KR102935552B1

KR102935552B1 - 역미셀을 형성하는 발효유화제를 이용한 항노화 조성물

Info

Publication number: KR102935552B1
Application number: KR1020190158296A
Authority: KR
Inventors: 김광년; 손주현; 박소영; 조사랑; 전향화
Original assignee: 주식회사 뉴라이프비에스티
Priority date: 2019-12-02
Filing date: 2019-12-02
Publication date: 2026-03-06
Anticipated expiration: 2039-12-02
Also published as: KR20210068811A

Abstract

본 발명은 역미셀을 형성하는 발효유화제를 이용하여 항산화 효능물질을 포집시킨 조성물에 관한 것으로, 활성물질을 피부에 효율적으로 통과시켜 지질층에 효과적으로 전달할 수 있다.
또한, 용해성, 유화성, 산화 안정성, 활성물질의 효능 등을 향상시킬 수 있으며, 합성물이 아닌 발효물로써 친환경적이고, 피부세포에 대한 독성이 없어 인체 친화적이므로 다양한 분야에 용이하게 적용할 수 있다.

Description

역미셀을 형성하는 발효유화제를 이용한 항노화 조성물{ANTIAGING COMPOSITION USING FERMENTED EMULSIFIER FORMING REVERSE MICELL}

본 발명은 역미셀을 형성하는 발효유화제를 이용하여 항산화 기반의 항노화 효능물질을 포집시킨 조성물에 관한 것이다.

인간의 피부는 크게 표피와 진피, 피하지방으로 나누어지고 다시 표피는 각질층, 투명층, 과립층, 유극층, 기저층으로 세분화되어 있다. 피부의 최외각층인 각질층은 죽은 케라틴세포 덩어리로 이루어져 있으며, 주로 단백질로 이루어져 있는 각질 세포로 구성되고, 각질 세포 간의 사이를 세라마이드, 콜레스테롤, 유리지방산 등의 지질이 채우고 있는 구조를 가진다. 이 지질층은 체내 수분이 증발되는 것을 방지하며, 외부 침입에 대해 신체를 보호하는 건강학적 기능과 동시에, 피부를 윤택하고 매끄럽게 보이게 하는 심미적 기능을 가지고 있다.

피부는 나이가 들어가면서 외부환경 및 스트레스에 노출되어 염증반응에 의해 노화가 발생하게 된다. 인플라메이징(inflammaging)은 inflammation과 aging의 합성어이며, 인간은 나이가 들어감에 있어서 만성 염증 반응에 노출되기 쉽고, 이는 노화와 연관을 지을 수 있으며, 생물학적 노화과정에서 나타나는 면역 노화에 노출되기 쉽다.

한편, 피부 내에 유효 물질을 투과시키기 위한 경로는 intrapathway, interpathway, transcelluar pathway가 있다. 이중, 피부 내로의 물질 투과효율은 interpathway가 높다. 한편, 피부 각질층은 친수성 물질보다 소수성 물질이 흡수 및 투과되기 용이하다.

약물의 피부 흡수에 영향을 미치는 요인은 크기, 모양, 표면 전하, 친유성, 투과 촉진제, 제형의 형태 그리고 각질층의 상태이다. 유효 성분을 피부에 자연스럽게 통과시키기 위해서는 소수성 혹은, 친수성과 소수성이 결합된 담체를 이용해야 하며 특히, 수용성 활성물질을 피부에 전달하기 위해 미셀(micelle) 혹은 리포좀(liposome)과 같은 형태의 담체를 이용하는 것이 일반적이다.

그러나 이러한 미셀 혹은 리포좀의 형태는 피부의 지질층을 통과시켜 유효물질을 흡수시키기에는 한계가 있다. 이는 피부의 최외각층인 각질층은 각질세포들로 쌓여있고, 그 사이 사이는 지질성분으로 이루어진 구조이기 때문에 구조적으로 친수성의 물질보다는 소수성의 물질이 각질세포 사이로 투과시키는 것이 용이하다.

역미셀이란, 계면활성제의 활성에 의해 유기용매 안에 나노미터 사이즈(1~10 nm)의 둥근 형태의 입자가 분산되어 있는 것을 의미한다.

역미셀계(reverse micelle system)는 비극성용매의 환경에서 계면활성제의 소수성 부분(tail)이 외부로 향하고, 친수성 부분(head)이 내부로 향하도록 자발적으로 배열되는 응집체이다. 이는 나노크기의 입자로 분산될 수 있다.

그러므로, 역미셀을 적용하여 피부로부터 유효성분을 효과적으로 침투시킬 수 있는 방법이 필요하다. 또한, 산화 및 분해에 취약한 활성물질을 포집함으로 써 안정성을 향상시키고자 하였다.

본 발명의 목적은 역미셀을 형성하는 발효유화제를 이용하여 항노화 활성물질을 포집시킨 조성물을 제공하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위하여 본 발명은,

Candida bombicola UA-06(기탁번호: KCTC13855BP, 한국생명공학연구원) 미생물로부터 형성된 발효물; 및

크로신, 에르고티오네인, 글루타치온, 레티놀, 풀러렌, 레스베라트롤, 설포라판 및 가자산으로 이루어지는 활성물질을 포함하되,

상기 발효물은 역미셀 구조를 형성하고, 상기 활성물질은 상기 역미셀 구조 내에 포집된 형태인, 항노화 조성물을 제공한다.

일구현예에 따르면, 상기 발효물은 Candida bombicola UA-06 미생물을 활성화시키는 종균배양 단계; 및

상기 종균배양한 미생물 및 식물성 오일을 발효시키는 발효 단계를 포함하는 방법으로 제조될 수 있다.

또한, 상기 종균배양 단계에서 사용하는 배지는 이스트 추출물(yeast extract), 글리세린(glycerin), K₂HPO₄, KH₂PO₄, NH₄NO₃ 및 MgSO₄를 포함할 수 있다.

또한, 상기 발효 단계에서 사용하는 배지는 이스트 추출물(yeast extract), 글리세린(glycerin), K₂HPO₄, KH₂PO₄, NH₄NO₃, MgSO₄, 글루쿠로노락톤(glucuronolactone) 및 식물성 오일을 포함할 수 있다.

구체적으로, 상기 종균배양 단계에서 사용하는 배지는 이스트 추출물(yeast extract) 1g/L, 글리세린(glycerin) 20g/L, K₂HPO₄ 25g/L, KH₂PO₄ 7g/L, NH₄NO₃ 3g/L 및 MgSO₄ 2g/L를 포함하고,

상기 발효 단계에서 사용하는 배지는 이스트 추출물(yeast extract) 1g/L, 글리세린(glycerin) 20g/L, K₂HPO₄ 25g/L, KH₂PO₄ 7g/L, NH₄NO₃ 3g/L, MgSO₄ 2g/L, 글루쿠로노락톤(glucuronolactone) 100g/L 및 식물성 오일 500g/L 을 포함할 수 있다.

일구현예에 따르면, 상기 종균배양 단계는 20℃, 300rpm, 1vvm, 호기 조건으로 진행되고,

상기 발효 단계는 25℃의 온도 및 100rpm의 혼합 조건으로 진행될 수 있다.

또한, 종균배양 단계는 배양 시작 60시간 시점에서 종료될 수 있다.

일구현예에 따르면, 상기 식물성 오일은 해바라기씨유일 수 있다.

일구현예에 따르면, 상기 발효 단계 후 정제공정 단계를 더 포함할 수 있고,

상기 정제 단계는 발효물을 정치시켜 상층과 하층을 분리하여 하층을 폐 기하고, MgSO₄를 첨가하여 교반 후 원심분리하여 미생물 및 수분을 제거하는 단계 및,

친화크로마토그라피 컬럼에 규산마그네슘을 충진제로 사용하여 지방산 및 불순물이 제거된 오일을 회수하는 단계를 포함할 수 있다.

기타 본 발명에 따른 구현예들의 구체적인 사항은 이하의 상세한 설명에 포함되어 있다.

본 발명은 역미셀(reverse micelle)을 이용하여 기능적으로 우수하나 수용액상에서 안정성이 낮은 항노화 활성물질을 피부에 효율적으로 통과시켜 지질층에 효과적으로 전달할 수 있도록 한다.

역미셀 내에 항노화 활성물질을 포집하여 용해성, 유화성, 산화 안정성, 활성물질의 효능 등을 향상시킬 수 있다. 또한, 합성물이 아닌 발효물로써 친환경적이고, 피부세포에 대한 독성이 없어 인체 친화적이므로 다양한 분야에 용이하게 적용할 수 있다.

도 1은 역미셀 형성 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 수용성 물질의 포집 과정을 나타낸 것이다.
도 3은 세포 증식율을 확인한 그래프이다.

본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예를 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

천연유래의 계면활성제는 피부에 유용한 성분을 다량 함유하고 있으며, 그 중, 미생물을 이용하는 생물 계면활성제(bio-surfactant)는 많은 이점을 가진다.

한편, 계면활성제는 일정 농도 이상일 때, 수상에서 중심에 소수기를 밀집시키는 미셀(micelle) 구조를 이루는 것이 일반적이다. 반대로, 유상에서는 저분자 친수기를 중심에 밀집시키는 역미셀(reverse micelle) 구조를 이룬다. 역미셀의 구조와 관련하여 역미셀 형성 모식도를 도 1에 나타내었다.

역미셀은 미셀보다 피부의 지질층을 통과하는데 더 효율적이기 때문에 세포간극을 통하여 수용성 활성물질을 피부세포에 안정적으로 전달하는 시스템으로 적용할 수 있다.

항산화 작용을 기반으로 하는 항노화 활성물질은 기능적으로는 우수하나 수용액상에서 안정성이 낮은 물질 특성을 갖기도 한다. 본 발명에 따르면, 이와 같은 활성물질을 역미셀로 포집함으로써 경피를 통한 피부 흡수율 및 침투율을 증진시킬 수 있으며, 활성물질의 기능을 최대화할 수 있다. 또한, 활성물질이 소수성 오일에 포집된 상태의 구조를 가지므로 활성물질의 안정성을 향상시킬 수 있고, 이를 다양한 제형에 접목시킬 수 있다. 본 발명의 일구현예에 따라 수용성 물질을 역미셀로 포집하는 과정을 도 2에 나타내었다.

이하, 본 발명의 구현예에 따른 항노화 조성물에 대하여 보다 상세하게 설명한다.

본 명세서 내의 용어 "역미셀(reverse micelle)"은 친수성 용해물의 존재 하에 극성기가 안쪽으로 배향되고, 소수기가 바깥쪽 비극성 용매측으로 배향되며, 거의 구상의 배향성 집단을 이루는 분자 집단을 의미한다.

본 명세서 내의 용어 "포집"은 상기 역미셀 내에 수용성 물질이 캡슐화된 형태를 의미한다.

구체적으로 본 발명은,

크로신(crocin)은 Crocus sativus L,flowers, 붓꽃과에서 추출한 샤프란 색소의 주요성분이며, 노란색의 색을 띈다. 또한, 물에 용해가 용이하며, 식품소재 및 화장품소재로도 많이 사용되고 있다. 하지만, 크로신은 열, 산소, 빛, 산성과 같은 환경에 노출될 경우 때 안정도가 낮다. Crocin은 항산화 및 항염효과도 있는 것으로 보고되어 있다(ref. Crocin, a natural molecule with potentially beneficial effects against skin ageing, International Journal of Cosmetic Science [09 Aug 2018, 40(4):388-400]).

에르고티오네인(L-Ergothioneine)는 강력한 천연 항산화제이며, 산화 스트레스로부터 세포를 보호하고, 광에 대한 항노화작용을 하여 화장품 소재로써 활용가치가 높다(참고문헌: L-Ergothioneine Protects Skin Cells against UV-Induced Damage??A Preliminary Study, Cosmetics 2014, 1, 51-60; doi:10.3390/cosmetics1010051).

글루타티온(glutathione)은 시스테인(cysteine), 글리신(glycine), 글루타메이트(glutamate)라는 3가지 아미노산으로 구성된 트리펩타이드(tripeptide)이며, 주요 기능은 항산화, 미백 효과가 있는 것으로 보고되어 있다. 하지만, 극성이 높기 때문에 피부 투과가 어려운 단점이 있다(Partition Coefficient and Glutathione Penetration of Topical Antiaging: Preformulation Study, International Journal of Drug Delivery Technology 2018; 8(2); 39-43). 또한, 열이나 광안정성이 매우 떨어지므로 제형에 적용하여도 효능 효과를 발현하기 어렵다는 문제점이 있다.

레티놀(retinol)은 비타민 A1의 화학명으로, 순수비타민 A라고도 한다. 동물의 장점막세포에 존재하며, 녹황색 식물에 많이 들어 있다. 활성 형태인 레티노인산(retinoic acid)으로 변형되기도 하며, 표피세포가 원래의 기능을 유지하는 데 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 즉, 주름을 감소시키고 피부 탄력을 증대시키는 효능이 있는 것으로 알려져 주름 제거나 피부 노화를 예방하는 화장품으로 개발된 바 있다.

풀러렌(fullerene)은 흑연이나 다이아몬드와 같은 탄소 동소체이다. 탄소원자가 5각형이나 6각형으로 배열 연결된 탄소고리를 가지며, 축구공과 유사한 형상을 갖는다. 또한, 강력한 항산화성과 살균성을 가진다.

레스베라트롤(Resveratrol)은 폴리페놀의 일종으로 베리류의 식물에 많이 포함되어 있으며, 항균물질을 분비하고, 항산화, 항염증, 항노화 등의 효과가 있다.

설포라판(sulforaphane)은 브로콜리, 브뤼셀 새싹(brussel), 양배추 등과 같은 십자화과 야채에 함유되어 있는 물질이며, 강력한 항산화 효과가 있다. 하지만, 광안정성, 온도, pH, 산소 등의 조건에 대한 안정도가 매우 낮다는 단점이 있다.

가자산(chebulic acid)은 숙성된 과일로부터 분리 가능한 페놀 화합물이다.

상기 종균배양 단계에서 사용하는 배지는 이스트 추출물(yeast extract), 글리세린(glycerin), K₂HPO₄, KH₂PO₄, NH₄NO₃ 및 MgSO₄를 포함할 수 있다. 구체적으로 예를 들면, 이스트 추출물(yeast extract) 1.0g/L, 글리세린(glycerin) 20g/L, K₂HPO₄ 25g/L, KH₂PO₄ 7 g/L, NH₄NO₃ 3 g/L 및 MgSO₄ 2g/L을 포함할 수 있다. 또한, 추가로 물을 포함할 수 있고, 구체적으로는 정제수가 바람직하며, 예를 들어 이온교환수지를 이용한 정제수를 사용할 수 있다.

상기 발효 단계에서 사용하는 배지는 이스트 추출물(yeast extract), 글리세린(glycerin), K₂HPO₄, KH₂PO₄, NH₄NO₃, MgSO₄, 글루쿠로노락톤(glucuronolactone) 및 식물성 오일을 포함할 수 있다. 구체적으로 예를 들면, 이스트 추출물(yeast extract) 1g/L, 글리세린(glycerin) 20g/L, K₂HPO₄ 25g/L, KH₂PO₄ 7g/L, NH₄NO₃ 3g/L, MgSO₄ 2g/L, 글루쿠로노락톤(glucuronolactone) 100g/L 및 식물성 오일 500g/L을 포함할 수 있다. 또한, 추가로 물을 포함할 수 있고, 구체적으로는 정제수가 바람직하며, 예를 들어 이온교환수지를 이용한 정제수를 사용할 수 있다.

상기 발효단계에서 글루쿠로노락톤을 포함함으로써 글루쿠로노락톤-지방산 형태의 친수성이 증가된 유화제를 생성시킬 수 있으며, 그에 따라 발효유화제의 유화력을 증가시키거나 친수성 활성물질 포집력을 향상시킬 수 있다.

일구현예에 따르면, 상기 종균배양 단계는 20℃, 300rpm, 1vvm, 호기 조건으로 진행할 수 있다. 또한, 상기 발효 단계는 25℃의 온도 및 100rpm으로 3일 동안 진행될 수 있다.

일구현예에 따르면, 상기 종균발효 단계는 균의 지수생장 종말점 시점에서 종료될 수 있다. 구체적으로 예를 들면, 지수생장 종말점 시점으로 예를 들어 60시간이 되는 시점에서 종균발효를 종료시킬 수 있다.

일구현예에 따르면, 상기 식물성 오일은 해바라기씨유를 사용할 수 있다.

일구현예에 따르면, 상기 발효 단계 후 정제공정 단계를 더 포함할 수 있다. 구체적으로, 수분 및 미생물의 제거를 위하여, 오일발효 후 발효물을 정치시켜 상층에 위치하는 소수성 부분(발효물)과 하층에 위치하는 친수성 부분(배지 및 불순물)을 분리하여 하층을 폐기하고, MgSO₄를 첨가하여 교반한 후 원심분리기를 이용하여 잔존 불순물 및 미생물을 제거할 수 있다.

또한, 상기 발효 후 발효물의 지방산 및 불순물의 정제를 위하여, 크로마토그라피(chromatography) 방법을 사용할 수 있다. 구체적으로, 상기 친화크로마토그라피 컬럼(affinity chromatography column)에 규산마그네슘(magnesium silicate)을 충진제로 사용하여 지방산 및 불순물 등을 흡착, 여과시킬 수 있다.

일구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 통상적인 화장료 조성물, 피부 외용제 약학 조성물 등 피부학적으로 적용이 가능한 어떠한 제형으로도 제조될 수 있다. 피부학적으로 적용이 가능하다는 것은 적용 대상에게 비교적 비독성이고 무해한 유효작용을 할 수 있는 조성물로서, 피부에 적용할 수 있는 외용제를 포함할 수 있으며, 상기 조성물로부터 기인하는 부작용이 유효 성분의 효능을 저하시키기 않고, 적용 대상에 심각한 자극을 유발하지 않으면서 유효성분들의 활성 및 물성을 손상시키지 않는다는 것을 의미할 수 있다.

이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.

제조예

Candida bombicola UA 06(기탁번호: KCTC13855BP, 한국생명공학연구원) 균체 수득

Candida bombicola UA 06(기탁번호: KCTC13855BP, 한국생명공학연구원)을 이스트 추출물(yeast extract) 1.0 g/L, 글리세린(glycerin) 20 g/L, K₂HPO₄ 25 g/L, KH₂PO₄ 7 g/L, NH₄NO₃ 3 g/L, MgSO₄ 2 g/L 및 증류수 933 g/L로 구성된 배지에 접종하여 20℃, 300rpm, 1NL/min(1vvm)의 호기적인 조건에서 종균배양을 진행하였다. 배양은 분광광도계(Epoch2, BioTek)로 600nm에서 흡광도를 측정하여 균의 지수생장 종말점인 60시간 시점에서 종료하였다. 배양액을 원심분리(16,000g, 30분)하여 균체를 침전시키고 인산 버퍼로 수 회 세척하여 균체를 수득하였다.

오일의 발효

오일 발효를 위하여 이스트 추출물(yeast extract) 1.0 g/L, 글리세린(glycerin) 20 g/L, K₂HPO₄ 25 g/L, KH₂PO₄ 7 g/L, NH₄NO₃ 3 g/L, MgSO₄ 2 g/L, 글루쿠로노락톤(glucuronolactone) 100 g/L, 식물성오일 500 g/L 및 증류수 333 g/L 로 구성된 발효액을 5 L 발효조에 25℃, 100rpm 조건으로 발효액을 혼합 제조하였다. 상기 발효액의 온도가 25℃일 때, 균체 2.5 g/L를 투입하고, 3일 동안 발효를 진행하였다. 식물성 오일로는 해바라기씨유를 사용하였다.

정제

발효 3일 후, 발효물에 대하여 잔존하는 효소활성을 90℃ 고온으로 활성 상실시킨 후, 1N HCl로 pH를 4 내지 5로 조정하고, 발효물을 6 내지 12시간 정치하여 수층(미생물 및 배지)과 유층(역미셀 형성 발효 유화물)을 분리하여 수층을 제거하였다. 발효물에 남아있는 수분을 제거하기 위하여 MgSO₄를 20 g/L 첨가하고, 50℃, 300rpm 조건으로 2시간 교반하여 원심분리 후 투명한 유층(역미셀 형성 발효 유화물)을 수득하였다. 또한, 상기 발효 유화물의 지방산 및 불순물을 규산마그네슘이 충진된 컬럼으로 정제 후, 잔존하는 작은 입자의 MgSO₄를 완전히 제거하기 위하여 0.45 ㎛ 필터로 여과시켜 역미셀을 형성하는 발효물(U-able HBG)을 수득하였다.

실시예 1 및 비교예 1: 항노화 조성물 제조

표 1과 같은 조성으로 조성물을 제조하였으며, 비교예 1은 활성물질을 단순 용해시킨 것이다. 구체적으로, 하기 표 1의 1 내지 8번 원료는 수용성 물질로서 9번 내지 11번 원료에 투명하게 용해시킨 후, 50℃까지 승온시킨 12번 원료에 투입하고, 1 내지 11번 원료를 12번 원료에 포집하였다. 포집은 아지 믹서(agi-mixer)를 이용하여 500 ~ 1000 rpm, 30분 ~ 1시간 동안 포집하는 방법으로 진행하였다. 이후, 25℃까지 냉각하여 각각의 조성물의 투명도와 장기적인 안정도를 관찰하였다. 단, 실시예 1에서 용매에 녹인 활성물질의 농도를 동일하게 제조하였다.

실시예 2: 에센스 제조

표 2의 조성에 따라 에센스를 제조하였다. 구체적으로, 표 2의 A상과 B상의 원료를 순차적으로 투입하고, 혼합 및 용해하였다. 이후 B상을 A상에 투입하여 70 ℃에서 호모믹서로 3000 rpm에서 10분간 혼합하였다. C상을 용해시킨 후 A 내지 B상이 혼합된 용기에 투입하고, 3000 rpm에서 3분간 혼합하였다. D상은 A 내지 C상이 혼합된 용기에 투입하여, 호모믹서로 3500 rpm으로 3분 간 혼합하였다. 그 후 탈포 및 30℃까지 냉각하였다.

실험예 1: 장기 보관 온도별 안정성 평가

보관 온도 조건에 따른 안정성을 평가하기 위하여, 안정한 조성물인 실시예 1에 따른 조성물에 대하여 상온, 25℃ 조건에서는 1개월동안, 저온(-5℃), 고온(50℃), 순환(-5 내지 40℃/12 hr) 조건에서는 3개월 동안 보관하여 성상을 관찰하였다. 평가 결과는 표 3 및 4에 나타내었다.

표 3 및 4의 결과로부터 실시예 1은 보관조건에 따른 투명도, 침전에 따른 안정도가 우수함을 확인하였고, 이로부터 실시예 1의 조성물이 안정적으로 활성물질을 포집할 수 있는 조건임을 알 수 있다.

실험예 2: 항산화력 시험(DPPH 라디칼 소거능 측정)

실시예 1의 상온에서 시간이 경과함에 따라 항산화력을 비교하기 위하여 DPPH assay를 수행하였다.

실시예 1과 비교예 1을 비교하였다. 각각의 시료는 한달간 상온에서 보관하였다.

DPPH(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl)는 0.2mM농도로 메탄올에 용해시켜 준비하여 사용하였다. 시료 500ul에 DPPH 시약 500ul를 첨가하여 15분간 반응 후, 517nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과는 표 5에 나타내었다.

표 5의 결과로부터 실시예 1은 비교예 1에 비해 라디칼 소거능이 월등하게 높은 것을 확인하였으며, 실시예 1은 포집한 조성물의 시간이 경과하여도 성분의 안정성이 높은 것을 확인되었다.

실험예 3: 사람 섬유아세포 세포 증식율

상온에서 한달 보관한 실시예 1 및 비교예 1의 인간섬유아세포 증식효과 및 독성을 검증하기 위하여 MTT 시험을 하였다.

인간섬유아세포인 Hs68세포를 24 well culture plate에 1x10⁵ cells/well 농도로 24시간 배양하였다. 상기 세포를 2시간 serum starvation 후, 각각의 샘플을 농도 별(0~1%)로 처리하여 24시간 배양하였다. 세포의 증식률을 측정하기 위하여 배양액을 모두 제거하고 MTT시약을 처리하여 2시간 동안 배양하였다. 형성된 포마잔(formazan)을 DMSO로 용해하여 microplate reader로 570nm에서 흡광도를 측정하였으며, 그 결과는 도 3에 나타내었다. 도 3에 나타난 바와 같이, 실시예 1은 0.05% 농도에서 최대 120%까지 세포증식을 촉진하였으며, 0.5% 농도까지 세포독성은 나타나지 않음을 확인할 수 있다. 단, 세포실험에 사용한 시료는 50% DMSO에 용해한 후 PBS로 희석하여 사용하였다.

실험예 4: 콜라겐 합성

상온에서 한달 보관한 실시예 1 및 비교예 1의 사람섬유아세포의 콜라겐 합성 효과를 비교하기 위하여, 각각의 시료의 농도가 0.05%, 0.01%가 되도록 사람 섬유아세포 배양 배지에 처리하고, 상기 배지를 1일 동안 배양한 후에, 배양액을 취하여 측정에 사용하였다.

PICP EIA kit(procollagen type I c-peptide enzyme immuno assay kit)를 사용하였으며, 합성된 콜라겐 양은 분광광도계를 이용하여 450nm에서 측정하였다. 콜라겐의 생합성 정도는 대조군(무혈청배지)에 대한 상대적인 합성 정도로 계산하였으며, 그 결과는 표 6에 나타내었다.

표 6에 나타난 바와 같이, 실시예 1은 30%의 콜라겐 합성 증가율을 나타내며, 이는 비교예 1에 비하여 20배 증가한 것임을 확인할 수 있다.

실험예 5: 실시예 2 및 비교예 2에 따른 조성물의 피부효능 비교

상기 실시예 2 및 비교예 2의 조성물의 피부효능 효과를 조사하기 위하여 인체피부에 대한 실험을 진행하였다.

구체적으로, 주름이 생기기 시작하거나 이미 생성된 피험자 또는 기미가 있는 피험자 10명씩 시험군과 비교군으로 나뉜 후, 시험군으로 실시예 2를, 비교군으로 비교예 2를 각각 1일 아침 저녁으로 2회 4주간 도포하였다. 피부상태의 측정은 안면분석기(야누스)를 이용하여 얼굴 전체를 일반광, 편광, 자외선광으로 정밀측정하였다. 일반광은 피부결 및 모공, 주름 등 굴곡을 분석하고, 편광은 색소침착 및 여드름 등의 염증성 발현을 분석하며, 자외선광은 피지 및 색소침착, 각질 등을 분석할 수 있다. 이를 종합적으로 평가하여 피부의 효과를 도출하였으며, 그 결과는 표 7 및 8에 나타내었다.

표 7 및 8에 나타난 바와 같이, 실시예 2와 비교예 2를 인체 안면피부에 적용하였을 때 효능학적으로 피부톤, 색소침착, 주름, 피부결에 대한 개선도를 비교하였다. 실시예 2는 효능물질 3종을 역미셀로 포집시킨 조성물을 제형에 투입한 것이며, 비교예 2는 역미셀을 포집하지않고, 용매에 용해시켜서 직접적으로 제형에 투입한 제형이다. 그 결과, 비교예 2보다 실시예 2의 제형이 피부노화 및 피부톤 개선에 우수한 효과를 나타냄을 확인할 수 있다. 이에 항산화 기능을 기반한 수용성의 효능물질을 동일한 농도로 소수성오일에 역미셀로 포집힌 것, 포집하지않은 것을 제형에 적용하였을 때에 피부효능 효과는 극명한 차이를 보였다. 따라서, 화장품 제형에 적용되는 수용성물질들은 피부에 침투되기 어렵기 때문에 역미셀로 포집하는 방법을 이용하여 피부지질층에 융합 및 흡수율이 높여 피부효과를 극대화시킬 수 있다.

상기와 같은 결과로부터 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명은 역미셀을 형성하는 발효유화제(U-ableㄾ HBG)를 이용하여 크로신(Crocin), 에르고티오네인(L-Ergothioneine), 글루타치온(Glutathione), 레티놀(Retinol), 풀러렌(Fullerene), 레스베라트롤(Resveratrol), 설포라판(Sulforaphane) 및 가자산(Chebulic acid)을 오일상으로 포집시킴으로써 항산화성분을 피부에 흡수 및 침투시키는 한계점을 역미셀을 형성시키는 유화제로 극복할 수 있다. 또한, 수용상에서의 불안정한 물질을 안정적으로 제조할 수 있기 때문에 피부학적 효능도 극대화할 수 있다.

따라서, 쉽게 산화되거나, 열에 의하여 변성되는 물질, 난용성 물질 등을 본 발명에 따라 포접시킴으로써 피부 침투성을 향상시킬 수 있으며, 화장품 제형에 안정적이고 용이하게 적용시킬 수 있다.

이상의 설명은 본 발명의 기술 사상을 예시적으로 설명한 것에 불과한 것으로서, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 다양한 수정 및 변형이 가능하다. 또한, 본 발명에 개시된 실시 예들은 본 발명의 기술 사상을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시 예에 의하여 본 발명의 기술 사상의 범위가 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 보호 범위는 아래의 청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술 사상은 본 발명의 권리범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

Candida bombicola UA-06(기탁번호: KCTC13855BP, 한국생명공학연구원) 미생물로부터 형성된 발효물; 및
크로신, 에르고티오네인, 글루타치온, 레티놀, 풀러렌, 레스베라트롤, 설포라판 및 가자산으로 이루어지는 활성물질을 포함하되,
상기 발효물이 역미셀 구조를 형성하고, 상기 활성물질이 상기 역미셀 구조 내에 포집된 형태이고,
상기 발효물이 Candida bombicola UA-06 미생물을 활성화시키는 종균배양 단계; 및 상기 종균배양한 미생물 및 식물성 오일을 발효시키는 발효 단계를 포함하는 방법으로 제조된 것이고,
상기 종균배양 단계에서 사용하는 배지가 이스트 추출물(yeast extract), 글리세린(glycerin), K₂HPO₄, KH₂PO₄, NH₄NO₃ 및 MgSO₄를 포함하고,
상기 발효 단계에서 사용하는 배지가 이스트 추출물(yeast extract), 글리세린(glycerin), K₂HPO₄, KH₂PO₄, NH₄NO₃, MgSO₄, 글루쿠로노락톤(glucuronolactone) 및 식물성 오일을 포함하는 것인, 항산화 화장료 조성물.
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제1항에 있어서,
상기 종균배양 단계에서 사용하는 배지가 이스트 추출물(yeast extract) 1g/L, 글리세린(glycerin) 20g/L, K₂HPO₄ 25g/L, KH₂PO₄ 7g/L, NH₄NO₃ 3g/L 및 MgSO₄ 2g/L를 포함하고,
상기 발효 단계에서 사용하는 배지가 이스트 추출물(yeast extract) 1g/L, 글리세린(glycerin) 20g/L, K₂HPO₄ 25g/L, KH₂PO₄ 7g/L, NH₄NO₃ 3g/L, MgSO₄ 2g/L, 글루쿠로노락톤(glucuronolactone) 100g/L 및 식물성 오일 500g/L을 포함하는 것인, 항산화 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 종균배양 단계가 20℃, 300rpm, 1vvm, 호기 조건으로 진행되고,
상기 발효 단계가 25℃의 온도 및 100rpm의 혼합 조건으로 진행되는 것인, 항산화 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 종균배양 단계는 배양 시작 60시간 시점에서 종료되는 것인, 항산화 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 식물성 오일이 해바라기씨유인 것인, 항산화 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 발효 단계 후 정제공정 단계를 더 포함할 수 있고,
상기 정제 단계가 발효물을 정치시켜 상층과 하층을 분리하여 하층을 폐기하고, MgSO₄를 첨가하여 교반 후 원심분리하여 미생물 및 수분을 제거하는 단계 및,
친화크로마토그라피 컬럼에 규산마그네슘을 충진제로 사용하여 지방산 및 불순물이 제거된 오일을 회수하는 단계를 포함하는 것인, 항산화 화장료 조성물.