JP2015502968A - 生体固有のタンパク質からの病原性の凝集体を定量化するための標準物質 - Google Patents
生体固有のタンパク質からの病原性の凝集体を定量化するための標準物質 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2015502968A JP2015502968A JP2014548050A JP2014548050A JP2015502968A JP 2015502968 A JP2015502968 A JP 2015502968A JP 2014548050 A JP2014548050 A JP 2014548050A JP 2014548050 A JP2014548050 A JP 2014548050A JP 2015502968 A JP2015502968 A JP 2015502968A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- protein
- dendrimer
- oligomers
- standard substance
- standard
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
- G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4711—Alzheimer's disease; Amyloid plaque core protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
- C08G83/00—Macromolecular compounds not provided for in groups C08G2/00 - C08G81/00
- C08G83/002—Dendritic macromolecules
- C08G83/003—Dendrimers
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
- G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
- G01N2333/4701—Details
- G01N2333/4709—Amyloid plaque core protein
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/28—Neurological disorders
- G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
- G01N2800/2821—Alzheimer
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/28—Neurological disorders
- G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
- G01N2800/2828—Prion diseases
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/28—Neurological disorders
- G01N2800/2835—Movement disorders, e.g. Parkinson, Huntington, Tourette
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
本発明は、タンパク質凝集性疾患、アミロイド変性、又はタンパク質ミスフォールディング疾患を特徴付ける生体固有のタンパク質からの病原性の凝集体又はオリゴマーを定量化するための標準物質、並びにこの病原性の凝集体又はオリゴマーを定量化するためのこの標準物質の使用に関する。
Description
本発明は、タンパク質凝集性疾患、アミロイド変性、又はタンパク質ミスフォールディング疾患を特徴付ける生体固有のタンパク質からの病原性の凝集体又はオリゴマーを定量化するための標準物質、並びにこの病原性の凝集体又はオリゴマーを定量化するためのこの標準物質の使用に関する。
多くの場合に(しかしながらこれに限定されるものではないが)、それぞれ特異的なタンパク質がβ折り畳みシート構造の規則的な構造で細胞外、全身又は局所的に堆積することをその共通の診断基準とする臨床症状の異質の群を、タンパク質ミスフォールディング疾患ないしタンパク質凝集性疾患、又はアミロイド変性と称する。この群にはアルツハイマー病(AD、アルツハイマー型認知症、ラテン語ではMorbus Alzheimer)又はパーキンソン病も含まれる。現代社会では加齢性の認知症がますます大きな問題となっており、それというのも、平均余命が延びているためにますます多くの人が加齢性の認知症を患っており、この疾患が社会保障システムやその財務上の実現可能性に影響を及ぼしているためである。
多くの神経変性疾患において、例えばオリゴマー又はフィブリルのような生体固有のタンパク質からの病理学的な凝集体が生じる。例えば、アルツハイマー型認知症の場合には脳にアミロイドβペプチド堆積物(Aβペプチド堆積物)が認められ、パーキンソン病の場合にはシヌクレイン堆積物が認められる。しかしながら、アミロイドβペプチド堆積物(又はペプチドフィブリルからなるプラーク)は、APP(アミロイド前駆体タンパク質)からのモノマーアミロイドβペプチドの分解を以て開始し、次いで神経毒性アミロイドβペプチドオリゴマーを形成し、最後にアミロイドβペプチドフィブリルのプラーク状の堆積を以て終了するというプロセスの最終段階に過ぎない。ADの主な病理学的特徴は、Aβペプチドからなる老人斑又はアミロイドプラークの形成である。さらに、タウタンパク質からの神経原繊維堆積物が生じる。Aβペプチドの前駆体タンパク質であるAPPは、神経細胞の細胞壁に局在している。タンパク質の分解と場合によりそれに続く変性により、これから、例えばAβ1−40、Aβ11−40、Aβ1−42、Aβ11−42又はpyroGluAβ3−42、pyroGluAβ3−40といった、長さや種類の異なるAβフラグメントが生じる。モノマーAβペプチドは、健康な生体においても生涯にわたって生じる。1990年代からのアミロイド・カスケード仮説によれば、プラークの形態のAβ堆積物が疾患症状のトリガである。しかしながら近年、様々な研究によって、特に自由に拡散する小さなAβオリゴマーは極めて毒性が高く、ADの発症及び進行の原因であることが指摘されている。従って、Aβペプチドの凝集体はADの病因と直接結びついている。
しかしながら、現在、確実な診断は、顕著な臨床症状が発現した後になって初めて可能であり、その際、信頼性は最高でも90%と考えられている。従来の唯一の確実な診断は、目下、患者の死亡後に、脳内での様々な変化の組織学的証拠によって初めて可能である。
従って、タンパク質凝集性疾患、アミロイド変性、又はタンパク質ミスフォールディング疾患を引き起こしかつ/又は特徴付ける生体固有のタンパク質の病原性の凝集体又はオリゴマーを同定し、かつ定量的に把握するための方法が求められている。
組織や体液における、タンパク質凝集性疾患、アミロイド変性、又はタンパク質ミスフォールディング疾患を引き起こす生体固有のタンパク質からの病原性の凝集体又はオリゴマーの特性決定及び定量化のための方法は、これまでごくわずかにしか記載されていない。
そのような方法の開発や、そのような方法により測定された結果を確実に比較し得るようにするためには、厳密に定義された標準物質、即ち厳密に特性決定された(合成)ポリマーが不可欠である。標準物質として使用するためには、このポリマーは種々のサイズや形態で存在しなければならず、このサイズや形態は厳密に定義されている必要がある。
しかしながら、ペプチドの凝集は、例えば温度、サンプルの塩含分、タンパク質の製造会社、純度等といった多数の因子により決定される。そのため、試験の開発や確認のためのモノマーペプチドの凝集による標準物質としてのポリマーの製造は、再現が困難である。さらに、従来、例えば調製されたAβオリゴマーの安定性は十分でなく、即ち、Aβオリゴマーを調製物から種々の時点で取り出す際に、常に同一のAβ凝集体種が存在することを保証することができなかった。従来公知であるオリゴマー調製物は、一般に種々の中間体形からなっており、この中間体形のサイズは不均一であり、よってその再現性は満足のいくものではない。
抗アミロイドモノクローナル抗体に結合する一連の化合物についての記載がなされている。そのような化合物は、例えばManea et al., (Biopolymeres Peptide Science 2004, Vol.76, p.503-511、及びPeptid-Science 2008, Vol.90, No.2, p.94-104)、並びにChafekar et al.(ChemBioChem 2007, 8, 1857-1864)から公知である。これらは、Aβエピトープ(4−10)又は(16−20)が結合しているポリマーをベースとしている。β−アミロイドペプチドの検出法はUS5,593,846号から公知であり、その際、ペプチドの13−28及び1−16の位置に結合する抗体が使用されている。しかしながら、ここではAβオリゴマーのみならずモノマーも検出される。
特に、組織又は体液からのサンプルにおけるAβオリゴマーの検出の分野では、従来、比較値として、合成により製造されたAβモノマーから種々のプロトコルで調製されたAβオリゴマーが用いられてきた。オリゴマー調製物中に存在するオリゴマーのサイズが1つのみであること、そしてこの調製物がAβモノマー又はAβフィブリルを含まないことは保証されていなかった。さらに、これらのサンプルが示す貯蔵安定性は十分でなく、そのオリゴマー・モノマー組成に関してその特性は変化する。
これらの欠点に基づき、これまで、オリゴマー検出システムの正確なキャリブレーション及び特性決定は不正確なものであるか、又は不可能であった。特に、様々な研究室においてプロトコルが様々に異なっているため、試験系の世界的な調和、ひいては確立は困難であった。
従って、タンパク質ミスフォールディング疾患、アミロイド変性、又はタンパク質凝集性疾患を引き起こしかつ/又は特徴付ける生体固有のタンパク質からの病原性の凝集体又はオリゴマーを定量化するための標準物質が求められている。
本発明の課題は、生体固有のタンパク質からの病原性の凝集体又はオリゴマーの厳密かつ定量的な測定を可能にする標準物質を提供することであった。この標準物質を内部標準物質又は外部標準物質として使用し得ることが望ましい。
さらに、本発明の課題は、生体固有のタンパク質からの病原性の凝集体又はオリゴマーの定量化のための、厳密に定義された均質でかつ安定な標準物質の調製物を提供することであった。
前記課題は、タンパク質凝集性疾患、又はアミロイド変性、又はタンパク質ミスフォールディング疾患を特徴付けるオリゴマー又は病原性の凝集体を定量化するための標準物質において、ポリマーがポリペプチド配列から構成されており、このポリペプチド配列は、その配列に関して、相応するサブセグメントにおいて、タンパク質凝集性疾患、又はアミロイド変性、又はタンパク質ミスフォールディング疾患を特徴付ける生体固有のタンパク質と同一であるか、又は、相応するサブセグメントにわたって、この生体固有のタンパク質と少なくとも50%の相同性を示し、その際、ポリマーが凝集しないことを特徴とする標準物質により解決される。
本発明の意味での標準物質とは、特性及び/又は量の比較及び測定に、特に生体固有のタンパク質からの病原性凝集体のサイズ及び量の測定に用いられる、一般に有効であり受け入れられる固定の参照量を表す。本発明の意味での標準物質は、機器のキャリブレーション及び/又は測定に使用可能である。
本発明の意味で、アミロイド変性及びタンパク質ミスフォールディング疾患も「タンパク質凝集性疾患」という概念で一括りにすることができる。そのような疾患と、それに関連する生体固有のタンパク質の例は、ADに関してはAβタンパク質及びタウタンパク質であり、パーキンソン病に関してはα−シヌクレインであり、またプリオン病、例えばヒトのクロイツフェルト・ヤコブ病(CJD)、羊のスクレイピー及び牛海綿状脳症(BSE)に関してはプリオンタンパク質である。
「相同な配列」とは、本発明の意味で、あるアミノ酸配列が、タンパク質凝集性疾患を引き起こす生体固有の病原性の凝集体又はオリゴマーからのアミノ酸配列と、少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%の同一性を示すことを意味する。本願明細書では、「同一性」という概念に代えて、「相同な」又は「相同性」という概念を同義で用いる。2つの核酸配列又はポリペプチド配列間の同一性は、Smith, T.F.及びWaterman, M.S(Adv. Appl. Math. 2: 482-489(1981))のアルゴリズムに基づくプログラムBESTFITを用いた比較により、アミノ酸に関するパラメータを、ギャップクリエーションペナルティー:8、及びギャップエクステンションペナルティー:2に設定し、核酸に関するパラメータを、ギャップクリエーションペナルティー:50、及びギャップエクステンションペナルティー:3に設定して算出される。好ましくは、2つの核酸配列又はポリペプチド配列間の同一性は、それぞれの全配列長にわたる核酸配列/ポリペプチド配列の同一性によって定義され、例えばこれは、Needleman, S.B.及びWunsch, C.D.(J. Mol. Biol. 48: 443-453)のアルゴリズムに基づくプログラムGAPを用いた比較により、アミノ酸に関するパラメータを、ギャップクリエーションペナルティー:8、及びギャップエクステンションペナルティー:2に設定し、核酸に関するパラメータを、ギャップクリエーションペナルティー:50、及びギャップエクステンションペナルティー:3に設定して算出される。
2つのアミノ酸配列が同一のアミノ酸配列を有している場合、これら2つのアミノ酸配列は本発明の意味で同一である。
生体固有のタンパク質の「相応するサブセグメント」という概念は、本発明による定義に従って、本発明による標準物質を構成しているモノマーの、同一の、又は、示されているパーセンテージで相同なペプチド配列を有しているペプチド配列と解釈されるべきである。
本発明による標準物質について重要な点は、好ましくは凝集しないモノマー配列を用いることによって標準物質が凝集しないという点であり、それというのも、生体固有のタンパク質の「相応するサブセグメント」は凝集の原因でないか、もしくは、凝集の原因となる群がブロッキングのために凝集しないためである。
本発明の意味での凝集体とは、以下のものである:
− 互いに共有結合していない、複数の、好ましくは同一の構成単位からなる粒子、及び/又は、
− 複数のモノマーの、共有結合していない集合体。
− 互いに共有結合していない、複数の、好ましくは同一の構成単位からなる粒子、及び/又は、
− 複数のモノマーの、共有結合していない集合体。
本発明の一実施態様において、標準物質は厳密に定義された数のエピトープを有しており、このエピトープは、相応するプローブの結合のために、(直接、又は、アミノ酸、スペーサー及び/又は官能基を介して)互いに共有結合している。本発明の意味でのプローブとは、以下のものからなる群から選択される:抗体、ナノボディ及びアフィボディ。さらに、検出すべき凝集体に対して十分な結合特異性を有している分子はいずれもプローブであり、例えば染料(チオフラビンT、コンゴーレッド等)である。
エピトープの数は、ポリペプチド配列であって、その配列に関して、エピトープを形成している生体固有のタンパク質のサブセグメントと同一であるか、又はこのサブセグメントと少なくとも50%の相同性を示し、かつその際、このエピトープの生物学的活性を有しているポリペプチド配列を用いることにより決定される。そのようにして選択されたポリペプチド配列は、所望の数で、本発明による標準物質の合成の際に組み込まれ、かつ/又は、一緒に本発明により結合される。
本発明による標準物質は、上記のポリペプチド配列、好ましくはエピトープから構成されており、場合により他の要素を含むポリマーである。本発明のもう一つの実施態様において、上記のポリペプチド配列、好ましくはエピトープ、及び/又は、相応するエピトープの生物学的活性を有するその相同体は、それぞれ標準物質の残りのモノマー種のうちの1種の数に対して、及び/又は、他の全てのモノマーの数に対して、同じか又はそれよりも大きい数のモノマーを表す。
本発明のもう一つの実施態様において、エピトープは、サブセグメントAβ1−8(配列番号2)、Aβ1−11(配列番号3)、Aβ1−16(配列番号4)、Aβ3−11(配列番号5)及びpyroGluAβ3−11(配列番号6)、Aβ11−16(配列番号7)及びpyroGluAβ11−16(配列番号8)から選択されたAβペプチドのエピトープ、例えば(以下の配列:DAEFRHDSGYE(1−11;配列番号3に相当)を有する)ヒトN末端エピトープである。pyroGluとは、そのN末端にある残基の分離後にAβペプチドの3位又は11位のグルタミン酸残基から生じ得るピログルタミン酸の略称である。
本発明による標準物質は、上で定義したポリペプチド配列からのポリマーである。本発明の意味でのオリゴマーとは、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個又は20個のモノマー(モノマーとは、上に挙げたポリペプチド配列と解釈されるべきである。)から形成されているポリマー又はその多量体であり、好ましくは2〜16個、4〜16個、8〜16個、特に好ましくは8個又は16個のモノマーから形成されているポリマー又はその多量体である。従って、本発明による標準物質は本発明によるオリゴマーないしポリマーである。
本発明の一別法において、標準物質は水溶性である。
本発明の一別法において、本発明による標準物質は同一のポリペプチド配列から構成されている。本発明の一別法において、本発明による標準物質は異なるポリペプチド配列から構成されている。
本発明の一別法において、上で定義したようなポリペプチド配列は直鎖状構造で連結している。本発明の一別法において、上で定義したようなポリペプチド配列が連結して、本発明による分岐鎖オリゴマーを形成している。本発明の一別法において、上で定義したようなポリペプチド配列が連結して、本発明による架橋オリゴマーを形成している。本発明による分岐鎖もしくは架橋オリゴマーは、リシンを用いて、又はクリックケミストリーを用いて、個々の構成単位を結合することによって製造可能である。上記の通り、本発明による標準物質、即ち本発明によるオリゴマーないしポリマーは、厳密に定義された数で存在するポリペプチド配列、好ましくはエピトープに加え、さらに、付加的なアミノ酸、スペーサー及び/又は官能基を含むことができ、これらを介して、ポリペプチド配列、好ましくはエピトープが互いに共有結合している。一別法において、特にシステインによるジスルフィド架橋を用いた、ポリペプチド配列、好ましくはエピトープとシステインとの直接結合は、(還元剤による解架橋を回避するために)排除される。同様に、もう一つの変法において、スペーサーと、一方ではポリペプチド配列との、及び他方ではシステインとの直接結合は排除される。
本発明は、一別法において、サブセグメントAβ1−8(配列番号2)、Aβ1−11(配列番号3)、Aβ1−16(配列番号4)、Aβ3−11(配列番号5)及びpyroGluAβ3−11(配列番号6)、Aβ11−16(配列番号7)及びpyroGluAβ11−16(配列番号8)から選択されたAβペプチドのアミノ末端部分、例えば(以下の配列:DAEFRHDSGYE(1−11)を有する)ヒトN末端エピトープのコピーを含むか又はこれから構成されている標準物質分子に関する。
個々の構成単位の合成の前又は後に、官能基によるエピトープのコピーを行うことができる。本発明による標準物質の特徴は、ポリペプチド配列の共有結合である。
本発明により使用可能なポリペプチド配列は、フルレングスのAβペプチドの配列と同一のものであってもよいし、フルレングスのAβペプチドの配列と50%、55%、60%、65%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%の相同性を示すものであってもよい。
また、フルレングスのAβペプチドのサブセグメントと同一であるか、又は、フルレングスのAβペプチドのサブセグメントと50%、60%、65%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%の相同性を示すポリペプチド配列は、本発明による標準物質分子の合成にも用いられる。本発明により使用される配列について重要な点は、凝集しない(又は条件により制御されてのみ凝集する)というその特性、及び/又はエピトープとしてのその活性である。
本発明のもう一つの実施態様において、標準物質はデンドリマーとして構成されている。本発明によるデンドリマーは、本発明により使用され得る上記のポリペプチド配列から構成されており、かつ中心骨格分子を含むことができる。好ましくは、この骨格分子はストレプトアビジンモノマー、特に好ましくはポリマー、特に四量体である。
本発明によるデンドリマーは、一変法において、Aβペプチドのサブセグメントと同一であるか又は相応するサブセグメントに対して少なくとも50%の相同性を示す配列を有するポリペプチド配列を含んでいる。
本発明によれば、少なくとも50%の相同性という概念は、50%、55%、60%、65%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%からなる群から選択された高い相同性とも解釈されるべきである。
好ましくは生体固有のタンパク質からの病原性の凝集体又はオリゴマーよりも水性物質中での溶解度が高い標準物質が、本発明の一実施態様において、AβペプチドのN末端領域と同一であるか又はこれに対して少なくとも50%の相同性を示すポリペプチド配列から形成されている。本発明によれば、AβポリペプチドのN末端領域とは、アミノ酸配列Aβ1−8(配列番号2)、Aβ1−11(配列番号3)、Aβ1−16(配列番号4)、Aβ3−11(配列番号5)及びpyroGluAβ3−11(配列番号6)、Aβ11−16(配列番号7)及びpyroGluAβ11−16(配列番号8)と解釈されるべきである。
本発明による標準物質分子は、少なくとも2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個又はそれを上回る種々のプローブに対するエピトープを含むことができる。
Aβペプチドの種々の領域と同一であるか又はこれに対して少なくとも50%の相同性を示すものの、相応するエピトープの活性を有しているポリペプチド配列を用いることにより、種々のプローブに対して固有のエピトープを本発明による標準物質に組み込むことができる。一実施態様において、このために、AβポリペプチドのN末端領域と同一であるか又は50%の相同性を示すポリペプチド配列、並びに、AβポリペプチドのC末端と同一であるか又は少なくとも50%の相同性を示すポリペプチド配列が用いられる。
本発明の一実施態様において、標準物質分子はいわゆるスペーサーを含んでいる。スペーサーとは、共有結合を介して標準物質分子に組み込まれており、所定の物理的及び/又は化学的特性を有しており、それによって標準物質分子の特性が変化するような分子と解釈されるべきである。本発明による標準物質の一実施態様において、親水性又は疎水性、好ましくは親水性のスペーサーが用いられる。親水性のスペーサーは、ポリエチレングリコール、糖、グリセリン、ポリ−L−リシン又はβ−アラニンから形成される分子群から選択される。
本発明による標準物質は、本発明の一実施態様において、(さらなる)官能基を含んでいる。官能基とは、標準物質に共有結合している分子と解釈されるべきである。一変法において、官能基はビオチン基を含んでいる。それにより、ストレプトアビジンとの強力な共有結合が可能となる。そのようにして、ビオチン基を含む標準物質分子はストレプトアビジン基を含む分子に結合できる。本発明による標準物質分子がビオチン基及び/又はストレプトアビジン基を含んでいる場合、比較的大きな標準物質を合成することもできるし、複数の、場合により種々の標準物質分子を骨格に結合させることもできる。
本発明のもう一つの別法において、標準物質分子は、分光光度定量のための染料及び/又は芳香族アミノ酸を含んでいる。芳香族アミノ酸は、例えばトリプトファン、チロシン、フェニルアラニン又はヒスチジンであるか、又はこの群から選択されたものである。トリプトファンを組み込むことによって、溶液中での標準物質の濃度の分光光度定量が可能となる。
本発明のさらなる対象は、ポリペプチドを含むデンドリマーであり、このポリペプチドは、その配列に関して、相応するサブセグメントにおいて、タンパク質凝集性疾患を特徴付ける生体固有のタンパク質と同一であるか、又は、相応するサブセグメントにわたって、この生体固有のタンパク質と少なくとも50%の相同性を示すものである。
本発明によるデンドリマーは、標準物質の上記の特徴の各々か、又はその各々の任意の組み合わせを有することができる。
本発明の一別法において、以下のものが該当する:
プローブの共有結合のための厳密に定義された数のエピトープを含むデンドリマー、
Aβペプチドのエピトープを含むデンドリマー、
タンパク質凝集性疾患を特徴付ける生体固有のタンパク質からの病原性の凝集体よりも水性物質中での溶解度が高いことを特徴とするデンドリマー、
官能基を含むデンドリマー、
少なくとも1つのスペーサー分子を含むデンドリマー、及び/又は
分光光度定量のための染料及び/又は芳香族アミノ酸を含むデンドリマー。
プローブの共有結合のための厳密に定義された数のエピトープを含むデンドリマー、
Aβペプチドのエピトープを含むデンドリマー、
タンパク質凝集性疾患を特徴付ける生体固有のタンパク質からの病原性の凝集体よりも水性物質中での溶解度が高いことを特徴とするデンドリマー、
官能基を含むデンドリマー、
少なくとも1つのスペーサー分子を含むデンドリマー、及び/又は
分光光度定量のための染料及び/又は芳香族アミノ酸を含むデンドリマー。
本発明によれば、デンドリマーは放射対称性を有している。一変法において、デンドリマーの第1世代の分岐は、リシン、特に3つのリシンアミノ酸を介して行われる。
本発明のもう1つの別法において、標準物質、特にデンドリマーにおいて、ポリペプチド配列、好ましくはエピトープは、硫黄原子との結合を介さずに、チオエーテル結合を介さずに、かつ/又はシステインを介さずに(場合によりシステインによるジスルフィド架橋を用いて)互いに結合しているか、又は、標準物質の他の要素、例えばアミノ酸、スペーサー及び/又は官能基及び/又は他の上記の要素と結合しており、特に共有結合している。同様に、もう1つの変法において、ポリペプチド配列、好ましくはエピトープと、これに結合しているスペーサーとは、スペーサー上で、硫黄原子との結合を介さずに、チオエーテル結合を介さずに、かつ/又はシステインを介さずに互いに結合しているか、又は、標準物質の他の要素、例えばアミノ酸、さらなるスペーサー及び/又は官能基及び/又は他の上記の要素と結合しており、特に共有結合している。
本発明はさらに、上記のような標準物質の製造法に関する。一実施態様において、本発明による標準物質は、当業者に公知のペプチド合成法又は組換え法により製造される。
本発明のもう1つの対象は、タンパク質凝集性疾患を特徴付ける生体固有のタンパク質からの病原性の凝集体又はオリゴマーを定量化するための、上記の標準物質又は上記のデンドリマーの使用である。
本発明の一実施態様において、標準物質はAβオリゴマーの定量化に用いられる。
従って、本発明によるオリゴマーないしポリマーを標準物質として使用する、タンパク質凝集性疾患、又はアミロイド変性、又はタンパク質ミスフォールディング疾患を特徴付ける生体固有のタンパク質からの病原性の凝集体又はオリゴマーを定量化するための方法も、本発明の対象である。
本発明の一実施態様において、本発明による標準物質は、サーフェスFIDA法、Elisa(サンドイッチElisa)又はFACSにおけるキャリブレーションに使用される。
もう1つの実施態様において、本発明は、本発明による標準物質を含むキットに関する。本発明のキットの化合物及び/又は構成要素は、容器内に、場合によりバッファー及び/又は溶液と一緒に、あるいはバッファー及び/又は溶液中にパックされていてよい。また、いくつかの構成要素が同じ容器内にパックされていてもよい。これに加えて、又はこの代わりに、1つ以上の構成要素が、例えばガラスプレート、チップ、又はナイロンメンブレンといった固体の支持体に、又はマイクロタイタープレートのウェルに吸収されていてもよい。さらに、キットは、このキットを任意の一態様に用いるための使用説明書を含むことができる。
本発明の一別法において、標準物質は、以下のようにして生体固有のタンパク質からの病原性の凝集体又はオリゴマーの定量化に用いられる:
第一の工程において、標準物質又はデンドリマーをプローブでマークし、この標準物質又はデンドリマーに結合しているプローブの数を測定し、
第二の工程において、タンパク質凝集性疾患を特徴付ける生体固有のタンパク質からの病原性の凝集体又はオリゴマーをプローブでマークし、このそれぞれ病原性の凝集体又はオリゴマーに結合しているプローブの数を測定し、
第三の工程において、第一の工程からのそれぞれ標準物質又はデンドリマーに結合しているプローブの数を、第二の工程からの数と比較し、さらに
第四の工程において、それにより、体液からのオリゴマーの数及びサイズを決定する。
第一の工程において、標準物質又はデンドリマーをプローブでマークし、この標準物質又はデンドリマーに結合しているプローブの数を測定し、
第二の工程において、タンパク質凝集性疾患を特徴付ける生体固有のタンパク質からの病原性の凝集体又はオリゴマーをプローブでマークし、このそれぞれ病原性の凝集体又はオリゴマーに結合しているプローブの数を測定し、
第三の工程において、第一の工程からのそれぞれ標準物質又はデンドリマーに結合しているプローブの数を、第二の工程からの数と比較し、さらに
第四の工程において、それにより、体液からのオリゴマーの数及びサイズを決定する。
本発明の一変法において、本発明による標準物質、好ましくはデンドリマーは、サーフェスFIDA法のキャリブレーションに用いられる。第一の工程において、体液からの生体固有の病原性の凝集体、例えばAβ凝集体は、キャプチャー分子、例えばキャプチャー抗体によりガラス表面上に固定化される。Aβ凝集体の場合には、このためにN末端に結合するキャプチャー抗体を使用することができる。固定化の後、この凝集体は2つの異なるプローブによりマークされる。Aβ凝集体の場合には、例えば、双方がN末端結合エピトープを介して結合するAβ抗体が使用される。これらの検出プローブは、好ましくは異なる蛍光染料でマークされている。それにより、これらの検出プローブは例えばレーザー走査型顕微鏡のような顕微鏡下での視認が可能となる。
本発明によれば、試験系において、類似もしくは同一のエピトープに結合する3つの異なるプローブか又は3つの異なってマークされたプローブを用いることによって、生体固有のポリペプチドのモノマー検出が排除される。これに代わって、又はこれに加えて、比較的強度の低いシグナルを強度閾値の定義により評価しないことによって、モノマーの検出を排除することができる。これに代わって、又はこれに加えて、比較的大きい凝集体は、異なってマークされた染料を有する2つのプローブに対して複数の結合部位を有しているため、これらのシグナルの相互相関によりモノマーの検出を排除することができる。本発明による標準物質を、測定の際に内部標準物質又は外部標準物質として使用することができる。
1.Aβオリゴマー標準物質の製造
一実施例において、N末端に結合するAβ抗体に対する16個のエピトープ(エピトープはAβ1−11に相当する。配列:DAEFRHDSGYE、配列番号3)を有するAβオリゴマー標準物質を調製した。まず、4つのN末端AβエピトープAβ1−11からなる多抗原ペプチド(MAP)を合成した。これらのエピトープは図1Aに相応してトリプルリシンコア結合しており、このトリプルリシンコアは、UV/VIS分光法によりMAP濃度を厳密に測定するために2つのトリプトファンを含んでいた。さらに、ビオチンタグをN末端につけた。これを、図1のBに示すように、それぞれ4つの4−MAP単位をストレプトアビジン四量体に結合するのに用いた。4−MAP及びストレプトアビジンをインキュベーションした後に、図1のCに示すように16−MAPを形成させた。サイズ排除クロマトグラフィーにより、16−MAPをインキュベーション混合物の他の成分と分離した。次いで、MAP−16を順にPBSで希釈し、Aβオリゴマーの検出のためにsFIDA試験で使用した。
一実施例において、N末端に結合するAβ抗体に対する16個のエピトープ(エピトープはAβ1−11に相当する。配列:DAEFRHDSGYE、配列番号3)を有するAβオリゴマー標準物質を調製した。まず、4つのN末端AβエピトープAβ1−11からなる多抗原ペプチド(MAP)を合成した。これらのエピトープは図1Aに相応してトリプルリシンコア結合しており、このトリプルリシンコアは、UV/VIS分光法によりMAP濃度を厳密に測定するために2つのトリプトファンを含んでいた。さらに、ビオチンタグをN末端につけた。これを、図1のBに示すように、それぞれ4つの4−MAP単位をストレプトアビジン四量体に結合するのに用いた。4−MAP及びストレプトアビジンをインキュベーションした後に、図1のCに示すように16−MAPを形成させた。サイズ排除クロマトグラフィーにより、16−MAPをインキュベーション混合物の他の成分と分離した。次いで、MAP−16を順にPBSで希釈し、Aβオリゴマーの検出のためにsFIDA試験で使用した。
2.Aβオリゴマーの検出
a.ガラスプレートの準備
ガラス製のマイクロタイタープレートを超音波浴中で15分間洗浄し、次いでプラズマ洗浄装置で10分間処理した。ガラス表面の活性化のために、ウェルを5M NaOH中で少なくとも3時間インキュベートし、水ですすいだ後、窒素ガス流中で乾燥させた。デキストランで被覆するために、ガラス表面をヒドロキシル化し、次いでアミノ基で活性化させた。このために、ガラスプレートをDMSO中の5Mエタノールアミンの溶液中で一晩インキュベートした。次いで、このガラスプレートを水ですすぎ、窒素ガス流中で乾燥させた。カルボキシメチルデキストラン(CMD)を20mg/mlの濃度で水中に溶解させ、N−エチル−N−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)(200mM)及びN−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)(50mM)と混合した。10分間のプレインキュベーションの後、この溶液を室温でさらに2時間インキュベートした。次いで、このガラスプレートを水で洗浄した。
a.ガラスプレートの準備
ガラス製のマイクロタイタープレートを超音波浴中で15分間洗浄し、次いでプラズマ洗浄装置で10分間処理した。ガラス表面の活性化のために、ウェルを5M NaOH中で少なくとも3時間インキュベートし、水ですすいだ後、窒素ガス流中で乾燥させた。デキストランで被覆するために、ガラス表面をヒドロキシル化し、次いでアミノ基で活性化させた。このために、ガラスプレートをDMSO中の5Mエタノールアミンの溶液中で一晩インキュベートした。次いで、このガラスプレートを水ですすぎ、窒素ガス流中で乾燥させた。カルボキシメチルデキストラン(CMD)を20mg/mlの濃度で水中に溶解させ、N−エチル−N−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)(200mM)及びN−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)(50mM)と混合した。10分間のプレインキュベーションの後、この溶液を室温でさらに2時間インキュベートした。次いで、このガラスプレートを水で洗浄した。
b.被覆したガラス上へのキャプチャー分子としての抗体の固定化
EDC/NHSの溶液(200又は50mM)で、第二の活性化を5分間行った。抗体の溶液をこれに添加し、4℃で2時間インキュベートした。これにより、抗体を、CMDで活性化されたガラス表面に共有結合させた。次いで、CMDスペーサー上の残りの活性カルボキシル末端基を失活させるために、これをDMSO中の1Mエタノールアミンで5分間インキュベートした。次いで、ガラスをPBSで3回洗浄した。
EDC/NHSの溶液(200又は50mM)で、第二の活性化を5分間行った。抗体の溶液をこれに添加し、4℃で2時間インキュベートした。これにより、抗体を、CMDで活性化されたガラス表面に共有結合させた。次いで、CMDスペーサー上の残りの活性カルボキシル末端基を失活させるために、これをDMSO中の1Mエタノールアミンで5分間インキュベートした。次いで、ガラスをPBSで3回洗浄した。
c.前処理したガラス上へのMAP−16の固定化
アッセイを行うべきMAP−16を含むサンプルをガラス上で1時間インキュベートし、次いで、TBST(0.1%)(W/W)、(TBSバッファー中のTween 20、TBS:50nM Tris−HCl、0.15M NaCl、pH7.4)で3回洗浄した。
アッセイを行うべきMAP−16を含むサンプルをガラス上で1時間インキュベートし、次いで、TBST(0.1%)(W/W)、(TBSバッファー中のTween 20、TBS:50nM Tris−HCl、0.15M NaCl、pH7.4)で3回洗浄した。
d.蛍光染料でのプローブの標識
6E10−Alexa488抗体及びIC−16抗体を使用した。IC−16抗体を、製造者の使用説明書に従い、キット(蛍光標識キットAlexa−647、分子プローブ、Karlsruhe社、ドイツ在)でマーキングした。標識した抗体を、2mMアジ化ナトリウムを含むPBS中で暗所で4℃で貯蔵した。
6E10−Alexa488抗体及びIC−16抗体を使用した。IC−16抗体を、製造者の使用説明書に従い、キット(蛍光標識キットAlexa−647、分子プローブ、Karlsruhe社、ドイツ在)でマーキングした。標識した抗体を、2mMアジ化ナトリウムを含むPBS中で暗所で4℃で貯蔵した。
e.プローブでの凝集体のマーキング
プローブを添加し、室温で1時間インキュベートし、次いで、TBSTで5回、水で2回洗浄した。
プローブを添加し、室温で1時間インキュベートし、次いで、TBSTで5回、水で2回洗浄した。
f.凝集体標準物質の検出
共焦点レーザー走査型顕微鏡LSM 710(Carl Zeiss社、Jena、ドイツ在)を用いて測定を行った。この顕微鏡は、1つのアルゴンイオンレーザーと3つのヘリウムネオンレーザーを具備していた。タイルスキャンモードで測定を行い、その際、1つのウェル内の隣接する面を測定して画像化した。各タイルスキャンは3×2個の各画像を含んでおり、各画像の面積は213×213μmであった。また、倒立型顕微鏡DMI 6000、レーザーボックス及びHamamatsu−EM−CCD C9100カメラから構成されているTIRF顕微鏡(TIRF=total internal reflection)で測定を行った。タイルスキャンモードで、それぞれ109.9×109.9μmのサイズを有する3×3個の各画像が存在していた。
共焦点レーザー走査型顕微鏡LSM 710(Carl Zeiss社、Jena、ドイツ在)を用いて測定を行った。この顕微鏡は、1つのアルゴンイオンレーザーと3つのヘリウムネオンレーザーを具備していた。タイルスキャンモードで測定を行い、その際、1つのウェル内の隣接する面を測定して画像化した。各タイルスキャンは3×2個の各画像を含んでおり、各画像の面積は213×213μmであった。また、倒立型顕微鏡DMI 6000、レーザーボックス及びHamamatsu−EM−CCD C9100カメラから構成されているTIRF顕微鏡(TIRF=total internal reflection)で測定を行った。タイルスキャンモードで、それぞれ109.9×109.9μmのサイズを有する3×3個の各画像が存在していた。
ソフトウェア「Image J」(http://rsbweb.nih.gov/ij/)を用いて評価を行った。様々なプローブを用いることにより、共局在解析を実施することができた。このために、まず、個々のピクセルの強度値から、MAP−16を含まない陰性対照により定義されるカットオフ値を減じた。次いで、強度が0よりも大きい共局在ピクセルの数を加えた。
図2に測定結果を示す。sFIDAシグナル、即ち共局在ピクセルの数がMAP−16分子の濃度と相関関係にあることが明らかに認められる。
図の説明
図1:
Aβの最初の11個のアミノ酸に相応する(配列:DAEFRHDSGYE)N末端に結合するAβ抗体に対する16個のエピトープを有するAβオリゴマー標準物質の調製。A)UV/VIS分光法により濃度を測定するために2つのトリプトファンを含むトリプルリシンコアに結合した4つのN末端Aβエピトープ1−11からなる4−MAPを合成した。B及びC)16−MAPを製造するために、それぞれ4つの4−MAPをストレプトアビジン四量体を介して結合した。サイズ排除クロマトグラフィーにより、MAP−16をインキュベーション混合物の他の成分から分離した。
図1:
Aβの最初の11個のアミノ酸に相応する(配列:DAEFRHDSGYE)N末端に結合するAβ抗体に対する16個のエピトープを有するAβオリゴマー標準物質の調製。A)UV/VIS分光法により濃度を測定するために2つのトリプトファンを含むトリプルリシンコアに結合した4つのN末端Aβエピトープ1−11からなる4−MAPを合成した。B及びC)16−MAPを製造するために、それぞれ4つの4−MAPをストレプトアビジン四量体を介して結合した。サイズ排除クロマトグラフィーにより、MAP−16をインキュベーション混合物の他の成分から分離した。
図2:
PBSバッファーで希釈した様々な濃度でのMAP−16のsFIDA測定。MAP−16を含まないPBSバッファーを陰性対照として使用した。A)レーザー走査型顕微鏡(Zeiss社 LSM 710)で測定を行った。B)TIRF顕微鏡(Leica社)で測定を行った。
PBSバッファーで希釈した様々な濃度でのMAP−16のsFIDA測定。MAP−16を含まないPBSバッファーを陰性対照として使用した。A)レーザー走査型顕微鏡(Zeiss社 LSM 710)で測定を行った。B)TIRF顕微鏡(Leica社)で測定を行った。
Claims (19)
- タンパク質凝集性疾患、又はアミロイド変性、又はタンパク質ミスフォールディング疾患を特徴付ける生体固有のタンパク質からの病原性の凝集体又はオリゴマーを定量化するための標準物質において、ポリマーがポリペプチド配列から構成されており、このポリペプチド配列は、その配列に関して、相応するサブセグメントにおいて、タンパク質凝集性疾患、又はアミロイド変性、又はタンパク質ミスフォールディング疾患を特徴付ける生体固有のタンパク質と同一であるか、又は、相応するサブセグメントにわたって、この生体固有のタンパク質と少なくとも50%の相同性を示し、その際、ポリマーが凝集しないことを特徴とする、標準物質。
- プローブの結合のために互いに共有結合している、厳密に定義された数のエピトープを有している、請求項1に記載の標準物質。
- Aβペプチドのエピトープを含んでいる、請求項1又は2に記載の標準物質。
- Aβ1−8(配列番号2)、Aβ1−11(配列番号3)、Aβ1−16(配列番号4)、Aβ3−11(配列番号5)、pyroGluAβ3−11(配列番号6)、Aβ11−16(配列番号7)及びpyroGluAβ11−16(配列番号8)からなる群から選択された少なくとも1つのエピトープを含んでいる、請求項3に記載の標準物質。
- 水性物質に可溶である、請求項1から4までのいずれか1項に記載の標準物質。
- 官能基を有している、請求項1から5までのいずれか1項に記載の標準物質。
- 少なくとも1つのスペーサー分子を含んでいる、請求項1から6までのいずれか1項に記載の標準物質。
- 分光光度定量のための染料及び/又は芳香族アミノ酸を含んでいる、請求項1から7までのいずれか1項に記載の標準物質。
- ポリペプチド配列が、硫黄原子との結合を介さずに、チオエーテル結合を介さずに、かつ/又はシステインを介さずに、互いに連結しているか、又は標準物質の他の要素と連結しており、特に共有結合している、請求項1から8までのいずれか1項に記載の標準物質。
- ポリペプチド配列が、直鎖状構造、分岐鎖状構造又は架橋構造で互いに結合しているか、又はデンドリマーとして存在している、請求項1から9までのいずれか1項に記載の標準物質。
- ポリペプチドを含むデンドリマーにおいて、このポリペプチドが、その配列に関して、相応するサブセグメントにおいて、タンパク質凝集性疾患を特徴付ける生体固有のタンパク質と同一であるか、又は、相応するサブセグメントにわたって、この生体固有のタンパク質と少なくとも50%の相同性を示し、その際、ポリマーが凝集しないことを特徴とするデンドリマー。
- 請求項2から9までのいずれか1項に記載の特徴を少なくとも1つ有している、請求項10に記載のデンドリマー。
- 請求項1から6までのいずれか1項に記載の標準物質、又は請求項11又は12に記載のデンドリマーの製造法において、ペプチド合成法又は組換え法を用いることを特徴とする方法。
- タンパク質凝集性疾患を特徴付ける生体固有のタンパク質からの病原性の凝集体又はオリゴマーを定量化するための、請求項1から9までのいずれか1項に記載の標準物質、又は、請求項10から12までのいずれか1項に記載のデンドリマーの使用。
- Aβオリゴマーを定量化するための、請求項14に記載の使用。
- 請求項1から9までのいずれか1項に記載の標準物質、又は請求項11又は12に記載のデンドリマーを、サーフェスFIDA法、Elisa、サンドイッチElisa、又はFACSのキャリブレーションに使用する、請求項14に記載の使用。
- 以下の工程を含む、請求項14に記載の使用:
− 第一の工程において、請求項1から9までのいずれか1項に記載の標準物質、又は請求項11又は12に記載のデンドリマーをプローブでマークし、この標準物質又はデンドリマーに結合しているプローブの数を測定し、
− 第二の工程において、タンパク質凝集性疾患を特徴付ける生体固有のタンパク質からの病原性の凝集体又はオリゴマーをプローブでマークし、このそれぞれ病原性の凝集体又はオリゴマーに結合しているプローブの数を測定し、
− 第三の工程において、第一の工程からのそれぞれ標準物質又はデンドリマーに結合しているプローブの数を、第二の工程からの数と比較し、さらに
− 第四の工程において、それにより、体液からのオリゴマーの数及びサイズを決定する。 - タンパク質凝集性疾患を特徴付ける生体固有のタンパク質からの病原性の凝集体又はオリゴマーを定量化するための、請求項1から9までのいずれか1項に記載の少なくとも1つの標準物質、又は請求項11又は12に記載の少なくとも1つのデンドリマーを含む、キット。
- タンパク質凝集性疾患、又はアミロイド変性、又はタンパク質ミスフォールディング疾患を特徴付ける生体固有のタンパク質からの病原性の凝集体又はオリゴマーを定量化するための方法において、標準物質としてポリペプチド配列から構成されるポリマーを使用し、このポリペプチド配列は、その配列に関して、相応するサブセグメントにおいて、タンパク質凝集性疾患、又はアミロイド変性、又はタンパク質ミスフォールディング疾患を特徴付ける生体固有のタンパク質と同一であるか、又は、相応するサブセグメントにわたって、この生体固有のタンパク質と少なくとも50%の相同性を示し、その際、ポリマーが凝集しないことを特徴とする方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE102011057019A DE102011057019A1 (de) | 2011-12-23 | 2011-12-23 | Standard zur Quantifizierung von pathogenen Aggregaten aus körpereigenen Proteinen |
DE102011057019.5 | 2011-12-23 | ||
PCT/EP2012/076551 WO2013092951A2 (de) | 2011-12-23 | 2012-12-21 | Standard zur quantifizierung von pathogenen aggregaten aus körpereigenen proteinen |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2015502968A true JP2015502968A (ja) | 2015-01-29 |
Family
ID=47561562
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2014548050A Pending JP2015502968A (ja) | 2011-12-23 | 2012-12-21 | 生体固有のタンパク質からの病原性の凝集体を定量化するための標準物質 |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20150037826A1 (ja) |
EP (2) | EP3470847A3 (ja) |
JP (1) | JP2015502968A (ja) |
CN (2) | CN108593937A (ja) |
BR (1) | BR112014015397A2 (ja) |
CA (1) | CA2858210A1 (ja) |
DE (1) | DE102011057019A1 (ja) |
IL (1) | IL232871B (ja) |
WO (1) | WO2013092951A2 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP7473398B2 (ja) | 2020-05-28 | 2024-04-23 | シスメックス株式会社 | キャリブレータ、複合体、及びIgA凝集体を測定する方法 |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE102013106713A1 (de) * | 2013-06-26 | 2014-12-31 | Forschungszentrum Jülich GmbH | Verfahren zur Ermittlung von Indikatoren zur Bestimmung von Krankheiten |
DE102013011634A1 (de) * | 2013-07-12 | 2015-01-29 | Forschungszentrum Jülich GmbH | Verfahren zur quantitativen Charakterisierung amyloider Peptide und/oder Proteine in einer Probe |
CN107109701B (zh) * | 2014-09-16 | 2020-10-09 | 斯坦福国际研究院 | 通过光纤阵列扫描技术发现亲和试剂和催化剂 |
DE102015003404B4 (de) | 2015-03-18 | 2021-10-07 | Forschungszentrum Jülich GmbH | Verfahren zur Herstellung eines Standards für den Nachweis von Proteinaggregaten einer Proteinfehlfaltungserkrankung sowie Standard und dessen Verwendung |
CN116574271B (zh) * | 2023-06-06 | 2023-12-19 | 苏州谱迪生物科技有限公司 | 一种用于免疫检测低丰度生物标志物信号级联放大的荧光树状大分子的制备方法及其应用 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5593846A (en) * | 1992-07-10 | 1997-01-14 | Athena Neurosciences | Methods for the detection of soluble β-amyloid peptide |
JP2009531294A (ja) * | 2006-02-24 | 2009-09-03 | シエシー ファルマセウティチィ ソシエタ ペル アチオニ | 抗アミロイド免疫原性組成物、方法、および使用 |
JP2010065046A (ja) * | 2002-04-19 | 2010-03-25 | Governing Council Of The Univ Of Toronto | アルツハイマー病の処置のための免疫学的方法および組成物 |
JP2010540485A (ja) * | 2007-09-25 | 2010-12-24 | グラクソ グループ リミテッド | 抗原結合性タンパク質 |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20060257420A1 (en) * | 2002-04-26 | 2006-11-16 | Cel-Sci Corporation | Methods of preparation and composition of peptide constructs useful for treatment of autoimmune and transplant related host versus graft conditions |
RU2007119382A (ru) * | 2004-10-25 | 2008-11-27 | Мерк энд Ко., Инк. (US) | Антитела против addl и их применение |
NZ560535A (en) * | 2005-01-13 | 2011-01-28 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Elisa assays using prion-specific peptide reagents |
WO2006136906A2 (en) * | 2005-06-17 | 2006-12-28 | Epfl Ecole Polytechnique Fédérale De Lausanne | Switch-peptides as tool for the study of fibrillogenesis |
KR20080103560A (ko) * | 2006-02-22 | 2008-11-27 | 가부시끼가이샤 하야시바라 세이부쓰 가가꾸 겐꾸조 | 항 아밀로이드-β-펩티드 항체 생산 유도용 펩티드 백신 |
EA029481B1 (ru) * | 2007-01-05 | 2018-04-30 | Юнивэсэти Оф Цюрих | Способ получения человеческого рекомбинантного антитела, специфично связывающего вариант эндогенного белка, формирующий аномальные патологические белковые структуры путем агрегации, олигомеризации или образования фибрилл |
EA026787B1 (ru) * | 2007-08-27 | 2017-05-31 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Ниармедик Плюс" | Конструкция нуклеиновой кислоты и ее применение для лечения, предотвращения и сдерживания болезни альцгеймера |
ITNA20080006A1 (it) * | 2008-01-28 | 2009-07-29 | Consiglio Nazionale Ricerche | Proteine chimeriche capaci di formare particelle virus-like, che contengono sequenze peptidiche del beta-amiloide e la componente e2 della alfachetoacido deidrogenasi di "geobacillus stearothermophilus", utili per l'induzione di una risposta anticorp |
-
2011
- 2011-12-23 DE DE102011057019A patent/DE102011057019A1/de not_active Ceased
-
2012
- 2012-12-21 BR BR112014015397A patent/BR112014015397A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2012-12-21 CN CN201810497739.6A patent/CN108593937A/zh active Pending
- 2012-12-21 EP EP18206804.9A patent/EP3470847A3/de not_active Withdrawn
- 2012-12-21 CA CA2858210A patent/CA2858210A1/en not_active Abandoned
- 2012-12-21 JP JP2014548050A patent/JP2015502968A/ja active Pending
- 2012-12-21 WO PCT/EP2012/076551 patent/WO2013092951A2/de active Application Filing
- 2012-12-21 CN CN201280064164.XA patent/CN104067129A/zh active Pending
- 2012-12-21 US US14/366,941 patent/US20150037826A1/en not_active Abandoned
- 2012-12-21 EP EP12816051.2A patent/EP2795336A2/de not_active Withdrawn
-
2014
- 2014-05-29 IL IL232871A patent/IL232871B/en active IP Right Grant
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5593846A (en) * | 1992-07-10 | 1997-01-14 | Athena Neurosciences | Methods for the detection of soluble β-amyloid peptide |
JP2010065046A (ja) * | 2002-04-19 | 2010-03-25 | Governing Council Of The Univ Of Toronto | アルツハイマー病の処置のための免疫学的方法および組成物 |
JP2009531294A (ja) * | 2006-02-24 | 2009-09-03 | シエシー ファルマセウティチィ ソシエタ ペル アチオニ | 抗アミロイド免疫原性組成物、方法、および使用 |
JP2010540485A (ja) * | 2007-09-25 | 2010-12-24 | グラクソ グループ リミテッド | 抗原結合性タンパク質 |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
JPN5015003299; CURRENT ALZHEIMER RESEARCH Vol.4, No.4, 200709, p.427-436 * |
JPN5015003301; 'AMYLOID-BETA (N3PE) ELISA-INSTRUCTIONS FOR USE' IBL INTERNATIONAL [ONLINE] , 20110701, P4 * |
JPN6016024789; J Biol Chem Vol.286, No.6, 201102, p.4454-4460 * |
JPN6016024793; ChemBioChem Vol.8, 2007, p.1857-1864 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP7473398B2 (ja) | 2020-05-28 | 2024-04-23 | シスメックス株式会社 | キャリブレータ、複合体、及びIgA凝集体を測定する方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
BR112014015397A2 (pt) | 2019-09-24 |
CA2858210A1 (en) | 2013-06-27 |
EP3470847A2 (de) | 2019-04-17 |
DE102011057019A1 (de) | 2013-06-27 |
IL232871B (en) | 2019-06-30 |
CN104067129A (zh) | 2014-09-24 |
CN108593937A (zh) | 2018-09-28 |
IL232871A0 (en) | 2014-07-31 |
EP2795336A2 (de) | 2014-10-29 |
US20150037826A1 (en) | 2015-02-05 |
EP3470847A3 (de) | 2019-08-07 |
WO2013092951A3 (de) | 2013-11-07 |
WO2013092951A2 (de) | 2013-06-27 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6625709B2 (ja) | Aβ凝集体の選択的定量化方法 | |
Ait-Bouziad et al. | Discovery and characterization of stable and toxic Tau/phospholipid oligomeric complexes | |
Bruggink et al. | Methods for analysis of amyloid-β aggregates | |
JP2015502968A (ja) | 生体固有のタンパク質からの病原性の凝集体を定量化するための標準物質 | |
Wilhelm et al. | Immune reactivity towards insulin, its amyloid and protein S100B in blood sera of Parkinson's disease patients | |
JP6478987B2 (ja) | 表面fidaの使用下でのタンパク質凝集体の測定方法 | |
AU2010315133B2 (en) | Positively charged species as binding reagents in the separation of protein aggregates from monomers | |
Sjöhamn et al. | Unraveling aquaporin interaction partners | |
JP2015502551A5 (ja) | ||
CA2384006A1 (en) | A minimal tau peptide for the nucleation of paired helical filaments | |
JP2023065484A (ja) | 新規タウ種 | |
US20230228771A1 (en) | Determination of disease-specific protein aggregates in stool samples | |
WO2014161875A1 (en) | METHOD FOR DETECTING Aβ-SPECIFIC ANTIBODIES IN A BIOLOGICAL SAMPLE | |
JP4829797B2 (ja) | 結合を定量化する薬剤および方法 | |
Guo et al. | Recent Advances in the Application Peptide and Peptoid in Diagnosis Biomarkers of Alzheimer’s Disease in Blood | |
US9261514B2 (en) | Conformational-switching fluorescent protein probe for detection of alpha synuclein oligomers | |
Zingale et al. | The Use of Surface Plasmon Resonance to Study the Interactions of Proteins Involved in Conformational Diseases: Experimental Approaches for New Therapeutical Perspectives | |
WO2014073885A1 (ko) | 멀티머-형성 폴리펩타이드의 멀티머 정량분석을 위한 표준 단백질 복합체 | |
JP2021504675A (ja) | 試料中のタンパク質ミスフォールディング疾患のタンパク質凝集体を定量化する方法 | |
WO2002042778A2 (en) | For amyloid formation inhibitors | |
McArthur et al. | Development of a pan‐tau multivalent nanobody that binds tau aggregation motifs and recognizes pathological tau aggregates | |
Lieknina et al. | Structural basis of epitope recognition by anti-alpha synuclein antibodies MJFR14-6-4-2 | |
Hackl | The impact of membrane composition on conformation and trafficking of lipidated prion protein (PrP) variants | |
Bugyei-Twum | Inhibition of transthyretin fibrillogenesis using a conformation specific antibody | |
Lee | Method Development for an Easy and Direct Quantitation of Protein Adsorption by Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20150918 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20160704 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20161003 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20161128 |