KR19990038423A

KR19990038423A - 간질환 예방 및 치료용 생약조성물

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Publication number: KR19990038423A
Application number: KR1019970058132A
Authority: KR
Inventors: 이정식
Original assignee: 김상조; 삼천당제약 주식회사
Priority date: 1997-11-05
Filing date: 1997-11-05
Publication date: 1999-06-05
Also published as: KR100239878B1

Abstract

본 발명은 간질환 예방 및 치료용 생약조성물에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 주생약성분으로 4 종의 생약성분, 즉 백화사설초, 강황, 호장근 및 산두근의 추출물을 함유하는 간질환, 특히 B 형 바이러스성 간염의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 생약조성물은 각각의 생약성분의 다양한 작용에 의해 면역기능을 항진시키고 항바이러스 작용을 나타내어 바이러스성 간염에 대한 예방 및 치료효과를 갖는다. 본 발명의 조성물에는 또한 목적하는 약물학적 효과를 더욱 강화시키기 위하여 필요에 따라 대청엽, 고삼, 인진호, 시호, 백출, 택사, 동충하초, 대황, 판남근, 용담초, 황금 및 중루로 구성된 그룹중에서 선택된 1 종 또는 2 종 이상의 보조생약성분을 포함시킬 수 있다.

Description

간질환 예방 및 치료용 생약조성물

본 발명은 간질환 예방 및 치료용 생약조성물에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 주생약성분으로 4 종의 생약성분, 즉 백화사설초, 강황, 호장근 및 산두근의 추출물을 함유하는 간질환, 특히 B 형 바이러스성 간염의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 생약조성물은 각각의 생약성분의 다양한 작용이 독특한 조화를 이루어 면역기능을 항진시키고 항바이러스 작용을 나타내어 바이러스성 간염에 대한 예방 및 치료효과를 갖는다.

간염은 주로 미생물(바이러스, 박테리아) 및 화학적 요인(에탄올, 발암성 물질, 환경오염인자등)에 의한 간장 손상을 유발시키며, 매년 약 200 만명 정도의 만성 바이러스성 간염 환자가 간경화, 간암 등으로 사망한다고 한다. 바이러스성 간염의 유발형으로는 A 형, B 형, C 형, 델타(Delta) 등의 약 28 종의 바이러스가 알려져 있으며, 이들의 병리기전에 대한 연구도 활발히 진행되고 있는 실정이지만 현재까지 만족할 만한 치료제의 개발은 이루어지지 않고 있다.

간염중에서도 특히 B 형 간염 바이러스의 감염에 의한 간염 환자는 세계적으로 널리 분포되어 있다. 특히 우리나라에는 급성 간염 환자뿐 아니라 만성적인 바이러스 보균자도 많다. 더구나 우리나라의 경우 만성 간염, 간경변증 및 간암 등의 중증 간질환에 대한 선행질환으로서 이러한 B 형 바이러스성 간염이 차지하는 비율도 다른 나라에 비해 월등히 높은 것으로 알려져 있다.

또한 B 형 간염 보균자는 현재 전세계에 2 억 1600 만명, 그중 아시아에 1 억 6800 만명, 중국에 1 억명 이상 등으로 주로 극동아시아, 아프리카 지역 및 개발도상국에 국한하여 집중분포하고 있으며 세계적으로 인구의 약 80% 가 병원성 항원에 노출되어 있는 실정이다. 우리나라도 40 대 이상 성인의 사망 원인중에서 바이러스성 B 형 간염 및 간암이 단연 우위로 나타나고 있으며, 전체 인구의 약 10% 정도가 B 형 간염 바이러스 보균자인 것으로 추정되고 있다.

현재까지 알려져 있는 B 형 간염의 항원으로는 HBsAg, HBcAg, HBeAg 등의 세가지가 있으며, 각각에 대한 항체도 알려져 있다. B 형 간염은 잠복기가 30-160 일이며 비경구적으로 감염되고, 증상은 A 형에 비해 더 심하며, 보통 쉽게 피로감을 느끼고 입맛이 없어지며 우측 상복부의 불쾌감이나 소화장애를 나타낸다.

일반적으로 간염의 치료목표는 질병의 진행을 중단시켜 간경변이나 간부전으로의 이행을 방지하고 전염성을 줄이는데 있다. 다양한 면역조절제와 항바이러스제들이 간염의 예방 및 치료제로서 가장 광범위하게 연구되어 왔으나, 아사이클로비르(acyclovir), 비다라빈(vidarabine) 등의 항바이러스제는 간염에 대한 유효성이 의문시되고, 코르티코스테로이드(corticosteroid)의 사용은 부작용 등으로 인하여 아직 논란의 대상이 되고 있다.

현재 간염의 예방 및 치료를 위해 가장 일반적으로 사용되고 있는 약물은 우르소데옥시콜린산, 면역자극제 및 항바이러스제가 있다.

이들중에서 우르소데스옥시콜린산은 담즙의 구성성분으로서 만성 간염 환자의 담즙농도를 낮추기 위해 투여되며, 간염에 대하여 어느 정도의 예방효과를 나타내기는 하나 근본적인 간염 치료효과는 미미한 형편이다.

간염의 치료를 위해 면역자극제를 사용하는 것은, B 형 간염 환자에게 있어서는 B 형 바이러스에 대한 면역반응의 결핍으로 인해 바이러스의 계속적인 증식이 초래된다는 가설을 근거로 하여 결핍된 면역체제를 자극하면 바이러스의 제거가 이루어질 수 있을 것이라는 점에 착안해서 개발된 방법이다. 이러한 목적으로 사용되는 면역자극제로는 레바미졸(levamisol), 리바바빈(ribavarin) 등이 있다. 그러나, 이러한 면역자극제도 간염에 대한 치료효과는 거의 없는 것으로 나타나고 있다.

한편, 항바이러스제는 체내에 존재하는 바이러스 자체를 제거하려는 의도로 개발된 가장 이상적인 치료제중의 하나로 볼 수 있으며, 대표적인 것으로는 인터페론이나 아데노신(adenosine), 아라비노사이드(arabinoside) 등이 있고 다른 치료제에 비해 비교적 그 우수성이 알려져 있으나 아직 만족할 만한 정도는 아니다. 특히 α-인터페론은 1991 년에 만성 B 형 간염과 C 형을 포함한 비(非, non)-A, 비-B 형 만성 간염에 대해 FDA 의 승인을 받은 약물로서 현재로선 만성 간염에 가장 효과가 있는 약물로 평가되고 있지만 그 약리기전은 정확히 밝혀지지 않았고, 단지 세포내 효소계를 활성화시켜 감염된 세포내에서 바이러스의 mRNA 를 파괴하는것으로 추정되고 있다. α-인터페론에 대한 간염의 반응율은 40-50% 로 보고되고 있으나 재발율이 높아 60% 의 환자가 6-12 개월 이내에 재발을 경험하는 경우가 많다는 단점이 있다.

이와 같이 간염의 치료에서 현재까지 단독으로 뚜렷한 성과를 나타내는 치료법은 개발되지 못하고 있는 실정이며, 단지 상기한 바와 같은 여러가지의 치료법을 병용하여 이용하고 있는 정도이다.

이에 본 발명자들은 면역학을 생약학과 접목시켜 연구함으로써 인체면역능력을 증대시켜 체내의 간염병원체를 신속히 제거하고, 또 바이러스(virus)의 증식을 억제하며 손상된 간세포를 회복재생시켜 HBsAg 의 음성전환을 촉진시켜 SGPT 를 저하시키는 생약복합제를 개발하기 위해 다양한 생약성분들을 대상으로 하여 집중적인 연구를 수행하였으며, 그 결과 이하에서 상세히 설명하는 바와 같은 특정의 구성을 갖는 생약조성물이 이러한 목적을 달성하는 것을 실험적으로 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 간질환, 특히 간염의 예방 및 치료에 유용한 생약조성물에 관한 것이다.

더욱 구체적으로, 본 발명은 4 종의 생약성분, 즉 백화사설초, 강황, 호장근 및 산두근을 주생약성분으로 함유하는 간질환, 특히 B 형 바이러스성 간염의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

상기한 바와 같은 4 종의 주생약성분을 함유하는 본 발명의 조성물은 이들 각각의 생약성분의 다양한 작용에 의해 면역기능을 항진시키고 항 바이러스작용을 나타내어 바이러스성 간염에 대한 예방 및 치료효과를 나타낸다. 특히, 본 발명의 조성물에서는 4 개의 주생약성분의 작용이 독특한 조화를 이루어 기존의 간염 치료용 생약제, 또는 각각의 성분을 생약으로 단독으로 사용하거나 이들 중의 일부만을 사용한 생약제 조성물들에 비해 월등히 우수한 간염 예방 및 치료효과를 제공한다. 이러한 효과에 의해 본 발명의 조성물은 바이러스성 간염에 의한 무력감, 식욕감퇴, 복부동통, 복수, 복부팽만감 등의 증상을 감소시키고 만성 간염이 간경화, 간암으로 진행되는 것을 현저히 저하시킨다.

이하에서는 본 발명의 조성물에서 각각의 생약이 어떤작용을 나타냄으로써 바이러스성 B 형 간염의 예방 및 치료 효과를 가지는지를 구체적으로 설명하고자 한다.

백화사설초는 주로 심장, 간장에 작용하여 항종양작용 및 항균, 소염작용을 나타내며, HBsAg 를 억제하고 SGPT 를 저하시키는 것으로 알려져 있다. 이는 청열해독작용이 있어 황달 및 바이러스성 간염 등의 간장질환에 사용되며 독성도 LD₅₀(마우스, i.p.)치가 104g/㎏이나 되므로 거의 무독성인 생약재이다.

강황은 담즙분비를 증가시키고 담즙성분을 정상화시켜 이담작용을 하며 항균작용도 뛰어난 것으로 알려져 있다. [현대실용중약]에 의하면 강황은 방향건위약으로서 담도 및 간장의 해독작용을 도와 황달, 흉통 등의 치료에 이용되는 것으로 기술되어 있다.

호장근은 항균작용 및 항바이러스작용이 있으며 저혈당에 의한 쇼크시 정맥주사하기도 한다. 한편 [약성론]에 의하면 호장근은 무독하나 임부는 복용을 금하고 있다.

산두근의 항종양작용은 마우스의 복수암에 대한 시험관내 시험에서 유효한 것으로 인정되었으며, 또한 [개보본초(開寶本草)]에 의하면 산두근은 각가지 약물의 독성을 제거하고 진통효과를 가지며 상처의 독을 제거하며 급성 황달과 해소, 발열을 치료하는 것으로 알려져 있다.

본 발명에 따르는 조성물에서 각 생약성분의 조성비율은 각각의 건조중량을 기준으로 하여 백화사설초 2-10, 호장근 2-10, 산두근 2-10, 강황 0.1-5의 비로 조합하여 사용한다. 바람직하게는, 본 발명의 조성물에서 각 생약성분은 건조중량기준으로 하여 백화사설초 4-6, 호장근 4-6, 산두근 4-6, 강황 1-3의 비로 조합하며, 특히 바람직하게는 백화사설초:호장근:산두근:강황을 5:5:5:2 의 중량비로 배합하여 사용한다.

위와 같은 조성비는 각각의 생약이 갖는 유효용량과 부작용등을 고려하여 찾아낸 것이며, 그 비율의 범위를 벗어나는 경우에는 효과가 떨어지거나 부작용의 우려가 있다.

본 발명의 조성물에는 또한 더욱 강력한 B 형 바이러스성 간염 치료효과를 얻기 위하여, 필요에 따라 대청엽, 고삼, 인진호, 시호, 백출, 택사, 동충하초, 대황, 판남근, 용담초, 황금 및 중루로 구성된 그룹중에서 선택된 1 종 이상의 보조생약을 첨가할 수도 있다.

보조생약이 첨가되는 경우에 이들의 첨가량은 건조중량을 기준으로 하여 대청엽, 고삼, 인진호, 시호, 백출, 택사, 판남근, 용담초, 황금 및 중루는 각각 2-10 중량부, 바람직하게는 4-6 중량부씩의 양으로 배합하고, 동충하초 및 대황은 각각 0.5-6 중량부, 바람직하게는 2-4 중량부의 비로 배합하여 사용하는 것이 적합하다.

본 발명에 따른 생약조성물의 인체에 대한 투여용량은 환자의 연령, 성별, 건강상태, 및 질환의 중등도 및 투약횟수 등에 따라 적절히 증감할 수 있으나, 일반적으로 성인(체중 약 70kg)에 대하여 상기와 같은 비로 배합된 원료생약조성물 6-35g 에 해당하는 추출물을 함유하는 제제를 투여하는 것이 적합하며, 예를들어 주사제의 경우에는 ㎖ 당 상기 정의한 양에 해당하는 추출물을 함유하는 제제를 1 일에 1-10㎖, 바람직하게는 3-6㎖ 의 양으로 정맥주사하는 것이 적합하다.

상기한 바와 같은 조성을 갖는 본 발명의 조성물은 간질환, 특히 B 형 바이러스성 간염의 치료를 위해 투여시에, 필요에 따라 간경변을 치료하기 위한 다른 약제와 병용하는 것이 바람직할 수도 있다.

본 발명에 따르는 조성물은 간질환, 특히 간염의 예방 및 치료를 위한 목적으로 인체에 투여시에 약제학적 분야에서 통상인 방법에 따라 주사제, 액제, 환제, 정제, 캅셀제 및 현탁제 등의 제제로 제형화시켜 사용할 수 있다. 특히 바람직하게는 본 발명의 조성물은 정맥주사제 등의 주사제의 형태로 제조하여 사용한다. 예를들어, 본 발명에 따르는 주사제 조성물은 강황을 물로 추출하여 증류하고, 백화사설초, 호장근 및 산두근도 물로 추출하여 증류하고, 농축시킨 후, 에탄올 용액으로 3 회 침출하고 여과하여 수득된 최종 여액에 강황의 추출물을 합하고 주사제의 제조에 통상적으로 사용되는 약제학적으로 허용되는 첨가제, 예를들면 트윈 80(Tween 80)과 같은 유화제를 첨가하여 대한약전 제제총칙중 주사제의 제법에 따라 제조한다.

본 발명은 이하의 실시예 및 실험예에 의해 더욱 구체적으로 설명되나, 본 발명이 이들에 의해 어떤식으로는 제한되는 것은 아니다.

실시예 1

강황 100g 을 물에 침지시켜 3 시간 동안 방치한 후, 증류수 1ℓ 를 가하고 추출액이 약 400-500㎖ 가 되도록 가열추출한 다음, 이 추출액이 약 250㎖ 가 되도록 농축하여 A 액을 제조하였다.

백화사설초, 산두근 및 호장근을 각각 250g 씩 취하여 증류수 7ℓ 를 가하고 24 시간 동안 방치한 후, 1 차로 1 시간 동안 가열추출하여 여과하고, 잔류물에 다시 증류수 3ℓ 를 가하여 40 분간 가열추출하였다. 추출액을 합하여 약 600㎖ 가 되도록 농축하여 B 액을 제조하였다. 이 B 액을 다음과 같은 방법에 의해 에탄올로 3 회 추출하여 불순물을 정제하였다.

B 액에 100% 에탄올 1400㎖ 를 가하여 70% 에탄올 용액으로 만들어 24 시간 동안 방치한 후에 여과하고, 여액 2000㎖ 로 부터 에탄올을 증발시켜 600㎖ 로 만들어 B1 액을 수득하였다.

B1 액에 100% 에탄올 2400㎖ 를 가하여 약 80% 에탄올 용액으로 만들어 24 시간 동안 방치한 후에 여과하여 여액 3000㎖ 를 얻고, 여기에 20% 수산화나트륨을 가하여 pH 를 8-9 로 조정하고 냉소(0-4℃)에서 24-48 시간 동안 방치한 후, 여과하고 여액 3000㎖ 를 취하여 에탄올을 증발시켜 600㎖ 로 만들어 B2 액을 수득하였다.

수득한 B2 액에 에탄올 3400㎖ 를 가하여 85% 에탄올 용액으로 만들고, 냉소(0-4℃)에서 24 시간 방치한 다음 여과하고, 여액 4000㎖ 가 600㎖ 가 되도록 증발, 농축시켜 B3 액을 수득하였다.

수득된 B3 액에 상기에서 수득한 A 액 250㎖ 및 트윈 80(TWEEN 80) 3g 을 혼합시키고, 증류수를 가하여 용액의 총량이 약 1ℓ 가 되도록 조정한 다음, 2N NaOH 를 사용하여 pH 를 7.5-8.0 으로 조정하고 대한약전, 제제총칙중 주사제의 제조방법에 따라 주사제를 제조하였다.

실시예 2

강황 100g 을 잘게 분쇄하여 분말화시켰다(분말 A). 별도로 백화사설초, 호장근 및 산두근은 각 250g 씩을 취하여 물 5ℓ 를 붓고 24 시간 동안 방치한 후, 1 시간 30 분 동안 가열추출하고 냉각시킨 다음 여과하여 여액 B 와 잔류물을 얻고, 이 잔류물에 물 약 2ℓ 를 가하고 1 시간 동안 가열추출하고 냉각시킨 다음 여과하고, 그 여액을 위의 B 여액과 합하였다. 이 혼합여액을 가열농축시킨 다음 냉각시켜 C 액을 얻고, 여기에 분말 A 를 가하여 균질하게 혼합시킨 다음 60℃ 이하의 온도에서 건조시키고 냉각시킨 다음 분쇄하여 생약혼합물의 분말 150g 을 수득하였다.

실시예 3

강황 100g 을 잘게 분쇄하여 분말화시켰다(분말 A). 별도로 백화사설초, 호장근, 산두근, 대청엽, 고삼, 인진호, 시호, 백출, 택사, 판남근, 용담초, 황금 및 중루 각 250g 및 동충하초 및 대황 각 100g 씩을 취하여 물 10ℓ 를 붓고 24 시간 동안 방치한 후, 1 차로 1 시간 동안 가열추출하여 여과하고, 잔류물에 다시 증류수 5ℓ 를 가하여 40 분간 가열추출하였다. 추출액을 합하여 약 600㎖ 가 되도록 농축하여 B 액을 제조하였다. 이 B 액을 다음과 같은 방법에 의해 에탄올로 3 회 추출하여 불순물을 정제하였다.

이하의 실험예에서 시험물질로 사용된 본 발명의 생약조성물은 실시예 1 에 따라 제조된 것으로, "UKG" 로 약칭하여 표시하였다. 경구용 UKG 또는 UKG1 은 실시예 2 에 따라 제조된 경구용 분말형태의 제제를 의미하며, 주사용 UKG 또는 UKG2 는 실시예 1 에 따라 제조된 주사제를 의미한다.

실험예 1

마우스 간염 바이러스에 의해 유발된 전격성 바이러스성 간염에 대한 본 발명 조성물(UKG)의 간세포 보호효과

본 발명의 생약조성물(UKG)의 바이러스성 간염에 대한 간세포 보호효과를 실험하기 위하여 혈청검사에 의해 마우스 간염 바이러스(MHV-2 바이러스)가 감염되지 않은 것으로 인정된 4 주령의 암컷 SPF-ICR 마우스(한국화학연구소)를 실험동물로 사용하였다. 마우스는 멸균한 폴리카보네이트 케이지(polycarbonate cage)에서 멸균한 시판 마우스용 고형사료(삼양사료주식회사)와 정제수를 자유롭게 공급하면서 사육하였다.

본 실험에서 마우스 간염 바이러스의 증식 또는 역가를 측정하기 위해 사용되는 SR-CDF1-DBT(DBT) 세포는 37℃ 에서 10% FCS(fetal calf serum, Gibco), 10% TPB(트립토즈 포스페이트 육즙, Gibco)를 포함하는 E-MEM 배지(Gibco)에서 계대배양하면서 유지시켰다.

간염 바이러스는 히라노(Hirano) 등의 방법[참고: Hirano. N.K. Fugiwara, S.I. Lino and M. Matsumoto: Replication and plaque formation of mouse hepatitis-virus (MHV-2) in mouse cell line DBT culture, Arch. Gesamte Virus- forsch. 44: 298-302, 1974]을 이용하여 MHV-2 를 DBT 세포에 감염시킨 다음, 15 시간 후에 배양상등액을 회수하여 E-MEM 배지에 넣고 회수된 플라그를 세어 플라그 형성단위(PFU; plaque forming unit)수로서 바이러스 역가를 측정하고, 식염수를 사용하여 1×10⁶PFU/0.2㎖ 의 농도로 희석하여 실험에 이용하였다. 모든 바이러스의 접종군에는 MHV-2 바이러스를 마우스당 1×10⁶PFU/0.2㎖ 의 농도로 복강주사하여 감염시켰다.

MHV-2 접종한 후에 마우스를 각군당 15 마리씩 다음의 4 군으로 나누었다.

① 제 1 군 : 생리식염수 10㎖/㎏ 경구투여군

② 제 2 군 : UKG 200㎎/㎏ 경구투여군

③ 제 3 군 : UKG 350㎎/㎏ 복강투여군

④ 제 4 군 : UKG 100㎎/㎏ 경구투여 + UKG 200㎎/㎏ 복강투여군

UKG 를 바이러스 접종 1 일후부터 상기의 농도로 매일, 8 일간 연속해서 경구 또는 복강투여한 후에 이하에 기술하는 바와 같은 방식으로 혈청생화학적 검사 및 병리조직학적 검사를 수행하였다. 본 실험에서 각 군에서의 MHV-2 접종 및 UKG 투여시기를 도시하면 다음과 같다.

(a) 제 1 군 (↑ : 생리식염수 8 회 경구투여)

(b) 제 2 군 (↑ : UKG 8 회 경구투여)

(c) 제 3 군 (↑ : UKG 8 회 복강투여)

(d) 제 4 군 (↑ : UKG 8 회 경구 및 복강투여)

A. 혈청생화학적 검사

혈청생화학적 검사는 시험종료 최종일까지 생존한 각 군의 마우스를 에테르로 마취시킨 후, 복대정맥으로 부터 혈액을 채혈하여 수행하였다. 혈액을 소원심분리관에 넣고 3,000rpm 으로 5 분간 원심분리한 후, 혈청만을 분리하여 혈액자동분석기(Express 550)를 이용하여 간기능 손상의 지표로서 혈청중 ALT(alanine amino-transferase), AST(aspartate amino-transferase), ALP(alkaline phospha- tase) 및 LDH(lactate dehydrogenase) 치를 측정하였다.

측정된 결과는 다음 표 1 에 기재하였다.

MHV-2(1×10⁶PFU)로 감염된 마우스에서 혈청생화학적 수치에 대한 UKG 의 영향

항 목	동물수	ALT(IU/L)	AST(IU/L)	ALP(IU/L)	LDH(IU/L)
제 1 군(MHV-2+생리식염수)	7	83.3± 6.9	96.4±10.2	174.8±27.5	714.3±92.7
제 2 군[MHV-2+경구용 UKG(200㎎/㎏)]	3	49.2±12.5	70.8±8.5	115.4±23.4	510.3±74.3
제 3 군[MHV-2+주사용 UKG(100㎎/㎏)]	4	45.9± 7.8	63.0±7.4	107.5±32.1	507.5±138
제 4 군[MHV-2+경구용 UKG(100㎎/㎏)+ 주사용UKG(200㎎/㎏)]	5	47.8±11.0	75.2±13.3	122.1±19.7	513.7±89.5
주) 1) 모든 수치는 평균치±표준편차로 나타낸 것이다.2) 비처리 대조군과 유의적으로 상이함.

상기 표 1 에 기재된 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 조성물 UKG 는 대조군인 제 1 군에 비해 ALT, AST, ALP 및 LDH 치의 증가를 현저히 억제시켰으며, 따라서 본 발명의 조성물은 MHV-2 감염으로 부터 간을 보호하는 효과가 있음을 알 수 있다.

A. 병리조직학적 검사

병리조직학적 검색을 위하여 각 군의 마우스를 에테르로 마취시키고 채혈한 후, 방혈치사시키고 간장을 적출하였다. 적출한 간장을 10% 중성 완충포르말린에 고정시키고 통상적인 조직처리과정을 거쳐 파라핀 포매조직을 만든 후, 4㎛ 두께로 조직절편을 제작하고 H-E(Hematoxylin & Eosin) 염색을 시행하여 광학현미경으로 관찰하였다.

(1) 간장의 육안적 소견

마우스 간염 바이러스(MHV-2)만을 접종한지 3 일째 폐사한 제 1 군의 마우스 간장의 육안적 소견에 따르면 생리식염수만을 접종한 마우스의 간은 유백색으로 취약위축되고 간전체에 걸쳐서 간표면에 출혈을 동반한 광범위한 응고괴사가 관찰되었다. 그러나 경구용 UKG(200㎎/㎏)를 투여한 제 2 군의 마우스의 간은 유백색으로 취약총대되고 간표면은 백색응고의 괴사상을 나타내었으며 일부 변성중에 있는 간조직도 관찰되었으나, 제 1 군의 마우스에 비하여는 미약하였다. 또한 주사용 UKG (300㎎/㎏)를 투여한 제 3 군 및 경구용 UKG(100㎎/㎏)와 주사용 UKG (200㎎/㎏)를 투여한 제 4 군의 마우스의 사망례에서는 간전체에 걸쳐서 백색의 광범위한 응고괴사병소와 울혈성괴사병소가 관찰되었으나 제 1 군보다는 병소의 정도가 상당히 미약하였다.

(2) 간장의 병리학적 소견

간장의 병리학적 소견은 MHV-2 를 단독접종(생리식염수 투여)한 후 폐사한 제 1 군의 마우스의 간 전체에 걸쳐 출혈성 융해괴사상과 단세포괴사상이 관찰되고, 세포핵은 파괴 또는 융해되었으며 염증세포의 침윤은 극히 적었다.

그러나 제 2 군(경구용 UKG 200㎎/㎏ 투여군)과 제 3 군(주사용 UKG 350㎎/㎏ 투여군)의 간조직에서는 간전체에 걸쳐 출혈을 동반한 간세포의 공포변성및 융해괴사상이 인정되었으며 괴사탈락된 간세포의 주위에는 중등도의 염증세포의 침윤이 관찰되었다.

제 4 군(경구용 UKG 100㎎/㎏+주사용 UKG 200㎎/㎏ 투여군)의 병소 또한 괴사성 병변으로서 간전체에 걸쳐 광범위하게 산재되어 있었으나 염증반응은 중등도로 관찰되었다.

각 군의 동물에서 관찰된 병리조직학적 소견을 요약하여 표 2 에 나타내었다.

MHV-2(1×10⁶PFU)를 복강내 감염시킨 후에 UKG 를 접종한 ICR 마우스에서 간병변의 형태

실험물질	병 변	염증반응*
실험물질	형태	염증반응*	성장	빈도
제 1 군(MHV-2+생리식염수)	괴사	산재성	++++	+++
제 2 군(MHV-2+경구용UKG 200mg/kg)	괴사	산재성	+++	++
제 3 군(MHV-2+주사용UKG 350mg/kg)	괴사	산재성	+	-
제 4 군(MHV-2+경구용UKG 100mg/kg +주사용UKG 200mg/kg)	괴사	산재성	+	+
주) * 염증반응은 감염후 72 시간째에 검사한 것이다.

상기 표 2 에 기재된 결과로부터, 본 발명의 조성물 UKG 는 병변의 발현빈도나 염증의 발현을 감소시키는 것을 알 수 있다.

실험예 2

B 형 간염 바이러스 표면항체(HBsAg)에 대한 본 발명의 조성물(UKG)의 영향

0.1-0.4g/㎖ 의 UKG2 와 0.1㎎/㎖ 비라졸(Virazole) 용액에 각각 HBV(HBsAg)혈청을 투입하였다. 또 이상 용액(HBsAg를 넣지 않은것), HBsAg 및 혈구희석액에 각각 상기 UKG2 및 비라졸 용액을 배비희석(1:2→1:4→1:8 희석)한후 37℃ 에서 4시간 동안 배양하였다. 다시 상기의 UKG2 및 비라졸 용액에 HBsAblgG-적혈구를 투입하여 37℃ 에서 8 시간 동안 배양한 후, 결과를 관찰하였다.

실험결과 : 관찰된 결과는 다음 표 3 에 기재하였다. 결과에서 적혈구가 응집하지 않은 경우는 해당 약물농도에서 HBsAg 가 음성으로 전환된 것으로 판정한다. 표 3 에서 보는 바와 같이 HBsAg 를 첨가하지 않은 서로 다른 농도의 UKG 와 비라졸 용액과 혈구희석액이 모두 HBsAblgG-적혈구와 접촉하면 적혈구는 응집할 수 없었다. 이는 상술한 물질이 적혈구의 응집을 막아준다는 것을 입증하며 UKG 가 HBsAg 를 음성으로 전환시켜 준다는 것을 알수 있다. 특히 UKG 를 0.3g/㎖ 이상 사용했을 때 가장 효과가 높다는 것을 알 수 있다.

UKG 용액이 B 형 간염 바이러스 표면항원(HBsAg)에 미치는 영향

실 험 군	UKG 희석도
실 험 군	1:2	1:4	1:8
(1) ⓐ 0.1g/㎖ UKG	-	-	-
ⓑ 0.2g/㎖ UKG	-	-	-
ⓒ 0.3g/㎖ UKG	-	-	-
ⓓ 0.4g/㎖ UKG	-	-	-
ⓔ 0.1g/㎖ 비라졸	-	-	-
(2) ⓐ 0.1g/㎖ UKG + HBsAg	+	+	-
ⓑ 0.2g/㎖ UKG + HBsAg	+	-	-
ⓒ 0.3g/㎖ UKG + HBsAg	-	-	-
ⓓ 0.4g/㎖ UKG + HBsAg	-	-	-
ⓔ 0.1g/㎖ 비라졸 + HBsAg	+	-	-
(3) ⓐ HBsAg 청	+	+	+
ⓑ 혈구희석액	-	-	-
+ : 적혈구응집항원 , - : 적혈구불응집항원

상기 표 3 에 기재된 결과로부터, 본 발명의 조성물 UKG 는 간염바이러스 표면항원인 HBsAg 를 음성으로 전환시켜 주어 간염의 발병을 억제함을 알수 있다.

실험예 3

갈락토사민으로 유도된 급성 간질환에 대한 본 발명 조성물(UKG)의 효과

체중 150-200g 내외의 스프라그-도울리계 웅성 랫트를 각 군당 10 마리씩 다음과 같이 6 군으로 나누었다.

① 정상군 : 생리식염수 10㎖/㎏ 만을 경구투여

② 대조군 : 갈락토사민 500㎎/㎏ 만을 복강 투여

③ UKG1-L : 경구용 UKG 40㎎/㎏ 경구투여

④ UKG1-H : 경구용 UKG 200㎎/㎏ 경구투여

⑤ UKG2-L : 주사용 UKG 70㎕/㎏ 복강투여

⑥ UKG2-H : 주사용 UKG 350㎕/㎏ 복강투여

본 발명조성물인 경구용 UKG 와 주사용 UKG 를 7 일 동안 연속해서 각 군별로 매일 오전에 경구 및 복강투여하였다. 정상군을 제외한 모든 시험군에 대하여 최종일 UKG 투여 4 시간 후에 갈락토사민을 500㎎/㎏ 의 용량으로 복강투여하고, 24 시간후에 실험동물의 안와정맥총으로 부터 혈액을 채혈하여 4,000rpm 에서 원심분리하여 수득한 혈청으로 부터 혈액분석기를 사용하여 혈청중의 GOT(glutamic oxaloacetic transaminase), GPT(glutamic pyruvic transaminase), ALP(alkaline phosphatase) 및 T-BIL(Total-Bilirubin) 농도를 측정하였다. 측정된 결과는 다음 표 4 에 나타내었다.

	GPT(IU/L)	GOT(IU/L)	ALP(IU/L)	T-BIL(mg/㎗)
정상군(n=10)	143±31.41	153±411.70	361±6.2	0.48±0.07
대조군(n=10)	1373±428.96	2722±411.70	648±36.60	1.16±0.45
UKG1-L(n=10)	572±187.06^*	1121±198.61^*	489±36.60^*	0.92±0.04^*
UKG1-H(n=10)	496±124.37^*	973±126.55^*	391±48.45^*	0.86±0.13^*
UKG2-L(n=10)	664±106.07^*	1354±199.50^*	577±99.50^*	0.9±0.32^*
UKG2-H(n=10)	566±136.77^*	1297±182.71^*	493±82.71^*	0.81±0.17^*
주) * : p<0.05

상기 표 4 에 기재된 결과로부터, 본 발명의 조성물 UKG 는 갈락토사민에 의한 간손상을 예방하는 효과가 있음을 알 수 있다.

실험예 4

사염화탄소(CCl₄)로 유도한 급성 간질환에 대한 본 발명 조성물(UKG)의 효과

① 정상군 : 생리식염수 10㎖/㎏ 만을 경구투여

② 대조군 : 25% 사염화탄소 3㎖/㎏ 용량으로 경구투여

③ UKG1-L : 경구용 UKG 40㎎/㎏ 경구투여

④ UKG1-H : 경구용 UKG 200㎎/㎏ 경구투여

⑤ UKG2-L : 주사용 UKG 70㎕/㎏ 복강투여

⑥ UKG2-H : 주사용 UKG 350㎕/㎏ 복강투여

UKG 를 각 군별로 7 일간 연속해서 매일 오전에 투여하고, 최종일 오후에 올리브유에 용해시킨 25% 사염화탄소를 3㎖/㎏ 씩 경구투여하였다. 사염화탄소 투여 24 시간 후에 실험동물의 안와정맥총으로부터 혈액을 채혈하여 약 30 분간 방치한 후, 혈청을 분리하여 혈액분석기를 이용하여 혈청중의 GOT(glutamic oxaloace- tic transaminase), GPT(glutamic pyruvic transaminase), ALP(alkaline phospha- tase) 및 T-BIL(Total-Bilirubin) 농도를 측정하였다. 측정된 결과는 다음 표 5 에 나타내었다.

	GPT(IU/L)	GOT(IU/L)	ALP(IU/L)	T-BIL(mg/㎗)
정상군(n=10)	204±36.0	153±10.2	297±38.2	0.31±0.05
대조군(n=10)	2380±713.2	1871±373.6	729±49.1	1.21±0.24
UKG1-L(n=10)	659±168.5^*	891±308.9^*	195±81.2^*	0.51±0.31^*
UKG1-H(n=10)	460±150.1^*	771±200.1^*	183±47.2^*	0.44±0.13^*
UKG2-L(n=10)	2015±512.4^*	1567±433.7^*	556±185.6^*	0.67±0.27^*
UKG2-H(n=10)	1147±405.8^*	1433±479.2^*	497±156.8^*	0.65±0.17^*
주) * : p<0.05

상기 표 5 에 기재된 결과로부터, 본 발명의 조성물 UKG 는 대조군에 비해 GOT, GPT, ALP 및 T-BIL 수치가 낮게 나타난 것으로 보아 사염화탄소에 의한 간손상으로 부터 간세포보호작용이 있음을 알 수 있다.

실험예 5

본발명의 조성물 UKG 의 독성시험

쿤밍(Kunming)종 마우스(체중 18-22g)를 암수 각 5 마리씩 2 군으로 나누어 다음과 같은 방법에 따라 본 발명의 의약조성물(UKG)의 독성을 측정하였다.

마우스에게 정맥주사할 수 있는 최대량인 0.1㎖/10g 의 양으로 주사용 UKG 를 1 차 정맥주사한 후, 호흡과 맥박이 빨라지는 외에 별다른 이상은 없었다. 주사후 곧 정상으로 회복되고 7 일간 마우스의 식사량, 음수량, 소대변이 모두 정상이며 체중이 조금 증가했을뿐 사망한 쥐는 없었다. 이로부터 UKG 조성물의 마우스에 대한 독성량은 적어도 10㎖/㎏ 이상이라는 것을 알수 있고, 이것을 정상체중이 70㎏ 인 사람에게 적용하면 700㎖/일에 해당하는 양이다. 따라서, 본 발명에 따르는 UKG 조성물은 실질적으로 독성과 부작용이 없는 안전한 약제인 것으로 밝혀졌다.

실험예 6

본 발명의 조성물 UKG 와 각 구성성분의 간보호효과 비교

동의보감에 간담의 기를 보하고 습열을 다스리는 것으로 잘 알려진 생약제로서 본 발명 조성물의 구성성분인 백화사설초, 강황 및 호장근 각각의 수추출물의 간보호작용과 본 발명의 UKG2 조성물의 간보호작용을 비교하기 위하여 다음과 같은 방법으로 실험을 수행하였다.

혈청검사에 의해 마우스 MHV-2 바이러스가 감염되지 않은 것으로 인정된 4 주령의 암컷 SPF-ICR 마우스(한국화학연구소)를 실험동물로 사용하였다. 마우스는 멸균한 폴리카보네이트 케이지에서 멸균한 시판 마우스용 고형사료(삼양사료주식회사)와 정제수를 자유롭게 공급하면서 사육하였다.

본 실험에서 마우스 간염 바이러스의 증식 또는 역가를 측정하기 위해 사용되는 SR-CDF1-DBT(DBT) 세포는 37℃ 에서 10% FCS, 10% TPB(트립토즈 포스페이트 육즙, Gibco)를 포함하는 E-MEM 배지(Gibco)에서 계대배양하면서 유지시켰다.

간염 바이러스는 실험예 1 에서와 마찬가지로 히라노(Hirano) 등의 방법을 이용하여 MHV-2 를 DBT 세포에 감염시킨 다음, 15 시간 후에 배양상등액을 회수하여 E-MEM 배지에 넣고 회수된 plaque 를 세어 플라그 형성단위(PFU)수로서 바이러스 역가를 측정하고, 식염수를 사용하여 1×10⁶PFU/0.2㎖ 의 농도로 희석하여 실험에 이용하였다. 모든 바이러스의 접종군에는 MHV-2 바이러스를 마우스당 1×10⁶PFU/0.2㎖ 의 농도로 복강주사하여 감염시켰다.

MHV-2 접종한 후에 마우스를 각군당 15 마리씩 다음의 5 군으로 나누었다.

① 제 1 군 : 생리식염수 10㎖/㎏ 경구투여군

② 제 2 군 : UKG2 350㎎/㎏ 복강투여군

③ 제 3 군 : 백화사설초 추출물 200㎎/㎏ 경구투여군

④ 제 4 군 : 강황 추출물 200㎎/㎏ 경구투여군

⑤ 제 5 군 : 호장근 추출물 200㎎/㎏ 경구투여군

UKG2 및 각각의 생약재의 추출물을 바이러스 접종 1 일후부터 상기의 농도로 매일, 5 일간 연속해서 경구 또는 복강투여한 후에 이하에 기술하는 바와 같은 방식으로 혈청생화학적 검사를 수행하였다.

혈청생화학적 검사는 시험종료 최종일까지 생존한 각 군의 마우스를 에테르로 마취시킨 후, 복대정맥으로 부터 혈액을 채혈하여 수행하였다. 혈액을 소원심분리관에 넣고 3,000rpm 으로 5 분간 원심분리한 후, 혈청만을 분리하여 혈액자동분석기(Express 550)를 이용하여 간기능 손상의 지표로서 혈청중 ALT, AST 및 ALP 치를 측정하였다. 측정된 결과는 다음 표 6 에 기재하였다.

항 목	동물수	ALT(IU/L)	AST(IU/L)	ALP(IU/L)
제 1 군[정상군]	10	40.1± 6.5	55.7± 9.2	89.3±10.5
제 2 군[UKG2 투여군]	10	47.8±11.0	76.8± 8.5	107.3±19.1
제 3 군[백화사설초 추출물 투여군]	10	57.5±13.2	92.7±12.3	123.7± 6.8
제 4 군[강황 추출물 투여군]	10	57.2± 9.5	90.5±10.8	109.8±11.2
제 5 군[호장근 추출물 투여군]	10	63.1±10.8	107.7±11.1	130.5±10.8
주) p<0.05

상기 표 6 에 기재된 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 UKG2 조성물 투여군에서의 ALT, AST 및 ALP 치는 백화사설초, 강황 및 호장근 추출물 각각을 투여한 군보다 훨씬 정상군에 가깝게 나타났으며, 폐사한 마우스의 간장을 육안적으로 관찰해보았을 때도 정상군에서는 간표면에서 출혈 및 괴사가 관찰되지 않았으나 백화사설초, 강황 및 호장근 추출물을 각각 투여한 군에서는 간장이 유백색으로 위축되어 있었고 간표면에 괴사가 관찰되었다. 이러한 결과로 부터, 본 발명의 조성물은 각각의 구성성분을 단독으로 투여한 경우에 비해 월등히 우수한 상승적 간보호효과를 나타냄을 알 수 있다.

Claims

주생약성분으로 백화사설초, 강황, 호장근 및 산두근의 추출물을 함유하는 간질환 예방 및 치료용 조성물.
제 1 항에 있어서, B 형 바이러스성 간염의 예방 및 치료용인 조성물.
제 1 항에 있어서, 주사제 형태인 조성물.
제 1 항에 있어서, 백화사설초, 강황, 호장근 및 산두근을 각 생약의 건조중량 기준으로 2-10:2-10:2-10:0.1-5 의 비로 함유하는 조성물.
제 4 항에 있어서, 백화사설초, 강황, 호장근 및 산두근을 각 생약의 건조중량 기준으로 4-6:4-6:4-6:1-3 의 비로 함유하는 조성물.
제 5 항에 있어서, 백화사설초, 강황, 호장근 및 산두근을 각 생약의 건조중량 기준으로 5:5:5:2 의 비로 함유하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 추가로 대청엽, 고삼, 인진호, 시호, 백출, 택사, 동충하초, 대황, 판남근, 용담초, 황금 및 중루로 구성된 그룹중에서 선택된 1 종 또는 2 종 이상의 보조생약성분을 함유하는 조성물.
제 7 항에 있어서, 생약의 건조중량 기준으로 대청엽, 고삼, 인진호, 시호, 백출, 택사, 판남근, 용담초, 황금 및 중루는 각각 2-10 중량부, 동충하초 및 대황은 각각 0.5-6 중량부의 비로 함유하는 조성물.
제 8 항에 있어서, 생약의 건조중량 기준으로 대청엽, 고삼, 인진호, 시호, 백출, 택사, 판남근, 용담초, 황금 및 중루는 각각 4-6 중량부, 동충하초 및 대황은 각각 2-4 중량부의 비로 함유하는 조성물.