사용하기에 적합한 양의 부형제와 혼합할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 물, 식염수, 덱스트로즈, 글리세롤, 에탄올 등 및 이들의 배합물이 있다. 또한, 경우에 따라, 당해 조성물은 활성 성분의 유효성을 증진시키는 습윤제 또는 유화제, pH 완충제 등의 미량의 보조 물질을 함유할 수 있다.
본 발명의 치료학적 조성물은 본원에 기재된 성분의 약제학적으로 허용되는 염을 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 염으로는 염산 또는 인산 등의 무기산 또는 아세트산, 타르타르산, 만델산 등의 유기산과 형성되는 산 부가 염(폴리펩티드의 유리 아미노 그룹과 형성됨)이 있다. 유리 카복실 그룹과 형성된 염은, 예를 들면, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 수산화 제2철 등의 무기 염기, 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등의 유기 염기로부터 또한 유도할 수 있다.
사이클릭 폴리펩티드 αⅴβ3길항제의 제제에 사용될 때 특히 바람직한 것은 TFA와 HCl의 염이다. 펩티드의 대표적인 염이 본 실시예에 기재되어 있다.
생리학적으로 허용되는 담체는 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 액상 담체의 예는 활성 성분과 물 이외에는 어떠한 물질도 함유하지 않거나, 또는 인산나트륨과 같은 생리학적 pH 값의 완충제 또는 생리학적 식염수를 함유하거나 이들 둘 다, 예를 들면, 인산염 완충된 식염수를 함유하는 멸균 수용액이다. 추가로, 수성 담체는 하나 이상의 완충 염 뿐만 아니라 염화나트륨 및 염화칼륨 등의 염, 덱스트로즈, 폴리에틸렌 글리콜 및 기타 용질을 함유할 수 있다.
액상 조성물은 또한 물 이외에 및 물을 제외하고 액체 상을 함유할 수 있다. 이러한 부가의 액체 상의 예는 글리세린, 식물성 오일(예: 면실유) 및 수-오일 유액이다.
치료학적 조성물은 이러한 치료학적 조성물의 총 중량당 길항제를 0.1중량%의 양으로 함유하도록 전형적으로 제형화된, 혈관 형성 억제량의 본 발명에 따르는 αⅴβ3길항제를 함유한다. 중량%는 총 조성물 중량에 대한 억제제의 중량비이다. 따라서, 예를 들면, 0.1중량%는 총 조성물 100g 당 억제제 0.1g이다.
E.인테그린 α ⅴ β 3 의 길항제
αⅴβ3길항제는 조직에서 혈관 형성을 억제하기 위해 본 방법에 사용되며, 천연 αⅴβ3리간드와의 작용성 상호작용이 방해되는 방식으로 αⅴβ3와 상호반응하는 화합물을 포함하는 각종 형태를 취할 수 있다. 길항제의 예로는 αⅴβ3상의 리간드 결합 부위로부터 유도된 αⅴβ3의 동족체; αⅴβ3-리간드 결합 상호작용과 연관된 구조적 영역을 모사하는 αⅴβ3또는 αⅴβ3의 천연 리간드의 모사체; αⅴβ3에 대해 특이적인 천연 리간드의 작용성 결합 영역에 상응하는, 특히 αⅴβ3의 천연 리간드의 RGD-함유 영역에 상응하는 서열을 갖는 폴리펩티드; 및 αⅴβ3또는 천연 리간드와 면역반응되는 항체가 있으며, 이들 모두는 본원에 정의된 바와 같은 길항제 활성을 나타낸다.
1.폴리펩티드
한 양태에 있어서, 본 발명은 폴리펩티드 형태의 αⅴβ3길항제를 포괄한다. 폴리펩티드(펩티드) αⅴβ3길항제는 αⅴβ3-리간드 상호작용과 연관된 영역에서 αⅴβ3의 천연 리간드 또는 αⅴβ3자체의 서열 특징을 지닐 수 있으며 본원에 기술된 바와 같은 αⅴβ3길항제 활성을 나타낸다. 바람직한 αⅴβ3길항제 펩티드는 RGD 트리펩티드를 함유하고 서열이 이러한 RGD-함유 영역에서의 천연 리간드에 상응한다.
바람직한 RGD-함유 폴리펩티드는 피브리노겐, 비트로넥틴, 폰 빌레브란트 인자, 라미닌, 트롬보스폰딘 및 기타 리간드와 같은 αⅴβ3의 천연 리간드의 RGD-함유 영역의 아미노산 잔기 서열에 상응하는 서열을 갖는다. 이들 αⅴβ3리간드의 서열은 널리 공지되어 있다. 따라서, αⅴβ3길항제 펩티드는 어떠한 천연 리간드로부터 유도할 수 있지만, 피브리노겐 및 비트로넥틴이 바람직하다.
특히 바람직한 αⅴβ3길항제 펩티드는 앞서 기술된 바와 같이, 기타 인테그린과 비교해서 이의 천연 리간드(들)에 대한 αⅴβ3결합을 우선적으로 억제시킨다. 이들 αⅴβ3-특이적 펩티드는 적어도 αⅴβ3에 대한 특이성이 다른 인테그린의 억제와 같은 바람직하지 못한 부작용의 발생을 감소시키기 때문에 특히 바람직하다. αⅴβ3에 대한 특이성을 지닌 바람직한 αⅴβ3길항제 펩티드의 동정은 본 실시예에 기술된 ELISA 검정과 같은, 전형적인 결합 검정 억제에서 용이하게 동정될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 전형적으로 약 100개 이하의 아미노산 잔기, 바람직하게는 약 60개 이하의 아미노산 잔기, 더욱 바람직하게는 약 30개 이하의 아미노산 잔기를 포함한다. 펩티드는 선형 또는 사이클릭일 수 있으나, 특히 바람직한 펩티드는 사이클릭이다.
이러한 폴리펩티드가 약 100개 보다 많은 잔기를 갖는 경우, 이는 전형적으로, 본원에 기술된 바와 같이 융합 단백질 또는 이의 단백질 단편의 형태로 제공된다.
바람직한 사이클릭 및 선형 펩티드, 및 이의 명칭이 본 실시예의 표 1에 제시되어 있다.
주 폴리펩티드가 필요한 서열을 포함하고 본원에 기술된 바와 같은 검정에서 αⅴβ3길항제로서 작용할 수 있는 한은, 이러한 주 폴리펩티드가 αⅴβ3천연 리간드의 아미노산 잔기와 동일할 필요는 없다는 것을 인지해야 한다.
주 폴리펩티드에는 이러한 폴리펩티드가 αⅴβ3길항제인 한은 아미노산 잔기 서열이 본원에 나타낸 폴리펩티드의 어떠한 동족체, 단편 또는 화학적 유도체도 포함된다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드를 대상으로 하여 각종 변화, 즉 치환, 삽입 및 결실이 이루어질 수 있으며, 이러한 변화는 이의 사용에 있어서 특정한 이점을 제공해준다. 이에 관하여, 본 발명의 αⅴβ3길항제 폴리펩티드는 하나 이상의 변화가 이루어지고 본원에 규정된 하나 이상의 검정에서 αⅴβ3길항제로서 작용하는 능력을 보유하고 있는 것으로 인용된 펩티드의 서열과 동일하기보다는 이러한 서열에 상응한다.
따라서, 폴리펩티드는 아미드를 포함하는 펩티드 유도체, 단백질과의 접합체, 사이클릭 펩티드, 중합된 펩티드, 동족체, 단편, 화학적으로 변형된 펩티드 및 기타 유도체의 어떠한 각종 형태일 수 있다.
용어 "동족체"는 하나 이상의 잔기가 작용적으로 유사한 잔기로 보존적으로 치환되고 본원에 기술된 바와 같은 αⅴβ3길항제 활성을 나타내는, 본원에 구체적으로 제시된 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 잔기 서열을 갖는 모든 폴리펩티드를 포함한다. 보존적 치환의 예로는 이소루이신, 발린, 루이신 또는 메티오닌 등의 하나의 비-극성(소수성) 잔기로 치환하는 것; 아르기닌과 리신 사이, 글루타민과 아스파라긴 사이, 글리신과 세린 사이의 잔기를 하나의 극성(친수성) 잔기로 치환하는 것; 리신, 아르기닌 또는 히스티딘 등의 하나의 염기성 잔기로 치환하는 것; 또는 아스파르트산 또는 글루탐산 등의 하나의 산성 잔기로 치환하는 것이 있다.
용어 "보존적 치환"이란 비-유도체화 잔사 대신 화학적으로 유도체화된 잔기를 사용하는 것을 의미하는데, 단 폴리펩티드는 필요한 억제 활성을 나타내야 한다.
"화학적 유도체"는 작용성 측쇄 그룹의 반응에 의해 화학적으로 유도체화된 하나 이상의 잔기를 갖는 주 폴리펩티드를 지칭한다. 측쇄 그룹 유도체화 이외에, 화학적 유도체는 N-메틸, N-에틸, N-프로필 등의 α-아미노 치환, 및 티오에스테르, 티오아미드, 구아니디노 등의 α-카보닐 치환을 포함한 하나 이상의 주쇄 변형체를 지닐 수 있다. 이러한 유도체화된 분자로는 예를 들어, 유리 아미노 그룹을 유도체화하여 아민 하이드로클로라이드, p-톨루엔 설포닐 그룹, 카보벤족시 그룹, t-부틸옥시카보닐 그룹, 클로로아세틸 그룹 또는 포밀 그룹을 형성시킨 분자가 있다. 유리 카복실 그룹을 유도체화하여 염, 메틸 및 에틸 에스테르 또는 다른 유형의 에스테르 또는 하이드라자이드를 형성할 수 있다. 유리 하이드록실 그룹을 유도체화하여 O-아실 또는 O-알킬 유도체를 형성할 수 있다. 히스티딘의 이미다졸 질소를 유도체화하여 N-임벤질히스티딘을 형성할 수 있다. 또한 화학적 유도체에 포함되는 것은 20개 표준 아미노산의 천연 아미노산 유도체를 하나 이상 함유하는 펩티드이다. 예를 들면, 프롤린이 4-하이드록시프롤린으로 대체될 수 있고; 리신이 5-하이드록시리신으로 대체될 수 있으며; 히스티딘이 3-메틸히스티딘으로 대체될 수 있고; 세린이 호모세린으로 대체될 수 있으며; 리신이 오르니틴으로 대체될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드에는 또한, 필수 활성이 유지되는 한은, 본원에 제시된 서열을 갖는 폴리펩티드의 서열에 비해 하나 이상의 첨가 및/또는 결실 잔기를 갖는 어떠한 폴리펩티드도 포함된다.
특히 바람직한 유도체는 c(RGDf-NMeV)로 약칭된 사이클로(Arg-Gly-Asp-D-Phe-NMeVal)에 따른 사이클릭 펩티드이며, 여기에서 상기 펩티드의 발린 잔사 상에 N-메틸 치환된 α-아미노 그룹이 존재하며 폐환 반응은 펩티드의 1급 아미노와 카복시 말단을 결합시킨다.
용어 "단편"은 아미노산 잔기 서열이 본원에 제시된 폴리펩티드의 것 보다 짧은 아미노산 잔기 서열을 갖는 모든 주 폴리펩티드를 지칭한다.
본 발명의 폴리펩티드가 αⅴβ3천연 리간드의 서열과 동일하지 않는 서열을 갖는 경우, 이는 전형적으로, 하나 이상의 보존적 또는 비-보존적 치환이 이루어졌기 때문이고, 통상적으로 아미노산 잔기의 약 30수% 이하, 바람직하게는 10수% 이하가 치환된다. "링커"를 제공함으로써 본 발명의 폴리펩티드가 라벨 또는 고체 매트릭스 또는 담체에 편리하게 부착될 수 있게 할 목적으로, 폴리펩티드의 어느 한 말단에 부가의 잔기를 가할 수도 있다.
본 발명의 폴리펩티드와 함께 사용될 수 있는 라벨, 고체 매트릭스 및 담체는 다음에 기술된다.
아미노산 잔기 링커는 통상적으로 하나 이상의 잔기이며 40개 이상의 잔기, 보다 종종은 1 내지 10개 잔기일 수 있지만, αⅴβ3리간드 에피토프를 형성하지는 않는다. 링커에 사용된 전형적인 아미노산 잔기는 티로신, 시스테인, 리신, 글루탐산 및 아스파르트산 등이다. 또한, 주 폴리펩티드는 달리 언급하지 않는다면, αⅴβ3리간드의 천연 서열과는 상이할 수 있는데, 이러한 서열은 말단-NH2아실화, 예를 들면, 아세틸화 또는 티오글리콜산 아미드화, 예를 들어 암모니아, 메틸아민을 이용한 말단 카복실아미드화, 및 기타 말단 변형에 의해 변형되어진다. 말단 변형은 널리 공지된 바와 같이, 프로테이나제 분해에 의한 감수성을 감소시키는데 유용하므로 용액중, 특히 프로테이나제가 존재할 수 있는 생물학적 유체 중에서의 당해 폴리펩티드의 반감기를 연장시키는 작용을 한다. 이에 관하여, 폴리펩티드 폐환이 또한 유용한 말단 변형이고, 폐환 반응에 의해 형성된 안정한 구조와 본원에 기술된 바와 같은 사이클릭 펩티드에 대해 관찰된 생물학적 활성 측면에서 보면 상기 폐환이 특히 바람직하다.
본 발명의 어떠한 펩티드도 약제학적으로 허용되는 염의 형태로 사용할 수 있다. 본 발명의 펩티드와 염을 형성할 수 있는 적합한 산으로는 트리플루오로아세트산(TFA), 염산(HCl), 수소화브롬산, 과염소산, 질산, 티오시안산, 황산, 메탄 설폰산, 아세트산, 인산 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 락트산, 피루브산, 옥살산, 말론산, 석신산, 말레산, 푸마르산, 안트라닐산, 신남산, 나프탈렌 설폰산, 설파닐산 등의 무기산이 있다. HCl 및 TFA 염이 특히 바람직하다.
본 발명의 펩티드와 염을 형성할 수 있는 적합한 염기로는 수산화나트륨, 수산화암모늄, 수산화칼륨 등의 무기 염기; 및 모노-, 디- 및 트리-알킬 및 아릴 아민(예: 트리에틸아민, 디이소프로필 아민, 메틸 아민, 디메틸 아민 등) 및 임의로 치환된 에탄올아민(예: 에탄올아민, 디에탄올아민 등) 등의 유기 염기가 있다.
또한, 본 발명의 펩티드는 아미노산 잔기 측쇄 그룹(예: Arg, Asp 등)에 존재하는 전하를 띤 산 또는 염기 그룹이 서로 연합되고 중화되어 "내부 염" 화합물을 형성시키는 유리 이온성 염을 포함하지 않으면서도 본 실시예에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다.
본원에서 주 폴리펩티드로서 지칭된 본 발명의 펩티드는 재조합 DNA 기술을 포함하여, 폴리펩티드 분야의 숙련인에게 공지된 어떠한 기술에 의해서도 합성할 수 있다. 고체상 메리필드형 합성과 같은 합성 화학 기술이 순도, 항원 특이성, 바람직하지 못한 부산물 부재, 제조 용이성 등의 이유로 인해 바람직하다. 이용되고 있는 많은 기술에 관한 탁월한 요약이 문헌[참조:Steward et al., "Solid Phase Peptide Synthesis", W.H. Freeman Co., San Francisco, 1969; Bodanszky, et al., "Peptide Synthesis", John Wiley ＆ Sons, Second Edition, 1976; J. Meienhofer, "Hormonal Proteins and Peptides", Vol. 2, p.46, Academic Press(New York), 1983; Merrifield,Adv. Enzymol., 32:221-96, 1969; Fields et al.,Int. J. Peptide Protein Res., 35:161-214, 1990; 및 고체상 펩티드 합성에 대한 미국 특허 제4,244,946호 및 전통적인 용액 합성에 대한 Schroder et al., "The Peptides", Vol. 1, Academic Press(New York), 1965; 이들 모든 문헌은 본원에 참조문헌으로 삽입되어 있다]에 발견될 수 있다. 이러한 합성에 사용될 수 있는 적절한 보호 그룹은 상기 문헌 및 문헌[J.F.W. McOmie, "Protective Groups in Organic Chemistry", Plenum Press, New York, 1973; 이는 본원에 참조문헌으로 삽입된다]에 기재되어 있다.
일반적으로, 고려된 고체 상 합성 방법은 증대하는 펩티드 쇄에 하나 이상의 아미노산 잔기 또는 적합하게 보호된 아미노산 잔기를 일련으로 첨가하는 것을 포함한다. 정상적으로, 첫 번째 아미노산 잔기의 아미노 또는 카복실 그룹을 선택적으로 제거 가능한 적합한 보호 그룹에 의해 보호시킨다. 선택적으로 제거 가능한 상이한 보호 그룹을 리신과 같은 반응성 측쇄 그룹을 함유하는 아미노산에 대해 이용한다.
한 예로서 고체 상 합성을 사용하는 경우, 보호되거나 유도체화된 아미노산을 이의 보호되지 않은 카복실 또는 아미노 그룹을 통하여 내부 고체 지지체에 부착시킨다. 이어서, 아미노 또는 카복실 그룹의 보호 그룹을 선택적으로 제거시키고 적합하게 보호된 우대(아미노 또는 카복실) 그룹을 갖는 서열에서 다음 아미노산을 혼합하고 이미 고체 지지체에 부착된 잔사와 아미드 결합을 형성하기에 적합한 조건 하에서 반응시킨다. 이어서, 아미노 또는 카복실 그룹의 보호 그룹을 이와 같이 새로이 첨가된 아미노산 잔기로부터 제거한 다음, 다음 아미노산(적합하게는 보호된)을 가하고, 이를 반복한다. 목적하는 모든 아미노산을 적당한 순서로 연결시킨 후, 잔존하는 모든 말단과 측쇄 보호 그룹( 및 고체 지지체)를 연속적으로 또는 동시에 제거하여 최종 선형 폴리펩티드를 수득한다.
예를 들어 앞서 언급된 바와 같이 제조된 선형 폴리펩티드를 반응시켜 이의 상응하는 사이클릭 펩티드를 형성할 수 있다. 사이클릭 펩티드를 제조하는 방법의 예가 문헌[참조:Zimmer et al.,Peptides 1992, pp.393-394, ESCOM Science Publishers, B.V., 1993]에 기재되어 있다. 전형적으로, 3급 부톡시카보닐 보호된 펩티드 메틸 에스테르를 메탄올에 용해시키고 수산화나트륨 용액을 가한 다음, 이 혼합물을 20℃에서 반응시켜 메틸 에스테르 보호 그룹을 가수분해적으로 제거한다. 용매를 증발시킨 후, 3급 부톡시카보닐 보호된 펩티드를 산성화된 수성 용매로부터 에틸 아세테이트로 추출한다. 이어서, 3급 부톡시카보닐 보호 그룹을 디옥산 보조용매 중에서 순하게 산성 조건하에서 제거한다. 이로써 수득된 유리 아미노 및 카복시 말단을 갖는 보호되지 않은 선형 펩티드를, 디클로로메탄과 디메틸포름아미드의 혼합물 중의 상기 선형 펩티드의 묽은 용액을 1-하이드록시벤조트리아졸 및 N-메틸모르폴린의 존재 하에서 디사이클로헥실카보디이미드와 반응시킴으로써 이의 상응하는 사이클릭 펩티드로 전환시킨다. 이어서, 이로써 생성된 사이클릭 펩티드를 크로마토그래프에 의해 정제시킨다.
또 다른 사이클릭 펩티드 합성 방법이 문헌[참조:Gurrath et al.,Eur. J. Biochem., 210:911-921(1992)] 및 본 실시예에 기재되어 있다.
또한, αⅴβ3길항제는 융합 단백질의 형태로 제공될 수 있다. 융합 단백질은 주 폴리펩티드가 글루타티온 설프하이드릴 트랜스퍼라제(GST) 또는 기타 널리 공지된 담체 등의 제2 담체 단백질과의 융합물로서 발현되는, 본원에 기재된 재조합 DNA 방법에 의해 생성된 단백질이다. 바람직한 융합 단백질은 본원에 기재된 MMP-2 폴리펩티드를 포함한다. MMP-2 융합 단백질의 제조가 본 실시예에 기재되어 있다.
본 발명의 방법에 사용하기에 특히 바람직한 펩티드 및 유도체는 c-(GrGDFV)(서열 4), c-(RGDfV)(서열 5), c-(RADfV)(서열 6), c-(RGDFv)(서열 7), c-(RGDf-NMeV)(서열 15) 및 선형 펩티드 YTAECKPQVTRGDVF(서열 8)(여기서, "c-"는 사이클릭 펩티드를 지시하고, 대문자는 L-아미노산에 대한 단일 문자 코드이고 소문자는 D-아미노산에 대한 단일 문자 코드이다)이다. 이들 펩티드의 아미노산 잔기 서열이 또한 서열 4, 5, 6, 7, 15 및 8에 각각 제시되어 있다.
서열 17 내지 28 및 45에 제시된 서열을 갖는, 본원에 기재된 MMP-2로부터 유도된 폴리펩티드가 또한 바람직하다.
2.모노클로날 항체
본 발명은 한 양태에 있어서, 본원에 기재된 바와 같이 αⅴβ3와 면역반응되고 이의 천연 리간드에 대한 αⅴβ3결합을 억제시키는 모노클로날 항체 형태의 αⅴβ3길항제를 기술하고 있다. 본 발명은 또한, 이러한 항체를 생산하는 세포주, 이러한 세포주의 생산 방법, 및 모노클로날 항체의 제조 방법을 기술하고 있다.
본 발명의 모노클로날 항체는 1) 분리된 αⅴβ3와 면역반응되고 2) αⅴβ3에 대한 피브리노겐 결합을 억제시키는 항체 분자를 포함한다. αⅴβ3와 우선적으로 결합되는 바람직한 모노클로날 항체로는 하이브리도마 세포주 ATCC HB 9537에 의해 분비된 mAb LM609의 면역반응 특징을 지니고 있는 모노클로날 항체가 있다. 이러한 하이브리도마 세포주 ATCC HB 9537은 부다페스트 조약에 따라서 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC)에 1987년 9월 15일 자로 기탁되었다.
각종 문법상 형태의 용어 "항체 또는 항체 분자"는 면역글로불린 분자 집단 및/또는 면역글로불린 분자의 면역학적 활성 분획, 즉 항체 조합 부위 또는 파라토프를 함유하는 분자를 지칭하는 집합 명사로서 사용된다.
"항체 조합 부위"는 항원을 특이적으로 결합시키는 중쇄 및 경쇄 가변 및 과도 가변 영역으로 구성된 항체 분자의 구조적 부분이다.
본 발명에 사용하기 위한 항체의 예는 본래의 면역글로불린 분자, 실질적으로 본래의 면역글로불린 분자, 및 당해 분야에서 Fab, Fab', F(ab')2및 F(v)로서 공지되고 또한 항체 단편으로서 지칭된 분획을 포함하여, 파라토프를 함유하는 면역글로불린 분자의 분획이다.
또 다른 바람직한 양태에 있어서, 본 발명은 본 발명의 모노클로날 항체로부터 유도된 Fab 단편을 포함하는 절단된 면역글로불린 분자를 고려하고 있다. Fc 수용체가 결여된 Fab 단편은 가용성이며 혈청 반감기 측면에서 치료학적 이점을 부여해주고 가용성 Fab 단편을 사용하는 모드에서 진단상의 이점을 부여해준다. 가용성 Fab 단편의 제조는 일반적으로 면역학적 분야에서 공지되어 있고 각종 방법에 의해 달성할 수 있다.
예를 들면, 항체의 Fab 및 F(ab')2분획(단편)은 널리 공지된 방법에 의해 실질적으로 본래의 항체 상에서 파파인 및 펩신 각각의 단백질 분해적 반응에 의해 제조한다[예를 들어, 미국 특허 제4,342,566호(Theofilopolous and Dixon) 참조]. Fab' 항체 분획 또한 널리 공지되어 있고 이는 2개의 중쇄 분획을 연결하는 디설파이드 결합을 머캅토에탄올로 환원시킨 다음, 이로써 생성된 단백질 머캅탄을 요오도아세트아미드 등의 시약으로 알킬화시킴으로써, F(ab')2분획으로부터 제조한다. 본래의 면역글로불린 분자를 함유하는 항체가 바람직하며 본원에서 그 예로서 이용된다.
이의 각종 문법상 형태에서의 용어 "모노클로날 항체"는 특정한 에피토프와 면역반응할 수 있는 단지 한 종류의 항체 조합 부위만을 함유하는 항체 분자 집단을 지칭한다. 따라서, 모노클로날 항체는 전형적으로, 면역반응되는 어떠한 에피토프에 대해서도 단일의 결합 친화도를 나타낸다. 따라서, 모노클로날 항체는 다수의 항체 조합 부위(각각은 상이한 에피토프에 대해 면역특이적이다)를 갖는 항체 분자를 포함하며, 예를 들면, 이중 특이적 모노클로날 항체이다.
모노클로날 항체는 전형적으로, 단지 한 종류의 항체 분자만을 분비(생성)하는 하이브리도마로 불리우는 단일 세포의 클론에 의해 생성된 항체로 구성된다. 이러한 하이브리도마 세포는 항체 생성 세포와 골수종 또는 기타 자가-영속성 세포주를 융합시킴으로써 형성된다. 이러한 항체의 제조는 본원에 참조문헌으로 삽입된 문헌[Kohler and Milstein, Nature 256:495-497(1975)]에 처음으로 기재되었다. 부가의 방법이 문헌[참조:Zola,Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc.(1987)]에 기재되어 있다. 이로써 제조된 하이브리도마 상등액을 αⅴβ3와 면역반응되는 항체 분자의 존재에 대해 그리고 천연 리간드에 대한 αⅴβ3결합 억제에 대해 스크리닝할 수 있다.
간략하게 언급하면, 모노클로날 항체를 생성시키는 하이브리도마를 형성하기 위하여, 골수종 또는 기타 자가-영속성 세포주를, 문헌[참조:Cheresh et al.,J. Biol. Chem., 262:17703-17711(1987)]에 기재된 바와 같이 M21 사람 흑색종 세포로부터 분리된 αⅴβ3과 같은, αⅴβ3의 공급원으로 과도하게 면역시킨 포유동물의 비장으로부터 수득된 임파구와 융합시킨다.
하이브리도마를 제조하기 위해 사용된 골수종 세포주가 임파구와 동일한 종으로부터 기원된 것이 바람직하다. 전형적으로, 균주 129 GlX+의 마우스가 바람직한 포유동물이다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 마우스 골수종 세포주로는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(Rockville, MD)으로부터 각각 CRL 1580 및 CRL 1581이란 명칭으로 입수 가능한 하이포크산틴-아미노프테린-티미딘-민감성(HAT) 세포주 P3X63-Ag8.653, 및 Sp2/0-Ag14가 있다.
비장 세포를 전형적으로, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 1500을 사용하여 골수종 세포와 융합시킨다. HAT에 대한 민감도에 의해 융합된 하이브리드를 선별한다. 본 발명의 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마는 본 실시예에 기재된 효소 연결된 면역흡착 검정(ELISA)을 이용하여 동정한다.
본 발명의 모노클로날 항체는 적당한 특이성의 항체 분자를 분비하는 하이브리도마를 함유하는 영양 배지를 포함하는 모노클로날 하이브리도마 배양을 개시함으로써 생성시킬 수 있다. 이러한 배양은 하이브리도마가 항체 분자를 상기 배지 내로 분비시키기에 충분한 시간 및 조건 하에 유지시킨다. 이어서, 항체 함유 배지를 수집한다. 이어서, 널리 공지된 기술에 의해 항체 분자를 추가로 분리시킬 수 있다.
이들 조성물의 제조에 유용한 배지는 모두 당해 분야에 널리 공지되어 있고 시판중이며 이의 예로는 합성 배양 배지, 근친 교배된 마우스 등이 있다. 합성 배지의 예는 4.5g/l 글루코즈, 20mM 글루타민 및 20% 송아지 태아 혈청이 보충된 둘벡코 최소 필수 배지(DMEM; Dulbecco et al.,Virol, 8:396, 1959]이다. 근친 교배된 마우스 균주의 예는 Balb/c이다.
모노클로날 항체, 하이브리도마 세포 또는 하이브리도마 세포 배양물을 제조하는 기타 방법이 또한 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[참조:Sastry et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:5728-5732(1989); and Huse et al.,Science, 246:1275-1281(1989)]에 기재된 바와 같은 면역학적 레파토리로부터 모노클로날 항체를 분리하는 방법을 참조하기 바란다.
또한 본 발명에 의해 고려되는 것은 하이브리도마 세포, 및 본 발명의 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 함유하는 배양물이다. ATCC HB 9537로 명명된 모노클로날 항체 mAb LM609를 분비하는 하이브리도마 세포주가 특히 바람직하다. mAb LM609는 문헌[참조:Cheresh et al.,J. Biol. Chem., 262:17703-17711]에 기재된 바와 같이 제조하며 이의 제조는 또한 본 실시예에 기재되어 있다.
본 발명은 한 양태에 있어서, mAb LM609의 면역반응 특징을 지니고 있는 모노크로날 항체를 고려하고 있다.
과도한 실험 없이도, 특정 모노클로날 항체가 본 발명의 모노클로날 항체와 동일한(즉, 등가의) 특이성(면역반응 특징)을 지니는 지를 결정하는 것은 전자 모노클로날 항체가 후자 모노클로날 항체가 예비선택된 표적 분자에 결합되는 것을 방지하는 지를 확인함으로써 가능할 수도 있다. 고체 상에 존재할 때 표적 분자에 대한 결합에 관한 표준 경쟁 검정에서 본 발명의 모노클로날 항체에 의한 결합 감소로 나타낸 바와 같이, 시험되는 모노클로날 항체가 본 발명의 모노클로날 항체와 경쟁하는 경우에는, 이러한 2가지 모노클로날 항체가 동일하거나 밀접하게 관련된 에피토프에 결합되는 것으로 여겨진다.
특정 모노클로날 항체가 본 발명의 모노클로날 항체의 특이성을 지니고 있는 지를 결정하는 또 다른 방법은 본 발명의 모노클로날 항체를 이와 정상적으로 반응되는 표적 분자와 함께 예비-배양한 다음, 시험되는 모노클로날 항체를 가하여 시험되는 모노클로날 항체가 상기 표적 분자와 결합하는 능력이 억제되었는지를 결정하는 것이다. 시험되는 모노클로날 항체가 억제되면, 모든 경우에 있어서, 이는 본 발명의 모노클로날 항체와 동일하거나 작용적으로 등가인 에피토프 특이성을 지닐 가능성이 있다.
특정 모노클로날 항체가 본 발명에 따른 모노클로날 항체의 특이성을 지니고 있는지를 결정하는 부가의 방법은 문제의 항체의 CDR 영역의 아미노산 잔기 서열을 결정하는 것이다. 이들의 CDR 영역에서 동일하거나 작용적으로 등가의 아미노산 잔기 서열을 갖는 항체 분자는 동일한 결합 특이성을 지니고 있다. 폴리펩티드를 서열화하는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다.
항체의 면역특이성, 이의 표적 분자 결합 능력, 및 항체가 에피토프에 대해 나타내는 부수의 친화도는 항체가 면역반응되는 에피토프에 의해 규정된다. 에피토프 특이성은 적어도 부분적으로는, 항체 면역글로불린의 중쇄 가변 영역의 아미노산 잔기 서열에 의해 규정되고 부분적으로는, 경쇄 가변 영역 아미노산 잔기 서열에 의해 규정된다.
용어 "결합 특이성을 갖는"의 사용은 등가의 모노클로날 항체가 동일하거나 유사한 면역반응(결합) 특징을 나타내고 예비선택된 표적 분자와의 결합에 대해 경쟁한다는 것을 지시한다.
인간화 모노클로날 항체는 특히 이들이 사람에서 치료학적으로 사용될 수 있는 한은 쥐의 모노클로날 항체에 비해 특정한 이점을 부여해준다. 구체적으로 언급하면, 사람 항체는 "외래" 단백질 만큼 신속하게 순환되지 않고 외래 단백질 및 외래 항체와 동일한 방식으로 면역 시스템을 활성화시키지 않는다. "인간화" 항체의 제조 방법은 일반적으로 당해 분야에 널리 공지되어 있고 본 발명의 항체에 용이하게 적용할 수 있다.
따라서, 본 발명은 한 양태에 있어서, 항원을 결합시키는 항체의 능력을 실질적으로 방해하지 않으면서도 사람 면역 시스템의 성분들을 도입하기 위해 이식시킴으로써 인간화시킨 본 발명의 모노클로날 항체를 고려하고 있다.
3.α ⅴ β 3 -특이적 모사체
본 발명은 αⅴβ3길항제가 일반적으로 본 발명에 사용될 수 있고 이러한 길항제에는 αⅴβ3기능을 방해하는 능력을 지니고 있는, 폴리펩티드, 항체 및 "모사체"로 명명된 기타 분자가 포함될 수 있다. αⅴβ3기능을 특이적으로 방해하고 다른 인테그린의 기능을 방해하지 않는 길항제가 특히 바람직하다.
이와 같은 맥락에서, 각종 시약이 필요한 생물학적 활성을 지니고 있는 한은 이들 시약이 본 발명의 방법에서 사용하기에 적합할 수 있다는 것이 인지된다. 이들 시약은 일반적으로 모사체로 지칭되는데, 이는 이들이 수용체와 리간드의 작용성 상호작용과 관련된 αⅴβ3리간드 또는 αⅴβ3상의 결합 영역을 "모사"하는 능력을 보유하고 있음으로써 정상적인 기능을 방해(즉, 억제)하기 때문이다.
αⅴβ3모사체는 상기 언급된 성질을 나타내는, 항체 또는 리간드-유도된 펩티드 이외의 모든 분자이다. 이는 합성 펩티드, 펩티드의 동족체 또는 유도체, 유기 모사 분자와 같이 상기 언급된 결합 영역의 결합 포켓과 유사한 외형의 화합물, 또는 기타 분자일 수 있다.
본 발명의 바람직한 모사체는 유기계 분자이므로 유기 모사체로 지칭된다. αⅴβ3의 리간드에 대한 모사체로 존재함으로써 αⅴβ3길항제로서 작용하는데 특히 바람직한 유기 모사체 분자는 실시예 10에 기재된 바와 같은 화합물 7, 9, 10, 12, 14, 15, 16, 17 및 18이다.
αⅴβ3모사체의 고안은 분자 모델링, 2차원 핵자기 공명(2-D NMR) 분석, X선 결정학, 펩티드, 펩티드 동족체 또는 기타 화학적 중합체 또는 화합물 라이브러리의 랜덤 스크리닝, 및 기타 약물 고안 방법을 포함하여, 당해 분야에 공지된 약물-고안을 위한 각종 구조적 분석 방법 중의 어떠한 것에 의해서도 수행할 수 있다.
αⅴβ3길항제가, αⅴβ3을 선택적으로 억제하는 작용성 특성을 공유하는 다양하게 상이한 화학적 구조인, 융합 폴리펩티드(예를 들어, MMP-2 융합 단백질), 작은 폴리펩티드, 사이클릭 펩티드, 유도체 펩티드, 유기 모사체 분자 또는 모노클로날 항체일 수 있다는 것을 보여주는 본원 명세서에 제시된 광범위한 구조적 증거 측면에서 보면, 본 발명의 방법에 유용한 주 αⅴβ3길항제의 구조가 그렇게 제한될 필요는 없지만, 본원에 기재된 바와 같은 모든 αⅴβ3모사체는 이에 포함된다.
F.α ⅴ β 3 길항제의 동정 방법
본 발명은 또한 본 발명의 방법에 따라서 사용하기 위한 후보 αⅴβ3길항제를 동정하기 위한 검정 방법을 기술하고 있다. 이들 검정 방법에서는 이들 후보 분자를 대상으로 하여 이들의 천연 리간드에 대한 αⅴβ3결합 억제 능력에 대해 평가하고, 추가로 특정 조직에서의 혈관 형성을 억제하는 이들의 능력에 대해 평가한다.
첫 번째 검정은 αⅴβ3에 대한 천연 리간드의 직접적인 결합을 측정하는 것이고 이의 바람직한 양태가 본 실시예에 상세히 기재되어 있다. 이러한 검정은 전형적으로, ELISA에 의한 고체 상에서 분리된 αⅴβ3에 대한 천연 리간드(예: 피브리노겐)의 결합 억제도를 측정한다.
본 검정을 사용하여 αⅴβ3에 대해 특이성을 나타내고 천연 리간드가 다른 인테그린과 결합하는 것을 방해하지 않는 화합물을 동정할 수 있다. 특이성 검정은 αⅴβ3와 기타 인테그린 모두를 대상으로 하여 천연 리간드와 결합하는 이들 각각의 능력과 예비선택된 리간드와 결합되는 상기 인테그린 각각의 능력을 억제하는 후보 화합물에 대해 알아보기 위해 이들을 별개의 검정 챔버에서 동시에 스크리닝하는, 병행식 ELISA 검정법을 실시함으로서 수행한다. 바람직한 스크리닝 검정 포맷이 본 실시예에 기재되어 있다.
두 번째 검정은 병아리 융모요막(CAM)에서의 혈관 형성을 측정하고 이는 CAM 검정으로 지칭된다. 이러한 CAM 검정은 기타 문헌에 상세히 기재되어 있으며 추가로 이를 사용하여 종양 조직의 혈관 형성과 신생혈관화 모두를 측정하였다[참조:Ausprunk et al.,Am. J. Pathol., 79:597-618(1975) and Ossonski et al.,Cancer Res., 40:2300-2309(1980)].
상기 CAM 검정은 생체내 혈관 형성에 대해 널리 인식된 검정 모델인데, 이는 완전한 조직의 신생혈관화가 발생되고 실제적인 병아리 배아 혈관이 CAM 내로 또는 CAM 상에서 성장하는 조직 내로 증대되기 때문이다.
본원에서 입증된 바와 같이, CAM 검정은 새로운 혈관 성장 정도와 양을 근거로 한 신생혈관화의 억제를 예시해준다. 추가로, 종양 조직과 같이, CAM 상에 이식된 어떠한 조직의 성장도 모니터하는 것이 용이하다. 최종적으로, 상기 검정은 이러한 검정 시스템 내에 독성에 대한 내부 제어가 있기 때문에 특히 유용하다. 병아리 배아를 모든 시험용 시약에 노출시키므로, 배아의 건강 상태가 독성에 대한 지표가 된다.
혈관 형성을 측정하는 세 번째 검정은 생체내 래빗 안구 모델이고 이는 래빗 안구 검정으로 지칭된다. 이러한 래빗 안구 검정은 기타 문헌에 상세히 기술되어 있으며 추가로 이를 사용하여 탈리도마이드 등의 혈관 형성 억제제의 존재 하에서 혈관 형성과 신생혈관화 모두를 측정하였다[참조:D'Amato et al.,Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91:4082-4085(1994)].
이러한 래빗 안구 검정은 생체내 혈관 형성에 대해 널리 인식된 검정 모델인데, 이는 각막 가장자리로부터 각막 내로 증대되는 래빗 혈관에 의해 예시된 신생혈관화 과정이 안구의 천연적으로 투명한 각막을 통하여 용이하게 가시화되기 때문이다. 부가적으로, 신생혈관화의 자극 또는 억제 정도와 양, 또는 신생혈관화의 퇴화 정도와 양 모두는 시간에 따라 용이하게 모니터할 수 있다.
최종적으로, 래빗을 모든 시험용 시약에 노출시키므로, 래빗의 건강 상태가 시험용 시약의 독성에 대한 지표가 된다.
네 번째 검정은 키메릭 마우스:사람 마우스 모델에서의 혈관 형성을 측정하는 것이고 이는 키메릭 마우스 검정으로 지칭된다. 이러한 검정은 기타 문헌에 상세히 기술되어 있으며 추가로, 종양 조직의 혈관 형성, 신생혈관화 및 퇴화를 측정하는 것으로 본원에 기재되어 있다[참조:Yan et al.,J. Clin. Invest., 91:986-996(1993)]. 키메릭 마우스 검정은 생체내 혈관 형성에 대해 유용한 검정 모델인데, 이는 이식된 피부 이식체가 정상적인 사람 피부와 조직학적으로 상당히 밀접하게 닮고 완전한 조직의 신생혈관화가 발생되기 때문이며, 여기서는 실제적인 사람 혈관이 이식된 사람 피부로부터 이식된 사람 피부 표면의 사람 종양 조직 내로 성장하게 된다. 사람 이식체로의 신생혈관화의 기원은 신생맥관계를 사람-특이적 내피 세포 마아커로 면역조직화학적 염색시킴으로써 입증될 수 있다.
본원에서 입증된 바와 같이, 키메릭 마우스 검정은 새로운 혈관 성장의 퇴화 정도와 양 모두를 근거로 한 신생혈관화의 퇴화를 입증해준다. 추가로, 종양 조직과 같이, 이식된 피부 상에 이식된 어떠한 조직의 성장에 대한 효과도 모니터하는 것이 용이하다. 최종적으로, 상기 검정은 이러한 검정 시스템 내에 독성에 대한 내부 제어가 있기 때문에 특히 유용하다. 키메릭 마우스를 모든 시험용 시약에 노출시키므로, 마우스의 건강 상태가 독성에 대한 지표가 된다.
G. 제품
본 발명은 또한, 본 발명의 αⅴβ3길항제를 제공하기 위한, 표지된 용기 형태의 제품을 고려하고 있다. 제품은 패키징 재료와 이러한 패키징 재료 내에 함유된 약제학적 제제를 포함한다.
제품 내의 약제학적 제제는 기재된 지시에 따라서 본원에 기재된 바와 같이 약제학적으로 허용되는 형태로 제형화된, 본 발명에 따른 모든 αⅴβ3길항제이다. 이러한 제품은 단위 용량 또는 수회 용량으로 본원에 지시된 질환을 치료하는데 사용하기에 충분한 양의 약제학적 제제를 함유한다.
상기 패키징 재료는 예를 들어, 혈관 형성을 억제함으로써 도움을 받는 질환 및 본원에 기재된 기타 질환을 치료하기 위하여 이에 함유된 약제학적 제제의 용도를 지시해주는 라벨을 포함한다. 이러한 라벨은 마케팅에 필요할 수도 있는 사용 및 관련 정보에 대한 지시 사항을 추가로 포함할 수 있다. 패키징 재료에는 약제학적 제제를 저장하기 위한 용기(들)가 포함될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 패키징 재료는 특정 약제학적 제제를 고정된 수단 내에 유지시킬 수 있는 유리, 플라스틱, 종이, 호일 등의 재료를 지칭한다. 따라서, 예를 들면, 이러한 패키징 재료는 상기 약제학적 제제를 포함하는 약제학적 조성물을 함유하도록 사용된 플라스틱 또는 유리 바이알, 적층된 엔벨로프 및 기타 용기일 수 있다.
바람직한 양태에 있어서, 패키징 재료에는 제품의 내용물과 이 안에 함유된 약제학적 제제의 용도를 기술하는 실체적인 표현인 라벨이 포함된다.
본 발명에 관한 다음 실시예는 본 발명을 예시하는 것이지 본 발명을 구체적으로 제한하고자 하는 것은 아니다. 더욱이, 당해 분야의 숙련인의 이해 범위 내인, 현재 공지되거나 나중에 밝혀질 본 발명의 각종 변화 역시 나중에 청구되는 본 발명의 범위 내에 속하는 것으로 간주되어야 한다.
1.합성 펩티드의 제조
a.합성 과정
표 1에 열거된 선형 및 사이클릭 폴리펩티드를, 예를 들면, 문헌[참조:Merrifield,Adv. Enzymol., 32:221-96(1969), and Fields, G.B. and Noble, R.L.,Int. J. Peptide Protein Res., 35:161-214(1990)]에 기재된 바와 같은 표준 고체 상 합성 기술을 사용하여 합성한다.
BOC-Gly-D-Arg-Gly-Asp-Phe-Val-OMe(서열 1) 2g을 먼저 메탄올 60ml에 용해시키고 이에 2N 수산화나트륨 용액 1.5ml를 가하여 혼합물을 형성시킨다. 이어서, 상기 혼합물을 20℃에서 3시간 동안 교반시킨다. 증발 후, 잔사를 물에 흡수시키고, 희석된 HCl을 사용하여 pH 3으로 산성화한 다음 에틸 아세테이트로 추출한다. 이러한 추출물을 Na2SO4로 건조시키고, 다시 증발시킨 다음, 이로써 생성된 BOC-Gly-D-Arg-Gly-Asp-Phe-Val-OH(서열 2)를 디옥산 중의 2N HCl 20ml와 함께 20℃에서 2시간 동안 교반시킨다. 생성된 혼합물을 증발시켜 H-Gly-D-Arg-Gly-Asp-Phe-Val-OH(서열 3)을 수득하고, 이를 연속적으로 디클로로메탄 1800ml와 디메틸포름아미드(DMF) 200ml의 혼합물에 용해시킨 다음 0℃로 냉각시킨다. 그 후, 디사이클로헥실카보디이미드(DCCI) 0.5g, 1-하이드록시벤조트리아졸(HOBt) 0.3g 및 N-메틸모르폴린 0.23ml를 교반시키면서 연속적으로 가한다.
이로써 생성된 혼합물을 0℃에서 24시간 더 교반시킨 다음 20℃에서 48시간 더 교반시킨다. 용액을 농축시키고 혼합 상 이온 교환체로 처리하여 이로부터 염을 제거한다. 이로써 생성된 수지를 여과시켜 제거한 후, 정화된 용액을 증발시키고 잔사를 크로마토그래피하여 정제하여 사이클로(-Gly-D-Arg-Gly-Asp-Phe-Val)(서열 4)를 회수한다. 단일 문자 코드 아미노산 잔기 약칭을 사용하여 표 1에 열거되고 펩티드 번호명으로 동정된 다음 펩티드가 유사하게 수득되었다: 사이클로(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val)(서열 5); 사이클로(Arg-Ala-Asp-D-Phe-Val)(서열 6); 사이클로(Arg-D-Ala-Asp-Phe-Val)(서열 9); 사이클로(Arg-Gly-Asp-Phe-D-Val)(서열 7); 및 사이클로(Arg-Gly-Asp-D-Phe-NMeVal)(메틸화는 발린 잔사의 아미드 결합의 알파-아미노 질소 위치에서 이루어진다)(서열 15).
펩티드 62184의 서열과 동일한 서열을 갖는 66203으로 명명된 펩티드는 단지 62184에 존재하는 TFA 염이 아닌 염 HCl을 함유하기 때문에 상기 펩티드 62184와 상이하다. 펩티드 69601 및 62185와 펩티드 85189 및 121975에 대해서도 동일하게 적용된다.
b.또 다른 합성 과정
i.사이클로-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NmeVal), TFA 염의 합성
고체 상 메리필드형 과정을 이용하여 NMeVal, DPhe, Asp(OBut), Gly 및 Fmoc-Arg(Mtr)을 단계별 방식으로 4-하이드록시메틸-펜옥시메틸-폴리스티렌 수지(왕 유형 수지)에 순차적으로 가함으로써 Fmoc-Arg(Mtr)-Gly-Asp(OBut)-DPhe-NMeVal-ONa를 합성한다(여기서, 펩티드 합성의 통상의 메리필드형 방법은 문헌[Houben-Weyl, 1.c., Volume 15/Ⅱ, pages 1 to 806(1974)]에 기재된 바와 같이 적용하고 폴리스티렌 수지 및 아미노산 잔기 전구체는 알드리히, 시그마 또는 플루카 화학 회사들로부터 시판되고 있다). 아미노산 잔기의 순차적 첨가를 완료한 후, 상기 수지를 TFA/디클로로메탄의 1:1 혼합물을 사용하여 펩티드 쇄로부터 제거하여 Fmoc-Arg(Mtr)-Gly-Asp(OBut)-DPhe-NMeVal-OH 생성물을 제공한다. 이어서, Fmoc 그룹을 피페리딘/DMF의 1:1 혼합물을 사용하여 제거하여 조악한 Arg(Mtr)-Gly-Asp(OBut)-DPhe-NMeVal-OH 전구체를 제공한 다음 이를 통상적인 방식으로 HPLC에 의해 정제한다.
폐환시키기 위해, DMF(디메틸포름아미드; Aldrich) 15ml 중의 Arg(Mtr)-Gly-Asp(OBut)-DPhe-NMeVal-OH(앞서 합성됨) 0.6g의 용액을 디클로로메탄(Aldrich) 85ml로 희석시키고 NaHCO350mg을 가한다. 드라이 아이스/아세톤 혼합물 중에서 냉각시킨 후, 디페닐포스포릴 아지드(Aldrich) 40㎕를 가한다. 실온에서 16시간 동안 정치시킨 후, 용액을 농축시킨다. 이러한 농축물을 겔 여과(이소프로판올/물 8:2 중의 세파덱스 G10 칼럼)시킨 다음 통상적인 방식으로 HPLC에 의해 정제한다. TFA(트리플루오로아세트산)/HO(98:2)로 처리하여 사이클로-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-NmeVal) x TFA를 수득한 다음 이를 통상적인 방식으로 HPLC에 의해 정제한다; RT = 19.5; FAB-MS(M+H): 589.
ⅱ."내부 염"의 합성
사이클로-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-NmeVal) x TFA를 물에 현탁시킴으로서 상기 생성된 사이클릭 펩티드로부터 TFA 염을 제거한 다음 진공하에 증발시겨 TFA를 제거한다. 이로써 형성된 사이클릭 펩티드가 "내부 염"으로 지칭되며 사이클로-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)로 명명된다. 상기 사이클릭 펩티드가 서로 내부-전기적으로 평형을 이루어 전반적으로 비-하전된 분자를 형성시키는 2개의 반대로 하전된 잔기를 함유하기 때문에 "내부 염"이란 용어가 사용된다. 하전된 잔기 중의 하나는 산 잔기를 함유하고 다른 하전된 잔기는 아미노 잔기를 함유한다. 이러한 산 잔기와 아미노 잔기가 서로 가까이 근접해 있는 경우, 산 잔기를 아미노 잔기에 의해 탈양성자화되어 전반적으로 중성 전하를 갖는 카복실레이트/암모늄 염이 형성될 수 있다.
ⅲ.사이클로-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-NMeVal) x HCl를 제공하기 위한 HCl 처리
사이클로-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-NMeVal) 80mg을 0.01M HCl에 5 내지 6회 용해시키고 각각의 용해 작동 후에 동결건조시킨다. HPLC에 의해 연속적으로 정제하여 사이클로-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal) x HCl를 수득한다; FAB-MS (M+H): 589.
ⅳ.사이클로-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-NMeVal) x MeSO 3 H를 제공하기 위한 메탄 설폰산 처리
사이클로-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-NMeVal) 80mg을 0.01M MeSO3H(메탄 설폰산)에 5 내지 6회 용해시키고 각각의 용해 작동 후에 동결건조시킨다. HPLC에 의해 연속적으로 정제하여 사이클로-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal) x MeSO3H를 수득한다; RT = 17.8; FAB-MS (M+H): 589.
또 다른 폐환 방법에는 설프하이드릴 잔기를 갖는 아사이클릭 펩티드 전구체의 측쇄 그룹 쇄를 유도체화하는 것이 포함되며, 정상적인 생리학적 pH 조건(pH 7.5) 보다 약간 높은 pH 조건에 노출되는 경우에는, 사이클릭 펩티드를 형성하기 위해 분자 내에 존재하는 다른 설프하이드릴 그룹과 함께 디설파이드 그룹이 분자내적으로 형성된다. 부가적으로, 아사이클릭 펩티드 전구체의 C-말단 카복실레이트 잔기가 티오에스테르 폐환된 펩티드를 생성시키기 위한 분자 내에 존재하는 유리 설프하이드릴 잔기와 반응될 수 있다.
합성 펩티드가 사용되는 실시예 7에 기재된 바와 같은 혈관 형성 검정의 억제에 있어서, HCl 중의 66203 펩티드가 TFA 중의 동일한 펩티드 보다 혈관 형성을 억제하는데 약간 더 효과적이다.
펩타이드 명칭 아미노산 서열 서열 번호
62181 사이클로(GrGDFV) 4
62184 (66203*) 사이클로(RGDfV) 5
62185 (69601*) 사이클로(RADfV) 6
62187 사이클로(RGDFv) 7
62880 YTAECKPQVTRGDVF 8
62186 사이클로(RaDFV) 9
62175 사이클로(ARGDfL) 10
62179 사이클로(GRGDfL) 11
62411 TRQVVCDLGNPM 12
62503 GVVRNNEALARLS 13
62502 TDVNGDGRHDL 14
121974 (85189*) 사이클로(RDGf0NH2Me-V) 15
112784 사이클로(RDEf-NH2Me-V) 16
huMMP-2 (410-631)** 17
huMMP-2 (439-631)** 18
huMMP-2 (439-512)** 19
huMMP-2 (439-546)** 20
huMMP-2 (510-631)** 21
huMMP-2 (543-631)** 22
chMMP-2 (410-637)*** 23
chMMP-2 (445-637)*** 24
chMMP-2 (445-518)*** 25
chMMP-2 (445-552)*** 26
chMMP-2 (516-637)*** 27
chMMP-2 (549-637)*** 28
*별표가 표시된 펩티드는 HCl에서 제조하고 이는 동일 선상에 명명된 펩티드의 서열과 동일하고; 별표가 없는 펩티드는 TFA에서 제조한다. 소문자는 D-아미노산을 지시하고; 대문자는 L-아미노산을 지시한다.**합성 펩티드에 대한 사람 MMP-2 아미노산 잔기 서열은 도 22A 및 22B에 도시된 상응하는 잔기 위치로 지시된다(MMP-2는 매트릭스 메탈로프로테이나제 효소 계열의 한 구성원을 지칭한다). 사람 MMP-2 서열에는 천연 시스테인 잔기가 열거되어 있지만, 융합 펩티드에 대해 기재된 바와 같이 공학적으로 처리된 시스테인 잔기는 열거되어 있지 않다. 합성 단백질 뿐만 아니라 발현된 융합 단백질의 용해도를 촉진시키고 결합 부위의 표시를 위한 적절한 폴딩을 보장하기 위해서 지시된 잔기 위치에서의 천연 아미노산 잔기를 천연이 아닌 시스테인 잔기로 대체한다.***합성 펩티드에 대한 닭 MMP-2 아미노산 잔기 서열은 도 22A 및 22B에 도시된 상응하는 잔기 위치로 지시된다. 닭 MMP-2 서열에는 천연 시스테인 잔기가 열거되어 있지만, 앞서 기재된 바와 같이, 융합 펩티드에 대해 기재된 바와 같이 공학적으로 처리된 시스테인 잔기는 열거되어 있지 않다.
2.모노클로날 항체
하이브리도마 ATCC HB 9537에 의해 분비된 모노클로날 항체 LM609는 세파로즈-렌틸 렉틴 비드 상에 흡착된 분리된 αⅴβ3로 면역시킴으로써 표준 하이브리도마 방법을 이용하여 제조한다. 이러한 αⅴβ3는 M21로 명명된 사람 흑색종 세포로부터 분리하였으며 항체는 문헌[참조:Cheresh et al.,J. Biol. Chem., 262:17703-17711(1987)]에 기재된 바와 같이 생성된다. M21 세포는 모톤 디 엘 박사(Dr. Morton, D.L.; University of California at Los Angles, CA)에 의해 제공되었으며 2mM L-글루타민, 50mg/ml 젠타마이신 설페이트 및 10% 송아지 태아 혈청을 함유하는 RPMI 1640 배양 배지에서 현탁 배양으로 성장시킨다.
모노클로날 항체 LM609는 αⅴβ3복합체와는 특이적으로 면역반응되지만, αⅴ아단위, β3아단위 또는 기타 인테그린과는 면역반응되지 않는 것으로 밝혀졌다.
3.α ⅴ β 3 발현의 조직 분포에 관한 특징 확인
A.항-인테그린 수용체 항체와의 면역형광성
상처 치유 동안, 혈관의 기저막은 폰 빌레브란트 인자, 피브로넥틴 및 피브린을 포함한 몇몇 유착성 단백질을 발현시킨다. 또한, 유착 수용체의 인테그린 계열의 몇몇 구성원은 배양된 평활근 및 내피 세포의 표면 위에 발현된다[참조: Cheresh et al.,Proc. Natl. Acad. S ci., USA, 84:6471(1987); Janat et al.,J. Cell Physiol., 151:588(1992); and Cheng et al.,J. Cell Physiol., 139:275(1989)]. 이들 중에서 인테그린은 αⅴβ3, 즉 문헌[참조: Cheresh et al.,Proc. Natl. Acad. S ci., USA, 84:6471(1987)]에 기재된 바와 같이 폰 빌레브란트 인자, 피브리노겐(피브린) 및 피브로넥틴에 대한 내피 세포 수용체이다. 이러한 인테그린은 내피 세포 이동을 유발시키는 칼슘-의존적 시그널링 경로를 개시시키므로, 문헌[참조:Leavelsey et al.,J. Cell Biol., 121:163(1993)]에 기재된 바와 같이 혈관성 세포 생물학 분야에서 기본적인 역할을 하는 것으로 여겨진다.
혈관 형성 동안의 αⅴβ3의 발현을 조사하기 위하여, 사람 상처 과립화 조직 또는 인접한 정상 피부를 동의받은 환자로부터 수득하고, 이를 인산염 완충된 식염수 1ml로 세척한 다음 O.T.C 배지(Tissue Tek)에 봉매시킨다. 이와 같이 봉매된 조직을 약 30 내지 45초 동안 액체 질소에서 스냅 동결시킨다. β3인테그린(αⅴβ3또는 αⅡbβ3), 또는 인테그린의 β1아계열에 대해 특이한 항체로 면역퍼옥시다제를 연속적으로 염색하기 위하여 6마이크론 두께의 절편을 저온조 마이크로톰 상에서 상기와 같이 동결된 블록으로부터 절단시킨다.
정상적인 사람 피부와 상처 과립화 조직을 염색한 결과가 도 1A 내지 1D에 도시되어 있다. β3및 β1인테그린에 대해 각각 지시된 모노클로날 항체 AP3 및 LM534를 동결된 절편의 면역조직화학 분석에 사용한다. 4명의 상이한 사람 공여자로부터의 조직을 이용한 실험은 동일한 결과를 가져왔다. 현미경사진을 300x의 배율로 나타내었다.
αⅴβ3인테그린은 과립화 조직 중의 혈관 상에는 풍부하게 발현되었지만(도 1B), 동일한 공여자로부터의 정상 피부의 진피 및 내피에서는 전혀 탐지되지 않았다(도 1A). 이와는 달리, β1의 인테그린은 정상 피부(도 1C)와 과립화 조직(도 1D) 모두 중의 혈관 및 지질 세포 상에서는 풍부하게 발현되었으며, 이는 내피 속의 기저 세포를 대상으로 한 문헌[참조:Adams et al.,Cell, 63:425(1991)]에 기재된 바와 같이 앞서 제시된 바와 같다.
B.항-리간드 항체와의 면역형광성
앞서 제조된 사람 정상 피부와 과립화 조직의 부가의 절편을 대상으로 하여 β3및 β1인테그린, 폰 빌레브란트 인자 및 라미닌 각각에 대한 리간의 존재에 대해 검사한다. 폰 빌레브란트 인자는 정상 피부(도 2A) 및 과립화 조직(도 2B) 중의 혈관에 국재하는 반면, 라미닌은 모든 혈관 뿐만 아니라 양 조직 제제 중의 내피 기저막에 국재한다(도 2C 및 2D).
C.암 조직에 대한 항-α ⅴ β 3 항체의 분포
상기 분석 이외에, 사람 환자로부터의 암 조직의 생검을 대상으로 하여 αⅴβ3의 존재 및 분포에 대해 검사한다. 상기 조직을 실시예 1A에 기재된 바와 같이 제조하는데, 단 이들을 인테그린 수용체 복합체인 αⅴβ3에 대해 특이적인, 실시예 2에서 제조된 모노클로날 항체 LM609로 염색시킨다. 또한, 대표적인 예의 종양을 불린스 픽세티브(Bulins Fixative)에 8시간 동안 고정시키고 일련의 절편을 절단하며 H＆E 염색시킴으로써, 종양을 현미경 이용한 조직학적 분석을 위해 준비한다.
방광암, 결장암, 유방암 및 폐암 조직을 면역퍼옥시다제 염색한 결과가 각각 도 3A 내지 3D에 도시되어 있다. αⅴβ3는 분석된 4가지 암 생검에 존재하는 혈관에서만 풍부하게 발현되었고 상기 조직에 존재하는 다른 어떠한 세포에서는 발현되지 않았다.
따라서, 본 실시예에 기재된 결과는 αⅴβ3인테그린 수용체가 특정한 조직 유형, 즉 과립화된 전이성 조직 및 혈관 형성이 이루어지는 기타 조직에서는 선택적으로 발현되고 새로운 혈관 형성이 중단된 정상 조직에서는 그렇지 않다는 것을 보여주고 있다. 따라서, 이들 조직은 본 발명의 치료학적 국면에 대해 이상적인 표적을 제공해준다.
4.세포 부착의 억제 및 리간드-수용체 결합 검정에 의해 탐지된 α ⅴ β 3 -특이적 합성 펩티드의 동정
A.세포 부착의 억제
본 발명에 따른 길항제의 인테그린 수용체 특이성을 결정하기 위한 하나의 수단으로서, 세포 부착 억제 검정을 다음과 같이 수행한다.
간략하게 언급하면, αⅴβ3의 및 αⅴβ3의 발현이 결여된 CS-1 햄스터 흑색종 세포를 먼저, 문헌[참조:Filardo et al.,J. Cell Biol., 130:441-450(1995)]에 기재된 바와 같이 β3아단위를 발현시키기 위한 플라스미드로 형질감염시킨다. 효능있는 αⅴβ3길항제의 특이성은 VN 또는 라미닌 피복된 플레이트에 대한 αⅴβ3-발현 CS-1 세포의 결합을 차단시키는 능력에 의해 결정한다. 전형적인 검정의 한 예로서, 웰을 먼저 10㎍/ml 기질로 밤새 피복시킨다. 실온에서 30분 동안 PBS 중의 1% 열 변성된 BSA로 세정 및 차단시킨 후, 0.0001 내지 100μM의 농도 범위의 펩티드 85189(서열 15)를, 50,000세포/웰의 세포수로 웰에 적용하기 위하여 CS-1 세포와 별도로 혼합한다. 10 내지 15분 동안 배양한 후, 상기 세포와 펩티드를 함유하는 용액을 따라 버린다. 이어서, 1% 크리스탈 바이올렛으로 염색한 후 부착된 세포의 수를 결정한다. 세포 결합된 크리스탈 바이올렛은 10% 아세트산 100㎕를 첨가함으로써 용출시킨다. 600nm의 파장에서 용출된 크리스탈 바이올렛의 광밀도를 측정함으로써 세포 유착을 정량화한다.
도 21은 αⅴβ3길항제(여기서는 펩티드 85189)를 이용한 전형적인 검정 결과를 도시한 것이다. 상기 펩티드를 이용해서는 라미닌 피복된 표면에 대한 어떠한 억제도 탐지되지 않았다. 이와는 달리, 용량-의존적 곡선으로 나타낸 바와 같이, 10μM 이상의 펩티드 농도를 사용한 경우 VN 피복된 표면에 대해 완전한 결합 억제가 수득되었다.
MMP-2 단백질의 각종 영역을 함유하는 융합 단백질을 이용하여 유사한 검정을 수행한다. MMP-2-유도된 폴리펩티드에는 αⅴβ3와의 결합 상호작용에서 활성인 MMP-2의 C-말단 영역이 포함됨으로써 MMP-2 활성화 및 이와 연관된 활성을 억제시킬 수 있다. 이들 폴리펩티드는 실시예 1에 기재된 바와 같이 MMP-2의 C-말단 영역으로부터 유도된 서열을 갖는 합성 폴리펩티드로서 또는 다음에 기재된 바와 같이 제조된, MMP-2의 C-말단 영역의 모든 분획 또는 일정 분획을 포함하는 융합 단백질로서 제조된다. MMP-2 C-말단 분자가 닭 및 사람 특이적 서열에 대해 표시된다.
힌지 영역과 바로 인접한 헤모펙신 영역으로 지칭된 닭-유도된 MMP-2 C-말단 영역은 MMP-2의 445번 내지 637번 아미노산 잔기를 포함한다. 닭 MMP-2의 완전한 뉴클레오티드 및 암호화된 아미노산 서열이 다음이 기재되어 있다. 사람 MMP-2 뉴클레오티드 및 암호화된 아미노산 서열이 또한 다음에 기재되어 있다. 445번 내지 637번의 닭 영역에 상응하는 사람 MMP-2에서의 C-말단 영역은 도 22A 및 22B에 도시된 바와 같이 사람 서열로부터 6개의 잔사가 생략되었기 때문에 439번 아미노산 잔기에서 시작되어 631번 아미노산 잔기에서 종결된다. 본 발명의 방법을 실시하는데 사용하기 위한 사람- 및 닭-유도된 C-말단 MMP-2 합성 펩티드 모두가 표 1에 열거되어 있다. 이러한 합성 펩티드의 아미노산 잔기 서열은 재조합 융합 단백질 대응물에 의해 발생된 것과 동일하지만, GST 융합 성분을 갖지는 않는다. 사람과 닭 모두로부터 유도된 C-말단 MMP-2 융합 단백질은 다음에 기재된 바와 같이 제조한다.
MMP-2 융합 단백질은 글루타티온 설프하이드릴 트랜스퍼라제(GST)와 같은 담체(융합) 단백질에 융합된(공유 펩티드 결합에 의해 작동적으로 연결된) MMP-2 C-말단 영역 또는 이의 일정 분획의 서열을 갖는 키메릭 폴리펩티드이다.
닭 및 사람 MMP-2의 각종 영역을 증폭시키기 위하여, 닭 및 사람 MMP-2의 공지된 각각의 cDNA 서열을 기준으로 하여 프라이머 서열을 고안한다. 프로젤라티나제로서 또한 지칭된, 프로세싱되지 않은 닭 MMP-2의 cDNA 뉴클레오티드 서열의 완전한 상부 쇄가 두 번째 라인 상에 나타낸 추론된 아미노산 서열과 함께 도 22A 및 22B에 도시되어 있다[참조: Aimes et al.,Biochem. J., 300:729-736, 1994]. 세 번째 및 네 번째 라인은 각각 사람의 추론된 아미노산 서열[참조:Collier et al.,J. Biol. Chem., 263:6579-6587(1988)] 및 마우스 MMP-2의 추론된 아미노산 서열[참조:Reponen et al.,J. Biol. Chem., 267:7856-7862(1992)]를 나타낸다. 동일한 잔사는 점(도트)로 지시되는 반면 상이한 잔사는 이들의 1 문자 IUPAC 문자표기로 제시된다. 생략된 잔사는 데쉬(-)로 표시된다. 아미노산 잔기의 넘버링은 프로엔자임의 첫 번째 잔사부터 출발하며, 시그널 펩티드의 잔사는 음수로 제시된다. 뉴클레오티드 서열은 이에 따라서 번호가 매겨진다. 추정상 해독 개시점(ATG)은 3개의 전방 화살촉으로 표시하였고 해독 종결 시그널(TGA)은 별표로 지시된다. 닭 프로엔자임 및 활성 효소에 대한 아미노 말단 서열은 다이아몬드 및 단일 화살촉에 함유되어 있다. 닭 프로젤라티나제 뉴클레오티드 및 아미노산 잔기 서열은 서열 29로서 함께 열거되어 있는 반면 암호화된 아미노산 잔기 서열은 서열 30으로서 별도로 열거되어 있다.
닭 MMP-2의 증폭된 영역을 발생시키기 위한 주형은 뉴욕 주립대학(Stoney Brook, New York)의 퀴글리 제이 피 박사에 의해 제공된 완전한 길이의 성숙한 닭 MMP-2 폴리펩티드를 암호화하는 cDNA이거나, 또는 닭 융모요막의 절단된 샘플로부터 표준 기술에 의해 유도된 완전한 세포내 RNA 주형으로부터 발생된 cDNA이다. 후자의 경우, cDNA는 MuLV 역전사효소 및 3'-말단 뉴클레오티드, 즉 5'ATTGAATTCTTCTACAGTTCA3'(서열 31)(이의 5' 및 3' 말단은 각각 공개된 닭 MMP-2 서열의 뉴클레오티드 1932 내지 1912에 상보적이다)에 대해 특이적인 하부 프라이머를 사용하여 수득한다. 역전사효소 폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR)은 GeneAmp RNA PCR 키트 제조업자(Perkin Elmer)의 명세에 따라서 수행한다. 이러한 프라이머를 공학적으로 처리하여 내부 EcoRI 제한 부위를 함유하도록 한다.
상기 언급된 cDNA 주형 중의 어느 하나로부터, 각각 카복시 말단에서 637번 위치의 천연 시스테인 잔사를 갖는 수많은 C-말단 영역은, 다음에 열거된 수많은 5' 프라이머 중의 어느 하나와 쌍을 이룬 상기 열거된 3' 프라이머(서열 31)로의 PCR에 의해 수득한다. 이와 같이 증폭된 영역은 도 22A 및 22B에 도시되고 서열 30에 열거된 바와 같은 아미노산 잔기 위치에 상응하는 서열을 갖는 다음 MMP-2 융합 단백질을 암호화하였다: 1)203-637; 2)274-637; 3)292-637; 4)410-637; 5)445-637. 상기 열거된 MMP-2 융합 단백질을 암호하는 뉴클레오티드 영역 각각을 증폭시키기 위한 상부 또는 5' 프라이머는 pGEX-1λT 또는 pGEX-3X 발현 벡터로의 지시적 연결을 허용해주기 위하여 공학적으로 처리된, 즉 PCR-유도된 내부 BamHI 제한 부위에 대해 3' 위치의 폴리펩티드 출발 부위를 암호화하도록 고안된다. 5' 프라이머에는 다음 서열이 포함되는데, 이의 5' 및 3' 말단은 도 22A 및 22B에 도시된 바와 같은 닭 MMP-2 서열의 지시된 5' 및 3' 뉴클레오티드 위치에 상응한다(아미노산 잔기 위치 출발 위치가 또한 각 프라이머에 대해 지시되어 있다): 1) 203 출발 부위를 암호화하는 뉴클레오티드 599-619, 5'ATGGGATCCACTGCAAATTTC3'(서열 32); 2) 274 출발 부위를 암호화하는 뉴클레오티드 809-830, 5'GCCGGATCCATGACCAGTGTA3'(서열 33); 3) 292 출발 부위를 암호화하는 뉴클레오티드 863-883, 5'GTGGGATCCCTGAAGACTATG3'(서열 34); 4) 410 출발 부위를 암호화하는 뉴클레오티드 1217-1237, 5'AGGGGATCCTTAAGGGGATTC3'(서열 35); 및 5) 445 출발 부위를 암호화하는 뉴클레오티드 1325-1345, 5'CTCGGATCCTCTGCAAGCACG3'(서열 36).
주형 cDNA의 지시된 뉴클레오티드 영역을 시스템(Expand High Fidelity PCR 시스템; Boehringer Mannheim)에 대한 제조업자의 지시에 따라서 35주기(어닐링 온도 55℃) 동안 연속적으로 증폭시킨다. 이로써 생성된 PCR 생성물을 겔 정제하고, BamHI 및 EcoRI 제한 효소로 분해시킨 다음, 유사하게 분해시킬 뿐만 아니라 연결 반응에 앞서 탈포스포릴화시킨 pGEX-1λT 또는 pGEX-3X 발현 벡터(Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)에 연결시키기 전에 재정제한다. 플라스미드의 선택은 증폭 생성물의 요구된 판독 프레임에 좌우된다. 적격한 이. 콜라이 균주 BSJ72 또는 BL21 세포를 열 쇼크에 의해 별도의 작제물로 형질전환시킨다. 이로써 생성된 콜로니를 대상으로 하여, 양성 클론의 디데옥시 서열화에 앞서 PCR에 의한 각각의 MMP-2 융합 단백질-암호화 플라스미드의 혼입에 대해 스크리닝하여 도입된 암호화 서열의 실체를 확인한다. 또한, 플라스미드 혼입의 검증은 적절한 크기로 형성된 GST-MMP-2 융합 단백질의 발현에 의해 확인되었다.
재조합 GST-MMP-2 융합 단백질 각각의 정제는 필수적으로 GST 유전자 융합 시스템(Pharmacia Biotech)에 대한 제조업자가 기재된 바와 같이 IPTG-유도된 로그상 배양을 이용하여 수행한다. 간략하게 언급하면, 회수된 세균을 초음파 처리하여 용해시키고, 정화 및 상기 재조합 단백질을 세파로즈 4B-커플된 글루타티온(Pharmacia Biotech) 상에 고정화시키기에 앞서 세정제와 배양한다. 광범위하게 세척한 후, 고정화된 융합 단백질을 50mM 트리스-HCl(pH 8.0) 중의 10mM 환원된 글루타치온으로 친화 매트릭스로부터 별도로 융출시키고, PBS에 대하여 광범위하게 투석하여 사용에 앞서 잔류성 글루타치온을 제거한다.
하나의 암호화된 시스테인 잔기만을 갖는 닭 MMP-2 잔사 445 및 637 사이에 융합 단백질을 생성시키기 위한 선행 시도는 불용성 생성물 만을 제조하였다. 따라서, 앞서 기술된 융합 단백질에 존재하는 바와 같은 내인성 말단 시스테인 잔기를 포함하지 않는 C-말단 영역으로부터 유도된 부가의 가용성 MMP-2 융합 단백질을 발생시키기 위해서는, 뉴클레오티드 서열을 증폭된 MMP-2 영역 내로 도입하여 필요한 경우 특정 융합 단백질에 따라서 시스테인 잔사를 암호화한다. 시스테인 잔기는 445번 및 637번 위치의 닭 MMP-2 서열에 천연적으로 존재한다. 사람 서열에 있어서, 이들 위치는 각각 440번 및 631번에 상응한다. 따라서, 융합 단백질은 작제물에 요구되는 바와 같이, 다른 말단에서 천연 시스테인과의 디설파이드 결합에 제공하도록 관심있는 닭 MMP-2 서열의 아미노- 또는 카복시-말단에 공학적으로 처리된 말단 시스테인 잔기를 함유하도록 고안된다.
이에 따라서 올리고뉴클레오티드 프라이머는 가용성 MMP-2/GST 융합 단백질의 발현을 위해 닭 MMP-2 C-말단 영역의 증폭을 허용하도록 고안된다. 증폭된 닭 MMP-2 C-말단 영역에는 아미노산 잔기 위치 445 내지 518, 445 내지 552, 516 내지 637 및 549 내지 637를 암호화하는 영역이 포함된다. 잔기 517을 함유하는 융합 단백질의 경우, 천연적으로 암호화된 티로신 잔기를 446번 또는 637번 잔기 위치에서 어느 하나의 시스테인과의 디설파이드 결합을 허용해주기 위해 시스테인으로 대체시킨다. 잔기 551을 함유하는 융합 단백질의 경우에는, 천연적으로 암호화된 트립토판 잔기를 446번 또는 637번 잔기 위치에서 어느 하나의 천연적으로 암호화된 시스테인과의 디설파이드 결합을 허용해주는 시스테인으로 대체시킨다.
간략하게 언급하면, 상기 제조된 재조합 GST/MMP-2(410-637)을 암호화하는 pGEX-3X 플라스미드 작제물을, 한 셋트의 올리고뉴클레오티드 프라이머(이의 고안은 도 22A 및 22B에 도시된 바와 같이 공개된 닭 MMP-2 서열을 근거로 한 것이다)를 이용하는 익스팬드 하이 피델러티 PCR 키트(Expand High Fidelity PCR Kit)(Boehringer Mannheim)에 대한 제조업자의 프로토콜에 따라서 증폭용 주형으로서 사용된다. pGEX-3X GST 벡터 내로 삽입하기 위한 공학적으로 처리된 내부 BamHI 엔도뉴클레아제 제한 부위 다음의 445번 위치에서 닭 MMP-2 단백질 출발 부위를 암화하도록 고안된 하나의 상부 프라이머는 뉴클레오티드 서열(5'CTCGGATCCTCTGCAAGCACG3'(서열 37))을 갖는다. 이러한 프라이머의 5' 및 3' 말단은 각각 상기 수에서 닭 MMP-2 서열의 1325 내지 1345번 위치에 상응한다. pGEX-1λT GST 벡터 내로의 삽입을 위한 공학적으로 처리된 내부 BamHI 제한 부위 다음의 156번 위치에서 닭 MMP-2 단백질 출발 부위를 암호화하고 517번 위치에서 시스테인 잔기를 암호화하도록 고안된 또 다른 상부 프라이머는 뉴클레오티드 서열(5'GCAGGATCCGAGTGCTGGGTTTATAC3'(서열 38))을 갖는다. 이러한 프라이머의 5' 및 3' 말단은 닭 MMP-2 서열의 1537 내지 1562번 위치에 상응한다. pGEX-1λT GST 벡터 내로의 삽입을 위한 공학적으로 처리된 내부 EcoRI 엔도뉴클레아제 제한 부위 다음의 549번 위치에서 닭 MMP-2 단백질 출발 부위를 암호화하고 551번 위치에서 시스테인 잔기를 암호화하도록 고안된 제3의 상부 프라이머는 뉴클레오티드 서열(5'GCAGAATTCAACTGTGGCAGAAACAAG3'(서열 39))을 갖는다. 이러한 프라이머의 5' 및 3' 말단은 닭 MMP-2 서열의 1639 내지 1665번 위치에 상응한다.
이들 상부 프라이머를 아래에 열거된 다음 하부 프라이머 중의 하나와 함께 개별적으로 사용하여 닭 MMP-2의 C-말단 영역으로부터 상기 언급된 영역을 생성시킨다. 518번 위치에서 닭 MMP-2 단백질 종결 부위를 암호화하고, 517번 위치에서 시스테인 잔기를 암호화하며 GST 벡터내로의 삽입을 위한 내부 EcoRI 엔도뉴클레아제 제한 부위를 함유하도록 고안된 제1의 하부 프라이머(안티센스)는 뉴클레오티드 서열(5'GTAGAATTCCAGCACTCATTTCCTGC3'(서열 40))을 갖는다. 5'-3' 방향으로 기재된, 이러한 프라이머의 5' 및 3' 말단은 각각 닭 MMP-2 서열의 1562 내지 1537번 위치에 대해 부분적으로 상보적이다. 552번 위치에서 닭 MMP-2 단백질 종결 부위를 암호화하고, 551번 위치에서 시스테인 잔기를 암호화하며 GST 벡터내로의 삽입을 위한 내부 EcoRI 엔도뉴클레아제 제한 부위를 함유하도록 고안된 제2의 하부 프라이머는 뉴클레오티드 서열(5'TCTGAATTCTGCCACAGTTGAAGG3'(서열 41))을 갖는다. 5'-3' 방향으로 기재된, 이러한 프라이머의 5' 및 3' 말단은 각각 닭 MMP-2 서열의 1666 내지 1643번 위치에 대해 부분적으로 상보적이다. 637번 위치에서 닭 MMP-2 단백질 종결 부위를 암호화하고 GST 벡터 내로의 삽입을 위한 내부 EcoRI 엔도뉴클레아제 제한 부위를 함유하도록 고안된 제3의 하부 프라이머는 뉴클레오티드 서열(5'ATTGAATTCTTCTACAGTTCA3'(서열 42))을 갖는다. 5'-3' 방향으로 기재된, 이러한 프라이머의 5' 및 3' 말단은 각각 닭 MMP-2 서열의 1932 내지 1912번 위치에 대해 부분적으로 상보적이다.
상기 언급된 바와 같은 공학적으로 처리된 하나 이상의 시스테인 잔기를 함유하는 융합 단백질을 생성하기 위해 특정한 조합물에 사용된, 상기 상부 및 하부 프라이머에 의해 결합된 닭 MMP-2 카복시 말단의 영역을 익스팬드 하이 피델러티 PCR 시스템(Boehringer Mannheim)에 대한 제조업자의 지시 사항에 따라서 55℃의 어닐링 온도로 30주기 동안 별도로 증폭시킨다. 이로써 생성된 증폭 생성물을 별도로 정제하고, BamHI 및 EcoRI 제한 효소로 필요에 따라 분해시킨 다음, 앞서 지시된 바와 같이 상부 올리고뉴클레오티드 프라이머의 판독 프레임에 의해 상기 기재된 바와 같이, 적당한 GST 융합 단백질 벡터, 즉 pGEX-1λT 또는 pGEX-3X 벡터에 연결시키기 전에 재정제한다. 증폭된 MMP-2 생성물을 연결하기 위하여, 상기 벡터를 유사하게 분해시킬 뿐만 아니라 연결 반응에 앞서 탈포스포릴화한다. 이어서, 적격한 이. 콜라이 균주 BL21 세포를 열 쇼크에 의해 생성된 MMP-2 함유 벡터 작제물로 별도로 형질전환시킨다. 이로써 생성된 콜로니를 대상으로 하여, 양성 클론의 디데옥시 서열화에 앞서 PCR에 의한 상기 적절한 융합 단백질-암호화 플라스미드의 혼입과 적절한 크기로 형성된 GST-융합 단백질의 생성에 대해 스크리닝하여 도입된 암호화 서열의 실체를 확인한다. 재조합 GST 융합 단백질의 정제는 필수적으로 다른 GS-MMP-2 융합 단백질을 생성하기 위해 앞서 기술된 바와 같이 IPTG-유도된 로그상 배양을 이용하여 수행한다.
각종 닭 MMP-2 단백질을 이용할 뿐만 아니라 다른 펩티드를 이용한 세포 부착 검정의 억제 결과는 본래의 MMP-2, 즉 MMP-2(1-445) 및 대조군 펩티드 69601이 아니라 잔사 445-637 및 펩티드 66203(서열 5)로부터의 융합 단백질 CTMMP-2(2-4)이 라미닌이 아닌 비트로넥틴에 대한 β3-발현 CS-1 세포 부착을 억제함으로써, 비트로넥틴에 대한 비트로넥틴 수용체(αⅴβ3) 결합이 정상적인 αⅴβ3결합 활성을 방해함으로서 억제되었다는 것을 지시하고 있다. 잔기 274-637로부터의 시험된 기타 CTMMP-2 융합 단백질 7-1, 잔기 292-637로부터의 10-1 및 잔기 274-400으로부터의 4-3이 2-4에 비해 세포 유착에 대해 덜 영향을 끼쳤다.
상기 언급된 닭 MMP-2 GST 융합 단백질 이외에, 2가지 사람 MMP-2 GST 융합 단백질을, 성숙한 사람 MMP-2 프로엔자임 폴리펩티드의 아미노산 영역 203-631 및 439-631을 발현하기 위해 제조한다. 이와 같이 지시된 영역은 닭 MMP-2 영역 203-637 및 445-637에 각각 상응한다. 사람 MMP-2 GST 융합 단백질은 스테틀러-스티븐슨 더블유 지 박사(Dr. Stetler-Stevenson, W.G.; The National Cancer Institute, Bethesda, MD)에 의해 제공된 완전한 사람 MMP-2 개방 판독 프레임을 암호화한 cDNA 주형을 이용하여, 닭 MMP-2-GST 융합 단백질에 대해 상기 언급된 바와 같이 PCR에 의해 제조한다. 상부 5' 프라이머 서열은 앞서 공개된 사람 MMP-2의 서열[참조:Collier et al.,J. Biol. Chem., 263:6579-6587(1988)]을 근거로 하고 적절한 발현 벡터 내로의 증폭된 생성물의 삽입을 허용해주기 위해 도입된 내부 EcoRI 제한 부위를 암호화하도록 고안되었다.
pGEX-1λT GST 벡터 내로의 삽입을 위해 공학적으로 처리된 내부 EcoRI 엔도뉴클레아제 제한 부위 다음의 203번 위치에서 사람 MMP-2 단백질 출발 부위를 암화하도록 고안된 하나의 상부 프라이머는 뉴클레오티드 서열(5'GATGAATTCTACTGCAAGTT3'(서열 43))을 갖는다. 이러한 프라이머의 5' 및 3' 말단은 각각 사람 MMP-2 개방 판독 프레임 서열의 685 내지 704번 위치에 상응한다. pGEX-1λT GST 벡터 내로의 삽입을 위해 공학적으로 처리된 내부 EcoRI 제한 부위 다음의 439번 위치에서 사람 MMP-2 단백질 출발 부위를 암호화하도록 고안된 또 다른 상부 프라이머는 뉴클레오티드 서열(5'CACTGAATTCATCTGCAAACA3'(서열 44))을 갖는다. 이러한 프라이머의 5' 및 3' 말단은 사람 MMP-2 개방 판독 프레임 서열의 1392 및 1412번 위치에 상응한다.
상기 프라이머 각각을, 상기 MMP-2 개방 판독 프레임에 대해 원위에 종결되고 아미노산 잔기 631 다음에 단백질 종결을 지시하는 사람 MMP-2 서열의 염기 1998 및 1978에 각각 상보적인 5' 및 3' 말단을 갖는 하부 프라이머와 함께 별도로 사용한다. 이와 같이 증폭된 생성물은 사람 MMP-2 아미노산 잔기 203-631(서열 45) 및 439-631(서열 18)을 함유하는 발현된 융합 단백질을 생성시킨다.
생성된 PCR 생성물을 정제하고, EcoRI로 분해하며, 연결 반응에 앞서 유사하게 분해하고 탈포스포릴화시킨 pGEX-1λT 플라스미드로의 연결을 위해 재정제시킨다. 세포를 앞서 기재된 바와 같이 형질전환시킨다.
아미노산 잔기 410-631(서열 17), 439-512(서열 19), 439-546(서열 20), 510-631(서열 21) 및 543-631(서열 22)를 함유하는 기타 사람 MMP-2 융합 단백질을 또한 본 발명의 방법에 사용하기 위해 앞서 기재된 바와 같이 제조한다.
B.리간드-수용체 결합 검정
정제된 리간드-수용체 결합 검정에서 αⅴβ3및 αⅡbβ3를 길항시키는 능력을 측정함으로써, 실시예 1에서 제조된 합성 펩티드를 상기 언급된 MMP-2 융합 단백질과 함께 추가로 스크리닝한다. 이들 결합 연구를 위한 방법은 문헌[참조:Barbas et al.,Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 90:10003-10007(1993), Smith et al.,J. Biol. Chem., 265:11008-11013(1990), and Pfaff et al.,J. Biol. Chem., 269:20233-20238(1994); 이들 전문이 본원에 참조문헌으로 삽입된다]에 기재되어 있다.
본원에는 수용체를 고체 지지체에 고정화시키고 리간드와 길항제를 용해시키는 리간드-수용체 결합 검정에서 길항제를 동정하는 방법이 기술되어 있다. 또한, 리간드를 고체 지지체에 고정화시키고 수용체와 길항제를 용해시키는 리간드-수용체 결합 검정이 기술되어 있다.
간략하게 언급하면, 선택된 정제된 인테그린을 웰 당 50나노그램(ng)의 피복 농도로 티터텍 미세역가 웰에서 별도로 고정화시킨다. 이러한 리간드-수용체 결합 검정에서 사용된 수용체의 정제는 당해 분야에 널리 공지되어 있고 당해 분야의 숙련인에게 친숙한 방법을 사용하여 용이하게 수득할 수 있다. 4℃에서 18시간 배양한 후, 상기 플레이트 상의 비특이적 결합 부위를 트리스 완충된 식염수 중의 소의 혈청 알부민(BSA) 10mg/ml로 차단시킨다. 억제 연구를 위해, 표 1로부터의 각종 농도의 선택된 펩티드를 대상으로 하여, 인테그린 수용체 αⅴβ3및 αⅡbβ3에 대한125I-비트로넥틴 또는125I-피브리노겐의 결합을 차단시키는 능력에 대해 시험한다. 이들 리간드가 특정한 인테그린, 즉 αⅴβ3에 대한 비트로넥틴 및 αⅡbβ3에 대한 피브리노겐에 대한 최적 결합을 나타내긴 하지만, 어느 한 수용체에 대한 피브리노겐의 결합을 차단시키는 펩티드를 사용하는 결합 억제 연구는 리간드에 대한 수용체의 결합을 최대치의 절반으로 억제시키는데 필요한 펩티드의 양(μM)을 정확하게 결정시켜 준다. 방사선표지된 리간드를 1nM의 농도로 사용하고 결합을 표지되지 않은 합성 펩티드로 별도로 챌린지한다.
3시간 배양한 다음, 유리 리간드를 세척에 의해 제거하고 결합된 리간드를 감마 계수함으로써 탐지한다. 표 1에 열거된 선택된 사이클릭 펩티드를 사용하여 개별적으로 고정화된 αⅴβ3및 αⅡbβ3를 수용체에 대한 방사선 표지된 피브리노겐 및 수용체의 결합을 억제시키는 검정으로부터의 데이터는 전형적으로 11% 이하의 데이터 지점 사이의 오차를 나타내면서 고도로 재현 가능하다. IC50데이터(μM)는 표 2에 나타낸 바와 같이 이중 데이터 지점 ± 표준 편차 평균치로서 표현된다.
펩티드 번호 αⅴβ3(IC50μM) αⅡbβ3(IC50μM)
62181 1.96 ± 0.62 14.95 ± 7.84
62184 0.05 ± 0.001 0.525 ± 0.10
62185 0.885 ± 0.16 100 ± 0.001
62187 0.05 ± 0.001 0.26 ± 0.056
62186 57.45 ± 7.84 100 ± 0.001
62175 1.05 ± 0.07 0.63 ± 0.18
62179 0.395 ± 0.21 0.055 ± 0.007
따라서, 각각 하나의 D-아미노산 잔기를 갖는, RGD-함유 또는 RGD-유도체화 사이클릭 펩티드 62181, 62184, 62185 및 62187는 αⅡbβ3수용체에 대한 것과 비교해서 최대치의 절반을 억제시키는데 요구되는 보다 낮은 농도의 펩티드로 측정된 바와 같이, αⅴβ3수용체에 대한 피브리노겐 결합을 우선적으로 억제시키는 것으로 나타났다. 이와는 달리, 다른 RGD-함유 또는 RGD-유도체화 사이클릭 펩티드 62186, 62175 및 62179는 αⅴβ3에 대한 피브리노겐 결합을 차단시키는데 유효하지 않거나 또는 αⅴβ3과 비교해서 αⅡbβ3에 대한 피브리노겐 결합을 우선적으로 억제시키는 것으로 나타났다. 이들 결과는 최근에 공개된 문헌[참조:Pfaff, et al.,J. Biol. Chem., 269:20233-20238(1994)]에 기재된 결과와 일치하는데, 상기 문헌에는 사이클릭 펩티드 RGDFV(여기서,F는 D-아미노산 잔기를 지시한다)가 αⅡbβ3또는 α5β1인테그린에 대해서가 아니라 αⅴβ3인테그린에 대한 피브리노겐 결합을 특이적으로 억제시킨다고 기재되어 있다. RGD 모티브를 갖거나 결여된 선형화된 펩티드(이의 서열은 αⅴ수용체 아단위, αⅡb수용체 아단위 또는 비트로넥틴 리간드 아미노산 잔기로부터 유도된 것이다)를 사용하여 유사한 결합 억제 검정을 수행한다. 선형 폴리펩티드의 서열, 62880(VN-유도된 아미노산 잔기 35-49), 62441(αⅴ-유도된 아미노산 잔기 676-687); 62503(αⅴ-유도된 아미노산 잔기 655-667) 및 62502(αⅡb-유도된 아미노산 잔기 296-306)가 표 1에 열거되어 있다. 이들 펩티드 각각을 별개의 검정에 사용하여 αⅡbβ3또는 αⅴβ3에 대한 비트로넥틴(VN) 또는 피브리노겐(FG)의 결합을 억제한다. 각 실험에 대한 개별적인 검정의 IC50데이터(μM)이 표 3에 제시되어 있다.
펩티드 번호 αⅡbβ3IC50(μM) αⅴβ3IC50(μM)
FG VN FG VN
62880 4.2 0.98 〈0.1 0.5
62441 〉100 〉100 〉100 〉100
62503 〉100 〉100 〉100 〉100
62502 90 5 〉100 〉100
선형화된 펩티드를 이용하여 선택된 인테그린 수용체에 대한 리간드 결합 억제 검정을 수행한 결과는 αⅡbβ3수용체와 비교해서 최대치 절반 억제에 필요한 보다 낮은 펩티드 농도로 측정된 바와 같이, 펩티드 62880 만이 αⅴβ3에 대한 FG 또는 VN의 최대 절반 결합을 억제하는데 유효하다는 것을 나타내고 있다. 다른 선형화된 어떠한 펩티드도 αⅴβ3에 대한 리간드 결합을 차단시키는데 유효하지 않았지만, 펩티드 6250가 αⅡbβ3에 대한 VN 결합을 차단시키는데 유효하였다.
결합 또는 억제 탐지를 ELISA 및 퍼옥시다제-접합된 염소 항-래빗 IgG를 이용하여 수행한다는 것을 제외하고는 앞서 기재된 바와 같이 수행된 기타 리간드 수용체 결합 검정에서는, 효능 순서로 열거된 5 내지 50ng/웰 범위의 리간드 VN, MMP-2 및 피브로넥틴은 고정화된 αⅴβ3수용체와 결합하는 반면 콜라겐은 그렇지 않은 것으로 나타났다. 또한, 고정화된 αⅴβ3에 대한 MMP-2 또는 VN의 결합을 억제하는 펩티드의 능력을 펩티드 69601(서열 6) 및 66203(서열 5)을 사용하여 평가한다. 펩티드 66203 만이 αⅴβ3수용체에 대한 어느 한 기질의 결합을 억제하는데 유효한 반면, 대조군 펩티드 69601은 어느 리간드가 지니고 있는 효과도 나타내지 못하였다.
인테그린 수용체에 대한 MMP-2 결합의 특이성은 고체 상 수용체 결합 검정을 이용하여 확인하는데, 이러한 검정에서는 요오드화 MMP-2가 고체 상에 고정화시킨(300 결합된 cpm 대 약 10 결합된 CPM) αⅡbβ3가 아니라 αⅴβ3와 결합하는 것으로 나타났다. αⅴβ3에 대한 MMP-2의 특이적 결합을 억제시키는 MMP-2-유도된 펩티드 또는 융합 단백질의 능력은 비교 가능한 검정에서 입증되었으며 이의 결과가 도 23에 도시되어 있다. 앞서 기재된 바와 같이 제조된 GST-CTMMP-2(445-637)(또한 CTMMP-2(2-4)로서 지칭되기도 함) 융합 단백질, 즉 표지된 GST-MAID는 αⅴβ3에 대한 요오드화 MMP-2의 결합을 억제시킨 반면, GST 단독은 억제제가 전혀 공급되지 않은 웰에 필적하는 수준의 결합된 CPM에서는 어떠한 효과도 나타내지 않았다(표지된 NT). CTMMP-2(274-637)로서 지칭된 MMP-2 융합 단백질(이는 또한 CTMMP-2(10-1)로서 지칭되기도 함)은 αⅴβ3에 대한 표지된 MMP-2의 결합을 억제시키지 못하였다.
MMP-2 유도된 길항제와의 수용체 상호작용의 특이성은 결합 및 결합 억제 고체 상 검정을 이용하여 확인한다. [125I]GST2-4로서 도 24에 표지된 CTMMP-2(2-4)는 αⅡbβ3가 아니라 αⅴβ3와 결합한 반면, [125I]GST10-1로서 도 24에 표지된 CTMMP-2(10-1)은 시험관내 고체 상 검정에서 어느 수용체와도 결합되지 않았다. 또한, 표지된 GST2-4의 결합은 표지되지 않은 GST2-4에 의해 경쟁되었다.
따라서, 본 실시예에서 기재된 리간드-수용체 검정을 이용하여 본 발명을 실시하는데 있어서 비트로넥틴 수용체(αⅴβ3) 길항제로서 사용된 바와 같이, 특정한 인테그린 수용체, 구체적으로는 αⅴβ3에 대하여 선택적인 특이성을 나타내는 환식 또는 선형화된 합성 펩티드 모두를 스크리닝할 수 있다.
5.처리되지 않은 병아리 융모요막(CAM)의 특징 확인
A.CAM의 제조
정상적인 배아 혈관 형성으로 인해 성숙한 혈관이 형성된 후에 병아리 융모요막(CAM)에 대하여 혈관 형성을 유도할 수 있다. 혈관 형성은 문헌[참조:Leibovich et al.,Nature, 329:630(1987) and Ausprunk et al.,Am. J. Pathol., 79:597(1975)]에 기재된 바와 같이 특이적 사이토킨 또는 종양 단편에 반응하여 유도되는 것으로 밝혀졌다. 실시예 6 및 7에 각각 기재된 바와 같이 혈관 형성의 연속적인 유도 및 이의 억제에 대해 알아보기 위하여 병아리 배아로부터 CAMs를 제조한다. 10일생 병아리 배아를 수득하고(McIntyre Poultry, Lakeside, CA) 37℃ 및 60% 습도로 배양한다. 작은 크래프트용 드릴(Dremel, Division of Emerson Electric Co. Racine WI)을 사용하여 에어 색으로 직접적으로 난 말기에 껍질을 통하여 작은 구멍을 만든다. 상기 난을 캔들링함으로써 미리 결정된 배아 혈관이 없는 영역에서 난의 넓은 측면에 두 번째 구멍을 뚫는다. 본래의 구멍에 음압을 적용하면, CAM(융모요막)이 껍질 막으로부터 멀리 당겨져서 CAM 전반에 걸쳐 가짜 에어 색이 형성되었다. 작은 모델 연마용 휠(Dremel)를 사용하여 구멍 뚫린 CAM 상에서 상기 껍질을 통하여 1.0cm x 1.0cm의 사각형 창을 절단한다. 이러한 작은 창을 통하여 진행되고 있는 CAM으로 직접적으로 접근할 수 있었다.
이어서, 이로써 생성된 CAM 제제를 배아형성된지 6일째 되는 날(이는 배아 신생혈관화에 대한 효과를 평가하기 위해 사용된 모델을 반영해주는 CAM에 대한 부가의 처리없이, 활성 신생혈관화가 뚜렷이 나타난 시기이다) 또는 배아형성이 이루어진지 10일째 되는 날(혈관 형성이 중단된다)에 사용한다. 따라서, 실시예 6에 기재된 바와 같이 사이토킨 처리 또는 종양 접촉에 반응하여 새로워진 혈관 형성을 유도하기 위해, 후자 제제를 본 발명에 사용한다.
B.CAM의 조직학
실시예 8에 기재된 바와 같이 병아리 배아로부터 절제시킨 병아리 배아 CAMs 및/또는 사람 종양의 현미경 구조를 분석하기 위하여, CAMs와 종양을 실시예 3A에 기재된 바와 같이 동결된 분획화를 위해 준비한다. 6㎛ 두께의 분획을, 면역형광성 분석을 위해 저온조 마이크로톰 상에서 동결된 블록으로부터 절단한다.
도 4는 처리되지 않은 10일생 CAM에서 혈관이 결여된 영역의 전형적인 현미경사진을 도시한 것이다. 이러한 CAM 시스템에서의 혈관 형성이 상기 배형성 단계에 의해 감퇴되기 때문에, 이러한 시스템은 인접한 영역으로부터 현재 어떠한 혈관도 결핍되어 있는 CAM의 영역 내로 존재하는 혈관으로부터 새로운 맥관계를 생성시키는 것을 자극하기 위해 본 발명에 유용하다.
C.면역형광에 의해 탐지된 CAM에서의 인테그린 프로필
CAM 조직에 존재하는 인테그린 수용체의 조직 분포를 검사하기 위하여, 종양 조직과 병아리 배아 CAM 조직 모두의 6㎛ 동결된 분획을 아세톤에 30초간 고정시키고 문헌[참조:Buck et al.,J. Cell Biol., 107:2351(1988)]에 기재된 바와 같이 β1인테그린 아단위에 대해 특이적인 모노클로날 항체인 mAb CSAT 10㎍/ml으로 면역형광에 의해 염색시켜 대조군용으로 사용하거나, 또는 실시예 2에서 제조된 바와 같은 LM609에 대해 사용한다. 1차 염색에 이어서, 염소 항-마우스 로다민 표지된 2차 항체(Tago)의 1:250 희석물을 사용하여 염색함으로써 1차 면역반응 생성물을 탐지할 수 있다. 이어서, 이러한 분획을 자이쓰(Zeiss) 면역형광성 화합물 현미경으로 분석한다.
면역형광성 분석 결과는 처리되지 않은 10일생 병아리 배아에 존재하는 성숙한 혈관이 인테그린 β1아단위를 발현하였다는 것을 나타내고 있다(도 5A). 이와는 달리, 도 5A에 도시된 조직의 일련의 분획에서는, LM609와의 어떠한 면역반응성도 나타나지 않았다(도 5B). 따라서, LM609 항체에 의해 탐지된 인테그린 αⅴβ3은 처리되지 않은 10일생 병아리 배아에 존재하는 성숙한 혈관에 의해서는 활성적으로 발현되지 않았다. CAM 모델 및 다음 실시예에 나타낸 바와 같이, 혈관이 정상적인 배형성에서는 새로운 성장을 경험하게 되거나 사이토킨 또는 종양에 의해 유도되긴 하지만, 이러한 혈관은 αⅴβ3을 발현한다. 그러나, 활성 신생혈관화 후, 혈관이 진행을 중단하게 되면, αⅴβ3의 발현은 면역형광성 분석에 의해 탐지가 불가능한 수준으로 감소된다. 성숙한 혈관에서의 발현되지 않는 것과는 대조적으로 혈관 형성이 진행되는 혈관에서의 이와 같은 αⅴβ3발현 조절은 CAM 혈관 형성 검정 시스템을 사용하여 다음 실시예에 제시된 바와 같이 혈관 형성을 제어 및 억제하기 위한 본 발명의 독특한 능력을 제공해준다.
다른 프로필에 있어서, 메탈로프로테이나제 MMP-2 및 αⅴβ3은 10일생 CAM 모델에서 bFGF 유도한지 3일 후에 혈관 형성이 진행되는 내피 세포 상에 동시에 위치되었다. MMP-2는 αⅴβ3수용체가 결여된 혈관 상에서는 단지 최소로 발현되었다. MMP-2는 생체내 혈관 형성 M21-L 종양 연관된 혈관(실시예 11에 기재된 바와 같이 M21-L 사람 흑색종 세포를 SCID 마우스 상에서 성장된 사람 피부 이식체의 진피 내로 주입하여 생성된 종양 상에 αⅴβ3와 동시에 위치되지만 예비존재하는 비-종양 연관된 혈관과는 그렇지 않다. MMP-2와 αⅴβ3간의 선택적인 결합에 대한 유사한 결과가 또한, αⅴβ3가 결여된 CS-1 세포가 아니라 CAM 모델에서 αⅴβ3보유 CS-1 흑색종 종양을 사용하여도 수득되었다.
6.CAM 혈관 형성 검정
A.성장 인자에 의해 유도된 혈관 형성
혈관 형성은 실시예 5A에 언급된 바와 같이 사이토킨 또는 성장 인자에 의해 유도되는 것으로 밝혀졌다. 본 실시예에 기재된 실험에서는, 실시예 5에 기재된 CAM 제제에서의 혈관 형성이 본원에 기재된 바와 같이 CAM 혈관 상으로 국부적으로 적용되는 성장 인자에 의해 유도된다.
한크스 균형된 염 용액(HBSS, GIBCO, Grand Island, NY) 또는 재조합 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF)(Genzyme, Cambridge, MA) 150ng/ml를 함유하는 HBSS로 포화된 5mm X 5mm 왓트만 필터 디스크(Whatmam Filter paper No.1)를 혈관이 결여된 영역에서 10일생 병아리 배아의 CAM 위에 놓아둠으로써 혈관 형성을 유도하고 창을 나중에 테이프로 밀봉한다. 다른 검정에서는, 125ng/ml bFGF가 또한 혈관 성장을 유도하는데 유효하다. 길항제를 정맥내 주사하여 혈관 형성의 억제를 평가하는 검정의 경우에는, 섬유아세포 성장 배지 중에서 1 내지 2㎍/ml bFGF를 사용하여 먼저 혈관 형성을 유도한다. 72시간 후에 현미경사진으로 혈관 형성을 모니터한다. CAMs를 스냅 동결시키고, 6㎛ 저온조 분획을 아세톤으로 고정시키고 실시예 5C에 기재된 바와 같이 항-β1모노클로날 항체 CSAT 또는 LM609 10㎍/ml로 면역형광에 의해 염색한다.
도 5C에서의 면역형광성 현미경사진은 도 5B에 도시된 바와 같이 처리되지 않은 병아리 CAM에서의 αⅴβ3발현 부재와는 대조적으로 병아리 CAM에서의 bFGF-유도된 혈관 형성 동안 αⅴβ3의 발현이 증진되었다는 것을 보여주고 있다. αⅴβ3는 bFGF-처리된 CAMs 상의 많은(75 내지 80%) 혈관에서 용이하게 탐지될 수 있었다. 또한, 인테그린 β1의 발현은 처리되지 않은 CAM에서 나타난 것으로부터 변화되지 않았는데, 이는 β1이 또한 자극된 혈관 상에서 용이하게 탐지될 수 있기 때문이다.
이어서, CAM 저온조 분획을 레이저 초점이 같은 영상 분석에 의해 bFGF-유도된 혈관 형성 동안 αⅴβ3와 β1인테그린의 상대적 발현을 정량화한다. 염색된 분획을 자이쓰 레이저 초점이 같은 현미경으로 분석한다. LM609로 염색된 25개 혈관 및 CSAT로 염색된 15개 혈관(평균 크기 약 1200 sq mm2, 범위 350 내지 3,500mm2)을 랜덤한 분야로부터 선택하고 단위 영역 당 각 혈관에 대한 평균 로다민 형광성을 레이저 초점이 같은 영상 분석에 의해 임의의 단위에서 측정한다. 데이터는 혈관의 임의의 단위에서의 평균 형광성 강도 ± 표준 편차(SE)로서 표현된다.
도 6에 플롯된 결과는 αⅴβ3의 염색이 윌콕슨 랭크 섬 테스트(P〈0.0001)에 의해 결정된 바와 같이 bFGF로 처리된 CAMs 상에서 상당히 증진된(4배 이상) 반면, β1염색은 bFGF 처리와 상당히 상이하지 않다.
CAM 검정을 추가로 사용하여 β1및 β3인테그린의 발현에 대한 또 다른 강력한 혈관 형성 유도인자인 종양 괴사 인자-알파(TNF-α)의 효과를 검사한다. bFGF 또는 TNFα로 함침시키고 10일 배아로부터의 CAMs 상에 위치한 필터 디스크는 72시간 후 국소적 혈관 형성을 증진시키는 것으로 밝혀졌다.
결과는 처리되지 않거나(도 7A), bFGF로 처리되거나(도 7B) 또는 TNFα로 처리된(도 7C) CAM의 현미경사진으로 제시된다. bFGF 및 TNFα 처리된 제제 모두에서는 혈관이 용이하게 가시적이지만, 처리되지 않은 CAM에서는 존재하지 않는다. 따라서, 성장 인자/사이토킨을 국부적으로 적용하면, 인접한 영역에서의 성숙한 혈관으로부터 혈관이 본래 없는 영역으로의 혈관 형성이 유도된다. 도 5C에 도시된 바와 같이 bFGF-유도된 혈관과 이와 동시에 발생되는 αⅴβ3의 발현 측면에서 보면, TNFα로 처리하면 필적하는 활성이 발생된다.
이들 발견은 사람과 병아리 모두에 있어서 혈관 형성에 연관된 혈관이 αⅴβ3의 발현을 증진시킨다는 것을 지시하고 있다. 이와 일관되게, 배양된 내피 세포 상의 αⅴβ3의 발현은 문헌[참조: Janat et al.,J. Cell Physiol., 151:588(1992); Enenstein et al.,Exp. Cell Res., 203:499(1992); and Swerlick et al.,J. Invest. Derm., 99:715(1993)]에 기재된 바와 같이 시험관내에서 각종 사이토킨에 의해 유도될 수 있다.
항체 및 펩티드 억제제에 의한 성장 인자 유도된 혈관 형성에 대한 효과는 실시예 7A 및 7B에 제시되어 있다.
B.배아성 혈관 형성
배아성 신생혈관화의 천연적 형성에 대한 혈관 형성 억제제의 효과를 평가하기 위한 CAM 제제는 앞서 기술된 바와 같이 6일생 배아성 병아리 배아이다. 이러한 발생 단계에서는, 혈관이 신규한 성장을 진행하므로 αⅴβ3가 배아성 혈관 형성에 관여하는지를 결정하는데 유용한 시스템을 제공해준다. 검정을 10일생 배아 보다는 6일생 배아에서 수행하는 것을 제외하고는 CAM 시스템을 앞서 기재된 바와 같이 제조한다. 본 발명에 따른 항체 및 펩티드로의 처리에 의한 배아성 혈관 형성에 대한 효과가 실시예 7C에 제시되어 있다.
C.종양에 의해 유도된 혈관 형성
종양-유도된 혈관 형성에서의 αⅴβ3의 역할을 조사하기 위하여, 문헌[참조:Brooks et al.,J. Cell Biol., 122:1351(1993)]에 기재되고 본원에 기재된 바와 같이 17일생 병아리 배아의 CAM으로부터 미리 성장시키고 분리시킨 각종 αⅴβ3-음성 사람 흑색종 및 암종 단편을 CAM 검정에 사용한다. 이러한 단편은 완충제 단독의 존재 하에서 광범위한 신생혈관화를 유도하였다.
종양 단편을 CAM 상에 직접적으로 부착시킴으로써 혈관 형성을 CAM 검정 시스템에서 유도한다. 병아리 배아 CAM의 제조는 앞서 기술된 과정과 동일하다. 필터 종이 디스크 대신, 사람 흑색종 종양 M21-L, 사람 폐암 종양 UCLAP-3, 사람 췌장암 세포주 FG[Cheresh et al., Cell 58:945-953, 1989] 또는 사람 후두암 세포주 HEp3(이들 모두는 αⅴβ3음성 종양이다) 중의 하나의 50mg 내지 55mg 중량 단편을 혈관이 본래 결여된 영역 내의 CAM에 놓아둔다.
모두 αⅴβ3음성인, M21-L 사람 흑색종 세포주, UCLAP-3 사람 폐암 세포주, FG 췌장암 세포주, 또는 HEp3 사람 후두암 세포주를 사용하여 병아리 배아의 CAMs 상에서 고체 사람 종양을 성장시킨다. 8 x 106M21-L, UCLAP-3 및 FB 또는 5 x 105HEp3 세포의 단일 세포 현탁액을 먼저, 총 30㎕ 용적의 멸균성 HBSS 중의 CAMs에 적용한다. 상기 창을 테이프로 밀봉하고 배아를 7일 동안 배양하여 사람 종양 병변이 성장하도록 한다. 7일 마지막(지금은 17일 배아)에, 종양을 CAMs로부터 절제하고 주변 CAM 조직이 없도록 잘라낸다. 종양을 혈관 형성 또는 종양 성장 검정에 사용하기 위하여 50 내지 55mg 종양 단편으로 슬라이싱한다. 이러한 종양 단편을 혈관이 결여된 영역에서 실시예 6A에 기재된 바와 같이 새로운 셋트의 10일생 병아리 배아 CAM 위에 놓아둔다.
실시예 3A에 기재된 바와 같이 mAb LM609로의 αⅴβ3의 발현을 알아보기 위하여, 상기 병아리 배아 CAM 상에서 생체내 성장된 종양을 염색시킨다. 종양 세포의 어떠한 특이적 염색도 관찰되지 않았는데, 이는 αⅴβ3발현이 없다는 것을 지시해준다.
이어서, 종양-유도된 혈관 형성에 대한 항체 및 펩티드의 효과를 측정하기 위하여, 이들 CAM 종양 제제를 실시예 7D 및 7E에 기재된 바와 같이 연속적으로 처리한다. 종양의 퇴화 및 혈관 형성 혈관 및 혈관성 세포의 어팝토시스에 대한 항체 및 펩티드의 효과를 측정하기 위하여, 이러한 CAM 종양 제제를 또한 실시예 8, 9 및 12에 기재된 바와 같이 처리한다.
7.CAM 검정에서 측정된 바와 같은 혈관 형성의 억제
A.억제제의 국부적 적용에 의한 성장 인자-유도된 혈관 형성의 억제
1)모노클로날 항체로의 처리
αⅴβ3가 혈관 형성에서 능동적인 역할을 하는지를 결정하기 위하여, bFGF 또는 TNFα로 포화된 필터 디스크를 CAM 위에 놓아둔 다음, 모노클로날 항체(또한 mAb로서 지칭됨), LM609(αⅴβ3에 대해 특이적임), CSAT(β1에 대해 특이적임), 또는 P3G2 또는 P1F6(모두 αⅴβ5에 대해 특이적임)를 상기 제제에 가한다.
bFGF로 포화된 필터 디스크에 의해 10일생 병아리 배아로부터의 CAM 상에서 혈관 형성을 유도시킨다. 이어서, 디스크를 0, 24 및 48시간에 총 25㎕ 용적의 멸균 HBSS 중에 mAb 25mg을 함유하는 50ml HBSS로 처리한다. 72시간에, CAM을 수거하고 이를 35mm 페트리 디쉬에 놓아두고 인산염 완충된 식염수 1ml로 1회 세척한다. 이어서, 필터지와 CAM의 바닥면을 올림푸스 스테레오 현미경으로 분석하는데, 이는 두명의 관찰자가 이중 블라인드 방식으로 분석한다. CAM이 상기 디스크 하에서 직접적으로 CAM의 혈관 침윤을 50% 이상 감소시키는 것으로 나타낼 때 혈관 형성 억제가 유의성인 것으로 간주된다. 실험을 항체 당 4회 반복하고, 이때 조건 당 6 내지 7개 배아를 사용한다.
bFGF-유도된 혈관 형성에 대한 mAb 처리의 효과에 관한 결과가 도 8A 내지 8B에 도시되어 있다. 혈관이 결여된 처리되지 않은 CAM 제제가 도 8B에 도시된 bFGF-혈관 유도 및 8C 내지 8E에 도시된 mAb에 의한 효과와의 비교를 제공하기 위해 도 8A에 도시되어 있다. mAb LM609로 처리된 이들 CAM의 약 75%가 도 8E에 도시된 바와 같이 혈관 형성을 〉50% 억제시키는 것으로 나타났으며, 이들 중 상당수가 혈관 침윤이 결여된 것으로 보인다. 이와는 달리, 완충제 대조군(도 8A) 및 mAb CSAT(도 8C) 및 P3G2(도 8D)로 처리된 디스크는 일관되게 광범위한 혈관화를 나타내었다.
혈관 형성을 TNFα로 유도하는 경우에 동일한 결과가 수득되었다. 혈관이 결여된 영역과 인접한 정상적인 혈관 발생으로부터 존재하는 미리 존재하는 성숙한 혈관에 대한 이들 동일한 항체의 효과를 검사하기 위하여, mAb로 포화된 필터 디스크를 사이토킨이 국부 투여되지 않은 10일생 배아로부터의 CAM의 혈관화 영역 위에 놓아둔다. 입체 현미경으로 가시적으로 평가한 결과, 3가지 mAb 중의 어떠한 것도 미리 존재하는 혈관에 전혀 영향을 미치지 못하였다. 따라서, mAb LM609는 새로운 혈관 성장에 대해서만 선택적으로 억제시키며 인접한 영역에 존재하는 성숙한 혈관에 대해서는 영향을 미치지 않았다. 실시예 7A2) 및 7E2)에 각각 기재된 바와 같이 국부적 또는 정맥내 투여된 합성 펩티드를 적용하는 경우에 동일한 결과가 나타났다.
2)합성 펩티드로의 처리
성장 인자 유도된 혈관 형성에 대한 사이클릭 및 선형화된 펩티드의 효과를 결정하기 위하여 본 발명의 합성 펩티드를 사용하여 CAM 검정을 수행한다. 이러한 펩티드는 실시예 1에서와 같이 제조하며 펩티드 80㎍이 총 25㎕ 용적의 멸균 HBSS에 존재한다. 이러한 펩티드 용액을 CAM 용액에 즉시 적용하고 24 및 48시간에 다시 적용한다. 72시간에 필터지 및 주변 CAM 조직을 절개하고 앞서 기재된 바와 같이 검사한다.
이러한 검정으로부터 나타난 결과는 합성 펩티드를 종양 유도된 혈관 내로 정맥내 주입시킨 실시예 7E2)에서 기재된 바와 같이 도 9A 내지 9C에 도시된 것과 유사하다. 대조군 펩티드 62186을 사용하는 경우 bFGF- 유도된 혈관이 도 9A에 도시된 바와 같이 파열되지 않은 채로 유지되었다. 사이클릭 RGD 펩티드 62814를 상기 필터에 적용하는 경우와는 대조적으로, 혈관 형성이 억제되었는데, 이로써 새로운 혈관계가 결여된 영역이 생긴다. 이러한 효과는 다음 실시예 7E2)에 기재된 바와 같이 도 9B에 도시된 것과 외관상 유사하다. 또한, 정맥내 주입된 펩티드에 대해 도 9C에 도시된 바와 같이, 성숙한 혈관이 성장 인자 포화된 필터 위치로부터 멀리 떨어져 존재하는 영역에서는, 이와 같이 동떨어진 혈관에 대하여 합성 펩티드를 국부적 처리한 경우에 어떠한 효과도 관찰되지 않았다. 따라서, 혈관 형성에 대한 펩티드의 억제 활성은 성장 인자에 의해 유도된 혈관 형성의 영역으로 제한되며 인접한 미리 존재하는 성숙한 혈관에는 전혀 영향을 미치지 않거나 주변 영역에 대해서는 어떠한 유해한 세포독성도 나타내지 않는다.
실시예 1에서 제조되고 표 1에 열거된 다른 합성 펩티드를 사용하여 유사한 검정을 수행한다.
3)MMP-2 펩티드 단편으로의 처리
혈관 형성에 대한 MMP-2 펩티드 단편의 생물학적 효과를 입증하기 위하여, 혈관 형성이 HBS 중의 1.0㎍/ml의 농도로 bFGF로 10분간 포화시킨 필터 디스크를 사용하여 유도되었다는 것을 제외하고는 상기 언급된 바와 같이 CAM 검정을 수행한다. 이어서, 상기 디스크를 미리 존재하는 혈관의 수가 감소된 영역에서의 CAM에 위치시킨다. 앞서 기재된 바와 같이 제조된 C-말단 CTMMP-2(410-637) 융합 단백질, 또는 대조군 GST 수용체 결합된 융합 단백질(RAP)(HBSS 30㎕ 중의 1.5㎍)을 총 3일 동안 1일 1회씩 필터 디스크에 국부적으로 적용한다. 배양 주기가 끝날 무렵, 상기 배아를 희생시키고 필터 디스크와 진행되는 CAM 조직을 절제하고 입체 현미경을 사용하여 혈관 형성에 대해 분석한다. 필터 디스크의 경계 내에 발생되는 혈관 분기점의 수를 계수함으로써 혈관 형성을 정량화한다. 이와 같이 분지된 혈관은 새로운 혈관 형성 발생 혈관에 1차적으로 상응하는 것으로 간주된다.
정량화는 2명 이상의 독립적인 관찰자에 의해 이중 블라인드 방식으로 수행한다. 결과가 혈관 형성 지수로 표현되는데, 여기서 혈관 형성 지수는 필터 당 분기점(bFGF 자극됨)의 수 - 분기점(자극되지 않은 대조군)의 수이다. 실험은 통상 조건 당 6 내지 10개의 배아를 사용한다.
CAM 혈관 형성 검정 결과가 도 25A 내지 D, 26 및 27에 도시되어 있다. 도 25에서, 4개의 그림, 즉 도 25A 내지 25D로 나눈 일련의 사진은 CTMMP-2 융합 단백질(CTMMP-2(410-637))의 존재 하에서 억제된(도 25C 및 D) 및 대조군 GST 융합 단백질의 존재 하에서 억제되지 않은(도 25A 및 B) 혈관 형성의 비교를 나타낸 것이다. 도 26 및 27은 대조군(bFGF 단독 또는 GST-RAP 융합 단백질)과 비교하여, 상기 언급된 바와 동일한 융합 단백질인 CTMMP-2를 이용한 CAM 혈관 형성 검정의 혈관 형성 지수를 예시하는 막대 그래프이다. 도 27에서는, CTMMP-2(410-637) 융합 단백질을 사용한 2가지 별개의 실험(#1 ＆ #2) 결과가 도시되어 있다.
3가지 숫자로 나타낸 이들 결과는 MMP-2의 C-말단 영역을 함유하는 폴리펩티드 또는 CTMMP-2 융합 단백질이 αⅴβ3억제에 의해 bFGF-매개된 혈관 형성을 억제하는데 유용한 조성물이라는 것을 지시해준다.
B.억제제의 정맥내 투여에 의한 성장 인자 유도된 혈관 형성의 억제
1)모노클로날 항체로의 처리
CAM 제제 내로 정맥내 주입된 모노클로날 항체를 사용한 성장 인자-유도된 혈관 형성에 대한 효과를 또한 본 발명에 사용하기 위해 평가한다.
정맥내 주입용 병아리 배아 CAM 제제는 본질적으로 실시예 7A에 기재된 바와 같은데, 약간만 변형되었다. 캔들링 과정 동안 두드러진 혈관을 선별하고 이들의 위치를 지시하기 위해 난 껍질에 마크한다. 이 껍질에 구멍을 뚫고 CAM을 떨어뜨리며 bFGF 포화된 필터지를 상기 언급된 바와 같이 CAM에 놓아둔다. 창을 멸균 테이프로 밀봉하고 배아를 배양기에 위치시킨다. 24시간 후에, 앞서 선별된 두드러진 혈관 전반에 걸쳐 직접적으로 난 껍질의 측면 상에 제2의 작은 창을 조심스럽게 절단한다. 바깥쪽 껍질을 조심스럽게 제거하면 배아성 막이 본래대로 남게된다. 혈관이 용이하게 가시화되도록 해주는 광유(Perkin-Elmer Corp, Norwalk, CT) 작은 방울을 이용하여 상기 껍질 막을 투명하게 만든다. 정제된 멸균성 mAb, 또는 합성 펩티드(이는 다음에 기재되어 있다)를, 총 100㎕ 용적의 멸균 PBS 중의 배아당 IgG 200㎍의 용량으로 30게이지 바늘을 이용하여 혈관 내로 1회 직접적으로 접종한다. 창을 테이프로 밀봉하고 배아를 72시간이 될 때까지 배양한다. 필터 디스크와 주변 CAM 조직을 앞서 기재된 바와 같이 분석한다.
본 실시예 및 다음 실시예에 나타낸 바와 같이, LM609로 미리 정맥내 접종시킨 CAM 조직 또는 종양 조직에서의 LM609 mAb의 국재를 결정하기 위하여, 고정된 분획을 실온에서 1시간 동안 HBSS 중의 2.5% BSA로 차단한 다음, 염소 항-마우스 로다민 표지된 2차 항체(Tago)의 1:250 희석물로 염색한다. 이어서, 상기 분획을 자이쓰 면역형광성 화합물 현미경으로 분석한다.
bFGF 유도된 혈관 CAM 제제에 대한 정맥내 항체 처리 결과가 도 10A 내지 도 10C에 도시되어 있다. 도 10A에서는, bFGF 처리 결과로서 유도된 혈관 형성이 도시되어 있다. 도 10B에 도시된 바와 같이, 항-αⅴβ5항체인 mAb P3G2에 대해 정맥내 노출한 경우에는 bFGF 유도된 혈관계의 존재에 어떠한 변화도 관찰되지 않았다. 이와는 달리, 항-αⅴβ3항체인 LM609로 bFGF 유도된 혈관 형성 CAM 제제를 처리한 경우에는 도 10C에 도시된 바와 같은 필터 영역 내로 새로운 혈관이 성장하는 것을 완전하게 억제할 수 있다. 따라서, 혈관 형성에 대한 억제 효과는 LM609 항-αⅴβ3특이적 항체에 의한 αⅴβ3수용체 활성의 억제로부터 야기된 것이다. αⅴβ5를 차단하는 것이 CAM 필터 부위 내로의 신생혈관계의 형성을 억제하지 않기 때문에, αⅴβ5이 αⅴβ3와 비교해서 새로운 혈관 성장에 필수적이지 않다.
2)합성 펩티드로의 처리
혈관 형성을 앞서 기재된 바와 같이 1 내지 2㎍/ml bFGF로 유도시킨 CAM 제제의 경우에는, 혈관 형성을 bFGF로 유도한지 18시간 후에 합성 펩티드 69601(대조군) 및 66203(서열 5)을 개별적으로 상기 CAM 제제에 정맥내 주입한다. 이 제제를 36 내지 40시간 더 유지시킨 후, 분기점의 수를 앞서 기재된 바와 같이 결정한다.
결과가 도 28에 도시되어 있는데, 여기서는 펩티드 66203이 대조군 펩티드를 이용한 억제 부재와는 대조적으로 bFGF-유도된 혈관 형성을 완전하게 억제하였다.
다른 검정에서는, 펩티드 85189(서열 15)를 대상으로 하여, 10 내지 300㎍/배아의 용량 범위에 걸쳐 CAM 검정에서 bFGF-유도된 혈관 형성을 억제하는 것에 대해 평가한다. 이러한 검정을 앞서 기술된 바와 같이 수행한다. 결과가 도 29에 도시되어 있는데, 여기서는 가장 낮은 유효 용량은 30㎍이고 100 및 300㎍이 거의 완벽하게 혈관 형성을 억제한다.
추가의 검정에서는, 항-혈관 형성 활성을 알아보기 위하여 펩티드 85189를 펩티드 69601 및 66203와 비교한다. 50㎍ 펩티드를 사용하는 것을 제외하고는 상기 검정을 앞서 기재된 바와 같이 수행한다. 도 30에 플롯된 결과는 펩티드 66203(표지된 203) 및 85189(표지된 189)가 bFGF-처리된(표지된 bFGF) 및 69601-처리된(표지된 601) 대조군과 비교해서 bFGF-매개된 혈관 형성의 유효한 억제제라는 것을 나타낸다.
펩티드 85189의 상이한 염 형성의 효능을 유사한 bFGF-유도된 CAM 검정에서 평가한다. 이러한 펩티드를 100㎍/배아로 사용한다. HCl(펩티드 85189) 및 TFA(펩티드 121974) 중의 동일한 펩티드 서열은 bFGF-유도된 혈관 형성을 억제하였으며, HCl 제형화된 펩티드가 TFA 중의 것보다 약간 더 효과적이다(펩티드 85189 대 121974에 대한 각각의 분기점의 수는 30 대 60이다). "사이토킨이 아닌"것으로 표지된 처리되지 않은 CAM은 bFGF 처리로 관찰된 바와 같이 많은 분기점의 대략 절반을 갖는데, 각각 70 대 190이다. 대조군 펩티드 69601로의 처리는 혈관 형성을 억제하는데 어떠한 효과도 나타내지 않았다(230 분기점).
실시예 1에서 제조된 다른 합성 펩티드를 상기 기술된 바와 같이 CAM 제제에서 성장 인자 유도된 혈관 내로 개별적으로 정맥내 주입한다. 혈관의 생존성에 대한 펩티드의 효과를 유사하게 평가한다.
3)MMP-2 단편으로의 처리
상기 언급된 프로토콜을 사용하여, CTMMP-2(445-467) 및 CTMMP-2(10-1)로서 지칭되고 또한 CTMMP-2(274-637)로서 지칭된 MMP-2 융합 단백질 CTMMP-2(2-4)의 효과를 또한 평가한다. 융합 단백질 50㎍을 bFGF-처리된 배아에 투여하는 것을 제외하고는 상기 검정을 앞서 기재된 바와 같이 수행한다. 융합 단백질 처리 효과를 24시간, 48시간 및 72시간에 평가한다.
결과는 혈관 형성을 처리없음, bFGF 처리, bFGF 처리에 이어서 bFGF + MAID(MAID = MMP-2 혈관 형성 억제 영역)로서 표지된 CTMMP-2(2-4)로 처리, 및 bFGF 처리에 이어서 bFGF + 대조군으로서 표지된 CTMMP-2(10-1) 처리의 검정 조건하에서 사진으로 평가한 도 31A 내지 L에서 선택된 시간 동안 나타내었다. bFGF 처리시킨지 48 및 72시간 후에 야기된 상당한 혈관 형성 유도가 단지 CTMMP-2(2-4)로의 노출에 의해서 거의 완전하게 억제되었다. CTMMP-2(2-4)을 이용한 억제 정도는 몇몇 생체내 항-혈관 형성 활성을 나타내는 CTMMP-2(10-1)을 사용한 경우에 관찰된 것보다 훨씬 크다.
앞서 기재된 바와 같이 제조된 다른 MMP-2 조성물, 완전한 MMP-2, 단편 및 융합 단백질을 또한, 상기 기술된 바와 같이 CAM 제제에서 성장 인자 유도된 혈관 내로 개별적으로 정맥내 주입한다. 혈관의 생존성에 대한 펩티드의 효과를 유사하게 평가한다.
C.국부적 적용에 의한 배아성 혈관 형성의 억제
1)모노클로날 항체로의 처리
αⅴβ3가 배아성 혈관 형성에 관여하는지를 결정하기 위하여, CAM 상에서의 혈관의 신규한 성장에 대한 LM609의 효과를 실시예 5A에 기재된 바와 같이 활성 신생혈관화가 특징적으로 나타나는 단계인 6일생 배아에서 검사한다. 사이토킨의 부재하에서 6일생 배아의 CAM 상에 놓여진 mAb로 포화된 디스크를 연속적으로 국부적 적용하여 실시예 6C에 기재된 바와 같이 CAM 검정을 준비한다. 3일 후, CAM을 절제하고 사진을 찍는다. 각 실험은 그룹 당 6개 배아를 포함하고 2회 반복한다.
CSAT(도 11A) 또는 P3G2(도 11B)가 아니라 항체 LM609(도 11C)가 이들 조건하에서 혈관성 성장을 방지하였으며; 이는 αⅴβ3가 혈관 형성 유도를 위해 첨가된 성장 인자와 독립적으로 배아성 신생혈관화에 상당한 역할을 한다는 것을 지시해준다.
2)합성 펩티드로의 처리
실시예 1에서 제조된 합성 펩티드를 CAM에 국부적으로 적용하거나 혈관에 정맥내 적용함으로써 실시예 5A2)에 기재된 바와 같고 앞서 제조된 배아성 CAM 제제에 개별적으로 가한다. 혈관의 생존성에 대한 펩티드의 효과를 유사하게 평가한다.
D.국부적 적용에 의한 종양-유도된 혈관 형성의 억제
1)모노클로날 항체로의 처리
배아성 혈관 형성에 대한 항-αⅴβ3길항제, LM609 및 각종 펩티드의 효과를 평가하는, 상기 언급된 혈관 형성 검정 이외에, 종양-유도된 혈관 형성에서의 αⅴβ3의 역할을 또한 조사한다. 유도인자로서, 앞서 성장되고 17일생 병아리 배아의 CAM으로부터 분리된 αⅴβ3-음성 사람 M21-L 흑색종 단편을 사용한다. 이러한 단편은 실시예 6C에 기재된 바와 같이 제조한다.
실시예 7A1)에서 기재된 바와 같이, mAb를 HBSS 25㎕ 중의 25㎍의 농도로 종양 단편에 개별적으로 국부적 적용한 다음 창을 테이프로 밀봉한다. 24시간 및 48시간에 mAb를 동일한 방식으로 다시 가한다. 72시간에, 종양 및 주변 CAM 조직을 실시예 7A1)에 기재된 바와 같이 분석한다.
실시예 6C에 기재된 바와 같이, 문헌[참조:Felding-Habermann et al., J. Clin. Invest., 89:2018(1992)]에 기재된 바와 같이 인테그린 αⅴβ3를 발현시키지 않는 배양된 M21-L 세포를 10일생 병아리 배아의 CAM 상으로 이식함으로써 종양을 초기에 유도한다. 이들 αⅴβ3의 음성 단편은 완충액 단독, 또는 mAb CSAT(항-β1) 또는 P3G2(항-αⅴβ5)의 존재 하에서 광범위한 신생혈관화를 유도하였다. 이와는 대조적으로, mAb LM609(항-αⅴβ3)는 종양괴와 주변 CAM으로의 대부분 혈관의 침윤을 감소시켰다.
종양 유도된 혈관 형성에 대한 mAb의 효과를 정량화하기 위하여, CAM의 초점면 내에서 종양으로 유입되는 혈관을 이중 블라인드 방식으로 2명의 관찰자가 입체 현미경으로 관찰하여 계수한다. 도 12에 제시된 각 데이터 막대는 이중 실험을 나타내는 각 그룹에서 12 CAM으로부터의 평균 혈관수 ± SE를 나타낸다.
이러한 정량적 분석은 윌콕슨 랭크 섬 테스트에 의해 결정된 바와 같이 완충액, 또는 다른 mAb인 P3G2 또는 CSAT(P〈0.0001)으로 처리된 종양과 비교해서 mAb LM609로 처리된 종양으로 유입되는 혈관의 수가 3배 정도 감소되었다는 것을 나타낸다. M21-L 종양이 αⅴβ3를 발현하지 못한다는 사실은 mAb LM609가 종양 세포가 아니라 혈관 세포에 직접적으로 영향을 미침으로써 혈관 형성을 억제한다는 것을 지시해준다. 이들 결과는 도 3A 내지 3D에서 제시된 암 조직 생검에서의 αⅴβ3의 조직학적 분포에 상응하며, 여기서 αⅴβ3의 분포는 종양 세포 그 자체가 아니라 종양 중의 혈관으로 제한된다.
2)합성 펩티드로의 처리
MMP-2-유도된 펩티드 및 융합 단백질을 포함한, 실시예 1에서 제조된 합성 펩티드를 앞서 기재된 바와 같은 종양 유도된 혈관 형성 CAM 검정 시스템에 국부적으로 적용한다. 혈관의 생존성에 대한 펩티드의 효과를 유사하게 평가한다.
E.정맥내 적용에 의한 종양-유도된 혈관 형성의 억제
1)모노클로날 항체로의 처리
실시예 7E1)에 기술된 바와 같이 제조된 종양 유도된 혈관을 또한, 정맥내 주입하여 적용된 mAb로 처리한다. 종양을 실시예 7D1)에 기재된 바와 같이 CAM에 놓아두고 창을 테이프로 밀봉하고 24시간 후에, 정제된 mAb 200㎍을 앞서 기재된 바와 같이 병아리 배아 혈관에 1회 정맥내 접종한다. 이어서, 상기 병아리 배아를 7일 동안 배양한다. 이어서, 혈관 형성 정도를 상기 기재된 바와 같이 관찰하였다. 다음 실시예 8에 기재된 바와 같이, 이러한 주기 후, 종양을 절제하고 종양 성장 또는 억제에 대한 항체 노출의 효과를 결정하기 위해 이들의 중량에 근거하여 분석한다.
2)합성 펩티드로의 처리
CAM 검정 시스템에서 종양 유도된 혈관계에 대한 펩티드 노출 효과를 또한 평가한다. mAb를 정맥내 주입하는 것 대신, 실시예 1 및 실시예 7A2)에 기재된 바와 같이 제조된 합성 펩티드를 개별적으로 가시적 혈관으로 정맥내 주입하는 것을 제외하고는 종양-CAM 제제를 상기 언급된 바와 같이 사용한다.
HCl 염을 함유하는 사이클릭 펩티드 66203, 및 대조군 펩티드 62186을 이용한 CAM 검정 결과가 도 9A 내지 9C에 도시되어 있다. 도 9A에서, 대조군 펩티드로의 처리는 본래 혈관이 결여된 CAM의 영역 내로 성장되도록 종양 처리에 의해 유도된 풍부한 큰 혈관에 영향을 미치지 않았다. αⅴβ3에 대한 길항제인 사이클릭 RGD 펩티드 66203을 필터에 적용하는 경우와는 대조적으로, 혈관 형성이 억제되었는데, 이로써 도 9B에 도시된 바와 같이 새로운 혈관계가 결여된 영역이 남겨된다. RGD-함유 펩티드의 억제 효과는 특이적이고 종양이 위치한 곳과 인접하게 위치한 혈관에 어떠한 유해한 영향도 미치지 않는다는 사실로써 입증된 바와 같이 국재된다. 따라서, 도 9C에서는, 억제성 펩티드가 CAM 검정 시스템 내로 정맥내 주입되는 경우, 종양이 위치한 곳과 인접하긴 하지만 동떨어진 영역에서 CAM에 존재하는 미리 존재하는 성숙한 혈관에 대해서는 어떠한 효과도 관찰되지 않았다. 이러한 위치의 미리 존재하는 혈관은 이들 혈관 내에서 유동되는 억제성 펩티드에 의해 영향을 받지 않지만, 이들 미리 존재하는 혈관으로부터 종양괴로의 새로운 혈관의 발생은 억제되었다. 따라서, αⅴβ3의 길항제인 것으로 실시예 4의 리간드-수용체 검정에서 미리 나타낸 합성 펩티드 66203 및 62184는 미리 존재하는 성숙한 혈관이 아니라 발생되고 있는 혈관에 제한된 혈관 형성을 억제하는 것으로 본 발명에 의해 밝혀졌다. 또한, 상기 펩티드를 정맥내 주입하는 것은 도 9C에서 본래의 혈관계에의해 입증된 바와 같이 주변 영역에 어떠한 유해한 세포독성도 야기시키지 않는다.
실시예 1에서 제조되고 표 1에 열거된 다른 합성 펩티드를 본 발명의 MMP-2 조성물과 함께 사용하여 유사한 검정을 수행한다.
3)MMP-2 단편으로의 처리
CS-1 종양(β3-음성)을 상기 언급된 바와 같이 CAM에서 제조한다. 종양 성장한지 24시간 후에, CTMMP-2(2-4)로 명명되고 실시예 4A에 기재된 바와 같이 제조된 MMP-2 단편의 조성물을 PBS 100㎕ 중의 50㎍ 단편으로 정맥내 투여한다. 6일 후, 상기 종양괴에 대해 평가한다. CTMMP-2(2-4)로 처리된 종양은 CTMMP-2(10-1) 또는 PBS 대조군으로 처리된 대조군 종양의 성장 속도와 비교해서 성장 속도가 약 50% 정도 감소되었다. 따라서, αⅴβ3길항제는 종양 성장을 억제시킨다.
8.CAM 검정에서 측정된 바와 같은 α ⅴ β 3 길항제를 이용한 종양 조직 성장의 억제
실시예 7E1)에 기재된 바와 같이, 성장 인자 또는 종양 유도된 혈관 형성에 대한 항-αⅴβ3길항제의 효과를 가시적으로 평가하는 것 이외에, 노출 후 종양괴에 대한 모든 변화를 측정함으로써 상기 길항제의 효과를 또한 평가한다. 이러한 분석을 위하여, 종양 유도된 혈관 형성 CAM 검정 시스템을 실시예 6C 및 7D에 기재된 바와 같이 제조한다. 7일 배양 주기 말기에, 생성된 종양을 CAM으로부터 절제하고 어떠한 잔류성 CAM 조직도 없게 자르고, 1ml의 인산염 완충 식염수로 세척하고 각 종양에 대한 습윤 중량을 결정한다.
또한, 현미경을 이용한 조직학적 분석을 위한 종양을 제조에는 대표적인 예의 종양을 8시간 동안 불린 픽세이티브에 고정시키고 파라핀에 봉매시키는 것이 포함된다. 현미경 분석을 위해 일련의 분획을 절단하고 헤마톡실린 및 에오신(H＆E)으로 염색한다[참조:Gladson, et al.,J. Clin. Invest., 88:1924(1991)]. 분획을 올림푸스 화합물 현미경으로 250배율로 사진찍는다.
A.국부 적용
대조군 완충액(HBSS), P3G2(항-αⅴβ5) 또는 LM609(항-αⅴβ3)을 국부 적용함으로써 발생된 전형적인 사람 흑색종 종양(M12L) 중량 결과가 표 4에 열거되어 있다. 각 처리에 대해 수많은 배아를 평가하는데, 각각은 표의 하단에 제시된 바와 같이 평균치의 SE와 함께 산정된 것이다.
배아 번호 mAb 처리 종양 중량(mg)
1 HBSS 108
2 152
3 216
4 270
5 109
6 174
1 P3G2 134
2 144
3 408
4 157
5 198
6 102
7 124
8 99
1 LM609 24
2 135
3 17
4 27
5 35
6 68
7 48
8 59
mAb 처리 평균 종양 중량(mg)
HBSS 대조군 172 ± 26
P3G2 171 ± 36
LM609 52 ± 13
CAM 검정 시스템에서 LM609에 αⅴβ3음성 사람 흑색종 종양을 노출시키면, 처리되지 않은 평균 종양 중량이 172mg ± 26에서 52mg ± 13으로 감소되었다. P3G2 항체는 종양괴에 대하여 어떠한 영향도 미치지 않았다. 따라서, αⅴβ3의-특이적 LM609 항체를 국부적 적용함으로써 αⅴβ3의 길항제를 차단시키면, 앞서 실시예에 제시된 바와 같이 혈관 형성의 억제와 함께 질량괴의 퇴화가 야기된다. P3G2에 대한 노출로부터 발생된 종양괴의 측정된 직경은 대략 평균적으로 8mm 내지 1cm이다. 이와는 대조적으로, LM609 처리된 종양의 평균 직경은 2 내지 3mm이다.
이들 종양의 동결된 분획은 LM609에 노출된 종양에서 결핍되거나 유기화된 세포내 구조와는 대조적으로 P3G2에 노출된 종양에 대해 본래의 종양 세포구조를 나타내었다. 따라서, αⅴβ3수용체 활성은 αⅴβ3음성 종양이 αⅴβ3-발현 신생혈관계의 발생에 의해 육성된 이의 덩어리를 유지하는데 필수적이다. 본 발명의 αⅴβ3길항제로 αⅴβ3를 차단시키면 종양으로의 혈관 형성이 억제되어 궁극적으로는 종양괴가 탈실된다.
B.정맥내 적용
대조군 완충액(PBS, 인산염 완충 식염수), CSAT(항-β1) 또는 LM609(항-αⅴβ3)을 정맥내 적용함으로써 발생된 전형적인 암 종양(UCLAP-3) 중량 결과가 표 5에 열거되어 있다. 각 처리에 대해 수많은 배아를 평가하는데, 각각으로부터의 평균 종양 중량은 표의 하단에 제시된 바와 같이 평균치의 SE와 함께 산정된 것이다.
배아 번호 mAb 처리 종양 중량(mg)
1 PBS 101
2 80
3 67
4 90
1 CSAT 151
2 92
3 168
4 61
5 70
1 LM609 16
2 54
3 30
4 20
5 37
6 39
7 12
mAb 처리 평균 종양 중량(mg)
PBS 대조군 85 ± 7
CSAT 108 ± 22
LM609 30 ± 6
CAM 검정 시스템에서 LM609에 αⅴβ3음성 사람 암 종양괴를 노출시키면, 처리되지 않은 평균 종양 중량이 85mg ± 7에서 30mg ± 6으로 감소되었다. CSAT 항체는 종양괴의 중량에 상당한 영향을 미치지 않았다. 따라서, αⅴβ3특이적 항체를 정맥내 적용함으로써 αⅴβ3수용체를 차단시키면 앞서 실시예에 나타낸 바와 같이 혈관 형성의 억제와 함께, 상기 흑색종 종양괴에 대해서와 같이 암이 퇴화되었다. 또한, 사람 흑색종 종양 성장이 LM609의 정맥내 주입에 의해 유사하게 억제되었다.
9.CAM 검정에서 측정된 바와 같이 α ⅴ β 3 길항제를 이용한 종양 조직 성장의 퇴화
종양 성장과 생존에 대한 αⅴβ3길항제의 효과를 추가로 평가하기 위하여, 사람 흑색종 단편 및 폐암, 췌장암 및 후두암 단편을 실시예 5A에 기재된 바와 같이 10일생 배아의 CAM에 놓아둔다.
A.정맥내 적용
1)모노클로날 항체로의 처리
a.LM609(항-α ⅴ β 3 ) 및 CSAT(항-β 1 )로의 처리
CAM에 αⅴβ3음성 사람 흑색종 M21-L, 췌장암 FG, 사람 폐암 UCLAP-3 또는 사람 후두암 HEp3의 암 단편을 이식한지 24시간 후에, 배아에 PBS 단독 또는 단일 용량(300㎍/100㎕)의 mAb LM609(항-αⅴβ3) 또는 CSAT(항-β1)을 정맥내 주사한다. 종양을 6일 동안 더 증식시켜 둔다. 배양이 끝날 무렵, 종양을 조심스럽게 절제하고 주변 CAM 조직이 없게 자른다. 용이하게 규정될 수 있는 고체 종양괴 만을 제거시키면서 2명의 독립적인 관찰자가 종양 절제를 수행한다. 이러한 종양은 잘 정련된 모서리를 가지므로, 고형 종양괴와 용이하게 구별될 수 있는 얇은 반투명한 막(CAM)을 종양괴 자체는 파괴시키지 않으면서 제거한다. 절제된 중량을 칭량하고 형태학적 및 조직학적으로 조사한다.
도 13에 도시된 바와 같이, 7일째에 습윤 종양 중량을 측정하고 처리하기 전에 초기 종양 중량과 비교한다. 각 막대는 그룹 당 5 내지 10개 종양의 평균 ±S.E.를 나타낸다. mAb LM609는 시험된 모든 종양에서 대조군과 비교해서 종양 성장을 유의적으로(p〈0.001) 억제하였다. PBS 또는 CSAT로 처리된 종양은 모든 경우에 증식되었다. 이와는 달리, mAb LM609는 이들 종양의 성장을 방지시킬 뿐만 아니라 대부분의 경우에 광범위한 퇴화를 유도하였다. 중요하게는, 이들 종양 세포는 인테그린 αⅴβ3을 발현시키지 못하는데, 이는 성장 억제가 종양 세포에 직접적으로 기인된 것이 아니라 신생혈관계에 대한 항체의 항-혈관 형성 효과에 기인된 것임을 입증해준다.
b.LM609(항-α ⅴ β 3 ) 및 P3G2(항-α ⅴ β 5 )로의 처리
사람 M21-L 흑색종 종양 단편(50mg)을 실시예 5A에 기재된 바와 같이 10일생 배아의 CAM에 이식한다. 24시간 후에, 배아에 PBS 단독 또는 단일 용량(300㎍/100㎕)의 mAb LM609(항-αⅴβ3) 또는 P3G2(항-αⅴβ5)를 정맥내 주사한다. 종양을 실시예 9A1)에 기재된 바와 같이 증식시켜 두고 본원에 기술된 바와 같이 형태학적 및 조직학적으로 조사한다.
mAb LM609(항-αⅴβ3) 또는 P3G2(항-αⅴβ5)로 처리된 M21-L 종양의 대표적인 예를 형태학적으로 조사한다. P3G2로 처리된 종양은 크고(직경 8mm) 잘 혈관화된 반면 mAb LM609로 처리된 종양은 훨씬 더 작고(직경 3mm) 탐지할 만한 혈관이 없었다.
실시예 9A1)a에 기재된 바와 같이 조직학적 단편을 제조하고 헤마톡실린 및 에오신으로 염색함으로써 종양을 추가로 조사한다. 도 14에 도시된 바와 같이(상부 패널), mAb P3G2(항-αⅴβ5)로 처리된 종양은 핵분열 형상(화살촉) 뿐만 아니라 종양 지질 전반에 걸친 다중 혈관(화살)에 의해 지시된 바와 같이 생존성이고 활성적으로 나눠진 수많은 종양 세포를 나타내었다. 이와는 달리, mAb LM609(항-αⅴβ3)로 처리된 종양에서는 생존성 종양 세포 또는 혈관이 거의 탐지되지 않았다(도 14, 하부 패널). 이들 결과는 인테그린 αⅴβ3의 길항제가 종양 유도된 혈관 형성을 억제하여 성장이 중단되고 각종 사람 종양이 생체내에서 퇴화된다는 것을 입증해주고 있다. 종양 성장한지 7일(배아성 17일) 후에 조사된 배아는 이들이 αⅴβ3길항제로 처리되었는지를 총체적으로 조사했을 때 정상적인 것으로 나타났다는 것을 지적하는 것이 중요하다. 이러한 발견은 상기 인테그린의 길항제가 발생되는 배아에 대하여 비-독성을 나타낸다는 것을 지시해준다.
2)합성 펩티드로의 처리
사람 M21-L 흑색종 종양 단편(50mg)을 실시예 5A에 기재된 바와 같이 10일생 배아의 CAM에 이식한다. 24시간 후에, 배아에 단일 용량(300㎍/100㎕)의 사이클로-RADfV(69601) 및/또는 사이클로-RGDfV(66203)을 정맥내 주사한다. 총 72시간 후에, 실시예 9A1)에 기재된 바와 같이, 종양을 제거하고, 형태학적으로 조사한 다음 입체 현미경으로 사진을 찍는다.
도 15A 내지 15E에 도시된 패널은 다음과 같이 해당된다: 도 15A, 사이클로-RADfV 펩티드(69601)로 처리된 이중 샘플; 도 15B, 사이클로-RGDfV 펩티드(66203)으로 처리된 이중 샘플; 도 15C, 사이클로-RGDfV 펩티드(66203)으로 처리된 동일한 배아로부터 취한 인접한 CAM 조직; 및 도 15D 및 15E, 펩티드 처리된 종양의 고배율(13x) 사진. 도 15D는 대조군 펩티드(69601) 처리된 종양으로부터의 정상적인 혈관을 도시한 것이다. 도 15E는 사이클로-RGDfV 펩티드(66203) 처리된 종양(화살)로부터의 파괴된 혈관의 예를 도시한 것이다.
결과는 대조군 펩티드 69601과는 대조적으로 펩티드 66203만이 혈관 형성을 억제하였고 추가로 종양에 인접한 CAM 조직 중의 혈관이 영향을 받지 않았다는 것을 예시해준다.
대조군으로서 69601에 대한 αⅴβ3-반응성 펩티드 85189(서열 15)를 사용하여 부가적인 종양 퇴화 검정을 수행한다. 펩티드 100㎍을 이식한지 18시간 후에 CAM에 정맥내 주입하는 것을 제외하고는 상기 검정을 앞서 기재된 바와 같이 수행한다. 48시간이 더 지난 후, 종양을 절제하고 습윤 중량을 칭량한다.
도 32, 33 및 34는 각각, PBS 또는 펩티드 69601을 이용한 경우에 효과가 없는 것과는 대조적으로 펩티드 85189에 대한 정맥내 노출 후에 UCLAP-3, M21-L 및 FgM 종양에 대한 종양 중량이 감소되었다는 것을 보여준다.
10.생체내 래빗 안구 모델 검정에서 측정된 바와 같이 α ⅴ β 3 길항제를 이용한 종양 조직 성장의 퇴화
성장 인자 유도된 혈관 형성에 대한 항-αⅴβ3길항제의 효과는 안구 각막으로 예시되는 천연적으로 투명한 구조물에서 관찰할 수 있다. 새로운 혈관은 혈액 공급이 풍부한 각막 가장자리로부터, 정상적으로 혈액 공급이 이루어지지 않는 각막의 중심부로 성장된다. bFGF와 같은 혈관 형성의 자극인자가 각막 내로 적용되는 경우, 이는 각막 가장자리로부터의 새로운 혈관의 성장을 유도한다. 이러한 각막에 적용된 혈관 형성의 길항제는 각막 가장자리로부터의 새로운 혈관의 성장을 억제시킨다. 따라서, 각막에서는 내피 세포의 침입을 통한 혈관 형성이 각막 가장자리로부터 용이하게 가시적인 거칠은 콜라겐 팩킹된 각막 조직 내로 진행된다. 따라서, 래빗 안구 모델 검정은 화합물을 안구의 각막 내로 직접적으로 이식한 후 혈관 형성의 자극 및 억제를 직접적으로 관찰하기 위한 생체내 모델을 제공해준다.
A.생체내 래빗 안구 모델 검정
1)성장 인자에 의해 유도된 혈관 형성
성장 인자 bFGF를 사용한 생체내 안구 모델 검정에서 혈관 형성을 유도하고 이를 다음 장에 기술하였다.
a.성장 인자와 모노클로날 항체를 함유하는 하이드론 펠릿의 제조
성장 인자와 mAb를 함유하는 하이드론 중합체 펠릿을 문헌[참조:D'Amato et al., Proc. Natl. Acad. Sc I., USA, 91:4082-4085(1994)]에 기재된 바와 같이 제조한다. 개별적인 펠릿은 bFGF를 안정화시키고 이러한 성장 인자가 주변 조직 내로 서방출되도록 해주는 수크랄페이트(sucralfate; Caraft, Marion Merrell Dow Corporation)에 결합된 성장 인자 bFGF 650ng을 함유한다. 또한, PBS 중의 mAb LM609(항-αⅴβ3) 또는 mAb P1F6(항-αⅴβ5) 40㎍을 함유한 하이드론 펠릿을 제조한다. 이러한 펠릿을 특수하게 제조된 테플론 페그(이의 표면에 구멍이 뚫린 2.5mm코어를 갖는다)에서 주조한다. 주조 물질 약 12㎕를 각 페그에 놓아두고 멸균 후드에서 밤새 중합시킨다. 이어서, 펠릿을 자외선 조사하여 멸균시킨다.
b.모노클로날 항체로의 처리
각 실험은 3마리 래빗로 이루어지는데, 여기서 한쪽 안구에는 bFGF와 LM609를 포함하는 펠릿을 투여하고 다른쪽 안구에는 bFGF와 마우스 mAb P1F6(항-αⅴβ5)를 포함하는 펠릿을 투여한다. LM609를 다른 mAb와 PBS 대조군과 비교하기 위해 쌍을 이룬 안구 시험을 사용하는 것은 시험된 mAb 간의 상당한 차이를 입증해주는 엄격한 시험용 수단을 제공해준다.
P1F6 mAb는 혈관성 내피 세포의 표면에 발견되지만 아마도 혈관 형성에는 관여하지 않는 인테그린 αⅴβ5과 면역반응된다. mAb P1F6이 혈관 형성에 관여하는 지를 결정하기 위하여, 이러한 mAb 만을 함유하는 펠릿을 제조하고 다음에 기재된 바와 같이 검정하여 이러한 mAb가 혈관 형성을 유도하는 않는 지를 확인한다.
시험된 모든 mAb를 널리 공지된 방법에 따라서 단백질-A 세파로즈 CL-4B 친화 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 복수증 유액으로부터 정제한다. 이어서, 용출된 면역글로불린을 PBS에 대하여 투석하고 데톡시 겔(Pierce Chemicals)로 처리하여 내독소를 제거한다. 내독소는 강력한 안지오제믹 및 염증 자극인자인 것으로 밝혀졌다. 따라서, mAb를 대상으로 하여, 색소원성 리물루스 아메바양세포 용해물 검정(Bil-Whettaker)으로 내독소 존재에 대해 시험하고 탐지 가능한 내독소를 갖지 않는 mAb 만이 래빗 안구 모델 검정에 사용된다.
bFGF와 mAb LM609(항-αⅴβ3) 또는 P1F6(항-αⅴβ5)을 포함하는 하이드론 펠릿을 래빗의 안구에 형성된 각막 포켓에 삽입한다. 이러한 하이드론 펠릿은 또한, 검정 동안 bFGF를 안정화시키기 위한 수크랄페이트를 함유한다. 개별적인 펠릿을 래빗의 각막의 중간-지질에 형성된 외과적으로 생성된 "포켓"에 이식한다. 이러한 외과적 과정은 개개의 각막을 사진으로 기록하기 위한 카메라가 탑재된 빔스프리터가 장착된 현미경이 작동되는 와일드 모델 M691을 사용하여 멸균 기술하에 수행한다. 69 비버 블레이트를 이용하여 각막 두께 절반으로 3mm 절개함으로써 3mm x 5mm "포켓"이 각막 지질에 형성된다. 이 지질을 아이리스 압설자를 사용하여 말초적으로 절개하고 펠릿을 상기 가장자리로부터 2mm 떨어진 이의 말초적 변두리로 이식한다.
다음 14일 동안, bFGF와 mAb가 이식된 펠릿으로부터 주변 조직 내로 확산됨으로써 각막테로부터 혈관 형성을 수행한다.
각 처리의 대표적인 결과가 도 16A 내지 16E에 도시되어 있다. 존재하는 혈관의 양을 정량화하고 다음과 같이 정의되는 클럭 시간으로 기재한다. 클럭을 시간으로 나눈 것과 동일한 방식으로 안구를 12개의 동등한 분획으로 나눈다. 혈관의 1클럭 시간"은 안구의 특정 영역을 채우는 혈관의 양이 클럭 상의 1시간과 등가인 것을 지칭한다. bFGF만이 투여된 5마리 래빗은 현란한 혈관 형성을 나타내는데, 여기서 새로운 혈관이 각막테로부터 각막 중앙(이는 정상적으로 혈관을 갖지 않는다)으로 성장되었다. 이들 래빗 중의 1마리는 펠릿에 대한 혈관의 1 클럭 시간 만을 지닌다. bFGF와 mAb LM609 모두가 투여된 래비트 중의 2마리는 외과 수술후 14일 까지 탐지할 만한 혈관 형성을 전혀 나타내지 않았다. 이들 래빗 중의 1마리는 14일에 3개의 출혈성 병소와 발육되는 혈관을 지닌다. bFGF와 mAb P3G2(항-αⅴβ5)가 투여된 래빗은 광범위한 혈관화를 나타냈는데, 여기서는 새로운 혈관이 각막테로부터 각막으로 성장하였다. 이들 래빗 중의 1마리는 펠릿에 대해 단지 1 내지 2시간의 혈관을 지녔다.
래빗 안구 모델 검정에서 입증된 바와 같이, mAb LM609(항-αⅴβ3)이 투여된 래빗에서 성장 인자 bFGF의 존재 하에서 정상적인 파리림벌(paralimbal) 혈관에 대해서는 어떠한 혈관 형성 효과도 관찰되지 않았다. 이와는 대조적으로, mAb P3G2(항-αⅴβ5)가 투여된 래빗에서 성장 인자 bFGF의 존재 하에서 파라림벌 혈관 상에서 혈관 형성이 관찰되었다. mAb LM609에 의한 각막 혈관 형성의 완전한 억제는 선행 기술에서 보고된 어떠한 항-혈관 형성 시약 보다 훨씬 더 크다.
c.폴리펩티드로의 처리
각 실험은 8마리 래빗로 이루어지는데, 여기서 한쪽 안구에는 bFGF 100ng을 포함하는 펠릿을 투여하고 다른쪽 안구에는 VEGF 1㎍를 포함하는 펠릿을 투여한다. 이 펠릿을 앞서 기술된 바와 같이 각막 포켓에 삽입하고, 사이토킨은 연속적으로 각막 내로의 새로운 혈관의 성장을 자극하였다. 1ml의 PBS 중의 펩티드를 펠릿 삽입한 날 50㎍/래빗 kg의 초기 투여량으로 피하 투여하고 그 후 1일 20㎍/kg의 투여량으로 피하 투여한다. 7일 후, 각막을 앞서 기술된 바와 같이 평가한다.
대조군 펩티드 69601이 투여된 래빗은 vFGF와 VEGF 자극된 안구 모두에서 7일째 실질적인 각막 혈관 성장을 나타내었다. 펩티드 85189가 투여된 래빗은 vFGF-자극된 안구에서는 대조군과 비교해서 각막 혈관 성장 양의 50% 미만을 나타냈고 VEGF-자극된 안구에서는 거의 100% 억제를 나타내었다.
11.키메릭 마우스:사람 검정에서 측정된 바와 같이 α ⅴ β 3 길항제를 사용한 종양 조직 성장의 생체내 퇴화
SCID 마우스로부터의 피부 일부를 사람 신생아 피부에 놓아둠으로써 생체내 키메릭 마우스:사람 모델을 발생시킨다(도 17). 피부 이식체를 정착시킨 후, 사람 피부에 암 세포를 접종한다. 측정 가능한 종양이 정착된 후, mAb LM609(항-αⅴβ3)나 PBS를 마우스 꼬리 정맥에 주사한다. 2 내지 3주 후, 종양을 절제하고 중량 및 조직을 분석한다.
A.생체내 키메릭 마우스:사람 검정
생체내 키메릭 마우스:사람 모델을 필수적으로 문헌[참조:Yan et al.,J. Clin. Invest., 91:986-996(1993)]에 기재된 바와 같이 제조한다. 간략하게 언급하면, 2㎠ 면적의 피부를 SCID 마우스(6 내지 8주생)로부터 외과적으로 제거하고 이에 사람 피부를 놓아둔다. 마우스를 마취시키고 복부 측면의 각 면 위의 5㎠ 면적으로부터 모발을 면도하여 제거한다. 근막 아래의 완전한 두께의 피부를 제거함으로써 2㎠의 2개의 환상 이식층을 준비한다. 사람 신생아 피부로부터 유도된 동일한 크기의 완전한 두께 사람 피부 이식체를 상처 부위에 놓아두고 제자리로 봉합한다. 이식체를 피부에 봉합된 밴드-에이드로 덮는다. 마이크로스포어 가제를 또한 사용하여 상처를 덮는다.
M21-L사람 흑색종 세포주 또는 MDA 23.1 유방암 세포주(ATCC HTB 26; 조직 단편과 mAb LM609과의 면역반응성에 의해 αⅴβ3음성임)를 사용하여 SCID 마우스 상의 사람 피부 이식체 위에 고형 사람 종양을 형성시킨다. 5 x 106M21-L 또는 MDA 23.1 세포의 단일 세포 현탁액을 사람 피부 이식체 내로 피내 주입한다. 이어서, 상기 마우스를 측정될만한 사람 종양이 성장되도록 2 내지 4주 동안 관찰한다.
B.정맥내 적용
1)모노클로날 항체로의 처리
측정될만한 종양이 성장된 후, M21L 종양 세포를 주입시킨 SCID 마우스의 꼬리 정맥에 2 내지 3주 동안 1주에 2회씩 mAb LM609(항-αⅴβ3) 또는 PBS 250㎍을 정맥내 주사한다. 이 후, 종양을 피부로부터 절제하고 주변 조직이 없게 자른다. 몇몇 마우스를 대상으로 하여 각 처리에 대해 평가하고, 각 처리로부터의 평균 종양 중량을 산정하고 표 6의 하단에 제시하였다.
M21L 종양 번호 처리 종양 중량(mg)
1 PBS 158
2 192
3 216
4 227
5 LM609 195
6 42
7 82
8 48
9 37
10 100
11 172
처리 평균 종양 중량(mg)
PBS 197
LM609 113
마우스:사람 키메릭 검정 시스템에서 M21L αⅴβ3-음성 사람 암 종양괴를 mAb LM609(항-αⅴβ3)에 노출시키면 PBS 처리된 평균 종양 중량이 198mg에서 113mg으로 감소되었다.
mAb LM609(항-αⅴβ3) 및 PBS로 처리된 M21L 종양의 대표적인 예를 형태학적으로 조사한다. PBS 처리된 종양은 크고(직경 8 내지 10mm)이고 잘 혈관화된 반면 mAb LM609(항-αⅴβ3)로 처리된 종양은 훨씬 더 작고(직경 3 내지 4mm) 탐지할만한 혈관이 없다.
마우스:사람 키메릭 검정 시스템에서 M21L 흑색종 종양 세포를 이용한 다른 실험에서는, mAb LM609와의 반응성을 대조군 합성 펩타이드 69601(서열 6)과 비교해서, 합성 펩타이드 85189(서열 15)를 이용하여 수득된 반응과 비교한다. 이러한 검정을 앞서 기재된 바와 같이 수행한다. 도 35에 도시된 결과는 합성 펩타이드 85189는 종양 용적이 약 360mm3인 대조군 펩타이드와 비교해서 종양 용적을 25mm3이하로 감소시켰다는 것을 나타내고 있다. mAb LM609은 또한 종양 용적을 약 60mm3로 상당히 감소시킨다.
MDA 23.1이 주입된 피부 이식체에서 형성된 종양은 탐지할만하고 측정할만한 수준이다. 이와 같이 정착된 종양의 형태학적 조사 결과, 이식된 사람 조직으로부터 MDA 23.1 종양 세포로의 신생혈관화가 발생된 것으로 나타났다.
따라서, αⅴβ3특이적 LM609 항체 및 펩타이드를 정맥내 적용하여 αⅴβ3수용체를 차단시키면, 실시예 9 및 10에서 각각 기재된 바와 같이 CAM 및 래빗 안구 모델 시스템과 동일한 방식으로 상기 모델 시스템에서 암을 퇴화시켰다.
2)합성 펩타이드로의 처리
모노클로날 항체에 대해 상기 기재된 것과 유사한 과정에서, αⅴβ3의 펩타이드 길항제를 측정될만한 M21L 종양을 갖는 SCID 마우스의 꼬리 정맥에 정맥내 주사한다. 예비 분석에서는, 10 내지 25O㎍/ml의 농도 범위에 걸쳐 주사된 펩타이드 69601(대조군) 및 85189(시험용)에 대해 용량 반응 곡선을 수행한다. 도 36A 및 36B에 각각 도시된 결과를 이용하여 처리 후의 절제된 종양의 평균 용적과 중량을 결정한다. 펩타이드 85189는 대조군 펩타이드로 처리한 것과 비교해서, 시험된 농도 범위에서 M21-L 종양 성장을 억제하는데 효과적이며, 가장 효과적인 투여량은 250㎍/ml이다.
시간에 따른 펩타이드 85189 처리 효과를 분석하기 위하여, 동일한 SCID 종양 모델에서 2가지 처리 섭생을 평가한다. 한 검정에서는, 6일째에 펩타이드 85189 또는 69601로의 처리를 개시하며, 0일에는 M21-L 종양 세포 3 x 106를 마우스 피부로 피하 주사하고, 펩타이드 85189 250㎍/ml를 복강내 주사하거나 대조군 69601을 29일 까지 매일 주사한다. 처리를 20일에 개시하는 것을 제외하고는 다른 검정을 동일하게 수행한다. 이러한 검정이 끝날 무렵, 종양을 절제하고 평균 종양 용적(mm3)을 결정한다. 데이터를 이러한 평균 값 ±표준 오차로서 플롯한다.
이들 검정 결과가 각각 도 37A 및 37B에 도시되어 있는데, 이는 펩타이드 69601이 아닌 85189가 처리 개시 후 특정한 처리 섭생에 따라서 여러 날에서 종양 성장을 억제하였다는 것을 지시하고 있다. 따라서, 펩타이드 85189가 혈관 형성 및 이에 따른 종양 성장 모두에 대해 유효한 αⅴβ3길항제이다.
12.CAM 검정에서 측정된 바와 같이 인테그린 α ⅴ β 3 의 길항제의 존재 하에서 세포 주기를 도입하고 어팝토시스를 진행하기 위한 혈관성 세포의 자극
혈관 형성 과정은 명백하게, 혈관성 세포 증식을 자극하기 위한 bFGF 및 VEGF 등의 사이토킨의 능력에 좌우된다[참조:Mignatti et al.,J. Cell. Biochem.,471:201(1991); Takeshita et al.,J. Clin. Invest., 93:662(1994); and Koyama et al.,J. Cell. Physiol., 158:1(1994)]. 그러나, 시그널링 사건이 이들 혈관성 세포를 성숙한 혈관으로 분화시키는 것을 조절할 수 있다는 것은 명백하다. 따라서, 새로운 성장 또는 혈관 형성을 진행하는 혈관성 세포의 성장 또는 분화와 관련된 시그널로 방해하면 혈관 형성을 섭동시킬 수 있는 것으로 생각된다.
인테그린 연결 사건은 세포 증식 뿐만 아니라 시험관내 어팝토시스 또는 프로그램된 세포 사멸 모두에 관여하는 것으로 밝혀졌다[참조:Schwartz,Cancer Res., 51:1503(1993); Meredith et al.,Mol. Biol. Cell., 4:953(1993); Frisch et al.,J. Cell Biol., 124:619(1994); and Ruoslahti et al.,Cell, 77:477(1994)]. 혈관 형성에 대한 αⅴβ3길항제의 효과에 관한 밀접한 조사는 불연속적이고 파괴된 종양-연관 혈관이 존재한다는 것을 나타낸다. 따라서, 혈관 영속성의 상실은 혈관성 세포의 선택적인 괴사 또는 어팝토시스에 기인된 것일 수 있다.
이러한 가능성을 조사하기 위하여, 성장 인자 bFGF로 혈관 형성을 유도하고 본 발명의 mAb 및 사이클릭 펩타이드로 처리한 후 CAM을 검사한다.
A.모노클로날 항체로의 처리
DNA의 단편화를 탐지하기 위하여 조직으로부터 분리된 DNA를 직접적으로 검사하고 단편화된 DNA의 유리 3'OH 그룹을 특이적으로 탐지하는 항체를 이용하여 본래의 조직에서 3'OH를 탐지하는 것을 포함하는 각종 방법에 의해 어팝토시스를 탐지할 수 있다.
1)DNA 단편화의 분석
bFGF로 포화된 필터 디스크를 실시예 6A에 기재된 바와 같이 10일생 배아의 CAM에 놓아둠으로써 혈관 형성을 유도한다. LM609(항-αⅴβ3)로 CAM을 면역조직학적으로 분석한 결과, bFGF로 혈관 형성을 개시한지 12 내지 24시간 후에 혈관 상에 αⅴβ3가 최고조도 발현되었다. 따라서, bFGF로 자극한지 24시간 후에, 배아에 PBS 단독, 또는 mAb CSAT(항-αⅴβ1) 또는 LM609(항-αⅴβ3) 300㎍을 함유하는 PBS 100㎍을 정맥내 접종한다.
mAb LM609(항-αⅴβ3), CSAT(항-αⅴβ1) 또는 PBS로 정맥내 접종한지 24시간 또는 48시간 후에 bFGF 포화된 필터 디스크 바로 아래에서 CAM 조직을 절제함으로써 DNA 단편화를 탐지할 수 있다. 절제된 CAM 조직을 멸균 PBS로 3회 세척하고 미세하게 분쇄하며, 0.25% 세균성 콜라게나제(Worthington Biochemical; Freehold, NJ)에 재현탁시키며 간헐적으로 와동시키면서 37℃에서 90분 동안 배양한다. DNA를 앞서 기재된 바와 같이 단일 세포 현탁액으로부터 동수의 CAM 세포로부터 추출한다[참조:Bissonette et al., Nature, 359:552(1992)]. 간략하게 언급하면, 동수의 CAM 세포를 10mM 트리스-HCl(pH 8.0), 0.5%(v/v) 트리톤 X-100(Sigma, St. Louis, MO) 중의 10mM EDTA에서 용해시킨다. 세포 용해물을 4℃에서 15분 동안 16,000x g로 원심분리시켜 본래의 크로마틴 펠릿으로부터 단편화된 가용성 DNA를 분류시킨다. 단편화된 DNA를 세척하고, 침전시킨 다음 1.2%(v/v) 아가로즈 겔 상에서 분석한다.
가용성의 단편화된 DNA를 각 처리로부터 동수의 CAM 세포로부터 분리하고, 아가로즈 겔 상에서 전기영동적으로 분류한 다음, 에티듐 브로마이드로 염색함으로써 가시화한다. 처리한지 24시간 후에 3가지 상이한 처리로부터 발생된 DNA 단편화의 상대적 양에서는 어떠한 차이도 탐지되지 않았다. 그러나, mAb LM609(항-αⅴβ3)로 처리한지 48시간째에, mAb CSAT(항-β1) 또는 PBS 단독으로 처리된 배아와 비교해서 DNA 단편화가 상당히 증가된 것이 관찰되었다.
2)세포 주기를 도입하기 위한 혈관성 세포의 자극
이들 과정에서의 αⅴβ3)의 역할을 실험적으로 조사하기 위하여, bFGF로 처리되거나 처리되지 않은 CAM으로부터 유도된 세포를 프로피듐 요오다이드로 염색시키고 mAb LM609(항-αⅴβ3)와 면역반응시킨다.
mAb LM609(항-αⅴβ3), CSAT(항-β1) 또는 PBS로 처리된지 24시간 및 48시간이 지난 배아로부터 분리된 CAM을 앞서 기재된 바와 같이 세균성 콜라게나제와 함께 배양함으로써 단일 세포 현탁액으로 해리시킨다. 이어서, 단일 세포를 침투되도록 하고 제조업자(Oncor, Gaithersburg, MD)의 지시에 따라서 탐지 키트(Apop Tag Insitu Detection Kit)로 염색시킨다. 아포프 태그는 단편화된 DNA의 유리 3'OH그룹을 특이적으로 탐지하는 항체이다. 이러한 유리 3'OH 그룹의 탐지는 아팝토틱 세포를 탐지하기 위해 정립된 방법이다[참조:Gavrieli et al.,J. Cell Biol., 119:493(1992)].
이어서, 아포프 태그 염색된 세포를 PBS 중의 0.1%(v/v) 트리톤 X-100에서 세정하고 PBS 중의 0.5%(w/v) BSA, 0.02%(w/v) 나트륨 아지드 및 200㎍/ml RNase A를 함유하는 FACS 완충액에 재현탁시킨다. 세포를 1.5시간 동안 배양하고, 세척하며, 형광 활성화된 세포를 분류함으로써 분석한다. 세포 형광성을 FACScan 유동 세포측정기를 사용하여 측정하고 데이터를 다음에 기술된 바와 같이 분석한다.
세포 형광을 FACScan 유동 세포측정기(Becton Dickinson, Mountain View, CA)를 사용하여 측정한다. 측면 스캐터(SSC)와 전방 스캐터를 동시에 결정하고 모든 데이터를 FACScan 조사 소프트웨어(Becton Dickinson, Mountain View, CA)가 장착된 휴렛 패키드(HP9000) 컴퓨터로 수집한다. 이러한 데이터를 P.C 라이시스 버전 Ⅰ 소프트웨어(Becton Dickinson, Mountain View, CA)로 분석한다. 아포프 태그 키트로부터의 1차 항체를 첨가하지 않는 세포 현탁액을 사용함으로써 음성 대조군 게이트를 설정한다. 상이한 세포 처리 당 대략 8,000개 세포를 분석해주는 양 세포 집단에 동일한 게이팅을 적용한다.
mAb 처리된 CAM으로부터 유도되고 FACS 분석으로 측정된 바와 같이 아포프 태그로 염색시킨 단일 세포 비율(%)이 도 18에 도시되어 있다. 블랙 막대는 분석에 앞서 24시간 전에 처리된 배아로부터의 세포를 나타낸 것이다. 스티플형 막대는 분석에 앞서 48시간 전에 처리된 배아로부터의 세포를 나타낸 것이다. 각 막대는 3회 실험의 평균치 ±S.E.이다.
도 18에 도시된 바와 같이, 2일 먼저 mAb LM609(항-αⅴβ3)로 처리한 CAM은 PBS 단독 또는 CSAT(항- β1)로 처리된 CAM과 비교해서 아포프 태그 염색이 3 내지 4배 증가된 것으로 나타났다.
B.합성 펩타이드로의 처리
어팝토시스에 대한 사이클릭 펩타이드의 효과를 결정하기 위하여 본 발명의 합성 펩타이드를 사용하여, 실시예 6A에 기재된 바와 같이 성장 인자 유도된 혈관 형성을 이용한 CAM 검정을 또한 수행한다. 펩타이드 사이클로-RGDfV(66203) 및 사이클로-RADfV(69601)을 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조한다. 펩타이드 용액 또는 PBS를 300㎍/ml의 농도로 CAM 제제에 주입한다. 24시간 및 48시간에, 필터지와 주변 CAM 조직을 절개하고 아포프 태그로 염색하여 실시예 12A2)에 기술된 바와 같이 어팝토시스를 탐지한다.
도 18에 도시된 바와 같이, 2일 먼저 펩타이드 69203(사이클로- RGDfV)로 처리된 CAM은 PBS 단독 또는 대조군 사이클로 펩타이드 69601(사이클로-RADfV)로 처리된 CAM과 비교해서 아포프 태그 염색이 3 내지 4배 증가된 것으로 나타났다.
C.어팝토시스 및 세포 주기에 대한 모노클로날 항체로의 처리 효과
단일 세포 현탁액을 대상으로 하여, 세포 주기 및 아포프 태그로의 염색에 의한 어팝토시스에 대한 모노클로날 항체로의 처리 효과를 결정하기 위하여, 프로피듐 요오다이드로 염색하여 염색체성 DNA의 복사수에 대해 조사한다.
mAb LM609(항-αⅴβ3), CSAT(항-β1) 또는 PBS로 처리하기 24시간 또는 48시간 전에 CAM의 단일 세포 현탁액을 실시예 12A1)에 기재된 바와 같이 제조한다.
세포를 아포프 태그로 염색하기 위하여, 세포 현탁액을 PBS 중의 2.5%(w/v) BSA 및 0.25%(w/v) 나트륨 아지드를 함유하는 완충액으로 3회 세척한다. 이어서, 세포를 PBS 중의 1%(w/v) 파라포름알데히드에 15분 동안 고정시킨 다음, 앞서 기재된 바와 같이 3회 세척한다. 비-특이적 결합을 막기 위하여, 단일 세포 현탁액을 PBS 중의 5%(w/v) BSA로 4℃에서 밤새 차단시킨다. 이어서, 세포를 앞서와 같이 세척하고 아포프 태그로 염색시킨 다음, 실시예 12A에 기재된 바와 같이 FACScan으로 세포 형광성을 측정한다.
각 실험 조건으로부터의 세포를 PBS 중의 10㎍/ml의 농도의 프로피듐 요오다이드(Sigma, St. Louis, MO)로 1시간 동안 염색시키고, PBS로 2회 세척한 다음, 크로마틴 축합 및 절편화를 포함한 어팝토시스의 전형적인 핵상 특징에 대해 분석한다. 아팝토틱 세포의 비율(%)은 적어도 10 내지 15개 무작위로 선별된 현미경 시야로부터의 세포를 형태학적으로 분석함으로써 평가한다.
CSAT(항-β1) 또는 LM609(항-αⅴβ3)로 처리되고, 아프포 태그 및 프로피듐 요오다이드로 염색시키고 FACS로 분석된 배아로부터의 CAM의 단일 세포 현탁액에 관한 조합된 결과가 도 19에 제시되어 있다. Y축은 아포프 태그 염색(어팝토시스)를 나타내고 X축은 프로피듐 요오다이드 염색(DNA 함량)을 나타낸다. 가로선은 아포프 태그 염색에 대한 음성적 게이트이다. 좌측 및 우측 패널은 각각 CSAT 및 LM609 처리된 배아로부터의 CAM 세포를 지시한다. 조건다 대략 8,000개 사건을 분석함으로써 세포 주기 분석을 수행하고 데이터를 등고선 플롯으로 나타내었다.
DNA 염료 프로피듐 요오다이드로 염색시킨 단일 세포 샘플은 LM609(항-αⅴβ3)로 처리시킨지 48시간이 지난 CAM 세포의 25 내지 30%가 핵상 축합 및/또는 절편화의 증거를 나타내었다는 것을 보여준다. 이들 과정은 어팝토시스를 진행하는 세포의 특징이다. 이는 CSAT(항-β1)로 처리된 CAM(여기서, 세포의 90 내지 95%가 정상적인 핵상 염생을 나타내었다)과는 대조적이다.
도 19에 도시된 바와 같이, LM609에 의한 어팝토시스의 유도와 일관되게, 1개 미만의 DNA 복사물을 함유하는 피크에서 상당 수의 세포가 관찰되었다(AO). 이러한 피크는 후기 단계의 아팝토틱 세포에서 단편화된 DNA를 나타내는 것으로 앞서 밝혀졌다[참조:Telford et al., Cytometry, 13:137(1992)]. 더욱이, 이들 AO 세포는 아포프 태그로 용이하게 염색되는데, 이는 아팝토틱 세포를 탐지하는 상기 시약의 능력을 확인시켜준다. 그러나, 세포를 AO에서 염색하는 것 이외에, 1개 보다 많은 DNA 복사물을 함유하는 상당수의 세포를 아포프 태그로 또한 염색시켰다(도 19). 이들 결과는 이미 세포 주기로 유입된 혈관성 세포 중에서 LM609가 어팝토시스를 증진시키는 능력을 갖고 있다는 것을 입증해준다. 이와는 달리, 세포 주기로 유입된 대조군 CAM으로부터 유도된 세포는 대조군 시험된 CAM에서 아팝토틱 세포가 거의 탐지되지 않았다는 사실과 일관되게 최소의 아포프 태그 염색을 나타내었다.
세포 주기(S 및 G2/M 상)로 유입된 bFGF 자극된 CAM 중의 세포 중에서, 70%가 LM609(항-αⅴβ3)와 양성 염색을 나타내었다. 이는 비-bFGF 처리된 CAM으로부터의 세포 주기 중에서 관찰된 10% LM609 염색과는 비교된다. 이들 발견은 bFGF 자극 후, 대부분의 αⅴβ3-보유 세포가 능동적인 증식을 나타내었다는 것을 지시하고 있다.
이들 발견들을 함께 고려해보면, mAb LM609 또는 αⅴβ3의 사이클릭 펩타이드 길항제를 정맥내 주사하면 혈관 형성의 유도 후 병아리 CAM 내에서 어팝토시스가 증진된다는 것을 지시하고 있다.
LM609와의 면역반응성에 의한 αⅴβ3)의 발현에 대해 그리고 아포프 태그와의 면역반응성에 의해 어팝토시스를 진행하는 세포에 대해 알아보기 위하여 CAM을 또한 조직학적으로 검사한다. 실시예 5A에서 제조된 LM609(항-αⅴβ3), CSAT(항-β1) 또는 PBS로 처리하기 48시간 전의 배아로부터 절제된 CAM 분획을 세척하고, OTC(Baxter)에 봉매시킨 다음 액체 질소에 스냅 동결시킨다. CAM 조직의 6마이크론 분획을 절단하고, 아세톤에 30초 동안 고정시키며, 사용할 때까지 -70℃에서 저장한다. 70%(v/v) 에탄올(ETOH)에서 간단하게 세정한 다음 PBS에서 3회 세척함으로써 염색용 조직 분획을 제조한다. 이어서, 분획을 PBS 중의 5%(w/v) BSA로 2시간 동안 차단한 다음, mAb LM609 10㎍/㎖와 2시간 동안 배양한다. 이어서, 상기 분획을 세척하고, 로다민 접합된 염소 항-마우스 IgG(Fisher Scientific, Pittsburg, PA)의 1:50 희석물과 2시간 동안 배양한다. 최종적으로, 동일한 분획을 세척하고 실시예 12A2)에 기재된 바와 같이 아포프 태그로 염색한다. 이와 같이 염색된 조직 분획을 올려놓고 초점이 동일한 면역형광 현미경으로 분석한다.
도 20에서, 패널 A 내지 C는 CSAT(항-β1) 처리된 배아로부터의 CAM 조직을 나타내고 패널 D 내지 F는 LM609(항-αⅴβ3) 처리된 배아로부터의 CAM 조직을 나타낸다. 패널 A 및 D는 아포프 태그로 염색되고 D.I.C. 영상 위에 겹쳐 놓여진 형광체(FITC)에 의해 가시화된 조직을 도시한 것이다. 패널 B 및 E는 mAb LM609(항-αⅴβ3)로 염색되고 형광체(로다민)에 의해 가시화된 동일한 조직을 도시한 것이다. 패널 C 및 F는 아포프 태그와 LM609 모두로 염색된 동일한 조직의 합쳐진 영상을 나타내고, 여기서 황색 염색은 동시에 위치된 것을 나타내다. 막대는 좌측 및 우측 패널에서 각각 15 및 50㎛이다.
도 20(A 내지 C)에 도시된 바와 같이, CSAT 또는 PBS 대조군을 정맥내 주사한 후, 아포프 태그로의 염색은 최소 및 랜덤하게 나타났는데, 이는 조직 내에 최소 수준의 어팝토시스가 발생되었다는 것을 지시해준다. 이와는 달리, LM609 또는 사이클릭 펩타이드 203으로 미리 처리된 배아로부터의 CAM은 대부분의 혈관이 아포프 태그로 강하게 염색되었다는 것을 나타내는 반면, 주변 비혈관성 세포에서 최소 반응성이 관찰되었다(도 20D 내지 F). 게다가, 아포프 태그와 LM609 모두를 사용하여 이들 조직을 염색하는 경우(도 19C 및 19F), αⅴβ3길항제로 처리된 배아로부터 유도된 CAM에서 이들 마커 사이에서만 상당한 동시-국재화가 관찰되었다(도 20F). 이러한 발견은 생체내 혈관 형성을 유도한 후, 인테그린 αⅴβ3의 억제제가 αⅴβ3-보유 혈관의 어팝토시스를 선택적으로 증진시킨다는 것을 입증해준다.
혈관 형성이 많은 분자상 및 세포 생물학적 사건을 포함한 복잡한 과정이긴 하지만, 몇몇 문헌은 혈관성 세포 인테그린 αⅴβ3가 이러한 과장에서 비교적 늦게 작용한다고 제안하고 있다. 먼저, 면역조직학적 분석 결과는 bFGF로 혈관 형성을 유도한지 최대 12 내지 24시간 후에 혈관성 세포에 대한 αⅴβ3의 발현이 달성되었다는 것으로 나타났다. 두 번째, αⅴβ3의 길항제가 다중 활성화제에 의해 유도된 혈관 형성을 교란시키는데, 이는 상기 수용체가 혈관 형성을 야기시키는 아마도 모든 1차적 시그널링 사건으로부터의 통상적인 경로 하류에 내포되어 있다는 것을 지시해준다. 세 번째, mAb LM609 또는 사이클릭 펩타이드 처리된 CAMDMS 이들 길항제로 처리된지 48시간이 지날 때까지 DNA 래더링에 의해 측정된 바와 같이 어팝토시스에서의 상당한 증가를 나타내지 않았다. 최종적으로, αⅴβ3)의 길항제는 세포 주기로 이미 유입된 혈관성 세포의 어팝토시스를 증진시킨다.
본 실시예에서 제시된 결과는 인테그린 연결 사건이 생체내 세포 생존을 조절할 수 있다는 첫 번째 직접적인 증거를 제공해준다. 따라서, 일단 혈관 형성이 시작되면, 개개의 혈관성 세포가 분할하여 혈관 형성 공급원 쪽으로 이동하기 시작하고, 이후 αⅴβ3연결시키면 분화와 성숙한 혈관 형성을 야기하는 세포 생존을 지속적으로 허용해주는 시그널이 제공되는 것으로 가정된다. 그러나, αⅴβ3연결이 방지되면, 세포는 이러한 분자 신호를 받지 못하게 되어 결핍에 의해 어팝토시스를 진행하게 된다. 이러한 가설은 분화가 발생된 후에는 성숙한 혈관이 생존에 필요한 αⅴβ3시그널링을 더 이상 필요로 하지 않으므로 이러한 인테그린의 길항제에 반응하지 않는다고 예상할 수 있다.
최종적으로, 본 실시예에서 제시된 결과는 인테그린 αⅴβ3의 길항제가 혈관 형성을 특징으로 하는 신형성 또는 기타 질환을 치료하기 위한 강력한 치료학적 접근법을 제공할 수 있다는 증거를 제공해준다. 먼저, αⅴβ3의 길항제는 미리 존재하는 혈관계에는 어떠한 영향도 미치지 않으면서 새로이 형성되는 혈관을 파괴시킨다. 두 번째, 이들 길항제는 병아리 배아 생존성에 상당한 영향을 미치지 않는데, 이는 이들이 무독성이라는 것을 지시해준다. 세 번째, 혈관 형성은 혈관 형성 자극과 무관하게 상당히 차단되었다. 최종적으로, αⅴβ3길항제를 전신 투여하면, 조직학적으로 별개인 각종 사람 종양이 상당히 퇴화된다.
13.유기 분자 α ⅴ β 3 길항제의 제조
유기 αⅴβ3길항제 화합물 7(96112), 9(99799), 10(96229), 12(112854), 14(96113), 15(79959), 16(81218), 17(87292) 및 18(87293)의 합성은 다음에 기재되어 있고 또한 인용된 숫자로 제시된다. 유기 길항제는 또한 괄호 안의 수로 지칭된다. 앞서 정의된 바와 같이 본 발명의 유기 모사체로서 지칭된 생성된 유기 분자를 실시예 11에 기재된 바와 같이 αⅴβ3-매개된 혈관 형성을 억제하는 방법에 사용한다.
다음에 기재된 합성 각각의 경우, 광학 회전수는 퍼킨-엘머 241 분광광도계로 측정하고 UV 및 가시광선 스펙트럼은 벡크만 DU-70 분광계로 기록한다.1H 및13C NMR 스펙트럼은 브루커 AMX-400 및 AMX-500 분광계로 400 및 500MHz에서 기록한다. 고-회전 질량 스펙트럼(HRMS)은 고속원자 충격(FAB) 조건 하에서 VG ZAB-ZSE 질량 분광계로 기록한다. 칼럼 크로마토그래피는 70 내지 230메쉬의 실리카 겔로 수행한다. 예비용 TLC는 머크 아트 5744(0.5mm) 상에서 수행한다. 융점은 토마스 후버 장치에서 취한다.
A.화합물 1: 도 38에 예시된 바와 같은 t-Boc-L-티로신 벤질 에스테르
0.10M(M) 메틸렌 클로라이드 중의 N-(3급-부톡시카보닐)-L-티로신(t-Boc-L-티로신)의 용액(1.0당량; Aldrich)에 디사이클로헥실카보디이미드(DCC)(1.5당량)를 25℃에서 가하고 1시간 동안 교반시켜 둔다. 이어서, 1.5당량의 벤질 알콜을 가하고 혼합물을 25℃에서 12시간 더 교반시킨다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트(0.10M)로 희석시키고 황산마그네슘 상에서 건조시킨다. 이어서, 용매를 진공하에 제거한 다음, 조 생성물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피하여 정제한다. 화합물 1인 t-Boc-L-티로신 벤질 에스테르는 또한 시그마(Sigma)로부터 구입할 수 있다.
B.화합물 2: 도 38 단계 ⅰ에서 예시된 바와 같은 (S)-3-(4-(4-브로모부틸옥시)페닐-2-N-3급-부틸옥시카보닐-프로피온산 벤질 에스테르
t-Boc-L-티로신 벤질 에스테르(2g, 5.38mmol; 상기와 같이 합성됨), 1,4-디브로모부탄(1.9ml, 16.2mmol; Aldrich), 탄산칼륨(5g) 및 18-크라운-6(0.1g; Aldrich)의 혼합물을 80℃에서 12시간 동안 가열한다. 냉각 후, 침전물을 여과하고 반응 혼합물을 진공하에서 건고 증발시킨다. 이어서, 조 생성물을 100% 헥산을 사용하여 결정화함으로써 정제하여 화합물 2를 2.5g(92%) 수득한다.
C.화합물 3: 도 38 단계 ⅱ에서 예시된 바와 같은 (S)-3-(4-(4-아지도부틸옥시)페닐-2-N-3급-부틸옥시카보닐-프로피온산 벤질 에스테르
화합물 2(2.5g, 4.9mmol)를 디메틸포름아미드(DMF)(20ml) 중의 나트륨 아지드(1.6g, 25mmol)과 함께 25℃에서 12시간 동안 교반시킨다. 이어서, 용매를 증발시키고 잔사를 물(대략 10ml)로 처리하고 에틸 아세테이트로 2회 추출한다. 유기 층을 합하고, 황산마그네슘을 통하여 건조시킨 다음 증발시켜 무색 시럽으로서 화합물 3을 2.0g(90%) 수득한다(FAB-MS: 469 (M+H+)).
D.화합물 4: 도 38 단계 ⅲ에서 예시된 바와 같은 (S)-3-(4-(4-아지도부틸옥시)페닐-2-아미노-프로피온산 벤질 에스테르
화합물 4
화합물 3(2.0g, 4.4mmol)을 트리플루오로아세트산(TFA; 2ml)에 용해시키고 실온에서 3시간 동안 교반시킨다. 진공하에 증발시켜 무색 시럽으로서의 화합물 4 1.6g(정량적)을 수득하고 이를 다음 단계에 추가의 정제없이 사용한다. FAB-MS: 369 (M+H+).
E.화합물 5: 도 38 단계 ⅳ에서 예시된 바와 같은 (S)-3-(4-(4-아지도부틸옥시)페닐-2-부틸설폰아미도-프로피온산 벤질 에스테르
화합물 5
화합물 4(1.6g, 4.3mmol), 부탄 설폰산 클로라이드(0.84ml, 6.6mmol) 및 트리에틸 아민(1.5당량)의 혼합물을 실온에서 12시간 동안 메틸렌 클로라이드(20ml)에서 교반시킨다. 이어서, 반응 혼합물을 증발시키고 잔사를 에틸 아세테이트에 용해시키며, 묽은 HCl, 수성 중탄산나트륨 및 물로 세척한다. 건고 증발시킨 후, 조 생성물을 플래쉬 크로마토그래피(실리카 겔, 톨루엔/에틸 아세테이트 15:1)하여 정제하여 무정형 고체로서의 화합물 5를 1.4g(67%) 수득한다.
F.화합물 6: 도 38 단계 ⅴ에서 예시된 바와 같은 (S)-3-(4-(4-아미노부틸옥시)페닐-2-부틸설폰아미도-프로피온산
화합물 6
화합물 5(1.3g, 2.6mmol)을 에틸 아세테이트/메탄올/물(5/3/1) 20ml 및 트리플루오로아세트산(TFA) 0.2ml에 용해시키고 25℃에서 100mg 팔라듐(목탄 상 10%)의 존재 하에 수소(1대기압; Parr Shaker 장치) 하에서 수소화시킨다. 3시간 후, 촉매를 여과시키고 용매를 증발시켜 오일상 잔사로서의 화합물 6을 수득한다. 물로부터 동결건조시킨 후, 화합물 6 1.0g을 백색 분말로서 수득한다. FAB-MS: 373 (M+H+).
G.화합물 7: 도 38 단계 ⅵ에서 예시된 바와 같은 (S)-3-(4-(4-구아니디노부틸옥시)페닐-2-부틸설폰아미도-프로피온산
화합물 7
디메틸포름아미드(DMF; 5ml) 중의 화합물 6(200mg, 0.5mmol), 3,5-디메틸피라졸-1-카복스아미딘 니트레이트(DPFN)(170mg; 0.8mmol; Aldrich Chemical Company) 및 트리에틸아민(0.15ml, 1.0mmol)를 60℃에서 12시간 동안 가열한다. 냉각 후, 용매를 진공하에 증발시키고 잔사를 HPLC(Lichrocart RP-18, 구배 아세토니트릴/물 + 0.3% TFA 99:1 내지 1:99)에 의해 정제한 후 동결건조시켜 백색 비결정성 분말로서의 화합물 7을 50mg 수득한다. FAB-MS: 415 (M+H+), 융점: 70℃.
H.화합물 8: 도 39 단계 ⅲ에서 예시된 바와 같은 (S)-3-(4-(4-아미노부틸옥시)페닐-2-N-3급-부틸옥시카보닐-프로피온산
화합물 8
화합물 3(0.5g, 1.07mmol)을 에틸 아세테이트/메탄올/물(5/3/1) 10ml 및 트리플루오로아세트산(TFA) 0.1ml에 용해시키고 25℃에서 30mg 팔라듐(목탄 상 10%)의 존재 하에 수소(1대기압; Parr Shaker 장치) 하에서 수소화시킨다. 3시간 후, 촉매를 여과시키고 용매를 증발시켜 오일상 잔사로서의 화합물 8을 수득한다. 물로부터 동결건조시킨 후, 화합물 8 370mg(정량적)을 백색 분말로서 수득한다. FAB-MS: 353 (M+H+).
I.화합물 9: 도 39 단계 ⅳ에서 예시된 바와 같은 (S)-3-(4-(4-구아니디노부틸옥시)페닐-2-N-3급-부틸옥시카보닐-프로피온산
화합물 9
디메틸포름아미드(DMF; 5ml) 중의 화합물 8(200mg, 0.5mmol), 3,5-디메틸피라졸-1-카복스아미딘 니트레이트(DPFN)(170mg; 0.8mmol; Aldrich Chemical Company) 및 트리에틸아민(0.15ml, 1.0mmol)를 60℃에서 12시간 동안 가열한다. 냉각 후, 용매를 진공하에 증발시키고 잔사를 HPLC(Lichrocart RP-18, 구배 아세토니트릴/물 + 0.3% TFA 99:1 내지 1:99)에 의해 정제한 후 동결건조시켜 백색 비결정성 분말로서의 화합물 9을 160mg 수득한다. FAB-MS: 395 (M+H+).
J.화합물 10: 도 40 단계 ⅰ 내지 ⅵ에서 예시된 바와 같은 (R)-3-(4-(4-구아니디노부틸옥시)페닐-2-부틸설폰아미도-프로피온산
화합물 10
화합물 7을 합성하기 위해 사용된 것과 동일한 반응 순서를 사용하여 화합물 10의 D-티로신 동족체 205mg을 백색 무정형 물질(FAB-MS: 415 (M+H+))로서 수득하고 다음과 같이 중간체 화합물 100 내지 600을 사용하여 화합물 10을 형성한다:
1) 화합물 100:도 40에 예시된 바와 같은 t-Boc-D-티로신 벤질 에스테르
화합물 100
0.10M 메틸렌 클로라이드 중의 N-(3급-부톡시카보닐)-D-티로신(t-Boc-L-티로신)의 용액(1.0당량; Aldrich)에 디사이클로헥실카보디이미드(DCC)(1.5당량)를 25℃에서 가하고 1시간 동안 교반시켜 둔다. 이어서, 1.5당량의 벤질 알콜을 가하고 혼합물을 25℃에서 12시간 더 교반시킨다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트(0.10M)로 희석시키고 물로 2회 세척한 다음 염수로 1회 세척하며, 황산마그네슘 상에서 건조시킨다. 이어서, 용매를 진공하에 제거한 다음, 조 생성물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피하여 정제한다.
2)화합물 200: 도 40 단계 ⅰ에서 예시된 바와 같은 (R)-3-(4-(4-브로모부틸옥시)페닐-2-N-3급-부틸옥시카보닐-프로피온산 벤질 에스테르
화합물 200
t-Boc-D-티로신 벤질 에스테르(2g, 5.38mmol; 상기와 같이 합성됨), 1,4-디브로모부탄(1.9ml, 16.2mmol; Aldrich), 탄산칼륨(5g) 및 18-크라운-6(0.1g; Aldrich)의 혼합물을 80℃에서 12시간 동안 가열한다. 냉각 후, 침전물을 여과하고 반응 혼합물을 진공하에서 건고 증발시킨다. 이어서, 조 생성물을 100% 헥산을 사용하여 결정화함으로써 정제하여 화합물 200를 2.5g(92%) 수득한다.
3)화합물 300: 도 40 단계 ⅱ에서 예시된 바와 같은 (R)-3-(4-(4-아지도부틸옥시)페닐-2-N-3급-부틸옥시카보닐-프로피온산 벤질 에스테르
화합물 300
화합물 200(2.5g, 4.9mmol)를 디메틸포름아미드(DMF)(20ml) 중의 나트륨 아지드(1.6g, 25mmol)과 함께 25℃에서 12시간 동안 교반시킨다. 이어서, 용매를 증발시키고 잔사를 물(대략 10ml)로 처리하고 에틸 아세테이트로 2회 추출한다. 유기 층을 합하고, 황산마그네슘을 통하여 건조시킨 다음 증발시켜 무색 시럽으로서 화합물 300을 2.0g(90%) 수득한다(FAB-MS: 469 (M+H+)).
4)화합물 400: 도 40 단계 ⅲ에서 예시된 바와 같은 (R)-3-(4-(4-아지도부틸옥시)페닐-2-아미노-프로피온산 벤질 에스테르
화합물 400
화합물 300(2.0g, 4.4mmol)을 트리플루오로아세트산(TFA; 2ml)에 용해시키고 실온에서 3시간 동안 교반시킨다. 진공하에 증발시켜 무색 시럽으로서의 화합물 400 1.6g(정량적)을 수득하고 이를 다음 단계에 추가의 정제없이 사용한다. FAB-MS: 369 (M+H+).
5)화합물 500: 도 40 단계 ⅳ에서 예시된 바와 같은 (R)-3-(4-(4-아지도부틸옥시)페닐-2-부틸설폰아미도-프로피온산 벤질 에스테르
화합물 500
화합물 400(1.6g, 4.3mmol), 부탄 설폰산 클로라이드(0.84ml, 6.6mmol) 및 트리에틸 아민(1.5당량)의 혼합물을 실온에서 12시간 동안 메틸렌 클로라이드(20ml)에서 교반시킨다. 이어서, 반응 혼합물을 증발시키고 잔사를 에틸 아세테이트에 용해시키며, 묽은 HCl, 수성 중탄산나트륨 및 물로 세척한다. 건고 증발시킨 후, 조 생성물을 플래쉬 크로마토그래피(실리카 겔, 톨루엔/에틸 아세테이트 15:1)하여 정제하여 무정형 고체로서의 화합물 500를 1.4g(67%) 수득한다.
6)화합물 600: 도 40 단계 ⅴ에서 예시된 바와 같은 (R)-3-(4-(4-아미노부틸옥시)페닐-2-부틸설폰아미도-프로피온산
화합물 600
화합물 500(1.3g, 2.6mmol)을 에틸 아세테이트/메탄올/물(5/3/1) 20ml 및 트리플루오로아세트산(TFA) 0.2ml에 용해시키고 25℃에서 100mg 팔라듐(목탄 상 10%)의 존재 하에 수소(1대기압; Parr Shaker 장치) 하에서 수소화시킨다. 3시간 후, 촉매를 여과시키고 용매를 증발시켜 오일상 잔사로서의 화합물 600을 수득한다. 물로부터 동결건조시킨 후, 화합물 600 1.0g(정량적)을 백색 분말로서 수득한다. FAB-MS: 373 (M+H+).
7)화합물 10: 도 40 단계 ⅵ에서 예시된 바와 같은 (R)-3-(4-(4-구아니디노부틸옥시)페닐-2-부틸설폰아미도-프로피온산
디메틸포름아미드(DMF; 5ml) 중의 화합물 600(200mg, 0.5mmol), 3,5-디메틸피라졸-1-카복스아미딘 니트레이트(DPFN)(170mg; 0.8mmol; Aldrich Chemical Company) 및 트리에틸아민(0.15ml, 1.0mmol)를 60℃에서 12시간 동안 가열한다. 냉각 후, 용매를 진공하에 증발시키고 잔사를 HPLC(Lichrocart RP-18, 구배 아세토니트릴/물 + 0.3% TFA 99:1 내지 1:99)에 의해 정제한 후 동결건조시켜 백색의 비결정성 분말로서의 화합물 10을 50mg(25%) 수득한다. FAB-MS: 415 (M+H+), 융점: 70℃.
K.화합물 11: 도 4에서 예시된 바와 같은 (S)-3-(4-(4-아지도부틸옥시)페닐-2-(10-캄포르설폰아미도)-프로피온산 벤질 에스테르
화합물 11
화합물 4(1.0g, 2.7mmol), 10-캄포르설폰산 클로라이드(6.6mmol; Aldrich Chemical Company) 및 트리에틸 아민(1.5당량)의 혼합물을 실온에서 12시간 동안 메틸렌 클로라이드(20ml)에서 교반시킨다. 이어서, 반응 혼합물을 증발시키고 잔사를 에틸 아세테이트에 용해시키며, 묽은 HCl, 수성 중탄산나트륨 및 물로 세척한다. 건고 증발시킨 후, 조 생성물을 플래쉬 크로마토그래피(실리카 겔, 톨루엔/에틸 아세테이트 15:1)하여 정제하여 무정형 고체로서의 화합물 11를 1.4g(67%) 수득한다.
L.화합물 12: 도 41 단계 ⅰ 내지 ⅱ에서 예시된 바와 같은 (S)-3-(4-(4-구아니디노부틸옥시)페닐-2-(10-캄포르설폰아미도)-프로피온산
화합물 12
다음 조건에 따라서 화합물 11을 수소화 및 구아닐화시킨 후에 화합물 12를 수득한다:
단계 ⅰ: 화합물 11(1.3g, 2.6mmol)을 에틸 아세테이트/메탄올/물(5/3/1) 20ml 및 트리플루오로아세트산(TFA) 0.2ml에 용해시키고 25℃에서 100mg 팔라듐(목탄 상 10%)의 존재 하에 수소(1대기압; Parr Shaker 장치) 하에서 수소화시킨다. 3시간 후, 촉매를 여과시키고 용매를 증발시켜 오일상 잔사로서의 중간체 아민을 수득한다. 물로부터 동결건조시킨 후, 중간체 아민 1.0g(정량적)을 백색 분말로서 수득하고, 이에 대해 다음과 같이 수행한다:
단계 ⅱ: 디메틸포름아미드(DMF; 5ml) 중의 상기 형성된 중간체 아민 화합물(200mg, 0.5mmol), 3,5-디메틸피라졸-1-카복스아미딘 니트레이트(DPFN)(170mg; 0.8mmol; Aldrich Chemical Company) 및 트리에틸아민(0.15ml, 1.0mmol)를 60℃에서 12시간 동안 가열한다. 냉각 후, 용매를 진공하에 증발시키고 잔사를 HPLC(Lichrocart RP-18, 구배 아세토니트릴/물 + 0.3% TFA 99:1 내지 1:99)에 의해 정제한 후 동결건조시켜 백색의 비결정성 분말로서의 화합물 12을 50mg(25%) 수득한다. FAB-MS: 509.6 (M+H+).
M.화합물 13: 도 41에서 예시된 바와 같은 (S)-3-(4-(5-브로모펜틸옥시)페닐-2-N-3급-부틸옥시카보닐-프로피온산 벤질 에스테르
화합물 13
t-Boc-L-티로신 벤질 에스테르(4.5g, 12.1mmol; 상기와 같이 합성된 화합물 1), 1,5-디브로모펜탄(5ml, 36.7mmol; Aldrich), 탄산칼륨(10g) 및 18-크라운-6(0.25g; Aldrich)의 혼합물을 80℃에서 12시간 동안 가열한다. 냉각 후, 침전물을 여과하고 반응 혼합물을 진공하에서 건고 증발시킨다. 이어서, 조 생성물을 100% 헥산을 사용하여 결정화함으로써 정제하여 화합물 13를 5.35g(85%) 수득한다.
N.화합물 14: 도 41 단계 ⅰ 내지 ⅴ에서 예시된 바와 같은 (S)-3-(4-(5-구아니디노펜틸옥시)페닐-2-부틸설폰아미도-프로피온산
화합물 14
브롬-아지드 교환, Boc 절단, 부탄 설폰산 클로라이드를 이용한 설포닐화, 수소화 및 DPFN으로의 구아닐화의 5단계 반응 순서를 앞서 기재된 바와 같이, 중간체 화합물 1 내지 6을 사용하여 화합물 7을 형성하는 상기 과정 또는 화합물 100 내지 600을 사용하여 화합물 10을 형성하는 과정과 동일하게 수행한다. 백색 분말로서의 화합물 14를 수득한다. FAB-MS: 429 (M+H+).
O.화합물 15: 도 42에 예시된 바와 같은 3-(4-아미디노페닐)-5-(4-(2-카복시-2-아미노-에틸)페녹시)메틸-2-옥사졸리디논, 디하이드로클로라이드
1)화합물 15에 대한 출발 물질 2-N-BOC-아미노-3-(4-하이드록시-페닐)프로피오네이트의 합성
화합물 15
(D 또는 L), N-(3급-부톡시카보닐)-L(D)-티로신(t-Boc-L(D)-티로신)(1.0당량; Sigma)을 0.10M 메탄올 및 묽은 1% HCl 중에서 에스테르화시킴으로써 출발 물질 2-N-BOC-아미노-3-(4-하이드록시-페닐)프로피오네이트를 수득한다. 반응 혼합물을 25℃에서 12시간 동안 교반시킨 다음 탄산칼륨을 통해 중화시키고, 에틸 아세테이트(0.10M)으로 희석시키며, 물로 2회 세척한 다음 염수로 1회 세척한 후, 황산마그네슘으로 건조시킨다. 이어서, 용매를 진공하에 제거하고 조 생성물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피하여 정제하여 2-N-BOC-아미노-3-(4-하이드록시-페닐)프로피오네이트를 수득한다.
2)화합물 15에 대한 출발 물질 3-p-N-BOC-아미디노-페닐-5-메탄설포닐옥시-메틸-2-옥사졸리디논의 합성: 다음과 같은 3-단계 공정:
메틸렌 클로라이드(0.10M) 중의 p-아미노-벤조트리아졸(1.0당량; Aldrich)을 25℃에서 12시간 동안 2,3-에폭시프로판올(1.0당량; Aldrich)과 교반시킨다. 이어서, 용매를 진공하에 제거하고 조 4-(2,3-디하이드록시프로필아미노)벤조트리아졸을 다음 단계에 다음과 같이 수행한다:
25℃하의 디메틸포름아미드(0.10M) 중의 4-(2,3-디하이드록시프로필아미노)벤조트리아졸(1.0당량; 앞서 기재된 바와 같음)을 110℃에서 6시간 동안 디에틸 카보네이트(1.1당량; Aldrich) 및 칼륨 3급-부틸레이트(1.1당량; Aldrich)와 교반시킨다. 이어서, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트(0.10M)으로 희석시키며, 물로 2회 세척한 다음 염수로 1회 세척한 후, 황산마그네슘으로 건조시킨다. 이어서, 용매를 진공하에 제거하고 조 생성물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피하여 정제하여 3-(4-시아노페닐)-5-하이드록시메틸-2-옥사졸리딘를 수득하고 이를 다음과 같이 다음 단계에서 사용한다:
25℃하의 메틸렌 클로라이드(0.10M) 중의 3-(4-시아노페닐)-5-하이드록시메틸-2-옥사졸리딘(1.0당량; 앞서 기재된 바와 같음)을 하이드로겐 설파이드 1.1당량, 메틸 요오다이드 1.1당량 및 암모늄 아세테이트 1.1당량과 교반시킨다. 이어서, 반응 혼합물을 6시간 동안 교반시킨 다음, 에틸 아세테이트(0.10M)으로 희석시키며, 물로 2회 세척한 다음 염수로 1회 세척한 후, 황산마그네슘으로 건조시킨다. 이어서, 용매를 진공하에 제거하고 조 생성물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피하여 정제하여 아미딘을 수득하고 이를 다음과 같이 다음 단계에서 사용한다:
상기 기재된 바와 같이 합성된 1.0당량의 아미딘을 25℃에서 메틸렌 클로라이드(0.10M) 중의 1.1당량의 BOC-ON(2-(BOC-옥시이미노)-2-페닐아세토니트릴; Aldrich)로 보호시킨 다음 6시간 동안 교반시킨다. 이어서, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트(0.10M)으로 희석시키며, 물로 2회 세척한 다음 염수로 1회 세척한 후, 황산마그네슘으로 건조시킨다. 이어서, 용매를 진공하에 제거하고 조 생성물을 0.10M 메틸렌 클로라이드 및 1.1당량의 메탄설포닐 클로라이드에서 에스테르화한다. 반응 혼합물을 0℃에서 6시간 동안 교반시킨 다음 물(5당량)로 급냉시킨 후, 에틸 아세테이트(0.10M)으로 희석시키며, 물로 2회 세척한 다음 염수로 1회 세척한 후, 황산마그네슘으로 건조시킨다. 이어서, 용매를 진공하에 제거하고 조 생성물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피하여 정제하여 3-p-N-BOC-아미디노-페닐-5-메탄설포닐옥시-메틸-2-옥사졸리디논을 수득한다.
3)보호된 형태의 화합물 15, 즉 3-(4-BOC-아미디노페닐)-5-(4-(2-메톡시-카보닐-2N-BOC-아미노에틸)페닐옥시메틸-2-옥사졸리디논을 형성하기 위해 중간체 2-N-BOC-아미노-3-(4-하이드록시-페닐)프로피오네이트와 3-p-N-BOC-아미디노-페닐-5-메탄설포닐옥시-메틸-2-옥사졸리디논과의 커플링
2-N-BOC-아미노-3-(4-하이드록시-페닐)프로피오네이트(상기 언급된 바와 같음) 1.9g, 디메틸포름아미드(DMF) 20ml 및 NaH(1.0당량)의 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반시킨다. 교반 후, 디메틸포름아미드(DMF) 10ml 중의 3-p-N-BOC-아미디노-페닐-5-메탄설포닐옥시-메틸-2-옥사졸리디논(상기 기재된 바와 같음) 1.8g을 가하고 실온에서 다시 15분 동안 교반시킨다. 이어서, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트(0.10M)으로 희석시키며, 물로 2회 세척한 다음 염수로 1회 세척한 후, 황산마그네슘으로 건조시킨다. 이어서, 용매를 진공하에 제거하고 조 생성물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피하여 정제하여 보호된 형태의 화합물 15, 즉 3-(4-BOC-아미디노페닐)-5-(4-(2-메톡시-카보닐-2N-BOC-아미노에틸)페닐옥시메틸-2-옥사졸리디논을 수득하고 이를 다음 단계에 사용한다.
4)보호된 형태의 화합물 15를 탈보호시켜 화합물 15, 즉 도 42에 예시된 바와 같은 3-(4-아미디노페닐)-5-(4-(2-카복시-2-아미노-에틸)페녹시)메틸-2-옥사졸리디논, 디하이드로클로라이드를 형성함
보호된 형태의 화합물 15, 즉 3-(4-BOC-아미디노페닐)-5-(4-(2-메톡시-카보닐-2N-BOC-아미노에틸)페닐옥시메틸-2-옥사졸리디논(1.0당량; 앞서 기재된 바와 같이 합성됨)을 실온에서 4시간 동안 4ml의 2N NaOH로 처리한다. 이어서, 상기 혼합물을, 0 내지 25℃에서 3시간 동안 적가된 디옥산 중의 2N HCl-용액 40ml로 처리한다. 이어서, 반응 혼합물을 중탄산나트륨(5당량)으로 급냉시키고, 에틸 아세테이트(0.10M)으로 희석시키며, 물로 2회 세척한 다음 염수로 1회 세척한 후, 황산마그네슘으로 건조시킨다. 이어서, 용매를 진공하에 제거하고 조 생성물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피하여 정제하여 화합물 15: 3-(4-아미디노페닐)-5-(4-(2-카복시-2-아미노-에틸)페녹시)메틸-2-옥사졸리디논, 디하이드로클로라이드(융점 165℃(d))를 수득한다.
P.화합물 16: 도 X(구 14)에 예시된 바와 같은 3-(4-아미디노페닐)-5-(4-(2-카복시-2N-부틸설포닐아미노에틸)페녹시)메틸-2-옥사졸리디논
1)화합물 16에 대한 출발 물질 2-N-부틸설포닐아미노-3-(4-하이드록시-페닐)프로피오네이트의 합성
화합물 16
((D 또는 L)티로신)(1.0당량; Sigma)을 0.10M 메탄올 및 묽은 1% HCl 중에서 에스테르화시킴으로써 출발 물질 2-N-부틸설포닐아미노-3-(4-하이드록시-페닐)프로피오네이트를 수득한다. 반응 혼합물을 25℃에서 12시간 동안 교반시킨 다음 탄산칼륨을 통해 중화시키고, 에틸 아세테이트(0.10M)으로 희석시키며, 물로 2회 세척한 다음 염수로 1회 세척한 후, 황산마그네슘으로 건조시킨다. 이어서, 용매를 진공하에 제거하고 조 생성물을 대상으로 하여 다음과 같이 수행한다:
상기 화합물 (4.3mmol), 부탄 설폰산 클로라이드(6.6mmol) 및 트리에틸 아민(1.5당량)의 혼합물을 실온에서 12시간 동안 메틸렌 클로라이드(20ml)에서 교반시킨다. 이어서, 반응 혼합물을 증발시키고 잔사를 에틸 아세테이트에 용해시키며, 묽은 HCl, 수성 중탄산나트륨 및 물로 세척한다. 건고 증발시킨 후, 조 생성물을 플래쉬 크로마토그래피(실리카 겔, 톨루엔/에틸 아세테이트 15:1)하여 정제하여 표제 화합물을 수득한다.
2)화합물 16에 대한 출발 물질 3-p-N-BOC-아미디노-페닐-5-메탄설포닐옥시-메틸-2-옥사졸리디논의 합성: 다음과 같은 3-단계 공정:
메틸렌 클로라이드(0.10M) 중의 p-아미노-벤조트리아졸(1.0당량; Aldrich)을 25℃에서 12시간 동안 2,3-에폭시프로판올(1.0당량; Aldrich)과 교반시킨다. 이어서, 용매를 진공하에 제거하고 조 4-(2,3-디하이드록시프로필아미노)벤조트리아졸을 대상으로 하여 다음 단계에 다음과 같이 수행한다:
25℃하의 디메틸포름아미드(0.10M) 중의 4-(2,3-디하이드록시프로필아미노)벤조트리아졸(1.0당량; 앞서 기재된 바와 같음)을 110℃에서 6시간 동안 디에틸 카보네이트(1.1당량; Aldrich) 및 칼륨 3급-부틸레이트(1.1당량; Aldrich)와 교반시킨다. 이어서, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트(0.10M)으로 희석시키며, 물로 2회 세척한 다음 염수로 1회 세척한 후, 황산마그네슘으로 건조시킨다. 이어서, 용매를 진공하에 제거하고 조 생성물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피하여 정제하여 3-(4-시아노페닐)-5-하이드록시메틸-2-옥사졸리딘를 수득하고 이를 다음과 같이 다음 단계에서 사용한다:
25℃하의 메틸렌 클로라이드(0.10M) 중의 3-(4-시아노페닐)-5-하이드록시메틸-2-옥사졸리딘(1.0당량; 앞서 기재된 바와 같음)을 하이드로겐 설파이드 1.1당량, 메틸 요오다이드 1.1당량 및 암모늄 아세테이트 1.1당량과 교반시킨다. 이어서, 반응 혼합물을 6시간 동안 교반시킨 다음, 에틸 아세테이트(0.10M)으로 희석시키며, 물로 2회 세척한 다음 염수로 1회 세척한 후, 황산마그네슘으로 건조시킨다. 이어서, 용매를 진공하에 제거하고 조 생성물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피하여 정제하여 아미딘을 수득하고 이를 다음과 같이 다음 단계에서 사용한다:
상기 기재된 바와 같이 합성된 1.0당량의 아미딘을 25℃에서 메틸렌 클로라이드(0.10M) 중의 1.1당량의 BOC-ON(2-(BOC-옥시이미노)-2-페닐아세토니트릴; Aldrich)로 보호시킨 다음 6시간 동안 교반시킨다. 이어서, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트(0.10M)으로 희석시키며, 물로 2회 세척한 다음 염수로 1회 세척한 후, 황산마그네슘으로 건조시킨다. 이어서, 용매를 진공하에 제거하고 조 생성물을 0.10M 메틸렌 클로라이드 및 1.1당량의 메탄설포닐 클로라이드에서 에스테르화한다. 반응 혼합물을 0℃에서 6시간 동안 교반시킨 다음 물(5당량)로 급냉시킨 후, 에틸 아세테이트(0.10M)으로 희석시키며, 물로 2회 세척한 다음 염수로 1회 세척한 후, 황산마그네슘으로 건조시킨다. 이어서, 용매를 진공하에 제거하고 조 생성물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피하여 정제하여 3-p-N-BOC-아미디노-페닐-5-메탄설포닐옥시-메틸-2-옥사졸리디논을 수득한다.
3)보호된 형태의 화합물 16, 즉 3-(4-BOC-아미디노페닐)-5-(4-(2-메톡시-카보닐-2-N-부틸설포닐아미노에틸)페닐옥시메틸-2-옥사졸리디논을 형성하기 위해 중간체 2-N-부틸설포닐아미노-3-(4-하이드록시-페닐)프로피오네이트와 3-p-N-BOC-아미디노-페닐-5-메탄설포닐옥시-메틸-2-옥사졸리디논과의 커플링
2-N-부틸설포닐아미노-3-(4-하이드록시-페닐)프로피오네이트(상기 언급된 바와 같음) 1.9g, 디메틸포름아미드(DMF) 20ml 및 NaH(1.0당량)의 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반시킨다. 교반 후, 디메틸포름아미드(DMF) 10ml 중의 3-p-N-BOC-아미디노-페닐-5-메탄설포닐옥시-메틸-2-옥사졸리디논(상기 기재된 바와 같음) 1.8g을 가하고 실온에서 다시 15분 동안 교반시킨다. 이어서, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트(0.10M)으로 희석시키며, 물로 2회 세척한 다음 염수로 1회 세척한 후, 황산마그네슘으로 건조시킨다. 이어서, 용매를 진공하에 제거하고 조 생성물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피하여 정제하여 보호된 형태의 화합물 16, 즉 3-(4-BOC-아미디노페닐)-5-(4-(2-메톡시-카보닐-2N-부틸설포닐아미노에틸)페닐옥시메틸-2-옥사졸리디논을 수득하고 이를 다음 단계에 사용한다.
4)보호된 형태의 화합물 16를 탈보호시켜 화합물 16, 즉 도 42에 예시된 바와 같은 3-(4-아미디노페닐)-5-(4-(2-카복시-2-N-부틸설포닐아미노에틸)페녹시)메틸-2-옥사졸리디논을 형성함
보호된 형태의 화합물 16, 즉 3-(4-BOC-아미디노페닐)-5-(4-(2-메톡시-카보닐-2-N-부틸설포닐아미노에틸)페닐옥시메틸-2-옥사졸리디논(1.0당량; 앞서 기재된 바와 같이 합성됨)을 실온에서 4시간 동안 4ml의 2N NaOH로 처리한다. 이어서, 상기 혼합물을, 0 내지 25℃에서 3시간 동안 적가된 디옥산 중의 2N HCl-용액 40ml로 처리한다. 이어서, 반응 혼합물을 중탄산나트륨(5당량)으로 급냉시키고, 에틸 아세테이트(0.10M)으로 희석시키며, 물로 2회 세척한 다음 염수로 1회 세척한 후, 황산마그네슘으로 건조시킨다. 이어서, 용매를 진공하에 제거하고 조 생성물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피하여 정제하여 화합물 16: 3-(4-아미디노페닐)-5-(4-(2-카복시-2-N-부틸설포닐아미노에틸)페녹시)메틸-2-옥사졸리디논(융점 236 내지 237℃)를 수득한다.
Q.화합물 17: 도 42에 예시된 바와 같은 3-(4-아미디노페닐)-5-(4-(2-카복시-2-N-프로필-설포닐아미노에틸)페녹시)메틸-2-옥사졸리디논
1)화합물 17에 대한 출발 물질 2-N-프로필-설포닐아미노-3-(4-하이드록시-페닐)프로피오네이트의 합성
화합물 17
((D 또는 L)티로신)(1.0당량; Sigma)을 0.10M 메탄올 및 묽은 1% HCl 중에서 에스테르화시킴으로써 출발 물질 2-N-프로필-설포닐아미노-3-(4-하이드록시-페닐)프로피오네이트를 수득한다. 반응 혼합물을 25℃에서 12시간 동안 교반시킨 다음 탄산칼륨을 통해 중화시키고, 에틸 아세테이트(0.10M)으로 희석시키며, 물로 2회 세척한 다음 염수로 1회 세척한 후, 황산마그네슘으로 건조시킨다. 이어서, 용매를 진공하에 제거하고 조 생성물을 대상으로 하여 다음과 같이 수행한다:
상기 화합물 (4.3mmol), 프로필 설폰산 클로라이드(6.6mmol; Aldrich) 및 트리에틸 아민(1.5당량)의 혼합물을 실온에서 12시간 동안 메틸렌 클로라이드(20ml)에서 교반시킨다. 이어서, 반응 혼합물을 증발시키고 잔사를 에틸 아세테이트에 용해시키며, 묽은 HCl, 수성 중탄산나트륨 및 물로 세척한다. 건고 증발시킨 후, 조 생성물을 플래쉬 크로마토그래피(실리카 겔, 톨루엔/에틸 아세테이트 15:1)하여 정제하여 표제 화합물을 수득한다.
2)화합물 17에 대한 출발 물질 3-p-N-BOC-아미디노-페닐-5-메탄설포닐옥시-메틸-2-옥사졸리디논의 합성: 다음과 같은 3-단계 공정:
메틸렌 클로라이드(0.10M) 중의 p-아미노-벤조트리아졸(1.0당량; Aldrich)을 25℃에서 12시간 동안 2,3-에폭시프로판올(1.0당량; Aldrich)과 교반시킨다. 이어서, 용매를 진공하에 제거하고 조 4-(2,3-디하이드록시프로필아미노)벤조트리아졸을 대상으로 하여 다음 단계에 다음과 같이 수행한다:
25℃하의 디메틸포름아미드(0.10M) 중의 4-(2,3-디하이드록시프로필아미노)벤조트리아졸(1.0당량; 앞서 기재된 바와 같음)을 110℃에서 6시간 동안 디에틸 카보네이트(1.1당량; Aldrich) 및 칼륨 3급-부틸레이트(1.1당량; Aldrich)와 교반시킨다. 이어서, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트(0.10M)으로 희석시키며, 물로 2회 세척한 다음 염수로 1회 세척한 후, 황산마그네슘으로 건조시킨다. 이어서, 용매를 진공하에 제거하고 조 생성물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피하여 정제하여 3-(4-시아노페닐)-5-하이드록시메틸-2-옥사졸리딘를 수득하고 이를 다음과 같이 다음 단계에서 사용한다:
25℃하의 메틸렌 클로라이드(0.10M) 중의 3-(4-시아노페닐)-5-하이드록시메틸-2-옥사졸리딘(1.0당량; 앞서 기재된 바와 같음)을 하이드로겐 설파이드 1.1당량, 메틸 요오다이드 1.1당량 및 암모늄 아세테이트 1.1당량과 교반시킨다. 이어서, 반응 혼합물을 6시간 동안 교반시킨 다음, 에틸 아세테이트(0.10M)으로 희석시키며, 물로 2회 세척한 다음 염수로 1회 세척한 후, 황산마그네슘으로 건조시킨다. 이어서, 용매를 진공하에 제거하고 조 생성물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피하여 정제하여 아미딘을 수득하고 이를 다음과 같이 다음 단계에서 사용한다:
상기 기재된 바와 같이 합성된 1.0당량의 아미딘을 25℃에서 메틸렌 클로라이드(0.10M) 중의 1.1당량의 BOC-ON(2-(BOC-옥시이미노)-2-페닐아세토니트릴; Aldrich)로 보호시킨 다음 6시간 동안 교반시킨다. 이어서, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트(0.10M)으로 희석시키며, 물로 2회 세척한 다음 염수로 1회 세척한 후, 황산마그네슘으로 건조시킨다. 이어서, 용매를 진공하에 제거하고 조 생성물을 0.10M 메틸렌 클로라이드 및 1.1당량의 메탄설포닐 클로라이드에서 에스테르화한다. 반응 혼합물을 0℃에서 6시간 동안 교반시킨 다음 물(5당량)로 급냉시킨 후, 에틸 아세테이트(0.10M)으로 희석시키며, 물로 2회 세척한 다음 염수로 1회 세척한 후, 황산마그네슘으로 건조시킨다. 이어서, 용매를 진공하에 제거하고 조 생성물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피하여 정제하여 3-p-N-BOC-아미디노-페닐-5-메탄설포닐옥시-메틸-2-옥사졸리디논을 수득한다.
3)보호된 형태의 화합물 17, 즉 3-(4-BOC-아미디노페닐)-5-(4-(2-메톡시-카보닐-2-N-프로필-설포닐아미노에틸)페닐옥시메틸-2-옥사졸리디논을 형성하기 위해 중간체 2-N-프로필-설포닐아미노-3-(4-하이드록시-페닐)프로피오네이트와 3-p-N-BOC-아미디노-페닐-5-메탄설포닐옥시-메틸-2-옥사졸리디논과의 커플링
2-N-프로필-설포닐아미노-3-(4-하이드록시-페닐)프로피오네이트(상기 언급된 바와 같음) 1.9g, 디메틸포름아미드(DMF) 20ml 및 NaH(1.0당량)의 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반시킨다. 교반 후, 디메틸포름아미드(DMF) 10ml 중의 3-p-N-BOC-아미디노-페닐-5-메탄설포닐옥시-메틸-2-옥사졸리디논(상기 기재된 바와 같음) 1.8g을 가하고 실온에서 다시 15분 동안 교반시킨다. 이어서, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트(0.10M)으로 희석시키며, 물로 2회 세척한 다음 염수로 1회 세척한 후, 황산마그네슘으로 건조시킨다. 이어서, 용매를 진공하에 제거하고 조 생성물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피하여 정제하여 보호된 형태의 화합물 17, 즉 3-(4-BOC-아미디노페닐)-5-(4-(2-메톡시-카보닐-2-N-프로필-설포닐아미노에틸)페닐옥시메틸-2-옥사졸리디논을 수득하고 이를 다음 단계에 사용한다.
4)보호된 형태의 화합물 17을 탈보호시켜 화합물 17, 즉 도 42에 예시된 바와 같은 3-(4-아미디노페닐)-5-(4-(2-카복시-2-N-프로필설포닐아미노에틸)페녹시)메틸-2-옥사졸리디논을 형성함
보호된 형태의 화합물 16, 즉 3-(4-BOC-아미디노페닐)-5-(4-(2-메톡시-카보닐-2-N-프로필설포닐아미노에틸)페닐옥시메틸-2-옥사졸리디논(1.0당량; 앞서 기재된 바와 같이 합성됨)을 실온에서 4시간 동안 4ml의 2N NaOH로 처리한다. 이어서, 상기 혼합물을, 0 내지 25℃에서 3시간 동안 적가된 디옥산 중의 2N HCl-용액 40ml로 처리한다. 이어서, 반응 혼합물을 중탄산나트륨(5당량)으로 급냉시키고, 에틸 아세테이트(0.10M)으로 희석시키며, 물로 2회 세척한 다음 염수로 1회 세척한 후, 황산마그네슘으로 건조시킨다. 이어서, 용매를 진공하에 제거하고 조 생성물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피하여 정제하여 화합물 17: 3-(4-아미디노페닐)-5-(4-(2-카복시-2-N-프로필설포닐아미노에틸)페녹시)메틸-2-옥사졸리디논(융점 200℃(d))를 수득한다.
R.화합물 18: 도 42에 예시된 바와 같은 3-(4-아미디노페닐)-5-(4-(2-카복시-2-N-에틸-설포닐아미노에틸)페녹시)메틸-2-옥사졸리디논
1)화합물 18에 대한 출발 물질 2-N-에틸설포닐아미노-3-(4-하이드록시-페닐)프로피오네이트의 합성
화합물 18
((D 또는 L)티로신)(1.0당량; Sigma)을 0.10M 메탄올 및 묽은 1% HCl 중에서 에스테르화시킴으로써 출발 물질 2-N-에틸-설포닐아미노-3-(4-하이드록시-페닐)프로피오네이트를 수득한다. 반응 혼합물을 25℃에서 12시간 동안 교반시킨 다음 탄산칼륨을 통해 중화시키고, 에틸 아세테이트(0.10M)으로 희석시키며, 물로 2회 세척한 다음 염수로 1회 세척한 후, 황산마그네슘으로 건조시킨다. 이어서, 용매를 진공하에 제거하고 조 생성물을 대상으로 하여 다음과 같이 수행한다:
상기 화합물 (4.3mmol), 에틸 설폰산 클로라이드(6.6mmol; Aldrich) 및 트리에틸 아민(1.5당량)의 혼합물을 실온에서 12시간 동안 메틸렌 클로라이드(20ml)에서 교반시킨다. 이어서, 반응 혼합물을 증발시키고 잔사를 에틸 아세테이트에 용해시키며, 묽은 HCl, 수성 중탄산나트륨 및 물로 세척한다. 건고 증발시킨 후, 조 생성물을 플래쉬 크로마토그래피(실리카 겔, 톨루엔/에틸 아세테이트 15:1)하여 정제하여 표제 화합물을 수득한다.
2)화합물 18에 대한 출발 물질 3-p-N-BOC-아미디노-페닐-5-메탄설포닐옥시-메틸-2-옥사졸리디논의 합성: 다음과 같은 3-단계 공정:
메틸렌 클로라이드(0.10M) 중의 p-아미노-벤조트리아졸(1.0당량; Aldrich)을 25℃에서 12시간 동안 2,3-에폭시프로판올(1.0당량; Aldrich)과 교반시킨다. 이어서, 용매를 진공하에 제거하고 조 4-(2,3-디하이드록시프로필아미노)벤조트리아졸을 대상으로 하여 다음 단계에 다음과 같이 수행한다:
25℃하의 디메틸포름아미드(0.10M) 중의 4-(2,3-디하이드록시프로필아미노)벤조트리아졸(1.0당량; 앞서 기재된 바와 같음)을 110℃에서 6시간 동안 디에틸 카보네이트(1.1당량; Aldrich) 및 칼륨 3급-부틸레이트(1.1당량; Aldrich)와 교반시킨다. 이어서, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트(0.10M)으로 희석시키며, 물로 2회 세척한 다음 염수로 1회 세척한 후, 황산마그네슘으로 건조시킨다. 이어서, 용매를 진공하에 제거하고 조 생성물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피하여 정제하여 3-(4-시아노페닐)-5-하이드록시메틸-2-옥사졸리딘를 수득하고 이를 다음과 같이 다음 단계에서 사용한다:
25℃하의 메틸렌 클로라이드(0.10M) 중의 3-(4-시아노페닐)-5-하이드록시메틸-2-옥사졸리딘(1.0당량; 앞서 기재된 바와 같음)을 하이드로겐 설파이드 1.1당량, 메틸 요오다이드 1.1당량 및 암모늄 아세테이트 1.1당량과 교반시킨다. 이어서, 반응 혼합물을 6시간 동안 교반시킨 다음, 에틸 아세테이트(0.10M)으로 희석시키며, 물로 2회 세척한 다음 염수로 1회 세척한 후, 황산마그네슘으로 건조시킨다. 이어서, 용매를 진공하에 제거하고 조 생성물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피하여 정제하여 아미딘을 수득하고 이를 다음과 같이 다음 단계에서 사용한다:
상기 기재된 바와 같이 합성된 1.0당량의 아미딘을 25℃에서 메틸렌 클로라이드(0.10M) 중의 1.1당량의 BOC-ON(2-(BOC-옥시이미노)-2-페닐아세토니트릴; Aldrich)로 보호시킨 다음 6시간 동안 교반시킨다. 이어서, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트(0.10M)으로 희석시키며, 물로 2회 세척한 다음 염수로 1회 세척한 후, 황산마그네슘으로 건조시킨다. 이어서, 용매를 진공하에 제거하고 조 생성물을 0.10M 메틸렌 클로라이드 및 1.1당량의 메탄설포닐 클로라이드에서 에스테르화한다. 반응 혼합물을 0℃에서 6시간 동안 교반시킨 다음 물(5당량)로 급냉시킨 후, 에틸 아세테이트(0.10M)으로 희석시키며, 물로 2회 세척한 다음 염수로 1회 세척한 후, 황산마그네슘으로 건조시킨다. 이어서, 용매를 진공하에 제거하고 조 생성물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피하여 정제하여 3-p-N-BOC-아미디노-페닐-5-메탄설포닐옥시-메틸-2-옥사졸리디논을 수득한다.
3)보호된 형태의 화합물 18, 즉 3-(4-BOC-아미디노페닐)-5-(4-(2-메톡시-카보닐-2-N-에틸-설포닐아미노에틸)페닐옥시메틸-2-옥사졸리디논을 형성하기 위해 중간체 2-N-에틸설포닐아미노-3-(4-하이드록시-페닐)프로피오네이트와 3-p-N-BOC-아미디노-페닐-5-메탄설포닐옥시-메틸-2-옥사졸리디논과의 커플링
2-N-에틸-설포닐아미노-3-(4-하이드록시-페닐)프로피오네이트(상기 언급된 바와 같음) 1.9g, 디메틸포름아미드(DMF) 20ml 및 NaH(1.0당량)의 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반시킨다. 교반 후, 디메틸포름아미드(DMF) 10ml 중의 3-p-N-BOC-아미디노-페닐-5-메탄설포닐옥시-메틸-2-옥사졸리디논(상기 기재된 바와 같음) 1.8g을 가하고 실온에서 다시 15분 동안 교반시킨다. 이어서, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트(0.10M)으로 희석시키며, 물로 2회 세척한 다음 염수로 1회 세척한 후, 황산마그네슘으로 건조시킨다. 이어서, 용매를 진공하에 제거하고 조 생성물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피하여 정제하여 보호된 형태의 화합물 18, 즉 3-(4-BOC-아미디노페닐)-5-(4-(2-메톡시-카보닐-2-N-에틸-설포닐아미노에틸)페닐옥시메틸-2-옥사졸리디논을 수득하고 이를 다음 단계에 사용한다.
4)보호된 형태의 화합물 18를 탈보호시켜 화합물 18, 즉 도 42에 예시된 바와 같은 3-(4-아미디노페닐)-5-(4-(2-카복시-2-N-에틸설포닐아미노에틸)페녹시)메틸-2-옥사졸리디논을 형성함
보호된 형태의 화합물 18, 즉 3-(4-BOC-아미디노페닐)-5-(4-(2-메톡시-카보닐-2-N-에틸설포닐아미노에틸)페닐옥시메틸-2-옥사졸리디논(1.0당량; 앞서 기재된 바와 같이 합성됨)을 실온에서 4시간 동안 4ml의 2N NaOH로 처리한다. 이어서, 상기 혼합물을, 0 내지 25℃에서 3시간 동안 적가된 디옥산 중의 2N HCl-용액 40ml로 처리한다. 이어서, 반응 혼합물을 중탄산나트륨(5당량)으로 급냉시키고, 에틸 아세테이트(0.10M)으로 희석시키며, 물로 2회 세척한 다음 염수로 1회 세척한 후, 황산마그네슘으로 건조시킨다. 이어서, 용매를 진공하에 제거하고 조 생성물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피하여 정제하여 화합물 18: 3-(4-아미디노페닐)-5-(4-(2-카복시-2-N-에틸설포닐아미노에틸)페녹시)메틸-2-옥사졸리디논(융점 212℃(d))를 수득한다.
14.α ⅴ β 3 리간드 유기 모사체를 정맥내 적용하여 CAM 검정에서 측정된 바와 같은 성장 인자 유도된 혈관 형성의 억제
CAM 제제 내로 정맥내 주입된 αⅴβ3리간드의 유기 모사체를 이용한 성장 인자 유도된 혈관 형성에 대한 효과를 본 발명에 사용하기 위해 평가한다.
10일생 CAM 제제를 실시예 5A에 기재된 바와 같이 사용한다. bFGF-유도된 혈관 형성이 개시된지 24시간 후에, 화합물 16(81218), 17(87292) 및 18(87293)으로서 지칭된 유기 모사체를 개별적으로 pH 7.0의 20% 테트라글리콜-PBS 중에서 1mg/ml(100㎍/배아)의 농도로 100㎕ 용적의 CAM 제제에 정맥내 주입한다. 병행되는 검정에서는, 화합물 7(96112), 9(99799), 10(96229), 12(112854) 및 14(96113)을 유사하게 평가한다. 유기 모사체의 효과를 48시간 후에 분석하는데, 여기서는 이중 블라인드 접근법에서 필터 디스크 영역에서의 혈관 분기점의 수를 계수함으로써 정량화를 수행한다.
결과를 각각 도 43 및 44에 도시하였다. 도 43에서는, 화합물 14(96113), 10(96229), 9(99799) 및 12(112854)(억제 감소 순서임)가 대조군 bFGF 유도 및 화합물 7(96112)와 비교해서 새로운 혈관의 분기점 수를 감소시키는데 효과적이다. 도 44에서는, 화합물 17(87292) 및 18(87293)이 처리되지 않은 bFGF 대조군 및 화합물 16(81218)로의 처리와 비교해서 항-혈관 형성 특성을 나타내었다.
제3의 검정에서는, 유기 화합물 7(96112), 10(96229) 및 14(96113)을 펩타이드 69601 및 66203과 함께 bFGF-유도된 혈관 형성의 억제제로서 평가되었다. 이러한 검정의 경우, 유기 화합물 250㎍/ml를 실시예 7B에 기재된 바와 같이 bFGF 처리한지 18시간 후에 투여한다. 결과가 도 28에 도시되어 있는데, 여기서는 상기와 같이, 화합물 14(96113) 및 10(96229)가 bFGF에 의해 유도된 새로운 혈관의 형성을 거의 완전하게 억제하였다.
따라서, 앞서 언급된 실시예들은 인테그린 αⅴβ3가 각종 자극에 의해 유도된 혈관 형성에서 중요한 역할을 하며 αⅴβ3자체가 신생혈관화를 특징으로 하는 질병에 대해 본 발명의 αⅴβ3길항제를 이용한 경우에 유용한 치료학적 표적이 된다는 것을 입증해주고 있다.
앞서 기술된 명세서 내용은 당해 분야의 숙련인이 본 발명을 실시하는데 충분한 것으로 간주된다. 본 발명은 기탁된 세포주로 범위가 한정되지는 않는데, 이는 기탁된 양태는 본 발명의 한 국면을 예시하는 하나의 예로서 의도된 것이고 작용적으로 등가인 어떠한 세포주도 본 발명의 범위 내에 있기 때문이다. 물질의 기탁은 본원에 포함된 서술 내용이 본 발명의 어떠한 국면(이의 최상 양태도 포함함)을 실시하는데 부적절하다는 승인을 구성하지 않으며 또한 청구의 범위의 범주를 특정한 예로서 제한하고자 하는 것도 아니다. 실제로, 본원에 기술된 것 이외의 본 발명의 각종 변형이 당해 분야의 숙련인에게는 앞서 기술내용으로부터 명백할 것이며 이 또한 첨부된 청구의 범위 내에 속한다.
(1) 일반적 정보:
(ⅰ) 출원인:
(A) 명칭: 더 스크립스 리서치 인스티튜트
(B) 거리: 노쓰 토레이 파인스 로드 10550
(C) 시: 라 졸라
(D) 주: 캘리포니아
(E) 국가: 미국
(F) 우편번호: 92037
(G) 전화번호: (619) 784-2937
(H) 팩시밀리 번호: (619) 784-9399
(ⅱ) 발명의 명칭: 혈관 형성 억제에 유용한 방법 및 조성물
(ⅲ) 서열수: 45
(ⅳ) 컴퓨터 판독형:
(A) 매체 유형: 플로피 디스켓
(B) 컴퓨터: IBM PC 호환성
(C) 운영 시스템: PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어: 페이턴트인 릴리즈 #1.0, 버전 #1.25
(ⅴ) 현 출원 데이터:
(A) 출원 번호: PCT/US97/
(B) 출원일: 1997. 5. 30
(ⅵ) 선행 출원 데이터:
(A) 출원 번호: US 08/210,715
(B) 출원일: 1994. 3. 18.
(ⅵ) 선행 출원 데이터:
(A) 출원 번호: US 08/366,665
(B) 출원일: 1994. 12. 30.
(2) 서열 1에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징
(A) 길이: 6개 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 유형: 펩타이드
(ⅴ) 단편 유형: 내부
(ⅸ) 양상
(A) 명칭/키: 펩타이드
(B) 위치: 1..6
(D) 기타 정보: /라벨=BOC-GRGDFV-OMe
/주="BOC는 N-말단 보호 그룹 부틸옥시카보닐을 의미하고; OMe는 C-말 단 메틸 에스테르를 의미하며; 아르기닌은 두 번째 위치이다."
(ⅸ) 양상
(A) 명칭/키: 펩타이드
(B) 위치: 1..6
(D) 기타 정보: /라벨=OMe
/주="OMe는 C-말단 보호 그룹 메틸 에스테르를 의미한다."
(ⅸ) 양상
(A) 명칭/키: 펩타이드
(B) 위치: 1..6
(D) 기타 정보: /라벨=D-Arg
/주="D-Arg에서 A 앞의 첨자 "D"는 위치 2에서의 아르기닌이 D-아미노 산이라는 것을 의미한다."
(2) 서열 2에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징
(A) 길이: 6개 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 유형: 펩타이드
(ⅴ) 단편 유형: 내부
(ⅸ) 양상
(A) 명칭/키: 펩타이드
(B) 위치: 1..6
(D) 기타 정보: /라벨=BOC
/주="BOC는 N-말단 차단 그룹 3급 부틸옥시카보닐을 의미한다."
(ⅸ) 양상
(A) 명칭/키: 펩타이드
(B) 위치: 1..6
(D) 기타 정보: /라벨=OH
/주="OH는 유리 C-말단 카복실산을 의미한다."
(ⅸ) 양상
(A) 명칭/키: 펩타이드
(B) 위치: 1..6
(D) 기타 정보: /라벨=D-Arg
/주="D-Arg에서 A 앞의 첨자 "D"는 위치 2에서의 아르기닌이 D-아미노 산이라는 것을 의미한다."
(2) 서열 3에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징
(A) 길이: 6개 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 유형: 펩타이드
(ⅴ) 단편 유형: 내부
(ⅸ) 양상
(A) 명칭/키: 펩타이드
(B) 위치: 1..6
(D) 기타 정보: /라벨=H
/주="H는 유리 N-말단 아민을 의미한다."
(ⅸ) 양상
(A) 명칭/키: 펩타이드
(B) 위치: 1..6
(D) 기타 정보: /라벨=OH
/주="OH는 유리 C-말단 카복실산을 의미한다."
(ⅸ) 양상
(A) 명칭/키: 펩타이드
(B) 위치: 1..6
(D) 기타 정보: /라벨=D-Arg
/주="D-Arg에서 A 앞의 첨자 "D"는 위치 2에서의 아르기닌이 D-아미노 산이라는 것을 의미한다."
(2) 서열 4에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징
(A) 길이: 6개 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(D) 형태: 환형
(ⅱ) 분자 유형: 펩타이드
(ⅴ) 단편 유형: 내부
(ⅸ) 양상
(A) 명칭/키: 펩타이드
(B) 위치: 2
(D) 기타 정보: /주="Arg는 D-아미노산이다."
(2) 서열 5에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징
(A) 길이: 5개 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(D) 형태: 환형
(ⅱ) 분자 유형: 펩타이드
(ⅴ) 단편 유형: 내부
(ⅸ) 양상
(A) 명칭/키: 펩타이드
(B) 위치: 4
(D) 기타 정보: /주="Arg는 D-아미노산이다."
(2) 서열 6에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징
(A) 길이: 5개 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(D) 형태: 환형
(ⅱ) 분자 유형: 펩타이드
(ⅴ) 단편 유형: 내부
(ⅸ) 양상
(A) 명칭/키: 펩타이드
(B) 위치: 4
(D) 기타 정보: /주="Phe는 D-아미노산이다."
(2) 서열 7에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징
(A) 길이: 5개 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(D) 형태: 환형
(ⅱ) 분자 유형: 펩타이드
(ⅴ) 단편 유형: 내부
(ⅸ) 양상
(A) 명칭/키: 펩타이드
(B) 위치: 5
(D) 기타 정보: /주="Val는 D-아미노산이다."
(2) 서열 8에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징
(A) 길이: 15개 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 유형: 펩타이드
(ⅴ) 단편 유형: 내부
(2) 서열 9에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징
(A) 길이: 5개 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(D) 형태: 환형
(ⅱ) 분자 유형: 펩타이드
(ⅴ) 단편 유형: 내부
(ⅸ) 양상
(A) 명칭/키: 펩타이드
(B) 위치: 2
(D) 기타 정보: /주="Ala는 D-아미노산이다."
(2) 서열 10에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징
(A) 길이: 5개 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(D) 형태: 환형
(ⅱ) 분자 유형: 펩타이드
(ⅴ) 단편 유형: 내부
(ⅸ) 양상
(A) 명칭/키: 펩타이드
(B) 위치: 5
(D) 기타 정보: /주="Phe는 D-아미노산이다."
(2) 서열 11에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징
(A) 길이: 5개 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(D) 형태: 환형
(ⅱ) 분자 유형: 펩타이드
(ⅴ) 단편 유형: 내부
(ⅸ) 양상
(A) 명칭/키: 펩타이드
(B) 위치: 5
(D) 기타 정보: /주="Phe는 D-아미노산이다."
(2) 서열 12에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징
(A) 길이: 12개 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 유형: 펩타이드
(ⅴ) 단편 유형: 내부
(2) 서열 13에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징
(A) 길이: 13개 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 유형: 펩타이드
(ⅴ) 단편 유형: 내부
(2) 서열 14에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징
(A) 길이: 11개 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 유형: 펩타이드
(ⅴ) 단편 유형: 내부
(2) 서열 15에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징
(A) 길이: 5개 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(D) 형태: 환형
(ⅱ) 분자 유형: 펩타이드
(ⅴ) 단편 유형: 내부
(ⅸ) 양상
(A) 명칭/키: 펩타이드
(B) 위치: 5
(D) 기타 정보: /주="메틸화는 발린 잔사의 아미노(NH2) 말단에서 이루어 진다."
(2) 서열 16에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징
(A) 길이: 5개 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(D) 형태: 환형
(ⅱ) 분자 유형: 펩타이드
(ⅴ) 단편 유형: 내부
(ⅸ) 양상
(A) 명칭/키: 펩타이드
(B) 위치: 5
(D) 기타 정보: /주="메틸화는 발린 잔사의 아미노(NH2) 말단에서 이루어 진다."
(2) 서열 17에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징
(A) 길이: 222개 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 유형: 단백질
(ⅴ) 단편 유형: C-말단
(2) 서열 18에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징
(A) 길이: 193개 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 유형: 단백질
(ⅴ) 단편 유형: C-말단
(2) 서열 19에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징
(A) 길이: 74개 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 유형: 단백질
(ⅴ) 단편 유형: 내부
(2) 서열 20에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징
(A) 길이: 108개 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 유형: 단백질
(ⅴ) 단편 유형: 내부
(2) 서열 21에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징
(A) 길이: 122개 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 유형: 단백질
(ⅴ) 단편 유형: C-말단
(2) 서열 22에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징
(A) 길이: 89개 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 유형: 단백질
(ⅴ) 단편 유형: C-말단
(2) 서열 23에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징
(A) 길이: 228개 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 유형: 단백질
(ⅴ) 단편 유형: C-말단
(2) 서열 24에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징
(A) 길이: 193개 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 유형: 단백질
(ⅴ) 단편 유형: C-말단
(2) 서열 25에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징
(A) 길이: 74개 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 유형: 단백질
(ⅴ) 단편 유형: 내부
(2) 서열 26에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징
(A) 길이: 108개 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 유형: 단백질
(ⅴ) 단편 유형: 내부
(2) 서열 27에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징
(A) 길이: 122개 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 유형: 단백질
(ⅴ) 단편 유형: C-말단
(2) 서열 28에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징
(A) 길이: 89개 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 유형: 단백질
(ⅴ) 단편 유형: C-말단
(2) 서열 29에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징
(A) 길이: 2123개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 이본쇄
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 유형: cDNA
(ⅲ) 가설: 없음
(ⅳ) 안티센스: 없음
(ⅸ) 양상
(A) 명칭/키: CDS
(B) 위치: 132..2123
(2) 서열 30에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징
(A) 길이: 663개 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 유형: 단백질
(2) 서열 31에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징
(A) 길이: 21개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 유형: cDNA
(ⅲ) 가설: 없음
(ⅳ) 안티센스: 없음
ATTGAATTCT TCTACAGTTC A 21
(2) 서열 32에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징
(A) 길이: 21개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 유형: cDNA
(ⅲ) 가설: 없음
(ⅳ) 안티센스: 없음
ATGGGATCCA CTGCAAATTT C 21
(2) 서열 33에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징
(A) 길이: 21개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 유형: cDNA
(ⅲ) 가설: 없음
(ⅳ) 안티센스: 없음
GCCGGATCCA TGACCAGTGT A 21
(2) 서열 34에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징
(A) 길이: 21개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 유형: cDNA
(ⅲ) 가설: 없음
(ⅳ) 안티센스: 없음
GTGGGATCCC TGAAGACTAT G 21
(2) 서열 35에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징
(A) 길이: 21개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 유형: cDNA
(ⅲ) 가설: 없음
(ⅳ) 안티센스: 없음
AGGGGATCCT TAAGGGGATT C 21
(2) 서열 36에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징
(A) 길이: 21개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 유형: cDNA
(ⅲ) 가설: 없음
(ⅳ) 안티센스: 없음
CTCGGATCCT CTGCAAGCAC G 21
(2) 서열 37에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징
(A) 길이: 21개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 유형: cDNA
(ⅲ) 가설: 없음
(ⅳ) 안티센스: 없음
CTCGGATCCT CTGCAAGCAC G 21
(2) 서열 38에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징
(A) 길이: 26개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 유형: cDNA
(ⅲ) 가설: 없음
(ⅳ) 안티센스: 없음
GCAGGATCCG AGTGCTGGGT TTATAC 26
(2) 서열 39에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징
(A) 길이: 27개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 유형: cDNA
(ⅲ) 가설: 없음
(ⅳ) 안티센스: 없음
GCAGAATTCA ACTGTGGCAG AAACAAG 27
(2) 서열 40에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징
(A) 길이: 26개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 유형: cDNA
(ⅲ) 가설: 없음
(ⅳ) 안티센스: 없음
GTAGAATTCC AGCACTCATT TCCTGC 26
(2) 서열 41에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징
(A) 길이: 24개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 유형: cDNA
(ⅲ) 가설: 없음
(ⅳ) 안티센스: 없음
TCTGAATTCT GCCACAGTTG AAGG 24
(2) 서열 42에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징
(A) 길이: 21개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 유형: cDNA
(ⅲ) 가설: 없음
(ⅳ) 안티센스: 없음
ATTGAATTCT TCTACAGTTC A 21
(2) 서열 43에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징
(A) 길이: 20개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 유형: cDNA
(ⅲ) 가설: 없음
(ⅳ) 안티센스: 없음
GATGAATTCT ACTGCAAGTT 20
(2) 서열 44에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징
(A) 길이: 21개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 유형: cDNA
(ⅲ) 가설: 없음
(ⅳ) 안티센스: 없음
CACTGAATTC ATCTGCAAAC A 21
(2) 서열 45에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징
(A) 길이: 429개 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 유형: 단백질
(ⅴ) 단편 유형: C-말단

Claims (43)

  1. 특정 조직에서 혈관 형성(angiogenesis)을 억제하는데 유효하고, 인테그린 αⅴβ3과 결합될 수 있으며 매트릭스 메탈로프로테이나제의 카복시 말단 영역의 일정 부분을 포함하는 아미노산 잔기를 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 혈관 형성-억제량의 αⅴβ3길항제를 포함하는, 패키징 재료 내에 함유되어 있는 약제학적 제제; 및 이러한 약제학적 제제가 혈관 형성의 억제에 의해 질환을 치료하는데 사용될 수 있다는 것을 지시해주는 라벨을 포함하는 패키징 재료를 포함하는 제품.
  2. 제1항에 있어서, 폴리펩타이드가 서열 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 또는 28에 제시된 아미노산 잔기를 포함하는 제품.
  3. 제1항에 있어서, 조직이 염증 발생된 조직이고 질환이 관절염 또는 류마티스성 관절염인 제품.
  4. 제1항에 있어서, 조직이 고형 종양 또는 고형 종양 전이인 제품.
  5. 제1항에 있어서, 조직이 망막 조직이고 질환이 망막증, 당뇨병성 망막증 또는 퇴화성 반점인 제품.
  6. 인테그린 αⅴβ3과 결합될 수 있으며 매트릭스 메탈로프로테이나제의 카복시 말단 영역의 일정 부분을 포함하는 아미노산 잔기를 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 αⅴβ3길항제.
  7. 제6항에 있어서, 폴리펩타이드가 서열 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 또는 28에 제시된 아미노산 잔기를 포함하는 길항제.
  8. 제6항에 있어서, 폴리펩타이드가 융합 단백질인 길항제.
  9. 제6항에 있어서, 폴리펩타이드가 서열 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 또는 28에 제시된 아미노산 잔기를 갖는 길항제.
  10. 약제학적으로 허용되는 담체 중에, 제6항에 따르는 αⅴβ3길항제를 특정 조직에서의 혈관 형성을 억제하기에 충분한 양으로 포함하는 약제학적 제제.
  11. 혈관 형성-억제량의 αⅴβ3길항제를 포함하는 조성물을 특정 조직에 투여하는 것을 포함하여, 이러한 조직에서의 혈관 형성을 억제하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 길항제가 융합 단백질, 폴리펩타이드, 유도체화된 폴리펩타이드, 사이클릭 폴리펩타이드, 모노클로날 항체 또는 유기 모사체(mimetic) 화합물인 방법.
  13. 제11항에 있어서, 인테그린 αⅴβ3길항제가 αⅡbβ3에 대한 피브리노겐 결합과 비교해서 αⅴβ3에 대한 피브리노겐 결합을 우선적으로 억제시키는 방법.
  14. 제11항에 있어서, αⅴβ3길항제가, 인테그린 αⅴβ3과 결합될 수 있으며 매트릭스 메탈로프로테이나제의 카복시 말단 영역의 일정 부분을 포함하는 아미노산 잔기를 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 방법.
  15. 제11항에 있어서, 폴리펩타이드가 서열 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 또는 28에 제시된 아미노산 잔기를 포함하는 방법.
  16. 제11항에 있어서, 폴리펩타이드가 융합 단백질인 방법.
  17. 제11항에 있어서, 폴리펩타이드가 서열 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 또는 28에 제시된 아미노산 잔기를 갖는 방법.
  18. 제11항에 있어서, 조직이 염증 발생된 조직이고 혈관 형성이 염증 발생된 조직 혈관 형성인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 조직인 관절염 조직인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 관절염 조직이 류마티스성 관절염에 걸린 포유동물에 존재하는 방법.
  21. 제11항에 있어서, 조직이 당뇨병성 망막증에 걸린 환자의 망막 조직이고 혈관 형성이 망막성 혈관 형성인 방법.
  22. 제11항에 있어서, 조직이 고형 종양 또는 고형 종양 전이이고 혈관 형성이 종양 혈관 형성인 방법.
  23. 제11항에 있어서, 투여가 정맥내, 경피, 활액내, 근육내 또는 경구 투여를 포함하는 방법.
  24. 제22항에 있어서, 투여가 화학치료법과 병행하여 수행되는 방법.
  25. 제11항에 있어서, 투여가 단일 용량을 정맥내 투여하는 것을 포함하는 방법.
  26. 고형 종양 조직의 신생혈관화를 억제하기에 충분한 치료학적으로 유효한 양의 인테그린 αⅴβ3길항제를 포함하는 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하여, 환자에서 고형 종양 조직 퇴화를 유도하는 방법.
  27. 제26항에 있어서, 길항제가 융합 단백질, 폴리펩타이드, 유도체화된 폴리펩타이드, 사이클릭 폴리펩타이드, 모노클로날 항체 또는 유기 모사체 화합물인 방법.
  28. 제26항에 있어서, αⅴβ3길항제가 제6항에 따르는 αⅴβ3길항제인 방법.
  29. 고형 종양 조직 성장을 억제시키기에 충분한 치료학적으로 유효한 양의 인테그린 αⅴβ3길항제를 포함하는 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하여, 환자에서 신생혈관화를 진행시키는 고형 종양 조직 성장을 억제하는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 길항제가 융합 단백질, 폴리펩타이드, 유도체화된 폴리펩타이드, 사이클릭 폴리펩타이드, 모노클로날 항체 또는 유기 모사체 화합물인 방법.
  31. 제29항에 있어서, αⅴβ3길항제가 제6항에 따르는 αⅴβ3길항제인 방법.
  32. 치료학적으로 유효한 양의 인테그린 αⅴβ3길항제를 포함하는 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하여, 신생혈관화가 일어나는 염증 발생된 조직을 지닌 환자를 치료하는 방법.
  33. 제32항에 있어서, 길항제가 융합 단백질, 폴리펩타이드, 유도체화된 폴리펩타이드, 사이클릭 폴리펩타이드, 모노클로날 항체 또는 유기 모사체 화합물인 방법.
  34. 제32항에 있어서, αⅴβ3길항제가 제6항에 따르는 αⅴβ3길항제인 방법.
  35. 신생혈관화-억제량의 인테그린 αⅴβ3길항제를 포함하는 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하여, 신생혈관화가 망막 조직에서 발생되는 환자를 치료하는 방법.
  36. 제35항에 있어서, 길항제가 융합 단백질, 폴리펩타이드, 유도체화된 폴리펩타이드, 사이클릭 폴리펩타이드, 모노클로날 항체 또는 유기 모사체 화합물인 방법.
  37. 제35항에 있어서, αⅴβ3길항제가 제6항에 따르는 αⅴβ3길항제인 방법.
  38. 치료학적으로 유효한 양의 인테그린 αⅴβ3길항제를 포함하는 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하여, 혈관형성술 후에 평활근 세포 이동이 일어나는 조직에서의 재발협착증(restenosis)에 대해 환자를 치료하는 방법.
  39. 제38항에 있어서, 길항제가 융합 단백질, 폴리펩타이드, 유도체화된 폴리펩타이드, 사이클릭 폴리펩타이드, 모노클로날 항체 또는 유기 모사체 화합물인 방법.
  40. 제38항에 있어서, αⅴβ3길항제가 제6항에 따르는 αⅴβ3길항제인 방법.
  41. 조직에 대한 혈액 공급을 감소시키기에 충분한 치료학적으로 유효한 양의 인테그린 αⅴβ3길항제를 포함하는 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하여, 환자에서 조직의 새로운 성장을 지지하는데 요구되는 조직에 대한 혈액 공급을 감소시키는 방법.
  42. 제41항에 있어서, 길항제가 융합 단백질, 폴리펩타이드, 유도체화된 폴리펩타이드, 사이클릭 폴리펩타이드, 모노클로날 항체 또는 유기 모사체 화합물인 방법.
  43. 제41항에 있어서, αⅴβ3길항제가 제6항에 따르는 αⅴβ3길항제인 방법.
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