KR19990028314A - 항원에 비특이적인 글리코실레이션 억제인자 유도체 - Google Patents

Abstract

SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 가지는 항원 비특이적인 사람 글리코실레이션 억제 인간에 비해 증가된 생물학적 활성을 가지는, 전기 억제인자의 유도체; SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 서열의 돌연변이를 포함하면서 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 가지는 항원 비특이적인 사람 글리코실레이션 억제인자에 비해 증가된 생물학적 활성을 가지는, 전기 억제인자의 유도체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 전기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터; 전기 폴리뉴클레오티드에 의해 형질전환된 원핵 혹은 진핵 세포; 항원에 비특이적인 사람 글리코실레이션 억제 인자 유도체와 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물; 항원에 대한 사람 면역반응을 억제하는 방법을 제공한다.

Description

항원에 비특이적인 글리코실레이션 억제인자 유도체

발명의 분야

본 발명은 항원에 대한 인간의 면역반응을 억제하는 데 사용될 수 있는, 항원에 비특이적인 글리코실레이션 억제인자(이하, 'GIF'로 기재함) 유도체 단백질, GIF 유도체 단백질을 코딩하는 DNA, 이 DNA를 포함하는 재조합 발현벡터, 전기 DNA로 형질전환된 세포, GIF 유도체 단백질의 제조방법 및 GIF 유도체 단백질을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.

발명의 배경

IgE 항체는 알러젠(항원)에 대하여 화분병(pollinosis) 같은 알러지 질환을 일으키는 것으로 잘 알려져 있다. 알러지 질환에서 IgE의 역할은, 알러젠에 대한 IgE 항체 형성의 조절과 억제가 알러지 질환의 근본적인 치료들 중의 하나가 될 수 있다는 가능성을 제기하였다. 최근, 알러지 환자들에게 미세한 양의 알러젠을 반복적으로 주입하여 민감성을 잃게 하는 치료법이 실제적 임상 분야에서 수행된다. 비록 민감성을 잃게 하는 치료법이 어떤 환자들에게 있어서는 임상적 징후들을 개선시킬 수는 있지만, 이것은 아나필락틱 쇼크(anaphylatic shock)을 일으킬 위험을 내포한다. 그러므로, 민감성을 잃게 하는 치료법은 충분한 검토를 거친 한정된 환자들에게만 행하여진다.

앞서 언급된 문제들을 해결하기 위하여, 자연상태의 항원에 대한 항체와는 결합하지 않는 변형된 항원을 주입하려는 시도가 있었다. 그러나, 치료 후에도 환자의 IgE 항체 역가는 감소하지 않았다. 반면에, 변형된 항원의 주입은 헬퍼 T세포 뿐만 아니라, 항원에 특이적인 억제성 T세포도 유도하며, 항원에 특이적인 억제성 T세포의 전이는 면역화에 의해 유도된 IgE 생성의 진행을 억제한다는 것이 발견되었다(참조 : Takatsu and Ishizaka, J. Immunol., 117, 1211, 1976). 이러한 발견들은 만약 헬퍼 T세포가 아닌, 항원에 특이적인 억제성 T세포가 헬퍼 T세포의 수를 늘리지 않고 선택적으로 유도될 수 있다면, IgE 생성의 진행을 억제할 수 있음을 시사한다.

1980년대에, IgE 생성을 선택적으로 조절하기 위하여 IgE에 결합하는 두 종류의 T세포 인자가 IgE 생성의 조절에 관한 연구과정에서 발견되었다. IgE에 결합하는 인자 중 하나는 IgE 생성을 증가시키는 반면, 다른 하나는 IgE 생성을 억제한다. IgE 강화인자와 IgE 억제인자의 구조는, 단백질 부분에 있어서 비슷하지만 탄수화물 부분에서 차이가 있다. IgE 강화인자는 N-결합의 만노오즈(mannose)가 많은 탄수화물을 가지며, 렌틸 렉틴(lentil lactin)에 결합한다. IgE 억제인자는 렌틸 렉틴에 대하여 친화력을 가지지 않는다(참조 : Yodoi, et al., J. Immunol., 128, 289, 1982). IgE 강화인자와 IgE 억제인자는 탄수화물 부분의 구조 차이에 따라 서로 다른 생물학적 특성을 가진다. 생리학적 조건하에서, IgE 결합인자들의 글리코실레이션은 이 과정을 향상시키거나 억제하는 두가지 T세포 인자에 의해 조절된다. IgE 결합인자의 글리코실레이션을 증가시켜 IgE 강화인자로 만드는 인자는 글리코실레이션 증가인자(GEF)로 명명되며, IgE 결합인자의 글리코실레이션을 억제하여 IgE 억제인자로 만드는 인자는 글리코실레이션 억제인자(GIF)로 명명된다. 동물실험에서, GEF는 IgE 생성이 증가될 때 항상 제조되며, GIF는 IgE 생성이 억제될 때 항상 제조된다. 그러므로, GEF와 GIF의 조화가 IgE 결합인자의 특성을 결정하여, IgE 생성을 조절하는 것으로 생각되었다.

이후의 연구에서, GIF를 생산하는 T세포는 항원에 특이적인 억제성 T세포임이 밝혀졌다(참조 : Jardieu et al., J. Immunol., 133, 3266, 1984). 오브알부민(OVA)에 특이적인 억제성 T세포 하이브리도마를 사용한 연구에서, 전기 하이브리도마는 GIF를 항상적으로 생산했으며, GIF는 항원에 대한 특이성을 나타내지 않았다(항원에 비특이적인 GIF). 또한, 오브알부민에 친화력을 가진 GIF(항원에 특이적인 GIF)의 생산은 전기 하이브리도마 세포를 오브알부민으로 자극된 항원 제시세포(antigen-presenting cell)로 자극함으로서 유도되었다. 항원에 특이적인 GIF는 항원과 결합하는 폴리펩티드 사슬과 비특이적인 GIF로 구성되었다(참조 : Jardieu and Ishizaka, Immune Regulation by Characterized Polypeptides, edited by Goldstein et al., Alan R. Liss, Inc., N. Y., page 595, 1987). 항원에 특이적인 GIF는 항원 특이적인 억제성 T세포 인자와 공통적인 항원 결정기(antigenic determinants)를 공유하는 것으로 밝혀졌다(참조 : Steel, J. K. et al., J. Immunol., 142, 2213-2220, 1989). 그리고 항원에 특이적인 GIF는 항원(담체)에 특이적인 방식으로 항체반응을 억제하는 것으로 밝혀졌다(참조 : Jardieu, P. et al., J. Immunol. 138, 1494-1501, 1987). 또한, 오브알부민에 특이적인 GIF의 생산은 비특이적인 GIF를 오브알부민으로 자극된 쥐(mouse)에 주입한 후, 오브알부민으로 이 쥐의 비장(spleen) 세포를 자극함으로서 유도되는 것으로 밝혀졌다(참조 : Akasaki, M. et al., J. Immunol., 136, 3172-3179, 1986).

최근, 본 발명자들은 쥐의 억제성 T세포에서 GIF를 분리하고, 항원에 비특이적인 GIF 유전자의 클로닝에 성공하였다. 더욱이, 이들은 이 GIF 유전자를 프로브로 사용하여 사람 유전자를 얻었다(참조 : Mikayama, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 10056-10060, 1993). 유전자 재조합 기술을 이용하여 전기 유전자를 숙주 세포인 대장균(E. coli)이나 동물 세포에서 직접 발현시켰을 때, 제조된 재조합 GIF는 억제성 T 세포에서 파생된 GIF에 비해 지극히 낮은 생물학적 활성을 나타내었다. 이 유전자가 소포체로 이동하는 융합 단백질(fused protein)의 형태로 동물 숙주 세포에서 발현되었을 때만, 생산된 재조합 GIF는 억제성 T 세포에서 파생된 GIF와 비슷한 수준의 생물학적 활성을 나타내었다. 그 후, GIF 펩티드의 번역후 변형(post-translational modification)이 충분히 높은 생물학적 활성을 가지기 위하여 필요한 것으로 밝혀졌다(참조 : Liu, Y-C. et al., Proc. Nalt. Acad. Sci. USA, 91, 11227-11231, 1994). 한정된 양의 정제 단백질로써 GIF의 구조를 연구하기에는 어려움이 있으므로, 생물학적 활성에 대한 구조는 현재 알려져 있지 않다.

항원에 특이한 GIF 그 자체, 혹은 항원에 특이한 억제성 T세포를 유도할 수 있는 비특이적 GIF의 주입은 알러지 치료에 매우 효과적일 것으로 기대된다. 이러한 치료는 재조합 DNA 기술에 의해 충분히 높은 생물학적 활성을 가진 GIF의 대량생산을 필요로 한다. 그러나, 생물학적 활성이 높은 GIF의 생성에 대한 분자측면에서의 기작은 알려져 있지 않기 때문에, 충분히 높은 생물학적 활성을 가진 재조합 GIF 유도체 생산에는 아직 아무도 성공하지 못하였다.

본 발명은 첫 번째 목적은, 높은 생물학적 활성을 가진 GIF 유도체를 제공하는 것이다.

본 발명의 두 번째 목적은, 방법에 사용되는 재료는 물론 방법과 숙주세포에 상관없이, 높은 생물학적 활성을 가진 GIF 유도체를 대량으로 생산할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

나아가 본 발명의 세 번째 목적은, 알러지와 같은 질환의 치료를 위해 항원에 대한 면역반응의 억제에 이용할 수 있는 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

제1도는 펩신으로 절단된 재조합 GIF의 수퍼 ODS(Super ODS) 컬럼에서의 분획패턴과, 이 펩티드 단면의 아미노산 서열을 나타내고 있다.

제2도는 광선 산란(light scattering)으로 측정한 재조합 GIF(야생형)와 C57A/N106S-GIF의 분자량 분포를 나타내고 있다.

제3도는 카복시메틸레이션된 재조합 GIF의 CM-5PW 칼럼에서의 분획 패턴을 나타내고 있다.

제4도는 피리딜에틸레이션된 재조합 GIF의 CM-5PW 컬럼에서의 분획 패턴을 나타내고 있다.

제5도는 GIF 유도체(C57A/N106S-GIF)의 알러지 반응(active cutaneous anaphylaxis)에 미치는 효과를 나타내고 있다.

제6도는 GIF 유도체(C57A/N106S)가 인슐린 의존적 진성 당뇨병(diabetes mellitus)의 전진에 미치는 효과를 나타내고 있다.

본 발명을 수행하기 위한 바람직한 실시예

본 발명은 숙주세포와 제조과정에 상관없이 높은 면역억제 활성을 가진 GIF 유도체 단백질(이하, "본 발명의 단백질"이라 함)을 제공한다.

GIF의 면역억제 활성(이하, "GIF 활성"이라 함)은 생체 내에서 항원에 의해 유도되는 면역글로불린 E와 G1으로 분류되는 특이 항체의 형성을 억제하는 활성으로 정의된다. 이 활성은 글리코실레이션 된 IgE 결합인자를 생산할 수 있는 쥐의 T세포 하이브리도마 12H5 세포가 실험실 조건하에서, 글리코실레이션 되지 않은 IgE 결합인자를 생산할 수 있는 세포로 전환되는 능력으로서 결정된다(참조 : Iwaka and Ishizaka, J. Immunol., 141, 3270, 1988).

본 발명의 단백질은 면역억제 활성을 가진, 항원에 비특이적인 사람 글리코실레이션 억제인자 유도체이다. 이때, 이 유도체에는 SEQ ID NO : 1의 아미노산 서열 일부의 치환, 결실 및/혹은 삽입을 위해 돌연변이가 도입되고/되거나, SEQ ID NO : 1의 아미노산 서열 중 하나 혹은 그 이상의 아미노산 잔기에 화학적 변성이 도입되었다. 돌연변이 및/혹은 화학적 변성은 GIF 분자의 생물학적 활성을 증가시키며, SEQ ID NO : 1의 아미노산 서열을 포함하는, 항원에 비특이적인 사람 글리코실레이션 억제인자가 삼중체를 이루는 데에 관여하는 부분에서 분자간 연합(association)의 세기를 약화시킬 수도 있다. 분자간 연합의 세기는 광선 산란, 분석용 초원심분리, 크리스탈로그래픽 분석 등의 방법으로 측정할 수 있으며, 높은 GIF 활성을 나타내기 위하여는 614 이하가 바람직하다.

분자간 연합의 세기를 약화시키는 돌연변이는 적어도 한 개의 아미노산 잔기의 치환, 결실 그리고 삽입을 포함하며, 이러한 것들을 돌연변이가 일어나기 쉬운 부위에서 분자간 상호작용(특히 수소결합 형성과 소수성(hydrophobic) 상호 작용에 의한)을 변화시킬 것이다. 돌연변이의 예로서는 연합에 관여하는 부위의 극성(polarity)를 변화시키는 치환, 결실, 삽입 그리고 부가(예를 들면, 중성아미노산 잔기를 전하를 띤 아미노산 잔기로 치환하거나 그의 반대, 전하를 띤 아미노산 잔기의 삽입이나 결실 등), 연합에 관여하는 부위에서 한 아미노산 잔기를 이와 다른 길이의 곁가지를 가진 아미노산 잔기로의 치환 등이 있다. 다른 예로서는, 관심이 되는 부위의 바깥에 있지만 연합의 세기를 약화시키기 위해 그 부위의 구조에 영향을 미치는 부위에 있는 아미노산 잔기를 돌연변이시키는 것이다.

바람직한 돌연변이 위치는 삼중체를 이루기 위한 분자간 연합에 관여하는 것으로 생각되는 부위, 그 부근의 부위들 그리고 그 부위의 구조에 영향을 미치는 부위들에 있는 아미노산 잔기를 포함한다. 분자간 연합에 관여하는 것으로 생각되는 부위의 예로는, SEQ ID NO : 1의 아미노산 서열을 가진 분자와의 소수성 상호작용에 의한 무리(cluster) 형성에 관여하는 39, 48, 50, 57 그리고 59위치를 포함하여, 분자간 수소결합 형성에 관여하는 37-45, 47-50, 94-98 그리고 106-110의 위치가 있다. 돌연변이의 특이적인 예로는, 57 위치에서 시스인 잔기를 알라닌이나 세린 잔기로 치환하는 것, 57과 106 위치에서 시스테인과 아스파라긴 잔기를 알라닌과 세린 잔기로 각각 치환하는 것 등이 있다.

분자간 연합을 약화시키는 변형에는 지금까지 알려진, 변형될 아미노산의 전하 혹은 소수성을 증가시키거나 저하시키는 선택적 화학변형이 있다. 이러한 예로서 포스포릴레이션, 알킬레이션, 아실레이션 그리고 시스테인 잔기의 설프히드릴 그룹의 변형이 있다. 변형의 특이한 예로는 카복시메틸레이션, 피리딜에틸레이션 그리고 에틸머큐리치오살리실레이트(EMTS) 혹은 5,5'-디치오비스(2-니트로 벤조익 산)(DTNB)를 이용한 시스테인 잔기의 선택적 화학변형, N-말단의 변형을 위한 아세틸레이션, 포밀레이션 등이 있다.

선택적 화학변형은 야생형의 아미노산 서열을 포함하는 GIF 단백질뿐만 아니라, 야생형 GIF의 아미노산 서열(SEQ ID NO : 1)의 치환, 결실 및/혹은 삽입을 위해 돌연변이된 GIF 단백질에도 적용될 수 있다. 돌연변이 GIF 단백질의 화학적 변형의 예로는, 57 위치에서 시스테인 잔기가 알라닌 잔기로 치환된 돌연변이 GIF의 카복실레이션과, 57과 106 위치에서 시스테인과 아스파라긴 잔기가 알라닌과 세린 잔기로 각각 치환된 돌연변이 GIF의 카복실레이션을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 본 발명은 또한, 높은 면역억제 활성을 가지는 GIF 유도체 단백질을 코딩하고 있는 폴리뉴클레오티드(이하, "본 발명의 폴리뉴클레오티드"라 함)를 제공한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 글리코실레이션 억제인자의 면역 억제활성을 가진, 항원에 비특이적인 사람 글리코실레이션 억제인자 유도체의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한 폴리뉴클레오티드이다.

이때, 이 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO : 1의 아미노산 일부가 치환, 결실 및/혹은 삽입된 돌연변이를 가지며, 이 돌연변이는 분자간 연합의 세기를 약화시키는데 특히, SEQ ID NO : 1의 아미노산 서열을 포함하는 항원에 비특이적인 사람 글리코실레이션 억제인자가 삼중체를 이루는 데 관여하는 부분에서의 세기를 약화시킨다. 이러한 폴리뉴클레오티드들은 알려진 GIF cDNA (참조 : Mikayama, T. et al., Supra)를 이용한 부위 특이적 돌연변이(site-directed mutagenesis)에 의해; 목적의 돌연변이 위치를 포함한 폴리뉴클레오티드 일부의 화학합성과 GIF cDNA의 해당 부위를 전기 화학합성된 폴리뉴클레오티드로 치환함으로써; 혹은, 전부 화학합성함으로써 제조할 수 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드에는 유전정보(genetic code)의 축퇴(degeneracy)로 인한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 있다. 만일, 부분 혹은 전체 GIF를 코딩하는 부위에 대하여, GIF 유도체 단백질이 발현될 숙주에 적합한 바람직한 코돈을 선택한다면, 단백질의 발현 농도를 증가시킬 수 있다. 특히, 부분 GIF를 코딩하는 부분에서 바람직한 코돈을 선택한다면, N-말단을 코딩하는 부위에 대해 선택하는 것이 효과적이다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드의 예로는 SEQ ID NO : 2, 3 혹은 20 등의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드에는 발현을 용이하게 하는 발현 벡터의 구축을 위해, 개시 부위와 종결부위에 제한 부위(restriction site) 삽입 그리고/혹은 DNA 첨가가 있을 수 있다.

본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 가진 벡터, 벡터로 형질 전환된 숙주 세포, 숙주 세포의 배양을 포함하는 본 발명의 단백질 제조법 그리고 본 발명으로 제조된 단백질의 분리과 정제법을 제공한다.

숙주 세포로는 원핵생물(예로서 박테리아, 바람직하게는 대장균), 진핵생물의 세포(예로서 효모, 곤충, 포유동물)를 사용할 수 있다. 포유세포의 예로서는 COS 세포, CHO 세포(Chinese Hamster Ovary cells), X63.6.5.3 세포, C-127 세포, BHK(Baby Hamster Kidney) 세포, 사람 유래의 세포(예로서 Hela cell) 등이 있다. 효모의 예로서는 사카로마이세스 세레비시아(Saccaromyces cerevisiae), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 등이 있다. 곤충세포의 예로서는 봄빅스 모리(Bombyx mori) 배양 세포(예로서 Sf21 세포) 등이 있다.

이러한 숙주 세포들을 형질 전환하기 위해 사용될 벡터로는, 대장균에서의 발현에는 pKC30(참조 : Shimatake H. and M. Rosenberg, Nature, 292, 128-132, 1981)과 pTrc99A(참조 : Amann E. et al., Gene 6, 69, 301-315, 1988) 등; 포유세포에서의 발현에는 pSV2-neo(참조 : Southern and Berg, J. Mol. Appl. Genet., 1, 327-341, 1982), pCAGGS( 참조 : Niwa, et al., Mol. Cell. Biol., 8, 466-472, 1988), pcDL-SR α296(참조 : Takabe, et al., Mol. Cell. Biol., 8, 466-472, 1988) 등; 효모에서의 발현에는 pG-1(참조 : Schena M. and Yamamoto K. R., Science, 241, 965-967, 1988) 등; 봄빅스 모리 배양 세포에서의 발현에는 재조합 바이러스 제조를 위한 전이 벡터 pAc373(참조 : Luckow, et al., Bio/Technology, 6, 47-55, 1988) 등을 사용할 수 있다.

이러한 벡터들은 필요하다면 복제 기원, 선택 표지(selective maker), 프로모터를 포함할 수 있다. 진핵 세포에서의 발현을 위한 벡터들은 필요하다면 RNA 스플라이스 부위, 폴리아데닐레이션 시그널 등을 포함할 수 있다.

복제 기원으로서는 SV40, 아데노바이러스 그리고 보바인 파필로마 바이러스 등에서 파생된 것들을 포유 세포에서의 발현을 위한 벡터에 사용할 수 있다. Co1E1, R 인자, F 인자에서 파생된 복제 기원은 대장균에서의 발현을 위한 벡터에 사용할 수 있다. 2μ mDNA와 ARS1에서 파생된 복제 기원은 효모에서의 발현을 위한 벡터에 사용할 수 있다.

유전자 발현을 위한 프로모터로는 레트로바이러스, 폴요마(polyoma) 바이러스, 아데노바이러스, SV40 등의 바이러스에서 파생된 프로모터와 엄색체에서 파생된 프로모터(예로서 EF1-α)가 포유세포에서의 발현을 위한 벡터에 사용할 수 있다. 박테리오파아지 λ에서 파생된 프로모터와 trp, lpp, lac, tac 프로모토들은 대장균에서의 발현을 위한 벡터에 사용할 수 있다. ADH, PH05, GPD, PGK, MADα 프로모터는 사카로마이시스 세레비시아에서의 발현을 위한 벡터에 사용할 수 있으며, AOX1 프로모터 등은 피치아 파스토리스에서의 발현을 위한 벡터에 사용할 수 있다. 뉴클리어 폴리헤드로시스 바이러스(nuclear polyhedrosis virus) 등에사 파생된 프로모터는 봄빅스 모리 배양세포에서의 발현을 위한 벡터에 사용할 수 있다.

선택 표지로는 네오마이신 (네오)-저항 유전자, 티미딘 키나아제(thymidine kinase)(TK) 유전자, 디히드로폴레이트 환원효소(dihydrofolate reductase)(DHFR)유전자 등을 포유세포에서의 발현을 위한 벡터에 사용할 수 있다. 카나마이신-저항 유전자, 앰피실린-저항 유전자, 테트라사이클린-저항 유전자 등은 대장균에서의 발현을 위한 벡터에 사용할 수 있다. Leu2, Trp1, Ura3 유전자 등은 효모에서의 발현을 위한 벡터에 사용할 수 있다.

상기 기재한 숙주세포-벡터 체계에서 제조된 본 발명의 단백질은 하기와 같이 획득할 수 있다 :

본 발명의 DNA를 적당한 위치에 포함하는 재조합 DNA로 숙주 세포를 형질전환하여 배양한 다음, 배양세포나 배지로부터 본 발명의 단백질을 분리 정제한다. 단백질을 생산하기 위하여, 공지된 제조과정과 기술을 조합하여 사용할 수 있다.

정제 기술로는 단백질 정제에 일반적으로 사용하는 방법(이온 교환 크로마토그라피, 소수성 상호작용 크로마토그라피, 젤 투과(gel permeation) 크로마토그라피, 역상(reverse) 크로마토그라피, 등전적(isoelectric) 크로마토그라피, 정제용(preparative) 크로마토그라피, 등전적 전기영동 등)과 이들의 조합(combination)이 있다. 정제 방법에는 GIF를 인식하는 항체를 이용한 친화력-정제법이 있다(참조 : WO94/26923).

본 발명은 또한, 야생형 GIF 혹은 그 유도체의 아미노산 서열을 가지는, 화학 변성된 GIF를 포함한 본 발명의 화학변성 단백질의 제조방법을 제공한다. 이때, 화학변성은 항원에 비특이적인 사람 글리코실레이션 억제인자 혹은 그의 유도체가 삼중체를 이루는 데에 관여하는 부위에 있어서 특히 분자간 연합의 세기를 약화시키기 위한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명의 단백질은 변성될 아미노산 잔기의 전하나 소수성 성질을 증가 혹은 저하시키는 변성기(modification group)를 야생형 혹은 그의 유도체의 아미노산 서열을 포함하는 GIF에 결합시키고, 이 생성물을 분리 정제함으로써 제조할 수 있다.

화학적 변성의 구체적인 예로서는 포스포릴레이션, 알킬레이션, 아실레이션, EMTS 혹은 DTNB에 의한 변성 등이 있다. 보다 구체적인 예로서는, 시스테인 잔기를 선택적으로 화학변성시키는 카복시메틸레이션과 피리딜에틸레이션, N-말단을 변성시키는 아세틸레이션, 포밀레이션 등이 있다.

포스포릴레이션은 단백질 키나아제에 의해 ATP의 γ-포스포릴 그룹이 세린, 트레오닌 혹은 티로신의 히드록시 그룹에 전이되는 효소반응으로써 수행할 수 있다.

SH 그룹의 알킬레이션은 할로겐화 된 알킬그룹(모노요도아세트산과 그의 아미드, 모노브로모아세트산과 그의 아미드, α-요도프로피온산, β-브로모에틸아민, 모노클로로, 아세트산, 클로로아세토페논 등)을 포함하는 화합물을 이용하여 수행할 수 있다. 예를 들면, 파니실 그룹(farnesyl group) 같은 지질은 파니실 브로미드를 이용하여 도입할 수 있다. 아미노 그룹의 변성은 카보닐 그룹을 포함하는 지방족 알데히드, 케톤 등으로써 수행할 수 있다.

아실레이션은 카복실릭 무수물, 카복실릭 클로라이드 혹은 카복실산과 카보디이미드의 결합물 같은 탈수 축합시약을 이용하여 히드록시, 설프히드릴 혹은 아미노 그룹의 수소원자가 아실 그룹으로 치환되는 반응에 의해 수행할 수 있다. 예를 들면, N-아세틸 이미다졸, N-아세틸 석시니미드 등은 아미노 그룹의 아세틸레이션에 사용할 수 있다. 말단에 카복시 그룹을 가지는 폴리에틸렌 글리콜과 N-히드록시석시니미드를, 카보디이미드를 사용하여 탈수(dehydration)시킨 축합 반응은 아미노 그룹과 반응할 수 있는 활성화된 PEG를 제조하며, 이 활성화된 PEG는 단백질의 N-말단에 첨가될 수 있다. 글리신을 단백질의 N-말단에 첨가한 다음, 미리스토일레이션을 수행할 수 있으며; 티로신, 트레오닌, 시스테인 등의 경우에는 대안으로서 팔미토일레이션, 레티노일레이션 그리고 리포일레이션을 수행할 수 있다.

에틸 머큐리치오살리실레이트(이하, "EMTS"로 함)나 DTNB 같은 치올 시약 혹은 메틸 메탄 치오설페이트는 단백질의 시스테인 잔기를 변성시키기 위해 사용할 수 있다.

거대분자 화합물을 이용한 변성의 구체적인 예로서는, 가용성 덱스트린을 결합시키는 방법(참조 : Wileman, T.E. et al., J. Pharm. Pharmacol. 33, 85, 1982), 폴리-DL-알라닌을 이용한 방법(참조 : Uren, J.R. et al., Cancer Res., 42, 4068-4071, 1982) 등이 있다.

변성의 정도는 단백질에 존재하는 미반응의 반응기 양을 결정함으로써 측정할 수 있다. 예를 들면, 반응하지 않은 SH 그룹은 엘만의 방법(Ellman's method)(참조 : Glazer, A.N., The proteins, 3rd., II, Academic Press, NY, 1976)으로 결정할 수 있으며, 이 방법에서 시스테인 잔기의 자유 SH 그룹은 모노요도아세트산 혹은 4-비닐피리딘에 의해 변성된 후, S-카복시에틸레이션 혹은 S-피리딜에틸레이션 된다.

티로신 잔기는 요오드화 하는 약품(예를 들면, 트리요오디드 이온(I^-3), 요딘클로라이드 등)으로써 변성되고, 히스티딘 잔기는 디에틸피로카보네이트로써, 아르기닌 잔기는 페닐 글리옥살로써 변성될 때, 반응하지 않은 아미노산 잔기의 양은 아미노산 조성 분석 혹은 자외선 흡광 스펙트럼에서의 변화로써 측정할 수 있다. 변성이 단백질의 분자량을 크게 변화시킬 경우에, 변성의 정도는 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)에서의 변성된 단백질의 이동변화를 추적함으로서 측정할 수 있다. 펩티드 멥핑(mapping)은 어느 아미노산 잔기가 변성되었는지를 결정하는 데 이용할 수 있다.

변성된 단백질은 앞서 기재하였듯이, 유전자 재조합에 의한 본 발명의 돌연변이 단백질을 생산하는 방법과 연관하여 공지된 제조과정, 기술 그리고 이들의 조합에 의해 분리 정제할 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 단백질을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물(이하, "본 발명의 약학적 조성물"이라 함)을 제공한다. 본 발명의 약학적 조성물은 면역억제, 좀 더 구체적으로, 치료될 사람에게서 야기될 수 있는 바람직하지 못한 면역반응을 완화 및/혹은 예방에 사용할 수 있다. 바람직하지 못한 면역반응, 즉 불리한 면역반응에는 류마티스성 관절염, 단발성 경화증이나 당뇨등과 같은 자가면역 질환, 다양한 항원에 대한 알러지 질환, 숙주 버서스 그라프트(host versus graft, HVG)와 그라프트 버서스 숙주 거부(graft versus host rejections) 등이 있다. 본 발명의 실시예에서는, 본 발명의 약학적 조성물이 당뇨병의 치료 그리고/혹은 예방에 사용되고 있다. 본 발명은 치료상 효과적인 양의 본 발명의 단백질과 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 약학적 조성물은 희석제, 방부제, 용해제, 유제 그리고 그 외 아쥬반트(adjuvant)를 포함한다. 용어 "치료상 효과적인 양"은 주어진 조건하에서 주어진 투여방법으로 치료상의 효과를 나타내는 양을 의미한다. 약학적 조성물은 하기와 같이 제제화되는 액상, 동결건조 혹은 건조된 형태의 제제이다 : 트리스(Tris-HCℓ), 아세테이트, 포스페이트와 같이 다양한 pH값과 이온 세기를 가지는 완충제로부터 선택되는 희석제; 알부민과 젤라틴과 같이 표면 흡착을 방지하는 첨가제; 트윈 20, 트윈 80, 플루로닉 F68 그리고 담즙산 염과 같은 계면 활성제; 글리세롤과 폴리에틸렌 글리콜과 같은 용해제; 아스코르브산과 소듐 메타비설피트와 같은 항산화제; 치메로살, 벤질 알코올, 라파벤스 같은 방부제; 락토오즈와 만니톨 같은 비히클과 강장제(tonicity agents). 유효성분으로서 본 발명의 단백질은 금속이온과 복합체를 이루거나; 폴리락틱산, 폴리글리콜릭산 혹은 히드로겔 같은 중합 화합물을 포함하는 미립자 제제에 삽입되거나 이들의 표면에 흡착될 수 있으며; 리포좀, 미세 유제(micro emulsion), 마이셀, 단층 혹은 다층 비히클, 적혈구 막 고스트 그리고 스피로블라스트에 포함될 수 있다. 약학적 조성물은 본 발명 단백질의 물리적 상태, 용해성, 안정성, 생체 내에서의 방출 속도 그리고 생체 내에서의 제거율에 영향을 미치기 때문에, 약학적 조성물의 선택은 유효성분으로서의 본 발명의 단백질의 물리적, 화학적 특성에 따라 다르다. 본 발명의 약학적 조성물은 폐를 통하여(transplumonarily), 코를 통과하여(transnasally), 경구로, 정맥으로, 복강내로, 근육으로, 피하로, 동내(within cavities)로 혹은 피부 사이로 투여할 수 있다. 이들은 미립자 형태일 수도 있으며, 투여 경로에 따라 필요하다면 보호 피막, 단백질 분해효소 억제제 혹은 흡수 촉진제와 함께 제공될 수 있다.

본 발명의 단백질은 일반적으로, 환자의 나이, 건강상태, 성별, 질병의 정도와 투여 경로에 따라, 하루 혹은 며칠 동안 하루에 한 번 혹은 그 이상으로 0.001 mg/kg에서 2 mg/kg의 양으로 투여할 수 있다.

본 발명은 하기 실시예들에서 상세히 설명될 것이며, 이들 실시예는 단지 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.

실시예 1:

시스테인 잔기가 치환된 GIF 유도체의 대장균에서의 발현

A. 발현 체계 구축

본 실시예는 시스테인 잔기가 치환된 GIF 유도체의 발현과 관련된 것이다. GIF 폴리펩티드의 57, 60, 81 위치에 있는 세 시스테인 잔기를, SEQ ID NO: 1인 GIF 유전자의 해당 위치에서 뉴클레오티드를 돌연변이 시킴으로서, 알라닌 잔기로 각각 치환하였다.

중합효소 연쇄반응 (PCR, 참조: Mullis, et al., Method in Enzymol., 155; 335-350, 1987)은 주형 DNA로서 발현 플라스미드 pTMK-hGIF(참조: WO94/26923, Supra)를 이용하여 수하였었다. 상기 플라스미드는 하기 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 대장균에서의 발현을 위해 발현 벡터 pST811(참조: 일본 특허공개 소(63)-269983)에 삽입된 사람 GIF cDNA로 구성되어 있다.

5'-AACCTTAAGAAAAACCAAGGAGGTAATAAATAAATAATGCCGATGTTCATCGTAAACACCAACG-3'

(프라이머 #1: SEQ ID NO : 4)

3'-CTCGGCCGGCGCGAGACGTCGGAC-5'(SEQ ID NO : 5)

각 PCR 주기는 95℃에서 1분간 변성, 56℃에서 2분간 연결(annealing) 그리고 72℃에서 2분간 연장(elongation)으로 구성되었다. 모든 PCR 단계는 상기 기재한 동일한 조건하에서 수행하였다. 증폭된 DNA 단편은 아가로즈 겔로부터 회수하였고 Afl II와 Pst I으로 절단하였다.

별개의 단계에서, pTMK-hGIF를 Pst I과 BamHI으로 자르고 GIF cDNA의 3'-말단 DNA 단편을 회수하였다. 이 단편들을 DNA 연결효소(ligase)를 이용하여 Afl II와 BamHI으로 자른 벡터 pST811에 삽입하였다. 제조된 발현 플라스미드는 SEQ ID NO:2에 나타내었듯이 57 위치에서 시스테인 잔기가 알라닌 잔기로 치환된 사람 GIF cDNA를 포함하였으며 이것을 pC57A-hGIF로 명명하였다.

유사한 방식으로, 60 위치에서 시스테인 잔기가 알라닌 잔기로 치환된 사람 GIF cDNA를 포함하는 발현 벡터 pC60A-hGIF를 다음과 같이 구축하였다: PCR은 pTMK-hGIF를 주형으로 하고, 프라이머 #1과 하기 올리고 뉴클레오티드 프라이머를 이용하여 수행하였다.

3'-CGCGAGCGATCGGACGTGTCGTAG-5' (SEQ ID NO : 6)

증폭된 DNA 단편들은 회수하여 Afl II와 NheI으로 절단하였다.

3'-말단 DNA 단편은 하기 프라이머를 이용하여 제조하였다:

5'-GCGCTCGCTAGCCTGCACAGCATC-3' (SEQ ID NO : 7)

3'-CACCCGACCTTGTTGAGGTGGAAGCGGATTATCCCTAGGCAA-5'

(프라이머 #2 : SEQ ID NO : 8)

증폭된 DNA 단편들은 회수하여 NheI과 BamHI으로 절단하였다. 이 단편들은 Afl II와 BamHI으로 절단한 벡터 pST811에 삽입하였다.

81 위치에서 시스테인 잔기가 알라닌 잔기로 치환된 사람 GIF cDNA를 포함하는 발현 플라스미드 pC81A-hGIF는 다음과 같이 제조하였다:

PCR은 pTMK-hGIF를 주형으로 하여, 프라이머 #1과 하기 프라이머를 사용하여 수행하였다.

3'-GGCCAGCAGGCCGGCTAGCAGCTT-5' (SEQ ID NO : 9)

증폭된 DNA 단편들을 회수하여 Afl II와 NheI으로 절단하였다.

3'-말단 DNA 단편은 프라이머 #2와 하기 프라이머를 이용하여 제조하였다:

5'-AAGCTGCTAGCCGGCCTGCTGGCC-3' (SEQ ID NO : 10)

증폭된 DNA 단편들을 회수하여 NheI과 BamHI으로 절단하였다. 이 단편들은 Afl II와 BamHI으로 절단한 벡터 pST811에 삽입하였다.

각 발현 플라스미드는 형질전환 가능한(competent) RR1 대장균 숙주에 형질전환시켰다.

발현 체계의 구축을 위해 사용된 프라이머의 DNA 서열과 PCR로 증폭된 DNA 단편의 DNA 서열은 전통적 DNA 서열 확인법에 의해 확인하였다.

B. GIF 유도체를 생산하는 대장균의 배양

발현 플라스미드 pC57A-hGIF, pC60A-hGIF 혹은 pC81A-hGIF를 가진 RR1 대장균을 앰피실린 50mg/l이 첨가된 루리아 브로스 (LB) 20ml에서 37℃로 밤새 배양하였다. 접종 배양을 0.8% 글루코스, 0.4% 카사미노산, 티아민 10ml/l 그리고 엠피실린 50ml/l로 구성된 M9 브로스 1L에 옮겨 37℃에서 3시간 동안 배양하였다. 이 초기 배양의 끝부분에 인돌 아크릴산(indole acrylic acid) 40mg을 첨가하였고, 배양액은 37℃에서 5시간 더 추가로 배양하였다.

실시예 2:

재조합 GIF 유도체 생성물의 정제

본 실시예는 대장균에서 발현된 재조합 GIF 유도체 단백질을 생체내 투여할 수 있는 양으로 정제하는 방법에 관한 것이다.

실시예 1에서 배양된 대장균 세포 5g(습윤 함량)을 수확하여 물 30ml에 현탁한 후, 프렌치 프레스(French-Press, 8000psi로 4번 반복)로 분쇄하였다. 상층액과 분쇄된 세포 찌꺼기는 15000xg으로 10분간 원심분리하여 분리하였다. 상층액을 회수하였다. GIF 유도체 단백질의 발현은 SDS-PAGE로 확인하였다.

발현 플라스미드 pC57A-hGIF에 코딩된 GIF 유도 단백질은 C57A-GIF라 명명하였다. 유사하게, 발현 플라스미드 pC60A-hGIF에 코딩된 GIF 유도체 단백질들은 각각 C60A-GIF와 C81A-GIF로 명명하였다.

소듐 아세테이트 완충액 (pH S.S)을 최종농도 20mM로 GIF 유도체 단백질에 첨가하였고, 그 결과의 용액은 4℃에서 동일 완충액으로 평형시킨 CM-세파로즈 페스트 플로우(Pharmacia) 컬럼(5×18cm)에 부하하였다. 이 컬럼을 2ml/분의 유속에서 20mM 소듐 아세테이트 완충용액(pH 5.5)과 0.3M NaCl이 녹아있는 소듐 아세테이트 완충용액(pH 5.5)으로 세척하였다. GIF 유도체 단백질은 0.5M NaCl이 녹아있는 20mM 소듐 아세테이트 완충용액(pH 5.5)에서 용출되었다.

용출된 분획을 100배 양의 20mM 소듐 아세테이트 완충용액(pH 5.5)으로 투석하고, 동일 완충액으로 평형된 토소 CM-5PW(TOSOH) 컬럼(0.75×7.5cm)에 부하하였다. 컬럼을 1ml/분의 유속에서 20㎛ 소듐아세테이트 완충액으로 세척한 후, GIF 유도체 단백질을 0에서 0.5M NaCl 농도구배로 실온에서 용출하였다.

GIF 유도체 단백질을 포함한 분획은 SDS-PAGE와 항-GIF 항체를 이용한 웨스턴 블럿(참조: WO94/26923, Supra)으로서 결정하였다. 상기 제조과정으로 획득한 C57A-GIF, C60A-GIF, C81A-GIF의 정제도는 99% 이상임을 확인하였다. 완충액을 투석으로서 PBS 용액으로 바꾼 후 이 시료를 저장하였다.

대장균에서 파생된 내부 독소를 완전히 제거하기 위하여, 피로셉 C(DAICEL CHEMICAL INDUSTRIES, LTD.) 1/10의 양을 정제한 시료에 첨가하고, 필요하다면 혼합물을 1~12시간 교반하였다. 상층액을 회수하였다. 내부 독소의 양은 리물러스 ES-II 단일 검사법(WAKO PURE CHEMICAL INDUSTRIES, LTD.)을 이용하여 결정하였다. GIF 유도체 단백질의 양은 280nm 파장에서 흡광도를 측정하고, 아미노산 조성 분석으로 얻은 각 유도체의 분자흡광계수를 이용하여 계산함으로써 결정하였다.

실시예 3 :

재조합 GIF 유도체의 생물학적 활성

본 실시예는 실시예 2에서 제조된 재조합 GIF 유도체의 생체내 활성과 관련된 것이다. 재조합 GIF 유도체의 생체내 IgE 항체형성 억제 활성을 측정하였다. 활성비교에서 대조군으로 사용하기 위하여 대장균은, 생체내에서 IgE와 IgG1 항체형성 억제활성을 가지는 것으로 이미 알려진, 야생형의 아미노산 서열을 포함하는 재조합 사람 GIF 단백질을 생산하였다. 이것은 발현 플라스미드가 pTMK-hGIF인 것을 제외하고는 실시예 1B, 2와 동일한 방법으로 제조되었다(참조: WO94/26923).

BDF₁쥐(mice)에 0.1mg의 백반에 흡수된 0.1㎛의 DNP-오브알부민을 복강내 주사하여 면역화하였다. 재조합 GIF와 그의 유도체들을 면역화 전, 면역화시킨 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10일째 되는 날에 각각 복강내 주사하였다. 대조군 쥐에는 PBS만 주사하였다.

면역화 후 2, 3주 째에 혈액을 각 쥐에서 채취하여, 혈청내 항-DNP-IgG1 농도를 엘리자 방법(ELISA)을 이용하여 측정하였다. 결과는 C57A-GIF가 대조군 재조합 GIF보다 높은 활성을 가짐을 나타내었다(표1).

동일 제조물의 GIF 생활성(bioactivity)은, 이 사이토카인(cytokine)이 글리코실레이션 된 IgE 결합인자를 생산할 수 있는 쥐의 T세포 하이브리도마 12H5 세포를 글리코실레이션 되지 않은 IgE 결합인자를 생산할 수 있는 세포로 전환시키는 능력으로 측정하였다(참조: Iwata et al., J. Immunol. 140: 2534, 1988). 하이브리도마 세포의 현탁액 분주를, 시험할 시료 존재하에 10㎍/ml의 쥐 IgE와 함께 24시간 동안 배양하였다. 배양 상층액은 CF50A 막을 여과하였고, 여과물의 IgE 결합인자는 렌틸 렉티브 세파로스로 분획하였다(참조: Yodoi et al., J. Immunol. 125: 1436, 1980). 유출(flow through) 분획에 있는 인자와 컬럼에 잔재한 인자는 로젯 억제 기술(rosette inhibition technique)로써 측정하였다. 만약 시험(test)할 시료에 충분한 양의 GIF가 존재한다면 12H5 세포에 의해 형성된 대부분의 IgE 결합인자는 렌틸 렉틴에 대한 친화력을 상실하여 유출분획에서 회수된다(참조: Iwata & Ishizaka, J. Immunol. 141:3270, 1988). GIF 생활성 감지를 위한 야생형 GIF 혹은 그의 유도체의 최소 농도는 표1에 나타내었다.

[표 1]

재조합 GIF와 그 유도체들의 활성

실시예 4 :

재조합 GIF와 그의 유도체들의 분자내 S-S 결합의 부제

본 실시예는 재조합 GIF와 그 유도체들이 분자내 S-S 결합을 가지지 않음을 밝힌다.

1) 생물학적 활성을 실시예 3에서 결정한 재조합 GIF와 그의 유도체들을 0.2M 소듐 아세테이트 완충용액(pH 4.0)에 용해시켰다. 이 용액에 1/125양의 펩신(Sigma)양을 첨가하였고, 단백질을 자를 수 있도록 실온에서 7시간 동안 방치하였다. 시료 용액을 95% 용액 A(0.05% 트리플로로아세트산)과 5% 용액 B(0.02% 트리플로로아세트산, 70% 이소프로판올 그리고 30% 아세토니트릴)로 평형시킨 수퍼 ODS(TOSOH) 컬럼(0.2X5cm)에 부하하였다. 컬럼을 0.2ml/분의 유속으로 5분간 세척하였다. 용액 B의 비율은 40분간 25%까지 직선으로 증가시켰고 그후 5분간 100%까지 증가시켜 조각난 펩티드 분획을 회수할 수 있게 하였다. 회수된 모든 펩티드의 아미노산 서열을 기체상(gas-phase) 아미노산 시퀀서 PPSQ 10(Shimazu)을 사용하여 결정하였다. 결과로써, 하나의 시스테인 잔기를 가진 세 가지 종류의 펩티드가 각각 분리되었으며, 이는 어떤 시스테인 잔기도 S-S 결합으로 상호연결되지 않았음을 나타낸다. 재조합 GIF와 그의 유도체들을 펩신 처리하여 얻은 펩티드 분획 패턴과 펩티드의 아미노산 서열은 제1도에 나타내었다.

확인을 위하여, 하기 실험을 수행하였다. 디치오트레이톨(DTT)을 최종농도 10mM로 펩신으로 절단된 시료에 첨가하고, 이 혼합물은 실온에서 30분간 방치하였다. 시료 용액은 수퍼 ODS 컬럼에 부하하였고 상기 과정을 되풀이하였다. 펩티드의 용출 패턴은 재조합 GIF와 그의 유도체들의 경우와 동일하였다.

2) 이황화 결합이 단백질의 안정성 유지에 중요한 역할을 함은 일반적으로 잘 알려져 있다. 분자내에 이황화 결합이 존재한다면, 시스테인을 알라닌으로 치환할 때 단백질 분자가 극명하게 불안정해진다. 재조합 GIF에서 세 시스테인 잔기 중 하나가 알라닌으로 치환된 돌연변이 단백질 C57A-GIF와 C81A-GIF의 전이 온도는 50mM 아세테이트 완충용액(pH 5.5)에서 각각 68.7℃, 71.6℃인 것으로 밝혀졌다. 이 온도는 야생형의 전이 온도(70.9℃)와 거의 일치한다. 이것은 세 시스테인 잔기가 어떤 이황화 결합도 이루지 않았음을 시사한다.

3) 야생형의 아미노산 서열을 포함하는 대장균에서 생산된 재조합 인간 GIF 단백질에서 세 시스테인 잔기의 이온화된 원자들 사이의 거리, 즉 S(Cys 57)-S(Cys 60), S(Cys 57)-S(Cys 81), S(Cys 60)-S(Cys 81)의 거리는 X선 결정(X-ray crystallography)에서 각각 약 10Å, 13Å, 8Å인 것으로 결정되었다. 이황화 결합의 형성시 이러한 원자간 거리는 약 2Å 이하이어야 한다. X선 결정의 결과에 의해 세 시스테인 잔기는 삼차구조상 2.0Å보다 멀리 위치에 있음이 밝혀졌으며, 이는 GIF가 분자내에 어떤 이황화 결합도 가지지 않음을 시사한다.

실시예 5 :

삼중체로서의 재조합 GIF의 존재

A. 재조합 GIF의 분자량 결정

실시예 3에서 대조군으로 사용된, 야생형의 아미노산 서열을 가진 재조합 GIF를 1.2mg/ml 농도로 PBS에 용해시키고, 이 시료 용액을 0.1M NaCl이 녹아있는 50mM 포스페이트 완충용액(pH 6.8)로 평형된 쇼덱스 KW803(Showa Denko K.K)에 부하하였다. 1.0ml/분의 유속으로 용출된 단백질의 절대 분자량을 야트 돈 DSP-F 광선산란 광도계(WYATT DAWN DSP-F light-scattering photometer, Wyatt)를 사용하여 측정하였다. dn/dc=0.180㎤/g, A2=0일 때 계산 결과로서 분자량은 36,490으로 측정되었다.

그 다음, 재조합 GIF를 0.68mg/ml의 농도로 PBS에 용해시켰다. 시료 용액은 평균 분자량을 결정하기 위해 분석용 초원심분리기 옵티마 XL(Optima XL, Beckman)을 이용하여 20℃에서 15분간 17000rpm으로 원심분리하였다. 결과로서, GIF 단백질은 평균분자량 32,013인 것으로 밝혀졌다. 연합상수(association constant)는 614.18로 계산되었다.

이러한 결과들은 재조합 GIF가 삼중체로 존재함을 보여준다.

B. 재조합 GIF의 결정화

재조합 GIF는 증기확산법으로 결정화하였다. 더욱 상세하게는, GIF 단백질(20mg/m)을 2.0M 암모늄 설페이트와 2%(W/V) PEG400을 포함하는 100mM 헤페스 완충용액(pH 7.5)에 용해시킨 다음, 4℃에 방치하였다. 1-2주 후 약 0.5mm 길이의 결정(crystal)을 획득하였다.

중원자(heavy atom) 유도체의 결정은 담그기법(soaking method)으로 상기 재조합 GIF 유도체로부터 제조하였다. 결정 중 한 가지는 재조합 GIF의 결정을 0.2mM Hgcl₂, 2.6M 암모늄 설페이트와 2% (W/V) PEG 400을 포함하는 100mM 헤페스 완충용액에 5일간 담그어 둠으로써 제조하였다. 다른 한 가지 결정은 0.2mM HgCl₂대신 1.0mM EMTS를 포함한 헤페스 완충용액을 사용한 점을 제외한 동일한 방식으로 제조하였다. 모든 반응은 4℃에서 수행하였다.

데이타는 IP 디프렉토미터(difractometer)를 사용하여 획득하였다. 운반 가능한 X선 발생기(4kw)를 사용하였다. 재조합 GIF의 결정의 경우 2.3Å의 해상도로 30시간 동안 측정하였고, HgCl₂를 처리한 중원자 유도체의 결정의 경우에는 2.5Å 해상도로 25시간동안, EMTS를 처리한 중원자 유도체는 2.7Å 해상도로 40시간동안 측정하였다.

구조 분석을 위하여, 위상(phase) 계산에는 다중 동형치환법(multiple isomorphous replacement method)을 사용하였고, 위상 변형에는 용매 평면화법(solvent flattening method)과 분자 평균법(molecular averaging method)을 사용하였다. 분자 구조 분석(주사슬의 추적과 부사슬의 배정)과 분자모델 구축은 획득한 데이터에 기초하여 수행하였으며, 이러한 방법들을 재조합 GIF가 연합을 통하여 삼중체화됨을 밝혔다. 이 연합은 주로 39, 48, 50 그리고 57 사이의 소수성 상호작용에 의한 무리 형성에 의한 것일 뿐만 아니라, 37-45 부위와 47-50 부위간 그리고 94-98 부위와 106-110 부위간의 분자간 수소 결합 형성의 결과이기도 하다.

실시예 6 :

시스테인 외 아미노산 잔기의 치환을 가지는 GIF 유도체의 대장균에서의 생산, 생물학적 활성 그리고 그의 구조

A. 아미노산 잔기의 106 위치가 치환된 GIF 유도체의 대장균에서의 생산

BBL사에서 완전 합성된 DNA(코드번호 BBG54)를 구입하였다. 이 DNA는 아스파라긴 잔기가 106번 위치에서 세린 잔기로 치환된 것을 제외하고는 SEQ ID NO: 1과 동일한 아미노산 서열(SEQ ID NO : 11)을 코딩하고 있다. 57 혹은 81 위치에서 시스테인이 알라닌으로 치환된 돌연변이를 실시예 1과 동일한 방법으로 DNA에 도입하고, 이 돌연변이를 가지는 DNA를 발현 벡터 pST811을 이용하여 대장균에서 발현하였다. 발현된 재조합 GIF 단백질을, GIF가 0.3M NaCl에서 용출된다는 점을 제외하고는 실시예 2와 동일한 방법으로 정제하였다. 두 아미노산에서 돌연변이를 가지는 이 GIF 유도체를 C57A/N106S-GIF와 C81A-N106S-GIF로 명명하였다.

B. C57A-N1065-GIF와 C81A/N1065-GIF의 생물학적 활성

상기 재조합 GIF 유도체의 항체 형성억제 활성을, 20㎍의 재조합 GIF 유도체가 주사되는 점을 제외한 실시예 3과 동일한 생체내 활성 측정법으로 측정하였다. 그 결과는, C57A/N106S-GIF가 C81A/N106S-GIF보다 높은 활성을 나타내었다(표 2).

[표 2]

재조합 GIF 유도체의 활성

GIF 유도체의 주사횟수를 6번(면역전날, 면역후 1, 3, 6, 8, 10일)으로 감소시킨 다른 실험에서, C57A/N106S-GIF는 C57A-GIF 보다 높은 활성을 나타내었다(표 3).

[표 3]

재조합 GIF 유도체의 활성

C. C57A/N106S-GIF의 입체구조

C57A/N106S-GIF의 분자량 분포는 광선-산란 광도계를 사용하여 실시예 5와 동일한 방법으로 측정하였다. 결과로서, C57A/N106S-GIF는 야생형 GIF의 경우와 같이 삼중체화 되었고, 분자량 분포는 낮은 쪽(제2도)으로 옮겨갔다. 이는 삼중체 구조가 더 불안정함을 시사한다.

실시예 7 :

시스테인이 세린으로 치환된 포유세포 유래의 재조합 돌연변이 GIF의 생물학적 활성

A. 포유세포에서 돌연변이 GIF의 구축과 발현

SEQ ID NO: 1의 57, 60 혹은 81 위치에서 시스테인 잔기에 대한 코딩 서열(TGC)을, 각각 PCR을 이용하여 세린 잔기에 대한 코딩 서열(AGC)로 바꾸었다. 하나의 잔기를 돌연변이 시키기 위하여 두 세트의 PCR 프라이머를 사용하였다. 프라이머 첫 번째 세트에서, 센스 프라이머는 리보좀 결합 부위(ATC)와 상류(upstream)의 추가 EcoRI 위치를 가진 인간 GIF의 5' 코딩 서열과 상응하며(프라이머 A), 안티센스 프라이머는 돌연변이 위치에 걸쳐 있는 서열들을 코딩한다(프라이머 1,2,3).

5'-GAATTCATCATGCCGATGTTCATCG-3' (primer A: SEQ ID NO: 12)

3'-CTCGGCTCGCGCGAGACGTCGGACG-5' (primer 1: SEQ ID NO: 13)

3'-CTCGGCACGCGCGAGTCGTCGGACG-5' (primer 2: SEQ ID NO: 14)

3'-TCGACGACTCGCCGGACGACCGGCT-5' (primer 3: SEQ ID NO: 15)

두 번째 프라이머 세트의 경우, 센스 프라이머는 첫 번째 프라이머 세트의 안티센스 프라이머와 중복되는 (overlapping), 돌연변이 위치에 걸쳐있는 서열들을 코딩하며(프라이머 4, 5, 6), 안티센스 프라이머는 하류의 정지 코돈(TAA)과 추가 EcoRI 위치를 가진, 인간 GIF의 3' 코딩 서열을 코딩한다(프라이머 B).

5'-GAGCCGAGCGCGCTCTGCAGCCTGC-3' (primer 4: SEQ ID NO: 16)

5'-GAGCCGTGCGCGCTCAGCAGCCTGC-5' (primer 5: SEQ ID NO: 17)

5'-AGCTGCTGAGCGGCCTGCTGGCCGA-3' (primer 6: SEQ ID NO: 18)

3'-TTGAGGTGGAAGCGGATTCTTAAG-5' (primer 7: SEQ ID NO: 19)

인간 GIF cDNA를 주형으로 하여, 두 개의 cDNA 단편을 각각 PCR로 증폭시키고, 바이오래드(Bio-Rad) 키드를 사용하여 정제하였다. 두 cDNA 단편에서 중복되는 서열을 이용하여 두 단편을 다시 연결하고, 두 번째 PCR 주기에 주형으로 사용하였다. 이때 돌연변이 된 완전한 길이의 인간 GIF를 제조하였다. 57 위치의 시스테인 잔기가 세린 잔기로 치환된 C57S-GIF의 생성을 위해 프라이머 1, 1, 4 그리고 B를 사용하였다. 60 위치의 시스테인 잔기가 세린으로 치환된 C60S-GIF의 생성을 위하여 프라이머 A, 2, 5 그리고 B를 사용하였다. 81 위치의 시스테인 잔기가 세린 잔기로 치환된 C81S-GIF의 경우에는 프라이머 A, 3, 6 그리고 B를 사용하였다. 그 다음, 돌연변이된 cDNA 단편을 TA 클로닝 벡터(Invitrogen)에 연결하고, DNA 시퀀싱으로 그 서열을 밝혔다. 하나의 잔기가 돌연변이된 인간 GIF를 코딩하는 EcoRI 단편을 포유류 발현 벡터인 pEFneo(참조: Liu, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 11227, 1994)의 EcoRI 위치에 삽입하였다. 결과적으로 만들어진 플라스미드를 그후 BMT 세포에 감염(transfection)시키고, 안정된 감염체(transfectant)를 G418 저항성을 이용하여 선택하였다.

선택한 감염체의 배양액 상층액을 회수하고, 항 GIF 폴리클로날 항체가 결합된 친화겔(affigel) 혹은 항 GIF 모노클로날 항체 388F1가 결합된 친화겔(참조: WO94/26923, Supra)에 부하하였다. 면역흡수체에 잔재한 단백질은 산성 pH에서 용출되었고, 용출분획에서의 GIF 농도는 SDS-PAGE와 은염색법으로 결정하였다.

B. 돌연변이 GIF의 생물학적 활성

GIF 활성은 T 세포 하이브리도마 12H5세포(참조: Iwata, et al., J. Immunol., 140: 2534, 1988)를 이용하여 측정하였다. 하이브리도마 세포의 현탁액을 동량의 시험 시료(test sample)과 혼합하고, 이 세포 현탁액을 10㎍/ml의 쥐 IgE와 함께 24시간 배양하였다. 배양액 상층액을 CF50A 막으로 여과하고, IgE-결합인자(IgE-BF)를 포함한 이 여과물을 렌틸-렉틴 세파로스(참조: Yodoi et al., J. Immunol., 125: 1436, 1980)로 분획하였다. 결합하지 않은 단백질(용출분획)과 0.2M α-메틸만노시드로 용출된 단백질(용출분획)의 IgE-BF 존재유무는 로젯 억제 기술로 확인하였다. 충분한 양의 GIF를 쥐 IgE와 함께 12H5 세포 배양액에 포함되었다면, 세포에 의해 생성된 대부분의 IgE-BF는 렌틸 렉틴에 대한 친화력을 잃고 유출분획에서 회수될 것이다(참조: Iwaka & Ishizaka, J. Immunol., 141: 3270, 1988). 그러므로 유출분획/용출분획 사이의 로젯 억제 백분율의 비가 3.0 이상이면 GIF는 (+)로 획득할 수 있다. GIF 활성에 요구되는 최소 농도는 표 4에 나타내었다.

[표 4]

BMT10 세포에서 발현되는 GIF 유도체들의 활성

실시예 8:

대장균 유래의 변형된 재조합 GIF의 제조와 생물학적 활성

본 실시예는 하나 이상의 시스테인 잔기가 변형된 재조합 GIF의 제조에 관련된 것이다.

A. 카복시메틸레이션 된 재조합 GIF의 제조

야생형의 아미노산 서열을 포함하는, 실시예 3에서 비교 대조군으로 사용된 재조합 GIF(2.5mg)을 1.25ml의 PBS에 용해시켰다. 1N 수산화나트륨에 용해된 모노요도아세트산 20㎕를 240mg/ml의 농도로 상기 용액에 첨가하고, 실온에서 밤새 방치하였다. 반응 종결 후 용매를 NAP-25(Phamacia)를 사용하여 20mM 소듐아세테이트 완충용액(pH 5.5)으로 치환하고, 이 용액을 동일 완충용액으로 평형시킨 토소 CM-5PW 컬럼(0.75×7.5cm)에 부하하였다. 단백질 용출을 위해 NaCl 농도를 1.0ml/분의 유속으로 0.5M까지 직선으로 증가시켰다. 분획 패턴은 GIF 유도체 단백질 4가지 피크를 나타내었다(제3도). 반응하지 않은 재조합 GIF는 반응한 GIF의 4번째 피크와 동일한 분획에서 하나의 피크로 나타났다. 첫 번째에서 세 번째 피크에 있는 GIF 유도체의 자유 SH 그룹의 수는 엘만의 방법(참조: Glazer, et al., supra)을 이용하여 각각 2.1, 2.4, 2.7, 3.0임을 측정하였다.

이 결과에서, 첫 번째 피크는 시스테인 잔기 하나가 알킬레이션 된 GIF 세 분자가 이룬 삼중체와 일치함을; 두 번째 피크는, 시스테인 잔기 하나가 알킬레이션 된 GIF 두 분자와 어떤 시스테인 잔기도 알킬레이션 되지 않은 GIF 한 분자가 이룬 삼중체; 세 번째 피크는, 시스테인 잔기 하나가 알킬레이션 된 GIF 한 분자와 어떤 시스테인 잔기도 알킬레이션 되지 않은 GIF 두 분자가 이룬 삼중체; 네 번째 피크는, 어떤 시스테인 잔기도 알킬레이션 되지 않은 GIF 세 분자가 이룬 삼중체와 일치함을 시사한다. 첫 번째 피크에서 네 번째 피크의 GIF 분자들을 각각 CM3-GIF, CM2-GIF, CM1-GIF, CM0-GIF라 명명하였다.

실시예 4에서 기재한 방법으로 수행한 펩티드 맵핑(peptide mapping)의 결과는 시스테인 잔기가 모노요도아세트산에 의해 60 위치에서만 변형되었음을 밝혀주었다.

B. 카복시메틸레이션된 재조합 GIF의 생물학적 활성

CM3-GIF, CM2-GIF, CM1-GIF 그리고 CM0-GIF를 실시예 3에서와 동일한 방법으로, 생체 내에서의 항체생성 억제활성에 대해 측정하였다. 결과로써, 활성수치는 시스테인 잔기의 변형수치에 따라 변하였다(표 5).

[표 5]

변형된 재조합 GIF의 활성

C. 피리딜에틸레이션된 재조합 GIF의 제조

실시예 3에서 비교 대조군으로 사용한, 야생형의 아미노산 서열을 포함하는 재조합 GIF를 1.25ml의 PBS에 용해시켰다. 0.2㎕의 4-비닐피리딘을 전기 용액에 첨가하고 이 혼합물을 실온에서 밤새 방치하였다. 반응 종결 후, 용매는 20mM 소듐 아세테이트 완충용액(pH 5.5)으로 대치하였고, 이 용액은 토소(TOSOH) CM-5PW 컬럼으로 분획하였다. 분획 패턴은 카복시메틸레이션의 경우와 같이 GIF 유도체 단백질 4가지 피크를 나타내었다(제4도). 첫 번째에서 네 번째 피크 분획에 있는 GIF 유도체들의 자유 SH 그룹수는 엘만의 방법에서 각각 2.1, 2.4, 2.7, 3.0으로 측정되었다. 첫 번째에서 네 번째 피크의 GIF 분자들은 각각 PE3-GIF, PE2-GIF, PE1-GIF 그리고 PE0-GIF로 명명하였다. 카복시메틸레이션의 경우와 같이, 시스테인 잔기는 단지 60 위치에서만 피리딜에틸레이션 되었다.

D. 피리딜에틸레이션 된 재조합 GIF의 생물학적 활성

PE3-GIF, PE2-GIF, PE1-GIF 그리고 PE0-GIF를 실시예 3과 동일한 방법으로 생체내 항체 형성억제 활성에 대하여 활성 측정하였다. 그 결과, 카복시메틸레이션 된 GIF의 경우와 완전히 일치하지는 않았다. 이러한 불일치는 변형기 그룹의 화학적 성질의 차이에 기인하는 것으로 생각된다. 모든 변성된 GIF에서 활성 증가가 관찰되었다(표 6).

[표 6]

변형된 재조합 GIF의 활성

실시예 9 :

재조합 GIF의 유도체의 항알러지 활성

본 실시예는 재조합 GIF 유도체가 알러지 반응을 억제할 수 있는 능력을 가짐을 나타낸다. C57A/N106S-GIF를 면역화로 유도된 알러지 반응의 억제력에 대해 측정하였다. BDF₁쥐를 0.1mg의 백반에 흡수된 0.1㎍의 DNP-오브알부민(OVA)으로 면역화하였다. C57A/N106S-GIF(20㎍)는 면역전, 면역후 0, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 그리고 12일째에 복강내 주사하였다. 대조군 쥐에는 PBS만 주사하였다.

면역화 후 14일째에, 0.1㎍의 DNP-BSA를 쥐의 귀에 주사하고 0.25ml의 0.5% 에반스 블루 용액을 정맥 주사하였다. 30분후에 쥐를 희생시켜 귀를 잘랐다. 절단한 귀를 1N 수산화칼륨 용액 0.7㎖에 담근후, 37℃에서 밤새 방치하였다. 이 용액에 0.6N 인산과 아세톤의 혼합용액(5:13) 9.3ml을 첨가한 다음 교반하였다. 상층액에 있는 염색액 양은 620nm 파장에서의 흡광도 측정으로 결정하였다. 비교 대조군 쥐에게는 항알러지제인 케토티펜 1mg/kg을 면역화 13일째에 주사하였다. 이 실험을 두 번 반복하였다(실험 1과 실험 2).

그 결과, C57A/N106S-GIF를 주사한 쥐는 염색제 누수(dye leakage)를 거의 보이지 않았으며, 이는 C57A/N106S-GIF가 상업적으로 이용가능한 항알러지제 케토티펜보다 높은 항알러지 활성을 가짐을 시사한다(제5도).

실시예 10 :

대장균 유래의 변형된 GIF 유도체의 제조와 생물학적 활성

A. 카복시메틸레이션 된 재조합 GIF 유도체의 제조

재조합 GIF 유도체 (C57A 혹은 C57A/N106S) (0.2mg)를 10ml의 PBS에 용해시킨 다음, 1N 수산화나트륨에 녹인 5㎕의 모노요도아세트산을 240mg/ml의 농도로 전기 용액에 용해시켰다. 이 혼합물을 실온에서 밤새 방치하였다. 반응 종결후, YM3 막(Amicon)을 이용하여 용매를 1ml로 농축시켰다. 이 용액을 50ml의 20mM 소듐 아세테이트 완충용액(pH 5.5)에 첨가하고 다시 1ml로 농축하였다. 이 단계를 한 번 더 반복 후 전기 용액을, 20mM 소듐 아세테이트(pH 5.5)로 평형시킨 토소 CM-5PW 컬럼(0.7×7.0cm)에 부하하였다. 단백질을 용출시키기 위하여 NaCl 농도를 1.0ml/분의 유속으로 0.5M까지 직선으로 증가시켰다. 한 개의 시스테인 잔기가 알칼레이션된 GIF 돌연변이(C57A 혹은 C57A/N106S) 세 분자가 이룬 삼중체와 일치하는 첫 번째 피크를 수집하여 각각 C57A-CM3 혹은 C57A/N106S-CM이라 명명하였다.

실시예 4에 기재한 방법으로 수행한 펩티드 맵핑의 결과는 시스테인 잔기는 60 위치 및/혹은 81 위치에서 카복시메틸그룹으로 변형되었음을 나타내었다.

B. 카복시메틸레이션 된 재조합 GIF 유도체의 생물학적 활성

C57A-CM3와 C57A/N106S-CM을 생체 내에서의 항체 형성억제 활성에 대하여, 9번 주사 대신 면역 하루전, 면역후 0, 1일째에 주사(총 세 번주사)하는 것을 제외하고는 실시예 3과 유사한 방법으로 활성 측정하였다. 결과로써, 카복시메틸레이션 된 GIF 유도체는 C57A 혹은 C57A/N106S보다 높은 활성을 나타내었다(표 7). 실험실 조건에서 동일 제조물의 생활성 측정(참조: 실시예 3)은 표 7에서 나타내었으며, C57A와 C57/106S의 카복시메틸레이션은 활성을 현저히 증가시켰다.

[표 7]

변형된 GIF 유도체의 활성

실시예 11 :

노드(NOD) 쥐에서의 재조합 GIF 유도체에 의한 자발적 당뇨의 예방

본 실시예는 재조합 GIF 유도체가 인슐린 의존성 진성 당뇨병을 예방할 수 있음을 나타낸다.

10㎍의 C57A/N106S를 노드(NOD) 자성 쥐(참조: Serreze, D.V. et al., J. of Autoimmunity, 2, 759-776 (1989), Bowman, M.A. et al., Immunology Today, 15, 3, 115-120 (1994))에 일주일에 세 번, 생후 5주에서 38주까지 복강내 주사하였다. 시험 조각(test strips)과 열량계 활성측정을 이용하여, 쥐들을 일주일에 한 번 당뇨(glycosuria)에 대해 모니터하였다. 당뇨병은 200mg/dl 이상의 지속적인 절식 혈당(glycemia)이 나타날 때 발생하는 것으로 진단하였다. C57A/N106S를 처리한 쥐에서는 자발적 당뇨병의 거의 완벽한 예방이 관찰되었다.

실시예 12:

EMTS 혹은 DTNB로 변형된 재조합 GIF의 제조와 생물학적 활성

A. EMTS로 변형된 GIF의 제조

실시예 3에서 비교 대조군으로 사용된 재조합 야생형 GIF 100㎍/ml를 PBS에 용해시킨 용액을 다양한 농도의 EMTS와 함께 4℃에서 24시간 방치하였다. PBS로 광범위 투석 후, 유도체의 농도를 ELISA로 결정하고, 제조물의 생활성을 측정하였다. EMTS로 변형된 GIF를 분리하기 위하여, 시료를 10mM 포스페이트 완충용액(pH 6.5)으로 평형시킨 CM-5PW 컬럼으로 분획하였다. 단백질 용출을 위하여 NaCl의 농도를 0.5ml/분의 유속으로 0.5M까지 직선으로 증가시켰으며, 두 개의 주요 피크를 얻었다. 동일 컬럼에서 나온 EMTS 처리하지 않은 GIF의 용출곡선과 비교했을 때, 36-38분에 회수되는 후반부 단백질 피크는 변형되지 않은 GIF와 일치하는 반면, 31-34분에 회수되는 전반부 피크는 원래의 GIF 재조물에는 존재하지 않음을 나타낸다.

B. EMTS로 변형된 재조합 GIF의 생물학적 활성

EMTS 처리된 GIF와 분획한 GIF의 GIF 생활성은 실시예 3에서와 같이, 쥐의 T 세포 하이브리도마 12H5 세포를, 글리코실레이션 된 IgE-결합인자를 형성하는 세포에서 글리코실레이션 되지 않은 IgE-결합인자를 형성하는 세포로 전환시키는 능력으로 측정하였다. GIF 생활성 측정을 위한 GIF 유도체의 최소 농도는 표 8에 나타내었다.

[표 8]

EMTS로 변형된 GIF의 활성

이 결과는 전반부 피크의 단백질이 생활성을 가진 GIF 유도체임을 분명히 나타낸다. 생활성을 가진 GIF의 생성은 설프히드릴 그룹의 변형에 기인함을 확인하기 위하여, EMTS 처리하여 제조한 생활성을 가진 GIF 유도체의 일부를 5mM 디치오트레이톨(dithiothreitol)과 함께 4℃에서 방치하였다. 광범위 투석 후, 환원된 물질의 GIF 생활성 측정 결과는 1㎍/㎖의 환원형태 GIF가 GIF 생활성 감지에 요구됨을 나타내었으며, 이는 GIF 생활성에 미치는 EMTS 처리효과는 EMTS와 시스테인 잔기의 반응에 기인함을 나타낸다.

C. DTNB로 변형된 GIF의 제조

높은 생활성을 가진 유도체의 생성이 SH 그룹의 머캅티드 형성에만 의한 것일 가능성을 배제하기 위하여, 재조합 야생형 GIF에 다른 치올 시약인 5, 5'-디치오비스(2-니트로벤조익산)(DTNB)를 처리하였다. 130㎍/㎖의 GIF를 PBS에 녹인 용액을 다양한 농도의 DTNB와 함께 4℃에서 24시간 방치하고, PBS로 광범위 투석하였다. 그 결과로 만들어진 DTNB 처리된 GIF를 A에서와 같이 CM-5PW 컬럼으로 분획하였다. 크로마토그램은 변형되지 않은 GIF가 실험 조건하에서 46-48분 사이에 용출됨을 시사하는 26-29분 사이에 회수된 한 개의 주요 피크를 측정할 수 없음을 나타낸다.

D. DTNB로 변형된 재조합 GIF의 생물학적 활성

DTNB로 변형된 GIF 유도체의 GIF 생활성은 B에 기재한 방법으로 측정하였으며 표 9에 나타내었다.

[표 9]

DTNB로 변형된 GIF의 활성

이 결과는 수은의 삽입이 생활성이 높은 GIF의 생성에 필수적이지 않음을 시사한다.

생활성을 가진 GIF 유도체의 일부를 5mM 디치오트레이톨과 함께 4℃에서 밤새 방치하고 난 후 광범위하게 투석하였다. GIF 생활성 측정에서, GIF로부터 환원된 1㎍/㎖조차도 GIF 활성을 나타내지 못함을 나타내었다. 이 결과는, 불활성화된 재조합 GIF의 SH그룹을 DTNB로 변형시킨 것은 높은 GIF 생활성을 생성시킴을 시사한다.

이제부터 약학적 제조 실시예를 기재할 것이다.

제조 실시예 1:

실시예 2에서 획득한 C57A-GIF를 포함하는 용액을 무균상태로 여과한 다음 주사용 제조를 위해 10ml의 바이얼에 충진시켰다.

제조 실시예 2:

실시예 2에서 획득한 C57A-GIF를 포함하는 용액을 무균상태로 여과한 다음 농축시켜, 무균상태하에서 이 농축액 5ml을 10ml의 바이얼에 충진시켰다. -20℃에서 동결 건조한 후, 동결건조물을 포함한 바이얼은 주사용 제조를 위해 고무마개로 막았다.

제조 실시예 3:

실시예 6에서 획득한 C57A/N106S-GIF를 포함하는 용액을 무균상태로 여과한 다음 주사용 제조를 위해 10ml의 바이얼에 충진시켰다.

제조실시예 4:

실시예 6에서 획득한 C57A/N106S-GIF를 포함하는 용액을 무균상태로 여과한 다음 농축시켜, 무균상태하에서 이 농축액 5ml을 10ml의 바이얼에 충진시켰다. -20℃에서 동결 건조한 후, 동결건조물을 포함한 바이얼은 주사용 제조를 위해 고무마개로 막았다.

제조 실시예 5:

실시예 8에서 획득한 CM2-GIF를 포함하는 용액을 무균상태로 여과한 다음 주사용 제조를 위해 10ml의 바이얼에 충진시켰다.

제조 실시예 6:

실시예 8에서 획득한 CM2-GIF를 포함하는 용액을 무균상태로 여과한 다음 농축시켜, 무균상태하에서 이 농축액 5ml을 10ml의 바이얼에 충진시켰다. -20℃에서 동결 건조한 후, 동결건조물을 포함한 바이얼은 주사용 제조를 위해 고무마개로 막았다.

제조 실시예 7:

실시예 8에서 획득한 PE3-GIF를 포함하는 용액을 무균상태로 여과한 다음 주사용 제조를 위해 10ml의 바이얼에 충진시켰다.

제조 실시예 8:

실시예 8에서 획득한 PE3-GIF를 포함하는 용액을 무균상태로 여과한 다음 농축시켜, 무균상태하에서 이 농축액 5ml을 10ml의 바이얼에 충진시켰다. -20℃에서 동결 건조한 후, 동결건조물을 포함한 바이얼은 주사용 제조를 위해 고무마개로 막았다.

제조 실시예 9:

실시예 7에서 획득한 C57S-GIF를 포함하는 용액을 무균상태로 여과한 다음, 주사용 제조를 위해 10ml의 바이얼에 충진시켰다.

제조 실시예 10:

실시예 7에서 획득한 C57S-GIF를 포함하는 용액을 무균상태로 여과한 다음 농축시켜, 무균상태하에서 이 농축액 5ml을 10ml의 바이얼에 충진시켰다. -20℃에서 동결 건조한 후, 동결건조물을 포함한 바이얼은 주사용 제조를 위해 고무마개로 막았다.

제조 실시예 11:

실시예 10에서 획득한 C57A-CM3를 포함하는 용액을 무균상태로 여과한 다음, 주사용 제조를 위해 10ml의 바이얼에 충진시켰다.

제조 실시예 12:

실시예 10에서 획득한 C57A-CM3를 포함하는 용액을 무균상태로 여과한 다음 농축시켜, 무균상태하에서 이 농축액 5ml을 10ml의 바이얼에 충진시켰다. -20℃에서 동결 건조한 후, 동결건조물을 포함한 바이얼은 주사용 제조를 위해 고무마개로 막았다.

제조 실시예 13:

실시예 10에서 획득한 C57A/N106S-CM를 포함하는 용액을 무균상태로 여과한 다음, 주사용 제조를 위해 10ml의 바이얼에 충진시켰다.

제조 실시예 14:

실시예 10에서 획득한 C57A/N106S-CM을 포함하는 용액을 무균상태로 여과한 다음 농축시켜, 무균상태하에서 이 농축액 5ml을 10ml의 바이얼에 충진시켰다. -20℃에서 동결 건조한 후, 동결건조물을 포함한 바이얼은 주사용 제조를 위해 고무마개로 막았다.

제조 실시예 15:

실시예 12A에서 획득한 EMTS에 의해 변형된 GIF(CM-5PW 분획의 전반부 피크)를 포함하는 용액을 무균상태로 여과한 다음, 주사용 제조를 위해 10ml의 바이얼에 충진시켰다.

제조 실시예 16:

실시예 12에서 획득한 EMTS에 의해 변형된 GIF(CM-5PW 분획의 전반부 피크)를 포함하는 용액을 무균상태로 여과한 다음 농축시켜, 무균상태하에서 이 농축액 5ml을 10ml의 바이얼에 충진시켰다. -20℃에서 동결 건조한 후, 동결건조물을 포함한 바이얼은 주사용 제조를 위해 고무마개로 막았다.

제조 실시예 17:

실시예 12C에서 획득한 DTNB에 의해 변형된 GIF(CM-5PW 분획의 주요 피크)를 포함하는 용액을 무균상태로 여과한 다음, 주사용 제조를 위해 10ml의 바이얼에 충진시켰다.

제조 실시예 18:

실시예 12C에서 획득한 DTNB에 의해 변형된 GIF(CM-5PW 분획의 주요 피크)를 포함하는 용액을 무균상태로 여과한 다음 농축시켜, 무균상태하에서 이 농축액 5ml을 10ml의 바이얼에 충진시켰다. -20℃에서 동결 건조한 후, 동결건조물을 포함한 바이얼은 주사용 제조를 위해 고무마개로 막았다.

본 발명의 바람직한 구체화를 상기 기재하였으나, 다양한 변화와 변형이 당업계 통상의 지식을 가진 자들에게는, 본 발명의 진의를 벗어남 없이 분명할 것이다.

그러므로, 본 발명의 범위는 하기 청구범위에 의해서만 결정된다.

공업적 응용성

본 발명은 높은 면역억제 활성을 가지는 GIF 유도체 단백질의 변함없는 대량생산을 가능하게 한다. GIF 유도체 단백질은 알러지 질환 등의 치료 및/혹은 예방에 사용할 수 있다.

GIF가 재조합 DNA 기술에 의해 생산될 때, 생산된 GIF는 분비를 위한 신호-펩티드를 가진 다른 단백질과의 융합 단백질 형태로서 포유동물 숙주세포에서 발현되어 분비되는 경우를 제외하면, 억제성 T세포 하이브리도마에 의해 생산된 GIF에 비해 더 낮은 생물학적 활성을 가진다. 본 발명자들은, 이런 사실이 재조합 단백질에서 흔히 발생하는 바람직하지 못한 분자내 이황화 결합(disulfide bonds)에 기인하는 것이 아니라, GIF 분자들이 이황화 결합이 아닌 다른 방식으로 자신들끼리 연합하여 삼중체(trimer)를 형성하기 때문임을 발견하였다. 아울러, 높은 생물학적 활성을 가진 GIF 유도체들은 돌연변이 그리고/혹은 화학적 변형을 도입함으로써 제조할 수 있음을 발견하였다. 본 발명은 이러한 결과들에 근거해 완성되었다. 본 발명의 요지는 다음과 같다 :

(1) SEQ ID NO : 1의 아미노산 서열을 가지는 항원 비특이적인 사람 글리코실레이션 억제 인자에 비해 증가된 생물학적 활성을 가지는, 전기 억제인자의 유도체.

(2) SEQ ID NO : 1의 뉴클레오티드 서열의 돌연변이를 포함하면서 SEQ ID NO : 1의 아미노산 서열을 가지는 항원 비특이적인 사람 글리코실레이션 억제인자에 비해 증가된 생물학적 활성을 가지는, 전기 억제인자의 유도체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.

(3) (2)의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터.

(4) (2)의 폴리뉴클레오티드에 의해 형질전환된 원핵 혹은 진핵 세포.

(5) (4)의 원핵 혹은 진핵 세포를 배양하고, 생산된 항원 비특이적인 사람 글리코실레이션 억제 인자의 유도체를 분리하고 정제하는 공정을 포함하는, 항원에 비특이적인 사람 글리코실레이션 억제 인자의 유도체를 제조하는 방법.

(6) 항원에 비특이적인 사람 글리코실레이션 억제 인자 혹은 그의 유도체를, 전기 억제 인자 혹은 그의 유도체 중의 삼중체 형성에 관여하는 부분에서 분자간 연합 세기를 약화시키도록 화학적 변성시키는 공정을 포함하는 항원에 비특이적인 사람 글리코실레이션 억제 인자의 유도체를 제조하는 방법.

(7) 항원에 비특이적인 사람 글리코실레이션 억제 인자 유도체(1)과 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물.

(8) 항원에 비특이적인 사람 글리코실레이션 억제 인자 유도체(1)을 면역억제에 효과적인 양으로 사람에게 투여하는 단계를 포함하는, 항원에 대한 사람 면역반응을 억제하는 방법.

Claims (44)

1. SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 가지는 항원 비특이적인 사람 글리코실레이션 억제 인자에 비해 증가된 생물학적 활성을 가지는, 전기 억제인자의 유도체.
2. 제1항에 있어서,

   유도체는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열에 돌연변이 및/혹은 화학적 변성을 포함하는 것을 특징으로 하는

   항원에 비특이적인 사람 글리코실레이션 억제인자 유도체.
3. 제2항에 있어서,

   돌연변이 및/혹은 화학적 변성은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 가지는, 항원에 비특이적인 사람 글리코실레이션 억제인자가 삼중체를 이루는 데에 관여하는 부분에서 분자간 연합의 세기를 약화시키는 것을 특징으로 하는

   항원에 비특이적인 사람 글리코실레이션 억제인자 유도체.
4. 제3항에 있어서,

   삼중체 형성에 관여하는 부분은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 37-45, 47-50, 57, 59, 60, 94-98 및 106-110으로 구성된 그룹으로 부터 선택되는 적어도 한 부분인 것을 특징으로 하는

   항원에 비특이적인 사람 글리코실레이션 억제인자 유도체.
5. 제3항에 있어서,

   분자간 연합의 세기는 삼중체의 연합 상수가 614 이하되도록 약화되는 것을 특징으로 하는

   항원에 비특이적인 사람 글리코실레이션 억제인자 유도체.
6. 제2항에 있어서,

   돌연변이는 적어도 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 57번 위치의 시스테인 잔기에 도입되는 것을 특징으로 하는

   항원에 비특이적인 사람 글리코실레이션 억제인자 유도체.
7. 제6항에 있어서,

   돌연변이는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 37-45, 47-50, 59, 60, 94-98 및 106-110으로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 한 부분에 있는, 적어도 하나의 아미노산 잔기에 추가로 도입되는 것을 특징으로 하는

   항원에 비특이적인 사람 글리코실레이션 억제인자 유도체.
8. 제6항에 있어서,

   57 위치의 시스테인 잔기는 알라닌이나 세린으로 치환되는 것을 특징으로 하는

   항원에 비특이적인 사람 글리코실레이션 억제인자 유도체.
9. 제7항에 있어서,

   57번 위치의 시스테인 잔기는 알라닌 잔기로 치환되고, 106번 위치의 아스파라긴 잔기는 세린 잔기로 치환되는 것을 특징으로 하는

   항원에 비특이적인 사람 글리코실레이션 억제인자 유도체.
10. 제2항에 있어서,

    SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열에서 하나 혹은 그 이상의 아미노산 잔기의 화학적 변성은 포스포릴레이션, 알킬레이션, 아실레이션, EMTS에 의한 변성 DTNB에 의한 변성으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는

    항원에 비특이적인 사람 글리코실레이션 억제인자 유도체.
11. 제10항에 있어서,

    시스테인 잔기는 카복시메틸레이션 되는 것을 특징으로 하는

    항원에 비특이적인 사람 글리코실레이션 억제인자 유도체.
12. 제10항에 있어서,

    시스테인 잔기는 피리딜에틸레이션 되는 것을 특징으로 하는

    항원에 비특이적인 사람 글리코실레이션 억제인자 유도체.
13. 제10항에 있어서,

    시스테인 잔기는 EMTS에 의해 변성되는 것을 특징으로 하는

    항원에 비특이적인 사람 글리코실레이션 억제인자 유도체.
14. 제10항에 있어서,

    시스테인 잔기는 DTNB에 의해 변성되는 것을 특징으로 하는

    항원에 비특이적인 사람 글리코실레이션 억제인자 유도체.
15. 제2항에 있어서,

    돌연변이는 적어도 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 57번 위치의 시스테인 잔기에 도입되고, SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열에서 하나 혹은 그 이상의 아미노산 잔기의 화학적 변성은, 포스포릴레이션, 알킬레이션, 아실레이션, EMTS에 의한 변성 및 DTNB에 의한 변성으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는

    항원에 비특이적인 사람 글리코실레이션 억제인자 유도체.
16. 제15항에 있어서,

    57 위치에서 시스테인 잔기가 알라닌이나 세린으로 치환되는 것을 특징으로 하는

    항원에 비특이적인 사람 글리코실레이션 억제인자 유도체.
17. 제15항에 있어서,

    시스테인 잔기는 카복시메틸레이션 되는 것을 특징으로 하는

    항원에 비특이적인 사람 글리코실레이션 억제인자 유도체.
18. 제15항에 있어서,

    돌연변이는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 106번 위치의 아스파라긴 잔기에 추가로 도입되는 것을 특징으로 하는

    항원에 비특이적인 사람 글리코실레이션 억제인자 유도체.
19. 제18항에 있어서,

    106번 위치의 아스파라긴 잔기는 세린 잔기로 치환되는 것을 특징으로 하는

    항원에 비특이적인 사람 글리코실레이션 억제인자 유도체.
20. SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 서열의 돌연변이를 포함하면서 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 가지는 항원 비특이적인 사람 글리코실레이션 억제인자에 비해 증가된 생물학적 활성을 가지는, 전기 억제인자의 유도체를 코딩하는 폴리유클레오티드.
21. 제20항에 있어서,

    돌연변이는 뉴클레오티드의 결실, 뉴클레오티드의 삽입 및 뉴클레오티드의 치환으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는

    폴리뉴클레오티드.
22. 제20항에 있어서,

    돌연변이는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 가지는, 항원에 비특이적인 사람 글리코실레이션 억제 인자가 삼중체를 이루는 데에 관여하는 부위에서 분자간 연합의 세기를 약화시키는 것을 특징으로 하는

    폴리뉴클레오티드.
23. 제22항에 있어서,

    삼중체 형성에 관여하는 부분은, SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 37-45, 47-50, 57, 59, 60, 94-98 및 106-110으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 적어도 한 부분인 것을 특징으로 하는

    폴리뉴클레오티드.
24. 제23항에 있어서,

    뉴클레오티드 서열은 돌연변이가 적어도 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 57번 위치에 있는 시스테인 잔기에 도입된, 항원에 비특이적인 사람 글리코실레이션 억제 인자 유도체 단백질의 아미노산 서열을 코딩하는 것을 특징으로 하는

    폴리뉴클레오티드.
25. 제24항에 있어서,

    돌연변이는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 37-45, 47-50, 59, 60, 94-98 및 106-110으로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 한 부분에 있는, 적어도 하나의 아미노산 잔기에 추가로 도입되는 것을 특징으로 하는

    폴리뉴클레오티드.
26. 제24항에 있어서,

    뉴클레오티드 서열은 57번 위치의 시스테인 잔기가 알라닌이나 세린잔기로 치환된, 항원에 비특이적인 사람 글리코실레이션 억제 인자 유도체 단백질의 아미노산 서열을 코딩하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
27. 제26항에 있어서,

    뉴클레오티드 서열은 57번 위치의 시스테인 잔기가 알라닌으로 치환되고, 106 위치의 아스파라긴 잔기가 세린으로 치환된, 항원에 비특이적인 사람 글리코실레이션 억제 인자 유도체 단백질의 아미노산 서열을 코딩하는 것을 특징으로 하는

    폴리뉴클레오티드.
28. 제20항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터.
29. 제20항의 폴리뉴클레오티드에 의해 형질전환된 원핵 혹은 진핵 세포.
30. 제29항에 있어서,

    원핵 생물은 세균인 것을 특징으로 하는

    세포.
31. 제29항에 있어서,

    원핵 생물은 대장균인 것을 특징으로 하는

    세포.
32. 제29항에 있어서,

    진핵 생물은 포유류인 것을 특징으로 하는

    세포.
33. 제29항의 원핵 혹은 진핵 세포를 배양하고, 생산된 항원 비특이적인 사람 글리코실레이션 억제 인자의 유도체를 분리하고 정제하는 공정을 포함하는, 항원에 비특이적인 사람 글리코실레이션 억제 인자의 유도체를 제조하는 방법.
34. 항원에 비특이적인 사람 글리코실레이션 억제 인자 혹은 그의 유도체를, 전기 억제 인자 혹은 그의 유도체 중의 삼중체 형성에 관여하는 부분에서 분자간 연합 세기를 약화시키도록 화학적 변성시키는 공정을 포함하는 항원에 비특이적인 사람 글리코실레이션 억제 인자의 유도체를 제조하는 방법.
35. 제34항에 있어서,

    화학적 변성은 포스포릴레이션, 알킬레이션 및 아실레이션으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는

    방법.
36. 제1항의 항원에 비특이적인 사람 글리코실레이션 억제 인자 유도체와 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물.
37. 제36항에 있어서,

    면역억제에 사용되는 것을 특징으로 하는

    약학적 조성물.
38. 제36항에 있어서,

    알러지의 치료 및/혹은 예방에 사용되는 것을 특징으로 하는

    약학적 조성물.
39. 제36항에 있어서,

    당뇨병의 치료 및/혹은 예방에 사용되는 것을 특징으로 하는

    약학적 조성물
40. 제1항의 항원에 비특이적인 사람 글리코실레이션 억제 인자 유도체를 면역억제에 효과적인 양으로 사람에게 투여하는 단계를 포함하는, 항원에 대한 사람 면역반응을 억제하는 방법.
41. 제40항에 있어서,

    항원에 비특이적인 사람 글리코실레이션 억제 인자 유도체는 적어도 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 57번 위치에 있는 시스테인 잔기에 유발된 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는

    방법.
42. 제40항에 있어서,

    투여는 비경구인 것을 특징으로 하는

    방법.
43. 제42항에 있어서,

    비경구 투여는 피하로, 근육으로, 복강내로, 동내로(intracavity), 피부사이로, 혹은 정맥으로 주사하는 것을 특징으로 하는

    방법.
44. 제40항에 있어서,

    당뇨병의 치료 및/혹은 예방에 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.