CZ383498A3 - Průmyslový výrobek, antagonista integrinu alfav beta3, farmaceutický přípravek s obsahem alfav beta3 antagonisty a způsob inhibice angiogeneze ve tkáni - Google Patents

Průmyslový výrobek, antagonista integrinu alfav beta3, farmaceutický přípravek s obsahem alfav beta3 antagonisty a způsob inhibice angiogeneze ve tkáni Download PDF

Info

Publication number
CZ383498A3
CZ383498A3 CZ983834A CZ383498A CZ383498A3 CZ 383498 A3 CZ383498 A3 CZ 383498A3 CZ 983834 A CZ983834 A CZ 983834A CZ 383498 A CZ383498 A CZ 383498A CZ 383498 A3 CZ383498 A3 CZ 383498A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
tissue
angiogenesis
antagonist
polypeptide
amino acid
Prior art date
Application number
CZ983834A
Other languages
English (en)
Inventor
Peter Brooks
David A. Cheresh
Original Assignee
The Scripps Research Institute
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by The Scripps Research Institute filed Critical The Scripps Research Institute
Publication of CZ383498A3 publication Critical patent/CZ383498A3/cs

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6489—Metalloendopeptidases (3.4.24)
    • C12N9/6491—Matrix metalloproteases [MMP's], e.g. interstitial collagenase (3.4.24.7); Stromelysins (3.4.24.17; 3.2.1.22); Matrilysin (3.4.24.23)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A61K38/4886—Metalloendopeptidases (3.4.24), e.g. collagenase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C279/00—Derivatives of guanidine, i.e. compounds containing the group, the singly-bound nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C279/04—Derivatives of guanidine, i.e. compounds containing the group, the singly-bound nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups having nitrogen atoms of guanidine groups bound to acyclic carbon atoms of a carbon skeleton
    • C07C279/14—Derivatives of guanidine, i.e. compounds containing the group, the singly-bound nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups having nitrogen atoms of guanidine groups bound to acyclic carbon atoms of a carbon skeleton being further substituted by carboxyl groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C311/00—Amides of sulfonic acids, i.e. compounds having singly-bound oxygen atoms of sulfo groups replaced by nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C311/01—Sulfonamides having sulfur atoms of sulfonamide groups bound to acyclic carbon atoms
    • C07C311/02—Sulfonamides having sulfur atoms of sulfonamide groups bound to acyclic carbon atoms of an acyclic saturated carbon skeleton
    • C07C311/03—Sulfonamides having sulfur atoms of sulfonamide groups bound to acyclic carbon atoms of an acyclic saturated carbon skeleton having the nitrogen atoms of the sulfonamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • C07C311/06—Sulfonamides having sulfur atoms of sulfonamide groups bound to acyclic carbon atoms of an acyclic saturated carbon skeleton having the nitrogen atoms of the sulfonamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms to acyclic carbon atoms of hydrocarbon radicals substituted by carboxyl groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C311/00—Amides of sulfonic acids, i.e. compounds having singly-bound oxygen atoms of sulfo groups replaced by nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C311/01—Sulfonamides having sulfur atoms of sulfonamide groups bound to acyclic carbon atoms
    • C07C311/10—Sulfonamides having sulfur atoms of sulfonamide groups bound to acyclic carbon atoms of a saturated carbon skeleton containing rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D263/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-oxazole or hydrogenated 1,3-oxazole rings
    • C07D263/02—Heterocyclic compounds containing 1,3-oxazole or hydrogenated 1,3-oxazole rings not condensed with other rings
    • C07D263/30—Heterocyclic compounds containing 1,3-oxazole or hydrogenated 1,3-oxazole rings not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D263/34—Heterocyclic compounds containing 1,3-oxazole or hydrogenated 1,3-oxazole rings not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D263/36—One oxygen atom
    • C07D263/38—One oxygen atom attached in position 2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C07K14/75—Fibrinogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2839—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2839—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily
    • C07K16/2848—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily against integrin beta3-subunit-containing molecules, e.g. CD41, CD51, CD61
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C2602/00—Systems containing two condensed rings
    • C07C2602/36—Systems containing two condensed rings the rings having more than two atoms in common
    • C07C2602/42—Systems containing two condensed rings the rings having more than two atoms in common the bicyclo ring system containing seven carbon atoms

Description

Oblast techniky
Navrhovaný vynález spadá do oboru medicíny a konkrétně se týká způsobů inhibice a prostředků pro inhibici angiogeneze ve tkáních. Vynález je založen na použití antagonistů receptoru pro vitronektin ανβ3·
Dosavadní stav techniky
Integriny patří mezi buněčné receptory o nichž je známo, že váží proteiny extracelulární matrix a tudíž zprostředkovávají vzájemné mezibuněčné interakce, nebo interakce buňky s extracelulární matrix. Oba zmíněné typy interakcí jsou obecně nazývané buněčná adheze. Ovšem ačkoliv je v literatuře popsáno mnoho integrinů i jejich ligandů, biologická funkce mnoha z nich je zatím nejasná. Integrinové receptory tvoří rodinu proteinů, jejichž společným strukturním rysem je tvorba nekovalentního heterodimerního glykoproteinového komplexu α a β podjednotek.
Nyní jsou známy tři různé integriny, jejichž hlavní charakteristikou je přednostní vazba vitronektinu (nazývané též podle této své vlastnosti receptory pro vitronektin), a to ανβι, ανβ3 a ανβ5 (Horton: Int. J. Exp. Pathol., 71: 741-759 (1990)).
• ·
ανβι váže fibronektin a vitronektin. ανβ3 váže širokou škálu ligandů včetně fibrinu, fibrinogenu, lamininu, thrombospondinu, vitronektinu, von Wildebrandova faktoru, osteospontinu a kostního sialoproteinu I. ανβ5 váže vitronektin. Konkrétní úloha, jakou hrají tyto tři integriny v procesech buněčné adheze v různých tkáních je stále předmětem zkoumání, ale již dnes je zřejmé, že existují různé integriny s různými biologickými funkcemi.
Sekvence arginin-glycin-kyselina asparagová (RGD) je jedním z důležitých rozpoznávacích míst ligandů, které je specifické pro mnoho integrinů. Bylo zjištěno, že všechny výše zmíněné ligandy nesou RGD místo pro vitronektinové receptory. Toto RGD rozpoznávací místo může být napodobeno jinými polypeptidy („peptidy“), které nesou RGD sekvenci. Takové RGD peptidy jsou známé jako inhibitory funkce integrinů. Je ovšem důležité zmínit, že v závislosti na sekvenci a struktuře RGD peptidů se může měnit i specifičnost inhibice konkrétního cílového integrinů.
RGD rozpoznávací místa jsou podrobněji diskutována například v Piersbacher a kol., Nátuře, 309; 30-33 (1984) a Piersbacher a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81; 5985-5988 (1984). Různé RGD polypeptidy s rozlišnou integrinovou specifitou byly dále popsány v Grant a kol, Cell 58; 933-943 (1989); Cheresh a kol, Cell 58: 945-953 (1989); Aumailley a kol., FEBS Letts. 291: 5054 (1991) a Pfaff a kol., J. Biol. Chem. 269: 20233-20238 (1994), a dále v US patentech č.: 4,517,686; 4,578,079; 4,589,881;
4,614,517; 4,661,111; 4,792,525; 4,683,291; 4,879,237;
4,988,621; 5,041,380 a 5,061,693.
Angiogeneze je proces vaskularizace tkáně, který zahrnuje vrůstání nově se vyvíjejících krevních cév do tkáně, ale může být • ·
tímto termínem označován i proces neovaskularizace. Základem tohoto procesuje infiltrace endoteliálních buněk a buněk hladkého svalstva. Předpokládá se, že k vaskularízaci dochází jedním ze tří následujících způsobů: 1. cévy mohou vznikat pučením z již existujících cév, 2. cévy mohou vznikat de novo z prekurzorových buněk (vaskulogeneze), a nebo 3. mohou již existující drobné cévky zvětšovat svůj průměr Blood a kol., Bioch. Biophys. Acta 1032: 89-118 (1990). Je známo, že buňky cévního endotelu nesou nejméně pět RGD-závislých integrinů, tj. vitronektinový receptor (ανβ3 nebo ctyps), receptor pro kolagen typu I a IV (oti β i), receptor pro laminin (α2βι), fibronektin/laminin/kolagenový receptor (α3βι) a fibronektinový receptor (α,5βι) Davis a kol., J. Cell. Biochem. 51: 206-218 (1993). Je známo, že buňky hladkého svalstva nesou nejméně šest RGD-závislých integrinů, včetně &5βι; ανβ3 a ανβ5. Angiogeneze je velice důležitým procesem v období neonatálního růstu, ale je neméně důležitá i v procesu hojení ran a v patogenezi velkého množství klinických onemocnění, jakými jsou například záněty, artritida, nádorové bujení, diabetická retinopatie, pigmentová zvrhlost retiny způsobená její neovaskularizaci a další podobné stavy. Zmíněné klinické projevy spojené s angiogenezi se obecně označují jako angiogenní onemocnění Folkman a kol., Science 235: 442-447 (1987). Angiogeneze se obecně netýká dospělých a nebo maturovaných tkání s výjimkou hojení ran a růstového cyklu corpus luteum, viz. např. Moses a kol. Science 248: 1408-1410 (1990).
Inhibice angiogeneze byla považována za jednu z možností léčby nádorového bujení. V těchto souvislostech se uvažovalo o třech možnostech inhibice angiogeneze: 1. o inhibici uvolňování „angiogenních molekul“, jako např. bFGF (základní fibroblastový růstový faktor), 2. o neutralizaci angiogenních molekul například pomocí protilátek (např. anti-bFGF protilátky) a 3. o inhibici endoteliální buněčné odpovědi na angiogenní podnět. Poslední zmíněná strategie si získala pozornost vědců a v článku Folkman a kol., Cancer Biology 3: 89-96 (1992) bylo popsáno hned několik inhibitorů endoteliální buněčné odpovědi, například inhibitor kolagenázy, inhibitory pochodů probíhajících na bazální membráně, angiostatické steroidy, inhibitory angiogeneze houbového původu, destičkový faktor 4, thrombospondin, léčiva jako např. D-penicilamin, analogy vitaminu D3, interferon a a další, které mohou být použity pro inhibici angiogeneze. Další možné inhibitory angiogeneze jsou popsány v článcích Blood a kol., Bioch. Biophys. Acta 1032: 89-1 18 (1990); Moses a kol., Science 248: 1408-1410 (1990); Ingber a kol., Lab. Invest. 59: 4451 (1988) a v US patentech 5,092,885; 5,112,946; 5,192,744 a v
5,202,352. Žádný z inhibitorů angiogeneze, popsaných v předcházejících odkazech není inhibitorem ανβ3 RGD peptidy inhibující vitronektinový receptor ανβ3 již byly také popsány: Aumailley a kol., FEBS Letts. 291: 50-54 (1991); Choi a kol., J. Vasc. Surg. 19: 125-134 (1994); Smith a kol., J. Biol. Chem. 265: 12267-12271 (1990) a Pfaff a kol., J. Biol. Chem. 269: 20233-20238 (1994). Ovšem až dosud neexistovaly o roli integrinu ανβ3 v angiogenezi ani dohady, tím méně důkazy.
Objevy, prezentované v navrhovaném vynálezu potvrdil například Hammes a kol., Nátuře Med. 2: 529-53 (1996). V tomto článku bylo na myším modelu prokázáno, že cyklické peptidy včetně cyklického RGDfV (struktura a funkce RGDfV byla již dříve popsána v patentové přihlášce, která předcházela navrhovanému vynálezu) inhibují neovaskularizaci retiny, která byla navozena pomocí nedostatečného přívodu kyslíku. Jiná nezávislá studie, taktéž podporující navrhovaný vynález i předcházející patentovou žádost, Luna a kol., Lab. Invest. 75; 563-573 (1996) popisuje dva konkrétní cyklické methylované peptidy nesoucí RGD motiv, které se ukázaly jako obzvlášť účinné při inhibici neovaskularizace retiny na myším modelu kyslíkem indukované ischemické retinopatie. Peptidy podle navrhovaného vynálezu vykazují téměř úplnou inhibici neovaskularizace na modelových systémech, popsaných v následujícím textu.
Inhibice buněčné adheze in vitro s pomocí monoklonálních protilátek, specifických pro a či β podjednotky různých integrinů, nepřímo prokazuje i účast ανβ3 v procesech buněčné adheze mezi různými typy buněk včetně mikrovaskulárních endoteliálních buněk Davis a kol., J. Cell Biol. 51: 206-218 (1993). Nicosia a kol., Am. J. Pathol. 138: 829-833 (1991) navíc popisuje použití RGD peptidů GRGDS pro in vitro inhibici tvorby „vlásečnic“ z krysí aorty, kultivované v kolagenovém gelu. Ovšem model inhibice tvorby „vlásečnic“ in vitro v kulturách v kolagenovém gelu není použitelným modelem inhibice angiogeneze ve tkáních, neboť neukazuje, že vlásečnicové struktury jsou stejné jako pučící kapiláry, nebo že tvorba vlásečnic v kultuře v kolagenovém gelu je shodná s neovaskulárním růstem v intaktní tkáni, jakou je například artritická tkáň, tumor, nebo jiná nemocná tkáň, ve které chceme dosáhnout inhibice angiogeneze.
Při vzniku cév musí endoteliální buňky nejprve rozrušit a překonat bariéru, kterou tvoří bazální membrána krevních cév, a to podobným způsobem, jaký využívají nádorové buňky během invaze a tvorby metastáz.
• ·
Vědci již dříve popsali, že angiogeneze závisí na interakci mezi vaskulárními integriny a proteiny extracelulární matrix (Brooks a kol., Science 264, 569-571 (1994)). Dále bylo prokázáno, že programovaná buněčná smrt (apoptóza) angiogenních vaskulárních buněk je iniciována interakcí, která může být inhibována určitými antagonisty cévních integrinů ανβ5 (Brooks a kol., Cell 79, 1 1571164 (1994)). Ještě později bylo prokázáno, že vazba metaloproteinázy-2 z extracelulární matrix (MMP-2) k vitronektinovému receptoru (ανβ§) může být inhibována pomocí ανβ5 antagonistů, a tak je inhibována i enzymatická funkce proteinázy (Brooks a kol., Cell 85, 683-693 (1996)).
S výjimkou zde citovaných prací si nejsou žadatelé vědomi žádné jiné studie, popisující inhibici angiogeneze ve tkáních pomocí inhibitorů buněčné adheze. Konkrétně, nikdy dříve nebylo nikým jiným prokázáno, že je funkce ανβ3 nezbytná pro tvorbu cév ve tkáních a že antagonisté ανβ3 mohou tvorbu cév ve tkáních inhibovat.
Podstata vynálezu
Podle navrhovaného vynálezu je pro angiogenezi ve tkáních nezbytný integrin ανβ3, a inhibitory ανβ3 mohou angiogenezi ve tkáních inhibovat. Dále je zde prokázáno, že antagonisté dalších integrinů, jako jsou například αιΠιβ3 nebo ανβι angiogenezi neinhibují, pravděpodobně proto, že tyto integriny nejsou pro angiogenezi nezbytné.
Vynález se dále týká způsobu inhibice angiogeneze ve tkáni, který zahrnuje aplikaci prostředku s obsahem ανβ3 antagonisty na tkáň, a to v množství dostatečném pro inhibici angiogeneze.
• · · ·
Ί
Takto léčenou tkání může být kterákoliv tkáň, ve které je žádoucí zabránit angiogenezí, například nemocná tkáň ve které probíhá neovaskularizace. Dalšími příklady mohou být zanícená tkáň, pevné tumory, metastázy, tkáně ve kterých probíhá opětovná stenóza atd.
Antagonisté otvp3 pro použití podle navrhovaného vynálezu jsou schopni vázat ανβ3 a kompetitivně inhibovat schopnost otvp3 vázat přirozený ligand. Antagonista ανβ3 podle navrhovaného vynálezu je nejraději specifický pro ocvp3· Ještě raději inhibuje antagonista ανβ3 vazbu fibrinogenu a dalších RGD-obsahujících ligandů na ανβ3, ale podstatně neovlivní vazbu fibrinogenu na anbP3· Preferovaným ανβ3 antagonistou může být fúzní polypeptid, cyklický nebo lineární polypeptid, derivát polypeptidu, monoklonální protilátka, která imunologicky reaguje s ανβ3, organický analog ανβ3, a nebo funkční fragment kteréhokoliv ze zmíněných polypeptidů.
Přehled obrázků
Obrázky, jejichž popis následuje jsou součástí navrhovaného vynálezu:
Obrázky 1A-1D zobrazují distribuci podjednotek integrinů βι a β3 v normální tkáni a ve tkáni, ve které probíhá hojení rány (též nazývané granulace tkáně). Byla provedena imunohistochemická analýza s protilátkami proti βι a ββ (viz. příklad 3A). Obrázky 1A a 1B resp. ilustrují imunoreaktivitu anti^3 protilátek v normální a v hojící se tkáni. Obrázky 1C a ID resp. ilustrují imunoreaktivitu anti-βι protilátek v normální a v hojící se tkáni.
• · ·
8· · ··· · ·· ·<···· ···« · · · · · ·
Na obrázcích 2A-2D je zobrazena tkáňová distribuce von Wildebrandova faktoru a lamininu, tj. ligandů které váží βι a ββ podjednotky integrinů resp., v normální tkáni a ve tkáni, ve které probíhá hojení rány (též nazývané granulace tkáně). Byla provedena imunohístochemická analýza s protilátkami proti von Wildebrandovu faktoru (anti-vWF) a lamininu (anti-laminin) (viz. příklad 3B). Obrázky 2A a 2B resp. ilustrují imunoreaktivitu anti vWF protilátek v normální a v hojící se tkáni. Obrázky 2C a 2D resp. ilustrují imunoreaktivitu protilátek proti lamininu v normální a v hojící se tkáni.
Na obrázcích 3A-3D je zobrazena distribuce receptoru pro vitronektin ανβ3 ve tkáních získaných biopsií z karcinomu močového měchýře, karcinomu tlustého střeva, karcinomu prsu a karcinomu plic resp. Byla provedena imunohístochemická analýza s protilátkou LM609 proti ανβ3 (popis viz příklad 3C).
Na obrázku 4 je typická mikrofotografie CAM podle vynálezu, postrádající krevní cévy. Preparát byl získán z neošetřeného 10 dnů starého kuřecího embrya. Příprava preparátu je popsána v příkladu 5B.
Na obrázcích 5A-5C je zobrazena tkáňová distribuce integrinů βι a ανβ3 v izolátech CAM podle vynálezu. Na obrázku 5A je zobrazena distribuce βι podjednotky v neošetřené 10 dní staré CAM tkáni, βι podjednotka byla detekována imunofluorescenčně pomocí CSAT anti-βι protilátky. Na obrázku 5B je zobrazena distribuce ανβ3 receptorů v neošetřené 10 dní staré CAM tkáni. ανββ receptory byly detekovány imunofluorescenčně pomocí LM609 anti-a^3 protilátky. Na obrázku 5C je zobrazena distribuce ανβ3 receptorů v 10 dní staré CAM tkáni ošetřené
bFGF. otvp3 receptory byly detekovány imunofluorescenčně pomocí LM609 anti-otvP3 protilátky. Způsob ošetření tkáně a výsledky pokusu jsou popsány v příkladu 5C.
Sloupcový graf na obrázku 6 je kvantitativním zobrazením relativní exprese ανβ3 a βι v neošetřené a bFGF ošetřené 10 dní staré CAM tkáni (popis viz příklad 6A). Průměrná intenzita fluorescence je vynesena na ose , typ integrinu je zobrazen na ose X.
Na obrázcích 7A-7C je zobrazena neošetřená 10 dní stará CAM tkáň, a dále CAM ošetřená bFGF a TNFa resp. Způsob provedení experimentu a výsledky jsou popsány v příkladu 6A.
Obrázky 8A-8E ilustrují úěinek léěby pomocí protilátek a to u 10 dní staré CAM tkáně ve které byla angiogeneze vyvolána pomocí bFGF (viz. příklad 7A1). Na obrázku 8A je neléčená CAM tkáň ve které nejsou vyvinuty žádné krevní cévy. Na obrázku 8B je vidět infiltrace nově vznikajících cév do oblastí, kde dříve vaskularizace chyběla, po indukci bFGF. Obrázky 8C, 89D a 8E resp. zobrazují účinky protilátek proti βι (anti-βι; CSAT), ανβ5 (ηηΝ-ανβ5; P3G2) a ανββ (ηηΒ-ανβ3; LM609).
Obrázky 9A-9C ilustrují účinky intravenózni injekce syntetického peptidu 66203 na angiogenezi indukovanou nádorovým bujením (viz. příklad 7E2). Na obrázku 9A je vidět, že intravenózni léčba kontrolním peptidem nemá na tumorem indukovanou angiogenezi žádný inhibiční efekt. Inhibiční účinek intravenózni injekce peptidu 66203 (cyklický RGD peptid) je zobrazen na obrázku 9B. Na obrázku 9C je vidět, že po intravenózni injekci peptidu 66203 nedochází k žádnému inhibičnímu efektu a nebo je dokonce patrná • · cytotoxická reakce s již dříve existujícími cévami v oblastech sousedících s indukovaným tumorem.
Na obrázcích 10A-10C je zobrazen účinek intravenózní aplikace monoklonálních protilátek na angiogenezi vyvolanou růstovým faktorem (popis viz. příklad 7B1). Obrázek 10A zobrazuje kontrolní tkáň s bFGF indukovanou angiogenezi bez ošetření protilátkami. V případě, kdy byla tkáň z obrázku 10A léčena antiανβ5 protilátkou P3G2, nebyla zaznamenána žádná inhibice angiogeneze (viz. obrázek 10B). Jak je vidět na obrázku 10C, inhibice angiogeneze bylo dosaženo po léčbě anti-avP3 protilátkou LM609.
Obrázky 11A-11C ilustrují vliv protilátek proti integrinu na embryonální angiogenezi (popis viz příklad 7C). Angiogeneze v 6 dní staré CAM tkáni nebyla inhibována anti-βι ani anti-a^5 protilátkami resp. (obrázky 11A a 11B). Naproti tomu ošetření anti-c^3 protilátkou LM609 mělo za následek inhibici tvorby krevních cév tak jak je to zobrazeno na obrázku 11C. Graf na obrázku 12 představuje kvantitativní znázornění počtu cév vstupujících do tumoru ve vzorku CAM tkáně (popis experimentu viz příklad 7D1). V grafu je zachycen počet cév (osa Y) který je výsledkem působení CSAT (anti-βι), LM609 (anti-a^Ts) a P3G2 (anti-OL^s) protilátek (osa X).
Na obrázcích 13A-13D je zachyceno srovnání mokré hmotnosti tumorů 7 dní po ošetření s výchozí hmotností tumoru (popis viz. příklad 9Al)a). Každý sloupec zobrazuje průměrnou hmotnost tumoru (skupiny 5-10 tumorů) ± S.E. Tkáně byly získány z lidského melanomu CAM (M21-L) (obrázek 13A), karcinomu pankreatu CAM (Fg) (obrázek 13B), karcinomu plic CAM • · > · «· «·* · · · • · · · · · (UCLAP-3) (obrázek 13C) a z karcinomu hrtanu CAM (HEp3) (obrázek 13D) a byly léčeny intravenózním podáním PBS, CSAT (anti-βι), nebo LM609 (anti-avP3) protilátek. Graf zachycuje hmotnost tumoru (osa Y), která je výsledkem intravenózní aplikace PBS, CSAT (anti-βι), nebo LM609 (anti-a^) (osa X).
Na obrázcích 14A a 14B jsou histologické řezy tumorů léčených P3G2 (anti-oc^s) (obrázek 14A) a LM609 (anti-o/^a) (obrázek 14B), barvené hematoxylinem a eozinem (popis viz. příklad 9Al)b). Jak je vidět na obrázku 14A, tumory léčené kontrolní protilátkou P3G2 obsahují četné viditelné a aktivně se dělící nádorové buňky, což je prokázáno zviditelněním mitotického aparátu (plné šipky), a dále četné krevní cévy procházející celým nádorem (šipky). Naproti tomu jen minimum nádorových buněk a krevních cév bylo detekováno v tumorech léčených LM609 (antiανββ) (obrázek 14B).
Obrázky 15A-15E znázorňují M21L tumory léčené peptidy (popis viz. příklad 9A2). Obrázek 15A - kontrolní cyklický RAD peptid (69601), 15B - cyklický RGD peptid (66203), 15C - sousedící CAM tkáň odebraná ze stejného embrya léčená cyklickým RGD peptidem (66203) a dále tumory léčené kontrolním RAD (69601) (obrázek 15D) a cyklickým RGD peptidem (66203) (obrázek 15E) při velkém zvětšení (13x).
Na obrázcích 16A-16E je znázorněna inhibice angiogeneze pomocí antagonistů angiogeneze a to in vivo na modelu králičího oka (popis viz. příklad 10). Na obrázcích 16A a 16B je vidět angiogeneze v králičím oku za přítomnosti bFGF a mAb P1F6 (anti-α νβ5). Obrázky 16C-16E znázorňují inhibici angiogeneze v králičím oku v přítomnosti bFGF a mAb LM609 (anti- ανβ3).
• ·
Na obrázku 17 je znázorněn diagram pokusu, ve kterém byl in vivo připraven chimerní myšTlidský model (viz. příklad 11). Část kůže SCID myši byla zaměněna za lidskou neonatální pokožku. Štěp byl ponechán po dobu přihojení (4 týdny) v klidu. Poté byl lidský štěp zaočkován lidskými nádorovými buňkami. Během následujících čtyř týdnů byl pozorován měřitelný lidský tumor s lidskou vaskularizací prorůstající do tumoru z lidského kožního štěpu.
Na obrázku 18 je graficky znázorněno procento jednotlivých buněk, odvozených od mAb léčené a peptidem léčené CAM, zviditelněné barvením Apop Tag a analyzované pomocí FACS (viz. příklad 12). Šrafované a tečkované sloupce představují buňky z embryí, která byla ošetřena 24 hodin a 48 hodin před analýzou resp. Každý sloupec představuje průměr ze tří opakování ± S.E. CAM byly ošetřeny mAb LM609 (anti-ocv^3) nebo CSAT (anti-ocvPs) a nebo PBS. Dále byly CAM ošetřeny cyklickým peptidem 66203 (cyklo-RGDfV, označovaný též jako peptid 203), nebo kontrolním cyklickým peptidem 69601 (cykloRADfV, označovaným též jako peptid 601).
Na obrázcích 19A a 19B jsou spojeny výsledky získané pro suspenze buněk CAM z embryí léčených buď CSAT (anti-βι) (obrázek 19A) nebo LM609 (anti-oc^3) (obrázek 19B). Preparáty byly značeny Apop Tag a propidium jodidem a analyzovány pomocí FACS (viz. příklad 12C). Osa Y představuje počet buněk značených Apop Tag (apoptóza), na ose X je vynesen počet buněk značených propidium jodidem (obsah DNA). Horizontální linka představuje hranici negativity pro Apop Tag značení. Na levém obrázku je vidět profil CAM buněk z CSAT (anti-βι) ošetřených embryí, na pravém obrázku je zobrazen profil CAM buněk z • · • · ·
LM609 (anti-avp3) ošetřených embryí. Byla provedena analýza buněčného cyklu, tj. pro každé testované podmínky bylo provedeno přibližně 8 000 analýz.
Obrázky 20A-20C zobrazují CAM tkáň z CSAT (anti-βι) ošetřených embryí a obrázky 20D-20F zobrazují CAM tkáň z LM609 (anti-avP3) ošetřených embryí připravených tak, jak to bylo popsáno v příkladu 12C. Na obrázcích 20A a 20D je tkáň barvena Apop Tag a zviditelněna pomocí fluorescence (FITC) a převedena na D.I.C. obraz. Na obrázcích 20B a 20E je stejná tkáň značená mAb LM609 (anti-avp3) a vizualizovaná fluorescenčně (rhodamin). Na obrázcích 20C a 20F bylo použito obojí značení, tj. Apop Tag i LM609. Žlutě je znázorněn společný výskyt obou znaků. Úsečka představuje 15 a 50 pm v levém a pravém sloupci resp.
Na obrázku 21 jsou znázorněny výsledky pokusů o inhibici buněčné adheze pomocí peptidů 85189 (viz. příklad 4A). Účinku peptidového antagonisty byly testovány v rozsahu koncentrací od 0,001 do 100 pM (osa X). Míra buněčné adheze, měřená jako optická denzita O.D. při 600 nm je vynesena na ose Y. Buněčná adheze byla testována na vitronektinem (přerušovaná čára) a lamininem (plná Čára) pokrytém povrchu.
Obrázky 22A a 22B zobrazují cDNA sekvenci kuřecího MMP-2 spolu s předpokládanou aminokyselinovou sekvencí (druhý řádek). Ve třetím a Čtvrtém řádku resp. jsou zobrazeny předpokládané aminokyselinové sekvence lidského a myšího MMP-2 (viz. příklad 4A). Kuřecí cDNA sekvence je uložena pod číslem SEQ ID NO 29 spolu s kódující aminokyselinovou sekvencí, která je také uvedena samostatně pod číslem SEQ ID NO 30. Číslování prvního • · · ·
nukleotidu 5' nepřekládané oblasti a kódující sekvence proenzymu použité na obrázku 22A zápornými čísly může vyvolat dojem, že sekvence uvedená v seznamu sekvencí je delší, neboť je tato číslována od +1, ovšem obě sekvence jsou co do délky i co do pořadí nukleotidů identické. Odkazy na určité nukleotidy či nukleotidové sekvence kuřecího či lidského MMP-2 uvedené v popisu vynálezu, jako jsou například primery použité pro amplifikaci fragmentů MMP-2, odpovídají číslování nukleotidů tak jak je uvedeno na obrázku 22A, nikoliv číslování v seznamu sekvencí.
Na obrázku 23 jsou ve sloupcovém grafu znázorněny výsledky pokusu ve kterém byla testována schopnost jodidovaného MMP-2 vázat avp3 v přítomnosti inhibitorů či bez přítomnosti inhibitorů tak jak je to dále popsáno v příkladu 4B. Získaná data jsou vynesena jako hodnoty vázaných CPM (osa Y) při použití různých potencionálních inhibitorů či kontrol (osa X).
Na obrázku 24 je znázorněna specifičnost vazby látek odvozených od kuřecího MMP-2 na ανβ3 a otnbP3 v přítomnosti inhibitorů MMP-2 (popis viz příklad 4B). Data jsou zaznamenána stejným způsobem, jako na obrázku 23.
Na obrázku 25 je zaznamenán vliv kuřecího MMP-2 (410-637) GST fúzního proteinu na angiogenezi indukovanou bFGF (popis experimentu viz příklad 7A3). Na obrázcích 25A-25B jsou vidět účinky kontrolního proteinu (fúzního proteinu, který neobsahuje MMP-2 fragment) a na obrázcích 25C-25D jsou zobrazeny výsledky pokusu s MMP-2 GST fúzním proteinem.
Sloupcové grafy na obrázcích 26 a 27 představují index angiogeneze (stanovený měřením počtu větvení cév) kuřecího MMP-2 (410-637) GST fúzního proteinu (značeného CTMMP-2) • ·
• · ve srovnání s kontrolním proteinem (RAP-GST nebo GST-RAP). Pokus byl prováděn s CAM tkání ve které byla angiogeneze indukována pomocí bFGF (popis viz příklad 7A3). Index angiogeneze je vynesen na ose Y, způsoby ošetření tkáně jsou zaznamenány na ose X.
Na obrázku 28 je vidět vliv peptidů a organických sloučenin na bFGF indukovanou angiogenezí. Účinky jednotlivých látek byly stanoveny jako změny v počtu větvení cév (osa Y) v závislosti na jednotlivých způsobech ošetření tkáně (osa X). Zobrazeny jsou účinky bFGF bez dalšího ošetření a dále bFGF spolu s peptidy 69601, 66203 a dále s organickými sloučeninami 96112, 96113 a 96229 (viz. příklady 7B a 14).
Na obrázku 29 je graficky znázorněn vliv dávkování peptidů 85189 na inhibici bFGF indukované angiogeneze (viz. příklad 7B2). Počet větvení je vynesen na ose Y, množství peptidů, kterým bylo ošetřeno kuřecí embryo, je vyneseno na ose X.
Na obrázku 30 je znázorněn inhibiční účinek peptidů 66203 (označen jako 203) a 85189 (označen jako 189) na angiogenezí vyvolanou bFGF v CAM tkáni tak, jak je to popsáno v příkladu 7B2). Jako kontroly byly použity vzorky CAM tkáně s uměle (bFGF) vyvolanou angiogenezí, které byly ošetřeny peptidem 69601 (označen jako 601), nebo které nebyly ošetřeny žádným peptidem. Data jsou vynesena v grafu stejným způsobem, jako je tomu na obrázku 27 (viz legenda k obrázku 27).
Na obrázcích 31A-L je vidět účinek různých způsobů léčby ve srovnání s neléčenou CAM tkání a v závislosti na čase (od 24 do 72 hodin) tak jak je to dále popsáno v příkladu 7B3. Fotografie z jednotlivých pokusů označené jako neléčená, bFGF, bFGF + MAID (tj. po aplikaci bFGF vystavená účinkům kuřecího MPP-2 • · • · · · • · · · • · (2-4) GST fúzního proteinu) a bFGF + kontrola (po aplikaci bFGF léčena pomocí kuřecího MPP-2 (10-1), jsou v tomto pořadí zobrazeny na obrázcích 31A-C, 31D-F, 31G-I a 31J-L.
Na obrázcích 32, 33 a 34 je znázorněna redukce hmotnosti tumoru pr UCLAP-3, M21-L a FgM tumory resp., která nastala po intravenózní aplikaci kontrolního peptidů 69601 a antagonisty 85189 (viz. příklad 9A). Hmotnost tumoru je v grafu vynesena na ose Y, způsob léčby je znázorněn na ose X.
Obrázek 35 ilustruje účinky peptidů a protilátek na růst melanomu a to na chimérním modelu myší a lidské tkáně (popis experimentu viz příklad 11B). Použity byly: kontrolní peptid 69601 (označen jako 601) a antagonista 85189 (označen jako 189), a dále protilátka LM609. Velikost tumoru v mm je znázorněna na ose Y, různé způsoby léčení jsou vyneseny na ose X.
Na obrázcích 36A a B resp. je znázorněn vliv antagonisty 85189 (označovaný jako 189) ve srovnání s kontrolním peptidem 69601 (označeným 601) na zmenšení objemu a snížení mokré hmotnosti M21L tumorů při dávkování 10, 50 a 250 pg / injekci tak, jak je to popsáno v příkladu 11C.
Obrázky 37A a 37B znázorňují účinnost inhibičního působení antagonistického peptidů 85189 (který je označen jako 189, plná čára a plná kolečka) ve srovnání s kontrolním peptidem 69601 (601, přerušovaná čára, prázdná kolečka) na růst M21L tumoru na hybridním modelu myš:člověk tak, jak je to popsáno v příkladu 11C. Objem tumoru v mm je vynesen na ose Y, čas (počet dnů) je vynesen na ose X.
Obrázky 38 až 42 schematicky znázorňují různé způsoby chemické syntézy αγβ3 antagonistů tak jak jsou dále popsány v příkladu 13.
• · • ·
Na obrázcích 43 a 44 jsou znázorněny účinky různých organických molekul na angiogenezi indukovanou v CAM tkáni bFGF (viz. příklad 14). Počet větvení je znázorněn na ose Y, použité sloučeniny jsou vyneseny na ose X. Sloučeniny byly pro terapii použity v množství 250 pg/ml (obrázek 43) a 100 pg/ml (obrázek 44).
DETAILNÍ POPIS VYNÁLEZU
A. DEFINICE
Aminokyselinový zbytek: aminokyselina vzniklá chemickým štěpením peptidové vazby (hydrolýzou) polypeptidu. Aminokyselinové zbytky tak, jak jsou popsány zde jsou nejraději ve formě L-izomerů. Ovšem kterýkoliv L-aminokyselinový zbytek může být nahrazen D-aminokyselinou potud, pokud jsou zachovány funkční vlastnosti polypeptidu. NH2 je volná aminoskupina na N-terminálním konci polypeptidu. COOH je volná karboxylová skupina na C-terminálním konci polypeptidu. Následující tabulka shrnuje používané jedno- a třípísmenné zkratky aminokyselin, které odpovídají standardnímu názvosloví polypeptidů (poprvé popsány v J. Biol. Chem. 243:3552-59, 1969; a přijaty 37 CFR § 1,822(b) (2)).
SYMBOL jednopísmenný třípísmenný AMINOKYSELINA
Y G F M A Tyr Gly Phe Met Ala tyrozin glycin fenylalanin methionin alanin
« « · ·
* t·
s Ser serin
I Ile izoleucin
L Leu leucin
T Thr threonin
V Val valin
P Pro prolin
K Lys lyzin
H His histidín
Q Gin glutamin
E Glu kyselina glutamová
Z Glx Glu nebo Gin
w Trp tryptofan
R Arg arginin
D Asp kyselina asparagová
N Asn asparagin
B Asx Asn nebo Asp
C cys cystein
X Xaa neznámá, jiná
Další používané zkratky a symboly:
BOC tercíální-butyloxykarbonyl
DCCI dicyklohexylkarbodiimid
DFM dimethylformamid
OMe methoxy
HOBt 1 -hydroxybenzotriazol
Dále by mělo být zmíněno, že všechny aminokyselinové sekvence, které jsou v této práci zmíněny mají pravo-levou orientaci ve shodě s konvencí, tj. od N-konce k C-konci. Pomlčka na počátku • ·* « · nebo na konci aminokyselinové sekvence představuje peptidovou vazbu s další aminokyselinou nebo aminokyselinovou sekvencí. Polypeptid: je lineární sekvence aminokyselinových zbytků spojených navzájem peptidovou vazbou mezi α-amino skupinou karboxylovou skupinou sousedících aminokyselinových zbytků. Peptid: Tento termín tak, jak je použit zde se týká lineární sekvence ne více než 50 aminokyselinových zbytků spojených navzájem peptidovou vazbou stejně jako u polypeptidu.
Cyklický peptid: je sloučenina s cyklickou strukturou obsahující heteroatom a několik amidových vazeb, jaké se běžně vyskytují v peptidech. Cyklickým peptidem může být původně lineární polypeptid u kterého se vytvořila peptidická vazba mezi N-koncem a C-koncem molekuly. Ovšem cyklickým peptidem může být i molekula homopolymeru či heteropolymeru s cyklickou strukturou, ve které jsou molekuly navzájem vázány amidovými a/nebo jinými vazbami, které uzavírají molekulu do kruhu, například disulfidovými můstky, thioesterovou vazbou, thioamidovou vazbou a dalšími.
Protein: je lineární sekvence více než 50 aminokyselinových zbytků, které jsou navzájem spojeny stejně jako v polypeptidu peptidovou vazbou.
Fúzní protein: je polypeptid obsahující nejméně dvě odlišné polypeptidové domény, které byly operativně spojeny typickou peptidovou vazbou („fúzovány“), kdy obě zmíněné domény odpovídají peptidům, jež nejsou přirozeně navzájem spojeny. Syntetický peptid: je chemicky připravený řetězec aminokyselin, spojených navzájem peptidovou vazbou, ve kterém se nevyskytují přirozené proteiny ani jejich fragmenty.
• · · • · · • · · · ·· ··
B. OBECNÁ VÝCHODISKA
Navrhovaný vynález je v podstatě založen na zjištění že angiogeneze je zprostředkována specifickým vitronektinovým receptorem ανβ3 a že zablokováním funkce ανβ3 receptoru je inhibována i angiogeneze. Tento objev je velmi důležitý neboť angiogeneze hraje významnou roli při rozvoji mnoha chorobných procesů. Inhibici angiogeneze lze zasáhnout do průběhu onemocnění, zlepšit příznaky a v některých případech i vyléčit zmíněné onemocnění.
V těch případech, kdy je růst nových krevních cév příčinou, nebo kdy přispívá k rozvoji patologických jevů asociovaných s chorobou je inhibice angiogeneze způsobem jak redukovat zhoubné projevy onemocnění. Mezi příklady takových onemocnění patří například revmatoidní artritida, diabetická retinopatie, různá zánětlivá onemocnění a mnohá další. V případě, že je růst nových krevních cév nezbytný pro podporu růstu zhoubné tkáně, inhibice angiogeneze redukuje krevní zásobení zmíněné tkáně a tím přispívá k redukci objemu zmíněné tkáně. Příkladem je růst nádorů, kdy je neovaskularizace nezbytným předpokladem růstu nádoru byť jen o několik milimetrů a je ovšem nezbytná i pro vznik pevných metastáz.
Metody navrhovaného vynálezu jsou účinné jen zčásti, neboť léčba je vysoce selektivní ve smyslu inhibice angiogeneze a neovlivňuje další biologické procesy. Na příkladech bude ukázáno, že pouze nově vznikající cévy obsahují v dostatečném množství ανβ3 receptory, a tudíž na již maturované cévy zmíněná terapie inhibičně nepůsobí. Dále bylo zjištěno, že ανβ3 receptory nejsou rozšířeny v normální tkáni, naopak byly selektivně detekovány pouze v nově vznikajících cévách. Je tedy zajištěno, ·« ·*·· že terapie je selektivně namířena pouze proti nově vznikajícím cévám.
Zjištění, že samotná inhibice ανβ3 účinně inhibuje angiogenezi, vede k vývoji terapeutických prostředků vykazujících vysokou specifitu a tudíž poměrně málo toxických. A tak, ačkoliv je předmětem navrhovaného vynálezu použití látek na bázi peptidů schopných inhibovat jeden či více integrinů, mohou být připraveny i jiné látky, které budou ještě selektivněji inhibovat οίνβί, a tudíž nebudou vykazovat žádné vedlejší účinky jako např. inhibici jiných biologických procesů než těch, které jsou zprostředkovány ανβ3.
Tak mohou být například připraveny některým z navrhovaných způsobů monoklonální protilátky, které vysoce selektivně imunologicky reagují s ανβ3 a které podobně selektivně inhibují i funkci ανβ3· Dále mohou být připraveny peptidy nesoucí RGD motiv, které také selektivně inhibují ανβ3, jak je to popsáno v následujícím textu.
Až dosud nebylo známo, že by mohly být angiogeneze a procesy závislé na angiogenezi inhibovány in vivo s pomocí látek, které jsou antagonisty biologické funkce ανβ3.
C. ZPŮSOBY INHIBICE ANGIOGENEZE
Vynález se týká způsobu inhibice angiogeneze ve tkáních a tudíž i inhibice dalších tkáňových procesů závislých na angiogenezi. Obecně navrhovaný způsob léčby představuje podání prostředku obsahujícího angiogenezi inhibující množství ανβ3 antagonisty.
Jak bylo vysvětleno dříve, angiogeneze zahrnuje množství procesů včetně neovaskularizace tkáně včetně „pučení“ nových cév, ·· ···· ·· ·«·· vaskulogeneze či rozšiřování cév. Všechny zmíněné angiogenní procesy jsou zprostředkovány a jsou závislé na expresi ανβ3. Předpokládá se, že s výjimkou hojení ran, tvorby žlutého tělíska a embryogeneze je většina angiogenních procesů spojena s některým onemocněním, a tudíž je použití navrhovaných terapeutických metod selektivní pro chorobné pochody a nemá nežádoucí vedlejší účinky.
Existuje množství onemocnění ve kterých hraje angiogeneze důležitou úlohu. Souborně se nazývají angiogenní poruchy a patří mezi ně například různá zánětlivá onemocnění (imunitního i neimunitního původu), chronický kloubní revmatismus, psoriáza, poruchy asociované s nepatřičnou invazí krevních cév jako je například diabetická retinopatie, neovaskulární glaukom, restenóza, proliferace kapilár v arteriosklerotických plátech a osteoporóza, a dále choroby asociované se zhoubným bujením, tj. pevné tumory, jejich metastázy, angiofibromy, retrolentální fibroplázie, hemangiomy, Kaposiho sarkomy a další podobné nádory pro jejichž růst je neovaskularizace nezbytná.
Terapeutické metody, které inhibují angiogenezi v nemocné tkáni tak zmírňují příznaky choroby a v závislosti na povaze onemocnění mohou přispět i k jejímu úplnému vyléčení. Jeden z aspektů vynálezu se tedy týká inhibice angiogeneze v tkáni per se. Rozsah angiogeneze v tkáni a tudíž i rozsah inhibice dosažené pomocí terapie podle vynálezu, může být hodnocen množstvím různých metod, z nichž některé jsou popsány v následujících příkladech. Jedná se o detekci oc^3-imunopozitivních nematurovaných cév imunohistochemickými metodami.
Jak bude dále vysvětleno, kterákoliv z mnoha typů tkání, nebo kterýkoliv z orgánů, který je složen z organizovaných tkání, tj.
• · ··· · · · ······ • « · * ···· · · kůže, svalstvo, střevní epitel, pojivová tkáň, klouby, kosti atd., může za patologických podmínek podporovat angiogenezi, tj. všechny tyto tkáně mohou po stimulaci angiogeneze začít prorůstat novými cévami.
Dalším aspektem vynálezu je tedy léčba zanícené tkáně a inhibice angiogeneze ve zmíněné zanícené tkáni, ve které dochází v důsledku onemocnění k neovaskularizaci. Do této skupiny patří metody inhibice angiogeneze v artritické tkáni, například u pacientů s chronickým kloubním revmatismem, se záněty imunitního i neimunitního původu, u pacientů trpících psoriázou atd.
Pacient léčený podle navrhovaného vynálezu je nejraději lidský jedinec, ačkoliv je nutné podotknout, že princip navrhovaného vynálezu umožňuje použití metod podle vynálezu i v případě léčby kteréhokoliv savčího druhu. Termínem „pacient“ podle vynálezu tedy rozumíme nejen člověka, ale i kteréhokoliv savce. V tomto kontextu je termínem „savec“ označován kterýkoliv savčí druh, u kterého je žádoucí léčba onemocnění spojeného s angiogenezi. Nejčastěji se jedná o hospodářská nebo domácí zvířata.
V dalším z aspektů vynálezu je léčenou tkání retina. Jedná se o pacienty trpící například diabetickou retinopatií, makulární degenerací či neovaskulárním glaukomem. Inhibovanou angiogenezi je angiogeneze ve tkáni oční sítnice.
V dalším z aspektů vynálezu je léčenou tkání nádorová tkáň. Jedná se o pacienty s pevným nádorem, jeho metastázami, s nádorem kůže, s nádorem prsu, s hemangiomem nebo angiofibromem a s dalšími podobnými nádory. V tomto případě je inhibována angiogeneze v nádorové tkáni, čímž nedochází k tvorbě nových cév v nádoru a nádor je nedostatečně zásobován krví. Mezi • · ··· · ·· ······ • · · · · · · · · · typické nádory, léčitelné metodami podle navrhovaného vynálezu patří například nádory plic, pankreatu, prsu, tlustého střeva, hrtanu, vaječníků atd. Příklady angiogeneze v nádorové tkáni a její inhibice jsou uvedeny v následující kapitole „Příklady provedení vynálezu“.
Inhibice angiogeneze v nádorové tkáni je jedním ze zvláště preferovaných aspektů vynálezu neboť při růstu nádoru hraje neovaskularizace velmi důležitou roli. Pokud nedochází k neovaskularizaci nádorové tkáně, není nádor dostatečně zásoben nezbytnými živinami, zpomaluje se jeho růst, nebo se může i úplně zastavit, nastává regrese a v některých případech i nekróza a tedy úplné odumření nádorové tkáně.
Řečeno jinými slovy navrhovaný vynález představuje způsob inhibice neovaskularizace nádorové tkáně pomocí inhibice angiogeneze. Podobně lze říci, že navrhovaný vynález představuje způsob inhibice nádorového růstu a to opět prostřednictvím inhibice angiogeneze.
Metody podle navrhovaného vynálezu jsou dále účinné i v terapii metastazujících nádorů, neboť 1) pro tvorbu metastáz (tj. aby mohly metastazující buňky opustit primární nádor) je nezbytná vaskularizace primárního tumoru a 2) usazení metastazujících buněk na sekundárním místě opět vyžaduje neovaskularizaci, neboť jen dostatečné krevní zásobení umožní růst sekundárního nádoru.
Dalším z mnoha aspektů navrhovaného vynálezu je spojení metod podle vynálezu s běžnými způsoby terapie (např. konvenční chemoterapie) namířenými proti pevným nádorům a proti rozvoji metastáz. Inhibitory angiogeneze jsou nejčastěji podávány během nebo následně po chemoterapii, ačkoliv výhodnější je podávat • » «·· · · · ··»··· · · · · · · · · · inhibitory angiogeneze po chemoterapii, tj. v okamžiku, kdy nádorová tkáň odpovídá na toxický atak indukcí angiogeneze, která má zajistit dostatečné krevní zásobení a tím i dostatečný přísun živin a následně uzdravení poškozené nádorové tkáně. Dále je vhodné používat inhibitory angiogeneze po chirurgickém zákroku při kterém byl pevný nádor odstraněn. V tomto případě účinkují inhibitory angiogeneze preventivně proti tvorbě metastáz. Vzhledem k tomu že navrhované způsoby terapie inhibují neovaskularizaci nádorové tkáně, jsou zároveň i inhibitory nádorového růstu jako takového, inhibitory tvorby metastáz a významně přispívají k regresi již existujících nádorů. Na příkladech je dále ilustrována regrese již existujících nádorů po jediném intravenózním podání ανβ3 podle vynálezu.
Restenóza je proces migrace buněk hladkého svalstva (SMC = smooth muscle cell) a jejich proliferace v místě koronární angioplastiky, která má za následek neúspěch provedené angioplastiky. Migrace a proliferace SMC v průběhu restenózy může být považována za angiogenní proces a může být inhibována navrhovanými metodami podle vynálezu. Jedním z aspektů vynálezu je tedy i inhibice restenózy u pacientů po angioplastice prostřednictvím inhibice angiogeneze některou z navrhovaných metod. V takovém případě jsou ανβ3 antagonistické látky podávány následně po zákroku a to v období od 2 do 28 dnů, nejtypičtěji však po dobu 14 dnů po zákroku.
Navrhovaný způsob inhibice angiogeneze ve tkáních a způsob léčby angiogenních onemocnění zahrnuje vystavení tkáně ve které probíhá nežádoucí angiogeneze nebo kde existuje riziko propuknutí nežádoucí angiogeneze účinkům léčebného prostředku s obsahem terapeuticky účinného množství ανβ3 antagonisty, tj.
• · · · · · ·· ·*»··« • · · · ···· * · látky schopné blokovat vazbu ανβ3 receptoru s jeho přirozeným ligandem. Navrhovaný způsob léčby tedy zahrnuje podání terapeuticky účinného množství fyziologicky tolerovaného léčebného prostředku s obsahem ανβ3 antagonisty podle vynálezu. Používané dávky οτνβ3 antagonisty jsou závislé na formě a síle podávaného prostředku jak bude dále vysvětleno na příkladech, ale vždy se jedná o množství dostatečné pro dosažení požadovaného účinku, tj. k dosažení inhibice angiogeneze a k potlačení symptomů onemocnění vyvolaného angiogenezi. Dávka by neměla být příliš vysoká aby nedocházelo k nežádoucím vedlejším účinkům, jakými jsou například syndrom hyperviskozity, plicní edémy, srdeční selhání atd. Obecně se bude dávka lišit v závislosti na věku, kondici a pohlaví pacienta a povaze choroby. Přesné dávkování odborník snadno stanoví. V případě jakýchkoliv komplikací může být dávkování dodatečně upraveno ošetřujícím lékařem.
Terapeuticky účinné množství je takové množství ανβ3 antagonisty, které je dostatečné pro navození měřitelné inhibice angiogeneze v léčené tkáni, tj. angiogenezi-inhibující množství. Inhibice angiogeneze může být měřena imunohistochemicky in šitu tak jak je to popsáno zde, nebo dalšími obecně známými metodami.
Vzhledem k tomu, že οΐνβ3 antagonista může být ve formě ανβ3 mimetika, RGD-peptidu, anti-c^3 monoklonální protilátky či fragmentu některé ze zmíněných sloučenin je zřejmé, že se bude účinnost a tím i terapeuticky účinné množství látky různit v závislosti na jejím původu a charakteru. Ovšem s použitím • » ··· · ·> ······ * · · · ·«·· · -» ·· ·· · · · ♦ ·· 9·9 navrhovaných testovacích metod může odborník snadno určit sílu odpovídajícího ανβ3 antagonisty a tedy i vhodné dávkování.
Síla použité látky může být stanovena některým z mnoha různých způsobů včetně stanovení inhibice angiogeneze v CAM tkáni, in vivo měření na modelu králičího oka, dále in vivo stanovením na chimérním modelu myš-člověk, nebo např. měřením inhibice vazby přirozeného ligandu na ανβ3 (viz. příklady).
Preferovaný 0ί,νβ3 antagonista má schopnost podstatně inhibovat vazbu přirozeného ligandu, jakým je například fibrinogen nebo vitronektin, na ανββ receptory v roztoku při koncentracích antagonisty menších než 0,5 μπι, ještě raději pak menších než 0,1 pm a nejraději menších než 0,05 pm. Výraz „podstatně“ v tomto případě znamená že po podání antagonisty dochází minimálně k 50% redukci vazby přirozeného ligandu fibrinogenu. Koncentrace antagonisty při níž dochází právě k 50% redukci vazby fibrinogenu se označuje jako IC50.
Preferovaný antagonista ανβ3 receptorů podle vynálezu dále vykazuje značnou selektivitu, tj. podstatně inhibuje vazbu fibrinogenu na ανβ3 receptory, ale nemá žádný výrazný vliv na vazbu fibrinogenu na další integriny jako jsou například ανβι, ανβ5 nebo α,ι^ββ· Zvláště výhodné je použití antagonistů, jejichž hodnota IC50 pro inhibici vazby fibrinogenu na ανβ3 je lOx až lOOx nižší než hodnota IC50 pro inhibici vazby na ostatní integriny. Příklad stanovení IC50 pro inhibici vazby fibrinogenu na integriny je popsán v kapitole „Příklady provedení vynálezu“. Terapeuticky účinné množství ανβ3 antagonisty ve formě monoklonální protilátky je typicky takové množství, které je po podání ve formě fyziologicky tolerovaného přípravku dostatečné k • · « · » ··· · · «· ······ ··· 9 · * · · · dosažení plazmatické koncentrace od 0,01 pg/ml do asi 0,1 mg/ml, nejraději pak od 1 pg/ml do 5 pg/ml. Nejvýhodnější plazmatická koncentrace je 5 pg/ml. Jinak řečeno dávka se může pohybovat od 0,1 mg/kg do asi 300 mg/kg , raději pak od asi 0,2 mg/kg do asi 200 mg/kg, nejraději pak od 0,5 mg/kg do 20 mg/kg v jedné či více denních dávkách po dobu jednoho či několika dní.
V případě, kdy je antagonista ve formě fragmentu monoklonální protilátky musí být množství upraveno na základě poměru molekulových hmotností fragmentu a celé protilátky. Nejvhodnější molární plazmatická koncentrace se pohybuje v rozmezí od 2 pM do 5 mM, ještě vhodnější je potom 100 pM až 1 mM koncentrace. Terapeuticky účinné množství ocvp3 antagonisty ve formě polypeptidu nebo ve formě jiné malé molekuly podobné velikosti (otvp3 mimetické molekuly) je typicky takové množství, které je po podání ve formě fyziologicky tolerovaného přípravku dostatečné k dosažení plazmatické koncentrace od 0,1 pg/ml do asi 0,2 mg/ml, nejraději pak od 1 pg/ml do 150 pg/ml. V případě polypeptidu s molekulovou hmotností 500 g/mol je doporučovaná molární plazmatická koncentrace od asi 2 pM do asi 5 mM, nejraději potom od 100 pM do 1 mM. Jinak řečeno doporučená dávka vztažená na tělesnou hmotnost se může pohybovat od 0,1 mg/kg do asi 300 mg/kg , raději pak od asi 0,2 mg/kg do asi 200 mg/kg, nejraději pak od 0,5 mg/kg do 20 mg/kg v jedné či více denních dávkách po dobu jednoho či několika dní.
Monoklonální protilátky nebo polypeptidy podle vynálezu mohou být podávány parenterálně injekcí nebo infuzí. Ačkoliv mohou podávané látky dosáhnout v těle cílové tkáně systémovou cestou při intravenózním podání, musíme mít na mysli, že existuje »»·· ···· « c-· ·* ·· «· ·· možnost, že se i v jiných tkáních nacházejí cílová místa pro antagonistickou molekulu. Tudíž mohou být monokionální protilátky nebo polypeptidy podle vynálezu podávány podle potřeby intravenózně, intraperitoneálně, intramuskulárně, subkutálně, transdermálně, perorálně a nebo mohou být dopraveny na místo určení s využitím peristaltiky.
Terapeutické prostředky s obsahem monokionální protilátky nebo polypeptidu podle vynálezu jsou nejčastěji podávány intravenózně, tj. například injekcí jednotkové dávky. Termín „jednotková dávka“ tak jak je použit v kontextu navrhovaného vynálezu, se týká fyzicky diskrétní jednotky, která je vhodnou jednorázovou dávkou pro daný subjekt, kdy každá jednotka obsahuje předem určené množství aktivní složky spolu s odpovídajícím vhodným nosičem nebo rozpouštědlem. Množství aktivní složky je vypočteno pro dosažení požadovaného terapeutického účinku.
V jednom z preferovaných aspektů vynálezu (viz příklady) je ανβ3 antagonista podáván intravenózně v jednotlivých dávkách. Terapeutické prostředky jsou podávány způsobem odpovídajícím formě přípravku a v terapeuticky účinném množství. Množství podávané látky a časový rozvrh podávání jednotlivých dávek závisí na povaze a stavu léčeného subjektu, na schopnosti zpracovat a využít aktivní složku přípravku a na požadovaném účinnosti přípravku. Přesné množství podané aktivní složky je velmi individuální a je na posouzení praktického lékaře. Samozřejmě určitý rozsah vhodného dávkování pro systémovou aplikaci je zde uveden. Dávka je ovšem závislá i na způsobu podání. Vhodný režim dávkování léčiva je také variabilní. Obvykle je pacientovi podána první dávka léčiva a další dávky • ··· · * » ······ « « · *··« « · následují v jedno nebo vícehodinových intervalech. Léčivo je podáváno injekcí, nebo může být použit jiný způsob podávání. Alternativně může být léčivo podáváno kontinuálně intravenózní infúzí, čímž je zajištěno udržení požadované stálé hladiny léčiva v krvi.
Na příkladech je dále ukázáno, že inhibice angiogeneze a regrese nádoru nastávají již 7 dní po prvním podání antagonistické látky. Je vhodné pokračovat v podávání antagonistické látky ještě po dobu 7 dnů až 6 týdnů, nejraději 14 až 28 dnů.
V jednom podobném případě je na příkladech demonstrován vztah mezi inhibici ocvp3 a indukcí apoptózy v buňkách nově vznikajících cév, které na svém povrchu nesou ανβ3. Vynález se tedy dále zbývá i způsobem inhibice apoptózy v nově vznikajících cévách v ošetřované tkáni. Metoda je založena v podstatě na stejném principu, jaký zde byl popsán pro inhibici angiogeneze, a to ve všech zmiňovaných tkáních a za všech zmiňovaných podmínek. Jediná významná odlišnost je v načasování. Apoptóza se totiž projevuje neobyčejně rychle, typicky již za 48 hodin po prvním kontaktu s antagonistickou látkou, zatímco inhibice angiogeneze a regrese nádoru se projevuje mnohem pomaleji. Těmito odlišnostmi se řídí terapeutický režim, tj. doba podávání léčiva, a je na nich závislý i výsledný efekt. V případě apoptózy je léčivo typicky podáváno po dobu 24 hodin až 4 týdnů. Nejvýhodnější ze zdá být doba podávání léčiva 48 hodin až 7 dnů.
D. TERAPEUTICKÉ PROSTŘEDKY
Navrhovaný vynález se týká terapeutických prostředků vhodných pro použití v léčebných postupech podle navrhovaného vynálezu. Léčebné prostředky podle navrhovaného vynálezu obsahují • · β · · · * ··*··· ·«· «««>· · · fyziologicky tolerovaný nosič společně s ανβ3 antagonistou tak, jak je zde popsán. Ten je ve zmíněném nosiči rozpuštěn nebo dispergován jako aktivní látka. V preferovaných provedeních vynálezu není terapeutický prostředek s obsahem ανβ3 antagonisty pro lidské či savčí pacienty, je-li podáván za účelem léčby, imunogenní.
Termíny „farmaceuticky přijatelný“ a „fyziologicky tolerovaný“ a jejich gramatické obměny jsou, v případě, že popisují sloučeniny, nosiče, rozpouštědla a reagencie, navzájem zaměnitelné a týkají se látek, které mohou být podány savčímu pacientu bez nebezpečí nežádoucích fyziologických reakcí, mezi které patří například nevolnost, závratě, žaludeční potíže atd.
Příprava farmakologického prostředku, ve kterém je rozpuštěna nebo dispergována aktivní složka, je odborníkům dobře známá a není nutné se o konkrétních postupech v souvislosti s αγβ3 antagonistou zmiňovat. Typicky jsou takové přípravky vyrobeny v injikovatelné formě, tj. buď jako roztok aktivní látky, nebo suspenze, ovšem je možné připravit látku podle vynálezu i v pevné formě, určené k přípravě roztoku nebo suspenze těsně před použitím. Přípravek může být také emulgován.
Aktivní složka může být dále smíšena s kompatibilním a farmaceuticky přijatelným vehikulem, a to v množství, které je vhodné pro terapeutické použití. Vhodnými vehikuly jsou například voda, roztok soli, dextróza, glycerol, ethanol nebo jiná podobná látka, a nebo jejich směsi. Pokud je to nutné, mohou přípravky obsahovat i minoritní pomocné složky, jako například zvlhčovadla nebo emulgátory, pufrační činidla atp. Tyto látky mohou ještě zvyšovat účinek aktivní složky farmaceutického prostředku. Terapeutický prostředek podle vynálezu může dále obsahovat • · · · • · · · • · · · · * * * • ··· · · * <»»·· » · · ···« · některé farmaceuticky přijatelné soli. Farmaceuticky přijatelné soli zahrnují soli vzniklé přidáním kyseliny (vytvořené s volnými aminoskupinami polypeptidu). Pro tvorbu těchto solí mohou být použity anorganické kyseliny jako např. kyseliny chlorovodíková nebo fosforečná, nebo kyseliny organické jako např. kyselina octová, vinná, mandlová atd. Soli, vytvořené reakcí s volnými karboxylovými skupinami, mohou být odvozeny od anorganických zásad jako jsou např. hydroxid sodný, hydroxid draselný, hydroxid vápenatý, hydroxid amonný nebo hydroxid železitý, a organických zásad jako je např. isopropylamin, trimethylamin, 2ethylaminoethanol, histidin, prokain atd.
V přípravcích s obsahem cyklického polypeptidového ocvp3 antagonisty je zvláště vhodné použití solí TFA a HCI. Některé ze zmíněných solí peptidů jsou popsány v příkladech.
Fysiologicky tolerované nosiče jsou odborníkům dobře známé. Příkladem tekutého nosiče mohou být sterilní vodné roztoky, které obsahují pouze aktivní složku a vodu, nebo mohou navíc obsahovat pufr jako např. fosforečnan sodný při fyziologických hodnotách pH, fyziologický roztok, a nebo obojí,tj. např. fosfátem pufrovaný roztok NaCl. Vodné nosiče mohou dokonce obsahovat více než jen jednu pufrující sůl, a kromě solí jako např. chlorid sodný, nebo chlorid draselný, mohou obsahovat i dextrosu, polyethylenglykol, nebo další rozpuštěné látky.
Kapalné prostředky mohou navíc kromě vody obsahovat také další tekuté složky. Mezi takové látky patří například glycerin, rostlinné oleje jako např. bavlníkový olej, a dále emulze voda-olej.
Léčebný prostředek může dále obsahovat angiogenezí inhibující množství ανβ3 antagonisty podle navrhovaného vynálezu. Množství antagonisty obvykle odpovídá alespoň 0,1 % z celkové hmotnosti • η «·* * · « · • ··· » · * ······ • « » · » ♦ « · · φ » '. · 9 9 9 9 * * léčebného přípravku. Hmotnostní procento je poměr hmotnosti inhibitoru k celkové hmotnosti přípravku. Tedy, např. 0,1 hmotnostního procenta je 0,1 gramu inhibitoru ve 100 gramech celého prostředku.
E. ANTAGONISTÉ INTEGRINŮ ανβ3 αγβ3 antagonisté jsou sloučeniny, které se podle navrhovaného vynálezu používají pro inhibici angiogeneze ve tkáních. Zmíněné látky mohou existovat v mnoha formách, mezi něž patří například sloučeniny, které interagují s ανβ3 tak, že zabrání vazbě přirozeného ligandu ανβ3. Za příklad mohou sloužit například analogy αγβ3 odvozené od vazebného místa αγβ3 pro ligand, dále mimetika αγβ3 nebo přirozených ligandů ανβ3, která imitují oblasti, zahrnuté v a^3-ligand vazebných interakcích, dále polypeptidy obsahující sekvenci jež odpovídá funkční vazebné doméně přirozeného ligandu, specifického pro ανβ3, zvláště pak doméně nesoucí motiv RGD, a konečně protilátky, které imunologicky reagují s ανβ3 receptorem nebo s jeho přirozeným ligandem.
1. Polypeptidy
Jeden z aspektů vynálezu se týká αγβ3 antagonístů ve formě polypeptidů. Polypeptidový (peptidový) ανβ3 antagonista může obsahovat buď sekvenci charakteristickou pro přirozený ligand αγβ3, a nebo sekvenci charakteristickou přímo pro samotný ανβ3 receptor, konkrétně tu oblast, která je zahrnuta v interakci ανβ3ligand, a musí vykazovat ανβ3 antagonistickou aktivitu tak, jak zde byla popsána. Mezi nejvhodnější ανβ3 antagonistické peptidy patří takové peptidy, které obsahují sekvenci RGD, která odpovídá vazebné sekvenci přirozeného ligandu ανβ3.
Nejvhodnější RGD-polypeptidy mají sekvenci, která odpovídá aminokyselinové sekvenci RGD-oblasti přirozeného ligandů αγββ. Takovým přirozeným ligandem jsou například fibrinogen, vitronektin, von Wildebrandův faktor, laminin, thrombospondin a další. Sekvence těchto přirozených ligandů Οίγβ3 receptoru jsou známé. Peptidový ανβ3 antagonista tedy může být odvozen od kteréhokoliv ze zmíněných přirozených ligandů, z nichž nejvhodnější jsou fibrinogen a vitronektin.
Nejvhodnější peptidoví ανβ3 antagonisíé přednostně inhibují vazbu přirozeného ligandů na αγβ3 receptor ve srovnání s ostatními integriny. Tyto αγββ specifické peptidy jsou zvláště výhodné proto, že je díky jejich specifičnosti významně snížen výskyt nežádoucích vedlejších účinků, spojených s inhibici funkce ostatních Íntegrinů. Identifikace těchto zvláště vhodných αγββ peptidových antagonistů, vyznačujících se vysokou selektivitou vazby na ανββ, je velmi snadná a to s pomocí typického testu inhibice vazby na receptor (například ELISA). viz. příklady.
Polypeptidy podle navrhovaného vynálezu typicky nejsou delší než 100 aminokyselin, často neobsahují víc než 60 aminokyselin a nejvhodnější jsou takové, které neobsahují více než 30 aminokyselin. Peptidy mohou být lineární nebo cyklické; cyklické peptidy jsou vhodnější.
V případě, kdy je peptid delší než 100 aminokyselin je tento nejčastěji použit ve formě fúzního proteinu, nebo je použit pouze jeho fragment.
Nejvhodnější lineární a cyklické peptidy jsou včetně popisu shrnuty v tabulce 1.
Je nutné zde poznamenat, že polypeptidy, které jsou předmětem • · vynálezu nemusí mít nutně identickou aminokyselinovou sekvenci s přirozenými Iigandy αγββ receptoru. Stačí, obsahují-li dostatečně podobnou část sekvence, která je odpovědná za vazbu na receptor tak, aby byla zajištěna odpovídající specifičnost antagonisty. Předmětným polypeptidem může být jakýkoliv analog, fragment nebo chemický derivát polypeptidů, jehož aminokyselinová sekvence je zde uvedena, pokud je αγβ3 antagonistou. Navrhovaný polypeptid tudíž může být předmětem různých změn, substitucí, inzercí a delecí, pokud tyto změny povedou ke zlepšení některé z požadovaných vlastností antagonisty. Z tohoto pohledu polypeptidový αγβ3 aníagonista podle navrhovaného vynálezu spíše odpovídá než je identický k sekvenci výše zmíněného polypeptidů,ve které byla provedena jedna nebo několik záměn, přičemž zůstala zachována schopnost působit jako α,γβ3 antagonista v některém z pokusů, které jsou popsány v následujícím textu. Polypeptid tedy může být v jakékoliv z řady forem peptídových derivátů, mezi které patří amidy, konjugáty s proteiny, cyklické peptidy, polymerní peptidy, peptidové analogy či fragmenty, chemicky modifikované peptidy a další podobné deriváty.
Termín „analog označuje jakýkoliv polypeptid, který má aminokyselinovou sekvenci téměř identickou se sekvencí původního polypeptidů, ve které ovšem došlo k jedné nebo k několika konzervativním substitucím. Termínem konzervativní substituce označujeme záměnu jedné aminokyseliny funkčně podobným aminokyselinovým zbytkem. Zmíněný analog potom vykazuje ανβ3 antagonistickou aktivitu tak, jak je zde popsána. Příklady konservativních substitucí zahrnují substituce jednoho nepolárního (hydrofobního) aminokyselinového zbytku jakým je např. izoleucin, valin, leucin nebo methionin za druhý, nebo substituci jednoho • · polárního (hydrofilního) zbytku za druhý. Příkladem mohou být záměny ve dvojicích arginin a lyzin, glutamin a asparagin, glycin a serin. Dále patří mezi konzervativní substituce záměna jednoho zásaditého zbytku (lyzin, arginin nebo histidin) za druhý, nebo substituce jednoho kyselého zbytku, jako např. kyselina asparagová nebo kyselina glutamová za druhý.
Výraz „konzervativní substituce může označovat i použití chemicky upraveného zbytku namísto přirozeně se vyskytující aminokyseliny tak, aby výsledný polypeptid vykazoval požadovanou inhibiční aktivitu.
Výraz „chemický derivát“ označuje polypeptid podle vynálezu, který obsahuje jeden nebo více aminokyselinových zbytků chemicky upravených reakcí na funkční boční skupině. Kromě záměn na bočních skupinách, může chemický derivát obsahovat jednu nebo více modifikací na hlavním řetězci. Mohou to být substituce na a aminoskupině, kdy vznikají např. N-methyl, N-ethyl, nebo N-propyl deriváty, nebo substituce na a karbonylové skupině, které dávají vzniknout např. thioesterům, thioamidům, nebo guanidinovým derivátům. Mezi výše zmíněné deriváty patří např. i ty molekuly, ve kterých byly volné aminoskupiny modifikovány za vzniku amin hydrochloridů, p-toluen sulfonylových skupin, karbobenzoxidových skupin, t-butyloxykarbonylových skupin, chloroacetylových skupin a nebo formylových skupin. Volné karboxylové skupiny mohou být modifikovány za vzniku solí, methyl- a ethylesterů nebo jiných typů esterů, nebo hydrazidů. Volné hydroxylové skupiny mohou být modifikovány za vzniku O-acylových nebo O-alkylových derivátů. Dusík atom imidazolu u histidinu může být modifikován za vzniku N-im-benzylhistidinu. Jako chemické deriváty jsou označovány také peptidy, které obsahují jeden nebo více přirozeně se vyskytujících
3Ί • · · derivátů některé z dvaceti standardních aminokyselin.Příkladem může být 4-hydroxyprolin namísto prolinu, 5-hydroxylyzin může nahradit lyzin, 3-methylhistidin může nahradit histidin, homoserin může nahradit serin, ornitin může nahradit lyzin.
Mezi polypeptidy podle navrhovaného vynálezu patří také jakýkoliv polypeptid, který obsahuje jednu nebo více adicí a/nebo deleci a nebo který obsahuje aminokyselinové zbytky příbuzné sekvenci polypeptidů, jehož sekvence je dále uvedena, pokud je zachována požadovaná antagonistická aktivita.
Obzvláště vhodným derivátem je cyklický peptid, se vzorcem cyklo(Arg-Gly-Asp-D-Phe-NMeVal), zkráceně c(RGDf-NMev), který má N-methylem substituovanou ot-aminoskupinu valinového zbytku a u kterého došlo k cyklizaci spojením počáteční aminoskupiny a koncové karboxyskupiny peptidu.
Termín „fragment“ označuje jakýkoliv odpovídající polypeptid, který má aminokyselinovou sekvenci kratší než je sekvence původního polypeptidů, která je uvedena v následujícím textu.
Pokud má polypeptid podle navrhovaného vynálezu sekvenci, která není identická se sekvencí přirozeného otvp3 ligandů, je to obvykle způsobeno tím, že byla provedena jedna nebo více konzervativních nebo nekonzervativních substitucí. Obvykle není substituováno více než asi 30 % aminokyselinových zbytků, ale ještě raději je substituováno maximálně 10 % aminokyselinových zbytků.
Některý z konců polypeptidů může být prodloužen o další aminokyselinové zbytky za účelem vytvoření „linkeru“, pomocí kterého může být polypeptid podle vynálezu připevněn ke značce, pevné matrix nebo k nosiči.
Značky, pevné matrix a nosiče, které mohou být použity s polypeptidy podle vynálezu, jsou popsány níže.
• ·
Aminokyselinové linkery jsou obvykle tvořeny jedním až čtyřiceti aminokyselinovými zbytky, častěji pak 1 až 10 zbytky, ale netvoří epitopy podobné ανβ3 ligandu. Typickými aminokyselinovými zbytky, které se používají ve spojovacích peptidech jsou tyrosin, cystein, lyzin, glutamová a asparagová kyselina atd.
Polypeptid, který je předmětem vynálezu se může od přirozené sekvence ανβ3 ligandu lišit, pokud není uvedeno jinak, acylací terminální NH2 skupiny, např· acetylací; nebo amidací kyseliny thioglikolové, amidací terminální karboxylové skupiny, např. amoniakem, methyaminem a podobně.
Terminální modifikace jsou vhodné, jak je známo, pro snížení citlivosti proteinu ke štěpení proteinázami, a proto slouží k prodloužení poločasu polypeptidů v roztocích, zejména v biologických tekutinách, kde mohou být proteinázy přítomné. Z tohoto pohledu je vhodnou terminální modifikací i cyklizace. Tato modifikace je obzvláště vhodná proto, že vzniklé cyklické struktury jsou z hlediska biologických procesů stabilnější než lineární, což bylo pozorováno i v případě námi studovaných proteinů.
Kterýkoliv peptid podle navrhovaného vynálezu může být použit ve formě farmaceuticky přijatelné soli. Mezi vhodné kyseliny, které mohou tvořit soli s peptidy podle navrhovaného vynálezu, patří anorganické kyseliny jako např. kyselina trifluoroctová (TFA), kyselina chlorovodíková (HCL), kyselina bromovodíková, chloristá, dusičná, thiokyanatá, sírová, methansulfonová, octová, fosforečnooctová, propionová, pyrohroznová, glykolová, mléčná, šťavelová, jantarová, maleinová, fumarová, anthranilová, skořicová, naftalensulfonová, sulfanilová atd. Soli HCI a TFA jsou zvláště vhodné.
Mezi vhodné zásady, které mohou tvořit soli s peptidy podle navrhovaného vynálezu, patří anorganické zásady jako např. hydroxid sodný, hydroxid amonný, hydroxid draselný atd.; a organické zásady jako např. mono-, di- a trialkyl- a arylaminy (např. triethylamin, diisopropylamin, methylamin, dimethylamim atd.) a případně substituované ethanolaminy (např. ethanolamin, diethanolamin atd.).
Peptid podle navrhovaného vynálezu může být dále připraven tak, jak je to popsáno v příkladech provedení vynálezu, bez přidání volné neiontové soli, ve které se nabité kyselé nebo zásadité skupiny na postranních skupinách aminokyselinových zbytků (např. Arg, Asp atd.) spojí a neutralizují se navzájem za vzniku „vnitřní soli“.
Peptid podle navrhovaného vynálezu, může být syntetizován kteroukoliv technikou, známou odborníkům v oboru práce s polypeptidy, včetně technik rekombinantní DNA. Postupy chemické syntézy jsou preferovány z důvodů dosažení vyšší čistoty, antigenní specifičnosti, snadné výroby bez nežádoucích vedlejších produktů, atd. Příkladem chemické syntézy je syntéza na pevné fázi Merrifieldova typu. Výborné shrnutí mnoha použitelných technik je možno nalézt v publikacích Steward et al., „Solid Phase Peptide Synthesis“, W. H. Freeman Co., San Francisko, 1969; Bodanszky et al., „Peptide Synthesis“, John Wiley and Sons, Druhé vydání, 1976;
J. Meinehofer, „Hormonal Proteins and Peptides“, svazek 2, str. 46, Academie press (New York), 1983; Merrifield, Adv. Enzymol., 32: 221-96, 1969; Fields et al., Int. J. Peptide Protein Res., 35: 161-214, 1990 a US Patentu No 4 244 946 popisujícím syntézu peptidů na pevné fázi, a v Schroeder et al., „The Peptides“, svazek 1, Academie Press (New York), 1965, popisující klasickou syntézu v roztoku. Odpovídající ochranné skupiny, vhodné pro použití v popsaných syntetických metodách, jsou popsány v textech uvedených výše a v • · · • · • ·
J. F. W. McOmie, „Protective Groups v Organic Chemistry“, Plenům Press, New York, 1973.
Obecně tyto metody syntézy na pevné fázi představují postupné přidávání jednoho nebo více aminokyselinových zbytků, a nebo vhodně chráněných aminokyselinových zbytků k rostoucímu peptidovému řetězci. Běžně je bud’ aminoskupina nebo karboxylová skupina prvního aminokyselinového zbytku chráněna vhodnou, selektivně odstranitelnou ochrannou skupinou. Jiná, selektivně odstranitelná ochranná skupina je použita u aminokyselin jakou je např. lyzin, které obsahují reaktivní postranní skupinu.
Při syntéze na pevné fázi je chráněná nebo modifikovaná aminokyselina navázána na inertní pevný nosič přes nechráněnou karboxylovou skupinu nebo aminoskupinu. Ochranná skupina na aminoskupině nebo karboxylové skupině je následně selektivně odstraněna a dále je navázána následující aminokyselina v sekvenci, která má vhodně chráněnou komplementární (amino- nebo karboxylovou) skupinu, za podmínek vhodných pro tvorbu amidové vazby s aminokyselinovým zbytkem, který je již vázán na pevný nosič. Následně je odstraněna ochranná skupina z amino- nebo karboxylové skupiny nově připojeného aminokyselinového zbytku a je přidána následující (opět vhodně ochráněná) aminokyselina v sekvenci, atd. Poté co byly všechny požadované aminokyseliny spojeny ve správném pořadí jsou, za vzniku konečného lineárního polypeptidů, postupně nebo najednou odstraněny všechny ochranné skupiny terminálních a postranních skupin, které ještě zůstaly navázány, a je odstraněn pevný nosič.
Výsledné lineární polypeptidy, připravené např. tak, jak je to popsáno výše, mohou dále reagovat za vzniku odpovídajících cyklických peptidů. Jeden ze způsobů přípravy cyklického peptidů ··«· · · ···· ·· ·· • · · · · · » * · ·· · · ♦ · · “ * , ··· · ·· ··“·** ··· · · · · * · je popsán v Zimmer et al., Peptides 1992, str. 393-394, ESCOM Science Publishers, Β. V., 1993. Typicky je methylester peptidu chráněného terciálním butoxykarbonylem rozpuštěn v methanolu, dále je přidán roztok hydroxidu sodného a směs je inkubována při °C (20C), čímž je hydroiyticky odstraněna methylesterová ochranná skupina. Po odpaření rozpouštědla je terciálním butoxykarbonylem chráněný peptid extrahován z okyseleného vodného roztoku ethylacetátem. Terciální butoxykarbonylová ochranná skupina je dále odstraněna za slabě kyselých podmínek v dioxanovém spolurozpouštědle. Takto získaný nechráněný lineární peptid s volnou N-terminální aminoskupinou a C-terminální karboxylovou skupinou je přeměněn na odpovídající cyklický peptid, reakcí zředěného roztoku lineárního peptidu ve směsi dichlormethanu a dimethylformamidu s dicyklohexylkarbodiimidem v přítomnosti 1-hydroxybenzotriazolu a N-methylmorfolinu. Alternativní metody syntézy cyklických peptidů jsou popsány v Gurrath et al., Eur. J. Biochem., 210: 911-921 (1992) a dále v příkladech provedení vynálezu.
ανβ3 antagonista může být dále připraven ve formě fúzního proteinu. Fúzní proteiny jsou proteiny, připravené metodami rekombinantní DNA tak, jak je to popsáno v následujícím textu, kdy je předmětný polypeptid exprimován jako fúzní protein spolu s nosným proteinem, jakým je např. glutathionsulfhydryltransferáza (GST), nebo spolu s jiným známým nosičem.
Nejvhodnější fúzní proteiny obsahují polypeptid MMP-2, který je popsán v následujícím textu. Příprava MMP-2 fúzního proteinu je popsána v příkladech provedení vynálezu.
Obzvláště vhodné peptidy nebo deriváty peptidů pro použití v metodách podle vynálezu jsou c-(GrGDFV) (SEQ ID NO 4), c(RGDfV) (SEQ ID NO 5), c-(RADfV) (SEQ ID NO 6), c-(RGDfV) (SEQ ID NO 7) c-(RGDf-NMeV) (SEQ ID NO 15) a dále lineární peptid YTAECKPQVTRGDVF (SEQ ID NO 8), kde „c-“ označuje cyklický peptid, velká písmena představují jednopísmenný kód pro L-aminokyseliny, a malá písmena jednopísmenný kód pro Daminokyseliny. Aminokyselinové sekvence zmíněných peptidů jsou dále zobrazeny v seznamu sekvencí pod čísly SEQ ID NO 4, 5, 6, 7, 15 a 8 resp.
Velmi vhodné jsou také v textu popsané polypeptidy odvozené od MMP-2,jejichž sekvence jsou uvedené pod čísly SEQ ID NO. 17-28 a 45.
2. MONOKLONÁLNÍ PROTILÁTKY
V jednom z provedení popisuje navrhovaný vynález ανβ3 antagonisty ve formě monoklonálních protilátek, které imunologicky reagují s ανβ3 a inhibují tak vazbu přirozeného ligandu k ανβ3 receptoru. Vynález dále popisuje buněčné linie produkující zmíněné protilátky , způsoby přípravy těchto buněčných linií a způsoby přípravy zmíněných monoklonálních protilátek.
Monoklonálními protilátkami podle navrhovaného vynálezu jsou takové molekuly protilátek, které 1) imunologicky reagují s izolovaným ανβ3 a 2) inhibují vazbu fibrinogenu na ανβ3· Mezi nejvhodnější monoklonální protilátky, které se přednostně váží na ανβ3, patří monoklonální protilátky, které mají imunologické vlastnosti mAb LM609, produkovaných hybridomovou buněčnou linií ATCC HB 9537. Hybridomová buněčná linie ATCC HB 9537 byla uložena ve shodě s požadavky Budapest Treaty v American Type Culture Collection (ATCC), 1301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA, 15. září 1987.
Termín „protilátka nebo molekula protilátky“ je zde v různých mluvnických formách použit jako společný název, označující populaci imunoglobulinových molekul a/nebo imunologicky aktivních částí imunoglobulinových molekul, jako např. molekul, které obsahují vazebné místo pro antigen nebo paratop.
„Vazebné místo pro antigen“ ta je strukturní část molekuly protilátky, která je složena z variabilních a hypervariabilních domén těžkých a lehkých řetězců a která specificky váže antigen. Příkladem protilátek pro použití podle navrhovaného vynálezu jsou celé (neporušené) molekuly imunoglobulinů, funkčně neporušené molekuly imunoglobulinů a ty části molekul imunoglobulinů, které obsahují paratop, včetně částí, které jsou odborníkům známé jako Fab, Fab', F(ab')2 a F(v) fragmenty protilátek.
V jiném provedení zahrnuje vynález zkrácené molekuly imunoglobulinů, které obsahují Fab fragment, odvozený od monoklonální protilátky podle navrhovaného vynálezu. Fab fragment, postrádající Fc receptor, je rozpustný, z léčebného hlediska výhodnější, neboť vykazuje delší poločas v séru, a i z diagnostického hlediska přináší použití rozpustného Fab fragmentu mnohé výhody. Příprava rozpustného Fab fragmentu je v oboru imunologie obecně známá a může být provedena mnoha způsoby.
Fab a F(ab')2 fragmenty lze připravit například proteolytickým štěpením funkčně neporušených protilátek, pomocí papainu nebo pepsinu resp. Metody pro takové proteolytické štěpení jsou v oboru dobře známé, viz. např. U.S. Patent No. 4 342 566, Theofilopolous a Dixon. Fab' fragmenty protilátek jsou také dobře • 9
Λ Λ 9 · 9 9 · · 99 9 · · 9 9 9
ΗΉ ««·· ···· · · známé a připravují se z F(ab')2 fragmentů redukcí disulfidových můstků, které navzájem spojují těžké řetězce, a to např. pomocí merkaptoethanolu a následnou alkylací vzniklého merkaptanu pomocí alkylačního činidla jakým je např. jodoacetamid. Protilátky obsahující neporušené imunoglobulinové molekuly jsou nejvýhodnější a jsou zde používané, jako modelové.
Slovní spojení „monoklonální protilátka“ označuje v různých mluvnických formách molekuly protilátek, které nesou pouze jeden druh vazebného místa pro antigen, jež je schopné imunologické reakce s vybraným epitopem. Monoklonální protilátka tak typicky vykazuje zcela jedinečnou vazebnou afinitu ke každému jednomu epitopu, se kterým reaguje. Monoklonální protilátka se tudíž může skládat z molekul protilátek, které mají různá vazebná místa pro antigen, z nichž každé je imunospecifické pro jiný epitop; příkladem mohou být například bispecifické monoklonální protilátky.
Monoklonální protilátka je typicky složena z molekul protilátek produkovaných klony jediné buňky, nazývané hybridom, která sekretuje (produkuje) pouze jeden druh molekuly protilátky. Hybridomová buňka je vytvořena fúzí buněčné linie produkující protilátku a myelomové nebo jiné nesmrtelné buněčné linie. Příprava takovýchto protilátek byla poprvé popsána v Kohler a Milstein, Nátuře, 256 : 495-497 (1975). Další metody popsal Zola v Monoklonal antibodies : A Manual of Techniques, CRS Press, lne. (1987). Hybridomové supernatanty připravené posle zmíněných metod mohou být testovány na přítomnost molekul protilátek, které jsou schopné imunologické reakce s ανβ3, a na inhibici vazby mezi ανβ3 a jeho přirozeným ligandem.
• · · • « 9 · · · * · · * * · · • « ··· · · · · · • ·· · · ·· · • 4 >· 99 99 99
Krátce, hybridom, který produkuje monoklonální protilátku podle vynálezu, může být vytvořen fúzí myelomové nebo jiné nesmrtelné buněčné linie s lymfocyty, získanými ze sleziny savce, který byl hyperimunizován zdrojem οτνβ3 jakým je například ανβ3 izolovaný z lidských melanomových buněk linie M21 (Cheresh et al, J. Biol. Chem. 262: 17703-17711 (1987))..
Je s výhodou, pochází-li myelomová buněčná linie, použitá pro přípravu hybridomu, ze stejného druhu jako lymfocyty. Typickým vhodným savcem je myš kmene 129 GIX+. Mezi vhodné myší myelomy pro použití podle navrhovaného vynálezu patří hypoxantin-aminopterin-thymidin-sensitivní (HAT) buněčné linie P3X63-Ag8,653, a Sp2/0-Agl4, které jsou k dispozici v American Type Culture Collection, Rockville, MD, pod označením CRL 1580 a CRL 1581 resp.
Slezinné buňky (splenocyty) jsou obvykle fúzovány s myelomovými buňkami, za použití polyethylenglykolu (PEG) 1500. Hybridy vzniklé zmíněnou fúzí jsou selektovány na základě citlivosti k HAT. Hybridomy produkující monoklonální protilátky podle navrhovaného vynálezu lze identifikovat pomocí metody nazývané odborně ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), která je popsána v příkladech provedení vynálezu.
Monoklonální protilátky podle navrhovaného vynálezu mohou být také produkovány nově založenou monoklonální hybridomovou kulturou, tvořenou živným mediem obsahujícím hybridom, který produkuje do média molekuly protilátek příslušné specifity. Kultura je udržována v takových podmínkách a po takovou dobu, jaká je dostačující pro produkci molekul protilátky do media. Z media s protilátkami jsou poté odděleny buňky a protilátky jsou dále izolovány pomocí některé ze známých technik.
• ·
Media, vhodná pro přípravu zmíněných kultur, jsou v oboru dobře známá, jsou komerčně dostupná a patří mezi ně syntetická kultivační media, inbrední myši apod. Příkladem syntetického media je
Dulbeccovo základní minimální medium (DNEM; Dulbecco et al.,
Virol., 8 396, 1959), doplněné 4,5 g/ml glukosy, 20 mM glutaminem a 20% fetálním telecím sérem. Příkladem inbredního myšího kmene je kmen Balb/c.
Jsou známé i další metody pro přípravu monoklonálních protilátek, hybridomových buněk, nebo hybridomové buněčné kultury. Například metoda izolace monoklonálních protilátek z imunologické sbírky popsaná v Sastry et al., Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 86 : 5728-5732 (1989) a Huse et al., Science, 246 : 1275-1281 (1989). Součástí tohoto vynálezu jsou také hybridomová buňka a buněčné kultury obsahující hybridomovou buňku, které produkují monokionální protilátky podle navrhovaného vynálezu. Obzvláště vhodná je hybridomová buněčná linie ATCC HB 9537, která produkuje monokionální protilátku mAb LM609. Monoklonálmí protilátka LM609 byla připraven tak jak je to popsáno v Cheresh et al, J. Biol. Chem. 262: 17703-17711 (1987) a v příkladech provedení vynálezu.
V jednom z provedení se navrhovaný vynález týká monokionální protilátky, která má imunoreakční vlastnosti mAb LM609.
Je také možné určit, zda má monokionální protilátka stejnou (tj. ekvivalentní) specifitu (imunoreakční vlastnosti) jako monokionální protilátka podle navrhovaného vynálezu, a to pomocí stanovení jejich vzájemné zkřížené reaktivity, tj. zda jedna brání druhé ve vazbě vybranou cílovou molekulu. Jestliže testovaná monokionální protilátka soutěží (kompetuje) s monokionální protilátkou podle navrhovaného vynálezu, což se projeví poklesem vazby « « # • · ···· ·· ··· · monoklonální protilátky podle navrhovaného vynálezu na cílovou molekulu navázanou na pevné fázi ve standardních kompetičních pokusech, potom je pravděpodobné, že tyto dvě monoklonální protilátky rozpoznávají stejný nebo blízce příbuzný epitop.
Dalším způsobem jak určit, zda má nějaká monoklonální protilátka specifitu monoklonální protilátky podle navrhovaného vynálezu, je pre-inkubace monoklonální protilátky podle vynálezu s cílovou molekulou, se kterou běžně reaguje, a následné přidání testované monoklonální protilátky. Tímto testem se zjišťuje, zda bude inhibována vazba testované monoklonální protilátky na cílovou molekulu. Je-li vazba testované monoklonální protilátky inhibována, pak má bezpochyby stejnou nebo funkčně ekvivalentní epitopovou specifitu jako monoklonální protilátka podle tohoto vynálezu.
Dalším způsobem, jak určit, má-li testovaná monoklonální protilátka specifitu monoklonální protilátky podle navrhovaného vynálezu, je stanovení aminokyselinové sekvence v CDR oblastech testovaných protilátek. Molekuly protilátek, které mají identickou nebo funkčně ekvivalentní sekvenci aminokyselinových zbytků ve svých CDR oblastech, mají i stejnou vazebnou specifitu. Metody sekvenování polypeptidů jsou v oboru dobře známé.
Imunospecifita protilátky, její schopnost vazby na cílovou molekulu a afinita protilátky k epitopu jsou definovány epitopem, se kterým protilátka imunologicky reaguje. Specifita protilátky je definována alespoň z části sekvencí aminokyselinových zbytků variabilní oblasti těžkého řetězce imunoglobulinu a z části sekvencí aminokyselinových zbytků variabilní oblasti lehkého řetězce.
Termín „mající stejnou vazebnou specifitu“ označuje, odpovídající si monoklonální protilátky, které se vyznačují stejnými nebo podobnými imunologickými (vazebnými) vlastnostmi a tudíž spolu ·· ····
Φ· ····
AQ · · » · · · · · ·»<-··«
Η-Ο ···· · · · · * <
soupeří ο vazbu na vybranou cílovou molekulu.
Humanizované monoklonální protilátky mají oproti myším monoklonálním protilátkám jisté výhody. Především mohou být použity při léčbě lidského pacienta. Lidské protilátky nejsou z oběhu odstraněny tak rychle jako „cizí“ antigeny a navíc lidské protilátky neaktivují imunitní systém tak jako cizí antigeny a cizí protilátky. Způsoby přípravy „humanizovaných“ protilátek jsou v oboru obecně dobře známé a mohou být snadno aplikovány na protilátky navrhovaného vynálezu.
V jednom z provedení se tedy navrhovaný vynález týká monoklonální protilátky podle vynálezu, která je humanizována pomocí implantace složky lidského imunitního systému bez vážného omezení schopnosti protilátky vázat antigen.
3. ανβ3 SPECIFICKÁ MIMETIKA (NAPODOBENINY) Předkládaný vynález ukazuje, že v jeho rámci mohou být obecně použiti ανβ3 antagonisté, mezi něž patří polypeptidy, protilátky a další molekuly, označované jako „mimetika“, které mají schopnost blokovat funkci ανβ3. Zvláště vhodní jsou antagonisté, kteří specificky blokují funkci ανβ3 ale nikoliv funkce jiných integrinů.
V této souvislosti je s výhodou, že v navrhovaných metodách může být použita celá řada látek, pokud mají požadovanou biologickou aktivitu. Tyto látky jsou obecně označovány jako napodobeniny, neboli mimetika, protože mají obecně schopnost „napodobovat“ ανβ3 vazebnou doménu nebo ανβ3 ligand, které se účastní funkční interakce receptor-ligand, a tím brání (tj. inhibují) normální funkci receptoru.
Mimetikem je jakákoliv molekula, s výjimkou protilátky nebo od ligandu odvozeného peptidu, která má výše uvedené vlastnosti.
• · • ·
Může to být syntetický peptid, analog nebo derivát peptidů, sloučenina, která vypadá jako vazebné místo výše popsané vazebné domény, jako např. organická molekula mimetika, nebo jiná molekula.
Zvláště vhodnou napodobeninou podle navrhovaného vynálezu je napodobenina organického původu, označovaná jako organická napodobenina. Zvláště vhodnými organickými napodobeninami, které fungují jako ανβ3 antagonisté imitující ligand ανβ3 receptoru, jsou sloučeniny 7, 9, 10, 12, 14, 15, 16, 17 a 18, popsané v příkladu 10.
Návrh ανβ3 napodobeniny může být vytvořen pomocí řady metod strukturní analýzy, používaných pro tvorbu léků, které jsou v oboru dobře známé, včetně např. molekulárního modelování, dvourozměrné nukleární magnetické rezonance (2-D NMR), x-ray krystalografie, náhodného prohledávání knihoven peptidů, peptidových analogů nebo jiných chemických polymerů nebo dalších sloučenin, a dalších metod podobných těm, které se používají pro navrhování léků.
Vzhledem k důkazům, uvedeným v popisu vynálezu, podle nichž může být ανβ3 antagonistou fúzní polypeptid (např. MMP-2 fúzní protein), malý polypeptid, cyklický peptid, derivát peptidů, organické mimetikum (napodobenina) nebo monoklonální protilátka, což jsou různé chemické struktury, které sdílejí jen funkční schopnost selektivní inhibice ανβ3 receptoru, ale nikoliv chemickou strukturu, je zřejmé, že struktura předmětných ανβ3 antagonistů, vhodných pro použití v navrhovaných metodách, nemusí být tak omezena a může zahrnovat jakékoliv ανβ3 napodobeniny, jak jsou zde definovány.
• · · · • · · · • · • · · · · · • · · * · · 4 • · ·· ·· · ·
F. ZPŮSOBY IDENTIFIKACE ανβ3 ANTAGONISTŮ Vynález také popisuje způsoby identifikace kandidátů na ανβ3 antagonisty pro použití podle navrhovaných metod. Metody jsou založeny na určování schopnosti testované molekuly inhibovat vazbu ανβ3 s přirozeným ligandem a dále schopnosti inhibovat angiogenezí ve tkáních.
Prvním způsobem je měření inhibice přímé vazby přirozeného ligandu na ανβ3. Nejvhodnější metoda tohoto typu je detailně popsána v příkladech provedení vynálezu. Metody tohoto typu měří stupeň inhibice vazby přirozeného ligandu, jakým je například fibrinogen, na izolovaný ανβ3 receptor. Receptor je navázán na pevné fázi a test se provádí metodou ELISA.
Zmíněná metoda může být použita také pro identifikaci látek, které vykazují specifickou vazbu na ανβ3 receptory, ale nikterak neinhibují vazbu přirozeného ligandu na ostatní integriny. Specifičnost vazby testovaných látek je určena pomocí paralelních ELISA testů, kdy jsou ανβ3 receptory i ostatní integriny testovány součastně v oddělených testovacích jamkách. V pokusech je testována schopnost receptorů vázat přirozený ligand a schopnost testovaných látek inhibovat schopnost integrinů vázat předem vybraný ligand. Nejvhodnější aplikace zmíněné metody jsou popsány v příkladech provedení vynálezu.
Další metodou je měřena angiogeneze v kuřecí chorioalantoidní membráně (CAM). Tato metoda je označována jako CAM test. CAM test byl již dříve detailně popsán byl používán pro měření angiogeneze a neovaskularizace v nádorových tkáních. Viz Ausprunk et al., Am. J. Pathol., 79: 597-618 (1975) a Ossonski et • · al., Cancer Res., 40: 2300-2309 (1980).
CAM test je uznávaným experimentálním modelem in vivo angiogeneze, protože dochází k neovaskularizaci veškeré tkáně.
Nové cévy kuřecího embrya vrůstají do CAM nebo do tkáně, která z CAM vyrůstá.
Jak je zde vidět, CAM test objasňuje inhibici neovaskularizace na základě množství a míry růstu nových cév. Dále je snadné monitorovat růst jakékoliv tkáně, transplantované na CAM, jako např. nádorů. A konečně je tento test zvláště užitečný, protože je zároveň vnitřní kontrolou toxicity v testovaném systému. Kuřecí embryo je vystaveno testované látce a zdraví embrya je pak ukazatelem toxicity.
Třetím testem, kterým se stanovuje míra angiogeneze, je in vivo model králičího oka, který je zde označován jako test na králičím oku. Test na králičím oku byl již dříve detailně popsán a byl používán pro měření angiogeneze a neovaskularizace v přítomnosti inhibitorů angiogeneze, jakým je například thalidomid. Viz D'Amato et al., Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 91 : 4082-4085 (1994). Test na králičím oku je uznávaným modelem angiogeneze in vivo, protože proces neovaskularizace, jehož příkladem je vrůstání králičích cév od okraje rohovky do rohovky, je snadno viditelný skrze přirozeně průhlednou tkáň oční rohovky. Navíc, rozsah a množství stimulace nebo inhibice neovaskularizace nebo regrese neovaskularizace mohou být snadno monitorovány v čase.
A konečně, králík je vystaven testované látce a jeho zdraví je tedy ukazatelem toxicity dané látky.
Čtvrtou metodou je stanovení angiogeneze na chimérním modelu myš:člověk. Tento test je zde nazýván test s chimérní myší. Metoda byla již dříve detailně popsána, a nyní je popsána zde jako způsob • · · · • · · · · · ; · · · · · · · · ·· ·· ·· ·· měření angiogeneze, neovaskularizace a regrese nádorové tkáně. Viz. Yan et al. J. Clin. Invest. 91: 986-996, (1993). Test na chimérní myši je velmi vhodným modelem pro sledování in vivo angiogeneze, protože transplantovaný kožní štěp velmi přesně histologicky napodobuje přirozenou lidskou kůži a také proto, že veškerá tkáň je nově vaskularizována, neboť nově vznikající lidské cévy prorůstají ze štěpu lidské kůže do lidské nádorové tkáně na povrchu kožního štěpu. Původ nových cév v lidském štěpu může být určen pomocí imunohistochemického barvení nově vzniklých cév značkou, která se specificky váže na lidské endoteliální buňky.
Na chimérním modelu myš:člověk je zde demonstrována regrese neovaskularizace, tj. jak síla, tak rozsah regrese růstu nových cév. Dále lze tímto testem monitorovat vliv na růst jakékoliv tkáně transplantované na kožní štěp, například nádorové tkáně. A konečně i tento test je vhodným způsobem testování toxicity studované látky. Chimérní myš je vystavena účinkům sledované látky a její zdraví je tudíž ukazatelem toxicity.
G. VÝROBEK
Součástí navrhovaného vynálezu je také výrobek, kterým je označený obal, určený pro distribuci ανβ3 antagonisty podle navrhovaného vynálezu. Výrobek se skládá z obalu a farmaceutického přípravku, který je ve něm zabalen.
Farmaceutickým přípravkem ve výrobku je jakýkoliv ανβ3 antagonista podle navrhovaného vynálezu, ve farmaceuticky přijatelné formě, tak jak je zde popsána. Výrobek obsahuje takové množství farmaceutického přípravku, které je dostatečné pro použití pro léčení stavů,které jsou zde popsány, a to buď v jedné nebo několika dávkách.
• · · · • · · jj . · · · · · · 1 .· .· ·· ··
Obal obsahuje štítek, na kterém je uveden způsob použití farmaceutického přípravku obsaženého uvnitř, např. pro léčení různých stavů pomocí inhibice angiogeneze. Štítek může dále obsahovat pokyny pro použití a další informace, které mohou být požadované trhem. Obal může dále obsahovat další obal(y) pro uložení farmaceutického přípravku.
Zde použitý termín, obal, označuje obalové materiály jako např. sklo, umělá hmota, papír, folie apod., v nichž je možné skladovat a přepravovat farmaceutický přípravek. Obalovým materiálem mohou tedy být např. plastové nebo skleněné lahvičky, vrstvené obaly a jiné podobné obaly, které se běžně používají pro farmaceutické prostředky obsahující účinné látky.
V doporučovaných provedeních zahrnuje obalový materiál štítek, na kterém je zřetelně popsán obsah výrobku a způsob použití obsažené farmaceutické látky.
Příklady provedení vvnálezu
Následující příklady, týkající se navrhovaného vynálezu, jsou pouze ilustrativní a neměly by být, samozřejmě, považovány za limitující. Navíc, takové obměny navrhovaného vynálezu,které jsou již nyní známé a nebo budou později vyvinuté, a které budou v mezích znalostí odborníka v oboru, jsou považovány za součást navrhovaného vynálezu.
Příklad 1: Příprava syntetických peptidů a. Způsob syntézy
Lineární a cyklické polypeptidy uvedené v tabulce 1, byly syntetizovány za použití standardních technik syntézy na pevné fázi, viz. např. Merrifield, Adv. Enzymol., 32 : 221-296 (1969) a • * β ·
Fields G. B. a Noble R. L., Int. J. Peptide Protein Res., 35: 161214 (1990).
Dva gramy (g) BOC-Gly-D-Arg-Gly-Asp-Phe-Val-Ome (SEQ ID NO 1) byly nejdříve rozpuštěny v 60 mililitrech (ml) methanolu, do kterého bylo přidáno 1,5 ml 2N roztoku hydroxidu sodného. Vzniklá směs byla míchána po dobu 3 hodin při 20 stupních C (20°C). Po odpaření byl zbytek směsi ve vodě okyselen na pH 3 zředěnou HCI a extrahován ethylacetátem. Extrakt byl vysušen přes Na2SO4, znovu odpařen a výsledný BOC-Gly-D-Arg-Gly-AspPhe-Val-OH (SEQ ID NO 2) byl míchán při 20°C po dobu 2 hodin s 20 ml 2N HCI v dioxanu. Výsledná směs byla odpařena za vzniku H-Gly-D-Arg-Gly-Asp-Phe-Val-OH (SEQ ID NO 3), který byl následně rozpuštěn ve směsi 1800 ml dichlormethanu s 200 ml dimethyformamidu (DMF) a vzniklá směs byla ochlazena na 0°C. Poté bylo postupně za stálého míchání přidáno 0,5 g dicyklohexylkarbodiimidu (DCCI), 0,3 g 1-hydroxybenzotriazolu (HOBt) a 0,23 ml N-methylmorfolinu.
Výsledná směs byla míchána dalších 24 hodin při 0°C a poté při 20°C dalších 48 hodin. Roztok byl zahuštěn a na iontoměničové vrstvě zbaven solí. Po odstranění vzniklé pryskyřice filtrací byl pročištěný roztok odpařen a výsledná směs byla purifikována pomocí chromatografie. Výsledkem je cyklo-(-Gly-D-Arg-GlyAsp-Phe-Val-) (SEQ ID NO 4). Následující peptidy uvedené v tabulce 1 spolu s identifikačním číslem peptidů (v tabulce jsou použity jednopísmenné zkratky názvů aminokyselinových zbytků) byly získány analogickým způsobem: cyklo-(Arg-Gly-Asp-D-PheVal) (SEQ ID NO 5), cyklo-(Arg-Ala-Asp-D-Phe-Val) (SEQ ID NO 6); cyklo-(Arg-D-Ala-Asp-Phe-Val) (SEQ ID NO 9); cyklo(Arg-Gly-Asp-Phe-D-Val) (SEQ ID NO 7); a cyklo-(Arg-Gly-AspD-Phe-NMeVal) (methylace na alfa-amino dusíku amidové vazby valinového zbytku) (SEQ ID NO 15).
Peptid označený číslem 66203 má shodnou aminokyselinovou sekvenci s peptidem označeným číslem 62184. Oba zmíněné peptidy se navzájem liší pouze obsahem solí, první peptid obsahuje soli HCI, zatímco druhý peptid (62184) obsahuje spíše soli TFA. Stejný vztah je i mezi dvojicemi peptidů 69601 a 62185 a 85189 a 121974.
b. Alternativní způsob syntézy
i. Syntéza TFA soli cyklo-(Arg-Gly-Asp-DPheNMeVal)
Fmoc-Arg(Mtr)-Gly-Asp(OBut)-DPhe-NMeVal-ONa byl syntetizován na pevné fázi metodou Merrifieldova typu, tj. postupným přidáváním NMeVal, DPhe, Asp(OBut), Gly a FmocArg(Mtr) na 4-hydroxymethyl-fenoxymethyl-polystyrenové pryskyřici (pryskyřice typu Wang) (bylo použito obvyklých Merrifieldových metod syntézy peptidů, tak, jak jsou popsány v Houben-Weyl. l.c. ročník 15/11, str. 1 až 806 (1974)). Polystyrénové pryskyřice a prekurzory aminokyselin jsou komerčně dostupné od společností Aldrich, Sigma nebo Fluka. Po ukončení postupné syntézy byla pryskyřice od vzniklého peptidového řetězce odstraněna za použití směsi TFA/dichlormethan 1:1. Výsledným produktem byla sloučenina Fmoc-Arg(Mtr)-Gly-Asp(OBut)-DPheNmeVal-OH. Skupina Fmoc byla poté odstraněna reakcí se směsí piperidin/DMF 1:1, za vzniku hrubého prekurzoru Arg(Mtr)-GlyAsp(OBut)-DPhe-NMeVal-OH, který byl dále obvyklým způsobem vyčištěn pomocí HPLC.
• · • *
Cyklický peptid byl z lineárního peptidu, připraveného podle výše uvedených metod, vyroben následujícím způsobem: roztok 0,6 g Arg(Mtr)-Gly-Asp(OBut)-DPhe-NMeVal-OH v 15 ml DMF (dimethyformamid; Aldrich) byl zředěn 85 ml dichlormethanu (Aldrich) a k roztoku bylo přidáno 50 mg NaHCO3. Po ochlazení ve směsi suchý led/aceton bylo přidáno 40 μΐ difenylfosforylazidu (Aldrich). Po 16 hodinách stání při pokojové teplotě byl roztok zahuštěn. Koncentrát byl přečištěn nejprve gelovou chromatografií (Sefadex 10; izopropanol/voda 8:2) a poté obvyklým způsobem pomocí HPLC. Po působení roztokem TFA (kyselina trifluoroctová)/H2O (98:2) vznikl cyklo-(Arg-Gly-Asp-DPheNMeVal) x TFA, který byl obvyklým způsobem vyčištěn pomocí HPLC; RT=19,5; FAB-MS (M+H) : 589.
ii. syntéza „vnitřní soli“
Sůl TFA je z cyklického peptidu, připraveného podle výše uvedené metody, snadno odstraněna následujícím způsobem: cyklo-(Arg-GlyAsp-DPhe-NmeVal) x TFA je resuspendován ve vodě; TFA je z roztoku odstraněna odpařením ve vakuu. Vzniklý cyklický peptid se nazývá „vnitřní sůl“ a je označován jako cyklo-(Arg-Gly-AspDPhe-NMeVal). Termín „vnitřní sůl“ je zde použit proto, že tento cyklický peptid obsahuje dva opačně nabité zbytky, jejichž protikladné náboje se uvnitř molekuly navzájem vyrovnávají a molekula navenek působí jako nenabitá. Jeden z nabitých zbytků obsahuje kyselou skupinu a druhý nabitý zbytek obsahuje aminoskupinu. Když se tato kyselá skupina a aminoskupina v rámci molekuly dostatečně přiblíží, může aminoskupina odejmout proton kyselé skupině za vzniku karboxy-/amonné soli, jejíž celkový náboj je neutrální.
• · • · iii. Zpracování pomocí HCI za vzniku cyklo-(Arg-GlyAsp-DPhe-NMeVal) x HCI mg cyklo-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal) bylo 5 až 6 krát rozpuštěno v 0,01M HCI; po každém rozpuštění byl roztok vysušen vymražením; Na závěr byla směs purifikována pomocí HCI za vzniku cyklo-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal) x HCI; FAB-MS (M+H) : 589 iv. Zpracování pomocí kyseliny methansulfonové za vzniku cyklo-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NmeVal) x MeSO3H mg cyklo-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal) bylo 5-6 krát rozpuštěno v 0,01M MeSO3H (kyselině methansulfonové); po každém rozpuštění byl roztok vysušen vymražením. Po následné purifikaci HPLC vzniká cyklo-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal) x MeSO3H; RT=17,8; FAB-MS (M+H) : 589.
Alternativní způsoby cyklizace zahrnují derivatizaci bočních skupin necyklických peptidových prekurzorů sulfhydrylovými skupinami. Je-li poté molekula vystavena podmínkám mírně zvýšeného pH (ve srovnání s normálním fysiologickým pH 7,5), tvoří se vnitromolekulární disulfidické vazby s jinými sulfhydrylovými skupinami, přítomnými v molekule, za vzniku cyklického peptidu. Navíc, C-terminální karboxylová skupina necyklického peptidového prekurzoru může reagovat s některou volnou sulfhydrylovou skupinou v molekule za vzniku cyklického peptidu cyklizovaného thioesterovou vazbou.
Testy popsané v příkladu 7, ve kterých byla sledována schopnost syntetických peptidů inhibovat angiogenezí, prokázaly, že syntetický peptid 66203 v HCI je mírně účinnější, než identický peptid v TFA.
0
TABULKA 1
Označení peptidů Aminokyselinová sekvence SEQ ID NO
62181 cyklo (GrGDFV) 4
62184 (66203*) cyklo(RGDfV) 5
62185 (69601*) cyklo(RADfV) 6
62187 cyklo(RGDFv) 7
62880 YTAECKPQVTRGDVF 8
62186 cyklo (RaDFV) 9
62175 cyklo (ARGDfL) 10
62179 cyklo (GRGDfL) 11
62411 TRQVVCDLGNPM 12
62503 GVVRNNEALARLS 13
62502 TDVNGDGRHDL 14
121974 (85189*) cyklo (RDGf-NH2Me-V) 15
112784 cyklo (RGDf-NH2Me-V) 16
huMMP-2 (410-631)** 17
huMMP-2 (439-631)** 18
huMMP-2 (439-512)** 19
huMMP-2 (439-546)** 20
huMMP-2 (510-631)** 21
huMMP-2 (543-631)** 22
chMMP-2 (410-637)*** 23
chMMP-2 (445-637)*** 24
chMMP-2 (445-518)*** 25
chMMP-2 (445-552)*** 26
• *
chMMP-2 (516-637)*** 27
chMMP-2 (549-637)*** 28
* Peptidy označené hvězdičkou jsou připraveny v HCI a mají shodnou aminokyselinovou sekvenci s peptidy uvedenými ve stejném řádku; peptidy bez hvězdičky jsou připraveny v TFA.
Malá písmena označují D-aminokyseliny; velká písmena označují Laminokyseliny.
** Aminokyselinové sekvence syntetických peptidů odvozených od lidského MMP-2 jsou vyznačeny odpovídajícími pozicemi aminokyselin na obrázcích 22A a 22B. (MMP-2 je označení pro člena rodiny metaloproteináz extracelulární matrix). Lidské MMP-2 sekvence jsou uvedeny s přirozenými cysteinovými zbytky a ne s vytvořenými cysteinovými zbytky, jak je popsáno pro fúzní proteiny. Nepřirozené cysteinové zbytky byly v odpovídajících pozicích nahrazeny přirozenými aminokyselinovými zbytky za účelem zlepšení rozpustnosti syntetických, stejně jako exprimovaných fúzních proteinů. Zároveň je tímto krokem zajištěno správné sbalení a prezentace vazebného místa.
* * ★ Aminokyselinové sekvence syntetických peptidů odvozených od kuřecího MMP-2 jsou vyznačeny odpovídajícími pozicemi aminokyselin na obrázcích 22A a 22B. Kuřecí MMP-2 aminokyselinové sekvence jsou uvedeny s přirozenými cysteinovými zbytky a ne s vytvořenými cysteinovými zbytky, jak je to popsáno pro fúzní proteiny (viz. výše).
Příklad 2: Monoklonální protilátky
Monoklonální protilátka LM609 produkovaná hybridomem
ATCC HB 9537 byla připravena standardními technikami, tj. imunizací izolovanými ανβ3 proteiny, adsorbovanými na lektinem potažené částice Sepahrosy. ανβ3 receptory byly izolovány z lidských melanomových buněk M21 a protilátka byla připravena tak, jak je to popsáno v Cheresh et al., J.Biol. Chem. 262: 177031771 1 (1987). Buňky M21 laskavě poskytla Dr. D. L. Morton (University of California at Los Angeles, CA). Buňky byly pěstovány v suspenzi v RPMI kultivačním médiu, které obsahuje 2 mM L-glutamin, 50 mg/ml gentamicin sulfátu a 10% fetální telecí sérum.
Bylo prokázáno, že monoklonální protilátka LM609 specificky imunologicky reaguje s ανβ3 komplexem, ale nereaguje s av podjednotkou, β3 podjednotkou, ani s jinými integriny.
Příklad 3: Charakterizace tkáňové distribuce exprese ανβ3.
A. Imunofluorescence s použitím protilátek proti integrinovým receptorům.
Během hojení ran exprimují bazální membrány cév několik adhezívních proteinů včetně von Willebrandova faktoru, fibronektinu a fibrinu. Navíc na povrchu kultivovaných endoteliálních buněk a buněk hladkého svalu je exprimováno několik členů integrinové rodiny adhezívních receptorů. Viz. Cheresh, Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 84 : 6471 (1987), Janat et al., J. Cell Physiol., 151: 588 (1992) a Cheng et al., J. Cell Physiol., 139 : 275 (1989). Jedním ze zmíněných integrinů je ανβ3, endoteliální buněčný receptor pro von Wildebrandův faktor, fibrinogen (fibrin) a • · · · * · · · • · fibronektin, popsaný v Cheresh, Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 84 :
6471 (1987). Tento integrin je počátkem tzv. kalcium-dependentní signální dráhy vedoucí k migraci endoteliálních buněk, a tudíž hraje pravděpodobně fundamentální roli v biologii cév (viz. Leavelsey a kol., J. Cell Biol. 121:163 (1993).
Pro studium exprese ανβ3 během angiogeneze byla se souhlasem pacientů použita lidská poraněná granulující tkáň, nebo přilehlá zdravá tkáň. Tkáň byla promyta 1 ml fosfátem pufrovaného roztoku NaCI a uložena v O.T.C. mediu (Tissue Tek). Tkáň byla prudce zmražena v tekutém dusíku (30 až 45 sekund). Pomocí kryostatového mikrotomu byly ze zmražené tkáně odděleny šest mikronů silné řezy, které byly dále barveny pomocí protilátek specifických pro buď β3 integriny (ανβ3 nebo cti^3), nebo βι rodinu integrinů a zviditelněny imunologickou reakcí s peroxidázou. Výsledky barvení zdravé lidské kůže a poraněné granulované tkáně jsou zobrazeny na obrázcích 1A až ID. Pro imunohistochemickou analýzu zmrazených sekcí byly použity monokionální protilátky AP3 a LM534 proti β3 a βι integrinům resp.Výsledky experimentů s tkání pocházející od čtyřech různých lidských dárců byly shodné. Zobrazené mikrofotografie jsou zvětšeny 300 x.
ανβ3 integriny byly hojně exprimovány na povrchu buněk krevních cév granulované tkáně (obrázek 1B), ale nebyly detekovány v dermis ani v epitelu zdravé kůže stejného dárce (obrázek 1A). Naopak βι integriny byly hojně exprimovány na povrchu krevních cév i buněk vazivové tkáně zdravé kůže (obrázek 1C) i granulované tkáně (obrázek ID), a, jak bylo již dříve prokázáno Adamsem a kol., Cell 63: 425 (1991), i na bazálních buňkách epitelu.
• · • · · · • ♦ • · · · • ·
B. Imunofluorescence s protilátkami proti ligandu Ultratenké řezy lidské normální a granulované tkáně, připravené stejně jako v předešlém případě, byly použity pro testování přítomnosti ligandů βι a β3 integrinů, von Willdebrandova faktoru a lamininu resp. Von Willdebrandův faktor byl lokalizován v krevních cévách zdravé kůže (obrázek 2A) a v cévách granulované tkáně (obrázek 2B), zatímco laminin byl lokalizován ve všech cévách stejně jako v epitelu bazální membrány v obou vzorcích tkáně (obrázky 2C a 2D).
C. Distribuce protilátek proti ανβ3 v nádorové tkáni.
kromě výše zmíněných analýz byly testovány také přítomnost a tkáňová distribuce ανβ3 receptorů v biopsiích nádorové tkáně lidských pacientů. Vzorky tkáně byly připraveny tak, jak je to popsáno v příkladu IA. Jedinou výjimkou v postupu bylo značení monoklonální protilátkou LM609 specifickou pro integrinový receptor ανβ3, připravenou jako v příkladu 2. Vzorky nádorové tkáně byly také upraveny pro mikroskopickou histologickou analýzu fixací reprezentativních vzorků nádorové tkáně Bulinovým fixačním činidlem po dobu 8 hodin. Z takto fixované tkáně byly připraveny seriální řezy, které byly dále barveny H&E. Výsledky imunoperoxidázového barvení nádorů močového měchýře, tlustého střeva, prsu a plic jsou zobrazeny na obrázcích 3A-3D resp. ανβ3 receptory jsou hojně exprimovány pouze na krevních cévách všech čtyř testovaných nádorů, ale nebyly prokázány na žádných jiných buňkách testovaných tkání.
Výsledky těchto pokusů ukazují, že ανβ3 integrinový receptor je selektivně exprimován jen na určitých typech tkání, konkrétně na granulované tkáni, metastázách a dalších tkáních, ve kterých • * • · • · probíhá angiogeneze, ale nejsou přítomny v normální tkáni, ve které byla tvorba nových cév ukončena. Zmíněné tkáně jsou tedy ideálním cílem terapeutického působení podle vynálezu.
·· ··
Příklad 4: Identifikace av33-specifických syntetických peptidů detekovaných pomocí testu inhibice buněčné adheze a testu vazby ligand-receptor.
A. Inhibice buněčné adheze
Pro stanovení specifičnosti antagonisty podle navrhovaného vynálezu k integrinovému receptoru je určen test inhibice buněčné adheze tak jak je popsán níže.
Krátce; křeččí melanomové buňky CS-1, které neexprimují ανβ3 ani ανβ5 receptory, byly nejprve transfektovány plazmidem, nesoucím gen pro expresi β3 podjednotky tak, jak to bylo popsáno v Filardo et al., J. Cell Biol. 130: 441-450 (1995). Specifičnost potenciálního ανβ3 antagonisty byla určena jeho schopností blokovat vazbu ανβ3 exprimujících CS-1 buněk na VN nebo lamininem pokryté povrchy. Typické testování probíhá následujícím způsobem: jamky jsou nejprve přes noc potaženy 10 ug/ml substrátu. Poté jsou promyty a blokovány teplotně denaturovaným BSA v PBS při pokojové teplotě po dobu 30 minut. Směs peptidů 85189 (SEQ ID NO 15) v koncentracích od 0,0001 μΜ do 100 μΜ s CS-1 buňkami byla aplikována do jednotlivých předpřipravených jamek a to v množství 50 000 buněk na jamku. Po 10 až 15 minutách inkubace při 37 °C byla tekutina z jamek odsáta. Počet buněk zachycených v jamce byl určen pomocí barvení 1% krystalovou violetí. Krystalová violeť byla z buněk eluována přidáním 100 μΐ 10% kyseliny octové a buněčná adheze byla kvantifikována měřením optické denzity • · » • · · · · • · · · eluované krystalové violeti při vlnové délce 600 nm.
Na obrázku 21 jsou znázorněny výsledky takového typického pokusu s avp3 antagonistou, kterým byl v tomto případě peptid 85189. Na lamininem pokrytých jamkách nebyla se zmíněným peptidem detekována žádná inhibice. Naopak úplná inhibice vazby nastala v jamkách pokrytých vitronektinem v koncentracích 10 μΜ a vyšší, což je vidět na křivce znázorňující odpověď v závislosti na dávce peptidu.
Podobné testy byly provedeny s fúzními proteiny s obsahem různých částí MMP-2 proteinu. Polypeptidy odvozené od MMP-2 v sobě zahrnují C-koncové oblasti MMP-2, které se aktivně podílejí na vazebné interakci s ανβ3 a tudíž mohou inhibovat aktivaci pomocí MMP-2 a s ní spojené další jevy. Tyto polypeptidy jsou připraveny buď jako syntetické polypeptidy nesoucí sekvenci odvozenou od Ckoncové domény MMP-2 tak, jak je to popsáno v příkladu 1, a nebo jsou to fúzní proteiny obsahující buď celou C-koncovou doménu MMP-2, nebo jen její část. Příprava těchto fúzních proteinů je popsána dále. Jsou popsány molekuly nesoucí MMP-2 C-koncovou část, které jsou specifické pro kuřecí tkáň i ty, které jsou specifické pro tkáň lidskou.
C-koncová doména odvozená od kuřecího MMP-2 proteinu, nazývaná také hemopexinová doména, těsně přiléhající k pantové oblasti, obsahuje aminokyselinové zbytky 445-637 MMP-2 proteinu. Kompletní nukleotidová i kódující aminokyselinová sekvence kuřecího MMP-2 jsou popsány níže, stejně jako kompletní nukleotidová i kódující aminokyselinová sekvence lidského MMP-2. Aminokyselinové sekvenci 445-637 kuřecího MMP-2 proteinu odpovídá aminokyselinová sekvence 439-637 lidského MMP-2. V lidské sekvenci totiž chybí ve srovnání s kuřecí sekvencí šest aminokyselinových zbytků (viz. obrázky 22A a 22B). Syntetické peptidy s obsahem jak lidské, tak i kuřecí C-koncové domény odvozené od MMP-2, jsou uvedeny v tabulce 1. Aminokyselinové sekvence syntetických peptidů jsou stejné jako sekvence odpovídajících rekombinantních fúzních proteinů, narozdíl od nich však neobsahují GST fúzní komponentu. Příprava fúzních proteinů nesoucích C-koncovou oblast lidského nebo kuřecího MMP-2, je popsána v následujícím textu.
MMP-2 fúzní protein je chimérní polypeptid, ve kterém je kovalentní peptidovou vazbou funkčně spojena (fúzována) sekvence C-koncové domény MMP-2, nebo její část, s nosičem (fúzovaným proteinem), kterým může být například glutathion sulfhydryl transferáza (GST).
Za účelem amplifikace různých oblastí kuřecího či lidského MMP-2 byly na základě znalosti odpovídajících cDNA sekvencí obou proteinů navrženy vhodné primery. Úplná nukleotidová sekvence kódujícího řetězce cDNA neprocesovaného kuřecího MMP-2, nazývaného také progelatináza, je zobrazena na obrázcích 22A a 22B, spolu s odvozenou aminokyselinovou sekvencí (na druhém řádku) (Aimes et al., Biochem. J., 300 : 729-736, 1994). Na třetím a čtvrtém řádku těchto obrázků resp. jsou znázorněny odvozené aminokyselinové sekvence lidského (Collier et al., J. Biol. Chem., 236 : 6579-6587 (1988) a myšího MMP-2 (Reponen et al., J. Biol. Chem., 267 : 7856-7862 (1992)). Identické aminokyselinové zbytky jsou označeny tečkou, zatímco rozdílné zbytky jsou uvedeny v jednopísmenném kódu IUPAC. Chybějící zbytky jsou označeny pomlčkou. Číslování aminokyselinových zbytků začíná od první aminokyseliny proenzymu, zbytky signálního peptidu mají tudíž záporná čísla. Nukleotidová sekvence na obrázku je číslována • · · ·
stejným způsobem. Předpokládané místo iniciace translace (ATG) je označeno třemi šipkami a terminační kodón (TGA) je označen hvězdičkou. Aminoterminální sekvence kuřecího proenzymu a aktivního enzymu jsou vymezeny kosočtverci a šipkami. Nukleotidová a aminokyselinová sekvence kuřecí progelatinázy jsou uvedeny společně jako SEQ ID NO 29, zatímco kódující sekvence aminokyselinových zbytků je uvedena zvlášť pod číslem SEQ ID NO
30.
Templátem pro přípravu amplifikovaných úseků kuřecího MMP-2 byla buď cDNA, kódující maturovaný kuřecí MMP-2 polypeptid, a to v plné délce, poskytnutá Dr J. P. Quigley z the State University of New York, Stoney Brook, New York; nebo cDNA,připravená z celkové buněčné RNA, získané standardními technikami ze vzorku tkáně kuřecí chorionalantoidní membrány. Pro další použití byla cDNA získána pomocí MuLV reverzní transkriptázy a downstream primem, specifického pro 3' terminální nukleotidy, 5'ATTGAATTCTTCTACAGTTCA3' (SEQ ID NO 31), jehož 5' a 3' konce resp. jsou komplementární k nukleotidům 1932-1912 publikované sekvence kuřecího MMP-2. Reverzní polymerázová řetězová reakce (RT-PCR) byla provedena podle návodu výrobce GeneAmp RNA PCR Kitu (Perkin Elmer). Primer byl také navržen tak, aby obsahoval vnitřní restrikční místo pro EcoRI.
Z jednoho z výše uvedených cDNA templátů byla pomocí PCR, za použití 3 'primeru, uvedeného výše (SEQ ID NO 31), ve dvojici s jedním z řady 5' primerů uvedených níže, získána řada úseků Ckoncové oblasti kuřecího MMP-2, které na svém C-konci obsahovaly přirozený cysteinový zbytek v pozici 637. Amplifikované úseky kódují následující MMP-2 fúzní proteiny, jejichž sekvence odpovídají pozicím aminokyselinových zbytků, uvedeným na obr.
22A a 22B a dále pod č. SEQ ID NO 30: 1) 203-637, 2) 274-637, 3) 292-637, 4) 410-637 a 5) 445-637. Upstream nebo-li 5' primery pro amplifikaci nukleotidových úseků, kódujících výše uvedené MMP-2 fúzní proteiny, byly navrženy tak, aby kódovaly 3' počátek polypeptidu od pomocí PCR vytvořeného interního BamHI restrikčního místa, umožňujícího přímou ligaci do expresních vektorů pGEX-ΙλΤ nebo pGEX-3X. Mezi 5' primery patří následující sekvence, jejichž 5' a 3' konce odpovídají uvedeným 5' a 3' nukleotidový, pozicím v sekvenci kuřecího MMP-2, která je uvedena na obrázku 22A a 22B (pro každý primer je uvedena pozice aminokyseliny odpovídající počátku): 1) nukleotidy 599-619, kódující počátek v pozici 203, 5'ATGGGATCCACTGCAAATTTC3' (SEQ ID NO 32), 2) nukleotidy 809-830, kódující počátek v pozici 274, 5'GCCGGATCCATGACCAGTGTA3' (SEQ ID NO 33), 3)
nukleotidy 863-883, kódující počátek v pozici 292,
5 'GTGGGATCCCTGAAGACTATG3' (SEQ ID NO 34), 4)
nukleotidy 1217-1237, kódující počátek v pozici 410,
5 'AGGGGATCCTTAAGGGGATTC3' (SEQ ID NO 35) c i 5)
nukleotidy 1325-1345, kódující počátek v pozici 445,
5OTCGGATCCTCTGCAAGCACG3' (SEQ ID NO 36).
Uvedené úseky templátové cDNA byly amplifikovány ve 35 cyklech (při annealingové teplotě 55 °C) podle návodu výrobce Expand High Fidelity PCR Systému (Boehringer Mannheim). Výsledné PCR produkty byly purifikovány elektroforézou v gelu, štěpeny restrikčními enzymy BamHI a EcoRI a znovu přečištěny před ligaci do jednoho z vektorů pGEX-ΙλΤ nebo pGEX-3X (Pharmacia Biotech, Uppsala, Švédsko). Vektor byl před ligaci stejně jako fragment štěpen a defosforylován. Plazmid byl vybrán na základě požadovaného čtecího rámce amplifikovaného produktu.
·< ·* • #
J»í· ► « · « • fe ··
Kompetentní buňky E. coli BSJ62 nebo BL21 byly jednotlivě transformovány připravenými konstrukty pomocí tepelného šoku. Výsledné kolonie byly testovány na přítomnost jednotlivých plazmidů, kódujících MMP-2 fúzní protein, pomocí PCR. U pozitivních kolonií byla úplnost vložené kódující sekvence ověřena dideoxy sekvenací. Navíc byla úspěšnost transformace ověřena expresí GST-MMP-2 fúzního proteinu odpovídající velikosti. Purifikace všech rekombinantních GST-MMP-2 fúzních proteinů byla provedena, za použití IPTG- indukovaných kultur v log-fázi, v podstatě tak, jak je popsána v návodu od výrobce GST Gene Fusion Systému (Pharmacia Biotech). Krátce, sklizené bakterie byly lyžovány sonikací a inkubovány s detergentem až do projasnění lyzátu. Rekombinantní protein byl imobilizován na sefarosa 4Bglutathionu (Pharmacia Biotech). Po řádném promytí byl zachycený fúzní protein eluován z afinitní matrix 10 mM redukovaným glutathionem v 50 mM Tris-HCl, pH 8,0 a dále byl dialyzován proti PBS, za účelem odstranění zbytků glutathionu před dalším použitím. Výsledkem dosavadních pokusů o přípravu fúzních proteinů mezi zbytky 445 a 637 kuřecího MMP-2, které obsahovaly pouze jeden kódovaný cysteinový zbytek, byly nerozpustné produkty. Proto byly v některých případech za účelem přípravy dalších rozpustných MMP-2 fúzních proteinů, odvozených od C-koncového úseku MMP2, který neobsahuje vnitřní terminální cysteinový zbytek, tak jak to bylo ukázáno u dříve popsaného fúzního proteinu, do amplifikovaných MMP-2 úseků vneseny sekvence, kódující cysteinový zbytek. Cysteinové zbytky jsou přirozeně v kuřecí MPP2 sekvenci přítomny v pozicích 446 a 637. V lidské sekvenci tomu odpovídají pozice 440 a 631. Byly tedy navrženy takové fúzní proteiny, které obsahují vložený terminální cysteinový zbytek na C69 ·· ·«»· ·· ·* nebo N-konci odpovídající sekvence kuřecího MMP-2, tak aby se mohl tvořit disulfidický můstek s přirozeně se vyskytujícím cysteinem na druhém konci sekvence tak, jak je to konstruktem požadováno.
V souladu se zmíněnými požadavky byly navrženy oligonukleotidové primery, které umožnily amplifikaci Cterminálních úseků kuřecího MMP-2, vhodných pro expresi rozpustných MMP-2/GST fúzních proteinů. Amplifikované Cterminální úseky kuřecího MMP-2 zahrnují následující kódující úseky aminokyselinové sekvence: 445-518, 445-552, 516-637 a 549639. U fúzních proteinů obsahujících zbytek 517, byl přirozený tyrozinový zbytek nahrazen cysteinem, aby byl umožněn vznik disulfidické vazby s cysteinovým zbytkem v pozici 446 nebo 637. U fúzních proteinů obsahujících zbytek 551, byl cysteinem nahrazen přirozeně kódovaný tryptofanový zbytek, aby byl umožněn vznik disulfidického můstku s cysteinovým zbytkem v pozici 446 nebo 637.
Krátce, konstrukt pGEX-3X plazmidu, nesoucí rekombinantní GSTMMP-2 (410-637) fúzní protein, připravený podle výše zmíněného postupu, byl použit jako templát pro PCR amplifikaci, provedenou podle protokolu výrobce Expand High Fidelity PCR Kit (Boehringer Mannheim). Pro amplifikaci byl použit soubor oligonukleotidových primerů, jejichž sekvence byla odvozena od publikované sekvence kuřecího MMP-2 (také uvedené na obr. 22A a 22B ). Jeden upstream primer, navržený tak, aby kódoval počátek kuřecího MMP-2 proteinu v pozici 445 za vnitřním restrikčním místem BamHI, vytvořeným pro inzerci do vektoru pGEX-3X GST, měl nukleotidovou sekvenci (5'CTCGGATCCTCTGCAAGCACG3' (SEQ ID NO 37)). 5'a 3'konce tohoto primeru odpovídají pozicím 1325• ·
1345 zobrazené sekvence kuřecího MMP-2. Druhý upstream primer, navržený tak, aby kódoval počátek kuřecího MMP-2 proteinu v pozici 516 za vytvořeným vnitřním restrikčním místem BamHI pro inzerci do vektoru pGEX-ΙλΤ GST, a aby kódoval cysteinový zbytek v pozici 517, měl nukleotidovou sekvenci (5'GCAGGATCCGAGTGCTGGGTTTATAC3' (SEQ ID NO 38)). 5'a 3'konce tohoto primeru odpovídají pozicím 1537-1562 zobrazené sekvence kuřecího MMP-2. Třetí upstream primer, navržený tak, aby kódoval počátek kuřecího MMP-2 proteinu v pozici 549 za vytvořeným vnitřním restrikčním místem EcoRI pro inzerci do vektoru pGEX-ΙλΤ GST, a aby kódoval cysteinový zbytek v pozici 551, měl nukleotidovou sekvenci (5'GCAGAATTCAACTGTGGCAGAAACAAG3' (SEQ ID NO 39)). 5'a 3 konce tohoto primeru jednotlivě odpovídají pozicím 16391665 zobrazené sekvence kuřecího MMP-2 .
Tyto upstream primery byly jednotlivě použity s jedním z následujících downstream primerů, pro tvorbu výše popsaných úseků C-terminální domény kuřecího MMP-2. První dowstream primer („antisense“), navržený tak, aby kódoval místo terminace kuřecího MMP-2 proteinu v pozici 518, dále aby kódoval cysteinový zbytek v pozici 517 a aby obsahoval vnitřní restrikční místo EcoRI pro inzerci do GST vektoru, měl nukleotidovou sekvenci (5'GTAGAATTCCAGCACTCATTTCCTGC3' (SEQ ID NO 40). 5'a 3'konce tohoto primeru resp., psaného ve směru 5'-3', jsou částečně komplementární s pozicemi 1562-1537 sekvence kuřecího MMP-2. Druhý dowstream primer, navržený tak, aby kódoval místo terminace kuřecího MMP-2 proteinu v pozici 552, aby kódoval cysteinový zbytek v pozici 551 a aby obsahoval vnitřní restrikční místo EcoRI pro inzerci do GST vektoru, měl nukleotidovou • ·
7] sekvenci (5'TCTGAATTCTGCCACAGTTGAAGG3' (SEQ ID NO 41)). 5'a 3'konce tohoto primeru, psaného ve směru 5'=3', jsou částečně komplementární s pozicemi 1666=1643 resp. sekvence kuřecího MMP-2. Třetí dowstream primer („antisense“), navržený tak, aby kódoval místo terminace kuřecího MMP-2 proteinu v pozici 637 a aby obsahoval vnitřní restrikční místo EcoRI pro inzerci do GST vektoru, měl nukleotidovou sekvenci (5 'ATTGAATTCTTCTACAGTTCA3' (SEQ ID NO 42)). 5'a
3'konce tohoto primem, psaného ve směru 5'=3', jsou částečně komplementární s pozicemi 1932 = 1912 sekvence kuřecího MMP-2. Úseky C-terminální části kuřecího MMP-2, vymezené výše jeden piroí alingové teplotě 5í PCR System ( amplifikace byly pro přípravu GST fúzního je rovněž ě jako E. coli, kmen BL21.
šoku.
OClJl
GST-fúzní
GST sán výše, za vzniku dalších GST=MMP=2 fúzních
MMP=2,
445=637 a peptid 66203 (SEO receptorů («vPs
vazebnou aktivitou «vPs. MMP-2 (1=445) a kontrolní peptid 69601 si testované LIJ proteiny 7 = 1 (aminokyselinové zbytky 274=637), 10=1
IT
IP=2 GST fúzní proteiny,
KCl é úseky
ÍOV1
GST fúzní proteiny byly vytvořeny pomocí PCR,
Institute, Bethesda, MO. Sekvence upstream 5' primerú byly (Collier et al., J. Biol. Chem., 263 : 6579=6587 (1988)) a byly • · · · • · · • · · »
umožňující místem EcoRI pro inzerci do vektoru pGEX-ΙλΤ GST měl nukleotidovou sekvenci (5'GATGAATTCTACTGCAAGTT3' (SEQ ID NO 43)). Sto 3'konce tohoto primerů odpovídají pozicím 685=704 sekvence otevřeného čtecího rámce lidského MMP=2.
místem EcoRI, určeným pro inzerci do vektoru pGEX-ΙλΤ GST měl nukleotidovou sekvenci (5 'GACTGAATTCATCTGCAAACA3 ’ (SEQ ID NO 44)). Sto 3'konce tohoto primerů odpovídají pozicím 13921412 resp. sekvence otevřeného čtecího rámce lidského MMP-2. Každý z těchto primerů byl jednotlivě použit s downstream primerem, který má Sto 3'konce komplementární s bázemi 1998 resp. 1978 sekvence lidského MMP-2, a který končí distálně od otevřeného čtecího rámce MMP-2 a ukončuje protein za aminokyselinovým zbytkem 631. Expresí amplifikovaných produktů vznikly fúzní proteiny obsahující části sekvence lidského MMP-2, a to aminokyselinové zbytky 203-631 (SEQ ID NO 45) a 439-631 (SEQ ID NO 18).
purifikovány před ligaci do plazmidu pGEX-ΙλΤ. Plazmid byl před byly transtormovany tak, jak je popsáno připraveny ještě další lidské MMP-2 fúzní proteiny, obsahující • · aminokyselinové zbytky 410=631 (SEQ ID NO 17), 439-512 (SEQ
ID NO 19), 439=546 (SEQ ID NO 20), 510=631 (SEQ ID NO 21) a
543=631 (SEQ ID NO 22).
Syntetické peptidy, připravené v příkladu 1 spolu s MMP=2 fúzními proteiny, popsanými výše, byly dále testovány měřením jejich schopnosti antagonizovat vazebnou aktivitu receptorů ανβ3 a αι^β3, v pokusech s purifikovanými ligandy a receptory. Metody pro
Nati. Acad. Sci., USA, 90 : 10003 = 10007 (1993), Smith et ah, J. Biol. Chem., 265 : 11008 = 11013 (1990) a Pfaff et ah, J. Biol. Chem., 269 : 20233=20238 (1994).
Zde je popsána metoda identifikace antagonistů v testu vazby ligand=receptor, kde je receptor fixován na pevný nosič a ligand a antagonista jsou v rozpustné fázi. Dále je popsán podobný pokus, ve kterém je ovšem ligand fixován na pevný nosič a receptor a antagonisté jsou rozpus
Krátce, vybrané purifikované integriny byly fixovány na povrch Titertek mikrotitračních jamek v koncentrací 50 nanogramů (ng) na lígand=receptor, je běžnou metodou, která je odborníkům dobře igr íodin pří 4 °C. Při
125 ° ° 125 z tabulky 1 na schopnost blokovat vazbu Dvitronektinu nebo 1= fibrinogenu na integrinové receptory ανβ3 a «πΒβ3.
Ačkoliv tyto ligandy vykazují optimální schopnost vazby na • · · · · · • · konkrétní integrim, vitronektin na avps a fibrinogen na «nbPa, vazby fibrinogenu na jeden z receptorů, umožňují přesné určení množství peptidů (v miKromoiieen (pj
li oncentracích InM a vazba byla provedena
značeného fibrinogenu na imobilizované receptory αγββ, nebo «nbps cyklické peptidy, uvedené v tabulce 1 jsou vysoce reprodukovatelná s chybou typicky nižší než 11%. Hodnoty IC50 v mikromolech (IC50
TABULKA ανβ^ (HG§® μϊΠ) 1,96 ± 0,62 0,05 ± 0,001 0,885 ± 0,16 0,05 ± 0,001 57,45 ± 7,84 1,05 ± 0,07 0,395 ± 0,21 ttnbPs PU§® pRH) 14,95 ± 7,84 0,525 ± 0,10 100 ± 0,001 0,26 ± 0,056 100 ± 0,001 0,63 ± 0,18 0,055 ± 0,007
Z tabulky je zřejmé, že cyklické peptidy 62181, 62184, 62185 a 62187 nesoucí RGD sekvenci nebo RGD odvozenou sekvencí a mající každý alespoň jeden D-aminokyselinový zbytek, přednostně
Πί nedostatečně účinné ;enu na avpsmi na otvP3 mn, (XiibP3 a ttsPn podjednotky receptorů, «nb podjednotky receptorů nebo od aminokyselinové sekvence vitronektinového ligandů. Sekvence lineárních peptidů 62880 (VN-odvozená aminokyselinová sekvence 35-49), 62411 (aminokyselinová sekvence odvozená od av podjednotky 676-687), 62503 (aminokyselinová sekvence odvozená od av podjednotky 655-667) a 62502 (aminokyselinová sekvence odvozená od aut podjednotky 296-306) jsou uvedeny v tabulce 1. Každý z těchto peptidů byl použit pro zvláštní analýzu inhibice vazby buď vitronektinu (VN) nebo fibrinogenu (FG) na buď «nbps nebo avps receptory. Hodnoty IC50 v míkromolech (μΜ), získané z jednotlivých pokusů, jsou zaznamenány v tabulce 3.
TABULKA 3
Peptid č. ttnbPs IC50 FG (μΜ) VN Οίγββ ICso FG (μΜ) VN
62880 4,2 0,98 <0,1 0,5
62411 >100 >100 >100 >100
62503 >100 >100 >100 >100
62502 90 5 >100 >100
kterých byla detekce vazby nebo inhibice prováděna metodou ELISA s použitím kozí=anti=králičí IgG protilátky konjugované s peroxidázou. Bylo prokázáno, že se ligandy VN, MMP-2 a fibronektin v koncentracích 5=50 ng na jamku (ligandy jsou seřazeny podle účinnosti) váží na ímobilizované αγβ3 receptory, zatímco u kolagenu vazba prokázána nebyla. Schopnost inhibovat vazbu MMP= peptidů 69601 (SEQ IB NO 6) a 62203 (SEQ IB NO 5). Pouze peptid 66203 byl účinným inhibitorem vazby kteréhokoliv substrátu na αγβ3 receptor, zatímco kontrolní peptid 69601 neprokázal vůbec
^rinove receptory byla potvrzena
-z neváže se na «nbps receptory (300 vázáných cpm ku přibližně 10
nebo = Z Jílld GcvPS
23. GST-CT] =2 (445=637) uvedeného popisu, značený GST-MAID inhiboval vazbu
GST vázaného cpm). MMP=2 fúzní protein CTMMP-2 (274=637) mi (2=4) označený na jako [125I]GST2=4 se vázal na «νβ3, ale nikoliv na «nbPs, zatímco
CTMMP-2 (10-1), označený na obrázku 24 iako [125I1GST10GT2-4
receptor,
• · · · ανΡ3·
Na kuřecí chorionalantoidní membráně (CAM) může být indukována angiogeneze po ukončení přirozené embryonální angiogeneze, která dala vzniknout maturovaným krevním cévám. Bylo prokázáno, že nos cytokiny, nebo s některými fragmenty nádorové tkáně Leibovich et al., Nátuře, 329: 630 (1987) a Ausprunk et al., Am. J. Pathol., 79: 579 (1975). Vzorky CAM tkání byly připraveny z kuřecích embryí a pro naši jak je to popsáno v příkladech 6 resp. 7.
Deset dní stará kuřecí embrya byla získána z Mclntyre Poultry
Wli-VOll IL W 11 V, v ZLJ >5UJ. <U1 1111 v JVfc. Ulili <U1 A 3
Division of Enerson Electrc Co., Racine, otvor vytvořen podtlak, což mělo za následek odtržení CAM
1,U (cm) centimetr x l,tn k CAM, uložené pod ním.
n dnů embryogeneze, tedy v období, charakterizovaném aktivní • · · · • · « · neovaskularizaci, a to bez dalších terapeutických zásahů, tj. je použit jako model pro hodnocení vlivu na embryonální neovaskularizaci, a nebo je takový preparát použit až po 10 dnech embryogeneze, tj. ve stadiu kdy angiogeneze ustala. Tento druhý preparát byl použit podle navrhovaného vynálezu pro indukci obnovené angiogeneze v odpověď na působení cytokinů nebo kontakt s nádorovou tkání (viz. příklad 6).
B. Histologie CAM
Aby bylo možno analyzovat mikroskopickou strukturu CAM kuřecích embryí a/nebo lidských nádorů, které byly resekovány z kuřecích embryí, jak jeto popsáno v příkladu 8, byly CAM i vzorky nádorů upraveny pro přípravu kryo-řezů tak jak je to popsáno v příkladu 3A. Šest mikronů silné řezy byly nařezány ze zmrazených bločků na kryostatovém mikrotomu a tyto řezy byly dále analyzovány pomocí imunofluorescence.
Na obr. 4 je znázorněna typická mikrofotografie oblasti bez krevních cév v neošetřené 10 dní staré CAM. Jelikož v tomto období embryogeneze angiogeneze CAM systému ustává, je zmíněný systém v tomto vynálezu vhodný pro stimulaci tvorby nových cév v oblastech CAM, kde v současné době jakékoliv cévy chybí. Angiogeneze probíhá prorůstáním z již existujících cév v sousedních oblastech.
C. Rozložení integrinů v CAM určené pomocí imunofluorescence.
Pro zviditelnění tkáňové distribuce integrinových receptorů přítomných v CAM tkáni byly 6 μιη tenké kryostatové řezy nádorové tkáně i kuřecí embryonální CAM tkáně fixovány acetonem po dobu
Po sekund a poté imunonuore
X Cell· Biol· 107: 2351 (1988)), a nro kontrolv a nebo LM609 protilátkou značenou rhodaminem (Tágo), ředěnou 1:250, čímž je
analyzovány Zeissovým imunofluorescenčním mikroskopem.
[munonuoreseenem , ze maturované ní tu exprimují βι podjednotku integrinů (obr. 5A). Naopak na seriálních tkáňových řezech zobrazených na obr. 5A je vidět, že s LM609 nebyla zaznamenána žádná imunologická odpověď (obr. 5B). Tudíž integrin avpu v následujících příkladech, rostoucí cévy, ať již rostoucí v důsledku normálně probíhající embryogeneze, nebo po indukci cytokiny nebo nádorem, vždy exprimují na svém povrchu «vPs. Ovšem byla-li
Iffi povrchu rostoucích krevním ? je
cev cim u an_ stovací systém pří eneze, viz.
1C1 * « « · ♦ · 4 « «· v · · » * * * »
3Ώ1Β13 předtím úspěšně ex’§{ s naoorem. vysieoiKy poooone sewKiivni asocidci iviivif=z a uvP3 byly získány na CAM modelu i v případě CS-1 melanomu s asociovanými ανβ3 receptory, ale nikoliv s CSC buňkami nogeneze
A= Ani rm
Jak jíž bylo řečeno, angiogeneze může být indukována cytokiny indukována růstovými faktory, které papíru (Whatman Filter páper No. 1) o velikosti 5 milimetrů (mm) x mm, který byl nasycen Hanks Balanced Salt Solution (HBSS, GIBCO, Grand Island, NY) nebo HBSS, který obsahoval 150 nanogramů na mililitr (ng/ml) rekombinantního základního ···* ·* ···· tf 4 9 4 »
99
» » 4 » • « 4 9 4 4 » 4 4 9 9 • 9 4 r « » 4 ·< 44 49 94
MA) na CAM kuřecího embrya, , do oblasti bez cev a indukci úspěšně intravenózním podání antagonisty, byla angiogeneze indukována
, které popsáno v příkladu 5C, 10 pg/ml buď antAPi monoklonáiní protilátky CSAT nebo LM609.
Imunofluorescenční mikrofotografíe na obrázku 5C ukazuje zvýšenou expresi avPs během bFGF indukované angiogeneze na kuřecí CAM ve srovnání § chybějící expresí avPs receptoru na neošetřené kuřecí CAM, která je znázorněna na obr. 5B. otvPs
Cil h také
Relativní exprese «vPs a Pi integrínů byla během bFGF indukované an pomocí Zeissova laserového konfokálního a 15 cév obarvených CSAT (průměrná velikost
1200 sq mm , rozpětí od 350 do 3:
na mny
• · • · • · · · vztažena na libovolnou jednotku plochy cévy ± standardní odchylka (SE).
Výsledky, vynesené v grafu na obrázku 6 ukazují, že na CAM ošetřených bFGF byl detekován významně intenzivnější signál ανβ3 (4 x vyšší) (určeno Wilcoxonovým testem náhodných součtů P<0,0001) oproti neošetřené tkáni, zatímco barvení βι se navzájem mezi ošetřenou a neošetřenou tkání nelišilo.
Pokusy s CAM byly dále použity pro testování vlivu dalšího silného induktoru angiogeneze, tumor nekrotizujícího faktoru a (TNFa), na expresi βι a β3 integrinů. Disky filtreačního papíru, napuštěné bFGF nebo TNFa byly umístěny na CAM tkáň 10 dnů starého embrya. Bylo zjištěno, že oba faktory indukují po 72 hodinách lokální angiogenezi.
Výsledky jsou vidět na mikrofotografiích CAM buď neošetřené (obr. 7A), nebo ošetřené bFGF (obr. 7B) a nebo ošetřené TNFa (obr. 7C). Krevní cévy jsou snadno viditelné na obou ošetřených preparátech (bFGF i TNFa), ale nejsou patrné na neošetřeném vzorku tkáně, je tedy zřejmé, že povrchová aplikace růstového faktoru nebo cytokinů vede k indukci angiogeneze z maturovaných cév v odpovídající oblasti do oblastí, ve kterých původně cévy nebyly. Lze říci, že ve srovnání s bFGF indukovanou angiogenezi a s tím spojenou expresí ανβ3 (viz. obr. 5C) vykazuje TNFa srovnatelné výsledky.
Z výše uvedených poznatků je zřejmé, že jak u člověka, taki u kuřete vykazují cévy, účastnící se angiogeneze zvýšenou expresi ανβ3· V souladu s tím může být exprese ανβ3 na endoteliálních buňkách indukována různými cytokiny in vitro, tak jak to popsal Janat et al., J. Cell Physiol., 151: 588 (1992); Enenstein et al., Exp.
« ·
Cell Res., 203: 499 (1992) a Swerlick et al., J. Invest. Derm., 99:
nogeneze
Pro hodnocení účinků inhibitorů angiogeneze na přirozenou kuřecího embrya tak, jak to 1 s© OCVP3
Tkán /C.
C“ Angiogeneze indukovaná nádorem.
Pro zkoumání úlohy ανβ3 v angiogenezi indukované nádorem se v pokusech s CAM používají fragmenty různých ouPs-negatívníefa lidských melanomů a karcinomů, které dříve vyrostly a byly
Angiogeneze byla v CAM systému indukována přímým přiložením nádorového fragmentu na CAM. Příprava CAM kuřecího embrya je lidského karcinomu pankreatu linie FG (Cheresh et. al. Cell 58; 94 • · · ·
953, 1989), a nebo buňky linie HEp3 lidského karcinomu hrtanu, avp3 ne^
UCLAP-3, buňky lidského karcinomu pankreatu linie FG, a nebo buňky linie HEp3 lidského karcinomu hrtanu, všechny avp3 negativní byly použity pro přípravu solidního nádoru lidského původu na CAM kuřecích embryí. Buněčná suspenze 8 x 106 M21-L, UCLAP-3 a FB, nebo 5 x 105 HEp3 buněk byla nejprve aplikována na CAM v celkovém objemu 30 μΐ HBSS. Okénka byla utěsněna páskou a embrya byla inkubována po dobu 7 dní. Tím byl umožněn růst lidských nádorových lézí. Po 7 dnech byly nádory z CAM teď tkáň CAM. Nádory byly nařezány na fragmenty o hmotnosti 50 mg až 55 mg pro použití v testech angiogeneze nebo nádorového růstu. Tyto nádorové fragmenty byly umístěny na nový soubor CAM 10-tí denních embryí, opět do oblasti bez cév, viz příklad 6A.
avP3 expresi mAb LM609 sáno v
Nebylo pozor 'U
Takto připravené vzorky nádorové tkáně byly postupně zpracovány naaorem
CAM s nádory byly také dále zpracovány (popis viz. příklady 8, 9 a 12). V těchto pokusech byl stanovován účinek protilátek a peptidů na regresi nádoru a apoptózu angiogenních krevních cév a η
stanovená testem na CAM.
navozené působením růstového • · · · · · »
Aby bylo možné určit, zda hrají ανβ3 receptory aktivní roli v angiogenezí, byl učiněn následující pokus: na CAM byly umístěny k jednotlivým vzorkům přidány monoklonální protilátky (mAb) LM609 (mAb specifická pro ανβ3), CSAT (specifická p-ro βι), a nebo P3G2, nebo P1F6 (obě specifické pro ayps)·
Angiogeneze byla v CAM desetidenních kuřecích embryí indukována pomocí disků z filtračního papíru, nasycených bFGF. Na disky bylo dále aplikováno 50 ml HBSS s obsahem 25 mg mAb v celkovém objemu 25 μΐ sterilního HBSS/disk v časech 0, 24 a 48 hodin. Po 72 hodinách byly CAM sklizeny, umístěny v 35 mm petriho miskách a promyty 1 ml fosfátem pufrovaného roztoku NaCl. Spodní strana filtračního papíru a CAM tkáň byly dvěma nezávislými badateli. Inhibice angiogeneze byla považována za významnou, když u CAM došlo k > 50% snížení infiltrace cév protilátku, s 6-7 embryi pro každé testovací podmínky.
Výsledky účinků působení mAB na angiogenezí vyvolanou bFGF jsou zobrazeny na obr. 8A a 8B. Neošetřená CAM bez krevních cév je znázorněna na obr. 8A, na obr. 8B je patrná indukce růstu »C-8E jsou užne /5 • · · · ·· ·· • · · · · • · · · • · ··· ··· • · · ► · · · ·
LM609 vykázalo > 50% inhibici angiogeneze (viz. obr. 8E) a u
CAM ošetřené mAb CSAT (obr.
Shodné výsledky byly získány v případě, kdy byla angiogeneze indukována pomocí TNFa. Dále byl testován vliv již zmíněných cev.
fil ý vliv (ookus byl hodnocen vizuálně pomoci stereo mikroskopu. Z výše zmíněných dat vyplývá, že mAb LM609 selektivně inhibuje pouze nově
7A2 a 7E2' stanoven vliv byly připraveny tak, jak to bylo popsáno v příkladu 1 a byly aplikovány v množství 80 gg peptidů v celkovém použitém množství ihned a dále v intervalech 24 a 48 hodin. Po 72 hodinách byl pokus • ♦ • · « » * · · · * · ,Ό obr. 9A je vidět, vzniklou působením bFGF žádný vliv. Naopak po aplikaci filtru, nasyceného roztokem § obsahem cyklického RGD peptidu 62814, zas ie v cévami, vzdálené od původního terčíku nasyceného růstovým faktorem, ů bylo dosaženo i při povrchové aplikaci syntetických peptidů. Inhibiční účinky peptidů na angiogenezi jsou tedy lokálně omezeny do míst, ve kterýcn byla angiogeneze vyvolána působením růstového faktoru, a dále tyto peptidy neovlivňují již primárně existující krevní cévy.
Podobné experimenty byly provedeny i s dalšími syntetickými nu íragmenty.
tkání, jejichž účelem bylo zjistit biologické účinky MMP=2 peptidových fragmentů na angiogenezi. Pro tyto poku filtračního papíru, použité pro indukci angiogeneze, byly po dobu 10 min. syceny roztokem bFGF v HBS o koncentraci 1,0 pg/ml. Disky byly poté umístěny na CAM tkáň do oblasti se sníženou přirozenou • · ·· • · · • · · • · · • · · · • · · * papíru 1 x denně aplikovány buď CTMMP-2 (410=637) fúzní protein, připravený podle výše uvedeného popisu, nebo kontrolní fúzní protein asociovaný s GST receptorem (RAP) (1,5 p.g ve 30 μΐ HBSS). na závěr experimentu bulo kuřecí embryo usmrceno a disk filtračního papíru a pod ním se nacházející CAM tkáň byly analyzovány pomocí stereo mikroskopu. Angiogeneze byla kvantifikována sečtením počtu větvení krevních cév v oblasti pod diskem filtračního papíru. Větvení krevních cév je považováno za důkaz probíhající angiogeneze.
Kvantifikace byla prováděna formou dvojitě slepých pokusů nejméně dvěma nezávislými prezentovány jako index angiogeneze, tedy číslo, ktere udava počet větvení (stimulovaného bFGF) minus kontrolní počet větvení (bez jakékoliv stimulace) na jeden disk. Běžně byly pokusy prováděny a 27.
Na obr. 25 je série čtyř fotografií (A-B), které porovnávají inhibici angiogeneze v přítomnosti GTMMP-2 fúzního proteinu (CTMMP=2 410=637) (25C a 25D) s působením kontrolního GST fúzního proteinu (žádná inhibice.; obr. 25A a 25B). Na obr. 26 a 27 jsou sloupcové grafy zobrazující index angiogeneze v CAM testech obrázku 27 t rímentů (#1 a #2) s použitím CTMMP=2 (410=637).
Data, získaná z výše zmíněných experimentů naznačují, že CTMMP= • · · · • · angiogeneze indukované růstovým faktorem mi aplikace monoklonálních protilátek na angiogenezi, indukovanou růstovým faktorem. Vzorky CAM kuřecích embryí byly připraveny v zásadě stejným způsobem, jaký je popsán v příkladu 7A, jen prosvěcovaní skořápky
a na CAM byly aplikovány disky filtračního papíru přesně podle pás
ru.
ícím textu) byl· iy jeniou c.
ΜΙ embrya skořápce ru po
CAM hodin.
v CAM nebo v nádorové tkáni. Tkáň byla nejprve intravenozně inokulována LM609. Fixované vzorky tkáně byly blokovány 2,5% BSA v HBSS po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě a poté barveny
an fluorescenčním mikroskopem. Výsledky pokusu s intravenózní aplikací protilátky na krevní cévy, indukované ve vzorku CAM bFGF jsou znázorněny na obrázcích 10A-C. Na obrázku 10A je
PrGr.
mtraven protilátky, n na bFGF receptorů působením specifické anti-avPs protilátky LM609. Vzhledem k tomu, že blokace avPs nemá za následek inhibici
2o Působení syntetickými peptidy.
V následujícím experimentu byly použity CAM, ve kterých byla indukována angiogeneze 1=2 pg/ml bFGF, tak jak bylo popsáno výše. 18 hodin po indukci angiogeneze byly do vzorků CAM jednotlivě intravenozně aplikovány syntetické peptidy 69601 > · · ' • 9 ··
ších 36 až 40
(SEQ ID NO 15) na angiogenezi, Indukovanou v CAM působením brOl·. Peptid byl testován v dávkách od 10 gg/embryo do A gg/embryo. T ůsobem, jaký byl popsán »011
Π 001
ά
DDii a
ibovaly angiogenezi
V dalším pokusu byla antí-angiogenní aktivita peptidu 85189
203. Test byl prováděn stejným způsobem, jaký byl popsán výše. Použitá dávka peptidu
, ve
inhibiční účinek různý v koncentraci 100 gg/embryo.
, a to buď cév, odpovídající jednotlivým sloučeninám 85189 a 121974 byl 30 a
angiogeneze peptidy, připravené v příkladu 1, tj. do cévního systému CAM, o vliv hici na základě
3h Působení fragmenty MMP-2.
Výše popsaným způsobem byly testovány i účinky MMP-2 fúzních proteinů CTMMP-2 (2=4) (nazývaného také CTMMP-2 (445=467)), a CTMMP-2 (10-1) (nazývaného také CTMMP=2 (274-637). Test byl prováděn stejným způsobem, jaký byl popsán výše. 50 pg fúzního proteinu bylo podáno kuřecím embryím, u kterých byla angiogeneze indukována působením bFGF. Účinky fúzního proteinu byly hodnoceny 24, 48 a 72 hodin po podání.
Výsledky pokusu získané pro tyto vybrané časové úseky jsou znázorněny na obrázcích 31A-L. Angiogeneze byla stanovena fotograficky pro podmínky pokusu bez jakéhokoliv ošetření, ošetření bFGF, bFGF s následným podáním CTMMP-2 (2-4) (označeno jako bFGF + MAIB; MAID = angiogenezi inhibující doména MMP-2) a bFGF +CTMMP-2 (10-1) (označený jako bFGF + kontrolní peptid). Rozsáhlá angiogeneze, způsobená ošetřením tkáně bFGF byla po 48 a 72 hodinách téměř úplně inhibována pouze po aplikaci proteinu CTMMP-2 (2=4). Rozsah inhibice, vyvolané CTMMP-2 (2=4) byl větší než inhibice, způsobená CTMMP-2 (10=1), ovšem i tento protein vykazoval in vivo jakousi anti angiogenní aktivitu.
• · · · • · · · protein,
pogeneze. Frotemy byly na účastní embryonální
LívlbUv na růst Frevmcn cev de novo wtilátkou byl umístěn na CAM 6 dnů
Bylo prokázáno, že v podmínkách experimentu protilátka LM609 brání růstu cév (obr. 11C), zatímco protilátky CSAT (obr. 11 A) ani
P3G2 (obr. 11B) na růst cév inhibiční vliv nemají. Z uvedených přidaných za účelem in an?
hvnteticke peptidy mi αγβ3 antagonistů, LM609 a různých dalších peptidů na embryonální
ianomu =L„ aplikovány na fragmenty nádoru, a to v množství 25 gg v celkovém
Monoklonální protilátky byly znovu stejným způsobem přidány po 24 a dále po 48 hodinách. Po 72 hodinách byly nádor a přilehlá
CAM tkáň analyzovány způsobem, který byl popsán v příkladu 7A1.
kultivované Wl-L Punky, ktere neexpnmujji αγρ3 integnn (keJ do CAM 10 dnů starého kuřecího embrya. Tyto αγβ3 negativní fragmenty indukovaly pouze v přítomnosti pufru, nebo mAb CSAT níi avps), velmi silnou neovaskularizaci.
Naopak mAb LM609 (anti-avPs) zabránila infiltraci většiny cév do nádorové tkáně i do přilehlé CAM.
Účinek monoklonálních protilátek na nádorem indukovanou angiogenezi byl kvantifikován tak, že byly pomocí stereo mikroskopu sečteny krevní cévy vstupující z CAM do nádoru. Kvantifikace byla provedena dvojitě slepým způsobem dvěma nezávislými osobami. V každé skupině bylo testováno 12 CAM a každý pokus byl proveden 2 x. Data ve sloupcovém grafu na obr. 12 představují vždy průměrnou hodnotu ± SE.
Tato kvantitativní analýza, provedená Wilcoxonovým testem náhodných součtů, prokázala trojnásobnou redukci počtu cév vstupujících do nádoru po aplikaci mAb LM609 ve srovnání s nádory léčenými pouze pufrem, nebo pufrem spolu s mAb P3G2 nebo CSAT (P < 0,0001). Vzhledem k tomu, že M21-L nádory neexprimují αγββ integriny lze konstatovat, že mAb LM609 inhibuje angiogenezi přímým působením na krevní cévy a nikoliv působením na nádorové buňky. Tyto výsledky se shodují s výsledky histologické analýzy distribuce ανβ3 v nádorové tkáni (obr. 3A-3D), podle nichž je výskyt αγββ receptorů omezen na krevní cévy a v buňkách nádoru se nevyskytují.
2. Aplikace syntetických peptidů.
Syntetické peptidy, připravené podle příkladu 1, včetně peptidů odvozených od MMP-2 a fúzních proteinů, byly použity v testu inhibice nádorem indukované angiogeneze v CAM tkáni při povrchovém způsobu aplikace inhibitoru tak, jak byl popsán v předcházejícím příkladu. Vliv peptidů na životaschopnost krevních cév byl hodnocen stejným způsobem, jaký byl popsán výše.
• · * · • · · · · ·
ρπ protilátek na nádorem indukovanou angiogenezi (viz. poklad /tsi) při intravenózním způsobu podání protilátky. Nádory byly umístěny to bylo dkou. O 24 200 pg
ázejíeíeh ) 7 dnech
vliv
ísahei
62186, jsou zobrazeny na obr. 9A-9C. Na obr. 9A je vidět, že vliv.
tvorby krevních cév a sledovaná oblast zůstala bez vaskularizace (obr. 9B). Inhibiční účinky RGD peptidu jsou specifické a lokalizované, neboť nedošlo k žádné inhibici či poškození cév ve je intr;
, ani , nedošlo
CAM nebyly nikterak ovlivněny inhibujícím peptidem,
V ZMlLlLIELOj Wh WVJ, ustaiící z jiz maturo m inhib cev
Je pomstě, jsou inhibitory angiogeneze, v Ti v / li e c. tni i oblastí, což dokazuje nepoškozený cévní systém na obr. 9
Podobné pokusy byl
Al uvedenými v tabulce 1 a se (Ps-negativní) nádor. Po 24 hodinách růstu nádoru bylo do CAM intravenóznč aplikováno 50 pg fragmentu MMP-2, nazývaného
CTMMP-2 (2-4), připraveného podle příkladu 4A, v celkovém objemu 100 pl PBS. Po dalších šesti dnech byla stanovena hmotnost nádoru. Hmotnost nádorů, ošetřených CTMMP-2 (2=4) byla ve • · · · « · · *
PříMaKdl 8= Inhibice nádorového růstu pomocí αγβι antagonistů
Jak bylo popsáno v příkladu 7E1, byla, kromě vizuálního zhodnocení účinků anti-avPs antagonistů na angiogenezi, připravený podle příkladů óC a 7D. Na závěr sedmi denní inkubační doby byly nádory vyňaty z CAM a očištěny od zbytků CAM tkáně, dále byly promyty 1 ml PBS a byla stanovena suchá hmotnost
cmn &E) (Gladson a kol., J. Cl iT :
Ví zvetsern 25<
Výsledky pokusu s typickým lidským melanomem M21-L po povrchové aplikaci kontrolního pufru (HBSS), P3G2 (anti=avPs) byl testován na několika embryích, přičemž byla vždy určena průměrná hmotnost nádoru v miligramech (mg) a vypočtena • · tt · • « « «
101 ♦ tt J fc • · · • * · • · * • · * * tt· ·· směrodatná odchylka od průměru (SE), která je uvedena v závěru tabulky.
Embryo č 1
LM609
TABULKA 4 použitá mAb hmotnost nádoru (mg)
HBSS 108
152 216 270 109 174
P3G2 134
144
408
157 198 102 124
135 17 27 35 průměrná hmotnost nádoru
172 ± 26
171 ± 36 ± 13
aplikovaná mAb kontrola (pouze HBSS)
P3G2
LM609
Z tabulky vyplývá, že je-li lidský avp3-negativní melanomový nádor v CAM testu vystaven působení mAb LM609, dochází ke značnému poklesu hmotnosti nádoru ve srovnání s nádorem neléčeným; tj. ze 172 mg ± 26 na 52 mg ± 13. Protilátka P3G2 neměla na hmotnost nádoru žádný vliv. Lze tedy říci, ve shodě s předcházejícími příklady, že zablokování αγβ3 receptorů po povrchové aplikaci specifické 8ηίϊ-ανβ3 protilátky, má za následek snížení hmotnosti nádoru spolu s inhibici angiogeneze. Průměr nádoru po aplikaci P3G2 protilátky byl v průměru 8 mm až 1 cm. Nádory, na které byla aplikována protilátka LM609 měřily v průměru 2-3 mm.
Ve zmrazených řezech nádorů, ošetřených protilátkou P3G2 byla zachována původní buněčná architektura nádoru, zatímco nádory ošetřené LM609 postrádaly jakoukoliv organizovanou buněčnou strukturu. Je tedy zřejmé, že aktivita ανβ3 receptorů je pro αγβ3negativní nádor nezbytná, neboť umožňuje vyživování hmoty nádoru díky vývoji nových ανβ3-εχρπιη^ίϋίο1ι cév. Zablokováním ανβ3 receptorů αγβ3 antagonisty podle vynálezu dochází k inhibici angiogeneze v oblasti nádoru a tím i k ubývání hmoty nádoru.
B. Intravenózní aplikace inhibitorů.
Výsledné hmotnosti typického karcinomu (UCLAP-3) po intravenózní aplikaci kontrolního pufru (PBS; fosfátem pufrovaný roztok NaCl), CSAT (anti-βι) nebo LM609 (ηηΗ-αγβ3), jsou • · « ·
103 • ··· · · · · ··« · · · · · » ··· • · · · · · » «· * · ·· β · ·· ·» uvedeny v tabulce 5. Každý typ léčby byl testován na několika embryích, přičemž byla vždy určena průměrná hmotnost nádoru v miligramech (mg) a vypočtena směrodatná odchylka od průměru (SE), která je uvedena v závěru tabulky.
TABULKA 5
Embryo č. 1 použitá i PBS nAb hmotnost nádoru (mg) 101
2 80
3 67
4 90
1 CSAT 151
2 92
3 168
4 61
5 70
1 LM609 16
2 54
3 30
4 20
5 37
6 39
7 12
aplikovaná mAb průměrná hmotnost nádoru
kontrola (pouze PBS) 85 ± 7
CSAT 108 ± 22
LM609 30 ± 6
• · · · • · • · · ·
104
Z tabulky vyplývá, že je-li lidský otvP3-negativní karcinom v CAM testu vystaven působení mAb LM609, dochází ke značnému poklesu hmotnosti nádoru ve srovnání s nádorem neléčeným; tj. z 85 mg ± 7 na 30 mg ± 6. Protilátka CSAT neměla na hmotnost nádoru žádný vliv. Lze tedy říci, ve shodě s předcházejícím příkladem, že zablokování ανβ3 receptorů intravenozní aplikací specifické antiανβ3 protilátky, má za následek snížení hmotnosti nádoru spolu s inhibici angiogeneze. Navíc i růst lidského melanomu byl stejným způsobem inhibován intravenozní injekcí mAb LM609.
Příklad 9: Regrese růstu nádorové tkáně působením ανβ3 antagonistů stanovená pomocí testu s CAM.
Aby bylo ještě lépe posoudit vliv ανβ3 antagonistů na růst a přežívání nádorů, byly provedeny následující pokusy s fragmenty lidského melanomu, a s fragmenty karcinomů plic, slinivky a hrtanu, které byly transplantovány na CAM 10 dnů starých kuřecích embryí stejným způsobem, jaký byl popsán v příkladu 5A.
A. Intravenozní aplikace
1. Aplikace monoklonálních protilátek.
a) Aplikace protilátek LM609 (anti-o^3) a CSAT (anti-β]).
hodin po implantaci CAM fragmenty nádorů (o^3-negativního lidského melanomu M21-L, karcinomu slinivky břišní FG, lidského karcinomu plic UCLAP-3, nebo lidského karcinomu hrtanu HEp3) byla embryím intravenozní injekcí podána jedna dávka samotného PBS, nebo 300 pg/100 μΐ jedné z mAb LM609 (Αηίί-ανββ) nebo CSAT (anti-βι). Nádory byly ponechány v klidu po dobu dalších šesti dnů. Na závěr inkubační doby byly nádory
pečlivě vyjmuty a zbaveny okolní CAM tkáně. Resekci nádoru prováděli dva nezávislí vědci, kteří odebírali pouze snadno definovanou pevnou hmotu nádoru. Nádory byly velmi dobře ohraničeny a tudíž bylo snadné odlišit od pevné hmoty nádoru tenkou poloprůsvitnou CAM a odstranit ji bez jakéhokoliv porušení nádorové tkáně. Odebrané nádory byly zváženy a morfologicky i histologicky prozkoumány.
Jak je vidět na obr. 13, byla stanovena mokrá hmotnost nádoru na konci sedmého dne inkubace, a ta byla porovnána s původní hmotností nádoru před započetím léčby. Každý sloupec představuje průměrnou hodnotu ± SE z 5 až 10 nádorů pro každou skupinu. Ve srovnání s kontrolní skupinou statisticky významně (p < 0,001) inhibovala mAb LM609 nádorový růst ve všech případech. Nádory ošetřené PBS nebo CSAT proliferovaly ve všech testovaných případech. Naopak mAb LM609 nejen působila preventivně proti růstu zmíněných nádorů, ale ve většině případů i indukovala extenzivní regresi nádorů. Důležitým faktem je, že buňky zmíněných nádorů neexprimují αγβ3 integrin, a tudíž inhibice růstu nádoru je způsobena anti angiogenním působením protilátky na nově vznikající cévy a nikoliv přímo na buňky nádoru samotného.
b) Aplikace mAb LM609 (anti-ctvPs) a P3G2 (antiβι).
Fragmenty lidského melanomu M21-L (50 mg) byly implantovány na CAM 10 dnů starých kuřecích embryí způsobem, který byl popsán v příkladu 5A. O 24 hodin později byla embryím intravenózní injekcí podána jedna dávka samotného pufru PBS, nebo 300 pg/100 μΐ jedné z protilátek LM609 (anti-avps) nebo • · · · • · • «
106
P3G2 (anti-avps)· Nádory byly dále inkubovány stejně jako v příkladu 9A1 a výsledky pokusu byly morfologicky i histologicky vyhodnoceny výše popsaným způsobem.
Reprezentativní příklady M21-L nádorů, ošetřených mAb LM609 (anti-otvP3) nebo P3G2 (anti-avPs), byly morfologicky vyhodnoceny. Nádory, ošetřené P3G2 byly velké (8 mm v průměru) a dobře vaskularizované, zatímco nádory ošetřené mAb LM609 byly mnohem menší (3 mm v průměru) a bez viditelné vaskularizace.
Další fází posouzení nádorů byla příprava histologických řezů a jejich barvení hematoxilinem a eozinem tak jak to již bylo popsáno v příkladu 9Ala). Jak je vidět v horní části obr. 14, nádory, ošetřené mAb P3G2 vykazovaly četné viditelné a aktivně se dělící buňky (důkazem je viditelný mitotický aparát označený na obr. plnými šipkami) stejně jako četné krevní cévy prostupující do těla nádoru (šipky). Naopak jen několik málo viditelných nádorových buněk a krevních cév bylo detekováno v nádorech, ošetřených mAb LM609 (obr. 14 dole). Z výsledků je zřejmé, že antagonisté integrinu αγββ inhibují nádorově indukovanou angiogenezi, což vede k pozastavení růstu nádoru a případně i k regresi některých lidských nádorů in vivo. Je důležité zde poznamenat, že embrya, vyšetřená po sedmi dnech růstu nádoru (17 dnů stará) dorůstala normální velikosti nezávisle na tom, bylali ošetřena οίγββ antagonistou či nikoliv. Z tohoto zjištění vyplývá, že antagonisté tohoto integrinu nejsou pro vyvíjející se embryo toxičtí.
• · · ·
107 ··· · · · · * * · t « ··· · ·· ······ ···· ···· « ·
2. Aplikace syntetických peptidů.
Fragmenty lidského melanomu M21-L (50 mg) byly implantovánay na CAM 10 dnů starých kuřecích embryí způsobem, který byl popsán v příkladu 5A. O 24 hodin později byla embryím intravenózní injekcí podána jedna dávka 300 pg/100 pl jednoho z peptidů cyklo-RADfV (69601) nebo cyklo-RGDfV (66203). Celkem po 72 hodinách byly nádory vyjmuty, morfologicky prozkoumány a vyfotografovány ve stereo mikroskopu tak, jak to bylo popsáno v příkladu 9A1.
Výsledky pokusu jsou znázorněny na obr. 15A-E v následujícím pořadí: 15A - dvojice vzorků ošetřených cyklo-RADfV (69601); 15B - dvojice vzorků ošetřených cyklo-RGDfV (66203); 15C přilehlá CAM tkáň odebraná ze stejného embrya, ošetřeného peptidem cyklo-RGDfV (66203); 15D-E - peptidem ošetřené nádory při velkém zvětšení (13x). Na obrázku 15D je vidět normální vaskularizace v nádoru ošetřeném kontrolním peptidem 69601. Na obr. 15E je vidět příklad rozrušených krevních cév (označeno šipkou) po ošetření nádoru peptidem cyklo-RGDfV (66203).
Pokusem bylo prokázáno, že pouze peptid 66203 inhiboval tvorbu cév, zatímco kontrolní peptid 69601 nikoliv, a dále že ani v případě ošetření inhibujícím peptidem 66203 nedošlo k poškození cév v přilehlé CAM tkáni.
Další pokus o regresi nádoru byl proveden s otvP3-reaktivním peptidem 85189 (SEQ ID NO 15). Jako kontrola opět sloužil peptid 69601. test byl proveden stejným způsobem, jaký byl popsán výše s tím rozdílem, že bylo intravenózně injikováno 100 pg peptidu 18 hodin po implantaci nádoru. Po dalších 48 hodinách byly nádory resekovány a byla stanovena jejich mokrá hmotnost.
• · · ·
108 • · ··· · ·* ······ ···· · · · · · ·
Na obr. 32, 33 a 34 je znázorněna redukce hmotnosti nádoru pro UCLAP-3, M21-L a FgM nádory po intravenózní aplikaci peptidů 85189 ve srovnání s působením PBS nebo kontrolního peptidů 69601, které nemělo na hmotnost nádoru žádný vliv.
Příklad 10: Potlačení růstu nádorové tkáně působením ανβ3 antagonistů, studované in vivo na modelu králičího oka.
Vliv 8ηίί-ανβ3 antagonistů na angiogenezí, indukovanou růstovým faktorem, může být pozorován v přirozeně průhledných strukturách. Příkladem takové struktury je rohovka v oku. Nové cévy rostou z okraje rohovky, který je bohatě zásoben krví, směrem do středu rohovky, kde normálně žádné cévy nejsou. Pokud jsou aplikovány na rohovku stimulátory angiogeneze, jako např. VEGF a TGF-α, indukují tyto růst nových cév z okraje rohovky. Antagonisté angiogeneze, po aplikaci na rohovku, inhibují růst nových cév z okraje rohovky. K angiogenezí v rohovce tedy dochází invazí endoteliálních buněk z okraje rohovky do tuhé, kolagenem obalené, rohovkové tkáně, která je snadno viditelná. Králičí oko tudíž poskytuje vhodný in vivo model pro přímé pozorování stimulace nebo inhibice angiogeneze, která následuje po implantaci látek přímo do rohovky oka.
A. Pokus in vivo na modelu králičího oka
1) Angiogeneze indukovaná růstovými faktory
Angiogeneze byla v in vivo pokusu na modelu králičího oka indukována růstovými faktory a je popsána v následujícím textu.
a. Příprava hydronových peletů, obsahujících růstový faktor a monoklonální protilátky.
109
Pelety z hydronového polymeru, obsahující růstový faktor a monoklonální protilátky (mAb) byly připraveny tak, jak je to popsáno v D'Amato et al., Proč. Nati. Acad. Sci., 91 : 4082-4085 (1994). Jednotlivé pelety, obsahovaly 650 ng růstového faktoru bFGF, který byl navázán na sukralfat (Carafet, Marion Merrell Dow Corporation), který zajistil stabilizaci bFGF a jeho pomalé uvolňování do okolní tkáně. Dále byly připraveny hydronové pelety, které obsahovaly buď 40 pg mAb LM609 (anti-avp3) nebo kontrolní protilátky P1F6 (anti ανβ5),ν PBS.
Pelety byly uzavřeny do speciálně připravených Teflonových čípků, které měly uvnitř 2,5 mm velký otvor spojený s povrchem vyvrtaným otvorem. Do každého čípku bylo uloženo přibližně 12 μΐ materiálu, který byl přes noc ve sterilním prostředí polymerizován. Pelety byly sterilizovány UV zářením.
b) Aplikace monoklonálních protilátek.
V každém experimentu byli použiti tři králíci. Každému z nich byl do jednoho oka vložen pelet s obsahem bFGF a mAb LM609 a do druhého oka pelet s obsahem bFGF a myší protilátky P1F6 (antiανβ5)· Použití párového testování pro srovnání mAb LM609 (antiα,νββ) s ostatními protilátkami a s PBS kontrolou umožňuje zodpovědně posoudit a prokázat významnost rozdílů mezi jednotlivými testovanými protilátkami.
Protilátka P1F6 imunologicky reaguje s integrinem αγβ5, který byl objeven na povrchu cévních endoteliálních buněk, ale který se pravděpodobně neúčastní angiogeneze.
Všechny testované mAbs byly zbaveny ascitické tekutiny za použití Protein-A Sepharose CL-4B afinitní kolonové chromatografie
110 s použitím známých metod. Vyčištěný imunoglobulin byl dále dialyzován proti PBS a pro odstranění endotoxinu byl použit Detoxi-gel (Pierce Chemicals, Rockfort, IL). Ukázalo se, že endotoxin silně stimuluje angiogenezi a záněty. Monoklonální protilátky proto byly testovány na přítomnost endotoxinu pomocí Cromogenic Limulus Amebocyte Lysáte Assay (Bio Whittaker, Walkersville, MD) a pouze protilátky bez obsahu detekovatelného endotoxinu byly použity v pokusech na modelu králičího oka. Hydronové pelety s obsahem bFGF a mAb LM609 (anti-avPs) nebo P1F6 (anti-avps) byly vloženy do kapsy, vytvořené v rohovce králičího oka. Hydronové pelety obsahovaly zároveň i sukralfát pro stabilizaci bFGF v průběhu pokusu. Jednotlivé pelety byly implantovány do chirurgicky vytvořených „kapes“ ve stromatu králičích rohovek. Chirurgické úkony byly provedeny pomocí sterilních technik, za použití operačního mikroskopu Wild model M691, který byl vybaven optickým děličem, ke kterému byl upevněn fotoaparát pro fotografování jednotlivých rohovek. 3mm x 5mm velká „kapsa“ byla vytvořena ve stromatu rohovky 3mm řezem do poloviny tlouštky rohovky pomocí nože Beaver 69. Stroma bylo z vnějšku odstraněno pomocí irisové stěrky a pelet byl implantován svým vnějším okrajem 2 mm od limbu.
Během následujících 14 dnů difundovaly bFGF a mAb z implantovaných peletů do okolní tkáně a tím ovlivňovaly angiogenezi od okraje rohovky k jejímu středu.
Reprezentativní výsledky z každého pokusu jsou znázorněny na obr. 16A až 16E. Počet cév byl kvantifikován a popsán v hodinových dílech, které jsou definovány dále. Oko bylo rozděleno na 12 shodných dílů stejným způsobem, jakým je rozdělen ciferník hodin. Jedna „hodina cév“ je tedy takové • ·
111 množství cév, které vyplní plochu oka ekvivalentní jednomu dílku na ciferníku hodin, tj. 1/12 kruhu. Pět králíků, kteří obdrželi pouze bFGF, vykazovalo intenzivní angiogenezi, kdy nově vznikající krevní cévy prorůstaly z okraje rohovky do jejího centra, které za normálních okolností jakoukoliv vaskularizaci postrádá. Jeden ze zmíněných pěti králíků vykazoval pouze jednu „hodinu cév“. U dvou králíků, kterým byla kromě bFGF podána i mAb LM609 nebyla ani po 14 dnech od chirurgického zákroku zaznamenána vůbec žádná viditelná angiogeneze. Jeden z králíků vykazoval 14. den po zákroku 3 ložiska hemorhagických a rostoucích cév. Dva z králíků, kterým byla kromě bFGF podána ještě mAb P3G2 (anti-otvPs) vykazovali extenzivní vaskularizaci, kde nově vznikající krevní cévy prorůstaly z okraje rohovky do jejího středu. Jeden z těchto králíků vykazoval pouze 1 až 2 „hodiny cév“ na pelet.
Na modelu králičího oka bylo prokázáno, že růstovým faktorem bFGF indukovaná angiogeneze je v přítomnosti mAb LM609 (antictvp3) úplně potlačena. Naopak pokud byla králíkům podána kromě bFGF ještě mAb P3G2 (anti-otvPs), byla na paralimbálních cévách pozorována intenzivní angiogeneze. Inhibiční efekt LM609 na angiogenezi vyvolanou v rohovce králičího oka je prokazatelně nejsilnější ze všech dosud popsaných anti-angiogenních látek.
C. Aplikace polypeptidů.
V každém experimentu bylo použito osm králíků. Každému z nich byl do jednoho oka implantován pelet obsahující 100 ng bFGF a do druhého oka pelet obsahující 1 pg VEGF. Pelety byly implantovány do kapes, vytvořených v rohovce tak, jak již bylo výše popsáno. Cytokíny, uvolňující se z peletu postupně • · · ·
stimulovaly růst nových krevních cév do oblasti rohovky. Peptidy byly podávány subkutálně (s.q.) v 1 ml PBS. První dávka obsahovala 50 pg peptidu na 1 kg hmotnosti králíka, a dále byla králíkům denně podávána dávka 20 pg/kg s.q. Po sedmi dnech byl vyhodnocen stav rohovky stejně jako v předchozím případě. Králíci, ošetření kontrolním peptidem 69601 vykazovali po 7 dnech v obou případech (bFGF i VEGF) významnou vaskularizací rohovky. Králíci, ošetření peptidem 85189 vykazovali ve srovnání s kontrolami menší než 50% množství cév v oku, které bylo stimulováno bFGF a téměř 100% inhibici vaskularizace v oku, které bylo stimulováno VEGF.
Příklad 11: Potlačení růstu nádorové tkáně pomocí ανβ3 antagonistů v pokusech in vivo na chimérním modelu myš : člověk
In vivo chimérní model myš : člověk byl vytvořen tak, že byla část kůže SCID myši nahrazena lidskou neonatální kůží (obr. 17). Poté co byly kožní štěpy přihojeny byly do lidského štěpu naočkovány nádorové buňky. Když se vyvinul měřitelný nádor, byly myši do ocasní žíly injikovány buď mAb LM609 (anti-o^3), nebo PBS. Po 2 až 3 týdnech byl nádor vyjmut a byla analyzována jeho hmotnost a histologie.
A. In vivo chimérní model myš:člověk In vivo chimérní model myš:člověk byl připraven v podstatě tak, jak je to popsáno v Yan et al., J Clin. Invest., 91 : 986-996 (1993). Krátce, SCID myši (staré 6-8 týdnů) byla chirurgicky odebrána kůže o ploše 2 cm a byla nahrazena lidskou kůží. Myš byla pod anestezií zbavena srsti v oblasti o ploše 5 cm2 na každé straně boční břišní • · • ·
110 ·· ·.·· ········
1J ·»······ · · oblasti. Odstraněním plné tloušťky kůže až na povázku, byla vytvořena dvě kruhová lůžka pro štěpy o velikosti 2 cm . Lidské kožní štěpy plné tloušťky stejné velikosti, odvozené od lidské neonatální kůže, byly umístěny na tato lůžka a byly přišity. Štěp byl zakryt Band-Aid, který byl přišit ke kůži. Na ránu byla přiložena mikroporézní textilní páska, aby zakryla ránu.
Lidská melanomová buněčná linie M21L, a nebo buněčná linie karcinomu prsu MDA 23.1 (ATCC HTB 26; α,γββ negativní - určeno testem imunologické reaktivity s mAb LM609) byly použity pro přípravu pevných lidských nádorů na lidských kožních štěpech na SCID myších. Do lidského kožního štěpu byla intradermálně injikována suspenze buněk 5 x 106 M21-L nebo MDA 23.1. Tyto myši byly poté pozorovány po dobu 2 až 4 týdnů, během kterých se u myší vyvinul měřitelný lidský nádor.
B. Intravenózní aplikace inhibitorů.
1) Aplikace monoklonálních protilátek
Po vytvoření měřitelných nádorů, bylo myším s M21-L nádorem intravenózně injikováno do ocasní žíly 250 pg mAb LM609 (antiα,νββ) nebo PBS. Injekce se opakovaly 2 x týdně po dobu 2 až 3 týdnů. Poté byly nádory vyjmuty z kožního štěpu a zbaveny okolní tkáně. Pro každé podmínky bylo testováno několik myší. Na konci tabulky 6 jsou uvedeny průměrné hmotnosti nádoru, vypočtené pro každý jednotlivý typ léčby.
114 • · · · · » * • ··· · ·· ·»* • « · ···· · číslo M21-L nádoru
TABULKA 6 způsob léčby
PBS
LM609 hmotnost nádoru (mg)
158
192
216
227
195
100
172
ZPŮSOB LÉČBY PRŮMĚRNÁ HMOTNOST NÁDORU (mg)
PBS 198
LM609 113
Působením mAb LM609 na M21-L ανβ3 negativní lidský nádor v chimérním systémy myš:člověk došlo k poklesu průměrné hmotnosti nádoru ve srovnání s nádory, léčenými pouze PBS a to v poměru 113 mg .198 mg.
Reprezentativní vzorky nádorů M21-L ošetřených buď mAb LM609 nebo PBS byly vyhodnoceny morfologicky. Nádory ošetřené PBS byly velké (8-10 mm v průměru) a dobře vaskularizované, zatímco nádory ošetřené mAb LM609 (anti-o^3) byly mnohem menší (3-4 mm v průměru) a bez viditelné vaskularizace.
V dalším pokusu byla na chimérním modelu myš:člověk s vyvinutým M21-L nádorem porovnávána aktivita mAb LM609 s aktivitou • ·
115 syntetického peptidu 85189 (SEQ ID NO 15) a kontrolního peptidu
69601 (SEQ ID NO 6). Testy byly provedeny stejně jako v předchozím případě. Z výsledků na obr. 35 je patrné, že syntetický peptid 85189 zredukoval objem nádoru na pouhých 25 mm , zatímco objem nádorů ošetřených kontrolním peptidem dosahoval 360 mm . Také mAb LM609 významně redukovala objem nádoru, a to
O přibližně na 60 mm .
Nádory vytvořené na kožních štěpech po injekci buněk MDA 23.1 byly snadno pozorovatelné a měřitelné. Morfologický průzkum vytvořených nádorů ukázal, že dochází k prorůstání cév z přihojeného lidského štěpu do MDA 23.1 nádoru.
Zablokováním otvP3-receptorů intravenózní injekcí mAb LM609 nebo peptidů podle vynálezu dochází k regresi karcinomu na chimérním modelu myš:člověk stejně jako na modelu kuřecí CAM nebo na modelu králičího oka (viz. příklady 9 a 10).
2) Aplikace syntetických peptidů.
Podobným způsobem, jaký byl popsán výše pro monoklonální protilátky, byly SCID myším s detekovaným M21-L nádorem intravenózně injikovány do ocasní žíly peptidoví antagonisté otvp3 receptorů. V předchozích testech byla stanovena závislost účinnosti peptidů 69601 (kontrolní) a 85189 (testovaný) na použité koncentraci v rozmezí od 10 do 250 pg/ml. U nádorů, odebraných po ukončení léčby byla stanovena jejich hmotnost a objem a výsledky jsou znázorněny na obr. 36A a 36B. Peptid 85189 byl účinným inhibitorem růstu M21-L nádoru ve všech testovaných koncentracích. Kontrolní peptid byl nejúčinnější v koncentraci 250 pg/ml.
Pro zjištění časové závislosti účinků peptidu 85189 byly na stejném • ·
116 • ··» · · · ··♦··· ··· ···· · ·
SCID modelu hodnoceny dva časové rozvrhy léčby. V prvním případě bylo započato s podáváním peptidu 69601 nebo 85189 šestý den po podkožní injekci 3 x 106 M21-L nádorových buněk. Peptid byl podáván intraperitoneálně v množství 250 pg/ml každý druhý den až do 29. dne od započetí pokusu. Ve druhém případě byl pokus uspořádán obdobně, ovšem léčba byla započata až 20. den pokusu. Na závěr experimentu byly nádory odebrány a byl stanoven jejich objem v mm . Data jsou vynesena v grafu jako průměrný objem ± SE.
Z výsledků těchto experimentů, zobrazených na obr. 37A a 37B vyplývá, že peptid 85189 je inhibitorem nádorového růstu v obou testovaných případech, zatímco kontrolní peptid 69601 není. Peptid 85189 je tedy účinným αγβ3 antagonistou a inhibitorem angiogeneze stejně jako nádorového růstu.
Příklad 12: Stimulace buněk cév ke vstupu do buněčného cyklu a k apoptóze v přítomnosti antagonistů integrinu ανβ3, testovaná na modelu CAM.
Proces angiogeneze zcela zjevně závisí na schopnosti cytokinů bFGF a VEGF stimulovat proliferaci cévních buněk (Mignatti et. al., J. Cell. Biochem. 471: 201 (1991), Takeshita et al., J. Clin. Invest. 93:662 (1994) a Koyama et al., J. Cell. Physiol. 158: 1 (1994)). Je ovšem také zřejmé, že působením různých signálů je řízena diferenciace těchto cévních buněk na maturované cévní buňky. Lze si také představit, že ovlivněním signálů, spojených buď s růstem nebo s diferenciací právě rostoucích cévních buněk, lze negativně ovlivnit angiogenezi.
Bylo také in vitro prokázáno, že události spojené s ligaci integrinů mají vliv jak na buněčnou proliferaci, tak na apoptózu, neboli • · · · • ·
117 programovanou buněčnou smrt (Schwartz, Cancer Res. 51: 1503 (1993); Meredith et al., Mol. Biol. Cell 4: 953 (1993); Frisch et al., J. Cell Biol. 124: 619 (1994); a Ruoslahti et al., Cell, 74:477 (1994)). Pečlivé prozkoumání účinků avp3 antagonístů na angiogenezí ukázalo na přítomnost diskontinuálních a rozrušených krevních cév asociovaných s nádorem. Je tedy možné, že ztráta kontinuity cévního systému může být způsobena selektivní nekrózou nebo apoptózou cévních buněk.
Tato hypotéza byla testována na modelu CAM. Angiogeneze byla v CAM indukována růstovým faktorem bFGF a CAM byla dále ošetřena mAb nebo cyklickými peptidy podle vynálezu.
A. Aplikace monoklonálních protilátek.
Apoptóza může být stanovena mnoha metodami, mezi něž patří například přímá analýza fragmentace DNA izolované ze sledované tkáně a nebo detekce 3ΌΗ v intaktní tkáni pomocí protilátek specifických pro volné 3ΌΗ skupiny fragmentované DNA.
1) Analýza fragmentace DNA.
Angiogeneze byla v CAM 10 dnů starých kuřecích embryí indukována po aplikaci bFGF nasyceného disku filtračního papíru na povrch CAM stejně jako v příkladu 6A. Imunohistologická analýza CAM s mAb LM609 (anti-ctvPs) ukázala maximální expresi ανβ3 na buňkách krevních cév 12 až 24 hodin po iniciaci angiogeneze bFGF. 24 hodin po stimulaci bFGF byla tedy embrya intravenózně inokulována 100 μΐ PBS nebo 100 μΐ PBS obsahujícího 300 μg jedné z protilátek CSAT (anti-βι) nebo LM609 (ηηίί-ανβ3).
118 • ·
DNA fragmentace byla stanovena následujícím způsobem. 24 nebo 48 hodin po intravenózním podání testované látky byl z CAM z oblasti přímo pod diskem filtračního papíru, nasyceným bFGF, odebrán vzorek tkáně. Odebraná CAM tkáň byla 3 x promyta sterilním PBS a nakonec byla jemně rozmělněna, resuspendována v 0,25% bakteriální kolagenáze (Worthington Biochemical; Freehold, NJ) a inkubována po dobu 90 min. při 37 °C za občasného míchání. DNA byla extrahována ze stejného počtu CAM buněk z buněčné suspenze již dříve popsaným způsobem (Bissonette et al., Nátuře 359: 552 (1992)). Krátce: jednotné množství CAM buněk bylo lyžováno v 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM EDTA v 0,5% (v/v) Tritonu X-100 (Sigma, St. Louis, MO). Buněčný lyzát byl 15 min. centrifugován při 16 000 x g, 4 °C. V tomto kroku byla oddělena rozpustná fragmentovaná DNA od neporušeného chromatinu. Fragmentovaná DNA byla promyta, přesrážena a analyzována elektroforézou v 1,2% (w/v) agarózovém gelu.
Rozpustná fragmentovaná DNA byla izolována z jednotného počtu CAM buněk z každého pokusu, rozdělena elektroforézou v agarózovém gelu a zviditelněna barvením ethidium bromidem. 24 hodin po podání testované látky nebyly mezi jednotlivými testovanými látkami pozorovány žádné rozdíly v relativním množství fragmentované DNA. Ovšem v případě mAb LM609 bylo 48 hodin po podání zaznamenáno, ve srovnání s mAb CSAT nebo s PBS, značné zvýšení fragmentace DNA.
• · · · • · · ·
119
2) Stimulace cévních buněk ke vstupu do buněčného cyklu.
Aby bylo možné experimentálně stanovit úlohu αγββ v těchto procesech, byly buňky CAM po aplikaci bFGF i bez ní, barveny propidium jodidem a dále byla provedena imunologická reakce s mAb LM609 (anti-otvPs).
CAM, izolované z embryí 24 a 48 hodin po podání mAb LM609, mAb CSAT (anti-βι), nebo PBS, byly homogenizovány až do vzniku suspenze jednotlivých buněk. Tato suspenze byla dále inkubována s bakteriální kolagenázou tak jako v předcházejícím příkladu. Jednotlivé buňky byly permeabilizovány a barveny pomocí Apop Taq Insitu Detection Kit přesně podle návodu výrobce (Oncor, Gaithersburg, MD). Apop Taq je protilátka, která specificky imunologicky reaguje svolnými 3ΌΗ skupinami fragmentované DNA. Detekce takových volných 3'OH skupin je zavedenou metodou pro detekci apoptózy v buňkách (Gavrieli et al., J. Cell Biol. 119: 493 (1992)).
Buňky barvené Apop Taq byly poté promyty 0,1% (v/v) Tritonem X-100 v PBS a resuspendovány ve FACS pufru s obsahem 0,5% (w/v) BSA, 0,2% (w/v) azidu sodného a 200 pg/ml RNázy A v PBS. Buňky byly inkubovány po dobu 1,5 hodiny, promyty a analyzovány pomocí FACS (fluorescenčně aktivované třídění buněk). Fluorescence byla měřena pomocí průtokového cytometru FACScan a získaná data byla analyzována tak, jak je to popsáno v následujícím textu.
Fluorescence v buňkách byla měřena pomocí FACScan průtokového cytometru (Becton Dickinson, Mountain View, CA). Boční rozptyl (SSC) a přední rozptyl (FSC) byly stanoveny simultánně a všechna data byla uložena a zpracována počítačem • · • » » · • · · ·
120
Hewlet Packard (HP9000) vybaveným FACScan softwarem (Becton Dickinson, Mountain View, CA). Data byla analyzována programem P.C. Lysis verze 1 (Becton Dickinson, Mountain View, CA). Jako negativní kontrola byla použita suspenze buněk bez přidání primární protilátky Apop Taq. Stejné negativní kontroly byly použity pro obě buněčné populace. Výsledkem je analýza přibližně 8000 buněk pro každý způsob ošetření.
Na obr. 18 je znázorněno procentuální zastoupení buněk, pocházejících z mAb ošetřených CAM, barvených Apop TAq. Černý sloupec představuje buňky z embryí, ošetřených 24 hodin před analýzou. Tečkovaný sloupec představuje buňky z embryí, ošetřených 48 hodin před analýzou. Každý sloupec představuje průměrnou hodnotu ze tří opakování ± SE.
Jak je vidět na obr. 18, u CAM ošetřených mAb LM609 48 hodin před analýzou bylo pozorováno tří- až čtyřnásobně intenzivnější barvení Apop Taq ve srovnání s CAM, které byly ošetřeny pouze PBS nebo anti-βι mAb CSAT.
B. Aplikace syntetických peptidů.
Test s CAM, ve které byla působením růstového faktoru indukována angiogeneze (viz. příklad 6A), byl proveden také se syntetickými peptidy podle vynálezu, aby bylo možné určit, jaký vliv má působení cyklických peptidů podle vynálezu na apoptózu. Peptidy cyklo-RGDfV (66203) a cyklo-RADfV (69601) byly připraveny stejně jako v příkladu 1. Do CAM byl injikován roztok peptidů v PBS v koncentraci 300 pg/ml. Po 24 a 48 hodinách byl byly disk filtračního papíru i okolní CAM tkáň odebrány a barveny Apop Taq za účelem stanovení apoptózy tak, jak je to popsáno v příkladu 12A2). Jak je vidět na obr. 18, u CAM • 4 ··· ·«*·· («· ♦ · · « * * · ošetřených peptidem 66203 (cyklo-RGDfV) 48 hodin před analýzou bylo pozorováno tří- až čtyřnásobně intenzivnější barvení Apop Taq ve srovnání s CAM, které byly ošetřeny pouze
PBS nebo kontrolním cyklickým peptidem 69601 (cyklo-RADfV).
C. Vliv aplikace monoklonálních protilátek na apoptózu a buněčný cyklus.
Buněčné suspenze byly testovány také na počet kopií chromozomální DNA, a to pomocí barvení propidium jodidem. Pomocí tohoto testu bylo možné stanovit vliv ošetření monoklonálními protilátkami na buněčný cyklus, stejně jako barvení Apop Taq je ukazatelem apoptózy v buňkách.
Suspenze jednotlivých buněk z CAM tkáně, ošetřené 24 nebo 48 hodin před analýzou mAb LM609 (anti-otvp3) nebo CSAT (antiβι), nebo PBS, byly připraveny podle popisu v příkladu 12A1).
Pro barvení buněk Apop Taq byla buněčná suspenze promyta 3 x pufrem, obsahujícím 2,5% (w/v) BSA a 0,25% (w/v) azidu sodného v PBS. Buňky byly dále fixovány po dobu 15 min. v 1% (w/v) roztoku paraformaldehydu v PBS. Poté byly buňky 3 x promyty (viz výše). Aby bylo zabráněno nespecifickým reakcím, byla suspenze buněk přes noc při 4°C blokována 5% (w/v) BSA v PBS. Poté byly buňky promyty jako v předcházejícím případě, barveny Apop Taq a výsledná fluorescence byla analyzována pomocí průtokového cytometru FACScan, stejně jako v příkladu 12A.
Buňky z každého pokusu byly dále barveny propidium jodidem (Sigma, St. Louis, MO) v koncentraci 10 pg/ml v PBS po dobu 1 hodiny, dále byly promyty 2 x PBS a analyzovány na přítomnost jaderných charakteristik, typických pro apoptózu, jakými jsou • ·· · např. kondenzace chromatinu a segmentace DNA. Procento buněk v apoptóze bylo stanoveno morfologickou analýzou buněk nejméně s 10 až 15 náhodně vybraných mikroskopických polí.
Na obrázku 19 jsou znázorněny výsledky, získané barvením buněčných suspenzí z CAM embryí, ošetřených buď CSAT (antiβi) nebo mAb LM609 (anti-a^s), Apop Taq a propidium jodidem, a analýzou pomocí FACS. Osa Y představuje barvení Apop Taq (apoptózu), osa X barvení propidium jodidem (obsah DNA). Horizontální linka představuje hodnoty pro negativní kontrolu pro barvení Apop Taq. Levé panely představují CAM buňky z CSAT ošetřených embryí, pravé panelu CAM buňky z LM609 ošetřených embryí. Fáze buněčného cyklu, ve které se buňky nacházely byla stanovena přibližně u 8000 buněk pro každé testované podmínky a získaná data jsou vynesena v grafu.
Barvením DNA propidium jodidem bylo prokázáno, že ve 25 až 30 % buněk z CAM, ošetřené 48 hodin před analýzou mAb LM609 (anti-o^s), dochází ke kondenzaci chromatinu a/nebo segmentaci DNA. Tyto procesy jsou charakteristické pro buňky v apoptóze. Naopak buňky CAM, ošetřené nati-βι mAb CSAT vykazovaly v 90-95 % normální jaderné barvení.
Jak je vidět na obrázku 19, spolu s indukcí apoptózy mAb LM609 bylo pozorováno i významné množství buněk, obsahujících méně než jednu kopii DNA (AO). Tato frakce buněk byla již dříve popsána jako frakce, představující buňky s fragmentovanou DNA v pozdním stádiu apoptózy (Telford et al., Cytometry 13: 137 (1992)). Navíc jsou tyto AO buňky snadno barvitelné Apop Taq, což potvrzuje schopnost této protilátky detekovat apoptotické buňky. Ovšem kromě buněk v AO bylo Apop Taq barveno i významné množství buněk, nesoucích více než jednu kopii DNA • 4 ···· *· ·«·· ·· *· « » · · Λ · » · · (obr. 19). Z těchto údajů vyplývá, že mAb LM609 je schopna indukovat apoptózu i v buňkách cév, které již vstoupily do buněčného cyklu. Naopak buňky, pocházející z kontrolní CAM, které již vstoupily do buněčného cyklu, vykazovaly jen minimální barvitelnost Apop Taq, což je v souladu s faktem, že v kontrolních CAM bylo detekováno jen velmi málo buněk v apoptóze.
Mezi buňkami, pocházejícími z bFGF stimulovaných CAM, které vstoupily do buněčného cyklu (S a G2/M fáze), bylo 70 % buněk, které vykazovaly pozitivní barvení mAb LM609. V kontrolních (bFGF-neošetřených) CAM bylo detekováno jen 10 % aktivně se dělících buněk, barvitelných mAb LM609. Tyto výsledky naznačují, že po stimulaci bFGF začíná většina ανββ-ροζίίί vních buněk aktivně proliferovat. Lze tedy konstatovat, že po intravenozní aplikaci mAb LM609 nebo cyklického peptidu antagonisty otvp3 - do kuřecí CAM, ve které byla předem indukována angiogeneze, dochází v CAM k indukci apoptózy.
Byla provedena také histologická analýza CAM. Byla stanovena exprese αγβ3 pomocí imunologického barvení mAb LM609 a v apoptotických buňkách byla stanovena také imunologická reaktivita s Apop Taq. Řezy CAM, odebrané embryím 48 hodin po aplikaci mAb LM609, mAb CSAT nebo PBS (viz. příklad 5A), byly promyty, fixovány v OTC (Baxter) a prudce zmraženy v tekutém dusíku. Byly připraveny 6 mikronů silné řezy CAM, které byly fixovány po dobu 30 s v acetonu a uloženy při -70 °C až do dalšího použití. Tkáňové řezy byly připraveny pro barvení krátkým promytím 70% (v/v) ethanolem (ETOH) a dále trojnásobným promytím v PBS. Dále byly řezy 2 hodiny blokovány 5% (w/v) BSA v PBS, a poté následovala inkubace s 10 qg/ml mAb LM609 po dobu 2 hodin. Poté byly řezy promyty a ·· 0000 ·· ···
124
0 * 0 ·
0 0 0 f ·
0 0 0 0 *
0 0 0 * 0 0 inkubovány 2 hodiny s 50 x ředěným rhodaminem, konjugovaným s kozím anti-myším IgG (Fisher Scientific, Pittsburg, PA). Na závěr byly stejné řezy promyty a inkubovány s Apop Taq (viz příklad 12A2). Nakonec byly obarvené tkáňové řezy fixovány a analyzovány pomocí konfokálního imunofluorescenčního mikroskopu. Panely A až C na obr. 20 představují CAM tkáň z embryí, ošetřených CSAT, panely D až F představují CAM tkáň z embryí, ošetřených mAb LM609. Na obrázcích A a D jsou znázorněny vzorky tkání, barvených Apop Taq, vizualizované fluorescenčně (FITC) a převedené na D.I.C. obraz. Panely B a E zobrazují stejnou tkáň, barvenou mAb LM609, vizualizovanou fluorescenčně (rhodaminem). Panely C a F představují spojené obrazy zmíněné tkáně, barvené mAb LM609 i Apop Taq. Žlutá barva indikuje společnou lokalizaci obou značek. Úsečka na levém panelu odpovídá 15 pm, úsečka na pravém panelu odpovídá 50 pm. Z obrázků 20A-C je zřejmé, že po intravenózni injekci CAST nebo PBS (kontrola) byla barvitelnost Apop Taq jen minimální a spíše náhodná, což ukazuje na minimální úroveň apoptózy ve tkáni. Naopak CAM z embryí, kterým byla předem aplikována mAb LM609 nebo cyklický peptid 203, vykazovala intenzivní barvení většiny cév protilátkou Apop Taq, přičemž okolní nevaskularizovaná tkáň vykazovala jen minimální reaktivitu s touto protilátkou (obr. 20D-F). Navíc, v případě společného barvení oběma protilátkami Apop Taq i LM609 (obr. 19C a 19F) byla pozorována významná ko-lokalizace obou markérů pouze v CAM embryí, kterým byla podána ανβ3 antagonistická látka (obr. 20F). Tyto údaje naznačují, že po indukci angiogeneze in vivo způsobují inhibitory integrinů αγβ3 selektivní apoptózu αγβ3exprimujících buněk krevních cév.
• · · ·
125
Angiogeneze je komplexní proces, zahrnující řadu biologických procesů na molekulární i buněčné úrovni. Je několik důvodů předpokládat, že integrin ανβ3, exprimovaný na povrchu vaskulárních buněk, hraje v tomto procesu relativně pozdní úlohu. Imnuohistologickou analýzou bylo prokázáno, že exprese integrinů αγβ3 na povrchu vaskulárních buněk dosahuje svého maxima 12 až 24 hodin po indukci angiogeneze růstovým faktorem bFGF. Za druhé, antagonisté αγβ3 inhibují angiogenezí, indukovanou různými aktivátory. Předpokládáme tedy, že αγβ3 receptor je některou pozdní součástí běžné signální dráhy, společné možná pro všechny primární signály, vedoucí k angiogenezí. Za třetí, mAb LM609 nebo cyklickým peptidem ošetřená CAM nevykazuje při měření stavu DNA 48 hodin po podání antagonisty žádné výrazné zvýšení výskytu apoptózy. A konečně antagonisté αγβ3 receptorů iniciují apoptózu vaskulárních buněk, které právě vstoupily do buněčného cyklu.
Zde prezentované výsledky jsou prvním přímým důkazem toho, že vzájemná vazba integrinů může být regulátorem buněčného přežívání in vivo. Průběh angiogeneze může být popsán následující hypotézou. Po započetí angiogeneze se jednotlivé vaskulární buňky začínají dělit a pohybují se směrem k angiogennímu zdroji. Následná ligace ανβ3 je signálem, který umožňuje delší přežívání buněk, jež vede k diferenciaci a tvorbě maturovaných krevních cév. Pokud je ovšem zabráněno ligaci αγβ3, nedostanou buňky potřebný molekulární podnět a směřují k apoptóze. Podle této hypotézy po ukončení diferenciace již maturované cévy nevyžadují pro své přežití ανβ3 signalizaci a tudíž jsou proti působení αγβ3 antagonistů netečné.
« ·
Závěrem lze říci, že výsledky, získané ve výše uvedených pokusech dokazují výjimečnou účinnost antagonistů ανβί integrinů jako léčiv při léčení neoplázie a dalších onemocnění spojených s angiogenezi. Za prvé, antagonisté αγβ3 rozruší nově vznikající krevní cévy, aniž by ovlivnili již existující cévní systém. Za druhé nemají tito antagonisté žádný významný vliv na životaschopnost kuřecího embrya, z čehož lze usuzovat, že nejsou toxičtí. Za třetí, angiogeneze byla významným způsobem blokována nezávisle na angiogenním stimulu. A konečně systémové podání ανβ3 antagonistů způsobuje dramatickou regresi různých histologicky odlišných lidských nádorů.
Příklad 13: Příprava organických molekul αγβ3 antagonistů.
Syntéza organických antagonistů αγβ3 integrinů, tj. sloučenin 7 (96112), 9 (99799), 10 (96229), 12 (112854), 14 (96113), 15 (79959), 16 (81218), 17 (87292) a 18 (87293) je popsána v následujícím textu a je také doložena vzorci. Organičtí antagonisté jsou někdy také uváděni pod čísly, uvedenými v závorkách. Výsledné organické molekuly, někdy také nazývané organická mimetika, podle vynálezu, tak, jak byly definovány výše, jsou dále používáni v metodách podle vynálezu jako inhibitory angiogeneze, zprostředkované ανβ3 (viz. příklad 11).
Pro každou synézu, popsanou níže, byly na UV spektrofotometru Perkin-Elmer 241 měřeny optické rotace a viditelná spektra byla měřena na spektrometru Beckmann DU-70. NMR spektra a byla měřena při 400 a 500 MHz na spektrometrech Bruker AMX-400 a AMX-500. Vysoko rozlišovací hmotová spektra
127 (HRMS) byla měřena na hmotovém spektrometru VG ZAB-ZSE v podmínkách FAB (fast atom bombardment). Byla provedena kolonová chromatografie na silikagelu při záběru 70-230. Preparativní TLC byla provedena na Merck Art. 5744 (0,5 mm). Body tání byly stanoveny na přístroji Thomas Hoover.
A. Sloučenina 1: t-Boc-L-tyrozin benzyl ester, viz. obr. 38.
o
JI, . , O Benzyl r jí .o.
HO ' β ΐΟ Sloučenina 1
Do roztoku N-(tert-butoxykarbonyl)-L-tyrozinu (t-Boc-L-tyrozin) (1,0 díl reakční hmotnosti; Aldrich) v 0,10 Μ (M) methylenchloridu byl přidán dicyklohexylkarbodiimid (DCC) (1,5 dílu reakční hmotnosti). Roztok byl míchán po dobu 1 hodiny při °C. Potom bylo přidáno 1,5 dílu reakční hmotnosti benzylalkoholu a směs byla míchána po dobu dalších 12 hodin při °C. Reakční směs byla zředěna ethylacetátem (0,10 M), dvakrát promyta (2 x) vodou, jednou (1 x) solným roztokem a dále byla vysušena nad síranem hořečnatým. Rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu a hrubý produkt byl vyčištěn pomocí silikageiové kolonové chromatografie. Sloučenina 1, t-Boc-L-tyrosin benzylester je také komerčně dostupný od firmy Sigma
128 : : . : :
·_··..· ·.. ·.· ··· ·
B. Sloučenina 2: (S)-3-(4-(4-bromobutyloxy)fenyl-2-Nterciální-butyloxykarbonyl benzyl ester kyseliny propionové, obr. 38, krok i.
o u
o-Benzyl
BrSloučenina 2
Směs t-Boc-L-tyrozin benzyl esteru (2 gramy, 5,38 mmol, připraveného tak, jak je popsáno výše), 1,4-dibrombutanu (1,9 ml, 16,2 mmol, Aldrich), uhličitanu draselného (5 g) a 18-crown-6 (0,1 g, Aldrich) byla zahřívána na 80 °C po dobu 12 hodin. Po ochlazení byla sraženina odfiltrována a reakční směs byla odpařena do sucha ve vakuu. Hrubý produkt byl vyčištěn krystalizaci za použití 100% hexanu. Výtěžkem bylo 2,5 g (92% ) sloučeniny 2.
C. Sloučenina 3: (S)-3-(4-(4-azidobutyloxy)fenyl-2-Nterciální-butyloxykarbonyl benzyl ester kyseliny propionové, viz. obr. 38, krok ii.
HN.
o
Ji.
J O Benzyl
Sloučenina 3
Sloučenina 2 (2,5 g; 4,9 mmol) byla míchána spolu s azidem sodným
129 (1,6 g, 25 mmol) v dimethylformamidu (DMF) při 25 °C po dobu 12 hodin. Rozpouštědlo bylo poté odpařeno, ke zbylé směsi byla přidána voda (přibližně 10 ml) a směs byla dvakrát extrahována v ethylacetátu. Organické vrstvy byly spojeny, vysušeny nad síranem hořečnatým a odpařeny. Výsledkem byly 2,0 gramy (90%) sloučeniny 3 ve formě bezbarvého sirupu (FAB-MS : 469 (M+H+).
D. Sloučenina 4: (S)-3-(4-(4-azidobutyloxy) fenyl-2-amino benzyl ester kyseliny propionové, viz. obr. 38, krok iii.
NM1 nh2
Ό -Benzyl
Sloučenina 4
Sloučenina 3 (2,0 g; (4,4 mmol)) byla rozpuštěna v kyselině trifluoroctové (TFA, 2 ml) a byla míchána po dobu 3 hodin při pokojové teplotě. Po odpaření ve vakuu byl výtěžek 1,6 g (kvantitativně) sloučeniny 4, ve formě bezbarvého syrupu, a která byla bez dalšího čištění použita v následujícím kroku. (FAB-MS : 369 (M+H+).
E. Sloučenina 5: (S)-3-(4-(4-azidobutyloxy)fenyl-2butylsulfonamido benzyl ester kyseliny propionové, viz. obr. 38 krok iv.
HN, o
JI
O-Benzyl O
Sloučenina 5
130
Směs sloučeniny 4 (1,6 g; 4,3 mmol), chloridu kyseliny butansulfonové (0,84 ml, 6,6 mmol) a triethylaminu (1,5 dílu reakční hmotnosti) byla míchána v methylenchloridu (20 ml) po dobu 12 hodin při pokojové teplotě. Reakční směs byla poté odpařena a zbytek byl rozpuštěn v ethylacetátu, promyt zředěnou HCI, kyselým uhličitanem sodným a vodou. Po odpaření do sucha byl hrubý produkt vyčištěn kolonovou chromatografii (silikagel, toluen/ethylacetát 15:1). Výtěžkem bylo 1,4 gramů (67%) sloučeniny 5 ve formě pevné amorfní látky.
F. Sloučenina 6: (S)-3-(4-(4-aminobutyloxy)fenyl-2butylsulfonamido-propionová kyselina, viz. obr. 38, krok v.
o
Sloučenina 6
Sloučenina 5 (1,3 g, 2,6 mmol) byla rozpuštěna ve 20 ml směsi ethylacetát/methanol/voda v poměru 5/3/1 a 0,2 ml kyseliny trifluoroctové (TFA) a směs byla hydrogenována ve vodíkové atmosféře (1 atmosféra, přístroj Parr Shaker) při teplotě 25 °C v přítomnosti 100 mg palladia (10% na aktivním uhlí). Po třech hodinách byl katalyzátor odfiltrován a rozpouštědlo bylo odpařeno za vzniku olejnaté sloučeniny 6. Po lyofilizaci z vody byl získán 1,0 gram (kvantitativně) sloučeniny 6 ve formě bílého prášku. FAB-MS: 373 (M+H+).
• · · · • ·
131 • · · · • · ·
G. Sloučenina 7: (S)-3-(4-(4-guanidinobutyloxy)fenyl-2butylsulfonamido-propionová kyselina, viz. obr. 38, krok vi.
h2n nh
Sloučenina 7
Sloučenina 6 (200 mg; 0,5 mmol), 3,5-dimethylpyrazol-l karboxamidin nitrát (DPFN) (170 mg, 0,8 mmol, Aldrich Chemical Company) a triethyamin (0,15 ml, 1,0 mmol) v dimethylformamidu (DMF, 5 ml) byly zahřívány na 60 °C po dobu 12 hodin. Po ochlazení bylo rozpouštědlo odpařeno ve vakuu a zbylá směs byla vyčištěna pomocí HPLC (Lichrocart RP-18, gradient acetonitril/voda + 0,3% TFA od 99 : 1 do 1 : 99). Výtěžkem bylo po lyofilizaci 50 mg (25 %) sloučeniny 7 v podobě bílého amorfního prášku. FAB-MS: 415 (M+H+), t.v.: 70 °C.
H. Sloučenina 8: (S)-3-(4-(4-aminobutyloxy)fenyl-2-Nterciální-butyloxykarbonyl-propionová kyselina, viz. obr. 39, krok iii.
o
O-Benzyl w „ J- HA/°\/' • O || |\ *
Sloučenina 8
132 • · · • ·
Sloučenina 3 (0,5 mg; 1,07 mmol), byla rozpuštěna v 10 ml směsi ethylacetát/methanol/voda v poměru 5/3/1 s 0,1 ml kyseliny trifluoroctové (TFA) a směs byla hydrogenována vodíkem (1 atmosféra, přístroj Parr Shaker) při 25 °C v přítomnosti 30 mg palladia (10 % na aktivním uhlí). Po třech hodinách byl katalyzátor odfiltrován a rozpouštědlo bylo odpařeno za vzniku sloučeniny 8 ve formě olejnaté látky. Po lyofilizaci z vody bylo získáno 370 miligramů (kvantitativně) sloučeniny 8 ve formě bílého prášku. FAB-MS: 353 (M+H+).
I. Sloučenina 9: (S)-3-(4-(4-guanidinobutyloxy)fenyl-2-Nterciální butyloxykarbonyl-propionová kyselina, viz. obr. 39, krok iv.
Sloučenina 9
Sloučenina 8 (200 mg; 0,5 mmol), 3,5-dimethylpyrazol-l karboxamidin nitrát (DPFN) (170 mg; 0,8 mmol, Aldrich Chemical Company) a triethylamin (0,15 ml; 1,0 mmol) v dimethylformamidu (DMF, 5 ml) byly zahřívány na 60 °C po dobu 12 hodin. Po ochlazení bylo rozpouštědlo odpařeno ve vakuu a zbylá směs byla vyčištěna pomocí HPLC (Lichrocart RP-18, gradient acetonitril/voda + 0,3% TFA od 99 : 1 do 1 : 99). Výtěžkem po lyofilizaci bylo 160 mg (90 %) sloučeniny 9 v podobě bílého amorfního prášku. FAB-MS: 395 (M+H+).
• * • · · · • · · · • · · · · ·
133
J. Sloučenina 10: (R)-3-(4-(4-guanidinobutyloxy)fenyl-2butylsulfonamido-propionová kyselina, viz. obr. 40, kroky i-vi.
NH o'
Sloučenina 10
Pro přípravu D-tyrozinového analogu sloučeniny 7, sloučeniny 10, bylo použito identické pořadí reakcí jako pro syntézu sloučeniny 7. Sloučenina 10 byla připravena s použitím meziproduktů 100-600. Bylo získáno 205 mg sloučeniny 10 ve formě bílého amorfního prášku FAB-MS: 415 (M+H+).
1) Sloučenina 100: t-Boc-D-tyrozin benzyl ester, viz.obr. 40.
Sloučenina 100
Do roztoku N-(terciálního-butoxykarbonyl)-D-tyrozinu (t-Boc-Ltyrozin) (1,0 díl reakční hmotnosti, Aldrich) v 0,10 M methylen chloridu byl přidán dicyklohexylkarbodiimid (DCC) (1,5 dílu reakční hmotnosti). Roztok byl míchán po dobu 1 hodiny při 25 °C. Potom bylo přidáno 1,5 dílu reakční hmotnosti benzylalkoholu a směs byla míchána po dobu dalších 12 hodin při 25 °C. Reakční směs byla zředěna ethylacetátem (0,10 M), 2 x promyta vodou, 1 x * ·
134 solným roztokem a dále byla vysušena nad síranem hořečnatým. Rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu a hrubý produkt byl vyčištěn pomocí silikagelové kolonové chromatografie.
2) Sloučenina 200: (R)-3-(4-(4-bromobutyloxy)fenyl-2-Nterciální-butyloxykarbonyl benzyl ester kyseliny propionové, viz. obr. 40, krok i.
Sloučenina 200
Směs t-Boc-D-tyrozin benzyl esteru (2 gramy; 5,38 mmol, připraveného tak, jak je popsáno výše), 1,4-dibrombutanu (1,9 ml, 16,2 mmol, Aldrich), uhličitanu draselného (5 g) a 18-crown-6 (0,1 g, Aldrich) byla zahřívána na 80 °C po dobu 12 hodin. Po ochlazení byla sraženina odfiltrována a reakční směs byla odpařena do sucha ve vakuu. Hrubý produkt byl vyčištěn krystalizaci za použití 100% hexanu za vzniku 2,5 g (92 %) sloučeniny 200.
3) Sloučenina 300: (R)-3-(4-(4-azidobutyloxy) fenyl-2-Nterciální-butyloxykarbonyl benzyl ester kyseliny propionové, viz. obr. 40, krok ii.
O - Benzyl
HŇ^
O
Sloučenina 300
135
Sloučenina 200 (2,5 g; 4,9 mmol) byla míchána s azidem sodným (1,6 g, 25 mmol) v dimethylformamidu (DMF) při 25 °C po dobu 12 hodin. Rozpouštědlo bylo poté odpařeno, a ke zbylé směsi byla přidána voda (přibližně 10 ml). Směs byla dvakrát extrahována v ethylacetátu. Organické vrstvy byly spojeny, vysušeny nad síranem hořečnatým. Po odpaření byl výtěžek 2,0 gramů (90 %) sloučeniny
300 ve formě bezbarvého sirupu (FAB-MS : 469 (M+H+).
4) Sloučenina 400: (R)-3-(4-(4-azidobutyloxy)fenyl-2-amino benzyl ester kyseliny propionové, viz. obr. 40, krok iii.
S Od - Benzyl
NH2
Sloučenina 400
Sloučenina 300 (2,0 g; (4,4 mmol)) byla rozpuštěna v kyselině trifluoroctové (TFA, 2 ml) a byla míchána po dobu 3 hodin při pokojové teplotě. Výtěžkem reakce po odpaření ve vakuu bylo 1,6 g (kvantitativně) sloučeniny 400, ve formě bezbarvého sirupu, která byla bez dalšího čištění použita v následujícím kroku. (FAB-MS: 369 (M+H+).
• ·
136
5) Sloučenina 500: (R)-3-(4-(4-azidobutyloxy)fenyl-2butylsulfonamido benzyl ester kyseliny propionové, viz. obr. 40 krok iv.
o
Sloučenina 500
Směs sloučeniny 400 (1,6 g; 4,3 mmol), chloridu kyseliny butansulfonové (0,84 ml, 6,6 mmol) a triethylaminu (1,5 dílu reakční hmotnosti) byla míchána v methylenchloridu (20 ml) po dobu 12 hodin při pokojové teplotě. Reakční směs byla poté odpařena a produkt byl rozpuštěn v ethylacetátu, promyt zředěnou HCI, kyselým uhličitanem sodným a vodou. Po odpaření do sucha byl hrubý produkt vyčištěn kolonovou chromatografií (silikagel, toluen/ethylacetát 15:1). Výtěžkem bylo 1,4 gramu (67 %) sloučeniny 500 ve formě pevné amorfní látky.
6) Sloučenina 600: (R)-3-(4-(4-aminobutyloxy)fenyl-2butylsulfonamido propionová kyselina, viz. obr. 40, krok v.
O i
hOH
H2N
Sloučenina 600 • · · · • ·
137 « *
Sloučenina 500 (1,3 g, 2,6 mmol) byla rozpuštěna ve 20 ml směsi ethylacetát/methanol/voda v poměru 5/3/1 s 0,2 ml kyseliny trifluoroctové (TFA) a směs byla hydrogenována vodíkem (1 atmosféra, přístroj Parr Shaker) při 25 °C v přítomnosti 100 mg palladia (10 % na aktivním uhlí). Po třech hodinách byl katalyzátor odfiltrován a rozpouštědlo bylo odpařeno za vzniku sloučeniny 600 ve formě olejnaté látky. Po lyofilizaci z vody byl získán 1,0 g (kvantitativně) sloučeniny 600 ve formě bílého prášku. FAB-MS : 373 (M+H+).
7) Sloučenina 10: (R)-3-(4-(4-guanidinobutyloxy)fenyl-2butylsulfonamido-propionová kyselina, viz. obr. 40 krok vi
Sloučenina 600 (200 mg; 0,5 mmol), 3,5-dimethylpyrazol-lkarboxamidin nitrát (DPFN) (170 mg; 0,8 mmol, Aldrich Chemical Company) a triethyamin (0,15 ml; 1,0 mmol) v dimethylformamidu (DMF, 5 ml) byly zahřívány na teplotu 60 °C po dobu 12 hodin. Po ochlazení bylo rozpouštědlo odpařeno ve vakuu a produkt byl vyčištěn pomocí HPLC (Lichrocart RP-18, gradient acetonitril/voda + 0,3% TFA od 99 : 1 do 1 : 99). Výtěžkem po lyofilizaci z vody bylo 50 mg (25 %) sloučeniny 10 ve formě bílého amorfního prášku. FAB-MS: 415 (M+H+), t.v.: 70 OC.
• · ·
138 • · • ·
K. Sloučenina 11: (S)-3-(4-(4-azidobutyloxy)fenyl-2-(l 0kafrosulfonamido) benzyl ester kyseliny propionové, viz. obr. 4.
Sloučenina 11
Směs sloučeniny 4 (1,0 g; 2,7 mmol), chloridu kyseliny kafrosulfonové (6,6 mmol, Aldrich Chemical company) a triethylaminu (1,5 dílu reakční hmotnosti) byla míchána v methylenchloridu (20 ml) po dobu 12 hodin při pokojové teplotě. Reakční směs byla poté odpařena a vzniklý produkt byl rozpuštěn v ethylacetátu, promyt zředěnou HCI, kyselým uhličitanem sodným a vodou. Po odpaření do sucha byl hrubý produkt vyčištěn kolonovou chromatografií (silikagel, toluen/ethylacetát 15:1). Výtěžkem bylo 1,4 gramu (67 %) sloučeniny 11 ve formě pevné amorfní látky.
L. Sloučenina 12: (S)-3-(4-(4-guanidinobutyloxy)fenyl-2-(l0kafrosulfonamido) propionová kyselina, viz. obr. 41, kroky i-ii.
h2n, nh li
NH
Sloučenina 12
139
Sloučenina 12 byla získána hydrogenací a guanylací sloučeniny 11 za následujících podmínek:
Krok i : Sloučenina 11 (1,3 g, 2,6 mmol) byla rozpuštěna ve 20 ml směsi ethylacetát/methanol/voda v poměru 5/3/1 s 0,2 ml kyseliny trifluoroctové (TFA) a směs byla hydrogenována vodíkem (1 atmosféra, přístroj Parr Shaker) při 25 °C v přítomnosti 100 mg palladia (10 % na aktivním uhlí). Po třech hodinách byl katalyzátor odfiltrován a rozpouštědlo bylo odpařeno za vzniku olejnatého meziproduktu. Po lyofilizaci z vody byl získán 1,0 gram (kvantitativně) meziproduktu (aminu) ve formě bílého prášku, s nímž bylo naloženo následovně :
Krok ii: Výše vytvořený meziprodukt (amin) (200 mg; 0,5 mmol), 3,5-dimethylpyrazol-l-karboxamidinnitrát (DPFN) (170 mg; 0,8 mmol, Aldrich Chemical Company) a triethyamin (0,15 ml; 1,0 mmol) v dimethylformamidu (DMF, 5 ml) byly společně zahřívány na teplotu 60 °C po dobu 12 hodin. Po ochlazení bylo rozpouštědlo odpařeno ve vakuu a vzniklý produkt byl vyčištěn pomocí HPLC (Lichrocart RP-18, gradient acetonitril/voda + 0,3% TFA od 99:1 do 1:99). Výtěžkem po lyofilizaci bylo 50 mg (25 %) sloučeniny 12 ve formě bílého amorfního prášku. FAB-MS: 509,6 (M+H+).
M. Sloučenina 13: (S)-3-(4-(4-bromopentyloxy)fenyl-2-Nterciální-butyloxykarbonyl benzyl ester kyseliny propionové, viz. obr. 41.
RB
O-Benzyl HN —BOC
Sloučenina 13 • ·
140
Směs t-Boc-L-tyrozin benzyl esteru (4,5 gramu, 12,1 mmol, sloučenina 1, připravená tak, jak je popsáno výše), 1,5dibrompentanu (5 ml, 36,7 mmol, Aldrich), uhličitanu draselného (10 g) a 18-crown-6 (0,25 g, Aldrich) byla zahřívána na 80 °C po dobu 12 hodin. Po ochlazení byla sraženina odfiltrována a reakční směs byla odpařena do sucha ve vakuu. Hrubý produkt byl vyčištěn krystalizací za použití 100% hexanu. Výtěžkem bylo 5,35 g (85 %) sloučeniny 13.
N. Sloučenina 14: (S)-3-(4-(4-guanidinopentyloxy)fenyl-2butylsulfonamido propionová kyselina, viz. obr. 41, kroky i-v.
NH li.
H2N NH i
HN
O
ΌΗ
O
Sloučenina 14
Sekvence 5 reakcí (výměna brom-azid, štěpení Boc, sulfonylace chloridem kyseliny butan sulfonové, hydrogenace a guanylace DPFN) byla provedena stejným způsobem, jako v případě výše popsané přípravy sloučeniny 7 s použitím meziproduktů 1-6, nebo sloučeniny 10 za použití meziproduktů 100-600.
Sloučenina 14 byla získána ve formě bílého prášku FAB-MS: 429 (M+H+).
• *
141
O. Sloučenina 15: dihydrochlorid 3-(4-amidinofenyl)-5-(4(-2karboxy-2-amino-ethyl)fenyloxy)methyl-2-oxazolidinonu, viz obr.
42.
1) Syntéza výchozí látky pro přípravu sloučeniny 15; 2-N-BOCamino-3-(4-hydroxy-fenyl) propionátu.
h2n
o
χ COOH
Ί nh2
Sloučenina 15
Výchozí látka, 2-N-BOC-amino-3-(4-hydroxy-fenyl) propionát, byla získána esterifikaci (D nebo L) N-(tercialního-butoxykarbonyl)L(D)-tyrozinu (t-Boc-L(D)-tyrozin) (1,0 díl reakční hmotnosti, Sigma) v 0,10 M methanolu a zředěné 1% HCI. Reakční směs byla míchána při 25 °C po dobu 12 hodin a poté byla neutralizována uhličitanem draselným. Dále byla směs zředěna ethylacetátem (0,10 M), 2 x promyta vodou, 1 x solným roztokem a nakonec byla vysušena nad síranem hořečnatým. Rozpouštědlo bylo odstraněno odpařením ve vakuu a hrubý produkt byl vyčištěn pomocí silikagelové kolonové chromatografie. Výsledkem byl 2-N-BOCamino-3-(4-hydroxy-fenyl) propionát.
2) Syntéza 3-p-N-BOC-amidino-fenyl-5-methansulfonyloxymethyl-2-oxazolidinonu, výchozí látky pro přípravu sloučeniny 15: postup, sestávající z následujících tří kroků:
p-amino-benzonitril (1,0 díl reakční hmotnosti, Aldrich) v • ·
142 : · ·..· ·..* *..* .·* ·♦’ methylenchloridu (0,10 Μ) byl míchán s 2,3- epoxypropanolem (1,0 díl reakční hmotnosti, Aldrich) po dobu 12 hodin při 25 °C. Rozpouštědlo bylo poté odstraněno ve vakuu a hrubý produkt, 4(2,3-dihydroxypropylamino)benzonitril byl použit v dalším kroku: 4-(2,3-dihydroxypropylamino)benzonitril (1,0 díl reakční hmotnosti, jak popsáno výše) v dimethylformamidu (0,1 M), při 25 °C, byl míchán s diethylkarbonátem (1,1 dílu reakční hmotnosti, Aldrich) a terciálním-butylátem draselným (1,1 dílu reakční hmotnosti, Aldrich) při 110 °C po dobu 6 hodin. Reakční směs byla poté zředěna ethylacetátem (0,10 M), 2 x promyta vodou, 1 x solným roztokem a dále byla vysušena nad síranem hořečnatým. Rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu a hrubý produkt byl vyčištěn pomocí silikagelové kolonové chromatografie. Produkt 3(4-kyanofenyl)-5-hydroxymethyl-2-oxazolidin byl použit v dalším kroku následovně:
3-(4-kyanofenyl)-5-hydroxymethyl-2-oxazolidin (1,0 díl reakční hmotnosti, jak bylo popsáno výše) byl při 25 °C,míchán s 1,1 dílem reakční hmotnosti sirovodíku, 1,1 dílem reakční hmotnosti methyl jodidu a 1,1 dílem reakční hmotnosti octanu amonného. Reakční směs byla míchána po dobu 6 hodin a poté byla zředěna ethylacetátem (0,10 M), 2 x promyta vodou, 1 x solným roztokem a dále byla vysušena nad síranem hořečnatým. Rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu a hrubý produkt byl vyčištěn pomocí silikagelové kolonové chromatografie. Takto získaný amidin byl použit v dalším kroku následovně:
1,0 díl reakční hmotnosti amidinu, připraveného tak, jak je uvedeno výše, byl ochráněn 1,1 dílem reakční hmotnosti BOC-ON (2-(BOC-oxyimino)-2-fenylacetonitril, Aldrich) v methylen chloridu (0,10 M) při 25 °C a směs byla míchána po dobu 6 hodin.
• · · ·
Reakční směs byla poté zředěna ethylacetátem (0,10 M), 2 x promyta vodou, 1 x solným roztokem a dále byla vysušena nad síranem hořečnatým. Rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu a hrubý produkt byl potom esterifikován v 0,10 M methylen chloridu a 1,1 dílu reakční hmotnosti methansulfonyl chloridu. Reakční směs byla míchána při 0 °C po dobu 6 hodin a poté bylo přidáno 5 dílů reakční hmotnosti vody. Reakční směs byla poté zředěna ethylacetátem (0,10 M), 2 x promyta vodou, 1 x solným roztokem a dále byla vysušena nad síranem hořečnatým. Rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu a hrubý produkt byl vyčištěn pomocí silikagelové kolonové chromatografie. Výsledným produktem byl 3-p-N-BOC-amidino-fenyl-5methansulfonyloxy-methyl-2-oxazolidinon.
3) Spojení meziproduktů 2-N-BOC-amino-3-(4-hydroxyfenyl) propíonátu a 3-p-N-BOC-amidino-fenyl-5methansulfonyloxy-methyl-2-oxazolidinonu, za vzniku chráněné formy sloučeniny 15, 3-(4-BOC-amidinofenyl)-5(4(-2-methoxy-karbonyl-2N-BOC-aminoethyl)fenoxylmethyl2-oxazolidinonu.
Směs 1,9 gramů 2-N-BOC-amino-3-(4-hydroxy-fenyl) propíonátu (jak je popsáno výše), 20 ml dimethyformamidu (DMF) a NaH (1,0 dílu reakční hmotnosti) byla míchána při pokojové teplotě po dobu 30 min. Poté bylo přidáno 1,8 gramů 3-p-N-BOC-amidino-fenyl-5methansulfonyloxy-methyl-2-oxazolidinonu (jak je popsáno výše) v 10 ml dimethyformamidu (DMF) a směs byla míchána po dobu dalších 15 min při pokojové teplotě. Reakční směs byla zředěna ethylacetátem (0,10 M), 2 x promyta vodou, 1 x solným roztokem a dále byla vysušena nad síranem hořečnatým. Rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu a hrubý produkt byl vyčištěn pomocí • · · ·
silikagelové kolonové chromatografie, čímž byla získána chráněná forma sloučeniny 15, 3-(4-BOC-amidinofenyl)-5-(4(-2-methoxykarbonyl-2N-BOC-aminoethyl)fenoxylmethyl-2-oxazolidinon, která byla použita v dalším kroku.
4) Vytvoření výsledné nechráněné sloučeniny 15, dihydrochloridu 3-(4-amidinofenyl)-5-(4(-2-karboxy-2-aminoethyl)fenoxy)methyl-2-oxazolidinonu, z chráněné formy sloučeniny 15, viz. obr. 42.
Na chráněnou formu sloučeniny 15, 3-(4-BOC-amidinofenyl)-5-(4(2-methoxy-karbonyl-2-N-BOC-aminoethyl) fenoxy lmethy 1-2oxazolidinon (1,0 díl reakční hmotnosti, připravena podle výše uvedeného popisu), bylo při pokojové teplotě po dobu 4 hodin působeno 4 ml 2N NaOH. K této směsi bylo dále po kapkách přidáno 40 ml roztoku 2N HCI v dioxanu při 0 °C až 25 °C. Po 3 hodinách byl k reakční směsi přidán kyselý uhličitan sodný (5 dílů reakční hmotnosti), poté byla směs zředěna ethylacetátem (0,10 M) a 2 x promyta vodou, 1 x solným roztokem a dále byla vysušena nad síranem hořečnatým. Rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu a hrubý produkt byl vyčištěn pomocí silikagelové kolonové chromatografie za vzniku výsledné sloučeniny 15: dihydrochlorid 3(4-amidinofenyl)-5-(4(-2-karboxy-2-amino-ethyl)fenoxy)methyl-2oxazolidinonu; t. v.: 165 °C (d).
P. Sloučenina 16: 3-(4-amidinofenyl)-5-(4(-2-karboxy-2-Nbutylsulfonylaminoethyl)fenoxy)methyl-2-oxazolidinon, viz. obr. X (dříve 14).
145
1) Syntéza výchozí látky pro přípravu sloučeniny 16, 2N-butylsulfonylamino-3-(4-hydroxy-fenyl) propionátu.
• · fe * _/
NH . . —λ ° \\ |J—4 /) —N ,0
H2n 11 o
COOH
I
NH - SO2
Sloučenina 16
Výchozí látka, 2-N-butylsulfonylamino-3-(4-hydroxy-fenyl) propionát, byl získán esterifikací ((D nebo L) tyrozinu) (1,0 díl reakční hmotnosti, Sigma) v 0,10 M methanolu a zředěné 1% HCI. Reakční směs byla míchána při 25 °C po dobu 12 hodin a potom byla neutralizována uhličitanem draselným. Poté byla zředěna ethylacetátem (0,10 M), 2 x promyta vodou, 1 x solným roztokem a dále byla vysušena nad síranem hořečnatým. Rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu a získaný hrubý produkt byl použit následujícím způsobem:
Směs získané sloučeniny (4,3 mmol), chloridu kyseliny butansulfonové (6,6 mmol) a triethylaminu (1,5 dílu reakční hmotnosti) byla míchána v methylen chloridu (20 ml) po dobu 12 hodin při pokojové teplotě. Reakční směs byla poté odpařena a získaný produkt byl rozpuštěn v ethylacetátu, promyt zředěnou HCI, kyselým uhličitanem sodným a vodou. Po odpaření do sucha byl hrubý produkt vyčištěn kolonovou chromatografií (silikagel, toluen/ethylacetát 15:1) za vzniku titulní sloučeniny.
• · · · ř ·
146
2) Syntéza výchozí látky pro přípravu sloučeniny 16, 3-p-NBOC-amidino-fenyl-5-methansulfonyloxy-methyl-2oxazolidinonu, postup, sestávající z následujících tří kroků :
p-amino-benzonitril (1,0 díl reakční hmotnosti, Aldrich) v methylenchloridu (0,10 M) byl míchán s 2,3- epoxypropanolem (1,0 díl reakční hmotnosti, Aldrich) po dobu 12 hodin při 25 °C. Rozpouštědlo bylo poté odstraněno ve vakuu a hrubý produkt, 4(2,3-dihydroxypropylamino)benzonitril byl použit v dalším kroku následujícím způsobem:
4-(2,3-dihydroxypropylamino)benzonitril (1,0 díl reakční hmotnosti, jak je popsáno výše) v dimethylformamidu (0,10 M), při 25 °C, byl míchán s diethylkarbonátem (1,1 dílem reakční hmotnosti, Aldrich) a terciálním butylátem draselným (1,1 dílem reakční hmotnosti, Aldrich) při 110 °C po dobu 6 hodin. Reakční směs byla poté zředěna ethylacetátem (0,10 M), 2 x promyta vodou, 1 x solným roztokem a dále byla vysušena nad síranem hořečnatým. Rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu a hrubý produkt byl vyčištěn pomocí silikagelově kolonové chromatografie za vzniku 3(4-kyanofenyl)-5-hydroxymethyl-2-oxazolidinu, který byl použit v dalším kroku následovně:
3-(4-kyanofenyl)-5-hydroxymethyl-2-oxazolidin (1,0 díl reakční hmotnosti, jak je popsáno výše) byl míchán při 25 °C s 1,1 dílem reakční hmotnosti sirovodíku, 1,1 dílem reakční hmotnosti methyljodidu a 1,1 dílem reakční hmotnosti octanu amonného. Reakční směs byla míchána po dobu 6 hodin a poté byla zředěna ethylacetátem (0,10 M), 2 x promyta vodou, 1 x solným roztokem a dále byla vysušena nad síranem hořečnatým. Rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu a hrubý produkt byl vyčištěn pomocí silikagelově kolonové chromatografie za vzniku amidinu, který byl • 9
47 · · 9 9 9 9 9 9 99, 999
Η· / · · · · ···· · · použit v dalším kroku následujícím způsobem:
1,0 reakční hmotnosti amidinu, připraveného tak, jak je uvedeno výše, bylo ochráněno 1,1 dílem reakční hmotnosti BOC-ON (2(BOC-oxyimino)-2-fenylacetonitril, Aldrich) v methylenchloridu (0,1 M) při 25 °C a směs byla míchána po dobu 6 hodin. Reakční směs byla poté zředěna ethylacetátem (0,10 M), 2 x promyta vodou, 1 x solným roztokem a dále byla vysušena nad síranem hořeČnatým. Rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu a hrubý produkt byl poté estrifikován v 0,10 M methylenchloridu a 1,1 dílu reakční hmotnosti methansulfonylchloridu. Reakční směs byla míchána při 0 °C po dobu 6 hodin a poté bylo přidáno 5 dílů reakční hmotnost vody. Reakční směs byla poté zředěna ethylacetátem (0,10 M), 2 x promyta vodou, 1 x solným roztokem a dále byla vysušena nad síranem hořeČnatým. Rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu a hrubý produkt byl vyčištěn pomocí silikagelové kolonové chromatografie za vzniku 3-p-N-BOC-amidino-fenyl-5methansulfonyloxy-methyl-2-oxazolidinonu.
3) Spojení meziproduktů 2-N-butylsulfonylamino-3-(4hydroxy-fenyl) propionátu a 3-p-N-BOC-amidino-fenyl-5methansulfonyloxy-methyl-2-oxazolidinonu, za vzniku chráněné formy sloučeniny 16, 3-(4-BOC-amidinofenyl)-5(4(-2-methoxy-karbonyl-2N-butylsulfonylaminoethyl) fenoxylmethyl-2-oxazolidinonu.
Směs 1,9 gramů 2-N-butylsulfonylamino-3-(4-hydroxy-fenyl) propionátu (jak je popsáno výše), 20 ml dimethyformamidu (DMF) a NaH (1,0 díl reakční hmotnosti) byla míchána při pokojové teplotě po dobu 30 min. Poté bylo přidáno 1,8 gramů 3-p-N-BOC-amidinofenyl-5-methansulfonyloxy-methyl-2-oxazolidinonu (jak je popsáno výše) v 10 ml dimethyformamidu (DMF) a směs byla míchána po
148 • ·< · • · » « · · ·· ··«·*· • 9 · » ···· · · dobu dalších 15 min při pokojové teplotě. Reakční směs byla zředěna ethylacetátem (0,10 M), 2 x promyta vodou, 1 x solným roztokem a dále byla vysušena nad síranem hořečnatým. Rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu a hrubý produkt byl vyčištěn pomocí silikagelové kolonové chromatografie za vzniku chráněné formy sloučeniny 16, 3-(4-BOC-amidinofenyl)-5-(4(-2methoxy-karbonyl-2N-butylsulfonylaminoethyl)fenoxylmethyl-2oxazolidinonu, která byla použita v dalším kroku.
4) Příprava výsledné nechráněné sloučeniny 16, 3-(4amidinofenyl)-5-(4(-2-karboxy-2-N-butylsulfonylaminoethyl) fenoxy)methyl-2-oxazolidinonu, z chráněné formy sloučeniny 16, viz. obr. 42.
Na chráněnou formu sloučeniny 16, 3-(4-BOC-amidinofenyl)-5-(4(2-methoxy-karbonyl-2-N-butylsulfonylaminoethyl)fenoxylmethyl-2oxazolidinon (1,0 díl reakční hmotnosti, připravenou podle výše uvedeného popisu), bylo při pokojové teplotě po dobu 4 hodin působeno 4 ml 2N NaOH. K této směsi bylo dále po kapkách přidáno 40 ml roztoku 2N HCI v dioxanu při 0 °C až 25 °C. Po 3 hodinách byl k reakční směsi přidán kyselý uhličitan sodný (5 dílů reakční hmotnosti), poté byla směs zředěna ethylacetátem (0,10 M) a 2 x promyta vodou, 1 x solným roztokem a dále byla vysušena nad síranem hořečnatým. Rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu a hrubý produkt byl vyčištěn pomocí silikagelové kolonové chromatografie za vzniku sloučeniny 16: 3-(4-amidinofenyl)-5-(4(2-karboxy-2-N-butylsulfonylaminoethyl)fenoxy)methyl-2oxazolidinonu; t.v.: 236-237 °C.
149 •F ····
Q. Sloučenina 17: 3-(4-amidinofenyl)-5-(4(-2-karboxy-2-Npropyl-sulfonylaminoethyl)fenoxy)methyi-2-oxazolidinon, viz. obr. 42.
1) Syntéza výchozí látky pro přípravu sloučeniny 17, 2-Npropyl-sulfonylamino-3-(4-hydroxy-fenyl) propionátu.
uuun
NH
-N.
NH -SO2 h2n
Sloučenina 17 >
Výchozí látka, 2-N-propyl-sulfonylamino-3-(4-hydroxy-fenyl) propionát, byla získána esterifikací ((D nebo L) -tyrozinu) (1,0 díl reakční hmotnosti, Sigma) v 0,10 M methanolu a zředěné 1% HCI.
Reakční směs byla míchána při 25 °C po dobu 12 hodin a potom byla neutralizována uhličitanem draselným. Poté byla zředěna ethylacetátem (0,10 M), 2 x promyta vodou, 1 x solným roztokem a dále byla vysušena nad síranem hořečnatým. Rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu a hrubý produkt byl použit následujícím způsobem:
Směs této sloučeniny (4,3 mmol), chloridu kyseliny butansulfonové (6,6 mmol) a triethylaminu (1,5 dílu reakční hmotnosti) byla míchána v methylenchloridu (20 ml) po dobu 12 hodin při pokojové teplotě. Reakční směs byla poté odpařena a produkt byl rozpuštěn v ethylacetátu, promyt zředěnou HCI, kyselým uhličitanem sodným a vodou. Po odpaření do sucha byl hrubý produkt vyčištěn kolonovou chromatografií (silikagel, toluen/ethylacetát 15:1) za vzniku titulní ·· »··· tr ·«··
150 sloučeniny.
2) Syntéza výchozí látky pro přípravu sloučeniny 17, 3-p-NBOC-amidino-fenyl-5-methansulfonyloxy-methyl-2oxazolidinonu, postup, sestávající z následujících tří kroků :
p-amino-benzonitril (1,0 díl reakční hmotnosti, Aldrich) v methylenchloridu (0,10 M) byl míchán s 2,3- epoxypropanolem (1,0 díl reakční hmotnosti, Aldrich) po dobu 12 hodin při 25 °C. Rozpouštědlo bylo poté odstraněno ve vakuu a hrubý produkt, 4(2,3-dihydroxypropylamino)benzonitril, byl použit v dalším kroku následovně:
4-(2,3-dihydroxypropylamino)benzonitril (1,0 díl reakční hmotnosti, jak bylo popsáno výše) v dimethylformamidu (0,10 M) byl míchán při 25 °C s diethylkarbonátem (1,1 dílu reakční hmotnosti, Aldrich) a terciálním butylátem draselným (1,1 dílu reakční hmotnosti, Aldrich) při 110 °C po dobu 6 hodin. Reakční směs byla poté zředěna ethylacetátem (0,10 M), 2 x promyta vodou, 1 x solným roztokem a dále byla vysušena nad síranem hořečnatým. Rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu a hrubý produkt byl vyčištěn pomocí silikageiové kolonové chromatografie za vzniku 3(4-kyanofenyl)-5-hydroxymethyl-2-oxazolidin, který byl použit v dalším kroku následujícím způsobem:
3-(4-kyanofenyl)-5-hydroxymethyl-2-oxazolidin (1,0 díl reakční hmotnosti, jak popsáno výše) byl míchán při 25 °C s 1,1 dílem reakční hmotnosti sirovodíku, 1,1 dílem reakční hmotnosti methyljodidu a 1,1 dílem reakční hmotnosti octanu amonného. Reakční směs byla míchána po dobu 6 hodin a poté byla zředěna ethylacetátem (0,10 M), 2 x promyta vodou, 1 x solným roztokem a dále byla vysušena nad síranem hořečnatým. Rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu a hrubý produkt byl vyčištěn pomocí
151 • · · · • · · · • ·
silikagelové kolonové chromatografie za vzniku amidinu, který byl dále použit následujícím způsobem:
1,0 díl reakční hmotnosti amidinu, připraveného podle výše uvedeného návodu, byl ochráněn 1,1 dílem reakční hmotnosti BOCON (2-(BOC-oxyimino)-2-fenylacetonitril, Aldrich) v methylenchloridu (0,1 M) při 25 °C a směs byla míchána po dobu 6 hodin. Reakční směs byla poté zředěna ethylacetátem (0,10 M), 2 x promyta vodou, 1 x solným roztokem a dále byla vysušena nad síranem hóřečnatým. Rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu a hrubý produkt byl potom estrifikován v 0,10 M methylenchloridu a 1,1 dílu reakční hmotnosti methansulfonylchloridu. Reakční směs byla míchána při 0 °C po dobu 6 hodin a poté bylo přidáno 5 dílů reakční hmotnosti vody. Reakční směs byla poté zředěna ethylacetátem (0,10 M), 2 x promyta vodou, 1 x solným roztokem a dále byla vysušena nad síranem hóřečnatým. Rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu a hrubý produkt byl vyčištěn pomocí silikagelové kolonové chromatografie za vzniku 3-p-N-BOCamidino-fenyl-5-methansulfonyloxy-methyl-2-oxazolidinonu.
3) Spojení meziproduktů, 2-N-propyl-sulfonylamino-3-(4hydroxy-fenyl) propionátu a 3-p-N-BOC-amidino-fenyl-5methansulfonyloxy-methyl-2-oxazolidinonu, za vzniku chráněné formy sloučeniny 17, 3-(4-BOC-amidinofenyl)-5(4(-2-methoxy-karbonyl-2N-propyl-sulfonylaminoethyl) fenoxylmethyl-2-oxazolidinonu.
Směs 1,9 gramů 2-N-propyl-sulfonylamino-3-(4-hydroxy-fenyl) propionátu (jak je popsáno výše), 20 ml dimethyformamidu (DMF) a NaH (1,0 dílu reakční hmotnosti) byla míchána při pokojové teplotě po dobu 30 min. Poté bylo přidáno 1,8 gramů 3-p-N-BOC-amidinofenyl-5-methansulfonyloxy-methyl-2-oxazolidinonu (jak je popsáno
152 výše) v 10 ml dimethyformamidu (DMF) a směs byla míchána po dobu dalších 15 min při pokojové teplotě. Reakční směs byla zředěna ethylacetátem (0,10 M), 2 x promyta vodou, 1 x solným roztokem a dále byla vysušena nad síranem hořečnatým. Rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu a výsledný hrubý produkt byl vyčištěn pomocí silikagelové kolonové chromatografie za vzniku chráněné formy sloučeniny 17, 3-(4-BOC-amidinofenyl)-5-(4(-2methoxy-karbonyl-2N-propyl-sulfonylaminoethyl)fenoxylmethyl-2oxazolidinonu, která byla použita v dalším kroku.
4) Příprava výsledné nechráněné sloučeniny 17, 3-(4-amidino fenyl)-5-(4(-2-karboxy-2-N-propyl-sulfonylaminoethyl) fenoxy) methyl-2-oxazolidinonu, z chráněné formy sloučeniny 17, viz. obr. 42.
Na chráněnou formu sloučeniny 17, 3-(4-BOC-amidinofenyl)-5-(4(2-methoxy-karbonyl-2-N-propyl-sulfonylaminoethyl)fenoxylmethyl2-oxazolidinon (1,0 díl reakční hmotnosti, připravenou podle výše uvedeného popisu), bylo při pokojové teplotě po dobu 4 hodin působeno 4 ml 2N NaOH. K této směsi bylo dále po kapkách přidáno 40 ml roztoku 2N HCI v dioxanu při 0 °C až 25 °C. Po 3 hodinách byl k reakční směsi přidán kyselý uhličitan sodný (5 dílů reakční hmotnosti), poté byla směs zředěna ethylacetátem (0,10 M) a 2 x promyta vodou, 1 x solným roztokem a dále byla vysušena nad síranem hořečnatým. Rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu a hrubý produkt byl vyčištěn pomocí silikagelové kolonové chromatografie za vzniku výsledné sloučeniny 17: 3-(4amidinofenyl)-5-(4(-2-karboxy-2-N-propyl-sulfonylaminoethyl) fenoxy)methyl-2-oxazolidinonu; t.v.: 200 °C (d).
• · • ·
153
R. Sloučenina 18 : 3-(4-amidinofenyl)-5-(4(-2-karboxy-2-Nethyl-sulfonylaminoethyl)fenoxy) methy 1-2-oxazo li dinon, viz. obr. 42.
1) Syntéza výchozí látky pro přípravu sloučeniny 18, 2-Nethyl-sulfonylamino-3-(4-hydroxy-fenyl) propionátu.
H,N
NH \\ z/
N^x° li o
COOH
Ϊ
NH —SO2
Sloučenina 18
Výchozí látka, 2-N-ethyl-sulfonylamino-3-(4-hydroxy-fenyl) propionát, byla získána esterifíkací ((D nebo L) -tyrozinu) (1,0 dílu reakční hmotnosti, Sigma) v 0,10 M methanolu a zředěné 1% HCI.
Reakční směs byla míchána při 25 °C po dobu 12 hodin a potom byla neutralizována uhličitanem draselným. Poté byla zředěna ethylacetátem (0,10 M), 2 x promyta vodou, 1 x solným roztokem a dále byla vysušena nad síranem hořečnatým. Rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu a výsledný hrubý produkt byl použit následujícím způsobem:
Směs produktu z předchozí reakce (4,3 mmol), chloridu kyseliny butansulfonové (6,6 mmol) a triethylaminu (1,5 dílu reakční hmotnosti) byla míchána v methylenchloridu (20 ml) po dobu 12 hodin při pokojové teplotě. Reakční směs byla poté odpařena a vzniklý produkt byl rozpuštěn v ethylacetátu, promyt zředěnou HCI, kyselým uhličitanem sodným a vodou. Po odpaření do sucha byl hrubý produkt vyčištěn kolonovou chromatografií (silikagel, • · · · • · · ·
154 · · ........: ··:
«······ · · · ·· ·· ·· ·· ·· ·· toluen/ethylacetát 15:1) za vzniku titulní sloučeniny.
2) Syntéza výchozí látky pro přípravu sloučeniny 18, 3-p-NBOC-amidino-fenyl-5-methansulfonyloxy-methyl-2oxazolidinonu, postup, sestávající z následujících tří kroků:
p-amino-benzonitril (1,0 díl reakční hmotnosti, Aldrich) v methylenchloridu (0,10 M) byl míchán s 2,3- epoxypropanolem (1,0 dílem reakční hmotnosti, Aldrich) po dobu 12 hodin při 25 °C. Rozpouštědlo bylo poté odstraněno ve vakuu a hrubý produkt 4-(2,3dihydroxypropylaminojbenzonitril byl použit v dalším kroku následujícím způsobem:
4-(2,3-dihydroxypropylamino)benzonitril (1,0 díl reakční hmotnosti, připravený podle výše uvedeného popisu) v dimethylformamidu (0,10 M) byl při 25 °C míchán s diethylkarbonátem (1,1 dílem reakční hmotnosti, Aldrich) a terciálním butylátem draselným (1,1 dílem reakční hmotnosti, Aldrich) při 110 °C po dobu 6 hodin. Reakční směs byla poté zředěna ethylacetátem (0,10 M), 2 x promyta vodou, 1 x solným roztokem a dále byla vysušena nad síranem hořečnatým. Rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu a hrubý produkt byl vyčištěn pomocí silikagelové kolonové chromatografie za vzniku 3-(4-kyanofenyl)-5-hydroxymethyl-2oxazolidinu, který byl použit v dalším kroku následujícím způsobem:
3-(4-kyanofenyl)-5-hydroxymethyl-2-oxazolidin (1,0 díl reakční hmotnosti, připravený podle výše uvedeného popisu) byl při 25 °C míchán s 1,1 dílem reakční hmotnosti sirovodíku, 1,1 dílem reakční hmotnosti methyljodidu a 1,1 dílem reakční hmotnosti octanu amonného. Reakční směs byla míchána po dobu 6 hodin a poté byla zředěna ethylacetátem (0,10 M), 2 x promyta vodou, 1 x solným • · · · • · · · roztokem a dále byla vysušena nad síranem hořečnatým. Rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu a hrubý produkt byl vyčištěn pomocí silikagelové kolonové chromatografie za vzniku amidinu, který byl použit v dalším kroku následujícím způsobem:
1,0 díl reakční hmotnosti amidinu, připraveného podle výše uvedeného popisu byl ochráněn 1,1 dílem reakční hmotnosti BOCON (2-(BOC-oxyimino)-2-fenylacetonitril, Aldrich) v methylenchloridu (0,1 M) a směs byla míchána při 25 °C po dobu 6 hodin. Reakční směs byla poté zředěna ethylacetátem (0,10 M), 2 x promyta vodou, 1 x solným roztokem a dále byla vysušena nad síranem hořečnatým. Rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu a hrubý produkt byl potom estrifikován v 0,10 M methylenchloridu a 1,1 dílu reakční hmotnosti methansulfonylchloridu. Reakční směs byla míchána při 0 °C po dobu 6 hodin a poté bylo přidáno 5 dílů reakční hmotnosti vody. Reakční směs byla poté zředěna ethylacetátem (0,10 M), 2 x promyta vodou, 1 x solným roztokem a dále byla vysušena nad síranem hořečnatým. Rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu a hrubý produkt byl vyčištěn pomocí silikagelové kolonové chromatografie za vzniku 3-p-N-BOCamidino-fenyl-5-methansulfonyloxy-methyl-2-oxazolidinonu.
3) Spojení meziproduktů, 2-N-ethyl-sulfonylamino-3-(4hydroxy-fenyl) propionátu a 3-p-N-BOC-amidino-fenyl-5methansulfonyloxy-methyl-2-oxazolidinonu, za vzniku chráněné formy sloučeniny 18, 3-(4-BOC-amidinofenyl)-5(4(-2-methoxy-karbonyl-2N-ethyl-sulfonylaminoethyl) fenoxylmethyl-2-oxazolidinonu.
Směs 1,9 gramů 2-N-ethyl-sulfonylamino-3-(4-hydroxy-fenyl) propionátu (připraveného podle výše uvedeného popisu), 20 ml dimethyformamidu (DMF) a NaH (1,0 díl reakční hmotnost) byla • · · · • · · ·
Isč ·· ···· ····*··♦
1JU *······· * · míchána při pokojové teplotě po dobu 30 min. Poté bylo přidáno 1,8 gramů 3-p-N-BOC-amidino-fenyl-5-methansulfonyloxy-methyl-2oxazolidinonu (příprava viz. výše) v 10 ml dimethyformamidu (DMF) a směs byla míchána po dobu dalších 15 min při pokojové teplotě. Reakční směs byla zředěna ethylacetátem (0,10 M), 2 x promyta vodou, 1 x solným roztokem a dále byla vysušena nad síranem hořečnatým. Rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu a hrubý produkt byl vyčištěn pomocí silikagelové kolonové chromatografie za vzniku chráněné formy sloučeniny 18, 3-(4-BOCamidinofenyl)-5-(4(-2-methoxy-karbonyl-2N-ethylsulfonylaminoethyl)fenoxylmethyl-2-oxazolidinonu, která byla použita v dalším kroku.
4) Vytvoření sloučeniny 18, 3-(4-amidinofenyl)-5-(4(-2karboxy-2-N-ethyl-sulfonylaminoethyl)fenoxy)methyl-2oxazolidinonu, z chráněné formy sloučeniny 18, viz.obr. 42.
Na chráněnou formu sloučeniny 18, 3-(4-BOC-amidinofenyl)-5-(4(2-methoxy-karbonyl-2-N-ethyl-sulfonylaminoethyl) fenoxylmethyl2-oxazolidinon (1,0 díl reakční hmotnosti, připravenou podle výše uvedeného popisu), bylo při pokojové teplotě po dobu 4 hodin působeno 4 ml 2N NaOH. K této směsi bylo dále po kapkách přidáno ml roztoku 2N HCl v dioxanu při 0 °C až 25 °C. Po 3 hodinách byl k reakční směsi přidán kyselý uhličitan sodný (5 dílů reakční hmotnosti), poté byla směs zředěna ethylacetátem (0,10 M) a 2 x promyta vodou, 1 x solným roztokem a dále byla vysušena nad síranem hořečnatým. Rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu a hrubý produkt byl vyčištěn pomocí silikagelové kolonové chromatografie za vzniku sloučeniny 18. 3-(4-amidinofenyl)-5-(4(2-karboxy-2-N-ethyl-sulfonylaminoethyl)fenoxy)methyl-2oxazolidinonu; t.v.: 212 °C.
• · · · • ·
157
Příklad 14: Inhibice angiogeneze indukované růstovým faktorem po intravenózní aplikaci organického mimetika otvp3 ligandu, stanovená testem na CAM.
Pro použití podle navrhovaného vynálezu byl také na modelu CAM, testován vliv intravenózní aplikace organického mimetika ayp3 ligandu na angiogenezí, indukovanou růstovým faktorem.
V tomto testu byly použity CAM 10 dnů starých kuřecích embryí, připravené stejně jako v příkladu 5A. 24 hodin po indukci angiogeneze růstovým faktorem bFGF bylo do CAM intravenózní injekcí aplikováno 100 μΐ jedné z organických látek (mimetik) 16 (81218), 17 (87292) nebo 18 (87293), v koncentraci 1 mg/ml (100 pg/embryo) ve 20% tetraglykol-PBS; pH 7,0.
V paralelních pokusech byly podobným způsobem testovány také látky 7 (96112), 9 (99799), 10 (96229), 12 (112854) a 14 (96113). Účinky zmíněných látek byly analyzovány o 48 hodin později. Kvantifikace byla provedena dvojitě slepým způsobem sečtením počtu větvení krevních cév v oblasti pod diskem filtračního papíru.
Výsledky jsou zobrazeny na obr. 43 a 44. V grafu na obr. 43 jsou látky 14 (96113), 10 (96229), 9 (99799) a 12 (112854) seřazeny podle klesajícího vlivu na redukci počtu větvení nových cév ve srovnání s kontrolami, tj. bFGF a sloučenina 7 (96112). Na obr. 44 je znázorněn anti-angiogenní účinek sloučenin 17 (87292) a 18 (87293) ve srovnání s neošetřenou, kontrolní CAM (bFGF) a s CAM, ošetřenou látkou 16 (81218).
Ve třetím pokusu byly testována schopnost inhibovat bFGF indukovanou angiogenezí u látek 7 (96112), 10 (96229) a 14 (96113) spolu s peptidy 66203 a 69601. Tentokrát bylo použito «· ····
250 pg/ml organické látky, která byla podána 18 hodin po indukci angiogeneze bFGF (stejně jako v příkladu 7B). Výsledky jsou zobrazeny na obr. 28. Stejně jako v předchozím případě látky 14 (96113) a 10 (96229) téměř úplně inhibovaly tvorbu nových cév, indukovanou bFGF.
Na výše uvedených příkladech je prokázáno, že integrin αγβ3 hraje klíčovou úlohu v rozvoji angiogeneze po indukci různými faktory, a jako takový je, spolu s ανβ3 antagonisty podle vynálezu, vhodným terapeutickým cílem při léčení oněmocnění, charakterizovaných neovaskularizaci.
Předcházející popis je považován pro odborníka za dostačující pro praktické provedení vynálezu. Navrhovaný vynález není v žádném případě limitován rozsahem uvedeného textu; zmíněný popis vynálezu a příklady provedení jsou jen ukázkami některých aspektů vynálezu, a kterýkoliv z dalších aspektů, který je funkčně ekvivalentní uvedenému popisu, je také předmětem navrhovaného vynálezu. Je nutné říci, že výčet zde vyjmenovaných možností vynálezu není konečný a vynález není omezen nároky, které se týkají jen některých konkrétních aplikací vynálezu. Pro odborníky, kteří se budou vynálezem zabývat, nebude problematické si představit mnohé další modifikace navrhovaného vynálezu kromě těch, které jsou zde popsané. Zmíněné modifikace jsou ovšem také součástí vynálezu a přiložených nároků.
CQ ·· · « · » ..· ·»’ ijy · ·« · · »· · .. ..
»· ·· ·· ·· ·· ’·
SEZNAM SEKVENCÍ (1) OBECNÉ INFORMACE:
(i) ŽADATEL:
(A) JMÉNO: THE SCRIPPS RESEARCH INSTITUTE (B) ULICE: 10550 North Torrey Pines Road (C) MĚSTO: La Jolla (D) STÁT: California (E) ZEMĚ: US (F) ZIP: 92037 (G) TELEFON: (619) 784-2937 (H) TELEFAX: (619) 784-9399 (ii) NÁZEV VYNÁLEZU: PROSTŘEDKY A METODY, VHODNÉ PRO INHIBICI ANGIOGENEZE.
(iii) POČET SEKVENCÍ: 45 (iv) FORMA PRO ZPRACOVÁNÍ NA POČÍTAČI:
(A) TYP MÉDIA: disketa (B) POČÍTAČ: IBM PC kompatibilní (C) OPERAČNÍ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, verze #1.25 (v) ÚDAJE O SOUČASTNÉ ŽÁDOSTI:
(A) ČÍSLO ŽÁDOSTI: PCT/US97/ (B) DATUM PODÁNÍ: 30. května 1997 (vi) ÚDAJE O PŘEDCHOZÍ ŽÁDOSTI:
(A) ČÍSLO ŽÁDOSTI: US 08/210,715 (B) DATUM PODÁNÍ: 18. března 1994 (vii) ÚDAJE O PŘEDCHOZÍ ŽÁDOSTI:
(A) ČÍSLO ŽÁDOSTI. US 08/366,665 (B) DATUM PODÁNÍ: 30. prosince 1994 • · · · • ·
160 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 1:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 6 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: interní (ix) VLASTNOSTI:
(A) NÁZEV/KLÍČOVÉ SLOVO: peptid (B) LOKALIZACEl ...6 (D) DALŠÍ INFORMACE: /označení= BOC-GRGDFV-OMe /poznámka= „BOC je označení pro Nkoncovou ochranou skupinu butyloxykarbonyl; OMe označuje C-koncový methyl ester; arginin je ve druhé pozici“ (ix) VLASTNOSTI:
(A) NÁZEV/KLÍČOVÉ SLOVO, peptid (B) LOKALIZACE l ...6 (D) DALŠÍ INFORMACE: /označení= OMe /poznámka= „OMe označuje C-koncový chránící methyl ester“ (ix) VLASTNOSTI.
(A) NÁZEV/KLÍČOVÉ SLOVO: peptid (B) LOKALIZACE l ...6 (D) DALŠÍ INFORMACE: /oznacení= D-Arg /poznámka= „Písmeno „D“ ve zkratce D-Arg označuje, že arginin v pozici 2 je D aminokyselina“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO 1:
Gly Arg Gly Asp Phe Val 1 5 • · · · • · · *
161 • * (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 2:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 6 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY, peptid (v) TYP FRAGMENTU: interní (ix) VLASTNOSTI:
(C) NÁZEV/KLÍČOVÉ SLOVO: peptid (D) LOKALIZACE: 1 ...6 (D) DALŠÍ INFORMACE: /označení= BOC-GRGDFV-OMe /poznámka= „BOC je označení pro Nkoncovou ochranou skupinu terciální butyloxykarbonyl“ (ix) VLASTNOSTI:
(C) NÁZEV/KLÍČOVÉ SLOVO: peptid (D) LOKALIZACE.l ...6 (D) DALŠÍ INFORMACE: /označení= OH /poznámka^ „OH označuje volnou Ckoncovou karboxylovou kyselinu“ (ix) VLASTNOSTI:
(C) NÁZEV/KLÍČOVÉ SLOVO: peptid (D) LOKALIZACE:1 ...6 (D) DALŠÍ INFORMACE: /označení= D-Arg /poznámka= „Písmeno „D“ ve zkratce
D-Arg označuje, že arginin v pozici 2 je D aminokyselina“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO 2.
Gly Arg Gly Asp Phe Val 1 5 • · · • · · ·
162 • · · (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 3:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 6 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: interní (ix) VLASTNOSTI:
(E) NÁZEV/KLÍČOVÉ SLOVO: peptid (F) LOKALIZACE:1 ...6 (D) DALŠÍ INFORMACE: /označení= H /poznámka= „H označuje volný Nkoncový amin“ (ix) VLASTNOSTI:
(E) NÁZEV/KLÍČOVÉ SLOVO: peptid (F) LOKALIZACE: 1 ...6 (D) DALŠÍ INFORMACE: /označení= OH /poznámka= „OH označuje volnou Ckoncovou karboxylovou kyselinu“ (ix) VLASTNOSTI:
(E) NÁZEV/KLÍČOVÉ SLOVO: peptid (F) LOKALIZACE:1 ...6 (D) DALŠÍ INFORMACE: /označení= D-Arg /poznámka^ „Písmeno „D“ ve zkratce
D-Arg označuje, že arginin v pozici 2 je D aminokyselina“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO 3:
Gly Arg Gly Asp Phe Val 1 5 • · • · · *
163
(2) INFORMACE O SEQ ID NO: 4:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 6 aminokyselin (B) TYP; aminokyselinová (C) TOPOLOGIE: cirkulární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: interní (ix) VLASTNOSTI:
(A) NÁZEV/KLÍČOVÉ SLOVO; peptid (B) LOKALIZACE: 2 (D) DALŠÍ INFORMACE: /označení= D-Arg /poznámka= „Arg je D aminokyselina“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO 4: Gly Arg Gly Asp Phe Val 1 5 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 5:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 5 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) TOPOLOGIE: cirkulární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: interní (ix) VLASTNOSTI.
(A) NÁZEV/KLÍČOVÉ SLOVO: peptid (B) LOKALIZACE. 4 (D) DALŠÍ INFORMACE: /poznámka= „Arg je D aminokyselina“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO 5.
Arg Gly Asp Phe Val 1 5 • · · · • ·
164 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 6:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 5 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) TOPOLOGIE: cirkulární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: interní (ix) VLASTNOSTI:
(A) NÁZEV/KLÍČOVÉ SLOVO: peptid
(B) LOKALIZACE: 4
(D) DALŠÍ INFORMACE: /poznámka=
aminokyselina“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO 5: Arg Ala Asp Phe Val 1 5 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 7:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 5 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) TOPOLOGIE: cirkulární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: interní (ix) VLASTNOSTI:
(A) NÁZEV/KLÍČOVÉ SLOVO: peptid
(B) LOKALIZACE: 5
(D) DALŠÍ INFORMACE: /poznámka= „Val je D
aminokyselina“ (xi) POPIS SEKVENCE. SEQ ID NO 7: Arg Gly Asp Phe Val 1 5
165 • · • · (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 8:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 15 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: interní (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO 8:
Tyr Thr Ala Glu Cys Lys Pro Gin Val Thr Arg Gly Asp Val Phe 15 10 15 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 9:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 5 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) TOPOLOGIE: cirkulární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: interní (ix) VLASTNOSTI:
(A) NÁZEV/KLÍČOVÉ SLOVO: peptid (B) LOKALIZACE: 2 (D) DALŠÍ INFORMACE: /poznámka= „Ala je D aminokyselina“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO 9:
Arg Ala Asp Phe Val 1 5 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 10:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 6 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) TOPOLOGIE: cirkulární
166
(ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: interní (ix) VLASTNOSTI:
(A) NÁZEV/KLÍČOVÉ SLOVO: peptid (B) LOKALIZACE. 5 (D) DALŠÍ INFORMACE: /poznámka= „Phe je D aminokyselina“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO 10:
Ala Arg Gly Asp Phe Leu 1 5 (2) INFORMACE O SEQ ID NO. 11:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 6 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) TOPOLOGIE: cirkulární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: interní (ix) VLASTNOSTI:
(A) NÁZEV/KLÍČOVÉ SLOVO: peptid (B) LOKALIZACE: 5 (D) DALŠÍ INFORMACE. /poznámka= „Phe je D aminokyselina“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO 11: Gly Arg Gly Asp Phe Leu 1 5 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 12:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 12 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (D) TOPOLOGIE: lineární • · · ·
167 • · • · (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: interní (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO 12:
Thr Arg Glu Val Val Cys Asp Leu Gly Asn Pro Met 1 5 10 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 13:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE.
(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: interní (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO 13:
Gly Val Val Arg Asn Asn Glu Ala Leu Ala Arg Leu Ser 1 5 10 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 14:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 11 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (D) TOPOLOGIE: cirkulární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU, interní (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO 14:
Thr Asp Val Asn Gly Asp Gly Arg His Asp Leu 1 5 10 (2) INFORMACE O SEQ ID NO. 15:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 5 aminokyselin • · · ·
168 ··· · ·· ··· ··· t · * · * « · (B) TYP: aminokyselinová (D) TOPOLOGIE: cirkulární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: interní (ix) VLASTNOSTI.
(A) NÁZEV/KLÍČOVÉ SLOVO: peptid (B) LOKALIZACE: 5 (D) DALŠÍ INFORMACE: /poznámka= „Methylace je na amino (NH2) konci valinového zbytku“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO 15: Arg Gly Asp Phe Val 1 5 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 16:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 5 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (D) TOPOLOGIE: cirkulární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: interní (ix) VLASTNOSTI:
(A) NÁZEV/KLÍČOVÉ SLOVO: peptid (B) LOKALIZACE: 5 (D) DALŠÍ INFORMACE: / poznámka= „Methylace je na amino (NH2) konci valinového zbytku“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO 16: Arg Gly Glu Phe Val 1 5 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 17:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 222 aminokyselin
169 (B) TYP: aminokyselinová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (v) TYP FRAGMENTU: C-koncový (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO 17:
Lys 1 Gly Ile Gin Glu Leu Tyr 5 Gly Ala Ser Pro 10 Asp Ile Asp Leu 15 Gly
Thr Gly Pro Thr Pro Thr Leu Gly Pro Val Thr Pro Glu Ile Cys Lys
20 25 30
Gin Asp Ile Val Phe Asp Gly Ile Ala Gin Ile Arg Gly Glu Ile Phe
35 40 45
Phe Phe Lys Asp Arg Phe Ile Trp Arg Thr Val Thr Pro Arg Asp Lys
50 55 60
Pro Met Gly Pro Leu Leu Val Ala Thr Phe Trp Pro Glu Leu Pro Glu
65 70 75 80
Lys Ile Asp Ala Val Tyr Glu Ala Pro Gin Glu Glu Lys Ala Val Phe
85 90 95
Phe Ala Gly Asn Glu Tyr Trp Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Glu Arg
100 105 110
Gly Tyr Pro Lys Pro Leu Thr Ser Leu Gly Leu Pro Pro Asp Val Gin
115 120 125
Arg Val Asp Ala Ala Phe Asn Trp Ser Lys Asn Lys Lys Thr Tyr Ile
130 135 140
Phe Ala Gly Asp Lys Phe Trp Arg Tyr Asn Glu Val Lys Lys Lys Met
145 150 155 160
Asp Pro Gly Phe Pro Lys Leu Ile Ala Asp Ala Trp Asn Ala Ile Pro
165 170 175
Asp Asn Leu Asp Ala Val Val Asp Leu Gin Gly Gly Gly His Ser Tyr 180 185 190
170
Phe Phe Lys Gly Ala Tyr Tyr Leu Lys Leu Glu Asn Gin Ser Leu Lys
195 200 205
Ser Val Lys Phe Gly Ser Ile Lys Ser Asp Trp Leu Gly Cys
210 215 220
(2) INFORMACE O SEQ ID NO: 18:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 193 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (v) TYP FRAGMENTU: C-koncový (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO 18:
Ile 1 Cys Lys Gin Asp 5 Ile Val Phe Asp Gly Ile Ala Gin Ile Arg Gly
10 15
Glu Ile Phe Phe Phe Lys Asp Arg Phe Ile Trp Arg Thr Val Thr Pro
20 25 30
Arg Asp Lys Pro Met Gly Pro Leu Leu Val Ala Thr Phe Trp Pro Glu
35 40 45
Leu Pro Glu Lys Ile Asp Ala Val Tyr Glu Ala Pro Gin Glu Glu Lys
50 55 60
Ala Val Phe Phe Ala Gly Asn Glu Tyr Trp Ile Tyr Ser Ala Ser Thr
65 70 75 80
Leu Glu Arg Gly Tyr Pro Lys Pro Leu Thr Ser Leu Gly Leu Pro Pro
90 95
Asp Val Gin Arg Val Asp Ala Ala Phe Asn Trp Ser Lys Asn Lys Lys 100 105 110
171
Thr Tyr Ile Phe Ala Gly Asp Lys Phe Trp Arg Tyr Asn Glu Val Lys
115 120 125
Lys Lys Met Asp Pro Gly Phe Pro Lys Leu Ile Ala Asp Ala Trp Asn
130 135 140
Ala Ile Pro Asp Asn Leu Asp Ala Val Val Asp Leu Gin Gly Gly Gly
145 150 155 160
His Ser Tyr Phe Phe Lys Gly Ala Tyr Tyr Leu Lys Leu Glu Asn Gin
165 170 175
Ser Leu Lys Ser Val Lys Phe Gly Ser Ile Lys Ser Asp Trp Leu Gly
180 185 190
Cys (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 19:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 74 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (v) TYP FRAGMENTU: interní (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO 19:
Ile Cys Lys Gin Asp Ile Val Phe Asp Gly Ile Ala Gin Ile Arg Gly
1 5 10 15
Glu Ile Phe Phe Phe Lys Asp Arg Phe Ile Trp Arg Thr Val Thr Pro
20 25 30
Arg Asp Lys Pro Met Gly Pro Leu Leu Val Ala Thr Phe Trp Pro Glu
35 40 45
Leu Pro Glu Lys Ile Asp Ala Val Tyr Glu Ala Pro Gin Glu Glu Lys
55 60
Ala Val Phe Phe Ala Gly Asn Glu Tyr Trp 65 70 • · · · • · · ·
172 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 20:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 108 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (v) TYP FRAGMENTU: interní (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO 20
Ile Cys Lys Gin Asp Ile Val Phe Asp Gly Ile Ala Gin Ile Arg Gly
1 5 10 15
Glu Ile Phe Phe Phe Lys Asp Arg Phe Ile Trp Arg Thr Val Thr Pro
20 25 30
Arg Asp Lys Pro Met Gly Pro Leu Leu Val Ala Thr Phe Trp Pro Glu
35 40 45
Leu Pro Glu Lys Ile Asp Ala Val Tyr Glu Ala Pro Gin Glu Glu Lys
50 55 60
Ala Val Phe Phe Ala Gly Asn Glu Tyr Trp Ile Tyr Ser Ala Ser Thr
65 70 75 80
Leu Glu Arg Gly Tyr Pro Lys Pro Leu Thr Ser Leu Gly Leu Pro Pro
90 95
Asp Val Gin Arg Val Asp Ala Ala Phe Asn Trp Ser 100 105 • · · · • · (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 21:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 122 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (v) TYP FRAGMENTU: C-koncový (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO 21:
Glu Tyr Trp Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Glu Arg Gly Tyr Pro Lys
1 5 10 15
Pro Leu Thr Ser Leu Gly Leu Pro Pro Asp Val Gin Arg Val Asp Ala
20 25 30
Ala Phe Asn Trp Ser Lys Asn Lys Lys Thr Tyr Ile Phe Ala Gly Asp
35 40 45
Lys Phe Trp Arg Tyr Asn Glu Val Lys Lys Lys Met Asp Pro Gly Phe
50 55 60
Pro Lys Leu Ile Ala Asp Ala Trp Asn Ala Ile Pro Asp Asn Leu Asp
65 70 75 80
Ala Val Val Asp Leu Gin Gly Gly Gly His Ser Tyr Phe Phe Lys Gly
85 90 95
Ala Tyr Tyr Leu Lys Leu Glu Asn Gin Ser Leu Lys Ser Val Lys Phe
100 105 110
Gly Ser Ile Lys Ser Asp Trp Leu Gly Cys 115 120 • · · · « · • · · ·
174
(2) INFORMACE O SEQ ID NO: 22:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 89 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (v) TYP FRAGMENTU: C-koncový
(xi) POPIS SEK VENCE: SE< Q ID NO 22:
Phe Asn Trp Ser Lys Asn Lys Lys Thr Tyr Ile Phe Ala Gly Asp Lys
1 5 10 15
Phe Trp Arg Tyr Asn Glu Val Lys Lys Lys Met Asp Pro Gly Phe Pro
20 25 30
Lys Leu Ile Ala Asp Ala Trp Asn Ala Ile Pro Asp Asn Leu Asp Ala
35 40 45
Val Val Asp Leu Gin Gly Gly Gly His Ser Tyr Phe Phe Lys Gly Ala
50 55 60
Tyr Tyr Leu Lys Leu Glu Asn Gin Ser Leu Lys Ser Val Lys Phe Gly
65 70 75 80
Ser Ile Lys Ser Asp Trp Leu Gly Cys
(2) INFORMACE O SEQ ID NO: 23:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 228 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (D) TOPOLOGIE: lineární
175 • • • • • • · • * · • • · • » • · ·
(ii) TYP MOLEKULY; protein
(v) TYP FRAGMENTU: C-koncový
(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO 23:
Lys Gly Ile Gin Glu Leu Tyr Glu Val Ser Pro Asp Val Glu Pro Gly
1 5 10 15
Pro Gly Pro Gly Pro Gly Pro Gly Pro Arg Pro Thr Leu Gly Pro Val
20 25 30
Thr Pro Glu Leu Cys Lys His Asp Ile Val Phe Asp Gly Val Ala Gin
35 40 45
Ile Arg Gly Glu Ile Phe Phe Phe Lys Asp Arg Phe Met Trp Arg Thr
50 55 60
Val Asn Pro Arg Gly Lys Pro Thr Gly Pro Leu Leu Val Ala Thr Phe
65 70 75 80
Trp Pro Asp Leu Pro Glu Lys Ile Asp Ala Val Tyr Glu Ser Pro Gin
85 90 95
Asp Glu Lys Ala Val Phe Phe Ala Gly Asn Glu Tyr Trp Val Tyr Thr
100 105 110
Ala Ser Asn Leu Asp Arg Gly Tyr Pro Lys Lys Leu Thr Ser Leu Gly
115 120 125
Leu Pro Pro Asp Val Gin Arg Ile Asp Ala Ala Phe Asn Trp Gly Arg
130 135 140
Asn Lys Lys Thr Tyr Ile Phe Ser Gly Asp Arg Tyr Trp Lys Tyr Asn
145 150 155 160
Glu Glu Lys Lys Lys Met Glu Leu Ala Thr Pro Lys Phe Ile Ala Asp
165 170 175
Ser Trp Asn Gly Val Pro Asp Asn Leu Asp Ala Val Leu Gly Leu Thr
180 185 190
Asp Ser Gly Tyr Thr Tyr Phe Phe Lys Asp Gin Tyr Tyr Leu Gin Met
195 200 205
• · « ·
9
9 9 9 ·
176
Glu Asp Lys Ser Leu Lys Ile Val Lys Ile Gly Lys Ile Ser Ser Asp 210 215 220
Trp Leu Gly Cys 225 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 24:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 193 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (v) TYP FRAGMENTU: C-koncový (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO 24:
Leu 1 Cys Lys His Asp Ile 5 Val Phe Asp Gly Val Ala Gin Ile Arg Gly
10 15
Glu Ile Phe Phe Phe Lys Asp Arg Phe Met Trp Arg Thr Val Asn Pro
20 25 30
Arg Gly Lys Pro Thr Gly Pro Leu Leu Val Ala Thr Phe Trp Pro Asp
35 40 45
Leu Pro Glu Lys Ile Asp Ala Val Tyr Glu Ser Pro Gin Asp Glu Lys
50 55 60
Ala Val Phe Phe Ala Gly Asn Glu Tyr Trp Val Tyr Thr Ala Ser Asn
65 70 75 80
Leu Asp Arg Gly Tyr Pro Lys Lys Leu Thr Ser Leu Gly Leu Pro Pro
85 90 95
Asp Val Gin Arg Ile Asp Ala Ala Phe Asn Trp Gly Arg Asn Lys Lys
100 105 110
Thr Tyr Ile Phe Ser Gly Asp Arg Tyr Trp Lys Tyr Asn Glu Glu Lys 115 120 125 • · • · • · · ·
177 • 4> » · · ·
Lys Lys 130 Met Glu Leu Ala Thr 135 Pro Lys Phe Ile Ala 140 Asp Ser Trp Asn
Gly Val Pro Asp Asn Leu Asp Ala Val Leu Gly Leu Thr Asp Ser Gly
145
150
155
160
Tyr Thr Tyr Phe Phe Lys Asp Gin Tyr Tyr Leu Gin Met Glu Asp Lys
165 170 175
Ser Leu Lys Ile Val Lys Ile Gly Lys Ile Ser Ser Asp Trp Leu Gly
180 185 190
Cys -
(2)1 NFORMACE O SEQ ' ID NO: 25:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 74 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (v) TYP FRAGMENTU: interní (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO 25:
Leu 1 Cys Lys His Asp 5 Ile Val Phe Asp Gly 10 Val Ala Gin Ile Arg 15 Gly
Glu Ile Phe Phe 20 Phe Lys Asp Arg Phe 25 Met Trp Arg Thr Val 30 Asn Pro
Arg Gly Lys 35 Pro Thr Gly Pro Leu 40 Leu Val Ala Thr Phe 45 Trp Pro Asp
Leu Pro Glu Lys Ile Asp Ala Val Tyr Glu Ser Pro Gin Asp Glu Lys
55 60
Ala Val Phe Phe Ala Gly Asn Glu Tyr Trp 65 70
178 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 26:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 108 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (v) TYP FRAGMENTU: interní (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO 26
Leu Cys Lys His Asp Ile Val Phe Asp Gly Val Ala Gin Ile Arg Gly
1 5 10 15
Glu Ile Phe Phe Phe Lys Asp Arg Phe Met Trp Arg Thr Val Asn Pro
20 25 30
Arg Gly Lys Pro Thr Gly Pro Leu Leu Val Ala Thr Phe Trp Pro Asp
35 40 45
Leu Pro Glu Lys Ile Asp Ala Val Tyr Glu Ser Pro Gin Asp Glu Lys
50 55 60
Ala Val Phe Phe Ala Gly Asn Glu Tyr Trp Val Tyr Thr Ala Ser Asn
65 70 75 80
Leu Asp Arg Gly Tyr Pro Lys Lys Leu Thr Ser Leu Gly Leu Pro Pro
85 90 95
Asp Val Gin Arg Ile Asp Ala Ala Phe Asn Trp Gly
100 105 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 27:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE.
(A) DÉLKA: 122 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (D) TOPOLOGIE: lineární ·· ··** • O ··9 · • · (ii) TYP MOLEKULY: protein (v) TYP FRAGMENTU: C-koncový
( xi) POPIS S EKVENCE: SEQ ID NO 27:
Glu Tyr Trp Val Tyr Thr Ala Ser Asn Leu Asp Arg Gly Tyr Pro Lys
1 5 10 15
Lys Leu Thr Ser Leu Gly Leu Pro Pro Asp Val Gin Arg Ile Asp Ala
20 25 30
Ala Phe Asn Trp Gly Arg Asn Lys Lys Thr Tyr Ile Phe Ser Gly Asp
35 40 45
Arg Tyr Trp Lys Tyr Asn Glu Glu Lys Lys Lys Met Glu Leu Ala Thr
50 55 60
Pro Lys Phe Ile Ala Asp Ser Trp Asn Gly Val Pro Asp Asn Leu Asp
65 70 75 80
Ala Val Leu Gly Leu Thr Asp Ser Gly Tyr Thr Tyr Phe Phe Lys Asp
85 90 95
Gin Tyr Tyr Leu Gin Met Glu Asp Lys Ser Leu Lys Ile Val Lys Ile
100 105 110
Gly Lys Ile Ser Ser Asp Trp Leu Gly Cys
115 120
(2) INFORMACE O SEQ ID NO: 28:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 89 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (v) TYP FRAGMENTU: C-koncový • 4 « « >· « 4
180 (xi) POPIS SEKVENCE. SEQ ID NO 28:
9· ···· ·«' 9··· • · * ♦ · • · 4 · » · • 5 · »· · * · «•4« « * · « • * ·· · » · ·
Phe 1 Asn Trp Gly Arg 5 Asn Lys Lys Thr Tyr Ile Phe Ser Gly Asp Arg
10 15
Tyr Trp Lys Tyr Asn Glu Glu Lys Lys Lys Met Glu Leu Ala Thr Pro
20 25 30
Lys Phe Ile Ala Asp Ser Trp Asn Gly Val Pro Asp Asn Leu Asp Ala
35 40 45
Val Leu Gly Leu Thr Asp Ser Gly Tyr Thr Tyr Phe Phe Lys Asp Gin
50 55 60
Tyr Tyr Leu Gin Met Glu Asp Lys Ser Leu Lys Ile Val Lys Ile Gly
65 70 75 80
Lys Ile Ser Ser Asp Trp Leu Gly Cys
(2) INFORMACE O SEQ ID NO: 29:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 2123 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: dvouřetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÝ: ne (iv) ANTI-SENSE: ne (ix) VLASTNOST:
(A) NÁZEV/KLÍČOVÉ SLOVO: CDS (B) LOKALIZACE: 132...2123 • · · · • ·
181 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO 29:
AATTCCGGCA AAAGAGAAAA CGGTGCAGAG AGTTAAGATG TGCAGATAAG CAACTAGTGC
ACTGTGCAGC CAAAGTAACT GACAGTCAGT CAGAGAAATC TTTTAAAGAG GATTGCAAAA
ATATAGGCAG A ATG AAG ACT CAC AGT GTT TTT GGC TTC TTT TTT AAA GTA Met Lys Thr His Ser Val Phe Gly Phe Phe Phe Lys Val
1 5 10
CTA TTA ATC CAA GTG TAT CTT TTT AAC AAA ACT TTA GCT GCA CCG TCA
Leu Leu Ile Gin Val Tyr Leu Phe Asn Lys Thr Leu Ala Ala Pro Ser
15 20 25
CCA ATC ATT AAG TTC CCT GGA GAC AGC ACT CCA AAA ACA GAC AAA GAG
Pro Ile Ile Lys Phe Pro Gly Asp Ser Thr Pro Lys Thr Asp Lys Glu
30 35 60 45
CTA GCA GTG CAA TAC CTG AAT AAA TAT TAT GGA TGC CCA AAA GAC AAT
Leu Ala Val Gin Tyr Leu Asn Lys Tyr Tyr Gly Cys Pro Lys Asp Asn
50 55 60
TGC AAC TTA TTT GTA TTG AAA GAT ACT TTG AAG AAA ATG CAG AAA TTT
Cys Asn Leu Phe Val Leu Lys Asp Thr Leu Lys Lys Met Gin Lys Phe
65 70 75
TTT GGG CTG CCT GAA ACA GGA GAT TTG GAT CAA AAC ACA ATT GAG ACA
Phe Gly Leu Pro Glu Thr Gly Asp Leu Asp Gin Asn Thr Ile Glu Thr
80 85 90
ATG AAG AAA CCC CGC TGT GGT AAC CCC GAT GTG GCC AAT TAC AAC TTC
Met Lys Lys Pro Arg Cys Gly Asn Pro Asp Val Ala Asn Tyr Asn Phe
95 100 105
TTT CCA AGA AAG CCA AAA TGG GAA AAG AAT CAT ATA ACA TAC AGG ATT
Phe Pro Arg Lys Pro Lys Trp Glu Lys Asn His Ile Thr Tyr Arg Ile
110 115 120 125
ATA GGC TAT ACC CCG GAT TTG GAT CCT GAG ACA GTA GAT GAT GCC TTT
Ile Gly Tyr Thr Pro Asp Leu Asp Pro Glu Thr Val Asp Asp Ala Phe
130 135 140
• · · · • · * ► · · « • · · · · · • · · • · ·
182
GCC CGA GCC TTT AAA GTC TGG AGT GAT GTC ACG CCA Pro CTG AGA TTT AAC
Ala Arg Ala Phe 145 Lys Val Trp Ser Asp 150 Val Thr Leu Arg 155 Phe Asn
CGA ATA AAT GAT GGA GAG GCA GAC ATT ATG ATT AAT TTT GGC CGA TGG
Arg Ile Asn Asp Gly Glu Ala Asp Ile Met Ile Asn Phe Gly Arg Trp
160 165 170
GAA CAT GGT GAT GGC TAT CCA TTT GAT GGC AAA GAT GGT CTC CTG GCT
Glu His Gly Asp Gly Tyr Pro Phe Asp Gly Lys Asp Gly Leu Leu Ala
175 180 185
CAC GCC TTT GCA CCG GGG CCA GGA ATT GGA GGA GAC TCC CAT TTT GAT
His Ala Phe Ala Pro Gly Pro Gly Ile Gly Gly Asp Ser His Phe Asp
190 195 200 205
GAT GAT GAA CTG TGG ACT CTT GGA GAA GGG CAA GTG GTT AGA GTA AAG
Asp Asp Glu Leu Trp Thr Leu Gly Glu Gly Gin Val Val Arg Val Lys
210 215 220
TAT GGA AAT GCA GAT GGT GAA TAC TGC AAA TTT CCC TTC TGG TTC AAT
Tyr Gly Asn Ala Asp Gly Glu Tyr Cys Lys Phe Pro Phe Trp Phe Asn
225 230 235
GGT AAG GAA TAC AAC AGC TGC ACA GAT GCA GGA CGT AAT GAT GGA TTC
Gly Lys Glu Tyr Asn Ser Cys Thr Asp Ala Gly Arg Asn Asp Gly Phe
240 245 250
CTC TGG TGT TCC ACA ACC AAA GAC TTT GAT GCA GAT GGC AAA TAT GGC
Leu Trp Cys Ser Thr Thr Lys Asp Phe Asp Ala Asp Gly Lys Tyr Gly
255 260 265
TTT TGT CCC CAT GAG TCA CTT TTT ACA ATG GGT GGC AAT GGT GAT GGA
Phe Cys Pro His Glu Ser Leu Phe Thr Met Gly Gly Asn Gly Asp Gly
270 275 280 285
CAG CCC TGC AAG TTT CCC TTT AAA TTT CAA GGC CAG TCC TAT GAC CAG
Gin Pro Cys Lys Phe Pro Phe Lys Phe Gin Gly Gin Ser Tyr Asp Gin
290 295 300
TGT ACA ACA GAA GGC AGG ACA GAT GGA TAC AGA TGG TGT GGA ACC ACT
Cys Thr Thr Glu Gly Arg Thr Asp Gly Tyr Arg Trp Cys Gly Thr Thr
305 310 315 • * ’ · · e · ·
Φ · ·
183 • · ’ • · · ’ • · · · • · · · · ’ • · ··
GAA GAC TAT GAT AGA Glu Asp Tyr Asp Arg GAT AAG AAA TAC GGA TTC TGC CCA GAA ACT GCC Ala
Asp Lys Lys 325 Tyr Gly Phe Cys Pro 330 Glu Thr
320
ATG TCA ACA GTT GGT GGA AAT TCA GAA GGA GCT CGT TGT GTA TTC CCC
Met Ser Thr Val Gly Gly Asn Ser Glu Gly Ala Pro Cys Val Phe Pro
335 340 345
TTC ÁTC TTC CTT GGG AAT AAA TAC GAC TCC TGT ACA AGT GCA GGT CGC
Phe Ile Phe Leu Gly Asn Lys Tyr Asp Ser Cys Thr Ser Ala Gly Arg
350 355 360 365
AAT GAT GGC AAG CTG TGG TGT GCT TCT ACC AGC AGC TAT GAT GAT GAC
Asn Asp Gly Lys Leu Trp Cys Ala Ser Thr Ser Ser Tyr Asp Asp Asp
370 375 380
CGC AAG TGG GGC TTT TGT CCA GAT CAA GGA TAC AGT CTC TTC TTG GTT
Arg Lys Trp Gly Phe Cys Pro Asp Gin Gly Tyr Ser Leu Phe Leu Val
385 390 395
GCT GCC CAC GAA TTT GGC CAT GCG ATG GGA TTA GAG CAC TCC GAG GAC
Ala Ala His Glu Phe Gly His Ala Met Gly Leu Glu His Ser Glu Asp
400 405 410
CCA GGA GCT CTG ATG GCC CCG ATC TAC ACC TAC ACC AAG AAC TTC CGC
Pro Gly Ala Leu Met Ala Pro Ile Tyr Thr Tyr Thr Lys Asn Phe Arg
415 420 425
CTT TCT CAG GAT GAC ATT AAG GGG ATT CAG GAG CTA TAT GAA GTA TCA
Leu Ser Gin Asp Asp Ile Lys Gly Ile Gin Glu Leu Tyr Glu Val Ser
430 435 440 445
CCT GAT GTG GAA CCT GGA CCA GGG CCA GGA CCA GGG CCA GGA CCA CGT
Pro Asp Val Glu Pro Gly Pro Gly Pro Gly Pro Gly Pro Gly Pro Arg
450 455 460
CCT ACC CTT GGA CCT GTC ACT CCA GAG CTC TGC AAG CAC GAC ATT GTA
Pro Thr Leu Gly Pro Val .Thr Pro Glu Leu Cys Lys His Asp Ile Val
465 470 475
TTT GAT GGA GTT GCA CAA ATT AGA GGA GAA ATA TTT TTC TTC AAA GAC
Phe Asp Gly Val Ala Gin Ile Arg Gly Glu Ile Phe Phe Phe Lys Asp
480 485 490
184 • ·
AGA TTC ATG TGG • e AGG ACT GTA AAC CCT CGA GGA • · • · « AAA Lys 505 • · CCC Pro • · * ACA Thr • • · GGT Gly • • · CCT Pro
Arg Phe 495 Met Trp Arg Thr Val 500 Asn Pro Arg Gly
CTT CTC GTT GCT ACA TTC TGG CCT GAT CTG CCA GAG AAA ATC GAT GCT
Leu Leu· Val Ala Thr Phe Trp Pro Asp Leu Pro Glu Lys Ile Asp Ala
510 515 520 525
GTC TAC GAG TCC CCT CAG GAT GAG AAG GCT GTA TTT TTT GCA GGA AAT
Val Tyr Glu Ser Pro Gin Asp Glu Lys Ala Val Phe Phe Ala Gly Asn
530 535 540
GAG TAC TGG GTT TAT ACA GCC AGC AAC CTG GAT AGG GGC TAT CCA AAG
Glu Tyr Trp Val Tyr Thr Ala Ser Asn Leu Asp Arg Gly Tyr Pro Lys
545 550 555
AAA CTC ACC AGC CTG GGA CTA CCC CCT GAT GTG CAA CGC ATT GAT GCA
Lys Leu Thr Ser Leu Gly Leu Pro Pro Asp Val Gin Arg Ile Asp Ala
560 565 570
GCC TTC AAC TGG GGC AGA AAC AAG AAG ACA TAT ATT TTC TCT GGA GAC
Ala Phe Asn Trp Gly Arg Asn Lys Lys Thr Tyr Ile Phe Ser Gly Asp
575 580 585
AGA TAC TGG AAG TAC AAT GAA GAA AAG AAA AAA ATG GAG CTT GCA ACC
Arg Tyr Trp Lys Tyr Asn Glu Glu Lys Lys Lys Met Glu Leu Ala Thr
590 595 600 605
CCA AAA TTC ATT GCG GAT TCT TGG AAT GGA GTT CCA GAT AAC CTC GAT
Pro Lys Phe Ile Ala Asp Ser Trp Asn Gly Val Pro Asp Asn Leu Asp
610 615 620
GCT GTC CTG GGT CTT ACT GAC AGC GGG TAC ACC TAT TTT TTC AAA GAC
Ala Val Leu Gly Leu Thr Asp Ser Gly Tyr Thr Tyr Phe Phe Lys Asp
625 630 635
CAG TAC TAT CTA CAA ATG GAA GAC AAG AGT TTG AAG ATT GTT AAA ATT
Gin Tyr Tyr Leu Gin Met Glu Asp Lys Ser Leu Lys Ile Val Lys Ile
640 645 650
GGC AAG ATA AGT TCT GAC TGG TTG GGT TGC TG
Gly Lys Ile Ser Ser Asp Trp Leu Gly Cys
655 660
185 • · · • · • · • · • · « « · • · · • • • • • « • · · · · · • · · • * · » · · · « * • · • « • · · e • • 9
• * · 1 · · • «
(2) INFORMACE 0 SEQ ID NO: 30:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 663 aminokyselin
(B) TYP: aminokys elinová
(D) TOPOLOGIE: lineární
(ii) TYP MOLEKULY: protein
(xi) POPIS SEKVENCE. SEQ ID NO 30:
Met Lys Thr His Ser Val Phe Gly Phe Phe Phe Lys Val Leu Leu Ile
1 5 10 15
Gin Val Tyr Leu Phe Asn Lys Thr Leu Ala Ala Pro Ser Pro Ile Ile
20 25 30
Lys Phe Pro Gly Asp Ser Thr Pro Lys Thr Asp Lys Glu Leu Ala Val
35 40 45
Gin Tyr Leu Asn Lys Tyr Tyr Gly Cys Pro Lys Asp Asn Cys Asn Leu
50 55 60
Phe Val Leu Lys Asp Thr Leu Lys Lys Met Gin Lys Phe Phe Gly Leu
65 70 75 80
Pro Glu Thr Gly Asp Leu Asp Gin Asn Thr Ile Glu Thr Met Lys Lys
85 90 95
Pro Arg Cys Gly Asn Pro Asp Val Ala Asn Tyr Asn Phe Phe Pro Arg
100 105 110
Lys Pro Lys Trp Glu Lys Asn His Ile Thr Tyr Arg Ile Ile Gly Tyr
115 120 125
Thr Pro Asp Leu Asp Pro Glu Thr Val Asp Asp Ala Phe Ala Arg Ala
130 135 140
Phe Lys Val Trp Ser Asp Val Thr Pro Leu Arg Phe Asn Arg Ile Asn
145 150 155 160
Asp Gly Glu Ala Asp Ile Met Ile Asn Phe Gly Arg Trp Glu His Gly 165 170 175 • ·
186
• • Asp Gly Tyr Pro Phe Asp Gly Lys Asp Gly » · • * « Leu • Leu • · • · Ala • · • · His 190 • · Ala • • · Phe
180 185
Ala Pro Gly Pro Gly Ile Gly Gly Asp Ser His Phe Asp Asp Asp Glu
195 200 205
Leu Trp Thr Leu Gly Glu Gly Gin Val Val Arg Val Lys Tyr Gly Asn
210 215 220
Ala Asp Gly Glu Tyr Cys Lys Phe Pro Phe Trp Phe Asn Gly Lys Glu
225 230 235 240
Tyr Asn Ser Cys Thr Asp Ala Gly Arg Asn Asp Gly Phe Leu Trp Cys
245 250 255
Ser Thr Thr Lys Asp Phe Asp Ala Asp Gly Lys Tyr Gly Phe Cys Pro
260 265 270
His Glu Ser Leu Phe Thr Met Gly Gly Asn Gly Asp Gly Gin Pro Cys
275 280 285
Lys Phe Pro Phe Lys Phe Gin Gly Gin Ser Tyr Asp Gin Cys Thr Thr
290 295 300
Glu Gly Arg Thr Asp Gly Tyr Arg Trp Cys Gly Thr Thr Glu Asp Tyr
305 310 315 320
Asp Arg Asp Lys Lys Tyr Gly Phe Cys Pro Glu Thr Ala Met Ser Thr
325 330 335
Val Gly Gly Asn Ser Glu Gly Ala Pro Cys Val Phe Pro Phe Ile Phe
340 345 350
Leu Gly Asn Lys Tyr Asp Ser Cys Thr Ser Ala Gly Arg Asn Asp Gly
355 360 365
Lys Leu Trp Cys Ala Ser Thr Ser Ser Tyr Asp Asp Asp Arg Lys Trp
370 375 380
Gly Phe Cys Pro Asp Gin Gly Tyr Ser Leu Phe Leu Val Ala Ala His
385 390 395 400
• « · ·
187 • · · ·
Glu Phe Gly His Ala Met Gly Leu Glu His Ser Glu Asp Pro Gly 415 Ala
405 410
Leu Met Ala Pro Ile Tyr Thr Tyr Thr Lys Asn Phe Arg Leu Ser Gin
420 425 430
Asp Asp Ile Lys Gly Ile Gin Glu Leu Tyr Glu Val Ser Pro Asp Val
435 440 445
Glu Pro Gly Pro Gly Pro Gly Pro Gly Pro Gly Pro Arg Pro Thr Leu
450 455 460
Gly Pro Val Thr Pro Glu Leu Cys Lys His Asp Ile Val Phe Asp Gly
465 470 475 480
Val Ala Gin Ile Arg Gly Glu Ile Phe Phe Phe Lys Asp Arg Phe Met
485 490 495
Trp Arg Thr Val Asn Pro Arg Gly Lys Pro Thr Gly Pro Leu Leu Val
500 505 510
Ala Thr Phe Trp Pro Asp Leu Pro Glu Lys Ile Asp Ala Val Tyr Glu
515 520 525
Ser Pro Gin Asp Glu Lys Ala Val Phe Phe Ala Gly Asn Glu Tyr Trp
530 535 540
Val Tyr Thr Ala Ser Asn Leu Asp Arg Gly Tyr Pro Lys Lys Leu Thr
545 550 555 560
Ser Leu Gly Leu Pro Pro Asp Val Gin Arg Ile Asp Ala Ala Phe Asn
565 570 575
Trp Gly Arg Asn Lys Lys Thr Tyr Ile Phe Ser Gly Asp Arg Tyr Trp
580 585 590
Lys Tyr Asn Glu Glu Lys Lys
Lys
Met
Glu Leu Ala Thr
Pro Lys
Phe
595
600
605
Ile Ala Asp Ser Trp Asn Gly Val Pro Asp Asn Leu Asp Ala Val Leu 610 615 620 « ·
188
Gly Leu Thr Asp Ser Gly Tyr Thr Tyr Phe Phe Lys Asp Gin Tyr Tyr
625 630 635 640
Leu Gin Met Glu Asp Lys Ser Leu Lys Ile Val Lys Ile Gly Lys Ile
645 650 655
Ser Ser Asp Trp Leu Gly Cys
660 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 31:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 21 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) ANTI-SENSE: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO 3 1: ATTGAATTCT TCTACAGTTC A (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 32:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 21 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) ANTI-SENSE: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO 32: ATGGGATCCA CTGCAAATTT C (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 33:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
• · « · • · ·
189 (A) DÉLKA: 21 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) ANTI-SENSE: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO 33: GCCGGATCCA TGACCAGTGT A (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 34:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 21 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) ANTI-SENSE: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO 34: GTGGGATCCC TGAAGACTAT G (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 35:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 21 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ, jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) ANTI-SENSE: ne
190 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO 35: AGGGGATCCT TAAGGGGATT C (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 36:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 21 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) ANTI-SENSE: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO 36: CTCGGATCCT CTGCAAGCAC G (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 37:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 21 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE, lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) ANTI-SENSE: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO 37: CTCGGATCCT CTGCAAGCAC G (2) INFORMACE O SEQ ID NO. 38:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 26 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jednořetězcová
191 • · · · • « · · · » · « ► · · 1 ·· ·· ·» (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ, ne (iv) ANTI-SENSE: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO 38: GCAGGATCCG AGTGCTGGGT TTATAC (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 39:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 27 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ, jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) ANTI-SENSE: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO 39: GCAGAATTCA ACTGTGGCAG AAACAAG (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 40:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 26 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE, lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) ANTI-SENSE: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO 40: GTAGAATTCC AGCACTCATT TCCTGC
192 « · • · (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 41:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 24 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) ANTI-SENSE: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO 41: TCTGAATTCT GCCACAGTTG AAGG (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 42:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 21 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) ANTI-SENSE: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO 42: ATTGAATTCT TCTACAGTTC A (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 43:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne
193 (iv) ANTI-SENSE: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO 43: GATGAATTCT ATCGCAAGTT (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 44:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 21 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) ANTI-SENSE: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO 44: CACTGAATTC ATCTGCAAAC A (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 45:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 429 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (v) TYP FRAGMENTU: C-koncový (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO 45
Tyr Cys Lys Phe Pro Phe Leu Phe Asn Gly Lys Glu Tyr Asn Ser Cys
1 5 10 15
Thr Asp Thr Gly Arg Ser Asp Gly Phe Leu Trp Cys Ser Thr Thr Tyr
20 25 30
Asn Phe Glu Lys Asp Gly Lys Tyr Gly Phe Cys Pro His Glu Ala Leu
40 45
194 • ·
Phe Thr Met Gly Gly Asn Ala Glu Gly Gin Pro Cys Lys Phe Pro Phe
50 55 60
Arg Phe Gin Gly Thr Ser Tyr Asp Ser Cys Thr Thr Glu Gly Arg Thr
65 70 75 80
Asp Gly Tyr Arg Trp Cys Gly Thr Thr Glu Asp Tyr Asp Arg Asp Lys
85 90 95
Lys Tyr Gly Phe Cys Pro Glu Thr Ala Met Ser Thr Val Gly Gly Asn
100 105 110
Ser Glu Gly Ala Pro Cys Val Phe Pro Phe Thr Phe Leú Gly Asn Lys
115 120 125
Tyr Glu Ser Cys Thr Ser Ala Gly Arg Ser Asp Gly Lys Met Trp Cys
130 135 140
Ala Thr Thr Ala Asn Tyr Asp Asp Asp Arg Lys Trp Gly Phe Cys Pro
145 150 155 160
Asp Gin Gly Tyr Ser Leu Phe Leu Val Ala Ala His Glu Phe Gly His
165 170 175
Ala Met Gly Leu Glu His Ser Gin Asp Pro Gly Ala Leu Met Ala Pro
180 185 190
Ile Tyr Thr Tyr Thr Lys Asn Phe Arg Leu Ser Gin Asp Asp Ile Lys
195 200 205
Gly Ile Gin Glu Leu Tyr Gly Ala Ser Pro Asp Ile Asp Leu Gly Thr
210 215 220
Gly Pro Thr Pro Thr Leu Gly Pro Val Thr Pro Glu Ile Cys Lys Gin
225 230 235 240
Asp Ile Val Phe Asp Gly Ile Ala Gin Ile Arg Gly Glu Ile Phe Phe
245 250 255
Phe Lys Asp Arg Phe Ile Trp Arg Thr Val Thr Pro Arg Asp Lys Pro 260 265 270
195
Met Gly Pro Leu Leu Val Ala Thr Phe Trp Pro Glu Leu Pro Glu Lys
275 280 285
Ile Asp Ala Val Tyr Glu Ala Pro Gin Glu Glu Lys Ala Val Phe Phe
290 295 300
Ala Gly Asn Glu Tyr Trp Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Glu Arg Gly
305 310 315 320
Tyr Pro Lys Pro Leu Thr Ser Leu Gly Leu Pro Pro Asp Val Gin Arg
325 330 335
Val Asp Ala Ala Phe Asn Trp Ser Lys Asn Lys Lys Thr Tyr Ile Phe
340 345 350
Ala Gly Asp Lys Phe Trp Arg Tyr Asn Glu Val Lys Lys Lys Met Asp
355 360 365
Pro Gly Phe Pro Lys Leu Ile Ala Asp Ala Trp Asn Ala Ile Pro Asp
370 375 380
Asn Leu Asp Ala Val Val Asp Leu Gin Gly Gly Gly His Ser Tyr Phe
385 390 395 400
Phe Lys Gly Ala Tyr Tyr Leu Lys Leu Glu Asn Gin Ser Leu Lys Ser
405 410 415
Val Lys Phe Gly Ser Ile Lys Ser Asp Trp Leu Gly Cys 420 425 • ·
7\í VrA-As
.. .··· ·· ···;
196 j L ’
.. .. ·· ··

Claims (29)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Průmyslový výrobek, obsahující obalový materiál a farmaceutický přípravek, obsažený ve zmíněném obalovém materiálu vyznačující se tím, že zmíněný farmaceutický přípravek je účinným inhibitorem angiogeneze ve tkáni, a že na zmíněném obalovém materiálu je vyznačeno, že zmíněný farmaceutický přípravek může být použit pro léčení různých stavů pomocí inhibice angiogeneze, a že zmíněný farmaceutický přípravek obsahuje angiogenezí inhibující množství α,γβ3 antagonisty, kde zmíněným antagonistou je fúzní protein, polypeptid metaloproteináza z matrix, cyklický polypeptid, nebo organická mimetická sloučenina.
  2. 2. Průmyslový výrobek podle nároku 1 vyznačující se tím, že zmíněná metaloproteináza z matrix zahrnuje polypeptid s aminokyselinovou sekvencí, která obsahuje sekvenci část karboxy-terminální domény metaloproteinázy z matrix.
  3. 3. Průmyslový výrobek podle nároku 2 vyznačující se tím, že zmíněný polypeptid obsahuje aminokyselinovou sekvenci, uvedenou pod čísly SEQ ID NO 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 nebo 28.
  4. 4. Průmyslový výrobek podle nároku 1 vyznačující se tím, že zmíněný cyklický polypeptid má aminokyselinovou sekvenci, uvedenou pod číslem SEQ ID NO 15.
  5. 5. Průmyslový výrobek podle nároku 1 vyznačující se tím, že zmíněná organická mimetická sloučenina má
    9 strukturu, odpovídající vzorcům 7, 9, 10, 12, 14, 15, 16, 17 nebo 18, které jsou popsány v příkladu 7.
  6. 6. Průmyslový výrobek podle nároku 1 vyznačující se tím, že zmíněná tkáň je zanícená a zmíněným stavem je artritida nebo revmatoidní artritida.
  7. 7. Průmyslový výrobek podle nároku 1 vyznačující se tím, že zmíněná tkáň je pevný nádor nebo pevná nádorová metastáza.
  8. 8. Průmyslový výrobek podle nároku 1 vyznačující se tím, že zmíněná tkáň je tkáň rohovky a zmíněným stavem je retinopatie, diabetická retinopatie nebo makulární degenerace.
  9. 9. Průmyslový výrobek podle nároku 1 vyznačující se tím, že zmíněným stavem je restenóza po předchozí angioplastice.
  10. 10. ανβ3 antagonista obsahující polypeptid vyznačující se tím, že aminokyselinová sekvence zmíněného polypeptidu obsahuje část karboxy-terminální domény metaloproteinázy z matrix, tj. polypeptidu, který je schopný vázat integrin (Χνβ3·
  11. 11. Antagonista podle nároku 10 vyznačující se tím, ž e zmíněný polypeptid obsahuje aminokyselinovou sekvenci, uvedenou pod čísly SEQ ID NO 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 nebo 28.
  12. 12. Antagonista podle nároku 10 vyznačující se tím, ž e zmíněný polypeptid je fúzní polypeptid.
  13. 13. Antagonista podle nároku 10 vyznačující se tím, ž e zmíněný polypeptid má aminokyselinovou sekvenci, • · • · 4 · • » • · · ·
    198 uvedenou pod čísly SEQ ID NO 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24,
    25, 26, 27 nebo 28.
  14. 14. αγβ3 antagonista vyznačující se tím, že zahrnuje cyklický polypeptid s aminokyselinovou sekvencí, uvedenou pod číslem SEQ ID NO 15.
  15. 15. αγβ3 antagonista vyznačující se tím, že zahrnuje organickou mimetickou sloučeninu, jejíž struktura odpovídá vzorcům 7, 9, 10, 12, 14, 15, 16, 17 nebo 18, které jsou popsány v příkladu 7.
  16. 16. Farmaceutický přípravek vyznačující se tím, že obsahuje α,γββ antagonistů podle nároku 6, 14 nebo 15 ve farmaceuticky přijatelném nosiči a v množství dostatečném pro inhibici angiogeneze ve tkáni.
  17. 17. Způsob inhibice angiogeneze ve tkáni, zahrnující aplikaci přípravku s obsahem angiogenezi inhibujícího množství ανβ3 antagonisty na tkáň vyznačující se tím, že zmíněným antagonistou je fúzní protein, polypeptid metaloproteináza z matrix, cyklický polypeptid, nebo organická mimetická látka.
  18. 18. Způsob indukce regrese pevné nádorové tkáně u pacienta, zahrnující podání prostředku s obsahem terapeuticky účinného množství antagonisty integrinu αγβ3, dostatečného pro inhibici růstu pevné nádorové tkáně, zmíněnému pacientu vyznačující se tím, že zmíněným antagonistou je fúzní protein, polypeptid metaloproteináza z matrix, cyklický polypeptid, nebo organická mimetická látka.
  19. 19. Způsob inhibice růstu pevné nádorové tkáně, ve které probíhá neovaskularizace, u pacienta, zahrnující podání prostředku s obsahem terapeuticky účinného množství antagonisty integrinů ανβ3, dostatečného pro inhibici růstu pevné nádorové tkáně, zmíněnému pacientovi, vyznačující se tím, že zmíněným antagonistou je fúzní protein, polypeptid metaloproteináza z matrix, cyklický polypeptid, nebo organická mimetická látka.
  20. 20. Způsob léčby pacienta, trpícího zánětem tkáně, ve které probíhá neovaskularizace, zahrnující podání prostředku s obsahem terapeuticky účinného množství antagonisty integrinů ανβ3 zmíněnému pacientovi, vyznačující se tím, že zmíněným antagonistou je fúzní protein, polypeptid metaloproteináza z matrix, cyklický polypeptid, nebo organická mimetická látka.
  21. 21. Způsob léčby pacienta, trpícího neovaskularizaci tkáně rohovky, zahrnující podání prostředku s obsahem neovaskularizaci inhibujícího množství antagonisty integrinů ανβ3 zmíněnému pacientovi, vyznačující se tím, ž e zmíněným antagonistou je fúzní protein, polypeptid metaloproteináza z matrix, cyklický polypeptid, nebo organická mimetická látka.
  22. 22. Způsob léčby pacienta, trpícího restenózou tkáně, t.j. u kterého dochází následně po angioplastice k migraci buněk hladkého svalstva, zahrnující podání prostředku s obsahem terapeuticky účinného množství antagonisty integrinů ανβ3 zmíněnému pacientovi, vyznačující se tím, že zmíněným antagonistou je fúzní protein, polypeptid metaloproteináza z matrix, cyklický polypeptid, nebo organická mimetická látka.
  23. 23. Způsob redukce krevního zásobení tkáně, nezbytného pro růst zmíněné tkáně u pacienta, zahrnující podání prostředku s • · « · • · · · • ·
    200 obsahem terapeuticky účinného množství antagonisty integrinu ανβ3, dostačujícího pro redukci zmíněného krevního zásobení zmíněné tkáně, zmíněnému pacientovi, vyznačující se tím, že zmíněným antagonistou je fúzní protein, polypeptid metaloproteináza z matrix, cyklický polypeptid, nebo organická mimetická látka.
  24. 24. Způsob podle nároků 17 až 23 vyznačující se tím, ž e zmíněný antagonista αγβ3 integrinu přednostně inhibuje vazbu fibrinogenu na ανβ3 receptor ve srovnání s vazbou fibrinogenu na receptor οίι^β3.
  25. 25. Způsob podle nároků 17 až 23 vyznačující se tím, ž e zmíněný antagonista αγβ3 zahrnuje polypeptid s aminokyselinovou sekvencí, obsahující část karboxyterminální domény metaloproteinázy z matrix.
  26. 26. Způsob podle nároků 17 až 23 vyznačující se tím, ž e zmíněný antagonista α,γβ3 obsahuje aminokyselinovou sekvenci, uvedenou pod čísly SEQ ID NO 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 nebo 28.
  27. 27. Způsob podle nároků 17 až 23 vyznačující se tím, ž e zmíněný antagonista α,γβ3 má aminokyselinovou sekvenci, uvedenou pod čísly SEQ ID NO 15, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 nebo 28.
  28. 28. Způsob podle nároků 17 až 23 vyznačující se tím, ž e zmíněná organická mimetická sloučenina má strukturu, odpovídající vzorcům 7, 9, 10, 12, 14, 15, 16, 17 nebo 18, které jsou popsány v příkladu 7.
  29. 29. Způsob podle nároků 17 až 23 vyznačující se tím, že zmíněná tkáň je lidská tkáň.
    201 • · • · « · « « • · · · ♦ · » ·
    Způsob podle nároků 17 nebo 20 vyznačující se tím, že zmíněná tkáň je zanícená a zmíněná angiogeneze je angiogeneze v zanícené tkáni.
    Způsob podle nároku 30 vyznačující se tím, že zmíněná tkáň je artritická.
    Způsob podle nároku 31 vyznačující se tím, že se zmíněná tkáň nachází u savce trpícího revmatoidní artritidou. Způsob podle nároku 17, 20 nebo 21 vyznačující se tím, že zmíněná tkáň je tkáň rohovky a zmíněná angiogeneze je retinální angiogeneze.
    Způsob podle nároku 33 vyznačující se tím, že se zmíněná retinální tkáň nachází u pacienta, trpícího diabetickou retinopatií nebo makulární degenerací.
    Způsob podle nároku 17, 18, 19 nebo 23 vyznačující se tím, že zmíněná tkáň je pevný nádor nebo pevná nádorová metastáza a zmíněná angiogeneze je nádorová angiogeneze.
    Způsob podle nároku 35 vyznačující se tím, že zmíněnou tkání je karcinom.
    Způsob podle nároku 35 vyznačující se tím, že zmíněným pevným nádorem je nádor plic, pankreatu, prsu, tlustého střeva, hrtanu, nebo vaječníku.
    Způsob podle nároku 35 vyznačující se tím, že zmíněné podání léčiva pacientovi je koordinováno a spojeno s chemoterapií.
    Způsob podle nároků 17 až 23 vyznačující se tím, ž e zmíněné podání léčiva představuje intravenózní, transdermální, intrasynoviální, intramuskulární nebo orální způsob podání.
    ·· ···· ·· ··* · ?Π9 · · ··· · «♦ ·*;··!
    40. Způsob podle nároků 17 až 23 vyznačující se tím, že zmíněné angiogenezi inhibující množství je dávka od 0,1 mg/kg do asi 300 mg/kg.
    41. Způsob podle nároků 17 až 23 vyznačující se tím, ž e zmíněné terapeuticky účinné množství je dávka od 0,1 mg/kg do asi 300 mg/kg.
    42. Způsob podle nároků 17 až 23 vyznačující se tím, ž e zmíněné podání léčiva představuje jednu dávku podanou intravenózně.
    43. Způsob podle nároků 17 až 23 vyznačující se tím, ž e zmíněné podání léčiva představuje jednu nebo více dávek denně podávaných po dobu jednoho nebo několika dnů.
    44. Způsob podle nároků 17 nebo 22 vyznačující se tím, že zmíněné podání léčiva je ordinováno po angioplastice.
    45. Způsob podle nároku 44 vyznačující se tím, že zmíněná angioplastika je srdeční angioplastika.
    46. Způsob podle nároků 17 nebo 22 vyznačující se tím, že zmíněné podání léčiva je ordinováno u pacienta s hrozícím nebezpečím restenózy následně po angioplastice.
    /46
    ΑηΓι-β3
    Hojení rány OBR. 1B
    Normální kůže
CZ983834A 1996-05-31 1997-05-30 Průmyslový výrobek, antagonista integrinu alfav beta3, farmaceutický přípravek s obsahem alfav beta3 antagonisty a způsob inhibice angiogeneze ve tkáni CZ383498A3 (cs)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US1586996P 1996-05-31 1996-05-31
US1873396P 1996-05-31 1996-05-31

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ383498A3 true CZ383498A3 (cs) 1999-05-12

Family

ID=26687899

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ983800A CZ380098A3 (cs) 1996-05-31 1997-05-30 Způsoby, výrobky, farmaceutické látky a alfa v beta5 antagonisté, vhodní pro inhibici angiogeneze řízené alfa v beta5
CZ983834A CZ383498A3 (cs) 1996-05-31 1997-05-30 Průmyslový výrobek, antagonista integrinu alfav beta3, farmaceutický přípravek s obsahem alfav beta3 antagonisty a způsob inhibice angiogeneze ve tkáni

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ983800A CZ380098A3 (cs) 1996-05-31 1997-05-30 Způsoby, výrobky, farmaceutické látky a alfa v beta5 antagonisté, vhodní pro inhibici angiogeneze řízené alfa v beta5

Country Status (14)

Country Link
EP (2) EP0951295B1 (cs)
JP (1) JP2002515036A (cs)
KR (2) KR20000016302A (cs)
CN (1) CN1226254A (cs)
AT (1) ATE470450T1 (cs)
BR (1) BR9709514A (cs)
CA (2) CA2256588A1 (cs)
CZ (2) CZ380098A3 (cs)
DE (1) DE69739907D1 (cs)
DK (1) DK0951295T3 (cs)
HU (2) HUP9902099A3 (cs)
NO (2) NO985574L (cs)
PL (2) PL330241A1 (cs)
WO (2) WO1997045137A1 (cs)

Families Citing this family (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040063790A1 (en) * 1996-05-31 2004-04-01 The Scripps Research Institute Methods for inhibition of angiogenesis
US7387779B2 (en) 1998-06-17 2008-06-17 Beth Israel Deaconess Medical Center Anti-angiogenic proteins and fragments and methods of use thereof
US6759047B1 (en) 1998-06-17 2004-07-06 Beth Israel Deaconess Hospital Corp. Anti-angiogenic proteins and methods of use thereof
US6962974B1 (en) 1998-06-17 2005-11-08 Beth Israel Deaconess Medical Center Anti-angiogenic proteins and fragments and methods of use thereof
DK1096934T3 (da) * 1998-07-14 2005-11-28 Pharmacia & Upjohn Co Llc Oxazolidinoner til behandling af öjeninfektioner
DE19842415A1 (de) * 1998-09-16 2000-03-23 Merck Patent Gmbh Pharmazeutische Zubereitung
US6521593B1 (en) * 1999-02-01 2003-02-18 Childrens Hospital Los Angeles Methods for inhibiting brain tumor growth
DE60040651D1 (de) * 1999-02-12 2008-12-11 Emd Serono Res Ct Inc Methoden zur behandlung von tumoren und metastasen unter verwendung einer anti-angiogenen und immun-therapien
US6344484B1 (en) 1999-02-12 2002-02-05 3-Dimensional Pharmaceuticals, Inc. Tyrosine alkoxyguanidines as integrin inhibitors
UA71608C2 (en) * 1999-03-11 2004-12-15 Merck Patent Gmbh A method for producing the cyclic pentapeptide
AU2001258638A1 (en) * 2000-05-26 2001-12-03 Glaxo Group Limited Methods for identifying modulators of the interaction between lap (latency associated peptide) and intergrin alpha.v.beta.3 and medical use thereof
CN1329167A (zh) * 2000-06-19 2002-01-02 上海博德基因开发有限公司 一种新的多肽——人非整合蛋白－金属蛋白酶10.67和编码这种多肽的多核苷酸
US6486174B2 (en) 2000-08-07 2002-11-26 3-Dimensional Pharmaceuticals, Inc. Tetrahydroisoquinoline-3-carboxylic acid alkoxyguanidines as integrin antagonists
BR0115077A (pt) 2000-11-01 2003-12-23 Merck Patent Ges Mit Beschroen Métodos e composições para o tratamento de doenças dos olhos
CA2436130A1 (en) 2001-01-29 2002-08-08 3-Dimensional Pharmaceuticals, Inc. Substituted indoles and their use as integrin antagonists
CZ20033119A3 (cs) 2001-04-24 2005-01-12 Merck Patent Gmbh Kombinovaná terapie za použití antiangiogenových činidel a TNF alfa
US6872730B2 (en) 2001-04-27 2005-03-29 3-Dimensional Pharmaceuticals, Inc. Substituted benzofurans and benzothiophenes, methods of making and methods of use as integrin antagonists
US7019108B2 (en) 2001-06-01 2006-03-28 University Of Southern California Method and composition for inhibition of angiogenesis and tumor growth using compounds based on a sequence within MMP-2
BR0211604A (pt) * 2001-08-01 2004-08-24 Merck Patent Gmbh Inibidores de integrina para o tratamento de doenças do olho
DE10159453A1 (de) * 2001-12-04 2003-06-18 Merck Patent Gmbh Verwendung von 1-Phenyl-oxazolidin-2-on-Verbindungen als Protease
GB0217017D0 (en) * 2002-07-23 2002-08-28 Bioacta Ltd Peptide 2
FR2856598B1 (fr) * 2003-06-25 2005-10-28 Inst Nat Sante Rech Med Peptides derives de la proteine mmp-2 et leur utilisation en immunotherapie antitumorale
US7196061B2 (en) * 2003-09-10 2007-03-27 Wyeth Compounds that modulate neuronal growth and their uses
EA016817B1 (ru) 2006-01-18 2012-07-30 Мерк Патент Гмбх Специфическая терапия, использующая интегриновые лиганды для лечения рака
EP1862541A1 (en) * 2006-06-01 2007-12-05 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Polypeptides derived from the hemopexin-like domain of metalloproteinase MMP-2
KR20090108713A (ko) 2007-01-18 2009-10-16 메르크 파텐트 게엠베하 인테그린 리간드를 사용하는 암치료용 특이적 요법 및 의약
WO2009026681A1 (en) * 2007-08-24 2009-03-05 University Health Network Methods of inhibiting tumor growth using beta 5 integrin antagonists
EP2285960B1 (en) 2008-05-08 2015-07-08 Asuragen, INC. Compositions and methods related to mir-184 modulation of neovascularization or angiogenesis
KR20120104491A (ko) 2009-05-25 2012-09-21 메르크 파텐트 게엠베하 암 치료를 위한 실렌기티드의 연속 투여
PL2504035T3 (pl) 2009-11-10 2019-10-31 Allegro Pharmaceuticals Llc Kompozycje i sposoby hamowania adhezji komórkowej lub kierowania środków diagnostycznych lub terapeutycznych do miejsc wiązania RGD
US11673914B2 (en) 2009-11-10 2023-06-13 Allegro Pharmaceuticals, LLC Peptide therapies for reduction of macular thickening
WO2014163156A1 (ja) 2013-04-04 2014-10-09 味の素株式会社 脱保護方法
MX2017003014A (es) * 2014-09-12 2017-05-30 Biogen Ma Inc Anticuerpos anti-alfa v beta 5 humanizados y usos de estos.
CN111748041B (zh) * 2019-03-11 2021-09-14 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 微环境控释型功能化水凝胶、其制备方法及应用
CN116239704B (zh) * 2023-05-09 2023-07-14 北京青云智创科技有限公司 一种治疗新生血管性眼病的多肽及其制剂

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5770565A (en) * 1994-04-13 1998-06-23 La Jolla Cancer Research Center Peptides for reducing or inhibiting bone resorption
CN1313146C (zh) * 1995-08-14 2007-05-02 斯克里普斯研究学院 用于抑制αvβ5介导的血管生成的方法和组合物
DE19534177A1 (de) * 1995-09-15 1997-03-20 Merck Patent Gmbh Cyclische Adhäsionsinhibitoren
DE19538741A1 (de) * 1995-10-18 1997-04-24 Merck Patent Gmbh Cyclopeptidderivate

Also Published As

Publication number Publication date
CN1226254A (zh) 1999-08-18
EP0951295B1 (en) 2010-06-09
WO1997045137A1 (en) 1997-12-04
PL330240A1 (en) 1999-05-10
HUP9902099A2 (hu) 1999-09-28
CA2256588A1 (en) 1997-12-04
EP0907661A1 (en) 1999-04-14
HUP9901628A3 (en) 2002-11-28
ATE470450T1 (de) 2010-06-15
NO985575D0 (no) 1998-11-27
CZ380098A3 (cs) 1999-05-12
DK0951295T3 (da) 2010-09-13
KR20000016302A (ko) 2000-03-25
EP0951295A4 (en) 2000-07-26
DE69739907D1 (de) 2010-07-22
NO985574D0 (no) 1998-11-27
HUP9902099A3 (en) 2001-10-29
WO1997045137A8 (en) 2001-02-01
NO985574L (no) 1999-02-01
WO1997045447A1 (en) 1997-12-04
BR9709514A (pt) 1999-08-10
EP0907661A4 (en) 2000-07-26
NO985575L (no) 1999-02-01
PL330241A1 (en) 1999-05-10
KR20000016301A (ko) 2000-03-25
CA2256543C (en) 2010-12-07
JP2002515036A (ja) 2002-05-21
HUP9901628A2 (hu) 1999-08-30
EP0951295A1 (en) 1999-10-27
CA2256543A1 (en) 1997-12-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ383498A3 (cs) Průmyslový výrobek, antagonista integrinu alfav beta3, farmaceutický přípravek s obsahem alfav beta3 antagonisty a způsob inhibice angiogeneze ve tkáni
AU733303B2 (en) Methods and compositions useful for inhibition of angiogenesis
KR100327081B1 (ko) 혈관형성억제에유용한조성물
JP4903921B2 (ja) αＶβ５仲介血管形成の阻止に有効な方法及び組成物
WO1997045447A9 (en) METHODS AND COMPOSITIONS USEFUL FOR INHIBITION OF αvβ5 MEDIATED ANGIOGENESIS
US20060165703A1 (en) Methods and compositions useful for inhibition of alpha v beta 5 mediated angiogenesis
US20060270710A1 (en) Methods for inhibition of angiogenesis
US20030176334A1 (en) Methods and compositions useful for inhibition of angiogenesis
MXPA98009945A (en) Useful methods and compositions for angiogene inhibition
MXPA98009944A (en) Methods and useful compositions for medium angiogenesis inhibition by alfavbe

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic