KR19980701916A - 검사기구 및 검사방법 - Google Patents

Abstract

분석물의 존재 여부를 나타내는 가시성 신호가 지지체에 있는 검사 사이트에서 발생하도록된 시료중에 있는 분석물의 존재를 검사하는 검사기구는 전술한 신호가 표식된 제1결합 시약과 표식 현상 수단 간의 신호증폭 반응에 의하여 발생 또는 증폭되고, 전술한 표식된 제1결합 시약과 표식 현상수단은 단일 검사단계에서 검사 사이트로 이동하되 표식 현상수단에 앞서 제1결합 시약이 검사 사이트에 도달하도록 순차적으로 이동하게 배치하여서 됨을 특징으로 하는 검사기구로 구성됨. 검사 사이트로의 순차적인 시약들의 이동은 액체 회로, 지연성 용출제 등과 같은 기술에 의하여 달성됨. 검사방법과 검사에 이용되는 킷트도 본 발명의 한 형태를 구성함.

Description

검사기구 및 검사방법

[발명의 상세한 설명]

본 발명은 분석기구, 특히 감광성 속성 시험 진단기구용으로 유용하게 이용할 수 있는 일체화된 원 스텝 증폭 검사 시스템 및 검사방법과 검사도구에 관한 것이다.

원 스텝 속성 검사 시스템은 광범위한 용도, 예를 들면 임신, 성병, 음식물, 검사, 박테리아 감염, 알레르기 검사, 환경감시, 독극물 검사, 수의학적 검사, 생화학적 제제에 대한 검사와 같은 임상학적 면역검사에 널리 사용되고 있다. 대부분의 경우, 특히 타액이나 혈액중의 HIV 항체 검사 또는 특수한 질병을 진단하기 위한 소변이나 대변중의 바이러스 감염이나 저농도 박테리아 검사와 같은 검사할 물질의 농도가 시료중에 극히 미량으로 존재하는 경우에는 현재의 속성 검사방법에서 나오는 신호가 정성 또는 정량 결과를 제공할 정도의 충분한 민감성을 나타내지 못한다.

특히 원 스텝 검사는 조작하는데 숙련이 필요하지 않는 간단한 염가의 폐기성 기구를 사용하는 것이 바람직하다. 또한 기구에 대한 시료의 처리는 단일 단계로 실시될 수 있어야 하며, 세척할 필요가 없어야 한다. 그리고 검사결과는 특수한 기구를 사용하지 않고도 쉽게 판독할 수 있는 가시신호로 나타나야 한다.

이와 같은 속성 검사기구는 일반적으로 최종 검사를 발생하기 위한 착색 라텍스, 카본 또는 금과 같은 입자들을 포함한다. 이러한 검사기구의 예로는 소변중의 βHCG 호르몬 농도를 검사하기 위한 임신 검사 킷트가 있다. 이러한 기구에서는 βHCG에 대한 항체에 결합된 금이나 라텍스가 가시신호를 발생하는데 이용된다.

이러한 형태로된 공지기구의 예들은 EP-B 176799호 및 EP-B 291194호에 공개되었다.

가시신호가 직접적으로 발생되도록 하기 위하여는 신호를 발생하는 입자들이 특정된 크기 이상으로 되어야 한다. 금 입자의 경우에는 선명한 신호가 나타나도록 하기 위하여 입자 크기가 10nm 이상, 특히 40nm 이상으로 되는 것이 바람직하다. 그러나 이러한 원 스텝 속성 검사의 민감성에는 한계가 있어서 그 용도가 제한되고 있다.

따라서 극히 낮은 농도의 분석물을 검사하기 위하여는 보다 민감한 속성 진단 검사가 요구되고 있다. 타액중의 분석물 농도는 혈액중의 농도보다 100배 정도 낮으므로 비침습식 시료채취가 바람직하다.

본 발명의 목적은 고도로 민감한 속성 검사기구를 제공하는 것이다.

전술한 본 발명의 목적은 전술한 분석물의 존재 여부를 나타내는 가시성 신호가 지지체에 있는 검사 사이트에서 발생되도록 된 시료중에 있는 분석물의 존재를 측정하는 검사기구에 있어서, 전술한 신호가 표시된 제1결합 시약과 표식 현상 수단간의 신호 향상반응에 의하여 발생 및 향상되고, 전술한 제1결합 시약과 표식 향상 수단이 단일 검사단계에서 검사 사이트로 이동하되 제1결합 시약이 표식 현상수단에 앞서 검사 사이트에 도달하도록 배치하여서됨을 특징으로 하는 본 발명의 검사 기구에 의하여 달성된다.

본 발명은

(a) 다공성 소재;

(b) 분석물질과 특별히 결합될 수 있고 액체의 영향에 의하여 다공성 소재를 통하여 검사 구역으로 이동할 수 있으며 비가시성 표식물을 포함하는 제1결합 시약;

(c) 전술한 제1결합 시약의 분석물에 보충적으로 결합되는 방식으로 전술한 분석물과 결합하거나 또는 제1결합 시약에 결합하기 위하여 전술한 분석물과 경쟁하는 방식으로 전술한 분석물과 결합할 수 있는 전술한 검사 사이트에 고정된 제2결합 시약, 및

(d) 액체의 영향에 의하여 제1결합 시약에 뒤 이어 검사 사이트로 이동할 수 있고 비가시성 표식물을 가시성으로 변화시킬 수 있는 표식 현상수단을 포함하는 검사기구로 구성된다.

본원 발명에서 비가시성 표식물이라 함은 비록 검사단계에서 수집구역, 즉 검사 사이트에서 농축되어도 육안으로 보이지 않거나 또는 희미하게 보이는 표식물을 의미한다. 이러한 표식물의 예로는 효소 표식물이나 또는 우수한 가시 신호가 나타날 정도의 충분한 량의 수집되지 않거나 또는 그 크기가 10nm 이하, 5nm 이하, 특히 1-2nm 이하의 작은 입자로된 입상 표식물들이 있다.

표식 현상수단은 비가시성 표식물을 가시성으로 되도록 하여 신호를 발생시키는 시약을 포함한다. 현상수단의 특성은 사용된 비가시성 표식물의 특성에 의하여 좌우된다.

예를 들면, 비가시성 표식물이 효소 표식물인 경우, 표식 현상수단은 디아미노벤지딘이나 또는 공지된 효소 현상약을 포함할 수 있다.

표식물이 입상 표식물을 포함하는 경우, 현상수단은 입자들이 가시성으로 되게 입자에 침착되는 물질일 수 있다. 적당한 입상 표식물은 금, 은, 셀레늄 또는 백금과 같은 금속 표식물일 수 있는 바, 이러한 표식물들은 가시성을 향상시키기 위하여 효소나 또는 금속 피막으로 피복할 수 있다. 특히 바람직한 입상 표식물은 입상 금속 표식물을 포함하는 바, 가장 바람직한 입상 표식물은 입상 금 표식물이다.

입상 금속 표식물이 사용되는 경우, 바람직한 현상수단은 은 시약을 포함할 수 있는 바, 이러한 은 시약으로는 예를 들면 J. Hisotochem. Cytochem. 31, 938-944 에서 홀 게이트 등에 의하여 발표된 바와 같은 적당한 현상약과 함께 사용하는 젖산은이 있다. 전술한 은 시약은 다공성 소재의 적당한 부위에 건조 형태로 지지되어 검사 사이트를 향하여 전술한 부위를 통과하는 액체에 의하여 분산될 때까지 유지된다.

은 증폭 시약은 예를 들면 영국, 카디프, 타이 글라스 애비뉴, 골든 게이트 소재 브리티시 바이오셀 인터내쇼날 리미티드에서 구입할 수 있다.

은 증폭 시약과 결합된 입상 금 표식물을 사용하면 신호 강도가 100-1000배로 증가하여 본 발명의 분석 검사 기구를 광범위한 용도에 사용할 수 있게 된다. 신호 현상 속도는 기구의 기하학적 배치와 은 용액의 조성 및 금 입자의 크기에 좌우된다. 본 발명에 따르면 입자들은 1-100nm 범위의 크기를 갖는 것을 사용할 수 있으나, 바람직한 것은 5nm이하의 크기를 갖는 입자를 사용하는 것이다. 적은 입자들을 사용하면 주어진 시료에 대한 감소된 입체적인 면적에서도 보다 많은 입자들이 검사구역에 집적되는 이점이 있다. 이러한 현상은 증폭되지 아니한 큰 입자들 보다 크게 증가된 신호를 제공한다.

검사가 원 스텝 공정으로 실시되는 경우에는 분석물을 포함하는 시료와 표식된 제1결합 시약이 표식 현상 시스템보다 앞서서 검사 사이트에 도달하도록 하는 것이 필요하다. 이러한 배치는 여러가지 형태로 구성되는 바, 이러한 배치중의 한 형태로는 예를 들면 영국 특허 출원 2231150A에 기재되어 있는 액체 회로 형태가 있다. 전술한 영국 특허출원에는 원 스텝 검사에서 완성된 신호를 얻기 위한 표식 현상수단을 공급하기 위한 액체 회로의 사용에 대하여는 기재되어 있지 않다.

이러한 기술을 사용할 때는 일조의 비투과성 차단막에 의하여 액체들이 다른 구역으로 이동하도록 하기 위한 길이와 폭이 다른 이동로를 만들어야 한다. 액체 회로의 한 형태인 인쇄된 액체 회로는 실질적으로 비투과성 차단막을 형성하는 왁스가 인쇄된 하나 또는 그 이상의 층으로된 여과지나 여과막을 포함한다. 검사에 필요한 시약들은 기구의 적당한 위치에 처리되어 건조된다. 이동로의 길이와 형태는 회로의 특정 부분(이 경우 검사 사이트)에 액체가 도착하는 시간을 조절하는데 이용된다. 회로의 폭은 액체 압력을 조절하는데 이용된다.

시약들의 처리구역은 분석물을 포함하는 시료와 제1결합 시약이 표식 현상수단이 도달하기 전에 검사구역에 도달하도록 배치한다. 분석물을 포함하는 액체시료가 제1결합 시약과 별도로 분리하여 처리하는 경우, 정확한 신호가 발생되도록 하기 위하여는 분석물이 제1결합 시약보다 앞서 검사 사이트에 도달하도록 액체시료 이동구역을 배치하여야 한다.

따라서, 본 발명은

(a) 서로 비투과성이면서 검사 사이트에서만 합쳐지는 다수의 이동구역으로 나누어진 다공성 소재,

(b) 분석물과 특별히 결합되고 한 이동 구역에 위치하면서 액체의 영향에 의하여 다공성 소재를 통하여 전술한 검사 사이트로 이동할 수 있는, 비가시 표식물을 포함하는 제1결합 시약,

(c) 전술한 제1결합 시약에 보충적으로 결합되는 방식으로 전술한 분석물과 결합하거나 또는 제1결합 시약에 결합하기 위하여 전술한 분석물과 경쟁하는, 전술한 검사 사이트에 고정된 제2결합 시약, 및

(d) 전술한 이동구역과 다른 이동구역에 위치하고 액체의 영향에 의하여 검사 사이트로 이동할 수 있으며, 비가시성 표식물을 가시성으로 변화시킬 수 있는 표식 현상수단을 포함하는 검사기구로 구성된다.

제1결합 시약과 표식 현상수단은 각각 액체의 영향에 의하여 다공성 소재를 통하여 검사 사이트로 이동할 수 있다. 더구나, 분석물을 포함하는 액체시료는 제1결합 시약과 함께 검사 사이트쪽으로 이동할 수도 있고 이러한 목적을 위하여 기구에 설치한 다른 이동 구역을 따라 검사 사이트쪽으로 이동할 수도 있다. 서로 다른 액체가 각개 구역 또는 구역의 그룹에 처리될 수 있는 바, 이 경우 상이한 액체들은 시료 채취 부위 또는 각개 구역에 배치된 시료 웰에 개별적으로 처리될 수 있다.

그러나 바람직한 예에서는 제1결합 시약과 표식 현상 수단이 검사할 시료를 포함하는 동일한 액체의 영향에 의하여 감사 사이트로 이동할 수 있도록 기구를 설계한다. 이러한 구성은 원 스텝 속성 검사 시스템을 실시하는데 유리하다.

이동 구역들은 동일한 시료가 모든 구역의 시료채취 부분에 동시에 처리되고 다공성 소재를 통하여 검사 사이트로 이동하도록 기구에 배치되는 것이 좋다. 예를 들면, 이동구역들은 비투과성 차단막에 의하여 서로 분리되도록 서로 평행하게 형성하여 한 구역에 있는 액체 이동경로가 다른 구역의 액체 이동경로보다 길게 형성되도록 배치하는 것이 바람직하다.

이러한 배치에 의하면 시료가 제1결합 시약과 표식 현상 수단을 함께 검사 사이트로 운반할 수 있으므로 분석 검사기구를 원 스텝 속성 검사 시스템에 이용하는데 유리하게 된다.

그러나, 제1결합 시약과 표식 현상수단이 순차적으로 검사 사이트로 이동할 수 있도록 하기 위한 다른 방법이 사용될 수도 있다. 이러한 방법중에는 표식 현상수단이 제1결합 시약보다 늦게 용출되도록 하는 지연성 용출 조성물을 사용하는 방법이 있다.

이러한 지연성 용출 조성물에 사용하는 용출제로는 젤라틴과 같은 프로테인, 폴리 에틸렌글리콜(PEG), 폴리비닐피롤리돈(PVP)과 같은 중합체, 계면활성제, 아라비아껌, 설탕과 같은 당류, 점토, 오일, 리피드, 수지, 염류 및 기타 제약공업에서 사용하는 지연성 용출제가 있다. 이러한 지연성 용출제는 0.1-5%, 특히 1%w/v의 농도로 처리하는 것이 바람직하다.

막으로부터 검사 구역으로 흐르는 시약의 용출을 조절하는 다른 방법으로는 시료에 의한 검사 구역의 습윤 조절이 검사구역에 있는 막의 소수성을 변경시키는 방법이 있다. 이러한 방법은 트리톤 엑스 705와 같은 소수성 계면 활성제, 고농도 염(예를 들면 5% NaCl), 일부의 지방산 또는 폴리 엘 트리포판(시그마)과 같은 폴리아미노산을 사용한다. 전술한 물질들은 높은 소수성을 갖고 있고 막속으로 침투될 수 있다.

다른 방법에서는 이동성 표식된 결합 시약과 표식 현상수단을 젤라틴, 글리세롤, 중합체등과 같은 반투과성 차단제로 덮어서 시료가 전술한 차단제로 침투하면서 용해할 때 전술한 결합 시약과 표식 현상수단이 순차적으로 용출되도록 할 수 있다. 전술한 차단제 물질은 시약의 용해 속도와 수집 구역으로의 용출속도에 맞추어 선택한다.

또 다른 예에서는 이동성 표식된 시약 및/또는 표식 현상 시약을 다공성 소재와 접촉하는 별도의 다공성 물질 층에 처리하되, 액체가 우선 다공성 물질층을 통과하면서 다공성 물질층에 흡수되고 이어서 다공성 소재를 이동하도록 처리한다.

최종적으로 액체는 처리된 제1결합 시약 및 표식 현상수단과 결합되면서 기구를 통하여 흐르게 된다. 전술한 다공성 물질층은 막, 종이 또는 글라스파이버 패드를 포함할 수 있다.

또 하나의 다른 예에서는, 표식된 제1결합 시약과 표식 현상수단을 다공성 소재에 처리하되, 표식된 제1결합 시약은 액체시료의 층류와 함께 직접 검사 구역으로 이동하게 하고 표식 현상수단은 검사구역과 만나지 않도록 처리한다. 그러나 표식 현상 수단의 이동경로에 적당한 차단막을 형성하여 전술한 표식 현상수단의 이동경로를 검사구역쪽으로 변경시킬 수 있는바, 이러한 이동경로의 변경은 액체의 이동을 지연시킨다. 전술한 차단막은 처음부터 표식 현상수단을 수반하는 액체의 이동경로에 위치할 수 있으나, 바람직한 것은 표식 현상수단 자체가 표식된 제1결합 시약과 전술한 표식 현상수단의 도착 시간 사이에 약간의 시차가 나도록 차단막을 형성하는데 기여하도록 하는 것이다.

이러한 예는 표식이 금과 같은 입상 금속이고 표식 현상수단이 은 시약과 같은 금속입자의 표면에 침적되는 물질인 경우에 바람직하게 이용된다. 예를 들면, 소형 금속 입자들을 다공성 소재의 표식 현상수단 이동경로에 고정되게 배치하여 이들이 팽창되었을 때 표식 현상수단이 검사구역으로 이동하는 것을 차단하는 차단막을 형성하도록 할 수도 있다. 사용중, 표식 현상수단은 일차로 전술한 금속입자들과 만나서 그들의 표면에 퇴적층을 형성한다. 전술한 퇴적층이 형성되면 입자들이 커져서 차단막을 형성하므로 표식 현상수단을 포함하는 액체의 흐름은 층류를 형성하여 그 이동방향이 전환된다.

이러한 원리는 검사중에 순차적인 반응 또는 반응단계가 나타나도록 하기 위하여 액체 시료의 이동경로 전환이 요구되는 검사에 광범위하게 이용될 수 있다. 전술한 두 기능이 단일 표식 현상수단에서 나타나도록 하는 것이 필요하지만, 표식 현상 수단이 발생된 신호를 증폭시켜야 할 필요는 없다.

이러한 원리를 이용하는 검사기구도 본 발명의 일부를 구성한다.

본 발명의 기구는 샌드위치 또는 경쟁적 검사방법에 적용될 수 있다. 샌드위치 검사에서는 제1결합 시약이 제1결합 시약에 보충되는 방식으로 전술한 분석물에 결합된다. 이 경우, 제1결합 시약은 분석물을 포함하는 액체 시료의 영향에 의하여 검사구역으로 이동한다. 분석물에 결합된 제1결합 시약은 표식 현상수단이 이미 도달한 검사 사이트에 퇴적되어 표식 현상이 가시 신호를 발생하게 된다.

경쟁적 검사에서는, 제2결합제가 제1결합 시약과 결합 하기 위하여 분석물과 경쟁한다. 즉, 제1결합 시약은 검사할 액체 시료의 영향에 의하여 검사구역으로 이동하지만, 분석물에 결합된 제1결합 시약은 검사 사이트에 잔류하지 않고, 오직 미결합 제1결합 시약만이 퇴적되어 가시신호를 발생한다. 이 경우에는, 시료중에 보다 적은 량의 분석물이 존재하여도 신호는 보다 강하게 나타난다.

이러한 형태의 검사에서는 제1결합 시약에 직접 결합되거나 또는 제1결합 시약에 보충적인 방식으로 분석물에 결합되는 추가의 결합제가 사용될 수도 있다. 이러한 추가의 결합제는 시료 이동경로상의 검사 사이트 후방에 위치하는 결합 사이트에 고정된다. 이러한 추가의 결합제는 결합 사이트에서 결합된 분석물/제1결합 시약 복합체 또는 결합체에 퇴적되어 표식 현상 수단이 도착하면 가시 신호를 발생한다. 이러한 방법에서는 검사할 시료중에 존재하는 분석물의 량을 보다 정량적으로 검사하기 위하여 결합된 제1결합 시약에 의하여 발생된 신호를 미결합 제1결합 시약에 의하여 발생된 신호와 비교 평가할 수 있다.

필요에 따라서는 본 발명의 기구에 여과수단을 형성할 수 있는 바, 이러한 여과수단은, 예를 들면 비투과성 차단제를 포함하는 기구의 일부 구역 또는 막 표면에 처리된 시약의 시료 흐름 방향 전방에 설치되어 이러한 부위에 있는 시료로부터 불필요한 물질을 제거하는데 이용된다. 이러한 여과수단은 물리적 필터나 불필요한 물질과 결합되는 면역학적 또는 생화학적 결합제를 포함한다. 예를 들면 혈청에 대하여 혈청학적 검사를 실시하는 경우, 예를 들면 혈청이 표식 현상 수단의 제1결합 시약으로 사용되거나 또는 하기하는 바와 같이 액체 세척제로 사용될 때는 광범위한 혈청 항체의 존재가 유사한 가짜 신호를 발생시킬 수 있다. 이러한 경우에는 예를 들면 항-인간 IPG 항체와 같은 항 IPG항체를 포함하는 면역학적 차단제를 처리하여 해당 구역에 있는 혈청으로부터 전술한 혈청 항체를 제거하여야 한다. 이러한 항 IPG 항체를 포함하는 차단제는 혈청이 검사 사이트에 도달하기 전에 혈청이 전술한 차단제를 통과하도록 다공성 부재에 고정시킨다.

이와 같이 검사에 여과수단을 사용하는 것도 본 발명의 일부를 구성한다.

액체 회로 기술을 사용하면 검사에 부가적인 단계를 결합시켜 이용할 수 있다. 예를 들면 검사 사이트로 세척액을 공급하기 위하여 하나 또는 그 이상의 추가 구역을 설정하거나 배치할 수 있다. 예를 들면, 세척액은 제1결합 시약이 도착하고 표식 현상 수단이 도착하기 전에 공급되도록 하는 것이 필요하다. 이와 같은 세척은 신호가 발생하기 전에 검사 사이트로부터 미결합 제1결합 시약을 세척하여 제거하는 역할을 한다. 세척액은 오염물과 과잉의 시약을 제거하기 위하여 관계된 구역을 통과할 때 여과된 시료 자체일 수도 있다.

혈액 시료에 대한 혈청학적 검사의 경우에는, 검사 사이트로부터 과잉의 혈청과 불특정 항체를 제거하기 위하여 추가의 세척단계가 사용될 수 있다.

신호로 나타나는 표식물 현상은 필요에 따라 액체, 특히 시료 자체로 구성되는 액체를 최종단계의 검사 사이트로 이동시키는 추가의 구역을 형성하므로 달성되도록 할 수도 있다.

본 발명의 기구는 일련의 반응들이 시차를 두고 분리되게 일어나도록 형성할 수도 있다. 예를 들면 이러하 시차반응은 액체 회로의 경우에는 다공성 소재의 각개 비투과성 구역내에 형성된 액체 통로에서 나타나도록 할 수도 있고 각종 시약이 갖고 있는 용출특성과 차단 특성에 의하여 나타나도록 할 수도 있다.

바람직한 예에서는 액체와 과잉 시약이 수집되는 심지 또는 심지 구역을 형성하여 이러한 심지 또는 심지 구역의 전방과 후방에서 반응들이 일어나도록 할 수도 있다. 이러한 구성은 기구를 통한 액체의 흐름을 개선시킨다.

제1 및 제2결합 시약은 검사할 분석물의 특성에 따라 선택한다. 분석물이 호르몬형 βHCG와 같은 항원성 플테인 또는 폴리펩타이드를 포함할 때는 제1 및 제2결합 시약이 전술한 프로테인에 특정된 항체 또는 항체 결합편을 포함할 수 있는 바, 이러한 항체 또는 항체 결합편들은, 특히 샌드위치 검사 또는 경쟁적 검사기술에서 이미 알려졌다.

본 발명의 기구는 분석물 자체가 HIV 항체와 같은 특정 항체를 포함하는 혈청학적 검사에 이용할 수도 있다. 이 경우, 제2결합 시약은 표적 항체가 특정하여 결합하는 항원을 포함하고, 제1결합 시약은 분석물 항체와 결합하는 항-항체를 포함한다. 이 경웅, 분석물 항체는 표시된 항- 항체가 주입되기 전에 검사 사이트에 고정되는바, 전술한 표식된 항-항체는 예를 들면 액체 회로의 다른 구역을 통하여 검사구역에 늦게 도달하도록 처리된다.

또한 분석물은 RNA나 DNA 같은 핵산을 포함할 수도 있다. 이 경우, 제1 및 제2결합 시약은 검사할 핵산과 결합되는 표식된 핵산 탐침과 같은 핵산 결합 성분을 포함할 수 있다.

본 발명의 기구에 사용하는데 적당한 다공성 소재로는 당해 기술분야에 잘 알려진 다공성 막과 종이가 있는 바, 대표적인 것으로는 니트로셀룰로우스 막이 있다.

본 발명의 기구는 간단한 검사봉을 포함할 수 있다. 검사기구의 형태에 따라서 이러한 검사봉은 표면에 보호층이 처리되지 아니한 플라스틱 지지체에 형성된 통상의 검사봉보다 더 넓을 수도 있다. 또한 검사기구는 시료를 처리하기 위한 구멍을 갖는 플라스틱 하우징과 같은 외피로 둘러쌀 수도 있다. 그리고 검사기구는 적층된 카드의 형태로 형성하여 사용 직전에 적층된 층을 떼어내어 시료에 노출될 수도 있도록 하고 시료속에 침지할 수도 있다. 또 다른 형태의 기구는 모든 시약과 차단제 및 회로가 구비된 평평한 카드로 형성하고 비침투성 막으로 피복할 수도 있다. 전술한 비침투성 막은 예를 들면 분무 처리에 의하여 형성된 플라스틱 막일 수 있다.

[도면의 간단한 설명]

이하 본 발명을 도면에 의하여 상세히 설명하면 다음과 같다.

도 1은 사용전의 분석학적 검사기구의 구성을 보여주는 개략도이고,

도 2는 검사의 최종 단계에서 본 도 1의 검사기구를 보여주는 개략도이며,

도 3은 경쟁적 검사에 사용하는 분석학적 검사기구의 구성을 보여주는 개략도이고,

도 4는 세척단계가 결합된 혈청학적 검사에 사용하는 분석학적 검사기구의 구성을 보여주는 개략도이며,

도 5는 혈청학적 검사에 이용되는 검사기구의 다른 형태를 보여주는 개략되고,

도 6은 이송매체로서 혈청학적 시료를 사용하는 혈청학적 검사에 이용되는 검사기구의 개략도이며,

도 7은 신호 증폭이 나타나는 원 스텝 샌드위치 검사에 이용되는 시약이 순차적인 용출과 조절된 확산이 이루어지도록 된 분석학적 검사기구의 개략도이고,

도 8은 집중 대신에 확산구역을 갖는 도 7에 유사한 분석학적 검사기구를 보여주는 개략도이며,

도 9는 검사구역에 대한 시약들의 순차적인 이동이 사용중 액체의 흐름을 자동적으로 변경시키는 증폭반응에 의하여 달성되도록된 분석학적 검사기구를 보여주는 개략도이고,

도 10a와 b는 각각 샌드위치 검사에서 신호증폭을 위하여 시약들이 막의 표면으로 부터 순차적으로 용출되어 직선류로 흐르도록 된 분석학적 검사기구를 보여주는 정면 및 측면 개략도이며,

도 11a와 b는 각각 샌드위치 검사에서 신호증폭을 위하여 시약들이 막과 적층된 패드의 표면으로부터 순차적으로 용출되도록 된 분석학적 검사기구를 보여주는 정면 및 측면 개략도이고,

도 12는 샌드위치 검사에서 시약들이 점진적으로 용해되어 흐르도록 서서히 용해되는 차단제의 이면에 퇴적되어 신호증폭이 나타나도록된 분석학적 검사기구를 보여주는 개략도이다.

도 13a는 샌드위치 검사에서 시약들이 고정된 표적 결합 프로테인을 갖고 있는 막에 적층된 하부 심지로부터 순차적으로 용출되도록 된 분석학적 검사기구를 보여주는 개략도이도,

도 13b는 도 13a에 도시된 검사기구의 측면 개략도이다.

도 1에 도시된 검사기구는 비투과성 차단막(2)에 의하여 제1구역(3)과 제2구역(4)으로 분할된 다공성 소재(1)를 포함하고 있으며, 전술한 제1 및 제2구역은 결합 사이트(5)에서 서로 합쳐진다.

분석물용 항체(6)는 제1구역의 일측 단부(7)에 놓여 있으며, 이 항체는 5mm 이하의 직경을 갖는 금 입자(8)와 결합되었다. 포집 항체(9)는 다공성 소재(1)의 수집 사이트(5)에 고정되었다.

젖산은과 같은 건조 은 시약(10)과 하이드로퀴논같은 현상제는 제2구역(4)의 단부(7) 부분에 놓여 있으며, 전술한 제2부분(4)에는 다수의 비투과성 차단막(11)을 갖고 있는 이동로(12)가 형성되었다.

검사시에는, 전술한 단부(7)를 분석물이 포함된 액체시료속으로 삽입한다. 액체시료는 다공성 소재(1)속으로 흡수되어 제1구역(3)을 통과하면서 표식된 항체(6)를 포집하여 결합 사이트(5)로 이송한다. 도 2에 도시된 바와 같이 만약 시료중에 분석물(13)이 존재하고 있으면 이 분석물은 항체(6)와 결합하게 되고, 이와 같이 형성된 분석물-항체 복합체는 포집 항체(9)에 포집되게 된다.

반면, 제2구역(4)을 통과하는 시료는 은 시약(10)을 포집하고 이동로(12)를 통하여 화살표 방향으로 이동한다. 이동로(12)에는 다수의 차단막(11)들이 형성되어 있어서, 제2구역(4)으로부터 흡수된 액체 시료는 전술한 차단막(11)들을 돌아서 이동하므로 포집 사이트(5)에 도달하는 시간이 제1구역(3)으로 흡수된 시료가 도달하는 시간보다 늦어지게 된다. 따라서 제2구역(4)을 통하여 액체시료와 함께 이송되는 은 시약(10)이 전술한 포집 사이트에 도달하였을 때는 포집 사이트에 시료중의 분석물이 존재하고 있으면 포집 사이트(5)에는 이미 분석물과 금 표식 입자들이 충분한 농도로 존재하게 된다. 이와 같이 금 표식 입자들이 이미 존재하는 포집 사이트(5)에 은 시약(10)이 도달하면 은 시약이 전술한 금 입자들과 반응하여 흑갈색 가시 신호(14)를 발생한다.

도 3에 도시된 다른 형태의 기구에서는 경쟁적 검사가 실시된다. 이 기구는 3개의 이동로(15),(16),(17)가 구획된 다공성 카드(1)를 포함하는 바, 전술한 이동로중 제1이동로(15)는 생쥐 항체와 같은 금 표식된 항체(18)를 포함하고 제2이동로(16)는 젖산은/ 하이드로퀴논 복합체(19)를 포함하고 있다. 항체(18)와 결합하기 위하여 분석물과 경쟁하는 항원(20)은 검사 사이트(21)에 고정되었으며, 항-생쥐항체와 같은 항-항체(22)는 포집 사이트(23)에 고정되었다.

전술한 이동로(15),(16),(17)들은 이들을 통하여 흐르는 액체의 흐름이 검사 사이트(21)와 포집 사이트(23)에 도달하는 시간이 순차적으로 나타나도록 되었다. 카드(1)의 단부에는 포집 사이트(23)를 통과한 액체가 수집되는 심지 구역(24)이 전술한 이동로들과 격리되도록 형성되었다.

검사시에는, 카드(1)의 하단부(25)를 분석물이 포함된 액체 시료속으로 삽입한다. 카드의 하단부(25)에 흡수된 액체 시료는 이동로(15),(16),(17)를 통하여 이동하게 된다. 시료중의 분석물은 가장 짧은 이동로(15)에서 금 표식 항체(18)와 결합하여 검사 사이트(21)로 이동한 다음 검사 사이트에 고정된 고정 항원(20)과 결합되게 되고, 미결합 항체(18)는 전술한 포집 사이트에 축적되게 된다. 검사 사이트(21)를 통과한 결합된 표식 항체(18)는 항-항체(22)와 함께 포집 사이트(23)에 축적된다.

제2이동로(16)를 통하여 이동하는 시료는 은/하이드로퀴논 시약(19)을 동반하여 검사 사이트(21)와 포집 사이트(23)로 이동한 다음 전술한 사이트들에 축적된 금표식 항체(18)와 만나게 된다. 금 표식은 증폭되어 가시성 흑갈색 신호를 발생하는 바, 전술한 신호의 강도는 전술한 사이트들에 존재하는 항체(18)의 량에 의하여 좌우된다.

이어서 가장 긴 제3의 이동로(17)를 이동하는 시료는 검사 사이트(23)에 도달하여 전술한 사이트들에 온 증폭 금-결합 복합체를 세척한다. 모든 과잉 액체들은 심지 구역(24)에 흡착된다.

도 4는 혈청 항체 검사용 혈청학적 면역 검사에 유리하게 이용할 수 있는 본 발명에 의한 검사기구의 다른 예를 보여준다. 이 기구는 길이가 다른 제1, 제2 및 제3이동로(26),(27),(28)를 갖고 있는 다공성 지지체(26)를 포함한다. 전술한 각개 이동로들은 각각 액체 주입 구멍(30),(31),(32)을 갖고 있다.

혈청 항체 또는 분석물이 결합되는 항원(33)은 검사 구역(34)에 고정된다. 금 표식 항-항체(35)는 제2이동로(28)에 형성되고, 은/하이드로퀴논 현상약(36)은 제3이동로(29)에 부착되어 건조된다. 사용할 때는 혈청 시료를 제1이동로(27)에 있는 구멍(30)속으로 주입하고 다른 구멍(31),(32)에는 세척액을 주입한다. 시료는 제1이동로(27)를 이동하여 특정 시료 항체와 결합되는 항원(33)과 만나게 된다. 시료중의 불특정 항체들은 심지구역(37)으로 이동한다.

동시에 제2이동로(28)의 구멍(31)에 주입된 세척액은 금 표식 항체(35)를 검사 사이트(34)로 이동시켜 그곳에 고정된 임의의 혈청 항체와 결합되도록 한다. 이어서 제3이동로(29)의 구멍(32)에서 유출되는 세척액에 의하여 이동한 은/하이드로퀴논 현상약(36)은 결합된 금 결합체의 신호를 증폭시켜 시료중에 혈청 항체의 존재를 나타내는 가시성 신호를 발생시킨다.

도 5는 도 4에 도시된 검사기구의 개량된 형태를 보여주는 것으로서, 이 검사기구는 각개 검사 결합반응 사이에 세척단계가 결합되었다. 이 검사기구는 추가의 이동로(40),(41),(42)를 이용하는 바, 이들 모든 이동로들은 저장부분(39)에 있는 세척액을 받아 들이도록 배치되었다. 이동로(40),(41),(42)들은 세척액을 검사 사이트(34)로 보내어 각각 (a) 금 표식 항체(35)의 도착전에 사이트에 형성된 항원/ 혈청항체 복합체, (b) 은/하이드로퀴논 현상액의 도착전에 항원/혈청 항체/금 표식 항체 및 (c) 검사 사이트(34)에 있는 은 증가 복합체를 세척하여 신호증폭을 끝내도록 한다.

이러한 형태의 기구는 필요에 따라 혈청 시료가 세척단계로 공급되도록 하기 위하여 도 6과 같이 개량할 수 있다. 이 경우 제1이동로(27)에서 이동하는 혈청 이외의 모든 혈청들은 잔류 혈청이 세척액으로 작용할 수 있도록 혈청 항체를 세척하기 위하여 고정된 항-인간 IPG(43)와 접촉시키는 것이 필요하다. 고정된 항-인간 IPG(43)는 해당하는 이동로 각각을 가로지르도록 연장된 횡방향 차단막의 형태로 형성되는 것이 좋다. 이러한 구성에 의하면 별도의 세척액용 저장부분이 필요없게 된다.

또 하나의 다른 예에서는 검사기구가 적당한 시약이 묻어 있는 막으로 구성되는 바, 전술한 시약들은 처리된 시료의 영향에 의하여 검사구역으로 순차적으로 이동하게 배치된다. 이러한 검사기구의 일예가 도 7에 도시되었다. 도 7에 따르면, 전술한 종이, 니트로셀룰로우스, 글라스 파이버 또는 기타의 다공성 물질과 같은 고체 지지체(45)는 처리된 다수의 시약들을 갖고 있는 바, 일부의 시약은 이동할 수 있는 시약이며 일부의 시약은 고정된 시약이다. 이러한 기구는 도 7의 점선으로 표시된 바와 같이 비투과성 차단막(46)을 갖고 있을 수 있다.

시료는 금 표식 항체와 같은 이동성 결합 시약(48)과 은 강화 시약과 같은 표식 현상 시약 또는 이동성 증폭 시약(49)을 향하여 모세관 작용으로 이동할 수 있도록 하단부(47) 또는 하단부에 형성된 다수의 구멍에 처리할 수 있다. 시료는 지지체(45)에서 이동성 표식 결합 시약(48)과 이동성 증폭 시약(49)를 거쳐 검사 구역에 있는 결합 항체와 같은 고정된 결합 시약(50)을 향하여 이동한다. 이동성 시약(48),(49)들이 순차적으로 이동하도록 하기 위하여는 이들을 지지체에서 용출되는 시간이 다른 상이한 용출제에 결합시킨다. 적당한 용출제를 사용하면, 표식된 시약(48)과 증폭 시약(49)의 용출 순서와 용출 속도를 제어할 수 있음은 물론이고 일시적으로 고정되었다가 이어서 반응하도록 조절할 수 있다.

시약들은 화살표 방향을 따라 순차적으로 이동하여 모세관 형상에 의하여 검사 구역을 거쳐 상부구역(51)으로 이동한다. 결합 시약(50)이 이동성 시약(40),(49)과 상호작용하여 균일하게 노출되도록 하기 위하여는 시료 이동경로의 검사 구역 전방에 확산 수단(52)을 형성하는 것이 좋다. 이러한 확산 수단은 시약들이 검사구역을 통하여 균일하게 흐르도록 분산될 수 있게 막에 부착되어 고정된 물질의 형태로 될 수 있는 바, 이러한 확산 수단은 프로테인(예를 들면 소 혈청, 알부민 또는 BSA), 중합체(PVA, PEG, PVP 등), 염 또는 그외 글리세롤, 아라비아 껌, 리피드와 같은 기타 적당한 물질로 구성될 수 있다. 막은 확산 구역에서 혼합 또는 확산이 일어나도록 투과 또는 비투과성 물질을 침투시켜 형성할 수 있다. 비투과성 물질은 고온 가열 왁스 프린터를 이용하여 요구하는 형태가 나타나도록 컴퓨터 그래픽 프로그램을 이용하여 막에 처리한 왁스일 수 있다. 적당한 고온 왁스 프린터로는 영국 테트로닉스 유럽사의 페이서 340이 있다. 바람직한 그래픽 디자인 프로그램으로는 미국 아우토데스크 인코포레이티드의 아우토스켓치가 있다. 또한 확산은 전술한 막의 확산구역 표면에 글라스파이버 같은 별도의 물질을 부착하여 달성할 수도 있다.

시료중에 존재하는 분석물은 우선 제1표시된 결합 시약(48)과 반응하여 검사구역으로 이동한다. 이 반응물은 분석물과 결합제(50)의 상호반응에 의하여 샌드위치를 형성한다. 제1결합 시약(48)에 결합된 표식물은 비가시성이므로(예를 들면 효소나 금이나 기타의 금속 입자 또는 비증폭 표식물) 직접적인 신호는 검출되지 않는다. 시료가 검사구역으로 계속하여 이동하면 전술한 샌드위치의 형성에 이어서 세척효과가 나타난다. 이어서 증폭 시약(49)이 용출되어 검사구역으로 이동하여 간접 신호를 나타내기 위한 요구하는 신호 증폭이 이루어진다. 신호증폭이 이루어진 후 시료가 계속하여 더 공급되면 추가의 시료는 증폭된 신호를 가리고 있던 막을 세척하여 제거하므로 결합구역에 선명한 신호가 나타나게 된다.

또한 검사기구는 도 8에 도시한 바와 같이 단일 스트립으로된 막으로 구성될 수도 있는바, 이러한 기구에서는 이동성 시약(48),(49)이 스트립의 하단부에 평행하게 위치하고 있다. 적당한 지속성 용출제를 사용하면 각개 시약은 검사구역에 있는 결합제(50)를 향하여 순차적으로 이동하게 되고 검사구역 바로 앞에 확산수단(52)을 형성하면 시약들은 검사구역에 도달하기 전에 확산이 일어난다. 이와 같이 시약들은 순차적으로 확산수단에 도달할 때까지는 서로 혼합되지 않는 층류를 형성하게 된다.

은 증폭 시약이 검사 구역내의 금 표식된 결합 프로테인에 은 금속의 형태로 퇴적되면 형성된 은은 증폭 시약이 이 구역을 통하여 추가로 흐르도록 하는 반투과성 차단막을 형성한다는 놀라운 사실을 알게 되었다. 이러한 현상은 최종 반응생성물이 기구의 기하학적 형태를 변경시킬 수 있도록 검사구역을 통한 시약들의 흐름경로를 변경시키는 효과를 가져온다. 이러한 사실은 검사구역내의 금 입자들이 은 이온이 균일하게 확산된 전체 결합구역내에서 균일하게 증폭된 신호를 발생하게 하는 결과를 가져온다.

추가의 실험에 따르면, 적당한 위치에 있는 막에 금 입자를 영구적으로 부착시키면 은 증폭 시약이 은 금속으로 퇴적되어 막을 통과하는 액체의 흐름을 변경시킴을 알게 되었다. 이러한 구성에 의하면, 시약들이 비투과성 차단막 또는 지속성 용출제 없이도 검사구역으로 순차적으로 이동하도록 설계할 수 있다.

전술한 형태의 한 예가 도 에 도시되었다. 이 예에서는 표식된 시약(48)이 검사구역에 있는 결합제(50)쪽으로 직접적인 층류 형태로 이동하도록 지지체(45)에 지지된다. 증폭 시약(49)은 층류로 이동하지만 검사구역으로 우회하여 흘도록 지지된다. 금 입자들(53)은 지지체상의 증폭 시약(49)의 흐름 경로에 퇴적되어 시료가 지지체를 따라 계속하여 흐를 때 시료가 화살표를 따라 검사구역으로 흐르도록 흐름 경로를 변경시키는 차단막을 형성한다.

또한 검사기구는 도 10에 도시된 바와 같은 간단한 삽입봉의 형태로 구성될 수 있는 바, 이러한 검사기구에서는 모든 시약을 스트립을 가로지르는 상이한 구역에 형성하여 이러한 시약들의 용출이 각 구역에 처리된 용출시약에 의하여 조절되게 되었다. 시료는 스트립의 하단부(47)에 처리되고 모세관 작용에 의하여 각개 구역을 거쳐 상단부(51)로 흐르게 되었다. 시료는 중간 용출 없이 증폭 시약(49)을 통과하여 표식된 결합 프로테인(48)으로 이동하여 표식된 프로테인을 용출시킴과 동시에 시료중의 분석물이 표식된 결합 프로테인과 결합되게 한다. 이어서 표식된 결합 프로테인은 포집 결합 프로테인(50)으로 이동하여 앞에서 설명한 바와 같이 시료중에 특정된 분석물이 존재하는 경우에는 샌드위치를 형성하게 된다. 과잉의 시료액체는 포집구역을 거쳐 상단부분(51)으로 이동하는 바, 상당부분(51)에는 검사구역으로부터 이송되는 시료를 흡착하는 겹쳐진 심지부분 또는 보다 큰 면적 부분(도시하지 않았음)이 형성될 수 있다.

증폭 시약(49)은 시료 액체의 연속적인 흐름에 의하여 용출되게 되고, 이러한 용출은 전술한 바와 같은 지연성 용출제의 선택에 의하여 조절될 수 있다. 증폭 시약(49)은 검사 구역으로 이동하여 가시성 신호를 발생한다.

전술한 바와 같이 다수의 시약들을 순차적인 반응이 일어나도록 막의 하단부에 형성할 수 있다. 은 증폭에 뒤 따른 미세한 금 입자 표식물의 사용 또는 착색 반응 기질에 뒤 따른 효소 표식물의 사용은 통상적인 속성 검사 시스템에서 금 또는 특정 표식물에 의하여 나타나는 직접적인 신호 보다 큰 간접 신호강도가 나타나도록 한다. 더구나 본 발명의 방법은 포집 구역에서 나타나는 반응들 사이에 시료 자체에 의하여 이루어지는 세척 단계를 포함할 수도 있다. 더구나 시료로부터 하나 이상의 분석물을 동시에 검사할 수 있도록 하기 위하여 검사 구역에 하나 이상의 고정된 포집 결합 시약을 추가할 수도 있다.

또한 이동성 표식된 결합 시약 및/또는 증폭 수단은 지지체와 다른 투과성 막, 종이 또는 글라스파이버 등으로 구성된 별도의 막으로 형성된 제2의 층에 퇴적되게 할 수도 있다. 전술한 제2의 층은 기구를 구성하는 지지체 막에 접촉하도록 설치되어 있어서, 시료 액체는 포집 구역을 향하여 전술한 제2의 층 밑으로 이동한 다음 일정한 시간이 경과한 후 표식된 결합 시약 또는 표식 현상 수단을 전술한 제2의 층으로부터 용출시킨다. 이러한 구성은 도 11에 도시되어 있는 바, 도 11에 따르면 증폭 시약(49)이 지지체(45)의 표면에 부착된 글라스파이버 패드(54)에 처리된다. 표식된 결합 시약 또는 표식 현상 시약이 방출될때 까지의 시간차는 전술한 제2층을 형성하는 재질과 제2층내에 처리된 용출 시약의 선택에 의하여 조절할 수 있다. 기구막, 즉 지지체를 통하여 이동하는 시약의 이동 속도는 계면 활성제, 중합체, 프로테인, 설탕, 수지 등과 같은 적당한 차단제 중에서 선택한 일종 또는 이들의 배합물로 전술한 막 또는 제2층 재료를 전처리하므로서 조절할 수 있다.

이러한 원리에 따르면, 한 곳에 전술한 막으로 구성되는 수개의 층을 형성하여 각개 층에 처리된 상이한 반응 물질들이 순차적으로 용해되어 지지체 막으로 이동하도록 할 수 있다. 이러한 여러개의 층들은 반응물질들이 보다 정밀하게 순차적으로 용출되도록 하기 위하여 막으로 분리시킬 수도 있다. 이 경우, 막들은 피복된 막일 수도 있고 피복되지 아니한 막일 수도 있다. 이와 같은 층상 배치의 장점은 표식된 결합 시약 및/또는 표식 현상 수단이 시료 액체가 포집구역으로 자유롭게 흐를 수 있도록 하기 위하여 전술한 시약들을 처음부터 기구 막 내부에 결합시키지 않아도 된다는 것이다.

전술한 기구는 샌드위치 검사에 사용할 수도 있고 액체 회로에 대하여 설명한 바와 같이 경쟁적 검사에 사용할 수도 있다. 경쟁적 검사방법에서는 제2결합 시약(50)이 제1결합 시약(48)과 결합하기 위하여 시료 분석물과 경쟁한다. 제1결합 시약(48)은 검사할 액체 시료의 영향에 의하여 검사구역속으로 이동하지만, 시료 분석물에 결합된 제1결합 시약은 검사 구역내에 잔류하지 않고 오직 미결합 제1표식된 결합 시약(48)만이 검사구역에 퇴적되어 가시성 신호를 발생한다. 이 예에서는 시료에 존재하는 분석물이 적으면 적을수록 그에 비례하여 신호가 더 강하게 나타나므로 신호가 크다는 것은 시료중에 분석물이 거의 없다는 것을 의미한다. 즉석 표식된 결합 시약(48)은 검사구역에서 비가시성으로 되지만 뒤 이어 증폭 시약(49)이 도착하면 기존의 통상적인 직접 표식보다 더 높은 강도의 표식이 나타나게 된다.

본 발명의 기구는 혈청, 타액, 또는 기타의 공급원으로 만든 시료 액체에 들어 있는 특정 항체를 검사하는데 이용할 수 있다. 이 경우에 바람직한 예가 도 12에 도시되었다. 기구의 형태는 도 7에 도시된 기구와 유사하게 형성되었다. 그러나 이 경우에는 고정된 포집 시약(50a)이 검사할 항체에 특정된 항원일 수 있다. 표식된 결합 시약(48)은 미세한 금 입자들 또는 기타의 입자 물질이나 효소 등으로 표시된 프로테인 A 또는 프로테인 AG 또는 항 인간 IgG 등과 같은 적당한 결합 프로테인일 수 있다. 증폭 시약(49)은 전술한 바와 같이 은 증폭 시약, 효소, 기질 또는 염료일 수 있다. 이러한 결합 시약의 순차적인 용출은 검사 구역에서 시차 반응이 일어나도록 한다.

특정 및 비특정 항체를 포함하는 시료는 검사구역에 있는 고정 항원(50a)과 직접 반응하도록 미차단 공간(55)을 통하여 이동한다. 뒤 따라 용출된 표식된 시약(48)은 검사구역에 고정된 시료 항체와 결합된다. 표식된 결합 시약(48)과 증폭 시약(49)의 조절된 용출은 전술한 바와 같은 용출물질에 의하여 이루어질 수도 있고 전술한 바와 같은 반투과성 차단막 뒤 또는 내부에 침착시키므로서 달성될 수 있다. 시료는 뒤 이어 용출된 증폭 시약(49)이 가시성 신호를 나타내기 전에 세척 단계를 제공하는 검사구역으로 계속하여 통과한다.

시료중에 존재하는 비특정 항체가 표식된 결합 시약(48)에 부착되는 것을 감소시키기 위하여는 표식된 결합 시약(48)이 항 IPG(56) 밴드에 의하여 부분적으로 차단되도록 할 수 있다. 이러한 구성에서는 시료가 항 IPG(56)를 통과하면서 표식된 결합 시약(48)과 증폭 시약(49)이 순차적으로 용출되어 흐르지만 특정 및 비특정 IPG는 시료로부터 여과된다.

필요에 따라서는 막의 하단부에 시료가 저장되는 심지부분을 형성하여 시료가 심지부분으로부터 모세관 작용에 의하여 상단부의 검사 구역으로 이동하도록 할 수도 있다. 도 12에는 전술한 형태의 검사기구가 도시되어 있는 바, 이 기구에서는 시료와 시약들이 확산 수단(52)에 의하여 검사 또는 포집 구역으로 집중되도록 되었다.

또한 검사기구는 모든 시약들이 스트립을 가로지르는 상이한 구역에 형성되는 도 10에 도시된 형태로 구성될 수도 있다. 전술한 형태의 기구에서는 시약들의 용출이 각 구역에 적당한 용출물질을 처리하므로서 조절할 수 있다. 시료는 스트립의 하단에 처리되고 모세관 작용에 의하여 각 구역을 통하여 상단부(51)로 상향 이동한다. 이 경우 시약들은 시료가 중간 용출없이 증폭 시약(49)을 통과한 다음 표식된 결합 시약(48)으로 이동한다. 시료들은 시료 분석물이 포집 시약(50)에 결합되는 검사 구역으로 이동한다. 시료 액체의 흐름은 표식된 결합 시약(48)을 용출시키고, 용출된 표식된 결합 시약은 포집 구역으로 이동하여 포집 구역에 고정된 특정 항체와 결합한다. 또한 시료 액체의 흐름은 증폭 시약(49)를 용출시키고, 용출된 증폭 시약은 포집구역으로 이동하여 표식을 강화하므로서 가시신호가 발생되도록 한다.

본 발명의 바람직한 예는 도 13에 도시된 간단한 검사봉의 형태로 구성될 수 있는 바, 이러한 검사기구에서는 이동성 시약(48),(49)들이 예를 들면 글라스파이버를 포함하는 하부 패드 또는 심지(57)에 있는 상이한 구역에 처리되고 시약들의 용출을 조절하는 아라비아 껌과 같은 지연성 용출 물질로 덮혀 있다. 시료는 스트립의 하단부(47)에 처리되고 모세관 작용에 의하여 각개 시약이 처리된 구역을 통하여 상향 이동한다. 시료는 증폭 시약(49)을 즉석에서 용출시킴이 없이 표식된 결합 시약(48)으로 이동하여 결합 시약을 용출시키므로서 결합 시약(48)이 용출되면서 바로 시료 분석물과 반응하도록 한다. 이어서 생성된 액체는 막(58)을 거쳐 결합 시약(50)으로 이동하여 시료중의 특정 분석물과 전술한 바와 같은 샌드위치를 형성한다. 과잉의 시료 액체는 검사구역을 거쳐 겹쳐진 심지(59)를 갖고 있는 상단 부분(51)으로 이동하고, 이 겹쳐진 심지(59)가 검사구역으로부터 시료을 흡착하여 제거한다. 시료 액체의 흐름은 하부 심지로부터 증폭 시약(49)을 용출시키고, 용출된 시약은 막을 통하여 검사구역으로 이동하여 검사구역에서 표식을 증폭시킨다. 또한 시료의 흐름은 표적 구역으로부터 과잉의 증폭시약을 세척한다.

전술한 표식된 결합 시약용 지연성 용출 시약을 사용하는 간단하고 단순한 구성에 따르면 신호를 가시성으로 만들기 위한 추가의 증폭 없이도 도 7 내지 13에 도시된 예에 가시성 표식을 사용할 수 있게 된다.

본 발명의 검사기구는 완성품으로 공급할 수도 있고, 예를 들면 적당한 비투과성 차단막 및/또는 시약이 첨가되었음을 나타내는 표식물이나 밴드 또는 항체가 처리된 다공성 소재를 포함하는 도구의 형태로 공급할 수도 있다. 이 경우 시약들은 도구에 포함될 수도 있고 포함되지 않을 수도 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 상세하게 설명한다.

[실시예 1]

도 10에 도시된 기구를 다음과 같이 제조한다. 경질 플라스틱 지지체에 지지된 8μm의 기공 크기를 갖는 니트로셀룰로우스 막은 인도국 뉴 델리 소재, 애드밴스드 마이크로 디바이스로부터 구입하였다. 이 막의 스트립을 폭 5mm, 길이 80mm로 되게 절단한다. 토끼 IPG의 스트립(영국 풀 소재, 시그마 케미칼스 리미티드 제품)을 탈이온수에 1mg/ml로 되게 희석하고, 진단기구용 프로테인을 인쇄하기 위하여 특별히 설계된 압전 잉크 젯 프린터(영국 카디프 소재, 브리티시 바이오셀 인터내쇼날 리미티드의 바이오프린터)를 이용하여 스트립의 하단으로부터 4cm의 높이에 스트립을 가로지르도록 1μl/cm의 농도로 되도록 처리한다. 프로테인 스트립을 37℃에서 15분 동안 건조한다. 스트립을 0.1% 트윈 20과 1% 폴리비닐피롤리딘(영국, 시그마)의 용액에 1분 동안 침지한 다음 꺼내어 37℃에서 30분 동안 건조한다. 1nm 금입자에 결합된 양 항-토끼 IPG(영국, 브리티시 바이오셀)를 0.1% 트윈 20과 1% 폴리비닐피롤리딘에 1μg/ml의 항체농도로 되게 희석하고, 5μl를 하단으로부터 3cm 높이의 스트립에 피펫트로 처리한다. 라이트 마이크로스코프 실버 엔핸싱 킷(브리티시 바이오셀 인터내쇼날 리미티드)를 개시제 및 현상약과 함께 준비한다. 개시제와 현상약은 별도로 아라비아 껌의 수성 1% 용액(시그마 케미칼스, 유케이 리미티드)으로 1:1로 희석한다. 각개 시약 2μl를 막 스트립에 피멧트로 처리하되, 개시제는 하단으로부터 1cm의 높이에 처리하고 증폭제인 현상액은 하단으로부터 2cm높이에 처리한 다음 스트립을 37℃에서 30분간 건조한다. 이어서 스트립을 인산염 완충 생리식염수(PBS)100μl을 포함하는 마이크로 웰에 주입한다. 금 표식 양 항-토끼 IPG는 고정된 토끼 IPG를 향하여 이동하고 1분 동안 포집되도록 하였으나 분명한 신호가 나타나지 않았다. 2분이 경과한 후 개시제와 증폭제는 포집된 금 표식 항체까지 도달하였고 강한 흑색 신호가 나타났다.

[실시예 2]

도 10에 설명된 방법으로 뇨액중의 βHCG를 검사하기 위하여 샌드위치 검사를 실시한다. 플라스틱 지지체에 지지된 8μm의 기공크기를 갖는 니트로셀룰로우스 막(인도 소재, 애드밴스드 마이크로 디바이시스)으로 실시예 1에서와 같은 스트립을 형성하고, 스트립에 바이오프린터를 사용하여 1mg/ml 모노클로날 항 αHCG 용액(영국, 시그마 케미칼스 리미티드)을 1μl/cm의 농도로 되도록 밴드상으로 처리하고 처리된 스트립을 37℃에서 15분간 건조한다. 막 스트립을 0.1% 트윈 20과 1% 폴리 비닐필로리딘의 혼합물(영국, 시그마 케미칼스 리미티드)에 1분 동안 침지하고 37℃에서 30분 동안 건조한다. 1nm 금 입자들에 결합된 모노클로날 항 βHCG(영국, 브리티시 바이오셀)를 0.1% 트윈 20과 1% 폴리비닐피롤리딘의 혼합액에 1μg/ml의 항체 농도로 되도록 희석하고 5μl를 피펫트로 스트립의 하다으로부터 3cm 높이에 처리한다.

실시예 1에서와 같이 증폭제와 개시제를 스트립에 처리하고, 스트립을 37℃에서 30분 동안 건조한다. 4주된 임산부의 소변 100μl이 들어 있는 마이크로웰에 스트립을 삽입한다. 시료는 βHCG 분석물과 반응하면서 결합된 금을 수집 구역으로 이동하였다. 시료는 3분 내에 은 증폭 시약을 포집구역으로 이동시켜 분석물의 존재를 나타내는 강력한 흑색 라인을 생성시켰다. 또한 시료의 흐름은 스트립으로부터 오염물을 제조하였다.

[실시예 3]

도 10에서 설명한 형태의 표준 시료를 사용하여 B형 간염의 HBs 항원을 검사하는 또 다른 샌드위치 검사를 실시한다. 플라스틱 지지체에 지지된 8μm의 기공 크기를 갖는 니트로셀룰로우스 막(인도, AMK)을 스트립 형태로 절단하고, 스트립에 바이오프린터를 사용하여 모노클로날 표면 항원 1mg/ml 용액(영국, 겐자임)을 1μl/cm의 농도로 되도록 처리하고, 스트린을 37℃에서 15분 동안 건조한다. 스트립을 0.1% 트윈 20과 1% 폴리비닐피롤리딘의 혼합액(영국, 시그마 케미칼스 리미티드)에 1분 동안 침지하고 37℃에서 30분 동안 건조시킨다. 1nm의 금 입자들에 결합된 제2모노클로날 항 HBs 항원(영국, 브리티시 바이오셀)을 0.1% 트윈 20과 1% 폴리비닐 피롤리딘 혼합액에 1μg/ml의 항체 농도로 되도록 희석하고, 5μl를 스트립의 하단으로부터 약 3cm 높이에 피펫트로 처리한다. 전술한 바와 같이 증폭제와 개시제를 스트립에 처리하고 스트립을 37℃에서 3분 동안 건조한다. 스트립을 표준 농도의 HBs항원(영국, 겐자임)이 첨가된 PBS 100μl를 포함하는 마이크로웰에 삽입한다. 시료는 결합된 금 입자들이 시료중의 간염 분석물과 반응하면서 포집구역으로 이동시켰다. 3분 내에 시료가 은 증폭 시약을 수집 구역으로 이동시켜 분석물의 존재를 나타내는 강력한 흑색 라인을 생성시켰다.

[실시예 4]

도 13에 도시된 검사기구를 다음과 같이 제조한다 경질 플라스틱 지지체에 지지된 8μm의 기공 크기를 갖는 니트로셀룰로우스 막(인도 뉴델리, 어드밴스드 마이크로 디바이스)을 폭 5mm, 길이 25mm로 되도록 절단하여 스트립을 형성한다. 막에 상부 종이 심지를 2mm 겹쳐지도록 형성한다. 바이오프린터를 이용하여 스트립의 하단으로부터 약 4cm 높이에 모노클로날 항 βHCG의 1mg/ml 용액(영국, 시그마 케미칼스 리미티드)을 1μl/cm의 농도로 되도록 밴드상태로 처리한 다음, 37℃에서 15분 동안 건조한다. 막 스트립을 0.1% 트윈 20과 1% 폴리비닐피롤리딘의 혼합액에 1분 동안 침지한 다음, 37℃에서 30분 동안 건조한다. 금 입자들에 결합된 모노클로날 항 β HCG(영국, 브리티시 바이오셀)를 1μg/ml의 농도로 되도록 0.1% 트윈 20과 1% 폴리비닐피롤리딘 혼합액에 희석하고, 희석액 5μl를 별도의 5×30mm 글라스파이버에 하단에서 2cm 높이에 피펫트로 처리한다. 별도의 글라스파이버 스트립(영국, 하트맨)에 실버 언핸싱 킷트(영국, 브리티시 바이오셀 리미티드의 SEKL15)로부터 얻은 증폭제와 개시제 용액을 각각 피펫트를 이용하여 5mm의 간격을 두고 5μl씩 처리하고 37℃에서 30분 동안 건조한다. 글라스파이버 스트립을 양면 테이프로 플라스틱 지지체에 지지된 니트로셀룰로우스 막에 1mm 정도 겹쳐지도록 부착한다. 형성된 스트립의 하단을 임신 4주의 임산부 소변 100μl를 포함하는 마이크로웰에 삽입한다. 시료는 시료중의 βHCG 분석물과 반응하면서 결합된 금입자들을 글라스파이버로부터 포집구역으로 이동시킨다. 시료는 3분 내에 은 증폭 시약을 글라스파이버로부터 포집구역으로 이동시켜 분석물의 존재를 나타내는 강력한 흑색 라인을 생성하였다.

[실시예 5]

25mm의 폭과 80mm의 길이를 갖는 니트로셀룰로우스 스트립(인도, 어드밴스드 마이클 디바이시스)으로 도 7에 도시된 검사기구를 만들고, 도 7의 점선으로 도시된 바와 같이 마커 팬을 사용하여 불용성 잉크로 경계선을 그린다. 이러한 설계에서는 시약들을 위한 별도의 이동로가 형성되지 않아도 시약들이 집중되게 된다. 스트립의 검사구역에는 바이오프린터를 사용하여 모노클로날 항 βHCG(영국, 시그마 케미칼스 리미티드)의 1mg/ml 용액을 하단으로부터 4cm의 높이에 전체폭에 걸쳐지도록 밴드상으로 처리한 다음, 처리된 스트립을 37℃에서 15분 동안 건조한다. 막스트립을 0.1% 트윈 20과 1% 폴리피롤리딘 혼합액(영국, 시그마 케미칼스 리미티드)에 삽입한 다음 37℃에서 30분 동안 건조한다. 1nm 금 입자들에 결합된 모노클로날 항 βHCG(영국, 브리티시 바이오셀)를 0.1% 트윈 20과 1% 폴리비닐피롤리딘 혼합액으로 1μg/ml의 항체농도가 되도록 희석하고, 희석액 5μl를 스트립 하단으로부터 1cm 높이의 우측부분에 (도 7의 48위치) 피펫트로 처리한다. 실버 엔핸싱 킷트(영국, 브리티시 바이오셀 인터내쇼날 리미티드의 SEKL15)로부터 얻은 증폭제와 개시제를 각각 3μl 씩 피펫트로 도 7의 49로 표시된 구역에 처리하여 두 시약들이 중앙에서 5mm의 간격이 유지되도록 한 다음, 37℃에서 30분 동안 건조한다. 은 증폭 시약은 스트립 하단으로부터 2cm 높이의 좌측 부분에 위치하고 있다. 스트립의 하단을 임신 2주째의 임산부 소변 100μl를 포함하는 마이크로웰에 침지한다. 시료는 시료중의 βHCG 분석물과 반응하면서 결합된 금 입자들을 스트립으로부터 포집구역으로 이동시킨다. 3분 내에 시료는 은 증폭 시약을 니트로셀룰로우스 막 표면의 글라스파이버 스트립으로부터 포집 구역으로 이동시켜 분석물의 존재를 나타내는 강력한 흑색 라인을 생성시켰다. 또한 하단부로 부터의 시료 흐름은 남아 있는 시약들을 막으로부터 상단부로 씻어낸다.

전술한 검사기구에 따르면 원 스텝 공정으로 고도로 민감한 검사가 신속하게 이루어진다. 된다. 실시할 검사의 종류와 사용하는 시약에 따라 많은 상이한 설계가 이루어질 수 있는 바, 이러한 변형들도 본 발명의 범주에 속한다.

Claims (31)

1. 검사할 분석물의 존재 여부를 나타내는 가시성 신호가 지지체상의 검사 사이트에서 발생하도록 된 시료중의 분석물 존재를 검사하는 검사기구에 있어서, 이 기구가 단일 이동로를 갖는 기구로 구성되고, 전술한 신호는 표식된 제1결합 시약과 표식 현상 수단 간의 신호 증폭 반응에 의하여 발생 또는 증폭되며, 전술한 제1결합 시약과 표식 현상 수단은 시료 처리에 의한 단일 검사단계에서 검사 사이트로 이동하도록 배치되었으나 제1결합 시약이 표식 현상 시약에 앞서 검사 사이트에 도착되도록 되었음을 특징으로 하는 검사기구.
2. 시료중의 분석물을 검사하는 검사기구에 있어서, 이 검사기구가

   (a) 다공성 소재,

   (b) 분석물과 특별히 결합되고 시료를 기구에 처리하는 단일 단계에서 액체의 영향에 의하여 다공성 소재를 통하여 검사 사이트로 이동할 수 있으며 비가시성 표식물을 포함하는 제1결합 시약,

   (c) 제1결합 시약이 결합된 분석물에 보충적으로 결합되도록 전술한 분석물에 특별히 결합되거나 또는 전술한 제1결합 시약에 결합하기 위하여 전술한 분석물과 경쟁하는 전술한 검사 사이트에 고정된 제2결합 시약, 및

   (d) 전술한 제1결합 시약의 이동후에 액체의 영향에 의하여 검사 사이트로 이동할 수 있고, 비가기성 표식물을 가시성으로 만들 수 있는 표식 현상 수단

   을 포함함을 특징으로 하는 검사기구.
3. 제2항에서, 전술한 비가시성 표식물이 입자상 금속 표식물이고, 표식 현상 수단은 전술한 금속의 표면에 고형 물질을 퇴적시키는 시약임을 특징으로 하는 검사기구.
4. 제3항에서, 표식물의 입도가 1 내지 100nm, 특히 5nm 이하임을 특징으로 하는 검사기구.
5. 제3항에서, 표식물이 입자상 금 표식물임을 특징으로하는 검사기구.
6. 제5항에서, 표식 현상 수단이 은 함유 시약을 포함함을 특징으로 하는 검사기구.
7. 제2 내지 6항중의 한 항에서 전술한 다공성 소재가 서로 통하지 않으면서 검사 사이트에서 합쳐지는 다수의 구역으로 나누어지고, 전술한 제1결합 시약은 전술한 구역들중의 하나에 위치하고 있으며, 제2결합 시약은 다른 구역에 위치하고 있으며, 전술한 제2시약이 위치하는 다른 구역을 통과하는 흐름 경로는 제1결합 시약이 위치하는 구역을 통과하는 흐름 경로보다 길게 되었음을 특징으로 하는 검사기구.
8. 제7항에서, 구역들이 왁스 차단막에 의하여 분리되었음을 특징으로 하는 검사기구.
9. 제7항에, 구역들이 홈 또는 공간부에 의하여 분리되었음을 특징으로하는 검사기구.
10. 제2 내지 6항중의 한 항에서, 전술한 표식 현상 수단이 액체의 존재하에 다공성 소재로부터의 용출이 제1결합 시약의 용출에 비하여 늦어지도록 다공성 소재에 처리됨을 특징으로 하는 검사기구.
11. 제10항에 있어서, 표식 현상 수단이 지연성 용출제를 포함하는 조성물의 형태로 처리됨을 특징으로 하는 검사기구.
12. 제10 또는 11항에서, 표식 현상 수단이 다공성 소재와 접촉하는 제2다공성 소재내에 함유되어 있음을 특징으로 하는 검사기구.
13. 제12항에서, 제2다공성 소재가 글라스파이버임을 특징으로하는 검사기구.
14. 제10 내지 13중의 한 항에서, 제1결합 시약이 지연성 용출제를 포함하는 조성물의 형태로 처리됨을 특징으로 하는 검사기구.
15. 제2 내지 6항중의 한 항에서, 다공성 소재 막으로부터의 이동성 시약들의 용출이 다공성 소재의 소수성을 개선시키므로서 조절됨을 특징으로하는 검사기구.
16. 제2 내지 6항중의 한 항에서, 다공성 소재를 통한 표식 현상 수단의 이동이 반투과성 차단막에 의하여 조절됨을 특징으로 하는 검사기구.
17. 제3 내지 6항중의 한 항에서, 표식 현상 수단이 다공성 소재에 존재하는 제1접촉 표식물에 배치되어 전술한 표식물에 퇴적된 물질이 검사구역으로 흐르는 액체의 흐름을 전환시키는 차단막을 형성함을 특징으로 하는 검사기구.
18. 전술한 청구범위들 중의 한 항에서, 이 검사기구가 시료를 주입하기 위한 구멍을 갖고 있고, 검사구역을 관찰할 수 있는 하우징을 포함함을 특징으로 하는 검사기구.
19. 전술한 청구범위들 중의 한 항에서, 이 검사기구가 기구를 통과하는 액체의 이동을 보조하는 최소한 하나의 심지 또는 심지구역을 갖고 있음을 특징으로 하는 검사기구.
20. 전술한 청구범위들 중의 한 항에서, 이 검사기구가 검사구역에서 반응이 일어나기 전에 시약들을 균일하게 분산시키는 확산수단을 포함함을 특징으로 하는 검사기구.
21. 내용 없음
22. 전술한 청구범위들 중의 한 항에서, 이 검사기구가 반응단계들 사이에 검사구역이 세척되도록 구성되었음을 특징으로 하는 검사기구.
23. 제22항에서, 분석물을 함유하는 시료가 세척액으로 사용됨을 특징으로 하는 검사기구.
24. 제23항에서, 이 검사기구가 전술한 세척액으로부터 불필요한 물질을 제거하는 여과 수단을 포함함을 특징으로 하는 검사기구.
25. 제24항에서, 이 검사기구가 혈청검사에 사용하도록 된 것이고, 여과수단은 혈청 시료로부터 항체를 제거하도록 배치된 항-항체를 포함함을 특징으로 하는 검사기구.
26. 제1 내지 제21항중의 한 항에서, 표식된 제1결합 시약이 표식된 핵산 탐침을 포함하고, 전술한 분석물은 검사구역에 고정된 핵산 시ㅋ스를 포함함을 특징으로 하는 검사기구.
27. 액체시료중의 분석물의 존재를 검사하는 방법에서, 이 방법이 전술한 청구범위중의 한 항에 청구된 검사기구의 액체시료를 처리하는 공정과 가시성 신호의 존재 여부를 기록하는 공정을 포함함을 특징으로 하는 검사방법.
28. 액체가 분석물의 존재 여부를 나타내는 신호를 발생하도록 다공성 소재를 통하여 이동할 수 있도록 되었고, 전술한 시스템은 검사과정에 다공성 소재를 통한 액체의 흐름을 전환시키는 물리적인 차단막이 생성되게 반응하도록 배치된 제1시약과 제2시약을 포함함을 특징으로 하는 진단용 검사기구.
29. 다수의 반응이 다공성 소재에 있는 검사 사이트에서 일어나고, 세척액은 최소한 두 반응들 사이에서 전술한 검사 사이트에 처리되며, 세척액은 전술한 소재에 형성된 여과수단을 통과한 시료의 일부를 포함함을 특징으로 하는 검사기구.
30. 제29항에서, 이 검사기구가 혈청학적 검사에 이용되는 것이고, 여과수단은 다공성 소재에 있는 고정된 항-항체의 밴드를 포함하며, 세척액체로 사용되는 시료의 일부는 검사 사이트에 도달하기 전에 전술한 항-항체 밴드를 통과하도록 되었음을 특징으로 하는 검사기구.
31. 제26항의 방법에 사용하도록된 다공성 소재를 포함하는 검사용 도구.