KR19980028711A

KR19980028711A - 폐흡충의 시스테인 프로테아제를 암호화하는 유전자 서열 및 재조합 단백질

Info

Publication number: KR19980028711A
Application number: KR1019960047876A
Authority: KR
Inventors: 공윤; 양현종; 정준용; 윤두희
Original assignee: 박원훈; 한국과학기술연구원
Priority date: 1996-10-24
Filing date: 1996-10-24
Publication date: 1998-07-15
Also published as: KR0175523B1

Abstract

본 발명은 폐흡충의 시스테인 프로테아제를 암호화하는 유전자 서열 및 이 서열에 의해 발현된 단백질에 관한 것이다. 본 발명에 따른 유전자 서열 및 단백질 서열은 특정의 프라이머를 사용함으로서 규명되었고, 이들 프라이머는 폐흡충의 감염을 진단하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

폐흡충의 시스테인 프로테아제를 암호화하는 유전자 서열 및 재조합 단백질

본 발명은 폐질환을 일으키는 폐흡충의 인체 병인에 중요한 역할을 담당하는 시스테인 단백질분해효소 (cysteine protease, 이하, 시스테인 프로테아제라 한다)를 암호화하는 전체 유전자 서열 및 발현된 단백질에 관한 것이다.되어왔다.27: 15-21, 1989). 이와 같이 폐흡충에서 시스테인 프로테아제가 중요한 역할을 수행하지만 유전자가 클로닝되지 않아 진단과 치료시 발생하는 문제를 근본적으로 해결하지 못했다.

따라서, 본 발명의 목적은 현재 폐흡충증을 진단하거나 치료할때 문제점을 분자생물학적 측면에서 특성을 규명하고자 폐흡충증 진단 시약과 치료제 개발을 위한 폐흡충의 시스테인 프로테아제의 유전적 정보 및 이를 진단하기 위한 합성 프로브를 제공하는데 있다.

도 1은 폐흡충에서 시스테인 프로테아제의 유전자를 찾기위한 과정을 나타내는 계통도.프로테아제의 유전자 서열.

위와 같은 본 발명의 목적은 폐흡충에서 시스테인 프로테아제를 암호화하는 유전자 서열 및 유전자 재조합 기술을 사용하여 대장균에서 생산된 재조합 시스테인 프로테아제를 제공함으로써 달성된다. 본 발명의 또다른 목적은 폐흡충의 인체내 감염을 신속히 진단하는데 사용되는 합성 프로브를 제공함으로써 달성된다.

본 발명은 먼저 폐흡충 시스테인 프로테아제의 유전자를 찾기 위하여 제1도와 같은 계획을 수립하였다 (도1 참조). 이를 구체적으로 설명하자면, 먼저 이 단백질을 암호화하는 유전자 서열을 찾기 위하여 목적하는 단백질을 생산하는 세포로부터 전령 RNA(이하, mRNA라 한다)를 단리·정제한다. 얻어진 mRNA들을 역전사효소를 사용하여 상보적 DNA (이하, cDNA라 한다)로 전환시키나, 이렇게 만든 cDNA에 (dC)n 테일을 붙이고 (dG)n 테일을 붙인 벡터와 어닐링(annealing)시킨 후, 대장균 등의 적절히 선택된 균주에 형질전환시킨다. 이 균주는 다양한 mRNA에 대응하는 cDNA를 가지게 되는데, 이렇게 만들어진 균주의 균을 cDNA-라이브러리라한다. 이 형질전환 균체중에서 원하는 유전자를 보유하는 균체를 선별하기 위하여 콜로니 하이브리다이제이션(co1ony hybridization) 방법 (참조: Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press, Co1d Spring Harbor, N. Y. (1982), pp. 312-319; 본 명세서에 참고로 인용함)을 이용한다. 프로브(probe)로서는 이미 다른 종에서 알려져있는 시스테인 프로테아제의 유전자 서열에서 상동성이 높은 부분을 선별하여 합성한다. 이후, 이를 이용하여 역전사 중합효소 연쇄반응(이하, RT-PCR이라함)을 수행하고 부분적인 유전자 서열을 얻는다 (도4 참조). 이렇게 얻어진 생성물을 방사성 동위 원소로 표지하여 시스테인 프로테아제의 유전자 서열을 갖는 양성 클론을 획득하고, 이 서열을 공지의 플라스미드 pBluescript II(-) 등의 적합한 운반체에 섭클로닝(subcloning)한 후, 재조합 플라스미드를 얻어 시스테인 프로테아제의 유전자 서열을 예컨대, 디테옥시뉴클레오타이드 사슬 종결 방법(참조: Maniatis et al., 1982“Molecular C1oning”) 등의 방법을 사용하여 프라이머(T3와 T7)를 이용하여 폐흡충에서 시스데인 프로테아제의 유전자 서열을 결정한다. 이 서열이 시스테인 프로테아제의 것임을 확인하기 위해서는 블라스트 서어치(blast search) 프로그램 등을 활용할 수가 있으며, 효소절단 부위 및 아미노산 서열로의 변환은 DNA 스트라이더(strider) 1.0 분석 프로그램에 의해 수행할 수 있다. 그 후, 시스테인 프로테아제 유전자(PwCP)를 대장균에서 발현시키기 위해서는 발현용 벡터 pET23d(+) (미국 WI 53711 Dr. Madison 소재의 Novagen Co.로부터 입수함)를 유전자 조작을 하여 재조합을 실시한다. 본 발명에 있어서는 먼저, 발현벡터 pET23d(+)를 Sacl과 Xhol으로 처리하여 1% 아가로스 겔에서 전기영동시켜 정제 및 분리하였다. 이 과정에 있어서 벡터의 시작 코돈을 이용하기 위하여 시스테인 프로테아제 유전자 (PwCP)의 시작 코돈을 없애고, 적당한 효소 절단 분위를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 합성한다. 본 발명자들은 5′ 쪽에 제한효소 Sacl 절단 부위 를 가지 도록 5′-ATCGAGCTCAAGAACAGGGCACGG-3′, 3′ 말단 쪽에 제한효소 Xhol 절단 부위를 가지도록 5′-GAAGTCTCGAGTTAGTGAATGATGGCGG-3′를 합성하고, PCR을 수행하여 얻은 산물을 제한효소 Sacl과 Xhol으로 처리하고 1% 아가로스 전기영동 겔에서 분리·정제한 후 벡터에 어닐링하여 재조합 pETPwCP 플라스미드를 만들었다 (도8 참조). 이 재조합 플라스미드를 대장균 등의 적합한 숙주, 예컨대 대장균 BL21 (DE3, 미국 WI 53711 Dr. Madison 소재의 Novagen Co.에서 상업적으로 입수 가능함)에 형질전환시키고, IPTG를 1 mM되도록 넣어 융합 단백질을 발현시켰다 (도 7 참조).실시예 1

시스테인 프로테아제를 생산하는 유전자를 얻기 위하여 먼저 성충으로부터 cDNA 라이브러리를 제조하였다. 도 1은 유전자 클로닝을 위한 계통 공정도이다. 구체적으로, 폐흡충 피낭 유충 100 개씩을 개에 경구감염시키고 9개월후에 개의 폐에서 폐흡충 성충을 회수하였다. 성충 50 마리로부터 약 2 ㎎의 전체 RNA를 분리하였다. 전체 RNA를 분리하기 위하여 RNA zol B (미국 TX 77033 Huston 소재의 Biotecx Co.로부터 입수함)를 이용하였다. 이렇게 얻은 전체 RNA를 1 M 포르말린(formaldehyde)이 혼합된 1.1% 아가로스 겔 상에 전기영동시켰다. 그 결과 기생충의 경우는 28S보다 18S의 양이 휠씬 많아 기존에 알려져 있는 사실과 반대임을 확인할 수 있었다. 전체 RNA로부터 mRNA와 특이하게 결합하는 올리고 (dT) 기질을 이용하여 mRNA 15 ㎍을 순수 분리하였다. 이렇게 준비된 mRNA 중 8 ㎍ 을 주형으로 하고 5′ 말단에 제한효소 Xho I의 염기 서열이 붙은 올리고(dT) 프라이머와 역전사효소 (AMV-RT)를 이용하여 0.5 kb - 4.5 kb 크기의 단일 가닥을 만들었다(도 2 참조). 단일 가닥에 DNA 중합효소를 이용하여 단일 가닥에 상응하는 크기의 이중 가닥을 만들었다(도 2 참조; 도 2에서 숫자 1은 첫번째 가닥, 2는 두번째 가닥을 나타냄). 여기에 운반체(vector)에 어닐링이 되도록 제한효소 EcoR I 링커를 붙인 다음 EcoR I 말단을 T4 폴리뉴클레오타이드 카이네이즈로 포스포릴레이션(phosphorylation)시켰다. 링커를 붙인 cDNA의 Xho I자리에 오버 행(overhang)을 만들었다. 이 cDNA를 세파크릴 S-400 스펀 컬럼 (Pharmarcia Co.)에 통과시켜 0.5kb 이상을 모았다. 도 3은 이 cDNA의 크기 분획화의 결과로서 숫자 1은 크기 마커이고, 숫자 2 - 8은 분획 1 - 7을 나타낸다. 그런 다음, 준비된 cDNA 약 100 ng과 운반체(Uni-Zap XR vector: 미국 CA 92037 La Jolla 소재의 Stratagene Co.로부터 입수함) 1 ㎍을 반응 및 어닐링시킨 다음 시험관내 패키징(in vitro packaging)(Giga Pak Gold Ⅱ, stratagene Co.로부터 구매)하여 대장균 SURE 균주 (미국 CA92037 La Jo1la 소재의 Stratagene Co.로부터 상업적으로 입수함)에 형질전환하여, cDNA-라이브러리를 만들었다.

표 1. 합성 프라이머

주) R은 A 또는 T를 나타낸다.₂있어서, 숫자1은 100 bp 마커이고, 2는 PwCPF1 + PwCPRl, 2는 PwCPF2 + PwCPR1, 3은 PwCPF3 + PwCPR1의 조합을 나타내고, 나타낸 서열이 시스테인 유전자의 부분 서열이다. 이렇게 얻은 유전자 서열은 일부분이지만 간질의 시스테인 유전자 서열과 90 % 이상의 유사성이 있었다. 이 산물을 방사성 동위원소(³²P)로 표지하여 cDNA-라이브러리를 3차에 걸쳐 탐색하여 양성 클론 2 개를 얻었다. 이 양성 클론을 헬퍼 페이지(helper phage, Stratagene Co.로부터 상업적으로 입수함)를 사용하여 정제된 클론으로부터 재조합 플라스미드, pBluescript Ⅱ(-) (미국 CA 92037 La Jo1la 소재의 Stratagene Co.로부터 상업적으로 입수함)를 단일 가닥으로 단리한 다음, 이 플라스미드를 대장균 SORL 균주 (Stratagene Co.로부터 상업적으로 입수함)에 형질 전환하여 시스테인 프로테아제의 유전자를 갖는 균체를 8 개 획득하였다. 획득된 균체에서 플라스미드 DNA를 분리하여 제한효소 EcoR I과 Xho I로 37 ℃에서 1 시간 동안 반응시켜 1 % 아가로스 겔 상에서 전기영동시켜 삽입 DNA를 확인한 다음, 디데옥시뉴클레오타이드 사슬 종결법 (참조: Maniatis et al., 1982 “Molecular Cloning”)으로 T3와 T7 프라이머를 이용하여 폐흡충에서 1030bp의 시스테인 프로테아제의 유전자 서열을 결정하였다. 도 5에 유전자의 전체 서열을 나타냈다. 도 5에 있어서 *는 정지 코돈이고, N-말단 부근의 밑줄친 부분은 시스테인 프로테아제의 활성 부위이고, 하측의 밑줄친 부분은 추정되는 폴리아데닐화 부위이다. 중간의 밑줄친 서열은 RT-PCR 산물이다. 이 유전자는 5′쪽에 N-말단 서열이 존재하며 3′-논코딩(noncoding)부위가 존재한다. 3′-논코딩 부위는 Poly(A) 서열이 존재하는 것을 알 수 있다. 블라스트 분석(blast anaysis) 결과, 폐흡충 시스테인 프로테아제는 pro-from의 경우 235 아미노산을 지니고 있었으며 pro-from의 -15번부터 -10번까지 6개 뉴클레오티드의 리보좀 결합 부위를 지니고 있었다. 성숙 효소는 16 개의 N-말단 아미노산과 214 개의 폴리팹타이드로 구성되었으며, 파파인(papain)과는 35.6 %, 폐흡충 피낭유충 중성 티올 프로테아제와는 48.1 %, 간질 및 만소열두조충의 카셉신 L(cathepsin L)과는 각각 40.0 및 41.1 %의 유사성을 보였다.₂상업적으로 입수함)에 형질전환시키고, LB 배지 3 ㎖ 에 IPTG를 1 mM 되도록 넣어 배향한다음, 12,000 rpm에 1분간 원심분리하여 대장균을 모은 다음, 상충액을 제거하고, 물 50 ㎕와 2 X SDS 시료 완충액 (1.25 ㎖의 0.5 M Tris-Cl, pH 6.8, 2 ㎖의 10% SDS, 1 ㎖의 100 % 글리세롤, 500 ㎕의 2-머캅토에탄을, 100 ㎕의 물, 그리고 150 ㎕의 0.1 % BPB) 50 ㎕을 더하여 100℃에서 3분간 끊인 다음 초음파 처리(sonication)시켜서 12 %, SDS-폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동하였다. 그 결과 약 28 kDa의 단백질이 발현되는 것을 확인하였다. 그 결과를 9도에 나타냈으며, 세로축 Mr은 분자량 마커(kDa)이고, 숫자 1은 유전자가 없는 벡터만을 발현시킨 단백질이고, 2는 폐흡충 시스테인 프로테아제의 성숙 형태의 유전자를 삽입하였으나 발현시키지 않은 상태의 단백질이며, 3은 폐흡충 시스테인 프로테아제의 성숙 형태의 유전자를 삽입하고 발현시킨 경우의 단백질로서 화살표로 표시하였고, 4는 폐흡충 시스테인 프로테아제의 전체 유전자를 삽입하였으나, 발현시키지 않은 상태의 단백질이며, 5는 폐흡충 시스테인 프로테아제의 전체 유전자를 삽입하고 발현시킨 단백질을 나타낸다.

시스테인 프로테아제 유전자 (PwCP)의 발현 정도롤 알아보기 위하여 폐흡충 성충으로부터 RNA zol B(Biotecx Co.로부터 입수함) 시약을 이용하여 전체 RNA(실시예 1에서 얻음)를 얻은 다음, 자외선 분광분석기를 이용하여 20 ㎍의 전체 RNA를 물에 5 분 동안 변성시킨 다음, l M 포르말린이 섞인 1.1 % 아가로스 겔에서 전기영동하였다. 그 후 에티듐 브로마이드로 염색하고 자외선에서 관찰하여 23S와, 16S 리보조말 RNA의 위치를 확인하고, 분리가 제대로 되었는지를 확인하였다. 이 RNA를 나일론 막에 전이시킨 다음, 하이브리다이제이션을 실시하였다. PwCP에³²P-dcTP로 랜덤 헥사머 (random hexamer) 방법 (Amersham Co.)에 의하여 표지한 다음, 50 % 포르말린, 6X SSC, 10% 덱스트린 설페이트, 1 % SDS, 그리고 차단제(blocking agent)가 포함된 하이브리다이제이션 용액에서, 42℃에서 18시간 동안 반응시킨 후, 1 X SSC와 0.1 % SDS의 용액으로 3회 세척한 후 X-ray 필름에 감광시킨 후 발색하였다. 그 결과, 도10에서 처럼 성충 시기에 약 1 kb가량의 유전자가 발현되는 것을 확인하였다.

본 발명에서 사용된 합성 프라이머 서열들은 폐흡중의 감염유무에 대한 진단에 사용될 수 있을 뿐만아니라, 본 발명에 따른 폐흡충의 유전자 서열 및 단백질 서열은 폐흡충에 의해 유발된 질병을 분자생물학적인 방법으로 치료하기 위한 기초를 제공한다. 아울러, 재조합 단백질은 폐흡충증의 진단 키트를 제조하는데 중요한 항원 단백질이 된다.

Claims

도 5에 나타낸 염기 서열로 이루어진 폐흡충의 시스테인 프로테아제를 암호화하는 DNA 서열.
도 5에 나타낸 아미노산 서열로 이루어지고, 약 28 kDa의 분자량을 갖는 시스테인 프로테아제.
폐흡충의 시스테인 프로테아제를 암호화하는 유전자를 포함하는 플라스미드 pETPwCP.
제3항에 따른 벡터 pETPwCP를 함유하는 대장균 균주 BL21.
다음의 염기 서열을 포함하는 합성 프로브.

5′-GAGTGGTATTTATTCAGAGCCAAAC-3′ (PwCPF3)

5′-GATTKGGCALATTCTACCGCATTGCC-3′ (PwCPRl)
제5항에 있어서, 상기 프로브가 인간 또는 동물에 있어서 폐흡충의 감염증의 진단에 사용하기 위한 것인 프로브.
도 4B에 나타낸 부분 DNA 서열.