CZ46098A3

CZ46098A3 - Konstrukt nukleové kyseliny pro expresi strukturních genů regulovanou buněčným cyklem

Info

Publication number: CZ46098A3
Application number: CZ98460A
Authority: CZ
Inventors: Rolf Prof. Dr. Müller; Ningshu Liu; Jörk Dr. Zwicker; Hans-Harald Prof. Dr. Sedlacek
Original assignee: Aventis Pharma Deutschland Gmbh
Priority date: 1997-02-18
Filing date: 1998-02-16
Publication date: 1998-09-16
Also published as: AU735514B2; BR9800641A; CN1197077A; TR199800237A2; JPH10229888A; HUP9800329A2; HU9800329D0; AR011446A1; PL324919A1; US6380170B1; HUP9800329A3; EP0860445A1; AU5539898A; KR19980071443A; CA2224123A1

Description

Konstrukt nukleové kyseliny pro expresi strukturních genů regulovanou buněčným cyklem

Oblast techniky

Vynález se týká konstruktu nukleové kyseliny, který obsahuje alespoň jednu aktivátorovou sekvenci, alespoň jeden promotorový modul obsahující nukleotidovou sekvenci, která váže protein rodiny E2F a protein rodiny CDF-1 a alespoň jeden strukturní gen.

Dosavadní stav techniky

Jeden z faktorů zasahujících do represe regulované buněčným cyklem je E2F, který může tvořit represorové komplexy vázající DNA prostřednictvím své interakce s kapsovými proteiny, jako je pRb (Weintraub et al., Nátuře, 358, 259, 1992, Helin a Harlow, Trends Cell Biol., 3, 43, 1993, Zamanian a La Thangue, Mol. Biol. Cell, 4, 389, 1993).

E2F je heterodimerický transkripčni faktor vytvořený ze členů multigenových rodin E2F a DB (Nevins, Science, 258, 424, 1992, Můller, Trends Genet., 11, 173, 1995, La Thangue, Transactions, 24, 54, 1996) . Další transkripčni faktor patřící do genové rodiny E2F je např. E2F-5 (WO 96/25494). Transkripčni aktivace způsobená E2F je modulována během buněčného cyklu kapsovými proteiny rodiny pRb. E2F je potlačen v G_o a časné G_lz ale během vývoje buněčného cyklu jsou oba, skupina DP/E2F a přidružené kapsové proteiny, hyperfosforylovány kinázami závislými na cyklinu a specifickými pro fázi Gl, což vede k aisociaci inhibičniho třídílného komplexu (DeCaprio et al., Proč. Nati. Acad. Sci.

• ·

USA, 89, 1795, 1992, Fagan et al., Cell, 78, 799, 1994,

Hatakeyama et al., Genes Dev., 8, 1759, 1994, Weinberg,

Cell, 81, 323, 1995) . Tato disociace vytváří transkripčně aktivní „volný E2F a vede k aktivaci genů regulovaných E2F. Proto již byl použit např. vektor obsahující nukleovou kyselinu kódující regulátor E2F a/nebo regulátor E1A k transfekci diferencovaného neuronu, aby se navodila syntéza DNA (WO 95/16774) .

Mezi promotory regulované transkripční represí prostřednictvím E2FBS jsou E2F-1, orc-1 a B-myb (Lam a Watson, EMBO J., 12, 2705, 1993, Hsiao et al., Genes Dev.,

8424, 1526, 1994, Johnson et al., Genes Dev., 8424, 1514, 1994, Ohtani et al., Mol. Cell Biol., 16, 6977, 1996). Avšak úloha E2F není výlučně aktivující, což bylo poprvé prokázáno pro myší gen B-myb (Lam a Watson, EMBO J., 12, 2705, 1993, Lam et al., EMBO J., 13, 871, 1994, Lam et al., Gene, 160, 277, 1995, Zwicker et al., Science, 271, 1595, 1996). Mutace vazebného místa pro E2F (E2FBS) v promotoru B-myb vede k dramaticky zvýšené aktivitě selektivně v Go a následně ke ztrátě regulace buněčného cyklu.

Dalšími příklady v této souvislosti jsou promotory E2F, pl07, histon H2A a orel, kde mutace E2FBS také ruší represi a regulaci buněčného cyklu (Hsiao et al., Genes Dev., 8424, 1526, 1994, Johnson et al., Genes Dev., 8424, 1514, 1994,

Zhu et al., Mol. Cell Biol., 15, 3552, 1995, Ohtani et al., Mol. Cell Biol., 16, 6977, 1996, Oswald et al., Mol. Cell Biol., 16, 1889, 1996).

Rozpoznání několika genů, které jsou potlačeny E2FBS naznačuje, že transkripční represe zprostředkovaná E2F je častý mechanismus transkripce regulované buněčným cyklem. Avšak mechanismus genové represe B-myb se ode všech modelů •· · · •· · •· · • ·· • · · · · · ·· · navrhovaných pro činnost E2F odchyluje v druhý prvek lokalizovaný přímo po et al., Oncogene,

13, 1073,

Science,

271, 1595,

Kromě toho obsazení E2FBS B-myb v buňce regulované buněčným cyklem a je pozorováno pouze během fází represe (Zwicker et al., Science, 271, 1595,

Tato pozorování jsou velice podobná těm, která byla učiněna u dalších promotorů, jako je cdc25C, cdc2 a cyklin

A, které jsou periodicky potlačovány prostřednictvím dvou spolupracuj ících prvků, CDE podobného E2FBS a přilehlého CHR (Zwicker e~ al.,

Mechanismus transkripce regulované buněčným cyklem byl objeven prostřednictvím analýzy genů, které jsou exprimovány v pozdních stadiích buněčného cyklu. Když byl studován promotor cdc25_r který je aktivován v pozdní fázi S/G₂, metodami „footprintingu („footprinting je technika založená na téhož vzorku

DNA před a po inkubaci v přítomnosti buněčného a mutační analýzou, byl nový represorový prvek, „prvek závislý na buněčném cyklu, CDE (Lucibello

EMBO J., 14, 132, a jeho obsazení se ztrácí v G₂, když je exprimován cdc25C. Že represe zprostředkovaná

CDE hraje rovněž roli v regulaci dalších promotorů bylo ukázáno výskytem funkčních

CDE v promotorech cyklin A a cdc2, jejichž represe je zrušena v pozdní fázi Gi/S (Zwicker et al.,

EMBO J., 14,

4514, 1995).

Tyto studie také vedly k objevu dalšího prvku přilehlého k CDE, který je totožný ve všech třech promotorech.

Tento prvek byl nazván „homologní oblast genů buněčného cyklu, CHR (Zwicker et al., EMBO J., 14,

4514,

1995) .

Mutace buď CDE nebo CHR v promotorech cdc25C, cdc2 nebo cyklinu A velkou měrou ruší represi v G₂. Tato funkční data byla podporována průkazem proteinu specifického pro Go~Gi vázajícího se jak k CDE tak k CHR v genomovém footprintingu. Je zajímavé, že CDE se spojuje ve velkém zářezu DNA, zatímco vazba CHR nastává v malém zářezu DNA (Zwicker et al., EMBO

J., 14, 4514, 1995). Nukleotidová sekvence CDE-CHR a její použití pro diagnózu, vyhledávání a genovou terapii již bylo nárokováno ve WO 96/06943.

Objev, že CHR spolupracuje s CDE v represi promotorů a identifikace sekvencí podobných CHR, které jsou sousedící s E2FBS v promotoru B-myb, podnítil detailní výzkum mechanismu represe B-myb. Tyto studie prokázaly, že oblast podobná CHR je pro represi nepostradatelná a působí jako korepresorový prvek spolu s E2FBS (Bennett et al., Oncogene, 13, 1073, 1996). Tato oblast byla nazvána B-myb-CHR (Bennett et al., Oncogene, 13, 1073, 1996) nebo DRS (Bennett et al., Oncogene, 13, 1073, 1996).

Kromě toho genomový „footprinting jasně ukázal ztrátu obsazení místa E2F paralelně s derepresí B-myb ve střední fázi Gi (Zwicker et al., Science, 271, 1595, 1996). Tato pozorování ukázala, že místa E2F-CHR regulují transkripci genů indukovaných v pozdní Gi podobným způsobem jako místa CDE-CHR vedou k derepresí genů ve fázích S nebo G₂. Navíc tyto nálezy naznačují, že represe míst E2F se liší od aktivace míst E2F nepřítomností přilehlého ko-represorového prvku CHR. Vzato dohromady, jsou obě represe zprostředkované E2F i CDE, působící v různých stadiích buněčného cyklu, závislé na prvcích CHR specifických pro promotor (Liu, N., et al., Nucleic Acids Res., 24, 2905, č. 15, 1996).

• · ·· · ···· ···· • · · · · ······ ···· · • · · · · · ··· ······ ·· · ·· · ·

CDE je totožný se sekvencemi jádra E2FBS, jako jsou v promotoru B-myb (GGCGG) (Zwicker et al., EMBO J., 14, 4514,

1995), ale zůstává těžko pochopitelné, co určuje rozlišení E2FBS od CDE. Kromě toho nebyly dosud identifikovány vazebné jednotky CDE nebo CDE-CHR. a vztah vazebného faktoru(ů) CDE k rodině transkripčních faktorů E2F je nejasný.

Oba represorové moduly potlačuji aktivační sekvence lokalizované v protisměru čteni od E2FBS-B-myb-CHR nebo CDE-CHR. Prvek B-myb-CHR inhibuje aktivátorovou sekvenci v protisměru čtení v časné fázi (G_o až střední fáze Gi) , CDE-CHR do pozdní fáze (G_o až S fáze) buněčného cyklu.

Tento nález vedl ke konstrukci genů, které obsahují aktivátorové sekvence, které jsou buněčně nespecifické, specifické pro určitou buňku či virus a/nebo metabolicky specifické, promotorové moduly specifické pro buněčný cyklus jako CDE-CHR nebo E2FBS-B-myb-CHR regulující aktivaci aktivátorové sekvence, a strukturní gen kódující léčebný protein.

Takové genové konstrukty byly nárokovány pro genovou terapii různých nemocí (viz např. WO 96/06943, D196.05274.2, D196.17851.7 , WO 96/06940, WO 96/06938, WO 96/06941, WO 96/06939) .

Podstata vynálezu

Jedním cílem předkládaného vynálezu bylo nalézt nové konstrukty nukleové kyseliny s genovou expresi závislou na odlišné fázi buněčného cyklu.

Bylo překvapivě shledáno, že faktory, které jsou zapojeny do represe promotorů regulovaných B-myb a CDE-CHR, jsou různé. Ukázalo se, že gen B-myb je potlačován • · · · ·«····· • · · ········ • · · ·· ······ ···· · ··· · · ·· · ·

9 9999 9 9 9 9 9 99 (reprimován) prostřednictvím komplexů E2F ve spojeni s faktorem vázajícím CHR, zatímco promotor cdc25C je potlačován novou jednotkou identifikovanou v předkládaném vynálezu a nazvanou faktor vázající CDE-CHR 1 (CDF-1).

Nato byla analyzována interakce CDF-1 s represorovými prvky v několika genech regulovaných buněčným cyklem. Za použití technik „DMS-footprintingu in vivo a in vitro, metody EMSA a funkčních testů promotorových luciferázových konstruktů, bylo možné identifikovat následující jednotku CDF-1:

a) CDF-1 interaguje kooperativně s CDE a CHR v promotoru cdc25C, což je ve shodě s obsazením CDE závislém na CHR pozorovaném v buňce.

b) CDF-1 interaguje s reziduy G v CDE (velký zářez DNA) a s reziduy A v CHR (malý zářez DNA) . Tento ochranný typ je totožný s tím, který byl nalezen při in vivo „footprintingu (Zwicker et al., EMBO J., 14, 4514, 1995).

c) Vazba CDF-1 k sekvencím obsahujícím mutované motivy CDE nebo CHR koreluje přesně s funkcí takových mutovaných prvků v represi regulované buněčným cyklem.

d) CDF-1 se váže s podobnou účinností ke všem známým, promotorům regulovaným CDE-CHR, tj. k cdc25C, cdc2, a cyklinu A, ale pouze slabě k B-myb.

e) Bylo ukázáno, že se CDF-1 váže k promotorům obsahujícím CDE-CHR cdc25C, cdc2 a genu cyklinu A s podobně vysokou afinitou, zatímco interakce s modulem E2FBS-CHR promotoru Bmyb byla srovnatelně slabší.

f) E2F není schopen zprostředkovat represi přes prvek CDECHR cdc25C a obráceně CDF-1 je neschopný zprostředkovat represi přes E2FBS-B-myb-CHR.

Protein CDF-1 může být izolován z jaderných extraktů ze • · • · ···· ······· ·· · · · · ····· • · · ·· ······ ···· · ··· ······ ·· ···· ·· · · · · · suspendovaných tkáňových kultur buněk HeLa vysolovánim vysokou koncentraci soli a purifikaci afinitni chromatografii při výskytu sekvenčních motivů CDE-CHR.

Tudíž první provedení předkládaného vynálezu se týká proteinu CDF-1, který se získá následujícími kroky:

a) příprava jaderného extraktu z buněk HeLa a

b) purifikace extraktu z kroku a) afinitni chromatografií za přítomnosti oligonukleotidu obsahujícího sekvenční motiv CDE-CHR, zejména motiv obsahující sekvenci GGCTG GCGGA AGGTT TGAAT, a sekvenci GGCTG GCGGA AGGTT TGAAT GGCTG GCGGA AGGTT TGAAT.

V obzvláště výhodném provedeni je oligonukleotid obsahující sekvenční motiv CDE-CHR spojen s agarózou, např. prostřednictvím streptavidinu. Obecně je jaderný extrakt podle kroku a) připraven extrakcí vysolením buněk HeLa, zejména vysolovánim vysokou koncentrací soli, např. podle Dignama, J.D., (Nucleic Acids Res., 11, 1475-1489, 1983).

Protein CDF-1 může být eluován z chromatografické kolony postupně zvyšovanou koncentrací solí, např. zvýšením koncentrace KC1 až na 1 M.

Protein CDF-1 je užitečný zejména pro identifikaci inhibitorů nebo stimulátorů CDF-1, obzvláště represorové funkce CDF-1.

Dalším výsledkem izolace a funkční charakterizace CDF-1 byla identifikace nukleotidů, které jsou nezbytné pro vazebnou a represorovou funkci E2F/DP a CDF-1.

Vazba byla obecně závislá na přítomnosti neporušených variant CDE a CHR. Souhlasná sekvence CDE by mohla být definována jako G/CGC/TGG/C (GGCGG v cdc25C, Zwicker et al., EMBO J. , 14, 4514, 1995) a sekvence CHR z cdc25C jako sekvence TTTGAA. V kontrastu k nukleotidům v této oblasti • · · · · · ···· · ··· · · ··· · · · · · · ······ ·· · a· ·· mohou být nukleotidy mezi CDE a CHR (AAGG, viz tabulky 1, 2) a nukleotidy po směru čtení od CHR (TGG, viz tabulky 1, 2) změněny bez detekovatelných účinků na represorovou funkci.

Podobný typ interakce specifické pro vazebné místo byl pozorován u částečně purifikovaného CDF-1.

Nukleotidy v E2FBS z B-myb a v CDE z cdc25C, které jsou významné pro rozlišení vazby mezi E2F a CDF-1, jsou nukleotidy přímo sousedící s jádrem E2FBS/CDE (GGCGG). Tak dva nukleotidy proti směru čtení (CT v B-myb) a jeden nukleotid po směru čtení (G v B-inyb) obecně způsobí vazbu E2F, ale ne CDF-1. Na základě těchto nálezů bylo možné testovat funkci mutovaného promotoru B-myb se silně redukovanou vazbou E2F, ale normální interakcí CDF-1, a ukázat, že represe tohoto konstruktu je zhoršena. Tato data ukazuji, že interakce s E2F je všeobecně nepostradatelná a že vazba CDF-1 je nepostačující k tomu, aby propůjčila promotoru B-myb jakoukoliv účast v regulaci buněčného cyklu.

Situace je velmi odlišná pro promotor cdc25C reprimovaný CDE-CHR. V tomto případě není nalezena žádná vazba E2F a silná interakce s CDF-1 je obyčejně závislá na CHR. Tedy vazebné místo E2F je větší (tj. alespoň 9 nukleotidů) než pětinukleotidové CDE (Zwicker et al., EMBO J., 14, 4514, 1995), ale nezahrnuje CHR, zatímco vazebné místo CDF-1 se skládá z pětinukleotidového CDE a přilehlého šestinukleotidového CHR. Bylo proto možné vytvořit promotory, které mají schopnost interagovat jak s E2F tak s CDF-1 s vysokou účinností buď změnou B-myb-CHR na cdc25C CHR (B-C4 viz tabulka 2) nebo změnou hraničních nukleotidů cdc25C CDE na jejich protějšky B-myb (viz tabulka 2, CBl,2). Je zajímavé, že tyto promotory ukazovaly nové • · • ·

vlastnosti se zřetelem k načasováni dereprese během buněčného cyklu v tom, že polovina maximální aktivity byla pozorována později než u B-myb, ale dříve než u cdc25, tj. v časné střední S fázi. Tato pozorování ukazují, že odlišná vazba E2F a CDF-1 má podíl na časování regulace. V souladu s tímto pozorováním bylo nalezeno, že mutant promotoru B-myb vykazující přednostní a silnou vazbu CDF-1 (viz tabulku 2, B-C1,3,4) ukazuje kinetiku exprese podobnou cdc25C.

Proto tedy další provedení předkládaného vynálezu je konstrukt nukleová kyseliny obsahující:

a) alespoň jednu aktivátorovou sekvenci,

b) alespoň jeden chimérický promotorový modul obsahující nukleotidovou sekvenci, která váže protein rodiny E2F a protein rodiny CDF-1, a

c) alespoň jeden strukturní gen, kde uvedený chimérický promotorový modul způsobí aktivaci genové exprese v buněčném cyklu později než promotor B-myb, ale časněji než promotor cdc25C.

Ve výhodném provedení je aktivátorové sekvence lokalizovaná v protisměru čtení od chimérického promotorového modulu.

Bylo zjištěno, že promotorový modul E2FBS-B-myb-CHR genu B-myb (pozice mutací podtržena) ACTTGGCGGGAGATAGGAAA (Zwicker et al., Science, 271, 1595, 1996) mutovaný na ACTTGGCGGGAGATTTGAAT (sekvence s identifikačním číslem 1) obsahuje vysokoafinitní E2F stejně jako vazebné místo CDF-1. Vazba E2F jakož i CDF-1 k této nukleotidové sekvenci in vivo (v buňce) je omezena na fáze G_o a Gi a je nedekovatelná ve fázích S, G₂ a M a nukleotidová sekvence s identifikačním číslem 1 je výrazně schopna potlačit aktivitu aktivátorové sekvence (lokalizované v protisměru čtení od sekvence s

identifikačním číslem 1) ve fázích G_o a Gi buněčného cyklu, aby se aktivovala transkripce strukturního genu (lokalizovaného po směru čtení od sekvence s identifikačním číslem 1).

Podobně bylo zjištěno, že promotorovy modul CDE-CHR genu cdc25C (pozice mutací podtrženy) GGCTGGCGGAAGGTTTGAAT (EMBO J., 14, 4514, 1995) mutovaný na GCTTGGCGGGAGGTTTGAAT (sekvence s identifikačním číslem 2) obsahuje vysokoafinitní vazebné místo CDF-1 stejně jako vazebné místo E2F. Vazba CDF-1, a také E2F, k této nukleotidové sekvenci in vivo (v buňce) je omezena na fáze Go a Gi a je nedetekovatelná ve fázích S, G a M a nukleotidová sekvence s identifikačním číslem 2 je výrazně schopna potlačit aktivitu aktivátorové sekvence (lokalizované v protisměru čtení od sekvence s identifikačním číslem 2) ve fázích Go a Gi buněčného cyklu, aby se aktivovala transkripce strukturního genu (lokalizovaného po směru čtení od sekvence s identifikačním číslem 2).

Proto se výhodné provedení předkládaného vynálezu vztahuje ke konstruktu nukleové kyseliny s chimérickým promotorovými modulem obsahujícím alespoň jednu nukleotidovou sekvenci, která je vybrána ze skupiny skládající se z ACTTGGCGGGAGATTTGAAT (sekvence s identifikačním číslem 1) a ACTTGGCGGGAGGTTTGAAT (sekvence s identifikačním číslem 2).

Všeobecně promotorovy modul interaguje s aktivátorovou sekvencí a uvedená interakce ovlivňuje expresi strukturního genu.

Aktivátor všeobecně působí prostřednictvím aktivace bazální transkripce, která je nespecifická, specifická pro určitou buňku nebo virus a/nebo metabolicky specifická. Strukturní gen je všeobecně exprimován způsobem, který je

specifický pro fázi buněčného cyklu, specifický pro určitou buňku a závislý na buněčném cyklu, specifický pro určitý virus a závislý na buněčném cyklu, a/nebo metabolicky specifický a závislý na buněčném cyklu.

Konstrukt nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu se výhodně skládá z DNA. Termín „konstrukt nukleové kyseliny, jak se používá v tomto textu, znamená umělou strukturu nukleové kyseliny, která může být transkribována v cílových buňkách. Takový konstrukt je vložen do vektoru. Používají se nevirové vektory, jako plazmidové vektory, nebo virové vektory. Druh vektorů a technika vložení konstruktu nukleové kyseliny podle tohoto vynálezu je odborníkovi známa. Konstrukt nukleové kyseliny podle vynálezu se nevyskytuje v přírodě v sestavě popsané předkládaným vynálezem. Jinými slovy, strukturní gen konstruktu nukleové kyseliny není přirozeně kombinován s aktivátorovou sekvencí a chimérickým promotorovým modulem.

Další provedení předkládaného vynálezu se týká buňky obsahující konstrukt nukleové kyseliny nebo vektor předkládaného vynálezu.

Konstrukt nukleové kyseliny podle vynálezu umožňuje strukturnímu genu podstoupit expresi specifickou pro buněčný cyklus nebo expresi specifickou jak pro určitou buňku, tak pro buněčný cyklus, nebo expresi specifickou jak pro určitý virus, tak pro buněčný cyklus, nebo expresi specifickou jak metabolicky, tak pro buněčný cyklus. V jednom výhodném provedení strukturní gen je gen, který kóduje farmakologicky aktivní látku. V dalším výhodném provedení strukturní gen kóduje enzym, který štěpí inaktivní prekurzor léčiva na aktivní léčivo (předlék na lék). Příklady takového farmaceutického prekurzoru pro léky jsou popsány autory • · • ·

Sedlaček et al·., Contrib. to Oncol., 43, Karger Verlag, 1992, Hay et al., Drugs of the Future, 21, 917, 1996.

„xÁktivátorová sekvence znamená nukleotidovou sekvenci, která je částí genu a ke které jsou schopny se vázat regulační proteiny, takzvané transkripční faktory, které jako výsledek této vazby aktivují transkripci strukturního genu, který je lokalizován po směru čtení. Oblasti nazývané sekvence „po směru (čteni) jsou lokalizované ve směru transkripce, zatímco sekvence uspořádané v opačném směru jsou nazývané sekvence „v protisměru (čtení).

V jednom provedení předkládaného vynálezu je aktivátorové sekvence nespecifická, specifická pro určitou buňku nebo virus nebo metabolicky specifická. Jak se používá v této specifikaci, „specifická pro určitou buňku znamená, že aktivátorové sekvence je vybrána z genu kódujícího protein, který je specificky exprimován dané buňce a „specifická pro určitý virus znamená, že aktivátorové sekvence je vybrána z virového genu, „metabolicky specifická znamená, že aktivátorové sekvence je vybrána z genu, kódujícího protein, který je specificky exprimován za definovaných metabolických podmínek. Tak v dalším výhodném provedení je aktivátorové sekvence vybrána ze skupiny promotorů nebo zesilovačů, které aktivují transkripci v endotelových buňkách, serózních buňkách, buňkách hladkého svalstva, svalových buňkách, synoviálních buňkách, hemopoetických buňkách, makrofázích, lymfocytech, leukemických buňkách, nádorových buňkách, nebo keratinocytech, gliových buňkách, nebo z promotorových sekvencí nebo zesilovacích sekvencí virů HBV, HCV, HSV, HPV, EBV, HTLV, CMV, SV40 nebo HIV.

Příklady aktivátorových sekvencí, které jsou specifické ·· · ···* · · · · • · · · · ······ ···· · • · · ··· ··· • · ·φ ·· ·· · · · ·· pro určitou buňku nebo virus a metabolicky specifické, jsou pospány ve WO 96/06940, WO 96/06938, WO 96/06941 a WO 96/05994. Aktivátorové sekvence může být promotor nebo zesilovač.

Chimérický promotorový modul podle tohoto vynálezu obsahuje vazebné místo pro protein rodiny E2F, a také CDF-1. Příklady takových promotorových modulů jsou sekvence s identifikačním číslem 1 a sekvence s identifikačním číslem

2.

V jednom výhodném provedení tohoto vynálezu je tento chimérický promotorový modul lokalizován po směru od aktivační sekvence.

V dalším výhodném provedení tohoto vynálezu je promotorový modul kombinován s aktivátorovou sekvencí podle technologie popsané v D196.17851.7. V této patentové přihlášce je popsáno několik příkladů pro kombinaci několika promotorů. Jeden příklad je aktivátorové responzivní promotorové jednotka. Skládá se ze dvou různých aktivátorových podjednotek A a B. Expresní produkty A a B dohromady fúzují, a tím tvoří transkripční faktor aktivující aktivátorový responzivní promotor. Exprese aktivátorových podjednotek A a B je pod kontrolou promotoru pro A a promotoru pro B. Tyto promotory mohou být totožné nebo odlišné.

V dalším výhodném provedeni tohoto vynálezu je chimérický promotorový modul kombinován s druhým promotorem vybraným ze skupiny promotorů obsahujících silné nespecificky aktivovatelné promotory, jako je promotor RNA polymerázy III, promotor RNA polymerázy II, promotor CMV a zesilovač a/nebo promotor SV40, nebo virový promotor a/nebo aktivátorové sekvence, jako je aktivátorové sekvence HBV,

HCV, HSV, HPV, EBV, HTLV a/nebo HIV, nebo metabolicky aktivovatelné promotorové nebo zesilovací sekvence, např. zesilovač nebo promotor indukovatelný hypoxií, nebo další promotor specifický pro buněčný cyklus, např. promotor genu cdc25C_t genu cyklinu A, genu B-myb, genu DHFR nebo genu E2F1, nebo tetracyklinem aktivovatelný promotor, např. tetracyklinový operátor v kombinaci s odpovídajícím represorem, nebo promotor aktivovatelný buněčně specificky, k těmto promotorům patří aktivační sekvence v protisměru čtení takových genů, které kódují proteiny exprimované převážně nebo výlučně ve vybraném buněčném typu.

Konstrukty nukleové kyseliny předkládaného vynálezu mohou být použity v genovém inženýrství a zejména v genové terapii.

V genové terapii jsou geny, které jsou určeny pro expresi v těle, do těla zavedeny. Pro terapeutický účinek genové terapie je důležitá regulace exprese těchto genů. Předkládaný vynález se proto týká také konstruktů nukleové kyseliny, které mohou být použity v genové terapii. Techniky genové terapie jsou odborníkům dobře známy. Například WO 93/24640 a WO 95/11984 vyjevují způsoby a přípravky genové terapie in vivo s technologií nevirového nebo virového vektoru. Jako další příklad vyjevuje WO 95/06743 způsob, kterým jsou terapeutické konstrukty nukleové kyseliny zavedeny do izolovaných buněk epitelu dýchacích cest pacienta cestou transformace virovým (AAV) vektorem obsahujícím konstrukt. Transformované buňky jsou poté podány pacientovi. Kromě toho RF 2735789 vyjevuje farmaceutické přípravky obsahující rekombinantní adenoviry.

Technologie pro různé nevirové vektory, které mohou být použity jako nosiče konstruktů tohoto vynálezu a aplikovány ·· do buněk in vitro, nebo které mohou být injikovány či podány pacientům in vivo, jsou podobně odborníkům dobře známy.

V jednom výhodném provedeni může být konstrukt nukleové kyseliny použit pro expresi alespoň jednoho strukturního genu regulovanou specificky pro určitou buňku a fázi buněčného cyklu. V dalším výhodném provedení může být konstrukt nukleové kyseliny použit pro expresi alespoň jednoho strukturního genu regulovanou specificky pro určitý virus a provedení fázi buněčného cyklu. V ještě dalším výhodném může být konstrukt nukleové kyseliny použit pro expresi alespoň jednoho metabolicky specificky a specifickou pro fázi buněčného cyklu.

Konstrukt nukleové kyseliny nebo buňka podle předkládaného vynálezu je výhodně použita v léčbě poruchy, která je charakterizována buněčnou proliferací nebo je s ní spojena. Taková léčba zahrnuje např. zavedení uvedeného konstruktu nukleové kyseliny do cílové buňky.

Příklady poruch charakterizovaných nebo spoj ených s buněčnou proliferací jsou nádorová onemocnění, leukémie, kardiovaskulární onemocnění, zánětlivé reakce, autoimunitní rejekce

CNS, infekční nemoci, poruchy krevní koagulace a chronické virové infekce.

Takové nemoci mohou být léčeny systémovou nebo lokální aplikací konstruktů nebo buněk předkládaného vynálezu.

Exprese takových konstruktů v příslušné buněčné populaci může být regulována buněčně specifickou, metabolicky specifickou nebo virově specifickou aktivátorovou sekvencí a promotorovým modulem specifickým pro buněčný cyklus. Expresní produkt konstruktu vynálezu • · • 4

4 44444444

4444 4444 4 444 44

444 444444

444444 44 4 4444 může přímo nebo nepřímo inhibovat buněčnou proliferaci nebo usmrtit proliferujíci buňky.

Na základě struktury konstruktu může být konstrukt exprimován během stadia buněčné proliferace.

Pro léčbu dalších poruch jsou aktivátorové sekvence a strukturní gen pro aktivní látku v konstruktech nukleové kyseliny nebo buňkách podle předkládaného vynálezu vybrány v závislosti na účelu použití.

Všeobecně strukturní geny kódují látku, která je vybrána ze skupiny skládající se z cytokinu, růstového faktoru, cytokinového receptoru, receptoru pro růstový faktor, proteinu majícího antiproliferační účinek, proteinu majícího apoptotický účinek, proteinu majícího cytostatický účinek, proteinu majícího cytotoxický účinek, proteinu majícího zánětlivý účinek, proteinu majícího protizánětlivý účinek, proteinu majícího imunosupresivní účinek, protilátky, protilátkovéno fragmentu, inhibitoru angiogeneze, koagulačního faktoru, fibrinolytické sloučeniny a antikoagulans, krevního proteinu, virového antigenu, bakteriálního antigenu a nádorového antigenu a fúzního proteinu mezi ligandem jako je růstový faktor, cytokin nebo protilátka a jedna z výše zmíněných látek.

V tomto ohledu vynález obsahuje následující konstrukty a léčebné způsoby.

1. Léčba nádorů a chronických zánětů cestou inhibice proliferace endotelových buněk

Nádory jsou stejně jako chronické záněty charakterizovány tvorbou nových krevních cév proliferaci endotelových buněk. V jednom provedení jsou takové proliferujíci endotelové buňky cílovými buňkami, které jsou • · • ·

transdukovány(přeměněny) konstrukty vynálezu tak, aby exprimovaly protein, který přímo nebo nepřímo inhibuje proliferaci endotelových buněk a/nebo usmrcuje proliferující endotelové buňky a přilehlé nádorové buňky.

1.1 Aktivátorové sekvence aktivované v endotelových buňkách

V jednom provedení aktivátorové sekvence aktivované v endotelových buňkách zahrnují ty genově regulační sekvence a prvky z promotorů genů, které kódují proteiny, které jsou detekovatelné v konkrétních endotelových buňkách. Příklady těchto proteinů specifických pro endotelové buňky a promotorových sekvencí jejich genů jsou popsány ve WO 96/06940.

K těmto promotorům patří promotorové nebo aktivátorové sekvence genů kódujících endotelový přenašeč glukózy 1 specifický pro mozek, endoglin, receptor-1 VEGF (fit—1), receptor-2 VEGF (flk-1, KDR) , tie-1 nebo tie-2, receptor B61 (receptor Eck), B61, endotelin, např. endotelin B nebo endotelin-1, receptor endotelinu, zejména receptor endotelinu B, receptory manózo-6-fosfátu, von Willebrandův faktor, IL-la, IL-Ιβ, receptor IL-1, adhezivní molekula cévní buňky (VCAM-1), syntetické aktivátorové sekvence, např. aktivátorové sekvence obsahující a/nebo 5'-TTATCT-3' vázající transkripční faktor GATA-2.

1.2 Aktivátorové sekvence aktivované v buňce přilehlé k aktivovaným endotelovým buňkám

Když jsou endotelové buňky proliferující, stávají se sousedící buňky přístupné pro makromolekuly z krve díky „těsným spojením. Tyto funkční a anatomické vzájemné vztahy znamenají, že buňky v sousedství aktivovaných endotelových

buněk jsou cílovými buňkami pro účel tohoto vynálezu. Příklady aktivátorových sekvencí, které jsou aktivovány v přilehlých buňkách jsou popsány ve WO 96/06940.

K těmto aktivátorovým sekvencím nebo promotorům patří promotorové nebo aktivátorové sekvence genů kódujících VEGF. Genově regulační sekvence pro gen VEGF jsou 5' hraniční oblast nebo 3' hraniční oblast nebo gen c-Src nebo gen v-Src.

Dalšími příklady jsou receptory steroidních hormonů a jejich promotorové prvky (Truss a Beato, Endocrin. Rev., 14, 459, 1993) zejména promotor viru myšího tumoru mléčné žlázy.

1.3 Strukturní geny pro protinádorové nebo protizánětlivě aktivní látky „Protizánětlivá” látka má jeden nebo více z následujících charakteristických rysů: inhibice proliferace endotelové buňky, inhibice angiogeneze, tvorba trombů, cytostatické nebo cytotoxické vlastnosti, schopnost vyvolat apoptózu nebo schopnost přeměnit předlék na aktivní lék s cytotoxickými, cytostatickými nebo protizánětlivými vlastnostmi. Jak se používá v této přihlášce, „protinádorová” látka má jednu nebo více z předcházejících vlastností. Kromě toho „protinádorová” látka může být látka, která vyvolává zánět. Příklady těchto látek a jejich genů jsou popsány ve WO 96/06940, WO 96/06941 a D196147851.7.

Geny kódující tyto látky jsou například strukturní geny pro inhibitory buněčné proliferace, např. protein retinoblastomu (pRb=pll0) nebo příbuzné proteiny pl07 a pl30, protein p53, protein p21 (WAF-1), protein pl6, další inhibitory cdk, protein GADD45 nebo protein bak. Protein retinoblastomu (pRb=pll0) a příbuzné proteiny pl07 a pl30 jsou inaktivovány fosforylací, preferované jsou takové geny • ·

těchto inhibitorů buněčného cyklu, které obsahují mutace pro inaktivačni místa exprimovaných proteinů, ale nezhorši funkci těchto inhibitorů.

Dalšími příklady jsou strukturní geny faktorů vyvolávajících trombózu a/nebo inhibitorů angiogeneze, např. inhibitor aktivátoru plazminogenu 1 (PAI-1), PAI-2, PAI-3, angiostatin, interferony, např. IFNa, ΙΓΝβ, IFNy, destičkový faktor 4, IL-12, TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3, leukemický inhibiční faktor (LIF), nebo tkáňový faktor (TF) a jeho aktivní fragmenty.

Dalšími příklady jsou strukturní geny pro cytostatické nebo cytotoxické proteiny, např. perforin, granzym, IL-2, IL-4, IL-12, interferony, např. IFNa, IFN^T3, IFNy, TNF, TNFa, TNFp, onkostatin M, sfingomyelinázu nebo magainin a deriváty magaininu.

1.4 Strukturní geny pro cytostatické nebo cytotoxické protilátky, protilátkové fragmenty a pro fúzni proteiny mezi protilátkami vázajícími antigen nebo protilátkovými fragmenty a cytostatickými, cytotoxickými nebo zánětlivými proteiny nebo enzymy

K cytostatickým nebo cytotoxickým protilátkám patří ty, které jsou namířeny proti membránovým strukturám na endotelových buňkách nebo na nádorových či leukemických buňkách. Takové protilátky byly popsány například autorem Sedlaček et al., (Contrib. to Oncol., 32, Karger Verlag, 1988 a Contrib. to Oncol., 43, Karger Verlag, 1992). Další příklady jsou protilátky specifické pro sialyl Lewis, peptidy na nádorech, které jsou rozpoznávány lymfocyty T, proteiny exprimované onkogeny, gangliosidy, např. GD3, GD2, GM, 9-0-acetyl GD3, fukosyl GM1, antigeny krevních skupin a • · • · • · · · · · · • · · · ··· · · · · • · · ···· ···· • · · ·· ······ ···· · ··· ··· ··· ti ···· «· · · · · · jejich prekurzory, antigeny na polymorfnim epitelovém mucinu, antigeny na proteinech tepelného šoku nebo CD13, CD15, CD33, CAMAL, CD5, CDlc, CD23, idiotypy a izotypy membránových imunoglobulinů, CD33, M38, receptory IL-2, T buněčné receptory, CALLA, CD19 nebo nehodgkinský lymfom.

1.5 Strukturní geny pro fúzní proteiny mezi ligandy vázajícími cílovou buňku a cytostatickými nebo cytotoxickými proteiny nebo enzymy

K takovým ligandům patří všechny proteiny, které se vážou na buněčnou membránu endotelových buněk, např. růstové faktory nebo fragmenty růstových faktorů, jako PDGF, bFGF, VEGF, ΤΟΕβ. Navíc k takovým ligandům patří adhezivni molekuly, které se vážou k aktivovaným a/nebo proliferujícim endotelovým buňkám, např. Slex, LFA-1,

MAC-1,

LECAM-1, VLA-4 nebo vitronektin.

Kromě toho k takovým ligandům patří sloučeniny, které se vážou na buněčnou membránu nebo membránové receptory nádorových nebo leukemických buněk, např. růstové faktory nebo fragmenty růstových faktorů. Takové růstové faktory již byly popsány autory: Cross et al., Cell, 64, 271, 1991, Aulitzky et al., Drugs, 48, 667,

1994, Moore, Clin. Cancer Res., 1, 3, 1995, Van Kooten et al., Leuk. Lymph., 12, 27, 1993).

1.6 Strukturní geny pro induktory zánětu

Ke strukturním genům pro induktory zánětu patří RANTES (MCP-2), monocytární chemotaktický a aktivující faktor (MCAF), IL-8, makrofágový zánětlivý protein 1 (MIP-1, -β), neutrofilový aktivující protein 2 (NAP-2), IL-3, IL-5, lidský leukemický inhibiční faktor (LIF), L-7, IL-11, IL-13, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, faktor kobřího jedu (CVF) nebo • · • · ···· · · · ···· • · · · · · » · · · · • · · ·· ······ ···· · ··· ··· ··· ······ ·· · ·· · · sekvence CVF, které funkčně odpovídají lidskému komplementovému faktoru C3, lidský komplementový faktor C3 nebo sekvence C3b, štěpné produkty lidskýc.h komplementových faktorů C3, které jsou funkčně a surukuurálně podobné CVF nebo bakteriálním proteinům, které aktivují komplement nebo vyvolávají záněty, např. poriny Salmonella typhímurium, „srážlivé faktory Staphylococcus aureus, moduliny Gram negativních baktérií, „hlavní vnější membránový protein legionell nebo Haemophilus influenzae typu B nebo klebsiell nebo M-molekuly skupiny G streptokoků.

1.7 Strukturní geny pro enzymy, které přeměňují předlék na lék

Ke strukturním genům pro enzymy, které např. přeměňují nebo štěpí předléky na aktivní cytostatika, patří například takové enzymy jako thymidinkináza viru Herpes simplex, thymidinkináza viru Varicella zoster, bakteriální nitroreduktáza, bakteriální β-glukuronidáza, β-glukuronidáza ze Secale cereale, lidská β-glukuronidáza, lidská karboxvpeptidáza (CB), např. CB-A mastocytů, pankreatická

CB-B, bakteriální karboxypeptidáza, bakteriální β-laktamáza, bakteriální cytosindeamináza, fosfatáza, např. lidská alkalická fosfatáza, lidská kyselá prostatická fosfatáza, kyselá fosfatáza typu 5, oxidáza, např. lidská lysyloxidáza, lidská kyselá D-aminooxidáza, peroxidáza, např. lidská glutathionperoxidáza, lidská eosinofilní peroxidáza, lidská tyreoidní peroxidáza nebo galaktosidáza.

···· ··· ···· • · · ···· · · · · • · · ♦ · ······ ···· · ··· ··· ··· ······ · · · ·· · ·

2. Aktivní látky pro léčení nedostatečné tvorby krevních buněk

2.1 Výběr aktivátorové sekvence pro hemopoetické buňky

Aktivátorové sekvence použitá pro hemopoetické buňky je genově regulační sekvence nebo prvek genu, který kóduje protein, který je exprimován obzvláště silně nebo selektivně v hemopoetických buňkách. Genově regulační sekvence tohoto typu zahrnují promotorové sekvence pro geny cytokinů nebo jeho receptorů, jehož exprese v nezralých hemopoetických buňkách nebo v buňkách sousedních, jako jsou například buňky stromatu kostní dřeně, předchází následný cytokin, který působí na hemopoetické buňky a je vyžadován jako aktivní látka. Cytokiny tohoto typu, které působí na nezralé hemopoetické buňky, jsou například faktor kmenové buňky, IL1,

IL-3, IL-6, GM-CSF nebo trombocytopoetin nebo receptory pro tyto cytokiny. Odkazy na takové cytokiny jsou uvedeny ve

WO

96/06941. K těmto patří promotorové sekvence genu pro např. receptor faktoru kmenové buňky, faktor kmenové buňky,

IL-Ια, receptor IL-1,

IL-3, receptor IL-3 receptor IL-3 (podjednotka

IL-6, receptor IL-6,

GM-CSF, receptor GM-CSF interferonový regulační faktor 1 erytropoetin nebo receptor erytropoetinu.

sekvence metabolícky specifické. Příklady metabolicky (tj.

hypoxií) aktivovatelných aktivátorových sekvencí byly popsány autory

Semenza et al., (PNAS, 88, 5680, 1991) nebo Mc Burney et al., (Nucl. Acids Res., 19, 5755, 1991).

2.2 Výběr strukturních genu • · · · · • · · · · · · • · · · · · · • · ·· ······ pro aktivní látky pro hemopoetické buňky „Aktivní látka pro hemopoetické buňky všeobecně znamená protein, který uskutečňuje proliferaci a/nebo diferenciaci krevních buněk. Příklady genů pro takovou látku jsou uvedeny v seznamu ve WO 96/06941.

Patři k nim strukturní geny pro léčbu anémie, např.

erytropoetin, strukturní geny pro léčbu leukopenie, např.

G-CSF, GM-CSF, strukturní geny pro léčbu trombocytopenie, např.

IL-3,

3. Aktivní inhibiční faktor látka pro léčbu (LIF), IL-11 nebo trombopoetin.

autoimunitnich nemocí, alergií, prevenci orgánových rejekcí

3.1 Výběr aktivátorové sekvence

Aktivátorové sekvence, které mohou být použity, jsou promotorové sekvence genů silně aktivovaných v makrofázích nebo lymfocytech nebo genů pro proteiny, které jsou extenzivně tvořeny během imunitní odpovědi v makrofázích a/nebo v lymfocytech. Příklady promotorových sekvencí genů kódujících takové proteiny jsou popsány ve WO 96/06941. K těmto proteinům patři receptor IL-1, IL-la, IL-Ιβ, IL-2, receptor IL-2, IL-3, receptor IL-3 (podjednotka a), receptor IL-3 (podjednotka β) , IL-4, receptor IL-4, IL-5, IL-6, interferonový regulační faktor 1 (IRF-1), promotor responzivní na IFN-γ, IL-7, IL-8, IL-10, IL-11, IFN, GM-CSF, receptor GM-CSF (řetězec a), IL-13, LIF, receptor faktoru stimulujícího kolonii makrofágů (M-CSF) , receptory makrofága typu I a II, MAC-1 (leukocytárni funkční antigen), LFA-Ια (leukocytárni funkční antigen) nebo pl50,95 (leukocytárni funkční antigen).

• ·

3.2 Výběr genů pro aktivní látky

Aktivní látka pro tento účel je sekvence DNA pro cytokin, chemokin, růstový faktor nebo jeden z jejich inhibitorů, extracelulárni část receptorů pro cytokin nebo růstový faktor, protilátka, protilátkový fragment, inhibitor enzymu nebo enzym. Výběr aktivní látky závisí na základní poruše, která má být léčena, a na vybrané promotorové sekvenci. Příklady výběru strukturního genu vhodného pro léčení autoimunitních nemocí, alergie, zánětu nebo pro prevenci orgánové rejekce jsou uvedeny ve WO 96/06941. K těmto příkladům patří např. strukturní geny pro léčbu alergií, např. kódující IFNP, IFNy, IL-10, protilátky nebo protilátkové fragmenty specifické pro IL-4, rozpustné receptory IL-4, IL-12 nebo TGFp.

Strukturní geny pro prevenci rejekce transplantovaných orgánů kódují např. IL-10, TGF3, rozpustné receptory IL-1, rozpustné receptory IL-2, antagonisty receptorů IL-1, rozpustné receptory IL-6, imunosupresivní protilátky nebo fragmenty obsahující fragmenty V_H a V_L těchto protilátek nebo fragmenty- V_H a V_L spojené spojkou. Protilátky jsou specifické pro T buněčný receptor nebo jeho komplex CD3, proti CD4 nebo CD8, proti receptorů IL-2, receptorů IL-1 nebo receptorů IL4, nebo proti adhezivním molekulám CD2, LFA-1, CD28 nebo CD40.

Strukturní geny pro léčbu autoimunitních nemocí zprostředkovaných protilátkami kódují např. TFGP, IFNa, IFNp, IFNy, IL-12, rozpustné receptory IL-4, rozpustné receptory IL-6 nebo imunosupresivní protilátky nebo jejich fragmenty obsahující V_H a V_L.

Strukturní geny pro léčbu autoimunitních nemocí zprostředkovaných buňkami

IL-13, TNFa, IL-4, TNFp kódují např. IL-6, IL-9, IL-10, nebo imunosupresivní protilátku a její fragmenty obsahující

V_H a V_L.

Strukturní geny kóduj ící inhibitory buněčné proliferace, cytostatické nebo cytotoxické proteiny enzymy pro přeměnu nebo aktivaci předléků na cytostatické nebo fúzní proteiny, mohou být stejné jako pro léčbu nádorů.

4. Aktivní látky pro léčbu artritidy

4.1 Výběr aktivátorové sekvence pro artritidu

Aktivátorové sekvence všeobecně znamená promotorovou nebo zesilovací sekvenci, se kterou se transkripčni faktory formují nebo aktivně zánětlivých buňkách.

Pro účel tohoto vynálezu výhodné promotorové sekvence zahrnují genově regulační sekvence a prvky genů, které kódují proteiny, které jsou exprimovány zejména v synoviálních buňkách

Příklady takových proteinů jsou těmto proteinům patří např.

MMP-1 kolagenáza), MMP-3 (stromelyzin/tranzin)

WO 96/06941. K nebo tkáňové inhibitory metaloproteináz (TIMP), např. TIMP-1, TIMP-2 nebo

TIMP-3.

4.2 Výběr strukturních genů pro aktivní látky pro artritidu

Aktivní látka pro tento účel všeobecně znamená sekvenci DNA, jejíž exprimovaný protein přímo nebo nepřímo inhibuje záněty, například v kloubu, a/nebo podporuje rekonstituci mezibuněčné hmoty jako je chrupavka a/nebo vazivová tkáň v kloubu. Příklady takových proteinů jsou uvedeny ve ·· · · · · · ···· • · · · · · ···· · ··· · · ··· ··· ··· ······ ·· · ·· · ·

WO 96/06941. K těmto proteinům patří např. antagonista receptoru IL-l, rozpustný receptor IL-1, IL-6, rozpustný receptor TNF, IL-4, IL-10, růstový faktor podobný inzulínu,

TGFp, superoxiddismutáza nebo TIMP, např. TIMP-1, TIMP-2 nebo TIMP-3.

5. Protiinfekční látka

Všeobecně může být aktivní látka připravena ve dvou podstatně odlišných formách: pro léčbu virových infekcí a parazitárních invazí nebo pro profylaxi infekčních nemocí způsobených virem, baktérií nebo parazitem. Pro profylaxi infekčních nemocí se všeobecně používají vakcíny. Avšak možnosti pro přípravu účinných vakcín obvyklými prostředky jsou omezeny. Tak byla vyvinuta technologie DNA vakcín. Avšak tyto DNA vakcíny vyvolaly otázky o bezpečnosti a vedlejších účincích (Fynan et al., Int. J. Immunopharm., 17, 79, 1995, Donelly et al., Immunol., 2, 20, 1994).

Následující konstrukty pro profylaxi infekčních nemocí jsou rozeznatelné od látek dosavadního stavu techniky pro svou buněčnou specifitu a regulaci buněčným cyklem, což poskytuje vysoký stupeň spolehlivosti těchto látek:

5.1 Výběr aktivátorové sekvence

5.1.1 Léčba infekčních nemocí

Aktivátorové sekvence, která je vybrána pro léčbu infekčních nemocí, obsahuje promotorové sekvence z buněčných genů, jejichž aktivita je změněna zejména infekcemi baktériemi nebo parazity, nebo promotorové sekvence jsou z virů, které transformují buňky jimi infikované a stimulují proliferaci. Tyto viry zahrnují například HBV, HCV, HSV, • 4 ·· 4 ········ • · 4 · 4 4 4444 · ··· ·· ··· ··· 4 44

444444 4 4 · · 4 44

HPV, HIV, EBV a HTLV. Příklady těchto aktivátorových sekvencí jsou popsány ve WO 96/06941.

5.1.2 Profylaxe infekčních nemocí

Aktivátorové sekvence, která je vybrána pro profylaxi infekčních nemocí, obsahuje promotorové sekvence, které jsou všeobecně silně aktivované v endotelových buňkách, svalových buňkách, lymfocytech nebo makrofázích, nebo které patří k buněčným genům kódujícím proteiny, které jsou všeobecně vysoce exprimovány v endotelových buňkách, svalových buňkách, makrofázích nebo lymfocytech.

Příklady těchto aktivačních sekvencí jsou dány v předchozích a následujících kapitolách.

5.2 Výběr strukturních genů pro aktivní látky

5.2.1 Léčba infekčních nemocí

Aktivní látka, která je vybrána, je DNA kódující protein, který má cytostatické, cytotoxické, protibakteriální nebo protivirové účinky nebo který je enzym transformující inaktivni prekurzor na cytostatický, cytotoxický, protibakteriální nebo protivirový lék. Příklady cytotoxických nebo cytostatických proteinů a cytokinů a růstových faktorů s protivirovou aktivitou byly popsány ve WO 96/06941. K těmto látkám patří například protivirové aktivní cytokiny a růstové faktory, např. IFNa, IFN3, IFNy, TNFp, TNFa, IL-1 nebo TGFp. Dalšími příklady jsou protilátky, které inaktivují specifický virus, nebo jejich fragmenty obsahující V_H a V_L, nebo jejich fragmenty V_H a V_Lspojené spojkou. Příklady protivirových protilátek jsou protilátky specifické pro HBV, HCV, HSV, HPV, HIV, EBV, • · • 9

HTLV,

Coxsackie virus nebo Hantaan virus.

Dalšími příklady jsou protein vázající rev, např. RBP9-27,

RBP1-8U,

RBP1-8D nebo pseudogen RBP1-8.

K těmto látkám patří také např.

ribozym, který katalýzuje mRNA genů pro proteiny, které řídí buněčný cyklus, nebo mRNA příslušného viru nebo strukturní geny pro antibakteriální proteiny, např. protilátky, které neutralizují bakteriální toxiny nebo opsonizují baktérie, např. protilátky specifické pro meningokok C nebo Β, E. coli, borrelie, pseudomonas, Helicobacter pylori nebo Staphylococcus aureus.

Protilátky nebo protilátkové fragmenty jsou příklady protibakteriálních nebo protivirových proteinů. Jak je zmíněno výše, pro některé látky může být vyžadována enzymatická přeměna prekurzoru na aktivní formu. V takovém případě je protibakteriální, protivirová, cytotoxická nebo protiparazitární látka přidána poté, co byl již podán konstrukt podle vynálezu. Příklady enzymů přeměňujících takové předléky a genů pro takové enzymy byly popsány ve WO 96/06940 a WO 96/06941 a v předešlé kapitole.

5.2.2 Profylaxe infekčních nemocí v jednom provedení je aktivní látka protilátka nebo protilátkový fragment specifický pro patogen. V dalším provedení je aktivní látka protein, který je tvořen patogenem a který vede prostřednictvím imunitní odpovědi, tj. vazbou protilátky a/nebo cytotoxických lymfocytů, k neutralizaci a/nebo usmrcení patogenu. Neutralizační antigeny tohoto typu se již používají jako imunizující antigeny (viz přehled Ellis, Adv. Exp. Med. Biol., 327, 263, 1992). Sekvence DNA kódující takové proteiny se používají, • · ·

• · · · · · · • · · · · ··· • · · · ·«· · ···· · • · · · · · • · · · · · · aby tvořily konstrukty podle vynálezu. Příklady těchto genů byly popsány ve WO 96/06941, např. geny kódující antigen chřipky A, antigeny HIV, antigen viru rabies, antigen HSV (virus herpes simplex), antigen RSV (respirační syncyciální

virus),	antigen viru parainfluenzy, ant	igen rotav	iru,
antigen	VZV (virus varicella	zoster),	antigen	CMV
(cytomegalovirus) , antigen viru	spalniček,	antigen	HPV
(lidský	papilomavirus), antigen	HBV (virus	hepatitidy	B) ,

antigen HCV (virus hepatitidv C), antigen HDV (virus hepatitidy D) , antigen HEV (virus hepatitidy E) , antigen HAV (virus hepatitidy A) , antigen vibria cholery, antigen borrelie Burgdorferi, antigen Helicobacter pylori, antigen malárie nebo antiidiotypová protilátka nebo její fragmenty vázající protilátku, jejichž komplementární určující oblasti jsou kopie proteinové nebo sacharidové struktury neutralizačního antigenu infekčního organismu.

6. Aktivní látky pro léčbu leukémií a nádorů

6.1 Výběr aktivátorové sekvence pro leukémie a nádory

Poskytnuté aktivátorové sekvence jsou promotorové nebo zesilovací sekvence, se kterými interagují transkripční faktory tvořené nebo aktivní v leukemických buňkách. Avšak pro účel vynálezu výhodné aktivátorové sekvence zahrnují genově regulační sekvence a prvky genů, které kódují proteiny tvořené zejména v nádorových nebo leukemických buňkách. Příklady jsou uvedeny ve WO 96/06941, např. promotory genů kódujících c-myc, HSP-70, bcl-l/cyklin D-l, bcl-2, IL-6, IL-10, NFcc, TNFp, HOX-11, BCR-Abl, E2A-PBX-1, PML-RATA (promyelocytární leukemie - receptor kyseliny retinové), c-myc, proteiny N-CAM, receptor růstového faktoru • · • · · · · · · ··«· «·« ···· ·· · · · · · ···· • · · · · ··*·«· »·· · · • · · · · · ··· «···«· «· · ·· · · hepatitidy, L-plastin nebo polymorfní epitelový mucin (PEM).

6.2 Výběr strukturních genů pro aktivní látky pro leukémie a nádorové buňky

Aktivní látka pro tento účel všeobecně znamená protein, který inhibuje proliferací buněk, obzvláště také nádorových nebo leukemických buněk. Tyto inhibitory buněčné proliferace zahrnují například sekvence DNA pro inhibiční, cytostatické, apoptotické a cytotoxické proteiny a enzymy pro štěpení předléků, které již byly popsány.

Inhibitor buněčné proliferace dále znamená sekvenci DNA, která exprimuje protein, který má, přímo nebo nepřímo, cytostatický nebo cytotoxický účinek na leukémie nebo nádory. Takové proteiny již byly popsány v předchozích kapitolách. Sekvence DNA kódující takové proteiny se používají ke tvorbě konstruktů podle předkládaného vynálezu.

Inhibitor buněčné proliferace dále všeobecně znamená sekvenci DNA kódující protein nebo peptid, který vyvolává humorální nebo buněčnou imunitní odpověď cytotoxickou nebo cytostatickou pro nádor. K takovým proteinům nebo peptidům patří např. strukturní geny pro nádorové vakciny. K tomu patří antigeny na nádorových buňkách. Například takové antigeny jsou uvedeny v přehledu autora Sedlaček et al., (Contrib. to Oncol., 32, Karger Verlag, 1988 a Contrib. to

Oncol., 43, Karger Verlag, 1992). Dalšími příklady jsou antigeny nebo geny kódující sialyl Lewis, peptidy na nádorových buňkách rozpoznatelné T buňkami, proteiny exprimované onkogeny, antigeny krevních skupin a jejich prekurzory, antigeny polymorfního epitelového mucinu nebo antigeny proteinů tepelného šoku.

·· 44 ·* ·44*4 • · · · 4 4 4*444 ·· · 4 4 4 4 ·· 4V · · · * · 4444 · 444 *4

444 444444 • 4 44*4 ·4 4 ·***

7. Aktivní látka pro inhibici proliterace buněk hladkého svalstva v cévních uzávěrech

7.1 Výběr aktivátorové sekvence pro buňky hladkého svalstva

V jednom provedení jsou aktivátorové sekvence genově regulační sekvence nebo prvky genů, které kódují proteiny, které jsou tvořeny zejména v buňkách hladkého svalstva. Příklady promotorů genů kódujících takové proteiny jsou popsány ve WO 96/06938 a WO 96/06940. Patří k nim tropomyozin, a-aktin, α-myozin, receptor pro PDGF, receptor pro FGF, MRF-4, fosfofruktokináza A, troponin C, myogenin, receptory pro endotelin A, dezmin, VEGF nebo syntetické promotory.

Kromě toho faktory rodiny „šroubovice-smyčkašroubovice (HLH, helix-loop-helix), (MyoD, Myf-5, myogeny MRF4) a protein „zinkového prstu GATA-4 jsou uváděny jako transkripční aktivátory specifické pro svaly. Proteiny HLH, a také GATA-4, projevují transkripci specifickou pro svaly nejenom s promotory genů svalově heterologním kontextu, např. se specifických, ale také v syntetickými promotory.

Takové syntetické promotory jsou například:

mnohonásobné (sekvence identifikačním číslem 3) nebo mnohonásobné kopie

5'GGCCGATGGGCAGATAGAGGGGGCCGATGGGC-AGATAGAGG-3' identifikačním číslem 4.)

7.2 Výběr strukturních genů pro aktivní látky pro buňky hladkého svalstva

Aktivní látky pro tento účel všeobecně znamenají protein, který inhibuje proliferaci buněk hladkého svalstva. Příklady těchto inhibitorů proliferace již byly popsány v

předchozích kapitolách.

8. Aktivní látka pro inhibici nebo aktivaci koagulace

8.1 Výběr aktivátorové sekvence pro inhibici nebo aktivaci koagulace

Aktivátorové sekvence pro použití za tímto účelem všeobecně jsou genově regulační sekvence nebo prvky genů, které kódují proteiny detekovatelné v buňkách hladkého svalstva, v aktivovaných endotelových buňkách, v aktivovaných makrofázích nebo aktivovaných lymfocytech.

8.1.1 Buňky hladkého svalstva

Příklady promotorových sekvencí pro geny buněk hladkého svalstva již byly zmíněny ve WO 96/06938 a v předchozích kapitolách.

8.1.2 Aktivované endotelové buňky nebo buňky sousedící s aktivovanými endotelovými buňkami

Příklady proteinů, které se tvoří obzvláště v aktivovaných endotelových buňkách, byly popsány ve WO 96/06938 a WO 96/06940 a v předchozích kapitolách.

8.1.3 Aktivované makrofágy a/nebo aktivované lymfocyty

Aktivátorové sekvence pro tento účel všeobecně znamená promotorovou sekvenci genu kódujícího protein, který je vydatně tvořen během imunitní odpovědi v makrofázích a/nebo v lymfocytech. Příklady již byly popsány ve WO 96/06941 a WO 96/06938 a v předchozích kapitolách.

• · • β • · ···· ······· ·· · ········ • · · · · · ···· · ··· · · • · · ······ ·· ···· ·· · · · ··

8.2 Výběr strukturních genů pro aktivní látky pro inhibici nebo aktivaci koagulace nebo pro modulaci kardiovaskulárního systému

V jednom provedení je aktivní látka použitá pro tento účel protein, který inhibuje, přímo nebo nepřímo, agregaci destiček nebo koagulační faktor, nebo stimuluje fibrinolýzu. Aktivní látka tohoto typu se tedy nazývá antikoagulans. Antikoagulans, která se použijí, jsou například geny pro aktivátory plazminogenu (PA), například tkáňový PA (tPA) nebo PA podobný urokináze (uPA) nebo hybridy tPA a uPA nebo protein C, antitrombin III, inhibitor C-1S, al-antitrypsin, inhibitor dráhy tkáňového faktoru (TFPI) nebo hirudin.

V dalším provedení je aktivní látka použitá pro tento účel také protein, který podporuje krevní koagulaci. Příklady takových proteinů jsou například proteiny krevní plazmy jako F VIII, F IX, von Willebrandův faktor, F XIII, PAI-1 nebo PAI-2.

Ve třetím provedení je aktivní látka použitá pro tento účel také protein, který moduluje kardiovaskulární systém indukcí angiogeneze nebo snížením krevního tlaku. Příklady genů kódujících takové proteiny jsou faktory angiogeneze, např. VEGF nebo FGF nebo peptidy snižující krevní tlak, např. kalikrein nebo „syntáza oxidu dusnatého endotelových buněk.

V dalším provedení je aktivní látka použitá pro tento účel gen kódující krevní protein. Příklady takových krevních proteinů jsou albumin, inaktivátor Cl, sérová cholinesteráza, transferin nebo 1-antitrypsin.

• · • · • · · · ······· • · · ········ • · · · · ······ ···· · • · · ······ ······ ·· · ·· ··

9. Aktivní látka pro ochranu před poškozením CNS

9.1 A.ktivátorové sekvence pro aktivní látku pro ochranu před poškozením CNS

9.1.1 Aktivátorové sekvence aktivované v endotelových buňkách

V jednom provedení tento typ aktivátoru zahrnuje promotorové sekvence genů proteinů specifických pro endotelové buňky. Příklady těchto promotorových sekvencí jsou uvedeny v seznamu ve WO 96/06939 a již byly popsány v předešlých kapitolách.

9.1.2 Aktivátorové sekvence aktivované v gliových buňkách

Jedna výhodná aktivátorové sekvence je promotorova nebo zesilovací sekvence, se kterou interaguji transkripčni faktory tvořené nebo do určité míry aktivní v gliových buňkách. Příklady těchto aktivátorových sekvenci jsou uvedeny v seznamu ve WO 96/06939. Patří k nim promotory genů kódujících protein periaxin specifický pro Schwannovy buňky, glutaminsyntetázu, protein specifický pro gliové buňky (gliový vláknitý kyselý protein = GFAP), protein SlOOb gliové buňky, IL-6 (CNTF), receptor 5-HT, TNFa, IL-10, receptor růstového faktoru podobného inzulínu I a II nebo VEGF.

9.2 Výběr strukturních genů pro neurospecifické faktory „Neurospecifický faktor pro účel předkládaného vynálezu je sekvence DNA, která kóduje neuronový růstový faktor nebo inhibitor či supresor TNFa. Příklady těchto genů jsou uvedeny v seznamu ve WO 96/06939. Patří k nim geny • · • ·

kódující FGF, nervový růstový faktor (NGF), neurotrofický faktor pocházející z mozku (BDNF), neurotrofin-3 (NT-3), neurotrofin-4 (NT-4), ciliární neurotrofický faktor (CNTF), TGFp, rozpustné receptory TNF, IL-10, rozpustné receptory IL-1, IL-1 receptor I, IL-1 receptor II, antagonista receptoru IL-1 nebo rozpustné receptory IL-6.

Konstrukty podle předkládaného vynálezu jsou výhodně aplikovány nebo injikovány do poškozené tkáně, do oblasti poškozených nervů nebo do míchy nebo do mozku, aby transdukovaly endotelové buňky nebo gliové buňky, aby exprimovaly léčebný protein.

10. Léčebné použití

Jako příklad může být výše popsaný konstrukt podáván pacientovi, který potřebuje léčit nemoc, například nádor, leukémii, zánětlivé onemocnění, onemocnění charakterizované nadbytkem proliferace endotelových tvorbu krevních buněk, autoimunitní buněk, nedostatečnou onemocnění, alergii, hrozící rejekci transplantovaného orgánu, infekci, koagulační poruchu nebo poškození CNS.

Pro podáváni může být popsaný konstrukt plazmidového vektoru odborníkovi dobře nebo virového vektoru podle může být známé. Vektor aplikován lokálně nebo injikován do systému, intrapleurálně, intracerebrospinálně, intravezikálně, technologie pacientovi kardiovaskulárního intraperitoneálně, intrabronchiálně, intragastrointestinálně nebo injikován do jakékoliv jiné tkáně nebo orgánů.

V případě, že strukturní gen konstruktu kóduje enzym, který štěpí nebo přeměňuje netoxický neúčinný předlék na účinný lék, je tento předlék pacientovi podáván následně po

	36	• · · · · · · • · · · · · · • · · · · · · • · · ·· ······ • · · · · · ·· ···· ·· ·	• · · · • · · · • · · · • · · · · • · · • 9 99
injekci konstruktu tohoto	vynálezu.
Předkládaný vynález	je deta	ilně vysvětlen	pomocí
následujících příkladů ε	i tabulek,	které ilustrují, ale
neomezují oblast vynálezu.
Popis tabulek
Tabulka 1
Strukturně funkční	analýza	CHR cdc25C.	Mutace

promotorových konstruktů cdc25C (založených na C290, Zwicker et al., EMBO J., 14, 4514, 1995) v oblasti CHR byly analyzovány na regulaci buněčného cyklu v buňkách NIH3T3. Pozice -16 až -12 představují dříve definovaný CDE (Zwicker et al., EMBO J., 14, 4514, 1995). Výsledky tranzientních luciferázových testů jsou vyjádřeny jako poměr pozorovaných RLU u rostoucích buněk vztažených k aktivitě v klidových buňkách. Výsledky ukázané v tabulce shrnují data ze 4 samostatných pokusů při použití alespoň dvou nezávislých preparátů plazmidové DNA. Hodnoty představují průměry, ve všech případech nebyly standardní odchylky vyšší než ± 1,5. Reportérový plazmid SV40 byl zahrnut do každého pokusu, aby standardizoval faktor indukce (reportérový SV40 typicky dával l,5x vyšší hodnotu v rostoucích buňkách ve srovnání s buňkami v klidu).

Tabulka 2

Účinky specifických nukleotidových záměn mezi modulem E2FBS-CHR B-myb a motivem CDE-CHR cdc25C na regulaci buněčného cyklu a vazbu DNA komplexů E2F a CDF-1. Represorové moduly B-myb a cdc25C jsou ukázány nahoře. Pět pozic, kde se sekvence navzájem liší, jsou označené jako • to ·· toto · · · toto toto·· ··· · • · · · · · · *··· • · · · · · ···· · ··· · · ··· ··· ··· ·· ···· ·· · ·· ·· oblasti 1 až 5. Každý z mutantů vyznačených níže obsahuje specifické změny mezi dvěma promotory na pozadí promotoru B-myb (horní blok) nebo cdc25C (dolní blok). „B a „C vyznačují, zda konkrétní mutant obsahuje cdc25C (C) nebo Bmyb (B) v oblastech 1 až 5 (např. B-Cl je sekvence B-myb obsahující nukleotidy cdc25C v oblasti 1). Regulace buněčného cyklu byla měřena nejdříve srovnáním aktivity divokého typu a mutovaných konstruktů v klidových buňkách NIH3T3. Sloupec označený „represe sumarizuje výsledky této analýzy. (+ poměr: mutant divoký typ: <2; - poměr mutant divoký typ: > 3) . U funkčních promotorových konstruktů se poté analyzovalo časování regulace buněčného cyklu v buňkách NIH3T3 stimulovaných sérem a určovaly se časy poloviny maximální aktivity. Prázdné šipky ukazují kinetiku, která se jasně liší od obou promotorů divokého typu B-myb a cdc25C. Data pro vazby CDF-1 a E2F se získaly pomocí metody EMSA se sondami pro divoký a mutovaný typ E2FBS-CHR B-myb a se sondami pro divoký a mutovaný typ CDE-CHR cdc25C při použití jaderného extraktu z buněk HeLa nebo částečně purifikovaného CDF-1.

Aby se prokázaly účinky specifických nukleotidových změn na časování transkripce regulované buněčným cyklem promotory B-myb a cdc25C, byly buňky NIH3T3 přechodně transfekovány vyznačenými konstrukty, synchronizovány v G_osérovou deprivací a stimulovány přidáním 10% FCS. Data jsou založena na 12 různých pokusech, kromě grafu pro C-B1,2, který je založen na 4 pokusech. Data byla normalizována na 100 (%) ve 20 hodinách pro každý konstrukt, aby se usnadnilo srovnání polovin maximálních hodnot exprese.

Příklady provedení vynálezu

Přiklad 1

1. Materiál a metody

1.1 Tkáňová kultura, transfekce DNA a luciferázové testy

Buňky NIH3T3 byly pěstovány v živném médiu podle Dulbecco-Vogta modifikovaného Eaglem (DMEM) doplněném 10% fetálním telecím sérem, penicilinem a streptomycinem. Buňky HeLa byly pěstovány v DMEM s 5% fetálním telecím sérem. Buňky NIH3T3 byly transfekovány dextranovou technikou DEAE (Lucibello et al., EMBO J., 14, 132, 1995). Pro synchronizaci ve fázi G_o byly buňky udržovány v živném médiu bez séra po 2 dny 12 hodin po transfekci a restimulovány 10% FCS. Určení luciferázových aktivit a standardizace výsledků za použití reportérových konstruktů řízených promotorem SV40 se prováděly jak bylo již dříve publikováno (Lucibello et al., EMBO J., 14, 132, 1995).

1.2 Sekvenční analýza a luciferázové konstrukty

Luciferázové konstrukty řízené promotory cdc25C a B-myb byly popsány autory Lucibello et al. (EMBO J., 14, 132, 1995) a Zwicker et al. (EMBO J., 14, 4514, 1995). Mutace byly zavedeny strategií PCR - polymerázové řetězové reakce, jak popsáno dříve (Good a Nazar, Nucl. Acids Res., 20, 4934, 1992, Lucibello et al., EMBO J., 14, 132, 1995). Všechny fragmenty množené metodou PCR byly ověřeny sekvencovánim DNA za použití dideoxynukleotidové terminační metody používající

Sequenase (USB) nebo Tth polymerázu (Pharmacia).

1.3 EMSA

Analýza změny elektroforetické pohyblivosti (electrophoretic mobility Shift analysis - EMSA) se prováděla, jak popsáno (Zwicker et al., Science, 271, 1595, 1996). Když byl použit částečně purifikovaný CDF-1, byla EMSA prováděna v nepřítomnosti deoxycholátu sodného a NP-40. Byly použity následující dvouřetězcové sondy:

- cdc25C-wt: 5'-ACTGGGCTGGCGGAAGGTTTGAATGGTCAA (sekvence s identifikačním číslem 5) (CDE tučně, CHR kurzívou). TI, T4, T7 (také nazýván jako cdc25C-mCDE), A8 a C9 jsou mutovány (Zwicker et al., Nucl. Acids Res., 23, 3822, 1995) v pozicích -19, -16, -13, -12 a -11 (tabulka 1), jak popsáno.

- cdc25C-lQ/-l: 5'-ACTGGGCTGGCGGActt7TTGAATGGTCAA (sekvence s identifikačním číslem 6)

- cdc25C-6/-3 (také nazývána jako ccřc25C-mCHR): S^-ACTGGGCTGGCGGAAGGTggtcATGGTCAA (sekvence s identifikačním číslem 7)

- cdc25C-l/+2: 5'-ACTGGGCTGGCGGAAGGTTTGAAggtTCAA (sekvence s identifikačním číslem 8)

- cdc25C-2: 5'-ACTGGGCTGGCGGAAGGTTTGAcTGGTCAA (sekvence s identifikačním číslem 9).

Sekvence všech dalších oligonukleotidů, včetně B-myb, byly popsány jinde (Zwicker et al., Science, 271, 1595,

1996) nebo jsou ukázány v tabulce 2. Náhodný oligonukleotid

obsahuje irelevantní sekvenci	(Zwicker et al.,	EMBO J.,	14,
4514, 1995).
Byly	použity následující	protilátky:	E2F-1	(Santa	Cruz
SC-251X),	E2F-2 (Santa Cruz	SC-632X),	E2F-3	(Santa	Cruz
SC-879X),	E2F-4 (Santa Cruz	SC-512X),	E2F-5	(Santa	Cruz
SC-999X),	DP-1 (získán od N.	La Thangue)	, DP-2	(Santa	Cruz

SC-830X).

1.4 Částečná purifikace C

Jaderné extrakty byly připraveny ze suspenzních kultur buněk HeLa v extrakčním pufru s vysokou koncentrací solí (Dignam et

Acids

Res., 11, 1475, přítomnosti proteaz pepstatinu

A (5 μρ/πιΐ) aprotininu (80

Biotinylovaný oligonukleotid obsahující dva tandemové motivy

CDE-CHR cdc25C byl navázán na streptavidinovou agarózu a použit pro afinitní chromatografii, jak popsáno (Kadonaga a

Tjian, PNAS, 83, 5889, 1986), za použití stejných podmínek jako pro EMSA (viz výše) kromě toho, že byla jako nespecifický kompetitor použita místo Poly(dA:dT) DNA lososího spermatu. Eluce se prováděla postupným zvyšováním koncentrace KC1 na 1 M.

1.5 „DMS-footprinting in vitro „DMS-footprinting in vitro kódujícího vlákna

oligonukleotidu (Zwicker et al.,	cdc25C se prováděl, jak Science, 271, 1595, 1996) .	bylopublikováno
1.6 Genomový	„footprinting stabilně	transfetovaných
buněčných linií

Pro vytvoření stabilních buněčných linií byly vloženy luciferázový konstrukt C290 divokého typu cdc25C a mutant CHR C290mCHR5/6 (TTTGAA změněno na TagGAA) do vektoru pAGLu, který obsahuje oblast pro připojení k matrici (SAR), a byly elektroporací vloženy do buněk NIH3T3. Trvale transfekované klony se izolovaly za selekce G418 a analyzovaly na luciferázovou expresi v klidových a rostoucích buňkách. Klony s očekávaným typem exprese byly množeny a analyzovány φφφφ φφφ · · ·· ·· · φφφφφφφφ • · · · · φ φ φ φ φ φ ····· • · · · · ···· • φ φ φ φ φ φ φ φ φφ φφ genomovým „footprintingem (Pfeifer et al., Science, 246, 810, 1989), jak popsáno (Lucibello et al., EMBO J., 14, 132, 1995) s výjimkou, že první primer (Pl) byl specifický pro luciferázový gen 5'-GTAACACAAAGGAATTCAAGC (sekvence s identifikačním číslem 10).

2. Výsledky

2.1 Identifikace CDF-1

2.1.1 Charakterizace CHR cdc25C

Nedávno byla definována souhlasná sekvence CDE jako G/CGC/TGG/C (GGCGG v cdc25C} (Zwicker et al., EMBO J., 14,

4514, 1995). Avšak pro CHR taková informace ještě není dostupná. Aby se vytyčily hranice CHR a identifikovaly pozice kritických nukleotidů, byl do CHR promotoru cdc25C zaveden velký počet mutací, a analyzovala se funkce těchto mutovaných konstruktů měřením jejich represe v buňkách NIH3T3 synchronizovaných v Go. Data v tabulce 1 jasně ukazují, že CHR se rozprostírá od -7 až -2, a že všechny nukleotidové pozice v této oblasti jsou nezbytné. Naopak nukleotidové pozice mezi CDE a CHR (-11 až -8, AAGG) a nukleotidy po směru čtení od CHR (> 1, TGG...) mohou být změněny bez detekovatelných účinků na represorovou funkci. CHR cdc25C může být tedy definován jako sekvence TTTGAA.

2.1.2 Obsazení CDE in vivo je závislé na intaktním CHR

Předešlá data jasně ukázala, že CDE a CHR v různých promotorech působí synergicky, protože mutace v jakémkoliv prvku zruší represi v Go (Zwicker et al., EMBO J., 14, 4514,

1995). To by mohlo znamenat, že interagující faktor(y) se ·· • · · · · · ···· · ··· · · • * · · · · «·· ·· ···· ·· · ·· ·· váže(i) k oběma prvkům kooperativně. Otázka byla objasněna genomovým „footprintingem trvale transfekované buněčné linie NIH3T3 nesoucí konstrukt promotoru cdc25C s inaktivující mutací v CHR (cdc25C-mCHR5/6: TTTGAA změněno na TagGAA). Očekávaný typ protekce byl pozorován u kontrolní linie trvale exprimující promotorový konstrukt divokého typu cdc25C. Naopak buněčná linie obsahující promotor cdc25C s mutací CHR nevykazovala žádnou protekci v oblasti ODE a mutovaného CHR, zatímco obsazení dvou konstitutivních vazebných míst pro NF-Y v protisměru čtení (Lucibello et al., EMBO J., 14, 132, 1995) bylo v mutovaném promotoru nezměněno. Bylo tedy vyvozeno, že obsazení CDE je závislé na intaktním CHR, což naznačuje kooperativní vazbu v buňce. Tento závěr je podporován pozorováním, že inzerce buď 5 bp nebo 10 bp mezi CDE a CHR v promotoru cdc25C zruší represi.

2.1.3 Identifikace CDF-1

Analýza změny elektroforetické pohyblivosti (EMSA) jaderného extraktu buněk HeLa vedla k identifikaci jednotky, která kooperativním způsobem interaguje jak s CDE, tak s CHR promotoru cdc25C. Kromě toho vazba této jednotky k mutovaným represorovým prvkům výrazně koreluje s funkčními vlastnostmi těchto prvků. Mutanty (T za G v -19, C za A v -11 nebo delece -1/+2) projevovaly represorovou funkci podobnou divokému typu, vykazovaly stejnou schopnost kompetice ve vazebném testu jako sekvence divokého typu (kompetice sama se sebou) . Naopak další mutanty v buď CDE (T za G v -16, T za G v -13 nebo A za G v -12) nebo CHR (delece -10/-1, delece -6/-3 nebo C za A v -2) vedoucí ke snížené nebo zhoršené represi v buňkách v G_o, vykazovaly také sníženou schopnost kompetice o vazbu. Pozorovaná kooperativní vazba • · vzatá dohromady s korelacemi funkční analýze je v souladu

zjištěnými při strukturně s očekávanými vlastnostmi vazebného faktoru CDE-CHR. Tato jednotka byla nazvána CDF-1.

2.1.4 CDF-1 se stýká s CDE ve velkém zářezu a CHR v malém zářezu

Aby se získal další důkaz, že CDF-1 je jednotka interaguj ící s represorovými prvky in vivo, byla analyzována interakce CDF-1 s metylačně protekčním „footprintingem DNA in vitro. Dříve bylo ukázáno, že CDE se in vivo kontaktuje ve velkém zářezu, zatímco CHR je obsazován v malém zářezu (Zwicker et al., EMBO J., 14, 4514, 1995). Velmi podobný výsledek byl získán in vitro „footprintingem horního vlákna. Čtyři rezidua G v CDE byla specificky chráněna, což naznačuje kontakty ve velkém zářezu (N-7) a dvě rezidua A v CHR byla také specificky chráněna, což naznačuje kontakty v malém zářezu (N-3). Způsob interakce mezi CDF-1 a CDE-CHR in vitro je tedy plně kompatibilní s pozorováními učiněnými intracelulárně.

2.1.5 CDF-1 interakce s mnohonásobnými promotory obsahujícími moduly CDE-CHR

Předešlé studie ukázaly, že funkční moduly CDE-CHR jsou přítomné v různých promotorech, včetně cdc25C, cdc2, a cyklinu A (Zwicker et al., EMBO J., 14, 4514, 1995). Kromě toho je nalezena podobná konfigurace vazebných míst v promotoru B-myb, kde je místo E2F se sekvencí jádra identickou s CDE cdc25C lokalizováno bezprostředně v protisměru čtení od prvku podobného CHR (Bennett et al., Oncogene, 13, 1073, 1996, Zwicker et al., Science, 271,

1595, 1996). Bylo proto zjevně zajímavé zkoumat, zda by

jednotka CDF-1 identifikovaná výše mohla interagovat s represorovými místy v těchto promotorech. Mohlo být zjištěno, že oba promotory obsahující CDE-CHR, tj. cdc2 a cyklín A, vážou jednotku CDF-1 s podobnou účinností jako promotor cdc25C. Ve všech třech případech byla vazba závislá na kooperativní vazbě k oběma CDE a

Materiál a metody) v každém místě sondou cdc25C. V identickém poměru

CHR, protože mutace (viz zhoršovala kompetici se sonda:kompetitor (1:20) byla kompetice modulu E2FBS-CHR promotoru B-myb nevýznamná, ačkoliv určitou kompetici bylo možno pozorovat ve vyšších koncentracích kompetitoru. Fakt, že jednotka CDF-1 vykazuje specifickou a silnou interakci se všemi třemi promotory obsahujícími CDE-CHR, poskytuje další důkaz pro relevanci jednotky identifikované v přítomné studii.

2.1.6 CDF-1 neobsahuje známé členy rodiny E2F

Se zřetelem k podobnosti CDE s E2FBS se usilovalo o vyšetření, zda by jednotka CDE-CHR identifikovaná výše mohla obsahovat známé členy rodin E2F nebo DP. Za tímto účelem byla provedena EMSA v přítomnosti protilátek namířených proti specifickým proteinům DP a E2F. U všech těchto protilátek bylo prokázáno, že buď vyvolávají změny nebo zruší vazbu E2F/DP v různých prostředích. Avšak mohlo být jasně ukázáno, že žádná z použitých protilátek neovlivňovala tvorbu komplexu CDF1-DNA, což naznačuje, že CDF-1 neobsahuje žádný ze známých členů rodin E2F nebo DP.

2.2 Identifikace nukleotidů, určujících přednostní vazbu E2F nebo CDF-1 nebo E2F a CDF-1

Identifikace nukleotidových sekvencí vázajících E2F a

CDF-1 byla komplikována faktem, že komplexy DP/E2F a CDF-1

		·· ·· • · · ·	·· · • · «	·· 99 9 9 9 9
		• · ·	* · · ·	9 9 99
		• · ·	• · ······	99 9 9 9
		• · ·	• · ·	9 9 9
		• · · · · ·	·· 9	99 99
	45
ukazují při EMSA	velmi	podobnou	elektroforetickou
pohyblivost. Proto byl	j aderný	extrakt buněk HeLa	rozdělen
do frakcí DNA-afinitní	chromatografií za	použití	sekvence

CDE-CHR cdc25C o velikosti 20 bp (pro detaily viz Materiál a metody). Tento postup poskytoval částečně purifikovaný CDF-1 vykazující velmi podobné vazebné vlastnosti jako CDF-1 v hrubých extraktech a skýtal kompletní separaci CDF-1 od vazebné jednotky E2F. Pro analýzu komplexů E2F byl do vazebných reakcí zahrnut kompetitorový oligonukleotid CDECHR cdc25C, aby se zabránilo tvorbě radioaktivně značených komplexů CDF-1.

Aby se určila vazebná místa DP/E2F a CDF-1, byly vyměněny specifické nukleotidy mezi promotory B-myb a cdc25C v pěti specifických oblastech, kde se represorové moduly od sebe navzájem liší (označené 1-5 nahoře v tabulce 2) . Odpovídající sekvence byly nejdříve testovány na vazbu E2F (tj. vazba DP1/E2F-1, -3 a -4 v jaderném extraktu HeLa) a na interakci s částečně purifikovaným CDF-1. Tato studie poskytla dva jasné výsledky.

1. Nukleotidy ohraničující CDE nebo jádro E2FBS (oblasti 1 a 2) hrají důležitou roli ve vazbě E2F. Naopak tatáž rezidua patrně neovlivňují vazbu CDF-1.. Zatímco nukleotidy v oblasti 1 (CT v B-myb) ovlivňuji maximum vazby DP1/E2F-4 (B-Cl v tabulce 2), reziduum G v oblasti 2 je rozhodující pro interakci se všemi komplexy E2F (B-C,2 a B-C2 v tabulce 2). V souhlase s tímto závěrem zavedení oblastí 1 a 2 B-myb, ale ne samotné oblasti 1, propůjčí CDE cdc25C schopnost interagovat s vysokou účinností s komplexy DP1/E2F-1, -3a4 (C-B1,2 v tabulce 2). Na rozdíl od toho žádná z těchto nukleotidových změn kolem jádra E2FBS nebo CDE neovlivní

vazbu CDF-1 (B-Cl a B-C1,2, B-C, C-Bl a C-B1,2 v tabulce 2).

2. Konverze byla potvrzena pro vazbu CDF-1, struktura CHR má silný vliv na vazbu CDF-1, i když neovlivní vazbu E2F, a z tohoto hlediska byla oblast 4 rozhodující. Tedy výměna dvou nukleotidů v této oblasti mezi cdc25C a B-myb vedla k silnému zesílení ve vazbě CDF-1 k promotoru B-myb (B-C4 v tabulce 2), zatímco opačná výměna zrušila vazbu CDF-1 k promotoru cdc25C (C-B4 v tabulce 2). Na rozdíl od toho změny v CHR v oblasti 4 neovlivnily vazbu komplexů E2F. Protože bylo formálně možné, že B-myb-CHR se rozšířil za hranice určené pro CHR cdc25C a že se tyto dva promotory liší v těchto pozicích (oblasti 3 a 5 v tabulce), nemohlo být vyloučeno, že C-B4 neinteraguje s CDF-1 kvůli nekompletnímu B-myb-CHR. Proto byly nukleotidy B-myb nalezené v oblastech 3 a 5 také začleněny do sekvence cdc25C navíc ke změně v oblasti 4 (C-B3,4, C-B3,4,5 a C-B4,5 v tabulce 2). Avšak tyto další změny mohly obnovit vazbu CDF-1 pouze do omezené míry, což potvrzuje, že sekvence B-myb-CHR a cdc25C-CHR nejsou ekvivalentní se zřetelem k interagujícím proteinům.

Nakonec se analyzovalo, jak by rozdílná interakce komplexů E2F a CDF- s B-myb a cdc25C, pozorovaná výše, mohla ovlivnit transkripčni represi regulovanou buněčným cyklem a časováni regulace. Stejné sekvence testované na vazbu E2F a CDF-1 byly zavedeny do promotorových luciferázových konstruktů B-myb a cdc25C a testovány na aktivitu v sérem stimulovaných buňkách NIH3T3, které byly synchronizovány v Go- Data v tabulce 2 ukazují, že zrušení vazby E2F k promotoru B-myb v přítomnosti vazby CDF-1 podobné divokému typu zhoršuje represi v G_o (viz B-C1,2). Toto pozorování • » • Λ • 444 silně naznačuje, že komplexy E2F spíše než CDF-1 jsou zodpovědné za transkripci genu B-myb regulovanou buněčným cyklem, která je v souladu s relativně nízkou afinitou CDF1 pro promotor B-myb. Na rozdíl od toho by mohlo být nalezeno, že mutace v CDE cdc25C, které ruší vazbu CDF-1, také zhoršují regulaci buněčného cyklu. Rovněž nahrazení cdc25C s B-myb ruší vazbu CDF-1, a také represi v G_o (C-B4,

C-B3,4 a D-B3,4,5 v tabulce 2). Opačný konstrukt obsahující CHR cdc25C na pozadí promotoru B-myb (B-C4) ukazoval intermediární kinetiku buněčného cyklu, tj. zpoždění v derepresi transkripce relativně k B-myb divokého typu o 3 hodiny.

2.3 Příklad konstrukce a použití genového konstruktu pro genovou terapii podle vynálezu

Vybraný genový konstrukt má následující složky

DNA (uvedené po směru čtení od 5'konce ke 3'konci) : oblast promotoru/časného zesilovače SV40 (nukleotidy 48 až

5191,

Tooze (ed.), DNA Tumor

Viruses (Cold Spring Harbor New

York,

New York, Cold

Spring

Harbor Laboratory, Lucibello et al.,

EMBO J., 14,

132,

1995) připojenou k sekvenci s identifikačním číslem

1, připojenou k sekvenci GCCACC (Kodak, J. Cell

Biol.,

108, 229, 1989), připojenou k cDNA pro signální peptid imunoglobulinu (nukleotidová sekvence <

až > 107, Riechmann et al., Nátuře, 332, 323, 1988), připojenou k cDNA pro β-glukuronidázu (nukleotidová sekvence < 93 až > 1982, Oshima et al., PNAS USA, 84, 685, 1987).

Genový konstrukt je klonován do plazmidového vektoru pUC18/19. Vazba různých složek genového konstruktu je tvořena pomocí vhodných míst, která jsou zachována na koncích každé složky prostřednictvím amplifikace metodou

4··· •« · · •· · • ·9 •99

999999

9 • · · • 9 99

9·99· ·· ··9 • 9 99 • · ·9 • ··9 « 99 9 99 • ·· ·· ··

PCR. Kromě toho jsou použity ligázy specifické pro vybraná restrikčni místa. Tyto ligázy jsou komerčně dostupné a odborníkovi známé.

Kultivované endotelové buňky lidského pupečníku (HuVEC) jsou transfekovány plazmidy popsanými výše podle metody popsané autory Lucibello et al., (EMBO J., 14, 132, 1995).

Množství β-glukuronidázy, tvořené HuVEC, se měří za použití 4-metylumbelliferyl-p-glukuronidu jako substrátu.

Pro testování specifity buněčného cyklu se endotelové buňky synchronizují v G₀/Gi odstraněním methioninu na 48 hodin. Obsah DNA buněk se měří na FACS po obarvení Hoechstem 33258 (Hoechst Ag, Frankfurt) (Lucibello et al., EMBO J., 14, 132, 1995).

Byly získány následující výsledky:

1. Transfekované HuVEC secernuji mnohem více β-glukuronidázy při srovnání s netransfekovanými HuVEC.

2. Proliferující HuVEC (DNA > 2S) secernuji významně více β-glukuronidázy než HuVEC synchronizované v G₀/Gi.

3. Tudíž sekvence s identifikačním číslem 1 vede k expresi β-glukuronidázy specifické pro fázi buněčného cyklu v HuVEC transfekovaných genovým konstruktem popsaným výše.

Průmyslová využitelnost

Vynález se týká konstruktu nukleové kyseliny, který obsahuje alespoň jednu aktivátorovou sekvenci, alespoň jeden promotorovy modul obsahující nukleotidovou sekvenci, která váže protein rodiny E2F a protein rodiny CDF-1, a alespoň jeden strukturní gen.

Aktivátor působí prostřednictvím aktivace transkripce, • * • · ·

která je buď nespecifická, nebo specifická pro určitou buňku nebo virus a/nebo metabolicky specifická. Strukturní gen je tedy exprimován způsobem, který je specifický pro fázi buněčného cyklu nebo specifický pro určitou buňku a závislý na buněčném cyklu, specifický pro určitý virus a závislý na buněčném cyklu, a/nebo metabolicky specifický a závislý na buněčném cyklu.

Konstrukt nukleové kyseliny nebo buňka podle předkládaného vynálezu se může použít v léčbě poruchy, která je charakterizována buněčnou proliferací nebo je s ní spojena. Příklady poruch, charakterizovaných nebo spojených s buněčnou proliferací, jsou nádorová onemocněni, leukémie, kardiovaskulární onemocnění, zánětlivé reakce, autoimunitní reakce, alergie, artritidy, psoriáza, hrozící rejekce transplantovaných orgánů, poškození CNS, infekční nemoci, poruchy krevní koagulace a chronické virové infekce. Takové nemoci mohou být léčeny systémovou nebo lokální aplikací konstruktů nebo buněk předkládaného vynálezu.

ti Λ!

μ

S

Α4 Ρ Μ +> m β Ο Α4 >Φ C Φ > Ο μ

relativní aktivita

Tt Ο0

00

ΓΊ

Os r—4

2.3

CM

1.4

00

6.9

ο

H

+

ο

ř-

H

Η

0

CM

<

0

1

<

O

τΤ 1

Ο

Η

E-

1

Η

0

Ο i

Η

O

0

1

Η

O

0

-

1

00 ι

Ο

O

H

1

0

o

H

ο

<

0

<

CM »*Μ 1

Ο

τΤ 1

ο

Ο 1

0

cdc25c (divoký typ)

-1/+2

-2/+2

-6/-3

-10/-7

CM 1

1

o (

r- 1

00 1

<

• · · · · · · • ♦ · · · · · • · · · · · · • · · ·· ······ • · · · · · ·· ···· ·» ·

Tabulka

CM

Vazba DP/E2F

+ +

!

+

1

+ +

1

+ +

1

neurčeno

Vazba CDF-1

+1

+ +

+1

neurčeno| 1

+ +

4

+1

Polovina max transkripce (h)

00

8.5

1

neurčeno

rH t

o t

l

1

0 c Φ >0 h 5 Φ C

Represe

+

1

neurčeno

+

í

1

neurčeno

AGT

TGG

CC

ca

o

O

o

cai

cal

motiv CDF-1

—>

TAGGAA

TTTGAA

CHR

ca

Ol

o

O

cai

cal

cai

CO -* CM *

<1 O < Ol

AAGG

a ca

ca Ol

ca ca

c c

o cai

c c

cal u

C B

C C

motiv E2F

motiv CDF-1

GGCGG

CDE 1

4 ””

H o <

GGCT

Ol

ca

Ol

cai

o

O

B-myb

cdc25C

B-Cl

CM ^•“4 O ca

B-C2

B-C4

C-Bl

C-B1.2

C-B4

C-B3.4

Tt m Í23 1 O

C-B4.5

• · • · · · · · · • · · ·· ······ • · · · · ·

4 ···· ·· 4

SEZNAM SEKVENCi (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina íC) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: promotor (B) POZICE: 1...20 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1:

ACTTGGCGGG AGATTTGAAT 20 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) • · «· * · · · · • · · · · · ·· · · · · · · · · · • · · · · ······ ···· · ··· · · · · · · «· · · · · ·· · · * · · (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: promotor (B) POZICE: 1...20 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 2:

GCTTGGCGGG AGGTTTGAAT 2 0 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 17 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: promotor (B) POZICE: 1...17 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3:

AGCAGGTGTT GGGAGGC 17 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 41 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina « · · · · < · ·· ·· ···· ······· ·· · ········ • · · · · · ···· · ··· · · ··· ······ toto to··· · to ··· ·· (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: promotor (B) POZICE: 1...41 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 4:

GGCCGATGGG CAGATAGAGG GGGCCGATGG GCAGATAGAG G 41 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 30 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: promotor (B) POZICE: 1...30 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 5:

ACTGGGCTGG CGGAAGGTTT GAATGGTCAA • ·

(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A)	DÉLKA: 30 párů baží
(B)	TYP: nukleová kyselina
(C)	TYP VLÁKNA: jednoduché
(D)	TOPOLOGIE: lineární
TYP MOLEKULY: DNA (genomová)
ZNAK:
(A)	JMÉNO/OZNAČENÍ: promotor
(B)	POZICE: 1...30

(xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 6:

ACTGGGCTGG CGGACTTGTT GAATGGTCAA 30 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 7:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 30 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ií) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: promotor (B) POZICE: 1...30 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 7:

ACTGGGCTGG CGGAAGGTGG TCATGGTCAA 30 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 8:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) (B) (C) (D)	DÉLKA: 30 párů baží TYP: nukleová kyselina TYP VLÁKNA: jednoduché
TOPOLOGIE:	lineární
TYP MOLEKULY: DNA	(genomová)
ZNAK:
(A)	JMÉNO/OZNAČENÍ: promotor
(B)	POZICE: 1.	. .30

(xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 8:

ACTGGGCTGG CGGAAGGTTT GAAGGTTCAA 30 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 9:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 30 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární

• · · ♦ (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: promotor (B) POZICE: 1...30 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 9:

ACTGGGCTGG CGGAAGGTTT GACTGGTCAA (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 10:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: promotor (B) POZICE: 1...21 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 10:

GTAACACAAA GGAATTCAAG C (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 11:

· • · • · • · ···· ··· · · · · • · · · · · · ···· • · · · · · ···· · ··· · · • · · ··· ··· • · ···· · · · · · · · (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: exon (B) POZICE: 1...21 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 11:

GGCTGGCGGA AGGTTTGAAT 2 0 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 12:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 40 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: promotor (B) POZICE: 1...40 • · · · · · · · · · · ···· ··· ···· ·· · ···· ···· • · · · · ······ ··· · · • · · · · · ··· ·· · · · · · · · · · ·· (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 12:

GGCTGGCGGA AGGTTTGAAT GGCTGGCGGA AGGTTTGAAT 4 0 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 13:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 20 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	TYP VLÁKNA: jednoduché
	(D)	TOPOLOGIE: lineární

(ii) TYP MOLEKULY: DNA. (genomová) (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: promotor (B) POZICE: 1...20 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 13:

ACTTGGCGGG AGATAGGAAA 20 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 14:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární • · • · · · · · ···· · ··· · · ··· · · · · · ♦ • · ···· · · 9 ·· ·· (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: promotor (B) POZICE: 1...20 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 14:

GGCTGGCGGA AGGTTTGAAT 20

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Konstrukt nukleové kyseliny obsahující:

a) alespoň jednu aktivátorovou sekvenci

b) alespoň jeden chimérický promotorový modul obsahující nukleotidovou sekvenci, která váže protein rodiny E2F a protein rodiny CDF-1, a

c) alespoň jeden strukturní gen, kde chimérický promotorový modul způsobí aktivaci genové exprese v buněčném cyklu později než promotor B-myb, ale dříve než promotor cdc25C.
2. Konstrukt nukleové kyseliny podle nároku 1, kde aktivátorové sekvence leží v protisměru (transkripce) od chimérického promotorového modulu.
3. Konstrukt nukleové kyseliny podle nároku 1 nebo 2, kde chimérický promotorový modul obsahuje alespoň jednu nukleotidovou sekvenci, která je vybrána ze skupiny skládající se z ACTTGGCGGGAGATTTGAAT (sekvence s identifikačním číslem 1) a GCTTGGCGGGAGGTTTGAAT (sekvence s identifikačním číslem 2).
4. Konstrukt nukleové kyseliny podle kteréhokoliv nároku 1 až 3, kde chimérický promotorový modul interaguje s aktivátorovou sekvencí a kde interakce ovlivňuje expresi strukturního genu.
5. Konstrukt nukleové kyseliny podle kteréhokoliv nároku 1 až 4, kde aktivátorové sekvence je buněčně specifická, metabolicky specifická nebo virově specifická.
6. Konstrukt nukleové kyseliny podle nároku 5, kde buněčně specifická aktivátorové sekvence je aktivována v buňce vybrané ze skupiny skládající se z endotelové buňky, serózni buňky, buňky hladkého svalstva, svalové buňky, synoviální buňky, makrofágu, lymfocytu, leukemické buňky, nádorové buňky, keratinocytu a gliové buňky.
7. Konstrukt nukleové kyseliny podle nároku 5, kde virově specifická aktivátorové sekvence je promotorové nebo zesilovací sekvence pocházející z viru vybraného ze skupiny Skládající se z HBV, HCV, HSV, HPV, EBV, HTLV, CMV, SV40 a HIV.
8. Konstrukt nukleové kyseliny podle kteréhokoliv nároku 1 až 7, kde strukturní gen kóduje enzym nebo fúzní protein mezi ligandem a enzymem, který přeměňuje nebo štěpí prekurzor léčiva tak, aby vytvořil léčivo.
9. Konstrukt nukleové kyseliny podle kteréhokoliv nároku 6 až 12, kde strukturní gen kóduje látku, která je vybrána ze skupiny skládající se z cytokinu, růstového faktoru, cytokinového receptorů, receptorů růstového faktoru, proteinu majícího antiproliferačni účinek, proteinu majícího apoptotický účinek, proteinu majícího cytostatický účinek, proteinu majícího cytotoxický účinek, proteinu majícího zánětlivý účinek, proteinu majícího protizánětlivý účinek, proteinu majícího imunosupresivní účinek, protilátky, protilátkového fragmentu, inhibitoru angiogeneze, koagulačního faktoru, fibrinolytické sloučeniny a antikoagulans, krevního proteinu, virového antigenů, bakteriálního antigenu a nádorového antigenu a fúzního proteinu mezi ligandem a jednou z výše zmíněných látek.
10. Konstrukt nukleové kyseliny podle nároku 8 nebo 9, kde ligand je vybrán ze skupiny skládající se z růstového faktoru, cytokinu nebo protilátky.
11. Konstrukt nukleové kyseliny podle kteréhokoliv nároku 1 * až 10, kde nukleová kyselina je DNA.
12. Konstrukt nukleové kyseliny podle kteréhokoliv nároku 1 až 11, kde konstrukt obsahuje následující složky ve směru 5'3': nukleotidy 48 až 5191 oblasti promotoru/časného zesilovače SV40 připojené k fragmentu DNA, obsahujícímu sekvenci ACTTGGCGGGAGATTTGAAT (sekvence s identifikačním číslem 1) připojenou k nukleotidům 63 až 107 kódujícím signální peptid imunoglobulinu, připojeným k nukleotidům 93 až 1982 z cDNA β-glukuronidázy.
13. Vektor obsahující konstrukt nukleové kyseliny podle kteréhokoliv nároku 1 až 12.
14. Vektor podle nároku 13, kde vektor je nevirový vektor.
15. Vektor podle nároku 13, kde vektor je virový vektor.
16. Buňka obsahující konstrukt nukleové kyseliny podle kteréhokoliv nároku 1 až 12 nebo vektor podle kteréhokoliv nároku 13 až 15.

• · · · • ♦ ·· • · *

9 ·· • · ·· • · ··«ί • ··
17. Způsob přípravy konstruktu nukleové kyseliny podle kteréhokoliv nároku 1 až 12 nebo vektoru podle kteréhokoliv nároku 13 až 16, vyznačující se tím, že prvky konstruktu jsou ligovány (spojovány) postupně.
18. Použití konstruktu nukleové kyseliny podle kteréhokoliv nároku 1 až 12 nebo vektoru podle kteréhokoliv nároku 13 až 16 pro přípravu léčiva pro léčbu nádorového onemocnění, leukémie, kardiovaskulárního onemocnění, zánětlivých reakcí autoimunitního onemocnění, alergie, artritidy, psoriázy, hrozící rejekce transplantovaného orgánu, poškození CNS, infekční nemoci, poruchy krevní koagulace a/nebo chronické virové infekce.
19. Protein CDF-1 získatelný následujícími kroky:

a) přípravou jaderného extraktu z buněk HeLa, a

b) přečištěním extraktu z kroku a) afinitní chromatografií za přítomnosti oligonukleotidu obsahujícího sekvenční motiv CDE-CHR.
20. Protein CDF-1 podle nároku 19, kde sekvenční motiv CDECHR obsahuje sekvenci GGCTG GCGGA AGGTT TGAAT.
21. Protein CDF-1 podle nároku 19, kde sekvenční motiv CDECHR obsahuje sekvenci GGCTG GCGGA AGGTT TGAAT GGCTG GCGGA AGGTT TGAAT.
22. Protein CDF-1 podle kteréhokoliv nároku 19 až 21, kde oligonukleotid je navázán na agarózu.
23. Protein CDF-1 podle kteréhokoliv nároku 19 až 22, kde jaderný extrakt je připraven extrakci vysolovánim z buněk HeLa.
24. Použití proteinu CDF-1 podle kteréhokoliv nároku 19 až

23 pro identifikaci inhibitorů nebo stimulátorů CDF-1.