KR101758611B1 - 바이오센서를 이용하여 용액에 포함된 미량의 아밀로이드베타를 검출하는 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 알츠하이머병 등의 조기 진단을 위해 바이오센서를 이용하여 용액에 포함된 미량의 아밀로이드베타를 검출하는 방법에 관한 것이다. 상기 바이오센서를 이용하여 용액에 포함된 미량의 아밀로이드베타를 검출하는 방법은, a) 복수의 웰(well)이 형성된 기판을 마련하는 단계; b) 상기 웰에 (3-아미노프로필)트리에톡시실란 또는 (3-아미노프로필)트리메톡시실란이 함유된 용액을 주입하는 단계; c) 상기 웰에 덴드리머가 함유된 용액을 주입하는 단계; d) 상기 웰에 아밀로이드베타가 함유된 용액을 주입하는 단계; e) 상기 웰에 상기 아밀로이드베타를 타켓으로 하는 1차 항체가 함유된 용액을 주입하는 단계; e) 상기 웰에 상기 1차 항체를 타겟으로 하는 2차 항체가 함유된 용액을 주입하는 단계; f) 상기 2차 항체를 검출하는 단계; 를 포함한다.
이러한 구성에 따르면, 용액 중에 포함된 미량의 아밀로이드베타를 높은 형광 감도로 검출할 수 있도록 바이오센서를 제작함으로써, 알츠하이머병 등의 표준마커가 되는 아밀로이드베타를 조기 진단할 수 있는 바이오센서를 이용하여 용액에 포함된 미량의 아밀로이드베타를 검출하는 방법을 제공할 수 있다.

Description

바이오센서를 이용하여 용액에 포함된 미량의 아밀로이드베타를 검출하는 방법 {Method for detecting traces of amyloid beta included in solution by using biosensor}
본 발명은 알츠하이머병 등의 조기 진단을 위해 바이오센서를 이용하여 용액에 포함된 미량의 아밀로이드베타를 검출하는 방법에 관한 것이다.
알츠하이머병(AD)은 기억력 감소와 그 외의 인식 부족 등의 특징이 나타나는 신경쇠퇴성병으로, 치매의 가장 중요한 원인이다.
노인성 치매는 고령화 시대에 진입하여 전세계적으로 주목하는 질병이며, 특히 한국은 초고령화 사회로 빠르게 진입하고 있어서 관련 사회 비용이 기하급수적으로 증가할 것으로 예상되고 있다.
기억력, 사고력이 급격히 저하하는 퇴행성 뇌질환인 노인성 치매는 대표적인 노인성 질환으로, 뇌기능이 점진적으로 쇠퇴하여 기억, 사고 및 일상적 생활 능력 및 행동에 문제가 생기는 질병으로, 뇌 내에 독성의 아밀로이드베타(Amyloid beta; Aβ)가 축적되는 것을 특징으로 한다. 뇌 속에 축적된 Aβ는 뇌세포의 손상 및 사멸을 일으켜 뇌의 여러 기능에 문제를 가져온다.
아밀로이드 플라크는 높은 소수성을 가지는 Aβ의 응집체를 말한다. 알츠하이머병은 아밀로이드 플라크(Aβ plaque)가 신경계세포(신경세포 및 뇌세포) 막에서 생성되어 신호전달(시냅스)를 직접적으로 방해하는 것이 원인이다. 이러한 아밀로이드 플라크는 알츠하이머병으로 사망한 환자의 뇌의 MRI 및 CT 촬영에 의해 발견되었다.
뇌에서 아밀로이드베타 단백질 (Αβ) 응집체, 특히 Αβ40 및 Αβ42의 축적은 알츠하이머병과 관련되며, 이들 단백질 응집체는 알츠하이머병에 대한 표준마커로서 생각되고 있다.
알츠하이머병의 임상적 진단은 병력(history taking)과 신경심리학적 검사에 주로 의존하고 있다.
현재, 알츠하이머병의 조기 검출을 위한 센서는 크게 용액 중에서의 Aβ42를 검출하는 방법과, 뇌 영상 촬영을 통해 뇌 내 아밀로이드 플라크의 축적 수준을 확인할 수 있는 방법이 있다.
혈액과 같은 체액에서의 Aβ 검출의 핵심은 매우 낮은 농도의 Aβ를 고감도로 검출하는 것이다. 왜냐하면, Aβ의 높은 소수성으로 인해 생성된 Aβ의 대부분은 응집에 의한 아밀로이드 플라크로 존재할 수 있고, 혈액, 소변 등 신경계세포 주변에서 다른 영역으로 분비된 Aβ는 양이 더 적을 가능성이 있기 때문이다.
그러나, 혈액, 소변 등에 존재하는 Aβ는 플라크를 형성하지 않고 소분자의 펩타이드 상태로 존재할 가능성이 높기 때문에, 이러한 매우 낮은 농도의 Aβ를 고감도로 검출할 수 있는 바이오센서를 제작하는 것이 알츠하이머병의 조기 검출을 위한 센서 제작의 핵심이 될 수 있다.
대한민국 등록특허 제10-1478609호
따라서, 본 발명은 상기 사정을 감안하여 발명한 것으로, 알츠하이머병 등의 표준마커가 되는 아밀로이드베타를 조기 진단하는 방안으로 체액 중에 포함된 아밀로이드베타를 고감도로 검출할 수 있는 바이오센서를 이용하여 용액에 포함된 미량의 아밀로이드베타를 검출하는 방법을 제공하고자 함에 목적이 있다.
상술한 바와 같은 목적을 구현하기 위한 본 발명에 따른 바이오센서를 이용하여 용액에 포함된 미량의 아밀로이드베타를 검출하는 방법은, a) 복수의 웰(well)이 형성된 기판을 마련하는 단계; b) 상기 웰에 (3-아미노프로필)트리에톡시실란 또는 (3-아미노프로필)트리메톡시실란이 함유된 용액을 주입하는 단계; c) 상기 웰에 덴드리머가 함유된 용액을 주입하는 단계; d) 상기 웰에 아밀로이드베타가 함유된 용액을 주입하는 단계; e) 상기 웰에 상기 아밀로이드베타를 타켓으로 하는 1차 항체가 함유된 용액을 주입하는 단계; e) 상기 웰에 상기 1차 항체를 타겟으로 하는 2차 항체가 함유된 용액을 주입하는 단계; f) 상기 2차 항체를 검출하는 단계; 를 포함한다.
또한, 상기 덴드리머는 NHS 덴드리머이다.
또한, 상기 2차 항체는 형광 물질 또는 발광 물질을 포함한다.
또한, 상기 (3-아미노프로필)트리에톡시실란 또는 상기 (3-아미노프로필)트리메톡시실란이 함유된 용액은 1~4 부피%의 (3-아미노프로필)트리에톡시실란 또는 (3-아미노프로필)트리메톡시실란을 함유한다.
또한, 상기 덴드리머가 함유된 용액은 0.1 mM~10 mM의 상기 NHS 덴드리머를 함유한다.
본 발명에 따르면, 용액 중에 포함된 미량의 아밀로이드베타를 높은 형광 감도로 검출할 수 있도록 바이오센서를 제작함으로써, 알츠하이머병 등의 표준마커가 되는 아밀로이드베타를 조기 진단할 수 있는 바이오센서를 이용하여 용액에 포함된 미량의 아밀로이드베타를 검출하는 방법을 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명의 아밀로이드베타를 검출하는 방법에 사용되는 예시적인 기판을 도시하는 도면이다.
도 2는 종래의 바이오센서에 의해 아밀로이드베타를 형광 검출한 결과를 나타내는 사진이다.
도 3은 본 발명의 바이오센서에 의해 아밀로이드베타를 형광 검출한 결과를 나타내는 사진이다.
도 4는 종래와 본 발명의 바이오센서에 의한 실험에서 아밀로이드베타의 양에 따른 형광 감도를 도시하는 도면이다.
도 5는 20 pg／100mL 농도의 아밀로이드베타를 이용한 실험에서 종래와 본 발명의 바이오센서에 의한 형광 감도를 비교하여 도시하는 도면이다.
이하 첨부한 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예에 대한 구성 및 작용을 상세히 설명하면 다음과 같다. 여기서 각 도면의 구성요소들에 대해 참조부호를 부가함에 있어서 동일한 구성요소들에 한해서는 비록 다른 도면상에 표시되더라도 가능한 한 동일한 부호로 표기되었음에 유의하여야 한다.
도 1은 본 발명의 아밀로이드베타를 검출하는 방법에 사용되는 예시적인 기판을 도시하는 도면이다.
본 발명은 체액 중에 미량으로 포함된 아밀로이드베타를 고감도로 검출할 수 있는 바이오센서를 제작함으로써 알츠하이머병 등을 조기에 진단하는데 활용할 수 있도록 하기 위한 것이다. 일반적으로, 아밀로이드베타는 알츠하이머병 등의 표준마커가 된다.
이하에서는, 본 발명의 바이오센서를 이용하여 용액에 포함된 미량의 아밀로이드베타를 검출하는 방법에 대해 설명하기로 한다.
먼저, 복수의 웰(well)이 형성된 기판을 마련한다. 기판으로는 유리 또는 플라스틱으로 된 투명한 기판을 사용할 수 있다. 기판은 공기 중에서 산화막을 형성하고 있다.
다음에, 기판의 각각의 웰에 (3-아미노프로필)(3-aminopropyl)트리에톡시실란(triethoxysilane) 또는 (3-아미노프로필)트리메톡시실란(trimethoxysilane)이 함유된 용액을 주입한다. 이때, 1~4%(부피)의 (3-아미노프로필)트리에톡시실란을 에탄올에 용해한 용액 또는 1~4%(부피)의 (3-아미노프로필)트리메톡시실란을 메탄올에 용해한 용액을 사용할 수 있다.
(3-아미노프로필)트리에톡시실란의 구조식은 다음과 같다.
Figure 112017035531829-pat00001
(3-아미노프로필)트리에톡시실란은 산화막과 반응성을 갖는 3개의 에톡시실란(ethoxysilane)과 바이오소재와 높은 반응성을 갖는 아미노기를 포함한다.
다음에, 각각의 웰에 덴드리머가 함유된 용액, 바람직하게는 NHS 덴드리머가 함유된 용액을 주입한다. 여기서, NHS 덴드리머는 최외각에 NHS 에스테르(ester)가 결합된 덴드리머일 수 있다. NHS 에스테르는 아미노기(1차 아민)와 공유결합한다. 본 발명의 경우, 아밀로이드베타의 아미노산 중 라이신의 1차 아민을 타겟으로 한다. 덴드리머가 함유된 용액은 0.1 mM~10 mM의 NHS 덴드리머를 함유할 수 있다.
반응 전의 아미노기와 NHS 에스테르의 구조식은 다음과 같다.
Figure 112017035531829-pat00002
반응 후의 아미노기와 NHS 에스테르의 구조식은 다음과 같다.
Figure 112017035531829-pat00003
NHS 에스테르가 최외각에 결합된 NHS 덴드리머는 아밀로이드베타의 수식 감도를 획기적으로 증폭시킬 수 있다.
NHS 덴드리머의 구조식은 다음과 같다.
Figure 112017035531829-pat00004
NHS 덴드리머가 수식된 아밀로이드베타 바이오센서의 구조식은 다음과 같다.
Figure 112017035531829-pat00005
다음에, 각각의 웰에 아밀로이드베타가 함유된 용액을 주입하고 실온에서 반응시킨다. 일반적으로, 알츠하이머병의 환자의 혈액 중에는 예를 들어, 수 ng/100mL 정도의 극미량의 아밀로이드베타가 포함될 것으로 예상되므로 아밀로이드베타의 인식수를 증가시키는 것이 무엇보다 중요하다.
덴드리머는 외부에 반응기가 존재하므로, 본 발명에서는 덴드리머의 최외각에 아미노기와 반응성을 갖는 NHS 에스테르가 수식된 덴드리머를 이용하여 아밀로이드베타의 인식수를 종래의 바이오센서에 비해 획기적으로 증가시키는 방법을 사용한다.
다음에, NHS 덴드리머 중 아밀로이드베타와 결합하지 않은 미반응 NHS 에스테르를 블로킹 용액으로 블로킹할 수 있다. 이는 미반응 NHS 에스테르가 이후의 반응에서 1차 항체 등과 반응하여 왜곡된 실험 결과가 나오는 것을 방지하기 위한 것이다. 블로킹 용액은 이전 단계에서 결합하지 않은 미반응 물질이 이후의 단계에서 타켓으로 하지 않는 물질과 결합(비특이적 결합)하지 않도록 하여 원하는 검출 결과를 얻기 위한 것이다. 예를 들어, 블로킹 용액은 100 mg/mL의 보빈 세럼 알부민(Bovine serum albumin) 용액이 될 수 있다.
다음에, 각각의 웰에 아밀로이드베타를 타켓으로 하는 1차 항체가 함유된 용액을 주입한다.
다음에, 각각의 웰에 상기 1차 항체를 타겟으로 하는 2차 항체가 함유된 용액을 주입한다. 2차 항체는 형광 물질(또는 발광 물질)을 포함할 수 있다.
NHS 덴드리머에 아밀로이드베타, 1차 항체 및 2차 항체가 결합된 예상 구조식은 다음과 같다.
Figure 112017035531829-pat00006
다음에, 2차 항체를 검출한다. 2차 항체의 검출은 형광 검출 방법을 사용할 수 있다.
형광 검출은 도립현미경과 EMCCD 카메라(ELISA Plate의 경우 플레이트리더로 가능)를 이용한다. 도립현미경의 스테이지 위에 아밀로이드베타가 수식된 센서를 세팅한 후, 형광 검출을 위한 암실 조건에서 EMCCD 카메라를 이용하여 측정한다.
한 웰의 총 형광 강도 또는 세 군데의 평균값을 하나의 데이터로 측정하여 세 번이상 반복하여 평균과 표준편차를 산출한다. 형광강도 산출은 이미징 프로세싱 소프트웨어를 이용한다.
본 발명의 방법은 형광 검출 외에 전기화학법, SPR(Surface Plasmon Resonance), 컨틸레버, 자성입자 등을 이용하여 용액에 포함된 표준마커를 검출하는데 응용될 수 있다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 바이오센서를 이용한 아밀로이드베타 검출 방법은 NHS 덴드리머를 (3-아미노프로필)트리에톡시실란에 아미노기와 반응하도록 하고, 덴드리머의 구조에 의해 아밀로이드베타와 결합되는 감도를 획기적으로 증폭시킬 수 있다. 그에 따라, 종래의 바이오 센서에 비해 동일한 양의 아밀로이드베타를 주입했을 경우, 형광 강도를 4~7배까지 증가시킬 수 있다.
알츠하이머병 환자의 경우 혈액이나 소변에 극미량의 아밀로이드베타가 포함되어 있을 것으로 예상되므로, 본 발명의 바이오센서는 극미량의 아밀로이드베타를 고감도로 검출함으로써 알츠하이머병 등을 조기 검진하는데 상당한 기여를 할 수 있다.
실시예
이하에서는, 상술한 내용을 바탕으로 본 발명의 바이오센서를 이용한 아밀로이드베타 검출 방법의 실시예를 설명하기로 한다.
먼저, 기판을 에탄올로 세척한다. 기판으로는 엘라이자 플레이트(ELISA plate)를 사용한다.
다음에, 2%(부피) (3-아미로프로필)트리에톡시실란이 함유된 에탄올 용액(용량 100 mL)을 기판의 웰에 주입하여 15분간 실온에서 반응시킨다.
다음에, 미반응 (3-아미로프로필)트리에톡시실란을 제거하기 위해 에탄올로 3회 세척한 후, 다음 반응의 완충용액인 인산완충 생리식염수(Phosphate Buffered Sailne, pH 7.4, 이하 PBS)로 3회 세척한다.
다음에, 0.1 mM ~ 10 mM NHS 덴드리머(PAMAM-succinamic acid dendrimer, Sigma-Aldrich사, 본 실험에서는 1 mM 농도사용)가 함유된 PBS용액(용량 100 mL)을 투입하여 30분간 실온에서 반응시킨다.
다음에, 미반응 NHS 덴드리머를 PBS용액으로 3회 세척한다.
다음에, 20 pg/100mL, 2 ng/100mL, 200 ng/100mL 아밀로이드베타[Amyloid Beta Peptide(Human), Abcam사] 용액(용량 100 mL)을 웰에 투입하여 60분간 실온에서 반응시킨다.
다음에, 미반응 아밀로이드베타를 PBS용액으로 3회 세척한다.
다음에, 수식된 NHS 덴드리머중 아밀로이드베타와 결합하지 않은 미반응 NHS 에스테르를 100 mg/mL의 보빈 세럼 알부민(Bovine serum albumin) PBS 용액으로 블로킹(blocking)한다.
다음에, 미반응 보빈 세럼 알부민을 PBS 용액으로 3회 세척한다.
다음에, 10 μg/mL 농도의 1차 항체를 함유한 용액(Anti-beta Amyloid Antibody PBS 용액)(용량 40 mL)을 투입하여 실온에서 12~24시간 동안 반응시킨다.
다음에, 미반응 1차 항체를 PBS용액으로 3회 세척한다.
다음에, 10 μg/mL 농도의 2차 항체를 함유한 용액(Alexa Fluor 488 Goat anti Rabbit Igg antibody PBS 용액)(용량 40 mL)을 투입하여 1시간 동안 반응시킨다.
다음에, 미반응 2차 항체를 PBS용액으로 3회 세척한다.
다음에, 형광 측정한다.
도 2는 종래의 바이오센서에 의해 아밀로이드베타를 형광 검출한 결과를 나타내는 사진이다. 도 3은 본 발명의 바이오센서에 의해 아밀로이드베타를 형광 검출한 결과를 나타내는 사진이다. 도 4는 종래와 본 발명의 바이오센서에 의한 실험에서 아밀로이드베타의 양에 따른 형광 감도를 도시하는 도면이다.
도 5는 20 pg／100mL 농도의 아밀로이드베타를 이용한 실험에서 종래와 본 발명의 바이오센서에 의한 형광 감도를 비교하여 도시하는 도면이다.
도 2 내지 도 4의 형광검출 결과에서, 녹색이 밝을수록 많은 양의 아밀로이드베타 검출에 성공한 것을 나타낸다. 동일한 아밀로이드베타의 양에서, 본 발명의 바이오센서는 종래와 비교하여 녹색이 밝으면서 훨씬 더 균일한 형태를 나타내는 것을 확인할 수 있다. 또한, 본 발명과 종래의 바이오센서 모두에서 투입된 아밀로이드베타의 양이 많을수록 강한 형광이 검출되는 것을 확인할 수 있다.
본 발명의 바이오센서는 종래에 비해 4 ~ 7배 높은 형광 감도를 나타낸다. 특히, 도 5에서 아밀로이드베타가 20 pg／100mL 농도에서의 결과는 본 발명의 바이오센서가 종래에 비하여 약 5배 정도의 높은 형광 감도를 나타내었다.
본 발명의 바이오센서 기술은 뇌하수체, 혈장, 혈청, 소변 등 다양한 용액 중의 아밀로이드베타의 검출에 응용할 수 있다. 또한, 본 발명의 바이오센서 기술은 아밀로이드베타 외에 다른 고감도 생체 소분자 검출에도 응용 가능하다.
본 발명의 바이오센서 기술은 아밀로이드베타가 표준마커가 되는 병을 조기 진단하는데 사용될 수 있다. 이러한 병에는 치매, 알츠하이머병, 다운증후군, 아밀로이드 맥관병증, 대뇌 아밀로이드 맥관병증, 전신성 아밀로이드증, 더치(Dutch)형 아밀로이드증, 봉입체 근염, 지중해열, 머클-웰스 증후군, 특발성 골수종, 아밀로이드 다발신경병증, 아밀로이드 심근병증, 전신성 노인성 아밀로이드증, 아밀로이드증성 유전성 뇌출혈, 스크라피, 크로이츠 펠트-야콥병, 쿠루병, 게르스트만-스트라우슬러-샤잉커 증후군, 갑상선 수질 암종, 근육쇠약병, 랑게르한스섬 Ⅱ형 당뇨병 등이 있다.
본 발명은 상기 실시예에 한정되지 않고 본 발명의 기술적 요지를 벗어나지 아니하는 범위 내에서 다양하게 수정 또는 변형되어 실시될 수 있음은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명한 것이다.

Claims (5)

  1. 바이오센서를 이용하여 용액에 포함된 미량의 아밀로이드베타를 검출하는 방법에 있어서,
    a) 복수의 웰(well)이 형성된 기판을 마련하는 단계;
    b) 상기 웰에 (3-아미노프로필)트리에톡시실란 또는 (3-아미노프로필)트리메톡시실란이 함유된 용액을 주입하는 단계;
    c) 상기 웰에 덴드리머가 함유된 용액을 주입하는 단계;
    d) 상기 웰에 아밀로이드베타가 함유된 용액을 주입하는 단계;
    e) 상기 웰에 상기 아밀로이드베타를 타켓으로 하는 1차 항체가 함유된 용액을 주입하는 단계;
    e) 상기 웰에 상기 1차 항체를 타겟으로 하는 2차 항체가 함유된 용액을 주입하는 단계;
    f) 상기 2차 항체를 검출하는 단계;
    를 포함하는 바이오센서를 이용하여 용액에 포함된 미량의 아밀로이드베타를 검출하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 덴드리머는 NHS 덴드리머인 바이오센서를 이용하여 용액에 포함된 미량의 아밀로이드베타를 검출하는 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 2차 항체는 형광 물질 또는 발광 물질을 포함하는 바이오센서를 이용하여 용액에 포함된 미량의 아밀로이드베타를 검출하는 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 (3-아미노프로필)트리에톡시실란 또는 상기 (3-아미노프로필)트리메톡시실란이 함유된 용액은 1~4 부피%의 (3-아미노프로필)트리에톡시실란 또는 (3-아미노프로필)트리메톡시실란을 함유하는 바이오센서를 이용하여 용액에 포함된 미량의 아밀로이드베타를 검출하는 방법.
  5. 제2항에 있어서,
    상기 덴드리머가 함유된 용액은 0.1 mM~10 mM의 상기 NHS 덴드리머를 함유하는 바이오센서를 이용하여 용액에 포함된 미량의 아밀로이드베타를 검출하는 방법.
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