KR19980071443A - 구조 유전자의 세포 주기 조절된 발현을 위한 핵산 작제물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 하나 이상의 활성인자 서열, E2F군의 단백질과 CDF-1군의 단백질을 결합시키는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 하나 이상의 키메라 프로모터 모듈(chimeric promoter module) 및 하나 이상의 구조 유전자를 포함하는 핵산 작제물에 관한 것이며, 여기서, 키메라 프로모터 모듈은 B-myb 프로모터보다는 늦게 그러나 cdc25C 프로모터보다는 먼저 세포 주기내 유전자 발현 및 단백질 CDF-1을 상향-조절한다.

Description

구조 유전자의 세포 주기 조절된 발현을 위한 핵산 작제물
본 발명은 하나 이상의 활성인자 서열, E2F군의 단백질과 CDF-1군의 단백질을 결합시키는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 하나 이상의 프로모터 모듈(promoter module) 및 하나 이상의 구조 서열을 포함하는 핵산 작제물에 관한 것이다.
세포 주기-조절된 저해와 관련된 인자중의 하나는 E2F이며, 이는 pRb와 같은 포켓 단백질(pocket protein)과의 상호작용을 통해 DNA-결합 리프레서 복합체(repressor complex)를 형성할 수 있다[참조: Weintraub et al., Nature 358, 259 (1992); Helin and Harlow, Trends Cell Biol. 3, 43 (1993); Zamanian and La Thangue, Mol. Biol. Cell 4, 389 (1993)].
E2F는 E2F와 DP 다중-유전자군의 일원으로 구성된 헤테로 이량체성 전사 인자이다[참조: Nevins, Science 258, 424 (1992); Muller, Trends Genet. 11, 173 (1995); La Thangue, Transactions 24, 54 (1996)]. E2F 유전자군에 속하는 다른 전사 인자는 예를 들면, E2F-5이다(참조: WO 96/25494). E2F에 의한 전사 활성화는 pRb군의 포켓 단백질에 의해서 세포 주기동안에 조절된다. E2F는 G0 기 및 초기 G1 기 상태에서 저해되지만, 세포 주기의 진행 동안에 DP/E2F잔기 및 연관된 포켓 단백질 모두는 억제성 삼원 복합체를 해리시키는 G1기-특이적인 사이클린 의존성 키나제에 의해 과포스포릴화된다[참조: DeCaprio et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 1795 (1992); Fagan et al., Cell 78, 799 (1994); Hatakeyama et al., Genes Dev. 8, 1759 (1994); Weinberg, Cell 81, 323 (1995)]. 이러한 해리는 전사적으로 활성인 유리 E2F를 생성하여 E2F-조절된 유전자를 활성화시킨다. 따라서, 예를 들면, E2F 조절인자 및/또는 E1A 조절인자를 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터는 분화된 뉴우런을 형질감염시켜 DNA 합성을 유도하는데 이미 사용되어 왔다(참조: WO 95/16774).
E2FBS를 통한 전사 저해에 의해 조절된 프로모터 중에는 E2F-1, orc-1 및 B-myb가 있다[참조: Lam and Watson, EMBO J. 12, 2705 (1993); Hsiao et al., Genes Dev. 8424, 1526 (1994); Johnson et al., Genes Dev. 8424, 1514 (1994); Ohtani et al., Mol. Cell. Biol. 16, 6977 (1996)]. 그러나, E2F의 역할은 전적으로 활성화되지 않는다. 이러한 사실은 우선 마우스 B-myb 유전자에서 입증되었다[참조: Lam and Watson, EMBO J. 12, 2705 (1993); Lam et al., EMBO J. 13, 871 (1994); Lam et al., Gene 160, 277 (1995); Zwicker et al., Science 271, 1595 (1996)]. B-myb 프로모터내 E2F 결합 부위(E2FBS)의 돌연변이는 G0기 상태에서 선택적으로 현저하게 증가된 활성을 가져오며 그 결과 세포 주기 조절을 상실시킨다.
이러한 맥락에서의 다른 예는 E2F, p107, 히스톤 H2A 및 orc1 프로모터이며, 여기서, E2FBS의 돌연변이는 또한 저해 및 세포 주기 조절을 파괴한다[참조: Hsiao et al., Genes Dev. 8424, 1526 (1994); Johnson et al., Genes Dev. 8424, 1514 (1994); Zhu et al., Mol. Cell. Biol. 15, 3552 (1995); Ohtani et al., Mol. Cell. Biol. 16, 6977 (1996); Oswald et al., Mol. Cell. Biol. 16, 1889 (1996)].
E2FBS를 통해 저해되는 몇개 유전자의 확인은 E2F-중재된 전사적 저해가 세포 주기 조절된 전사의 빈번한 메카니즘임을 암시한다. 그러나, B-myb 유전자 저해의 메카니즘은 E2FBS의 바로 하부에 위치한 제2 성분을 필요로 한다는 점에서 E2F의 작용에 대해 제안된 모든 모델과는 구별된다[참조: Bennet et al. Oncogene 13, 1073 (1996); Zwicker et al., Science 271, 1595 (1996)]. 또한, B-myb E2FBS의 세포내 활동은 세포 주기별로 조절되며 단지 저해 상태동안에만 관찰된다[참조: Zwicker et al., Science 271, 1595 (1996)]. 이러한 관찰은 2개의 협동 성분 즉, E2FBS형 CDE 및 인접한 CHR을 통해 주기적으로 저해되는 cdc25C, cdc2 및 사이클린 A와 같은 기타 프로모터를 사용하여 수행한 것과 매우 유사하다[참조: Zwicker et al., EMBO J. 14, 4514 (1995)].
세포 주기 조절된 전사 메카니즘은 세포 주기의 말기 단계에서 발현되는 유전자의 분석을 통해 발견되었다. 말기 S/G2 기 상태에서 상향-조절되는 cdc25C 프로모터를 생체내 풋프린팅(footprinting) 및 돌연변이 분석에 의해 연구하는 경우, 신규한 리프레서 성분, 즉 세포 주기 의존적 성분(CDE)이 확인된다[참조: Lucibello et al., EMBO J. 14, 132 (1995)]. CDE는 G0-G1 기 상태에서 활동하며 이의 활동은, cdc25C가 발현되는 경우, G2 기 상태에서 상실된다.
CDE 중재된 저해는 기타 프로모터를 조절하는 역할을 하며 말기 G1/S기 상태에서 탈저해되는 cdc2 프로모터와 사이클린 A내 작용성 CDE의 존재에 의해 나타내어 진다[참조: Zwicker et al., EMBO J. 14, 4514 (1995)]. 이러한 연구로 CDE와 인접하는 추가 성분이 발견되었고, 이 성분은 3개의 모든 프로모터내에서 동일하다. 이 성분은 세포 주기 유전자 상동 영역(CHR)이라고 불린다[참조: Zwicker et al., EMBO J. 14, 4514 (1995)].
cdc25C, cdc2 또는 사이클린 A 프로모터내 CDE 또는 CHR의 돌연변이는 G2기상태에서의 저해를 크게 억제한다. 이러한 작용적 데이터는 게놈성 풋프린팅에 있어서 CDE 및 CHR 모두에 결합하는 G0-G1기 특이적인 단백질의 입증에 의해 지지되었다. 흥미롭게도, CDE는 DNA의 큰 홈(major groove)내에서 접촉하지만 CHR에 대한 결합은 작은 홈(minor groove)에서 일어난다[참조: Zwicker et al., EMBO J. 14, 4514 (1995)]. CDE-CHR의 뉴클레오타이드 서열 및 진단, 선별 및 유전자 치료요법을 위한 이의 용도는 이미 제WO 96/06943호에 청구되어 있다.
CHR이 프로모터의 저해시 CDE와 협동한다는 사실과 B-myb 프로모터내 E2FBS에 인접한 CHR형 서열의 확인은 B-myb 저해 메카니즘으로의 상세한 연구를 고취시켰다. 이들 연구는 CHR형 영역이 저해에 필수적이며 E2FBS와 함께 공동-리프레서 성분으로서 작용함을 나타낸다[참조: Bennett et al., Oncogene 13, 1073 (1996)]. 이 영역은 Bmyb-CHR[참조: Bennett et al., Oncogene 13, 1073 (1996)] 또는 DRS[참조: Bennett et al., Oncogene 13, 1073 (1996)]라고 불린다.
또한, 게놈성 풋프린팅은 E2F 부위 활동의 상실이 중기-G1 기 상태에서의 B-myb의 탈저해와 일치함을 명백히 나타낸다[참조: Zwicker et al., Science 271, 1595 (1996)]. 이러한 관찰은 CDE-CHR 부위가 S 또는 G2 기 상태에서 유전자의 탈저해를 이끄는 것과 유사한 방식으로 E2F-CHR 부위가 말기 G1 기 상태에서 유도된 유전자의 전사를 조절함을 나타낸다. 또한, 이러한 발견은 저해시키는 E2F 부위가 인접하는 CHR 공리프레서 성분(corepressor element)의 부재에 의해 활성화시키는 E2F 부위와는 상이함을 나타낸다. 이를 종합하여 보면, 세포 주기의 상이한 단계에서 작용하는 E2F- 및 CDE-중재된 저해는 프로모터-특이적인 CHR 성분에 따른다[참조: Liu, N. et al., Nucleic Acids Res. 24, 2905, No. 15 (1996)].
CDE는 B-myb 프로모터에서의 서열(GGCGG)과 같이 E2FBS 코어 서열(core sequence)과 동일하나[참조: Zwicker et al., EMBO J. 14, 4514 (1995)], CDE로부터 E2FBS를 구별하는 것은 문제점으로 남아있다. 또한, CDE 또는 CDE-CHR 결합 활성은 지금까지 확인되어 있지 않으며 전사 인자의 E2F군에 대한 CDE 결합 인자의 관계는 명백하지 않다.
리프레서 모듈 모두는 E2FBS-Bmyb-CHR 또는 CDE-CHR의 상부에 위치한 활성화 서열을 저해한다. Bmyb-CHR 성분은 세포 주기의 초기(G0 내지 G1 중기)에서 상부 활성인자 서열을 억제하며 CDE-CHR은 보다 후기(G0 내지 S기)까지 상부 활성인자 서열을 억제한다.
이러한 발견은 비세포-특이적인, 세포-특이적인, 바이러스-특이적인 및/또는 대사-특이적인 활성인자 서열, 세포 주기-특이적인 프로모터 모듈형 CDE-CHR 또는 활성인자 서열의 활성화를 조절하는 E2FBS-Bmyb-CHR 및 치료학적 단백질을 암호화하는 구조 유전자를 포함하는 유전자의 작제를 가져왔다.
이러한 유전자 작제물은 각종 질환의 유전자 치료요법을 위해 청구되어 있다(참조: WO 96/06943; D196.05274.2; D196.17851.7; WO 96/06940; WO 96/06938; WO 96/06941; WO 96/06939).
본 발명의 목적은 상이한 세포-주기 의존적 유전자 발현을 갖는 신규의 핵산 작제물을 발견하는 것이다.
놀랍게도 B-myb 및 CDE-CHR 조절된 프로모터의 저해에 관여된 인자는 상이함이 밝혀졌다. B-myb 유전자는 CHR-결합 인자와 함께 E2F 복합체를 통해 저해되는 반면, cdc25C 프로모터는 본 발명에서 확인되어 CDE-CHR 결합 인자-1(CDF-1)이라 칭해진 신규 활성에 의해 저해된다.
연속해서, 몇 개의 세포 주기-조절된 유전자내 리프레서 성분과 CDF-1의 상호작용이 분석되었다. 생체내 및 시험관내 DMS 풋프린팅, EMSA 및 프로모터 루시퍼라제 작제물의 작용적 검정을 사용함으로써 다음의 CDF-1 활성을 확인할 수 있었다:
(a) CDF-1은 cdc25C 프로모터내 CDE 및 CHR과 협동적 양식으로 상호작용하며, 이것은 세포내에서 관찰된 CDE의 CHR-의존성 활동과 일치한다.
(b) CDF-1은 CDE(큰 홈)내 G 잔기 및 CHR(작은 홈)내 A 잔기와 상호작용한다. 이러한 보호 양식은 생체내 풋프린팅의 의해 밝혀진 것과 동일하다[참조: Zwicker et al., EMBO J. 14, 4514 (1995)].
(c) 돌연변이된 CDE 또는 CHR 모티프를 포함하는 서열에 대한 CDF-1의 결합은 세포 주기 조절된 저해시 이러한 돌연변이된 성분의 작용과 깊숙히 관련된다.
(d) CDF-1은 모든 공지된 CDE-CHR 조절된 프로모터, 즉 cdc25C, cdc2 및 사이클린 A에 유사한 효능으로 결합하지만, B-myb에는 단지 약하게 결합한다.
(e) CDF-1은 cdc25C, cdc2 및 사이클린 A 유전자의 프로모터를 포함하는 CDE-CHR에 유사한 고 효능으로 결합할 수 있는 반면 B-myb 프로모터 E2FBS-CHR 모듈과의 상호작용은 비교적 약한 것으로 밝혀졌다.
(f) E2F는 cdc25C CDE-CHR 성분을 통한 저해를 중재할 수 없는 반면 CDF-1은 E2FBS-Bmyb-CHR을 통한 저해를 중재할 수 없다.
CDF-1 단백질은 CDE-CHR 서열 모티프의 존재하에 고 염 추출 및 친화 크로마토그래피에 의한 정제에 의해서 헬라(HeLa)세포 배양물 현탁액으로부터의 핵 추출물에서 분리될 수 있다.
본 발명의 제1 양태는
(a) 헬라 세포로부터 핵 추출물을 제조하는 단계 및
(b) CDE-CHR 서열 모티프를 포함하는 올리고뉴클레오타이드의 존재하, 특히 서열 GGCTG GCGGA AGGTT TGAAT를 포함하는 모티프의 존재하 및 특히 서열 GGCTG GCGGA AGGTT TGAAT GGCTG GCGGA AGGTT TGAAT를 포함하는 모티프의 존재하에 친화 크로마토그래피에 의해서 단계 (a)의 추출물을 정제하는 단계에 의해 수득가능한 CDF-1 단백질에 관한 것이다.
특히 바람직한 양태에서 CDE-CHR 서열 모티프를 포함하는 올리고뉴클레오타이드는 예를 들면, 스트렙타비딘을 통해 아가로즈에 커플링된다. 일반적으로, 단계 (a)에 따른 핵 추출물은 헬라 세포의 염 추출, 특히 문헌[참조: Dignam, J. D. (1983) Nucleic Acids Res., 11, 1475-1489]에 따른 고 염 추출에 의해 제조된다. CDF-1 단백질은 단계별로 증가시킨 염 농도, 즉 KCl의 염 농도를 1M까지 증가시킴에 의해서 크로마토그래피 칼럼으로부터 용출시킬 수 있다.
CDF-1 단백질은 CDF-1의 억제인자 또는 자극인자, 특히 CDF-1의 리프레서 작용을 확인하는데 특히 유용하다.
CDF-1의 분리 및 작용 특성의 다른 결과는 E2F/DP 및 CDF-1의 결합 및 리프레서 작용에 필수적인 뉴클레오타이드의 확인이다.
일반적으로, 결합은 완전한 수준의 CDE 및 CHR의 존재에 의존한다. CDE의 컨센서스 서열(consensus sequence)은 G/CGC/TGG/C [cdc25C에서 GGCGG: 문헌 Zwicker et al., EMBO J. 14, 4514 (1995) 참조] 및 서열 TTTGAA로서 cdc25C의 CHR 서열로 정의될 수 있다. 이 영역에서의 뉴클레오타이드와는 대조적으로 CDE 및 CHR간의 뉴클레오타이드(AAGG, 표 1 및 표 2 참조) 및 CHR로부터 하부의 뉴클레오타이드(TGG, 표 1 및 표 2 참조)는 리프레서 작용에 있어 검출가능한 효과없이 변경될 수 있다.
유사한 결합 부위-특이적인 상호작용 양식은 부분 정제된 CDF-1으로 관찰할 수 있다.
E2F 및 CDF-1 결합간의 구별에 관여하는 B-myb의 E2FBS 및 cdc25C의 CDE내 뉴클레오타이드는 E2FBS/CDE 코어에 바로 인접하고 있는 뉴클레오타이드(GGCGG)이다. 즉, 상부의 2개의 뉴클레오타이드(B-myb내 CT) 및 하부의 하나의 뉴클레오타이드(B-myb내 G)는 일반적으로 E2F 결합을 유발시키나 CDF-1 결합은 유발시키지 않는다. 이러한 발견을 기본으로하여 정상의 CDF-1 상호작용이 아닌 E2F 결합이 크게 저하된 돌연변이 B-myb의 작용을 검정하고 이러한 작제물의 저해가 손상되는 것을 나타내는 것이 가능하다. 이러한 데이터는 E2F와의 상호작용이 일반적으로 필수적이며, CDF-1의 결합이 B-myb 프로모터상에서 어떠한 세포 주기 조절을 부여하기에는 불충분함을 나타낸다.
이러한 상황은 CDE-CHR 저해된 cdc25C 프로모터의 경우 매우 상이하다. 이 경우에, E2F의 결합은 발견되지 않으며 CDF-1과의 강력한 상호작용은 일반적으로 CHR에 따른다. 즉, E2F 결합 부위는 5-뉴클레오타이드 CDE보다는 크나(예를 들면, 9개 뉴클레오타이드 이상)][참조: Zwicker et al., EMBO J. 14, 4514 (1995)], CHR을 포함하지 않는 반면, CDF-1 결합 부위는 5개 뉴클레오타이드 CDE 및 인접한 6개 뉴클레오타이드 CHR로 이루어진다. 따라서, Bmyb-CHR을 cdc25C CHR로 변화시키거나(B-C4 표 2 참조) cdc25C CDE 플랭킹 뉴클레오타이드(flanking nucleotide)를 이의 B-myb 상대물로 변화시킴에 의해(참조: 표 2, C-B1,2) E2F 및 CDF-1 모두와 상호작용하는 능력을 지닌 프로모터를 창조하는 것이 가능하다. 흥미롭게도, 이들 프로모터는 세포 주기동안에 탈저해의 시기와 관련하여 신규 특성을 나타내는데, 최대 활성의 1/2이 B-myb보다는 늦게 그러나 cdc25C보다는 먼저, 즉 초기 S기-중기에서 관찰된다. 이러한 관찰은 E2F 및 CDF-1의 상이한 결합이 조절 시기에 기여함을 나타낸다. 이러한 관찰과 일치하여 바람직하고 강력한 CDF-1 결합을 나타내는 B-myb 돌연변이체(참조: 표 2, B-Cl, 3,4)는 cdc25C형 발현 역학을 보인다.
따라서, 본 발명의 다른 양태는
a) 하나 이상의 활성인자 서열,
b) E2F군의 단백질과 CDF-1군의 단백질을 결합시키는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 하나 이상의 키메라 프로모터 모듈 및
c) 하나 이상의 구조 유전자를 포함하는 핵산 작제물에 관한 것이며, 여기서, 키메라 프로모터 모듈은 B-myb 프로모터보다는 늦게 그러나 cdc25C 프로모터보다는 먼저 세포 주기내 유전자 발현을 상향-조절한다.
바람직한 양태에서 활성인자 서열은 키메라 프로모터 모듈의 상부에 위치한다.
ACTTGGCGGGAGATTTGAAT(서열 1)로 돌연변이된 B-myb 유전자의 E2FBS-Bmyb-CHR 프로모터 모듈(돌연변이된 위치는 밑줄쳐져 있음)인 ACTTGGCGGGAGATAGGAAA[참조: Zwicker et al., Science 271: 1595 (1996)]은 고-친화성 E2F 및 CDF-1 결합 부위를 포함한다. 생체내(세포내)에서 이 뉴클레오타이드 서열에 대한 E2F 및 CDF-1의 결합은 G0 및 G1기로 제한되며 S, G2 및 M기에서는 검출불가능하고 서열 1의 뉴클레오타이드는 세포 주기의 G0 및 G1기에서 구조 유전자(서열 1의 하부에 위치)의 전사를 활성화시키기 위한 활성인자 서열(서열 1의 상부에 위치)의 활성을 강력하게 저해할 수 있다.
또한, GCTTGGCGGGAGGTTTGAAT(서열 2)로 돌연변이된 cdc25C 유전자의 CDE-CHR 모듈(돌연변이 위치는 밑줄쳐져 있음), 즉 GGCTGGCGGAAGGTTTGAAT[참조: EMBO 14, 4514 (1995)]는 고-친화성 CDF-1 및 E2F 결합 부위를 포함한다. 생체내에서(세포내에서) 이 뉴클레오타이드 서열에 대한 CDF-1 및 E2F의 결합은 G0 및 G1기로 제한되며 S, G 및 M기에서는 검출 불가능하고 서열 2의 뉴클레오타이드는 세포 주기의 G0 및 G1기에서 구조 유전자(서열 2의 하부에 위치)의 전사를 활성화시키는 활성인자 서열(서열 2의 상부에 위치)의 활성을 강력하게 저해할 수 있다.
따라서, 본 발명의 바람직한 양태는 ACTTGGCGGGAGATTTGAAT(서열 1) 및 ACTTGGCGGGAGGTTTGAAT(서열 2)로 이루어진 그룹중에서 선택된 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 키메라 프로모터 모듈을 갖는 핵산 작제물에 관한 것이다.
일반적으로, 프로모터 모듈은 활성인자 서열과 상호작용하며, 이러한 상호작용은 구조 유전자의 발현에 영향을 미친다.
활성인자는 일반적으로 기본 전사의 비-특이적, 세포-특이적, 바이러스-특이적 및/또는 대사 특이적 활성화의 방식으로 작용한다. 구조 유전자는 일반적으로 세포-주기 특이적, 세포-특이적 및 세포 주기-의존적, 바이러스-특이적 및 세포-주기 의존적 및/또는 대사-특이적 및 세포-주기 의존적 방식으로 발현된다.
본 발명에 따른 핵산 작제물은 바람직하게는 DNA로 이루어진다. 본원에 사용된 것으로서, 용어 핵산 작제물은 표적 세포내로 전사될 수 있는 인공의 핵산 구조물을 의미한다. 이러한 작제물은 벡터내로 삽입될 수 있다. 플라스미드 벡터 또는 바이러스 벡터와 같은 비바이러스 벡터가 사용될 수 있다. 벡터의 종류 및 본 발명에 따른 핵산 작제물의 삽입 기술은 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다. 본 발명에 따른 핵산 작제물은 천연적으로는 본 발명에 기술된 배열로 존재하지 않는다. 한편, 핵산 작제물의 구조 유전자는 활성인자 서열 및 키메라 프로모터 모듈과 천연적으로 결합되지 않는다.
본 발명의 다른 양태는 본 발명에 따른 핵산 작제물 또는 벡터를 포함하는 세포에 관한 것이다.
본 발명에 따른 핵산 작제물은 구조 유전자가 세포-주기 특이적 발현 또는 세포- 및 세포 주기-특이적 발현 또는 바이러스- 및 세포 주기-특이적 발현 또는 대사- 및 세포 주기-특이적 발현이 가능하도록 한다. 하나의 바람직한 양태에서, 구조 유전자는 약리학적으로 활성인 물질을 암호화하는 유전자이다. 다른 바람직한 양태에서, 구조 유전자는 약물의 불활성 전구체를 활성 약물로 분해하는(프로약물 에서 약물로) 효소를 암호화한다. 약물에 대한 이러한 약제학적 전구체는 문헌[참조: Sedlacek et al., Contrib. to Oncol. 43, Karger Verlag (1992); Hay et al., Drugs of the Future 21, 917 (1996)]에 기술되어 있다.
활성인자 서열은 유전자의 일부이며 여기에 조절 단백질인 소위 전사 인자가 결합할 수 있고, 이 결합의 결과로써, 하부에 위치하고 있는 구조 유전자의 전사를 활성화시키는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 하부 서열로 언급된 영역은 전사 방향으로 위치하는 영역인 반면 반대 방향으로 배열된 서열은 상부 서열로 언급된다.
본 발명의 한 양태로써, 활성인자 서열은 비-특이적, 세포-특이적, 바이러스-특이적 또는 대사-특이적일 수 있다. 본 명세서에 기술된 바와 같이, 세포-특이적은 활성인자 서열이 주어진 세포내에서 특이적으로 발현되는 단백질을 암호화하는 유전자중에서 선택됨을 의미하며; 바이러스-특이적인은 활성인자 서열이 바이러스 유전자중에서 선택됨을 의미하고; 대사-특이적인은 활성인자 서열이 규정된 대사 조건하에서 특이적으로 발현된 단백질을 암호화하는 유전자중에서 선택됨을 의미한다. 즉, 다른 바람직한 양태에서, 활성인자 서열은 프로모터 또는 내피 세포, 장막 세포, 평활근 세포, 근육 세포, 활액 세포, 조혈 세포, 대식 세포, 임파 세포, 백혈 세포, 종양 세포 또는 케라티노사이트 세포(keratinocyte cell), 신경교 세포내에서 전사를 활성화시키는 프로모터 또는 인핸서의 그룹, 또는 바이러스 HBV, HCV, HSV, HPV, EBV, HTLV, CMV, SV40 또는 HIV의 프로모터 서열 또는 인핸서 서열중에서 선택된다.
세포-특이적인, 바이러스-특이적인 및 대사-특이적인 활성인자 서열의 예는 제WO 96/06940호, 제WO 96/06938호, 제WO96/06941호 및 제WO/05994호에 기술되어 있다. 활성인자 서열은 프로모터 또는 인핸서일 수 있다.
본 발명에 따른 키메라 프로모터 모듈은 E2F군의 단백질 및 CDF-1에 대한 결합 부위를 포함한다. 이러한 프로모터 모듈에 대한 예는 서열 1 및 서열 2이다.
본 발명의 하나의 바람직한 양태로써 이 키메라 프로모터 모듈은 활성화 서열의 하부에 위치한다.
본 발명의 다른 바람직한 양태로써 프로모터 모듈은 제D196.17851.7호에 기술된 기술에 따라 활성인자 서열과 합할 수 있다. 이 특허원에는 몇 개의 프로모터를 합하기 위한 몇몇 실시예가 기술되어 있다. 하나의 예는 활성인자에 관여하는 프로모터 단위이다. 이것은 2개의 상이한 활성인자 소단위인 A 및 B로 이루어진다. A 및 B의 발현 산물은 서로 융합하며 이로써 활성인자에 관여하는 프로모터를 활성화시키는 전사 인자를 형성한다. 활성인자 소단위 A 및 B의 발현은 A에 대한 프로모터 및 B에 대한 프로모터의 조절하에 있다. 이들 프로모터는 동일하거나 상이하다.
본 발명의 다른 바람직한 양태로써, 키메라 프로모터 모듈은 RNA 폴리머라제 III의 프로모터, RNA 폴리머라제 II의 프로모터, CMV 프로모터와 인핸서 및/또는 SV40 프로모터와 같은 비특이적으로 활성화가능한 강력한 프로모터; 또는 바이러스 프로모터 및/또는 HBV, HCV, HSV, HPV, EBV, HTLV 및/또는 HIV의 활성인자 서열과 같은 활성인자 서열; 또는 대사적으로 활성화가능한 프로모터 또는 인핸서 서열(예: 저산소압에 의해 유도될 수 있는 인핸서 또는 프로모터); 또는 기타 세포-주기 특이적인 프로모터(예: cdc25C 유전자, 사이클린 A 유전자, cdc2 유전자, B-myb 유전자, DHFR-유전자 또는 E2F-1 유전자의 프로모터); 또는 테트라사이클린 활성화가능한 프로모터[예: 상응하는 리프레서와의 테트라사이클린 오페레이터(tetracyclin operator)]; 또는 세포-특이적으로 활성화가능한 프로모터를 포함하는 일련의 프로모터중에서 선택된 제 2의 프로모터와 합해질 수 있으며, 이들 프로모터들은 선별된 세포 유형내에서 우세하게 또는 월등하게 발현되는 단백질을 암호화하는 유전자의 활성인자 서열의 상부에 속한다.
본 발명의 핵산 작제물은 유전 공학, 특히 유전자 치료요법에 사용될 수 있다.
유전자 치료요법에서는, 체내에서 발현시킬 유전자를 체내로 도입시킨다. 이들 유전자 발현의 조절은 유전자 치료요법의 치료 효과에 있어 중요하다. 따라서, 본 발명은 또한 유전자 치료요법중에 사용될 수 있는 핵산 작제물에 관한 것이다. 유전자 치료요법에 대한 기술은 당해 분야의 숙련가에게 잘 공지되어 있다. 예를 들어, 제WO93/24640호 및 제WO95/11984호는 비바이러스 또는 바이러스 벡터 기술을 사용한 생체내 유전자 치료요법을 위한 방법 및 조성물을 기술하고 있다. 다른 예로써, 제WO95/06743호에는 치료학적 핵산 작제물을 포함하는 바이러스(AAV) 벡터를 사용한 형질감염을 통해 환자의 분리된 기도 상피 세포내로 치료학적 핵산 작제물을 도입시키는 방법을 기술하고 있다. 다음 이러한 형질전환된 세포를 환자에게 투여한다. 또한, FR 제2735789호는 재조합 아데노바이러스를 함유하는 약제학적 조성물을 기술하고 있다.
본 발명의 작제물용 담체로써 사용될 수 있고 시험관내에서 세포에 적용되거나 환자에게 주입 또는 생체내 적용될 수 있는 각종의 비바이러스 벡터에 대한 기술은 또한 당해 분야의 숙련가에게 잘 공지되어 있다.
하나의 바람직한 양태로써, 핵산 작제물은 하나 이상의 구조 유전자의 세포-특이적인 및 세포 주기-조절된 발현에 사용될 수 있다. 다른 바람직한 양태로써, 핵산 작제물은 하나 이상의 구조 유전자의 바이러스-특이적인 및 세포 주기-조절된 발현에 사용될 수 있다. 또한 다른 바람직한 양태로써, 핵산 작제물은 하나 이상의 구조 유전자의 대사 특이적이고 세포 주기-조절된 발현에 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 핵산 작제물 또는 세포는 바람직하게는 세포 증식이 특징이거나 세포 증식과 관련된 질환의 치료에 사용된다. 이러한 치료는 예를 들면, 상기 핵산 작제물의 표적 세포내로의 도입을 포함한다.
세포 증식이 특징이거나 세포 증식과 관련된 질환의 예는 종양 질환, 백혈병, 심장혈관 질환, 염증 반응, 자가면역 반응, 알레르기, 관절염, 건선, 이식된 기관의 강한 거부반응, CNS 손상, 감염성 질환, 혈액 응괴 질환 및 만성 바이러스 감염이다. 이러한 질환은 본 발명의 작제물 또는 세포를 전신 또는 국소 적용함으로써 치료할 수 있다. 각각의 증식성 세포 집단내 이러한 작제물의 발현은 세포-특이적, 대사-특이적 또는 바이러스-특이적 활성인자 서열 및 세포 주기-특이적 프로모터 모듈에 의해 조절될 수 있다. 본 발명의 작제물의 발현 산물은 세포 증식을 직접 또는 간접적으로 억제하거나 증식하고 있는 세포를 사멸시킨다.
작제물의 구조 측면에서, 이것은 세포 증식 단계동안에 발현될 수 있다.
기타 질환의 치료를 위해서는, 본 발명에 따른 핵산 작제물 또는 세포내 활성 물질에 대한 활성인자 서열 및 구조 유전자를 사용 목적에 따라 선택한다.
일반적으로, 구조 유전자는 사이토킨, 성장 인자, 사이토킨 수용체, 성장 인자 수용체, 증식 억제 효과를 갖는 단백질, 아폽토시스 효과(apoptotic effect)를 갖는 단백질, 세포성색전 효과를 갖는 단백질, 세포독성 효과를 갖는 단백질, 염증 효과를 갖는 단백질, 소염 효과를 갖는 단백질, 면역억제 효과를 갖는 단백질, 항체, 항체 단편, 맥관 형성 억제제, 응집 인자, 피브린분해 화합물 및 응고억제제, 혈액 단백질, 바이러스 항원, 세균 항원 및 종양 항원, 및 성장 인자, 사이토킨 또는 항체와 같은 리간드와 상술한 물질중 하나사이의 융합 단백질로 이루어진 그룹중에서 선택된 물질을 암호화한다.
이와 관련하여, 본 발명은 다음의 작제물과 치료 방법을 포함한다.
1. 내피 세포 증식의 억제를 통한 종양 및 만성 염증 반응의 치료요법
종양 및 만성 염증반응은 내피 세포의 증식에 의한 새로운 혈관의 형성에 의해 특성화된다. 하나의 양태로써, 이렇게 증식하는 내피 세포는 본 발명의 작제물에 의해 형질도입(tranduction)되어 내피 세포의 증식을 직접 또는 간접적으로 억제하고/하거나 증식하는 내피 세포 및 인접하고 있는 종양 세포를 사멸시키는 표적 세포이다.
1.1 내피 세포내에서 활성화된 활성인자 서열
하나의 양태로써, 내피 세포내에서 활성화된 활성인자 서열은 특히 내피 세포내에서 검출가능한 단백질을 암호화하는 유전자에 대한 프로모터로부터의 유전자-조절 서열 및 성분을 포함한다. 이들 내피 세포-특이적인 단백질과 이들 유전자의 프로모터 서열의 예는 제WO96/06941호에 기술되어 있다.
이들 프로모터에는 뇌-특이적인 내피세포 글루코즈-1 트랜스포터(transporter), 엔도글린, VEGF 수용체-1(flt-1), VEGF 수용체-2(flk-1, KDR), tie-1 또는 tie-2, B61 수용체(Eck-receptor), B61, 엔도텔린(예: 엔도텔린 B 또는 엔도텔린-1), 엔도텔린 수용체, 특히 엔도텔린 B 수용체, 만노즈-6-포스페이트 수용체, 폰 빌레브란트 인자(von Willebrand factor), IL-1α, IL-1β, IL-1 수용체, 혈관 세포 부착 분자(VCAM-1)을 암호화하는 유전자의 프로모터 또는 활성인자 서열 및 합성 활성인자 서열, 즉 전사 인자 GATA-2에 결합하는 5'-TTATCT-3'를 포함하는 활성인자 서열이 포함된다.
1.2 활성화된 내피 세포에 인접한 세포내에서 활성화된 활성인자 서열
내피 세포가 증식하는 경우, 인접하고 있는 세포는 강력한 연결(tight junction)으로 인하여 혈액으로부터 거대 분자를 수용할 수 있게 된다. 이들 작용적 및 해부학적 상관관계는 활성화된 내피 세포에 인접한 세포가 본 발명의 목적을 위한 표적 세포임을 의미한다. 인접한 세포내중에서 활성화되는 활성인자 서열에 대한 예는 제WO96/06940호에 기술되어 있다.
이들 활성인자 서열 또는 프로모터에는 VEGF를 암호화하는 유전자에 대한 프로모터 또는 활성인자 서열이 속한다. VEGF 유전자에 대한 유전자 조절 서열은 5' 플랭킹 영역 또는 3' 플랭킹 영역, 또는 c-Src 유전자 또는 v-Src 유전자이다.
다른 예는 스테로이드 호르몬 수용체 및 이들의 프로모터 성분[참조: Truss and Beato, Enocrin. Rev. 14, 459 (1993)], 특히 마우스 유방 종양 바이러스 프로모터이다.
1.3 종양억제 또는 소염 활성 물질에 대한 구조 유전자
소염 물질은 다음 특성중 하나 이상을 가질 수 있다: 내피 세포 증식의 억제, 맥관형성의 억제, 혈전의 형성, 세포성색전 또는 세포독성 특성, 아폽토시스를 유발시키는 능력 또는 프로드럭을 세포독성의 활성 약물로 전환시키는 능력, 세포성색전 특성 또는 소염 특성. 본원에 사용된 것으로서 종양억제 물질은 앞서의 특성중 하나 이상을 가질 수 있다. 또한, 종양억제 물질은 염증을 유발시키는 물질일 수 있다. 이들 물질 및 이들의 유전자의 예는 제WO96/06940호, 제WO96/06941호 및 제D19617851.7호에 기술되어 있다.
이들 물질을 암호화하는 유전자는 예를 들면, 세포 증식 억제제용, 즉 망막아종 단백질(pRb=110) 및 관련된 p107과 p130 단백질, p53 단백질, p21 (WAF-1) 단백질, p16 단백질, 기타 cdk-억제제, GADD45 단백질 또는 bak 단백질용 구조 유전자이다. 망막아종 단백질(pRb=10) 및 관련된 p107과 p130 단백질은 포스포릴화에 의해 불활성화되며, 바람직하게는 발현된 단백질의 불활성화 부위에 대한 돌연변이를 포함하나 이들 억제제의 작용에 영향을 미치지 않는 세포-주기 억제제의 유전자이다.
기타 예에는 혈전 유발 인자 및/또는 맥관형성의 억제제, 즉 플라스미노겐 활성인자 억제제-1(PAI-1), PAI-2, PAI-3, 안지오스타틴(angiostatin), 인터페론[예: IFNα, IFNβ 및 IFNγ], 혈소판 인자 4, IL-12, TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3, 백혈병 억제 인자(LIF) 또는 조직 인자(TF)의 구조 유전자 및 이의 활성 단편이 있다.
추가의 예로는 세포성색전 또는 세포독성 단백질, 즉 퍼포린(perforin), 그렌자임(granzym), IL-2, IL-4, IL-12, 인터페론(예: IFNα, IFNβ 및 INFγ), TNF, TNFα, TNFβ, 온코스타틴 M, 스핀고마이엘리나제 또는 마가이닌(magainin) 및 마가이닌 유도체용 구조 유전자가 있다.
1.4 세포성색전 또는 세포독성 항체, 항체 단편 및 항원 결합 항체 또는 항체 단편과 세포성색전, 세포독성 또는 염증 단백질 또는 효소간의 융합 단백질용 구조 유전자
내피 세포상에서 또는 종양 세포 또는 백혈구 세포상에서 막 구조물에 대해 지시된 것들이 세포성색전 또는 세포독성 항체에 속한다. 이러한 항체는 문헌[참조: Sedlacek et al., Contrib. to Oncol. 32, Karger Verlag, Munchen (1988) und Contrib. to Oncol. 43, Karger Verlag, Munchen (1992)]에 기술되어 있다. 기타의 예로는 시알릴 루이스에 대해 특이적인 항체, T-임파세포에 의해 인지된 종양상에서의 펩타이드, 종양유전자(oncogene)에 의해 발현된 단백질, 강글리오사이드(예: GD3, GD2, GM 및 9-0 아세틸 GD3), 퓨코실 GM1, 혈액 그룹 항원 및 이들의 전구체, 다형성 내피 뮤친상에서의 항원, 열 쇽 단백질상에서의 항원 또는 CD13, CD15, CD33, CAMAL, CD5, CD1c, CD23, 막 면역글로불린의 유전자형 및 동형, CD33, M38, IL-2 수용체, T-세포 수용체, CALLA, CD19 또는 비-호지킨(Non-Hodgkin) 림프종이 있다.
1.5 표적 세포 결합 리간드와 세포성색전 또는 세포독성 단백질이나 효소간의 융합 단백질용 구조 유전자
이러한 리간드에는 내피 세포의 세포막에 결합하는 모든 단백질, 즉 성장 인자 또는 PDGF, bFGF, VEGF, TGFβ와 같은 성장 인자의 단편이 속한다. 더욱이, 이러한 리간드에는 활성화되고/되거나 증식하는 내피 세포에 결합하는 부착 분자, 즉 Slex, LFA-1, MAC-1, LECAM-1, VLA-4 또는 비트로넥틴이 속한다. 또한 이러한 리간드에는 세포막 또는 종양이나 백혈병 세포의 막 수용체에 결합하는 화합물, 즉 성장 인자 또는 성장 인자의 단편이 속한다. 이러한 성장 인자는 이미 문헌[참조: Cross et al., Cell 64, 271 (1991), Aulitzky et al., Drugs 48, 667 (1994), Moore, Clin. Cancer Res. 1, 3 (1995), Van Kooten et al., Leuk. Lymph. 12, 27 (1993)]에 기술되어 있다.
1.6 염증 유발인자용 구조 유전자
염증 유발인자용 구조 유전자에는 RANTES(MCP-2), 단핵세포 화학주성 및 활성화 인자(MCAF), IL-8, 대식구 염증 단백질-1(MIP-1, -β), 호중구 활성화 단백질-2(NAP-2), IL-3, IL-5, 사람 백혈병 억제 인자(LIF), L-7, IL-11, IL-13, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, 코브라 독 인자(CVF) 또는 사람 상보체 인자 C3b, 사람 상보체 인자 C3 또는 C3b의 서열에 작용적으로 상응하는 CVF의 서열, CVF와 작용적 및 구조적으로 유사한 사람 보체 인자 C3 또는 보체를 활성화시키거나 염증을 유발하는 세균 단백질[예: 살모넬라 타이피무리움(Salmonella typhimurium)의 포린(porins)], 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 클럼핑(clumping) 인자, 그람-음성 세균의 모듈린, 레지오넬라(legionella) 또는 헤모필리우스 인플루엔자(haemophilius influenza) B형 또는 클레브시엘라(Klebsiella)의 주요 외막 단백질 또는 스트렙토코코스 그룹 G의 M-분자가 속한다.
1.7 프로드럭을 약물로 전환시키는 효소용 구조 유전자
프로드럭을 활성의 세포성색전으로 전환시키거나 분해하는 효소용 구조 유전자에는 예를 들면, 헤르페스 단성 바이러스 티미딘키나제, 바리젤라 조스터 바이러스 티미딘키나제, 세균 니트로리덕타제, 세균 β-글루쿠로니다제, 호밀의 β-글루쿠로니다제, 사람 β-글루쿠로니다제, 사람 카복시 펩티다제(CB)(예: 유방 세포의 CB-A 및 췌장의 CB-B), 세균 카복시 펩티다제, 세균 β-락타마제, 세균 사이토신 디아미나제, 포스파타제(예: 사람 알칼린 포스파타제, 사람 산 프로스타타 포스파타제, 5형 산 포스파타제), 옥시다제(예: 사람 라이실 옥시다제), 사람 산 D-아미노 옥시다셈, 퍼옥시다제(예: 사람 글루타티온 퍼옥시다제, 사람 에오시노필 퍼옥시다제 및 사람 티로이달 퍼옥시다제) 또는 갈락토시다제가 속한다.
2. 혈액 세포의 결핍된 생산의 치료용 활성 물질
2.1 조혈 세포용 활성인자 서열의 선택
조혈 세포용으로 사용된 활성인자 서열은 유전자-조절 서열 또는 조혈 세포내에서 특히 강력하게 또는 선택적으로 암호화된 단백질을 암호화하는 유전자의 성분일 수 있다. 이러한 유형의 유전자-조절 서열은 사이토킨 또는 이의 수용체의 유전자에 대한 프로모터 서열 또는 이의 수용체를 포함하며, 예를 들어, 골수의 기질 세포와 같은 미성숙한 조혈 세포 또는 인접 세포 내에서의 이의 발현은 활성 물질로서 요구되며 조혈 세포상에서 작용하는 연속된 사이토킨의 앞쪽에 존재한다. 미성숙한 조혈 세포상에서 작용하는 이러한 유형의 사이토킨은 예를 들면, 간 세포 인자, IL-1, IL-3, IL-6, GM-CSF 또는 트롬보사이토포이에틴(thrombocytopoietin) 또는 이들 사이토킨에 대한 수용체이다. 이들 사이토킨에 대해서는 제WO96/06941호를 참조한다. 이들 활성인자 서열에는 예를 들면 간 세포 인자 수용체, 간 세포 인자, IL-1α, IL-1 수용체, IL-3, IL-3 수용체(α-소단위), IL-3 수용체(β-소단위), IL-6, IL-6 수용체, GM-CSF, GM-CSF 수용체(α-쇄), 인터페론 조절 인자 1(IRF-1), 에리트로포이에틴 또는 에리트로포이에틴 수용체가 속한다.
다른 양태에서, 활성인자 서열은 대사 특이적일 수 있다. 대사(즉, 저산소압에 의해) 활성화된 활성인자 서열의 예는 문헌[참조: Semenza et al., PNAS 88, 5680 (1991) 또는 Mc Burney et al., Nucl. Acids Res. 19, 5755 (1991)]에 기술되어 있다.
2.2 조혈 세포용 활성 물질에 대한 구조 유전자의 선택
조혈 세포용 활성 물질은 일반적으로 혈액 세포를 증식 및/또는 분화시키는 단백질을 의미한다. 이러한 물질용 유전자의 예는 제WO/06941호에 나열되어 있다. 이에는 빈혈 치료요법용 구조 유전자(예: 에리트로포이에틴), 백혈구감소증 치료용 구조 유전자(예: G-CSF 및 GM-CSF용 구조 유전자), 트롬보자이토페니아(thrombozytopenia) 치료용 구조 유전자[예: IL-3, 백혈병 억제 인자(LIF), IL-11 또는 트롬보포이에틴용 구조 유전자]가 속한다.
3. 자가 면역 질환, 알레르기 및 염증의 치료요법 및 기관 거부 예방용 활성 물질
3.1 활성인자 서열의 선택
사용가능한 활성인자 서열은 대식세포 또는 임파세포내에서 강력하게 활성화된 유전자 또는 대식세포 및/또는 임파세포내 면역 반응동안에 집중적으로 생성된 단백질용 유전자의 프로모터 서열이다. 이러한 단백질을 암호화하는 유전자의 프로모터 서열의 예는 제WO96/06941호에 기술되어 있다. 이러한 단백질에는 IL-1 수용체, IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-2 수용체, IL-3, IL-3 수용체(α-소단위), IL-3 수용체(β-소단위), IL-4, IL-4 수용체, IL-5, IL-6, 인터페론 조절 인자 1(IRF-1), IFN 반응성 프로모터, IL-7, IL-8, IL-10, IL-11, IFN, GM-CSF, GM-CSF 수용체(α-쇄), IL-13, LIF, 대식세포 콜로니 자극 인자(M-CSF) 수용체, I형 및 II형 대식세포 스캐빈저(scavenger) 수용체, MAC-1(백혈구 작용 항원), LFA-1α(백혈구 작용 항원) 또는 p150,95(백혈구 작용 항원)가 속한다.
3.2 활성 물질용 유전자의 선택
이러한 목적을 위한 활성 물질은 사이토킨, 케모킨, 성장 인자 또는 이들 억제제중 하나, 사이토킨 또는 성장 인자에 대한 수용체의 세포외 부위, 항체, 항체 단편, 효소 억제제 또는 효소에 대한 DNA 서열일 수 있다. 활성 물질의 선택은 치료될 기본 질환 및 선택된 프로모터 서열에 따른다. 자가면역 질환, 알레르기, 염증 치료용 또는 기관 거부 예방용으로 적합한 구조 유전자의 선택의 예는 제WO96/06941호에 기술되어 있다. 이들 예에는 예를 들면 알레르기 치료요법용 구조 유전자, 즉 IFNβ, IFNγ, IL-10, IL-4에 특이적인 항체 또는 항체 단편, 가용성 IL-4 수용체, IL-12 또는 TGFβ를 암호화하는 구조 유전자가 속한다.
이식된 기관의 거부를 예방하는 구조 유전자는 예를 들면, IL-10, TGFβ, 가용성 IL-1 수용체, 가용성 IL-2 수용체, IL-1 수용체 길항제, 가용성 IL-6 수용체, 면역 억제성 항체 또는 이들 항체의 VH 및 VL 단편 또는 링커에 의해 접합된 VH 및 VL 단편을 포함하는 단편을 암호화한다. 항체는 T-세포 수용체 또는 이의 CD3 복합체에 대해, CD4 또는 CD8에 대해, IL-2 수용체, IL-1 수용체 또는 IL-4 수용체에 대해 또는 부착 분자 CD2, LFA-1, CD28 또는 CD40에 대해 특이적이다.
항체-중재된 자가면역 질환 치료요법용 구조 유전자는 예를 들면, TGFβ, IFNα, IFNβ, IFNγ, IL-12, 가용성 IL-4 수용체, 가용성 IL-6 수용체 또는 면역 억제성 항체 또는 이들의 VH 및 VL 함유 단편을 암호화한다.
세포-중재된 자가면역 질환 치료요법용 구조 유전자는 예를 들면, IL-6, IL-9, IL-10, IL-13, TNFα, IL-4, TNFβ 또는 면역 억제성 항체 또는 이의 VH 및 VL 함유 단편을 암호화한다.
세포 증식, 세포성색전 또는 세포독성 단백질의 억제제 또는 프로드럭의 세포성색전제 또는 융합 단백질로의 전환 또는 활성용 효소를 암호화하는 구조 유전자는 종양 치료요법용 구조 유전자와 동일할 수 있다.
4. 관절염 치료용 활성 물질
4.1 관절염용 활성인자 서열의 선택
활성인자 서열은 일반적으로 전사 인자가 형성되거나 예를 들면, 활액 세포 및 염증 세포내에서 활성적으로 상호작용하는 프로모터 또는 인핸서 서열을 의미한다. 본 발명의 목적을 위하여, 바람직한 프로모터 서열은 유전자-조절 서열 및 활액 세포 및 염증 세포내에서 특히 발현되는 단백질을 암호화하는 유전자를 형성하는 유전자-조절 서열 및 성분을 포함한다. 이러한 단백질의 예는 제WO96/06941호에 요약되어 있다. 이들 단백질에는 예를 들면, MMP-1(장 콜라게나제), MMP-3(스트로멜라이신/트랜신) 또는 메탈로 프로테이나제(TIMP)의 조직 억제제(예: TIMP-1, TIMP-2 또는 TIMP-3)이 속한다.
4.2 관절염용 활성 물질에 대한 구조 유전자의 선택
이러한 목적용 활성 물질은 이로부터 발현된 단백질이 예를 들면, 관절내에서 염증을 직접 또는 간접적으로 억제하고/하거나 관절내에서 연골과 같은 세포외 매트릭스 및/또는 연결 조직의 재구성을 촉진하는 DNA 서열을 의미한다. 이러한 단백질의 예는 제WO96/06941호에 제공되어 있다. 이들 단백질에는 예를 들면, IL-1 수용체 길항제, 가용성 IL-1 수용체, IL-6, 가용성 TNF 수용체, IL-4, IL-10, 인슐린형 성장 인자, TGFβ, 슈퍼옥사이드디스뮤타제 또는 TIMP(예: TIMP-1, TIMP-2 또는 TIMP-3)이 속한다.
5. 감염억제 물질
일반적으로, 활성 물질은 2개의 기본적으로 상이한 형태로 제조될 수 있다: 바이러스 감염 및 기생충에 의한 침입의 치료요법용 또는 바이러스, 세균 또는 기생충에 기인한 감염성 질환의 예방용. 백신은 일반적으로 감염성 질환의 예방용으로 사용된다. 그러나, 통상의 방법으로 효과적인 백신을 제조할 수 있는 가능성은 제한되어 진다. 따라서, DNA 백신 기술이 개발되어지고 있다. 그러나, 이들 DNA 백신은 안정성 및 부작용에 관한 문제를 유발한다[참조: Fynan et al., Int. J. Immunopharm. 17. 79 (1995); Donnelly et al., Immunol. 2, 20 (1994)]. 하기의 감염성 질환의 예방용 작제물은 이들의 세포 특이성 및 이들 물질의 높은 안정도를 제공하는 세포 주기 조절로 인하여 선행 분야의 물질과 구별된다.
5.1 활성인자 서열의 선택
5.1.1 감염성 질환의 치료요법
감염성 질환 치료요법용으로 선택될 수 있는 활성인자 서열은 이의 활성이 특히 세균 또는 기생충 감염에 의해 변경되는 세포 유전자로부터의 프로모터 서열 또는 바이러스에 의해 감염된 세포를 형질전환시키거나 증식을 자극하는 바이러스로부터의 프로모터 서열을 포함한다. 이들 바이러스는 예를 들면, HBV, HCV, HSV, HPV, HIV, EBV 및 HTLV를 포함한다. 이들 활성인자 서열의 예는 제WO96/06941호에 기술되어 있다.
5.1.2 감염성 질환의 예방
감염성 질환을 예방하기 위해 선택될 수 있는 활성인자 서열은 일반적으로 내피 세포, 근육 세포, 임파세포 또는 대식세포내에서 강력하게 활성이거나 내피 세포, 근육 세포, 거대세포 또는 임파세포중에서 고도로 발현되는 단백질을 암호화하는 세포 유전자에 속하는 프로모터 서열을 포함한다.
이들 활성화 서열의 예는 앞서의 단락 및 이어지는 단락에서 제공된다.
5.2 활성 물질용 구조 유전자의 선택
5.2.1 감염성 질환의 치료요법
선택될 수 있는 활성 물질은 세포성색전, 세포독성, 세균억제 또는 바이러스억제 효과를 갖는 단백질용 DNA이거나 불활성 전구체를 세포성색전, 세포독성, 세균억제 또는 바이러스억제 약물로 전환시키는 효소일 수 있다. 세포독성 또는 세포성색전 단백질 및 사이토킨과 바이러스억제 활성을 갖는 성장 인자의 예는 제WO96/06941호에 기술되어 있다. 이들 물질에는 예를 들면, 바이러스억제 활성 사이토킨 및 성장 인자(예: IFNα, IFNβ, IFNγ, TNFα, TNFα, IL-1 또는 TGFβ)가 속한다. 다른 예는 특이적인 바이러스를 불활성화시키는 항체 또는 이의 VH 및 VL 함유 단편이나 링커에 의해 접합된 이들의 VH 및 VL 단편이 속한다. 바이러스억제 항체의 예는 HBV, HCV, HSV, HPV, HIV, EBV, HTLV, 콕사키 바이러스(Coxsackie virus) 또는 한탄 바이러스(Hantaan virus)에 특이적인 항체이다. 추가의 예는 rev. 결합 단백질, 즉 RBP9-27, PBP1-8U, PBP1-8D 또는 RBP1-8의 슈도유전자(pseudogene)이다.
이들 물질에는 또한 예를 들면 세포-주기 조절 단백질용 유전자의 mRNA 또는 각각의 바이러스의 mRNA 또는 세균억제 단백질용 구조 유전자, 즉 세균 독소를 중화시키거나 세균을 옵소닌화(opsonize)하는 항체, 즉 메닝고코쿠스(meningococcus) C 또는 B, 이. 콜라이, 보렐리아(borrelia), 슈도모나스(pseudomonas), 헬리코박터 피롤리(Helicobacter pylori) 또는 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)에 대해 특이적인 항체가 속한다.
항체 또는 항체 단편은 세균억제 또는 바이러스억제 단백질의 예이다. 상술한 바와 같이, 일부 물질의 경우, 활성 형태로 전구체의 효소적 전환이 요구될 수 있다. 이러한 경우, 세균억제, 바이러스억제, 세포독성 또는 기생충억제 물질이 본 발명에 따른 작제물이 투여된 후에 가해진다. 이러한 프로드럭을 전환시키는 효소 및 이러한 효소에 대한 유전자의 예는 제WO96/06940호 및 제WO96/06941호 및 선행 단락에 기술되어 있다.
5.2.2. 감염성 질환의 예방
한 양태에서, 활성 물질은 병원체에 대해 특이적인 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 다른 양태에서, 활성 물질은 병원체에 의해 형성되고 면역 반응을 통하여, 즉 항체 결합 및/또는 세포독성 임파세포에 의해 병원체를 중화시키고/시키거나 사멸시키는 단백질일 수 있다. 이러한 유형의 중화 항원은 이미 면역화 항원으로서 사용되고 있다[참조: Ellis, Adv. Exp. Med. Biol. 327, 263 (1992)]. 이러한 단백질을 암호화하는 DNA 서열은 본 발명에 따른 작제물을 제조하는데 사용된다. 이들 유전자의 예는 제WO096/06941호에 기술되어 있는데, 예를 들면, 인플루엔자 A 바이러스 항원, HIV 항원, 래비스 바이러스 항원, HSV(헤르페스 단성 바이러스) 항원, RSV(호흡기 합포체 바이러스) 항원, 파라인플루엔자 바이러스 항원, 로타바이러스 항원, VZV[바리젤라 조스터 바이러스(varizella zoster virus)] 항원, CMV[사이토메갈로 바이러스(cytomegalo virus)] 항원, 마진 바이러스 항원, HPV[사람 파필로마 바이러스(human papilloma virus)] 항원, HBV(B형 간염 바이러스) 항원, HCV(C형 간염 바이러스), HDV(D형 간염 바이러스) 항원, HEV(E형 간염 바이러스) 항원, HAV(A형 간염 바이러스) 항원, 비브리오 콜레라 항원, 보렐리아 부륵도르페리(borrelia Burgdorferi) 항원, 헬리코박터 피롤리 항원, 말라리아 항원 또는 항유전형 항체 또는 이의 항체 결합 단편, 단백질의 카피물인 상보성 결정화 영역 또는 감염성 유기체의 중화 항원의 탄수화물 구조물이다.
6. 백혈병 및 종양 치료용 활성 물질
6.1 백혈병 및 종양에 대한 활성인자 서열의 선택
제공된 활성인자 서열은 백혈병 세포 또는 종양 세포내에서 형성되거나 활성인 전사 인자가 상호작용하는 프로모터 또는 인핸서 서열일 수 있다. 그러나, 본 발명의 목적을 위한 바람직한 활성인자 서열은 유전자-조절 서열 및 특히 종양 세포 또는 백혈병 세포내에서 형성된 단백질을 암호화하는 유전자 성분을 포함한다. 이의 예가 제WO96/06941호에 인용되어 있는데, 즉 c-myc, HPS-70, bcl-1/사이클린 D-1, bcl-2, IL-6, IL-10, NFα, TNFβ, HOX-11, BCR-Ab1, E2A-PBX-1, PML-RATA(프로골수종 백혈병-레티노산 수용체), c-myc, N-CAM-단백질, 간염 성장 인자 수용체, L-플라스틴 또는 다형성 내피 뮤친(PEM)이다.
6.2 백혈병 및 종양 세포용 활성 물질에 대한 구조 유전자의 선택
이러한 목적을 위한 활성 물질은 세포, 특히 종양 세포 또는 백혈병 세포의 증식을 억제하는 단백질을 의미한다. 이들 세포 증식 억제제는 예를 들면, 억제, 세포성색전, 아폽토시스 및 세포독성 단백질에 대한 DNA 서열 및 이미 기술되어 있는 프로드럭의 분해용 효소를 포함한다.
또한 세포 증식 억제제는 백혈병 또는 종양에서 세포성색전 또는 세포독성 효과를 직접 또는 간접적으로 갖는 단백질을 발현하는 DNA 서열을 의미한다. 이러한 단백질은 이미 선행 단락에 기술되어 있다. 이러한 단백질을 암호화하는 DNA 서열은 본 발명에 따른 작제물을 제조하는데 사용될 수 있다.
또한 세포 증식 억제제는 일반적으로 종양에 대해 세포독성 또는 세포성색전성 체액 반응 또는 세포 면역 반응을 유발하는 단백질 또는 펩타이드를 암호화하는 DNA 서열을 의미한다. 이러한 단백질 또는 펩타이드에는 종양 백신용 구조 유전자 및 종양 세포상에서의 항원이 속한다. 이러한 항원의 예는 문헌[참조: Sedlacek et al., Contrib. to Oncol. 32, Karger Verlag, Munchen (1988) and Contrib. to Oncol. 43, Karger Verlag, Munchen (1992)]에서 찾을 수 잇다. 추가의 예는 시알릴 루이스(Sialyl Lewis)에 대한 항원 또는 이를 암호화하는 유전자, T-세포에 의해 인지가능한 종양 세포상의 펩타이드, 종양유전자에 의해 발현된 단백질, 혈액 그룹 항원 및 이들의 전구체, 다형성 내피 뮤친의 항원 또는 열 쇽 단백질의 항원이다.
7. 혈관 폐쇄에 있어서 평활근 세포의 증식을 억제하는 활성 물질
7.1 평활근 세포용 활성인자 서열의 선택
하나의 양태로써, 활성인자 서열은 유전자-조절 서열 또는 평활근 세포내에서 특별히 형성된 단백질을 암호화하는 유전자의 성분일 수 있다. 이러한 단백질을 암호화하는 유전자의 프로모터의 예는 제WO96/06938호 및 제WO96/06940호에 기술되어 있다. 이들에는 트로포마이오신, α-액틴, α-마이오신, PDGF에 대한 수용체, FGF, MRF-4, 포스포프럭토키나제 A, 트로포닌 C 및 마이오게닌에 대한 수용체, 엔도텔린 A, 데스민, VEGF 또는 인공 프로모터에 대한 수용체가 속한다.
또한, 헬릭스-루프-헬릭스(Helix-Loop-Helix: HLH) 군(MyoD, Myf-5, 마이오겐 MRF4) 및 징크핑거 단백질(Zinkfinger protein) GATA-4의 인자는 근육-특이적인 전사 활성인자인 것으로 기술되어 있다. HLH 단백질 및 GATA-4는 근육-특이적인 유전자의 프로모터를 사용할 뿐만 아니라 이종 관계에 있어서, 즉 인공 프로모터를 사용하는 근육-특이적인 전사를 나타낸다. 이러한 인공 프로모터는 예를 들면 5'-AGCAGGTGTTGGGAGGC-3'(서열 3)의 다수 카피물(즉, 4개) 또는 5'-GGCCGATGGGCAGATAGAGGGGGCCGATGGGCAGATAGAGG-3'(서열 4)의 다수 카피물이다.
7.2 평활근 세포용 활성 물질에 대한 구조 유전자의 선택
이러한 목적의 활성 물질은 일반적으로 평활근 세포의 증식을 억제하는 단백질을 의미한다. 증식 억제제의 예는 앞서 단락에 이미 기술되어 있다.
8. 응집을 억제 또는 활성화하는 활성 물질
8.1 응집을 억제하거나 활성화하는 활성인자 서열의 선택
본 목적에 사용될 활성인자 서열은 일반적으로 평활근 세포, 활성화된 내피 세포, 활성화된 대식세포 또는 활성화된 임파세포내에서 검출가능한 단백질을 암호화하는 유전자의 성분 또는 유전자-조절 서열일 수 있다.
8.1.1 평활근 세포
평활근 세포내 유전자에 대한 프로모터 서열의 예는 제WO96/06938호 및 앞서의 단락에 이미 언급되어 있다.
8.1.2 활성화된 내피 세포 또는 활성화된 내피 세포에 인접한 세포
활성화된 내피 세포내에서 특별히 형성되는 단백질의 예는 제WO96/06938호 및 제WO96/06940호에 기술되어 있다.
8.1.3 활성화된 대식세포 및/또는 활성화된 임파세포
본 목적을 위한 활성인자 서열은 일반적으로 대식세포 및/또는 임파세포내 면역 반응동안에 집중적으로 형성되는 단백질을 암호화하는 유전자로부터의 프로모터 서열을 의미한다. 이들의 예는 제WO96/06941호 및 제WO96/06938호와 선행 단락에 이미 기술되어 있다.
8.2 응집의 억제 또는 활성화, 또는 심장혈관계 조절용 활성 물질에 대한 구조 유전자의 선택
하나의 양태로써, 본 목적에 사용될 활성 물질은 혈소판 응집 또는 응집 인자를 직접 또는 간접적으로 억제하거나 피브린분해를 자극하는 단백질일 수 있다. 따라서, 이러한 유형의 활성 물질은 응집억제제로서 불리어진다. 사용될 응집억제제는 예를 들면, 플라스미노겐 활성인자(PA), 즉 조직 PA(tPA) 또는 유로키나제형 PA(uPA), 또는 tPA와 uPA의 하이브리드, 또는 단백질 C, 항트롬빈 III, C-1S 억제제, α1 안티트립신, 조직 인자 경로 억제제(TFPI) 또는 히루딘에 대한 유전자이다.
다른 양태로써, 본 목적에 사용될 활성 물질은 또한 혈액 응고를 촉진하는 단백질일 수 있다. 이러한 단백질의 예는 예를 들면, 인자 VIII, 인자 IX, 폰 빌레브란트 인자, F XIII, PAI-1 또는 PAI-2와 같은 혈액 혈장 단백질이다.
제3의 양태로써, 이러한 목적에 사용될 활성 물질은 또한 맥관형성을 유도하거나 혈압을 강하시킴에 의해 심장혈관계를 조절하는 단백질일 수 있다. 이러한 단백질을 암호화하는 유전자의 예는 맥관형성 인자, 즉 VEGF 또는 FGF, 또는 혈압을 강하시키는 펩타이드, 즉 칼리크레인(Kallikrein) 또는 내피 세포 산화 질소 신타제(nitric oxide synthase)이다.
추가의 양태로써, 본 목적에 사용될 활성 물질은 혈액 단백질을 암호화하는 유전자일 수 있다. 이러한 혈액 단백질의 예는 알부민, C1-불활성화제, 혈청 콜린스테라제, 트랜스페린 또는 1-안티트립신이다.
9. CNS 손상 보호용 활성 물질
9.1 CNS 손상 보호용 활성 물질에 대한 활성인자 서열
9.1.1 내피 세포내에서 활성화된 활성인자 서열
하나의 양태로써, 이러한 활성인자의 유형은 내피 세포에 대해 특이적인 단백질 유전자용 프로모터 서열을 포함할 수 있다. 이러한 프로모터 서열의 예는 제WO96/06939호에 나열되어 있으며 이미 앞서의 단락에 기술되어 있다.
9.1.2 신경교 세포내에서 활성화된 활성인자 서열
하나의 바람직한 활성인자 서열은 신경교 세포내에서 형성되거나 특수한 정도로 활성인 전사 인자와 상호작용하는 프로모터 또는 인핸서 서열이다. 이러한 활성인자 서열의 예는 제WO96/06939호에 나열되어 있다. 이들 중에는 슈완 세포(Schwann cell)-특이적인 단백질 페리악신, 글루타민신테타제, 활액 세포-특이적인 단백질(신경교 원섬유성 산성 단백질 = GFAP), 신경교 세포 단백질 S100b, IL-6(CNTF), 5-HT-수용체, TNFα, IL-10, 인슐린형 성장 인자 수용체 I 및 II 또는 VEGF를 암호화하는 유전자의 프로모터가 속한다.
9.2 신경 특이적인 인자에 대한 구조 유전자의 선택
본 발명의 목적을 위한 신경 특이적인 인자는 뉴우런 성장 인자 또는 TNFα의 억제제 또는 저해제를 암호화하는 DNA 서열일 수 있다. 이들 유전자의 예는 제WO96/06939호에 나열되어 있다. 이에는 FGF, 신경 성장 인자(NGF), 뇌-기원한 향신경성 인자(BDNF), 뉴로트로핀-3(neurotrophin-3: NT-3), 뉴로트로핀-4(NT-4), 향신경성 섬모 인자(CNTF), TGFβ, 가용성 TNF 수용체, IL-10, IL-10 억제제, 가용성 IL-1 수용체, IL-1 수용체 I, IL-1 수용체 II, IL-1 수용체 길항제 또는 가용성 IL-6 수용체가 속한다.
본 발명에 따른 작제물은 바람직하게는 손상된 조직내로, 손상된 신경의 부위내로 또는 척수내로 또는 뇌내로 적용되거나 주입되어 내피 세포 또는 신경교 세포를 형질도입시킴으로써 치료학적 단백질을 발현시킨다.
10. 치료학적 용도
예로써 상술한 단락에 기술된 작제물은 질환, 예를 들면 종양, 백혈병, 염증 질환, 과도한 내피 세포 증식이 특징인 질환, 혈액 세포의 생성 부족, 자가면역 질환, 알레르기, 이식된 기관의 강력한 거부, 관절염, 감염, 응집 질환 또는 CNS 손상의 치료가 요구되는 환자에게 투여될 수 있다.
투여를 위해, 기술된 작제물은 당해 분야의 숙련가에게 잘 공지된 기술에 따라 플라스미드 벡터 또는 바이러스 벡터내로 삽입시킬 수 있다. 이 벡터는 환자에게 국소적으로 적용시키거나 심장혈관계에, 흉막내, 복강내, 뇌척수내, 방광내, 기관지내 또는 위장내 주사하거나 상이한 조직 또는 기관중 하나에 주입할 수 있다.
작제물의 구조 유전자가 무독성, 비효과적인 프로드럭을 효과적인 약물로 분해하거나 전환시키는 효소를 암호화하는 경우에 이러한 프로드럭을 환자에게 적용한 후 본 발명의 작제물을 주사할 수 있다.
본 발명을 하기 실시예 및 나열하는 표로서 상세히 설명하나 이것이 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
표에 대한 설명
표 1
cdc25C CHR의 구조-작용 분석. CHR 영역내 cdc25C 프로모터 작제물[C290기준; Zwicker et al., EMBO J. 14, 4514 (1995) 참조] 돌연변이를 NIH3T3 세포내 세포 주기 조절에 대해 분석한다. -16 내지 -12 위치는 이미 정의된 CDE를 나타낸다[참조: Zwicker et al. EMBO J. 14, 4514 (1995)]. 일시적인 루시퍼라제 검정 결과는 휴지기 세포내 활성에 대해 성장하는 세포를 사용하여 관찰한 RLU의 비로써 나타낸다. 표에 나타낸 결과는 플라스미드 DNA의 2개 이상의 별개 제제를 사용한 4개의 독립된 실험 데이터를 요약한 것이다. 값들은 평균을 나타내며, 모든 경우에 표준 편차는 ±1.5보다 높지 않다. SV40 레포터 플라스미드는 도입 인자를 표준화하기 위해 각각의 실험중에 포함된다(SV40 리포터는 통상적으로 휴지기 세포와 비교하여 성장하는 세포에서 1.5배 높은 값을 제공한다).
돌연변이 작제물
-16 -14 -12 -10 -8 -6 -4 -2 +1 상대활성*
cdc25C(wt) G G C G G A A G G T T T G A A T G G 8,4
C C G G T C
-1/+2 G T T 8
-2/+2 C G T T 1.3
-6/-3 G G T C 1.9
-10/-7 C T T G 3
-2 - 2.3
-4 - 1.2
-6 - 1.4
-7 - 1.8
-8 - 7.8
-9 - 6.9
표 2
특이적인 뉴클레오타이드의 효과는 세포 주기 조절 및 E2F와 CDF-1 복합체의 DNA 결합에 있어서 B-myb E2FBS-CHR 모듈 및 cdc25C CDE-CHR 모티브사이에 교환된다. B-myb 및 cdc25C 리포터 모듈은 상부에 나타낸다. 서열이 서로 상이한 5개 위치는 영역 1 내지 5로 지정한다. 하기 나타낸 돌연변이체 각각은 B-myb(상부 □) 또는 cdc25C(하부 □) 프로모터를 기본으로 2개 프로모터간의 특이적인 교환을 갖는다. B 및 C는 특수한 돌연변이체가 영역 1 내지 5중에 cdc25C(C) 또는 B-myb(B) 뉴클레오타이드를 포함하는지를 나타낸다(즉, B-Cl은 영역 1내에 cdc25C 뉴클레오타이드를 포함하는 B-myb 서열이다. 세포 주기 조절은 우선 휴지기 NIH3T3 세포내 야생형 및 돌연변이 작제물의 활성을 비교하여 측정한다. 저해로 정의된 칼럼은 이러한 분석 결과를 나타낸다(+ 비: 돌연변이체 야생형: 2; -비 돌연변이체 야생형: 3). 다음 작용성 프로모터 작제물을 혈청-자극된 NIH3T3 세포내 세포 주기 조절 시기를 분석하고 최대 활성의 1/2의 시기를 측정한다. 수평 화살은 B-myb 및 cdc25C 야생형 프로모터 모두와는 명백히 상이한 역학을 나타낸다. CDF-1 및 E2F 결합 데이터는 헬라 세포 핵 추출물 또는 부분 정제된 CDF-1을 사용하여 야생형과 돌연변이된 B-myb E2FBS-CHR 프로브 및 야생형과 돌연변이된 cdc25C CDE-CHR 프로브에 의해 EMSA로 수득한다.
E2F 모티프 CDF-1모티프 저해 최대 전사/2(시간) CDF-1 결합 DP/E2F 결합
CDF-1 모티프
1↓↓ 2 3↓ ↓ 4↓↓ 5↓
B-myb ACTT GGCGG GAGA TAGGAA AGT + 8 ± ++
GGCGG AAGG TTTGAA TGG + 13 ++ -
CDE CHR
B-Cl C BB B B + 8.5 ± +
B-C1,2 C CB B B - - ± -
B-C2 B CB B B nd nd nd -
B-C4 B BB C B + →11 ++ ++
C-B1 B CC C C + 13 ++ -
C-B1,2 B BC C C + →10.5 ++ ++
C-B4 C CC B C - - - -
C-B3,4 C CB B C - - - nd
C-B3,4,5 C CB B B - - ± nd
C-B4,5 C CC B B nd nd ± nd
B-myb 및 cdc25C 프로모터로부터의 세포 주기-조절된 전사의 시기에 있어서 특이적인 뉴클레오타이트 변화의 효과를 입증하기 위하여, NIH3T3 세포를 일시적으로 제시된 작제물로 형질감염시키고, 혈청 고갈에 의해 G0 상태로 신크로나이즈(synchronize)시키고 10% FCS를 가하여 자극시킨다. 이 데이터는 4회의 실험을 기준으로 하는 C-B1,2 그래프를 제외하고는 12회의 상이한 실험을 기준으로 한다. 데이터는 각각의 작제물에 대해 20시간째에 100으로 표준화하여 최대 발현치의 1/2의 비교가 용이하도록 한다.
실시예
1. 물질 및 방법
1.1 세포 배양, DNA 형질감염 및 루시퍼라제 검정
NIH3T3 세포를 10% 태아 송아지 혈청, 페니실린 및 스트렙토마이신이 보충된 둘베코-보그 변형된 이글 배지(Dulbecco-Vogt modified Eagle medium) 중에서 배양시킨다. 헬라 세포를 DMEM와 5% 태아 송아지 혈청중에서 성장시킨다. NIH3T3 세포를 DEAE 덱스트란 기술[참조: Lucibello et al., EMBO J. 14, 132 (1995)]에 의해 형질감염시킨다. G0 상태에서의 동조배양을 위해, 세포를 형질감염 및 10% FCS로 재자극시킨 후, 혈청이 유리된 배지중에서 2일 12시간동안 유지시킨다. 루시퍼라제 활성의 측정 및 SV40 프로모터 기원한 리포터 작제물을 사용한 결과의 표준화를 문헌[참조: Lucibello et al., EMBO J. 14, 132 (1995)]에 기술된 바와 같이 수행한다.
1.2 서열 분석 및 루시퍼라제 작제물
cdc25C 및 B-myb 프로모터-기원한 루시퍼라제 작제물은 문헌[참조: Lucibello et al., EMBO J. 14, 132 (1995) 및 Zwicker et al., EMBO J. 14, 4514 (1995)]에 기술되어 있다. 돌연변이를 전술한 바와 같은 PCR 방법[참조: Good and Nazar, Nucl. Acids Res. 20, 4934 (1992); Lucibello et al., EMBO J. 14, 132 (1995)]으로 도입시킨다. 모든 PCR-증폭된 단편을 시쿼나제(USB 제조원) 또는 Tth 폴리머라제(Pharmacia 제조원)을 사용하는 디데옥시뉴클레오타이드 쇄-종결법으로 DNA 서열분석함으로써 확인한다.
1.3 EMSA
전기영동적 이동도 변위 분석(Electrophoretic mobility shift analysis: EMSA)을 문헌[참조: Zwicker et al., Science 271, 1595 (1996)]에 기술된 바와 같이 수행한다. 부분 정제된 CDF-1을 사용하는 경우, EMSA는 나트륨 데옥시콜레이트 및 NP-40의 부재하에 수행한다. 하기 이본쇄 프로브를 사용한다.
-cdc25C-wt: 5'-ACTGGGCTGGCGGAAGGTTTGAATGGTCAA(서열 5)(CDE 굵은 글씨체; CHR 이탤릭체). T1, T4, T7(또한 cdc25C-mCDE로 언급됨), A8 및 C9를 각각 기술한 바와 같이 -19, -16, -13, -12 및 -11번 위치에서 돌연변이시킨다(표 1 참조)[참조: Zwicker et al., Nucleic Acids Res. 23, 3822, (1995)].
-cdc35C-10/-7: 5'-ACTGGGCTGGCGGActtgTTGAATGGTCAA(서열 6)
-cdc25C-6/-3(또한 cdc25C-mCHR로 언급):
5'-ACTGGGCTGGCGGAAGGTggtcATGGTCAA (서열 7)
-cdc25C-1/+2: 5'-ACTGGGCTGGCGGAAGGTTTGAAggtTCAA (서열 8)
-cdc25C-2: 5'-ACTGGGCTGGCGGAAGGTTTGAcTGGTCAA (서열 9).
B-myb를 포함하는 다음 모든 올리고뉴클레오타이드의 서열은 또한 문헌[참조: Zwicker et al., Science 271, 1595 (1996)]에 기술되어 있거나 표 2에 제시되어 있다. 랜덤 올리고뉴클레오타이드는 관련되지 않은 서열을 포함한다[참조: Zwicker et al., EMBO J. 14, 4515 (1995)].
다음 항체를 사용한다: E2F-1(Santa Cruz SC-251X), E2F-2(Santa Cruz SC-632X), E2F-3(Santa Cruz SC-879X), E2F-4(Santa Cruz SC-512X), E2F-5(Santa Cruz SC-999X), DP-1 (N. La Thangue로부터 수득), DP-2(Santa Cruz SC-830X).
1.4 CDF-1의 부분 정제
핵 추출물을 고 염 추출 완충액중 헬라 세포 배양 현탁물로부터 프로테아제 억제제 류펩틴(50ng/ml), 펩스타틴 A(5㎍/ml) 및 아프로티닌(80ng/ml)의 존재하에 제조한다[참조: Dignam et al., Nucl. Acids Res. 11, 1475(1983)]. 2개의 탠덤 cdc25C CDC-CHR 모티프를 포함하는 바이오티닐화된 올리고뉴클레오타이드를 스트렙트아비딘 아가로즈에 커플링시키고 비-특이적인 경쟁자로서 사용된 폴리(dA:dT)대신에 연어 정자 DNA를 사용하는것외에는 EMSA에서와 동일한 조건(상기 참조)을 사용하여 문헌[참조: Kadonaga and Tjian, PNAS 83, 5889 (1986)]에 기술된 바와 같은 친화 크로마토그래피에 사용한다. KCl 농도를 1M로 단계별 증가시킴으로써 용출시킨다.
1.5 실험관내 DMS 풋프린팅
암호화 쇄 cdc25C 올리고뉴클레오타이드의 실험관내 DMS 풋프린팅을 문헌[참조: Zwicker et al., Science 271, 1595 (1996)]에 기술된 바와 같이 수행한다.
1.6 안정한 형질감염체의 게놈적 풋프린팅
안정한 세포주를 생성하기 위하여, 야생형 cdc25c 루시퍼라제 작제물 C290 및 CHR 돌연변이체 C290mCHR5/6(TTTGAA가 TagGAA로 돌연변이됨)를 매트릭스 부착 영역(SAR)을 포함하는 pAGLu 벡터내로 삽입시키고 일렉트로포레이션(electroporation)에 의해 NIH3T3 세포내로 도입시킨다. 안정하게 형질감염된 클론을 G418 선별하에 분리하고 휴지기 및 성장하는 세포에 있어 루시퍼라제 발현을 분석한다. 예견된 발현 유형을 갖는 클론을 증식시키고 제1 프라이머(P1)이 루시퍼라제 유전자 5'-GTAACACAAAGGAATTCAAGC (서열 10)에 대해 특이적인 것을 제외하고는 문헌[참조: Lucibello et al., EMBO J. 14, 132 (1995)]에 기술된 바와 같이 게놈적 풋프린팅[참조: Pfeifer et al., Science 246, 810 (1989)]에 의해 분석한다.
2. 결과
2.1 CDF-1의 확인
2.1.1 cdc25C CHR의 특성화
최근에, CDE의 컨센서스 서열이 G/CGC/TGG/C (cdc25C중 GGCGG)인 것으로 판명되었다[참조: Zwicker et al., EMBO J. 14, 4514 (1995)]. 그러나, CHR의 경우 이러한 정보는 유용하지 않다. CHR의 경계를 선형화하고 cdc25C 프로모터의 CHR내로 도입된 다수의 돌연변이 정확한 뉴클레오타이드 위치 및 G0 상태로 동조배양된 NIH3T3 세포내 이들의 저해를 측정함으로써 이들 돌연변이체 작제물의 작용을 확인한다. 표 1의 데이타는 CHR이 -7 내지 -2번 위치로 연장됨을 나타내며, 이 영역내에서의 모든 뉴클레오타이드 위치는 필수적이다. 대조적으로, CDE 및 CHR간의 뉴클레오타이드 위치(-11 내지 -8번; AAGG)와 CHR로부터의 하부 뉴클레오타이드(≥ 1; TGG…)는 리프레서 작용에 있어 검출가능한 효과의 변화없이 변화될 수 있다. cdc25C CHR은 따라서 서열 TTTGAA로 정의될 수 있다.
2.1.2 완전한 CHR에 의존적인 생체내 CDE 공유
앞서의 데이타는 CDE 및 CHR내 돌연변이가 G0 상태에서의 저해를 파괴하므로[참조: Zwicker et al., EMBO J. 14, 4514 (1995)], 상이한 프로모터내 이들 성분이 상승적 방식으로 작용함을 명백히 나타내고 있다. 이것은 상호작용하는 인자가 이들 두 성분에 협동적으로 결합함을 의미한다. 이 문제는 CHR내 불활성화된 돌연변이를 지니고 있는 cdc25c 프로모터 작제물(cdc25C-mCHR5/6: TTTGAA가 TagGAA로 변화됨)을 지닌 안정하게 형질감염된 NIH3T3 세포주의 게놈적 풋프린팅에 의해 명백해진다. 예상된 보호 유형은 야생형 cdc25C 프로모터 작제물을 안정하게 발현하는 대조군 세포주내에서 관찰된다. 대조적으로 CHR 돌연변이를 지닌 cdc25C 프로모터를 지닌 세포주는 CDE 및 돌연변이된 CHR의 영역내에서 어떠한 보호도 나타내지 않는 반면, NF-Y[참조: Lucibello et al., EMBO J. 14, 132 (1995)]에 대한 2개의 구성적인 상부 결합 부위의 점유는 돌연변이체 프로모터내에서 변하지 않는다. 즉, CDE 점유는 완전한 CHR에 의존적이며, 이러한 사실은 세포내에서 협동적으로 결합함을 의미하는 것으로 결론지을 수 있다. 이러한 결론은 cdc25C 프로모터내 CDE 및 CHR사이의 5bp 또는 10bp의 삽입으로 저해가 파괴된다는 관측에 의해 지지된다.
2.1.3 CDF-1의 확인
헬라 세포 핵 추출물의 전기영동적 이동도 변화 분석(EMSA)은 cdc25C 프로모터의 CDE 및 CHR 모두를 가진 협동적 양식으로 상호작용하는 활성을 확인할 수 있도록 한다. 또한, 돌연변이체 리프레서 성분에 대한 이러한 활성의 결합은 이들 성분들의 작용 특성과 강하게 관련되어 있다. 야생형과 유사한 저해 작용을 나타내는 돌연변이체(-19번 위치에서 G가 T로; -11번 위치에서 A가 C로 또는 -1/+2의 결실)는 야생형 서열과 같이 결합 검정에 있어 동일한 경쟁 능력(자가-경쟁)을 나타낸다. 대조적으로, G0 상태 세포내에서 저해가 감소되거나 감해진 CDE(-16번에서 G가 T로; -13에서 G가 T로 또는 -12번에서 G가 A로) 또는 CHR(-10/-1의 결실, -6/-1의 결실 또는 -2번에서 A가 C로)에서의 기타 돌연변이는 또한 감소된 결합 경쟁력을 나타낸다. 구조-작용 분석에 의해 확립된 상관관계와 함께 관측된 협동적 결합은 CDE-CHR 결합 인자의 예견된 특성과 일치한다. 이 활성을 CDF-1이라 칭한다.
2.1.4 큰 홈(major groove)에서 CDE와 접촉하고 작은 홈(minor groove)에서 CHR과 접촉하는 CDF-1
CDF-1이 생체내에서 리프레서 성분과 상호작용하는 활성이 있는지에 대한 추가의 입증을 위해, CDF-1과 DNA의 상호작용을 실험관내에서 메틸화 보호 풋프린팅으로 분석한다. 생체내에서 CDE가 큰 홈에 접촉하지만 CHR은 작은 홈에 접촉하고 있음이 이미 밝혀졌다[참조: Zwicker et al., EMBO J. 14, 4515 (1995)]. 매우 유사한 결과가 상부 쇄의 실험관내 풋프린팅에 의해 수득된다. 큰 홈 접촉을 나타내는 CDE내 4개의 G-잔기는 특이적으로 보호되어 있으며 작은 홈 접촉을(N-3) 나타내는 CHR내 2개의 A-잔기도 또한 특이적으로 보호되어 있다. 따라서 CDF-1 및 실험관내 CDE-CHR간의 상호작용 모드는 세포내적으로 이루어진 관측과 완전히 일치한다.
2.1.5 CDE-CHR 모듈을 포함하는 다수의 프로모터와 상호작용하는 CDF-1
앞서의 연구는 작용성 CDE-CHR 모듈이 cdc25C, cdc2 및 사이클린 A를 포함하는 상이한 프로모터내에 존재함을 나타낸다[참조: Zwicker et al., EMBO J. 14, 4515 (1995)]. 또한, 결합 부위의 유사한 배열은 B-myb 프로모터내에서 발견되며 여기서, cdc25C CDE와 동일한 중심 서열을 갖는 E2F 부위는 CHR-유사 성분의 바로 상부에 위치한다[참조: Zwicker et al., Science 271, 1595 (1996)]. 따라서, 상기 확인된 CDF-1 활성이 이들 프로모터내 리프레서 부위와 상호작용하는지를 실험하는 것은 흥미로운 것이다. CDE-CHR 포함 프로모터, 즉 cdc2 및 사이클린 A는 cdc25C 프로모터와 유사한 효능으로 CDF-1 활성에 결함함이 밝혀졌다. 3개의 경우 모두에서 결합은 CDE 및 CHR 모두에 대한 협동적 결합에 있어 의존적인데 이는 부위내 돌연변이(참조: 물질 및 방법란)가 cdc25C 프로브와의 경쟁을 손상시키기 때문이다. 프로브 : 경쟁인자(1: 20)의 동일한 비에서, 비록 일부 경쟁은 더욱 높은 경쟁인자 농도에서 나타난다 해도, B-myb 프로모터 E2FBS-CHR 모듈에 의해 경쟁이 현저해진다. CDF-1 활성인 3개의 모든 CDE-CHR 포함 프로모터와의 특이적이고 강력한 상호작용을 나타낸다는 사실은 본 연구에서 확인된 활성의 상관성에 대한 추가의 확증을 제공한다.
2.1.6 공지된 E2F 군 구성원을 포함하지 않는 CDF-1
CDE와 E2FBS의 유사성 측면에서 상기 확인된 CDF-CHR 활성이 공지된 E2F 또는 DP군 구성원을 포함하는지의 여부를 시험한다. 이를 위하여, EMSA를 특이적인 DP 및 E2F 단백질에 대해 지시된 항체의 존재하에 수행한다. 이들 모든 항체는 상이한 고정하에 E2F/DP의 큰 변화 또는 구별가능한 결합을 유발함을 보여준다. 그러나, CDF-1이 공지된 D2F 또는 DP 군 구성원의 어느것도 포함하지 않는다는 것을 의미하는 것으로서, 사용된 항체가 CDF1-DNA 복합체 형성에 영향을 미치지 않는다는 사실이 명백하게 밝혀져야 한다.
2.2 E2F 또는 CDF-1 또는 E2F 및 CDF-1의 우선적 결합을 측정하는 뉴클레오타이드의 확인
E2F 및 CDF-1을 결합시키는 뉴클레오타이드 서열의 확인은 DP/E2F 및 CDF-1 복합체가 EMSA내에서 매우 유사한 전기영동적 이동을 나타낸다는 사실로 인하여 어렵다. 따라서, 헬라 핵 추출물을 20bp cdc25C CDE-CHR 서열(참조: 물질 및 방법란)을 사용한 DNA-친화 크로마토그래피에 의해 분획화한다. 이러한 공정으로 조 추출물중에 CDF-1과 매우 유사한 결합 특성을 나타내는 부분 정제된 CDF-1이 수득되며 E2F 결합 활성으로부터 CDF-1이 경쟁적으로 분리된다. E2F 복합체를 분석하기 위해 cdc25C CDE-CHR 경쟁인자 올리고뉴클레오타이드를 결합 반응에 포함시켜 방사표지된 CDF-1 복합체의 형성을 방지한다.
DP/E2F 및 CDF-1의 결합 부위를 측정하기 위하여, 특이적인 뉴클레오타이드를 리프레서 모듈이 서로 상이한(표 2의 상부 1 내지 5에서 나타냄) 5개의 특이적 영역내 B-myb 및 cdc25C 프로모터사이에서 치환한다. 상응하는 서열을 우선 E2F 결합(즉, 헬라 핵 추출물내 DP1/E2F-A, -3 및 -4의 결합)과 부분 정제된 CDF-1과의 상호작용을 시험한다. 이 연구를 2개의 명확한 결과를 가져온다.
1. CDE 또는 E2FBS의 중심(영역 1 및 2)을 플랭킹하는 뉴클레오타이드는 E2F 결합에 있어 중요한 역활을 한다. 대조적으로, 동일한 잔기는 CDF-1 결합에 현저한 영향을 주지 않는다. 영역 1(B-myb내 B-C1)내 뉴클레오타이드는 DP1/E2F-4(표 2의 B-C1)의 최대 결합에 영향을 주지 않는 반면, 영역 2내 G-잔기는 모든 E2F 복합체(표 2의 B-C, 2 및 B-C2)와의 상호작용에 대해 임계적이다. 이러한 결론과 일치하여, B-myb 영역 1 및 2뿐만 아니라, 영역 1만의 도입도 DP1/E2F-1, -3 및 -4 복합체와 고 효능으로 상호작용하는 능력을 cdc25C CDE에 부여한다(표 2의 C-B1, 2). 대조적으로, E2FBS 중심 또는 CDE주변의 이들 뉴클레오타이드의 어떠한 변화도 CDF-1의 결합에 영합을 주지 않는다(표 2의 B-C1 및 B-C1,2; B-C; C-B1 및 C-B1,2).
2. CDF-1 결합의 경우 이의 반대이다: CHR의 구조는 CDF-1 결합에 있어 강력하게 영향을 미치는 반면, E2F 결합에는 영향을 미치지 않으며, 이와 관련하여 영역 4는 임계적이다. 즉, 이 cdc25C 및 B-myb 프로모터사이의 이 영역내 2개 뉴클레오타이드의 변화는 B-myb 프로모터에 대한 CDF-1의 결합을 크게 증가시키는 반면(표 2의 B-C4), 이와 반대의 교환은 cdc25C 프로모터에 대한 CDF-1의 결합을 파괴시킨다(표 2의 C-B4). 대조적으로, 영역 4내 CHR에 있어서의 변화는 E2F 복합체의 결합에 영향을 주지 않는다. cdc25C CHR 에 대해 측정된 주변을 초과하여 연장된 Bmyb-CHR 및 2개의 프로모터가 이들 위치(표의 영역 3 및 5)에서 상이할 수 있으므로, C-B4가 불완전한 Bmyb-CHR로 인하여 CDF-1과 상호작용하지 않을 수 있다. 따라서, 영역 3 및 5에서 발견된 B-myb 뉴클레오타이드는 영역 4내에서의 변화외에도 cdc25C 서열에 도입된다(표 2의 C-B3,4, C-B3,4,5 및 C-B4,5). 그러나, 이들 추가의 변화는 CDF-1 결합을 한계내에서만 보유할 수 있으며, 이러한 사실은 Bmyb-CHR 및 cdc25C-CHR 서열이 상호작용하는 단백질과는 동일하지 않음을 입증한다.
최종적으로 상기 관측된 E2F 및 CDF-1 복합체와 B-myb 및 cdc25C의 상이한 상호작용이 세포 주기별 조절된 전사 저해와 조절 시기에 미치는 영향을 분석한다. E2F 및 CDF-1의 결합에 대해 시험한 동일한 서열을 B-myb 및 cdc25C 프로모터 루시퍼라제 작제물내로 도입시키고 G0기 상태에서 동조배양되어진 혈청 자극시킨 NIH3T3 세포 내에서의 활성에 대해 시험한다. 표 2의 데이터는 야생형과 유사한 CDF-1 결합의 존재하에 B-myb 프로모터에 대한 E2F 결합의 파괴를 나타낸다(참조: B-Cl, 2). 이러한 관측은 CDF-1 복합체보다는 E2F가 B-myb 유전자의 세포 주기-조절된 전사에 관여하며 이것은 B-myb 프로모터에 대한 CDF-1의 비교적 낮은 친화도와 일치한다. 대조적으로, CDF-1 결합을 파괴하는 cdc25C CDE내의 돌연변이가 세포 주기 조절을 손상시킴이 밝혀졌다. 또한, B-myb가 치환된 cdc25C의 치환은 CDF-1 결합의 파괴 및 G0기 상태에서의 저해를 파괴한다(표 2의 C-B4; C-B3,4 및 D-B3,4,5). B-myb 기본 프로모터(B-C4)내에 cdc25C CHR을 지니고 있는 역 작제물은 중정도의 세포 주기 역학을 나타내는데, 즉 야생형 B-myb에 비해 전사의 탈저해를 3시간 지연시킨다.
2.3 본 발명에 따른 유전자 치료요법용 유전자 작제물의 작제 및 사용 예
선택된 유전자 작제물은 다음 DNA 성분(5'에서 3'방향으로 하부에 나열됨)을 지닌다: SV40의 프로모터/얼리 인핸서 영역[뉴클레오타이드 48 내지 5191; Tooze (ed.), DNA tumor Viruses (Cold Spring Harbor, New York, New York, Cold Spring Harbor Laboratory; Lucibello et al., EMBO J. 14, 132 (1995)], 이에 결합된 서열 1, 이에 결합된서열 GCCACC[참조: Kodak, J, Cell Biol., 108, 229 (1989)], 이에 결합된 면역글로블린의 시그날 펩타이드에 대한 cDNA(뉴클레오타이드 서열 ≤ 63 내지 ≥ 107; Riechmann et al., Nature 332, 323 (1988)], 이에 결합된 β-글루쿠로니다제에 대한 cDNA[뉴클레오타이드 서열 ≤ 93 내지 ≥ 1982; Oshima et al., PNAS USA 84, 665 (1987)].
이 유전자 작제물을 pUC18/19 플라스미드 벡터내로 클로닝한다. 유전자 작제물의 상이한 성분의 결합은 PCR 증폭을 통한 각각의 성분의 말단에서 관측된 적합한 부위를 통해 달성된다. 또한, 선택된 제한 부위에 대해 특이적인 리가제를 사용한다. 이들 리가제는 시판되고 있으며 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다.
배양된 사람 제대 내피 세포(HuVEC)를 문헌[참조: Lucibello et al. (EMBO J. 14, 132 (1995)]에 따라 상술한 플라스미드로 형질감염시킨다.
HuVEC에 의해 생산된 β-글루쿠로니다제의 양을 기질로서 4-메틸움벨리페릴-β-글루쿠로나이드를 사용하여 측정한다.
세포 주기 특이성을 시험하기 위하여 내피 세포를 메티오닌을 고갈시키면서 G0/G1기 상태에서 48시간동안 동조배양한다. 이들 세포의 DNA 성분을 훽스트 33258[Hoechst 33258; Lucibello et al., EMBO J. 14, 132 91995) 참조]로 염색한후 FACS 분석에 의해 측정한다.
다음의 결과가 달성된다:
1. 형질감염된 HuVEC는 형질감염되지 않은 HuVEC에 비해 더욱 많은 β-글루쿨니다제를 분비한다.
2. 증식하는 HuVEC(DNA 2S)는 G0/G1기 상태에서 동조배양된 HuVEC보다 더욱 많은 β-글루쿠로니다제를 분비한다.
3. 따라서, 서열 1은 상술한 유전자 작제물로 형질감염된 HuVEC내에서 β-글루쿠로니다제의 세포 주기 특이적인 발현을 가져온다.
본 발명에 따른 핵산 작제물은 약리학적 활성 물질을 암호화하거나 프로드럭을 약물로 전환시키는 효소를 암호화하는 구조 유전자가 세포-주기 특이적 발현 또는 세포- 및 세포 주기-특이적 발현 또는 바이러스- 및 세포 주기-특이적 발현 또는 대사- 및 세포 주기-특이적 발현을 할 수 있도록 함으로써 각종 질환의 유전자 치료요법에 사용될 수 있다.
서열목록
(1) 일반 정보:
(i) 출원인:
(A) 명칭: 훽스트 아크티엔게젤샤프트
(B) 거리:
(C) 도시: 프랑크푸르트
(D) 주:
(E) 국가: 독일
(F) 우편번호(ZIP): 65926
(G) 전화번호: 069-305-3005
(H) 팩스번호: 069-35-7175
(I) 텔렉스번호: 41234700
(ii) 발명의 명칭: 구조 유전자의 세포 주기 조절된 발현을 위한 핵산 작제물
(iii) 서열 수: 14
(iv) 컴퓨터 판독형:
(A) 매체 유형: 플라피 디스크
(B) 컴퓨터: IBM PC 호환성
(C) 운용 시스템: PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어: MS-DOS용 워드 퍼팩트 5.1
(2) 서열 1에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 20개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 본쇄형: 일본쇄
(D) 위상: 선형
(ii) 분자형: DNA(게놈성)
(ix) 특성:
(A) 명칭/키이: 프로모터
(B) 위치: 1..20
(xi) 서열 기술
(2) 서열 2에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 20개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 본쇄형: 일본쇄
(D) 위상: 선형
(ii) 분자형: DNA(게놈성)
(ix) 특성:
(A) 명칭/키이: 프로모터
(B) 위치: 1..20
(xi) 서열 기술
(2) 서열 3에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 17개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 본쇄형: 일본쇄
(D) 위상: 선형
(ii) 분자형: DNA(게놈성)
(ix) 특성:
(A) 명칭/키이: 프로모터
(B) 위치: 1..17
(xi) 서열 기술
(2) 서열 4에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 41개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 본쇄형: 일본쇄
(D) 위상: 선형
(ii) 분자형: DNA(게놈성)
(ix) 특성:
(A) 명칭/키이: 프로모터
(B) 위치: 1..41
(xi) 서열 기술
(2) 서열 5에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 30개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 본쇄형: 일본쇄
(D) 위상: 선형
(ii) 분자형: DNA(게놈성)
(ix) 특성:
(A) 명칭/키이: 프로모터
(B) 위치: 1..30
(xi) 서열 기술
(2) 서열 6에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 30개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 본쇄형: 일본쇄
(D) 위상: 선형
(ii) 분자형: DNA(게놈성)
(ix) 특성:
(A) 명칭/키이: 프로모터
(B) 위치: 1..30
(xi) 서열 기술
(2) 서열 7에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 30개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 본쇄형: 일본쇄
(D) 위상: 선형
(ii) 분자형: DNA(게놈성)
(ix) 특성:
(A) 명칭/키이: 프로모터
(B) 위치: 1..30
(xi) 서열 기술
(2) 서열 8에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 30개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 본쇄형: 일본쇄
(D) 위상: 선형
(ii) 분자형: DNA(게놈성)
(ix) 특성:
(A) 명칭/키이: 프로모터
(B) 위치: 1..30
(xi) 서열 기술
(2) 서열 9에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 30개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 본쇄형: 일본쇄
(D) 위상: 선형
(ii) 분자형: DNA(게놈성)
(ix) 특성:
(A) 명칭/키이: 프로모터
(B) 위치: 1..30
(xi) 서열 기술
(2) 서열 10에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 21개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 본쇄형: 일본쇄
(D) 위상: 선형
(ii) 분자형: DNA(게놈성)
(ix) 특성:
(A) 명칭/키이: 프로모터
(B) 위치: 1..21
(xi) 서열 기술
(2) 서열 11에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 20개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 본쇄형: 일본쇄
(D) 위상: 선형
(ii) 분자형: DNA(게놈성)
(ix) 특성:
(A) 명칭/키이: 엑손
(B) 위치: 1..21
(xi) 서열 기술
(2) 서열 12에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 40개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 본쇄형: 일본쇄
(D) 위상: 선형
(ii) 분자형: DNA(게놈성)
(ix) 특성:
(A) 명칭/키이: 프로모터
(B) 위치: 1..21
(xi) 서열 기술
(2) 서열 13에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 20개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 본쇄형: 일본쇄
(D) 위상: 선형
(ii) 분자형: DNA(게놈성)
(ix) 특성:
(A) 명칭/키이: 프로모터
(B) 위치: 1..21
(xi) 서열 기술
(2) 서열 14에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 20개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 본쇄형: 일본쇄
(D) 위상: 선형
(ii) 분자형: DNA(게놈성)
(ix) 특성:
(A) 명칭/키이: 프로모터
(B) 위치: 1..21
(xi) 서열 기술

Claims (24)

  1. a) 하나 이상의 활성인자 서열,
    b) E2F군의 단백질과 CDF-1군의 단백질을 결합시키는 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, B-myb 프로모터보다는 늦게 그러나 cdc25C 프로모터보다는 먼저 세포 주기내 유전자 발현을 상향-조절하는 하나 이상의 키메라 프로모터 모듈 및
    c) 하나 이상의 구조 유전자를 포함하는 핵산 작제물.
  2. 제1항에 있어서, 활성인자 서열이 키메라 프로모터 모듈의 상부에 위치하는 핵산 작제물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 키메라 프로모터 모듈이 ACTTGGCGGGAGATTTGAAT(서열 1) 및 GCTTGGCGGGAGGTTTGAAT(서열 2)로 이루어진 그룹중에서 선택된 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 작제물.
  4. 제1항 내지 제3항중 어느 한 항에 있어서, 키메라 프로모터 모듈이 활성인자 서열과 상호작용하며, 이러한 상호작용은 구조 유전자의 발현에 영향을 미치는 핵산 작제물.
  5. 제1항 내지 제4항중 어느 한 항에 있어서, 활성인자 서열이 세포-특이적, 대사-특이적 또는 바이러스-특이적인 핵산 작제물.
  6. 제5항에 있어서, 세포 특이적인 활성인자 서열이 내피 세포, 장막 세포, 평활근 세포, 근육 세포, 활액 세포, 대식 세포, 임파 세포, 백혈 세포, 종양 세포 또는 각질 세포 및 신경교 세포로 이루어진 그룹중에서 선택된 세포내에서 활성화된 핵산 작제물.
  7. 제5항에 있어서, 바이러스-특이적인 활성인자 서열이 HBV, HCV, HSV, HPV, EBV, HTLV, CMV, SV40 및 HIV로 이루어진 그룹중에서 선택된 바이러스로부터 기원한 프로모터 또는 인핸서 서열인 핵산 작제물.
  8. 제1항 내지 제7항중 어느 한 항에 있어서, 구조 유전자가 약물 전구체를 전환시키거나 분해하여 약물을 생성하는 효소 또는 리간드와 이러한 효소간의 융합 단백질을 암호화하는 핵산 작제물.
  9. 제1항 내지 제8항중 어느 한 항에 있어서, 구조 유전자가 사이토킨, 성장 인자, 사이토킨 수용체, 성장 인자 수용체, 증식 억제 효과를 갖는 단백질, 아폽토시스 효과(apoptotic effect)를 갖는 단백질, 세포성색전 효과를 갖는 단백질, 세포독성 효과를 갖는 단백질, 염증 효과를 갖는 단백질, 소염 효과를 갖는 단백질, 면역억제 효과를 갖는 단백질, 항체, 항체 단편, 맥관 형성 억제제, 응집 인자, 피브린분해 화합물 및 응고억제제, 혈액 단백질, 바이러스 항원, 세균 항원 및 종양 항원, 및 리간드와 상술한 물질중 하나사이의 융합 단백질로 이루어진 그룹중에서 선택된 물질을 암호화하는 핵산 작제물.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 리간드가 성장 인자, 사이토킨 또는 항체로 이루어진 그룹중에서 선택된 핵산 작제물.
  11. 제1항 내지 제10항중 어느 한 항에 있어서, 핵산이 DNA인 핵산 작제물.
  12. 제1항 내지 제11항중 어느 한 항에 있어서, 5' - 3' 방향으로 SV40의 프로모터/얼리 인핸서 영역(early enhancer region)의 48번 내지 5191번 뉴클레오타이드, 이에 결합된 서열 ACTTGGCGGGAGATTTGAAT(서열 1)을 포함하는 DNA 단편, 이에 결합된 면역글로불린의 시그날 펩타이드를 암호화하는 63번 내지 107번 뉴클레오타이드 및 이에 결합된 β-글루쿠로니다제의 cDNA의 93번 내지 1982번 뉴클레오타이드를 포함하는 핵산 작제물.
  13. 제1항 내지 제12항중 어느 한 항에 따른 핵산 작제물을 포함하는 벡터.
  14. 제13항에 있어서, 비-바이러스성인 벡터.
  15. 제13항에 있어서, 바이러스성인 벡터.
  16. 제1항 내지 제12항중 어느 한 항에 따른 핵산 작제물과 제13항 내지 제15항중 어느 한 항에 따른 벡터를 포함하는 세포.
  17. 작제물의 성분들을 단계별로 연결시킴을 포함하는, 제1항 내지 제12항중 어느 한 항에 따른 핵산 작제물 또는 제13항 내지 제16항중 어느 한 항에 따른 벡터의 제조방법.
  18. 종양 질환, 백혈병, 심장혈관 질환, 염증 반응, 자가면역 질환, 알레르기, 관절염, 건선 질환, 이식된 기관의 강한 거부반응, CNS 손상, 감염성 질환, 혈액 응괴 질환 및/또는 만성 바이러스 감염을 치료하기 위한 약제 제조용으로서의 제1항 내지 제12항중 어느 한 항에 따른 핵산 작제물 또는 제13항 내지 제16항중 어느 한 항에 따른 벡터의 용도.
  19. (a) 헬라(Hela) 세포로부터 핵 추출물을 제조하는 단계 및
    (b) CDE-CHR 서열 모티프를 포함하는 올리고뉴클레오타이드의 존재하에 친화 크로마토그래피에 의해서 단계 (a)의 추출물을 정제하는 단계에 의해 수득가능한 CDF-1 단백질.
  20. 제19항에 있어서, CDE-CHR 서열 모티프가 서열 GGCTG GCGGA AGGTT TGAAT를 포함하는 CDF-1 단백질.
  21. 제19항에 있어서, CDE-CHR 서열 모티프가 서열 GGCTG GCGGA AGGTT TGAAT GGCTG GCGGA AGGTT TGAAT을 포함하는 CDF-1 단백질.
  22. 제19항 내지 제21항중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드가 아가로즈에 커플링된 CDF-1 단백질.
  23. 제19항 내지 제22항중 어느 한 항에 있어서, 핵 추출물이 헬라 세포의 염 추출에 의해 제조되는 CDF-1 단백질.
  24. CDF-1의 억제인자 또는 자극인자를 확인하기 위한 제19항 내지 제23항중 어느 한 항에 따른 CDF-1 단백질의 용도.
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