KR19980039325A - 혈소판 이상 질병의 검사키트, 그 검사방법 및 센서 - Google Patents

Abstract

본 발명은 기판 위에 혈소판 점착성 물질이 도포된 센서와, 형광물질이 결합된 GPⅡb/Ⅲa 항체를 함유한 항체용액과, 상기 센서에 환자의 혈액을 가하고, 이어서 상기 항체용액을 상기 센서에 첨가하여 반응시키고, 반응이 끝난 후 미반응 물질을 제거한 후 센서로부터 형광을 검출하기 위한 수단을 포함하는 혈소판 이상 질병의 검사키트와, 그 검사방법에 관한 것이다. 본 발명에 의하면, 본 발명에 따른 혈소판 이상을 검사하는 키트와 방법은 환자의 혈액으로부터 신속하게 혈소판의 이상 여부를 판단할 수 있으며, 카메라로 얻은 형광 이미지를 실시간으로 모니터에 표시할 수 있는 장점이 있다. 더욱이, 형광 이미지를 다중 평균함으로써 노이즈를 제거한 깨끗한 형광 이미지를 얻을 수 있기 때문에, 검사의 정확도를 크게 향상시킬 수 있다.

Description

혈소판 이상 질병의 검사키트, 그 검사방법 및 센서

본 발명은 혈소판 이상을 검사하기 위한 키트 및 그 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 이상 혈소판이 특정 단백질에 점착하는 양상이 다른 점을 이용하여 그 점착 양상을 측정함으로써 혈소판 이상을 검사할 수 있는 키트 및 그 방법에 관한 것이다.

혈소판(platelet)은 혈액을 구성하는 한 성분으로, 지혈이나 혈전과 같이 혈액의 항상성(hemostasis)을 유지하는 역할을 한다. 혈소판은 생리적으로 민감하게 변하는 세포로서, 혈관계 질환이나 당뇨병이 걸린 환자의 혈소판은 정상인의 혈소판과는 다른 생리적 특성을 나타낸다. 즉, 활성화된 이상 혈소판은 특정 단백질에 점착하는 양상을 나타낸다(S. W. Kim et al., Adhered Platelet Morphology in Diabetes Mellitus, Diabete Metabolism, 1995, 21, 50-53).

일반적으로 이상 혈소판은 활성화되어 있어 혈장 단백질인 비트로넥틴(vitronectin)과 점착성을 보이는 것으로 알려져 있다. 또한, Arg-Gly-Asp-Phe를 포함하는 펩티드에도 점착성을 나타낸다고 보고되어 있다(P. Thiagarajan et al., Exposure of Binding Sites for Vitronectin on Platelets following Stimulation, J. of Biol. Chem. 263, 6, 3035-3038, 1988).

한편, 미국 특허 제 5,391,714호(1995. 2. 21. 발행)는 GPⅢa의 다형성(polymorphism)을 Pl^A1형과 Pl^A2형으로 구분하는 모노클로날 항체 및 인간의 혈소판과 관련된 질병의 진단방법을 개시한다. 그러나, 이 특허에 기재된 기술은 DNA 분석에 치우쳐, 실제로 혈소판 이상증을 진단하는 실용적이고 실제적인 방법을 제시하고 있지 못하다.

따라서, 본 발명자들은 혈소판 이상증을 검사하는 실용적인 검사키트와 그 방법을 탐구하여 본 발명에 도달하였다.

본 발명의 목적은 혈소판 이상과 관련된 질병을 검사할 수 있는 검사 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 혈소판 이상을 검사하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 혈소판 이상을 검사할 수 있는 센서를 제공하는 것이다.

도 1은 본 발명에 따라, 활성화된 혈소판이 센서에 결합되고 여기에 형광물질이 부착된 GPⅡb/Ⅲa 항체가 부착되는 양상을 나타낸 모식도.

도 2는 본 발명의 펩티드 센서에 활성화된 혈소판과 활성화되지 않은 혈소판이 점착되는 양상을 나타낸 모식도.

도 3는 형광 이미지를 다중 평균하기 위한 프로그램 흐름도.

* 도면의 주요 부분에 대한 부호의 설명

10 : 기판 20 : 혈소판 점착물질

30 : 혈소판 32 : 미반응 혈소판

40 : 형광 GPⅡb/Ⅲa 항체 42 : GPⅡb/Ⅲa 항체

44 : 형광물질 46 : 미반응 형광 GPⅡb/Ⅲa 항체

본 발명에 따라서, 기판 위에 혈소판 점착성 물질이 도포된 센서와, 형광물질이 결합된 GPⅡb/Ⅲa 항체를 함유한 항체용액과, 상기 센서에 환자의 혈액을 가하고, 이어서 상기 항체용액을 상기 센서에 첨가하여 반응시키고, 반응이 끝난 후 미반응 물질을 제거한 다음 센서로부터 형광을 검출하기 위한 수단을 포함하는 혈소판 이상 질병의 검사 키트가 제공된다.

본 발명의 검사 키트에서, 센서는 유리와 같은 기판 위에 혈소판 점착성 물질이 도포(plating)되어 있다. 혈소판 점착성 물질로서는 비트로넥틴 또는 Arg-Gly-Asp-Phe을 포함하는 펩티드를 사용한다. 이들 물질은 혈소판과 점착하는 성질을 가지며, 특히 당뇨병이나 혈관계 질환에 의해서 이상이 생긴 혈소판과는 매우 높은 점착성을 나타내기 때문에, 본 발명의 센서에 높은 밀도로 점착하는 양상을 보인다.

센서에 부착되는 혈소판을 정량적으로 검출하기 위해서, 혈소판에 부착되는 항체가 사용된다. GPⅡb/Ⅲa는 혈소판의 표면에 존재하는 글리코프로틴(glycoprotein)으로서, 혈소판의 점착 및 혈장 단백질과의 반응에 중심적인 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

따라서, GPⅡb/Ⅲa와 특이적으로 결합하는 항체(GPⅡb/Ⅲa 항체)를 이용하여, 이 항체에 형광물질을 결합시켜 사용한다. 형광물질로는 형광 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate)를 사용하는 것이 바람직하다. 항체로서 모노클로날 항체를 사용하는 것이 바람직하다. 따라서, FITC 결합 GPⅡb/Ⅲa 모노클로날 항체(FITC-conjugated anti-GPⅡb/Ⅲa Mab)가 본 발명의 목적에 가장 적합하다.

형광물질이 부착된 GPⅡb/Ⅲa 항체는 혈소판과 점착하는 성질을 가지므로, 본 발명의 센서에 결합되어 있는 혈소판에 가하였을 때 센서에 결합된 혈소판의 양을 형광으로 측정할 수 있다.

형광을 측정하기 위해서는 카메라를 사용한다. 혈소판에서 나오는 형광이 미약하기 때문에 저조도 카메라가 사용된다. 저조도 카메라에 의해 포착된 형광은 모니터를 통해 표시되며, 가시적으로 형광의 양상을 실시간으로 측정할 수 있고 이를 프린트하거나 디지털 신호로 저장할 수 있다.

검사의 정확도를 높이기 위해서는 수차례 반복해서 이미지를 얻어서 이들의 평균값을 구하는 것이 바람직하다. 따라서, 여러 차례 반복해서 얻어진 형광 이미지를 마이크로프로세서(microprocessor)를 통해 평균을 구하여 평균 이미지를 모니터에 표시하는 방법을 채용할 수 있다.

본 발명의 다른 양상으로, 혈소판 점착물질을 기판 위에 도포하여 혈소판 점착표면이 형성된 센서를 제조하고; 상기 센서에 혈소판을 풍부하게 함유하는 혈장을 가하여 반응시킨 후 미반응 물질을 제거하고; 반응이 끝난 후 형광물질이 결합된 GPⅡb/Ⅲa 항체용액을 상기 센서에 가하여 반응시킨 후 미반응 물질을 제거하고; 상기 센서의 형광을 검출하는 것을 특징으로 하는 혈소판 이상을 검사하는 방법이 제공된다.

혈소판 점착물질이 도포된 센서로서, 비트로넥틴 또는 Arg-Gly-Asp-Phe를 포함하는 펩티드를 유리와 같은 기판 위에 도포하여 점착성이 높아진 이상 혈소판이 점착하게 된다.

따라서, 본 발명에 따라 환자의 혈소판 이상 질환을 검사하기 위해서, 환자의 혈액으로부터 혈소판을 풍부히 함유하는 혈장을 분리하여야 한다. 이를 위해서 환자로부터 채취한 혈액을 원심분리하여 상징액(supernatant)을 얻는다. 상징액중에는 혈소판이 풍부하게 포함되어 있다.

준비된 본 발명의 센서에 상기 혈소판을 풍부하게 포함하는 혈장을 가하여 반응시킨다. 반응 시간은 20분 내지 1시간이 바람직하다. 이 때 활성화되어 점착성이 높아진 이상 혈소판은 센서 표면의 단백질층(비트로넥틴층 또는 Arg-Gly-Asp-Phe를 포함하는 펩티드 층)에 고밀도로 결합하게 되고, 활성화되지 않은 정상적인 혈소판은 상대적으로 저밀도로 결합하게 된다.

상기 센서와 혈소판의 반응이 끝나면, 센서를 세척함으로써 센서와 결합되지 않은 혈소판이나 기타 다른 단백질 등을 제거한다. 세척액으로는 생리적 적합성을 고려하여 인산완충액(phosphate buffered saline)을 사용하는 것이 바람직하다.

상기 세척에 의해서 센서에 결합된 혈소판의 양을 정량적으로 측정하기 위해, 센서에 형광물질이 결합된 GPⅡb/Ⅲa 항체용액을 가한다. 형광물질로는 형광 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate)를 사용하는 것이 바람직하다. 항체로서 모노클로날 항체를 사용하는 것이 바람직하다. 따라서, FITC 결합 GPⅡb/Ⅲa 모노클로날 항체(FITC-conjugated anti-GPⅡb/Ⅲa Mab)가 본 발명의 목적에 가장 적합하다.

상기 형광 GPⅡb/Ⅲa 항체를 희석액에 희석시켜 사용한다. 희석액으로서는 생리적 적합성을 고려하여 인산완충액(PBS)을 사용하는 것이 바람직하다. 항체용액(통상 항체의 농도는 10 내지 20 ㎎/㎖) 대 희석액의 희석비는 1/100 내지 1/1000 (v/v)이 바람직하고, 1/500 이 더욱 바람직하다.

이와 같이, 본 발명의 센서에 혈소판을 결합시키고 미반응 물질을 제거한 후 다시 상기 형광 GPⅡb/Ⅲa 항체용액을 가하여 약 20분 내지 1시간 반응시킨 후 다시 센서를 세척하여 미반응 물질을 제거한다. 세척 후 센서에는 센서의 점착면에 결합된 혈소판과 그 혈소판에 형광 GPⅡb/Ⅲa 항체가 결합되어 있다.

도 1에는 이와 같은 센서와 혈소판 및 형광 GPⅡb/Ⅲa 항체의 관계가 잘 나타나 있다. 도 1을 참조하면, 기판(10) 위에는 혈소판 점착물질(20, 비트로넥틴 또는 펩티드)이 도포되어 있다. 점착물질이 도포된 기판(센서)에 혈소판을 포함하는 혈장을 가하면, 점착성이 높은 이상 혈소판(30)이 상기 점착물질(20)에 결합하고 점착성이 낮은 혈소판(32)은 결합되지 못하고 부유하게 된다. 이 때 센서를 세척함으로써 점착력이 약한 혈소판이나 기타 미반응 부유물질을 제거한다. 계속해서, 형광물질(44)가 결합된 GPⅡb/Ⅲa 항체(42)를 첨가하면, 이 FITC-conjugated GPⅡb/Ⅲa 항체(40)가 혈소판과 용이하게 결합한다. 따라서 이상 혈소판이 많은 경우에는 이들이 센서에 많이 부착하고 또 여기에 많은 형광 GPⅡb/Ⅲa 항체가 결합하므로, 많은 양의 형광을 내게 된다. 반대로, 정상 혈소판의 경우에는 적은 양의 형광을 낸다.

상기 방법에 의해서 센서에 혈소판과 형광 GPⅡb/Ⅲa 항체을 결합시킨 후에 미반응 항체(46)를 제거하고, 점착면의 형광을 적절한 수단으로 검출한다. 검출수단으로는 형광 카메라로 이미지를 얻은 후 이를 컴퓨터로 처리하여 모니터에 표시하는 것이 바람직하다. 이렇게 처리된 이미지는 컴퓨터에 의해 저장하거나 편집할 수 있기 때문에, 편리성이 높다.

센서에서 나오는 형광의 양은 매우 미약하므로, 저조도 형광 카메라를 이용하는 것이 바람직하다. 또한, 형광 이미지를 강화하기 위하여 센서를 여러 차례 촬영한 후 얻어진 여러 이미지를 다중 평균함으로써 노이즈를 제거하면, 좋은 이미지를 표시할 수 있다.

따라서, 본 발명의 형광 검출수단으로는 형광 카메라와 얻어진 아날로그 신호를 디지털 신호로 변환하는 컨버터, 데이터의 저장을 위한 기억장치 및 모니터로 구성되며, 이들 장치의 제어를 위한 마이크로프로세서로 구성하는 것이 바람직하다.

도 3은 다중 평균을 위한 컴퓨터 프로그램의 플로우 챠트이다. 먼저 사용자는 의도하는 촬영 횟수를 입력한다(S10). 바람직한 촬영 횟수는 5 내지 50회이다. 촬영 횟수가 5회 이하이면 노이즈의 제거 효과가 적고, 50회를 초과하면 더 이상 이미지 개선 효과가 미미하다. 가장 바람직한 촬영 횟수는 15 내지 25회이다.

사용자가 촬영 횟수를 입력한 후, 형광 카메라는 센서 표면에서 나오는 형광을 촬영한다(S20). 이어서, 얻어진 형광 이미지는 마이크로프로세서가 처리할 수 있도록 디지털 신호로 변환된다. 이를 위하여 이미지 그래버(image grabber)를 사용하는 것이 바람직하다. 변환된 디지털 신호는 디스크 등 통상의 저장장치에 저장된다(S30).

저장이 끝나면, 마이크로프로세서는 실제로 촬영한 실행 횟수가 사용자가 입력한 횟수와 같거나 큰지를 판단한다. 즉, 실행 횟수가 입력 횟수에 도달하면 다음 단계로 진행하고, 도달하지 못한 경우에는 계속해서 카메라 촬영, 신호 변환 및 저장을 반복한다(S40).

실행 횟수가 입력 횟수에 도달되었을 때(실행 횟수=입력 횟수), 마이크로프로세서는 신호 값을 합계하고 이 합계 값을 실행 횟수로 나누어 평균 값을 구한다(S50).

이렇게 얻어진 평균 값의 이미지 데이터가 모니터에 표시된다(S60).

본 발명에서, 다중 평균 값을 구하여 표시하는 이유는 미약한 형광 이미지를 보다 명확하게 모니터에 표시하기 위한 것이다. 즉, 촬영된 이미지에 많은 노이즈가 포함되어 있어 모니터에 표시하는 경우, 실제로 기판에 부착되어 형광을 발하는 혈소판의 양상을 정확하게 반영하지 못할 염려가 있다. 따라서, 약 20여회의 반복된 이미지 신호를 모두 합계한 후 이를 촬영 횟수로 나누어 평균 값을 구하면 실제 형광 이미지는 거의 그대로 표시되는 반면, 노이즈는 급속히 감소하여 최종적으로는 거의 보이지 않게 된다.

본 발명의 또다른 양상으로, 기판과, 상기 기판 위에 부착된 혈소판 점착물질을 포함하는, 혈소판 이상을 검사하기 위한 센서가 제공된다.

기판은 유리 또는 생물학적 물질과 적합성을 갖는 기판을 사용할 수 있다. 대표적으로는 폴리비닐알콜 수지 등을 사용할 수 있다. 기판 위에는 비트로넥틴 또는 Arg-Gly-Asp-Phe 펩티드와 같은 이상 혈소판에 특이적으로 결합하는 혈소판 점착물질을 부착시킨다. 이러한 본 발명의 센서는 환자의 혈액을 가하였을 때 이상 혈소판이 고밀도로 결합되므로, 이상 혈소판의 유무를 검사할 수 있다.

본 발명의 또다른 양상으로, 기판 위에 비트로넥틴을 가하여 부착시키고, 상기 기판 위에 비트로넥틴 층이 형성된 후 미반응 물질을 세척하여 제거하는 것을 특징으로 하는 혈소판 이상을 검사하기 위한 비트로넥틴 센서의 제조방법이 제공된다.

기판으로는 유리나 생물학적 물질에 적합성을 갖는 폴리비닐알콜 수지 기판을 사용할 수 있다.

기판에 비트로넥틴을 부착시키기 위하여, 비트로넥틴을 희석시킨 용액을 기판에 도포하고 상온에서 방치한다. 이 때 비트로넥틴의 희석 농도는 비트로넥틴과 인산완충액을 10 내지 50 ㎍/㎖로 희석하는 것이 바람직하고, 20 내지 30 ㎍/㎖가 더욱 바람직하다. 비트로넥틴의 희석용액을 기판 위에 도포한 후, 상온에서 약 10 내지 30시간, 바람직하게는 약 20시간 방치함으로써 비트로넥틴이 기판 위에 부착하게 된다.

계속해서, 기판 위에 부착되지 못한 비트로넥틴을 포함한 미반응 물질을 세척액으로 씻어낸다. 즉, 세척액으로서 TPBS(Tween 20 이 첨가된 PBS)를 사용하여 3 내지 5 회 기판을 세척한다. 세척이 끝나면, 기판 위에는 비트로넥틴의 얇은 층이 형성되어 이상 혈소판과의 점착 양상을 판단할 수 있는 혈소판 이상을 검사하기 위한 비트로넥틴 센서가 완성된다.

한편, 이렇게 얻어진 센서에는 비트로넥틴 층이 도포되어 있으나, 군데군데 비트로넥틴이 완전히 부착되지 않아서 기판의 그대로 노출되어 있는 영역이 발생할 수 있다. 이러한 노출영역이 있는 센서에 혈장을 가하였을 때 혈소판이 이들 노출영역에 결합함으로써 센서의 감도를 저하시켜 정확한 검사를 방해할 수 있다. 따라서, 이러한 노출영역을 커버하는 것이 바람직하다. 이를 위해서, BSA(bovine serum albumin)을 포함하는 PBS 용액을 기판에 가하여 반응시켜 노출 영역을 블로킹한다.

본 발명의 또다른 양상으로, Arg-Gly-Asp-Phe 펩티드에 기판과 결합할 수 있도록 작용기를 도입시키고, 상기 작용기가 도입된 Arg-Gly-Asp-Phe 펩티드를 기판 위에 도포한 후 건조시킴으로써 상기 펩티드의 얇은 층을 형성하고, 상기 펩티드 층에 마이크로 오더의 포토 마스크를 덮은 후 광을 조사하여 농도 구배를 갖도록 펩티드를 상기 기판 위에 결합시키고, 상기 기판을 세척하여 미반응 펩티드를 제거하는 것을 특징으로 하는 농도 구배를 갖는 펩티드 물질이 도포된, 혈소판 이상을 검사하기 위한 펩티드 센서가 제공된다.

본 발명에서 상기 Arg-Gly-Asp-Phe 펩티드를 혈소판 점착물질로서 기판 위에 도포한 센서를 제공하기 위하여, 이 펩티드에 기판과 결합할 수 있는 작용기를 도입한다.

먼저, 상기 펩티드에 링커로서 Gly-Gly-Gly을 이용하며, 별도로 부착시키지 않고 Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp-Phe로 합성된 아미노산을 이용하는 것이 편리하다.

또한, 4-아지도벤조산과 N-히드록시숙신이미드를 1, 3-디시클로헥실카르보디이미드의 첨가하에 반응시켜 N-((4-아지도벤조일)옥시)숙신이미드를 얻고, 이렇게 얻어진 상기 N-((4-아지도벤조일)옥시)숙신이미드와 링커로서 Gly-Gly- Gly가 결합된 NH₂-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp-Phe 펩티드를 반응시킨다. 따라서, N-히드록시숙신이미드가 탈락하고 4-아지도벤조산과 펩티드 N 말단의 NH₂가 아미드 결합(CONH)을 형성함으로써, Arg-Gly-Asp-Phe 펩티드에 기판과 결합할 수 있는 아지도 작용기(N₃)가 도입된다.

이렇게 기판과 결합할 수 있는 상기 아지도 작용기가 도입된 Arg-Gly-Asp-Phe 펩티드를 포함하는 용액을 기판 위에 얇은 층으로 도포한다. 도포할 때, H₂O 와 CH₃OH 의 혼합용액을 사용하는 것이 바람직하다.

펩티드 용액을 기판에 얇은 층으로 도포한 후 공기중에서 완전히 건조시킴으로써 기판 위에 상기 펩티드의 얇은 층을 형성한다.

이어서 상기 펩티드 층 위에 마이크로 오더의 포토마스크를 덮은 후 광(바람직하게는 250 내지 300nm 자외선)을 조사하면 펩티드의 아지도 작용기는 기판과 결합(공유결합 형성)된다. 이 때, 마이크로 오더 포토마스크는 1 내지 100 ㎛ 범위의 다양한 면적으로 분할되어 있는 것을 사용한다. 그러므로, 포토마스크에 의해 차단된 부분은 광반응이 일어나지 않고 차단되지 않은 부분은 광반응이 일어나 펩티드의 아지도 작용기가 기판과 결합한다. 이 과정에서 마이크로 오더 포토마스크의 패턴에 따라, 펩티드가 고밀하게 결합되는 부분과 저밀하게 결합되는 부분으로 나타난다.

이와 같이 펩티드와 기판 사이에 결합반응이 종결된 후 기판을 세척하여 미반응 펩티드를 제거함으로써, 본 발명의 농도 구배를 갖는 펩티드 물질이 도포된, 혈소판 이상을 검사하기 위한 펩티드 센서가 제조된다.

본 발명에서 상기와 같이 펩티드를 농도 구배로 기판에 부착시킨 센서는 펩티드의 농도에 따라 혈소판의 점착 양상이 다르게 나타나므로, 이들 패턴을 비교함으로써 더욱 용이하게 혈소판의 이상을 검사할 수 있다.

즉, 센서에서 펩티드가 고농도인 영역에서는 활성화된 이상 혈소판의 점착 양상(도 2a)과 활성화되지 않은 정상 혈소판의 점착 양상(도 2c)이 크게 다르지 않은 반면, 펩티드가 저농도인 영역에서는 이상 혈소판이 비교적 고밀하게 점착되지만(도 2b) 정상 혈소판은 매우 저밀하게 점착되는 양상(도 2b)을 나타낸다.

이하에서, 실시예에 의거하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

실시예 1: 본 발명의 비트로넥틴 센서의 제조

비트로넥틴을 PBS(phosphate bovine saline)에 25 ㎍/㎖의 농도로 희석하여 0.1 ㎖를 슬라이드 글라스 위에 도포하고 상온에서 20시간 방치하였다. TPBS(Tween 20 이 함유된 PBS) 용액 0.5 ㎖로 도포된 비트로넥틴을 4회 세척한 후 1% BSA를 포함하는 PBS 용액 0.2 ㎖를 첨가하여 37 ℃에서 1시간 반응시켰다.

실시예 2: 본 발명의 펩티드 센서의 제조

64.6 mmol의 N-히드록시숙신이미드 7.43g과 58.7 mmol의 4-아지도벤조산 9.57g을 150 ㎖의 테트라히드로푸란(THF)에 용해시켜 얼음통(ice bath)에 방치하였다. 여기에 THF 50 ㎖에 녹인 1, 3-디시클로헥실카르보디이미드(99%)를 방울방울 첨가하였다.

반응 시작후 3시간이 경과한 다음 얼음통을 제거하고 상온에서 12시간 반응시켰다. 생성된 흰 고체는 제거하고 여과액으로부터 감압하에 용매 THF를 제거하였다. 얻어진 노란색 고체로부터 이소프로필 알콜을 이용하여 N-((4-아지도벤조일)옥시)숙신이미드 에스테르를 재결정하였다. 이 물질은 IR 스펙트럼 측정시 2140 ㎝^-1에서 아지도 작용기의 특정 밴드가 관찰되었고, 500-MHz¹H-NMR 에 의하여 측정한[(CD₃)₂SO; ppm from (CH₃)₄Si]δ7-8(4H, m, phenyl), and 2.9(4H, t, CH₂)결과로부터 상기 합성물의 존재를 확인하였다.

본 발명의 Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp-Phe 펩티드 30μmol을 1.2 ㎖의 디메틸포름아미드에 용해시키고, 상기 합성한 N-((4-아지도벤조일)옥시)숙신이미드 에스테르 30μmol을 1.2㎖에 용해시킨 후 빛을 차단한 용기에서 혼합시켰다. 혼합용액을 상온에서 12시간 반응시킨 후 감압하에 디메틸포름아미드를 증발시켜 약 80%를 제거하고, 에틸에테르를 사용하여 고체를 침전시킴으로써 아지도 작용기가 도입된 Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp-Phe 펩티드를 얻었다. IR 스펙트럼으로부터, 2140㎝^-1에서 아지도 작용기의 특정 밴드가 관찰됨으로써 펩티드 내에 아지도 작용기가 도입된 것을 확인하였다.

상기 얻어진 아지도 작용기가 도입된 펩티드를 H₂O와 CH₃OH와의 혼합용액(2/5 V/V)에 0.5%의 농도로 용해시켜 슬라이드 글라스에 얇은 층으로 도포하였다. 공기 중에서 완전건조시켜 형성된 슬라이드 글라스에 부착된 얇은 층의 펩티드 위를 마이크로-오더 포토마스크로 덮은 후, 자외선(300 nm 밴드 통과 필터 사용)을 2.2mW/㎝²으로 60초간 조사하였다.

광반응이 끝난 후 0.1M PBS(pH 7.2)로 슬라이드 글라스를 세척하여 반응하지 않은 펩티드를 제거하여 본 발명에 따른 펩티드 센서를 제조하였다.

실시예 3: 비트로넥틴 센서를 이용한 혈소판의 점착 실험

사람의 혈액을 ACD(무수구연산, 구연산나트륨 및 덱스트로스의 혼합용액, 녹십자(주) 제조)를 함유한 시험관에 넣고, 800g중으로 15분간 원심분리를 하였다. 원심분리후 상징액을 두 군으로 분리하여 활성화되지 않은 정상 혈소판을 포함하는 혈장의 대조군과 ADP(adenosine 5'-diphosphate)를 첨가하여 활성화된 이상 혈소판을 포함하는 혈장의 시험군으로 나누었다.

상기 대조군과 시험군의 혈장을 실시예 1의 방법에 따라 제조된 비트로넥틴 센서에 가하고 충분히 반응시킨 후 PBS를 사용하여 세척함으로써 센서에 부착되지 않은 혈소판과 기타 이물질을 제거하였다.

여기에 상업적으로 구입할 수 있는 FITC-conjugated anti-GPⅡb/Ⅲa Mab (12.3 ㎎/㎖, Serotec. Co. 제조)를 PBS 에 1/500(v/v) 비율로 희석한 용액을 상기 센서에 각각 50㎕씩 첨가하여 37 ℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후 센서를 PBS 용액 0.2 ㎖로 3번 세척하였다.

저조도 카메라(SIT camera)와 형광 필터를 사용하여 상기 센서의 비트로넥틴 표면을 촬영한 후 마이크로프로세서로 처리하여 모니터에 점착 양상의 이미지를 표시하였다. 얻어진 이미지는 대조군의 경우에는 점착도가 낮은 반면, 시험군의 경우에는 높은 점착도를 나타냈다.

실시예 4: 펩티드 센서를 혈소판의 점착 실험

실시예 2에서 제조한 펩티드 센서를 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 3과 같은 방법으로 혈소판에 대한 이미지를 구하였다. 실험 결과, 센서의 영역중 펩티드가 고밀한 영역에서는 시험군과 대조군이 비슷한 양상으로 점착되는 반면, 저밀한 영역에서는 시험군의 혈소판은 비교적 고농도로 점착되고 대조군의 혈소판은 저농도로 점착되는 양상을 나타냈다.

이상의 설명으로부터 명백한 바와 같이, 본 발명에 따른 혈소판 이상을 검사하는 키트와 방법은 환자의 혈액으로부터 신속하게 혈소판의 이상 여부를 판단할 수 있으며, 카메라로 얻은 형광 이미지를 실시간으로 모니터에 표시할 수 있는 장점이 있다. 더욱이, 형광 이미지를 다중 평균함으로써 노이즈를 제거한 깨끗한 형광 이미지를 얻을 수 있기 때문에, 검사의 정확도를 크게 향상시킬 수 있다.

한편, 본 발명에 따른 혈소판 이상을 검사하기 위한 센서는 이상 혈소판과 정상 혈소판의 점착 양상을 정밀하게 대비시켜 나타내기 때문에, 혈소판의 이상 여부를 판단할 수 있다. 특히, Arg-Gly-Asp-Phe 펩티드가 농도구배로 부착된 펩티드 센서는 농도 구배에 따라 각각 달리 점착되는 혈소판의 양상을 정확히 반영함으로써, 혈소판 이상을 더욱 정확하게 검사할 수 있다.

Claims (16)

1. 기판 위에 혈소판 점착성 물질이 도포된 센서와, 형광물질이 결합된 GPⅡb/Ⅲa 항체를 함유한 항체용액과, 상기 센서에 환자의 혈액을 가하고, 이어서 상기 항체용액을 상기 센서에 첨가하여 반응시키고, 반응이 끝난 후 미반응 물질을 제거한 후 센서로부터 형광을 검출하기 위한 수단 을 포함하는 혈소판 이상 질병의 검사키트.
2. 제 1항에 있어서, 상기 혈소판 점착성 물질이 비트로넥틴 또는 Arg-Gly-Asp-Phe를 포함하는 펩티드임을 특징으로 하는 키트.
3. 제 2항에 있어서, 상기 펩티드가 Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp-Phe 임을 특징으로 하는 키트.
4. 제 1항에 있어서, 상기 질병이 당뇨병 또는 혈관계 질환임을 특징으로 하는 키트.
5. 제 1항에 있어서, 상기 형광검출 수단이 저조도 카메라와 카메라 영상을 처리하는 마이크로 프로세서 및 모니터로 구성되는 것을 특징으로 하는 키트.
6. 제 5항에 있어서, 상기 형광검출 카메라의 이미지를 다중평균하는 것을 특징으로 하는 키트.
7. 혈소판 점착물질을 기판 위에 도포하여 혈소판 점착표면이 형성된 센서를 제조하고, 상기 센서에 상기 혈소판을 풍부하게 함유하는 혈장을 가하여 반응시킨 후 미반응 물질을 제거하고, 반응이 끝난 후 형광물질이 결합된 GPⅡb/Ⅲa 항체용액을 상기 센서에 가하여 반응시킨 후 미반응 물질을 제거하고, 상기 센서의 형광을 검출하는 단계를 포함하는 혈소판 이상을 검사하는 방법.
8. 제 7항에 있어서, 상기 혈소판 점착물질이 비트로넥틴 또는 Arg-Gly-Asp-Phe를 포함하는 펩티드임을 특징으로 하는 방법.
9. 제 8항에 있어서, 상기 펩티드가 Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp-Phe 임을 특징으로 하는 방법.
10. 제 7항에 있어서, 상기 센서의 형광을 모니터하기 위하여 형광검출 카메라로 이미지를 얻어서, 얻어진 이미지를 다중 평균하여 모니터에 표시하는 단계를 더 포함함을 특징으로 하는 방법.
11. 제 7항 또는 제 10항에 있어서, 상기 센서에 혈소판 점착물질을 농도 구배로 가하여 결합시키고, 혈소판 점착물질의 고농도 부분과 저농도 부분에 시료 혈소판의 점착 양상을 대비하여 혈소판 이상을 판단함을 특징으로 하는 방법.
12. 기판과, 상기 기판 위에 부착된 혈소판 점착물질; 을 포함하는 혈소판 이상을 검사하기 위한 센서.
13. 기판 위에 비트로넥틴을 가하여 부착시키고, 상기 기판 위에 비트로넥틴 층이 형성된 후 미반응 물질을 세척하여 제거하는 단계를 포함하는 혈소판 이상을 검사하기 위한 비트로넥틴 센서의 제조방법.
14. 제 13항에 있어서, 상기 미반응 물질을 세척하여 제거한 후 비트로넥틴 층의 불완전한 부분을 블로킹 물질로 덮는 단계를 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
15. Arg-Gly-Asp-Phe를 포함하는 펩티드에 기판과 결합할 수 있도록 작용기를 도입시키고, 작용기가 도입된 상기 펩티드를 기판 위에 도포한 후 건조시킴으로써 상기 펩티드의 얇은 층을 형성하고, 상기 펩티드 층에 마이크로 오더의 포토 마스크를 덮은 후 광을 조사하여 농도 구배를 갖도록 펩티드를 상기 기판 위에 결합시키고, 상기 기판을 세척하여 미반응 펩티드를 제거하는 단계를 포함하는 농도 구배를 갖는 펩티드 물질이 도포된, 혈소판 이상을 검사하기 위한 펩티드 센서의 제조방법.
16. 제 15항에 있어서, 4-아지도벤조산과 N-히드록시숙신이미드를 1, 3-디시클로헥실카르보디이미드의 첨가하에 반응시켜 N-((4-아지도벤조일)옥시)숙신이미드를 얻고, 상기 얻어진 N-((4-아지도벤조일)옥시)숙신이미드와 링커로서 Gly-Gly-Gly가 결합된 NH₂-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp-Phe 펩티드를 반응시킴으로써 상기 펩티드에 기판과 결합할 수 있도록 아지도 작용기를 도입시키는 것을 특징으로 하는 방법.