KR19990022717A - 박테리아 세포내 이종 유전자의 염색체 발현 - Google Patents
박테리아 세포내 이종 유전자의 염색체 발현 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은E. coli와 같은 숙주세포의 염색체에 관심있는 이종 단백질을 암호화하는 유전자 카피를 삽입함으로써 관심있는 이종 단백질을 제조하는 조성물 및 방법을 제공한다. 염색체 전이 DNA(환상의 비자기복제 DNA)가 숙주세포 염색체에 관심있는 이종 단백질을 암호화하는 유전자를 통합시키는 데 사용된다. 염색체 전이 DNA는 적어도 하나의 선별 마커로 이루어지고 이 선별 마커 측면에 있는 반복된 DNA 서열을 임의로 포함하여, 통합된 DNA의 염색체 증폭을 용이하게 할 수 있다. 관심있는 단백질을 암호화하는 유전자는 숙주세포 염색체에의 통합 후 발현될 수 있으며, 염색체 증폭을 위한 선별은 유전자 발현에 앞서 수행될 수 있다.
Description
유전공학으로 재조합 발현 시스템에 의해, 특히 Escherichia coli (E. coli)와 같은 원핵생물내에서의 발현에 의해 박테리아 세포내에서 다량의 이종 단백질 또는 폴리펩티드를 제조하는 것이 가능하게 되었다.
발현된 이종 단백질은 포유류, 기타 진핵, 바이러스, 박테리아, 시아노박테리아, 아르키박테리아, 또는 합성 기원의 것일 수 있다.
단일 염색체 유전자 카피에 의해 암호화될 때에도 종종 박테리아 세포내에 효과적으로 축적될 수 있는 천연 박테리아 단백질과 달리, 단일 염색체 유전자 위치로부터 발현될 때 총세포단백질의 0.1%를 초과하는 레벨로 박테리아 세포내에 축적되는 이종(heterologous) 단백질에 관한 공개된 보고는 현재까지 없다.
총세포단백질의 0.1%(박테리아 세포 1조개 당 단백질 150마이크로그램)는 (a) 현대의 재조합 박테리아 생산 표준에 의한 원하는 단백질의 경제적으로 현저한 축적, 및 (b) 전 박테리아 세포 추출물의 쿠마시 염색된 폴리아크릴아미드겔 분석에 의한 단백질 밴드의 육안 검출 하한을 대략적으로 한정하기 때문에 성공적인 단백질축적의 실용적 척도로서 선택된다.
가장 강한 공지된 박테리아 프로모터의 제어하에 놓일 때에도 박테리아 세포내에서 발현될 때 비박테리아 유전자의 성능이 비교적 불량한 것은 일반적으로 비박테리아 mRNA의 불량한 번역 및 새로 합성된 비박테리아 단백질의 급속한 분해에 기인해 왔다. 박테리아 세포내에서 비박테리아 또는 이종 단백질의 성공적 축적을 달성하기 위해서는 비단백질을 암호화하는 유전자가 다카피(multicopy) 플라스미드 벡터상에 위치되어야 한다고 거의 보편적으로 여겨져 왔다.
E. coli에서 비박테리아 단백질을 암호화하는 유전자를 클로닝 및 발현시키는 데 통상 사용되는 다카피 플라스미드 중 하나에 포함된 유전자는 보통 카피수가 20 카피/세포보다 많다. 카피수가 적은 플라스미드(예를 들면 pACYC177 및 pLG339)라도 일반적으로 세포 당 6-10 카피로 존재한다. 플라스미드 유전자 적용에 의해 부과되는 한 단점은 미량이라도 일부 외래 단백질의 발현은 숙주세포를 사멸시킬 수 있다는 것이다(Meth. Enzymol. 185:63-65, ed. D. Goeddel, 1990 참조). 이러한 이유로 예를 들면 유전자를 세포 당 한 개 이하의 카피수로 박테리아 염색체에 통합시킴으로써 그러한 독성 유전자 산물을 암호화하는 유전자 카피수를 신뢰성 있게 한정하는 것이 유리할 것이다. 예를 들면, 라이브러리내의 한 개 이상의 cDNA의 고카피 발현이 박테리아 숙주를 사멸시키거나 불충분하게 성장시킬 수 있다면 그러한 시스템은 박테리아 숙주에서 보다 대표적인 cDNA 발현 라이브러리를 제조하는 것을 가능하게 할 것이다.
이종 폴리펩티드를 암호화하는 유전자의 염색체 통합도 또한 박테리아 숙주세포내 이종 단백질의 발현을 위한 대체 수단으로서 유리할 것이다. 다카피 벡터는 종종 불안정하여 유지를 위해서는 성장배지에 항생물질을 사용할 것을 요한다. 외래유전자를 박테리아 염색체에 통합시키는 기존 방법은 비효과적이고 외래유전자의 통합부위를 제어할 수 없고 및/또는 통합된 유전자 카피수를 제어할 수 없다. 가장 중요하게는, 박테리아 프로모터를 이종 유전자에 융합시키는, 박테리아 염색체상에서 재조합 DNA 구조체를 형성해보려는 현재까지의 모든 노력은 그 구조체를 포함하는 바이러스 또는 플라스미드 중간체의 형성을 포함하였다. 그러한 중간체는 고카피수로 복제되기 때문에 외래유전자 산물이 박테리아 세포에 대해 독성인 경우에는 화수하기가 어려울 수도 있고 불가능할 수도 있다. 암호화된 유전자의 발현은 낮은 레벨에서도, 발현 레벨을 효과적으로 배가시키는 이들 중간체의 고카피수로 인해 숙주세포에 대해 독성일 수 있다.
박테리아 숙주 염색체로의 이종 단백질 통합을 달성하기 위한 이전의 방법은 파지 람다 벡터의 사용을 포함한다. 환상의 파지 DNA는 240 염기 길이의 파지 부착부위(attP)와 단지 25 염기 길이의 박테리아 부착부위(attB)간의 단일부위특이적 재조합에 의해 박테리아 염색체에 선형으로 삽입된다. 이 두 부위는 15 염기를 공통으로 갖는다. 이 부위특이적 재조합은 파지 유전자 INT에 의해 특정되는 특정 인테그라제에 의해 촉매된다(VIROLOGY pp.56-57, Lippincott, 2nd ed., R. Dulbecco and H. Ginsberg, eds., Philadelphia, PA, 1985).
INT인 파지 벡터는 인테그라제가 예를 들면 INT+헬퍼 파지에 의해 trans에 공급되는 한 통상적인 방식으로 염색체에 통합될 수 있다(예를 들면 Borck et al. (1976) Molec. Gen. Genet. 146:199-207 참조).
att- 및 INT- 둘다인 파지 벡터도 마찬가지로 att+INT+헬퍼 파지를 사용하여 이중 용원균으로서 박테리아 염색체에 통합될 수 있다. 이중 용원균은 박테리아 부착부위에서의 프로파지 연결에 의해 형성되며 불완전 파지상 및 헬퍼 파지상의 상동 서열간의 일반 박테리아 재조합에 의해 염색체에 통합된다(예를 들면 Struhl et al. (1976) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73:1471-1475 참조). 마찬가지로, 플라스미드 벡터에 의해 지지된 상동 서열과 숙주 염색체간의 재조합에 의해 E. coli의 polA 균주의 게놈에 비복제 colE1 레플리콘을 통합시키는 것도 또한 가능하다(Greener and Hill (1980) J. Bacteriol. 144:312-321).
보다 최근에는 박테리아 숙주 염색체에의 외래유전자 통합을 위한 시스템이 구체적으로 설계되었다. 예를 들면 미국특허 5,395,763호(Weinberg et al.)는 이종 유전자의 발현을 위한 염색체 발현 벡터를 개시하고 있다. 이 벡터는 다카피수 플라스미드 중간체를 사용하여 형성되었는데, 여기에 관심있는 유전자를 클로닝시켜 유전자를 박테리오파지 미들 프로모터 Pm과 작동가능하게 연결시킨다. 불완전 Mu 게놈(파지 입자의 형성에 필요한 유전자가 결핍됨)으로 이루어지는 이 플라스미드 중간체를 패키징 균주에 도입하여 감염성 Mu 입자를 생성하고, 그 다음 이것을 사용하여 벡터를 숙주세포에 도입하여 벡터를 숙주세포 게놈에 통합시킨다. 이 벡터 시스템은 일단 숙주세포 게놈에 통합되면 증폭가능하지만, 증폭(복제 트랜스포지션)의 메카니즘은 통상적으로 필수 숙주세포 유전자에의 복제 프로파지 통합으로 인해 숙주세포에 대해 독성이다(Neidhardt et al., ESCHERICHIA COLI AND SALMONELLA TYPHIMURIUM: MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY(American Society for Microbiology, Neidhardt et al. eds., Washington, D.C., 1987). 이 통합된 프로파지의 증폭은 통상적으로 독성이기 때문에, 증폭된 통합 DNA를 포함하는 숙주세포 균주를 얻어 증식시키기가 매우 어렵다. 따라서 이것은 단백질 제조가 요구되는 각각의 경우에 유전자가 증폭될 것을 요구한다.
Diederich et al.((1992)New plasmid vectors for integration into the l attachment site attB of the Escherichia coli chromosome, Plasmid 28:14-24)은 또한 박테리아 숙주세포의 염색체상에 유전자를 도입하는 시스템을 개시하고 있다. 이 시스템은 파지 람다 부착부위를 통해 박테리아 염색체에 통합될 수 있는 다카피 플라스미드 벡터 세트를 이용한다. 관심있는 유전자에 작동가능하게 연결된 프로모터를 암호화하는 DNA 서열을 기재된 다카피수 플라스미드 벡터 중 하나에 클로닝시키고, 플라스미드의 복제기원을 제한효소에 의해 제거하고, 얻어지는 DNA를 재환상화하고 숙주세포에 전이시켜 거기서 그것을 염색체에 통합시킨다.
이들 새로운 유전자전이 시스템은 이전의 시스템과 동일한 결점이 있다. USP 5,395,763(Weinberg et al.)과 Diederich et al. 둘 다 관심있는 유전자를 전이 DNA 구성 동안 작동가능한 배치로 있는 동안 다카피수 플라스미드에 클로닝시킬 것을 요구한다. 이 다카피수 플라스미드의 배치는 불가능하지 않다면 독성 외래유전자의 발현을 어렵게 하는데 그 이유는 다카피수 플라스미드가 증식될 때 관심있는 독성 유전자가 발현되기 때문이다.
따라서 다량의 단백질을 생산할 수 있고 생산 균주의 구성 동안 숙주세포에 대한 이종 단백질의 어떤 독성 효과든 최소화하는 이종 단백질을 제조하는 방법이 요구되고 있다. 본 출원인들은 놀랍게도 실시예 2에 나타낸 바와 같이 이종 단백질을 암호화하는 유전자의 저(약 2)카피 발현으로부터 고단백질축적(총 세포단백질의 약 20%)을 증명하였다.
발명의 요약
본 발명은 숙주세포 염색체에 염색체 전이 DNA(환상의 비자기복제 DNA)를 통합시킴으로써 E. coli와 같은 박테리아 숙주세포내에서 이종 단백질을 제조하는 방법 및 조성물을 제공한다. 염색체 전이 DNA는 관심있는 이종 단백질을 암호화하는 유전자의 1이상의 카피로 이루어진다.
따라서, 본 발명은
통합된 DNA의 염색체 증폭이 용이하게 되도록 숙주세포의 염색체에, 관심있는 이종 단백질을 암호화하는 유전자의 적어도 1카피 및 선별 마커로 이루어지는 염색체 전이 DNA를 통합시키고;
관심있는 이종 단백질을 암호화하는 유전자로서, 전이 DNA 구성 동안 다카피수 플라스미드내의 숙주세포에서 기능적인 프로모터에 한번도 작동가능하게 연결되지 않은 유전자를 발현시키는 것으로 이루어지는 관심있는 이종 단백질의 제조방법을 제공하는데,
관심있는 이종 단백질은 총세포단백질의 적어도 0.1%의 레벨로 축적된다.
염색체 전이 DNA는 관심있는 이종 단백질을 암호화하는 유전자에 작동가능하게 연결된 프로모터를 임의로 포함할 수 있고, 작동가능한 연결은 염색체 전이 DNA의 환상화에 의해 형성된다.
임의로, 염색체 전이 DNA는 선별 마커 측면에 있는 중복 DNA를 더 포함할 수 있다. 중복 DNA는 프로모터에 작동가능하게 연결된 관심있는 이종 단백질을 암호화하는 유전자 카피로 임의로 이루어질 수 있다.
이종 단백질의 발현방법은 염색체 증폭을 위해 선별하는 단계를 임의로 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 다음의 제1 및 제2플라스미드 벡터, 즉
제1복제기원, 및 관심있는 이종 단백질을 암호화하는 제1유전자로서, 프로모터 및 중복 DNA의 제1카피에 작동가능하게 연결되지 않은 제1유전자로 이루어지는 제1플라스미드 벡터;
제2복제기원, 및 제1프로모터 및 중복 DNA의 제2카피로 이루어지는 제2플라스미드 벡터
로부터의 단편을 함께 라이게이션시키는 것으로 이루어지는 염색체 전이 DNA의 제조방법을 제공하는데,
복제기원 및 프로모터는 숙주세포에서 기능하고, 상기 제1플라스미드 또는 상기 제2플라스미드는 선별 마커를 포함한다.
임의로, 제1플라스미드는 관심있는 이종 단백질을 암호화하는 제1유전자에 작동가능하게 연결되지 않은 제2프로모터를 더 포함할 수 있고, 제2플라스미드는 제1프로모터에 작동가능하게 연결되지 않은 관심있는 이종 단백질을 암호화하는 유전자의 제2카피를 더 포함할 수 있다.
또한,
숙주세포에서 기능적인 프로모터에 작동가능하게 연결된 관심있는 비박테리아 유전자: 및
중복 DNA가 측면에 있는 선별 마커
로 이루어지는 관심있는 이종 단백질의 제조에 사용하기 위한 염색체 전이 DNA가 제공되는데,
이종 단백질을 암호화하는 상기 유전자는 전이 DNA의 구성동안 다카피수 플라스미드 벡터상의 숙주세포에서 기능적인 프로모터에 한번도 작동가능하게 연결되지 않는다.
임의로, 염색체 전이 DNA는 관심있는 비 박테리아 단백질을 암호화하는 유전자의 2이상의 카피를 더 포함할 수 있고, 이 유전자 카피는 선별 마커 측면에 있다.
본 발명은 박테리아내에서의 이종 유전자의 발현 분야에 관한 것이다.
도 1은 복제기원이 결핍되어 있고(따라서 자기복제할 수 없으며) 박테리아 염색체에의 외래 유전자 통합에 적합한 DNA서클인 염색체 전이 DNA의 시험관내 형성단계를 나타낸다. 염색체 전이 DNA가 형성될 때까지, 발현될 외래 유전자(여기서는 IGF-I 융합 유전자)가 기능적 박테리아 프로모터(여기서는 T7 프로모터)로부터 분리된다.
도 2는 2개의 DNA 단편의 라이게이션으로부터 형성된 염색체 전이 DNA를 나타낸다. 단편중 하나는 1993년 8월 2일 출원된 공동소유의 계류중인 미국특허출원번호 08/100,744에 논의된 바와 같이 E. coli DsbA를 암호화하는 서열, 효모 우비퀴틴(Met로 개시), 및 사람인슐린유사 성장인자 I(dsbA-ubi-IGF)(Met로 개시하지 않음)로 이루어지는 융합유전자를 함유한다. 다른 하나의 DNA 단편은 T7 프로모터를 함유한다. 염색체 전이 DNA와 박테리아 염색체 둘다 파지 람다 attP로부터의 재조합부위를 함유한다. 염색체 전이 DNA는 E. coli 균주 B1384로 형질전환되고, 이것은 trp 프로모터(P-trp)의 제어하에 인테그라제(INT)를 제조한다. 인테그라제는 att 부위에서 박테리아 염색체에의 염색체 전이 DNA의 부위특이적 통합을 촉매한다. trp 프로모터는 배지에 1mM 인돌아크릴산(IAA)을 가함으로써 형질전환 동안 도입될 수 있다. 통합된 염색체 전이 DNA 서열을 갖는 세포는 클로르암페니콜(CAM-r, 10Tg/ml)에 대해 저항성이다.
도 3은 도 2에 기재된 방법으로 얻어지는 B1384 염색체 인테그란트를 나타낸다. 통합은 여러가지 프라이머 세트(예를들면 UBUF×IGFR, 1243×T7REV 또는 TRPPF×1239)에 의한 PCR로 숙주 염색체 DNA를 증폭시키고, 증폭된 단편을 적당한 제한효소(각각 SacII, HinCII 또는 BamHI)로 분해하고 산물을 겔전기영동으로 사이징함으로써 확인될 수 있다.
도 4는 클로르암페니콜 저항성 W311ODE3 형질도입체의 전세포용해물의 웨스턴 블롯을 나타낸다. 또한 단백질 크기 마커(좌측 레인 멀리) 및 IGF 융합단백질(콘트롤)도 포함된다.
도 5는 카나마이신 저항성 형질도입체의 전세포용해물의 웨스턴 블롯을 나타낸다.
도 6-9는 염색체 전이 DNA의 구성을 위한 일반방법을 도식적으로 나타낸다. 도 6은 관심있는 이종 단백질을 암호화하는 유전자의 단일카피 및 염색체 전이 DNA의 통합 후 염색체 증폭을 용이하게 하는 선별 마커 측면에 있는 제2유전자의 2카피로 이루어지는 염색체 전이 DNA를 나타낸다. 도 7은 실시예 2 내지 6 및 실시예 8에서 이종 단백질 발현에 이용한 이중 카세트 시스템을 나타낸다. 염색체 전이 DNA의 이 구체예는 통합된 DNA의 염색체 증폭을 용이하게 하는 선별 마커 측면에 있는 관심있는 이종 단백질을 암호화하는 유전자의 2카피로 이루어진다. 도 8 및 9는 프로모터없는 염색체 전이 DNA의 대체 구체예를 나타낸다. 이들 구체예는 숙주세포 염색체의 세그먼트와 상동인 DNA 서열을 이용한다. 프로모터없는 염색체 전이 DNA의 통합은 숙주세포 프로모터와 관심있는 이종 단백질을 암호화하는 유전자간의 작동가능한 연결의 형성 및 선별 마커 측면에 있는 중복 DNA 서열의 형성을 초래한다.
도 10-13은 염색체 전이 DNA의 플라스미드 계통을 나타낸다.
도 14는 이중 카세트 시스템에 사용된 2가지 DNA공급원의 구성방법을 나타낸다.
도 15 및 16은 효모 우비퀴틴 가수분해효소 유전자의 통합 및 발현을 위한 염색체 전이 DNA를 구성하는데 사용된 방법을 나타낸다.
도 17은 DsbA::우비퀴틴::IGF-I 융합단백질을 암호화하는 유전자를 통합 및 발현시키는데 사용된 염색체 전이 DNA를 구성하는 방법을 나타낸다.
도 18은 DsbA::2A::IGFBP-3 융합단백질을 암호화하는 유전자를 통합 및 발현시키는데 사용된 염색체 전이 DNA를 구성하는 방법을 나타낸다.
도 19 및 20은 DsbA::2A::IGF-I(도 19) 및 DsbA::3C::IGF-I(도 20) 융합단백질을 암호화하는 유전자를 통합 및 발현시키는데 사용된 염색체 전이 DNA를 구성하는 방법을 나타낸다.
도 21은 DsbA::우비퀴틴::TGF-β2 융합단백질을 암호화하는 유전자를 통합 및 발현시키는데 사용된 염색체 전이 DNA를 구성하는 방법을 나타낸다.
도 22는 DsbA::3C::IGFBF-3 융합단백질을 암호화하는 유전자를 통합 및 발현시키는데 사용된 염색체 전이 DNA를 구성하는 방법을 나타낸다.
도 23은 IGF-I 융합단백질을 발현시키는 분리물의 전세포용해물의 쿠마시 블루 염색된 SDS-PAGE 겔을 나타낸다. c49222, c49258#46 및 c53063은 쉽게 눈에 보이는 DsbA::우비퀴틴::IGF-I 융합단백질(좌측 화살표)을 발현시킨다. 놀랍게도 이 높은 발현레벨은 증폭되지 않은 c49222 및 c49258#46에서 보인다(즉 통합된 DNA의 염색체 증폭을 위한 선별은 전혀 없었다). c57264#5 및 c57264#28은 DsbA::3C::IGF-I 융합단백질을 발현시키는 한편 c57265#44 및 c57265#54는 DsbA::2A::IGF-I 융합단백질을 발현시킨다. 역시, 발현된 융합단백질은 쉽게 눈에 보인다. 이 겔의 사진농도분석으로 모든 분리물은 단백질을 총세포단백질의 19%가 초과하게 축적시킴을 알 수 있다(평균 단백질축적률은 총세포단백질의 25.7%이다).
도 24는 c49222 및 c49258#46, c53063, c57264#5, c57264#28, c57265#44 및 c57265#54로부터 분리된 염색체 DNA의 서던 블롯을 나타낸다. 블롯은 IGF-I에 융합된 우비퀴틴을 암호화하는 DNA 단편으로 프로브되었다. 각 레인에서 고분자량 밴드는 각 분리물에서 통합된 IGF-I 융합단백질 유전자의 단일 카피를 나타낸다. 저분자량 밴드도 또한 IGF-I 융합단백질 유전자를 나타내나, 이 단편은 염색체 증폭에 의해 증폭될 수 있다. 분리물 c53063, c57264#5, c57264#28, c57265#44 및 c57265#54는 명백히 증폭되어 약 3 내지 5배의 증폭을 보였다.
도 25는 IGFBP-3 융합단백질을 암호화하는 통합된 유전자를 포함하는 분리물내의 단백질축적을 보여주는 쿠마시 블루 염색된 SDS-PAGE 겔을 나타낸다. A) DsbA::2A::IGFBP-3 융합단백질을 발현시키는 분리물내의 단백질축적을 보여준다. 우측 레인은 배양배지에 IPTG를 가하여 T7 RNA 폴리머라제를 도입한 후의 단백질 발현을 보여준다. B) DsbA::3C::IGFBP-3 융합단백질을 발현시키는 분리물내의 단백질축적을 보여준다. 도 23에서와 같이 융합단백질을 나타내는 밴드는 쉽게 눈에 보인다. 이들 겔의 사진농도 스캐닝으로 패널 A에서는 축적된 단백질이 22.6%이고, 패널 B에서의 2개의 분리물은 총세포단백질의 33% 및 28.2%가 축적됨을 알았다(각각 좌측에서 우측으로).
도 26은 DsbA::우비퀴틴::TGF-β2를 암호화하는 유전자를 발현시키는 숙주세포로부터의 단백질축적을 보여주는 쿠마시 블루 염색된 SDS-PAGE 겔을 나타낸다. M은 분자량 마커를 나타내고 C는 양성 콘트롤을 나타낸다. 2개의 플라스미드 레인(레인 1 및 2)을 표준으로 사용하여 다카피수 플라스미드 벡터로부터의 단백질축적을 염색체에 통합된 유전자로부터의 단백질축적과 비교한다. 레인 3 및 4는 파지 4107에 스트리킹되었을 때 T7 RNA 폴리머라제 활성에 대해 음성인 분리물의 전세포용해물이었다. 이 겔의 사진농도분석으로 플라스미드 균주가 단백질을 총세포단백질의 26.4%로 축적시켰음이 증명되었다. 분리물 48, 56, 59, 65 및 66에 대해 단백질축적을 측정한 바, 단백질축적률은 각각 36.7%, 33.3%, 32.1%, 29.5% 및 26.7%임을 알았다.
본 발명은 (a) 관심있는 이종 단백질을 암호화하는 유전자와 프로모터간의 작동가능한 연결로서, 염색체 전이 DNA의 구성 동안 형성되거나 또는 숙주세포 염색체에의 그것의 통합 결과 형성되는 연결의 형성 및 (b) 관심있는 통합된 유전자의 적당한 염색체 증폭을 위한 수단의 동시 형성에 있다.
바람직한 구체예에서, 염색체 전이 DNA의 형성은 (1) 프로모터와 관심있는 유전자의 작동가능한 연결 및 (2) 선별 마커(이것은 염색체 전이 DNA의 증폭을 용이하게 하는 수단으로서 기능할 수 있다) 측면에 있는 중복 DNA의 위치설정이라는 2가지 목적을 동시에 달성한다. 또 다른 구체예는 염색체 전이 DNA의 형성 동안 유전자와 프로모터 사이에 작동가능한 연결을 형성하는 한편, 염색체 증폭을 위한 수단(염색체 전이 DNA 측면에 있는 중복 DNA 서열)은 통합 결과 형성된다.
기타 방법은 염색체상의 적당한 부위에의 염색체 전이 DNA의 통합에 의한 이들 결과 중의 어느 하나 또는 둘 다를 달성할 수 있다. 예를 들면 박테리아 염색체상의 프로모터 부근의 관심있는 유전자의 통합은 작동가능한 연결을 초래하도록 설계될 수 있다(예를 들면 숙주세포 염색체상의 오페론에 염색체 전이 DNA를 통합시킴으로써). 통합 부위 또는 통합 부위에 인접한 서열은 증폭을 용이하게 할 수 있다(예를 들면 통합 부위가 전위가능 요소에 위치하는 경우에는 중복 DNA 서열을 제공함으로써, 또는 염색체 전이 DNA의 일부와 상동인 DNA 서열 부분을 제공하여 중복 DNA 서열을 제공함으로써라도).
본 발명은 숙주세포, 예를 들면 E. coli의 염색체에 이종 유전자 카피를 간단하고 효과적이며 신뢰성 있게 삽입하는 데 사용될 수 있는 염색체 전이 DNA를 사용한다. 염색체 전이 DNA는 관심있는 이종 단백질을 암호화하는 유전자의 1이상의 카피, 선별 마커(예를 들면, 항생물질 저항성 유전자), 재조합 부위(예를 들면, 숙주세포 염색체상의 세그먼트와 상동인 DNA 서열 또는 람다 attP 또는 attB와 같은 부위특이적 재조합 부위), 및 복제기원 또는 자기복제서열(ARS)이 결핍된, 숙주세포 염색체로의 재조합 후의 염색체 전이 DNA의 증폭을 용이하게 하기 위한 수단으로 이루어지는 환상 DNA이다. 따라서 염색체 전이 DNA는 숙주세포에 도입되었을 때는 독립적으로 복제할 수 없다. 염색체 전이 DNA는 관심있는 유전자에 작동가능하게 연결된 프로모터를 임의로 포함할 수 있다.
부위특이적 재조합 부위를 포함하는 염색체 전이 DNA가 제2의 유사 재조합 부위(예를 들면, 또 다른 attP 또는 attB 부위)를 함유하는 염색체를 갖는 숙주세포에 도입될 때, 재조합 부위의 부위특이적 재조합을 촉매할 수 있는 효소(예를 들면, 인테그라제)의 숙주세포내 발현은 재조합 부위에서 숙주세포 염색체에 벡터를 통합시키게 된다. 이 부위특이적 재조합 공정은 상동 벡터 및 숙주 염색체 서열에 작용하는 일반 재조합 시스템보다 훨씬 더 효과적이며, 특히 인테그라제 합성이 제어될 수 있을 때는 보다 큰 안정성을 갖는 통합 서열을 초래하게 된다. 인테그라제는 또한 염색체 전이 DNA가 도입될 때 숙주세포에 일시적 또는 안정적으로 존재하는 플라스미드 또는 다른 DNA 분자에 의해 제공될 수도 있다.
attP, attB 및 INT를 이용하는 바람직한 방법 이외에 숙주세포 염색체에 염색체 전이 DNA를 통합시킬 수 있는 방법이 여러 가지 있다는 것이 당업자게 명백할 것이다. 예를 들면 비복제 colE1 레플리콘, 전위가능 요소, 또는 숙주 염색체상에서 발견되는 서열과 상동인 서열을 포함하는 네이키드 DNA까지도 숙주 염색체에 염색체 전이 DNA를 삽입하는데 사용될 수 있다. 다카피 콜리신 플라스미드 ColE1, CloDF13, ColK, 및 ColA는 모두 cis- 및 trans-작용 요소를 포함하는 부위특이적 재조합 시스템으로 이루어진다. 본 발명에 사용하기 위해, 이들 플라스미드 중 하나로부터의 cis-작용 요소는 염색체 전이 DNA상에 포함될 수 있고 trans-작용 요소는 염색체 전이 DNA상에 있거나 숙주세포에 의해 제공될 수 있다. 삽입서열(IS)과 같은 트랜스포손 및 프랜스포손의 Tn3군이 숙주세포 염색체에 DNA를 통합시키는 데 사용될 수도 있다. 상기한 콜리신 플라스미드와 마찬가지로 cis-작용 트랜스포손 요소는 염색체 전이 DNA상에 포함되는 한편, trans-작용 인자는 염색체 전이 DNA상에 포함되거나 숙주세포에 의해 제공될 수 있다. 염색체 전이 DNA는 또한 숙주세포 염색체상에서 발견되는 서열과 상동인 DNA 서열을 포함하여 상동 재조합에 의해 염색체 전이 DNA의 통합을 용이하게 할 수 있다. 이들 방법 모두 본 발명의 범주에 든다.
이 접근법의 중요한 특징은 관심있는 이종 단백질을 암호화하는 유전자가 전이 DNA 구성 동안 한번도 다카피 벡터상의 기능적 프로모터에 작동가능하게 연결되지 않는다는 것이다. 외래유전자가 저카피수로 세포에 도입되기 직전까지 관심있는 유전자로부터 분리된 기능적 프로모터를 유지시킴으로써, 유전자 산물의 잠재적인 독성 또는 치사 효과가 최소화될 수 있다. 유전자가 프로모터에 작동가능하게 연결되지 않으면 독성 외래유전자는 다카피수 플라스미드로부터 발현되지 않을 것이다. 숙주세포 염색체에 관심있는 유전자를 통합시키는 다른 방법은 프로모터에 작동가능하게 연결된 관심있는 유전자를 포함하는 다카피수 플라스미드를 이용한다(예를 들면, Diederich et al. 및 Weinberg et al.). 이들 유전자는 플라스미드 증식 동안 발현되어, 불가능하지 않다면, 관심있는 유전자가 플라스미드가 증식하는 숙주세포에 대해 독성이면 충분한 양의 플라스미드를 재조하는 것을 극히 어렵게 할 것이다.
관심있는 이종 단백질을 암호화하는 유전자와 프로모터간의 작동가능한 연결은 염색체 전이 DNA의 형성 결과 또는 숙주세포 염색체에의 통합 결과 형성될 수 있다. 작동가능한 연결이 염색체 전이 DNA의 형성 결과 형성되는 경우에는 연결이 염색체 전이 DNA의 환상화에 의해 형성된다. 환상화는 예를 들면 환상 DNA를 형성하는 하나 이상의 DNA 단편의 라이게이션에 의해 또는 삽입체의 환상화를 초래할 환상 DNA로의 상동 재조합에 의해 실행될 수 있다. 바람직하게는 환상화는 하나 이상의 DNA 단편의 라이게이션에 의해 실행된다.
대안으로, 저독성 유전자의 고레벨 발현은 다중통합에 의해 또는 통합된 유전자의 증폭을 위한 선별에 의해 실행될 수도 있다.
재조합 DNA법 및 시약
본 특허청구된 발명의 실시에 유용한 핵산 조작을 위한 일반기법은 예를들면(Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Vols. 1-3 (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2 ed., (1989); 또는 F. Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Green Publishing and Wiley-Interscience: New York, 1987) 및 정기적인 최신정보지에 일반적으로 기재되어 있다. 제한효소, T7 RNA 폴리머제, DNA 리가제 등과 같은 핵산 조작에 유용한 시약은 New England BioLabs, Boerhinger Mannheim, Amersham, Promega Biotec, U.S. Biochemicals, 및 New England Nuclear와 같은 판매자로부터 시중구입가능하다.
정의
외래 또는 이종 또는 비박테리아; 천연 또는 상동 외래 또는 이종 폴리펩티드는 특정 종의 숙주세포에서는 통상적으로 발견되지 않는 폴리펩티드이다. 그러한 폴리펩티드를 암호화하는 핵산도 또한 외래 또는 이종 이라고 한다. 예를들면 인슐린유사 성장인자(IGF), 인슐린유사 성장인자 결합 단백질(IGFBP) 및 형질전환 성장인자-베타(TGF-β)는 포유류세포에서 자연적으로 생기고 사람 리노바이러스 3C 프로테아제는 바이러스 및 바이러스 감염된 포유류세포에서 자연적으로 생기나, 이들 단백질은 E. coli에 대해서는 외래적 또는 이종이다. 비박테리아 단백질은 박테리아세포에서 자연적으로 발견되지 않는 단백질 또는 폴리펩티드이다. 비박테리아 단백질로는 바이러스 및 진핵 단백질을 들 수 있다. 비박테리아, 외래 또는 이종 단백질은 또한 비박테리아, 외래 또는 이종 단백질과 기타 단백질 또는 폴리펩티드간의 융합체일 수도 있다. 본 발명에 포함된 구체예에 대해서는 이종 단백질 및 비박테리아 단백질 둘 다 발현될 수 있다. 본 명세서에 개시된 바와같이, 관심있는 이종 또는 비박테리아 단백질을 암호화하는 유전자는 숙주세포에서 기능적인 프로모터를 함유하지 않는다. 유전자는 발현되기 위해서는 숙주세포에서 기능적인 독립된 프로모터에 연결되어야 한다. 대조적으로 천연 또는 상동 폴리펩티드 또는 DNA 서열은 숙주세포에서 통상적으로 발견된다. 예를들면 유전자의 전사 또는 번역을 행하는 프로모터 또는 기타 서열도 또한 숙주세포에서 기능적이지 않다면 상동인 것으로 간주된다. 예를 들면, T7 RNA 폴리머라제가 세포에 존재하면 T7 프로모터는 그것이 작동가능하게 연결되는 폴리펩티드 암호화 서열의 전사를 수행할 수 있으므로 T7 프로모터는 E. coli 숙주세포와 상동인 것으로 간주된다.
이종, 외래 또는 비박테리아 단백질을 암호화하는 유전자
이종, 외래 또는 비박테리아 단백질을 암호화하는 유전자는 숙주세포에서 기능적인 프로모터를 제외한, 이종, 외래 또는 비박테리아 단백질의 발현에 필요한 모든 유전요소를 함유한다. 이들 유전자는 숙주세포에서 자연적으로 생기는 유전요소를 포함할 수 있는 재조합 유전자를 포함한다. 또한 이들 유전자의 코팅영역은 임의로 숙주세포의 코돈 용례를 위해 최적화될 수 있다.
암호화한다 핵산은 그 본래의 상태에서 또는 재조합 DNA법에 의해 조작될 때 전사 및/또는 번역되어 폴리펩티드를 생성할 수 있으면 폴리펩티드를 암호화한다고 말해진다.
작동가능하게 연결 핵산서열은 또 다른 핵산서열과 서로 기능적인 관계로 놓일 때 작동가능하게 연결된다. 예를 들면 프로모터가 코딩서열의 전사 또는 발현에 영향을 미치면 프로모터는 코딩서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로 작동가능하게 연결되는 DNA 서열은 인접해 있고 필요한 경우 리딩 프레임내에 있다.
재조합 재조합 핵산은 시험관내에서 핵산서열의 다른 방식으로 분리된 2개의 세그먼트를 결합시킴으로써 또는 화학합성에 의해 제조되는 것이다.
염색체 증폭 염색체 증폭이란 숙주염색체상의 DNA 서열의 카피수 증가를 말한다. 염색체 증폭은 다카피수 플라스미드와 같은 염색체외 증폭 또는 폴리펩티드제 연쇄반응(PCR)과 같은 시험관내 증폭을 말하지는 않는다.
프로브 및 프라이머
핵산 프로브 및 프라이머는 일반적으로 단일가닥의 분리된 핵산이며, 특히 프로브의 경우에는 전형적으로 표지 또는 리포터 분자에 부착된다. 프로브는 예를들면 조직 또는 기타 샘플내의 하이브리드화 핵사서열 또는 라이브러리내의 cDNA 또는 게놈 클론의 존재를 동정하는데 사용된다. 프라이머는 예를 들면, 예컨대 폴리머라제 연쇄반응(PCR)에 의한 핵산서열의 증폭에 사용된다. 프로브 및 프라이머의 제조법 및 사용은 예를들면 Sambrook et al., 상기 또는 Ausubel et al., 상기에 기재되어 있다.
핵산의 화학합성
핵산, 특히 증폭 프라이머와 같은 짧은 핵산은 화학합성, 예를들면 Beaucage and Carruthers (1981) Tetra. Letts. 22:1859-1862에 기재된 포스포르아미디트법 또는 Matteucci et al.(1981) J. Amer. Chem. Soc. 103:3185에 따른 트리에스테르법으로 제조될 수 있고, 자동 올리고뉴클레오티드 합성기상에서 수행될 수 있다. 이중가닥 단편은 적당한 조건하에 상보적 가닥을 합성하고 그 가닥을 함께 어닐링시키거나 또는 적당한 프라이머 서열을 갖는 DNA 폴리머라제를 사용하여 상보적 DNA를 가함으로써 화학합성의 단일가닥 산물로부터 얻어질 수 있다.
염색체 전이 DNA 및 이것의 구성에 사용된 플라스미드의 특징
염색체 전이 DNA는 선별 마커를 암호화하는 DNA 단편 및 원하는 이종 폴리펩티드를 암호화하는 서열로 이루어진다. 임의로, 염색체 전이 DNA는 또한 원하는 이종 폴리펩티드를 암호화하는 서열에 대한 작동가능한 연결로 전사 및 번역개시 조절서열 및 발현제어서열을 포함할 수 있고, 이것은 적당한 곳에서 프로모터, 인핸서 그리고 리보솜결합부위 및 mRNA 안정화 서열과 같은 필요한 처리정보부위뿐만 아니라 어떤 필요한 분비신호를 포함할 수 있고, 적당한 곳에서 이것은 단백질을 세포막에서 교차 및/또는 충전시켜 그것의 기능적 형태를 얻거나 또는 세포로부터 분비될 수 있다.
염색체 전이 DNA의 구성에 사용되는 플라스미드는 또한 전형적으로 복제기원 또는 자기복제서열(ARS)을 포함하여 숙주가 인식하는 복제시스템으로 이루어지게 된다. 염색체 전이 DNA의 구성에 사용되는 플라스미드가 중복 DNA 서열을 포함하는 경우에는 플라스미드를 rec-숙주세포내에서 증식시킬 수 있다. 바람직하게는 rec-숙주세포는 염색체 전이 DNA를 형성하는데 사용되는 플라스미드 및 염색체 전이 DNA의 성분을 포함하는 플라스미드의 증식에 사용되고, 이들 플라스미드가 중복 DNA 서열을 포함하는 경우에는 일반적으로 염색체 전이 DNA의 통합을 위한 숙주세포로서 이용되지 않는다.
염색체 전이 DNA는 본 기술분야에 잘 알려진 표준 재조합법에 의해 그러한 벡터로부터 제조될 수 있고, 예를들면 Sambrook et al., 상기 또는 Ausubel et al., 상기에 논의되어 있다.
효과적인 전사 및/또는 번역에 필요한 적당한 프로모터 및 기타 서열은 숙주세포에서 기능적이도록 선택된다. 세포주 및 발현벡터의 작업가능한 조합의 예는 Sambrook et al., 상기 또는 Ausubel et al., 상기에 기재되어 있다. 또한 예를들면 Metzger et al., (1988) Nature 334: 31-36도 참조. trp, lac 및 파지 프로모터(예를들면 T7, T3, SP6), tRNA 프로모터 및 글리콜분해효소 프로모터와 같은 프로모터는 원핵 숙주에 유용하다. 유용한 효모 프로모터는 메탈로티오네인, 3-포스포글리세레이트 키나제, 또는 에놀라제 또는 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소, 말토스 및 칼락토스 이용의 원인이 되는 효소등과 같은 기타 글리콜분해효소에 대한 프로모터영역을 포함한다. 예를 들면 Hitzeman et al. EP 73,657A 참조. 적당한 포유류 프로모터는 SV40으로부터의 초기 및 말기 프로모터(Fiers et al. (1978) Nature 273:113) 또는 쥐과 Moloney 백혈병바이러스, 마우스 유방종양 바이러스, 조류 육종 바이러스, 아데노바이러스 II, 소 유두종 바이러스 또는 폴리오마 바이러스로부터 유래된 프로모터를 포함한다. 게다가 구조체는 원하는 경우 유전자의 다카피가 제조될 수 있도록 증폭가능 유전자(예를들면 DHFR)에 결합될 수 있다. 적당한 진핵 인핸서 및 기타 발현제어서열에 대해서는 예를들면 ENHANCERS AND EUKARYOTIC GENE EXPRESSION(Cold Spring Harbor Press, New York, 1983)을 참조한다.
숙주의 염색체에 통합되었을 때 이종 유전자의 발현을 수행하는 프로모터는 제어가능한 것이 바람직하다.
염색체 전이 DNA 및 이것의 구성에 사용되는 플라스미드는 일반적으로 염색체 전이 DNA 또는 플라스미드로 형질전환된 숙주세포의 생존 또는 성장에 필요한 단백질을 암호화하는 유전자인 선별 마커로 이루어진다. 전형적 선별 마커는 (a) 항생물질 또는 다른 독성물질, 예를들면, 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 등에 대한 저항성을 부여하거나; (b) 영양요구성 결핍을 보안하거나; (c) 복합배지, 예를들면 Bacilli에 대한 D-알라닌 라세마제를 암호화하는 유전자로부터 얻을 수 없는 중요한 영양물을 공급한다. 적당한 선별 마커의 선택은 숙주세포에 좌우된다.
본 발명의 염색체 전이 DNA는 파지 람다 attP 부위와 같은 부위특이적 재조합 부위를 함유할 수 있다. 효소 인테그라제를 제조하는 박테리아 숙주균주(E. coli B1384와 같은)로 형질전환될 때 인테그라제는 염색체 전이 DNA상의 attP 부위를 인식하고 attP 부위와 그것의 조합을 촉매한다(인테그라제는 2개의 attP 및 attB 또는 2개의 attP 부위간의 재조합을 촉매할 수 있다). 통합된 DNA를 포함하는 박테리아 숙주세포는 통합된 DNA상에 포함된 선별 마커를 기준으로 하여 선별된다.
따라서 부위특이적 재조합을 이용하는 통합은 일반적으로 염색체 전이 DNA 및 박테리아 염색체상의 효소가 인식하는 부위의 존재 및 부위특이적 재조합을 촉매할 수 있는 인테그라제와 같은 효소의 발현을 포함한다. 인테그라제 또는 유사효소와 인테그라제가 특이적으로 인식하는 부위를 특징으로 하는 다른 부위특이적 재조합 시스템도 물론 사용될 수 있다.
다카피로 숙주세포 염색체에 통합된 외래 유전자의 고레벨 발현은 또한 예를들면 숙주세포 염색체에 다중 att 부위를 혼입하고 숙주세포에 다중 염색체 전이 DNA를 도입함으로써 가능하다. 부가적 또는 선택적으로, 통합된 DNA의 다카피를 함유하는 숙주세포는 염색체증폭을 위해 선별함으로써 얻어질 수 있다. 염색체 증폭은 선별 마커 측면에 중복 DNA 서열이 있을때 용이하게 된다. 바람직하게는 중복 DNA 서열은 제1 및 제2선별 마커 측면에 있다. 제1선별 마커는 저카피수에서 유효하며 염색체 전이 DNA의 통합을 위해 선별하는데 사용될 수 있다. 제2선별 마커는 바람직하게는 고카피수에서만 유효하다. 제1선별 마커를 사용한 통합을 위한 선별 후, 제2선별 마커를 사용하여 통합된 DNA의 다카피를 함유하는 숙주세포를 위해 선별하는데 사용된다.
본 발명의 염색체 전이 시스템의 중요한 특징은 이종 단백질을 암호화하는 유전자가 통합전에는 발현되지 않는다는 것이다. 그것은 (a) 전이 DNA가 시험관내에서 구성되거나 (b) 염색체 전이 DNA가 숙주세포 염색체에 통합될 때까지는 프로모터에 작동가능하게 연결되지 않는다. 이 접근법은 염색체 전이 DNA을 구성하는 데 DNA 공급원으로서 고카피수 플라스미드를 사용할 수 있게 한다. 독성 이종 단백질을 포함하는 고카피수 플라스미드는 독성 유전자가 프로모터에 작동가능하게 연결될때는 종종 증식시키기가 어렵다. 저카피수 플라스미드는 실험실에서 작업하기가 더 어렵다. 예를들면 DNA 미니프렙은 시험관내 조작에 부적당한 DNA를 제조할 수 있다. 염색체 전이 DNA는 선별된 DNA 단편의 환상화에 의해 하나 이상의 DNA 공급원으로 부터 구성된다.
염색체 전이 DNA를 구성하는 데 단일 DNA가 사용될 때는 관심있는 이종 단백질을 암호화하는 유전자와 프로모터 둘다 동일 DNA상에 위치되지만 유전자와 프로모터는 작동가능하게 연결되지 않는다. 이것은 예를들면 (터미네이터 서열을 포함시킴으로써) 어떤 작동가능한 연결을 차단하는 스페이서 DNA 서열의 어느 한 측면상에 관심있는 유전자 및 프로모터를 위치시킴으로써 달성된다. 바람직하게는 이 개재 DNA 서열은 또한 복제기원 또는 ARS와 같은 염색체 전이 DNA의 형성을 위해서는 제거되어야 하는 DNA 공급원의 어떤 부분을 포함한다. 염색체 전이 DNA는 유전자와 프로모터간의 작동가능한 연결을 차단하는 DNA 서열을 결실시킨 다음 나머지 DNA를 환상화함으로써 구성된다.
도 7, 8 및 9에 도시된 바와같이 염색체 전이 DNA는 미국특허 5,459,051호에 기재된 바와같이 E. coli 시클로필린의 발현을 위한 DNA 서열을 임의로 포함할 수 있다.
2개 이상의 DNA 공급원을 사용하여 염색체 전이 DNA를 구성할 수 있는 몇가지 방법이 있다. 도 7에 도시된 한 바람직한 구체예에서도 2개의 DNA 공급원을 사용한다. 이 구체예에서 2개의 DNA 공급원은 각각 관심있는 이종 단백질을 암호화하는 유전자 카피 및 프로모터를 포함하지만, 관심있는 유전자를 암호화하는 유전자 및 프로모터는 어느 DNA 공급원에도 작동가능하게 연결되지 않는다. 앞서 기재한 구체예와 마찬가지로 다른 필요 서열이 어느 한 DNA 공급원에 포함될 수도 있다(이 대신 다른 필요 서열이 하나 이상의 액세서리 DNA 공급원에 의해 제공될 수도 있다). 2개의 DNA 공급원을 절단한 다음 서로 결합시켜 환상 염색체 전이 DNA를 형성하는데, 이것은 프로모터 카피에 각각 작동가능하게 연결된 외래 유전자 2카피를 갖는다. 제1 DNA 공급원으로부터의 프로모터는 제2 DNA 공급원으로부터의 관심있는 이종 단백질을 암호화하는 유전자에 작동가능하게 연결되고, 제2 DNA공급원으로부터의 프로모터는 제1 DNA공급원으로부터의 관심있는 이종 단백질을 암호화하는 유전자에 작동가능하게 연결된다.
염색체 전이 DNA는 또한 프로모터 없이 설계될 수도 있다(도 8 및 9). 이들 프로모터없는 염색체 전이 DNA는 관심있는 이종 단백질을 암호화하는 유전자를 숙주세포 염색체상의 프로모터와 작동가능하게 연결시키는 박테리아 염색체상의 표적부위에 통합된다. 이 구체예의 염색체 전이 DNA는 선별 마커 및 숙주세포 염색체상의 DNA와 상동인 표적부위 DNA의 세그먼트에 프레임내 연결된 관심있는 이종 단백질를 암호화하는 유전자 카피를 포함한다. 이 표적부위 DNA서열은 전형적으로 프로모터 하류의 박테리아 염색체상에 위치한 유전자의 5' 말단일 것이다. 숙주세포 염색체에의 염색체 전이 DNA 통합은 관심있는 이종 단백질을 암호화하는 유전자를 박테리아 프로모터와 작동가능하게 연결시키게 된다. 숙주세포 염색체상의 표적서열은 자연발생서열일 수도 있고, 숙주세포의 염색체에 도입되는 부위일 수도 있다. 표적은 염색체 전이 DNA의 통합에 대해 상술한 바와 같이 숙주세포 염색체의 세그먼트와 상동인 DNA서열을 이용하여 숙주세포의 염색체에 도입될 수 있다. 표적부위는 또한 상기한 attB/attP/INT 시스템과 같은 부위특이적 재조합을 사용하여 도입될 수도 있다. 표적부위서열은 적어도 약 10염기길이, 바람직하게는 적어도 약 30염기길이, 가장 바람직하게는 적어도 약 100염기길이이다. 염색체 전이 DNA상의 DNA서열과 표적부위는 적어도 약 80% 상동이고, 바람직하게는 적어도 약 90%상동이며, 가장 바람직하게는 적어도 약 95% 상동이다. 표적부위는 바람직하게는 숙주세포 염색체에서는 드물며, 보다 바람직하게는 숙주세포 염색체에는 좀처럼 없다. 숙주세포 염색체상의 세그먼트와 상동인 서열을 사용한 염색체 전이 DNA의 통합은 통합된 DNA의 측면에 있는 중복 DNA서열을 위치시킴으로써 통합된 DNA의 증폭을 용이하게 한다(도 8 및 도 9 참조).
숙주세포에의 DNA 도입
전기영동 ; 염화칼슘, 염화로비듐 인산칼슘; DEAE-덱스트란 또는 다른 물질을 사용하는 트랜스펙션; 마이크로사출 충격; 리포펙션; 및 감염(벡터가 레트로바이러스 게놈과 같은 감염제인 경우)을 한정없이 포함하여 숙주세포에 핵산을 도입하는 여러 가지 방법이 본 기술분야에 알려져 있다. 일반적으로 Sambrook et al., 상기 및 Ausubel et al., 상기 참조.
숙주세포
ａＰＬ 면역반응성 펩티드, 그것의 콘주게이트 및 ａＰＬ항체-매개병변의 치료방법본 발명의 방법은 바람직하게는 원핵 숙주세포와 함께 사용되지만 진핵 숙주세c포에도 또한 적용가능할 것이다. 원핵 숙주가운데 그램양성 박테리아, 특히 Escherichia coli가 바람직하다. Bacillus subtilis 또는 Pseudomonas와 같은 다른 원핵생물도 또한 사용될 수 있다.
효모, 사상 균류, 식물, 곤충, 양서동물, 조류와 같은 포유류 또는 다른 진핵 숙주세포도 또한 사용될 수 있다. TISSUE CULTURE(Kruse and Patterson ed., Academic Press, 1973)참조. 유용한 포유류 숙주로는 VERO 및 HeLa 세포, 중국산 햄스터 난소(CHO)세포 및 W138, BHK 및 COS세포주를 들 수 있으나 이것에 한정되지 않는다.
통합된 DNA의 증폭
통합된 유전자의 증폭은 몇가지 방법중 어느 것, 예를 들면 염색체 중복 또는 복제 트랜스포지션에 의해 효과적으로 실행될 수 있다. 25이상의 염기쌍의 중복 DNA서열이 측면에 있거나 또는 이것을 함유하는 통합된 DNA는 염색체 중복체를 형성하게 된다(Normark et al.(1977) J.Bacteriol. 132: 912-922; Edland et al.(1979) Mol. Gen. Genet. 173:115-125; Tlsty et al.(1984) Cell 37:217-224; Stern et al.(1984) Cell 37:1015-1026). 중복(증폭)의 선별이 중복 DNA가 숙주세포 결핍을 보완하는 항생물질 저항성 유전자 또는 유전자들과 같은 선별 마커를 함유하면 중복(증폭)의 선별이 크게 용이하게 된다. 바람직하게도 통합된 DNA는 저카피수에서 작동가능하고 인테그란트를 선별하는데 사용되는 제1선별 마커, 및 고카피수를 요구하고 통합된 DNA를 증폭시킨 숙주세포를 선별하는데 사용되는 제2선별 마커 등 2개의 선별 마커를 포함한다. 또한 염색체 전이 DNA가 적당한 트란스포손 서열을 함유하거나 염색체 전이 DNA가 트란스포손에 통합되는 경우에는 증폭이 복제 트랜스포지션에 의해 실행될 수도 있다. 바람직하게는 증폭은 염색체 중복을 위한 선별에 의해 실행된다.
비박테리아 단백질의 제조
숙주세포 염색체에 염색체 전이 DNA를 통합시키고, 임의로 통합된 DNA를 증폭시킨 후, 외래유전자를 발현시켜 관심있는 비박테리아 단백질을 제조할 수 있다. 유전자산물의 어떤 독성효과든 최소화될 수 있도록, 통합된 유전자의 발현은 제어가능(즉 유도가능)한 것이 바람직하다. 외래 유전자의 발현 후에는 단백질 산물을 정제할 수 있다. 당업자에게 명백해지는 바와 같이, 사용되는 정제방법은 외래단백질의 동일성에 좌우될 것이다.
본 발명은 다음 실시예를 참고하면 더 잘 이해될 것이며, 이 실시예는 단지 본 발명을 예시하고자 하는 것이다. 본 발명의 범주가 이것에 한정되는 것으로 간주되지는 않는다.
실시예1
E. coli 균주 B1384의 염색체에의 외래유전자로 이루어지는 염색체 전이 DNA의 통합
E. coli의 염색체에 외래 유전자로 이루어지는 염색체 전이 DNA를 통합시키는 일반방법이 도1에 도식적으로 묘사되어 있다. 2개의 플라스미드를 구성하였다. pDM25432는 작동가능하게 연결된 박테리아 프로모터가 결핍된 관심있는 외래유전자(이 실시예에서는 IGF-I 융합유전자)를 함유하였고, pDM25423은 T7프로모터를 함유하였다. 이들 벡터 각각으로부터 정제된 제한단편은 라이게이션시킴으로써, 복제기원이 결핍된 DNA 서클--염색체 전이 DNA--를 생성하였다. 이 염색체 전이 DNA는 클로르암페니콜(CAM-r)에 대한 저항성을 부여하는 항생물질 저항성 유전자 및 파지람다 attP로부터의 부위특이적 재조합 부위를 함유하였다. 이 염색체 전이 DNA를 E. coli B1384와 같은 박테리아 균주로 형질전환시키는데(Mascarenhas et al. (1983) Virology 124:100-108)(도 2), 이것은 trp 프로모터의 제어하에 효소 인테그라제(INT)를 제조하고, 이것은 배지에 1mM 인돌아크릴산(IAA)을 가함으로써 형질전환 동안 도입될 수 있다. 또한 B1384는 그것의 염색체에 attP를 함유한다. 인테그라제는 염색체 전이 DNA상의 그리고 B1384의 염색체내의 attP 부위를 인식하고 이들의 재조합을 촉매하여, attP 부위에서 박테리아 염색체에 염색체 전이 DNA를 부위특이적으로 통합시키게 된다(Weisberg et al. Comprehensive Virology, vol.8, pp.197-258 (Plenum, Fraenckel-Conrat and Wagner, eds., New York, NY, 1977). 통합된 DNA를 포함하는 박테리아 숙주세포를 클로르암페니콜에 대한 그것의 저항성을 기준으로 하여 선별한다.
클로르암페니콜 저항성 염색체 인테그란트를 도3에 요약된 바와 같이 시험하였다. 통합된 염색체 전이 DNA의 존재는 이하의 프라이머 세트(예를 들면 UBUF X IGFR, 1243 X T7REV 또는 TRPPF X 1239)에 의한 PCR로 숙주 염색체 DNA를 증폭시킴으로써 확인하였다.
증폭된 단편을 적당한 제한효소(각각 SacII, HinCII 또는 BamHI)로 분해시켰다. 생성물을 아가로스겔 전기영동으로 사이징하였다. 통합된 서열의 존재를 다음의 증폭으로 증명하였다.
● 적절한 외래유전자의 존재를 증명하는 염색체 우비퀴틴 및 IGF서열;
● T7 프로모터 및 융합유전자의 병렬을 증명하는 염색체 tet 및 T7서열 ; 및
● 예상 위치의 염색체 전이 DNA 삽입을 증명하는 인접 염색체 trp 및 tet 서열.
염색체 전이 DNA의 염색체 통합을 또한 다음 증거로 확인하였다.
● 클로르암페니콜에 대한 박테리아 숙주의 저항성;
● DNA 미니프렙의 플라스미드 DNA 부재;
● 모 플라스미드의 부재를 확증하는 베타-락타마제 효소활성의 결핍(베타락 타마제는 ENZYME INHIBITORs pp.169-179(Verlage Chemie, Broderick, V., ed.)에 기재된 바와 같이 색원 기질인 7-티에닐-2-아세트아미도-3-2-4-n,n- 디메틸아미노페닐아조피라디늄메틸-3-세펨-4-카르복실산(PADAC)를 사용하여 분석하였다); 및
● 분리분석 : 분리물은 1mM IAA가 있거나 없는 L 육즙에서 37℃에서 하룻밤 성장시키고 LB 한천 플레이트상에 플레이팅하였다. 각 배양물로부터의 단일 콜로니를 클로르암페니콜 저항성 보유율에 대해 시험하였다. IAA없는 배지에 서는 보유율 100%가 관찰되었고, IAA가 있는 배지에서는 보유율 11%가 관찰 되었다.
시험한 7개 분리물 중 6개는 예상된 표현형을 나타내었다.
B1384는 T7 RNA 폴리머라제 유전자를 함유하지 않는다. 염색체 구조체의 발현을 시험하기 위해, P1용해물을 통합된 DNA를 포함하는 6개 균주 각각에서 제조하고 균주 W3110DE3을 클로르암페니콜 저항성으로 형질도입시켰다. (A SHORT COURSE IN BACTERIAL GENETICS:A LABORATORY MANUAL AND HANDBOOK FOR ESCHERICHIA COLI AND RELATED BACTERIA(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Miller, J.H., ed., 1992)) 균주 W311ODE3은 lac프로모터 제어하의 T7 RNA 폴리머라제유전자를 포함한다. 그것은 또한 B1384와 달리 Gal+이다. 따라서 형질도입체를 20Tg/ml의 클로르암페니콜을 함유하는 갈락토스 최소배지상에서 선별하였다. 각 형질도입실험으로부터의 단일 콜로니(독립된 도너)를 정제하여 더 시험하였다.
● 얻어진 결과는 6개의 모든 독립된 경우에서 동일하였다. 즉 염색체 전이 DNA가 박테리아 염색체상의 새로운 위치, 즉 W311ODE3내의 프로파지 측면에 있는 att 부위로 고효율로 전이되었다. 이것은 다음에 의해 확인되었다.
● 클로르암페니콜 저항성;
● DNA 미니프렙내의 플라스미드 DNA 부재;
● i21 면역성(DE3 용원균 ; 파지 용해물을 표준방법에 의해 박테리아 론 (lawn)상에 플레이팅하였다);
○ gal+(즉 갈락토스 최소플레이트상의 성장);
○ lac 제어하의 IGF 단백질 발현(발현 및 분석은 실시예 1 또는 1993년 8월 2일 출원된 공동소유의 계류중인 미국특허 출원일련번호 08/101,506에 기재 된 바와 같이 수행하였다.
6개 균주로부터의 염색체 DNA(인테그란트)를 BalII 및 NcoI로 종료되기 까지 분해시키고 분해된 DNA를 성숙한 DsbA를 암호화하는 전체 유전자 서열을 커버하는 표지된 0.6 kb DsbA DNA로 프로브하였다(Bardwell et al.(1991) Cell 67:581-589; 또한 Kamitani et al. (1992) EMBO J 11:57-62도 참조). 6개의 인테그란트는 각각 삽입체를 함유하였다. 블롯은 몇 개의 이중 삽입체, 1개의 단일 삽입체 및 1개의 (분리물 WB3-6) 명백한 중복 이중(즉 삼중) 삽입체의 존재를 증명하였다.
이 6개의 인테그란트를 이소프로필-J-티오갈락토피라노시드(IPTG)와 함께 도입 후 IGF 융합 단백질의 발현에 대해 시험하였다. 세포를 2시간 동안 IPTG와 함께 도입하고 도입된 인테그란트는 물론 크기 마커 및 IGF 융합단백질 콘트롤에 대한 전세포추출물을 12% SDS-PAGE로 분리하고 웨스턴 블로팅하고 다클론성 항-IGF혈청과 반응시켰다(1993년 8월 2일 출원된 공동소유의 계류중인 미국특허출원일련번호 08/101,506의 실시예1 참조)(도 4). 분리물 WB3-6(도 4, 레인 6)은 가장 높은 레벨의 IGF 융합 단백질 발현을 나타내었다. 동일 크기의 도입된 밴드도 또한 쿠마시 블루 염색된 겔상에서 보였다.
상이한 바이너리 시스템을 사용하여 카나마이신 저항성 마커를 포함하는 염색체 전이 DNA를 생성하였다. 사용한 플라스미드 pDM25424 및 pDM25427은 도면에 기재되어 있다. 삽입체의 배치 및 위치를 PCR로 확인하여, 상기한 것과 실질적으로 동일하였던 결과를 얻었다. W311ODE3으로의 형질도입 후, 웨스턴 블로팅에 의해 쉽게 검출될 수 없는 레벨로 IGF 융합 단백질을 발현시키는 몇 개의 개별적인 분리물을 얻었다(도 5). 사용된 방법은 항생물질 및 저항성 유전자가 클로르암페니콜 대신 카나마이신이었던 것 외에는 클로르암페니콜 저항성 분리물에 대해 상술한 것과 동일하였다. 정제된 융합 단백질이 콘트롤이었다. 레인1 및 2는 2개의 형질도입된 분리물로부터의 전세포용해물을 함유한다.
이 2개의 바이너리 시스템에 사용한 벡터의 구성을 도 10-13에 요약한다. 사용된 플라스미드 공급원은 pBR322, pUC18, pUC19, pKK233-2, ptRC99A, pCH110, 및 pNEO(Pharmacia, Piscataway, NJ); pLG339HLY(Dr, Barry Holland, Institute de Genetiques et Microbiologie, Universite Paris-Sud); pRcCMV(Invitrogen, San Diego, CA); pACYC177 및 pACYC184(New England BioLabs, Beverly, MA); pET3b(Studier and Moffat(1986)J.Mol. Biol. 189:113-130); pYZ22070(1992년 8월 2일 출원된 공동소유의 계류중인 미국특허출원일련번호 08/101,744의 실시예1에 기재됨)이었다.
E. coli K-12 균주 W3110은 B. Bachmann, ECGSC, 예일대학에서 얻었다. 그것을 Studier and Moffat (1986) J. Mol, Biol. 198:113-130에 기재된 바와 같이 DE3결핍 파지로 용원화하였다. W3110DE3은 하나의 그러한 용원균이었다. 시클로필린 유전자는 프라이머 CYCF1 및 CYCR1을 사용하여 W3110으로부터 플리머라제연쇄반응(PCR)으로 증폭되었다(상기참조).
실시예2
DsbA::우비퀴틴::IGF-I 융합 유전자의 염색체 발현
DsbA::우비퀴틴::IGF-I 융합유전자를 조립하고 이중 카세트 바이너리 시스템을 사용하여 제조된 염색체 전이 DNA를 갖는 박테리아 숙주세포의 염색체에 통합시켰다. 이중 카세트 바이너리 시스템벡터를 구성하는 일반방법은 도 14에 도시되어 있다. DsbA::우비퀴틴::IGF-I 융합유전자를 포함하는 염색체 전이 DNA를 형성하는데 사용된 방법은 도 12에 도시되어 있다. 염색체 통합후 유전자를 발현시켜 극히 높은 레벨의 단백질 축적을 얻었다.
이중 카세트 바이너리 시스템은 도 7 및 14에 도시된 바와 같이 2개의 플라스미드 pDM25470 및 pDM25465를 이용하였다. pDM25425는 attP 카피, T7 프로모터 및 rrn1t2 터미네이터를 포함하는 pUC19 유도체로서, 1.6kb 단편이 BalII/BamHI 분해에 의해 결실된 것이다. DsbA(pDM25463으로부터의 1.5kb NcoI(fill)/NsiI 단편)를 암호화하는 서열 및 터미네이터를 EcoRI(fill)/NsiI 분해된 pDM25459에 가하여 라이게이션시켜 pDM25470(이중 카세트 바이너리 중 하나)을 형성하였다. 다른 이중 카세트 플라스미드 pDM25465는 터미네이터 2카피, 카나마이신 저항성 유전자 및 시클로필린 유전자를 포함한다(단백질 제조를 돕는데 시클로필린 유전자를 사용하는 것은 그 전체가 여기에 참고로 포함된 공동소유의 계류중인 미국특허출원일련번호 08/101,506에 기재되어 있다). 시클로필린 유전자를 pER15951(HinDIII(fill)/Xbal, 0.6kb단편)로부터 pDM25424(BamHI(fill)/XbaI, 5.2kb 단편; 카나마이신 저항성 유전자 및 터미네이터 2카피를 포함하는 pUC19 골격)로 클로닝시켰다. pDM25430(pDM25424로부터 유래)내의 카나마이신 저항성 유전자는 충분히 효과적이지 못하고, 그래서 pLG339hly(PvuII/EcoRI 분해물)로부터의 카나마이신 저항성 유전자로 대체하여 플라스미드 pDM25443을 형성하였다. 올리고 T7F 및 T7R을 어닐링시키고 EcoRI 분해된 pDM25443에 라이게이션시킴으로써, T7프로모터를 pDM25443에 클로닝시켜 pDM25465를 형성하였다.
올리고뉴클레오티드 2세트를 합성하고 (1, 2, 1R, 2R 및 3, 4, 3R, 4R), 인산화하여 변성시키고 어닐링시켰다. 우비퀴틴을 암호화하는, 1, 2, 1R 및 2R의 어닐링 산물을 pUC18(SphI-BamHI 분해물)에 라이게이션시켰다. IGF-I를 암호화하는, 3, 4, 3R 및 4R의 어닐링 산물은 pUC18(EcoRI-BamHI 분해물)에 라이게이션시켰다. 얻어진 플라스미드를 JM109로 형질전환시키고 형질전환된 숙주세포를 암피실린 플레이트상에서 선별하였다. 형질전환체를 우비퀴틴 및 IGF-I서열의 존재에 대해 분석한 다음 서열화하여, 올바르게 형성된 구조체를 동정하였다. 각각으로부터의 한 분리물을 선별하고 각각 pPO39354 및 pPO39334로 분해시켰다.
우비퀴틴 및 IGF-I 서열을 pPO39354 및 pP039334로부터 분리하고(각각 SphI-SacII 및 SacII-NsiI 분해에 의해), SphI-NsiI 분해된 pDM25454(DsbA를 암호화하는 서열을 포함하는 pUC19기재 플라스미드)에 클로닝시켜, DsbA::우비퀴틴::IGF-I 융합유전자를 함유하는 분해된 pPO39358인 플라스미드를 형성하였다.
pPO39358로부터의 융합단백질을 이중카세트 바이너리로 모벡터 pDM25470 및 pDM25465에 라이게이션시켜 각각 pPO39377 및 pPO41623을 형성하였다. pPO39377 및 pPO41623의 EcoRI-XbaI 단편을 라이게이션시켜 염색체 전이 DNA를 형성하였다(도 17).
이 염색체 전이 DNA를 E. coli 균주 B1384로 형질전환시켰는데, 이 균주는 attP부위는 물론, 효소인테그라제(INT)를 암호화하는 trp 프로모터 제어하의 서열도 함유한다. 인돌아크릴산(1mM)을 가하여 INT의 발현을 유도한 결과 형질도입된 염색체 전이 DNA의 통합이 초래되었다. 세포를 다음에 의해 염색체 전이 DNA 통합에 대해 시험하였다.
블루/옐로우 스크리닝 세포를 AmpScreen(BRL)에 의한 블루/옐로우 스크리닝 으로 통합된 DNA에 대해 시험하였다. 블루 표준형을 갖는 콜로니를 더 스크 리닝하고 옐로우 콜로니를 버렸다.
PCR 세포를 프라이머쌍, 즉 프로모터를 갖는 완전한 융합유전자의 존재를 확증하는
및 B1384의 att 부위로의 염색체 전이 DNA의 삽입을 확증하는
을 사용하는 숙주세포 염색체 DNA의 증폭으로 적절히 통합된 RNA에 대해 시험하였다.
통합된 유전자로부터의 단백질 제조는 B1384가 결핍되어 있는 활성 T7 RNA 폴리머라제 활성을 필요로 한다. 통합된 유전자로부터의 단백질 제조를 시험하기 위해 B1384 인테그란트를 사용하여 P1 용해물을 제조하였다. 그 다음 이 용해물을 E. coli 균주 W311ODE3에 형질도입시켰는데(실시예1에 기재된 바와 같이), 이 균주는 Gal+이며 lac 프로모터 제어하의 T7 RNA 폴리머라제 유전자 카피를 포함한다. 형질도입체를 10㎍/ml의 카나마이신을 함유한 갈락토스 최소배치 플레이트상에 플레이트함으로써 선별하였다. 단일 kanr/Gal+콜로니를 분리하고 카나마이신을 함유한 갈락토스 최소배지 플레이트상에서 재선별하였다. kanr/Gal+콜로니는 프라이어쌍, 즉 W311ODE3내의 프로파지 측면에 있는 상류 att 부위가 점유되지 않음을 증명한
및 융합단백질 발현 카세트가 본래대로 전이되었음을 확증하는
을 사용하는 PCR로 더 분석하였다.
W311ODE3 형질도입으로부터의 각 분리물을, 박테리아를 용해시키는데 T7 RNA 폴리머라제 활성을 필요로 하는 파지 4107(Novagen)에 대해 스트리킹하여 T7 RNA 폴리머라제 활성에 대해 시험하였다. 완전한 융합유전자 발현카세트를 함유하고 T7 RNA 폴리머라제 활성에 대해 양성인 분리물 (c49222로 나타냄)을 사용하여 단백질 제조를 시험하였다. 단백질 발현을 2시간 동안 c49222의 배양물에 IPTG를 가하여 단백질 발현을 유도하였다. 단백질 제조를 12.5% 아크릴아미드 겔 상에서 전세포용해물의 SDS-PAGE로 분석하였다. SDS-PAGE 겔의 사진농도분석으로 DsbA::우비퀴틴::IGF-I 융합단백질이 총세포단백질의 22.3%로 축적되었음이 증명되었다.
P1 용해물을 또한 사용하여 E. coli 균주 cDM46809(이것은 camr, malE가 결실되어 있고, lac영역에 도입된 attB부위를 함유하고 있다)로 통합된 유전자를 형질도입시켰다. 형질도입체를 카나마이신 및 클로르암페니콜을 함유하는 플레이트상의 성장으로 선별하였다. lac 영역으로의 통합은 프라이머쌍, 즉
를 사용하여 PCR로 확인되었다.
다음에 P1 용해물을 kanr/camr이고 lac 영역에 통합된 분리물로부터 제조하였다. 이 P1을 사용하여 W311ODE3을 형질도입시켰다. 형질도입체를 선택배지상의 성장으로 카나마이신 및 클로르암페니콜 저항성을 위해 선별하였다. kanr/camr을 상기한 바와 같이 파지 4107에 대해 스트리킹하여 T7 RNA 폴리머라제 활성에 대해 시험하였다. T7 RNA 폴리머라제 활성에 대해 양성인 두 분리물(c49258#46 및 c49258#50으로 나타냄)을 2시간 동안 IPTG에 의한 유도로 단백질 축적에 대해 시험하였다. 전세포용해물을 12.5% 아크릴아미드겔을 사용하여 SDS-PAGE로 분석하였다. DsbA::우비퀴틴::IGF-I 융합단백질은 SDS-PAGE 겔의 사진농도법으로 측정할 때 c4P258#46내의 총세포단백질의 19.6%까지 축적되었다.
c49222 및 c4925#846으로부터의 염색체 DNA의 서던 블롯 분석을 수행하여 통합된 DNA의 카피수를 점검하였다. c49222 및 c49258#46으로부터의 염색체 DNA를 분리하고 제한 엔도뉴클레아제로 분해하고 Hybond-N(Amersham)으로 전이시키고, 융합단백질의 IGF-I부분 및 우비퀴틴을 암호화하는 DNA 단편으로 프로브하였다. 서던 블롯분석으로 염색체 c49222 및 c49258#46(도 24)에 통합된 DsbA::우비퀴틴::IGF-I 유전자 각각 약 2카피, 즉 통합된 DNA 단일 카피)가 존재함이 증명되었다. 이 결과는 SDS-PAGE로 증명된 DsbA::우비퀴틴::IGF-I 단백질의 축적레벨(각각 총세포단백질의 22.3% 및 19.6%)면에서 놀랍고 예기치 못한 것이었다. 통상적으로 그러한 높은 레벨의 단백질 축적은 고카피수 플라스미드에 포함된 이종유전자의 발현에 의해서만 이루어질 수 있다고 예상된다.
UsbA::우비퀴틴::IGF-I는 또한 카나마이신 저항성 유전자에 더하여 테트라시클린 저항성 유전자를 포함하는 염색체 전이 DNA를 통합시킴으로서 제조되었다. B1384 인테그란트로부터 제조된 P1 용해물을 사용하여 W311ODE3을 카나마이신 저항성으로 형질도입시켰다(실시예1 참조). Kanr분리물을 상기한 바와 같이 프라이머쌍 T7F1×IGFREV 및 ATT3×T7RNAP1을 사용하여 적절히 통합된 DNA에 대해 점검하였다. 분리물을 또한 상기한 바와 같이 파지 4107에 대해 스트리킹하여 T7 RNA 폴리머라제 활성에 대해 시험하였다. 그 다음 T7 RNA 폴리머라제 활성에 대해 양성인 분리물을, 카나마이신(10㎍/ml) 및 테트라시클린(30㎍/ml)을 함유하는 배지상의 성장으로 통합된 DNA의 증폭을 위해 선별하였다. 이 구조체에 통합된 테트라시클린 대립형질 유전자는 고카피수에서 유효하며, 따라서 테트라시클린 저항성인 콜리니는 통합 DNA를 증폭시킬 수 있다. kanr/tetr콜로니를 상기한 바와 같이 IPTG에 의한 유도로 단백질축적에 대해 시험하였다. 모든 kanr/tetr콜로니는 유도시 융합단백질을 제조하였다.
실시예3
우비퀴틴 가수분해효소(UBP-1)의 염색체 발현
이 실시예에 사용된 플라스미드의 구성은 도 10-16에 기술되어 있다. PJ70은 우비퀴틴 가수분해효소 공급원이었다. pDM25493은 이 구조체에 사용된 trp 프로모터 공급원이었다. trp 프로모터 제어하의 효모 UBP-1유전자에 대한 염색체 전이 DNA를 pDM46813 및 pDM25472 또는 pDM25448로부터 제조하였다. 이 실시예에서는 pDM25472를 사용하였다(즉 도 16의 염색체 전이 DNA#1). 이 염색체 전이 DNA에 의해 형성된 융합 유전자는 끝이 잘린 DsbA 유전자 및 아미노말단 92 코돈이 없는 UBP-1 cDNA간의 프레임내 융합을 암호화한다.
염색체 전이 DNA를 실시예2에서와 같이 B1384에 도입하였다. 인테그란트를 카나마이신(10㎍/ml)으로 선별하였다. 분리된 콜로니를 프라이머 TRPPF 및 1239를 사용하는 진단적 PCR 반응으로 시험하였다(실시예1에 기재된 바와 같이). 모든 분리물은 이 시험에 양성이었다. 또한 모든 분리물은 암피실린에 민감하였다.
한 콜로니를 추가의 특성화를 위해 선별하였다. 이 분리물로부터 P1용해물을 제조하여 실시예1에 기재된 바와 같이 카나마이신 저항성으로 W311ODE3을 형질도입시키는데 사용하였다. 카나마이신 저항성 콜로니를 실시예2에 기재된 바와 같이 프라이머 ATT3 및 T7RNAP1을 사용하는 PCR로 더 시험하였다. 모든 분리물은 DE3용원균 측면에 있는 attB/P 또는 attP/B에서 예상된 로케이션을 나타내었다.
분리물을 우비퀴틴 가수분해효소 활성에 대해 시험하여 단백질 발현에 대해 시험하였다. 분리물을 카사미노산 최소배지에서 성장시키고 수거하여 초음파파괴로 용해시켰다. 가용성 분획을 37℃에서 1시간 동안 DsbA::우비퀴틴::IGF-I 융합단백질 기질과 함께 배양하여 활성에 대해 분석하였다. 절단을 SDS-PAGE로 모니터하였다. 모든 분리물(WBD311, 312, 313, 314, 331 및 332)은 양호한 레벨의 효소활성을 나타내었다(즉 분석조건하에 기질이 완전 절단됨).
실시예4
인슐린유사 성장인자결합단백질-3(IGFBP-3)융합단백질의 발현
이중카세트법을 사용하여 DsbA, 사람 리노바이러스 2A 프로테아제부위를 포함하는 링커 및 IGFBP-3(DsbA::2A::IGFBP-3)으로 이루어지는 융합단백질을 포함하는 염색체 전이 DNA을 형성하였다. 융합 유전자 및 염색체 전이 DNA의 구성이 도 18에 도시되어 있다. DsbA는 pDM46905로부터의 것이었고, 2A 프로테아제 부위는 프라이머 V2ATA 및 V2ATB를 어닐링시켜 형성되었고 IGFBP-3은 프라이머 BP3RZ 및 NBP3F를 사용하여 pYZ42580으로부터 PCR 증폭되었다.
DsbA::2A::IGFBP-3 융합을 형성하는데 사용된 IGFBP-3 유전자는 다수의 합성 올리고뉴클레오티드를 어닐링 및 라이게이션시켜 형성되었는데, 어것은 충분히 어셈블될 때 IGFBP-3 단백질을 암호화한다.
올리고뉴클레오티드는 3개의 세그먼트 5', 3' 및 미들로 어셈블되었다. 올리고뉴클레오티드
를 어닐링 및 라이게이션시켜 IGFBP-3의 5' 세그먼트를 형성한 다음 pUC18(HinDIII-SalI 분해물)에 클로닝시켰다. 이 구조체를 pYZ37437로 나타내었다. 이 유전자의 3'부분은 올리고뉴클레오티드
를 어닐링 및 라이게이션시킨 다음 SalI-EcoRI 분해된 pUC18에 클로닝시켜 형성되었다(pYZ37405로 나타냄). pYZ374100은 IGFBP-3 유전자의 미들 세그먼트를 함유하였고, 올리고뉴클레오티드
를 어닐링 및 라이게이션시키고 라이게이션된 DNA를 BssHII 및 SalI로 분해하고 Klenow로 말단을 채운 다음 Klenow 채워지고 XbaI 분해된 pUC18에 클로닝시켜 형성되었다.
pYZ37490 세그먼트의 PCR 증폭을 사용하여 ScaII 부위를 추가하고 클로닝 인공물을 정정하였다. 프라이머쌍
를 사용하여 제한부위를 도입하고 결함을 보완하였다. 그 다음 2개의 PCR 증폭된 단편을 혼합하고 프라이머쌍 1233×1224를 사용하여 단일 DNA를 형성하였다. 얻어진 DNA 단편을 HinDIII-SalI 분해된 pYZ37437에 클로닝시켜 pYZ237490을 형성하였다.
또한 PCR증폭을 사용하여 추가의 SacII 부위를 도입하여 이후의 클로닝 단계를 용이하게 하였다. 프라이머
를 사용하여 pYZ37490세그먼트를 증폭시킨 다음 그것을 HinDIII-SalI 분해된 pYZ37490에 라이게이션시켜 pYZ42519를 형성하였다.
IGFBP-3 유전자를 스리웨이 라이게이션 반응으로 3개의 세그먼트로부터 어셈블하였다. pYZ42519(HinDIII-BssHII 분해물), pYZ374100(BssHII-SalI 분해물) 및 pYZ37405(SalI-EcoRI 분해물)를 HinDIII-EcoRI 분해된 pUC18에 라이게이션시켰다. 적절히 어셈블된 클론을 제한 매핑 및 서열화로 동정하였다.
클로닝 인공물을 PCR을 사용하여 정정하였다. BPFIX1은 프라이머
로 pYZ42509를 증폭시키고 얻어진 단편(BssHII-SalI 분해된)을 pYZ42509의 BssHII-SalI 분해물에 클로닝시켜 형성되었다. BPFIX1의 HinDIII-BssHII 분해물을 pYZ42519 분해물의 HinDIII-BssHII와 라이게이션시켜 pYZ42529를 형성하였다. 제2 리페어는 프라이머쌍
를 사용하여 행해졌다. 이것은 클로닝 결함을 보완하고 SalI 부위를 추가시켰다. 프라이머쌍 715F1'×1233 및 715R'×1224를 사용하여 pYZ42529로부터 2개의 DNA 단편을 증폭시켰다. 이들 2개의 단편을 혼합하고 1233×1224를 사용하여 단일 DNA단편으로 PCR 증폭시켰다. 이 단일 단편을 BssHI 및 SalI로 분해시킨 다음 pYZ42529의 BssHI-SalI 분해물에 라이게이션시켜 pYZ50559를 형성하였다.
IGFBP-3 유전자의 도너 구조체인 pYZ42580은 pYZ50559 및 pDM25497로부터 EcoRI-SacII 단편의 라이게이션으로 형성되었다.
DsbA::2A::IGFBP-3 융합 유전자를 포함하는 염색체 전이 DNA를 E. coli 균주 B1384로 트랜스펙션시키고, 이것을 1001M IAA의 존재하에 성장시켜 INT의 발현 및 염색체 전이 DNA의 통합을 유도하였다. 인테그란트를 카나마이신으로 선별하였다. 모든 분리물은 또한 암피실린에 민감하였다.
분리물을 숙주세포 염색체의 진단적 PCR 증폭에 의해 더 특성화하였다. 프라이머쌍
에 의한 PCR증폭으로 att부위에서 염색체에 완전한 염색체 전이 DNA가 적절히 통합됨을 확인하였다.
단일 분리물로부터 P1 용해물을 제조하여 카나마이신 저항성으로 W311ODE3을 형질도입하는데 사용하였다(실시예1에 기재된 바와 같이) 카나마이신 저항성 분리물을 실시예2에 기재된 바와 같이 파지 4107에 대해 스트리킹하여 T7 RNA 폴리머라제활성에 대해 분석하였다. 그 다음 T7 RNA 폴리머라제활성을 갖는 분리물을 IPTG에 의한 유도로 융합 유전자의 발현에 대해 시험하고 이어서 12.5% 폴리아크릴아미드겔상에서 전세포용해물의 SDS-PAGE로 단백질 발현을 분석하였다. 전세포용해물의 사진농도분석으로 DsbA::2A::IGFBP-3 융합단백질이 22.6%의 레벨로 축적되었음을 알 수 있었다(도 25A).
실시예5
IGF-I 융합단백질의 제조
사람 리보바이러스 2A 또는 3C 프로테아제에 대한 부위를 포함하는 서열에 의해 연결된 DsbA 및 IGF-I를 포함하는 융합단백질은 이중 카세트 바이너리 시스템을 사용하여 제조되었다. 바이너리 플라스미드 및 염색체 전이 DNA의 구성은 도 19 및 도 20에 도시되어 있다.
DsbA::2A::IGF-I의 발현을 위해, pPO53096 및 pPO57211의 EcoRI/XbaI분해단편을 라이게이션시켜 염색체 전이 DNA(CTD-DsbA::2A::IGF-I)를 형성하였다. pPO53097 및 pPO57210의 EcoRI/XbaI 단편을 라이게이션시켜 DsbA::3C::IGF-I를 암호화하는 유전자를 포함하는 염색체 전이 DNA(CTD-DsbA::3C::IGF-I)를 형성하였다. CTD-DsbA::3C::IGF-I 및 CTD-DsbA::2A::IGF-I를 각각 인돌아크릴산의 존재하에 B1384 세포로 형질전환시켰다(INT 발현을 유도하기 위해). 형질전환체를 카나마이신을 함유하는 배지에서 성장시켜 인테그란트를 위해 선별하였다. 각 형질전환으로부터의 9개의 각 kanr콜로니를 암피실린 민감성에 대해 시험하였다. 시험한 콜로니는 모두 암피실린에 민감하였다.
분리물을 실시예2에 기재된 바와 같이 프라이머쌍 T7F1×IGFREV 및 T7REV×TRPBR2에 의한 PCR 증폭으로 올바로 통합된 DNA에 대해 시험하여 완전한 융합 유전자의 존재 및 B1384의 att부위에의 통합을 확인하였다.
P1용해물을 각 형질전환으로부터의 B1384 인테그란트 중 하나로부터 제조하여 카나마이신 저항성으로 W3110DE3을 형질도입시키는데 사용하였다. kanr/gal+분리물을 실시예2에 기재된 바와 같이 T7 RNA 폴리머라제활성의 존재에 대해 시험하였다. T7 RNA 폴리머라제 활성에 대해 양성인 분리물은 실시예2에 기재된 바와 같이 프라이머쌍 T7F1×IGFREV 및 ATT3×T7RNAP1을 사용하는 PCR로 더 시험하여 완전한 융합 유전자의 적절한 통합을 확인하였다.
그 다음 각 형질도입으로부터의 2개의 분리물(DsbA::2A::IGF-I에 대해서는 c57265#44 및 c57265#54 ; DsbA::3C::IGF-I에 대해서는 c57264#5 및 c57264#28)을 카나마이신과 테트라시클린 둘 다를 함유하는 배지에서 성장시켰다. DsbA::3C::IGF-I 와 CTD-DsbA::2A::IGF-I 둘 다 유전자가 고카피수로 있을 때 저항성을 부여하는 테트라시클린 저항성 대립형질 유전자를 포함하였다. 테트라시클린 존재하의 성장을 통합된 DNA의 증폭을 위해 선택한다. 각 형질도입으로부터의 두 단리물 모두 kanr/tetr이었다. 그 다음 분리물을 IPTG에 의한 유도로 융합단백질의 발현에 대해 시험하였다. 단백질 발현을 전세포용해물의 SDS-PAGE로 분석하였다. SDS-PAGE겔의 사진농도스캐닝으로 DsbA::3C::IGF-I 융합단백질을 발현시키는 2개의 분리물은 융합단백질을 총세포단백질으 20% 및 20.1%로 축적시켰고 DsbA::2A::IGF-I를 발현시키는 2개의 분리물은 융합단백질을 총세포단백질의 25.7% 및 38%로 축적시켰음이 증명되었다.
실시예6
이중 카세트 바이너리 시스템을 사용한 TGF-β2의 염색체 발현
이중 카세트법을 사용하여 DsbA, 우비퀴틴 및 사람 TGF-J2로 이루어지는 융합단백질을 암호화하는 염색체 전이 DNA(DsbA::우비퀴틴::TGF-β2)을 형성하였다. 융합유전자 및 염색체 전이 DNA의 구성은 도21에 도시되어 있다. DsbA::우비퀴틴은 pDM25497로부터의 것이었고, TGF-J2는 프라이머
를 사용하여 pPC-21(Madisen et al. (1988) DNA 7:1-8)로부터 증폭되었다.
pDM25497을 SacII-EcoRI로 분해하여 pUC18 및 DsbA::우비퀴틴 서열을 함유하는 4.3kb 단편을 분리하였다. 사람 TGF-J2의 최후 12 아미노산을 암호화하는 pPC-21의 증폭으로 얻어지는 0.35kb PCR산물을 정제하고 SacII-EcoRI로 분해하였다. 이들 2개의 단편을 라이게이션시켜, DsbA::우비퀴틴::TGF-J2 융합유전자를 함유하는 pUC18 유도체인 pDP26을 형성하였다. pDP26은 염색체 전이 DNA를 제조하는데 사용된 바이너리 플라스미드의 어셈블리를 위한 도너 구조체였다.
pDP26으로부터의 융합유전자를 이중 카세트 바이너리 벡터 pDM25470 및 pDM25465에 라이게이션시켜 각각 pC9DP에 및 pA6DP를 형성하였다. 간단히 말하면, pDM25470을 BamHI-SamI로 분해하여 4.2kb단편을 분리하였다. pPD26을 EcoRI로 분해하고 DNA 폴리머라제의 Klenow 단편으로 블런트말단화한 다음 BamHI로 분해하였다. 이 분해로부터의 1.1kb 단편을 분리하였다. 상기 2개의 단편을 라이게이션시켜 pC9DP를 형성하였다.
pDM25465를 BamHI로 분해하고 Klenow로 블런트 말단화하고 XbaI로 분해하여 7.1kb 단편을 분리하였다. pDP26을 EcoRI로 분해하고 Klenow로 블런트말단화하고 BamHI로 분해하여 1.2kb 단편을 분리하였다. 이 1.2kb 단편을 pDM25465로부터의 7.1kb 단편에 라이게이션시켜 pA6DP를 형성하였다.
XbaI-XhoI 분해후의 pDM46932로부터 분리된 7.2kb 단편 및 pA6DP로부터의 융합유전자(2.7kb XbaI-XhoI 단편)를 사용하여 테트라시클린 저항성 선별 마커를 함유하는 추가의 바이너리 프라스미드를 형성하였다. 이들 2개의 단편을 라이게이션시켜 pA6DPIIT를 형성하였다. pC9DP(2.2kb) 및 pA6DPIIT(6.4kb)의 EcoRI-XbaI단편을 라이게이션시켜 염색체 전이 DNA를 형성하였다(도 21).
이 염색체 전이 DNA를 E. coli 균주 B1384로 형질전환시키고, 그것을 500㎛ IAA의 존재하에 성장시켜 INT의 발현 및 염색체 전이 DNA의 통합을 유도하였다. 인테그란트를 10㎍/ml의 카나마이신으로 선별하였다. 모든 분리물은 암피실린에 민감함이 발견되었다.
분리물을 숙주세포 염색체 DNA의 진단적 PCR 증폭으로 더 특성화하였다. 앞서 기재한 프라이머쌍
과 프라이머 T7REV 및 TRPBR2에 의한 PCR 증폭으로(실시예 2참조)att부위에서 염색체에 완전한 염색체 전이 DNA가 적절히 통합됨이 확인되었다.
P1 용해물을 앞서 기재한 바와 같이 단일 분리물로부터 제조하여 카나마이신 저항성으로 W3110DE3을 형질도입하는데 사용하였다. 통합된 융합유전자의 증폭은 카나마이신 및 테트라시클린(30㎍/ml)을 함유하는 배지상에서 카나마이신 저항성 분리물을 성장시켜 수행하였다. 카나마이신/테트라시클린 저항성 분리물을 실시예2에 기재된 바와 같이 파지 4107에 대해 스트리킹하여 T7 RNA 폴리머라제 활성에 대해 분석하였다. 그 다음 T7 RNA 폴리머라제 활성을 갖는 분리물을 IPTE에 의한 유도로 융합유전자의 발현에 대해 시험하고, 이어서 10% 폴리아크릴아미드겔상에서 전세포용해물의 SDS-PAGE로 단백질 발현을 분석하였다(도 26). 염색체 인테그란트내의 단백질 축적은 DsbA::우비퀴틴::TGF-β2 융합단백질을 암호화하는 유전자 카피에 연결된 동일한 T7 프로모터를 이용하여 다카피수 플라스미드를 함유하는 숙주세포에서 보인 레벨에 필적하였다. 사진농도분석으로 염색체 인테그란트내의 단백질축적은 총세포단백질의 36.7% 만큼 높았음이 증명되었다.
실시예7
프로모터없는 CTD를 사용한 이종 단백질의 발현
이 실시예는 프로모터를 포함하지 않는 염색체 전이 DNA의 사용을 보여준다. 염색체 전이 DNA는 관심있는 이종 단백질(이 경우에는 실시예5의 DsbA::3C::IGF-I 융합단백질)를 암호화하는 DNA 서열에 프레임내 연결된 박테리아 유전자(이 실시예에서는 lacZ 또는 DsbA)와 상동인 DNA 세그먼트, 및 선별 마커 유전자를 포함한다. 상동 DNA는 박테리아 유전자의 5' 영역을 암호화한다. 염색체 전이 DNA를 숙주세포에 도입하여 거기서 그것을 숙주세포 염색체상의 이종 유전자에 통합시켜, 이종 유전자의 프로모터와 관심있는 이종 단백질을 암호화하는 DNA 서열 사이에 작동가능한 연결을 형성한다. 염색체 전이 DNA상에 포함된 선별 마커를 사용하여 인테그란트를 선별한다. 관심있는 이종 단백질을 상동 유전자의 프로모터를 통해 발현시킨다(도 8).
DsbA::3C::IGF-I 융합단백질을 암호화하는 DNA를 실시예5에 기재된 바와 같이 구성하였다. 그 다음 이 융합유전자를 lacZ 유전자의 최초 100 아미노말단 아미노산을 암호화하는 DNA 단편으로 프레임내 위치시켜 lacZ/DsbA::3C::IGF-I 유전자를 형성한다. 또한 실시예5에 이용된 시클로필린, 카나마이신 저항성 및 테트라시클린 저항성 유전자를 lacZ/DsbA::3C::IGF-I 유전자를 포함하는 플라스미드에 클로닝시킨다. 그 다음 이 플라스미드를 제한 엔도뉴클레아제로 절단하여 플라스미드 복제기원, 알피실린 저항성 유전자 및 다른 비필수 서열을 제거한 다음 재라이게이션시켜 환상 염색체 전이 DNA를 형성한다. 이 염색체 전이 DNA를 E. coli 숙주세포로 형질전환시키고 형질전환된 숙주세포를 카나마이신 (10㎍/ml)을 함유하는 배지에서 성장시킨다. 숙주세포가 플라스미드 DNA가 아니라 통합된 DNA를 포함함을 증명하기 위해 카나마이신 저항성 유전자를 암피실린 민감성에 대해 시험한다. 또한 Kanr분리물을 PCR을 사용하여 시험한다. lacZ 프로모터로부터의 PCR 프라이머 및 DsbA를 암호화하는 DNA 서열을 사용하여 완전한 염색체 전이 DNA의 통합을 확인한다. 통합된 융합유전자의 증폭을 카나마이신 및 테트라시클린(30㎍/ml)을 함유하는 배지상의 kanr분리물의 성장으로 선별한다. 통합된 융합유전자의 발현을 IPTG의 존재하에 kanr/tetr의 성장으로 유도한다. 단백질발현을 SDS-PAGE로 분석한다.
또한 프로모터없는 염색체 전이 DNA를 숙주세포 염색체상의 다른 부위에 통합시킬 수도 있다(도 9). 특정 유전자에 연결된 유도 프로모터(이 경우에는 T7 프로모터)의 염색체 카피를 포함하는 특정 숙주세포를 구성할 수도 있다. 이 숙주세포는 숙주세포(이 경우에는 W3110DE3, 이것은 T7 RNA 폴리머라제를 암호화하는 유전자 카피도 또한 포함한다)로 다양한 염색체 전이 DNA(lacZ 유전자 카피, DsbA 유전자의 5'말단에 작동가능하게 연결된 T7 프로모터 및 클로르암페니콜 저항성 유전자를 포함하는)를 형질전환시켜 제조한다. 염색체 전이 DNA의 통합을 클로르암페니콜을 함유하는 배지상의 형질전환된 W3110DE3 세포의 사정에 의해 선별한다. 염색체 전이 DNA의 통합은 DsbA 유전자의 5' 부분에 연결된 T7프로모터를 함유하는 W3110DE3 숙주세포를 생산한다. 그 다음 이 통합된 DNA는 관심있는 이종 단백질를 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 염색체 전이 DNA의 통합을 위한 표적이 된다.
관심있는 이종 단백질을 암호화하는 DNA서열을 포함하는 염색체 전이 DNA을 구성한다(이 경우에는 상기 및 실시예5에 기재된 DsbA::3C::IGF-I 융합유전자). 또한 시클로필린, 카나마이신 저항성 및 테트라시클린 저항성 유전자를 플라스미드에 클로닝시킨다. 그 다음 이 플라스미드를 적당한 제한효소로 절단하여 플라스미드 복제기원, 암피실린 저항성 유전자 및 다른 비필수 서열을 제거하고 재라이게이션시켜 환상 염색체 전이 DNA를 형성한다. 이 염색체 전이 DNA를 상기한 T7-DsbA W3110DE3 숙주세포로 형질전환시킨다. 인테그란트를 클로르암페니콜 및 카나마이신을 함유하는 배지상의 성장에 의해 선별한다. kanr/camr분리물을 PCR에 의한 완전한 염색체 전이 DNA의 통합에 대해 점검한다. 프라이머쌍 T7F1 X IGFREV를 사용한 숙주세포 염색체 DNA의 PCR 증폭으로 완전한 염색체 전이 DNA의 통합이 확인된다. 인테그란트를 실시예2에 기재된 바와 같이 파지 4107에 대해 스트리킹하여 T7 RNA 폴리머라제 활성에 대해 점검한다. 통합된 DNA의 증폭을 카나마이신, 클로르암페니콜 및 테트라시클린상의 T7 RNA 폴리머라제 양성 분리물 성장에 의해 선별한다. 저항성 분리물을 IPTG에 의한 유도로 단백질발현에 대해 분석한다. 단백질발현을 SDS-PAGE로 분석한다.
실시예8
이중 카세트 시스템을 사용한 DsbA::3C::IGFBP-3 융합단백질의 발현
도 7에 도시된 이중 카세트 바이너리 시스템을 사용하여 DsbA::3C::IGFBP-3 융합단백질 융합유전자을 발현시켰다. DsbA 서열을 E. coli염색체로부터의 Dsb 유전자의 PCR 증폭으로 최초에 분리하였다. 플라스미드 pDM25454를 이 융합유전자에 대한 DsbA 서열공급원으로서 사용하였다. 3C 프로테아제부위를 2개의 올리고뉴클레오티드
RV3CTA 5'-CCCGATTCTCTGGAAGTTCTGTTCCAA-3'
및
RV3CTB 5'-TTGGAACAGAACTTCCAGAGAATCGGGCATG-3'
를 합성하여 형성하고 이것을 어닐링하여 3C 프로테아제절단부위를 암호화하는 이중 표준 DNA 단편을 형성하였다. IGFBP-3 유전자는 실시예4에 기재된 바와 같이 합성 올리고뉴클레오티드를 어닐링 및 라이게이션시켜 구성되었다. DsbA::3C::IGFBP-3 융합단백질을 암호화하는 유전자의 구성에 사용된 IGFBP-3 서열은 프라이머 BP3RZ 및 NBP3F와 주형 pYZ42580을 사용하여 제조된 PCR 증폭된 DNA 단편이었다. DsbA::3C::IGFBP-3 융합단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 염색체 전이 DNA를 제조하는데 사용된 2개의 DNA공급원 pDM46947 및 pDM46948의 클로닝은 도 22에 도시되어 있다.
pDM46947 및 pDM46948로부터의 EcoRI-XbaI단편을 사용하여 염색체 전이 DNA를 구성하였다. 이 염색체 전이 DNA를 인돌 아크릴산의 존재하에 성장시킨 B1384 세포로 형질전환시켰다(INT 발현을 유도하키기 위해). 인테그란트를 카나마이신을 함유하는 배지상의 형질전환체 성장에 의해 선별하였다. 모든 카나마이신 저항성 분리물은 또한 암피실린에 민감하였다. 카나마이신 저항성 분리물을 실시예4에 기재된 바와 같이 프라이머쌍 1227×BP3-607, INT107×BP3-559 및 T7REV×TRPBR2를 사용한 PCR로 점검하였다.
P1 용해물을 카나마이신 저항성 분리물 중 하나로부터 제조하여 카나마이신 저항성으로 W3110DE3을 형질도입시키는데 사용하였다. 카나마이신 형질도입체를 실시예2에 기재된 바와 같이 파지 4107에 대해 스트리킹하여 T7 RNA 폴리머라제 활성의 존재에 재해 시험하였다. 카나마이신 저항성/T7 RNA 폴리머라제 양성 분리물을 카나마이신 및 테트라마이신을 함유하는 배지상의 성장에 의해 염색체증폭을 위해 선별하였다. 1개의 kanr/tetr분리물을 선별하고 IPIT에 의한 유도로 단백질발현에 대해 점검하였다. 단백질축적을 SDS-PAGE로 분석하였다(도 25B). SDS-PAGE겔의 사진농도분석으로 DsbA::3C::IGFBP-3 융합단백질은 총세포단백질의 평균 27.4%로 축적되었음이 증명되었다.
본 명세서에서 인용된 모든 간행물, 특허 및 특허출원은 각각의 간행물, 특허 또는 특허출원이 참고로 포함된다고 각각 나타내는 한 여기에 동일한 정도로 참고로 포함된다.
당업자는 또한 상기 명세서의 사상내에 있을 특허청구된 발명에 대한 대등물을 생각할 수 있다는 것이 명백하다. 이들 대등물은 본 발명의 범주내에 포함되어야 한다.
Claims (12)
- 관심있는 이종 단백질의 제조방법에 있어서,관심있는 이종 단백질을 암호화하는 유전자의 적어도 1카피 및 선별 마커로 이루어지는 염색체 전이 DNA를 염색체를 포함하는 박테리아 숙주세포로 전이시키는 단계;상기 숙주세포 염색체에의 상기 염색체 전이 DNA의 통합을 위해 선별하여, 숙주세포에서 기능적인 프로모터에 작동가능하게 연결된 관심있는 이종 단백질을 암호화하는 유전자 및 중복 DNA가 측면에 있는 선별 마커로 이루어지는 숙주세포 염색체를 생성하는 단계; 및상기 유전자를 발현시키는 단계로 이루어지고,상기 유전자는 전이 DNA의 구성 동안 다카피수 플라스미드 벡터상의 숙주세포에서 기능적인 프로모터에 한번도 작동가능하게 연결되지 않고,관심있는 상기 비박테리아 단백질은 총세포단백질의 0.1%를 초과하는 레벨로 상기 숙주세포내에 축적되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 염색체 전이 DNA는 상기 숙주세포에서 기능적인 프로모터를 더 포함하고, 상기 프로모터는 관심있는 이종 단백질을 암호화하는 상기 유전자에 작동가능하게 연결되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 숙주세포 염색체는 숙주세포 프로모터를 더 포함하고, 상기 염색체 전이 DNA는 상기 숙주세포 프로모터 하류의 박테리아 염색체 세그먼트와 상동인 DNA 서열을 더 포함하고, 상기 DNA 서열은 관심있는 이종 단백질을 암호화하는 상기 유전자에 프레임내 연결되고,상기 염색체 전이 DNA의 통합은 상기 DNA 서열과 숙주세포 프로모터 사이에 작동가능한 연결을 형성하게 되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 관심있는 상기 비박테리아 단백질은 총세포단백질의 1%를 초과하는 레벨로 상기 숙주세포내에 축적되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 관심있는 상기 이종 단백질은 진핵 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 관심있는 상기 이종 단백질은 포유류 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 각각의 상기 중복 DNA는 상기 프로모터에 연결된 관심있는 이종 단백질을 암호화하는 상기 유전자로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 숙주세포 염색체에의 상기 염색체 전이 DNA의 통합 후 상기 염색체 전이 DNA의 염색체 증폭을 위해 선별하는 것을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 염색체 전이 DNA의 제조방법에 있어서,제1플라스미드 벡터 및 제2플라스미드 벡터 각각으로부터의 제한단편을 라이게이션시켜 상기 염색체 전이 DNA를 제조하는 것으로 이루어지고,상기 제1벡터는 작동가능하게 연결된 프로모터가 결핍된 관심있는 이종 단백질을 암호화하는 유전자로 이루어지고,상기 제2벡터는 숙주세포에서 기능적인 프로모터로 이루어지고,상기 염색체 전이 DNA는 선별 마커, 상기 프로모터에 작동가능하게 연결된 관심있는 이종 단백질을 암호화하는 상기 유전자 및 상기 유전자 측면에 있는 중복 DNA로 이루어지며 상기 숙주세포에서 작동가능한 복제기원이 결핍되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
- 염색체 전이 DNA의 제조방법에 있어서,제1플라스미드 벡터 및 제2플라스미드 벡터 각각으로부터의 제한단편을 라이게이션시켜 염색체 전이 DNA를 제조하는 것으로 이루어지고,상기 제1플라스미드는 관심있는 이종 단백질을 암호화하는 제1유전자 및 숙주세포에서 기능적인 제1프로모터로 이루어지고, 상기 제1유전자 및 제1프로모터는 작동가능하게 연결되지 않고,상기 제2벡터는 작동가능하게 연결된 프로모터가 결핍된 관심있는 이종 단백질을 암호화하는 제2유전자 및 숙주세포에서 기능적인 제2프로모터로 이루어지고,상기 염색체 전이 DNA는 선별 마커로 이루어지며 상기 숙주세포에서 작동가능한 복제기원이 결핍되어 있고, 상기 제1유전자는 염색체 전이 DNA상의 상기 제2프로모터에 작동가능하게 연결되고, 상기 제2유전자는 상기 염색체 전이 DNA상의 상기 제1프로모터에 작동가능하게 연결되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 염색체 전이 DNA에 있어서,숙주세포에서 기능적인 프로모터에 작동가능하게 연결된 관심있는 이종 단백질을 암호화하는 유전자; 및중복 DNA가 측면에 있는 선별 마커로 이루어지고,관심있는 이종 단백질을 암호화하는 상기 유전자는 다카피수 플라스미드 벡터상의 숙주세포에서 기능적인 프로모터에 한번도 작동가능하게 연결되지 않는 것을 특징으로 하는 염색체 전이 DNA.
- 염색체 전이 DNA에 있어서,각각 숙주세포에서 기능적인 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 관심있는 이종 단백질을 암호화하는 유전자 2카피; 및관심있는 이종 단백질을 암호화하는 상기 유전자의 상기 카피가 측면에 있는 선별 마커로 이루어지고,상기 유전자의 상기 카피 각각은 다카피수 플라스미드 벡터상의 숙주세포에서 기능적인 프로모터에 한번도 작동가능하게 연결되지 않는 것을 특징으로 하는 염색체 전이 DNA.
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