KR20000006570A - 생리활성추출물 - Google Patents

Abstract

추출에 사용되는 유기용매중에서 생쪽(raw indigo plant)을 침지시켜 수득되는, 가용성 쪽(indigo plant)의 에틸 아세테이트 성분을 함유한 생리활성 추출물.

에틸 아세테이트 가용성 성분으로서는 3,5,4'-트리히드록시-6,7-메틸렌디옥시-플라본, 켐페롤(kaempferol), 3,5,7,4'-테트라히드록시-6-메톡시-플라본, 갈산(gallic acid), 카페산(caffeic acid), 인디루빈, 페오포르비드(pheophorbide) a, 및 메틸페오포르비드 a 등을 들 수 있다

Description

생리활성 추출물{PHYSIOLOGICALLY ACTIVE EXTRACT}

본 발명은 식물 유래의 신규의 생리활성 추출물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 생쪽(raw indigo plant) 유래의`에틸 아세테이트 가용성 성분을 함유하는 생리활성 추출물, 그 제조방법 및 용도에 관한 것이다.

쪽(indigo plant 또는 Polygonum tinctorium Lour)은 쌍떡잎 식물로 분류되는 마디풀속(polygonum屬)에 속하는 한해살이 식물인데 그 원산지는 남베트남이다.이 식물은 7세기전에 진한 청색 염색용의 식물로서 염색기술과 더불어 중국으로부터 일본에 도입되었는데, 현재 일본국의 토쿠시마현에서 재배되고 있다. 옛날에는 사람들은 쪽의 잎과 씨앗에는 유용한 생리활성 성분이 함유되어 있으며 쪽의 잎과 씨앗을 햇빛에 말려서 생약으로 사용되었던 것으로 생각하고 있다. 문헌 ["Nippon-Yakuso-Zensho" (Encyclopedia of Japanese Medicinal Plants), edited by Mizuo Mizuno, published on February 22, 1995 by Shin-Nihon-Hoki-Shuppan Publisher, Tokyo, Japan, pp. 5 - 7)]에 기재된 바와 같이 쪽은 단순히 소염작용, 완화작용 및 해독작용이 있는 것으로만 알려져 있었다. 이러한 생리작용은 쪽의 잎과 씨앗을 뜨거운 물속에서 침지시켜 제조한 침제(infusion) 형태로 사용할 경우에만 기대할 수 있을 뿐이다.

실질적으로 의,식,주의 불편이 없는 현재의 상황에서는 젊은이들을 포함한 대부분의 사람들은 그들의 건강, 보다 상세하게는 의사의 처방없이 매일 쉽사리 사용할 수 있는 생약에 대해 괄목할만큼 관심을 가지고 있다. 이것은 각종 생약에 관한 여러가지 문헌이 발표되고 있고 여러가지 종류의 건강식품과 건강보조 식품이 식품점과 약국에서 홍수를 이루고 있다는 사실로부터 알 수 있다. 일반적으로 생약은 완만한 작용을 가지고 있고 부작용이 적다는 유리한 장점을 가지고 있으나, 각 개체에 따라서는 상이한 감응성을 가지고 있다는 것이 결점으로 되어있다. 다양한 생리활성을 가진 신규의 생약의 확립은 수요자의 요구에 부응하기 위해 크게 요구되고 있다.

상기한 사정을 고려하여 본 발명의 목적은 식물유래의 다양한 생리작용을 나타내는 신규의 생리활성 추출물을 제공함에 있다.

또한 본발명의 목적은 상기한 생리활성 추출물의 제조방법을 제공함에 있다.

또한 본 발명의 목적은 생리활성 추출물을 함유한 생리활성 조성물을 제공함에 있다.

도 1은 화합물 2인 3,5,4'-트리히드록시-6,7-메틸렌디옥시-플라본의 적외선 흡수 스펙트럼.

도 2는 화합물 3인 켐페롤 (kaempferol)의 적외선 흡수 스펙트럼.

도 3은 화합물 4인 3,5,7,4'-테트라히드록시-6-메톡시-플라본의 적외선 흡수 스펙트럼.

도 4는 화합물 6인 카페산의 적외선 흡수 스펙트럼.

도 5는 화합물 7인 3-(1,3-디히드로-3-옥소-2H-인돌-2-일리덴)-1,3-디히드로-2H-인돌-2-온의 적외선 흡수 스펙트럼.

본 발명자들은 예의 연구한 결과, 생쪽을 유기용매중에 침지시켜 에틸 아세테이트 가용성 성분을 추출하여 얻은 쪽 유래의 신규의 생리활성 추출물 또는 추출물은 포유동물과 인간에 대하여 살균작용, 항바이러스 작용, 항종양 작용, 라디칼 포착작용, 세포 자연괴사증 억제작용, 사이토카인 생성 조절작용, 사이토카인 생성 억제작용 및 일산화 질소 합성효소에 대한 발현 억제작용을 비롯하여 다양한 생리작용을 발휘함을 판명하였다. 또한 본 발명자들은 이 추출물은 포유동물과 인간에 있어서 실질적으로 부작용을 나타내지 않으므로 인간을 위한 식품, 화장품 및 의약품에 안전하게 사용할 수 있음을 발견하였다.

본 발명은 본 발명의 제 1 과제를, 생쪽(raw indigo plant) 유래의 에틸 아세테이트 가용성 성분을 함유한 생리활성 추출물을 제공함으로써 해결한다.

본 발명은 본 발명의 제 2 과제를, 생쪽(raw indigo plant) 유래의 에틸 아세테이트 가용성 성분을 함유한 생리활성 추출물의 제조방법에 있어서, 쪽을 유기용매중에 침지시켜 쪽으로부터 에틸 아세테이트 가용성 성분을 추출하는 단계와, 이 추출물을 채취하는 단계를 특징으로 하는 쪽 유래의 에틸 아세테이트 가용성 성분 함유의 신규의 생리활성 추출물의 제조방법을 제공함으로써 해결한다.

본 발명은 본 발명의 제 3 과제를, 에틸 아세테이트 가용성 성분을 함유한 생리활성 조성물을 제공함으로써 해결한다.

이미 설명한 바와같이 햇빛에 말린 쪽의 잎과 씨앗을 물로 추출한 것은 소염작용, 완화작용 및 해독작용을 발휘한다는 것은 잘 알려져 있다. 쪽을 유기용매로 직접 처리하여 얻은 에틸 아세테이트 가용성 성분이 상기한 다양한 생리작용을 발휘한다는 것은 의외의 발견이다. 본 발명은 이 발견에 근거하여 된 것이다.

본 발명의 바람직한 실시의 형태에 대해 설명하면, 본 발명은 생물학명이 폴리고넘 팅그토륨(Polygonum tinctorium)인 쌍떡잎 식물로 분류되는 마디풀속에 속하는 한해살이 식물인 쪽(indigo plant)에 관한 것이다. 본 발명에서 언급하는 "생쪽(raw indigo plant)"이라는 말은 실질적으로 건조되거나 말라 죽은 것이 아닌 싱싱한 생쪽을 의미한다. 이러한 상태의 것이라면 식물 몸체 전부 및 그 잎, 줄기 및 씨앗의 특정부분 등의 그 종류와 형태에 관계없이 어떠한 쪽이라도 본 발명에서 사용할 수 있다. 가장 바람직하게는 쪽의 신선한 지상부(地上部), 특히 수확전의 식물로부터 얻은 것들을 사용한다.

본 발명의 생리활성 추출물은 생쪽을 유기용매중에서 침지하여 식물로부터 에틸아세테이트 가용성 성분을 추출하고, 이 추출물을 채취함으로써 제조된다. 생쪽의 일부 또는 전부를 물로 씻어 불순물을 제거하고, 필요에 따라 더욱 절단하여 분말화 및/또는 압착한 다음, 생쪽에 대해, 통상적으로 1배 내지 100배 체적의 양의 적당한 유기용매중에서 임의의 가열 조건하에서 0.1∼100시간 침지한다. 본 발명에서 사용되는 유기용매로서는 메탄올, 에탄올, n-프로판올, 이소프로판올, n-부탄올, 이소부탄올, t-부탄올, 메틸 에테르, 에틸 에테르, 테트라히드로푸란, 클로로포름, n-헥산, 아세톤, 에틸 아세테이트 등의 친수성 및 소수성 유기용매가 있다. 이들 유기용매를 용도에 따라 조합하여 사용해도 좋다

본 발명의 생리활성 추출물을 실질적으로 정제함이 없이 사용할 경우에 있어서 에틸 아세테이트 가용성 성분의 추출효율이 오히려 감소하더라도 물과 에탄올 또는 메탄올의 혼합액을 사용하는 것이 바람직하다.

이렇게 하여 얻은 생리활성 추출물을 그대로 사용해도 좋은데, 통상적으로는 여과, 분리, 분별침전, 경사분리 및/또는 원심분리 등의 방법으로 더욱 처리하여 불순물을 제거한후에 사용된 유기용매의 종류와 추출물의 최종 용도에 따라 유기용매를 제거하기 위해 처리를 한다.

유기용매의 종류에 따라 본 발명의 생리활성 추출물은, 에틸 아세테이트 가용성 성분으로서 6,12-디히드로-6,12-디옥소인돌로[2,1-b]퀴나졸린; 3,5,4'-트리히드록시-6,7-메틸렌디옥시-플라본; 켐페롤; 3,5,7,4'-테트라히드록시-6-메톡시-플라본; 갈산; 카페산; 3-(1,3-디히드로-3-옥소-2H-인돌-2-일리덴)-1,3-디히드로-2H-인돌-2-온; [3S-(3α, 4β, 21β)]9-에틸-14-에틸-21-(메톡시카르보닐)-4,8,13,18-테트라메틸-20-옥소-3-포르빈프로판산); 및/또는 [3S-(3α, 4β, 21β)]9-에틸-14-에틸-21(메톡시카르보닐)-4,8,13,18-테트라메틸-20-옥소-3-프로빈프로판산메틸에스테르를 고형물 환산으로 0.01 % 이상 함유한다. 이들 성분은 포유동물과 인간에 있어서 살균작용, 항바이러스 작용, 항종양 작용, 라디칼 포착 작용, 세포자연괴사증억제작용, 및/또는 사이토카인 생성 조절 또는 억제작용을 효과적으로 발휘한다. 예컨대 본 발명의 생리활성 추출물을 비교적 고도로 정제된 형태로 필요로 하는 의약품에 사용할 경우, 인돌 유도체 및 플라본 화합물 정제시에 일반적으로 사용되는 방법에 의해 추출물로부터 에틸 아세테이트 가용성 성분을 미리 분리해야 한다. 정제방법의 예로서는 염석, 투석, 여과, 농축, 액체분리, 분별침전, 경사분리, 액체 크로마토그래피, 가스 크로마토그래피, 고속 액체 크로마토그래피, 결정화 등을 들 수 있다. 필요한 경우에는 이들 방법을 적당히 병용할 수도 있다. 에틸 아세테이트 가용성 성분 각각의 생리작용의 정도는 상이하며 작용범위도 상이하다. 이들을 각각의 성분으로 분리하지 않고 각 성분을 사용할 수 있는 식품을 비롯한 여러 분야에서 사용할 경우 이들이 추출물중에 함유되어 있는한 동일한 비율로 소요의 제품중에 그대로 첨가시키는 것이 바람직하다 이 생리활성 성분은 이러한 형태로 사용할 경우에는 생리작용이 각양각색이라는 결점을 가지고 있다. 이들 성분을 주사제 등의 의약품중에 첨가할 경우에는 성분에 대해 감수성이 있는 질환에 따라 분리후 또는 분리함이 없이 1종 이상의 성분을 임의로 사용할 수 있다. 상기한 방법들은 본 발명의 생리활성 추출물을 제조하기 위한 바람직한 예에 불과할 뿐이고 추출물중에 에틸 아세테이트 가용성 성분을 함유하는 한 본 발명의 생리활성 추출물을 한정하지 않는다.

본 발명의 에틸 아세테이트 가용성 성분을 함유하는 생리활성 추출물은 다음의 성질중 적어도 한가지 이상을 가지고 있고, 포유동물과 인간에 대해 다양한 생리활성을 발휘한다.

(1) 위염, 위궤양, 십이지장 궤양 및 위암을 유발하는 헬리코박터 파일로리 (Holicobacter pylori)를 비롯한 그람 양성균 및 그람 음성균의 성장을 억제함;

(2) 인플루엔자 바이러스, 소수포성 구내염 바이러스, 헤르페스 단순 바이러스, 종두 바이러스 및 거대세포 바이러스의 성장을 억제함;

(3) 백혈병 세포, 위암세포 및 폐암세포를 비롯한 난치성 종양의 종양세포의 성장을 억제함;

(4) 활성산소와 과산화 지방으로부터 유래하며, 악성종양, 심근경색증, 뇌일혈, 류머티스, 노인병, 신장장해, 스트레스, 노화등의 생활방식과 관련된 각종 질환을 유발하는 라디칼을 포착함.

(5) 정상 및 이상 B-세포, T 세포, 신경세포, 소화관의 상피세포, 소화관의 간(幹)세포, 혈관내피 세포, 피부세포등에 작용하여 상기한 세포들의 세포 자연 괴사증 등을 정상상태로 조절하고, 소화기, 순환기, 눈, 귀, 코, 목, 피부, 신경 및 뼈의 각종 질환을 치료/예방함;

(6) 면역담당 세포에 의하여 인터페론-γ와 인터로이킨 10을 비롯한 사이토카인류의 생성을 조절함. 이는 타입 1 헬퍼 T세포 (Th1)와 타입 2헬퍼 T세포 (Th2)사이의 생체내에서의 평형을 결정함으로써 평형을 정상상태내로 조절하며, 자기면역 질환, 간장장해, 신장장해, 췌장장해 등의 질환 및 이식-숙주 반응 관련 질환의 치료/예방과 관련됨.

(7) 사이토카인류와 균체 내독소에 의해 유발된, 생체내 세포에 의한 일산화 질소 합성효소의 발현을 억제하고, 또한 일산화 질소의 생성을 억제하여 자기면역질환, 알레르기성 질환, 염증 질환, 악성종양, 신장장해 및 폐 장해 등의 각종 질환을 치료/예방함,

본 발명의 생리활성 추출물중에서는 생체내에서의 종양증식과 깊이 관련된 맥관형성 저해물질을 함유해도 좋다. 상기한 생리작용 (1) 내지 (6)은 다음에 나오는 실험들의 각종 방법에 위해 확인할 수 있다. 예컨대 일산화 질소 합성효소에 대한 발현억제 작용은 효소에 대한 항체를 사용하는 종래의 방법에 따라 인터페론-γ 또는 리포다당 존재하에 배양했을 경우에 유발된 마우스 복막 대식세포 또는 대식세포 유래의 세포계에 있어서 일반적으로 "유도형 일산화 질소 합성효소(induction-type nitrogen monoxide synthetic enzymes), 즉 "IONS"로 불리우는 효소의 발현에 대한 본 발명의 생리활성 추출물의 첨가의 영향을 시험함으로써 확인할 수 있다. 상기한 배양계에서의 일산화 질소 레벨에 관한 Griess법 등의 종래의 연구결과에서는 이들 효소의 발현억제에 의해 일산화 질소에 대한 생성억제 작용이 있음이 밝혀지고 있다. 더욱이 본 발명의 생리활성 추출물은 생체내에서의 종양증식과 깊이 관련된 맥관형성 억제작용을 발휘한다. 또한 본 발명의 추출물은 그람 양성균, 그람 음성균 및 진균과 각종 바이러스에 의해 유발된 염증을 수반하는 생체내의 조직의 각종 장해, 생체의 각종 단백질, 유기 화합물 및 각종 금속과의 접촉 또는 이들의 침윤, 및 종양발생등에 따른 생체내 조직의 각종 장해에 대해서도 작용하여 생체내의 기능을 조절하므로 본 발명의 생리활성 추출물은 인터페론-γ 및 인터로이킨-1을 비롯한 염증성 사이토카인류의 생성을 저해하여 염증을 억제한다. 이들 다양한 생리작용으로 인해 본 발명의 생리활성 추출물은 각종 질환발생시에 유발되는 수면장해를 개선하는 성질도 가지고 있다. 따라서 본 발명의 생리활성 추출물을 식품, 화장품 및 의약품 등의 산업분야에서 살균작용, 항바이러스 작용, 항종양 작용, 라디칼 포착작용, 세포 자연 괴사증 억제작용, 사이토카인류 생성조절 작용, 사이토카인류 생성억제 작용, 맥관형성 억제작용, 수면장해 개선작용, 생체내 기능 조절작용 및/또는 일산화 질소 합성효소 발현 억제작용을 발휘하는 생약으로서 유리하게 사용할 수 있다.

이들 성질로 인해 본 발명의 생리활성 추출물은, 건강한 개체 및 병중의 개체 또는 상처를 입은 개체에서 살균작용, 항바이러스 작용, 항종양 작용, 라디칼 포착작용 및/또는 세포 자연괴사증 억제작용을 발휘하는 생약으로서 식품, 화장품 및 의약품 등의 분야에서 유리하게 사용할 수 있다.

상기한 각 분야에서의 용도에 대해 설명하자면 본 발명의 생리활성 추출물을 추출물의 흡수를 용이하게하기 위한 식품일반에서 사용되는 1종이상의 재료 및/또는 성분과 병용하여 식품분야에서 사용할 수 있는데, 이들 재료 및/또는 성분의 예로서는 물, 알코올, 전분물질, 단백질, 섬유, 당질, 지질, 지방산, 비타민, 미네랄, 향료, 색소, 감미료, 조미료, 향신료 및 방부제 등을 들 수 잇다.

수득한 혼합물을 식품의 실제적인 용도에 따라 액체, 현탁액, 크리임, 페이스트, 젤리, 분말, 과립 및 기타의 소요의 형상 등의 필요한 제형으로 제제화 할 수 있다. 이러한 식품에서 사용하자면 본 발명의 생리활성 추출물을 0.01 w/w % 이상, 바람직하게는 0.1 w/w %의 양으로 사용한다.

본 발명을 유리하게 적용할 수 있는 식품으로서는, 예컨대 간장, 분말 간장, 미소 (된장), 훈마츠 미소 (분말 된장), 모로미 (정제술), 히시오 (정제 간장), 후리카케 (어육 조미품), 마요네즈, 드레싱, 식초, 산바이 주 (설탕, 간장, 식초로 된 소오스), 훈마츠 스시 수 (초밥용 분말 식초), 텐츠유 (일본식 튀김 식품용 소오스), 멘츠유 (일본식 버어미셀리용 소오스), 소오스, 켓찹, 야구니쿠 노 타레 (일본식 불고기용 소오스), 커리 루우, 츄카 노 모토 (중화 요리용 인스탄트 믹스), 인스탄트 스튜우 믹스, 인스탄트 수우프 믹스, 다시 노 모토 (인스탄트 스톡 믹스), 복합 조미료, 미린 (감미나는 술), 신미린 (합성 미린), 테이블 슈거, 커피 슈거 등의 각종 조미료; 센베이 (쌀 크래커), 아라레 (입방체의 쌀떡), 오코시 (기장과 쌀로 된 케이크), 튀긴 반죽 케이크, 규히 (전분 페이스트), 모치(쌀 페이스트), 만주 (팥 잼 넣은 만두), 우이로 (단맛의 젤리), 안 (팥 잼), 요캉 (단맛의 팥 젤리), 미즈 요캉 (연질의 아즈키 팥 젤리), 킹요쿠 (요캉의 일종), 젤리, 파오 드 카스텔라, 아메다마 (일본식 토피) 등의 일본식 과자; 비스켓, 크래커, 쿠우키, 파이, 푸딩, 크리임 퍼프, 와플, 스폰지 케이크, 도우넛, 초콜렛, 츄잉 검, 카라멜, 캔디, 검 젤리 등의 양과자; 아이스 크리임, 아이스 캔디, 셔어벳 등의 빙과류; 코리미츠 (빙수용 설탕 시럽) 등의 시럽류; 버터 크림, 커스타드 크림, 플라워 페이스트, 피이넛 페이스트, 푸루트 페이스트 등의스프레드 및 페이스트류; 잼, 마아멀레이드, 시럽 즈케 (과실 피클류), 토카 (당과) 등의 과실과 야채의 가공 식품류; 빵, 면, 볶은밥, 인조육 등의 가공 곡류식품; 푸쿠진 즈케 (적색의 무우 피클), 베타라 즈케 (통무우 피클의 일종), 센마이 즈케 (갖썰은 무우 절임의 일종), 라쿄 즈케 (파 절임) 등의 절임 및 절임 제품류; 타쿠앙 즈케 노 모토(절인무우용의 프리믹스) 및 하쿠사이 즈케 노 모토 (배추 겉절임용 프리믹스) 등의 절임 및 절임 제품류용 프리믹스; 햄, 소오세지 등의 축육 제품류; 어육햄, 어육 소오세지, 어묵, 치쿠와 (어묵의 일종), 튀긴 어묵 등의 어육제품류; 성게 내장젓, 오징어젓, 가공된 다시마, 말린 오징어채, 미린으로 조미된 말린 복어 등의 각종 진미류; 농산물, 축산물, 수산물로 조리한 끓인 식품; 끓인 식품, 구운 식품, 튀김, 튀긴 식품, 찐 식품, 소오스로 드레싱된 요리 등의 일상 요리; 튀김용 새우, 크로케, 샤오-마이, 교자 (다진 포오크를 채운 튀기거나 찐 경단), 하루마키 (중국식 요리의 일종), 햄버어거 스테이크, 미트 볼, 어육 햄버어거, 어육 완자 등의 냉동식품; 햄버어거, 미트 보올, 팥 밥, 쇠고기 또는 닭고기와 함께 삶은 밥, 현미죽, 카레, 고기국, 데미글레이스 소오스, 진한 수우프, 맑은 수우프, 스튜, 일본식 , 잡탕찜, 합포사이(중국식 야채의 일종), 삶은 콩, 닭고기 구이, 도가니 잡탕찜, 삶은밤, 살은 야채 등의 레토르트 식품; 킨시-타마고(길쭉하게 동강낸 에그롤), 밀크 음료, 버터 치이즈 등의 계란 및 유(유)제품; 고기, 어육, 과실, 야채 등으로 된 통조림, 병조림 제품; 합성주, 술, 와인 소주 등의 알코올류; 커피, 코코아, 쥬우스, 녹차, 홍차, 우롱차, 미네랄 음료, 탄산음료, 신맛의 우유 음료, 유산균 음료 등의 소프트 드링크; 즉석 푸딩 믹스, 즉석 핫 케이트 믹스, 즉석 주우스, 소 쿠세키-시루코 (떡과 아즈키 팥죽으로된 즉석 믹스), 즉식 수우프 믹스 등의 즉석식품 등을 들 수 있다.

본 발명의 생리활성 추출물은 생체내에서 생긴 라디칼을 포착하는 성질이 있으므로 생활 방식과 관련된 질환 또는 노인병, 발암, 노화의 예방과 관련된 건강식품 및 건강보조 식품에 유리하게 사용할 수 있다. 인간을 위한 식품외에 본 발명의 추출물은 가축, 가금, 꿀벌, 누에, 물고기 등의 동물용의 사료, 이료에 사용할 수도 있다.

화장품 분야에 있어서 본 발명의 생리활성 추출물은, 예컨대 유성 기제, 수용성 기제, 향료, 색소, 염료, 냉매, 보습제, 완화제, 유화제, 겔화제, 점도 증가제, 연화제, 용해제, 계면 활성제, 발포 안정제, 청정제, 항산화제, 지방 과다증제, 부패제, 도막 형성제, 분무제 등, 추출물의 투여를 용이하게 하는 각종 성분들과 병용해도 좋다.

본 발명의 추출물을, 비타민, 아미노산, 펩티드, 호르몬, 추출물, 혈관 확장제, 혈행 개선제, 세포 활성화제, 살균제, 소염제, 담마진 발생 예방제, 수렴제, 피부기능 개선제, 각질 용해제 등의 의약 1종 이상과 혼합하여 사용할 수도 있다. 수득한 혼합물을 액체, 에멀젼, 크림, 페이스트, 분말, 과립, 또는 기타 소요의 형상의 고체 등의 형태로 가공할 수 있다. 용도에 따라 화장품으로서의 본 발명의 생리활성 조성물은 본 발명의 생리활성 추출물을 통상적으로 0.005 w/w% 이상, 바람직하게는 0.05 w/w % 이상 함유한다.

본 발명의 생리활성 추출물을 유리하게 적용할 수 있는 화장품의 예로서는 양모제 및 육모 촉진제, 포마드, 헤어 스틱, 헤어 오일, 헤어 크림, 헤어 솔리드, 헤어 리퀴드, 헤어 세트 로우션, 헤어 스타일링 젤, 헤어 워터 그리스, 헤어 블로우, 헤어 에어로졸, 파마용 헤어 리퀴드, 모발 염료 등의 두발용 화장품; 샴푸, 헤어린스, 머리세정용 비누, 화장비누, 크리싱 폼(creasing foam) 등의 세정용 화장품; 화장수, 크림, 유액, 로우션, 팩, 파운데이션, 립 스틱, 루우즈, 아이 라이너, 마스카라, 아이 쉐도우, 눈썹 연필, 매니큐어, 본 등의 피부용 화장품; 치약 분말, 보습 치약, 일반 치약, 치아 세정제, 의용 치약, 구중향정(cachou), 가아글 등의 구강용 화장품; 및 선스크린, 면도용 화장품, 목욕용 화장품, 향료, 콜론 향수, 겨드랑이 탈취제, 베이비 파우더, 아이 로우션, 표백 크림 등의 기타 화장품 등을 들 수 있다.

피부 및 모발용 화장품의 경우에 있어서 본 발명의 생리활성 추출물에 α-글루코실 루틴, α-글루코실 헤스페리딘 및 α-글루코실 나린진 등의 α- 글루코실 바이오플라보노이드를 약 0.001 w/w % ~ 약 10 w/w % 첨가하면 피부에 영양소를 보충하고, 생체내에서의 대사를 촉진함으로써 본 발명의 생리활성 추출물의 효과를 쉽게 발휘한다.

말토오스, 트레할로오스 및 말티톨 등의 보습작용이 있는 당질 또는 당 알코올을 보습제로 하여 적당량, 바람직하게는 1 w/w % 이하 첨가하면 피부, 두피 및/또는 머리털을 적당히 습기차게 하여 본 발명의 생리활성 추출물이 그 효과를 쉽사리 발휘하게 된다.

의약품 분야에 있어서 본 발명의 생리활성 추출물은 세균성 질환, 진균성 질환, 바이러스성 질환, 악성 종양, 과지방혈증, 허혈성 심장 질환을 비롯하여 본 발명의 에틸 아세테이트 가용성 성분에 대해 감수성인 모든 질환, 예컨대 소화기 질환, 순환기 질환, 비뇨/생식기 질환, 면역 질환, 뇌신경 질환, 안 질환, 피부 질환, 이비인후 질환 등을 치료 및/또는 예방하는데 유리하게 사용할 수 있다.

본 발명의 생리활성 추출물에 감수성인 이러한 각종 질환의 예로서는, 세균성 각막 궤양, 세균성 결막염, 세균성 식중독, 패혈성 쇼크, 내독소 쇼크, 세균성 심내막염, 세균성 뇌막염, 세균성 폐렴, 세균성 동맥류, 세균성 뇌 동맥류 등의 세균성 질환; 진균성 뇌막염, 진균성 각막 궤양, 진균성 피부 질환, 칸디다증, 버짐 등의 바이러스성 질환; 바이러스성 위대장염, 바이러스성 감염, 바이러스성 기관지염, 바이러스성 결장염, 바이러스성 심근염, 바이러스성 뇌막염, 바이러스성 소장 결장염, 바이러스성 뇌염, 바이러스성 폐렴, AIDS 등의 바이러스성 질환; 신장세포암, 균상 식육종, 만성 육아종 등의 충실성 악성종양; 대장암, 직장암, 대장 및 직장의 암종, 위암, 갑상선암, 혀암, 방광암, 섬모암, 간종양, 전립선암, 자궁암, 인두암, 폐암, 유방암, 악성 흑색종, 카포시 육종, 뇌종양, 신경아세포종, 난소종양, 고환종양, 췌장종양, 신장암, 부신종, 혈관내피종, 성인 T 세포 백혈병(ATL), 만성 골수성 백혈병(CML), 악성 임파종 등의 악성 혈액종양; 활성 만성간염, 위축성 위염, 자기면역 용혈성 빈혈, 바세도우병, 베체트 증후군, 크론병, CRST 증후군, 한랭응집소 용혈성 빈혈, 특발성 궤양성 대장염, 굿 패스튜어 증후군, 갑상선 기능 항진증, 만성 갑상선염, 폐포염, 사구체 신염, 특발성 혈판 감소성 자반병, 유년성 당뇨병, 인슐린 의존성 당뇨병, 백혈구 감소증, 다발성 경화증, 중증성 근무력증, 발작성 한랭 혈색소뇨증, 악성 빈혈, 결정성 다발 동맥염, 다근염, 원발성 담증성 간경변, 류마티스열, 류마티스성 관절염, 쇠그렌 증후군, 교감신경성 안염, 진행성 전신 경화증, 베그너 육아종증, 천식, 과민성 피부염, 기관지 천식, 이식-숙주 질환, 알레르기성 비염, 화분증 및 벌독 알레르기 등의 자기면역 질환, 알레르기성질환 및 바이러스성 질환; 알코올성 간염, 중독성 간염, 바이러스성 간경변, 알코올성 간경변, 중독성 간경변, 담즙성 간경변, 지방간, 간종양 및 간혈관 장해 등의 간질환; 담관염, 담낭염, 원발성 경화성 담관염, 담낭종양 및 담관암 등의 담낭/담도 질환; 급성 췌장염, 만성 췌장염, 췌장 부전증, 췌장암 및 췌장 낭포 등의 췌장 질환; 빈혈, 빈혈성 심질환, 뇌 빈혈, 기저동맥 편두통, 뇌저에서의 이상 맥관증, 뇌일혈, 뇌저 동맥류, 동맥 경화증, 혈관내피 장해, 비인슐린 의존성 당뇨병, 장간막 혈관 발생; 장간막 동맥 증후군 등의 순환기 질환; 파킨슨병, 척수성 위축증, 근위축성 측삭 경화증, 알쯔하이머병, 치매, 뇌혈관성 치매, AIDS 치매, 뇌막염 등의 신경질환; 소화성 궤양, 소화성 식도궤양, 장폴립(intestinal polyp), 장 유착, 장 경직, 위궤양 등의 소화성 질환; 정신질환, 중추신경계 억제제, 습관성 알코올, 호흡계 장해 등의 발생에 따른 수면장해; 및 최면약 투여에 따른 부작용 등을 들 수 있다.

의약품 분야에 있어서 본 발명의 생리활성 추출물을 이 분야에서 통상적으로 사용되는 아래의 성분들, 즉 마취제, 최면 진정제, 항불안제, 항간질제, 해열소염제, 흥분제, 각성 아민(wake amine), 항파킨슨제, 정신신경증제, 중추신경계제, 골격근 이완제, 자율 신경계제, 항경련제, 안약, 귀,코약, 항형훈제, 강심제, 항부정맥제, 이뇨제, 혈압 강하제, 혈관 수축제, 관상혈관 확장제, 말초혈관 확장제, 과지방혈증제, 호흡 자극제, 진해거담제, 기관지 확장제, 알레르기약, 설사방지제, 장 장해제, 소화성 궤양제, 건위 소화제, 제산제, 담즙 배출제, 뇌하수체 호르몬제, 침샘 호르몬, 갑상선 호르몬제, 항갑상선제, 단백동화 스테로이드, 코르티코스테로이드, 안드로겐제, 에스트로겐제, 황체 호르몬제, 혼합 호르몬, 비뇨기/생식기약, 항문약, 외과용 살균/소독제, 상처 보호제, 화농성 질환 외용제, 진통제, 지양제, 수렴제, 소염제, 기생 피부 질환용 외용제, 피부 연화제, 부식제, 치과/경구약, 비타민, 무기제제, 보충액, 지혈제, 항응고제, 간질환약, 해독약, 습관성 중독제, 통풍 치료약, 효소제제, 당뇨병약, 항부종제, 항히스타민제, 자극치료제, 항생제, 화학요법제, 생물학적 제제, 구충약, 항원충제, 각종 의약제제, X선 조영 매체 및 진단약을 유효량 첨가하여 사용할 수 있다.

더욱이 추출물, 엘릭시르, 캡슐제, 과립제, 환제, 안연고제, 현탁액제, 에멀젼제, 경고(plaster), 좌제, 산제, 에탄올 제제, 정제, 시럽제, 침제(infusion), 전제(decoction), 주사제, 팅크제, 점안액, 트로키제, 연고제, 찜질제, 방향수제(aromatic water), 리니멘트제(liniment), 레모네이드(lemonade), 유동 엑스(fluid extract), 로우션, 점비액(nasal drop), 비강 분무제, 하부기도 흡입제, 지속 방출성 안약, 경구용 점막 패치제, 및 관장약 중의 1종 이상을 병용해도 좋다. 용도와 투여경로 또는 투여빈도에 따라 본 발명의 생리활성 추출물의 투여량은 통상적으로 성인 1인당 하루에 0.01 ∼ 100 ㎎이다.

본 발명의 생리활성 추출물을 혼합, 혼련, 용해, 침지, 분무, 도포, 주입 등의 방법을 사용하여 가공 공정의 완료전에 소요량을 소망의 조성물중에 배합한다. 본 발명의 생리활성 추출물중에 함유되는 화합물들, 즉 6,12-디히드로-6,12-디옥소인돌로[2,1-b]퀴나졸린; 3,5,4'-트리히드록시-6,7-메틸렌디옥시-플라본; 켐페롤;

3,5,7,4'-테트라히드록시-6-메톡시-플라본; 갈산; 카페산; 3-(1,3-디히드로-3-옥소-2H-인돌-2-일리덴)-1,3-디히드로-2H-인돌-2-온; [3S-(3α, 4β, 21β)]9-에틸-14-에틸-21-(메톡시카르보닐)-4,8,13,18-테트라메틸-20-옥소-3-포르빈프로판산); 및/또는 [3S-(3α, 4β, 21β)]9-에틸-14-에틸-21-(메톡시카르보닐)-4,8,13,18-테트라메틸-20-옥소-3-포르빈프로판산 메틸 에스테르 등은 공지의 화합물이며, 이들의 합성방법도 공지되어 있다. 생리활성 추출물중에서의 에틸 아세테이트 가용성 성분의 함량이 소요의 레벨 미만이면 별도로 제조되는 것들을 이 첨가성분중에 보충할 수 있다.

상기한 바와 같이 본 발명의 생리활성 추출물은 상기한 양호한 작용을 가지고 있으므로 상기한 분야에서 뿐만 아니라 살균제, 항바이러스제, 항종양제, 라디칼 포착제, 세포 자연괴사증 억제제, 사이토카인 생성 억제제 및 일산화 질소 합성효소 발현 저해제 등의 기타의 분야에서 효과적으로 사용할 수 있다.

예컨대 살균제로서 사용할 경우에 있어서 본 발명의 생리활성 추출물을 상기한 각 분야에서 유리하게 사용할 수 있고, 또한 일반 일상 제품을 위한 저온살균 항균성 조성물에도 유리하게 사용할 수 있다. 이들 조성물에 있어서 필요한 경우, 본 발명의 생리활성 추출물을 프로폴리스, ε-폴리신, 벤조산, 파라옥시부틸 벤조에이트, 벤조산 나트륨, 글리신, 소르브산 칼륨, 미코나졸, 케토코나졸 및 에탄올 등의 기타의 살균제, 향료, 색소, 계면 활성제, 완충제, 금속, 금속염 등 적당량의 용매 또는 희석제에 용해하여 적절히 병용할 수 있다. 이들 저온살균 항균성 조성물을 사무기기, 의류, 가구, 완구, 전기제품, 침구 및 문구제품 등의 각종 제품에 대해 제품제조 완료전에 도포, 분무, 혼합, 혼련, 용해, 주입 또는 침지 등의 방법에 의해 사용할 수 있다. 어느 제품에 있어서도 본 발명의 생리활성 추출물은 소요의 살균작용을 발휘한다.

아래의 실험에서 본 발명의 생리활성 추출물의 생리학적 작용에 대해 설명한다.

실험 1: 생리활성 추출물의 제조

일본국의 시네마현 아키시산 생쪽의 지상부(地上部) 30 kg을 7월에 수확하여 분말화하여 1회 추출에 대해 에틸 아세테이트 30~60 리터로써 실온에서 3회 반복하여 추출하였다. 수득한 추출물을 한데 모아 여과지로써 여과하고, 여액을 회수한 후에 증발시켜 에틸 아세테이트를 제거하고 건조하여 쪽 유래의 에틸 아세테이트 가용성 성분을 함유한 추출물 168 g을 얻었다.

실험 2: 에틸 아세테이트 가용성 성분의 분리

실험 1의 방법으로 얻은 추출물을 50 v/v % 메탄올 수용액에 현탁하고, 수득한 용액을 8부분으로 나눈 다음 , 각각 1700 ml의 "FS-1830" (일본국의 Japan Organo사 판매의 흡착 크로마토그래피용 겔)을 충전한 칼럼에 부하하고, 용리제로서 60 v/v %, 70 v/v %, 80 v/v % 및 90 v/v % 메탄올 수용액, 메탄올 및 에틸 아세테이트를 겔과 동일한 양으로 하여 연속하여 공급함으로써 칼럼으로부터 용출시켰다.

80 v/v % 메탄올 수용액으로써 칼럼으로부터 용출한 먼저번 획분과 나중의 획분을 각각 획분 2 및 획분 1이라 하고 ; 60 v/v % 메탄올 수용액으로써 칼럼으로부터 용출한 나중의 획분을 획분 3이라 하며; 90 v/v % 메탄올 수용액으로써 칼럼으로부터 용출한 나중의 획분을 획분 4라 하고; 메탄올로써 칼럼으로부터 용출한 먼저번 획분과 나중의 획분을 각각 획분 5 및 획분 6이라 하여, 이들 획분을 각각 증발시켜 용매를 제거하고 건조시켜 고형물을 얻었다.

획분 1로부터 얻은 고형물 5.2 g중에서 2.6 g을 메탄올 30 ml에 현탁하고 흡인여과하여 가용성 획분과 불용성 획분 (876 g)으로 분리하였다. 가용성 획분을 실리카 겔 1,350 ml가 충전된 칼럼에 가하고, 메탄올 농도 5 v/v %로부터 100 v/v %까지 단계적으로 증가시키면서 메탄올과 클로로포름의 용매계의 직선 기울기로써 칼럼으로부터 용출시켜 용출획분 450 ml를 회수하였다. 4번째 획분을 증발처리하여 용매를 제거함으로써 고형물을 얻은 다음, 이것을 메탄올 2 ml에 현탁하고, 이 현탁액을 흡인하에 세척하면서 여과하여 화합물 1의 결정을 19.4 mg을 얻었다. 상기한 불용성 획분을 적당량의 메탄올에 용해하여 실온에서 방치함으로써 화합물 2의 황색 침상 결정을 278 mg 얻었다.

획분 2로부터 얻은 고형물 10.7 g을 메탄올 40 ml에 현탁하고, 이 용액을 "SEPHADEX LH-20" (스웨덴국의 Pharmacia LKB Biotechnology AB 판매의 흡착 크로마토그래피용 겔) 1,520 ml가 충전된 칼럼에 가하고, 메탄올로써 칼럼으로부터 용출시키면서 용출액 190 ml을 회수하였다. 15번째 및 18번째 획분 각각에 대해 증발에 의해 용매를 각각 제거하고 건조시켜 고형물을 얻었다. 18번째 획분으로부터의 고형물 400 mg을 메탄올과 물(=5:2 체적비)의 용매계 약 210 ml중에 완전히 용해하였다. 이 용액을 0.22 μm의 멤브레인 필터로써 여과하고, 여액을 실온에서 3일간 방치하여 결정을 석출시켰다. 수득한 혼합물울 종래의 여과지로 여과하여 화합물 3의 결정을 89.3 mg 회수하였다. 15번째 획분에서 얻은 고형물 500 mg을 메탄올 10 ml에 현탁하고 여과하여 불용성 물질을 회수한 다음, 여기에 메탄올 250 ml을 가하여 메탄올중에 완전히 용해시켰다. 이 용액을 0.22 μm의 멤브레인 필터로 여과하고 실온에서 7일간 방치하여 결정을 석출시킨 후에 통상적으로 사용되는 여과지로 여과하여 화합물 4의 결정을 252.3 mg얻었다.

획분 3으로부터 얻은 고형물 11.8 g을 메탄올 40 ml중에 현탁하고, 이 용액을 1,680 ml의 "SEPHADEX LH-20"(스웨덴국의 Pharmacia LKB Biotechnology AB 판매의 흡착 크로마토그래피용 겔)가 충전된 칼럼에 가하고, 메탄올로써 칼럼으로부터 용출시키면서 용출 획분을 560 ml을 회수하였다. 4번째 획분을 증발시켜 용매를 제거하고 건조시켜 고형물을 얻었다. 이 고형물을 메탄올 10 ml에 용해하고, 이 용액을 480 ml의 "FS-1830"(일본국의 Japan Organo사 판매의 흡착 크로마토그래피용 겔)이 충전된 칼럼에 가하고, 이 칼럼에 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60 및 70 v/v % 메탄올 수용액을 각각 480 ml씩 가하고, 다시 메탄올 960 ml로써 용출시켰다. 용출물을 분획하여 획분을 240 ml 얻고, 5번째 획분을 증발시켜 용매를 제거한 후 건조하여 고형물 150 mg을 얻었다.

수득한 고형물을 에틸 아세테이트 300 ml에 용해하고, 이 용액을 0.22 μm 멤브레인 필터로써 여과하였다. 여액을 실온에서 7일간 방치하여 결정을 석출시키고, 이 혼합물을 보통 사용되는 여과지로 여과하여 화합물 5의 결정을 18.7 mg 얻었다. "FS-1830" 충전 칼럼으로부터 용출한 9번째 획분을 증발시켜 용매를 제거하고 건조시켜 고형물 500 mg 을 얻은후, 이 고형물을 에틸 아세테이트 0.5 ml 중에용해하여 40 ml의 "SILICAGEL 60K650" (일본국의 Katayama Chemical Industries사 판매의 흡착 크로마토그래용 겔 )이 충전된 칼럼에 가한 다음, 이 칼럼에 에틸 아세테이트와 클로로포름의 혼합물 (=2:8, 3:7, 4:6, 5:5, 6:4, 7:3, 8:2 및 9:1, 체적비)과, 클로로포름 및 메탄올을 각각 40 ml씩을 이 순서로 가하였다. 칼럼으로부터의 용출액 10 ml을 분획하여 17번째와 21번째 획분을 모으고, "SILICAGEL" (미합중국의 Merck사 판매의 분리용 박층) 및 전개제로서의 톨루엔, 에틸 아세테이트 및 아세트산 (5:5:1, 체적비)의 혼합액을 사용한 박층 크로마토그래피 처리를 하였다. 전개후 Rf가 약 0.6인 위치에서의 실리카 겔의 일부를 회수하여 적당량의 메탄올로 추출하여 전개된 물질을 수득하였다. 이 추출물을 증발시켜 용매를 제거하고 건조하여 화합물 6의 결정을 15.4 mg 얻었다.

획분 4로부터 얻은 고형물 4.6 g중에서 4 g을 메탄올 40 ml와 혼합하여 용해시켰으나 일부는 용해하지 않고 침전을 형성하였다. 이 침전을 회수하고, 여기에 메탄올 800 ml을 가하여 충분히 용해한후 실온에서 2일간 방치하여 적색의 조(租)결정(crude crystal)을 석출시켰다. 이 조결정을 회수하고, 그 상청액을 상기와 동일한 조건하에서 방치하여 또 다른 적색 조결정을 석출시켰다. 새로 생긴 결정을 회수하여 앞서 얻은 결정과 합쳐 적당량의 메탄올로 세정함으로써 충분한 량의 메탄올중에 용해시켰다. 수득한 용액을 통상의 방법으로 여과하고, 여액을 증발시켜 용매를 제거하고 건조시켜 화합물 7의 결정을 44.5 mg 얻었다.

정확한 데이타가 나와 있지 않으나 획분 5를 획분 3에 대해 적용한바와 마찬가지로 하여 "FS-1830"의 칼럼 및 "SILICAGEL 60K650" 칼럼에서 처리하고, 메탄올중에서 결정석출시킴으로써 화합물 8의 결정을 얻었다. 그리고 획분 6을 획분 3에 대해 적용한바와 마찬가지로 하여 "FS-1830"의 칼럼에서 처리하고 아세토니트릴중에서 결정석출시킴으로서 화합물 9의 결정을 얻었다.

실험 3: 화합물 1의 확인

실험 3-1: 질량분석 스펙트럼

실험 2의 방법으로 얻은 화합물 1은, 고속 원자충격 질량 분광법 (이하, 간단히 "FAB-MS"라 함)으로 질량분석 스펙트럼을 측정했을 때 m/z 249 ([M + H]⁺)에서 피이크를 나타내었고, 고분해능 질량 분광법으로 측정했을때 m/z 249.064 ([M + H]⁺)에서 피이크를 나타내었다.

실험 3-2 : 자기공명 흡수 스펙트럼

실험 2의 방법으로 얻은 화합물 1에 대해¹H-핵자기 공명 분광분석법 및¹³C-핵자기 공명 분광분석법 (이하, 간단히 각각¹H-NMR 및¹³C-NMR이라 함)에 의해 자기공명 흡수 스펙트럼을 측정하였다.

각 스펙트럼에서 관찰된 화학적 이동(chemical shift) 및 수소원자와 탄소원자의 귀속(assignment)은 표 1에 나와 있다.

화학적 이동 δ(ppm)	귀속
1H-NMR8.48 (1H, d, J=7.9 Hz)8.32 (1H, d, J=7.7 Hz)7.95 (2H, J=3.7 Hz, 9.2 Hz)7.88 (1H, d, J=7.3 Hz)7.87 (1H, t, J=7.9 Hz)7.74 (1H, m, J=4.2 Hz)7.48 (1H, t, J=7.5 Hz)	H-10H-1H-3, H-4H-7H-9H-2H-8
13C-NMR182.4157.6146.4145.9144.9137.7135.1129.8	C-6C-12C-5aC-4aC-10aC-9C-3C-4
129.8126.9126.8124.7123.2122.2117.0	C-2C-1C-8C-7C-12aC-6aC-10

주 : DMSO-d6에서 측정

실험 데이타에 근거하여 쪽 유래의 에틸 아세테이트 가용성 성분으로서의 화합물 1은 6,12-디히드로-6,12-디옥소인돌로[2,1-b]퀴나졸린 [트립탄트린(tryptanthrin), C₁₅H₈N₂O₂, MW=248]으로 확인되었다. 화합물 1의 화학식은 다음과 같다.

실험 4: 화합물 2의 확인

실험 4-1 : 융점

실험 2의 방법으로 얻은 화합물 2에 대하여 통상적인 방법으로 그 융점을 측정한 결과, 298℃의 융점을 나타내었다.

실험 4-2: 자외선 흡수 스펙트럼

실험 2의 방법으로 얻은 화합물 2에 대하여 통상적인 방법으로 용매로서 메탄올을 사용하여 자외선 흡수 스펙트럼을 측정한 결과, 파장 206, 240, 273 및 353 nm에서 최대 흡수 스펙트럼을 나타내었다.

실험 4-3: 적외선 흡수 스펙트럼

도 1은 브롬화 칼륨 분말을 사용하는 가압 태블릿법(pressure tablet method)으로 측정한 화합물 2의 적외선 스펙트럼이다.

실험 4-4: 질량분석 스펙트럼

실험 2의 방법으로 얻은 화합물 2에 대하여 FAB-MS에 의해 질량분석 스펙트럼을 측정한 결과, m/z 314 (M⁺)에서 피이크를 나타내었다.

실험 4-5: 핵자기 공명 흡수 스펙트럼

실험 2의 방법으로 얻은 화합물 2에 대하여¹H-NMR 및¹³C-NMR에 의한 핵자기 공명 흡수 스펙트럼을 측정하였다.

각 스펙트럼에서 관찰된 각 시그날의 화학적 이동 및 수소원자와 탄소원자의 귀속은 표 2에 나와 있다.

화학적 이동 δ(ppm)	귀속
1H-NMR8.06 (2H, d, J=9 Hz)6.94 (2H, d, J=9 Hz)6.90 (1H, s)	H-2', H-6'H-3', H-5'H-8
1H-NMR6.15 (2H, s)13C-NMR176.2159.3153.7151.4147.4139.8135.8129.4128.7121.4115.4105.8102.689.3	O-CH2-OC-4C-4'C-7C-9C-2C-5C-3C-2', C-6'C-6C-1'C-3', C-5'C-10O-CH2-OC-8

주 : DMSO-d6에서 측정

실험 4-6: 원소 분석

실험 2의 방법으로 얻은 화합물 2에 대하여 통상적인 원소분석을 한 결과, C=59.2%, H=3.4%, O=37.4% 및 N＜0.3%이었고, 이로부터 화합물 2는 실험식 C₁₆H₁₀O7·3/5H₂O임이 판명되었다.

이 데이타에 근거하여 쪽 유래의 에틸 아세테이트 가용성 성분인 화합물 2는 3,5,4'-트리히드록시-6,7-메틸렌디옥시-플라본임이 확인되었다. 화합물 2의 화학식은 아래의 화학식 2와 같다.

실험 5: 화합물 3의 확인

실험 5-1: 박층 크로마토그래피

실험 2의 방법으로 얻은 화합물 3과, 클로로젠산, 퀘르세틴, 켐페롤, 페룰산, 신남산, 쿠마르산, 갈란긴, 피노셈브린 (이상의 것들을 모두가 미합중국의 Sigma Chemical사로부터 구입한 것임)을 통상적인 박층 크로마토그래피 처리하였다. "KIESELGEL 60F₂₅₄" (미합중국의 Sigma Chemical사 판매)를 박층판으로 사용하고, 톨루엔, 에틸 아세테이트 및 아세트산(=8:1:1, 체적비)의 혼합액을 전개 용매계로 사용하였다. 전개후에 판위의 시료에 대해 파장 254 nm에서의 자외선 복사에 의해 발색시킨 결과, 화합물 3의 Rf는 플라보노이드인 켐페롤의 Rf와 양호하게 일치하였다.

실험 5-2: 융점

실험 2의 방법으로 얻은 화합물 3에 대하여 통상의 방법으로 융점을 측정한 결과, 그 융점은 277℃이었다.

실험 5-3: 자외선 흡수 스펙트럼

실험 2의 방법으로 얻은 화합물 3에 대하여 통상의 방법으로 용매로서 메탄올을 사용하여 자외선 흡수 스펙트럼을 측정한 결과, 파장 265, 365 및 320 nm에서 어깨부(shoulder)같은 최대 흡수 스펙트럼을 나타내었다.

실험 5-4: 적외선 흡수 스펙트럼

도 2는 브롬화 칼륨 분말을 사용하는 가압 태블릿법으로 측정한 화합물 3의 적외선 흡수 스펙트럼이다.

이들 데이타에 근거하여 쪽 유래의 에틸 아세테이트 가용성 성분인 화합물 3은 화학식 C₁₅H₁₀O₆및 분자량 286의 켐페롤인 것으로 확인되었다. 화합물 3의 화학식은 아래의 화학식 3에 나와 있다.

실험 6: 화합물 4의 확인

실험 6-1: 융점

실험 2의 방법으로 얻은 화합물 4의 융점을 통상적인 방법으로 측정한 결과, 이 화합물의 융점은 272℃이었다.

실험 6-2: 자외선 흡수 스펙트럼

실험 2의 방법으로 얻은 화합물 4를 통상적인 방법에 따라 메탄올을 용매 1,소디움 메틸레이트 함유 메탄올을 용매 2, 무수 염화 알루미늄 함유 메탄올을 용매 3 또는 무수 염화 알루미늄과 염산 함유의 메탄올을 용매 4로 하는 용매를 사용하여 자외선 흡수 스펙트럼을 측정하였다. 각 용매계에서의 최대 흡수 스펙트럼은 표 3에 나와 있다.

용 매	최대흡수 (nm)
용매 1	255sh, 268, 355sh, 365
용매 2	273, 320, 404
용매 3	270, 305sh, 365sh, 425
용매 4	270, 305sh, 365sh, 425

주: 부호 "sh"는 어깨부(shoulder) 같은 최대 흡수를 나타내었음을 뜻함.

표 3의 결과로부터 화합물 4는 C-3, C-7 및 C-4' 또는 C-3, C-5, C-7 및 C-4'에서의 히드록시기를 가진 플라보놀에 속하는 화합물임을 알 수 있다.

실험 6-3:핵자기 공명 흡수 스펙트럼

실험 2의 방법으로 얻은 화합물 4에 대해¹H-NMR 및¹³C-NMR에 의한 핵자기

공명 흡수 스펙트럼을 측정하였다. 각 스펙트럼에서 관찰된 화학적 이동과 수소원자 및 탄소원자의 각각의 귀속은 표 4에 나와 있다.

화학적 이동 δ(ppm)	귀속
1H-NMR8.08 (2H, d, J=8.97 Hz)6.90 (2H, d, J=8.97 Hz)6.49 (1H, s)3.88 (3H, s)	H-3', H-5'H-2', H-6'H-8-O-CH3
13C-NMR177.7160.7158.8153.8153.0148.4136.9132.4130.8123.8116.4105.094.961.0	C-4C-4'C-7C-5C-9C-2C-3C-6C-2', C-6'C-1'C-3', C-5'C-10'C-8-O-CH3

주: 중수소화 메탄올에서 측정

실험 6-4: 질량분석 스펙트럼

실험 2의 방법으로 얻은 화합물 4에 대하여 통상의 방법으로 전자 이온화 질량분광 분석법(EI-MS)에 의해 질량분석 스펙트럼을 측정한 결과, m/z 316 (M⁺) 에서 피이크를 나타내었고, 또한 고분해능 질량분광 분석법에 의해 m/z 316.0486 (M⁺)에서 피이크를 나타내었다.

실험 6-5: 적외선 흡수 스펙트럼

도 3은 브롬화 칼륨 분말을 사용하여 가압 테블릿법으로 측정한 화합물 4의 적외선 흡수 스펙트럼이다.

이 데이타에 근거하여 쪽 유래의 에틸 아세테이트 가용성 성분인 화합물 4는화학식이 C₁₆H₁₂O₇이고 분자량이 316인 3,5,7,4'-테트라히드록시-6-메톡시-플라본인 것으로 확인되었다. 화합물 4의 화학식은 아래의 화학식 4에 나와 있다.

실험7: 화합물 5의 확인

실험 7-1: 질량분석 스펙트럼

실험 2의 방법으로 얻은 화합물 5에 대하여 통상의 방법으로 전자 이온화 질량 분광 분석법(EI-MS)에 의해 질량분석 스펙트럼을 측정한 결과, m/z 170 (M⁺)에서 피이크를 나타내었다.

실험 7-2: 핵자기 공명 흡수 스펙트럼

실험 2의 방법으로 얻은 화합물 5에 대하여¹H-NMR 및¹³C-NMR에 의해 핵자기 공명 흡수 스펙트럼을 측정하였다. 각 스펙트럼에서 관찰된 화학적 이동 및 수소원자와 탄소원자의 귀속은 표 5에 나와 있다.

화학적 이동 δ(ppm)	귀속
1H-NMR7.06 (2H, s)	H-2, H-6
13C-NMR170.4146.5139.6122.1110.4	C-7C-3, C-5C-4C-1C-2, C-6

주: 중수소화 메탄올에서 측정

이 데이타에 근거하여 쪽 유래의 에틸 아세테이트 가용성 성분인 화합물 5는 화학식이 C₇H₆O₅이고 분자량이 170인 갈산인 것으로 확인되었다. 화합물 5의 화학식은 아래의 화학식 5에 나와 있다.

실험 8: 화합물 6의 확인

실험 8-1: 질량분석 스펙트럼

실험 2의 방법으로 얻은 화합물 4에 대하여 통상의 방법으로 전자 이온화 질량분광 분석법(EI-MS)에 의해 질량분석을 한 결과, m/z 180 (M⁺) 에서 피이크를 나타내었다.

실험 8-2: 적외선 흡수 스펙트럼

도 4는 브롬화 칼륨 분말을 사용하여 가압 테블릿법으로 측정한 화합물 6의적외선 흡수 스펙트럼이다.

공지의 화합물의 적외선 흡수 스펙트럼과 비교하여 화합물 6의 스펙트럼은 카페산(caffeic acid)의 스펙트럼과 잘 일치하였다.

실험 8-3: 핵자기 공명 흡수 스펙트럼

실험 2의 방법으로 얻은 화합물 6에 대하여¹H-NMR 및¹³C-NMR에 의해 핵자기 공명 흡수 스펙트럼을 측정하였다. 각 스펙트럼에서 관찰된 화학적 이동 및 수소원자와 탄소원자의 귀속은 표 6에 나와 있다.

화학적 이동 δ(ppm)	귀속
1H-NMR7.43 (1H, d, J=15.9 Hz)7.03 (1H, d, J=2.0 Hz)6.91 (1H, dd, J=2.0 Hz, 8.3 Hz)6.77 (1H, d, J=8.1 Hz)6.27 (1H, d, J=15.6 Hz)	H-7H-2H-6H-5H-8
13C-NMR148.9146.8144.7128.7122.4119.2116.5115.1	C-4C-3C-7C-1C-6C-8C-5C-2

주: 중수소화 메탄올에서 측정

이 데이타에 근거하여 쪽 유래의 에틸 아세테이트 가용성 성분인 화합물 6는 화학식이 C₉H₈O₄이고 분자량이 180인 카페산인 것으로 확인되었다. 화합물 6의 화학식은 아래의 화학식 6에 나와 있다.

실험 9: 화합물 7의 확인

실험 9-1: 질량분석 스펙트럼

실험 2의 방법으로 얻은 화합물 7에 대하여 통상의 방법으로 전자 이온화 질

량분광 분석법(EI-MS)에 의해 질량분석을 한 결과, m/z 262 (M⁺) 에서 피이크

를 나타내었다.

실험 9-2: 적외선 흡수 스펙트럼

도 5는 브롬화 칼륨 분말을 사용하여 가압 테블릿법으로 측정한 화합물 7의 적외선 흡수 스펙트럼이다.

공지의 화합물의 적외선 흡수 스펙트럼과 비교하면 화합물 7의 스펙트럼은 3-(1,3-디히드로-3-옥소=2H-인돌-2-일리덴)-1,3-디히드로-2H-인돌-2-온과 잘 일치하였다.

실험 9-3: 핵자기 공명 흡수 스펙트럼

실험 2의 방법으로 얻은 화합물 7에 대하여¹H-NMR 및¹³C-NMR에 의해 핵자기 공명 흡수 스펙트럼을 측정하였다. 각 스펙트럼에서 관찰된 화학적 이동 및 수소원자와 탄소원자의 귀속은 표 7에 나와 있다.

화학적 이동 δ(ppm)	귀속
1H-NMR11.00 (1H, s)10.87 (1H, s)8.77 (1H, d, J=7.81 Hz)7.66 (1H, d, J=7.57 Hz)7.58 (1H, t, J=8.06, 8.30 Hz)7.42 (1H, d, J=8.06 Hz)7.26 (1H, t, J=7.73 Hz, 7.57 Hz)7.02 (2H, t, J=7.57 Hz, 7.32 Hz)6.91 (1H, d, J=7.57 Hz)	H-1H-1'H-4'H-4H-6H-7H-6'H-5, H-5'H-7'
13C-NMR188.53170.86152.42140.83138.27137.01129.19124.59124.27121.39121.18118.97113.35109.49106.51	C-3C-2'C-6'C-6C-4'C-4C-5, C-5'C-7'C-7

주: DMSO-d6에서 측정

이 데이타에 근거하여 쪽 유래의 에틸 아세테이트 가용성 성분인 화합물 7는 화학식이 C₁₆H₁₀N₂O₂이고 분자량이 262인 3-(1,3-디히드로-3-옥소-2H-인돌-2-일리덴)-1,3-디히드로-2H-인돌-2-온, 즉 인디루빈인 것으로 확인되었다. 화합물 7의 화학식은 아래의 화학식 7에 나와 있다.

화합물 1∼7의 확인과 마찬가지로 하여 화합물 8을 확인한 결과, 화학식 C₃₅H₃₆N₄O₅및 분자량 592.69인 [3S-(3α, 4β, 21β)]9-에틸-14-에틸-21-(메톡시카르보닐 )-4,8,13,18-테트라메틸-20-옥소-3-포르빈프로판산), 즉, 페오포르비드 (pheophorbide) a인 것으로 판명되었다.

또한 화합물 9를 확인한 결과, 화학식 C₃₆H₃₈N₄O₅이고 분자량 606인 [3S-(3α, 4β, 21β)]9-에틸-14-에틸-21-(메톡시카르보닐)-4,8,13,18-테트라메틸-20-옥소-3-포르빈프로판산 메틸 에스테르, 즉 메틸페오포르비드 a인 것으로 판명되었다. 페오포르비드 a인 화합물 8과 메틸페오포르비드인 화합물 9의 화학식은 아래의 화학식 8 및 9에 나와 있다.

실험 10: 살균작용

실험 1 및 2의 방법으로 얻은 생리활성 추출물에 대하여 아래의 표 8에 나온 바와 같이 선조 도말(streak smear)을 사용한 한천 평판 희석법에 의해 표 6의 박테리아에 대하여 최소 저지 농도(MIC)를 조사하였다. 한천 1.5 w/w%, 글루코오스 0.1 w/w %, 및 세균 무함유의 섬유소 제거된 말혈액 7 v/v%을 함유한 브루셀라 배양육즙을 헬리코박터 파일로리 (NCTC 11638)의 영양배지로 사용하였다. 기타의 박테리아에 대해서는 종래의 감수성 디스크용 배지를 사용하였다. 그 결과는 표 8에 나와 있다.

병원균	최소 저지 농도(㎍/㎖)
	A	B	C	D	E
헬리코박터 파일로리(NCTC 11638)	156	2.5	156	39.0	39.0
바실루스 세레우스(IF0 3466)	156	39.0	313	-	-
슈우도모나스 에루기노사(IFO 3453)	78	39.0	313	-	-
스타필로코커스 오레우스(ATCC 6538P)	313	39.0	313	-	-

주: 부호 "-"는 최소 저지 농도 시험을 하지 않았음을 나타냄.

부호 A, B, C, D 및 E는 실험 1의 생리활성 추출물, 실험 2의 화합물 1, 실험 2의 화합물 2, 실험 2의 화합물 3 및 실험 2의 화합물 4를 각각 나타냄.

표 8에 나온 결과로부터 본 발명의 생리활성 추출물은 그람 양성균과 그람 음성균의 생육을 저지하였음을 알 수 있다. 이들 추출물과, 화합물중에서 특히 화합물 1, 3 및 4는 위염, 위궤양, 십이지장 궤양 및 위암의 병원균인 헬리코박터 파일로리의 생육을 강력히 저지하였다.

실험 11: 항바이러스 작용

통상의 방법에 준하여 정상인의 양막(aminion) 조직 유래의 주화 세포인 FL세포(ATCC CCL62)를 마이크로플레이트에서 단층 배양하였다. 배양 상청액을 마이크로플레이트로부터 제거하고, 소수포성 구내염 바이러스 (VSV)를 세포당 0.1 플라크 형성 단위(PFU)의 비율로 단층 세포에다 흡착시킨 다음, 이들 세포에 대해, 실험 1 및 2의 방법으로 얻은 아래의 표 9에 나온 생리활성 추출물을 디메틸술폭시드(DMSO) 중에 용해한 것을 각기 상이한 농도로 첨가하고, 37℃에서 24시간 세포를 인큐베이트한 후에 마이크로플레이트 중에서 FL 세포를 동결 및 해동을 반복함으로서 파쇄하고, 이 마이크로플레이트를 원심처리함으로써 VSV를 함유한 배양 상청액을 얻었다.

그 후, 마우스 섬유아세포 유래의 L929 세포 (RCB0081)를 표적세포로 사용하고, 지수로서 바이러스에 의한 세포변성 효과(CPE)를 이용한 종래의 방법에 따라 각 시료의 항바이러스 활성을 조사하였다. 각 생리활성 추출물의 50% 생육 저지 농도를 산출하였다. 그 결과는 표 9에 나와 있다.

시료	50% 생육저지 농도(㎕/㎖)
실험 1의 생리활성 추출물	23
실험 2의 화합물 1	13
실험 2의 화합물 2	14

표 9에 나온 바와 같이 본 발명의 생리활성 추출물은 병원성 바이러스에 대해 항바이러스 작용을 나타내었다. 바이러스 무함유의 조건하에서 FL 세포를, 상기한 조사에서의 50% 생육 저지 농도에서 생리활성 추출물의 존재하 또는 부재하에 통상적인 방법으로 배양하였다. 그 결과, 각각의 조건하에서 세포의 생육 및 증식에서 유의차(有意差)는 전혀 발견되지 않았다. 상기한 CPE 지수에 의한 방법 또는 플라크 생성 지수에 의한 종래의 방법을 사용하여 본 발명의 생리활성 추출물의 헤르페스 단순 바이러스 (HSV-1), 인플루엔자 바이러스, 종두 바이러스(VV) 및 마우스 거대세포 바이러스 (MCMV)에 대한 항바이러스 작용을 조사하였다. 그 결과, 본 발명의 생리활성 추출물은 VSV에서 발견된 바와 같은 적어도 동일한 레벨의 이들병원성 바이러스에 대한 항바이러스 작용을 가지고 있음이 확인되었다. 이들 데이타로부터 본 발명의 생리활성 추출물은 동물 및 인간의 병원성 바이러스에 대해 강력한 항바이러스 작용을 발휘함을 알 수 있다.

실험 12: 항종양 작용

아래의 표 10에 나온바와 같이 실험 1 및 2의 방법으로 얻은 생리활성 추출물중의 어느 하나를 시료로 하여 농도 10 mg/ml 되도록 DMSO에 용해하고 10 v/v% 소태아 혈청이 보충된 RPMI1640 배지 (pH 7.2)로써 50배 희석하여 96웰 마이크로플레이트에 각 웰당 100 μl 씩 나누어 넣었다. 각 웰에서의 용액을 위에서 사용한 것과 동일한 갖 제조한 신선한 RPMI1640 배지 (pH 7.2)로써 계열 희석하였다. 급성 전골수세포성 백혈병 환자 유래의 HL-60 세포 (ATCC CCL-240), 위암환자 유래의 HGC-27 세포 (RCB0500) 및 폐 선암 (lung adenocarcinoma) 환자 유래의 HLC-1 세포 (RCB0083)를 위에서 사용한 것과 동일한 갖 제조한 신선한 RPMI1640 배지 (pH 7.2)중에 각각 세포농도 4 ×10⁵개/ml, 4 ×10⁵개/ml 및 2 ×10⁶개/ml가 되도록 부유시켰다.

각 세포 부유액을 마이크로플레이트에 각 웰당 50 μl씩 나누어 넣고 5 v/v% CO₂인큐베이터중에서 37℃에서 48시간 인큐베이트하였다. 각 마이크로플레이트에 25 v/v% 글루타르알데히드 수용액을 각 웰당 20 μl씩 가하고 15분간 방치하여 세포를 고정하였다. 이어서 각 웰에 부착한 세포를 물로 세척하고, 여기에 0.05 w/v% 메틸렌 블루 수용액을 각 웰당 100 μl씩 가하여 혼합한후 15분간 방치하여 세포를염색하였다. 그후, 과잉량의 염색용액을 물로 씻어 각 웰로부터 제거하고, 세포를 건조한후 여기에 0.33 N 염산을 각 웰당 300 μl씩 가하여 혼합하고 충분히 교반한 다음, 파장 620 nm에서 흡수를 측정하였다.

이와 병행하여 대조로서 시료 무함유의 계를 준비하여 시료에서의 경우와 마찬가지로 처리하였다. 각 시료의 50% 생육저지 농도 (IC₅₀)를 항종양 작용 지수로 사용하고, 대조의 세포생육을 100%로 간주하고 각 시료의 IC₅₀을 산출하였다. 그 결과는 표 10에 나와 있다.

시료	50% 생육 저지 농도(㎕/㎖)
	HL-60 셀	HGC-27 셀	HLC-1 셀
A	24.9	61.5	276.8
B	4.2	1.5	2.2
C	243.7	37.1	40.4

주 : 부호 A, B 및 C는 실험 1의 생리활성 추출물, 실험 2의 화합물 1 및 실 험 2의 화합물 2를 각각 나타냄

표 10의 결과로부터 본 발명의 생리활성 추출물은 난치성의 악성종양으로 알려진 백혈병, 위암 및 폐암의 종양세포의 생육을 효과적으로 저지함을 알 수 있다. 특히 화합물 1은 화합물 2보다 10배 이상의 항종양 작용을 나타내었다. 이들 데이타로부터 본 발명의 생리활성 추출물은 포유동물과 인간의 악성종양에 대해 치료/예방효과를 나타냄을 알 수 있다.

실험 13 : 라디칼 포착작용

표 11에 나온바와 같이 실험 1 및 2의 방법으로 얻은 생리활성 추출물의 라디칼 포착작용을 문헌 [Toshio IMANARI in Igaku-no-Ayumi(Development of Medical Science), Vol. 101, pp. 496∼497 (1977)]에 기재된 니트로 블루 테트라졸륨(NBT)법에 의해 평가하였다. 즉, 크산틴 옥시다아제를 크산틴에 작용시켜 초과산화물을 생성시키는 반응 및 생성된 초과산화물이 산화력에 의해 NTB를 포르마잔(formazan)으로 변환하는 반응계로 된 결합반응계에서 시료를 공존시켰다. 이어서 생성된 포르마잔을 분광화학 분석법으로 정량분석하였다.

본 발명의 생리활성 추출물의 어느 하나를 정제수에 적당한 농도로 용해하고, 이 용액을 시료로 사용하였다. 대조로서 시료 대신에 정제수를 사용하였다. 대조에서의 포르마잔 생성에 대한 50% 저해활성을 라디칼 포착작용 1 단위 활성으로 정의하였다. 이 정의에 근거하여 각 시료 1 g의 라디칼 포착작용을 조사하였다. 그 결과는 표 11에 나와 있다.

시 료	라디칼 포착작용(단위/g)
실험 1의 생리활성 추출물	27,800
실험 2의 화합물 1	-
실험 2의 화합물 2	1,830
실험 2의 화합물 3	14,000
실험 2의 화합물 4	4,010
실험 2의 화합물 5	692,000
실험 2의 화합물 6	418,000

주: 부호 "-"는 시료가 물에 충분히 용해하지 않았기 때문에 라디칼 포착작용을 평가할 수 없었음을 나타냄.

표 11에 나온바와 같이 본 발명의 생리활성 추출물은 강력한 라디칼 포착작용을 발휘하고 있다. 특히 실험 1의 생리활성 추출물과 실험 2의 화합물 5 및 6의 라디칼 포착작용은 현저하였다. 이로부터 본 발명의 생리활성 추출물은 활성 산소와 과산화 지방 유래의 생체내 라디칼을 효과적으로 포착하며, 또한 악성종양, 심근경색증, 뇌일혈, 류마티스, 생활방식과 관련된 각종 질환 또는 노인병, 스트레스 및 노화등의 생체내 라디칼과 관련된 각종 질환에 대해 치료/예방효과를 발휘함을 알 수 있다. 화합물 1은 수용성이 부족하여 실험 13의 방법에 의한 라디칼 포착작용의 평가가 불가능하였다.

실험 14 : 세포 자연괴사증 억제작용

실험 2의 방법으로 얻은 화합물 1을 농도 0.8 mg/ml 되도록 DMSO에 용해하고, 10 v/v% 소태아 혈청이 보충된 RPMI1640 배지 (pH 7.2)로써 희석하여 20 μm/ml 용액을 얻었다. 이 용액을 마이클로플레이트에 각 웰당 1 ml 씩 나누어 넣고, 각 웰의 용액을 상기에서 사용한 것과 동일한 갖 제조한 신선한 배지로써 계열희석하였다. 급성 전골수세포성 백혈병 환자 유래의 HL-60 세포 (ATCC CCL-240), 인간 조직구성 임파종(histiocytic lymphoma) 환자 유래의 U-937 세포 (ATCC CRL-1593.2), 위암 환자 유래의 HGC-27세포(RCB0500), 폐 선암 환자 유래의 HLC-1 세포 (RCB0083) 및 래트 신경교 종양(glial tumor) 유래의 C₆세포 (ATCC CCL-107)를 세포밀도 1 ×10⁶개/ml 또는 2 ×10⁵개/ml가 되도록 각각 RPMI1640 배지 (pH 7.2)중에 부유시켰다. 화합물 1을 20, 10 또는 5.0 μg/ml으로 희석한 것을 1 ml 함유한 마이클로플레이트에 상기한 세포부유액중의 하나를 각 웰당 1 ml 씩 가하여 시험계로서 사용하였다. 모든 시험계를 두개씩 만들어 37℃의 5 v/v% CO₂인큐베이터중에서 각각 24시간 및 48시간 인큐베이션하였다. 화합물 1 무함유의 계를 준비하여 상기와 마찬가지로 처리하여 대조로 사용하였다. 문헌 [I. Nicoletti et al. in Journal of Immunlogical Methods, Vol. 139, pp. 271-279 (1991)]에 기재된 방법에 따라 세포 자연 괴사증이 유발된 시험계 및 대조의 세포를 요오드화 프로피듐으로 염색하여 총 세포수에 대한 염색된 세포의 백분율을 구하고, 각각의 배양물을 폴리프로필렌제 튜우브에 옮겨 원심처리함으로써 생성된 상청액을 제거하고, 세포 침전물을 0.3 v/v% 소혈청 알부민을 함유한 인산완충 식염수로 세척한후, 세척한 세포를 다시 원심처리하여 상청액을 제거하였다. 새로 생성된 침전물을 각각 요오드화 프로피듐 (미합중국의 Sigma Chemical사 판매 ) 50μg/ml과, 0.1 w/v% 시트르산 나트륨 및 0.1 w/v% "TRITON X-100" (미합중국의 Sigma Chemical사 판매의 계면 활성제) 1.5 ml 씩과 혼합하여 세포를 요오드화 프로피듐으로 염색하였다. 염색된 세포를 어두운 곳에서 4℃에서 하루밤 저장한 다음, 각 시험계의 염색된 세포를 미합중국의 Beckman Coulter사 판매의 유동 혈구계산기인 "EPICS PROFILE Ⅱ"로 분석하였다. 수득한 데이타에 근거하여 각 시험계에서의 총 세포수에 대한 염색된 세포의 백분율을 세포 자연 괴사증 발현율로서 구하였다. 그 결과는 표 12에 나와 있다.

세포계*	배양시간(시간)	세포 자연 괴사중 발현율(%)
		대조	실험 2의 화합물 1 (농도)
			2.5㎍/ml	5.0㎍/ml	10㎍/ml
HL-60세포(5×105)	2448	0.71.5	0.71.3	1.74.2	11.822.6
U-937세포(5×105)	2448	3.24.5	3.25.2	5.011.7	6.866.9
HGC-27세포(1×105)	2448	1.51.4	1.92.2	1.74.1	3.514.1
HLC-1세포(1×105)	2448	2.71.5	3.75.8	4.27.3	8.121.8
C6세포(1×105)	2448	0.30.4	15.938.4	18.464.8	27.667.1

부호 "*"는 각 배양물에서의 초기 세포밀도 (개/ml)를 나타냄

표 12에 나온바와 같이 각 세포계에서의 세포 자연 괴사증 발현율은 본 발명의 생리활성 추출물의 투여량에 따라 증가하고 있다. 특히 각 시료와 대조 사이의 차이는 각 추출물의 투여량 10 μg/ml 에서 최대 레벨을 나타내었다. 본 발명의 생리활성 추출물은 세포계중에서도 임파종 유래의 U-937 세포 및 신경교 종양 유래의 C₆세포의 세포 자연괴사증 유발을 가장 현저하게 촉진하였다. 세포의 종양발생은 세포 자연괴사증이 몇가지 요인에 의해 유발되지 아니하기 때문에 발생하는 것이라하고 있다. 본 실험에서는 현저한 세포자연 괴사증이, 본 발명의 생리활성 추출물 존재하에 배양된 세포에서 관찰되고 있는 사실로부터 이 추출물은 생세포의 자연괴사증을 정상적인 상태로 억제하는 작용이 있음을 시사하고 있다. 데이타는 제시되어 있지 않으나 실험 1 및 2의 방법으로 얻은 화합물 1 이외의 생리활성 추출물을 상기한 방법으로 시험했을 경우에도 화합물에서와 마찬가지로 동일한 결과가 얻어졌다.

실험 15 : 사이토카인 생성 조절작용

실험 2에서의 화합물 7을 농도 1 mg/ml가 되도록 DMSO에 용해하고, 10 v/v% 소태아 혈청을 보충한 RPMI1640 배지 (pH 7.2)(이하, 간단히 실험 15에서는 "혈청배지"라 함)로써 희석하여 농도 50 mg/ml로 한 후, 다시 혈청 배지로써 계열 희석하였다. 면역 담당 세포로서의 HBL-38 세포를 소정의 세포밀도가 되도록 배양, 증식시켰다. 배양후에 증식된 HBL-38 세포를 RPMI1640 배지 (pH 7.2) (이하, 간단히 실험 15에서는 "혈청 무함유 배지"라 함)로써 원심처리에 의해 3회 세척한 후 혈청 무함유 배지를 사용하여 세포 밀도 1 ×10⁸개/ml가 되도록 조정하였다. 세포 부유액 1 ml에 혈청 무함유 배지 4.5 ml와, 디스파아제 (일본국의 Godo Shusei사 판매)를 생리 식염수에 농도 10,000단위/ml되도록 용해하여 제조한 분산액 0.5 ml을 가하고, 이 혼합물을 37℃에서 90분간 진탕하면서 인큐베이트하였다. 그 후, HBL-38 세포를 혈청 배지로써 원심처리에 의해 3회 세척하고, 여기에 혈청배지를 가하여 세포밀도 1 ×10⁶개/ml의 세포 부유액을 얻었다.

화합물 7의 상기한 희석액중의 하나를 50 μl 취하고, 분산 처리된 HBL-38 세포의 상기한 세포 부유액 150 μl와, 리포다당(LPS) 5 μg/ml 를 함유한 혈청 무함유 배지 50 μl를 마이크로플레이트의 각 웰에다 가한 후 5 v/v% CO₂인큐베이터중에서 37℃에서 24시간 세포를 인큐베이트한 것을 시험군으로 사용하였다. 이와 병행하여 음성 대조로서, 시험군의 LPS를 함유한 혈청 무함유 배지 대신에 혈청 무함유 배지로 된 계와, 양성 시험군으로서, 시험군의 화합물 7의 희석액 대신에 혈청 배지로 된 계를 준비하여 시험군에서와 마찬가지로 처리하였다. 24시간 인큐베이션한 후에 각 웰로부터 상청액을 50 μl씩 취하였다. 채취된 상청액을, Gg23-901-530 (미합중국의 National Institute of Health로부터 입수)을 인간 인터페론- γ의 표준물로 사용하는 통상적인 효소 면역 시험법으로 각각 처리하여 각 계에서의 인터페론-γ 생성을 정량분석하였다. 상청액을 각각 제거한 각 웰의 세포에 혈청배지에서의 방사선 강도가 5 μCi/ml 인³H-티미딘 용액을 50 μl씩 가하여 혼합한 후 5 v/v CO₂인큐베이터중에서 37℃ 에서 8시간 인큐베이트하였다. 그 후, 마이크로플레이트의 각 웰의 세포를 유리 필터로써 채취하여 미합중국의 Packard Instrument사 판매의 β선 검출기인 "DIRECT COUNTERㅡMATRIX 96"에 의해 방사선 강도를 측정하고, 각 웰의 세포에 의한³H-티미딘 흡수율을 조사하였다. 그 결과는 표 13에 나와 있다. 표 13에서³H-티미딘 흡수율의 레벨을 양성대조에 대한 상대값(%)으로 나타내었다.

	실험 2의 화합물 7의 농도(mg/ml)	인터페론-γ생성량(IU/ml)	3H-티미딘 흡수율의 상대값(%)
음성대조	` 0	1.367	-**
양성대조	0	5.468	100
시험군	0.070.150.310.621.252.55.010.0	2.7532.1951.9791.9581.2881.3420.9320.965	98.098.399.796.499.6105.7101.199.4

주: 부호 "*"는 양성 대조에서의 측정값에 의한 백분율을 나타냄.

부호 "**"는³H- 티미딘 흡수율을 측정하지 않았음을 나타냄.

표 13에 나온바와 같이 LPS는 HBL-38 세포에 의한 인터페론-γ생성을 유발하였고, 본 발명의 생리활성 추출물인 화합물 7은 인터페론-γ생성을 투여량과는 관계없이 억제하였다. 화합물 7의 농도가 적어도 1.25 ng/ml인 조건하에서는 LPS 무함유의 음성대조의 것과 동일한 레벨 또는 그 이하의 레벨로 인터페론-γ생성을 억제하였다. HBL-38 세포에 의한³H-티미딘 흡수율에 있어서 대조군과 시험군 사이에는 유의차가 전혀 발견되지 않았다. 이들 결과로부터 본 발명의 생리활성 추출물은 면역담당 세포의 증식에 영향을 주지 않으며 LPS등의 생체의 이물에 의해 유발된 세포의 인터페론-γ생성을 강력히 억제함을 알 수 있다. HBL-38 세포 대신에 면역 담당 세포로서의 마우스 비장 세포를 통상적인 방법으로 제조하고, 상기와 마찬가지로 처리하여 인터페론-γ생성이외에 인터로이킨 10 생성을 조사하였다. 그 결과, 본 발명의 생리활성 추출물은 인터페론-γ생성을 억제하며 인터로이킨 10 생성을 증가시킴이 관찰되었다.

생체내 면역계에서의 헬퍼 T 세포는 Th1 및 Th2를 포함하는 세포군으로 되어 있고, Th1과 Th2 사이의 평형은 면역반응의 발현에 크게 영향을 미친다고 하고 있다. 예컨대, 자기면역 및 염증 질환을 비롯한 각종 면역질환 등의 질환은 이 균형이 생체의 정상상태를 벗어나서 생체내에 Th1이 우세한 상태가 될 때 유발된다. 위에서 검토한 바와 같이 인터페론-γ와 인터로킨 10은, 전자의 사이토카인이 Th1 우세 상태에 대해 평형을 조절하는데 대하여 후자의 사이토카인은 Th1 우세상태로 되는 경향이 되지 않도록 평형을 억제하는 것으로 알려져 있다. 이들 실험 데이타에 의하면 본 발명의 생리활성 추출물은 면역 담당 세포에 의한 사이토카인 생성을 조절함으로써 생체내에서의 평형을 정상 상태로 조절하며, 이 평형의 이상에 의해 유발되는 각종 질환을 효과적으로 치료/예방하는 것을 시사하고 있다. 인터페론-γ는 염증성 사이토카인으로 알려져 있기 때문에 상기한 데이타 역시 본 발명의 생리활성 추출물을 이러한 사이토카인의 생성에 대한 억제제로서도 사용할 수 있음을 시사하고 있다.

데이타는 제시되어 있지 않으나 실험 1 및 2에서의 본 발명의 나머지 생리활성 추출물은 그 활성이 달라지더라도 화합물 7과 유사한 작용을 발휘하였음이 확인되었다.

실험 1 내지 15의 결과들로부터 실험 1의 방법으로 얻은 에틸 아세테이트 가용성 성분으로서의 본 발명의 생리활성 추출물, 즉 6,12-디히드로-6,12-디옥소인돌로[2,1-b]퀴나졸린; 3,5,4'-트리히드록시-6,7-메틸렌디옥시-플라본; 켐페롤; 3,5 ,7,4'-테트라히드록시-6-메톡시-플라본; 갈산; 카페산; 3-(1,3-디히드로-3-옥소-2H-인돌-2-일리덴)-1,3-디히드로-2H-인돌-2-온; [3S-(3α, 4β, 21β)]9-에틸-14-에틸-21-(메톡시카르보닐)-4,8,13,18-테트라메틸-20-옥소-3-포르빈프로판산); 및 [3S-(3α, 4β, 21β)]9-에틸-14-에틸-21-(메톡시카르보닐)-4,8,13,18-테트라메틸-20-옥소-3-포르빈프로판산 메틸 에스테르는 항바이러스 작용, 항종양 작용, 라디칼 포착작용 및 세포 자연 괴사증 조절작용, 사이토카인 생성 조절 또는 억제작용을 비롯하여 여러가지 생리학적 작용을 발휘함을 알 수 있다.

실험 16 : 급성 독성시험

통상적인 방법에 따라 실험 1 및 2의 방법으로 얻은 생리활성 추출물을 5주령의 ddy 마우스의 정맥 및 복강내에 투여한 결과, 투여경로와는 관계없이 LD₅₀은 체중 1 kg당 1 g 이상이었다. 이 데이타로부터 본 발명의 생리활성 추출물은 포유동물과 인간에 대해 거의 부작용 없이 안전하게 투여할 수 있음을 알 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시형태를 아래의 각 실시예로써 설명한다.

실시예 1: 생리활성 조(粗)추출물의 제조

일본국의 시네마현 아키시산 쪽(indigo plant)의 지상부(地上部) 30 kg을 7월에 수확하여 분말화하여 1회 추출에 대해 에틸 아세테이트 30~60 리터로써 실온에서 3회 반복하여 추출하였다. 수득한 추출물을 한데 모아 여과지로써 여과하고, 여액을 회수한 후에 증발시켜 에틸 아세테이트를 제거하고 건조하여 쪽 유래의 에틸 아세테이트 가용성 성분을 함유한 추출물 168 g을 얻었다.

여러가지 생리작용을 가진 이 추출물은 화장품과 의약품에 사용되는 생약으로서 유용하다.

실시예 2: 정제된 생리활성 추출물

실시예 1의 방법으로 얻은 추출물을 50 v/v % 메탄올 수용액에 현탁하고, 8부분으로 나눈 다음, 1700 ml의 "FS-1830" (일본국의 Japan Organo사 판매의 흡착 크로마토그래피용 겔)을 충전한 칼럼에 각각 부하하고, 60, 70, 80 및 90 v/v % 메탄올 수용액, 메탄올 및 에틸 아세테이트를 겔 체적과 동일량으로 하여 연속하여공급하였다. 용출액을 겔 체적의 절반 체적으로 분획하였다. 80 v/v % 메탄올 수용액으로써 칼럼으로부터 용출한 먼저번 획분과 나중의 획분을 각각 획분 2 및 획분 1이라 하고; 60 v/v %메탄올 수용액으로써 칼럼으로부터 용출한 나중의 획분을 획분 3이라 하며; 90 v/v % 메탄올 수용액으로써 칼럼으로부터 용출한 나중의 획분을 획분 4라 하고, 이들 획분을 별도로 회수하여 증발시켜 용매를 제거하고 건조시켜 고형물을 얻었다.

획분 1로부터 얻은 고형물 5.2 g 중에서 2.6 g을 메탄올 30 ml에 현탁하고 흡인여과하여 가용성 부분과 불용성 부분 (876 g)으로 분리하였다. 가용성 부분의 용액을 실리카 겔 1,350 ml가 충전된 칼럼에 가하고, 메탄올 농도 5 v/v %로부터 100 v/v %까지 단계적으로 증가시키면서 메탄올과 클로로포름의 혼합용액의 직선 기울기로써 가한 다음, 용출획분 450 ml를 회수하였다. 획분 4를 증발처리하여 용매를 제거하고, 수득한 고형물을 메탄올 2 ml에 현탁하고, 흡인조건하에서 여과함으로써 세척하여 6,12-디히드로-6,12-디옥소인돌로[2,1-b]퀴나졸린의 결정을 19.4 mg 얻었다. 불용성 획분을 적당량의 메탄올에 용해하여 실온에서 방치함으로써 3,5,4'-트리히드록시-6,7-메틸렌디옥시-플라본의 황색 침상 결정을 278 mg 얻었다.

획분 2로부터 얻은 고형물 10.7 g을 메탄올 40 ml에 현탁하고, 이 용액을 "SEPHADEX LH-20" (스웨덴국의 Pharmacia LKB Biotechnology AB 판매의 흡착 크로마토그래피용 겔) 1,520 ml가 충전된 칼럼에 가한 다음, 용출획분 190 ml을 회수하였다. 15번째 및 18번째 획분 각각을 증발시켜 용매를 제거하고 건조시켜 고형물을 얻었다. 18번째 획분으로부터 얻은 고형 조성물 400 mg을 메탄올과 물(=5:2 체적비)의 혼합용매 약 210 ml중에 완전히 용해하였다. 이 용액을 0.22 μm의 멤브레인 필터로써 여과하고, 실온에서 3일간 방치하여 결정을 석출시켰다. 이 결정을 종래의 여과지를 사용하여 켐페롤의 결정을 89.3 mg 회수하였다. 15번째 획분에서 얻은 고형물 500 mg을 메탄올 10 ml에 현탁하고 여과하여 불용성 물질을 회수한 다음, 여기에 메탄올 250 ml을 가하여 완전히 용해하였다. 이 용액을 0.22 μm의 멤브레인 필터로 여과하고 실온에서 7일간 방치하여 결정을 석출시켰다. 통상적인 여과지로 이 결정을 여과하여 3,5,7,4'-테트라히드록시-6-메톡시-플라본의 결정을 252.3 mg 얻었다.

획분 3으로부터 얻은 고형물 11.8 g을 메탄올 40 ml중에 용해하고, 이 용액을 1,680 ml의 "SEPHADEX LH-20" (스웨덴국의 Pharmacia LKB Biotechnology AB 판매의 흡착 크로마토그래피용 겔)가 충전된 칼럼에 가한 다음, 용출 획분을 560 ml을 회수하였다. 4번째 획분을 각각 증발시켜 용매를 제거하고 건조시켜 고형물을 얻었다. 이 고형물을 메탄올 약 10 ml에 용해하고, 이 용액을 480 ml의 "FS-1830" (일본국의 Japan Organo사 판매의 흡착 크로마토그래피용 겔)이 충전된 칼럼에 가한 다음, 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60 및 70 v/v % 메탄올 수용액을 각각 480 ml씩을 가하고 다시 메탄올 960 ml을 가하였다. 용출액을 분획하여 획분 240 ml을 얻었다. 5번째 획분을 증발시켜 용매를 제거하고 건조시켜 고형물 150 mg을 얻었다. 이어서 이 고형물을 에틸 아세테이트 300 ml에 용해하고, 이 용액을 0.22 μm의 멤브레인 필터로 여과하고 실온에서 7일간 방치하여 결정을 석출시켰다. 이 결정을 통상적인 여과지를 사용하여 회수함으로써 갈산의 결정을 18.7 mg 얻었다. "FS-1830"의 칼럼으로부터 용출한 9번째 획분을 증발하여 용매를 제거하고 건조시켜 고형물 500 mg 을 얻은후, 이 고형물을 에틸 아세테이트 0.5 ml 중에 용해하여 40 ml의 "SILICAGEL 60K650" (일본국의 Katayama Chemical Industries사 판매의 흡착 크로마토그래용 겔 )이 충전된 칼럼에 가한 다음, 에틸 아세테이트와 클로로포름의 혼합액 (=2:8, 3:7, 4:6, 5:5, 6:4, 7:3, 8:2 및 9:1, 체적비)과, 클로로포름 및 에탄올을 각각 40 ml씩 가하였다. 칼럼으로부터의 용출액을 분획하여 획분을 10 ml얻고, 17번째와 21번째 획분을 한데 모아, "SILICAGEL 60F₂₅₄(제품 No. 5717)" (미합중국의 Merck사 판매의 분리용 박층)을 박층판으로 사용하고 전개계로서의 톨루엔, 에틸 아세테이트 및 아세트산 (5:5:1, 체적비)의 혼합액을 사용한 박층 크로마토그래피 처리를 하였다. 전개후 Rf가 약 0.6인 위치에서의 실리카 겔의 일부를 회수하여 적당량의 메탄올로 추출하여 전개된 물질을 수득하였다. 이 추출물로부터 증발에 의하여 용매를 제거하고 건조하여 카페산(caffeic acid)의 결정을 15.4 mg 얻었다.

획분 4로부터 얻은 고형물 4.6 g중에서 4 g을 메탄올 40 ml와 혼합하여 용해시켰으나 일부는 용해하지 않고 침전을 형성하였다. 이 침전을 회수하고, 메탄올 800 ml중에 충분히 용해한후 실온에서 2일간 방치하여 적색의 조(租)결정 (crude crystal)을 석출시켰다. 이렇게 하여 얻은 조결정을 회수하고, 앞서 얻은 적색의 결정과 합쳐 적당량의 메탄올로 세정함으로써 충분한 량의 메탄올중에 용해시켰다. 수득한 용액을 멤브레인 여과하고, 여액을 증발시켜 용매를 제거하고 건조시켜 3-(1,3-디히드로-3-옥소-2H-인돌-2-일리덴)-1,3-디히드로-2H-인돌-2-온의 결정을 44.5 mg 얻었다.

여러가지 생리작용을 가진 이들 화합물은 비교적 고도로 정제된 성분을 필요로 하는 화장품과 의약품을 위한 생약으로서 유용하다.

실시예 3: 생리활성 조추출물

일본국의 시네마현 아키시산 쪽(indigo plant)의 지상부(地上部) 15 kg을 7월에 수확하여 분말화하여 1회 추출에 대해 에탄올 30 리터로써 실온에서 3회 반복하여 추출하였다. 수득한 추출물을 한데 모아 여과지로써 여과하고, 여액을 회수한 후에 증발시켜 에탄올을 제거하고 건조하여 쪽 유래의 에틸 아세테이트 가용성 성분을 함유한 추출물 560 g을 얻었다. 실시예 2의 방법으로 얻은 화합물을 표준품으로 사용하여 상기한 생리활성 추출물에 대해 통상적인 고속 액체 크로마토그래피 또는 가스 크로마토그래피에 의해 분석한 결과, 이 추출물은 에틸 아세테이트 가용성 성분으로서 6,12-디히드로-6,12-디옥소인돌로[2,1-b]퀴나졸린; 3,5,4'-트리히드록시-6,7-메틸렌디옥시-플라본; 켐페롤; 3,5,7,4'-테트라히드록시-6-메톡시-플라본; 갈산; 카페산; 3-(1,3-디히드로-3-옥소-2H-인돌-2-일리덴)-1,3-디히드로-2H-인돌-2-온; [3S-(3α, 4β, 21β)]9-에틸-14-에틸-21-(메톡시카르보닐)-4,8,13,18-테트라메틸-20-옥소-3-포르빈프로판산) 및 [3S-(3α, 4β, 21β)]9-에틸-14-에틸-21-(메톡시카르보닐)-4,8,13,18-테트라메틸-20-옥소-3-포르빈프로판산 메틸 에스테르를 각각 65, 780, 354, 988, 250, 230, 75, 52 및 63 mg의 양으로 함유하고 있음이 판명되었다.

여러가지 생리작용을 가진 이 추출물은 식품, 화장품 및 의약품에 사용되는 생약으로서 유용하다.

실시예 4: 스낵용 식품

20℃ 및 상대습도 85%에서 2주 동안 저장하여 환원당을 자기 동화시켜둔 감자를 통상의 방법에 따라 물로 씻고, 껍질을 벗긴후 선별하고 원심식 슬라이서 (slicer)로써 썰어 두께 약 1.5 mm의 슬라이스로 하였다. 이들 슬라이스를 물로 씻어 표면의 전분을 제거하고 물기를 뺀 다음 170℃의 기름중에서 5분간 튀긴후에 과잉의 기름을 제거하였다. 상기한 튀긴 슬라이스에 솔터(salter)를 사용하여 식염 6 중량부, 식품급 트레할로오스 분말 (등록상표 "TREHAOSE", 일본국의 주식회사 林原상사 판매의 트레할로오스 순도 98% 이상) 3 중량부, 실시예 3의 방법으로 얻은 생리활성 추출물 1 중량부 및 적당량의 향신료를 함유한 조미료 분말을 뿌렸다. 수득한 슬라이스를 칭량기(weighing machine)에 옮겨 주입하여 포장함으로써 스낵용 식품을 얻었다.

이 제품은 향기와 맛이 모두 양호하여 건강의 유지/촉진을 위한 건강식품으로서 유리하게 사용할 수 있다.

실시예 5: 티 백 (tea bag)

동결건조 홍차엑스 분말 9 중량부를 적당량의 물에 용해하고, 수득한 용액을 실시예 3의 방법으로 제조하여 엔탄올에 용해시켜 둔 생리활성 추출물 1 중량부와 혼합하였다. 이 혼합물을 통상의 방법으로 발효시키고 건조시켜 둔 홍차잎 90 중량부에 뿌렸다. 이어서 홍차잎을 체가름(sieving)하고, 절단하여 마무리 건조하고 선별기에서 이물을 제거한 후, 일본 종이를 사용하여 2 g씩 포장함으로써 티 백(tea bag)을 얻었다.

이 제품은 냉수 180 ml에 약 10분간 침출시키거나, 또는 90 - 100℃의 열탕 180 ml중에 약 2분간 침출시켜 마신다. 향기와 맛이 모두 좋은 이 제품은 건강을 유지증진하는 건강식품으로 유리하게 사용할 수 있다.

실시예 6: 건강보조 식품

식품급 트레할로오스 분말 (등록상표 "TREHAOSE", 일본국의 주식회사 林原상사 판매의 트레할로오스 순도 98% 이상) 42 중량부, 옥수수 전분 40 중량부, 실시예 3의 방법으로 얻은 생리활성 추출물 3.5 중량부 및 셀룰로오스 결정 2.5 중량부를 혼합하고, 통상의 방법에 따라 물을 분무하면서 혼련하고, 유동층 조립(造粒)한후 분쇄하여 정립(整粒)함으로써 타정(打錠)용 분말을 얻었다. 이 분말에 수크로오스 지방산 에스테르를 2 중량부 균일히 혼합한 후 직경 11 mm의 펀치를 장착한 타정기에서 타정하여 정제 (약 300 mg/정)를 얻었다.

섭취하기가 쉽고 소화관에서의 붕괴성이 우수한 이 제품은 건강을 유지증진하기 위한 건강보조 식품으로 유용하다.

실시예 7: 헤어 린스

식품급 트레할로오스 분말 (등록상표 "TREHAOSE", 일본국의 주식회사 林原상사 판매의 트레할로오스 순도 98% 이상) 1 중량부, 실시예 1의 방법으로 얻은 생리활성 추출물 2 중량부, α-글루코실 루틴 (상품명 "αG RUTIN", 일본국의 Toyo Sugar Refining사 판매) 2 중량부, 디스테아릴 메틸 암모늄 클로라이드 2 중량부,세탄올 2 중량부, 실리콘 오일 2 중량부, 폴리옥시에틸렌 올레일 알코올 에테르 1 중량부, 및 적당량의 향료를 가열용해하였다. 이 용액에 교반하면서 1,3-부틸렌글리콜 3 중량부, 정제수 85 중량부 및 적당량의 살균제를 가하여 혼합한 다음, 이 혼합물을 냉각하여 헤어 린스를 얻었다.

안정성이 양호하고 두피에 대한 자극이 거의 없는 이 제품은 두피와 모발의 건강상태를 유지증진하는 화장품으로 유리하게 사용할 수 있다.

실시예 8 : 밀크 로우션

폴리옥시 에틸렌 베헤닐 에테르 0.5 중량부, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 테트라올레에이트 1 중량부, 유용성 글리세릴 모노스테아레이트 1 중량부, 피루브산 0.5 중량부, 베헤닐 알코올 0.3 중량부, 말티톨 0.3 중량부, 아보카도 오일 1 중량부, 실시예 1의 방법으로 제조한 생리활성 추출물 1 중량부, 및 적당량의 비타민 E 와 살균제를 통상의 방법으로 가열용해하고, 여기에 소디움 L-락테이트 1 중량부, 1,3-부틸렌글리콜 7 중량부, 카르복시비닐 폴리머 0.1 중량부 및 정제수 86.3 중량부를 가하여 혼합하고, 이 혼합물을 호모지나이저(homogenizer)에서 에멀젼화 하여 밀크 로우션을 제조하였다.

이 제품은 점착성이 없고 확포성이 양호하므로 피부의 건강상태를 유지증진하는 화장품으로 유리하게 사용할 수 있다.

실시예 9: 치약

제2인산 칼슘 45 중량부, 풀룰란 2.9 중량부, 소디움 라우릴 술페이트 1.5 중량부, 글리세린 20중량부, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 라우레이트 0.5중량부, 소르비톨 10 중량부, 말티톨 7 중량부, 정제수 13 중량부, 및 실시예 1의 방법으로 제조한 생리활성 추출물 0.1중량부를 혼합하여 치약을 제조하였다.

이 제품은 구강의 건강상태를 유지증진하는 화장품으로 유리하게 사용할 수 있다.

실시예 10 : 연고

아세트산 나트륨 3수화물 1 중량부, DL-칼슘 락테이트 4 중량부, 글리세린 10 중량부, 박하유 0.5 중량부, 와셀린 49 중량부, 일본 왁스 10 중량부, 라놀린 10 중량부, 참기름 14.5 중량부, 및 실시예 1의 방법으로 제조한 추출물 백분율에 따라, 실시예 2의 방법으로 제조한 생리활성 추출물인 7가지의 화합물 1 내지 7과 배합된 조성물 2 중량부를 통상의 방법에 따라 균일하게 혼합하여 연고를 제조하였다.

침투성과 확포성이 양호한 이 제품은 피부의 건강상태를 유지증진하는 의약품으로 유리하게 사용할 수 있다.

상기한 바와 같이 본 발명은 생쪽(raw indigo plant) 유래의 에틸 아세테이트 가용성 성분이 포유동물과 인간에 대하여 여러가지 생리작용을 발휘한다는 자체 발견에 근거하여 된 것이다. 상기한 성분을 포유동물과 인간에 투여하면 살균작용, 항바이러스 작용, 항종양 작용, 라디칼 포착작용, 세포 자연괴사증 조절작용, 사이토카인 생성 조절작용, 사이토카인 생성 억제작용, 및 일산화 질소 합성효소 발현 억제작용을 비롯한 여러가지 생리활성을 발휘한다. 따라서 에틸 아세테이트 가용성성분을 함유한 본 발명의 생리활성 추출물을 식품, 화장품 및 의약품 분야에서 널리 사용할 수 있다.

햇빛에 말려 제조한 통상적인 쪽의 잎과 씨앗은 뜨거운 물로 추출한 후에 사용되는데, 실질적으로 사용되는 것은 쪽의 수용성 성분이다. 이들 성분중에서 인돌 성분은 햇빛에 건조 도중에 가수분해 및 공기산화 등의 화학변화를 일으키기 쉬우므로 쉽사리 열화(劣化)하게 된다. 본 발명에 의한 생리활성 조성물은 쪽을 햇빛에 말릴 필요없이 생쪽 유래의 에틸 아세테이트 가용성 성분을 사용하여 제조할 수 있다. 따라서 본 발명에 의하여 생쪽(living indigo plant)중의 생리학적으로 유효한 성분을, 때와 장소를 가리지 않고, 즉, 장소가 쪽의 산지와 멀리 떨어져 있더라도 그대로 사용할 수 있다. 이러한 유용성을 가진 본 발명의 생리활성 추출물을, 원료로서 생쪽을 사용하는 본 발명의 방법에 의하여 필요로 하는 양으로 제조할 수 있다.

이러한 유용한 효과를 가진 본 발명은 이 산업분야에 기여하는 바가 큰, 의의가 있는 발명이라 할 수 있다.

Claims (12)

1. 생쪽(raw indigo plant) 유래의 에틸 아세테이트 가용성 성분을 함유하는 생리활성 추출물.
2. 제1항에 있어서, 상기 쪽은, 상기 쪽의 신선한 지상부의 일부 또는 전부인 추출물.
3. 제1항에 있어서, 상기 에틸 아세테이트 가용성 성분은 6,12-디히드로-6,12-디옥소인돌로[2,1-b]퀴나졸린; 3,5,4'-트리히드록시-6,7-메틸렌디옥시-플라본; 켐페롤; 3,5,7,4'-테트라히드록시-6-메톡시-플라본; 갈산; 카페산; 3-(1,3-디히드로-3-옥소-2H-인돌-2-일리덴)-1,3-디히드로-2H-인돌-2-온; [3S-(3α, 4β, 21β)]9-에틸-14-에틸-21-(메톡시카르보닐)-4,8,13,18-테트라메틸-20-옥소-3-포르빈프로판산); 및/또는 [3S-(3α, 4β, 21β)]9-에틸-14-에틸-21-(메톡시카르보닐)-4,8,13,18-테트라메틸-20-옥소-3-포르빈프로판산 메틸 에스테르로 된 군으로부터 선택되는 1종 이상인 추출물.
4. 제1항에 있어서, 상기 에틸 아세테이트 가용성 성분을 고형물 기준으로 0.01 % 이상의 양으로 함유하는 추출물.
5. 생쪽을 유기용매중에 침지하여 상기 쪽의 에틸 아세테이트 가용성 성분을 추출하는 단계와, 이 추출물을 채취하는 단계를 포함하는 제 1 항의 추출물의 제조방법.
6. 제5항에 있어서, 상기 유기용매가 에탄올 또는 에틸 아세테이트인 제조방법.
7. 제5항에 있어서, 상기 쪽은, 상기 쪽의 신선한 지상부의 일부 또는 전부인 제조방법.
8. 제1항의 추출물을 함유하는 생리활성 조성물.
9. 제8항에 있어서, 추출물의 흡수를 용이하게 하는 다른 성분을 추가로 함유하는 조성물.
10. 제8항에 있어서, 식품, 화장품 또는 의약품으로 사용되는 조성물.
11. 제10항에 있어서, 상기 의약품은 살균제, 항바이러스제, 항종양제, 라디칼 포착제, 세포 자연 괴사증 억제제, 사이토카인 생성 조절제 또는 억제제, 일산화 질소 합성효소 발현 억제제, 신혈관 억제제, 및 수면장해 개선제로 된 군으로부터 선택되는 1종인 조성물.
12. 제8항에 있어서, 상기 에틸 아세테이트 가용성 성분을 고형물 기준으로 0.005 % 이상의 양으로 함유하는 조성물.