KR19990018942A

KR19990018942A - 항치매 활성 조성물 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR19990018942A
Application number: KR1019970042226A
Authority: KR
Inventors: 김영중; 박미정; 김소라
Original assignee: 김영중
Priority date: 1997-08-28
Filing date: 1997-08-28
Publication date: 1999-03-15
Also published as: KR100248098B1; KR100242546B1

Abstract

본 발명은 포부자 등의 해독시킨 부자의 저급알코올 추출물, 및 이의 부탄올 분획물, 알칼로이드 함유 분획물 및 네올린에서 선택된 1종 이상의 성분을 유효성분으로 함유하는 항치매 활성 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이며, 본 발명에 따라 치매의 예방과 치료에 우수한 효과를 나타내는 유용한 새로운 약학적 조성물이 제공된다.

Description

항치매 활성 조성물 및 그 제조방법

도1은 포부자의 총메탄올추출물 및 이의 부탄올 분획물과 알칼로이드 분획물의 항치매 활성을 스코폴라민으로 치매를 유발시킨 생쥐의 수동적 학습능력을 측정함으로써 측정한 그래프로서, 이때, 나타낸 값은 실험동물들의 평균 머무르는 시간±표준편차로 상대적인 값이며, 각 실험군은 15마리이고, 스코폴라민 대조군에 대한 유의성은 *:p0.05, **:p0.01이다.

도2는 네올린의 항치매활성을 스코폴라민으로 치매를 유발시킨 생쥐의 수동적 학습능력을 측정함으로써 측정한 그래프로서, 이때, 나타낸 값은 실험동물들의 평균 머무르는 시간±표준편차로 상대적인 값이며, 각 실험군은 15마리로 구성되고, 스코폴라민 대조군에 대한 유의성은 *:p0.05, **:p0.01이다.

도3은 스코폴라민으로 치매를 유발시킨 생쥐에서 네올린이 능동적 학습능력을 회복시킴으로써 학습력을 탁월하게 회복시키는 활성을 나타낸 그래프로서, 이때, 나타낸 값은 실험동물들의 평균 반응횟수±표준편차이며, 각 실험군은 15마리로 구성된다.

도4는 스코폴라민으로 치매를 유발시킨 생쥐의 기억력과 학습력을 탁월하게 향상시키는 네올린이 치매를 유발시키지 않은 정상의 생쥐에 있어서도 학습능력을 향상시키는 활성을 갗는 것을 나타낸 그래프로서, 이때, 나타낸 값은 실험동물들의 평균 반응횟수±표준편차이며, 각 실험군은 15마리로 구성된다.

본 발명은 항치매 활성 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 해독(저독화 또는 무독화)시킨 부자의 저급알코올 추출물, 및 이의 부탄올 분획물, 알칼로이드 함유 분획물, 네올린에서 선택된 1종 이상의 성분을 유효성분으로 함유하는 항치매 활성 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.

노인성 질환 중에서 최근 사회 문제로까지 대두되고 있는 치매 환자의 대부분이 알쯔하이머씨 병 환자인 것으로 알려졌다. 알쯔하이머씨 병 환자는 콜린성, 아드레날린성, GABA성 및 글루타메이트성 신경 등 거의 모든 신경에 이상이 초래되며, 특히 콜린성 신경의 손실이 가장 심각한 것으로 알려져 있다. 이에 콜린성신경의 이상을 회복시키거나 개선시키는 방향으로 알쯔하이머씨 병의 치료제 개발 연구가 활발히 이루어지고 있다(Smith C. M. Alzheimer's Disease. In Neurotransmitters, Drugs and Disease(eds Webster. R. A. and Jordan, C. C.), Blackwell Scientific Pub1. Co., London, p.428(1989)); Lang, W. and Henke, H. Cholinergic receptor binding and auto- radiography in brains of non-neurological and senile dementia of Alzheimer-type patients. Brain Res., 267: 271(1983)). 실험동물에 스코폴라민(scopolamine)을 투여하여 콜린성 신경계에 이상을 유발시켜 알쯔하이머씨 병과 비슷한 상태를 인위적으로 조작할 수 있는 방법이 알려지면서 알쯔하이머씨 병의 치료제 개발이 진일보하게 되었다.(Flood, J. and Cherkin, A. Scopolamine effects on memory retention in mice, Behav. Neural. Bio1.45:169-184(1986)). 흰쥐에 스코폴라민을 투여하면 콜린성신경기능의 퇴행과 기억력 상실증이 나타나는 것은 물론, 습득력, 즉각적인 대응법, 활동기억(working memory)에 결함이 나타나는 등 알쯔하이머씨 병 환자에게서 나타나는 증상과 유사한 증상이 나타난다(Smith, 1988; Giacobine, E. and Cuadra, G(1994) Second and third generation cholin-esterase inhibitors: from preclinical studies to clinical efficacy. In Alzheimer's Disease: Therapeutic Strategies(Giacobini, E. and Becker, R. ed.) Birkauser. Boston, pp. 155-171; Ben-Barak, J. and Dudai, Y.(1980) Scopolamin induced an increase in muscarinic receptor level in rat hippocampus, Brain Res., 193: 309-313). 이 러한 증상은 콜린성 신경의 효능제인 아레콜린(arecoline) 및 옥소트레모린(oxotremorine)이나 아세틸콜린의 분해를 억제시킴으로써 세포 내의 아세틸콜린의 농도를 유지시키는 아세틸콜린에스테라제(acetylcholinesterase : AChE) 저해제인 피조스티그민(physostigmine) 등의 투여에 의하여 완화되었다. 실제로 AChE 저해제인 타크린(tacrine)은 임상에서 사용되고 있으나 간독성, 짧은 반감기 및 낮은 생체 내 이용률 등의 문제가 제기되고 있어(Antuono, P. G.(1995) Effectiveness and Safety of Velnacrine for the Treatment of Alzheimers-Disease-A Double-Blind, Placebo-Controlled Study. Arch. Int. Med., 155: 1766-1772; Siegfried, K. (1995) The Efficacy of Cholinergic Drugs in Patients with Alzheimers Disease-Focus on the Aminoacridines. Human Psychopharmacology, Clin, Exp. 10:89-96) 새로운 대체약물을 찾기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다.

본 발명자들은 새로운 항치매 활성을 갖는 물질을 찾기 위하여 천연물을 대상으로 치매 활성을 검색하던 중 부자의 총 메탄올 추출물이 유의성 있는 항치매 활성이 있음을 발견하였다.

부자는 민간에서 오랫동안 강심, 해열, 진정, 진통, 신진대사촉진 및 기능항진등의 목적으로 사용되어 왔으며, 한방에서 치매의 치료제로 사용되어 왔기에(相賀撤夫,(1985) 중약대사전, 상해과학기술출판사 소학관, pp.1482-1487) 부자로부터 기억력 및 학습력을 증진시키는 물질을 분리하고자 하였다. 부자에는 주성분으로 아코니틴(aconitine) (Hikino, H., Takahashi, M., Konno, C., Hashimoto, I. and Namiki, T. (1983) Subacute and subchronic toxicity of Aconitum roots and mesaconitine, Shoyakugaku Zasshi 37: 1-9), 하이파코니틴(hypaconitine)(Hikino, H., Takahashi, M., Konno, C., Hashimoto, I. and Namiki, T. (1983) Subacute and subchronic toxicity of Aconitum roots and mesaconitine, Shoyakugaku Zasshi 37: 1-9) 및 메사코니틴(mesaconitine) (Hikino, H. Takata, H., Fujiwara, M., Konno, C. and Ohuchi, K. (1982) Mechnism of inhibitory action of mesaconitine in acute inflammations, Eur. J. Pharmacol. 28:65-71.)등의 알칼로이드계의 물질이 함유되어 있다고 보고되었다. 이외에도 알칼로이드 계열의 다른 물질들(Konno, C., Murayama, M., Suigiyama, K., Murakami, M., Takahashi, M. and Hikino, H. (1985) Isolation and hypoglycemic activity of aconitans, Planta med. 51:160-161; kitagawa, I., Chem Z. L., Yoshihara, M. and Yoshigawa, M.(1984) Chemical studies on crude drug processing. Ⅱ. Aconiti Tuber (1). On the constituents of Chuan-wu, the dried tuber of Aconitum carmichaeli Debx. Yakugaku Zasshi 104: 848-857; Hikino, H., Takahashi, M., Konno, Co., Hashinmoto, I. and Namiki, T. (1983) Subacute and subchronic toxicity of Aconitum roots and mesaconitine, Shoyakugaku Zasshi 37:1-9; Pelletier, S. W., Mody, N. V. And Varughese, K. I. (1982) Fuziline, a new alkaloids from chinese drug Fuzi (Aconitum carmichaeli Debx). Heterocycles 17-19)과 단순 아민 등의 (Konno, C., Shirasaka, M. and Hikino, H (1979) Cardioactive principle of Aconitum carmichaeli roots, Planta Med. 35:150-155)다양한 물질들이 분리, 보고된 바 있다.

부자의 약리학적 효능 중 신경계에 미치는 약리작용에 대한 연구는 미비한 실정이나 콜린성 신경에 작용한다는 보고(Yu, S. P. And Kloot, W. V. (1990) Non-quantal acetylcholone release at mouse neuromuscular junction : effects of elevated quantal release and aconitine. Neurosci. Lett. 117:111-116)가 있다.

이러한 부자가 속하는 바곳속(Acotitum) 식물의 종류는 다양하여 우리나라의백부자(白附子),진범(秦 ),초오(草烏)등과 같이 성분군이 유사하며, 용도도 비슷한 식물군이 있으나, 모두 독성이 강하여 여러 가공처리를 거친 후 사용하였는데 그러한 가공처리를 수치라 한다. 이러한 수치법에 따라서, 염부자(鹽附子 : 부자를 고즙(苦汁)과 소금물에 담그었다가 말림), 명부괴(明附塊 : 부자의 껍질을 벗기고 세로로 쪼개서 열탕에 담그었다가 건조함), 담부편(淡附片 : 부자외 껍질을 벗기고 박편으로 썰어 열탕에 담그었다가 건조함), 포부자(세로로 둘로 쪼개어 굽거나 찜) 등으로 불리어 진다(한덕룡 (1989) 현대생약사, 학창사, pp.268-271).

부자는 주성분인 아코니틴(aconitine), 메사코니틴(mesaconitine), 하이파코니틴(hypaconitine) 등에 의해 독성이 심하게 나타나 생쥐에 대한 급성독성 실험결과 LD50이 0.22, 0.27, 0.50mg/kg으로 독성이 상당히 크다(Hikino, H., Takahashi, M., Konno, C., Hashimoto, I. and Namiki, T.(1983) Phannaceutical studies on Aconitum roots. Part 13, Structure of hokbusine A and B, diterpend alkaloids of Aconitum carmichaeli roots from Japan, I. Nat. Prod. 46: 178-82). 수치한 부자의 경우 디테르펜 모핵에서 아세틸기나 벤조일기가 떨어지거나, 리포-알칼로이드(lipo-alkaloid)가 생성되어 기존의 알칼로이드가 독성이 약한 알칼로이드로 변하여 상대적으로 독성이 강한 알칼로이드의 함량이 감소하므로 수치한 부자에서 독성이 크게 감소하게 된다((Kitagawa, I., Chem Z. L., Yoshihara, M. and Yoshigawa, M. (1984) Chemical studies on crude drug processing. Ⅱ. Aconiti Tuber (1). On the constituents of Chuan-wu, the dried tuber of Aconitum carmichaeli Debx. Yakugaku Zasshi 104:848-857). 아코니틴류에서 아세틸기가 떨어져 나가면 벤조일아코니틴이 생성되고 거기에서 벤조일기가 떨어져 나가면 아코닌(aconine)이 생성된다. 또한, 아코니틴류는 융점부근에서 가열반응시켰을때 8번 탄소의 아세틸기가 떨어지고 15번 탄소의 수산기가 케토형(keto-form)으로 되어 있는 구조인 파이로형(pyro-type)으로 변한다. 생쥐에 대한 LD₅₀치 측정결과 벤조일메사코닌(benzoylmesaconine)은 메사코니틴보다 약 1/150, 메사코닌(mesaconine)은 1/500 정도의 독성을 갖고, 파이로메사코니틴(pyromesaconitine)은 메사코니틴의 약 1/200, 파이로메사코닌(pyromesaconine)은 1/3000 정도의 독성을 가진다. 이들의 독성은 메사코니틴벤조일메사코닌파이로메사코니틴메사코닌파이로메사코닌의 순으로 점차 약해진다.

네올린은 비교적 독성이 약한 탈라티자민(talatizamine)계열의 알칼로이드로서 독성을 나타내는 주요 관능기인 아세틸기나 벤조일기가 탈락된 모핵을 갖고 있어 독성보다는 약리학적 효능을 더 강하게 갖고 있다.

이상에 보듯이 수치를 전혀 하지 않은 부자의 추출물은 그 독성이 강하여 임상에서 약으로 사용할 수 없지만 포부자를 포함한 열처리나 염처리에 의한 수치를 통해 그 독성을 경감시킨 부자의 추출물은 임상에서 효과적으로 사용될 수 있다. 또한 항치매 활성의 조성물로서 네올린은 그 자체로서 뿐만 아니라 수치된 부자의 총추출물의 한 성분으로서도 효과적인 활성을 나타낼 수 있다.

따라서, 본 발명의 목적은 해독시킨 부자의 저급알코올 추출물, 및 이의 부탄올분획물, 알칼로이드 함유 분획물, 네올린에서 선택된 1종 이상의 성분을 활성성분으로 함유하는 치매의 예방과 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 해독시킨 부자의 저급알코올 추출물, 이의 부탄올 분획물, 알칼로이드 함유 분획물 및 네올린에서 선택된 1종 이상의 성분을 통상의 부형제, 보조제, 희석제 등에서 선택된 1종 이상의 성분과 혼합하고 통상의 약제학적으로 허용되는 방법으로 통상의 제제형태로 제제화하여 치매의 예방과 치료용 조성물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 조성물을 제공하기 위하여, 부자를 해독시킨 포부자 등을 메탄올, 에탄올 등과 같은 저급알코올로 추출하여 조추출물을 얻고, 부자의 여러 성분중 어느 성분이 유효한 약리작용을 나타내는가를 확인하기 위하여 다음의 스킴대로 분획하고 동정하여 실제로 약리작용을 나타내는 화합물을 찾아내었다.

스킴 1 : 포부자로부터 유효성분의 추출 및 분획

스킴2 : 분획 B및 C로부터의 네올린의 단리

상기 스킴을 참조하여 본 발명을 개략적으로 설명하면, 먼저 부자를 해독시킨 포부자를 메탄올로 추출하고 추출물을 감압농축시켜서 메탄올추출액을 얻는다.

이 메탄올 추출물을 물에 현탁시키고 메틸렌클로라이드로 분획하여 메틸렌클로라이드 분획과 물분획을 얻은 후, 물분획을 다시 n-부탄올로 분획하여 n-부탄올분획과 물잔류물을 얻는다. n-부탄올본획을 pH를 조절해가면서 초산에틸로 분획하여 pH 4의 분획물인 분획 A, pH 7에서의 분획물인 분획 B, pH 11에서의 분획물인 분획 C 및 pH 13에서의 분획물인 분획 D를 얻는다.

이중 알칼로이드 함유 분획물인 분획 B와 분획 C를 합하여 실리카겔 칼럼크로마토그래피하여 Fr. 1, Fr.2 (6.5g), Fr.3, Fr. 4, Fr.5, Fr.6, Fr.7, Fr.8, Fr.9 및 Fr.10을 얻고, Fr.2(6.5g)을 다시 실리카겔 칼럼크로마토그래피하여 Fr.11, Fr.12, Fr.13, Fr.14(4g), Fr.15 및 Fr.16을 얻고, Fr.14(4g)을 다시 실리카겔칼럼크로마토그래피하여 Fr.17, Fr.18, Fr.19(1g) 및 Fr.20을 얻는다. Fr.19에서 분리된 물질이 네올린으로 확인되었다.

다음에 실시예 및 실험예로써 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

실험동물 - ICR계 자성 생쥐(25-30g)를 서울대학교 동물사육장에서 공급받아 서울대학교 약학대학 실험동물실에서 사육하였다. 실험동물실의 환경은 실내온도를 22 ± 5℃로 유지하고 조명시간을 아침 7시에서 저녁 7시로 고정하였으며, 사료는 조단백 23.2%, 조지방 4.0%, 조섬유 6.0%, 조회분 10.0%, 조칼슘 0.6%, 조인 0.4%등이 함유된 고형사료 (서울, 삼양사)를 사용하였다.

실시예

1. 시약 및 재료:

부자 (Aconitum carmichaeli)는 서울대학교 약학대학 부설 약초원에서 재배하여 1994년 12월에 수확한 것을 사용하였으며, 흑두와 원감초는 경동시장 한약재상에서 구입하여 서울대학교 한대석 명예교수로부터 감정을 받아 사용하였으며, 본 연구에 사용한 모든 시약은 시그마사(Sigma, St. Louis, MO, U.S.A.)의 제품을 사용하였다.

2. 포부자의 제조, 추출 및 분획:

부자 47kg을 흐르는 물에 씻어 흙을 제거한 후 크게 4등분하고, 검은콩 8kg과 원감초 14kg을 2시간 동안 달인 흑두감초탕에 2시간동안 담가 해독하였다. 해독된 부자를 건져내어 2시간 동안 찐 후 뜨거울 때 세절하고 빨리 건조시켜 포부자 14kg을 얻었다. 포부자 14kg를 메탄올로 6회, 2시간 동안 상온에서 초음파장치를 이용하여 추출하였고, 감압농축하여 메탄올 엑스 1.8kg을 얻었다 (스킴1). 포부자 엑스 (1.8kg)를 증류수에 현탁시킨 다음, 용매의 극성에 따라 분획하여 메틸렌클로라이드(CH₂C1₂) 분획 (20g)과 물 분획 (1.75kg)을 얻었다. 물 분획을 다시 n-부탄올로 분획하여 n-부탄올 분획 330g을 얻었다.

3. 화합물 1의 분리:

부탄올 분획 (330g)을 1N HCl을 이용하여 pH 4로 맞춘 후 초산에틸로 추출하여 분획 A (25g)를, 다시 NH₄OH를 사용하여 pH 7로 맞춘 후 초산에틸로 추출하여 분획 B (10g)를, NH₄OH 및 NaOH를 사용하여 pH 11로 맞추어 분획 C(65g)를, NaOH를 사용하여 pH 13으로 맞춰 분획 D (1g)를 얻었다 (스킴 1). 이 중 알칼로이드를 함유한 분획인 분획 B와 C (75g)를 실리카겔 칼럼크로마토그래피를 반복 시행하고 n-헥산-초산에틸 혼합용매로 재결정하여 무색 침상 결정인 화합물 1을 1g 얻었다 (스킴 2).

4. 화합물 1의 구조결정:

무색의 침상형 결정, EIMS (m/z) 437 [M+], 분자량 : C₂₅H₃₉NO₆

IR (KBr) 3260 cm^-1(OH기),

¹H-NMR (CDCl₃,400MHz) δ 0.98 (3H, t, N-CH₂CH₃), δ 3.19 (3H, s, OCH₃),3.28 (3H, t, OCH₃), 3.50 (3H, s,OCH₃),

¹³C NMR (CDCl₃,100MHz) δ72.3(C1), 29.5(C2), 29.9(C3), 38.2(C4), 44.9(C5), 83.3(C6), 52.3(C7), 74.3(C8), 48.3(C9), 40.7(C10), 49.6(C11), 29.8(C12), 44.3(C13), 75.9(C14), 42.7(C15), 82.3(C16), 63.6(C17), 80.3(C18), 57.2(C19), 48.2(N-CH₂-CH₃),13.0(N-CH₂-CH₃),57.8(C6'), 56.3(C16'),59.1(C18')

이상의 스펙트럼 데이타(spectral data)를 근거로 화합물 1(compound 1)을 네올린(neoline)으로 추정하였으며 문헌치(Kitagawa, I., Chem Z. L., Yoshihara, M. and Yoshigawa, NL (1984) Chemical studies on crude drug processing. II. Aconiti Tuber (1). On the constituents of Chuan-wu, the dried tuber of Aconitum Carmichaeli Debx. Yakugaku Zasshi 104: 848-857; Pelletier, S. W. and Dajrmati, Z. (1976) Carbon-13 nuclear magnetic resonance : Aconitine-type diterpenoid alakloids form Aconitum and Delphinium species, J. Am. Chem. Soc. 98: 2626-2636)와 비교하여 동정하였다.

실험예

1. 스코폴라민(Scopolamine)에 의한 치매의 유발:

크리스텐센 등의 방법(Christensen, H., Maltby, N., Jorm, A. F., Creasey, H. and Broe, G. A. (1992) Cholinergic 'Blockade' as a model of the cognitive deficits in Alzheimer' disease, Brain 115: 1681-1699)으로 스코폴라민을 생쥐 체중 1kg당 1mg의 농도로 투여할 수 있도록 생리식염수로 제조하여 훈련시행 30분전에 피하주사하여 치매를 유발시켰다.

2. 약물의 투여:

스코폴라민을 투여하기 1시간 전에 농도별로 복강 주사하여 치매 유발에 어떻게 영향을 미치는 가를 관찰하였다.

3. 수동적 학습능력 측정 (Passive avoidance test):

상자의 하단에 두께 3mm의 격자(쇠창살)가 0.5cm간격으로 설치되어 있으며 2개의 방으로 나누어진 어보이던스 셔틀 박스(avoidance shuttle box )(40 x20 x 20 cm, Gemini Co., San Francisco)에 ICR계 생쥐 (25-30g, 웅성)를 넣고 한 방을 밝게 하였다. 어두운 곳을 선호하는 생쥐가 밝은 방에서 나머지의 어두운 방으로 들어가면 하단에 설치된 격자를 통하여 전기자극 (0.lmA/10g bodyweight)을 주는 훈련을 1회 시행하였다. 24시간 후에 스코폴라민과 약물의 주사를 제외한 나머지 과정을 전일과 동일하게 시행하고 생쥐가 밝은 방에 머무르는시간 (latency time)을 측정하여 이를 전일의 전기자극을 통한 훈련을 기억하는 지표로 정하였다.

4. 능동적 학습능력 측정 (Active avoidance test):

수동적 학습능력 측정시와 동일한 셔틀 박스(shuttle box)를 이용하여 능동적 회피학습력을 측정하였다. 생쥐에게 먼저 빛과 소리를 2초간 주는 자극을 조건자극(conditioned shock)으로 정하고, 계속하여 5초 후에 주는 전기자극(0.1mA/10g body weight)을 무조건자극(unconditioned shock)으로 정하였다.

생쥐가 무조건자극을 받는 중에 이를 피하여 다른 방으로 이동하여 무조건 자극이 정지되는 것을 도피반응 (escape response)이라 정하였다. 또한, 빛과 소리 자극인 조건 자극을 받는 중에 다른 방으로 이동하여 뒤따르는 전기자극을 피하는 것을 조건회피반응 (avoidance response)이라고 정하였으며, 조건자극은 물론 무조건 자극이 종료될 때까지도 다른 방으로 이동하지 않는 것을 무반응 (noresponse)이라고 정하였다.

이상의 조건으로 1일 1회 30번씩 5일간 훈련시켰을 때, 매일의 조건회피반응 및 도피반응의 횟수를 측정함으로써 능동적 학습능력을 측정하였다.

5. 통계 처리:

통계적 유의성 검토는 각 실험군의 생쥐의 수를 15로 하여 (n=15) 대조치로부터의 변동을 ''아노바 테스트(ANOVA test)''로 하였다. P값이 5% 미만일 때는 통계적으로 유의성이 있다고 판정하였다.

6. 결과 및 고찰 :

1) 포부자의 총메탄올 추출물의 항치매활성을 스코폴라민으로 치매를 유발시킨 생쥐의 수동적 학습능력을 측정하는 방법으로 알아보았다. 그 결과는 도1에 나타내었다. 즉, 포부자의 총 메탄올 추출물을 500mg/kg의 농도로 ICR계생쥐 (25-30g, 웅성)에 복강주사하고 1시간 후에 스코폴라민을 피하주사하였다. 30분이 경과한 후 하단에 두께 3mm의 격자가 0.5cm간격으로 설치되어 있으며 2개의 방으로 나누어진 어보이던스 셔틀박스(avoidance shuttle box : 40 x 20 x20 cm)에 상기의 생쥐를 넣고 한 방을 밝게 하였다. 어두운 곳을 선호하는 생쥐가 밝은 방에서 어두운 나머지 한 방으로 들어가면 하단에 설치된 격자를 통하여 전기자극 (0.1mA/10g body weight)을 받게하는 훈련을 1회 시행하였다. 24시간후 스코폴라민과 약물의 주사를 제외한 나머지 과정을 전일과 동일하게 시행하고 생쥐가 밝은 방에 머무르는 시간 (latency time)을 측정하여 이를 전일의 전기자극을 통한 훈련을 기억하는 지표로 설정하였다. 치매가 유발되지 않은 정상 쥐는 전일의 어두운 방에서의 전기자극을 기억하여 밝은 방에 남아 있으려고 하여 밝은 방에 머무르는 시간이 170±15초이었으나, 치매가 유발되어 전일의 어두운방에서의 전기자극을 기억하지 못하는 생쥐는 속성에 따라 어두운 방으로 빨리 옮겨가서 밝은 방에 머무르는 시간 (latency time)이 35±7초밖에 되지 않았다.

포부자의 메탄올 총 추출물을 생쥐에 복강주사하였을 경우, 밝은 방에 머무르는시간(latency time)이 78±10초로 길어져 생쥐의 기억력이 정상 상태 때의 32%수준까지 유지됨을 알 수 있었다. 이에 포부자의 총 메탄올 추출물을 용매의 극성에 따라 메틸렌클로라이드, n-부탄올 및 물 분획으로 나누고, 각각 분획의 항치매 활성을 검색하여 n-부탄올 분획이 유의성 있는 항치매 활성을 나타냄을 알 수 있었다 (도1). 포부자의 n-부탄올 분획은 드라겐도르프(dragendorff) 시약과 닌히드린(ninhydrin) 시약에 모두 양성으로 나타나 알칼로이드(alkaloid)가 함유되어 있음을 알 수 있었다. 따라서, n-부탄올 분획의 pH를 4, 7, 11 및 14로 조절한 후 초산에틸로 분획하여 알칼로이드를 함유하는 분획 B와 C를, 알칼로이드를 함유하지 않는 분획 A와 D를 얻었다 (스킴 1).

알칼로이드를 함유한 분획인 분획 B와 C가 생쥐의 수동적 학습능력에 미치는 효과를 100mg/kg의 농도로 복강주사하고 밝은 방에 머무르는 시간(latency time)을 측정함으로써 알아보았다.

알칼로이드를 함유한 분획인 분획 B와 C는 생쥐에 복강주사하였을 경우 밝은 방에 머무르는 시간(latency time)이 94±14초로 정상 상태 때의 기억력의 44% 수준까지 유지시킴을 알 수 있었다 (도1). 이에 알칼로이드를 함유한 분획인 분획 B와 C를 합하여 실리카겔 크로마토그래피를 반복 시행하고 η-헥산-초산에틸 혼합용매로 재결정하여 무색 침상 결정인 화합물 1을 1g 얻었고, 이의 NMR, IR, 질량분석 등 각종 스펙트럼 데이타를 기존의 문헌치와 비교하여 네올린(neoline)으로 동정하였다.

네올린은 이미 부자에서 분리 보고된 바 있는 알칼로이드 (Kitagawa et al., 1984; Pelletier and Djarmati, 1976)이나 그 약리학적 활성, 특히 기억력 및 학습력에 미치는 효과에 대한 연구는 아직까지 보고된 바 없다.

네올린의 항치매 활성을 알아보기 위하여 네올린을 생쥐에 체중 1kg당 0.01mg부터 10mg까지 농도별로 복강투여하고 1시간 후에 스코폴라민으로 치매를 유발시켜 수동적 학습능력을 측정하였다.

그 결과는 도2에 나타내었다. 네올린은 스코폴라민으로 인하여 저하된 기억력을 개선시켰으며 생쥐 체중 1kg당 0.1mg농도에서 정상 상태 때의 기억력의 55% 수준까지 유지시켜 최고의 효과를 나타내었다. 특히, 네올린의 이러한 효과는 양성 대조약물로 사용되고 있는 피조스티그민(physostigmine) 및 벨나크린(velnacrine) 각각 체중 1kg당 0.1mg 농도에서의 효과인 28% 및 30%보다 더 우수하었으며, 벨나크린이 체중 1kg당 1mg 농도에서 나타내는 최고의 항치매 활성인 37%보다도 1.5배나 높았다. 한편, 네올린(neoline)은 체중 1kg당 0.1mg의 농도에서 정상상태 때의 기억력의 55%를 유지시키는 최고의 항치매 효과를 나타내었으며, 그 농도를 체중 1kg당 10mg까지 농도를 증가시켜 투여하더라도 한마리의 생쥐도 사망하는 예가 없었다.

그러나 벨나크린은 네올린이 최고 효과를 나타내었던 농도보다 10배가 높은 농도인 체중 1kg당 1mg 농도에서 최고 효과로 정상상태때의 기억력의 37%를 유지시킬 수 있었으며, 그 농도를 체중 1kg당 10mg으로 높여 투여하였을 때는 15마리중 3마리가 사망하였다.

이상의 실험으로 네올린은 체중 1kg당 0.1mg 농도에서 10배 높은 농도의 벨나크린보다 항치매 효과가 우수하며 독성도 훨씬 적은 것으로 일단은 생각할 수 있었다.

기역력을 탁월하게 회복시키는 활성을 나타낸 네올린이 스코폴라민으로 인하여치매가 유발된 생쥐의 학습력에는 어떠한 영향을 미치는가를 알아보았다. 그 결과는 도 3도에 나타내었다. 즉, 네올린을 체중 1kg당 0.1mg의 농도로 복강투여한후, 스코폴라민으로 치매를 유발시키고 능동적 학습능력을 5일간 측정함으로써 알아보았다.

생쥐에게 먼저 빛과 소리를 2초간 주는 조건자극 (conditioned shock)을 준 다음, 계속하여 5초 후에 무조건자극 (unconditioned shock)으로 전기자극 (0.1mA/10g body weight)을 주었다. 생쥐가 무조건자극을 받는 중에 전기자극을 피하여 다른 방으로 이동하는 것을 도피반응 (escape response)이라 하고, 빛과 소리 자극인 조건 자극을 받는 중에 다른 방으로 이동하여 뒤따르는 전기자극을 피하는 것을 조건회피반응 (avoidance response) 이라 하며, 조건자극은 물론 무조건 자극이 종료될 때까지도 다른 방으로 이동하지 않는 것을 무반응(No response)으로 정하였다. 치매가 유발되지 않은 정상 생쥐는 학습을 반복하면 무반응의 횟수가 현저하게 감소되며 훈련 5일 째가 되었을 때는 무반응을 거의 보이지 않았다. 또한, 도피반응보다는 조건회피반응의 횟수가 증가되었으며 학습 1일째는 평균 1.4회이던 조건회피반응의 횟수가 학습 3일째가 되면 평균 9.0회로, 학습 5일째가 되면 평균 16.3회로 증가되었다. 그러나 스코폴라민으로 치매를 유발시킨 생쥐의 경우는 반복된 학습에 따라 증가되는 조건회피반응의 횟수가 정상 생쥐와 비교할 때 현저하게 낮았다.

반복된 학습에 따라 감소되는 무반응의 횟수는 정상 생쥐와 비교하여 유의성 있게 높았다. 즉, 학습 3일째가 되었을 때 치매가 유발된 생쥐의 조건회피반응의 횟수는 평균 4.0회이었으며, 학습 5일째가 되더라도 평균 6.7회 밖에 되지 않았다. 또한, 치매가 유발된 생쥐의 무반응횟수는 학습 5일째가 되더라도 평균 14.0회로 그 횟수가 정상 생쥐에 비하여 현저하게 높았다. 그러나, 네올린을 투여한 경우는 스코폴라민으로 인하여 현저하게 저하되는 학습력이 유지되어 학습 1일째는 평균 1.8회이던 조건회피반응의 횟수가 학습 3일째가 되었을 때는 평균 5.4회, 학습 5일째가 되었을 때는 평균 10.3회이었다. 한편, 무반응의 횟수도 치매가 유발되지 않은 정상 생쥐의 수준을 유지시켰다. 특히, 네올린의 이러한 효과는 벨나크라인이 최고의 기억력 증진효과를 나타내었던 농도인 체중 1kg당 1mg 농도에서의 효과와 비교하여 더욱 우수하였다. 이상의 결과로 네올린은 스코폴라민으로 인하여 저하된 기억력 뿐만 아니라 학습력도 유의성 있게 회복시킴을 알 수 있다.

스코폴라민으로 치매를 유발시킨 생쥐의 기억력과 학습력을 향상시키는 네올린이 치매를 유발시키지 않은 정상 생쥐의 학습력에는 어떠한 영향을 미치는가를 알아보았다. 그 결과는 도4에 나타내었다. 정상 생쥐는 학습을 반복하였을 경우 상기의 결과와 같이 조건회피반응의 횟수가 증가되어 학습 1일째는 평균 1.4회, 학습 3일째는 평균 9.0회였으며, 학습 5일째가 되었을 때는 평균 16.3회로 증가되었다. 한편, 네올린을 복강투여하고 학습을 시킨 생쥐의 경우는 학습 1일째는 평균 1.3회이던 조건회피반응의 횟수가 학습 3일째가 되었을 때 정상 쥐가 5일 동안 학습시켰을 때 보이는 조건회피반응 횟수와 동일한 평균 16.3회에 이르렀다.

이상의 결과로 네올린을 생쥐에 투여하고 훈련을 시키면, 학습력이 향상되어 훈련을 3일동안만 시키더라도 정상 생쥐가 5일간 학습하여야 얻을 수 있는 정도의 학습습득력을 보임을 알았다. 네올린의 이러한 효과는 10배 높은 농도에서의 벨나크린의 효과인 학습 1일째는 1.2±1.1회이던 조건회피반응의 횟수가 학습3일째에 10.2±3.7회, 학습 5일째에 16.6±2.1회보다 더 우수하였다.

이상의 실험으로 포부자로부터 분리한 알칼로이드인 네올린은 생쥐의 기억력과 학습력을 유의성 있게 향상시키며 급성독성도 나타내지 않는 것을 알 수 있었다. 이상의 실험결과로부터 확인되는 바와 같이, 포부자의 저급알코올의 추출물 및 네올린은 치매의 개선제나 예방약으로 개발될 수 있을 것으로 기대되며 이의 작용기전 및 체대 대사, 분포, 독성 등에 관한 연구가 뒷받침되어야 할 것이다.

이상의 실험예로부터 다음의 결과를 도출할 수 있다.

1. 포부자의 총 저급알코올추출물, 이의 부탄올 분획물 및 알칼로이드 함유 분획물은 스코폴라민의 투여로 인하여 저하된 생쥐의 기억력을 향상시켰다.

2. 포부자의 알칼로이드 함유 분획으로부터 단리된 네올린은 스코폴라민으로 인하여 저하된 생쥐의 기억력과 학습력을 향상시켰으며, 정상 상태 때의 생쥐의 학습력도 향상시켰다.

3. 네올린의 항치매 활성은 양성 대조약물로 사용되는 벨나크라인보다 우수하였으며 급성독성도 나타나지 않았다.

이상의 실험결과로부터 부자를 해독시킨 포부자 등의 저급알코올추출물, 이의부탄올 분획물, 알칼로이드함유 분획물 및 네올린은 치매의 예방과 치료용 약물로 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은, 부자를 해독시킨 포부자 등의 저급알코올 추출물, 이의 부탄올 분획물, 알칼로이드함유 분획물 또는 네올린을 통상의 약제학적으로 사용될 수 있는 부형제, 보조제, 회석제 등과 혼합하여 통상의 약제학적으로 사용되는 제제, 예를 들면, 정제, 캅셀제, 산제, 액제, 외용제, 주사제, 좌제 등의 제제형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 부자를 해독시킨 포부자 등의 저급 알코올추출물, 및 이의 부탄올 분획물, 알칼로이드 함유 분획물 또는 네올린 등의 활성성분은 환자의 나이, 치매의 정도, 체중에 따라서 달라질 수 있으나, 일일 0.1 내지 500 mg의 량을 일일 1 내지 수회 투여할 수 있다. 이 양은 질병의 정도, 성별, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다.

다음에 제제실시예를 예시한다.

제제실시예 1

정제의 제조:

포부자 메탄올추출물 500.0mg

유당 500.0mg

탈크 5.0mg

마그네슘 스테아레이트 1.0mg

상기의 성분을 통상의 정제의 제조방법으로 제제화한다.

제제실시예 2

정제의 제조:

포부자의 부탄올분획물 100.0mg

유당 100.0mg

탈크 1.0mg

마그네슘 스테아레이트 적량

상기의 성분을 통상의 정제의 제조방법으로 제제화한다.

제제실시예 3

정제의 제조:

네올린 2.0mg

유당 10.0mg

탈크 적량

마그네슘 스테아레이트 적량

상기의 성분을 통상의 정제의 제조방법으로 제제화한다.

제제실시예 4

캅셀제의 제조:

포부자의 메탄올추출물 500.0mg

유당 500.0mg

탈크 5.0mg

스테아린산 마그네슘 5.0mg

상기의 성분을 통상의 캅셀제의 제조방법으로 제제화한다.

제제실시예

캅셀제의 제조:

네올린 2.0mg

유당 30.0mg

탈크 1.0mg

스테아린산 마그네슘 1.0mg

상기의 성분을 통상의 캅셀제의 제조방법으로 제제화한다.

제제실시예 6

액제의 제조:

포부자의 부탄올 분획 500.0mg

이성화당 20.0g

산화방제제 적량

메틸 파라옥시벤조에이트 적량

정제수 적량 가하여 전체 100.0ml

상기의 성분을 통상의 액제의 제제방법으로 제제화하고 갈색병에 충전하여 액제를 제조한다.

제제실시예 7

액제의 제조:

네올린 100.0mg

이성화당 50.0mg

산화방지제 적량

메틸 파라옥시벤조에에트 적량

정제수 적량 가하여 전체 100.0ml

상기의 성분을 통상의 액제의 제조방법으로 제제화하고 갈색병에 충진하여 액제를 제조한다.

제제실시예 8

산제의 제조:

포부자의 알칼로이드 분획물 50.0mg

유당 100.0mg

탈크 5.0mg

상기의 성분을 통상의 산제의 제조방법으로 혼합하고 봉지에 넣고 밀봉하여 산제를 제조한다.

제제실시예 9

주사제의 제조:

네올린 1.0mg

산화방지제 적량

트윈 80 적량

주사용증류수 적량 가하여 전체 2.0ml

상기의 성분을 통상의 주사제의 제조방법으로 2.0ml의 용량의 앰플에 충전하고 멸균시켜서 주사제를 제조한다.

제제실시예 10

주사제의 제조:

포부자의 부탄올 분획 10.0mg

산화방제제 적량

트윈 80 적량

주사용중류수 적량 가하여 전체 2.0ml

상기의 성분을 통상의 주사제의 제조방법으로 2.0m1의 용량의 앰플에 충전하고 멸균시켜서 주사제를 제조한다.

제제실시예 11

좌제의 제조:

포부자의 메탄올 추출물 500.0mg

PEG 400 2000.0mg

PEG 4000 2000.0mg

상기의 성분을 통상의 좌제의 제조방법으로 가열용융하고 적당한 형틀에 넣고 냉각고화시켜서 좌제를 제조한다.

Claims

해독시킨 부자의 저급알코올 추출물, 이의 부탄올 분획물, 알칼로이드 함유분획물 및 네올린에서 선택된 1종 이상의 성분을 통상의 부형제, 보조제, 희석제등에서 선택된 1종 이상이 성분과 혼합하고 통상의 약제학적으로 허용되는 방법으로 통상의 제제형태로 제형화하여 제조된 치매의 예방과 치료용 조성물.
제 1항에서 제제형태로 산제, 정제, 캅셀제, 약제, 주사제, 좌제의 형태로 제형화한 치매의 예방과 치료용 조성물.
해독시킨 부자의 저급알코올 추출물, 이의 부탄올 분획물, 알칼로이드 함유분획물 및 네올린에서 선택된 1종 이상의 성분을 통상의 부형제, 보조제, 희석제등에서 선택된 1종 이상의 성분과 혼합하고 통상의 약제학적으로 허용되는 방법으로 통상의 제제형태로 제제화하여 치매의 예방과 치료용 조성물을 제조하는 방법.