KR19980702001A - 콕시디오이데스 이미티스 검출용 증폭 프라이머 및 핵산 프로브 - Google Patents

콕시디오이데스 이미티스 검출용 증폭 프라이머 및 핵산 프로브 Download PDF

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다이앤 엘 맥알리스터
캐슬린 에이 클락
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다니엘 엘. 캐시앙
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Abstract

본 발명은 콕시디오이데스 이미티스(Coccidioides immitis)의 검출을 돕는데 특히 유리한 콕시디오이데스 이미티스 핵산 서열을 표적으로 한 올리고뉴클레오티드를 기재한다. 이 올리고뉴클레오티드는 혼성화 검정시험 프로브 및(또는) 증폭 프라이머로서 작용함으로써와 같이 콕시디오이데스 이미티스를 검출하는데 있어서 상이한 방식으로 도움을 줄 수 있다.

Description

콕시디오이데스 이미티스 검출용 증폭 프라이머 및 핵산 프로브
콕시디오이데스 이미티스는 진균성 질환인 콕시디오이데스증의 병인제이다[산 조아퀸 밸리 피버(San Joaquin Valley Fever)]. 사람 및 다른 동물에서의 감염은 일반적으로 폐 내로의 관절분생포자기의 흡입에 따라 발생한다. 질환은 1 내지 4주의 배양기 후에 명백해질 수 있다. 이들 감염의 약 60%는 무증후성이거나 또는 자기 한정성 상부 호흡기 감염을 특징으로 한다. 나머지 40%의 감염은 하부 기도로 진행하여 저절로 치유되거나 또는 때때로 결핵증 또는 암과 유사한 폐동맥의 소결절 또는 공동을 형성하도록 발전할 수 있는 온화한 또는 심각한 폐염을 초래한다. 드물게는, 감염은 피부, 뼈 및 중추 신경계를 포함하여 신체의 거의 모든 기관으로 전염될 수 있다. 콕시디오이데스 이미티스를 포함하여 진균 병원체에 의한 감염의 최근의 증가는 콕시디오이데스 이미티스를 검출하기 위한 신속하고 민감한 방법에 대한 요구를 증가시키고 있다[윌리암 체크(William A. Check), CAP Today, 1994년 8월, 1, 12-16 참조].
콕시디오이데스 이미티스를 동정하는데 사용된 종래의 실험실 동정 방법은 진균 배지 상에서의 배양, 성장 속도, 콜로니 형태, 현미경 형태, 동물 접종 및 생화학적 시험을 포함한다. 이들 시험은 장기간의 배양을 필요로 할 수 있고, 추가의 확인 시험을 필요로 할 수 있다. 동정은 진균 배지 상에서의 시험표본의 배양으로 시작된다. 가시적인 거미줄형 콜로니로 성장시키는데 필요한 시간은 3 내지 21일 범위이고, 성숙 콜로니 형태도 변화한다. 교대식 관절분생포자기의 특징적인 현미경 포자형성 패턴이 나타나기 전에 추가의 성장이 필요하다. 말브란키아(Malbranchea) 및 운시노카르푸스(Uncinocarpus) 속과 같은 자연 발생적 토양 진균을 포함하는, 콕시디오이데스 이미티스 이외의 많은 진균 종들이 유사한 콜로니 및 포자형성 패턴을 생성시킬 수 있다. 일부 효모 유사 미생물, 예를 들면 지오트리쿰(Geotrichum) 및 트리코스포론(Trichosporon) 속도 또한 콕시디오이데스 이미티스와 유사할 수 있다.
동물 접종은 콕시디오이데스 이미티스의 특징인 종 특이적 구상체를 생성시킴으로써 콕시디오이데스 이미티스를 검출하는데 때때로 사용되는 다른 방법이다. 세균의 외막에 의해 만들어지는 항원 추출에 기초한 다른 확인 시험도 설명되어 있지만, 이들 시험은 수행하는데 3 내지 5일 또는 그 이상 걸릴 수 있다.
본 명세서에서 인용된 참고문헌 중 선행기술로 인정된 것은 없다.
발명의 요약
본 발명은 콕시디오이데스 이미티스 핵산 서열을 표적으로 한 올리고뉴클레오티드, 및 콕시디오이데스 이미티스의 검출 방법에 관한 것이다. 혼성화 검정시험 프로브, 증폭 프라이머 및 헬퍼 프로브가 기재된다. 혼성화 검정시험 프로브는 엄격한 혼성화 검정시험 조건 하에서 콕시디오이데스 이미티스 핵산 표적 영역과 우선적으로 혼성화되어 시험 샘플 중에 콕시디오이데스 이미티스가 존재함을 의미하는 검출가능한 듀플렉스(duplex)를 형성할 수 있다. 증폭 프라이머는 본 명세서에서 설명되는 프로브에 의해 검출될 수 있는 콕시디오이데스 이미티스 표적 핵산을 생성시키는 증폭 반응을 이끌어내는데(prime) 사용될 수 있다. 또한 콕시디오이데스 이미티스의 검출을 위한 혼성화 검정시험에 사용하기 위한 프로브 혼합체도 본 발명을 구성한다.
제1면에서, 본 발명은 하기하는 서열들 중의 하나를 갖는 혼성화 검정시험 프로브를 특징으로 한다.
서열 21
GCGCCACGGC ATAAGTTCCT TG
서열 22
CAAGGAACTT ATGCCGTGGC GC
서열 23
GCGCCACGGC AUAAGUUCCU UG
서열 24
CAAGGAACUU AUGCCGUGGC GC
이 프로브는 엄격한 혼성화 검정시험 조건 하에서 콕시디오이데스 이미티스 표적 핵산 서열 영역과 우선적으로 혼성화함으로써, 밀접하게 관련된 계통발생학적 이웃들과 콕시디오이데스 이미티스를 구별할 수 있다. 혼성화 검정시험 프로브는 콕시디오이데스 이미티스의 존재를 검출하는데 및(또는) 시험 샘플, 예를 들면 객담, 뇨, 혈액, 조직 절편, 음식물, 토양 및 물의 샘플 중의 콕시디오이데스 이미티스의 양을 측정하는데 유용하다. 콕시디오이데스 이미티스의 28S rRNA 소단위와의 다른 혼성화 프로브는 밀리만(Milliman)의 미국 특허 제5,284,747호(선행기술로 인정되지 않음)에 이미 기재되어 있다.
프로브는 콕시디오이데스 이미티스 표적 서열에 완전히 상보적인 또는 실질적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열을 함유한다. 혼성화 검정시험 프로브는 엄격한 혼성화 검정시험 조건 하에서 검출가능한 하이브리드 프로브:표적 듀플렉스를 형성할 수 있도록 표적 서열을 함유하는 핵산에 충분히 상보적이다. 혼성화 검정시험 프로브는 바람직하게는 길이 14 내지 100의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 길이 15 내지 50의 뉴클레오티드이다. 더욱 더 바람직하게는 프로브는 길이 15 내지 25의 뉴클레오티드이다.
혼성화 검정시험 프로브는 바람직하게는 리포터 기 성분, 예를 들면 프로브내로 혼입된 방사성동위원소, 형광 성분, 화학루미네센스 성분, 효소 또는 리간드로 표지된다. 이 성분을 사용하여 프로브의 그의 표적 서열과의 혼성화를 검출 또는 확인할 수 있다.
우선적으로 혼성화한다란 엄격한 혼성화 검정시험 조건 하에서, 혼성화 검정시험 프로브가 그들의 표적 핵산과 혼성화되어 표적 핵산의 존재를 의미하는 안정한 프로브:표적 하이브리드를 형성할 수 있고, 밀접하게 관련된 비표적 핵산의 존재를 의미하는 충분한 수의 안정한 프로브:비표적 하이브리드를 형성시키지 않음을 의미한다. 따라서, 프로브는 당업계의 통상의 숙련인이 콕시디오이데스 이미티스의 존재를 정확하게 검출할 수 있고 그의 존재를 밀접하게 관련된 미생물의 존재와 구별할 수 있도록 비표적 핵산보다 충분히 많은 정도로 표적 핵산과 혼성화한다.
콕시디오이데스 이미티스와 밀접하게 관련된 미생물로는 말브란키아 알볼루테아(Malbranchea albolutea), 블라스토마이세스 데르마티티디스(Blastomyces dermatitidis), 칸디다 파라프실로시스(Candida parapsilosis), 히스토플라스마 캅술라툼(Histoplasma capsulatum), 옥사르트론 탁스테리(Auxarthron thaxteri), 짐노아스쿠스 두과옌시스(Gymnoascus dugwayensis), 아스페르길러스 플라부스(Aspergillus flavus), 믹소트리쿰 데플렉숨(Myxotrichum deflexum), 아스페르길리스 니게르(Aspergillis niger), 칸디다 크루세이(Candida krusei), 칸디다 글라브라타(Candida glabrata), 아스페르길리스 푸미가투스(Aspergillis fumigatus), 아라크니오이테스 플라볼루테우스(Archnioites flavoluteus), 오이디오덴드론 에키눌라툼(Oidiodendron echinulatum), 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 및 말브란키아 덴드리티쿠스(Malbranchea dendriticus)를 들 수 있다. 임상적으로 가장 중요한, 밀접하게 관련된 미생물은 블라스토마이세스 데르마티티디스 및 히스토플라스마 캅술라툼이다.
본 발명의 다른 면은 혼성화 검정시험 프로브로 구성된 핵산 하이브리드 및 여기에 실질적으로 상보성인 핵산 서열을 갖는 콕시디오이데스 이미티스 핵산 분자를 함유하는 조성물에 관한 것이다. 하이브리드는 바람직하게는 길이가 15 내지 100 뉴클레오티드인 2중 스트랜드의 수소 결합된 영역을 포함하는 안정한 핵산 구조이다. 상기 하이브리드는 RNA:RNA, RNA:DNA, 또는 DNA:DNA 듀플렉스 분자를 포함한다. 핵산 하이브리드에 존재하는 혼성화 프로브는 하기하는 서열들 중의 하나를 함유하게 된다: 서열 21-24.
실질적으로 상보성이란 핵산 서열이 엄격한 혼성화 검정시험 조건 하에서 표적 핵산 영역과 우선적으로 혼성화할 수 있음을 의미한다. 바람직하게는, 프로브는 대응하는 표적 영역에 상보적인 10 염기 중 9의 영역을 갖는다. 보다 바람직하게는, 프로브는 대응하는 표적 영역에 상보적인 17 염기 중 14의 영역을 갖는다.
본 발명의 다른 면은 혼성화 검정시험에 사용하기 위한 혼성화 프로브 및 헬퍼 프로브를 함유하는 프로브 혼합체를 구성한다. 헬퍼 프로브는 혼성화 검정시험 프로브와 그의 표적 서열 영역의 혼성화를 용이하게 하기 위하여 사용될 수 있다. 헬퍼 프로브는 표적:혼성화 프로브 듀플렉스의 반응속도 및(또는) Tm을 향상시킴으로써 혼성화를 용이하게 한다. 헬퍼 프로브는 일반적으로 본 명세서에서 참고문헌으로 인용하고 있는 호간(Hogan) 및 밀리만(Milliman)의 미국 특허 제5,030,557호에 기재되어 있다. 바람직한 실시태양에서, 프로브 혼합체의 헬퍼 올리고뉴클레오티드는 헬퍼 프로브 서열 25 GAACAGGACG TCATAGAGGG TGAGAATCC 또는 그의 RNA 등가물(서열 27)을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어지거나 또는 이와 실질적으로 유사하다. 프로브 혼합체의 혼성화 검정시험 프로브는 하기하는 서열들 중의 하나를 함유하게 된다: 서열 21-24.
RNA 및 DNA 등가 뉴클레오티드는 등가의 염기쌍 혼성화 특성을 갖는 RNA 및 DNA 분자를 말한다. RNA 및 DNA 등가물은 상이한 당 기(즉, 리보오스 대 데옥시리보오스)를 갖고, RNA 중에서는 우라실 및 DNA 중에서는 티민의 존재에 의해 상이할 수 있다. RNA 및 DNA 등가물 사이의 차이는 실질적으로 유사한 핵산 서열의 차이의 원인이 되지 않는다.
혼성화 검정시험 프로브 또는 헬퍼 프로브에 관하여, 실질적으로 유사한 뉴클레오티드 서열은 동정된 뉴클레오티드 서열과 동일하거나 또는 이 서열과 10% 이하의 뉴클레오티드 염기 차이(RNA 또는 DNA 등가 뉴클레오티드의 치환, 예를 들면 T를 U로 또는 U를 T로 치환은 제외)를 갖고, 콕시디오이데스 이미티스를 검출하기 위해 사용된 엄격한 혼성화 검정시험 조건 하에서 프로브가 콕시디오이데스 이미티스 핵산과 혼성화할 수 있도록 하는 뉴클레오티드 서열이다. 증폭 올리고뉴클레오티드에 관하여, 실질적으로 유사한 뉴클레오티드 서열은 동정된 뉴클레오티드 서열과 동일하거나 또는 이 서열과 10% 이하의 뉴클레오티드 염기 차이(RNA 또는 DNA 등가 뉴클레오티드의 치환은 제외)를 갖고, 증폭 조건 하에서 증폭 올리고뉴클레오티드가 콕시디오이데스 이미티스 표적 핵산의 증폭을 이끌어낼 수 있도록 하는 뉴클레오티드 서열이다. 별법의 실시태양에서, 혼성화 검정시험 프로브, 헬퍼 프로브 또는 증폭 올리고뉴클레오티드의 경우에 실질적으로 유사한이란 특정 뉴클레오티드 서열을 함유하는 올리고뉴클레오티드에 대한 상보성에서의 5% 차이를 말한다.
구 ∼로 본질적으로 이루어지고 또는 ∼로 본질적으로 이루어지는이란 올리고뉴클레오티드가 명시된 뉴클레오티드 서열과 실질적으로 유사한 뉴클레오티드 서열을 갖고, 바람직하게는 4개 이하의 추가의 뉴클레오티드만큼 더 길거나 또는 2개의 뉴클레오티드만큼 더 짧은 것을 의미한다. 따라서, 이들 구는 서열 길이 제한 및 서열 변화 제한을 모두 함유한다. 올리고뉴클레오티드가 그의 청구된 특성을 갖지 못하도록 하지는 않는 임의의 추가 또는 결실은 명시된 뉴클레오티드 서열의 비물질 변화이다. 예를 들면, 혼성화 프로브 및 헬퍼 프로브에 관하여, 임의의 추가 또는 결실은 혼성화 프로브 또는 헬퍼 프로브가 엄격한 혼성화 검정시험 조건 하에서 비표적 핵산에 비해 그의 표적 핵산과 우선적으로 혼성화될 수 없도록 하지는 않는다. 증폭 올리고뉴클레오티드에 관하여, 임의의 추가 또는 결실은 증폭 올리고뉴클레오티드가 증폭 조건 하에서 콕시디오이데스 이미티스 핵산과 혼성화할 수 없도록 하거나 또는 증폭 조건 하에서 표적 콕시디오이데스 이미티스 핵산을 생성시키는 증폭 반응을 이끌어낼 수 없도록 하지는 않는다.
다른 면에서, 본 발명은 콕시디오이데스 이미티스 표적 영역을 증폭시키는데 유용한 증폭 올리고뉴클레오티드를 구성한다. 증폭 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 길이 15 내지 100의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 15 내지 60의 뉴클레오티드이다. 증폭 올리고뉴클레오티드는 블록된 3' 말단과 같은, 변형을 가질 수 있다.
증폭 올리고뉴클레오티드는 프라이머로서 작용할 수 있고, 프로모터-프라이머 혼합물의 일부분, 즉 RNA 폴리머라제에 의해 인식되는 5' 말단에 부착된 특이적 핵산 서열(T7, T3 또는 SP6 RNA 폴리머라제에 대한 프로모터 서열, 또는 RNA 폴리머라제에 의한 RNA 전사의 개시 또는 신장을 향상시키는 서열을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않음)을 갖는 프라이머일 수 있다. 프로모터 서열의 한 예로서는 서열 41 5'-AATTTAATAC GACTCACTATAGGGAGA-3'을 들 수 있다. 유용한 프로모터 서열의 다른 예들은 예를 들면 스트라타진 클로닝 시스템즈(Stratagene Cloning Systems)의 pBluescript(등록상표) 벡터 또는 프로메가 바이오텍(Promega Biotec)의 pGEM(등록상표) 벡터를 포함하여 각종의 시판되는 벡터 중에 함유된다.
바람직하게는, 증폭 올리고뉴클레오티드는 하기하는 서열들 중의 하나를 갖거나, 서열들 중의 하나로 본질적으로 이루어지거나, 서열들 중의 하나로 이루어지거나, 또는 서열들 중의 하나와 실질적으로 유사한 프라이머 서열을 함유한다.
서열 9
GCTCAAATTT GAAATCTGTC CATGCGGAGC
서열 11
(서열 9에 대한 RNA 등가물)
서열 29
GTCCAGCAGC CACAGACGGG ATTC
서열 31
(서열 29에 대한 RNA 등가물)
서열 33
CACAGACGGG ATTCTCACCC TC
서열 35
(서열 33에 대한 RNA 등가물)
서열 37
GGATTCTCAC CCTCTATGAC GTCCTG
서열 39
(서열 37에 대한 RNA 등가물)
보다 바람직하게는, 증폭 올리고뉴클레오티드는 서열 33, 35, 37, 39에 대응하는 프라이머 서열을 함유하게 된다. 더욱 더 바람직하게는, 증폭 올리고뉴클레오티드는 서열 37, 39에 대응하는 프라이머 서열을 함유하게 된다.
프로모터 서열을 갖는 증폭 올리고뉴클레오티드의 예는 다음과 같다.
서열 1
AATTTAATAC GACTCACTAT AGGGAGAGTC CAGCAGCCAC AGACGGGATT C
서열 5
AATTTAATAC GACTCACTAT AGGGAGACAC AGACGGGATT CTCACCCTC
서열 13
AATTTAATAC GACTCACTAT AGGGAGAGGA TTCTCACCCT CTATGACGTC CTG
보다 바람직하게는, 증폭 올리고뉴클레오티드는 서열 5, 13에 의해 제공되는 서열을 갖거나, 이 서열로 본질적으로 이루어지거나, 이 서열로 이루어지거나 또는 실질적으로 이 서열과 유사하다. 더욱 더 바람직하게는, 증폭 올리고뉴클레오티드는 서열 13에 의해 제공되는 서열을 갖거나, 또는 이 서열로 본질적으로 이루어진다.
증폭 올리고뉴클레오티드는 핵산 증폭 방법, 예를 들면 본 명세서에서 참고문헌으로 인용한, 상기한 카시안(Kacian) 및 펄쯔(Fultz)가 기재한 바와 같이, RNA 폴리머라제, DNA 폴리머라제 및 RNaseH 또는 그의 등가물을 사용하는 전사 매개 증폭 반응 또는 폴리머라제 연쇄 반응에 사용될 수 있다. 또한, 증폭 검정시험에 전사를 이용하는 다른 방법은 스닌스키(Sninsky) 등의 미국 특허 제5,079,351호에 기재되어 있다.
증폭 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산과 혼성화하고, 핵산 합성에 대한 프라이머로서 작용할 수 있다. 프라이머의 연장에 의해 증폭된 올리고뉴클레오티드는 혼성화 검정시험 프로브에 대해 상보적이게 된다. 바람직하게는, T7, T3 또는 SP6 RNA 폴리머라제와 같은 RNA 폴리머라제에 의해 인식되는 프로모터는 전사 기재 증폭에 사용된다.
증폭은 혼성화 검정시험 프로브에 대해 상보적인 1개 이상의 표적 핵산 서열을 갖는 핵산 분자 수의 증가를 의미한다. 표적 서열을 함유하는 올리고뉴클레오티드의 증폭을 증가시키기 위해서는, 증폭은 바람직하게는 RNA 폴리머라제에 대한 주형으로서 사용되는 2중 스트랜드의 프로모터 영역을 함유하는 표적-주형 스트랜드의 생성을 포함한다.
다른 면에서, 콕시디오이데스 이미티스를 검출하고 콕시디오이데스 이미티스와 밀접하게 관련된 미생물을 구별하는데 혼성화 검정시험 프로브, 헬퍼 프로브 및 증폭 올리고뉴클레오티드를 사용하는 방법을 설명한다. 이들 증폭 검정시험은 바람직하게는, 시험하고자 하는 샘플 중에서 표적 핵산을 증폭시키고, 증폭된 서열을 엄격한 혼성화 검정시험 조건 하에서 밀접하게 관련된 미생물 중에 존재하는 핵산에 비해 콕시디오이데스 이미티스 핵산과 우선적으로 혼성화하는 혼성화 검정시험 프로브와 접촉시키고, 혼성화된 프로브의 양을 측정하는 것을 포함한다.
샘플은 바람직하게는 음식물, 토양, 또는 물; 객담, 뇨, 혈액 또는 조직 절편과 같은 임상학적 샘플; 또는 배양시킨 샘플로부터 단리한 핵산이다. 보다 바람직하게는, 증폭 검정시험은 임상학적 샘플로부터 콕시디오이데스 이미티스를 직접적으로 검출하는데 사용되게 된다. 임상학적 샘플로부터의 직접적인 검출이란 진균 배지 상에서의 샘플의 배양이 검출 또는 증폭 전에 수행되지 않음을 의미한다.
바람직하게는, 증폭 검정시험은 하기하는 서열들 중의 하나로 이루어진 혼성화 프로브를 이용한다: 서열 17-24. 바람직한 실시태양의 증폭 검정시험에 사용하기 위한 헬퍼 프로브는 서열 25 및 서열 27을 갖거나 또는 이와 실질적으로 유사하다. 바람직한 실시태양의 증폭 검정시험에 사용될 수 있는 증폭 올리고뉴클레오티드는 서열 1, 5, 13을 갖거나, 이 서열로 본질적으로 이루어지거나, 이 서열로 이루어지거나 또는 이 서열과 실질적으로 유사하다. 보다 바람직하게는, 증폭 검정시험에 사용되는 증폭 올리고뉴클레오티드는 서열 5, 13을 갖거나, 이 서열로 본질적으로 이루어지거나, 이 서열로 이루어지거나 또는 이 서열과 실질적으로 유사하다. 더욱 더 바람직하게는, 증폭 검정시험에 사용되는 증폭 올리고뉴클레오티드는 서열 13을 갖거나, 이 서열로 본질적으로 이루어지거나, 이 서열로 이루어지거나 또는 이 서열과 실질적으로 유사하다. 다른 실시태양에서, 증폭 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 서열 9, 11, 29, 31, 33, 35, 37, 39를 갖거나, 이 서열로 본질적으로 이루어지거나, 이 서열로 이루어지거나 또는 이 서열과 실질적으로 유사하고; 또한 이들 증폭 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 RNA 폴리머라제, 바람직하게는 T7 RNA 폴리머라제에 대한 프로모터인 5' 말단에 대한 핵산 서열을 함유하게 된다. 더욱 더 바람직하게는, 이 첨가된 핵산 서열은 서열 41로 본질적으로 이루어지게 된다.
콕시디오이데스 이미티스를 표적으로 한 올리고뉴클레오티드는 콕시디오이데스 이미티스의 균주 및 상이한 종에 대해 독특한 특이적 핵산 서열의 존재를 검출함으로써 신속하고 비주관적인 콕시디오이데스 이미티스의 동정 및 정량화 방법을 제공한다. 본 발명의 프로브는 1시간 이내에 배양물로부터 단리된 콕시디오이데스 이미티스를 동정하는 혼성화 분석에 사용될 수 있다. 또한, 증폭 단계의 이용은 3시간 이내에 임상학적 샘플로부터 직접적으로 콕시디오이데스 이미티스를 검출할 수 있도록 한다.
증폭 검정시험에서 증폭 단계와 혼성화 검정시험의 혼합은 표적물의 양을 증가시키고, 따라서 콕시디오이데스 이미티스를 배양할 필요 및 실험실 작업자들에 대한 감염이라는 이에 따른 고유의 위험을 제거할 수 있다. 혼성화 검정시험 또는 증폭 검정시험이 배양 시험과 함께 수행될 경우, 검정시험은 실험실 작업자들에게 배양 샘플 중에 콕시디오이데스 이미티스가 존재함을 경고할 수 있다.
본 발명의 다른 특징 및 이점들은 하기하는 본 발명의 바람직한 실시태양의 설명, 및 특허 청구의 범위로부터 명백하게 드러날 것이다.
본 발명은 콕시디오이데스 이미티스(Coccidioides immitis) 핵산을 표적으로 한 올리고뉴클레오티드의 디자인 및 용도에 관한 것이다. 혼성화 검정시험 프로브, 헬퍼 프로브, 및 증폭 올리고뉴클레오티드를 포함하는 상이한 유형의 올리고뉴클레오티드가 기재된다. 올리고뉴클레오티드는 예를 들면 객담, 조직 샘플, 체액, 실험 용액 및 배양물로부터의 시험 샘플 중에서 콕시디오이데스 이미티스 종을 검출하는데 특히 유용하다.
여기에서는, 콕시디오이데스 이미티스 rRNA 또는 rDNA 내의 표적 서열과 혼성화되도록 디자인된 혼성화 검정시험 프로브, 헬퍼 프로브 및 증폭 올리고뉴클레오티드에 대한 바람직한 서열이 설명된다. 또한, 콕시디오이데스 이미티스를 검출하는데 유용한 혼성화 검정시험 프로브 및 헬퍼 프로브의 바람직한 혼합체가 설명된다. 또한 혼성화 검정시험 프로브 및 표적 서열에 의해 형성된 하이브리드도 설명된다. 콕시디오이데스 이미티스를 검출하기 위해 프로브 및 증폭 올리고뉴클레오티드를 사용하는 바람직한 방법도 본 설명에 포함된다.
I.혼성화 검정시험 프로브의 구성 및 이용
A.rRNA 서열의 제조
바이러스를 제외하고, 모든 원핵 미생물은 5S rRNA, 16S rRNA, 및 23S rRNA로 알려진 보다 큰 rRNA 분자와 상동성인 RNA를 코딩하는 rRNA 유전자를 함유한다. 진핵세포에서 이들 rRNA 분자는 원핵 분자와 실질적으로 유사한 5S rRNA, 18S rRNA 및 28S rRNA이다. 밀리만(Milliman)의 미국 특허 제5,284,747호는 콕시디오이데스 이미티스로부터 얻은 특정 28S rRNA 서열에 상보성인 핵산 프로브를 이미 기재하였고, 본 명세서에서는 이를 참고문헌으로 인용한다.
서열 정보는 실험적으로 및 공개된 정보로부터 얻었다[바이스버그(Weisburg) 등,J. Bacteriol171:6455 (1989) 참조]. 실험적인 정보는 당업계에 공지된 표준 기술을 사용하여 각종의 미생물로부터 rRNA를 단리하고 서열화함으로써 얻었다. 보다 구체적으로는, rRNA 서열 정보는 먼저 원핵 미생물들 사이에서 거의 변하지 않는 보존 영역에 상보적인 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 얻었다. 올리고뉴클레오티드 프라이머를 28S 소단위에 특이적인 정제시킨 rRNA 중의 보존 영역과 혼성화시키고, 효소 역 전사효소 및 데옥시리보뉴클레오티드로 연장시켜 cDNA를 생성시킨다[예를 들면, 레인(Lane) 등,Proc. Nat'l Acad. Sci. USA82:6955 (1985)].
B.프로브 디자인
데옥시리보-(DNA) 또는 리보-(RNA) 핵산의 스트랜드를 특이적 배열로 연결된 뉴클레오티드 단위, 또는 서열로부터 형성시킨다. 뉴클레오티드 소단위는 염기 구조를 함유하고, 염기에 의해 다른 뉴클레오티드와 구별된다. 염기로는 아데닌(A), 시토신(C), 티민(T), 구아닌(G), 우라실(U), 또는 이노신(I)을 들 수 있다.
뉴클레오티드 중의 염기의 구조는 특정의 염기쌍들이 수소 결합의 형성을 통해 다른 염기쌍과 상호작용할 수 있도록 한다. 일반적으로, A는 T 또는 U와 결합하는 반면, G는 C와 수소 결합한다. 그러므로, 사슬을 따라 임의의 지점에서, 전통적인 염기쌍 AT 또는 AU, TA 또는 UA, GC 또는 CG를 발견할 수 있다. AG, GU 및 동요(wobble) 또는 부적당하게 짝을 이룬 염기쌍도 또한 발견할 수 있다. 수소 결합할 수 있는 염기들은 서로 상보성인 것으로 말해진다.
DNA 또는 RNA의 2개의 단일 스트랜드는 특이적으로 정렬하고 결합하여(혼성화), 2개의 스트랜드가 상보적인 염기쌍들 사이에서 형성되는 수소 결합에 의해 함께 고정되는 2중 스트랜드 구조를 형성한다. 핵산의 제1 단일 스트랜드가 제2 스트랜드에 대해 충분히 인접하는 상보성 염기를 함유하고, 이들 2개의 스트랜드가 그들의 혼성화를 촉진시키는 조건 하에서 함께 놓여졌을 때 2중 스트랜드 핵산이 생겨난다. 적절한 조건 하에서, 2중 스트랜드의 DNA/DNA, RNA/DNA 또는 RNA/RNA 하이브리드가 형성될 수 있다. 주어진 2중 스트랜드 하이브리드를 형성하는 가능성을 감소시키는 조건은 하이브리드 형성이 덜 적당한 조건에 비해 더 엄격한 조건인 것으로 말해진다.
프로브는 일반적으로 검출하고자 하는 표적 서열로 이루어진 핵산 올리고뉴클레오티드 표적 영역과 어느 정도 상보성인 단일 스트랜드의 핵산 서열이다. 프로브는 방사성동위원소, 항원 또는 화학루미네센스 성분과 같은 검출가능한 성분을 함유할 수 있다. 특정 핵산 서열의 검출을 위한 방법으로서 핵산 혼성화를 사용하는 것의 배경 설명은 본 명세서에서 참고문헌으로 인용하고 있는, Nucleic Acid Probes for Detection and/Or Quantitation of Non-Viral Organisms 제목의 호간(Hogan) 등의 국제 특허 출원 번호 제PCT/US87/03009호에 기재되어 있다.
본 명세서에서 기재하고 당업계의 통상의 숙련인에게 공지된 방법을 사용하여, 콕시디오이데스 이미티스의 28S rRNA로부터의 rRNA 서열의 가변 영역을 동정하였다. rRNA 분자는 기능하기 위하여 2차 구조의 밀접한 관계를 나타낸다. 이 밀접한 관계는 부분적으로는 rRNA 분자의 상이한 영역들 사이의 분자내 수소 결합 상호작용에 의해 야기된다. 수소 결합 상호작용은 그의 스트랜드가 동일한 rRNA 분자의 상이한 영역인 이중 나선 구조의 형성으로 이끈다. 이 이중 스트랜드의 나선 구조의 형성은 1차 서열에서의 진화성 변화에 제한을 가하여 2차 구조가 유지되도록 한다. 이것은 2개의 매우 상이한 서열이 보존된 1차 서열에 기초하고 또한 보존된 2차 구조 엘레멘트에 기초하여 정렬되도록 한다. 본 명세서에서 설명한 혼성화 검정시험 프로브에 대한 잠재적인 표적 서열을 정렬된 서열의 상동성에서의 변화를 알아차림으로써 동정할 수 있다.
각각의 가변 영역에서의 서열 진화는 대부분 발산성이다. 이러한 발산 때문에 콕시디오이데스 이미티스의 보다 거리가 있는 계통발생학적 일가의 대응하는 rRNA 가변 영역은 계통발생학적으로 보다 가까운 일가의 rRNAs보다 콕시디오이데스 이미티스 rRNA와 더 큰 차이를 나타낸다. 콕시디오이데스 이미티스와 그의 임상학적으로 중요한, 밀접하게 관련된 계통발생학적 일가, 예를 들면 블라스토마이세스 데르마티티디스 및 히스토플라스마 캅술라툼 사이의 충분한 변화를 관찰하여 바람직한 표적 부위를 동정하고 이들 미생물의 핵산들을 구별하는데 유용한 혼성화 검정시험 프로브를 디자인하였다. 이들 가변 영역을 이어서 혼성화 검정시험 프로브에 대한 표적 서열 영역으로서 사용하였다.
B.올리고뉴클레오티드 프로브
본 출원은 콕시디오이데스 이미티스에 대해 특이적인 혼성화 검정시험 프로브, 및 콕시디오이데스 이미티스와 밀접하게 관련된 분류학적 또는 계통발생학적 이웃을 구별하여 콕시디오이데스 이미티스를 검출하기 위한 특이적 검정시험에서의 이들의 사용을 설명한다. 프로브:표적물 하이브리드 형성을 용이하게 하기 위하여 헬퍼 프로브 및 표적 서열을 증폭시키는데 사용할 수 있는 증폭 올리고뉴클레오티드도 또한 설명한다.
혼성화 검정시험 프로브는 엄격한 혼성화 검정시험 조건 하에서 콕시디오이데스 이미티스 표적 핵산 서열 영역과 우선적으로 혼성화함으로써 밀접하게 관련된 계통발생학적 이웃과 콕시디오이데스 이미티스를 구별할 수 있는 올리고뉴클레오티드이다. 상기한 프로브는 하기하는 서열들 중의 하나로 이루어진다: 서열 21-24.
올리고뉴클레오티드, 뉴클레오티드 중합체 또는 핵산이란 공유적으로 함께 연결된 2개 이상의 뉴클레오티드 소단위를 의미한다. 뉴클레오티드 소단위의 당 기는 리보오스, 데옥시리보오스 또는 이들의 개질된 유도체, 예를 들면 O-메틸 리보오스일 수 있다. 뉴클레오티드 소단위는 포스포디에스테르 결합 또는 변형된 결합과 같은 결합에 의해 또는 올리고뉴클레오티드와 그의 상보성 표적 핵산과의 우선적인 혼성화를 방해하지 않는 비뉴클레오티드 성분에 의해 연결될 수 있다. 변형된 결합으로는 표준 포스포디에스테르 결합이 상이한 결합, 예를 들면 포스포티오네이트 결합 또는 메틸포스포네이트 결합으로 대체된 결합을 들 수 있다.
프로브는 단리된 핵산이다. 사람의 간섭(예를 들면 외부 핵산과의 재조합, 단리 또는 어느 정도까지의 정제) 없이 자연적으로는 발견되지 않는 형태로 존재하는 단리된 핵산이란 올리고뉴클레오티드 또는 핵산 분자를 의미한다. 바람직하게는, 단리된 핵산 프로브는 사용 전에 존재하는 전체 핵산의 90% 이상을 구성하는 제제로 존재한다.
프로브는 또한 추가의 뉴클레오티드가 표적 영역과의 혼성화를 방해하지 않고 혼성화 검정시험 프로브의 경우 우선적인 혼성화를 방해하지 않는 한, 표적 영역과 인접하는 핵산 서열에 상보적이거나 또는 상보적이지 않는 추가의 뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 비상보적 서열, 예를 들면 프로모터 서열, RNA 전사를 위한 결합 부위, 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위, 또는 소정의 2차 또는 3차 구조, 예를 들면 촉매적 활성 부위를 제공하게 되는 서열을 사용하여 검출 및(또는) 증폭을 용이하게 할 수 있다.
하기하는 실시예에 의해 예시되는 바와 같이, 기재한 혼성화 검정시험 프로브는 콕시디오이데스 이미티스를 검출하고, 이것을 말브란키아 덴드리티쿠스 및 오이디오덴드론 에키눌라툼과 구별할 수 있다. 프로브는 또한 콕시디오이데스 이미티스를 다른 밀접하게 관련된 분류학적 또는 계통발생학적 이웃, 예를 들면 블라스토마이세스 데르마티티디스 및 히스토플라스마 캅술라툼과 구별할 수도 있다.
C.혼성화
혼성화 검정시험 프로브 및 헬퍼 프로브는 엄격한 혼성화 조건 하에서 그들의 표적 서열과 혼성화한다. 헬퍼 프로브 또는 증폭 올리고뉴클레오티드로 작용하는 올리고뉴클레오티드는 콕시디오이데스 이미티스 핵산과 우선적으로 혼성화할 수 있을 필요가 없다.
혼성화 검정시험 프로브와 그들의 표적 핵산과의 우선적인 혼성화는 적합한 혼성화 검정시험 조건 및 적절한 프로브 디자인을 선택함으로써 달성될 수 있다. 프로브:표적 핵산 하이브리드의 안정성은 안정하고 검출가능한 하이브리드가 고도로 상보성인 서열을 갖는 핵산들 사이에서만 형성되도록 검정시험 및 세척 조건과 상용성이도록 선택되어야 한다. 1개 이상의 상이한 검정시험 파라미터의 조작은 특정 혼성화 검정시험 프로브의 특이성 및 정확한 감수성을 결정한다.
우선적인 혼성화는 엄격한 검정시험 조건 하에서 일어날 수 있다. 일반적으로, 올리고뉴클레오티드 표적화된 영역의 그의 표적 서열 영역에 대한 상보성 정도의 감소는 프로브 올리고뉴클레오티드와 그의 표적 서열 영역과의 혼성화 정도 또는 속도를 감소시킨다. 그러나, 추가의 비상보성 뉴클레오티드(들)는 비표적 미생물에 대해 식별할 수 있는 올리고뉴클레오티드의 능력을 촉진할 수 있다.
우선적인 혼성화는 당업계에 공지되어 있고, 아래에서 제공되는 실시예에서와 같이 본 명세서에서 설명되는 기술을 사용하여 측정할 수 있다. 바람직하게는, 표적과 비표적 혼성화 시그널 사이에는 100배 이상, 보다 바람직하게는 1,000배 이상, 더욱 더 바람직하게는 10,000배 이상의 차이가 있다. 또한 바람직하게는, 비표적 혼성화 시그널은 배경 수준 이하이다.
하기하는 지침서는 프로브를 디자인하고 특이적인 엄격한 혼성화 검정시험 조건을 결정하는데 유용하다. 본 명세서에서 설명하는 바와 같은 혼성화 반응의 감수성 및 특이성이 많은 인자들, 예를 들면 혼성화 검정시험 프로브 뉴클레오티드 서열 및 길이, 표적 서열 영역의 서열, 밀접하게 관련된 미생물로부터의 상사적 리보솜 핵산 서열과 표적 서열 사이의 상동성 정도, 혼성화 온도 및 혼성화 시약의 조성에 의해 영향을 받기 때문에, 이들 인자들 중의 1개 이상의 조작은 그의 표적에 대해 완전히 상보적이거나 또는 아니거나, 특정 프로브의 정확한 감수성 및 특이성을 결정하게 된다. 본 명세서에서 추가로 설명된 각종 혼성화 검정시험 조건의 중요성 및 효과는 당업계의 통상의 숙련인에게 공지되어 있다.
첫째로, 프로브:표적 핵산 하이브리드의 안정성은 안정하고 검출가능한 하이브리드가 고도로 상보성인 서열을 갖는 핵산들 사이에서만 형성되도록 검정시험 및 세척 조건과 상용성이도록 선택되어야 한다. 프로브는 적합한 용융 온도(Tm)를 갖도록 디자인되어야 한다. 이것은 프로브 길이 및 뉴클레오티드 조성(G+C 대 A+T의 %)을 변화시킴으로써 달성될 수 있다. 프로브 길이 및 뉴클레오티드 조성은 바람직하게는 최종 검정시험이 수행되게 되는 온도보다 약 2 내지 10 ℃ 더 높은 Tm에 상응하도록 선택된다. 예를 들면, Tm은 긴 A 및 T 풍부 서열을 피함으로써 또는 하이브리드를 G:C 염기쌍으로 종료시킴으로써 증가될 수 있다. 프로브의 시작 및 종료 지점은 길이 및 G% 및 C%가 최종 검정시험이 수행되게 되는 온도보다 약 2 내지 10 ℃ 더 높은 Tm을 초래하도록 선택되어야 한다.
일반적으로, 올리고뉴클레오티드에 대한 최적 혼성화 온도는 주어진 듀플렉스에 대한 용융 온도보다 약 5 ℃ 이하이다. 최적 온도 이하의 온도에서의 배양은 부적당하게 짝을 이룬 염기 서열이 혼성화할 수 있도록 하여, 특이성을 감소시킬 수 있다. 올리고뉴클레오티드가 더 길수록, 수소 결합하는 더 많은 염기쌍들이 존재하고, 일반적으로 Tm이 더 높다. 프로브의 염기 조성은 G-C 염기쌍이 A-T 염기쌍보다 큰 추가의 수소 결합, 따라서 더 큰 열 안정성을 나타내기 때문에 중요하다[예를 들면, 2 샘브룩(Sambrook) 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 11 (2차 편집, 1989), (이하Molecular Colning이라 함) 참조]. 따라서, 보다 높은 G-C 함량의 상보적인 핵산을 포함하는 혼성화는 보다 높은 온도에서 안정하게 된다.
혼성화 검정시험 프로브의 그의 표적에 대한 특이성을 보장하기 위하여, 고도의 엄격함을 갖는 조건 하에서 단지 표적 핵산하고만 혼성화하는 프로브를 디자인하는 것이 바람직하다. 고도의 엄격함을 갖는 조건 하에서는 단지 매우 상보적인 핵산 하이브리드만이 형성되게 된다. 따라서, 검정시험 조건의 엄격함은 이들 조건 하에서 하이브리드를 형성하기 위하여 2개의 핵산 스트랜드 사이에 존재해야 하는 상보성의 양을 결정한다. 엄격함은 프로브:표적물 하이브리드와 잠재적인 프로브:비표적 하이브리드 사이의 안정성의 차이를 최대화시키도록 선택되어야 한다.
또한, 적절한 특이성은 비표적 서열에 대해 상동성인 G 및 C 풍부 영역을 피하여 비표적 유기체에 대해 완전히 상보성인 길이를 최소화시킴으로써 비표적 유기체의 서열에 대해 완전한 상보성을 갖는 혼성화 검정시험 프로브의 길이를 최소화시킴으로써 및 프로브가 가능한 한 많은 수의 불안정화시키는 비표적 서열과 부적당하게 짝을 이룬 것을 함유하도록 프로브를 구성함으로써 달성될 수 있다. 프로브 서열이 특이적 타입의 유기체만을 검출하기에 적절한지 여부는 프로브:표적 하이브리드 및 프로브:비표적 하이브리드 사이의 열 안정성 차이에 크게 의존한다. 프로브를 디자인하는데 있어서, 이들 Tm값의 차이는 가능한 한 커야 한다(예를 들면, 2 ℃ 이상, 바람직하게는 5 ℃ 이상).
표적 핵산 서열의 길이 및 따라서 프로브 서열의 길이도 또한 중요할 수 있다. 몇몇 경우에, 특정 영역으로부터 위치 및 길이가 다르고 소정의 혼성화 특성을 갖는 프로브를 갖는 생성시키게 되는 몇 개의 서열이 있을 수 있다. 다른 경우에, 한 서열은 단지 1개의 염기만큼 상이한 다른 서열보다 상당히 더 나을 수 있다. 핵산이 혼성화하기에 완전히 상보성이 아닐 수 있지만, 완전히 상동성인 염기 서열의 가장 긴 스트레치가 하이브리드 안정성을 결정한다.
셋째로, 혼성화를 억제하는 강한 내부 구조를 형성시키는 것으로 알려진 rRNA의 영역이 덜 바람직한 표적 영역이다. 마찬가지로, 강한 자기 상보성을 갖는 프로브는 피해야 한다. 스트랜드가 완전히 또는 부분적으로 분자내 또는 분자간 하이브리드에 관여하는 경우, 새로운 분자간 프로브:표적 하이브리드의 형성에는 덜 참여할 수 있게 된다. 리보솜 RNA 분자는 수소 결합에 의해 매우 안정한 분자내 나선 및 2차 구조를 형성시키는 것으로 알려져 있다. 프로브를 혼성화 조건 하에서 실질적으로 단일 스트랜드로 남아있는 표적 핵산의 영역으로 디자인함으로써, 프로브와 표적 사이의 혼성화 속도 및 정도가 증가될 수 있다.
콕시디오이데스 이미티스 표적 서열은 처음에 핵산 듀플렉스의 일부분으로서 존재할 수 있다. 예를 들면, 게놈 rDNA 표적은 자연적으로 이중 스트랜드 형태로 생성된다. 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)도 또한 이중 스트랜드의 생성물을 생성시킨다. 이들 2중 스트랜드의 표적은 혼성화 전에 변성을 필요로 한다. 적합한 변성 및 혼성화 조건은 당업계에 공지되어 있다[예를 들면, 사던(E.M. Southern),J. Mol. Biol.98:503 (1975)].
혼성화 속도는 C0T1/2를 결정함으로써 측정될 수 있다. 프로브가 그의 표적과 혼성화하는 속도는 프로브 영역에서의 표적 2차 구조의 열 안정성의 척도이다. 혼성화 속도의 표준 측정치는 리터 당의 핵산 몰수 x 초로서 측정되는 C0T1/2이다. 따라서, 프로브의 농도 x 그 농도에서의 혼성화 반감기이다. 이 값은 다양한 양의 프로브를 고정된 시간 동안 일정한 양의 하이브리드와 혼성화시킴으로써 결정된다. 예를 들면, 표적 0.05 pmol을 30분 동안 프로브 0.0012, 0.025, 0.05, 0.1 및 0.2 pmol과 함께 배양시킨다. 30분 후의 하이브리드 양을 하기하는 혼성화 보호 검정시험(Hybridization Protection Assay)으로 측정한다. 이어서 시그널을 상대적 광 단위(RLU) 최대치(최고의 프로브 농도로부터)의 %의 로그값 대 프로브 농도(리터 당의 뉴클레오티드 몰수)로서 플롯팅한다. RLU는 발광계에 의해 측정되는 표지시킨 프로브에 의해 방출된 광자의 양의 측정치이다. C0T1/2는 초 단위의 혼성화 시간을 곱한 최대 혼성화의 50%에 대응하는 농도로부터 그래프에서 찾을 수 있다. 이들 값은 9.0 x 10-6내지 9 x 10-5의 범위이고, 바람직한 값은 3.5 x 10-5미만이다.
핵산 재집합의 다른 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, 제목이 Accelerated Nucleic Acid Reassociation Method인 콘(Kohne) 및 케이션(Kacian)의 EP 229442호는 핵산 재집합을 가속화시키는 방법을 설명한다.
Tm을 결정하는 바람직한 방법은 제목이 Homogeneous Protection Assay인 아놀드(Arnold) 등의 미국 특허 제5,283,171호에 따라 혼성화 보호 검정시험(HPA)을 사용하여 혼성화를 측정한다. Tm은 하기하는 방식으로 HPA를 사용하여 측정할 수 있다. 프로브 분자를 아크리디늄 에스테르로 표지시킨다. 프로브:표적 하이브리드를 리튬 숙시네이트 완충액(0.1 M 리튬 숙시네이트 완충액, pH 5.0, 2 mM EDTA, 2 mM EGTA, 10%(w/v) 리튬 라우릴 술페이트) 중에서 과량의 표적을 사용하여 형성시킨다. 이어서 핵산 하이브리드를 함유하는 용액의 분취액을 리튬 숙시네이트 완충 용액 중에 희석시키고, 예측되는 Tm의 온도(대표적으로는 55 ℃) 아래에서 출발하여 2-5 ℃ 증가분으로 증가시키면서 각종의 온도에서 5분 동안 배양시킨다. 이어서 이 용액을 약알칼리성 보레이트 완충액(0.15 M 소듐 테트라보레이트, pH 7.6, 5% (v/v) TRITON(등록상표) X-100)으로 희석시키고, 보다 낮은 온도에서(예를 들면 50 ℃) 10분 동안 배양시킨다.
이들 조건하에서, 단일 스트랜드의 프로브에 부착된 아크리디늄 에스테르는 가수분해되지만, 혼성화된 프로브에 부착된 아크리디늄 에스테르는 비교적 가수분해로부터 보호된다. 따라서, 가수분해 처리 후에 남아있는 아크리디늄 에스테르의 양은 하이브리드 분자의 수에 비례한다. 남아있는 아크리디늄 에스테르의 양은 과산화수소 및 알칼리를 용액에 첨가하여 남아있는 아크리디늄 에스테르로부터 생성된 화학루미네센스를 모니터함으로써 측정될 수 있다. 화학루미네센스는 발광계(예를 들면, Gen-Probe LEADER(등록상표) I 또는 LEADER(등록상표) 50)로 측정할 수 있다. 생성된 데이타를 최대 시그널 %(일반적으로 최저 온도로부터) 대 온도로서 플롯팅한다. Tm은 최대 시그널의 50%가 남아있는 온도로서 정의된다. 상기한 방법 외에, Tm은 당업계의 통상의 숙련인에게 공지된 동위원소 방법에 의해 결정될 수 있다(예를 들면, 호간(Hogan) 등, 상기한 문헌 참조).
주어진 하이브리드에 대한 Tm은 사용된 혼성화 용액의 성질에 따라 변한다. 염, 세제 및 다른 용질의 농도와 같은 인자들은 열 변성 동안에 하이브리드 안정성에 영향을 미칠 수 있다(샘브루크(Sambrook) 등, 상기한 문헌 참조). 프로브가 사용되게 되는 조건, 예를 들면 이온 강도 및 배양 온도는 프로브를 구성하는데 있어서 고려해야 한다. 하이브리드 핵산의 열 안정성은 반응 혼합물의 이온 강도와 함께 증가하는 것으로 알려져 있다. 한편, 수소 결합을 파괴시키는 화학적 약품, 예를 들면 포름아미드, 우레아, DMSO 및 알콜의 첨가는 하이브리드 열 안정성을 크게 감소시키고, 이에 따라 혼성화의 엄격함을 증가시킬 수 있다. 일반적으로, 길이가 약 10 내지 50 염기인 합성 올리고뉴클레오티드 프로브를 위한 최적의 혼성화는 주어진 듀플렉스의 경우 용융 온도보다 대략 5 ℃ 아래에서 일어난다. 최적 이하의 온도에서의 배양은 부적당하게 짝을 이룬 염기 서열들이 혼성화되도록 하고, 따라서 특이성을 감소시킨다.
혼성화 검정시험 프로브에 대한 특이적 엄격한 혼성화 조건의 예는 하기하는 실시예에서 제공된다. 추가의 세트의 엄격한 혼성화 조건들은 본 명세서에 기초하여 당업계의 통상의 숙련인이 결정할 수 있다.
D.올리고뉴클레오티드 합성
정의된 올리고뉴클레오티드는 시아노에틸포스포르아미다이트 전구체를 사용하는 자동화 고체상 화학적 합성법을 포함하여 몇가지 공지된 방법들 중의 하나에 의해 제조될 수 있다[바론(Barone) 등,Nucleic Acids Research12:4051(1984)]. 또한, 다른 공지된 합성 올리고뉴클레오티드의 구성 방법들이 사용될 수 있다[Molecular Cloning, 상기한 문헌 (2:11)]. 올리고뉴클레오티드의 합성 및 정제에 이어, 몇가지 상이한 방법을 사용하여 크기 및 순도의 면에서 올리고뉴클레오티드의 허용가능성을 결정할 수 있다. 상기 방법들로서는 당업계의 통상의 숙련인에게 공지되어 있는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및 고속 액체 크로마토그래피를 들 수 있다.
일단 합성되면, 선택한 올리고뉴클레오티드 혼성화 검정시험 프로브를 몇가지 공지된 방법들 중의 하나에 의해 리포터 기로 표지시킬 수 있다[Molecular Cloning, 상기한 문헌 (2:11)]. 유용한 표지로서는 방사성동위원소 및 비방사성동위원소 리포터 기를 들 수 있다. 동위원소 표지로서는3H,35S,32P,125I, 코발트 및14C를 들 수 있다. 동위원소 표지는 틈(nick) 번역, 말단 표지화, 제2 스트랜드 합성, 역 전사와 같은 당업계에 공지된 기술에 의해 및 화학적 방법에 의해 올리고뉴클레오티드 내로 도입시킬 수 있다. 방사성 표지시킨 프로브를 사용할 때, 혼성화는 자동방사선사진법, 신틸레이션 계수 또는 감마 계수에 의해 검출될 수 있다. 선택된 검출 방법은 혼성화 조건 및 표지화에 사용된 특정 방사성동위원소에 의존한다.
비동위원소 물질도 표지화에 사용할 수 있고, 뉴클레오티드들 사이에 내부적으로 또는 올리고뉴클레오티드의 말단에 도입시킬 수 있다. 개질된 뉴클레오티드를 효소적으로 또는 화학적으로 혼입시킬 수 있다. 프로브의 화학적 변형은 프로브의 합성 동안에 또는 후에, 예를 들면 본 명세서에서 참고문헌으로 인용하는 아놀드(Arnold) 등의 제목이 Non-Nucleotide Linking Reagents for Nucleotide Probes인 EPO 출원 번호 88308766.0, 공개 번호 313219(이하,Non-Nucleotide Linking Reagents로 언급함)에 기재되어 있는 바와 같은 비뉴클레오티드 링커기의 사용에 의해 수행될 수 있다. 비동위원소 표지로서는 형광 분자, 화학루미네센스 분자, 효소, 보조인자, 효소 기질, 합텐 또는 기타 리간드를 들 수 있다.
바람직하게는, 혼성화 검정시험 프로브를 아크리디늄 에스테르로 표지시킨다. 아크리디늄 에스테르 표지화는 본 명세서에서 참고문헌으로 인용하고 있는, 1993년 2월 9일에 특허허여된 제목이 Acridinium Ester Labeling and Purification of Nucleotide Probes인 아놀드 등의 미국 특허 제5,185,439호에 의해 기재되어 있는 바와 같이 수행될 수 있다.
II.혼성화 검정시험 프로브 및 콕시디오이데스 이미티스 표적 서열을 함유하는 하이브리드
본 발명의 다른 면은 혼성화 검정시험 프로브 및 콕시디오이데스 이미티스의 표적 서열에 의해 형성된 하이브리드이다. 형성된 하이브리드는 표적의 존재를 검출하는데 유용하다. 예를 들면, 하이브리드 중에 존재하는 아크리디늄 에스테르(AE)는 알칼리 용액 중에서 가수분해에 대해 내성이지만, 단일 스트랜드의 핵산 중에 존재하는 아크리디늄 에스테르는 알칼리 용액 중에서 가수분해된다. 따라서, AE 표지시킨 프로브와 표적의 결합은 결합되지 않은 AE 표지시킨 프로브의 가수분해 후에, 핵산 하이브리드 중에 남아있는 아크리디늄 에스테르의 화학루미네센스를 측정하여 검출할 수 있다. 추가로, 형성된 하이브리드를 사용하여 혼성화되지 않은 프로브로부터 혼성화된 표적을 정제하는데 사용할 수 있고, 따라서 혼성화되지 않은 프로브에 기인한 배경을 제거한다. 예를 들면, 하이브리드 분자는 히드록시아파타이트 컬럼 상에서 또는 당업계의 통상의 숙련인에게 공지된 방법을 사용하여 필터 상에서 선택적으로 보유될 수 있다.
III.혼성화 검정시험 프로브 및 헬퍼 프로브의 혼합체
혼성화 검정시험 프로브 및 헬퍼 프로브의 혼합체를 콕시디오이데스 이미티스의 검출에 사용할 수 있다. 헬퍼 프로브는 검정시험 프로브와 그의 표적 핵산과의 핵산 혼성화 속도를 향상시키고, 혼성화 검정시험 프로브와 그의 표적의 혼성화를 용이하게 하는데 사용된다. 또한, 헬퍼 프로브는 엄격한 혼성화 검정시험 조건 하에서 헬퍼 프로브:표적 듀플렉스를 형성하도록 그들의 표적 핵산 서열에 대해 충분히 상보적이다. 주어진 헬퍼 프로브와 함께 사용된 엄격한 혼성화 검정시험 조건은 혼성화 검정시험 프로브가 그의 표적 서열과 우선적으로 혼성화하는데 사용된 조건에 의해 결정된다.
단일 스트랜드의 RNA 및 DNA의 영역은 엄격한 혼성화 검정시험 조건 하에서조차도 2차 및 3차 구조에 관여할 수 있다. 상기 구조는 혼성화 검정시험 프로브의 그의 표적 영역과의 혼성화를 입체적으로 억제하거나 또는 심지어는 차단할 수 있다. 헬퍼 프로브의 혼성화는 표적 핵산의 2차 및 3차 구조를 바꾸고, 따라서 혼성화 검정시험 프로브가 더욱 쉽게 접근할 수 있도록 만든다. 그 결과, 헬퍼 프로브는 표적:혼성화 프로브 듀플렉스의 Tm 및(또는) 반응속도를 향상시킨다. 헬퍼 프로브는 일반적으로 혼성화 검정시험 프로브 표적 영역 근처에 위치하는 핵산 서열과 혼성화하도록 선택된다.
본 발명의 혼성화 검정시험 프로브와 함께 사용될 수 있는 헬퍼 프로브는 서열 26에 의해 제공되는 서열의 표적 핵산 서열 영역에 대해 표적화된다. 표적 영역에 상보적인 헬퍼 프로브 중의 표적화된 영역은 바람직하게는 10 중 9 이상의 뉴클레오티드가 표적 영역 중에 존재하는 핵산 서열에 완전히 상보적인 10개 이상의 뉴클레오티드를 함유한다.
V.증폭 올리고뉴클레오티드 및 증폭 검정시험 조건
샘플 중에서의 표적 서열의 수를 증폭시키는 방법을 검출 검정시험의 적용성 및 감수성을 증가시키기 위해 프로브 서열의 사용과 함께 혼합할 수 있다[밀러(Miller) 등, Evaluation of Gen-Probe Amplified Mycobacterium Tuberculosis Direct Test and PCR for Direct Detection of Mycobacterium tuberculosis in Clinical Specimens,J. Clin. Micro.1994: 393-397; 레디(Reddy) 등, Specific amplification of Aspergillus fumigatus DNA by polymerase chain reaction, Mol. Cell. Probes 7: 121-126 (1993)].
증폭 올리고뉴클레오티드는 프라이머 연장 반응에 대한 프라이머로서 작용할 수 있고, TMA에 의한 콕시디오이데스 이미티스 표적 서열을 증폭시키기 위한 프로모터-프라이머 조합물의 일부일 수도 있다. 바람직하게는, 증폭 올리고뉴클레오티드는 서열 29, 31, 33, 35, 37, 39에 의해 제공되는 서열을 갖거나, 이 서열로 본질적으로 이루어지거나, 이 서열로 이루어지거나 또는 이 서열과 실질적으로 유사한 프라이머 서열을 함유하게 된다. 보다 바람직하게는, 증폭 올리고뉴클레오티드는 서열 33, 35, 37, 39에 의해 제공되는 서열을 갖거나, 이 서열로 본질적으로 이루어지거나, 이 서열로 이루어지거나 또는 이 서열과 실질적으로 유사한 프라이머 서열을 함유하게 된다. 더욱 더 바람직하게는, 증폭 올리고뉴클레오티드는 서열 37, 39에 의해 제공되는 서열을 갖거나, 이 서열로 본질적으로 이루어지거나, 이 서열로 이루어지거나 또는 이 서열과 실질적으로 유사한 프라이머 서열을 함유하게 된다. 바람직하게는, 프라이머 서열을 함유하는 증폭 올리고뉴클레오티드는 프라이머 서열의 5' 말단에 부착된 프로모터 서열을 갖게 된다. 바람직하게는, 프로모터 서열은 서열 41을 갖거나, 이 서열로 본질적으로 이루어지거나, 이 서열로 이루어지거나 또는 이 서열과 실질적으로 유사하게 된다.
바람직하게는, TMA에 사용하기 위한 증폭 올리고뉴클레오티드는 서열 1, 5, 13에 대응하는 서열을 갖거나, 이 서열로 본질적으로 이루어지거나, 이 서열로 이루어지거나 또는 이 서열과 실질적으로 유사하다. 더욱 바람직하게는, 증폭 올리고뉴클레오티드는 서열 5, 13에 대응하는 서열을 갖거나, 이 서열로 본질적으로 이루어지거나, 이 서열로 이루어지거나 또는 이 서열과 실질적으로 유사하다. 더욱 더 바람직한 실시태양에서는, 증폭 올리고뉴클레오티드는 서열 13에 대응하는 서열을 갖거나, 이 서열로 본질적으로 이루어지거나, 이 서열로 이루어지거나 또는 이 서열과 실질적으로 유사하다.
한 세트의 프라이머 또는 프로모터-프라이머를 사용하여 관찰되는 증폭의 정도는 특이적 표적 서열과 혼성화하는 올리고뉴클레오티드의 능력 및 RNA 폴리머라제에 의해 연장되거나 또는 인식되는 이들의 능력을 포함하여 몇 개의 인자에 의존한다. 상이한 길이 및 염기 조성을 갖는 올리고뉴클레오티드를 사용할 수 있지만, 보다 바람직한 올리고뉴클레오티드는 30 내지 60 염기를 갖는 결합 영역 및 약 65 ℃의 예측되는 하이브리드 Tm을 갖는다.
핵산 분자 상에 존재하는 표적 핵산 서열은 표적 서열의 안티센스 표적 스트랜드 3'과 혼성화되는 프라이머 증폭 올리고뉴클레오티드 및 표적 서열의 센스 스트랜드 3'과 혼성화되는 프로모터-프라이머 증폭 올리고뉴클레오티드를 사용하여 증폭될 수 있다. 프로모터-프라이머의 연장은 표적 서열의 RNA 복사물을 생성시킨다. 안티센스 스트랜드 상의 프라이머의 연장은 프로모터-프라이머를 인식하는 RNA 폴리머라제에 대한 센스 스트랜드 주형의 복사물을 생성시킨다. 바람직하게는, 프라이머는 서열 9, 11에 의해 제공되는 서열을 갖거나, 이 서열로 본질적으로 이루어지거나, 이 서열로 이루어지거나 또는 이 서열과 실질적으로 유사하다. 이들 프라이머는 또한 프라이머 서열의 5' 말단에 첨가된 추가의 프로모터 서열을 함유할 수도 있다.
증폭 올리고뉴클레오티드에 대한 바람직한 표적 부위는 길이가 약 15 염기보다 큰 영역이다. 증폭 올리고뉴클레오티드에 의해 형성되는 증폭된 영역은 바람직하게는 약 350 염기, 더욱 바람직하게는 150 염기 이내이다.
프로모터 혼성화에 영향을 미치는 파라미터, 예를 들면 Tm, 상보성 및 2차 구조는 또한 프라이머 혼성화에도 영향을 미치고, 따라서 증폭 올리고뉴클레오티드의 성능에 영향을 미친다. 상기 프로브 디자인에 관한 부분에서 논의된 이들 고려사항들은 증폭 조건에 따라 변화될 수 있다. 예를 들면, 증폭은 진단학적 혼성화 검정시험 조건보다 낮은 엄격함을 갖는 조건 하에서 수행될 수 있다.
비특이적 연장(프라이머-다이머 또는 비표적 복사)의 정도는 증폭 효능에 영향을 미칠 수 있다. 프라이머는 바람직하게는 특히 서열의 3' 말단에서 낮은 자기 상보성 또는 교차 상보성을 갖도록 선택된다. 의사 프라이머 연장을 감소시키기 위하여, 바람직하게는 긴 단일중합체 트랙 및 높은 GC 함량은 피한다. 디자인의 이러한 측면을 돕는 컴퓨터 프로그램이 시판되고 있다.
혼성화 검정시험 프로브, 헬퍼 프로브 및 증폭 올리고뉴클레오티드를 함유하는 프로브 혼합체는 또한 콕시디오이데스 이미티스의 검출을 위한 증폭 검정시험에 사용할 수도 있다.
IV.실시예
본 발명의 상이한 면 및 실시태양을 예시하는 실시예가 아래에 제공된다. 실시예는 본 명세서에서 기재한 올리고뉴클레오티드를 얻고 시험하는 방법을 예시한다.
실시예 I.방법
실시예 A.임상학적 시험표본 및 진균성 균주의 용해
핵산 증폭 실험에 사용된 참고용 진균성 균주(표 1)를 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC, 미국 매릴랜드주 록빌 소재)으로부터 얻어 사보드(Sabourd) 덱스트로스 아가 상에서 배양시켰다. 임상학적 시험표본을 표준 배양 및 동정법을 사용하여 배양하고, 동정하였다. 또한, AccuProbe(등록상표) 콕시디오이데스 이미티스 배양 동정 시험을 사용하여 진균 콜로니를 콕시디오이데스 이미티스로 동정하였다.
객담 시험표본을 동일한 부피의 N-아세틸-L-시스테인-NaOH(1%)로 15분 동안 처리하였다. 분취액 1.5 ml를 10,000 x g에서 5분 동안 원심분리시켜 농축시켰다[켄트(Kent, P.T.), 쿠비카(Kubica G.)Public Health Mycobacteriology. A Guide for the Level III Laboratory.미국 죠지아주 아틀랜타 소재; Centers for Disease Control (1985)]. 상징액을 경사제거하고, 침강물 50 μl를 0.2-0.3 mm 유리 비이드 0.17 g, 5% w/v 소르비톨 110 μl, 및 HCl로 pH 8.0으로 조절된 10 mM N-아세틸-L-시스테인-NaOH, 40 mM 트리즈마(Trizma) 염기, 2 mM 디소듐 EDTA의 용액(TB SDB 용액) 300 μl를 함유하는 TB 용해 튜브에 첨가하였다.
상부 흉부액, 하부 흉부액, 발현된 면봉채집물 또는 농양액의 유체 100 μl를 플래쉬트랙(flashtrack) 세척액[4M NaOH로 pH 7.5로 조절된 18 mM NaCl, 5.7 mM 소듐 아지드, 5 mM HEPES(0.5 나트륨염), 0.1% w/v 사포닌) 1 ml에 첨가하였다. 샘플을 소용돌이시킨 다음 에펜도르프 튜브 중에서 5분 동안 10,000 g로 원심분리시켰다. 상징액을 경사제거하고, 플래쉬트랙 세척액 1 ml 중에 재현탁시켰다. 펠릿을 TB SDB 200 μl 중에서 재현탁시키고, 소용돌이시켰다. 각 샘플 50 μl를 0.2-0.3 mm 유리 비이드 0.17 g, 5% w/v 소르비톨 110 μl, 및 TB SDB 및 유리 비이드 300 μl를 함유하는 TB 용해 튜브에 첨가하였다.
유체 시험표본, 예를 들면 뇌척수액(CSF)을 동일한 방식으로 원심분리시켜 농축시키고, 상징액을 경사제거하고 침강물 50 μl를 0.2-0.3 mm 유리 비이드 0.17 g, 5% w/v 소르비톨 110 μl, 및 TB SDB 300 μl를 함유하는 TB 용해 튜브에 첨가하였다.
배양물로부터의 측정을 위하여, 진균 세포 백금이량 1 μl를 0.2-0.3 mm 유리 비이드 0.17 g, 5% w/v 소르비톨 110 μl, 및 TB SDB 300 μl를 함유하는 TB 용해 튜브에 첨가하였다.
일단 샘플을 TB 용해 튜브에 첨가하면, 객담 및 다른 유체로부터 얻은 샘플을 동일한 방식으로 처리하였다. 샘플을 실온에서 15분 동안 수조 중에서 초음파처리하였다. 이어서 세포를 95 ℃에서 10분 동안 가열 블록 중에서 가열 살생하였다. 이어서 TB SDB 중에서 희석시켰다. 샘플을 즉시 사용하거나 또는 나중의 사용을 위해서 -70 ℃에서 동결시켰다.
실시예 B.콕시디오이데스 이미티스에 대한 증폭된 검정시험
여기서 예시되는 검정시험은 등온성 표적 기재 전사 매개 증폭(TMA) 시스템을 사용한다. 수 욕 소니케이터를 사용하여 닫혀진 튜브 중에서의 초음파에 의한 진균 유기체의 용해에 이어, 유리된 rRNA를 하기하는 TMA 방법을 통해 수많은 표적 서열들로 증폭시킨 다음 이 표적 서열을 동일 튜브 중에서 균질성 보호 검정시험을 사용하여 검출하였다.
액체 프라이머를 PAR(1M NaOH 및 6M HCl을 사용하여 pH 7.5로 조절된, 4 mM ATP, 4 mM CTP, 4 mM GTP, 4 mM UTP, 1 mM dATP, 1 mM dCTP, 1 mM dGTP, 1 mM dTTP, 40 mM 트리즈마 염기, 20 mM MgCl2, 17 mM KCl, 5% w/v 폴리비닐피롤리돈) 25 μl 당 각각 30 pmol로 희석시켰다. PAR 중의 프라이머 25 μl를 폴리프로필렌 시험관 바닥에 첨가하였다. 오일 시약 200 μl를 각 튜브에 첨가하였다. TB SDB 중에서 정확한 농도로 희석된 rRNA 50 μl를 각 튜브에 첨가하였다(SDB 50 μl만을 수용한 음성 대조용은 제외). 이어서 샘플을 95 ℃에서 10분 동안 가열 블록 중에 위치시켰다. 튜브를 42 ℃에서 5 분 동안 수 욕 중에 넣었다. 효소 희석 완충액(6M HCl로 pH 8로 조절된 60 mM N-아세틸-L-시스테인, 1 mM EDTA(유리산), 0.01% 페놀 레드(0.5% 용액), 140 mM 트리즈마 염기, 70 mM KCl, 20% v/v 글리세롤, 및 10% v/v 트리톤(Triton) X-102) 중에 역 전사효소(458 단위/μl) 및 T7 RNA 폴리머라제(367 단위/μl)를 함유하는 25 μl를 42 ℃ 수 욕 중에 남아있는 각 튜브에 첨가하였다. 랙을 부드럽게 진탕시키고, 튜브를 밀봉 카드로 덮은 다음 튜브를 추가로 2시간 동안 42 ℃에서 배양시켰다. 수 욕으로부터 튜브를 제거하고 혼성화 프로브 검정시험을 수행하였다. 별법으로는, 샘플을 추가의 시험을 위하여 냉장시킬 수 있다.
2개의 프라이머를 증폭 단계에 사용하였다: T7 RNA 폴리머라제 프로모터/프라이머, 및 프라이머. T7 프로모터-프라이머는 혼성화 프로브 표적 서열의 센스 스트랜드 3'의 영역에 상보적이었다. 이 프라이머의 연장은 표적 서열의 RNA 복사물을 생성시킨다.
프라이머는 표적 서열로부터의 안티센스 스트랜드 3'의 영역에 상보적이었다. 그러므로 안티센스 스트랜드 상에서의 프라이머의 연장은 T7 RNA 폴리머라제에 대한 센스 스트랜드 주형의 복사물을 생성시킨다. TMA에 의한 안티센스 표적 서열의 증폭은 따라서 센스 스트랜드가 먼저 역 전사효소의 DNA 폴리머라제 활성에 의해 복사되고, 이어서 이들 센스 스트랜드 복사물이 RNA 폴리머라제에 의해 주형으로 사용되어 표적 서열을 함유하는 안티센스 스트랜드 핵산을 증폭시킬 때 발생하였다. 이 과정은 자동촉매적으로 반복된다. 임상학적 시험표본으로부터 rRNA의 증폭은 또한 문헌 [죠나스(Jonas) 등,Detection and Identification of Mycobacterium tuberculosis Directly from Sputum Sediments by Amplification of rRNA, 2410-2416 페이지 (1993)]에 기재되어 있다.
실시예 II.혼성화 프로브 검정시험
콕시디오이데스 이미티스에 특이적인 프로브를 콕시디오이데스 이미티스의 28S rRNA에 상보적인 프라이머로 서열화하여 동정하였다. 프로브 서열 21을 특성화하였더니 콕시디오이데스 이미티스에 대해 특이적인 것으로 나타났다. 프로브는 콕시디오이데스 이미티스와 블라스토마이세스 데르마티티디스 및 히스토플라스마 캅술라툼을 포함하여 계통발생학적으로 가까운 임상학적으로 중요한 이웃들을 구별하였다.
콕시디오이데스 이미티스에 대한 프로브의 특이성 및 반응성을 증명하기 위하여, 혼성화 프로브 검정시험을 수행하였다. RNA를 표지시키지 않은 헬퍼 프로브 존재하에 아크리디늄 에스테르 표지시킨 프로브와 혼성화시켰다. 헬퍼 프로브는 서열 25: GAACAGGACG TCATAGAGGG TGAGAATCC에 대응하는 서열로 이루어졌다.
헬퍼 프로브 2.5 pmol 및 프로브(0.05 또는 0.1 pmol/반응) 10 μl를 함유하는 프로브 혼성화 완충액(2M LiOH로 pH 4.7로 조절된, 100 mM 숙신산, 230 mM LiOH, 150 mM 알드리티올-2, 1.2M LiCl2, 20 mM EDTA, 20 mM EGTA, 3% v/v 에틸 알콜, 2% v/v 리튬 라우릴 설페이트) 중의 프로브 혼합물 90 μl를 각 튜브에 첨가하였다. 프로브 혼합물은 하기하는 뉴클레오티드 서열, 즉 서열 17 GCAGCCACGG CATAAGTTCC TTG, 서열 21 GCGCCACGGC ATAAGTTCCT TG 중의 하나를 갖는 아크리디늄 에스테르 표지시킨 프로브 및 표지되지 않은 헬퍼 프로브, 즉 서열 25 GAACAGGACG TCATAGAGGG TGAGAATCC를 함유하였다.
튜브를 잘 소용돌이시키고, 60 ℃에서 15분 동안 배양시켰다. 600 mM 붕산, 182 mM NaOH, 및 4M NaOH로 pH 8.5로 조절된 1% v/v(선별시약) 300 μl를 각 샘플에 첨가하였다. 샘플을 수 욕으로부터 제거하고 실온에서 5분 동안 정치시킨 후 표준 2 주입 포맷으로 2초 동안 젠-프로브 발광계 중에서 읽었다. 30,000의 상대 광 단위(RLU)값을 양성 시험에 대한 제시된 커트라인으로 사용하였다. 각 실험은 증폭 양성 및 음성 대조물을 포함하였다. 각각의 측정을 위해 4중 검정시험을 행하고, 평균 RLU값을 계산하였다.
실시예 IV.증폭시킨 혼성화 프로브 검정시험의 특이성
정제한 rRNA 제제 및 초음파처리한 진균 배양 용해물을 사용하여 시험의 특이성을 평가하였다. 2개의 프로브를 증폭 검정시험에서 시험하였다: 서열 17(표 1A-C) 및 서열 21(표 1D-E). 서열 13에 대응하는 서열을 함유하는 T7 프로모터-프라이머 및 서열 9에 의해 제공되는 서열을 함유하는 프라이머를 사용하여 표 1A 및 1C의 결과를 얻었다. 서열 5에 대응하는 서열을 함유하는 T7 프로모터-프라이머 및 서열 9에 의해 제공되는 서열을 함유하는 프라이머 서열을 사용하여 표 1B의 결과를 얻었다. 다른 단일의 병원체 및 밀접하게 관련된 유기체를 나타내는 균주를 패널에 포함시켰다. 단지 콕시디오이데스 이미티스 균주만이 검정시험에서 양성(30,000 RLU)이었다.
하기하는 데이타는 프로브가 광범위의 계통발생학적 교차 부분으로부터 유기체와 교차 반응하지 않았음을 보여준다. 샘플을 또한 매우 광범위의 특이성을 갖는 프로브로 시험하였다. 이 프로브로부터의 양성 시그널은 샘플 적합성(나타나지 않은 데이타)의 확인을 제공하였다.
rRNA 주형을 이용한 혼성화 프로브 서열 17의 특이성
ATCC 미생물 rRNA 농도 평균 RLU값
(-) 대조용 0 fg 1,615
콕시디오이데스 이미티스 (+) 대조용 500 fg 391,321
말브란키아 알볼루테아 500 fg 1,264
블라스토마이세스 데르마티티디스 500 fg 1,247
히스토플라스마 캅술라툼 500 fg 1,171
옥사르트론 탁스테리 500 fg 4,613
짐노아스쿠스 두과옌시스 500 fg 1,255
(-) 대조용 0 fg 5,867
콕시디오이데스 이미티스 (+) 대조용 50 fg 450,393
콕시디오이데스 이미티스 (+) 대조용 500 fg 737,434
아스페르길러스 플라부스 500 fg 2,432
믹소트리쿰 데플렉숨 500 fg 1,610
아스페르길러스 니게르 500 fg 2,307
칸디다 크루세이 500 fg 1,793
칸디다 글라브라타 500 fg 5,022
아스페르길러스 푸미가투스 500 fg 2,574
아라크니오이테스 플라볼루테우스 500 fg 2,929
칸디다 파라프실로시스 500 fg 2,100
오이디오덴드론 에키눌라툼 500 fg 1,247
칸디다 알비칸스 500 fg 3,189
* RLU값은 2개의 복제물의 평균인 칸디다 글라브라타에 대한 값을 제외하고는 4개의 복제물의 평균이다. 사용된 프라이머는 T7 프로모터-프라이머 서열 13 및 프라이머 서열 9이었다.
rRNA 주형을 이용한 혼성화 프로브 (서열 17)의 특이성
ATCC 미생물 rRNA 농도 평균 RLU값
(-) 대조용 0 fg 2,977
콕시디오이데스 이미티스 (+) 대조용 500 fg 604,535
말브란키아 알볼루테아 500 fg 1,247
블라스토마이세스 데르마티티디스 500 fg 2,224
히스토플라스마 캅술라툼 500 fg 968
옥사르트론 탁스테리 500 fg 1,072
짐노아스쿠스 두과옌시스 500 fg 7,638
(-) 대조용 0 fg 2,421
콕시디오이데스 이미티스 (+) 대조용 50 fg 618,916
콕시디오이데스 이미티스 (+) 대조용 500 fg 652,483
아스페르길러스 플라부스 500 fg 2,475
믹소트리쿰 데플렉숨 500 fg 1,572
아스페르길러스 니게르 500 fg 1,575
칸디다 크루세이 500 fg 1,702
칸디다 글라브라타 500 fg 2,234
칸디다 알비칸스 500 fg 1,607
아라크니오이테스 플라볼루테우스 500 fg 1,521
아스페르길러스 푸미가투스 500 fg 2,945
칸디다 파라프실로시스 500 fg 2,210
오이디오덴드론 에키눌라툼 500 fg 5,726
* RLU값은 3개의 복제물의 평균인 아스페르길러스 플라부스, 칸디다 크루세이 및 칸디다 글라브라타에 대한 값을 제외하고는 4개의 복제물의 평균이다. 사용된 T7 프로모터-프라이머는 서열 5에 의해 제공되는 서열을 함유하였고 및 사용된 프라이머는 서열 9의 서열을 함유하였다.
rRNA * 및 ATCC 세포 용해물을 이용한 특이성 시험
미생물 ATCC#** 평균 RLU값
콕시디오이데스 이미티스 46900 1,544,446
콕시디오이데스 이미티스 38149 1,496,889
콕시디오이데스 이미티스 28868 1,424,771
콕시디오이데스 이미티스 38146 1,478,833
콕시디오이데스 이미티스 (1 x 10-2) 38146 1,612,038
콕시디오이데스 이미티스 (1 x 10-5) 38146 1,395,387
콕시디오이데스 이미티스 (1 x 10-9) 38146 810,204
히스토플라스마 캅술라툼 11407 968
히스토플라스마 캅술라툼 38904 1,110
블라스토마이세스 데르마티티디스 60916 1,483
트리코피톤 테레스트레 28188 2,865
트리코피톤 루브룸 10218 4,978
트리코피톤 루브룸 28188 2,865
트리코피톤 루브룸 CI-4373 3,369
운시노카르푸스 레에세이이 34533 1,891
짐노아스쿠스 두과옌시스 18899 1,621
아라크니오이테스 플라볼루테우스 28364 10,336
28364 1,903
말브란키아 덴드리티카 34527 4,747
말브란키아 아르쿠아타 34523 1,500
말브란키아 알볼루테아 34522 1,871
말브란키아 집세움 24102 4,338
믹소트리쿰 데플렉숨 15686 2,143
옥사르트론 탁스테리 15598 1,414
오이디오덴드론 에키눌라툼 16287 1,497
아스페르길러스 플라부스 10124 2,432
아스페르길러스 니게르 16888 2,307
아스페르길러스 푸미가투스 16907 2,574
칸디다 크루세이 6258 1,793
칸디다 글라브라타 48435 2,234
칸디다 알비칸스 18804 3,189
칸디다 파라프실로시스 22019 2,100
음성 대조물 1,364
콕시디오이데스 이미티스 (+) 대조용 CI-W95 1,501,719
트리코피톤 테레스트레 CI-1441 1,859
트리코피톤 테레스트레 CI-TR-9 2,839
트리코피톤 테레스트레 CI-TR-73 2,924
* 이들 검정시험은 서열 13에 의해 제공되는 서열을 함유하는 T7 프로모터-프라이머, 서열 9에 의해 제공되는 서열을 함유하는 증폭 프라이머, 및 서열 17에 의해 제공되는 서열을 함유하는 혼성화 검정시험 프로브를 사용하여 수행하였다.** 몇몇 미생물의 경우, 임상학적 단리물(CI) 번호를 ATCC 번호 대신에 제공하였다.
rRNA 주형 * 을 이용한 혼성화 프로브 서열 21의 특이성
ATCC 미생물 rRNA 농도 평균 RLU값
(-) 대조용 0 fg 938
콕시디오이데스 이미티스 A 내생포자 9 x 105 590,111
9 x 103 454,899
9 540,528
0.9 348,205
말브란키아 덴드리티카 500 fg 1,264
오이디오덴드론 에키눌라툼 500 fg 1,247
* 사용된 T7 프로모터/프라이머는 서열 13에 대응하는 서열을 함유하였고, 사용된 프라이머는 서열 9에 대응하는 서열을 함유하였다.
rRNA 주형 * 을 이용한 혼성화 프로브 서열 21의 특이성
ATCC 미생물 rRNA 농도 평균 RLU값
(-) 대조용 0 fg 21,616
콕시디오이데스 이미티스 (+) 대조용 100 fg 96,453
콕시디오이데스 이미티스 (+) 대조용 100 fg 143,076
콕시디오이데스 이미티스 (+) 대조용 200 fg 137,590
콕시디오이데스 이미티스 (+) 대조용 500 fg 84,636
말브란키아 알볼루테아 500 fg 13,873
블라스토마이세스 데르마티티디스 500 fg 11,802
히스토플라스마 캅술라툼 500 fg 10,790
옥사르트론 탁스테리 500 fg 13,724
짐노아스쿠스 두과옌시스 500 fg 10,420
믹소트리쿰 데플렉숨 500 fg 17,156
아스페르길러스 니게르 500 fg 15,943
칸디다 크루세이 500 fg 16,861
칸디다 글라브라타 500 fg 12,515
아라크니오이테스 플라볼루테우스 500 fg 13,532
칸디다 파라프실로시스 500 fg 14,368
오이디오덴드론 에키눌라툼 500 fg 12,656
칸디다 알비칸스 500 fg 13,946
* 사용된 프라이머는 서열 13에 의해 제공되는 서열을 갖는 T7 프로모터-프라이머 및 서열 9에 의해 제공되는 서열을 갖는 프라이머이었다.
상기 데이타는 본 명세서에서 기재한 프로브가 증폭 검정시험에서 콕시디오이데스와 그의 밀접하게 관련된 계통발생학적 이웃을 구별할 수 있음을 확인하였다.
실시예 V.배양시킨 콕시디오이데스 이미티스를 검출하기 위한 증폭된 혼성화 프로브 검정시험의 감수성
검정시험의 감수성은 정제시킨 콕시디오이데스 이미티스 rRNA의 일련의 희석액을 시험하여 결정하였다. 시험은 발광계 상의 직선 범위 상의 값인 1,265,406 RLU의 평균 시그널을 갖는 rRNA 5 fg만큼 적은 정도로 검출하였다. 상이한 프로브를 사용하는 2개의 검정시험을 수행하였다. 프로브는 서열 17 (표 2) 및 서열 21 (표 3)의 서열을 함유하였다. 검정시험의 감수성을 결정하는 다른 방법은 2개의 상이한 프로브: 서열 21 (표 4) 및 서열 17 (표 5)를 사용하여 3개의 상이한 내생포자 제제의 희석액을 시험하는 것이었다. 각 시험에서의 내생포자의 수는 혈구계를 사용하여 직접 계수하여 측정하였다. 증폭된 검정시험은 시험 당 1개의 내생포자만큼 작은 정도로 검출할 수 있었다.
검정시험이 임상학적 시험표본 중에서 양성 RLU 시그널을 생성시키는지를 측정하기 위하여, 켄트 등의 방법[켄트(Kent, P.T.), 쿠비카(Kubica G.)Public Health Mycobacteriology. A Guide for the Level III Laboratory.미국 조지아주 아틀랜타 소재; Centers for Disease Control (1985)]에 따라 내생포자 희석액을 이미 소화시킨 5개의 배양-음성 객담 침강물에 첨가하였다. 역시, 양성 시그널을 시험 당 1개의 내생포자만큼 작은 정도로 얻었다. 내생포자는 또한 원심분리 전에 배양-음성 CSF의 분취액내로 접종하여 시험 당 3개의 내생포자와 같은 적은 양이 양성 결과를 생성시켰다.
rRNA 주형을 이용한 혼성화 검정시험 프로브 서열 17의 감수성
증폭 올리고뉴클레오티드 콕시디오이데스 이미티스 rRNA 농도 평균 RLU값
서열 13 서열 9 5 fg 1,265,406
20 fg 1,878,058
50 fg 1,645,021
100 fg 1,749,740
(-) 대조용 2,582
서열 5 서열 9 5 fg 22,979
20 fg 343,184
50 fg 489,363
100 fg 672,477
(-) 대조용 1,867
서열 1 서열 9 5 fg 11,639
20 fg 7,191
50 fg 45,217
100 fg 185,162
(-) 대조용 2,299
* RLU값은 4 복제물의 평균이다.
rRNA 주형을 이용한 혼성화 검정시험 프로브 서열 17의 감수성
증폭 올리고뉴클레오티드 콕시디오이데스 이미티스 rRNA 농도 평균 RLU값
서열 13 서열 9 5 fg 528, 577
20 fg 830,764
50 fg 743,241
100 fg 780,634
(-) 대조용 1,779
서열 5 서열 9 5 fg 6,517
20 fg 30,320
50 fg 159,855
100 fg 238,620
(-) 대조용 1,842
서열 1 서열 9 5 fg 9,611
20 fg 116,592
50 fg 139,480
100 fg 120,685
(-) 대조용 1,658
* RLU값은 4 복제물의 평균이다.
표 2 및 3에서의 결과는 동일한 프라이머 및 3개의 상이한 T7 프로모터-프라이머(서열 13, 서열 5, 및 서열 1)를 사용하는 증폭 검정시험(RLU값으로 측정됨)에서 얻은 시그널 수준에서의 큰 차이를 예시한다. 3개의 프로모터-프라이머는 콕시디오이데스 이미티스 상의 각각에 대해 가깝게 표적화되었으며, 동일한 프로모터 서열을 함유하였고, 유사한 길이의 프라이머 서열을 가졌다. 서열 13을 함유하는 프로모터-프라이머를 사용하는 증폭 검정시험은 상이한 검정시험에서 최고의 시그널을 발생시켰다. 서열 5를 함유하는 프로모터-프라이머를 사용하는 증폭 검정시험은 서열 17을 함유하는 프로브를 사용했을 때 프로모터-프라이머 서열 1을 사용하는 검정시험보다 높은 시그널을 발생시켰다. 서열 5를 함유하는 프로모터-프라이머를 사용하는 증폭 검정시험은 서열 21을 함유하는 프로브를 사용했을 때 프로모터-프라이머 서열 1을 사용하는 검정시험보다 rRNA 50 fg 및 100 fg에서 높은 시그널을 발생시켰다.
서열 13으로 명시된 서열은 53 뉴클레오티드 길이이고, 서열 21에 의해 표적화된 표적 영역의 3 뉴클레오티드 3'을 시작하는 26 뉴클레오티드 영역에 상보적이다. 서열 5로 제공되는 서열은 49 뉴클레오티드 길이이고, 서열 21에 의해 표적화된 표적 영역의 15 뉴클레오티드 3'을 시작하는 22 뉴클레오티드 영역에 상보적이다. 서열 1로 제공되는 서열은 51 뉴클레오티드 길이이고, 서열 21에 의해 표적화된 표적 영역의 23 염기 3'을 시작하는 24 뉴클레오티드 영역에 상보적이다. 따라서, 3개의 프로모터 프라이머를 사용하여 얻은 결과는 프로모터-프라이머들 사이의 유사성에도 불구하고 매우 상이하다.
내생포자 및 구상체 희석액 * 을 사용하는 혼성화 검정시험 프로브(서열 21)의 감수성
샘플 타입 내생포자 유입량 평균 RLU값
A 내생포자 9 x 105 590,111
9 x 103 454,899
9 540,528
0.9 348,205
B 내생포자 6.5 x 104 580,569
6.5 x 102 606,883
6.5 415,189
0.65 143,655
0.065 2,289
C 혼합 내생포자 구상체 3.25 x 106 573,807
3.25 x 104 623,849
3.25 x 102 494,017
3.25 131,760
0.325 1,679
(-) 대조용 없음 983
* RLU값은 2 복제물의 평균이다. 사용된 T7 프로모터-프라이머는 서열 13에 의해 제공되는 서열을 함유하였고, 사용된 프라이머는 서열 9에 의해 제공되는 서열을 함유하였다.
rRNA 주형을 사용하는 혼성화 검정시험 프로브(서열 17)의 감수성
A 제제
검정시험 당 내생포자 RLU 값
9 x 105 1619925
9 x 103 1455427
9 1163369
0.9 360861
B 제제
검정시험 당 내생포자 RLU 값
6.5 x 104 1402927
6.5 x 102 1347311
6.5 1339671
0.65 533590
0.065 3652
C 제제
혼합 내생포자 및 구상체 RLU 값
3.25 x 106 1359644
3.25 x 104 1366980
3.25 x 102 1218693
3.25 210010
0.325 2160
음성 대조용 1320
* 사용된 T7 프로모터-프라이머는 서열 13에 대응하는 서열을 함유하였고, 사용된 프라이머는 서열 9에 의해 제공되는 서열을 함유하였다.
실시예 VI.임상학적 시험표본으로부터 직접 콕시디오이데스 이미티스를 검출하는데 있어서 증폭된 혼성화 프로브 검정시험의 감수성
임상학적 시험표본을 이용한 결과(4 복제물 RLU값의 평균)를 표 6에 나타낸다. 4명의 환자로부터 얻은 5개의 균질화된 폐 및 흉막 조직 시험표본은 176,235 내지 1,475,187 RLU값의 양성 결과를 제공하였다. 3명의 환자로부터 얻은 4개의 호흡 분비 시험표본(객담, 기관지 세척액 및 흉부액)은 86,998 내지 1,342,617 RLU값의 양성 결과를 제공하였다. 전염된 콕시디오이데스증을 갖는 한 환자는 농양 배출물의 면봉채집물로부터 569,969 내지 953,985 RLU값의 양성 시그널을 제공하였다. 이들 시험표본은 모두 진균 배양 및 조직병리학에 의해 콕시디오이데스 이미티스에 대해 양성이었다.
3명의 환자로부터 얻은 2개의 CSF 시험표본 및 1개의 객담 시험표본은 원형 시험에 의해 음성이었다. RLU 값은 1,747 내지 12,850 범위이다. 이들 시험표본은 콕시디오이데스 이미티스에 대해 배양 음성이었다.
임상학적 시험표본에서 콕시디오이데스 이미티스의 검출을 확인하는 추가의 결과는 표 7 내지 9에 나타낸다. 이들 실험에 사용한 프로브는 서열 17이었다. 사용한 T7 프로모터-프라이머는 서열 13에 대응하는 서열을 함유하였고, 사용한 프라이머는 서열 9에 대응하는 서열을 함유하였다. 콕시디오이데스 이미티스는 흉막 조직, 폐 농양 조직, 흉막 덩어리, 폐 덩어리, 폐액, 객담 샘플, 및 기관지 세척액(표 6 및 7)에서 검출되었다. 또한, 콕시디오이데스 이미티스는 농양으로부터의 샘플 중에서 검출되었다(표 8).
환자 시험표본
콕시디오이데스 이미티스 배양 또는 조직병리학 양성*
환자 # 시험표본 평균 RLU값
1 좌측 흉막 조직 941,285
1 좌측 흉막 덩어리 1,441,898
2 좌측 폐 농양 176,235
3 좌측 폐 덩어리 1,475,187
4 우측 폐액 1,315,485
5 객담 1,009,956
6 기관지 세척액 1,342,617
7 상부 흉부액 258,259
7 하부 흉부액 86,998
8 측면 다리 농양 953,985
8 중간 다리 농양 569,969
콕시디오이데스 이미티스 배양 음성 시험표본
9 CSF 12,850
10 CSF 1,747
11 객담 침강물 6,786
* 사용된 프로브는 서열 17의 서열을 함유하였다. 사용된 T7 프로모터-프라이머는 서열 13에 의해 제공되는 서열을 함유하였고, 사용된 프라이머는 서열 9에 의해 제공되는 서열을 함유하였다.
환자 샘플
샘플 타입 평균 RLU 값
좌측 흉막 조직 T40995 941,285
T40995 (10-1) 4,043
폐 농양 조직 F44901 176,235
F44901 (10-1) 294,295
좌측 흉막 덩어리 T40996 1,441,898
T40996 (10-1) 1,593,774
좌측 폐 덩어리 W46404 1,475,187
W46404 (10-1) 1,549,916
우측 폐액 94441230212 1,315,485
94441230212 (10-1) 198,645
객담 샘플 PN114 1,009,956
PN114 (10-1) 633,191
기관지 세척액 W49281 1,342,617
W49281 (10-1) 889,543
(-) 대조용 1,052
(+) 대조용 1,763,026
* 사용된 T7 프로모터-프라이머는 서열 13에 의해 제공되는 서열을 함유하였고, 사용된 프라이머는 서열 9에 의해 제공되는 서열을 함유하였다. 사용된 프로브는 서열 17의 서열을 함유하였다.
환자 샘플 *
샘플 넘버 평균 RLU 값
좌측 흉막 조직 5,766
좌측 흉막 조직 (10-1) 3,554
좌측 흉막 조직 (10-2) 2,832
좌측 흉막 조직 (10-3) 2,583
폐 농양 조직 208,062
폐 농양 조직 (10-1) 113,559
폐 농양 조직 (10-2) 7,663
폐 농양 조직 (10-3) 3,406
좌측 흉막 덩어리 1,741,846
좌측 흉막 덩어리 (10-1) 1,777,578
좌측 흉막 덩어리 (10-2) 852,297
좌측 흉막 덩어리 (10-3) 265,296
좌측 폐 덩어리 962,209
좌측 폐 덩어리 (10-1) 1,260,207
좌측 폐 덩어리 (10-2) 4,592
좌측 폐 덩어리 (10-3) 3,920
우측 폐액 179,199
우측 폐액 (10-1) 238,102
우측 폐액 (10-2) 8,203
폐액 (10-3) 3,007
객담 샘플 816,631
객담 샘플 (10-1) 29,590
객담 샘플 (10-2) 200,518
객담 샘플 (10-3) 2,267
기관지 세척액 55,001
기관지 세척액 (10-1) 58,067
기관지 세척액 (10-2) 18,499
기관지 세척액 (10-3) 12,812
(+) 대조용 140,045
(-) 대조용 2,752
* 이들 검정시험에서 사용된 T7 프로모터-프라이머는 서열 13에 의해 제공되는 서열을 함유하였다. 사용된 프라이머는 서열 9에 의해 제공되는 서열을 함유하였다. 사용된 프로브는 서열 17에 대응하는 서열을 함유하였다.
환자 샘플 *
샘플 타입 평균 RLU 값
팔꿈치 농양 (Garcia) 1,527,707
중간 농양 (Garcia) 1,020,833
팔꿈치 농양 (Garcia) 1,178,792
농양 (Knox) 1,196,953
농양 (Knox) 1,056,303
(-) 대조용 5,007
실시예 VI.감수성에 미치는 NaOH의 효과
객담 시험표본을 N-아세틸-L-시스테인-NaOH로 처리하는 동안 NaOH 농도의 효과를 알아보기 위하여, 2명의 상이한 환자로부터 얻은 객담 샘플을 이 샘플 제조 단계 동안에 1% 및 4% NaOH에서 처리하였다. 결과를 표 10에 나타낸다.
환자 샘플 *
표 XIV NaOH 농도 평균 RLU 값
환자 1:
1% NaOH 230,162
1% NaOH 203,551
4% NaOH 1,005,982
4% NaOH 1,080,525
환자 2:
1% NaOH 13,875
1% NaOH 13,175
4% NaOH 157,216
4% NaOH 14,530
(-) 대조용 5,077
다른 실시태양들도 하기하는 특허청구의 범위 내에 속한다. 따라서, 몇가지 실시태양을 나타내고 설명하였지만, 각종의 변형이 본 발명의 본질 및 영역을 벗어나지 않고서 행해질 수 있다.
〈서열표〉
(1) 일반적 정보 :
(i) 출원인: 젠-프로브 인코포레이티드
(ii) 발명의 명칭: 콕시디오이데스 이미티스 핵산을 표적으로 한 증폭 프라이머 및 핵산 프로브
(iii) 서열수: 41
(iv) 통신 주소:
(A) 수신인: 라이언 앤드 라이언
(B) 거리: 웨스트 피브쓰 스트리트 633, 스위트 4700
(C) 도시: 로스 앤젤레스
(D) 주: 캘리포니아
(E) 국가: 미국
(F) 우편번호: 90071
(v) 컴퓨터 판독 형태:
(A) 매체 유형: 3.5 디스켓, 1.44 Mb 저장
(B) 컴퓨터: IBM 호환형
(C) 작동 시스템: IBM P.C. DOS 5.0
(D) 소프트웨어: 워드 퍼펙 5.1
(vi) 현재 출원 데이터:
(A) 출원 번호:
(B) 출원일:
(C) 분류:
(vii) 선행 출원 데이터:
(A) 출원 번호:
(B) 출원일:
(C) 분류:
(viii) 변리사/대리인 정보:
(A) 성명: 허버, 쉘던 오.
(B) 등록 번호: 38,179
(C) 참조/도켓 번호: 210/060
(ix) 원격 통신 정보:
(A) 전화: (213) 489-1600
(B) 팩스: (213) 955-0440
(C) 텔렉스: 67-3510
(2) 서열 1에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 51
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 서열 설명:
(2) 서열 2에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 51 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 서열 설명:
(2) 서열 3에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 51 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 서열 설명:
(2) 서열 4에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 51 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 서열 설명:
(2) 서열 5에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 49 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 서열 설명:
(2) 서열 6에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 49 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 서열 설명:
(2) 서열 7에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 49 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 서열 설명:
(2) 서열 8에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 49 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 서열 설명:
(2) 서열 9에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 30 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 서열 설명:
(2) 서열 10에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 30 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 서열 설명:
(2) 서열 11에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 30 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 서열 설명:
(2) 서열 12에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 30 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 서열 설명:
(2) 서열 13에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 53
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 서열 설명:
(2) 서열 14에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 53
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 서열 설명:
(2) 서열 15에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 53
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 서열 설명:
(2) 서열 16에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 53
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 서열 설명:
(2) 서열 17에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 23
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 서열 설명:
(2) 서열 18에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 23
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 서열 설명:
(2) 서열 19에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 23
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 서열 설명:
(2) 서열 20에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 23
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 서열 설명:
(2) 서열 21에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 22
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 서열 설명:
(2) 서열 22에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 22
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 서열 설명:
(2) 서열 23에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 22
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 서열 설명:
(2) 서열 24에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 22
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 서열 설명:
(2) 서열 25에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 29
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 서열 설명:
(2) 서열 26에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 29
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 서열 설명:
(2) 서열 27에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 29
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 서열 설명:
(2) 서열 28에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 29
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 서열 설명:
(2) 서열 29에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 24
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 서열 설명:
(2) 서열 30에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 24
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 서열 설명:
(2) 서열 31에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 24
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 서열 설명:
(2) 서열 32에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 24
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 서열 설명:
(2) 서열 33에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 22 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 서열 설명:
(2) 서열 34에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 22 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 서열 설명:
(2) 서열 35에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 22 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 서열 설명:
(2) 서열 36에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 22 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 서열 설명:
(2) 서열 37에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 26
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 서열 설명:
(2) 서열 38에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 26
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 서열 설명:
(2) 서열 39에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 26
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 서열 설명:
(2) 서열 40에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 26
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 서열 설명:
(2) 서열 41에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 27
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 서열 설명:

Claims (25)

  1. 서열 21, 22, 23, 및 24로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는 22 내지 100 염기 서열로 이루어지고, 엄격한 혼성화 검정시험 조건 하에서 히스토플라스마 캅술라툼 및 블라스토마이세스 데르마티티디스 핵산으로부터 콕시디오이데스 이미티스 핵산을 구별할 수 있는, 콕시디오이데스 이미티스 검출용 핵산 혼성화 검정시험 프로브.
  2. 제1항에 있어서, 상기 프로브가 아크리디늄 에스테르 표지를 함유하는 핵산 혼성화 검정시험 프로브.
  3. 제1항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 서열로 이루어진 핵산 혼성화 검정시험 프로브.
  4. 서열 21, 22, 23, 및 24로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는 22 내지 100 염기 서열로 이루어진 핵산 혼성화 검정시험 프로브 및
    상기 프로브가 콕시디오이데스 이미티스를 검출할 수 있도록 충분히 상보적인 콕시디오이데스 이미티스의 상보성 표적 서열
    을 포함하는, 콕시디오이데스 이미티스의 특이적 검출을 위한 핵산 하이브리드.
  5. 서열 25, 및 서열 27로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열로 본질적으로 이루어진 헬퍼 프로브.
  6. 서열 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 및 24로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는 22 내지 100 염기쌍 서열로 이루어지고 엄격한 혼성화 검정시험 조건 하에서 히스토플라스마 캅술라툼 및 블라스토마이세스 데르마티티디스 핵산으로부터 콕시디오이데스 이미티스 핵산을 구별할 수 있는, 핵산 혼성화 검정시험 프로브 및
    서열 25 및 27로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열로 본질적으로 이루어진 헬퍼 프로브
    를 포함하는 프로브 혼합체.
  7. 서열 9, 11, 29, 31, 33, 35, 37, 및 39로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는 22 내지 100 염기 서열로 이루어진 증폭 올리고뉴클레오티드.
  8. 제7항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가 그의 5' 말단에 RNA 폴리머라제에 의해 인식되거나 또는 RNA 폴리머라제에 의한 개시 또는 신장을 향상시키는 핵산 서열을 추가로 포함하는 증폭 올리고뉴클레오티드.
  9. 제8항에 있어서, 상기 핵산 서열이 RNA 폴리머라제에 의해 인식되는 프로모터 서열인 증폭 올리고뉴클레오티드.
  10. 제8항에 있어서, 상기 핵산 서열이 서열 41로 이루어진 증폭 올리고뉴클레오티드.
  11. 서열 1, 5, 13, 29, 31, 33, 35, 37, 및 39로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열로 본질적으로 이루어진 증폭 올리고뉴클레오티드.
  12. 제11항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 서열로 이루어진 증폭 올리고뉴클레오티드.
  13. 제11항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 서열이 서열 5, 33, 및 35로 이루어진 군으로부터 선택된 증폭 올리고뉴클레오티드.
  14. 제11항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 서열이 서열 13, 37, 및 39로 이루어진 군으로부터 선택된 증폭 올리고뉴클레오티드.
  15. a) 서열 21, 22, 23, 및 24로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는 22 내지 100 염기 서열로 이루어지고, 엄격한 혼성화 검정시험 조건 하에서 히스토플라스마 캅술라툼 및 블라스토마이세스 데르마티티디스 핵산으로부터 콕시디오이데스 이미티스 핵산을 구별할 수 있고, 엄격한 혼성화 조건 하에서 콕시디오이데스 이미티스 핵산과 검출에 대해 안정한 하이브리드를 형성하는 핵산 혼성화 검정시험 프로브와 시험 샘플을 엄격한 혼성화 검정시험 조건 하에서 접촉시키는 단계, 및
    b) 검출에 대해 안정한 상기 하이브리드의 존재 또는 양을 측정하는 단계
    를 포함하는, 시험 샘플 중의 콕시디오이데스 이미티스의 존재를 검출하고 상기 콕시디오이데스 이미티스를 히스토플라스마 캅술라툼 및 블라스토마이세스 데르마티티디스로부터 구별하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 서열 25 및 27로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 헬퍼 올리고뉴클레오티드의 사용을 추가로 포함하는 방법.
  17. 제15항에 있어서, 상기 (a) 단계 전에, 상기 콕시디오이데스 이미티스 표적 핵산을 증폭시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 증폭이 서열 1, 5, 13, 29, 31, 33, 35, 37, 및 39로 이루어진 군으로부터 선택된 서열로 본질적으로 이루어진 증폭 올리고뉴클레오티드를 사용하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가 서열 5, 33, 및 35로 이루어진 군으로부터 선택된 서열로 본질적으로 이루어진 방법.
  20. 제18항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가 서열 13, 37, 및 39로 이루어진 군으로부터 선택된 서열로 본질적으로 이루어진 방법.
  21. 제18항에 있어서, 상기 샘플은 임상학적 샘플이고, 상기 방법은 임상학적 시험표본으로부터 직접적으로 콕시디오이데스 이미티스를 검출하고, 존재하는 경우 히스토플라스마 캅술라툼, 블라스토마이세스 데르마티티디스, 오이디오덴드론 에키눌라툼, 및 말브란키아 덴드리티쿠스를 콕시디오이데스 이미티스와 구별하는데 사용하는 방법.
  22. 제17항에 있어서, 상기 증폭이 서열 29, 31, 33, 35, 37, 및 39로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는 22 내지 100 염기 서열로 이루어진 증폭 올리고뉴클레오티드를 사용하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 증폭 올리고뉴클레오티드가 그의 5' 말단에 RNA 폴리머라제에 의해 인식되거나 또는 RNA 폴리머라제에 의한 개시 또는 신장을 향상시키는 핵산 서열을 추가로 포함하는 방법.
  24. 제18항에 있어서, 상기 증폭 올리고뉴클레오티드가 상기 RNA 폴리머라제에 의해 인식되는 방법.
  25. (a) 서열 29, 31, 33, 35, 37, 및 39로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는 22 내지 100 염기 서열로 이루어진 증폭 올리고뉴클레오티드를 사용하여 시험 샘플 중에서 콕시디오이데스 이미티스 표적 핵산을 증폭시키는 단계,
    (b) 서열 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 및 24로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는 22 내지 100 염기 서열로 이루어지고, 엄격한 혼성화 검정시험 조건 하에서 히스토플라스마 캅술라툼 및 블라스토마이세스 데르마티티디스 핵산으로부터 콕시디오이데스 이미티스 핵산을 구별할 수 있고, 엄격한 혼성화 조건 하에서 콕시디오이데스 이미티스 핵산과 검출에 대해 안정한 하이브리드를 형성하는 핵산 혼성화 검정시험 프로브와 증폭시킨 표적 핵산을 엄격한 혼성화 검정시험 조건 하에서 접촉시키는 단계, 및
    (c) 검출에 대해 안정한 상기 하이브리드의 존재 또는 양을 측정하는 단계
    를 포함하는, 시험 샘플 중의 콕시디오이데스 이미티스의 존재를 검출하고 상기 콕시디오이데스 이미티스를 히스토플라스마 캅술라툼 및 블라스토마이세스 데르마티티디스로부터 구별하는 방법.
KR1019970705398A 1995-02-07 1996-02-02 콕시디오이데스 이미티스 검출용 증폭 프라이머 및 핵산 프로브 KR19980702001A (ko)

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