KR19990022230A - 페니실린 ｇ상에서의 익스팬다제 활성에 의한 7-ａｄｃａ의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
Penicillium chrysogenum 형질전환체 균주 발현 익스팬다제를 사용하여 페니실린 G상에서 효소학적 고리 확장 활성에 의한 7-아미노데스아세톡시세팔로스포란산(7-ADCA)의 제조 및 회수의 전체방법.
Description
β-락탐 항생물질은 임상적 사용의 오랜 역사를 가진 가장 중요한 항생물질 화합물군을 구성한다. 이 군중에서, 두드러지는 것은 페니실린과 세팔로스포린이다. 이들 화합물은 각각 사상균 Penicillium chrysogenum 및 Acremonium chrysogenum에 의해 자연생산된다.
전형적인 균주 개선기술의 결과로서, Penicillium chrysogenum 및 Acremonium chrysogenum에서 항생물질의 생산레벨이 과거 수십년에 걸쳐 극적으로 증가되었다. 페니실린 및 세팔로스포린을 얻는 생합성 경로의 증가되고 있는 지식 및 재조합 DNA 기술의 도래로 생산균주의 개선 및 화합물의 생체내 유도화를 위한 새로운 도구가 이용가능하게 되었다.
Ingolia 및 Queener, Med. Res. Rev. 9(1989), 245-264 (생합성 경로 및 효소), 및 Aharonowitz, Cohen, 및 Martin, Ann. Rev. Microbiol. 46 (1992), 461-495(유전자 클로닝)에서 알 수 있는 바와같이 β-락탐 생합성에 관련된 대부분의 효소가 동정되고 그 대응하는 유전자가 클로닝되었다.
P. chrysogenum에서 페니실린 생합성중 처음 두 단계는 3 아미노산, L-5-아미노-5-카르복시펜탄산(L-α-아미노아디프산)(A), L-시스테인(C) 및 L-발린(V)을 트리펩티드 LLD-ACV로 축합한 다음에 이 트리펩티드를 고리화하여 이소페니실린 N을 형성한다. 이 화합물은 전형적인 β-락탐구조를 갖는다.
제 3단계는 효소 아실트랜스퍼라제(AT)의 작용으로 L-5-아미노-5-카르복시펜탄산의 친수성 측쇄를 소수성 측쇄로의 교환을 포함한다. AT에 의해 매개된 효소 교환반응은 EP-A-0448180에 기술된 바와 같이 세포기관인, 미소체 내부에서 일어난다.
세팔로스포린은 페니실린 보다 훨씬 더 고가이다. 그 이유는 몇몇 세팔로스포린(예, 세팔렉신)이 많은 화학적 전환으로 페니실린으로부터 제조되기 때문이다. 다른 이유는 D-5-아미노-5-카르복시펜탄오일 측쇄를 갖는 세팔로스포린만이 발효될 수 있기 때문이다. 이런 관점에서 단연 가장 중요한 출발물질인 세팔로스포린 C는 어떤 pH에서도 매우 수용성이어서 부담이 되고 고가인 컬럼 기법을 사용하는 길고 고가인 분리 방법을 수반한다. 이 방법으로 얻은 세팔로스포린 C는 많은 화학적이고 효소학적인 전환에 의해 요법적으로 사용된 세팔로스포린으로 전환되어야 한다.
중간체 7-ADCA를 제조하기 위해 산업상 현재 하고 있는 방법은 페니실린 G의 확장 및 유도화를 일으키는 복잡한 화학단계를 포함한다. 7-ADCA를 제조하기 위해 필요한 화학단계중 하나는 5원(員) 페니실린 고리구조의 6원 세팔로스포린 고리구조로의 확장을 포함한다(예를들면 US 4,003,894참조). 이 복잡한 화학적 방법은 고가임과 동시에 환경에 유해하다.
따라서, 바람직하게는 발효동안에 그러한 화학적 방법이 효소학적 촉매와 같은 효소학적 반응으로 대체되는 것을 매우 바라고 있다. 화학적 확장방법이 생물학적 방법으로 대체되는 열쇠는 세팔로스포린 생합성 경로에서의 중심효소, 데아세톡시세팔로스포린 C 신테타제 또는 익스팬다제이다.
박테리아 Streptomyces clavuligerus로부터의 익스팬다제 효소는 어떤 경우에는 시험관내에서 페니실린 고리확장을 실시하여 발견되었다(Baldwin et al., Tetrahedron 43(13) 3009 (1987)). Cantwell et al.(Current Genetics, 17, 213-221 (1990))에는, P. chrysogenum에서 S. clavuligerus 익스팬다제의 발현이 기술되어 있다. 익스팬다제의 발현은 공보에 제안되어 있는 바와 같이 발효에서 세팔로스포린의 형성을 결과하지 않았다. S. clavuligerus의 이소페니실린 N 에피머라제 유전자와 함께 P. chrysogenum으로 도입될 때에만 Cantwell et al., Proc. R. Soc. Lond. B. 248 (1992), 283-289에 기술되어 있는 바와같이 페니실린 N의 페니실린 고리구조(그 천연기질)의 데스아세톡시세팔로스포린 C의 세팔로스포린 고리구조(그 천연생성물)로의 전환이 관찰되었다. 익스팬다제 효소는 그 대응하는 유전자를 가짐에 따라, 생화학적으로 그리고 관능적으로 둘다 잘 특성화되었다(EP-A-0366354). cefE 유전자, DNA 서열의 두 물리적 지도 및 cefE를 갖는 P. chrysogenum에서의 형질전환 연구가 기술되었다(EP-A-0341892).
고리확장 효소에 대한 다른 공급원은 박테리아 Nocardia lactamdurans(전에는 Streptomyces lactamdurans)이다. 유전자의 DNA 서열 및 효소의 두 생화학적 특성이 기술되었다(각각 Cortes et al., J. Gen. Microbiol. 133 (1987), 3165-3174; 및 Coque et al., Mol. Gen. Genet. 236 (1993), 453-458).
익스팬다제는 페니실린 N의 5원 티아졸리딘 고리의 데아세톡시세팔로스포린 C의 6원 디히드로티아진 고리로의 확장을 촉매하기 때문에 이 효소는 화학적 방법중 고리확장 단계를 대체하는데 당연한 필연적인 후보가 되었다. 그러나 불행하게도, 효소는 페니실린 G를 포함하는, P. chrysogenum에 의해 생산되는 바와같이 쉽게 구입할 수 있는 저가의 페니실린상이 아니라, 세팔로스포린 생합성 경로의 페니실린 N 중간체 상에서 작용한다. 페니실린 N은 시중 구입할 수 없고 확장될 때조차 그 D-아미노아디필 측쇄가 페니실린 아실라제에 의해 쉽게 제거될 수 없다.
최근에 익스팬다제 효소가 특정 측쇄를 갖는 페니실린을 대응하는 7-ADCA 유도체로 확장할 수 있다는 것을 발견하였다. EP-A-268343에는 시험관내에서 데아세톡시세팔로스포린 C 신테타제를 가함으로써 3-카르복시페닐아세틸 또는 아디포일 측쇄를 갖는 페니실린의 확장방법이 기술되어 있다. 더욱이, 이 익스팬다제의 특징은 EP-A-0532341, EP-A-0540210, WO95/04148 및 WO95/04149에 기술되어 있는 기법으로 명백해졌다. 이들 기술로 페니실린 G의 7-ADCA로의 종래의 화학적 전환이 익스팬다제 유전자를 함유하는 재조합 Penicillium chrysogenum 균주에서 어떤 6-아미노페니실란산(6-APA) 유도체의 생체내 전환으로 대체되었다.
보다 구체적으로, EP-A-0532341은 P. chrysogenum에서 아실트랜스퍼라제 효소에 대한 기질인, 공급원료로서 5-카르복시펜탄오일 측쇄와 조합하여 P. chrysogenum에서 익스팬다제 효소의 생체내 사용을 교시하고 있다. 이것은 5-카르복시펜탄오일-6-APA를 형성시키고, 이것은 P. chrysogenum 균주로 도입된 익스팬다제 효소에 의해 전환되어 5-카르복시펜탄오일-7-ADCA를 얻는다. 최종적으로, 5-카르복시펜탄오일 측쇄의 제거가 제안되고, 최종 생성물로서 7-ADCA를 얻는다.
WO95/04148 및 WO95/04149에서 3'-카르복시메틸티오프로피온산 및 3,3'-티오디프로피온산 각각이 익스팬다제에 대한 기질이라는 것을 알았고 2-(카르복시에틸티오)아세틸- 및 3-(카르복시메틸티오)-프로피오닐-7-ADCA를 얻는다는 것이 개시되었다.
그러나, 본 발명의 방법은 페니실린 생산 균주의 고 pen G 신테제능 및 페닐아세틸-7-ADCA산의 추출이 보다 유리한 방법이므로 보다 많은 이점을 제공한다. 더욱이 페니실린 G의 페닐아세틸 측쇄는 어떤 유형의 미생물에 의해 생산된 페니실린 G 아미다제에 의해 효소학적 절단으로 바로 보정할 수 있어 6-APA, 예를들면 EP-A-0453047에 개시된 바와같은 세파라제 G를 얻는다.
여러 공보에 확장을 위한 기질로서 페니실린 G를 수용하지 않는 익스팬다제가 기록되었다(Baldwin & Abraham (1988), Natural Product Reports, 5(2), p. 129-145; Maeda et al. (1995), Enzyme 및 Microbial Technology, 17, 231-234; Crawford et al. (1995), Bio/technology, 13, p. 58-61; Wu-Kuang Yeh et al., in 50 years Penicillin Application (editors Kleinkauf 및 Von Dohren), 209 (1991), 특히 표 3A참조).
그러나, 놀랍게도 익스팬다제 암호유전자로 형질전환된 P. chrysogenum을 생산하는 페니실린 G가 페닐아세틸-데스아세톡시-세팔로스포란산을 생산할 수 있다는 것을 이제 발견하였다.
발명의 개요
본 발명은 다음에 의한 7-아미노데스아세톡시세팔로스포란산(7-ADCA)의 제조 및 회수 방법을 제공한다:
a) 균류 발현 신호의 전사 및 번역 조절하에서 익스팬다제 유전자로 Penicillium chrysogenum 균주를 형질전환시키는 단계;
b) 상기 균주를 배지에서 발효시키고 상기 배지에 적당한 페닐아세트산 또는 그것의 염 또는 에스테르를 가하여 페니실린 G를 얻고, 이것을 확장시켜 페닐아세틸-7-ADCA를 형성하는 단계;
c) 발효액으로부터 페닐아세틸-7-ADCA를 회수하는 단계;
d) 페닐아세틸-7-ADCA를 탈아실화시키는 단계; 및
e) 결정성 7-ADCA를 회수하는 단계.
바람직하게는, 페닐아세틸-7-ADCA는 발효 여액을 약 4.5미만인 pH에서 수불혼화성 유기용매로 추출하고 다시 발효여액을 4와 10 사이인 pH에서 물로 추출함으로써 발효액으로 부터 회수된다.
더욱이, 균류 유전자, 예를들면 Aspergillus nidulans gpdA 유전자, 및 Aspergillus niger glcA 유전자의 전사 및 번역 제어요소에 관능적으로 결합된 DNA 암호 익스팬다제로 이루어지는 재조합 DNA 벡터 및 동일물로 형질전환된 숙주세포가 제공된다.
본 발명은 7-아미노데스아세톡시세팔로스포란산(7-ADCA)의 제조 및 회수를 위한 생합성 방법에 관한 것이다.
본 발명은 세팔로스포린 생합성에서 중요한 중간체인 7-아미노데스아세톡시세팔로스포란산 또는 7-ADCA의 유도체를 형성하기 위해 페니실린 G 고리구조의 생체내 확장에 대한 P. chrysogenum에서 관능 유전자 구조물의 사용에 관한 것이다. 이 유도체는 화학적 조성을 가져 효과적으로 용매추출을 하고, 따라서 경제적으로 매력적인 회수방법을 제공한다.
P. chrysogenum의 형질전환은 원칙적으로 PEG-Ca 매개된 원형질체 흡수, 일렉트로포레이션(electroporation) 또는 입자 건 기법, 및 형질전환체의 선택과 같은 DNA 운반의 상이한 방법에 의해 이루어질 수 있다. 예를들면, Van den Hondel en Punt, Gene Transfer and Vector Development for Filamentous Fungi, in: Applied Molecular Genetics of Fungi(Peberdy, Laten, Ogden, Bennett, eds.), Cambridge University Press (1991)참조. 지배적인, 비지배적인 선택 마커의 적용이 기술되었다(Van den Hondel, 상기참조). 동종(P. chrysogenum 유도된) 및 이종(비-P. chrysogenum 유도된) 기원 둘다의 선택 마커를 기술하였다(Gouka et al., J. Biotechnol. 20 (1991), 189-200).
형질전환체의 선택에서 비 선택성 DNA에 물리적으로 결합되거나 또는 결합되지 않은 벡터 서열의 존재 또는 부재하에서 동종 또는 이종인 상이한 형질전환체 선택 마커의 적용이 공지되어 있다.
익스팬다제 효소에 의해 매개된 고리확장반응은 P. chrysogenum에서, 예를들면 균주 Panlabs P14-B10, DS 18541(수탁번호 455.95로 CBS에 기탁됨)에서 이 방법으로 도입되고 발현된다. 고리 확장반응이 그 돌연변이체에서 실시되는 경우에 배지 조건이 효과적인 성장을 하는데 약간 적합해야 한다는 것이 분명해질 것이다.
더욱이, cefE 유전자는, 바람직하게는 P. chrysogenum 유전자 Y(EP-A-0549062에 기술됨), P. chrysogenum IPNS 유전자, β튜불린 유전자, Aspergillus nidulans gpdA 유전자 또는 Aspergillus niger glcA 유전자에서 유래된 균류(사상균이거나 또는 아닌) 유전자 제어요소의 전사 및 번역 제어하에 있다.
요약하면, 본 발명은 P. chrysogenum으로 도입된 익스팬다제 효소의 활성이 페니실린 G의 고리확장에 대해 생체내에서 일어날 수 있는 방법을 교시하고 있다.
본 발명에 따라서 β-락탐중간체 페닐아세틸-7-ADCA는 페닐아세트산 또는 그것의 염 또는 에스테르를 배지에 가함으로써 P. chrysogenum에서 생산된다. 적당한 염은, 예를들면 나트륨 또는 칼륨과의 것들이다. 7-ADCA는, 예를들면 다음과 같은 간단한 용매 추출을 통해 배지에서 효과적으로 회수된다:
발효액을 여과하고 수불혼화성 유기용매를 여액에 가한다. pH를 조정하여 수층으로 부터 세팔로스포린을 추출한다. pH 범위는 4.5미만; 바람직하게는 4와 1사이, 보다 바람직하게는 2와 1사이여야 한다. 이 방법으로 세팔로스포린을 발효액에 존재하는 많은 다른 불순물로부터 분리한다. 바람직하게는 소량의 유기용매를 사용하여 세팔로스포린의 농용액을 얻고 체적 흐름속도의 감소를 이룬다. 제 2의 가능성은 4이하인 pH에서 전체 발효액 추출이다. 바람직하게는 발효액은 수불혼화성 유기용매로 4와 1사이인 pH에서 추출한다.
세팔로스포린 분자를 간섭하지 않는 어떤 용매도 사용할 수 있다. 적당한 용매는, 예를들면 부틸아세테이트, 에틸아세테이트, 메틸이소부틸케톤, 부탄올등과 같은 알코올이다. 바람직하게는 부틸아세테이트가 사용된다.
다음에 세팔로스포린을 4와 10사이, 바람직하게는 6과 9사이인 pH에서 물로 다시 추출한다. 다시 최종부피를 격렬하게 감소시킨다. 회수는 0과 50℃사이의 온도, 바람직하게는 주위온도에서 실시할 수 있다.
이렇게 얻은 세팔로스포린 수용액을 적당한 효소로 처리하여 페닐아세틸 측쇄를 제거하고 원하는 7-ADCA를 얻는다. 동일물에 대한 적당한 효소는 EP-A-0453047에 기술된 페니실린 G 아실라제, 이른바 페니실린 아미다제이다.
바람직하게는 고정된 효소를 사용하여 효소를 반복적으로 사용할 수 있다. 그러한 입자의 제조 및 효소의 고정에 대한 방법론은 EP-A-0222462에 집중적으로 기술되었다. 수용액의 pH는, 예를들면 pH 4 내지 pH 9의 값을 갖고 여기에서 세팔로스포린의 분해 반응을 최소화하고 효소로 원하는 전환을 최적화한다. 따라서 효소를, 예를들면 수산화칼륨 용액과 같은 무기염기를 가하거나 또는 양이온 교환수지를 적용함으로써 적당한 레벨에서 pH를 유지하면서 세팔로스포린 수용액에 가한다. 반응이 완결되면 고정효소를 여과로 제거한다. 다른 가능성은 고정된 또는 유동화된 베드컬럼에서 고정효소를 적용하거나, 또는 용액중의 효소를 사용하고 막 여과에 의한 생성물을 제거한다. 결과적으로 반응혼합물은 수불혼화성 유기용매의 존재하에서 산성화된다.
약 0.1 내지 1.5로 pH를 조정한 후에 층들을 분리하고 수층의 pH를 2 내지 5로 조정한다. 다음에 결정성 7-ADCA를 여과제거한다.
또한 탈아실화는 종래 기술분야에서 공지된, 예를들면 이미노클로라이드 측쇄의 형성을 통해 10℃미만의 온도에서 오염화인을, 이어서 주위온도 이하에서 이소부탄올을 가함으로써 화학적으로 실시할 수 있다.
다음 실시예들은 예시의 목적으로 제공되고 제한의 목적으로는 제공되지 않는다.
실시예 1
페닐아세틸-7-ADCA의 발효에 의한 생산
수탁번호 455.95로 CBS에 기탁된 P. chrysogenum 균주 Panlabs P14-B10을 익스팬다제 발현 카세트 구조물에 대한 숙주 균주로서 사용한다.
P. chrysogenum IPNS 유전자 전사 및 번역 조절 신호하에서 익스팬다제 유전자를 함유하는 사용된 발현카세트는 Crawford et al (상기 참조)에 기술되어 있다. 형질전환 및 배양조건은 Crawford et al.(상기 참조)에 기술된 바와같다. 형질전환체를 정제하고 Crawford et al (상기참조)에 의해 기술된 바와같은 아디포일-7-ADCA를 생산하기 위한 그 능력을 시험함으로써 익스팬다제 효소의 발현에 대해 분석한다.
예를들면, 번호 74182로 ATCC에 기탁된 P. chrysogenum 균주 PC100으로서 아디포일-7-ADCA를 생산하는 형질전환체를 5.6의 살균전 pH에서 글루코스, 30; Pharmamedia(면실박), 10; Corn Steep Solids, 20; (NH4)2SO4, 20; CaCO3, 5; KH2PO4, 0.5; 락토스, 10; 이스트추출물, 10(g/l)으로 이루어지는 종자 배지로 2.106 분생자/ml에서 주입하였다.
종자배지(솜마개로 밀폐한 250ml 삼각플라스크중의 20ml)를 220rpm에서 25℃에서 배양한다. 48시간이 지난 후에 1ml을 사용하여 6.6의 살균전 pH에서 KH2PO4, 0.5; K2SO4, 5; (NH4)2SO4, 17.5; 락토스, 140; Pharmamedia, 20; CaCO3, 10; 라드유, 10(g/l)으로 이루어지는 생산배지 15ml을 주입하였다.
종자배지를 주입한 후에 KOH로 pH 7.0으로 조정한 10% 페닐아세트산 용액 0.15-0.75ml을 발효에 가한다.
생산배지를 밀크 필터로 밀폐시킨 250ml 삼각 플라스크에서 168시간동안 220rpm에서 25℃에서 주입한다. 증발된 물을 하루 걸러 채운다.
생산발효가 끝날때에 균사를 원심분리 또는 여과로 제거하고 페니실린 G 및 페닐아세틸-7-ADCA를 HPLC로 분석한다.
실시예 2
페닐아세틸-7-ADCA 생산분석
형질전환시킨 페니실린 균주로부터 발효 생성물을 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로 분석하였다. HPLC 시스템은 다음의 스펙트럼 물리적 성분으로 이루어졌다: P1500 용매 운반시스템, AS 1000 주사기, UV1000 다양한 파장검출기(214nm로 고정) 및 ISM 100 적분기 또는 유사한 것. 고정상은 Chrompack Chromspher C18 컬럼이었다. 이동상은 75% 인산염 완충액 pH 2.6 및 25% 아세토니트릴로 이루어졌다. 생성물을 페닐아세틸-7-ADCA 및 페니실린 G의 표준곡선과 비교하여 측정하였다. 페닐아세틸-7-ADCA의 동일성을 배지여액의 산추출에 의해 얻은 중수소-클로로포름용액 600MHz NMR에 의해 확립하였다. 산추출물중의 페닐아세틸-7-ADCA의 공명은 합성샘플의 것과 일치됨을 입증하였다.
특허수속상의 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약
국 제 서 식
기스트-브로카데스 엔.브이. 하기 국제기탁 기관에 의하여
리서치 & 디벨어프먼트/슈탐콘서베링 규칙 제 7.1에 따라 발행된
네덜란드 2600 엠에이 델프트 원기탁에 의한 수탁증
포스트부스 1
1규칙 6.4(d)가 적용될 경우, 원기탁일은 국제기탁기관의 지위취득일이다.
서식 BP/4(1면)
특허수속상의 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약
국 제 서 식
기스트-브로카데스 엔.브이. 하기 국제기탁 기관에 의하여
리서치 & 디벨어프먼트/슈탐콘서베링 규칙 제 10.2에 따라 발행된
네덜란드 2600 엠에이 델프트 원기탁에 의한 생존증명서
포스트부스 1
1원기탁일, 또는 새로운 기탁 또는 이전이 있은 경우에는 가장 최근의 관련일
(새로운 기탁일 또는 이전일).
2규칙 10.2(a)(ii) 및 (iii)에 규정된 경우인 때는 가장 최근의 생존력 시험.3
해당되는 괄호에 X 표시를 한다.
서식 BP/9(1면)
4정보가 요구되고 시험결과 부정적인 경우 작성한다.
서식 BP/9(2면)
Claims (4)
- a) 균류 발현 신호의 전사 및 번역 조절하에서 익스팬다제 유전자로 Penicillium chrysogenum 균주를 형질전환시키는 단계;b) 상기 균주를 배지에서 발효시키고 상기 배지에 적당한 페닐아세트산 또는 그것의 염 또는 에스테르를 가하여 페니실린 G를 얻고, 이것을 확장시켜 페닐아세틸-7-ADCA를 형성하는 단계;c) 발효액으로부터 페닐아세틸-7-ADCA를 회수하는 단계;d) 페닐아세틸-7-ADCA를 탈아실화시키는 단계; 및e) 결정성 7-ADCA를 회수하는 단계에 의한 7-아미노데스아세톡시세팔로스포란산(7-ADCA)의 제조 및 회수방법.
- 제 1 항에 있어서, 단계(e)는 여과단계인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 단계(c)는 발효여액을 약 4.5 미만인 pH에서 수불혼화성 유기용매로 추출하고 다시 발효여액을 4 내지 10인 pH에서 물로 추출하는 여과단계인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 3 항중의 어느 한항에 있어서, 익스팬다제 유전자는 Streptomyces clavuligerus 또는 Nocardia lactamdurans에서 유래되는 것을 특징으로 하는 방법.
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