KR19990025049A

KR19990025049A - 발암억제작용을 갖는 생강과 익지인의 활성성분들 및 이를 함유하는 조성물

Info

Publication number: KR19990025049A
Application number: KR1019970046494A
Authority: KR
Inventors: 서영준; 주영협; 이상섭; 박광균; 박영호
Original assignee: 서경배; 주식회사 태평양
Priority date: 1997-09-10
Filing date: 1997-09-10
Publication date: 1999-04-06

Abstract

본 발명은 생강과 익지인의 활성성분들의 발암억제작용에 관한 것이며, 더욱 상세하게는 생강과 익지인의 유효 활성성분들 중의 1종 이상을 함유하는 발암억제효과를 갖는 조성물에 관한 것이다.

Description

발암억제작용을 갖는 생강과 익지인의 활성성분들 및 이를 함유하는 조성물

발암과정의 정확한 분자생물학적 기전은 아직 분명히 규명되고 있지 않으나, 인체 종양의 대부분(60~90%)은 환경적 요인에 의해 발생되는 것으로 알려져 있다. 여러 동물실험 모델을 통해 암은 다단계로 진행된다는 것이 밝혀졌으며, 크게 개시(initiation), 촉진(promotion), 그리고 진행(progression)의 세단계로 나눌 수 있다.

이론적으로 암발생 억제는 개시 단계, 촉진-진행 단계 어느쪽으로도 가능하다. 개시단계에서의 억제는 1) 화학물질이 최종 발암물질로 되는 대사 활성화 단계 저해; 2) 발암물질의 제독화능 증가; 3) 발암원의 세포 표적(DNA, RNA, 단백질 등)에의 결합 저해로 가능하다.

천연 유래 혹은 합성 화합물이 동물 실험에서 또한 사람을 대상으로 한 역학조사에서 종양 발생을 감소시킬 수 있음을 관찰함으로써 특정 화학물질의 섭취로 암을 예방하거나 그 진행을 늦출 수 있다는 생각이 가능하게 되었다. 이에 따라서 암의 발생을 억제할 수 있는 각종 식품첨가물, 비타민, 호르몬, 항호르몬, 약물, 합성 화합물 등을 검색하게 되었다. 이러한 발암억제제는 작용기전상 여러 가지로 분류될 수 있으나 작용기전이 한가지 이상으로 중복되는 물질도 많다.

이에, 본 발명자들도 인체 안전성이 확보된 천연 유래의 발암억제제를 검색하던 중, 생강과 익지인의 활성성분들이, DMBA(7,12-디메틸벤즈안트라센(7,12-dimethylbenz(a)anthracene))를 발암개시제로 사용하고, TPA(12-O-테트라데카노일포르볼-13-아세테이트(12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate))를 발암촉진제로 처리한 마우스 피부암 억제 실험과, 백혈병 종양세포주인 HL-60에 대해 세포독성을 발휘함도 발견하고, 생강과 익지인의 활성성분들이 종양의 개시단계 뿐만 아니라 촉진단계에서도 발암억제력을 나타낼 것으로 기대되어 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 생강과 익지인의 활성성분의 발암억제효과를 확인하고, 생강과 익지인의 유효 활성성분들 중의 1종 이상을 함유하는 발암억제효과를 갖는 조성물을 제공하는 것이다.

도 1은 참조예 4에서 합성한 3-파라돌의 NMR 스펙트럼이며, 참조예 1에서 생강으로부터 추출하여, 정제한 3-파라돌의 NMR 스펙트럼도 이와 일치하였다.

도 2는 참조예 4에서 합성한 6-파라돌의 NMR 스펙트럼이며, 참조예 1에서 생강으로부터 추출하여, 정제한 6-파라돌의 NMR 스펙트럼도 이와 일치하였다.

도 3은 참조예 4에서 합성한 10-파라돌의 NMR 스펙트럼이며, 참조예 1에서 생강으로부터 추출하여, 정제한 10-파라돌의 NMR 스펙트럼도 이와 일치하였다.

도 4은 참조예 3에서 합성한 3-데히드로파라돌의 NMR 스펙트럼이며, 참조예 1에서 생강으로부터 추출하여, 정제한 3-데히드로파라돌의 NMR 스펙트럼도 이와 일치하였다.

도 5는 참조예 3에서 합성한 6-데히드로파라돌의 NMR 스펙트럼이며, 참조예 1에서 생강으로부터 추출하여, 정제한 6-데히드로파라돌의 NMR 스펙트럼도 이와 일치하였다.

도 6은 참조예 3에서 합성한 10-데히드로파라돌의 NMR 스펙트럼이며, 참조예 1에서 생강으로부터 추출하여, 정제한 10-데히드로파라돌의 NMR 스펙트럼도 이와 일치하였다.

도 7은 참조예 6에서 합성한 야쿠치논 B의 NMR 스펙트럼이며, 참조예 5에서 익지인으로부터 추출하여, 정제한 야쿠치논 B의 NMR 스펙트럼도 이와 일치하였다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에 따른 발암억제효과를 갖는 조성물은 하기 일반식(Ⅰ)로 표시되는 [n]-쇼가올([n]-shogaol), 일반식(Ⅱ)로 표시되는 [n]-파라돌([n]-paradol), 일반식(Ⅲ)으로 표시되는 [n]-데히드로파라돌([n]-dehydroparadol), 익지인의 메탄올 추출액인 올레오레진(oleoresin), 일반식(Ⅳ)로 표시되는 야쿠치논 A 및 일반식(Ⅴ)로 표시되는 야쿠치논 B로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을, 발암억제에 유효한 양으로 함유함을 특징으로 한다 :

.....(Ⅰ)

(식중에서, n은 0~16의 정수이다)

.....(Ⅱ)

(식중에서, n은 0~18의 정수이다)

.....(Ⅲ)

(식중에서, n은 0~18의 정수이다)

.....(Ⅳ)

.....(Ⅴ)

생강(Zingiber officitialeRoscoe)은 오랫동안 향신료로 쓰여온 식품이며, 동시에 민간약으로서 건위제, 구풍제, 발한제, 진토제, 식욕촉진제로 이용되어온 생약이다. 생강의 매운맛 성분인 일반식(I)의 [n]-쇼가올과 일반식(Ⅱ)의 [n]-파라돌은 주로 일차구심성 감각신경에 작용해 바닐로이드 특유의 강력하고 지속적인 진통작용을 나타내며, 아라키돈산 대사과정도 저해하는 것으로 밝혀져 비스테로이드성 소염진통제와도 일부 작용기전을 공유한다. 일반식(Ⅲ)의 [n]-데히드로파라돌은 [n]-파라돌의 합성 중간체로서 매운 맛이나 파라돌처럼 강력한 진통작용은 없다.

또한, 익지인은 생강과 식물인 익지(Alpinia oxyphyllaMiquel)의 열매로, 방향성 건위약, 정장약으로 사용되어 온 생약이다. 익지인의 매운맛 성분으로는 일반식(Ⅳ)의 야쿠치논 A와 일반식(Ⅴ)의 야쿠치논 B가 알려져 있다.

이하, 본 발명에 따른 조성물의 유효 활성성분들에 대한 발암억제작용을 실험예를 통하여 검증하고자 한다.

참조예 1생강으로부터 올레오레진(oleoresin)의 추출

시판 생강을 분쇄한 다음 에탄올로 추출하고 추출액을 감압 농축하여 올레오레진을 얻었다.

생강 분말 500g을 에탄올 2ℓ와 혼합한 후, 실온에서 4일간 정치시켜 추출하여 얻은 여과액을 감압 농축하여 용매를 완전히 제거하였다. 올레오레진으로서 수득률은 3%이었고, 분석 결과 레진 중 [n]-진제롤은 43.2%, [n]-쇼가올은 10.2%이었다. [n]-파라돌은 흔적량이었다.

참조예 2[n]-쇼가올류의 합성

바닐린과 아세톤을 축합하여 데히드로진제론을 얻은 후 팔라듐/탄소 촉매하에서 환원시켜 진제론을 얻었다. 진제론에 알칼리 촉매하에서 [n]-알킬알데히드를 가하여 알돌 축합시켜 [n]-쇼가올류를 합성하였다.

참조예 3[n]-데히드로파라돌류의 합성

바닐린과 알킬메틸케톤을 약산-약염기 촉매하에서 반응시킴으로써 [n]-데히드로파라돌류를 합성하였다.

참조예 4[n]-파라돌류의 합성

참고예 3에서 얻은 [n]-데히드로파라돌을 팔라듐/탄소 촉매하에서 환원시켜 [n]-파라돌류를 합성하였다.

참조예 5익지인으로부터 올레오레진(oleoresin)의 추출

익지인 분말 500g을 메탄올 2ℓ와 혼합한 후, 실온에서 4일간 정치시켜 추출하여 얻은 여과액을 감압 농축하여 용매를 완전히 제거한 후, 클로로포름에 다시 녹여 여과하였다. 올레오레진으로서 수득률은 3.5%이었다.

참조예 6야쿠치논 A, B의 합성

바닐린과 6-페닐-2-헥사논을 약산-약염기 촉매(초산-피롤리딘) 하에서 축합반응시켜 야쿠치논 B를 합성하였다. 야쿠치논 A는 야쿠치논 B를 접촉환원시켜 합성하였다. 6-페닐-2-헥사논은, 디메틸카드뮴과 5-페닐발레인산으로부터 얻은 5-페닐발레릴클로라이드를 반응시켜 얻었다.

실험예 1생강과 익지인의 올레오레진 및 그 주요활성성분의 발암억제효과

실험방법

마우스 피부암 모델을 이용해 발암억제력을 평가하였다.

6~8주령의 ICR 자성 마우스의 등을 전기면도기를 이용해 제모하고, 2일후 발암개시를 위해 DMBA 0.2μmol을 아세톤 200㎕에 녹여 제모부위에 발랐다. 음성 대조군에는 아세톤만 동량 처리했다. 개시 후 1주부터 시작해 TPA 15nmol을 일주일에 2회씩 15주 동안 국소 적용했다.

이때 생강으로부터 추출한 올레오레진, 익지인으로부터 추출한 올레오레진, 진제롤, 쇼가올, 파라돌, 데히드로파라돌과, 이들의 화학적 구조 및 약리학적 작용에 있어서 유사성이 있는 고추의 매운맛 성분인 캅사이신 등의 시료를, TPA를 적용하기 30분 전에 전처리했다. 생강과 익지익으로부터 추출한 올레오레진은 2㎎씩, 나머지 시험물질은 10μmol씩 적용하였다.

15주 이후부터는 실험종료시까지 TPA만 처리했다. 일주일에 한 번씩 마우스 등에서 지름 1㎜ 이상의 종양 형성을 관찰하고 기록했다. 각 군당 25마리의 마우스를 사용하였다. 각 군에서의 종양발생 빈도와 수효를 발암억제의 지표로 채택했다. 실험결과는 표 1에 정리하였다.

발암억제제의 대조군으로는 대표적인 항발암물질인 울금의 쿠르쿠민(curcumin)과 생강에서 분리한 진제롤을 사용하였다. [n]-쇼가올, [n]-파라돌 및 [n]-데히드로파라돌 동족체 및 야쿠치논 A, B의 상대적 역가는 표 2에 정리하였다.

DMBA-개시 생쥐 피부암 발암에 미치는 바닐로이드류의 항종양 촉진효과

시 료	19주째
시 료	% 종양 보유 생쥐	평균 종양 수/생쥐
음성 대조군쿠르쿠민생강 올레오레진익지인 올레오레진6-진제롤캅사이신	1005576717282	9.5±5.62.6±3.43.8±4.13.2±3.43.3±3.57.7±8.3

DMBA-개시 생쥐 피부암 발암에 미치는 [n]-쇼가올, [n]-파라돌 및 [n]-데히드로파라돌 동족체의 항종양 촉진효과

시 료	19주째
시 료	% 종양 보유 생쥐	평균 종양 수/생쥐
음성 대조군쿠르쿠민3-데히드로파라돌6-데히드로파라돌10-데히드로파라돌3-파라돌6-파라돌10-파라돌3-쇼가올6-쇼가올10-쇼가올야쿠치논 A야쿠치논 B	100619280837360647162675955	10.1±7.13.4±2.18.6±5.27.0±4.18.3±6.74.1±3.83.1±2.33.6±3.33.5±2.83.3±2.73.0±2.12.7±2.12.4±2.7

실험예 2익지인의 올레오레진 및 그 주요활성성분의 종양세포 독성효과

실험방법

티미딘 도입 분석법을 이용해 종양세포에 대한 세포독성을 평가하였다.

24웰(well) 플레이트의 각 웰에 HL-60 세포를 1×10⁵/㎖로 도포한 후, 히드록시우레아를 1.5mM 농도로 14시간 동안 처리하였다. 익지인 올레오레진과 야쿠치논 A, B를 각 농도별로 처리하여 24시간 동안 배양하였다.

세포배양이 끝나기 8시간 전에, 각 웰에 [³H]티미딘을 0.5μCi 가하고 세포배양이 끝난 후 세포내로 도입되지 않은 [³H]티미딘은 인산완충액으로 씻어냈다. 삼염화초산으로 세포를 고정하고, 0.2N의 NaOH(0.5%의 SDS)로 세포를 파괴한 후, 액체 섬광 계수장치(liquid scintillation counter)를 이용해 방사능을 측정하였다. 실험결과는 표 3에 정리하였다.

익지인 올레오레진과 야쿠치논 A, B의 백혈구 종양세포주 HL-60에 대한 세포독성 효과

시 료	농 도	생존율(%)
대조군		100
쿠르쿠민	10μM50μM100μM	753532
야쿠치논 A	10μM50μM100μM	745131
야쿠치논 B	10μM50μM100μM	612825
익지인 올레오레진	3㎍/㎖10㎍/㎖20㎍/㎖33㎍/㎖67㎍/㎖	7963412318

이상의 실험예로부터 생강의 유효 활성성분인 [n]-쇼가올, [n]-파라돌, [n]-데히드로파라돌, 익지인의 메탄올 추출액인 올레오레진 및 그의 활성성분인 야쿠치논 A 및 B의 발암억제효과를 확인할 수 있으며, 특히 익지인의 올레오레진 및 그의 활성성분인 야쿠치논 A, B는 대표적인 발암억제제인 울금의 쿠르쿠민의 활성에 유사한 활성을 발휘함을 알 수 있다.

이러한 실험적 결과를 토대로 하여, 본 발명은 상기한 생강의 활성성분인 [n]-쇼가올, [n]-파라돌, [n]-데히드로파라돌, 익지인의 메탄올 추출액인 올레오레진 및 그의 활성성분인 야쿠치논 A 및 B 중에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로하여 발암억제효과를 갖는 조성물로 제제화할 수 있다. 이 조성물은 발암억제에 유효한 함량으로 상기한 생강과 익지인의 활성성분들 중의 1종 이상을 경구 또는 비경구 경로를 통해 인체에 투여될 수 있다. 본 발명의 발암억제제는 투여목적, 투여경로 등에 따라서 적합한 제형으로 만들 수 있으며, 예를 들면, 정제, 주사제, 연고, 크림 등의 의약제제로, 또는 통상의 자양강장 목적의 보조제와 배합하여 차나 드링크 등의 기호식품이나 건강보조식품의 형태로 제제화하여 음용할 수도 있다. 제제화에 있어서 생강과 익지인의 활성성분들의 발암억제효과에 역효과를 미치지 아니하는 제약적으로 허용되는 각종의 부형제, 담체 또는 희석제 등을 사용할 수 있다. 어느 경우든지 투여량은 0.1~1000㎎/㎏의 범위에 있도록 하는 것이 바람직하다.

또한, 상기한 생강의 활성성분인 [n]-쇼가올, [n]-파라돌, [n]-데히드로파라돌, 익지인의 메탄올 추출액인 올레오레진 및 그의 활성성분인 야쿠치논 A 및 B 중에서 선택된 1종 이상을 유효 성분으로 하여 기초화장료로 제제화할 수도 있다. 이러한 기초화장료는 거의 매일 피부에 적용할 수 있는 것으로, 오염된 대기중의 발암성 물질이나 자외선에 의한 피부암 등의 발암을 예방할 수 있다. 기초화장료로서 제제화하는 경우, 조성물 총 중량에 대해 0.001~20중량%, 바람직하게는 0.1~10중량%의 범위내에서 제형에 따라 적의하게 배합하여 사용할 수 있다. 본 발명의 기초화장료 조성물은 그 제형에 있어서 특별히 한정되지 않으며, 구체적으로 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 아이에센스, 아이크림, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 팩 또는 파우다로 제형화될 수 있다.

이하에서는, 본 발명의 생강과 익지인의 활성성분들을 함유하는 기초화장료의 피부안전성을 확인하였다.

(제형예 1~5 및 비교예 1~2) 유연화장수

배합성분	제형예	비교예
배합성분	1	2	3	4	5	1	2
6-데히드로파라돌6-파라돌6-쇼가올익지인 올레오레진야쿠치논 A야쿠치논 B쿠르쿠민콜레스테롤글리세린1,3-부틸렌글리콜셀룰로오스 검에탄올POE-16 옥틸도데실에테르폴리솔베이트-60방부제색소향정제수	1.0----1.0-0.73.01.00.110.00.20.2미량미량미량to 100	-1.0---1.0-0.73.01.00.110.00.20.2미량미량미량to 100	--1.0--1.0-0.73.01.00.110.00.20.2미량미량미량to 100	---2.0---0.73.01.00.110.00.20.2미량미량미량to 100	----2.0--0.73.01.00.110.00.20.2미량미량미량to 100	------2.00.73.01.00.110.00.20.2미량미량미량to 100	-------0.73.01.00.110.00.20.2미량미량미량to 100

실험예 3 피부안전성 시험

상기 제형예 1~5 및 비교예 1~2에서 제조된 유연화장수에 대하여 피부 안전성을 비교하였다.

피부의 안전성에 대해서는 통상의 패취테스트를 실시하였다. 70명의 일반인을 7개조로 나누고, 상기 제형예 1~5 및 비교예 1~2에 의해 제조된 유연화장수를 각 조에 나누어 10일간 안면에 사용하게 한 다음, 자극의 강도에 따라 다음과 같이 점수를 주어 그 평균값을 계산하였다. 그 결과는 하기 표 4에 나타내었다.

(평가점수)

4 : 매우 자극이 심하여 화장료로 사용하기에 부적합함

3 : 자극이 심하여 사용을 않는 것이 좋음

2 : 약간의 자극이 있으며 사용할때 주의를 요함

1 : 거의 자극이 없음

0 : 전혀 자극이 없어 민감한 피부에 사용해도 좋음

시료명	비교예	제형예
시료명	1	2	1	2	3	4	5
판정	0.3	0.3	0.2	0.3	0.2	0.3	0.3

표 4의 결과로부터, 각 시료간 유의할 만한 차이점이 없으며 자극이 거의 없어 본 발명의 생강과 익지인의 활성성분들은 화장품용 원료로서 사용하기에 적합하다고 평가할 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 생강과 익지인의 유효 활성성분들 중의 1종 이상을 함유함으로써, DMBA를 발암개시제로 사용하고, TPA를 발암촉진제로 처리한 마우스 피부암 억제 실험과, 백혈병 종양세포주인 HL-60에 대해 세포독성을 나타내며, 따라서 종양의 개시단계 뿐만 아니라 촉진단계에서도 발암억제력을 나타낼 것으로 기대된다.

Claims

하기 일반식(Ⅰ)로 표시되는 [n]-쇼가올([n]-shogaol), 일반식(Ⅱ)로 표시되는 [n]-파라돌([n]-paradol), 일반식(Ⅲ)으로 표시되는 [n]-데히드로파라돌([n]-dehydroparadol), 익지인의 메탄올 추출액인 올레오레진(oleoresin), 일반식(Ⅳ)로 표시되는 야쿠치논 A 및 일반식(Ⅴ)로 표시되는 야쿠치논 B로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을, 발암억제에 유효한 양으로 함유함을 특징으로 하는 발암억제효과를 갖는 조성물 :

.....(Ⅰ)

(식중에서, n은 0~16의 정수이다)

.....(Ⅱ)

(식중에서, n은 0~18의 정수이다)

.....(Ⅲ)

(식중에서, n은 0~18의 정수이다)

.....(Ⅳ)

.....(Ⅴ)
제 1항에 있어서, 익지인의 메탄올 추출액인 올레오레진, 일반식(Ⅳ)의 야쿠치논 A 및 일반식(Ⅴ)의 야쿠치논 B로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을, 발암억제에 유효한 양으로 함유함을 특징으로 하는 발암억제효과를 갖는 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기한 군에서 선택된 1종 이상을 투여량 0.1~1000㎎/㎏의 범위로, 제약적으로 허용되는 각종의 부형제, 담체 또는 희석제와 배합하여 의약제제로서 제제화하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기한 군에서 선택된 1종 이상을, 자양강장 목적의 보조제와 배합하여 드링크제로서 제제화하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기한 군에서 선택된 1종 이상을, 자양강장 목적의 보조제와 배합하여 드링크제로서 제제화하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기한 군에서 선택된 1종 이상을 조성물 총 중량에 대해 0.001~20중량%의 양으로 배합하여 기초화장료로서 제제화하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 6항에 있어서, 상기한 조성물은 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 아이에센스, 아이크림, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 팩 또는 파우다의 제형을 가짐을 특징으로 하는 조성물.