KR19980701585A

KR19980701585A - 골용해와 전이를 개선하기 위한 조성물(composition to ameliorate osteolysis and metastasis)

Info

Publication number: KR19980701585A
Application number: KR1019970704977A
Authority: KR
Inventors: 알. 먼디 그레고리; 도시유키 요네다; 에이. 기스 테레사
Original assignee: 레이몬드 엠. 위티; 제노테크 인코오포레이티드
Priority date: 1995-01-23
Filing date: 1996-01-23
Publication date: 1998-05-15
Also published as: AU4764596A; EP0813423B1; EP0813423A4; CA2210484C; DK0813423T3; US20050244414A1; CA2210484A1; JPH10512885A; DE69622157T2; JP4231106B2; DE69622157D1; EP0813423A1; WO1996022790A1; KR100528604B1; ATE219945T1; ES2179929T3; AU703222B2; PT813423E

Abstract

본 발명은 PTHrp, TGFα, IL-1α, IL-1β, IL-6, 림프독소, TNF, PGE; 1,25 디하이드록시 비타민 D₃와 그들의 항원성 단편으로 구성되는 군으로부터 선택된 화합물에 대한 항체의 치료학적 유효량을 골용해와 그들의 증상성 후유증뿐만 아니라 뼈로의 암전이와 뼈에서의 암세포 성장의 치료에 이용하는 것에 관한 것이다. 부갑상선 호르몬-관련 단백질(PTHrp)과 면역반응하는 항체가 특히 바람직하다. 인체 환자에게 본 발명의 방법을 적용하기 위해 인체 특성을 가진 항체가 본 발명에 포함된다. 또한, 상기 항체는 일반적인 화학식 1을 가지는 비스포스포네이트 또는 피로포스포네이트 그리고 그들의 약학적 허용염, 수화물 및 부분 수화물의 치료학적 유효량과 조합하여 주사가능한 제제로 투여될 수 있으며, 상기 구조식에서 X는 포스포네이트기의 상호연결을 허락하는 연결부분이다. 상기 항체와 비스포스포네이트는 뼈로의 암전이와 그들의 증상성 후유증 그리고 특히 뼈 재흡수와 관련된 치료에서 상승적으로 작용한다.

Description

골용해와 전이를 개선하기 위한 조성물

암으로 인한 질병률과 사망률이, 특히 외과 기술이 쉽게 이용가능하다는 사실의 관점에서, 암세포의 초기의 증식의 다소 온몸을 침범하는 후유증에 기인한다는 것은 오랫동안 알려져 왔다. 초기 종양의 부가적인 위치로의 전이, 이러한 전이의 직접 또는 간접적인 결과로써 표적 부위의 파괴, 악액질, 칼슘과잉혈증, 및 다른 증상들이 악성 종양의 과정을 특징짓는다. 이들 후유증이 일어나는 기작은 여러 인자들중에서, 다양한 사이토카인, 성장 인자, 그리고 세포 접착 분자들에 관련되는 것으로 생각된다. 하지만, 현재로서는 어떻게 암이 뼈 전이에서 뼈를 용해하는 지는 전혀 알려져 있지 않으며, 뼈를 용해할 수 있는 것으로 알려진 유일한 세포는 파골세포이다. 어떻게 전이된 암이 암의 성장을 이루기 위해 뼈를 녹이는지는 알려져 있지 않다.

이들 과정의 적어도 일부에서 역할을 하는 것으로 알려진 많은 인자들중의 하나가 부갑상선 호르몬-관련 단백질(PTH-rp)이다. PTH와의 유사성 때문에, 그것은 악성 종양의 체액성 칼슘과잉혈증(HHM)의 매개자로 인식되어졌다. 이 역할에서, 종양에 의해 분비되는 PTH-rp는 혈액을 통해 순환하며 뼈 재흡수의 지표인 칼슘과잉혈증과 관련된다.

PTH-rp는 전신성 뼈 재흡수와 세관에서 소변으로부터 칼슘 재흡수의 원인인 것으로 나타났다. 이들 모두 혈중 칼슘 농도의 전신성 증가로 귀결된다. 이 인자는 미국 특허 제 5,116,952호에서 HHM과 관련하여 설명되었다. 이 특허는 또한 부분적으로 서열이 밝혀진 단백질의 펩티드 단위체를 이용해 항-PTH-rp 항체를 제조하는 것을 설명한다. 이 단백질은 또한 미국 특허 제 5,312,810호에서는 아데닐레이트 사이클레이즈 자극 인자(ACSF)로 그리고 미국 특허 제 5,114,843호에서는 체액성 칼슘 과잉혈 인자(hHCF)로 불렸다. HHM과 PTH-rp의 연관성은 또한J Clin Invest(1988) 81:932-938에서 Yates, A.J.P. et al.에 의해 설명된다. 1992년 8월 18일에 공개된 일본 출원 제 A4-228089호는 쥐/인체 키메라를 포함하는, 항-PTH-rp 항체의 재조합 생산을 설명한다. 이 출원은 또한 PTH-rp에 대해 형성된 쥐의 또는 키메라 단클론성 항체가, PTH-rp를 복막으로 쥐에 전신성으로 주입하거나 또는 PTH-rp-생성 전립선 종양 세포계를 누드 생쥐에 이식함으로써 HHM이 야기되는 모델 시스템에서 HHM의 효과를 완화시키는 것을 보여주는 동물 실험을 개시한다.

PTH-rp는 인체 폐암, 유방암 및 신장 세포암으로부터 정제되었다. PTH-rp는 처음에는 종양 세포와 관련되어 발견되었는데도 불구하고, 정상 조직에도 널리 존재한다. PTH-rp 암호화 유전자는 Suva, L.J. et al.에 의해 클로닝되어 발현되었으며Science(1987)237: 893-895에 개시된다. PTH-rp는 PTH 수용체에 결합하는 것으로 알려졌으며(Abou-Samra, A. et al.Proc Natl Acad SciUSA (1992) 89:2732-2736) PTH와 유사한 활성을 가진다(Horiuchi, N. et al. Science (1987) 23: 1566-1568). PTH-rp는 신장과 뼈 조직에서 아데닐레이트 사이클레이즈를 자극하며, 세관의 칼슘 재흡수를 증가시키고, 신장의 인산 흡수를 감소시키며 1α-하이드록실라아제를 자극하는 것으로 나타났다. 따라서, PTH-rp가 순환하는 곳에서, PTH-rp의 PTH-유사 작용의 저해제가, 신장 세관에서 소변으로부터 혈액으로의 칼슘 재흡수와 전신성 뼈 재흡수를 포함하여, 이들 생물학적 현상을 방해하는 것은 논리적이다. 하지만, PTH/PTH-rp 수용체는 파골세포에서는 발견되지 않는다. 그러한 수용체는 특성 규명이 잘 되지 않았으며 또는 PTH-rp가 파골세포에 영향을 주는 것으로 발견되고, 그 효과는 일부 미지의 기작, 예를 들어 골아세포(PTH/PTH-rp수용체를 가지는 것으로 알려짐)로부터의 미지의 매개자의 분비에 영향을 주는 것에 의해 효과를 나타낼 수도 있다는 정도였다. PTH-rp를 파골세포에 의해 매개되는 뼈 재흡수에 관련시킬 증거가 없다.

PTH-rp는 또한 Mallette, L.E.에 의한 논문Endocrine Rev(1991)12:110-117에서 요약되어 있는 바와 같은 태반의 칼슘 수송의 조절을 포함하여, PTH에 의해 공유되지 않는 특성들을 가진다. 특히 본 발명과 관련하여 PTH-rp는 또한 유방암에서 뼈 전이의 수립과 관련되어졌다(Powell, G.J.Cancer Res(1991)51:3059-3061; Southby, J. et al.Cancer Res(1990)50: 7710-7716). 상기 개시물에서 제공되는 자료는 단지 PTH-rp와 유방암의 뼈 전이와의 연관성을 보여줄 뿐, 어떠한 인과관계도 함축되어 있지 않다. PTH-rp는 제한된 수의 종양을 위한 가능한 오토크린 인자로 생각되어졌다(Burton, P.B.J.et al.Biochem Biophys Res Com(1990)167:1134-1138; Li, X. et al.Cancer Res(1993)53:2980-2986).

따라서, 일차성 암의 효과를 매개하는 데 있어서 PTH-rp의 정확한 역할은 잘 이해되어 있지 않다. 이러한 상태의 진전에 또한 참여하는 부가적인 인자가 있을뿐만 아니라, PTH-rp의 생산은 프로락틴, 글루코코르티코이드, 표피 성장 인자, TGF-α, TGF-β, 에스트로겐, 긴장, 그리고 세포외 칼슘 농도같은 부가적인 인자에 의해 영향을 받는 것으로 생각된다. 부가적인 인자의 존재는 특히 중요하며 기작의 불확실성을 더한다. IL-1, IL-6, IL-11, M-CSF 및 GM-CSF같은 인자가 특히 뼈 재흡수에서 중요한 것으로 생각되었다. Sasaki, A. et al.에 의한J Bone Min Res(1994)9 Supp l:S 294, B 257 보고서에서, 누드 생쥐의 두개관으로의 재조합 인체 IL-1α의 투여가 좌심실에 접종된 암세포의 전이를 이끌며, 반면 IL-1α를 받지 않은 동일한 동물의 다른 뼈는 암 전이를 나타내지 않음이 입증된다. 같은 책 S 337, B 433에서 Gilles, J. et al.은 IL-6가 파골세포의 뼈 재흡수에 대한 뼈 재흡수 인자의 효과를 강화하며, 뼈에서의 IL-6 생산이 사이토카인-매개 뼈 재흡수와 사이토카인-매개 뼈 재흡수가 잠재적으로 관련되는, 에스트로겐-관련 뼈 손실, 골수종 및 파제트(Paget's) 질병같은 질병 상태에서 중요하다는 것을 제안한다. IL-6 유전자 넉아웃(knockout)을 포함하도록 변형된 형질 전환 생쥐가 골다공증을 위한 모델에서 감소된 뼈 손실을 나타냄이 또한 보여졌다. 파골 세포가 IL-6와 IL-11을 위한 수용체를 가짐이 확인되었다. M-CSF와 GM-CSF로 처리된 파골 세포는 배양시 빠른 성숙을 보여준다. M-CSF 유전자에 유전적 결함을 가진 형질전환 생쥐는 또한 골다공증을 모방하는 상태를 나타내며 이 상태는 M-CSF의 주입에 의해 치료될 수 있다. 따라서, 여러 인자들이 국소적인 뼈 재흡수 및/또는 파골 세포 활성화에서 주요한 역할을 하는 것으로 나타난다.

Sato, K et al.은J Bone Min Res(1993)8:849-860에서, PTH-rp의 아미노산 위치 1-34를 나타내는 펩티드로 주사된 생쥐의 불멸의 비장 세포로부터 얻은 단클론성 쥐 항체를 병에 걸린 쥐에게 투여한, HHM의 쥐 실험에서 얻은 결과를 설명한다. 수동 면역은 인체 PTH-rp-생성 종양으로 이식된 칼슘과잉혈증 누드 생쥐에서 혈청 칼슘 농도 감소의 결과를 가져왔다. 이들 종양은 HHM을 위한 모델을 제공하기 위해 비골 조직에 이식되었다. 저자들은 만일 이 항체의 인체 상대물이 얻어질 수 있다면, 그것이 악성 종양 관련 칼슘과잉혈증이 PTH-rp에 기인하는 치료에 이용될 수 있음을 제안한다. (Sato, K. et al.은 이 논문에서 악성 종양-관련 칼슘과잉혈증이라는 개념을 이용하며 이는 HHM과 동의어이다.) 이 모델에서, PTH-rp의 증가된 농도는 항-PTH-rp 항체의 투여에 의해 명백히 완화되어 혈액에서 유지된다. 유사한 연구가 Kukreja, S.C.J Clin Invest(1988)82:1798-1802에 의해 수행되었으며 다클론성 항-PTH-rp 항체가 HHM의 인체 종양 모델에서 칼슘과잉혈증을 억제함을 보여주었다. 이것은 항-PTH-rp의 HHM에 대한 치료 효과의 첫 번째 개시이다. 이 모델의 관련성은 Tashjian, A.H. et al.J Exp Med(1964)119:467에서의 147 칼슘과잉혈증 유방암 환자의 15%가 뼈 전이를 보여주지 않았다는 발견에 의해 입증된다.

칼슘과잉혈증은 또한 파골 세포의 매개를 통한 뼈의 골용해에 의해 야기될 수도 있다. Mundy, G.R.은J Clin Invest(1988)82:1-6에서 유방암 전이 주위 부분에서의 증가된 파골 세포의 뼈 재흡수를 설명한다. 더욱이, 유방암 세포는 생체외에서 뼈를 직접적으로 재흡수하는 것으로 나타났다(Eilon, G. Mundy G.R.,Nature(1978)276:726-728).

Kohno, N. et al.Surgery Today,Japan J Surg(1993)4:215-220은 PTH-rp의 처음 34 아미노산으로 생쥐를 면역시켜 제조한 항-PTH-rp 항체를 이용하여, 외과적으로 제거된 유방암의 고정된 부분에서 수행된 연구를 보고했다. 항체는 종양의 57%에 결합했다; 그것은 골격 전이를 나타낸 환자의 종양의 83%에 결합했으나 폐 전이를 일으키거나 또는 전이를 전혀 일으키지 않은 환자의 종양에서는 38%에만 결합했다. 이들 저자들은 그들의 결과가 PTH-rp-양성 종양이 뼈에 대한 친화성을 가짐을 제안하는 것으로 결론내린다. 하지만, 그 결과는 단지 항-PTH-rp에 의한 암 조직의 염색에 관련되며 정량적이지는 않다. 따라서, 상기 결과는 PTH-rp의 존재와 뼈 전이의 가속화 또는 성장 촉진자 사이의 인과관계를 보여주지는 않는다. 동일하게 그럴듯한 설명은 PTH-rp가 전이, 암 성장 및/또는 골용해의 원인이라기 보다는 결과라는 것이다. 본 발명자들은 전이된 암 세포의 뼈에서의 국소 효과를 위한 효과적인 치료를 개발하기 위해 동물 모델을 이용했고 그래서 본 발명을 개발했다.

본 발명은 뼈로의 암전이와 뼈 종양의 성장의 방지와 치료에 관련되며 많은 원인의 종양의 가장 문제가 되는 양상의 일부인 연관된 골용해에 관련된다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 이들 상태를 완화시키기 위한 부갑상선 호르몬-관련 단백질(PTH-rp)에 대한 항체의 이용, 그리고 다른 형태의 항-PTH-rp 단독으로 또는 비스포스포네이트와 결합하여 이용하는 것에 관련된다.

도 1은 종양-보유 생쥐에서 PTH-rp에 대해 특이적인 단클론성 항체의 혈청 칼슘 농도에 대한 효과를 보여주는 그래프이다;

도 2는 기관 배양 모델에서 PTH-rp, PTH, IL-1 또는 1,25-디하이드록시 비타민 D₃에 의해 자극된 뼈 재흡수에서 칼슘 방출에 대한 PTH-rp의 특이적 단클론성 항체의 효과를 보여주는 그래프이다;

도 3은 종양-보유 생쥐에서 X-선 진단에 의해 뼈 병변과 연관된 것으로 나타나는 전체 지역에 대한 항-PTH-rp항체 투여의 효과를 보여주는 그래프이다;

도 4는 실시예 3에서 설명되는 실험 계획안의 결과를 보여주는 그래프이다;

도 5는 자극된 생쥐 골수에 대한 PTP-rp의 효과를 보여주는 그래프이다;

도 6은 면역글로불린의 일반적인 구조를 보여준다; 그리고

도 7은 대조 생쥐와 실시예 5의 동물에서 PTH-rp의 농도를 보여주는 그래프이다.

본 발명은 전이된 암세포의 뼈에서의 국소적인 효과의 치료를 제공하는 몇 가지 양상을 포함한다. 치료는 하나 또는 그 이상의 항체만을 가지거나 또는 하나 또는 그 이상의 비스포스포네이트와 결합된 하나 또는 그 이상의 항체를 가진 담체를 포함하는 약학적으로 허용 가능한 제제를 치료적으로 유효한 양을 투여함으로써 수행된다.

특이적인 국소 효과가 얻어질 수 있는 바, 즉, 뼈로의 암 전이가 방지될 수 있고, 뼈에 존재하는 암 세포의 성장이 저해될 수 있고, 골 용해 효과가 방지되고 치료될 수 있다. 더욱이, 뼈에서의 국소적인 현상과 관련된 전이, 성장, 및 골용해의 이차 효과가 완화될 수 있다.

담체는 바람직하게는 약학적으로 허용 가능한 주사가능한 담체이다. 항체는 PTHrp, TGFα, IL-1α, IL-1β, IL-6, 림프 독소, TNF, PGE, 및 1, 25 디하이드록시 비타민 D₃로 이루어지는 군으로부터 선택된 화합물과 면역반응하여 결합한다. PTHrp에 대한 항체가 바람직하며 바람직하게는 항-PTHrp만을 또는 하나 또는 그 이상의 비스포스포네이트와 결합된 항-PTH-rp를 포함하는 주사가능한 제제로 주사에 의해 투여된다.

PTHrp에 대한 항체는 바람직하게는 주사가능한 제제로 정맥 주사에 의해 투여된다. 제제는 비스포스포네이트와 따로 투여될 수 있다. 다르게는, PTHrp에 대한 항체는 비스포스포네이트와 함께 제제화되어 함께 투여될 수 있다. 유용한 비스포스포네이트는 에티드로네이트 파미드로네이트(etidronate pamidronate), 라이즈드로네이트(risedronate), 파이로포스페이트(pyrophosphate), 클로드로네이트(clodronate), 틸루드로네이트(tiludronate), 알렌드로네이트(alendronate), BM 21.0955, YM-175, CGP42446 그리고 약학적 허용염, 수화물 및 그들의 부분 수화물을 포함한다. 전술한 유형의 항체를 비스포스포네이트와 결합시킴으로써, 전이된 암 세포의 뼈에서의 국소적 효과의 치료 개념에서 비스포스포네이트와 비교하여 항체의 다른 작용 기작에 기인하는 상승 작용의 결과를 얻는 것이 가능하다.

파미드로네이트 디소듐같은 비스포스포네이트는 아미노-치환된 비스포스포네이트 화합물로 언급되며 상기 화합물은 수산화인회석 결정의 표면, 바람직하게는 뼈 대사회전이 높은 부분에서 칼슘을 빨리 화학적으로 흡착하여, 광물화된 기질의 용해도를 감소시켜 파골세포의 재흡수에 대해 더 내성을 가지도록 한다. 광물화된 기질에의 파골 세포 전구체의 부착은, 먼저 결합된 파미드로네이트가 재흡수의 초기 단계동안 기질 표면으로부터 높은 국소 농도로 방출될 때 손상된다. 따라서, 전구체의 성숙한, 기능을 갖춘 파골 세포로의 전환과 뼈 기질의 용해가 저해된다.

다른 양상에서, 본 발명은 암세포의 뼈로의 전이에 의한 골용해를 저해하는 방법 및/또는 뼈로의 암전이를 방지하는 방법 및/또는 전이된 또는 뼈-기원의 암세포의 뼈에서의 성장을 저해하는 방법을 목적으로 하며 그러한 치료를 필요로 하는 대상에게 특이적 항체(예로, 항-PTH-rp)만을 또는 치료적으로 유효한 효과를 가지기에 충분한 양의 비스포스포네이트와 결합한 항체를 일정량으로 투여하는 것을 포함한다.하며

전술한 일차 표적을 공격하는 데 있어서 본 발명의 방법의 또 다른 효과는 이차적인 증상의 개선이다. 이들은 통증, 대마비 또는 마비로 귀결될 수 있는 신경 압박, 칼슘과잉혈증, 병적 골절의 위험, 악액질 및 감소된 생존 예후를 포함한다.

여전히 다른 양상에서, 본 발명은 본 발명의 방법에 유용한 조성물을 목적으로 하며 본 발명의 치료 방법으로부터 도움을 얻는 대상을 구별하고 치료하는 방법과 본 발명의 방법에서 유용한 항체를 얻는 방법을 목적으로 한다.

상기에 기초하여 본 발명의 일차적인 목적은 암세포의 뼈로의 전이에 의해 나타나는 골용해의 국소적인 저해를 허락하는 국소 치료 방법에서 유용한 약학적 활성 제제를 제공하는 것으로 볼 수도 있다. 상기 방법은 PTHrp, TGFα, IL-1α, IL-1β, IL-6, 림프 독소, TNF, PGE, 및 1, 25 디하이드록시 비타민 D₃그리고 그들의 항원 단편으로 이루어지는 군으로부터 선택된 화합물과 면역 반응을 하는 항체, 항-PTH-rp만을 또는 비스포스포네이트와 함께 포함하는 주사가능한 제제의 치료적으로 유효한 양을 투여함으로써 수행된다.

본 발명의 또 다른 목적은 바람직하게는 약학적으로 허용가능한, 주사가능한 담체를 단백질 항체와 함께 또는 비스포스포네이트와 결합된 항체와 함께 포함하는, 뼈로의 암전이의 방지를 위한 주사가능한 제제의 형태인 제제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 뼈에 존재하는 암세포 성장의 저해를 위해, 약학적으로 허용되는 주사가능한 담체를 단백질 항체와만 또는 비스포스포네이트와 결합된 항체와 함께 포함하는, 바람직하게는 주사 가능한 제제 형태의 제제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 약학적으로 허용되는 주사가능한 담체를 단백질 항체와 함께 또는 비스포스포네이트와 결합된 단백질 항체와 함께 포함하는, 골용해의 방지를 위한 바람직하게는 주사가능한 제제 형태의 제제를 제공하는 것이다.

본 발명의 특징은 단백질 항체와 비스포스포네이트가 특히 통상적인 항암 화합물과 비교할 때 상대적으로 비-독성이라는 것이다.

본 발명의 장점은 전이에 의한 골용해를 저해하는 국소적인 효과가 예상치 않게 증가성이라는 것이다 즉, 단백질 항체의 효과가 비스포스포네이트의 효과에 부가적이어서 작용의 다른 기작에 기인하는 상승 효과를 제공하는 것이다.

본 발명의 이들 그리고 다른 목적, 장점 및 특징은 하기에서 본 명세서의 일부를 형성하는 수반되는 도면에 만들어지는 참고에서 더욱 자세하게 설명되므로 이들 제제와 치료 계획안의 상세한 설명을 읽으면 당업자에게 명백할 것이다.

암세포의 전이에 의한 골용해를 저해하는 본 발명의 방법과 그러한 방법에 이용되는 제제가 설명되기 전에, 본 발명은 전술한 특정 항체, 비스포스포네이트, 또는 제제와 변화시킬 수 있는 방법에 한정되지 않으며 다양할 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 또한 본 명세서에 이용된 개념은 단지 특정 구체예를 설명하기 위한 목적을 위한 것이며, 단지 청구항에 의해서만 제한될 본 발명의 범위를 제한하는 것을 목적으로 하지 않는다는 것이 이해되어져야 한다.

본 명세서와 청구항에서 이용된 것처럼, 단수형은 문맥에서 달리 명백하게 언급되지 않으면 복수 개념도 포함한다. 따라서, 예를 들어, 비스포스포네이트에 대한 언급은 비스포스포네이트의 혼합물과 특정 비스포스포네이트분자의 다수를 포함하며, 항체는 복수의 항체를 포함하며 방법에 대한 언급은 본 명세서를 읽으면 당업자에게 명백해지며 본 발명을 수행하는 데 있어 유용한 하나 또는 그 이상의 방법을 포함한다.

달리 정의되지 않으면 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 개념은 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본 명세서에 설명된 것과 유사하거나 또는 상당하는 임의의 방법과 재료가 본 발명의 실행 또는 시험에서 이용될 수 있는 데도 불구하고, 바람직한 방법과 재료가 여기서 설명된다. 본 명세서에서 언급되는 모든 출판물들은 그 출판물들이 관련하여 인용되는 재료를 개시하고 설명할 목적으로 참고로 본문에서 인용된다.

정의

본 명세서에서 사용된 바대로, 항-PTH-rp개념은 당업계에서 알려진 대로PTH-rp와 면역반응하는 항체와 항체-유사물, 대체물 및 단편을 언급한다. 항-PTH-rp가 또한 면역특이적인, 즉 PTH같은 관련 물질과 실제적으로 교차반응하지 않는 것이 바람직하다. 하지만, 항-PTH-rp는 PTH-rp 그 자체와 면역반응하는 한 본 발명의 방법에서 효과적이다. 본 발명의 방법과 조성물은 모두, PTHrp, TGFα, IL-1α, IL-1β, IL-6, 림프 독소, TNF, PGE, 및 1, 25 디하이드록시 비타민 D₃또는 그들의 항원 단편으로 이루어지는 군으로부터 선택된 화합물에 대해 면역반응하거나 면역특이적이며 그래서 특이적으로 그리고 선택적으로 상기 화합물에 결합하는 물질을 이용한다. PTH-rp와 면역반응하는 물질은 일반적으로 항-PTH-rp로 표시되며 TGFα와 면역반응하는 화합물은 일반적으로 항-TGFα로 나타내지는 것등이다. PTH-rp에 면역반응하고 면역특이적인 화합물이 바람직하다.

정제된 항체란 그 항체가 자연적으로 결합하고 있는 다른 단백질, 탄수화물, 및 지질이 충분히 제거된 것을 의미한다. 그러한 항체는 PTHrp, TGFα, IL-1α, IL-1β, IL-6, 림프 독소, TNF, PGE, 및 1, 25 디하이드록시 비타민 D₃(또는 그들의 항원 단편)로 이루어지는 군으로부터 선택된 화합물에 주로 결합하며, 즉, 항원적으로 무관한 다른 분자는 실제적으로 인식하지 못하고 결합하지 못한다. 본 발명의 정제된 항체는 PTHrp, TGFα, IL-1α, IL-1β, IL-6, 림프 독소, TNF, PGE, 및 1, 25 디하이드록시 비타민 D₃(또는 그들의 항원 단편)로 이루어지는 군으로부터 선택된 화합물과 주로 면역반응하고 면역특이적이다.

PTHrp, TGFα, IL-1α, IL-1β, IL-6, 림프 독소, TNF, PGE, 및 1, 25 디하이드록시 비타민 D₃로 이루어지는 군으로부터 선택된 화합물의 항원 단편이란 그러한 화합물 또는 그들의 단편으로 포유동물을 면역시켜 얻은 항체와 결합할 수 있는 상기 화합물의 일부를 의미한다. 바람직하게는, 분리된 항원 단편의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체는 또한 그 단편이 유래된 원래의 단백질내에서도 동일한 에피토프에 결합할 것이다.

항체란 항원에 결합할 수 있는 면역글로불린 단백질을 의미한다. 본 명세서에서 사용된 항체는 항원 또는 항원 단편에 결합할 수 있는 항체 단편(예를 들어, F(ab')₂, Fab', Fab)을 포함한다.

휴머나이즈드(humanized) 항체는 본 명세서에서 항체 단편(예를 들어, Fab, Fab', F(ab')₂, Fv)만으로 이루어진 항체뿐만 아니라 완전한 항체 분자(즉, 두 개의 완전한 L쇄와 두 개의 완전한 H쇄로 이루어진)를 설명하기 위해 이용되며, 상기 항체에서 CDRs는 인체가 아닌 공급원으로부터 유래되고 Ig분자 또는 그들의 단편의 나머지 부분은 인체 항체를 암호화하는 핵산 서열로부터 생산된 인체 항체로부터 유래된다.

인체 항체는 항체 분자의 모든 부분이 인체 항체를 암호화하는 핵산 서열로부터 유래되는 항체를 설명하기 위해 본 명세서에서 사용된다. 그러한 인체 항체는 인간 환자에서 면역 반응을 거의 일으키지 않으므로 항체 치료에서 이용하기에 바람직하다.

키메릭 항체는 휴머나이즈드 항체의 정의에서 전술한 것처럼 항체 단편뿐만 아니라 항체 분자를 설명하기 위해 본 명세서에서 이용된다. 키메릭 항체는 휴머나이즈드 항체를 포함한다. 키메릭 항체는 첫 번째 포유종에서 유래된 H쇄 또는 L쇄 아미노산 서열의 적어도 한 부분과 두 번째, 다른 포유종에서 유래된 H쇄 또는 L쇄 아미노산 서열의 다른 부분을 가진다. 바람직하게는, 가변부는 인체외의 포유종에서 유래되고 정상부는 인체종에서 유래된다. 구체적으로, 키메릭 항체는 가변부를 암호화하는 인체외 포유동물의 뉴클레오티드 서열과 항체의 정상부를 암호화하는 인체 뉴클레오티드 서열로부터 생성된다.

특이적으로 결합한다는 것은 항체의 특정 폴리펩티드에 대한 높은 결합성 및/또는 높은 친화성 결합을 의미한다. 이러한 특정 폴리펩티드상의 에피토프에의 항체 결합은, 임의의 다른 에피토프, 특히 그 특정 폴리펩티드와 결합된 분자에 또는 동일한 시료내의 분자에 존재할 수 있는 에피토프들에의 동일 항체의 결합보다 강하다. 특정 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체는 약하지만 검출할 수 있을 정도로 다른 폴리펩티드에 결합할 수도 있다(예를 들어, 특정 폴리펩티드에 대해 보여지는 결합의 10% 또는 그 미만). 그러한 약한 결합, 즉 백그라운드 결합은 적절한 컨트롤의 이용 등에 의해 상기 화합물 또는 관심의 폴리펩티드에의 특이적인 항체 결합으로부터 쉽게 구별할 수 있다.

검출가능하도록 표지된 항체, 검출가능하도록 표지된 항-PTHrp 또는 검출가능하도록 표지된 항-PTHrp 단편은 부착된 검출가능한 표지를 가진 항체(또는 결합 특이성을 보유한 항체 단편)를 의미한다. 검출가능한 표지는 일반적으로 화학적 결합에 의해 부착되지만, 표지가 폴리펩티드인 경우 유전공학적 기법에 의해 부착될 수도 있다. 검출가능하게 표지된 단백질의 생산을 위한 방법은 당업계에서 공지되어 있다. 검출가능한 표지는 당업계에서 공지된 다양한 표지로부터 선택될 수 있지만, 일반적으로 방사성동위원소, 형광단, 효소(예를 들어, 서양고추냉이 과산화효소), 또는 검출가능한 신호(예를 들어, 방사능, 형광, 발색)를 방출하거나 표지를 기질에 노출시킨후 검출가능한 신호를 방출하는 다른 일부분 또는 화합물이다. 다양한 검출가능한 표지/기질 쌍(예를 들어, 서양고추냉이 과산화효소/디아미노벤지딘, 아비딘/스트렙트아비딘, 루시퍼라제/루시페린), 항체 표지를 위한 방법, 및 항원(PTHrp, TGFα, IL-1α, IL-1β, IL-6, 림프 독소, TNF, PGE, 및 1, 25 디하이드록시 비타민 D₃로 이루어지는 군으로부터 선택된 화합물같은)을 검출하기 위해 표지된 항체를 이용하는 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다(예를 들어, Harlow and Lane, eds. (Antibodies: A Laboratory Manual (1988) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)를 참고).

치료등은 본 명세서에서 원하는 약학적 및/또는 생리학적 효과를 얻기 위한 일반적인 수단에 대해 사용된다. 그 효과는 질병 또는 그들의 증상을 완전히 또는 부분적으로 막는 개념에서 예방적인 것일 수도 있고 또는 질병 및/또는 그 질병에 기인하는 부작용의 부분적 또는 완전한 치료의 개념에서 치료적일 수도 있다. 본 명세서에서 사용된 치료는 포유동물, 특히 인체의 질병의 임의의 치료를 포함하며, 하기를 포함한다:

(a) 질병의 소인이 주어졌을 수도 있으나 아직 그 질병을 가진 것으로 진단되지 않은 대상에서 질병이 발생하는 것을 막기;

(b) 질병을 저해하기, 즉, 병의 진전을 막기; 또는

(c) 질병을 경감시키기, 즉, 질병의 퇴화 야기. 본 발명은 암환자를 치료하는 것을 목적으로 하며 특히 암세포가 뼈로 국소적으로 전이하는 것을 치료하는 것, 즉, 하나 또는 그 이상의 특정 부위에서 암세포 전이를 방지하거나 저해하거나 또는 경감하는 것을 목적으로 한다. 증상을 치료하는 개념에서 본 발명은 신경 압박; 칼슘과잉혈증; 감소된 수명; 병적 골절; 그리고 악액질을 치료하는 것을 목적으로 한다. 상기 치료는 특히 인상 세포 암세포, 선암 세포, 흑색종 세포, 골육종 세포, 신경 모세포종 세포, 또는 혈액 암세포로 이루어지는 군으로부터 선택된 암세포의 전이를 치료하는 것을 목적으로 한다. 더욱 구체적으로, 치료는 골용해와 그들의 증후성 후유증뿐만 아니라 뼈로의 암 전이와 뼈에서의 암세포 성장으로 고통받는 환자에게 치료학적으로 검출가능하고 이로운 효과를 제공하는 수단을 목적으로 한다.

더욱 구체적으로 치료는 PTHrp, TGFα, IL-1α, IL-1β, IL-6, 림프 독소, TNF, PGE, 및 1, 25 디하이드록시 비타민 D₃또는 그들의 항원 단편으로 이루어지는 군으로부터 선택된 화합물의 뼈-국소적 생산; 그리고 특히 파라티로이드 호르몬-관련 단백질(PTHrp)의 뼈-국소적 생산에 의해 매개되는 골용해를 방지, 경감, 및/또는 저해하는 것(1)을 의미한다. 구체적 치료는 PTHrp의 뼈-국소적 생산에 의해 매개되는 비정상적인 골용해를 방지하거나 저해하는 것을 목적으로 한다. 치료는 암세포의 뼈로의 전이에 의해 야기되거나 및/또는 전이와 관련된 뼈 재흡수를 방지하거나 저해하는 것을 포함한다.

상승적인, 상승 효과등은 본 명세서에서 하나 또는 그 이상의 항체를 하나 또는 그 이상의 비스포스포네이트와 결합하여 얻어지는 향상된 치료 효과를 설명하기 위해 이용된다. 일부 분야에서는 상승 효과는 단순한 합산 이상의 효과(예를 들어, 1+1=3)를 의미하지만, 암치료 분야에서는 합산(1+1=2) 또는 합산보다 적은(1+1=1.6) 효과가 상승 효과일 수 있다. 예를 들어, 만일 두 약의 각각이 개별적으로 주어지면 암세포 성장을 50% 늦춘다면 두 약이 암 성장을 완전히 멈추기 위해 결합되는 것이 기대되지는 않을 것이다. 많은 경우, 허용될 수 없는 부작용 때문에 두 약은 함께 투여될 수 없다. 다른 경우 두 약은 함께 투여될 때 서로 중화하여 50% 미만으로 암 성장을 늦춘다. 따라서, 두 약이 허용될 수 없는 부작용의 증가, 예를 들어, 증가된 독성을 야기하지 않고 혼자일 때보다 더 많이 암 성장을 늦추면(바람직하게는 혼자일 때와 비교해서 50% 또는 그 이상 성장을 감소시키는 겅우) 상승 효과가 얻어지는 것으로 말해진다.

치료 지수는 LD₅₀/ED₅₀으로 정의되는 화합물의 치료 지수를 말한다. LD₅₀(치사량, 50%)은 시험된 동물의 50%를 죽이는 화합물의 투여량으로 정의되며, ED₅₀은 개체의 50%를 위한 화합물의 효과적인 투여량으로 정의된다. 1에 가까운 치료 지수(즉, LD₅₀/ED₅₀이 대략 1임)를 가지는 화합물은 독성 농도에 매우 가까운 투여량에서 원하는 효과를 이루며 그래서 좁은 치료 범위를 가진다, 즉 그들이 투여될 수 있는 좁은 투여 범위를 가진다.

항체 생산

PTHrp, TGFα, IL-1α, IL-1β, IL-6, 림프 독소, TNF, PGE, 및 1, 25 디하이드록시 비타민 D₃또는 그들의 항원 단편으로 이루어지는 군으로부터 선택된 화합물에 특이적으로 결합하는 다클론성 항체 및/또는 단클론성 항체는 당업계에서 잘 공지되고 일상적인 방법에 의해 생성될 수 있다(예를 들어, Harlow and Lane, 1988,Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Schrier et al., 1980,Hybridoma Techniques, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY를 참고). 더욱 구체적으로, 본 발명에서 사용하기 위한 항체를 생산하기 위해 수퍼로즈(Superose)-12 젤 여과에 의해 PTHrp를 분리하고 분리된 화합물을 프로인트 완전 보조제와 결합하고 뉴질랜드 알비노 토끼에 주사할 수 있다. 21일 간격으로, 동물에게 단백질과 프로인트 불완전 보조제의 보조 주사를 제공한다. 세 번째 보조제 공급후, 혈청 시료를 얻고 통상적인 도트-블롯(dot-blot) 분석을 이용하여 항체를 검출한다. 니트로셀룰로스상에서의 연속적인 희석을 통해 항체 역가를 결정한다. 프로블롯(Problot)(Promega)시스템을 이용하여 항체 결합을 검출한다.

당업계에 공지된, 항체 유사물, 단편 및 대체물의 예는, L쇄와 H쇄 가변부를 암호화하는 유전자를 융합시켜 재조합에 의해 얻어진 F_V단편으로 표시되는 단쇄 형태뿐만 아니라 Fab, Fab', 및 F(ab')2 단편같은 단편들을 포함한다. 항체는 단클론성일 수도 있고 다클론성일 수도 있고 변형없이 항원의 투여에 반응하여 생성될 수 있으며, 또는 재조합 기술이 이용가능하므로, 이들 항체에 대한 변형 또한 가능하다. 예를 들어, 다른 종으로부터 유래된 아미노산 서열의 부분을 함유하는 키메릭 항체, 휴머나이즈드 및 인체 항체, 항원 특이성을 변화시키지 않고 다른 종의 항체와 유사하도록 변형된, 한 종에 의해 생성된 변형된 형태의 항체뿐만 아니라 프라이머타이즈드(primatized) 항체도 항-PTH-rp내에 포함된다. 본 발명의 항-PTH-rp의 특히 바람직한 구체예는, 인체 항체가 생성될 수 있도록 변형된 면역 시스템을 가진 형질 전환된 생쥐에게 PTH-rp를 투여하여 생성된 인체 항체를 포함한다.

항-PTH-rp는 다양한 방법으로 제조될 수 있다. 한 가지 방법은, PTH-rp 또는 그들의 단위체같은 적절한 면역원을 면역원에 대해 면역 반응할 수 있는 척추동물에 투여하는 것이다. PTH-rp의 특히 바람직한 단위체는 N-말단 부분, 특히 위치 1-34내의 단위체를 포함한다. 면역원으로 이용되는 PTH-rp 또는 단위체는 항체를 원하는 특정 종의 PTH-rp의 특징적인 에피토프를 포함해야 한다. 면역된 동물의 적절한 다클론성 항혈청이 이용될 수도 있다; 하지만, 재생가능하고 쉽게 제조될 수 있는 단클론성 제제를 얻는 것이 바람직하다. 그러한 단클론성 제제는 면역된 동물의 항체-생산 세포를 불멸시키고 적절한 면역반응성에 대해 스크리닝하여 얻을 수 있다. 면역 특이성은 또한, PTH같은 밀접하게 관련된 물질과 교차 반응하는 항체를 분비하는 림프잡종세포종을 스크리닝하여 확인할 수 있다.

그 결과 얻은 항체는 그 자체로 이용될 수도 있으며 또는 이들 항체의 단편이 Fab, Fab', 및 F(ab')₂단편을 제공하기 위해 표준적인 단백질 분해 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 한편, 항체를 암호화하는 유전자는 예를 들어, 림프잡종세포종으로부터 분리될 수 있고, 항체의 특성을 바꾸기 위해 조작될 수 있다. 분리된 유전자를 이용하여, F_V단위체는 하나의 펩티드 단위내로 공유적으로 연결된 L-쇄와 H-쇄 가변부를 함유하도록 만들어질 수 있다.

키메릭 항체

키메릭 항체는 첫 번째 포유동물종에 상응하는 아미노산 서열(가변부)을 가진 H 또는 L쇄의 한 부분과 다른 종에 상응하는 아미노산 쇄의 나머지 단편(정상부)을 가지는 항체이다. 일반적으로, 키메릭 항체는 첫 번째 포유 동물종(일반적으로 인간외)의 H쇄와 L쇄 둘다의 가변부와 다른 포유동물종(일반적으로 인간)의 서열에 상응하는 정상부를 포함한다.

가변부(임의의 원하는 항원에 특이적으로 결합하는)는 접종된 토끼같은 값싼 공급원으로부터 편리하게 얻을 수 있고 쉽게 이용가능한 림프잡종세포종을 이용해 재생될 수 있기 때문에 키메릭 항체를 생산하는 것이 바람직하다. 그러한 가변부는 인체 세포계로부터 유래된 정상부와 결합될 수 있다. 그 결과 얻어지는 키메릭 항체는 인체 공급원으로부터의 정상부를 유지하면서, 임의의 원하는 공급원을 이용하여 임의의 원하는 특이성을 가지고 쉽고 값싸게 제조될 수 있는 가변부를 가지는 장점을 가지며 만일 상기 항체가 인체에 투여되면 이들은 인체로부터 면역 반응을 일으킬 가능성이 적다.

도 6은 면역글로불린의 일반적인 구조의 대표이다. 구조적 단위는 대략 23,000 분자량의 두 개의 동일한 L 폴리펩티드쇄와 53,000-70,000 범위의 분자량의 두 개의 동일한 H 쇄를 포함한다. 네 개의 쇄는 경쇄가 Y모양의 입구에서 시작하여 분기점을 통과하여 계속되는 중쇄를 받치는 Y모양으로 디설파이드 결합에 의해 연결된다. 가지 부분은 Fab 지역으로 표시된다. 중쇄는 몇몇 세부류를 가지는 감마, 뮤, 알파, 델타, 또는 입실론으로 분류된다. 중쇄의 특성이 항체의 부류를 IgG, IgM, IgA, IgB, 또는 IgE로 결정한다. 면역글로불린의 경쇄는 카파 또는 람다로 분류된다. 각 중쇄는 카파 또는 람다 경쇄를 가지도록 제조될 수 있다. 경쇄와 중쇄는 서로 공유적으로 결합되며, 두 중쇄의 테일(tail)부분은 면역글로불린이 림프잡종세포종 또는 B 세포에 의해 생성될 때 서로 공유적인 디설파이드 결합에 위해 연결된다. 도 6에 대해 얘기할때, 키메릭 항체는 가변으로 표시된 백색 부분이 첫 번째 동물 공급원으로부터 유래되고 정상부로 표시된 회색 부분은 바람직하게는 인간인 두 번째, 다른 동물 공급원으로부터 유래된 항체이다.

본 발명의 키메릭 항체는 전술되고 도 6에서 보여지는 것처럼 항체의 일반적인 구조 그리고 전술한 대로의 키메릭 항체의 일반적인 구조와 특징에 대한 언급에 의해 이해될 수 있다. 키메릭 항체는 많은 다른 경로에 의해 만들어질 수 있다. 처음에, 키메릭 항체는 화학적 합성 방법에 의해 생산되었다. 키메릭 항체를 화학적으로 합성하는 방법은 Bobrzecka, et al.(Bobrzecka, K., Konieczny, L., Laidler, P., and Rybarska, J., 1980. Immunology Letters.2:151-155), 그리고 Konieczny, et al. (Konieczny, L., Bobrzecka, K., Laidler, P., 그리고 Rybarska, J., 1981. Haematologia.14:95-99), (총체적으로, Rybarska papers)내에 개시된다. 이들 논문들은 가변부가 토끼같은 동물내에서 편리하고 값싸게 생산되고 인체 공급원으로부터 추출된 정상부에 결합될 수 있다는 점에서 바람직한, 키메릭 항체를 만드는 일반적인 개념을 개시한다. 그 결과 얻는 키메릭은 인체에 투여될 때 면역 반응을 잘 일으키지 않는다.

키메릭 항체에 적용할 수 있는, 키메릭 단백질을 만드는 기본적인 기술은1987년에 알려졌다(1987년 11월 3일에 Itakura 등에게 특허된 미국 특허 제4,704,362호를 참고). 키메릭 항체를 생산하기 위해 Itakura 등의 기술을 적용하는 구체적인 예가 1989년 3월 28일에 Cabilly 등에게 특허된 미국 특허 제 4,816,567호내에 개시된다.

많은 동물 공급원뿐만 아니라 인체로부터의 항체의 가변부와 정상부 둘다를 포함하는 DNA서열들이 공개되었다. 특정 항체를 암호화하는 유전 물질을 분리하는 것은 이제 상대적으로 일반적이다. 이 기술을 이용해서 PTH-rp에 대해 면역반응하고 면역특이적인 토끼 생성 항체의 가변부를 암호화하는 유전 물질을 분리할 수 있다. 그 DNA 서열은 인체 항체의 정상부를 암호화하는 DNA 서열에 라이게이트(ligate)될 수 있다. 그 구조체는 적절한 벡터내로 삽입되고 이어서 그 벡터는 적절한 숙주 세포내로 삽입된다. 숙주 세포는 인체일 수 있고 배양되거나 개체내로 직접 삽입될 수도 있다. 어느 경우든 형질 도입된 세포는 PTH-rp에 결합하는 키메릭 항체를 생산할 것이다. 동일한 방법으로 다른 키메릭 항체가 생성될 수 있으며 상기 항체에서 가변부는 PTHrp, TGFα, IL-1α, IL-1β, IL-6, 림프 독소, TNF, PGE, 및 1, 25 디하이드록시 비타민 D₃및 그들의 항원 단편중의 하나에 결합한다. 그 결과 얻어지는 키메릭 항체가 인체에 투여될 때 항체는 면역 반응을 일으키지 않을 것이며 골용해과 그들의 증상성 후유증뿐만 아니라 뼈로의 암전이와 암세포 성장의 치료에 유용할 것이다.

휴머나이즈드 항체

비-인체 항체와 인체/비-인체 키메릭 항체 둘다 인체에 투여될 때 면역 반응을 야기한다(즉, 항원성이다). 휴머나이즈드 항체는 인체에 투여되는 항체의 항원성을 피하고, 비-인체 항체의 항원 특이성을 보유하도록 개발되어졌다.

휴머나이즈드 항체는 하기로 구성되는, 유전공학적으로 제조된 면역글루불린(Ig)분자이다: 1)원하는 항원 특이성을 항체에 부여하는, 비-인체 항체(예를 들어, 생쥐, 쥐, 또는 토끼)의 상보성-결정 부분(CDRs)의 전부 또는 일부, 2)인체 항체 가변부에서 유래된 뼈대 부분(FRs), 3)인체 항체로부터 유래된 정상부. 따라서, 단지 CDRs만이 비-인체 공급원에서 유래되며; 항체의 모든 다른 부분은 인체 항체로부터 유래된다. 그러한 휴머나이즈드 항체 기술은 원하는 항원 특이성의 항체를 얻기 위해 동물을 이용하는 것을 허락하며, 비-인체 항체의 항원성없이 비-인체 항체의 항원 특이성을 가지는 항체를 생산하는 유전공학적 기술을 사용한다. 본 명세서에서 사용된 것처럼, 휴머나이즈드 항체는 항체 단편(예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, 그리고 Fv)뿐만 아니라 완전한 항체 분자(즉, 2개의 완전한 L쇄와 2개의 완전한 H쇄로 구성됨)를 포함하며, 상기에서 CDRs는 비인체 공급원으로부터 유래되고 Ig분자 또는 그들의 단편의 나머지 부분은 인체 항체로부터 유래된다.

휴머나이즈드 항체는 당업자에게 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다(Jones et al., 1986 Nature321:522; Riechmann et al., 1988 Nature332:323; Verhoyen et al., 1988 Science239:1534; Presta et al., 1992 Curr Opin Struc Biol2:593; 미국 특허 제 5,225,539호; 그리고 PCT 출원 공개 번호 WO 91/09968). 휴머나이즈드 항체의 CDRs가 궁극적으로 항원에 접촉하고 항원 특이성을 결정하는 반면, CDRs의 결합 활성은 CDRs를 둘러싸고 있는 골격 잔기(FRs)에 의해 조절된다. CDRs에 의한 표적 항원 결합을 바꾸기 위해 FRs를 변형하는 다양한 기술적 접근은 예를 들어, Jolliffe et al., 1993 Intern Rev. Immunol10:241; Junghans et al., 1990 Cancer Res50:1495; Riechmann et al., 1988 Nature332:323; Sim et al., 1993 J Immunol151:2296; Chothia et al., 1987 J Mol Biol196:901; Carter et al., 1992 Proc Natl Acad Sci USA89:4285; and Presta et al., 1993 J Immunol151: 2623에 설명된다. 원하는 핵산 서열(원하는 비인체 및 인체 항체 부분같은 것)을 분리하고 조작하는 방법, 그리고 생체외에서 재조합 항체를 발현시키는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, Sambrook, et al., 1989,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Cabilly et al. 미국 특허 제 4,816,567호; and Morrison et al., 1984 Proc Natl Acad Sci USA81:6851을 참고).

인체 항체

본 명세서에서 사용된 바대로, 인체 항체는 항체 분자의 모든 부분이 인체 항체를 암호화하는 핵산 서열에서 유래된 항체를 의미한다. 그러한 인체 항체는 인간 환자에서 면역 반응을 거의 또는 전혀 일으키지 않으므로, 항체 치료에서 이용하기에 바람직하다.

인체 항체는 당업계에 공지된 다양한 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 인체 항체를 발현하는 인체 림프잡종세포종은 원하는 항원 특이성을 가진 항체를 발현하는 인체 B세포를 인체 골수종 또는 키메릭(즉, 인체/비인체) 잡종골수종과 융합시켜 제조될 수 있다. 인체 림프잡종세포종 세포계의 생산을 위한 방법은 당업계에서 잘 공지되어 있다(예를 들어, Kozbor et al., 1984 J Immunol147:86; Bordeur et al., 1987, In:Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, NY, p. 51-63).

인체 항체 생산을 위한 바람직한 방법은 인체 Ig 유전자를 발현하는 형질전환 동물을 이용한다. 생쥐가 일반적으로 숙주 동물로 선택된다. 그러한 인체 항체-생산 형질전환 동물은, 먼저 숙주 동물의 내인성 Ig 유전자를 불활성화시키고 이어서 숙주 동물의 배선 DNA내로 원하는 인체 Ig 유전자(예를 들어, 결합되어 원하는 특이성의 인체 항체를 제공하는 항체 H쇄와 항체 L쇄를 암호화하는 인체 유전자)를 삽입하는 기술의 결합을 이용하여 생산될 수 있다. 동물에서 면역 반응을 야기하기 위해 이어서 형질전환 동물을 트랜스유전자(transgene)에 의해 암호화되는 인체 항체가 특이적으로 결합하는 항원으로 면역시켜, 원하는 인체 항체를 발현하는 B세포의 발달과 성숙을 촉진한다. 이어서 림프잡종세포종 세포계를 당업계에 잘 알려진 방법을 이용하여 형질전환 숙주 동물로부터 제조한다(예를 들어, Kohler et al., 1975, Nature,256:495; Green et al., 1994, Nature Genetics7:13; Kucherlapati et al., PCT 국제 공개 번호 WO 94/02602; Nishi, June 1995 Nikkei Sciencevol?:40; and Cappechi, May 1994, Nikkei Sciencevol?:52).

인체 항체 및/또는 그들의 단편을 생산하는 다른 방법은 파아지 디스플레이 기술을 이용하며, 그들은 예를 들어, McCafferty et al., 1990 Nature348:552; Johnson et al., 1993 Curr Opin Struc Biol3: 564; Clackson et al., 1991 Nature352: 624; Marks et al., 1991 J Mol Biol222: 581; Griffith et al., 1993 EMBO J12:725; Marks et al., 1992 Bio-Technol10:779; Waterhouse et al., 1993 Nucl Acid Res21:2265; 그리고 PCT 공개 번호 WO 93/06213에 설명된다.

비스포스포네이트

본 발명과 관련되어 이용되는 비스포스포네이트 화합물은 하기의 일반적인 구조식을 가지며

상기 식에서, X는 포스포네이트기의 연결을 허락하는 연결기이다. 유용한 비스포스포네이트는 약학적 허용염, 그리고 디하이드레이트와 헤미하이드레이트같은 그들의 다 수화물과 부분 수화물 등을 포함한다.

바람직한 비스포스포네이트는 X가 -O-, 그리고로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것으로 상기 식에서 R¹, R²는 H, OH, Cl, NH₂, S, 티오페닐로 이루어지는 군으로부터 각각 독립적으로 선택되며, 티오페닐에서 페닐 고리는 Cl, OH, NH₂, 1 내지 12 탄소 원자를 가지는 알킬, 1 내지 12 탄소 원자를 가지는 치환된 알킬로 이루어지는 군으로부터 선택된 치환기로 치환될 수 있으며, 상기 치환기는 O, S, NH₂, N, 그리고 1 내지 12 탄소 원자를 가진 N-알킬, 1 내지 12 탄소 원자를 가진 고리 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되며, 상기에서 탄소원자는 Cl, OH, NH₂, 그리고 1 내지 12 탄소원자를 포함하는 이종환식 화합물로 이루어지는 군으로부터의 치환기로 선택적으로 치환되며, 상기 이종환식 화합물의 탄소 원자는 Cl, OH, NH₂,로 이루어지는 군으로부터 선택되는 치환기로 선택적으로 치환되며, 상기에서 헤테로 원자 O, N, S로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

일부 더욱 바람직한 비스포스포네이트는 -O-와 하기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것들을 포함한다.

,,,,

,,

하나의 특히 바람직한 비스포스포네이트는

로서 상기 비스포스포네이트는, PTHrp, TGFα, IL-1α, IL-1β, IL-6, 림프 독소, TNF, PGE, 및 1, 25 디하이드록시 비타민 D₃및 그들의 항원 단편으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 화합물에 대해 면역반응하고 면역특이적인 항체의 치료학적으로 유효한 양과 약학적 허용 부형제와 함께 주사가능한 약학 제제에 포함된다. 유용한 비스포스포네이트는 에티드로네이트 파미드로네이트, 라이즈드로네이트, 피로포스페이트, 클로드로네이트, 티루드로네이트, 아렌드로네이트, BM 21.0955, YM-175, CGP42446, 그리고 그들의 약학적 허용염, 수화물 및 그들의 부분 수화물을 포함한다.

제제-일반

적절한 항체 또는 항-PTH-rp의 다른 형태는 그러한 물질의 투여를 위한 일반적인 방식으로 투여를 위해 제제화된다. 일반적인 제제는Remington's Pharmaceutical Sciences, latest edition, Mack Publishing Company, Easton, PA에서 제공되는 것들이다. 바람직하게는, 항-PTH-rp는 근육내, 정맥, 피하 또는 복막주사를 포함하는 주사, 가장 바람직하게는 정맥 주사와 국소 주사에 의해 투여된다. 하지만, 항-PTH-rp가 조직 순환계에 들어가도록 하는 수단이 이용가능하다면, 점막투과(transmucosal)제제 또는 경피 제제같은 다른 투여형태가 이용될 수 있으며 이러한 제제는 좌약, 스킨 패취로, 또는 비강내로 적용될 수 있다. 부가적으로, 뼈 전이 부위 또는 골절 부위로의 뇌척수 주사 또는 국소 주사에 의한 국소 투여도 또한 이용될 수 있다. 항-PTH-rp의 혈류에의 전이 또는 뼈로의 국부적인 전이에 영향을 주는 임의의 적절한 제제가 적절히 이용될 수 있다.

투여를 위해, 적절한 제제는 일반적으로 생리 식염수, 행크(Hank's)용액, 또는 안정제 또는 다른 소량 성분을 선택적으로 포함하는 다른 완충액을 이용하는 수용액 또는 현탁액을 포함한다. 리포좀 제제와 다른 형태의 마이크로에멀젼이 또한 이용될 수 있다. 항-PTH-rp는 또한 동결건조된 형태로 공급되어 투여를 위해 재구성될 수 있다. 점막 투과(transmucosal)제제 및 경피 제제는 일반적으로 담즙염, 푸시드산과 그 유사물, 다양한 세정제등과 같은 점막 또는 진피 장벽의 통과를 촉진하는 제제를 포함한다. 만일 항-PTH-rp가 소화관에서 생존할 수 있도록 적절한 장내 피막이 제제화될 수 있으면 경구 투여 역시 가능할 것이다.

상기 제제의 특성은 어느 정도는 선택된 항-PTH-rp의 특성에 의존할 것이며 적절한 제제는 당업계에서 공지된 기술과 공지된 제제 원리를 이용해 제조된다. 특정 약학 조성물내에 함유된 항-PTH-rp의 비율은 또한 그 제제의 특성에 의존할 것이다; 항-PTH-rp의 비율은 일반적으로 약 1 중량 % 내지 약 85 중량 % 범위에 걸쳐 다양할 것이다.

투여량

적절한 투여 농도는 또한 치료 대상의 특성, 치료되어야 할 상태의 특정한 특성과 심각성, 활성 요소로 사용되는 항체의 특성, 투여 양상, 제제, 및 의사의 판단을 포함하는 많은 인자에 따라 달라질 것이다. 항체가 항-PTHrp같은 항체 그 자체로 주사가능한 제제로 투여될 때는 그 투여량은 한 번 투여시 50㎍/㎏-50㎎/㎏범위, 바람직하게는 1㎎/㎏-10㎎/㎏의 범위가 될 것이다. 전술한 변수를 고려하여 결정되는 계획에 따라 반복되는 투여가 요구될 수도 있다. 일반적으로, 3-10일에 걸친 매일 투여가 요구될 수도 있으며 또는 정맥 투여가 연속적일 수도 있다. 만성 상태를 위해서는, 투여가 필요한 만큼 장기간동안 계속될 수도 있다.

본 명세서에서 설명된 바대로, 항체(예로, 항-PTH-rp) 투여에 의해 이익을 보는 대상은 암세포의 뼈로의 전이 또는 뼈에서의 암세포의 성장 또는 골용해를 나타내는 환자다. 칼슘과잉혈증이 체액성 시스템에 의해 매개되는 환자들과는 달리, 이들 환자들은 혈액에서 순환하는 PTH-rp의 농도 증가를 가질 수도 있고 가지지 않을 수도 있다. 1992년 8월 18일에 공개된 일본 특허 출원 제 H4-228089호에서 설명된 것처럼, 악성 종양과 관련된 칼슘과잉혈증은 종양 세포의 뼈로의 침입에 의한 가속화된 뼈 재흡수에 의해 (국소 골용해 칼슘과잉혈증(LOH)) 또는 PTH-rp의 조직성 효과에 의해(악성 종양의 체액성 칼슘과잉혈증(HHM)) 야기될 수 있다. 상기 개시물에 따르면, LOH에 의해 야기되는 칼슘과잉혈증의 주된 실시예는 다발성 골수종, 유방암 등의 뼈 전이로부터 생기는 것들이며 HHM으로부터 생기는 칼슘과잉혈증의 예는 인상세포 종양과 신장/비뇨기과 종양과 관련된 상태이다. 하지만, 일본 특허 출원 제 H4-228089호는 PTH-rp의 국소 골용해 칼슘과잉혈증에 대한 관련성을 개시하지는 않는다.

비스포스포네이트 화합물은 일반적으로 보통 몸집의 성인에게 이주마다 약 30-60㎎ 범위의 양으로 투여된다. 한편, 비스포스포네이트는 한 달에 한 번씩 약 60-90㎎의 양으로 투여될 수 있으며 이때 비스포스포네이트는 1-24시간에 걸쳐 투여된다. 본 발명과 관련하여 비스포스포네이트는 항-PTH-rp같은 항체와 결합되어 매일 소량씩 투여될 것이다. 예를 들어, 본 명세서에서 설명된 유형의 비스포스포네이트는 대략 70㎏의 성인 남성에게 매일 약 5-25㎎의 양으로 투여될 수 있다. 투여되는 양은 치료되는 각 개인의 몸집, 나이, 또는 상태에 따라 감소되거나 증가될 수 있다. 임의의 약에서처럼, 상대적으로 적은 양의 활성 성분으로 치료를 시작하여 환자의 치료에서 약의 효과를 결정하면서 필요한 시간에 걸쳐 투여량을 점차 증가시키는 것이 바람직하다.

제제-특이적

본 발명의 제제는 항체의 제제를 비스포스포네이트의 제제와 결합하여 제조될 수 있다. 상기 두 제제는 분리된 용기에 유지되면서 동시에 투여될 수 있다. 하지만, 항체와 비스포스포네이트 화합물을 하나의 제제내에 함께 결합시키고 치료의 목적으로 환자에게 상기 제제를 투여하는 것이 가능하다. 본 발명과 관련하여 이용될 수 있는 제제의 예는 하기를 포함한다:

제제 1번

비스포스포네이트 5-25 ㎎

항체 70-700 ㎎

부형제 5-25 ㎖

제제 2번

비스포스포네이트 5-25 ㎎

항-PTHrp 70-700 ㎎

부형제 5-25 ㎖

제제 3번

비스포스포네이트 5 ㎎

항-TGFα 70 ㎎

부형제 5 ㎖

제제 4번

비스포스포네이트 25 ㎎

항-IL-1α 700 ㎎

부형제 25 ㎖

제제 5번

비스포스포네이트 5 ㎎

항-IL-1β 700 ㎎

부형제 5 ㎖

제제 6번

비스포스포네이트 25 ㎎

항-IL-6 700 ㎎

부형제 25 ㎖

제제 7번

비스포스포네이트 25 ㎎

항-림프독소 700 ㎎

부형제 5-25 ㎖

제제 8번

비스포스포네이트 5 ㎎

항-TNF 70 ㎎

부형제 5-25 ㎖

제제 9번

비스포스포네이트 5 ㎎

항-PGE 70-700 ㎎

부형제 5-25 ㎖

제제 10번

비스포스포네이트 5 ㎎

항-1,25 디하이드록시 비타민 D₃70-700 ㎎

부형제 5-25 ㎖

제제 11번

피로포스페이트 5-25 ㎎

항-PTHrp 70-700 ㎎

부형제 5-25 ㎖

제제 12번

에티드로네이트 5-25 ㎎

항-PTHrp 100 ㎎

부형제 10 ㎖

제제 13번

클로드로네이트 5 ㎎

항-PTHrp 200 ㎎

부형제 5 ㎖

제제 14번

파미드로네이트 20 ㎎

항-PTHrp 500 ㎎

부형제 5 ㎖

제제 15번

틸루드로네이트 15 ㎎

항-PTHrp 600 ㎎

부형제 15 ㎖

제제 16번

알렌드로네이트 25 ㎎

항-PTHrp 700 ㎎

부형제 25 ㎖

제제 17번

라이즈드로네이트 15 ㎎

항-PTHrp 350 ㎎

부형제 15 ㎖

제제 18번

에티드로네이트 2.5 g

항-PTHrp 70 ㎎

부형제 25 ㎖

제제 19번

에티드로네이트 2.0 g

항-PTHrp 300 ㎎

부형제 25 ㎖

제제 20번

항체(키메릭) 70-700 ㎎

부형제 5-25 ㎖

제제 21번

항-PTHrp(키메릭) 70-700 ㎎

부형제 5-25 ㎖

제제 22번

항-TGFα(키메릭) 70 ㎎

부형제 5 ㎖

제제 23번

항-IL-1α(키메릭) 700 ㎎

부형제 25 ㎖

제제 24번

항-IL-1β(키메릭) 700 ㎎

부형제 5 ㎖

제제 25번

항-IL-6(키메릭) 700 ㎎

부형제 25 ㎖

제제 26번

항-림프독소(키메릭) 700 ㎎

부형제 5-25 ㎖

제제 27번

항-TNF(키메릭) 70 ㎎

부형제 5-25 ㎖

제제 28번

항-PGE(키메릭) 70-700 ㎎

부형제 5-25 ㎖

제제 29번

항-1,25 디하이드록시 비타민 D₃(키메릭) 70-700 ㎎

부형제 5-25 ㎖

본 발명의 제제에서, 비스포스포네이트 성분 각각은 유사한 방식으로 작용할 것이다. 더욱이, 항체 성분 각각은 작용의 유사성을 가질 것으로 기대된다. 따라서, 본 발명의 제제를 제공하기 위해, 임의의 주어진 비스포스포네이트 또는 비스포스포네이트군은 임의의 주어진 항체 또는 항체군과 결합될 수 있고 치료에서 상승적인 결과를 얻을 수 있다. 특히 바람직한 제제는 인체 항체, 휴머나이즈드 항체 및 키메릭 항체 그리고 부형제로 이루어지는 군으로부터 선택된 항체를 비스포스포네이트와 함께 또는 비스포스포네이트 없이 포함하는 주사가능한 제제이다.

암세포 전이 모델

본 발명의 발명자들은 골용해로 귀결되는 뼈로의 인체 유방 세포 암 전이 모델을 개발했다. Nakai, M. et al.Cancer Res(1992) 52:5395-5399; Sasakai, A. et al.J Bone Min Res(1993)8 (Supp 1): No. 92. 누드 생쥐의 좌심실에 삽입된 종양 세포는 x-선 검사에 의해 보여질 수 있고 조직학적으로 확인될 수 있는 골용해 병변을 야기하는 것으로 보여질 수 있다. (상기 모델은 정상 생쥐와 누드 생쥐에 적용될 수 있다). A375 흑색종 세포와 인체 유방암 세포주 MDA231이 이 모델에서 이용되었다. 이 모델을 이용하여, 뼈 전이가 라미닌에 대한 합성 길항제에 의해 방지될 수 있음이 증명되었다.

이 모델은 또한 Yoneda, T. et al.J Bone Min Res(1994)9 (Supp 1):S 293, B 225에 의한 요약서에서 설명된 바대로 인체 신경모세포종 세포의 생체내 전이 특성을 증명하기 위해 이용되었다. 신경모세포종 세포로 접종하고 6주후, x-선은 경골에서 골용해적이고 골아세포적인 병변을 보여주었으나, 칼슘과잉혈증 또는 악액질은 없었다. 따라서, 뼈의 암전이는 명백히 골아세포와 파골세포 둘다를 생성할 수 있는 복잡한 상황이며 칼슘과잉혈증 또는 악액질같은 조직성 질병과 항상 연관되지는 않는다. 조직학적 검사는 신경모세포종 세포가 골수 공동을 차지하며, 골내 뼈 표면에 많은 뼈 재흡수 파골세포(PTH/PTH-rp 수용체를 보여주는 것으로 입증되지 않음)가 있었다. 종양 세포의 배양 상등액은 태아 쥐 장골의 기관 배양에서 뼈 재흡수를 자극하고 골아세포의 골육종 세포의 증식을 증가시켜 뼈 형성을 증진시켰다. 배양 배지는 상당한 정도의 PTH-rp와 고농도의 IL-6를 함유했다. 파골세포는 IL-6 수용체를 가진다.

골용해 병변의 수는 이 모델에서 이용된 MDA231 세포의 PTH-rp 발현을 증진시킴으로써 증가되지만, 안티센스 PTH-rp 구조체로 형질도입된 MDA231 세포에 의해 감소되지는 않는다. 인체 프리프로(prepro) PTH-rp를 암호화하는 cDNA로 MDA231 세포를 형질도입함으로써 과다발현 클론을 얻었다; 안티센스 구조체로 세포계에 형질도입하여 이 펩티드의 감소된 생산을 가지는 클론을 얻었다. 증가된 PTH-rp발현(100 pM/24hours)을 보여주는 클론은, 단지 7.6±.22 병변을 생성하는 0.3 pM/24시간보다 적게 분비하는 안티센스 구조체와 비교하여 3주째에 뢴트겐 사진에 의해 16.3±3.8 병변을 생성했다. 1.6-8.4 pM/24 시간 PTH-rp 를 생산하는 변형되지 않은 MDA231 세포가 투여된 생쥐에서 병변의 수는 더 적은 PTH-rp를 생산하는 안티센스 구조체를 함유하도록 변형된 MDA231 세포가 투여된 생쥐의 병변의 수와 유사하다. 본 연구에서 사용된 생쥐에서는 PTH-rp의 혈장 농도가 검출되지 않았으며; 칼슘과잉혈증은 PTH-rp-증진된 MDA231 세포를 가진 생쥐에서만 최소로 존재했다. 본 발명자들은 또한 세포가 뼈 세포에 의해 생산된 세포외 기질에서 배양될 때 MDA231 세포에 의해 조절되는 혈청-제거 배지에서 PTH-rp농도가 두배로 증가됨을 보여주었다. 이러한 결과들은 Guise, T.A. et al.J Bone Min Res(1994)9 (Supp 1):S 128, No. 30에 의해 보고되었다.

전술한 모델을 이용하여 우리는 PTH-rp에 대해 특이적인 항체가 전이를 저해하고 뼈에 위치한 악성 종양 세포의 효과를 완화시키는 데 있어서 효과적임을 발견했다. 이것은 치료에 대한 효과적인 약학적 접근을 제공한다.

골용해 전이와 구별되는 칼슘과잉혈증

전술한 동물 모델은 악성 종양의 체액성 칼슘과잉혈증(HHM)과 전이/골용해(칼슘과잉혈증으로 귀결될 수도 그렇지 않을 수도 있음) 사이의 차이를 증명하는 데 있어서 효과적이며 상기 전이/골용해는 전술한 항-PTH-rp 치료의 표적이며 그러한 전이/골용해에 대한 PTH-rp의 관련성은 Nakai et al.(상기)에서 본 발명자들에 의해 설명된 쥐 모델 시스템에서 명백히 입증된다. 두 종양 세포계가 이 모델에서 이용되었다: 배양시 다량(251 ± 8 pM)의 PTH-rp를 생산하는, 폐의 인체 인상 세포 종양인 RWGT-2 그리고 생체외에서 소량(3.1 ± .3 pM)을 생산하는 전술한 인체 유방 선암인 MDA231이 그들이다. 배양된 종양 세포는 근육내(10⁷세포) 또는 심장내 주사(10⁵세포)에 의해 무흉선 누드 생쥐로 접종시켰다. 골격 방사선 사진과 뼈 조직 검사 결과를 얻으면서, 혈액에서 칼슘 이온의 농도와 혈장에서 PTH-rp의 농도를 측정했다.

어느 한 세포계로 근육내 주사된 생쥐는 전이없이 3주내에 국소 종양를 발생했다. RWGT-2 함유 생쥐는 증가된 PTH-rp(11.8±2.2pM)를 갖는 칼슘과잉혈증(2.44±.16mM 칼슘)을 일으켰다. MDA231 함유 생쥐는 정상적인 칼슘 농도(1.22±.03mM)를 유지했고 PTH-rp는 혈장에서 증가되지 않았다(0.69±.17 pM). 파골세포의 뼈 흡수는 RWGT-2-함유 생쥐에서 일어나고, MDA231-함유 생쥐에서는 일어나지 않았다.

한편, 둘중 하나의 세포계로 좌심실에 접종된 생쥐는 4주째에 골용해 병변을 일으켰다. MDA231-함유 생쥐는 RWGT-2(1.45±.19mM)함유 생쥐처럼 정상적인 칼슘 농도(1.22±.03 mM)를 유지했다. 혈장내의 PTH-rp농도는 MDA231-함유 생쥐(0.88±.15pM)에서는 증가되지 않고 RWGT-2-함유 생쥐에서 약간 증가되었다(2.75±2.68pM). 하지만, 종양은 두 그룹 모두에서 파골세포의 증가된 뼈 재흡수 부분에 이웃하여 존재했다.

상기 결과는 PTH-rp가 그것이 생산되는 곳에 따라 다른 증상을 야기함을 보여준다; 뼈로부터 멀리 떨어진 곳에 있는 종양에 의해 고농도로 생산될 때는(RWGT-2), 혈장 PTH-rp는 증가되고 전이에 의한 뼈 질병없이 칼슘과잉혈증이 일어난다. PTH-rp가 뼈에서 종양세포에 의해 국소적으로 생산될 때는(MDA231) 국소적 뼈 파괴가, 칼슘과잉혈증과 함께 또는 칼슘과잉혈증 없이, 순환하는 PTH-rp의 필수적인 증가없이 일어난다. 한편, 관찰된 골용해는 전이된 암으로부터의 신호에 대한 반응으로 다른 세포에 의해 방출되는 PTH-rp에 의해 부분적으로 야기될 수 있다; 더욱이, PTH-rp의 증가된 농도는 뼈 기질의 환경에 있을 때 전이된 암세포에 의해 생성될 수도 있다. 그럼에도 불구하고 본 발명의 방법에 의해 얘기되는 증상은 명백히 HHM과 다르다는 것은 명확하다.

본 발명의 방법에 반응하는 상태로 고통받는 대상은 쉽게 식별될 수 있다. 일부 경우, 질병 그 자체의 특성이 진단성이다. 골다공증, 골연화증, 신장 골형성이상증 및 파제트 질병같은 내인성 골용해 상태는 일상적으로 진단된다. 일반적으로 골용해의 존재는 x-선 정밀조사를 이용하여 뼈 병변의 존재를 확인하여 입증될 수 있다. 일반적으로, 뼈 기원의 암 또는 뼈로 전이된 암 또는 뼈로의 전이에 대한 예후를 가지는 암으로 진단된 환자가 적합한 환자다. 예후는 생검과 분류에 의해 확인될 수 있는 종양의 알려진 특성을 기초로 만들어질 수 있으며, 또는 생검된 종양을 뼈와 관련된 성분의 존재하에서 증가된 농도로 PTH-rp를 생산하는 능력에 대해 분석하여 독립적으로 결정될 수 있다. 전술한 바대로, 본 발명자들은 세포가 뼈 세포에 의해 생산되는 세포외 기질에서 배양될 때 전이 종양 MDA231이 증가된 농도의 PTH-rp를 생산함을 보여주었다.

따라서, 다양한 기준에 의해, 본 발명의 방법에 의해 치료될 수 있는 특정 증상을 나타내는 대상이 확인될 수 있다.

본 명세서에서 설명된 치료의 이점은 방대하다. 뼈 전이 그리고 관련된 뼈 병변을 감소시키는 데 있어서의 항-PTH-rp의 직접적인 효과에 더하여, 전이와 뼈 병변의 이차 효과가 또한 설명된다. 따라서, 전이와 골용해를 나타내는 대상은 이차적으로 뼈의 파괴에 기인하는 칼슘과잉혈증을 나타낼 수 있다; 골용해에서 기인하는 골절된 또는 약해진 뼈는 그들에 바로 이웃해 있는 신경 조직망을 압박하여 궁극적으로 마비 또는 대마비를 일으킬 수 있다; 병리학적 골절의 위험도 명백하다; 종종 악액질이 생길 수 있다; 그리고 뼈 파괴는 반드시 통증과 연결된다. 기술한 모든 것들이 직접 또는 간접적으로 생존 예후를 감소시킨다. 이들 부정적인 효과의 완화는 뼈 또는 다른 조직으로부터 생겨난 암에 의한 뼈로의 암 전이의 방지와 치료로부터 얻어지며; 뼈에서의 암 성장의 방지와 치료로부터 그리고 전술한 것들에 의해 야기되는 뼈 병변의 방지와 치료로부터 얻어진다. 본 발명의 방법의 핵심에 놓인 항-PTH-rp는 본 명세서에서 설명된 증상들에 대해 책임있는 것으로 제안되었던 여러 인자들에 불구하고 치료의 성공적인 초점을 나타낸다.

치료의 방법-특정 투여량

본 발명과 일치하는 치료 방법은 일반적으로 전술한 특정 제제를 이용하고 전술한 제제-일반에서 설명된 대로 상기 제제를 투여함으로써 수행될 수 있다. 일반적으로, 항체는 적절한 완충용액과 주사용액에 통상적으로 포함되는 다른 소량 성분을 포함할 수 있는 생리 식염 용액같은 주사가능한 제제로 제제화된다. 환자에게 투여되는 정확한 항체의 양은 치료에 대한 환자의 반응성뿐만 아니라 나이, 성, 체중 및 환자의 상태같은 요소에 따라 달라질 것이다. 일반적으로, 항체는 투여량당 약 50㎍/㎏-50㎎/㎏의 투여 범위 그러나 더욱 바람직하게는 1㎎/㎏-10㎎/㎏의 투여 범위내로 주가가능한 제제로 투여된다. 투여량은 일정 기간에 걸쳐 환자에게 반복하여 투여된다. 일반적으로, 투여량은 하루 한 번을 기초로 투여되지만 하루 두 번 투여될 수도 있고 3 내지 10일에 한 번처럼 덜 빈번하게 투여될 수도 있다. 바람직한 투여는 3 내지 10일에 걸친 매일 투여가 될 것이다. 환자의 반응성을 결정한 후에 치료 계획안은 반복될 수 있다.

제제항에서 나타난 것처럼 항체는 동일한 제제내에서 비스포스포네이트와 동시에 전달될 수 있다. 한편으로는, 비스포스포네이트의 분리된 주사가능한 제제가 환자에게 투여될 수도 있다. 항체와는 달리, 투여되는 비스포스포네이트의 양은 일반적으로, 나이, 성, 체중 및 환자의 상태에 따라 달라질 것이다. 하지만, 환자의 반응성도 고려해야한다. 일반적으로, 비스포스폰은 각각 그리고 항체가 투여될 때마다 투여되지 않을 것이다. 더욱 일반적으로, 파미드로네이트 디소듐같은 비스포스포네이트는 보통 체격의 성인에게 격주로 약 30 내지 60 ㎎의 양으로 투여된다. 60 내지 90 ㎎ 범위의 더 많은 투여량은 한 달에 한 번씩 투여될 수 있다. 비스포스포네이트는 또한 일반적으로 정맥 주사로 투여된다. 비스포스포네이트 용액 60㎎은 1 내지 24시간에 걸쳐 환자에게 주입될 수 있다. 일정 기간에 걸친 원하는 투여량의 투여후 더 많은 비스포스포네이트를 재투여하기 전에 환자의 반응성을 결정하기 위해 일정 기간을 기다릴 것이다. 일반적으로, 60 내지 90㎎의 투여후에는 비스포스포네이트의 추가 투여전에 3 내지 6개월을 기다릴 것이다. 하지만, 그러한 것은 환자의 특정한 필요성에 따라 크게 변할 것이다.

투여되는 비스포스포네이트의 양은, 일반적으로, 투여되는 특정 비스포스포네이트에 따라 크게 변할 것이다. 당업자들은 이용되는 특정 화합물에 따라 투여량을 조절할 수 있을 것이다. 예를 들어, 파미드로네이트는 뼈 재흡수를 저해하는 데 있어서 에티드로네이트보다 대략 100배 정도 더 강력하다. 상기 투여 정보는 파미드로네이트의 투여를 기초로 한다. 따라서, 동일한 효과를 얻기 위해서는 훨씬 더 많은 양의 에티드로네이트가 투여되는 것이 필요할 것이다.

일차 암 종양을 가진 환자들은 종종 외과적으로 치료된다. 암 종양의 외과적 제거의 위험중의 하나는 암세포가 환자의 온몸으로 퍼진다는 것이다. 이것을 막는 것을 돕기 위해 본 발명의 제제는 외과 수술전, 수술동안 또는 수술후 투여될 수 있다. 더욱 일반적으로, 상기 제제는 외과 수술전에 투여될 것이다. 따라서, 항체의 제제(예로, 항-PTH-rp)는 비스포스포네이트의 투여와 함께 주사에 의해 투여된다. 일반적이지는 않지만, 비스포스포네이트는 또한 경구로 투여될 수도 있다. 더욱이, 본 발명은 약학적으로 그리고 생리학적으로 허용가능한 다양한 형태의 투여를 고려한다는 것이 지적된다.

본 명세서에서 설명된 치료 계획은 다른 진단 및 치료 계획과 함께 수행될 수 있음이 또한 주목된다. 한 예로서, 본 발명은 특히, x-선을 통해 암세포 전이에 기인하는 뼈 재흡수를 가지는 것으로 진단된 환자에 대하여 적용 가능하다. 환자의 x-선 사진이 환자가 뼈 재흡수로 고통받는 것을 보여줄 때, 항-PTH-rp같은 항체만을 또는 비스포스포네이트와 결합한 항체를 포함하는 본 발명의 제제가 투여된다. 도 4에서 나타나는 것처럼 항-PTHrp의 이용은 암 환자에서 뼈 재흡수를 감소시키는 데 있어서 중요한 효과를 가진다.

하기의 실시예는 당업자에게 본 발명의 제제를 만들고 본 발명의 방법을 수행하는 것에 대한 완전한 개시와 설명을 제공하기 위한 것으로 발명자들이 그들의 발명으로 간주하는 범위를 제한하려는 것은 아니다. 본문에서는 사용된 숫자(예를 들어, 양, 세포수, 온도, 시간 등)에 대해 정확성을 보장하기 위해 노력했지만 일부 실험적인 오류와 편차가 고려되어야 한다. 달리 표시되지 않으면, 일부는 중량부이고, 분자량은 평균 분자량이며, 단위는 통상적인 미터 단위이며, 온도는 ℃이고 18 내지 25℃ 범위의 대략 상온이고 압력은 대기압 또는 대기압 근처이다.

인체 PTHrp에 특이적으로 결합하는 항체의 생산

재조합 인체 PTHrp에 대해 특이적인 항체, 또는 자연 발생적인 또는 유전공학적으로 만들어진 인체 PTHrp단편에 특이적인 항체가 하기처럼 생산될 수 있다. 숙주 세포에서 인체 PTHrp를 암호화하는 cDNA의 일부 또는 전부를 발현시켜 PTHrp의 전부 또는 일부에 상응하는 폴리펩티드(재조합 또는 천연)를 생산한다. 다르게는, 인체 PTHrp, 또는 그들의 펩티드 단편은 표준 기술을 이용하여 합성 화학에 의해 생산될 수 있다. 바람직한 경우, 상기 펩티드는 면역성을 증가시키기 위해 담체 단백질 또는 다른 보조제에 결합될 수 있다.

다클론성 항체를 생산하기 위해 펩티드 또는 펩티드-담체를 프로인트 보조제와 혼합하여 동물(예를 들어, 생쥐, 기니아 피그, 토끼)에 주사한다. 재조합 인체 PTHrp 단백질, 또는 그들의 단편에 특이적으로 결합하는 단클론성 항체는 표준 림프잡종세포종 기술을 이용하여 생성된다(예를 들어, Kohler et al., 1975, Nature256:495; Kohler et al., 1976, Eur. J. Immunol.6:292; Kohler et al. 1976 Eur. J. Immunol.6:511; Hammerling et al. in Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas, (1981) Elsevier, NY; Ausubel et al., 상기; Harlow and Lane, eds.; Antibodies: A Laboratory Manual, (1988) Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY). 일단 생성되면, 항체는 웨스턴 블롯, 면역침전 분석, 또는 당업계에 공지된 다른 방법에 의해 인체 PTHrp 단백질에 대한 특이적 결합에 대해 시험된다(Ausubel et al., 상기; Harlow and Lane, 상기). 그렇게 생성된 항체는 본 발명의 제제와 치료 방법에서 이용된다. 한편, 그러한 항체는 전이에 기인하는 뼈 재흡수 부위를 식별하기 위해 표지되고 주사되고 이용될 수 있다.

제제 A

HHM 모델에서 칼슘 농도에 대한 PTHrp 단클론성 항체의 효과

HHM에서 칼슘 농도를 낮추는 데 있어서 항-PTH-rp의 효과를 확인하기 위해, 생쥐에게 CHOK-1 세포 또는 RWGT-2로 표시되는 뼈로 향하는 인상 폐암세포를 피하로 또는 정맥내로 주사했다. 주사를 위해, 0.05 ㎎/g 펜토바르비탈로 마취시켰다. 세포(1 x 10⁵)를 0.1㎖PBS에 현탁시켰다. 19일과 20일째에 생쥐에게 0.3㎖ PBS 또는 75㎍ 항-PTHrp(1-34) 단클론성 항체(Sato et al.J Bone Min Res(1993)8:849-860)를 포함하는 0.3㎖을 피하주사했다.

혈장에서 칼슘 농도를 0, 7, 14, 17,19 및 21일에 측정했다. 측정을 위해, 생쥐를 마취시키고 시바-코닝(Ciba-Corning) 칼슘 pH 분석기(Model 634, Corning, Medfield, MA)를 이용해 Yoneda, T et al.J Clin Oncol(1991)2:468-477에 설명된 바대로 칼슘 이온을 결정했다.

그 결과는 도 1에 나타난다. 나타나는 바대로, CHOK-1 세포로 이식된 컨트롤 생쥐는 정상적인 칼슘 농도를 유지한다. RWGT-2를 함유한 생쥐는 PBS만이 투여될 때는 연속적으로 증가하는 칼슘 농도(흑색 원)를 보여주며 반면 항-PTHrp의 투여는 항체를 받은 생쥐의 혈액에서 칼슘 농도를 급격히 떨어뜨린다(흑색 삼각형). 따라서, 이 HHM 모델에서, 항-PTHrp는 순환하는 PTHrp에 의해 매개되는 칼슘과잉혈증을 조절한다.

실시예 1

다양한 제제에 의해 자극되는 뼈 재흡수에 대한 항-PTHrp에 대한 효과

이 실시예에서, 태아 쥐 장골의 표지된 칼슘(⁴⁵Ca)의 비율은 뼈 재흡수의 척도로 이용되었다. 뼈를 표지하기 위해, 임신 18일째인 자성 쥐에게 표지된 칼슘 염 50μCi를 피하주사했다. 그 다음날, 즉 임신 19일째에 배를 회수하고 배에서 장골을 얻었다. 그 뼈를 뼈 재흡수 자극 인자로 생각되는 다양한 인자의 존재하 또는 부재하에서 그리고 제제 A에서 사용된 항-PTHrp(1-34)항체의 존재 또는 부재하에서 120시간동안 표준 배지에서 배양했다. 그 결과가 도 2에 나타난다.

나타나는 바대로, 처리되지 않은 뼈는 120 시간동안 표지된 칼슘의 약 20%를 배지에 방출했다. PTH-rp 10ng/㎖의 배양 배지에의 첨가는 표지된 칼슘의 거의 90%의 방출로 귀결된다; 하지만, 항-PTHrp항체의 첨가는 이를 약 30%로 감소시킨다. 10ng/㎖ PTH 그 자체의 배지에의 첨가는 또한 뼈 재흡수의 칼슘 지표의 거의 90% 방출로 귀결되지만 항체는 PTH-rp에 대해 충분히 면역특이적이어서 이 항체의 존재에 의한 영향이 거의 없다. 항체는 또한 10^-8M로 존재하는 1,25 D-3에 의해 자극되는 칼슘 방출을 감소시키는 것으로 나타나지만, 이들 결과는 반복되지 않았다. 10^-10M의 αIL-1의 첨가는 칼슘 방출에 거의 영향을 주지 않았고 항체의 첨가는 또한 효과가 없었다.

실시예 2

장골 병변에 대한 항-PTH-rp의 효과

Nakai, M. et al.Cancer Res(1992)52: 5395-5399의 골용해/전이 모델이 이용되었다. 0일에 0.05 ㎎/g 펜토바르비탈로 마취시킨 생쥐의 좌심실내에 MDA231 ± 4 세포를 주사했다. 14,17 및 20일에, 75㎍단백질을 함유한 항-PTH-rp(1-34) 0.3㎖(전술한 제제 A에서처럼) 또는 0.3㎖ PBS를 피하주사했다. 뼈 병변의 부위를 방사선 사진으로 추정했다; 생쥐를 깊이 마취시키고, 필름(22 x 27 cm X-O Mart AR Kodak, Rochester, New York)에 엎드린 자세로 눕히고 팩스트론 라디오그래픽 인스펙션 유니트(Faxtron Radiographic Inspection Unit)(Model 8050-020, Field Emission Corporation, Inc., McMinnville, OR)을 이용하여 6초동안 35kvp에서 x-선에 노출시켰다. RPX-O 마트 프로세서(Mart Processor)(Model M8B, Kodak)를 이용하여 필름을 인화했다. 모든 방사선 사진을 세가지 다른 개체에 의해 광범위하게 평가했다. 뼈에서 라디오루시드(radiolucid) 병변으로 인식되는 전이 병소를 확인했다. 실험 마지막에, 생쥐를 죽이고 뼈를 완충된 10% 포르말린에 고정하고, 전이성 종양의 존재를 확인하고 종양과 관련된 뼈와의 관계를 검사하기 위해 탈회했다.

상기 결과를 앞발과 뒷발의 뼈의 전체 병변 부분으로 표를 만들었으며 도 3에서 하나의 뼈에 대해 계산되어 나타난다. 나타나는 바대로, y-축에 나타나는 하나의 뼈의 전체 병변 부분은 항-PTH-rp가 투여될 때 감소되고 통계적으로 24일에 크게 감소한다.

실시예 3

4주된 자성 누드 생쥐(Balb c Nu/Nu, Harlan Sprague-Dawley, Houston, TX)에게 인체 유방암 세포 MDA-231( 1 x 10⁵세포/동물)를 좌심실에 접종하기 7일전 또는 접종과 동시에 PTH-rPAb(MAb)를 공급했다. 항-PTH-rp(1-34) (전술한 제제 A) 항체 또는 컨트롤 IgG(75㎍/동물)를 28일동안 3일마다 피하주사로 투여했다. 이들 생쥐의 발에서 골용해 병변의 발생을 Faxitron^R(model 43855A, Faxitron X-ray Corp., Buffalo Grove, IL)을 이용한 방사선 사진술에 의해 일주일에 한 번씩 검토했다. 17, 24, 및 26일에 찍은 방사선 사진을 골용해 병변에 대해 검토하고 각 생쥐의 발에서 병변 부분을 컴퓨터-연결된 상 분석기로 분석했다. 자료는 생쥐당 용해 병변면적(mm²)으로 표현되며 각 처리군당 12마리 누드 생쥐의 평균 ± S.E.M으로 표현된다. 통계적 차이를 ANOVA와 그에 이어지는 한 쌍인 시험에 의해 분석했다.

상기 과정의 결과가 도 4에서 그래프로 나타난다. 컨트롤 생쥐는 골용해 병변(뼈 재흡수)에서 극적인 증가를 나타냈으며 항-PTH-rp로 처리된 생쥐는 매우 소량의 골용해 병변을 보여준다.

실시예 4

생쥐 골수 세포 배양

생쥐 골수를 배양하여 C57BL 생쥐(웅성, 4-6주; Harlan Industries, Houston, TX)의 대퇴골과 경골로부터 골수 세포를 모아서, 혈청이 없는 알파 최소 필수 배지(αMEM; Hazelton Biologic, Inc., Lenexa, KS)로 두 번 세척하고, 최종 밀도 1.3 X 10⁶세포/cm²으로 48-웰 플레이트(Falcon; Becton Dickson; Labware, Lincoln Park, NJ)에 도말하고, 10% PCS(Hyclon Laboratories, Logan, UT)로 보충되고, 항생제 없이, 10nM 1,25D₃(Biomol Research Laboratory Inc., Plymouth Meeting, PA)로 보충된 αMEM 배지에서 6일동안 37℃에서 5% 습도 대기에서 배양했다. 달리 특정되어 있지 않으면, 2일마다 10% PCS와 10nM 1,25D₃를 함유한 새로운 αMEM배지를 공급했다.

배양 마지막에, 세포를 PBS로 세척하고, 시트르산 완충용액(pH 5.4)내의 60% 아세톤에서 30초동안 고정시키고, 공기 건조시키고, 상업적으로 이용가능한 키트(Sigma)를 이용하여, 주석산염-내성 산 포스파타아제(TRAP)에 대해 염색하였는 바, TRAP는 쥐 파골세포(11)의 널리 이용되는 세포화학적 표지이다. 염색된 배양물을 200배율에서 광학 현미경으로 검사했다. 각 웰에서 TRAP-양성(적색-염색) 다핵(셋 또는 그 이상의 핵)세포(TRAP(+)MNC)를 체계적으로 전체 웰을 수작업으로 스캐닝하여 센다. 자극된 생쥐 골수의 항-PTH-rp(1-34) 항체(상기 제제A에서 전술한 바대로)의 효과에 대해 얻어진 결과가 도 5에 나타난다.

실시예 5

동물 모델에 대한 항-PTH-rp의 효과

(1) PTH-rp농도에 대한 뼈로 전이된 암세포의 효과; 그리고 (2) 전이된 암에 대한 항-PTH-rp투여의 효과를 결정하기 위해 과정들을 수행했다. 처음에 두 그룹의 생쥐가 제공되었다. 첫 번째 그룹(컨트롤 그룹)은 정상 생쥐로 구성된다. 두 번째 그룹은 암세포 전이 모델이라는 제목의 항에서 전술한 바대로 좌심실에 암세포가 주사된 생쥐로서 첫 번째 그룹의 정상 생쥐와 동일한 유형의 생쥐로 이루어졌다. 주사된 암세포를 가지는 생쥐 그룹을 암세포가 주사되는 것을 제외하고는 컨트롤 그룹과 동일한 방법으로 처리하고 영양분을 제공했다. 주사된 암세포는 뼈로 전이하도록 했다.

골수 PTH-rp농도뿐만 아니라 말초 혈액 PTH-rp농도도 컨트롤 그룹과 암세포가 주사된 두 번째 그룹 둘다에서 측정되었다. 컨트롤 그룹에서 PTH-rp농도는 말초 혈액과 골수 둘다에서 1pm보다 적은 것으로 나타났다(도 7 참고). 하지만, 암세포가 주사된 그룹에서는 혈액 PTH-rp농도가 1pm이하인 반면 국소 골수 PTH-rp농도가 3pm 로 나타났다(도 7). 일부 동물은 국소 골수에서 더 높은 PTH-rp농도, 예로 6pm, 를 나타냈다. 컨트롤 그룹과 암세포가 주사된 그룹사이의 골수 PTH-rp농도 사이의 차이는 통계적으로 중요한 것으로 나타났다. 따라서, 상기 결과는 암세포가 뼈로 전이하도록 허락될 때 컨트롤 그룹의 골수에서의 PTH-rp농도와 비교할 때 통계적으로 중요한 양상으로 PTH-rp농도가 증가함을 보여준다.

암세포가 주사된 두 번째 생쥐 그룹을 이어서 두 그룹으로 나누었다.첫 번째 그룹은 새로운 컨트롤 그룹으로 이용하고 두 번째 그룹은 항-PTH-rp항체로 처리되는 것을 제외하고는 첫 번째 그룹(새로운 컨트롤 그룹)과 동일한 방식으로 처리되었다. 컨트롤 그룹, 즉 암세포를 가지나 항-PTH-rp항체로 처리되지 않은 그룹에서는 암세포의 조직학적 검사는 암세포가 살아있는 것을 보여주었다. 하지만, 항-PTH-rp항체로 처리된 그룹에서는 암세포의 조직학적 검사는 세포의 사멸, 즉 국소적인 암세포의 죽음을 보여주었다. 따라서, 상기 결과는 동물 모델내에서, 항-PTH-rp항체의 투여를 통한 국소적인 항암 활성을 보여준다.

본 발명은 가장 실제적이고 바람직한 구체예를 본 명세서에서 보여주고 설명한다. 하지만, 출발이 본 발명의 범위내로부터 만들어질 수 있고 명백한 변형이 본 명세서를 읽는 당업자에게 일어날 것으로 인식된다.

Claims

PTHrp, TGFα, IL-1α, IL-1β, IL-6, 림프독소, TNF, PGE; 1,25 디하이드록시 비타민 D₃및 그들의 항원성 단편으로 구성되는 군으로부터 선택된 화합물에 대해 면역반응하고 면역특이적인 항체 또는 그들의 단편의 치료상 유효량과 약학적으로 유효한 부형제를 포함하는 주사가능한 약학 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 항체가 PTHrp 또는 그들의 항원성 단편에 대해 면역반응하고 면역특이적인 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 항체가 비-인체 포유동물에서 유래한 가변부와 인체에서 유래한 정상부를 포함하는 키메릭 항체인 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 항체가 형질전환된 생쥐에서 유래한 휴머나이즈드 항체인 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 항체가 인체 항체인 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 하기의 일반적인 구조식을 가지는 비스포스포네이트 또는 피로포스페이트와 그들의 약학적 허용염, 수화물 및 부분 수화물을 치료상 유효량만큼 추가로 포함하는 조성물:

화학식 1

상기에서 X는 포스포네이트기의 상호연결을 허용하는 연결부이다.
제 6항에 있어서, X가 -O-, 그리고로 이루어지는 군으로부터 선택되는 조성물:

상기 식에서 R¹, R²는 H, OH, Cl, NH₂, S, 티오페닐로 이루어지는 군으로부터 각각 독립적으로 선택되며, 티오페닐에서 페닐 고리는 Cl, OH, NH₂, 1 내지 12 탄소 원자를 가지는 알킬, 1 내지 12 탄소 원자를 가지는 치환된 알킬로 이루어지는 군으로부터 선택된 치환기로 치환될 수 있으며, 상기 치환된 알킬의 치환기는 O, S, NH₂, N, 그리고 1 내지 12 탄소 원자를 가진 N-알킬, 1 내지 12 탄소 원자를 가진 고리 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되며, 상기 고리 화합물의 탄소원자는 Cl, OH, NH₂, 그리고 1 내지 12 탄소원자를 가진 이종환식 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 치환기로 선택적으로 치환되며, 상기 이종환식 화합물의 탄소 원자는 Cl, OH, NH₂로 이루어지는 군으로부터 선택되는 치환기로 선택적으로 치환되며, 상기에서 헤테로원자는 O, N, S로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
제 6항에 있어서, X가 -O-, 및 하기의 화합물들로 이루어지는 군으로부터 선택되는 조성물:

,,,,

,,

,,
PTHrp, TGFα, IL-1α, IL-1β, IL-6, 림프독소, TNF, PGE; 1,25 디하이드록시 비타민 D₃와 그들의 항원성 단편으로 구성되는 군으로부터 선택된 화합물에 대해 면역반응하고 면역특이적인 항체 또는 그들의 단편의 치료상 유효량과 약학적으로 유효한 부형제를 포함하며, 뼈로의 암전이 방지를 위한 주사가능한 약학 조성물.
PTHrp, TGFα, IL-1α, IL-1β, IL-6, 림프독소, TNF, PGE; 1,25 디하이드록시 비타민 D₃와 그들의 항원 단편으로 구성되는 군으로부터 선택된 화합물에 대해 면역반응하고 면역특이적인 항체 또는 그들의 단편의 치료상 유효량과 약학적으로 유효한 부형제를 포함하며, 뼈에 존재하는 암세포의 성장을 저해하기 위한 주사가능한 약학 조성물.
PTHrp, TGFα, IL-1α, IL-1β, IL-6, 림프독소, TNF, PGE; 1,25 디하이드록시 비타민 D₃와 그들의 항원 단편으로 구성되는 군으로부터 선택된 화합물에 대해 면역반응하고 면역특이적인 항체 또는 그들의 단편의 치료상 유효량과 약학적으로 유효한 부형제를 포함하며, 골용해를 방지하기 위한 주사가능한 약학 조성물.
PTHrp, TGFα, IL-1α, IL-1β, IL-6, 림프독소, TNF, PGE; 1,25 디하이드록시 비타민 D₃와 그들의 항원 단편으로 구성되는 군으로부터 선택된 화합물에 대해 면역반응하고 면역특이적인 항체 또는 그들의 단편의 약학적 유효량과 약학적으로 유효한 부형제를 포함하며, 국소 PTH-rp생산으로 인해 나타나는 상태의 치료를 위한 주사가능한 약학 조성물.
PTHrp, TGFα, IL-1α, IL-1β, IL-6, 림프독소, TNF, PGE; 1,25 디하이드록시 비타민 D₃와 그들의 항원 단편으로 구성되는 군으로부터 선택된 화합물에 대해 면역반응하고 면역특이적인 항체의 치료상 유효량과 약학적으로 유효한 부형제를 포함하는 조성물로서 유방, 폐, 신장, 머리/목, 전립선, 췌장, 피부, 갑상선, 고환, 간, 요로상피, 자궁내막, 경부, 식도, 혈액, 신경계, 및 림프조직으로 구성되는 군으로부터 선택된 일차 부위 암에서 생기는 증상의 치료를 위한 주사가능한 약학 조성물.
제 13항에 있어서, 상기 증상이 하기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 조성물:

상기 환자가 통증으로 고통받으며 상기 저해가 그 통증을 완화시키는 경우;

상기 환자가 신경 압박의 위험이 있으며 상기 저해가 상기 압박을 피하거나 완화시키는 경우;

상기 환자가 칼슘과잉혈증이고 상기 저해가 상기 칼슘과잉혈증의 개선을 야기하는 경우;

상기 환자가 사망의 위험에 있고 상기 저해가 생존 시간을 연장하는 경우;

상기 환자가 병적 골절의 위험이 있으며 상기 저해가 상기 위험을 감소시키는 경우;

상기 환자가 악액질이고 상기 저해가 상기 악액질을 개선하는 경우; 및 전술한 경우의 조합.
제 13항에 있어서, 상기 뼈 전이가 편평상피세포 암세포, 선암 세포, 흑색종 세포, 골육종 세포, 신경모세포종 세포, 또는 혈액암 세포로 이루어지는 군으로부터 선택된 세포의 비정상적인 성장의 결과인 조성물.
제 9항, 제 10항, 제 11항, 제 12항중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 그들의 단편이 PTHrp 또는 그들의 항원성 단편에 대해 면역반응하고 면역특이적인 조성물.
제 9항, 제 10항, 제 11항, 제 12항, 제 13항, 제 14항, 제 15항, 제 16항중 어느 한 항에 있어서, 하기의 일반적인 구조식을 가지는 비스포스포네이트 또는 피로포스페이트와 그들의 약학적 허용염, 수화물 및 부분 수화물의 치료상 유효량을 투여하는 것을 추가로 포함하는 조성물:

화학식 1

상기 식에서 X는 포스포네이트기의 상호연결을 허용하는 연결부이다.
제 9항, 제 10항, 제 11항, 제 12항, 제 13항, 제 14항, 제 15항, 또는 제 16항중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 비인체 공급원에서 유래한 가변부와 인체 공급원에서 유래한 정상부를 포함하는 키메릭 항체인 조성물.
제 9항, 제 10항, 제 11항, 제 12항, 제 13항, 제 14항, 제 15항, 또는 제 16항중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 휴머나이즈드 항체인 조성물.
제 9항, 제 10항, 제 11항, 제 12항, 제 13항, 제 14항, 제 15항, 또는 제 16항중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 인체 항체인 조성물.
PTHrp, TGFα, IL-1α, IL-1β, IL-6, 림프독소, TNF, PGE; 1,25 디하이드록시 비타민 D₃와 그들의 항원성 단편으로 구성되는 군으로부터 선택된 화합물에 대한 항체 또는 그들의 단편의 치료상 유효한 양을 그러한 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하며, 뼈로의 암 전이를 막는 방법.
PTHrp, TGFα, IL-1α, IL-1β, IL-6, 림프독소, TNF, PGE; 1,25 디하이드록시 비타민 D₃와 그들의 항원성 단편으로 구성되는 군으로부터 선택된 화합물에 대한 항체 또는 그들의 단편의 치료상 유효량을 그러한 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하며, 뼈에 존재하는 암세포의 성장을 저해하는 방법.
PTHrp, TGFα, IL-1α, IL-1β, IL-6, 림프독소, TNF, PGE; 1,25 디하이드록시 비타민 D₃와 그들의 항원성 단편으로 구성되는 군으로부터 선택된 화합물에 대한 항체 또는 그들의 단편의 치료상 유효량을 그러한 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하며, 골용해를 방지하는 방법.
PTHrp, TGFα, IL-1α, IL-1β, IL-6, 림프독소, TNF, PGE; 1,25 디하이드록시 비타민 D₃와 그들의 항원성 단편으로 구성되는 군으로부터 선택된 화합물에 대한 항체 또는 그들의 단편의 치료상 유효량을 그러한 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하며, 국소 PTHrp생산으로 생기는 상태를 치료하는 방법.
PTHrp, TGFα, IL-1α, IL-1β, IL-6, 림프독소, TNF, PGE; 1,25 디하이드록시 비타민 D₃와 그들의 항원성 단편으로 구성되는 군으로부터 선택된 화합물에 대해 면역반응하고 면역특이적인 항체 또는 그들의 단편의 치료상 유효량을 그러한 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 방법으로서 유방, 폐, 신장, 머리/목, 전립선, 췌장, 피부, 갑상선, 고환, 간, 요로상피, 자궁내막, 경부, 식도, 혈액, 신경계, 및 림프조직으로 이루어지는 군으로부터 선택된 일차 부위 암에서 생기는 증상의 치료 방법.
일차성 암 종양을 외과수술로 제거하는 단계; 그리고 수술전, 수술동안 그리고 수술후로 구성되는 군으로부터 선택된 시간에 PTHrp, TGFα, IL-1α, IL-1β, IL-6, 림프독소, TNF, PGE; 1,25 디하이드록시 비타민 D₃와 그들의 항원성 단편으로 구성되는 군으로부터 선택된 화합물에 대해 면역반응하고 면역특이적인 항체 또는 그들의 단편의 치료학상 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하며, 일차성 암 종양을 가진 환자를 치료하는 방법.
환자의 뼈의 x-선 사진을 얻는 단계; 암세포 전이에 기인하는 뼈 재흡수 부위를 결정하기 위해 사진을 분석하는 단계; PTHrp, TGFα, IL-1α, IL-1β, IL-6, 림프독소, TNF, PGE; 1,25 디하이드록시 비타민 D₃와 그들의 항원성 단편으로 구성되는 군으로부터 선택된 화합물에 대해 면역반응하고 면역특이적인 항체 또는 그들의 단편의 치료상 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법.
제 21항, 제 22항, 제 23항, 제 24항, 제 25항, 제 26항, 또는 제 27항중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 PTHrp 또는 그들의 항원성 단편에 대해 면역반응하고 면역특이적인 방법.
제 21항, 제 22항, 제 23항, 제 24항, 제 25항, 제 26항, 또는 제 27항중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 비인체 포유동물에서 유래한 가변부와 인체에서 유래한 정상부를 포함하는 키메릭 항체인 방법.
제 21항, 제 22항, 제 23항, 제 24항, 제 25항, 제 26항, 또는 제 27항중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 형질전환된 생쥐에서 유래한 휴머나이즈드 항체인 방법.
제 21항, 제 22항, 제 23항, 제 24항, 제 25항, 제 26항, 또는 제 27항중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 인체 항체인 방법.
제제가 하기의 일반적인 구조식을 가지는 비스포스포네이트 또는 피로 포스포네이트, 그리고 그들의 약학적 허용염, 수화물 및 부분 수화물의 치료상 유효량을 추가로 포함하는 제 1항 또는 제 2항의 조성물을 제조하는 방법:

화학식 1

상기 식에서 X는 포스포네이트기의 상호연결을 허용하는 연결부이다.