KR102675400B1 - 단백질 정제 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 단량체 형태의 인간 VH3 도메인 함유 항체를 회수하는 방법을 제공한다. 특히 본 발명은 항체의 단량체 및 다량체 형태를 함유하는 혼합물로부터 단량체 인간 VH3 도메인 함유 항체의 회수를 허용하는 신규의 방법을 제공한다.

Description

단백질 정제 방법
본 발명은 단백질 정제 분야, 보다 구체적으로는 항체 정제 분야에 관한 것이다.
치료 분야에서 단백질 및 항체 및 항체 유래 분자의 사용은 특히 끊임없이 존재감과 중요성을 얻고 있으며, 결과적으로, 제어된 제조 공정의 필요성이 동시에 드러나고 있다. 치료용 단백질의 상업화는, 이들이 대량 생산될 것이 요구된다. 이를 위해 단백질은 종종 숙주 세포에서 발현되며, 그 후 투여가능한 형태로 조제되기 이전에 회수 및 정제되어야 한다.
가장 일반적인 부류의 항체 분자는 면역글로불린 G(IgG)이며, 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄로 이루어진 헤테로사량체이다. IgG 분자는 하기 2개의 기능적 서브유닛으로 세분될 수 있다: (1) 항체의 꼬리를 구성하고 세포 표면 수용체와 상호작용하여 면역 반응을 활성화시키는 결정화가능한 단편(Fc), 및 (2) 항원 인식을 매개하는 항원 결합 단편(Fab). Fc 영역은 2개의 쌍으로 된 중쇄로부터 2쌍의 불변 도메인(CH2 및 CH3)을 포함하는 반면에, Fab 영역은 중쇄로부터 가변 도메인에 이어 불변 도메인(각각, VH 및 CH1)으로 구성되며, 이들은 경쇄로부터의 가변 및 불변 도메인(각각, VL 및 CL)과 쌍을 이룬다. Fc 및 Fab 영역은, 상기 2개 쇄를 함께 유지하는 디설파이드 결합을 함유하는 힌지 영역에 의해 경계지어진다. IgG 부류의 전장 항체는 전통적으로 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)에서 유래한 단백질 A를 이용한 친화성 크로마토그래피의 포획 단계를 포함하는 방법을 사용하여 정제되어왔다. 단백질 A와 항체의 Fc-영역 간의 결합의 높은 특이성으로 인해 이러한 방식의 크로마토그래피는 복합 용액 예컨대 세포 배양 수거 배지로부터 직접 출발하는 단일 단계에서 98% 초과의 불순물을 제거할 수 있게 해준다. 이러한 공정 단계에서 얻어진 큰 정제 인자는 전체 하류 정제 공정을 단순화시키는데 도움이 된다. 일반적으로, 미량의 오염물질(고분자량 응집체, 잔류 숙주 세포 단백질, 침출 단백질 A)만이 이러한 정제 단계 후에 제거된 상태이며 이는 일반적으로 1회 내지 2회의 후속 크로마토그래피 단계에서 달성될 수 있다.
부가적으로 결합 단백질 A에 대한 "대체 결합" 부위가, 가변 중쇄 도메인 VH3으로도 지칭되는 인간 중쇄 가변 영역의 특정 프레임워크 서브그룹 3을 함유하는 항체에 기재되어있고(Sasso et al. J. Immunol 1991, 147:1877-1883, Human IgA and IgG F(ab')2 that bind to staphylococcal protein A belong to the VHIII subgroup), 종종 2차 상호작용으로 분류되었다. 단백질 A의 5개 도메인(A, B, C, D, E) 모두가 Fc-영역을 통해 IgG에 결합하지만, 오직 도메인 D 및 E는 상당한 VH3 결합을 나타낸다. 단백질 A 친화성 크로마토그래피를 이용한 IgG 정제의 관점에서, 이는 IgG의 Fc 도메인과 단백질 A 간의 상호작용에 기초하며, 단백질 A와의 이들 VH3 도메인 상호작용은 정제될 항체의 용출 프로파일에 영향을 주므로 바람직하지 않은 것으로 여겨져 왔으며, SuRe®(GE Healthcare)와 같은 단백질 A의 도메인 B만을 함유하는 대안적인 수지가 개발되어 상업적으로 입수가능하다.
그러나, 현재 이용 가능하고/거나 개발중인 다수의 항체 및 항체 유래 분자는 Fc 영역을 함유하지 않으며 그들의 정제 방법의 추가 맞춤을 필요로 한다. VH3 영역에 의한 단백질 A의 전술한 결합은 그러한 항체의 제조에서 단백질 A의 사용을 가능하게 할 수 있다.
항체 정제의 특정의 요건은 단량체 형태의, 또는 이량체 및 삼량체와 같은 보다 고분자량의 종을 본질적으로 함유하지 않은 원하는 항체 또는 항체 유래 분자의 회수이다.
특정 항체 분자는 인접 분자에서 가변 도메인과의 가변 도메인 무차별 짝짓기 결과로 인해 다량체를 형성하는 경향이 보다 높다. 이것은 관심있는 다른 도메인들 사이에 링커 영역을 사용하는 보다 복잡한 항체 유래 분자의 경우에 특히 그러하다.
따라서 당해 분야에서는, 특히 이들 분자가 Fc 영역을 함유하지 않는 경우, 단량체 형태의 항체 및 항체 유래 분자를 제조 및 정제하는 추가의 방법에 대한 필요성이 존재한다.
도 1은 pH 구배 용출을 통한 단백질 A 수지로부터 A26Fab-645dsFv의 용출 프로파일을 도시한 크로마토그램이다.
도 2는 SEC-HPLC에 의해 분석된, 도 1에 도시된 크로마토그래피로부터 얻어진 각각의 분획에 존재하는 총 단백질, 단량체 및 다량체 A26Fab-645dsFv의 양을 도시한다.
도 3은 pH 구배 용출을 통한 단백질 A 수지로부터 Fc 구축물의 용출 프로파일을 도시한 크로마토그램이다.
도 4는 SEC-HPLC에 의해 분석된, 도 3에 도시된 크로마토그래피로부터 얻어진 각각의 분획에 존재하는 총 단백질, 단량체 및 다량체의 양을 도시한다.
도 5는 pH 단계 용출을 통한 단백질 A 수지로부터 A26Fab-645dsFv의 용출 프로파일을 도시한 크로마토그램이다.
도 6은 도 5에 도시된 단백질 A 크로마토그래피로부터 얻어진 분획의 SEC-HPLC 분석을 도시한다. 점선은 pH 3.8에서 용출된 분획의 분석을 나타내는 반면, 중단되지 않은 선은 pH 3.0에서 용출된 분획의 분석을 나타낸다.
도 7은 도 5에 도시된 pH 단계 용출을 통한 A26Fab-645dsFv의 단백질 A 크로마토그래피로부터 회수된 분획의 비-환원 SDS-PAGE 분석을 도시한다. 레인 1은 분자량 마커를 나타내고, 레인 2는 단백질 A 크로마토그래피에 로딩된 정화된 세포 배양 상청액의 샘플을 나타내고, 레인 3은 단백질 A 크로마토그래피로부터 회수된 통과액(flow-through) 분획을 나타내고, 레인 4는 pH 3.8에서 용출 후 회수된 분획을 나타내고, 레인 5는 pH 3.0에서 용출 후 회수된 분획을 나타낸다.
도 8은 도 5에 도시된 pH 단계 용출을 통한 A26Fab-645dsFv의 단백질 A 크로마토그래피로부터 회수된 분획의 환원 SDS-PAGE 분석을 도시한다. 레인 1은 분자량 마커를 나타내고, 레인 2는 단백질 A 크로마토그래피에 로딩된 정화된 세포 배양 상청액의 샘플을 나타내고, 레인 3은 단백질 A 크로마토그래피로부터 회수된 통과액 분획을 나타내고, 레인 4는 pH 3.8에서 용출 후 회수된 분획을 나타내고, 레인 5는 pH 3.0에서 용출 후 회수된 분획을 나타낸다.
도 9는 실시예 4에 기재된 바와 같이 구배 용출을 통한 A26Fab-645dsFv의 단백질 A 크로마토그래피로부터 회수된 분획의 SEC-UPLC 분석을 도시하며, 총 단백질, 단량체 및 다량체 A26Fab-645dsFv의 양을 나타낸다.
도 10은 실시예 5에 기재된 바와 같이 구배 용출을 통한 A26Fab-645dsFv의 단백질 A 크로마토그래피로부터 회수된 분획의 SEC-UPLC 분석을 도시하며, 총 단백질, 단량체 및 다량체 A26Fab-645dsFv의 양을 나타낸다.
도 11은 실시예 6에 기재된 바와 같이 구배 용출을 통한 A26Fab-645dsFv의 단백질 A 크로마토그래피로부터 회수된 분획의 SEC-UPLC 분석을 도시하며, 총 단백질, 단량체 및 다량체 A26Fab-645dsFv의 양을 나타낸다.
도 12는 단량체 Fab-dsFv 및 Fab-dsFv의 다량체 버젼, 및 또한 이의 기본 성분들: Fab 및 dsFv의 개략도를 도시한다. 이 모식도는 가능한 단량체, 이량체 및 삼량체를 설명한다. 그러나, 모든 링커는 이량체, 및 삼량체가 시클릭 구조를 형성하는 실제로 동일한 길이이다.
도 13 내지 20은 다양한 항체 분자 서열 및 이의 성분을 도시한다.
도 21은 pH 구배 용출을 통한 단백질 A 수지로부터 TrYbe의 용출 프로파일을 도시한 크로마토그램이다.
도 22는 도 21에 도시된 단백질 A 크로마토그래피에서 얻어진 분획의 SEC-HPLC 분석을 도시한다.
도 23은 도 21에 도시된 pH 구배 용출을 통한 TrYbe의 단백질 A 크로마토그래피로부터 회수된 분획의 비-환원 (A) 및 환원 (B) SDS PAGE 분석을 도시한다.
도 24는 SEC-HPLC에 의해 분석된, 도 21에 도시된 크로마토그래피에서 얻어진 각각의 분획에 존재하는 총 단백질, 단량체 및 다량체 TrYbe의 양을 도시한다.
도 25는 pH 구배 용출을 통한 단백질 A 수지로부터 BYbe의 용출 프로파일을 도시한 크로마토그램이다.
도 26은 도 25에 도시된 단백질 A 크로마토그래피에서 얻어진 분획의 SEC-HPLC 분석을 도시한다.
도 27은 도 25에 도시된 pH 구배 용출을 통한 BYbe의 단백질 A 크로마토그래피로부터 회수된 분획의 비-환원 (A) 및 환원 (B) SDS PAGE 분석을 도시한다.
도 28은 SEC-HPLC에 의해 분석된, 도 25에 도시된 크로마토그래피에서 얻어진 각각의 분획에 존재하는 총 단백질, 단량체 및 다량체 BYbe의 양을 도시한다.
도 29는 본 발명의 방법에 따른 정제가 가능한 대안적인 단량체 Fab-scFv 포맷의 개략도를 도시한다.
도 30은 본 발명의 방법에 따른 정제가 가능한 대안적인 단량체 Fab-2x dsscFv(TrYbe®) 및 Fab-dsscFv-dsFv 포맷의 개략도를 도시한다.
본 발명은 단량체 형태의 인간 VH3 도메인 함유 항체를 회수하는 신규의 방법을 제공함으로써 상술한 니즈를 해결한다. 인간 VH3 도메인과 단백질 A의 결합 사이에 아비디티(avidity) 효과가 관찰되었다. 이러한 발견은 Fc 영역과 단백질 A 사이의 상호작용에 대해 기술된 적이 없기 때문에 놀랍고, 항체의 단량체 및 다량체 형태를 함유하는 혼합물로부터 단량체 인간 VH3 도메인 함유 항체의 회수를 허용하는 신규의 방법의 개발을 유도했다.
제1 실시양태에서, 본 발명은 단량체 형태의 인간 VH3 도메인 함유 항체를 수득하는 방법으로서,
a) 단량체 및 다량체 형태의 인간 VH3 도메인 함유 항체를 포함하는 혼합물을, 상기 항체의 단백질 A에의 결합을 허용하는 조건하에, 단백질 A가 도메인 D 및/또는 E를 포함하는 단백질 A 크로마토그래피 재료에 적용하는 단계, 및
b) 단량체 형태의 인간 VH3 도메인 함유 항체를 회수하는 단계
를 포함하고, 인간 VH3 도메인 함유 항체가 Fc 영역을 함유하지 않는, 단량체 형태의 인간 VH3 도메인 함유 항체를 수득하는 방법을 제공한다.
제2의 대안적인 실시양태에서, 본 발명은 인간 VH3 도메인 함유 항체를 제조하는 방법으로서,
a) 상기 항체를 숙주 세포에서 발현시키는 단계,
b) 상기 항체, 숙주 세포 및 다른 오염 물질을 함유하는 혼합물을 회수하는 단계,
c) 단백질 A가 도메인 D 및/또는 E를 포함하는 적어도 단백질 A 크로마토그래피 단계를 이용하여 상기 항체를 정제하는 단계, 및
d) 인간 VH3 도메인 함유 항체를 회수하는 단계
를 포함하고, 인간 VH3 도메인 함유 항체가 Fc 영역을 함유하지 않는, 인간 VH3 도메인 함유 항체를 제조하는 방법을 제공한다.
제3의 대안적인 실시양태에서, 본 발명은 단량체 형태의 인간 VH3 도메인 함유 항체를 다량체 형태의 항체로부터 분리하는 방법으로서,
a) 단량체 및 다량체 형태의 인간 VH3 도메인 함유 항체를 포함하는 혼합물을, 단백질 A가 도메인 D 및/또는 E를 포함하는 단백질 A 크로마토그래피 재료에 적용하는 단계,
b) 상기 항체의 단백질 A에의 결합을 허용하는 단계,
c) 단량체 형태의 항체의 결합을 선택적으로 방해하는 용출 완충제를 적용하는 단계,
d) 얻어진 용출액을 회수하는 단계, 및 경우에 따라
e) 다량체 형태의 항체의 결합을 방해하는 제2 용출 완충제를 적용하고 이러한 제2 용출액를 회수하는 단계
를 포함하고, 인간 VH3 도메인 함유 항체가 Fc 영역을 함유하지 않는, 단량체 형태의 인간 VH3 도메인 함유 항체를 다량체 형태의 항체로부터 분리하는 방법을 제공한다.
제4의 대안적인 실시양태에서, 본 발명은 단량체 형태의 인간 VH3 도메인 함유 항체를 다량체 형태의 항체로부터 분리하는 방법으로서,
a) 단량체 및 다량체 형태의 인간 VH3 도메인 함유 항체를 포함하는 혼합물을, 단백질 A가 도메인 D 및/또는 E를 포함하는 단백질 A 크로마토그래피 재료에 적용하는 단계,
b) 다량체 형태의 항체의 결합을 허용하는 단계,
c) 통과액에서 단량체 형태의 항체를 회수하는 단계, 및 경우에 따라
d) 다량체 형태의 항체의 결합을 선택적으로 방해하는 용출 완충제를 적용하는 단계, 및
e) d)에서 생긴 용출액을 회수하는 단계
를 포함하고, 인간 VH3 도메인 함유 항체가 Fc 영역을 함유하지 않는, 단량체 형태의 인간 VH3 도메인 함유 항체를 다량체 형태의 항체로부터 분리하는 방법을 제공한다.
추가 실시양태에서 본 발명의 방법은 나머지 불순물을 제거하기 위해 또 다른 하나 이상의 크로마토그래피 단계를 부가적으로 포함할 것이다. 일반적으로 이러한 단계는 겔 여과 크로마토그래피, 양이온 크로마토그래피, 음이온 크로마토그래피, 혼합 모드 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피 및 소수성 전하 유도 크로마토그래피에서 사용하기 위한 적절한 작용성을 갖는 고체 상(phase)을 이용하는 비-친화성 크로마토그래피 단계를 채택할 것이다. 이들은 결합 및 용출 모드로 또는 플로우 스루 모드로 작동될 수 있다. 플로우 스루 모드에서, 불순물은 고체 상에 결합하거나 감소된 이동성을 나타내는 반면에, 타겟 단백질은 용출액 또는 통과액 분획에서 회수된다. 크로마토그래피에 사용하기 적절한 고체 상 예컨대 적절한 작용성을 갖는 멤브레인 또는 비드 처리된 수지가 당업자에게 용이하게 입수가능하다. 본 발명의 방법에 따른 특정 실시양태에서, 본 방법은 플로우 스루 모드로 작동되는 음이온 교환 크로마토그래피 단계를 부가적으로 포함한다.
추가의 특정 실시양태에서 본 발명의 방법은 단백질 A 크로마토그래피 단계 이후에 단백질을 함유하는 통과액을 생성하는 음이온 교환 크로마토그래피인 제1 크로마토그래피 단계 및 단백질을 함유하는 용출액을 회수하는 양이온 교환 크로마토그래피인 제2 크로마토그래피 단계를 포함한다.
대안적으로, 본 발명의 방법은 단백질 A 크로마토그래피 이후에 단백질 함유 용출액을 회수하는 양이온 교환 크로마토그래피인 제1 크로마토그래피 단계, 및 단백질 함유 통과액을 생성하는 음이온 교환 크로마토그래피인 제2 크로마토그래피 단계를 포함한다.
전형적으로, 단백질 A 크로마토그래피는 결합 및 용출 모드로 수행되며, 여기서 관심 단백질의 고체 상으로의 결합은, 관심 단백질이 고체 상에 결합된 채로 있으면서 불순물 예컨대 오염 단백질이 크로마토그래피 매체를 통과해 흐르도록 허용한다. 결합된 관심 단백질은 이후에 용출 완충제에 의해 고체 상으로부터 회수되며 이 용출 완충제는 관심 단백질이 상기 고체 상에 결합되는 메카니즘을 방해한다.
추가 실시양태에서 본 발명의 방법은, 결합되지 않은 물질이 제1 용액에서 제거되도록, 단량체 및 다량체 형태의 인간 VH3 도메인 함유 항체를 포함한 혼합물을 적용한 후 제1 용액을 단백질 A 크로마토그래피 재료에 첨가하는 것을 포함한다.
본 발명에 따른 방법의 추가 실시양태에서 용출 완충제는, 결합된 항체가 유리(방출)되도록 단백질 A 크로마토그래피 재료에 적용된다.
본 발명에 따른 방법의 추가 실시양태에서 단백질 A 크로마토그래피로부터 회수된 용출액은 적용된 혼합물과 관련하여 다량체 항체보다 단량체 항체가 풍부하다.
당업자가 이해할 수 있는 바와 같이, 본 문맥에서 단백질 A 크로마토그래피로부터 회수된 용출액은 단백질 A 크로마토그래피 단계 이전의 혼합물과 관련하여 보다 높은 비율의 단량체 형태의 항체를 함유하는 단백질 함량을 갖는다.
특정 실시양태에서, 단백질 A 크로마토그래피로부터 회수된 용출액은 단량체 형태의 인간 VH3 도메인 함유 항체를 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 또는 적어도 90% 포함한다.
추가의 대안적인 실시양태에서, 다량체 형태의 항체가 회수되는 경우에, 단백질 A 크로마토그래피로부터의 용출액은 단백질 A 크로마토그래피 단계 이전의 혼합물과 관련하여 보다 높은 비율의 다량체 형태의 항체를 함유하는 단백질 함량을 갖는다. 특정 실시양태에서 단백질 A 크로마토그래피로부터 회수된 용출액은 다량체 형태의 인간 VH3 도메인 함유 항체를 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 또는 적어도 90% 포함한다.
본 발명에 따른 방법의 추가 실시양태에서, 상기 단백질 A는 천연 재조합 단백질 A이다.
예를 들어 MabSelect®(GE Healthcare), Absolute®(Novasep), Captiv A®(Repligen), 또는 Amsphere®(JSR)와 같은, 상기 천연 재조합 단백질 A를 함유하는 당업자에게 입수가능한 다수의 크로마토그래피 재료가 존재한다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 결합된 항체는 항체 결합을 방해하는데 적합한 pH를 갖는 용출 완충제를 적용함으로써 단백질 A 크로마토그래피 재료로부터 유리된다. 상기 pH는 특정 분자에 좌우되고 일반적으로 당업자에 의해 경험적으로 결정되고 원하는 종점을 달성하도록 조절되며, 즉 적용된 혼합물로부터 가능한 다량의 단량체를 회수하는 것이 바람직할 수 있거나, 또는 가능한 가장 높은 순도로 단량체를 얻는 것이 바람직할 수 있다. 본 발명의 방법의 특정 실시양태에서 용출 완충제는 pH 3.0 내지 pH 4.5, 바람직하게는, pH 3.2 내지 pH 4.3, pH 3.5 내지 pH 4, 바람직하게는 pH 3.6 내지 pH 3.9 또는 pH 3.8을 갖는다.
단백질 A 크로마토그래피에서 세척 및 용출 완충제로서 사용하기에 적합한 완충제는 당업계에 용이하게 입수가능하며, 비제한적인 예로서 인산 완충 생리식염수(PBS), 트리스, 히스티딘, 아세테이트, 시트레이트 완충제, 또는 MES(2-(N-모르폴리노)에탄설폰산 이미다졸), BES (N,N-(비스-2-히드록시에틸)-2-아미노에탄설폰산), MOPS (3-(N-모르폴리노)-프로판설폰산), 또는 HEPES(N-2-히드록시에틸피페라진-N'-2-에탄설폰산) 완충제로부터 선택될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 방법은 단량체 및 다량체 형태의 인간 VH3 도메인 함유 항체를 포함하는 혼합물을, 상기 항체의 단백질 A에의 결합을 허용하는 조건하에, 단백질 A가 도메인 D 및/또는 E를 포함하는 단백질 A 크로마토그래피 재료에 적용하는 단계, 제1 용액 또는 세척 완충제를 적용하여 결합되지 않은 물질을 상기 용액에서 제거하는 단계, 용출 완충제를 단백질 A 크로마토그래피 재료에 적용하여 결합된 항체를 유리시키는 단계, 및 단량체 형태의 인간 VH3 도메인 함유 항체를 회수하는 단계를 포함하고, 여기서 회수된 용액은 적용된 혼합물과 관련하여 단량체 형태의 VH3 도메인 함유 항체가 풍부하고 인간 VH3 도메인 함유 항체는 Fc 영역을 함유하지 않는다.
추가의 특정 실시양태에서, 본 발명의 방법은 단량체 및 다량체 형태의 인간 VH3 도메인 함유 항체를 포함하는 혼합물을, 상기 항체의 단백질 A에의 결합을 허용하는 조건하에, 단백질 A가 도메인 D 및/또는 E를 포함하는 단백질 A 크로마토그래피 재료에 적용하는 단계, 제1 용액 또는 세척 완충제를 적용하여 결합되지 않은 물질을 상기 용액에서 제거하는 단계, 용출 완충제를 단백질 A 크로마토그래피 재료에 적용하여 단량체 형태의 결합된 항체를 유리시키는 단계, 및 단량체 형태의 인간 VH3 도메인 함유 항체를 회수하는 단계를 포함하고, 여기서 회수된 용액은 적용된 혼합물과 관련하여 단량체 형태의 VH3 도메인 함유 항체가 풍부하고 인간 VH3 도메인 함유 항체는 Fc 영역을 함유하지 않는다.
본 발명에 따른 추가 실시양태에서, VH3 도메인 함유 항체는 Fab', F(ab')2, scFv, Fab-Fv, Fab-scFv, Fab-(scFv)2, Fab-(Fv)2, 디아바디, 트리아바디, 및 테트라바디에서 선택된다.
본 발명에 따른 방법의 추가 실시양태에서, VH3 도메인 함유 항체는 적어도 2개의 인간 VH3 도메인을 포함한다.
본 발명에 따른 방법의 추가 실시양태에서 인간 VH3 도메인 함유 항체는 OX40과 특이적으로 결합한다.
본 발명의 방법의 일 실시양태에서 항체는 PCT/EP2014/074409(본원에서 인용에 의해 포함됨)에 개시된 바와 같은 FabFv 또는 이의 디설파이드 안정화된 형태이다.
일 실시양태에서 항체는 WO 2013/068563(본원에서 인용에 의해 포함됨)에 개시된 바와 같은, 특히 CDR 또는 가변 영역을 갖는, 인간 혈청 알부민에 특이적인 결합 도메인을 포함한다.
본 발명의 방법의 추가 실시양태에서, 상기 인간 VH3 도메인 함유 항체는 하기를 포함한다:
- 각각 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3에 정의된 바와 같은 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3; 및
- 각각 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6에 정의된 바와 같은 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3.
본 발명에 따른 방법의 추가의 특정 실시양태에서 항체는, WO 2013/068563(본원에서 인용에 의해 포함됨)에서 정의된 바와 같이, OX40에 특이적으로 결합하는 Fab 부분 및 혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 Fv 부분을 포함하는 A26Fab-645dsFv이며, 두 부분 모두 디설파이드 결합을 통해 안정화된다.
추가의 특정 실시양태에서, 본 발명의 방법은 단량체 및 다량체 형태의 A26Fab-645dsFv를 포함하는 혼합물을, 상기 항체의 단백질 A에의 결합을 허용하는 조건하에, 단백질 A가 도메인 D 및/또는 E를 포함하는 단백질 A 크로마토그래피 재료에 적용하는 단계, 제1 용액 또는 세척 완충제를 적용하여 결합되지 않은 물질을 상기 용액에서 제거하는 단계, 용출 완충제를 단백질 A 크로마토그래피 재료에 적용하여 단량체 형태의 결합된 항체를 유리시키는 단계, 및 단량체 형태의 A26Fab-645dsFv를 회수하는 단계를 포함하고, 여기서, 회수된 용액은 적용된 혼합물과 관련하여 단량체 형태의 A26Fab-645dsFv가 풍부하고 용출 완충제는 pH 3.5 내지 pH 4.2, 바람직하게는, pH 3.6 내지 pH 4.1, pH 3.7 내지 pH 4.0, 바람직하게는 pH 3.8 내지 pH 3.9 또는 pH 3.8을 갖는다.
추가의 특정 실시양태에서, 본 발명의 방법은 제2 용출 완충제를 단백질 A 크로마토그래피 재료에 적용하여 다량체 형태의 결합된 A26Fab-645dsFv를 회수하는 단계를 부가적으로 포함하며, 여기서, 상기 제2 용출 완충제는 3.5 미만의 pH, 바람직하게는 pH 3.4 미만, 바람직하게는 pH 2.8 내지 pH 3.2, 바람직하게는 pH 2.9 내지 pH 3.1, 바람직하게는 pH 3.0을 갖는다.
따라서, 본 개시내용은
N-말단부터 순서대로, 제1 중쇄 가변 도메인(VH#1), CH1 도메인 및 제2 중쇄 가변 도메인(VH#2)을 포함하는 중쇄,
N-말단부터 순서대로, 제1 경쇄 가변 도메인(VL#1), CL 도메인 및 제2 경쇄 가변 도메인(VL#2)을 포함하는 경쇄
를 포함하는 인간 OX40 및 인간 혈청 알부민에 결합하는 이중특이성 항체 융합 단백질을 제공하며,
여기서, 상기 중쇄 및 경쇄는 VH#1 및 VL#1이 제1 항원 결합 부위를 형성하고 VH#2 및 VL#2가 제2 항원 결합 부위를 형성하도록 정렬되고,
제1 항원 결합 부위에 의해 결합되는 항원은 인간 OX40이고 제2 항원 결합 부위에 의해 결합되는 항원은 인간 혈청 알부민이며, 특히
중쇄의 제1 가변 도메인(VH#1)은 CDR-H1에 대해 서열번호 1에서 제공된 서열, CDR-H2에 대해 서열번호 2에서 제공된 서열 및 CDR-H3에 대해 서열번호 3에서 제공된 서열을 포함하고 경쇄의 제1 가변 도메인(VL#1)은 CDR-L1에 대해 서열번호 4에서 제공된 서열, CDR-L2에 대해 서열번호 5에서 제공된 서열 및 CDR-L3에 대해 서열번호 6에서 제공된 서열을 포함하며,
제2 중쇄 가변 도메인(VH#2)은 서열번호 11에 제공된 서열을 가지고 제2 경쇄 가변 도메인(VL#2)은 서열번호 12에 제공된 서열을 가지며 제2 중쇄 가변 도메인(VH#2) 및 제2 경쇄 가변 도메인(VL#2)은 디설파이드 결합에 의해 연결된다.
일 실시양태에서 CH1 도메인과 제2 중쇄 가변 도메인(VH#2) 사이에 펩티드 링커가 존재한다. 일 실시양태에서 CL 도메인과 제2 경쇄 가변 도메인(VL#1) 사이에 펩티드 링커가 존재한다. 일 실시양태에서 제1 중쇄 가변 도메인(VH#1)은 서열번호 8에 제공된 서열을 포함한다. 일 실시양태에서 제1 경쇄 가변 도메인(VL#1)은 서열번호 7에 제공된 서열을 포함한다. 일 실시양태에서 중쇄는 서열번호 15에 제공된 서열을 포함하거나 이러한 서열로 이루어진다. 일 실시양태에서 경쇄는 서열번호 16에 제공된 서열을 포함하거나 이러한 서열로 이루어진다.
따라서 일 실시양태에서는 서열번호 15에 제공된 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 16에 제공된 서열을 포함하는 경쇄를 갖는, 인간 OX40 및 인간 혈청 알부민에 결합하는 이중특이성 항체 융합 단백질이 제공된다.
일 실시양태에서 항체 분자, 예컨대 Fab-dsFv 포맷은 PCT/EP2014/074409 또는 WO2014/019727(본원에서 인용에 의해 포함됨)에 개시된 것이 있다.
또 다른 실시양태에서 항체 분자는 WO 2013/068571(본원에서 인용에 의해 포함됨)에 개시된 Fab-scFv 융합 단백질 포맷이다.
또 다른 실시양태에서 항체 분자는 하기 a) 및 b)를 포함하거나 이들로 이루어진 다중특이성 항체 분자이다:
a) 식 (I)의 폴리펩티드 쇄:
VH -CH1-X-V1; 및
b) 식 (II)의 폴리펩티드 쇄:
VL -CL-Y-V2;
식 중:
VH는 중쇄 가변 도메인을 나타내고;
CH1은 중쇄 불변 영역의 도메인, 예를 들어 이의 도메인 1을 나타내고;
X는 결합 또는 링커를 나타내고;
Y는 결합 또는 링커를 나타내고;
V1은 dsFv, sdAb, scFv 또는 dsscFv를 나타내고;
VL은 경쇄 가변 도메인을 나타내고;
CL은 경쇄 불변 영역, 예컨대 C카파의 도메인을 나타내고;
V2는 dsFv, sdAb, scFv 또는 dsscFv를 나타내고;
여기서, V1 또는 V2 중 적어도 하나는 WO 2015/197772(본원에서 인용에 의해 포함됨)에 기재된 dsFv 또는 dsscFv이다.
일 특정 실시양태에서, 항체 분자는 WO 2015/197772(본원에서 인용에 의해 포함됨)에 기재된 포맷 Fab-2x dsscFv의 다중특이성 항체 분자이다.
추가의 특정 실시양태에서, 포맷 Fab-2x dsscFv의 다중특이성 항체 분자는 3가 항체이며, 즉, 각 Fv가 상이한 에피토프에 결합한다.
추가의 특정 실시양태에서 다중특이성 항체 분자는 WO2015/197772(본원에서 인용에 의해 포함됨)에 기재된 바와 같은 Fab-dsscFv-dsFv 포맷을 갖는다.
본 발명의 방법에 따라 제조될 수 있는 항체는 재조합 항체를 코딩하는 하나 이상의 발현 벡터로 형질감염된 진핵 숙주 세포를 배양함으로써 생산될 수 있다. 진핵 숙주 세포는 바람직하게는 포유류 세포, 더 바람직하게는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포이다.
포유류 세포는 항체의 증식 및 발현을 지지하는 임의의 배지에서 배양될 수 있고, 바람직하게는 상기 배지는 동물 유래 산물 예컨대 동물 혈청 및 펩톤이 없는 화학적으로 한정된 배지이다. 세포 증식 및 단백질 생성을 가능하게 하기 위해 적절한 농도로 존재하는 비타민, 아미노산, 호르몬, 증식 인자, 이온, 완충제, 뉴클레오시드, 글루코스 또는 동등한 에너지원의 다양한 조합을 포함하는, 당업자에게 입수가능한 다양한 세포 배양 배지가 존재한다. 추가의 세포 배양 배지 성분이 당업자에게 공지된 세포 배양 사이클 동안 상이한 시점에 적절한 농도로 세포 배양 배지에 포함될 수 있다.
포유류 세포 배양은, 원하는 생산 규모에 따라 페드-배치(fed-batch) 모드로 작동되거나 작동되지 않을 수 있는 임의의 적합한 용기 예컨대 진탕 플라스크 또는 바이오리액터에서 실시될 수 있다. 이들 바이오리액터는 교반식 탱크 또는 에어-리프트 반응기일 수 있다. 1,000 L 초과 내지 50,000 L, 바람직하게는 5,000 L 내지 20,000 L, 또는 내지 10,000 L의 용량을 갖는 다양한 대규모 바이오리액터가 입수가능하다. 대안적으로, 보다 소규모의 예컨대 2 L 내지 100 L의 바이오리액터가 또한 본 발명의 방법에 따른 항체의 제조에 사용될 수 있다.
본 발명의 방법에 따라 제조될 수 있는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 전형적으로 포유류 숙주 세포 배양물, 전형적으로 CHO 세포 배양물의 상청액에서 확인된다. 관심 단백질 예컨대 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 상청액에 분비되는 CHO 배양 공정의 경우, 상기 상청액은 당업계에 공지된 방법에 의해, 전형적으로 원심분리에 의해 수집된다.
따라서 본 발명의 특정 실시양태에서, 본 방법은 단백질 정제 이전에 원심분리 및 상청액 회수 단계를 포함한다. 추가의 특정 실시양태에서 상기 원심분리는 연속 원심분리이다. 의심의 여지를 피하기 위해, 상청액은 세포 배양물의 원심분리로 인해 침강된 세포 위에 놓인 액체를 의미한다.
대안적으로 상기 상청액은 예를 들어 심층 여과와 같은 당업자에게 공지된 정화 기술을 이용하여 회수될 수 있다. 따라서 본 발명의 특정 실시양태에서, 본 방법은 단백질 정제 이전에 심층 여과 및 상청액 회수 단계를 포함한다.
대안적으로, 숙주 세포는 원핵 세포, 바람직하게는 그람-음성 박테리아이다. 더 바람직하게는, 숙주 세포는 이. 콜라이(E. coli) 세포이다. 단백질 발현을 위한 원핵 숙주 세포는 당업계에 익히 알려져 있다 (Terpe, K. (2006). Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl Microbiol Biotechnol 72, 211-222.). 숙주 세포는 관심 단백질 예컨대 항체 단편을 생산하도록 유전적으로 조작된 재조합 세포이다. 재조합 이. 콜라이 숙주 세포는 MC4100, TG1, TG2, DHB4, DH5α, DH1, BL21, K12, XL1Blue 및 JM109를 포함한 임의의 적합한 이. 콜라이 균주에서 유래할 수 있다. 일례는 재조합 단백질 발효에 흔히 사용되는 숙주 균주인 이. 콜라이 균주 W3110(ATCC 27,325)이다. 항체 단편은 또한 변형된 이. 콜라이 균주, 예를 들어 대사 변이체 또는 프로테아제 결핍 이. 콜라이 균주, 예컨대 WO 2011/086136, WO 2011/086138 또는 WI 2011/086139(본원에서 인용에 의해 포함됨)에 기재된 것들을 배양함으로써 생산될 수 있다.
본 발명의 방법에 따라 정제될 수 있는 항체는, 단백질의 성질, 생산 규모 및 사용되는 이. 콜라이 균주에 따라, 전형적으로 이. 콜라이 숙주 세포의 주변세포질에서 또는 숙주 세포 배양 상청액에서 발견된다. 단백질을 이들 구획에 타겟팅하는 방법은 당업계에 익히 공지되어 있다 (Makrides,S.C. (1996). Strategies for achieving high-level expression of genes in Escherichia coli. Microbiol Rev 60, 512-538.). 단백질을 이. 콜라이의 주변세포질로 인도하기에 적합한 시그널 서열의 예는 이. 콜라이 PhoA, OmpA, OmpT, LamB 및 OmpF 시그널 서열을 포함한다. 단백질은 천연의 분비 경로에 의존함으로써 또는 단백질 분비를 야기하기 위해 외부 막의 한정된 누출의 유도에 의해 상청액으로 타겟팅될 수 있으며 이의 예는 pelB 리더, 단백질 A 리더의 사용, 글리신의 배양 배지로의 첨가와 함께 박테리오신 방출 단백질, 미토마이신-유도된 박테리오신 방출 단백질의 공발현 및 막 침투화를 위한 kil 유전자의 공발현이다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 방법에서, 재조합 단백질은 숙주 이. 콜라이의 주변세포질에서 발현된다.
이. 콜라이 숙주 세포에서 재조합 단백질의 발현은 또한 유도성 시스템의 제어하에 있을 수 있고, 이에 의해 이. 콜라이에서 재조합 항체의 발현은 유도성 프로모터의 제어하에 있다. 이. 콜라이에 사용하기 적합한 다수의 유도성 프로모터는 당업계에 익히 알려져 있고 재조합 단백질의 프로모터 발현에 따라 온도 또는 증식 배지 중 특정 물질의 농도와 같은 인자를 변화시킴으로써 유도될 수 있다. 유도성 프로모터의 예는 락토스 또는 비-가수분해성 락토스 유사체, 이소프로필-b-D-1-티오갈락토피라노시드(IPTG)로 유도가능한 이. 콜라이 lac, tac, 및 trc 프로모터 및 포스페이트, 트립토판 및 L-아라비노스 각각에 의해 유도되는 phoA, trp 및 araBAD 프로모터를 포함한다. 발현은 예를 들어, 유도물질의 첨가 또는 유도가 온도 의존적인 온도의 변화에 의해 유도될 수 있다. 재조합 단백질 발현의 유도가 배양물에 유도물질의 첨가에 의해 달성되는 경우 유도물질은 발효 시스템 및 유도물질에 따른 임의의 적합한 방법에 의해, 예를 들어, 단일 또는 복수의 샷 추가에 의해 또는 공급을 통한 유도물질의 점진적인 추가에 의해 첨가될 수 있다. 유도물질의 첨가와 단백질 발현의 실제 유도 간에 지연이 있을 수 있음은 인지가능하며, 예를 들어 유도물질이 락토스인 경우 임의의 기존의 탄소원이 락토스 이전에 이용되는 동안 단백질 발현의 유도가 일어나기 이전에 지연이 있을 수 있다.
이. 콜라이 숙주 세포 배양(발효)은 이. 콜라이의 증식 및 재조합 단백질의 발현을 지지하는 임의의 배지에서 배양될 수 있다. 배지는 예를 들어 문헌[Durany O, et al. (2004). Studies on the expression of recombinant fuculose-1-phosphate aldolase in Escherichia coli. Process Biochem 39, 1677-1684]에 기재된 것과 같은 임의의 화학적으로 한정된 배지일 수 있다.
이. 콜라이 숙주 세포의 배양은 원하는 생산 규모에 따라 임의의 적합한 용기 예컨대 진탕 플라스크 또는 발효조에서 일어날 수 있다. 1,000 리터 초과 내지 약 100,000 리터 이하의 용량을 갖는 다양한 대규모 발효조가 이용가능하다. 바람직하게는, 1,000 내지 50,000 리터, 더 바람직하게는 1,000 내지 25,000, 20,000, 15,000, 12,000 또는 10,000 리터의 발효조가 이용된다. 0.5 내지 1,000 리터의 용량을 갖는 보다 작은 규모의 발효조가 또한 사용될 수 있다.
이. 콜라이의 발효는 원하는 단백질 및 수율에 따라 임의의 적합한 시스템, 예를 들어 연속, 배치 또는 페드-배치 모드로 실시될 수 있다. 필요하다면 영양소 또는 유도물질의 샷 추가와 함께 배치 모드가 이용될 수 있다. 대안적으로, 페드-배치 배양이 사용될 수 있고 배양물은 발효조에 최초로 존재하는 영양소 및 발효가 완료될 때까지 증식 속도를 제어하기 위해 사용되는 하나 이상의 영양소 공급 방식을 사용하여 지속될 수 있는 최대 비 증식 속도에서 배치 모드의 예비-유도로 증식된다. 페드-배치 모드는 또한 이. 콜라이 숙주 세포의 대사를 제어하고 보다 높은 세포 밀도에 도달하도록 하기 위해 예비-유도로 사용될 수 있다.
원한다면, 숙주 세포는 발효 배지로부터 수집될 수 있으며, 예를 들어 숙주 세포는 원심분리, 여과 또는 농축에 의해 샘플로부터 수집될 수 있다.
일 실시양태에서 본 발명에 따른 공정은 단백질의 추출 이전에 원심분리 및 세포 회수 단계를 포함한다.
관심 단백질 예컨대 항체 단편이 숙주 세포의 주변세포질 공간에서 발견되는 이. 콜라이 발효 공정의 경우 숙주 세포로부터 단백질을 방출시킬 것이 요구된다. 방출은 임의의 적합한 방법 예컨대 기계적 또는 압력 처리, 동결-해동 처리, 삼투압 충격, 추출제 또는 열처리에 의한 세포 용해에 의해 달성될 수 있다. 단백질 방출을 위한 이러한 추출 방법은 당업계에 익히 알려져 있다. 따라서 특정 실시양태에서, 본 발명의 방법은 단백질 정제 이전에 추가의 단백질 추출 단계를 포함한다.
추가 실시양태에서 본 발명의 방법은 세포 배양 배지로부터 숙주 세포를 회수하는 단계, 단백질 추출 단계를 이용하여 단백질을 수거하는 단계, 단백질 추출 단계에서 나온 단백질 함유 혼합물을 회수하는 단계 및 혼합물로부터 상기 단백질을 정제하는 단계로서, 상기 정제가 적어도 하나의 단백질 A 크로마토그래피 단계를 포함하는 것인 단계를 추가로 포함한다.
특정의 실시양태에서 추출 단계는 추출 완충제를 샘플에 추가하는 단계 및 얻어진 단백질을 회수하는 단계를 포함한다. 바람직하게는 추출 단계는 본래 형태의 단백질의 회수를 가능하도록 하기에 적합한 시간 동안 및 적합한 온도에서 실시되며 각 특정 단백질에 대해 경험적으로 최적화된다. 본 발명의 특정 실시양태에서 상기 추출 단계는 25℃ 내지 35℃, 27℃ 내지 33℃, 바람직하게는 29℃ 내지 31℃에서 실시된다. 단백질 추출 단계는 사용되는 특정 단백질 및 온도에 따라 경험적으로 최적화되는 시간에 걸쳐 실시된다. 특정 실시양태에서 상기 추출 단계는 4 내지 20 시간, 6 내지 18 시간, 바람직하게는 8 내지 12 시간 동안 실시된다. 특정 실시양태에서 단백질 추출 단계는 29℃ 내지 31℃에서 8 내지 12 시간 동안, 바람직하게는 30℃에서 11 시간 동안 수행된다.
대안적인 실시양태에서 추출 완충제는 샘플에 첨가되고 이후에 샘플이 열처리 단계를 거치게 된다. 열처리 단계는 바람직하게는 US 5,665,866(본원에서 인용에 의해 포함됨)에서 상세히 기재된 바와 같다.
추출 단계 이후에 관심 단백질 예컨대 항체를 함유하는 혼합물은 원심분리 및/또는 여과 단계를 거칠 수 있다.
추가의 특정 실시양태에서, 본 발명의 방법은 추출 단계 이후에 및 상기 혼합물로부터 단백질의 정제 이전에 관심 단백질을 함유하는 혼합물의 pH를 조절하는 단계를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "항체" 또는 "항체들"은 단클론 또는 다클론 항체를 지칭한다. 본원에서 사용되는 용어 "항체" 또는 "항체들"은 당업계에 공지된 재조합 기법에 의해 생성되는 재조합 항체를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. "항체" 또는 "항체들"은 임의 종, 특히 포유류 종의 항체를 포함하며, 2개의 실질적으로 완전한 중쇄 및 2개의 실질적으로 완전한 경쇄를 갖는 항체, IgD, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgG4, IgE를 포함한 임의의 이소타입의 인간 항체 및 IgA1, IgA2를 포함한 이의 기본 구조의 이량체 또는 오량체 예컨대 IgM 및 이의 변형된 변이체로서 생산되는 항체, 비-인간 영장류 항체, 예를 들어 침팬지, 비비, 레서스 또는 시노몰구스 원숭이, 설치류 항체, 예를 들어 마우스, 또는 래트; 토끼 항체, 염소 또는 말 항체, 및 카멜리드 항체(예를 들어 낙타 또는 라마 항체 예컨대 NanobodiesTM) 및 이의 유도체, 또는 조류 종의 항체 예컨대 치킨 항체 또는 어류 종의 항체 예컨대 상어 항체를 포함한다. 용어 "항체" 또는 "항체들"은 또한 적어도 하나의 중쇄 및/또는 경쇄 항체 서열의 제1 부분이 제1 종으로부터의 것이고 중쇄 및/또는 경쇄 항체 서열의 제2 부분이 제2 종으로부터의 것인 "키메라" 항체를 지칭한다. 본원에서 관심 키메라 항체는 비-인간 영장류(예를 들어 구대륙 원숭이, 예컨대 비비, 레서스 또는 시노몰구스 원숭이)에서 유래한 가변 도메인 항원 결합 서열 및 인간 불변 영역 서열을 포함하는 "영장류화" 항체를 포함한다. "인간화" 항체는 비-인간 항체에서 유래한 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는 수용체의 초가변 영역의 잔기가 원하는 특이성, 친화성, 및 활성을 갖는, 비-인간 종(공여체 항체) 예컨대 마우스, 래트, 토끼, 치킨 또는 비-인간 영장류의 초가변 영역[또는 상보성 결정 영역(CDR)]의 잔기로 대체된 인간 항체(수용체 항체)이다. 대부분의 경우에 CDR 외부의; 즉, 프레임워크 영역(FR) 내의 인간 (수용체) 항체의 잔기는 부가적으로 상응하는 비-인간 잔기로 치환된다. 나아가, 인간화 항체는 수용체 항체에서 또는 공여체 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 성능을 더욱 개량하기 위해 이루어진다. 인간화는 인간에서 비-인간 항체의 면역원성을 감소시켜서, 인간 질병의 치료에 대한 항체의 적용을 용이하게한다. 인간화 항체 및 이를 생성하는 다양한 몇몇 기술이 당업계에 익히 알려져 있다. 용어 "항체" 또는 "항체들"은 또한 인간화에 대한 대안으로 생성될 수 있는 인간 항체를 의미한다. 예를 들어, 내생성 뮤린 항체의 생성의 부재하에 면역접종 시에 인간 항체의 완전한 레퍼토리를 생산할 수 있는 트랜스제닉 동물(예를 들어, 마우스)을 생성할 수 있다. 예를 들어, 키메라 및 생식계열 변이체 마우스에서의 항체 중쇄 결합 영역(JH) 유전자의 동형접합형 결실은 내생성 항체 생성의 완전한 저해를 초래한다고 기재되어 있다. 이러한 생식계열 변이체 마우스에서의 인간 생식계열 면역글로불린 유전자 어레이의 전달은 상기 항원으로 인간 생식계열 면역 글로불린 유전자를 보유하는 트랜스제닉 동물의 면역접종시 특정 항원에 대한 특이성을 갖는 인간 항체의 생산을 초래할 것이다. 이러한 트랜스제닉 동물을 생산하는 기술 및 이러한 트랜스제닉 동물로부터 인간 항체를 단리하고 생산하는 기술은 당업계에 공지되어 있다. 대안적으로, 트랜스제닉 동물; 예를 들어 마우스에서, 마우스 항체의 가변 영역을 코딩하는 면역글로불린 유전자만이 상응하는 인간 가변 면역글로불린 유전자 서열로 치환된다. 항체 불변 영역을 코딩하는 마우스 생식계열 면역글로불린 유전자는 변화되지 않고 유지된다. 이러한 방식으로, 항체 이펙터가 트랜스제닉 마우스의 면역 시스템에서 기능하고 결과적으로 B 세포의 발달은 본질적으로 변하지 않아 생체 내에서 항원성 챌린지 시에 항체 반응이 개선될 수 있다. 관심 특정 항체를 코딩하는 유전자가 이러한 트랜스제닉 동물로부터 단리되면 불변 영역을 코딩하는 유전자는 완전 인간 항체를 얻기 위해 인간 불변 영역 유전자로 치환될 수 있다. 시험관내에서 인간 항체를 얻는 다른 방법은 디스플레이 기술 예컨대 파지 디스플레이 또는 리보솜 디스플레이 기술을 기반으로 하며, 여기서, 적어도 부분적으로 인공적으로 생성되는 또는 공여체의 면역글로불린 가변 (V) 도메인 유전자 레퍼토리로부터 생성되는 재조합 DNA 라이브러리가 사용된다. 인간 항체를 생성하기 위한 파지 및 리보솜 디스플레이 기술은 당업계에 익히 알려져 있다. 인간 항체는 또한, 관심 항원으로 생체외 면역화되고 그 후에 융합되어 하이브리도마를 생성하여 차후에 최적의 인간 항체에 대해 스크리닝될 수 있는 단리된 인간 B 세포로부터 생산될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "항체" 또는 "항체들"은 또한 비글리코실화 항체로 지칭된다.
본 발명의 실시양태들 중 임의의 실시양태에 사용될 수 있는 항체 분자는 항체 단편 예컨대 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 및 scFv 단편; 및 BiTEs®(Bi-specific T-cell Engagers) 및 DARTsTM(Dual Affinity Re-Targeting 기술)와 같은 포맷을 포함한 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 미니바디, 도메인 항체(dAbs), 예컨대 sdAbs, VHH 및 VNAR 단편, 단일-쇄 항체, 항체 단편 또는 항체로부터 형성되는 이중특이성, 삼중특이성, 사중특이성 또는 다중특이성 항체를 포함하고, 여기에 Fab-Fv, Fab-scFv, Fab(Fv)2 또는 Fab-(scFv)2 구축물이 포함되며 이에 한정되지 않는다. 앞서 정의된 바와 같은 항체 단편은 당업계에 공지되어 있다. 명확성을 위해 Fab-Fv는 임의의 순서로 결합된 하나의 Fv 영역과 하나의 Fab 영역을 함유하는 구축물, 즉, Fab-Fv, 또는 Fv-Fab를 지칭하는 것으로 이해되며, 여기서, 한 영역의 마지막 아미노산 이후에 다음 영역의 첫번째 아미노산이 뒤따르고 그 반대의 경우도 마찬가지이다. 마찬가지로 Fab-scFv는 임의의 순서로 및 Fab의 경우에 어느 폴리펩티드 쇄에 결합된, 하나의 scFv 영역과 하나의 Fab 영역을 함유하는 구축물, 즉, Fab-scFv, 또는 scFv-Fab를 지칭하는 것으로 이해되며, 여기서, 한 영역의 마지막 아미노산 이후에 다음 영역의 첫번째 아미노산이 뒤따르고 그 반대의 경우도 마찬가지이다. 동일한 방식으로 Fab-(Fv)2는 임의의 순서로 결합된 2개의 Fv 영역과 하나의 Fab 영역을 함유하는 구축물, 즉 Fab-Fv-Fv, Fv-Fab-Fv, 또는 Fv-Fv-Fab를 지칭하는 것으로 이해되며, 여기서, 한 영역의 마지막 아미노산 이후에 다음 영역의 첫번째 아미노산이 뒤따르고 그 반대의 경우도 마찬가지이다. 마찬가지로 Fab-(scFv)2는 임의의 순서로 및 Fab의 경우에 어느 폴리펩티드 쇄에 결합되어 20가지의 가능한 순열을 발생하는 2개의 scFv 영역과 하나의 Fab 영역을 함유하는 구축물을 지칭하는 것으로 이해한다.
전형적으로 이들 구축물은 제1 영역(예를 들어 Fab)과 제2 영역(예를 들어 Fv) 사이에 펩티드 링커를 포함한다. 이러한 링커는 당업계에 익히 알려져 있고, 전형적으로 당업자에 의해 길이 및 조성이 최적화된 하나 이상의 아미노산일 수 있다. 대안적으로 상기 영역은 직접적으로, 즉, 펩티드 링커 없이 연결될 수 있다.
가변 도메인을 Fab 또는 Fab'에 연결하기에 적합한 링커 영역의 예는 WO 2013/068571 및 WO 2014/096390(본원에서 인용에 의해 포함됨)에 기재되어 있고, 유연한 링커 서열 및 경질의 링커 서열을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 유연한 링커 서열은 문헌[Huston et al., 1988, 10 PNAS 85:5879-5883; Wright & Deonarain, Mol. Immunol., 2007, 44(11):2860-2869; Alfthan et al., Prot. Eng., 1995, 8(7):725-731; Luo et al., J. Biochem., 1995, 118(4):825-831; Tang et al., 1996, J. Biol. Chern. 271(26): 15682-15686; and Turner et al., 1997, JIMM 205, 42-54]에 개시된 것들을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "VH3 도메인"은 면역글로불린의 인간 중쇄 가변 영역의 프레임워크 서브그룹 3을 지칭한다. 항체의 중쇄 가변 도메인은 DNA 서열 및 단백질 상동성에 기초하여 별개의 서브패밀리(VH1 내지 VH6)로 분류된다 (Walter et al. Am. J. Hum. Genet. 42:446-451, 1988, Analysis for genetic variation reveals human immunoglobulin VH -region gene organization; Schroeder et al. Int Immunol. 1990; 2(1):41-50, Structure and evolution of mammalian VH families).
본원에서 사용되는 용어 "Fc 영역"은 천연 항체의 Fc 영역을 지칭하며, 이는 불변 중쇄 도메인 1(CH1)이 결여된 불변 영역 이량체이다. 당업계에 알려진 바와 같이 항체의 Fc 영역은 펩신 또는 파파인으로 천연 항체를 소화한 후 회수되는 결정화 가능한 단편(Fc)이다.
본원에서 사용되는 "Fc 영역을 함유하지 않은" 항체는 천연 불변 중쇄 도메인 2(CH2), 천연 불변 중쇄 도메인 3(CH3) 및 천연 불변 중쇄 도메인 4(CH4) 영역 어느 것도 함유하지 않은 항체를 지칭한다.
단백질 A와의 결합을 담당하는 Fc 영역 내의 잔기는 당업계에 이미 기재되어 있다 (Nagaoka et al. Single amino acid substitution in the mouse IgG1 Fc region induces drastic enhancement of the affinity to protein A, PEDS Vol. 16, Issue 4, pages 243-245). 결과적으로 당업자는 단백질 A에 결합하는 능력을 상실한 Fc 영역을 갖는 항체를 개발할 수 있고, 이러한 항체는 본 발명에 따른 방법에 사용하기 적합하다.
본원에서 사용되는 용어 "다량체" 또는 "다량체 형태"는 2 이상의 단량체로부터의 도메인으로 이루어진 항체 형태를 지칭하며, 여기서 상기 도메인은 모두 정확히 폴딩되어 쌍을 이룬다. 다량체의 예는 도 12에 제공되고 있으며, 여기서, 상이한 항체 분자가 정확히 폴딩되고 각각의 VH 도메인은 상보적인 VL 도메인과 쌍을 이룬다. 명확성을 위해, 상보성 VH-VL 쌍은 동일한 항원에 협동적으로 결합하는 것으로 이해된다.
본원에서 사용되는 용어 "단백질 A" 또는 "스타필로코커스 단백질 A"는 그람-양성 박테리아 스타필로코커스 아우레우스의 대부분의 균주의 세포벽에 공유적으로 연결된 I형 막 단백질이다. 이는 인간, 토끼 및 기니아 피그와 같은 다양한 종으로부터의 IgG에 대한 높은 친화성을 가지지만, 소 및 마우스와 약한 상호작용만을 갖는다. 단백질 A는 2가지 별개의 결합 이벤트를 통해 항체와 상호작용한다: 인간 IgG1, IgG2, 및 IgG4의 Fc 부분 상의 "전통적인" 결합 부위, 및 VH3 서브패밀리의 중쇄를 함유하는 인간 IgG, IgM, IgA, 및 IgE의 Fab 부분 상에서 확인되는 "대체" 결합 부위. 스타필로코커스 아우레우스의 단백질 A의 최근에 보고된 분자량은 약 42,000 Da이다. 재조합 스타필로코커스 단백질 A는 299개의 아미노산으로 이루어지고 SDS-PAGE에 의해 예측된 33.8 kDa의 예상 분자 질량을 갖는다.
단백질 A는 3개 영역: S, 분비 동안 프로세싱되는 시그널 서열임; 5개의 상동성 IgG 결합 도메인 E, D, A, B 및 C 및 세포 벽 고정 영역 XM으로 이루어진다. 영역 X가 결여된 끝잘린 단백질은 약 31kD의 분자량을 갖는다. 도메인들은 독립적으로 IgG1, IgG2 및 IgG4의 Fc-파트에 결합할 수 있지만 IgG3와는 단지 약한 상호작용을 나타낸다. 부가적으로, 모든 천연 단백질 A 도메인은 필적할만한 Fab 결합을 나타내며, 이는 영역 D 및 E에 의해 매개되는 것으로 기재되어 있다.
본원에서 사용되는 용어 "OX40"은 CD134, TNFRSF4, ACT35 또는 TXGP1L로도 알려진 분자를 지칭하고, TNF 수용체 수퍼패밀리의 멤버이며, 이는 최적의 T 세포 증식과 생존을 위해 CD28과 OX40의 순차적인 맞물림이 필요한 보조자극 수용체로서 역할을 한다.
항체를 언급하면서 본원에서 사용되는 용어, 주어진 분자"에 특이적으로 결합하다", 주어진 분자"에 특이적으로 결합하는", 및 동의어는 항체가 생물학적으로 의미있는 효과를 달성하기에 충분한 친화성 및 특이성으로 상기 주어진 분자에 결합할 것임을 의미한다. 선택된 항체는 일반적으로 주어진 분자에 대해 결합 친화성을 가질 것이고, 예를 들어, 항체는 100 nM 내지 1 pM의 Kd 값으로 주어진 분자와 결합할 수 있다. 항체 친화성은 예를 들어, 표면 플라즈몬 공명 염기 검정, 예컨대 BIAcore 검정; 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA); 및 경쟁 검정(예를 들어 RIA)에 의해 결정될 수 있다. 본 발명의 의미 내에서 상기 주어진 분자에 특이적으로 결합하는 항체는 또한 또 다른 분자에 결합할 수 있다; 비제한적인 예로서 이중특이성 항체의 경우.
실시예
실시예 1: pH 구배 용출을 통한 A26Fab-645dsFv의 단백질-A 정제
A26Fab-645dsFv의 이. 콜라이 발현, 추출 및 정화
A26Fab-645dsFv(인간 OX40 및 혈청 알부민에 결합하는 항체 단편)가 이. 콜라이 W3110 숙주 세포에서 IPTG(이소프로필-b-D-1-티오갈락토피라노시드)에 의한 유도시 이종 단백질로서 발현되었고 이종 단백질은 pH 7.4로 조정된 100 mM 트리스/10 mM EDTA 완충제의 첨가 및 30℃에서 단백질 추출 단계에 의해 숙주 세포의 주변세포질 공간으로부터 방출되었다. 세포 물질을 원심분리를 통해 제거하고 이후에 이종 단백질을 함유한 세포 추출물을 원심분리 및 0.22 ㎛ 여과의 조합을 이용하여 정화시켰다.
pH 구배 용출을 통한 A26Fab-645dsFv의 단백질-A 정제
정화된 이. 콜라이 추출물을 Delbeccos 인산 완충 생리식염수(PBS) pH 7.4에서 평형화된, 천연 단백질 A 크로마토그래피 컬럼, 5ml HiTrap MabSelect(GE Healthcare)에 적용했다. 컬럼을 우선 PBS로 세척하여 결합되지 않은 물질을 제거하고, 결합된 물질을 그 후에 pH 7.4에서 pH 2.1의 pH 구배로 용출시켰다. 용출된 물질을 분별하고 SEC-HPLC(크기 배제 크로마토그래피 - 고성능 액체 크로마토그래피)를 통해 TSK 겔 G3000SWXL SEC-HPLC(Tosoh Corporation)을 사용하여 분석했다. SEC-HPLC 분석을 사용하여 각 분획에 존재하는 단량체 및 다량체의 %를 결정했다. A26Fab-645dsFv 단량체는 대략 9분의 보유 시간을 가졌다. 이량체, 삼량체, 사량체, 및 이보다 높은 차수의 구조체 모두 9분 미만의 보유 시간을 나타내었고 통틀어 다량체 종 또는 고분자량 종(HMWS)으로 명명되었다.
단백질 A 크로마토그래피 컬럼으로부터의 용출 동안, pH 구배를 통해 2개의 피크가 관찰되었다 (도 1 참조). 제2 피크에서 다량체 종의 레벨의 상승과 비교하여, 제1 피크에서는 단량체의 레벨의 상승이 관찰되었다 (표 1 및 도 2 참조).
A26Fab-645dsFv는 Fc를 결여하며, 따라서 단백질-A에의 결합은 V-영역의 인간 VH3 가변 프레임워크 서브클래스에 기인한 것이었다. 다량체 종의 증가된 결합은 단백질-A에 대한 이들 분자의 증가된 아비디티에 기인한 것으로 제안된다. 다량체 종은 보다 많은 VH3 영역을 가지며 이에 따라 용출을 위해 보다 낮은 pH를 요구하는 단백질-A 수지에 보다 강하게 결합한다.
pH 구배 용출을 통한 A26Fab-645dsFv의 단백질-A 정제로부터의 분획의 SEC G3000 분석
분획 부피 (ml) 농도 (mg/ml) 단백질 (mg) HMWS (%) 단량체 (%)
A1 3.3 0.3 0.9 4.0 96.1
A2 3.1 0.6 1.9 6.7 93.3
A3 3.2 1.6 5.0 15.0 85.0
A4 3.2 1.6 5.1 22.7 77.3
A5 3.2 1.8 5.8 44.2 55.8
A6 3.3 1.4 4.6 53.8 46.2
A7 3.3 0.5 1.5 54.7 45.3
A8 1.0 0.2 0.2 50.6 49.4
실시예 2: pH 구배 용출을 통한 Fc 구축물의 단백질-A 정제
다량체 Fc의 CHO 발현 및 정화
Fc를 다량체로 조립시키는 인간 IgM 테일 피스에 융합된 인간 IgG1 유래의 Fc 도메인을 함유하는 Fc 구축물을, 안정한 디히드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 결핍 중국 햄스터 난소 세포주(CHO DG44)에서 발현시켰다. 세포를 제조자의 지시에 따라 Nuclefector(Lonza)를 사용하여 선택 마커로서 DHFR에 대한 유전자 및 생성물을 코딩하는 유전자 둘다를 함유하는 플라스미드 벡터로 형질감염시켰다. 형질감염된 세포를, 하이포크산틴 및 티미딘이 결핍된 배지에서, DHFR 억제제 메토트렉세이트의 존재하에 선택했다. 배양물을 배치 모드로 진탕 플라스크 배양에서 유지시키고 14일 후에 수확했다.
세포 배양 상청액의 정화를 원심분리(4000 x g 실온에서 60분간)한 후 심층 및 무균 여과에 의해 수행했다.
정화된 세포 배양 상청액을 농축하고, 모든 Fc 함유 구축물을, PBS pH 7.4에서 평형화된, 단백질 A 크로마토그래피 컬럼, 5ml HiTrap MabSelect SuRe(GE Healthcare)를 이용하여 정제했다. 컬럼을 PBS로 세척하고 결합된 물질을 0.1M 시트레이트 pH 3.4로 용출시켰다. 용출된 물질을 PBS pH 7.4로 완충제 교환했다.
정제된 Fc 구축물을, PBS pH 7.4에서 평형화된, 천연 단백질 A 크로마토그래피 컬럼, 5ml HiTrap MabSelect(GE Healthcare)에 적용했다. 컬럼을 우선 PBS로 세척하여 결합되지 않은 물질을 제거하고, 결합된 물질을 그 후에 pH7.4에서 pH 2.1의 pH 구배로 용출시켰다 (도 3 참조). 용출된 물질을 분별하고 SEC-HPLC(G3000 SEC-HPLC, Tosoh Corporation)를 통해 분석했다. SEC-HPLC 분석을 사용하여 각 분획에 존재하는 단량체 및 다량체 Fc의 %를 결정했다. Fc 단량체는 대략 9.3분의 보유 시간을 가진다. 삼량체, 육량체, 및 이보다 높은 차수의 구조체 모두가 9.4 분 미만의 보유 시간을 가지며 통틀어 다량체 종 또는 고분자량 종(HMWS)으로 명명되었다 (표 2 및 도 4 참조).
pH 구배 용출을 통한 다량체 Fc의 단백질-A 정제로부터의 분획의 G3000 SEC 분석
분획 총 단백질 (mg) % Fc 단량체 % Fc 다량체
A1 0.89 2.3 97.6
A2 3.13 4.7 95.3
A3 3.14 9.5 90.4
A4 0.94 7.8 92.3
Fc 구축물이 상향 및 하향 굴곡 상에 약한 숄더와 함께 단일 피크로서 용출되었다. 그러나 SEC-HPLC에 의한 분획의 분석은 분자의 단량체 및 다량체 형태가 평행하게 용출되는 것을 보여주었다 (표 2 및 도 4 참조). 구배 용출을 통해 상이한 종 간에 분리는 관찰되지 않았다.
Fc 구축물의 다량체는 복수의 Fc 영역을 함유하지만 가변 영역이 결여되어 있고 이에 따라 인간 VH3 도메인을 통한 단백질-A와의 결합 가능성을 결여한다. 단량체 및 다량체 Fc 구축물은 구배 용출에서 단백질-A 컬럼으로부터 동시 용출되는데, 이는 수지에 대한 Fc 영역 아비디티가 용출을 위한 인자가 아니었음을 입증한다. 따라서 단량체 및 다량체 Fc 영역 함유 분자는 이러한 기법에 의해 효율적으로 분리될 수 없다. 이는, pH 구배를 이용한 Fc 영역을 갖지 않는 VH3-도메인 함유 항체의 단백질-A로부터의 용출이 다량체로부터 단량체를 분리할 수 있었던 실시예 1 및 2와 대조적이다.
실시예 3: pH 단계 용출을 통한 A26Fab-645dsFv의 단백질-A 정제
A26Fab-645dsFv의 CHO 발현 및 정화
인간 OX40 및 혈청 알부민에 결합하는 구축물을, 안정한 디히드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 결핍 중국 햄스터 난소 세포주(CHO DG44)에서 발현시켰다. 세포를, 제조자의 지시에 따라 Nuclefector(Lonza)를 사용하여 전기천공에 의해 선택 마커로서 DHFR에 대한 유전자 및 생성물을 코딩하는 유전자 둘다를 함유하는 플라스미드 벡터로 형질감염시켰다. 형질감염된 세포를, 하이포크산틴 및 티미딘이 결핍된 배지에서, DHFR 억제제 메토트렉세이트의 존재하에 선택했다. 배양물을 배치 모드로 진탕 플라스크 배양에서 유지시키고 14일 후에 수확했다.
세포 배양 상청액의 정화를 원심분리(4000 x g 실온에서 60분 동안) 후에 심층 및 무균 여과를 통해 수행했다.
pH 단계 용출을 통한 A26Fab-645dsFv의 단백질-A 정제
정화된 세포 배양 상청액을, Delbeccos 인산 완충 생리식염수(PBS) pH 7.4에서 평형화된, 천연 단백질 A 크로마토그래피 컬럼, 5ml HiTrap MabSelect(GE Healthcare)에 적용했다. 컬럼을 우선 PBS로 세척하여 결합되지 않은 물질을 제거하고 결합된 물질을 그 후에 pH 3.8에서 우선 용출시킨 다음 제2 용출 단계를 pH 3.0에서 실시했다 (도 5 참조). 용출된 물질을 분별하고 SEC-HPLC(G3000 SEC-HPLC, Tosoh Corporation)를 통해 분석했으며 4-20% 트리스/글리신 SDS-PAGE를 환원 및 비-환원 조건 둘다에서 실시했다.
SEC-HPLC 분석을 이용하여 각 분획에 존재하는 단량체 및 다량체의 %를 결정했다. A26Fab-645dsFv 단량체는 대략 9분의 보유 시간을 갖는다. 이량체, 삼량체, 사량체, 및 보다 높은 차수의 구조체 모두 9분 미만의 보유 시간을 가지며 통틀어 다량체 종 또는 고분자량 종(HMWS)으로 명명되었다 (도 6 및 표 3 참조).
pH 단계 용출을 통한 A26Fab-645dsFv의 단백질-A 정제로부터의 분획의 G3000 SEC 분석
　 부피 (ml) 농도 (mg/ml) 총 단백질 (mg) HMWS (%) 단량체 (%)
pH3.8 13.8 0.67 9.2 21.3 78.7
pH3.0 7.5 1.04 7.8 96.8 3.2
비-환원 SDS-PAGE는 용출 피크에서 상기 단량체 및 다량체 레벨을 확인시켜주었다. A26Fab-645dsFv 단량체는 97-66 kDa 사이에서 이동하며 pH 3.8에서의 용출에 상응하는 레인 4에서의 주된 밴드이며, A26Fab-645dsFv 다량체는 120 kDa를 초과하는 복수 밴드로서 이동하며 pH 3.0에서 용출로부터 회수된 분획에 상응하는 레인 5의 밴드의 대부분이다 (도 7 참조).
환원 SDS-PAGE는 비-환원 SDS-PAGE 상의 모든 밴드가 A26Fab-645dsFv와 관련되어 있음을 확인시켜 주었다 (도 8 참조).
pH 3.8에서의 용출은 하향 굴곡 상에 약한 테일과 함께 2.8 컬럼 부피에서 단일 피크를 용출시켰다. SEC-HPLC 분석은 이 피크가 단량체 형태의 79% A26Fab-645dsFv를 함유했음을 입증했으며, 높은 양의 단량체가 또한 비-환원 SDS-PAGE 분석에 의해 확인되었다. pH 3.0에서의 용출은 단일 피크를 용출시켰다. HPLC-SEC 분석은 이 피크가 다량체 형태의 97% A26Fab-645dsFv임을 입증했으며, 높은 양의 다량체가 또한 비-환원 SDS-PAGE 분석에 의해 확인되었다.
상기 결과는 단백질 A에 결합하는 VH3을 통해 다량체 종으로부터 단량체의 효율적인 분리가 가능함을 입증한다. 이는 이전 실시예에 나타낸 바와 같이 단백질-A에 결합하는 Fc와 대조적이다.
실시예 4: 구배 용출을 통한 A26Fab-645dsFv의 단백질-A(Amsphere) 정제
A26Fab-645dsFv의 CHO 발현 및 정화
인간 OX40 및 혈청 알부민에 결합하는 구축물을, 안정한 디히드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 결핍 중국 햄스터 난소 세포주(CHO DG44)에서 발현시켰다. 세포를 제조자의 지시에 따라 Nuclefector(Lonza)를 사용하여 전기천공에 의해 선택 마커로서 DHFR에 대한 유전자 및 생성물을 코딩하는 유전자 둘다를 함유하는 플라스미드 벡터로 형질감염시켰다. 형질감염된 세포를, 하이포크산틴 및 티미딘이 결핍된 배지에서, DHFR 억제제 메토트렉세이트의 존재하에 선택했다. 배양물을 배치 모드로 진탕 플라스크 배양에서 유지시키고 14일 후에 수확했다.
세포 배양 상청액의 정화를 원심분리(4000 x g 실온에서 60분 동안) 이후에 심층 및 무균 여과를 통해 수행했다.
pH 구배 용출을 통한 A26Fab-645dsFv의 단백질-A 정제 (Amsphere)
정화된 상청액을 Amsphere 단백질 A 크로마토그래피 컬럼(5ml 컬럼 부피 및 10cm 층 높이)에 적용하고 Delbeccos 인산 완충 생리식염수(PBS) pH 7.4에서 평형화시켰다. 이후, 컬럼을 PBS로 세척하여 결합되지 않은 물질을 제거하고, 결합된 물질을 그 후에 pH 6.0에서 pH 2.1의 pH 구배로 용출시켰다. 용출된 물질을 분별하고 SEC-UPLC(크기 배제 크로마토그래피 - 초고성능 액체 크로마토그래피)를 통해 Acquity UPLC BEH450 SEC 2.5 ㎛ 컬럼을 사용하여 분석했다. SEC-UPLC 분석을 이용하여 각 분획에 존재하는 단량체 및 다량체의 %를 결정했다. A26Fab-645dsFv 단량체는 대략 2.2분의 보유 시간을 가졌다. 이량체, 삼량체, 사량체, 및 보다 높은 차수의 구조체 모두 2.2분 미만의 보유 시간을 나타내었으며 통틀어 다량체 종 또는 고분자량 종(HMWS)으로 명명되었다.
Amsphere 단백질 A 크로마토그래피 컬럼으로부터 용출 동안, pH 구배를 통해 2개의 피크가 관찰되었다 (도 9 참조). 제2 피크에서 다량체 종의 레벨의 상승과 비교하여, 제1 피크에서는 단량체의 레벨의 상승이 관찰되었다 (표 5 및 도 9 참조).
A26Fab-645dsFv는 Fc를 결여하며 이에 따라 Amsphere 단백질-A에의 결합은 V-영역의 인간 VH3 가변 프레임워크 서브클래스에 기인한 것이었다. 다량체 종의 증가된 결합은 단백질-A에 대한 이들 분자의 증가된 아비디티에 기인한 것으로 제안된다. 다량체 종은 보다 많은 VH3 영역을 가지며 이에 따라 용출을 위해 보다 낮은 pH를 요구하는 단백질-A 수지에 보다 강하게 결합한다.
pH 구배 용출을 통한 A26Fab-645dsFv의 Amsphere 단백질-A 정제로부터의 분획의 SEC 분석
분획 부피 (ml) 농도 (mg/ml) 단백질 (mg) HMWS (%) 단량체 (%)
B15 5 0.54 2.68 0.0 85.2
B14 5 1.01 5.05 1.8 95.7
B13 5 1.14 5.7 48.2 49.7
B12 5 3.32 16.61 96.1 3.9
B11 5 1.85 9.235 96.1 2.8
B10 5 0.51 2.535 79.9 7.0
실시예 5: 구배 용출을 통한 A26Fab-645dsFv의 단백질-A (NovaSep Absolute) 정제
A26Fab-645dsFv의 CHO 발현 및 정화
인간 OX40 및 혈청 알부민에 결합하는 구축물을 안정한 디히드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 결핍 중국 햄스터 난소 세포주(CHO DG44)에서 발현시켰다. 세포를 제조자의 지시에 따라 Nuclefector(Lonza)를 이용하여 전기천공에 의해 선택 마커로서 DHFR에 대한 유전자 및 생성물을 코딩하는 유전자 둘다를 함유하는 플라스미드 벡터로 형질감염시켰다. 형질감염된 세포를, 하이포크산틴 및 티미딘이 결핍된 배지에서, DHFR 억제제 메토트렉세이트의 존재하에 선택했다. 배양물을 배치 모드로 진탕 플라스크 배양에서 유지시키고 14일 후에 수확했다.
세포 배양 상청액의 정화를 원심분리(4000 x g 실온에서 60분 동안) 이후에 심층 및 무균 여과를 통해 수행했다.
pH 구배 용출을 통한 A26Fab-645dsFv의 단백질-A 정제 (NovaSep Absolute)
정화된 상청액을 NovaSep Absolute 단백질 A 크로마토그래피 컬럼(5ml 컬럼 부피 및 10cm 층 높이)에 적용하고 Delbeccos 인산 완충 생리식염수(PBS) pH 7.4에서 평형화시켰다. 컬럼을 우선 PBS로 세척하여 결합되지 않은 물질을 제거하고, 결합된 물질을 그 후에 pH 6.0에서 pH 3.0의 pH 구배로 용출시켰다. 용출된 물질을 분별하고 Acquity UPLC BEH450 SEC 2.5㎛ 컬럼을 사용하여 SEC-UPLC를 통해 분석했다. SEC-UPLC 분석을 이용하여 각 분획에 존재하는 단량체 및 다량체의 %를 결정했다. A26Fab-645dsFv 단량체는 대략 2.2분의 보유 시간을 가졌다. 이량체, 삼량체, 사량체, 및 보다 높은 차수의 구조체 모두 2.2분 미만의 보유 시간을 나타내었고 통틀어 다량체 종 또는 고분자량 종(HMWS)으로 명명되었다.
NovaSep Absolute 단백질 A 크로마토그래피 컬럼으로부터 용출 동안, pH 구배를 통해 2개의 피크가 관찰되었다 (도 10 참조). 제2 피크에서 다량체 종의 레벨의 상승과 비교하여, 제1 피크에서는 단량체의 레벨의 상승이 관찰되었다 (표 6 및 도 10 참조).
A26Fab-645dsFv는 Fc를 결여하며 이에 따라 NovaSep Absolute 단백질-A와의 결합은 V-영역의 인간 VH3 가변 프레임워크 서브클래스에 기인한 것이었다. 다량체 종의 증가된 결합은 단백질-A에 대한 이들 분자의 증가된 아비디티에 기인한 것으로 제안된다. 다량체 종은 보다 많은 VH3 영역을 가지며 이에 따라 용출을 위해 보다 낮은 pH를 요구하는 단백질-A 수지에 보다 강하게 결합한다.
pH 구배 용출을 통한 A26Fab-645dsFv의 NovaSep Absolute 단백질-A 정제로부터의 분획의 SEC 분석
분획 부피 (ml) 농도 (mg/ml) 단백질 (mg) HMWS (%) 단량체 (%)
B15 2 0.36 0.72 0 99.7
B14 2 1.21 2.42 0 99.7
B13 2 0.46 0.92 4.6 94.8
B12 2 0.64 1.28 87.3 12.2
B11 2 2.05 4.1 98.4 1.4
B10 2 2.68 5.36 99 0.8
B9 2 0.67 1.34 97.2 2.3
B8 2 0.37 0.74 94.8 4.3
B6 2 0.03 0.06 94.7 4
실시예 6: 구배 용출을 통한 A26Fab-645dsFv의 단백질-A (AcroSep) 정제
A26Fab-645dsFv의 CHO 발현 및 정화
인간 OX40 및 혈청 알부민에 결합하는 구축물을 안정한 디히드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 결핍 중국 햄스터 난소 세포주(CHO DG44)에서 발현시켰다. 세포를 제조자의 지시에 따라 Nuclefector(Lonza)를 사용하여 전기천공에 의해 선택 마커로서 DHFR에 대한 유전자 및 생성물을 코딩하는 유전자 둘다를 함유하는 플라스미드 벡터로 형질감염시켰다. 형질감염된 세포를, 하이포크산틴 및 티미딘이 결핍된 배지에서, DHFR 억제제 메토트렉세이트의 존재하에 선택했다. 배양물을 배치 모드로 진탕 플라스크 배양에서 유지시키고 14일 후에 수확했다.
세포 배양 상청액의 정화를 원심분리(4000 x g 실온에서 60분간)한 후 심층 및 무균 여과에 의해 수행했다.
pH 구배 용출을 통한 A26Fab-645dsFv의 단백질-A 정제 (AcroSep)
정화된 상청액을 AcroSep 단백질 A 크로마토그래피 컬럼(1ml 컬럼 부피 및 1.5cm 층 높이)에 적용하고 Delbeccos 인산 완충 생리식염수(PBS) pH 7.4에서 평형화시켰다. 컬럼을 우선 PBS로 세척하여 결합되지 않은 물질을 제거하고, 결합된 물질을 그 후에 pH 6.0에서 pH 3.0의 pH 구배로 용출시켰다. 용출된 물질을 분별하고 Acquity UPLC BEH450 SEC 2.5 ㎛ 컬럼을 사용하여 SEC-HPLC에 의해 분석했다. SEC-HPLC 분석을 사용하여 각 분획에 존재하는 단량체 및 다량체의 %를 결정했다. A26Fab-645dsFv 단량체는 대략 2.2분의 보유 시간을 가졌다. 이량체, 삼량체, 사량체, 및 이보다 높은 차수의 구조체 모두 2.2분 미만의 보유 시간을 나타내었고 통틀어 다량체 종 또는 고분자량 종(HMWS)으로 명명되었다.
AcroSep 단백질 A 크로마토그래피 컬럼으로부터 용출 동안, pH 구배를 통해 폭넓은 단일 용출 피크가 관찰되었다 (도 11 참조). 감소된 분석능은 감소된 층 높이로 인한 것일 수도 있지만 용출 피크의 하향 굴곡 동안 상승된 레벨의 다량체 종과 비교하여 피크의 상향 굴곡 동안 단량체의 상승된 레벨이 여전히 관찰되었다 (표 7 및 도 11 참조).
A26Fab-645dsFv는 Fc가 결여되며 이에 따라 AcroSep Absolute 단백질-A에의 결합은 V-영역의 인간 VH3 가변 프레임워크 서브클래스에 기인한 것이었다. 다량체 종의 증가된 결합은 단백질-A에 대한 이들 분자의 증가된 아비디티에 기인한 것으로 제안된다. 다량체 종은 보다 많은 VH3 영역을 가지며 이에 따라 용출을 위해 보다 낮은 pH를 요구하는 단백질-A 수지에 보다 강하게 결합한다.
pH 구배 용출을 통한 A26Fab-645dsFv의 AcroSep Absolute 단백질-A 정제로부터의 분획의 SEC 분석
분획 부피 (ml) 농도 (mg/ml) 단백질 (mg) HMWS (%) 단량체 (%)
B13 1 0.17 0.17 28.9 71.1
B12 1 0.22 0.22 44.6 55
B11 1 0.35 0.35 67.1 32.8
B10 1 0.52 0.52 87.4 12.4
B9 1 0.73 0.73 96.2 3.6
B8 1 1.00 1.00 98.6 1.2
B7 1 1.19 1.19 99.1 0.7
B6 1 1.05 1.05 99.2 0.6
B5 1 0.54 0.54 98.6 0.9
B4 1 0.22 0.22 97.5 1.4
실시예 7: pH 구배 용출을 통한 TrYbe®의 단백질-A 정제
pH 구배 용출을 통한 TrYbe®의 단백질-A 정제
TrYbe®의 CHO 발현 및 정화
WO 2015/197772 (TrYbe®)에 기재된 바와 같이 포맷 Fab-2x dsscFv의 다중특이성 3가 항체 분자를 안정한 디히드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 결핍 중국 햄스터 난소 세포주(CHO DG44)에서 발현시켰다. 세포를 제조자의 지시에 따라 Nuclefector(Lonza)를 사용하여 선택 마커로서 DHFR에 대한 유전자 및 생성물을 코딩하는 유전자 둘다를 함유하는 플라스미드 벡터로 형질감염시켰다. 형질감염된 세포를, 하이포크산틴 및 티미딘이 결핍된 배지에서, DHFR 억제제 메토트렉세이트의 존재하에 선택했다. 발현은 인하우스 소유의 페드 배치 공정으로 실시되어 높은 세포수를 수득했다.
세포 배양 상청액의 정화를 원심분리(4000 x g 실온에서 60분 동안) 이후에 심층 및 무균 여과에 의해 수행했다. 정화된 세포 배양 상청액을 Delbeccos 인산 완충 생리식염수(PBS) pH 7.4로 평형화된 5ml HiTrap MabSelect(GE Healthcare)에 적용했다. 컬럼을 PBS로 세척하고 결합된 물질을 pH7.4에서 pH 2.1의 pH 구배로 용출시켰다 (도 21 참조). 용출된 물질을 분별하고 G3000 SEC-HPLC 및 4-20% 트리스/글리신 SDS-PAGE(환원 및 비-환원)를 통해 분석했다. SEC-HPLC 분석을 이용하여 단량체 및 다량체의 %를 결정했다. TrYbe® 단량체는 대략 9.4분의 보유 시간을 갖는다. 이량체, 삼량체, 사량체, 및 이보다 높은 차수의 구조체 모두 <9.4 분의 보유 시간을 가지며 통틀어 다량체 종 또는 HMWS로 명명되었다. 분획의 SEC-HPLC 분석 크로마토그램을 위해 도 22를 참조하기 바란다.
pH 구배 용출을 통해 하향 굴곡 상에 숄더와 함께 2개의 피크가 관찰되었다 (도 21 참조). 이들 3개의 분획을 SDS-PAGE로 분석했다 (도 23 참조). 용출 프로파일 전반에 걸쳐 비 환원 SDS-PAGE를 통해 몇 개의 밴드가 관찰되었다. 116-200kDa 분자량 밴드 사이에서 단량체가 이동한다. 단량체 위를 이동하는 모든 밴드는 통틀어 다량체 또는 HMWS로 명명되었다. 쇄간 디설파이드 종을 함유하지 않는 경쇄 관련 불순물 및 비-디설파이드 결합 중쇄 및 경쇄는 37-55kDa 분자량 마커 사이에서 이동한다. 분획 1(레인 2)은 HMWS가 거의 또는 전혀 보이지 않는 단량체 및 경쇄 관련 종으로 주로 이루어졌다. 단량체는 분획 2(레인 3)의 주요 밴드이다. HMWS 밴드가 보일지라도, 레벨은 분획 3(레인 4)에서 볼 수 있는 수준으로 상당히 감소된다. 환원된 겔에서 모든 생성물 관련 종은 레인 3 및 4에서 보이는 비-환원성 물질의 작은 밴드로 중쇄 및 경쇄로 환원된다. 레인 2는 분획 1이 경쇄 관련 종에 대해 풍부하게 농축되었음을 확인한다.
제1 피크(1)는 환원 SDS-PAGE에 의해 경쇄 관련 불순물로서 확인되었고 SEC-HPLC에 의해 분석시 2% HMWS를 함유했다. 제2 피크(2)는 TrYbe®로서 확인되었고 72% 단량체 및 22% HMWS를 함유했다 (표 8 및 도 24 참조). 피크 2, 분획 3에 대한 하향 굴곡은 TrYbe®로 확인되었으며 6% 단량체 및 92% HMWS를 함유했다.
TrYbe®은 Fc를 결여하며 따라서 단백질-A에의 결합은 v-영역의 인간 VH3 가변 프레임워크 서브클래스에 기인한 것이었다. 다량체 종의 증가된 결합은 단백질-A에 대한 이들 분자의 증가된 아비디티에 기인한 것으로 제안된다. 다량체 종은 더 많은 VH3 영역을 가지며 따라서 용출에 대한 보다 낮은 pH를 요구하는 단백질-A 수지에 대해 보다 강하게 결합한다.
pH 구배 용출을 통한 TrYbe®의 단백질-A 정제로부터의 분획의 G3000 SEC 분석
분획 단백질 (mg) HMWS (%) 단량체 (%)
1 3.9 2.0 97.3
2 33.9 22.1 72.0
3 0.4 91.5 6.4
실시예 8: pH 구배 용출을 통한 BYbe의 단백질-A 정제
BYbe의 CHO 발현 및 정화
상이한 가변 영역 서열을 이용하여 본질적으로 WO2013/068571의 실시예 4에 기재된 바와 같이 Fab-scFv 융합 단백질(Bybe)을 구축했다. 구축물을 안정한 디히드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 결핍 중국 햄스터 난소 세포주(CHO DG44)에서 발현시켰다. 세포를 제조자의 지시에 따라 Nuclefector(Lonza)를 사용하여 선택 마커로서 DHFR에 대한 유전자 및 생성물을 코딩하는 유전자 둘다를 함유하는 플라스미드 벡터로 형질감염시켰다. 형질감염된 세포를, 하이포크산틴 및 티미딘이 결핍된 배지에서, DHFR 억제제 메토트렉세이트의 존재하에 선택했다. 쉐이커 플라스크 단계까지 배양한 후, 증식 및 생산성을 평가하고, 24개의 최고 발현 클론을 페드-배치 진탕 플라스크 공정에서 평가하기 위해 선택하였다. 3L 진탕 플라스크에 1L의 배양물을 0.3 × 106 생세포/mL의 시작 밀도로 접종하고 5% CO2 분위기에서 36.8℃로 조절하였다. 3일째부터 12일째까지 영양소 공급물을 첨가하고 농도가 5.8g/L 아래로 떨어지면 글루코스를 볼루스 첨가물로서 첨가했다. 배양물을 14일째에, 4000 x g에서 60분간 원심분리하고 이후에 0.2㎛ 여과하여 수확하였다.
pH 구배 용출을 통한 BYbe의 단백질-A 정제
정화된 세포 배양 상청액을 Sigma 인산 완충 생리식염수(PBS) pH 7.4에서 평형화된 4.7ml HiScreen MabSelect(GE Healthcare) 컬럼에 적용했다. 컬럼을 PBS에 이어 90% 0.2M 인산나트륨/10% 시트르산, pH7.4로 세척하고 결합된 물질을 pH 7.4에서 pH 2.1의 pH 구배로 용출시켰다 (도 25 참조). 용출된 물질을 분별하고 G3000 SEC-HPLC 및 4-20% 트리스/글리신 SDS-PAGE(환원 및 비-환원)을 통해 분석했다. SEC-HPLC 분석을 이용하여 단량체 및 다량체의 %를 결정했다. BYbe 단량체는 대략 9.6분의 보유 시간을 갖는다. 이량체, 삼량체, 사량체, 및 보다 높은 차수의 구조체 모두 <9.6 분의 보유 시간을 가지며 통틀어 다량체 종 또는 HMWS로서 명명되었다. 분획의 SEC-HPLC 분석 크로마토그램에 대해 도 26을 참조하기 바란다.
pH 구배 용출을 통해 단일 피크가 관찰되었다 (도 25 참조). 용출 피크 분획은 SDS-PAGE에 의해 분석되었다 (도 27 참조). 용출 프로파일을 통해 몇 개의 밴드가 비 환원 SDS-PAGE를 통해 관찰되었다. 단량체는 98kDa 분자량 마커 가까이 이동한다. 단량체 위에서 이동하는 모든 밴드(250kDa 및 98kDa 분자량 마커 사이)는 통틀어 다량체 또는 HMWS로서 명명되었다. 비-디설파이드 결합된 중쇄 및 경쇄는 각각 50-64kDa 사이 및 30kDa 분자량 마커에서 이동한다. 분획 B9-B6(레인 6-9)은 HMWS가 거의 또는 전혀 보이지 않는 단량체로 주로 이루어졌다. pH 구배가 보다 산성이 됨에 따라 HMWS 밴드는 B5-B3 분획(레인 10-12)에서 증가/더 강렬해진다. 환원된 겔에서 모든 생성물 관련 종은 중쇄 및 경쇄로 환원된다.
용출 피크는 BYbe로서 확인되었고 대체로 84% 단량체 및 16% HMWS를 함유했다 (표 9 및 도 28 참조).
BYbe는 Fc를 결여하며 따라서 단백질-A에의 결합은 v-영역의 인간 VH3 가변 프레임워크 서브클래스로 인한 것이었다. 다량체 종의 증가된 결합은 단백질-A에 대한 이들 분자의 증가된 아비디티에 기인한 것으로 제안된다. 다량체 종은 보다 많은 VH3 영역을 가지며 따라서 용출에 대한 보다 낮은 pH를 요구하는 단백질-A 수지에 대해 보다 강하게 결합한다.
pH 구배 용출을 통한 BYbe의 단백질-A 정제로부터의 분획의 G3000 SEC 분석
분획 부피 (ml) 원심분리 (mg/ml) 단백질 (mg) HMWS (%) 단량체 (%)
B9 2.12 0.026 0.055 0.0 100.0
B8 2.14 0.103 0.220 0.0 100.0
B7 2.16 0.527 1.138 0.0 100.0
B6 2.18 2.395 5.221 0.7 99.3
B5 2.20 4.290 9.438 5.4 94.6
B4 2.22 1.886 4.187 28.8 71.2
B3 2.24 0.308 0.690 52.2 47.8
B2 2.26 0.047 0.106 40.8 59.2
평균: 16.0 84.0
SEQUENCE LISTING <110> UCB BIOPHARMA SPRL <120> METHOD FOR PROTEIN PURIFICATION <130> PF0017 WO <150> GB1506868.7 <151> 2015-04-22 <160> 38 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H1 <400> 1 Asn Tyr Gly Ile His 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H2 <400> 2 Ser Ile Ser Pro Ser Gly Gly Leu Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H3 <400> 3 Gly Gly Glu Gly Ile Phe Asp Tyr 1 5 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L1 <400> 4 Arg Ala Thr Gln Ser Ile Tyr Asn Ala Leu Ala 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L2 <400> 5 Asn Ala Asn Thr Leu His Thr 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L3 <400> 6 Gln Gln Tyr Tyr Asp Tyr Pro Leu Thr 1 5 <210> 7 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LV region of Ab A26 <400> 7 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Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr Gly Gly Glu Gly Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 9 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LC of Fab component <400> 9 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Thr Gln Ser Ile Tyr Asn Ala 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asn Ala Asn Thr Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Ala 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Ser Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Asp Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp 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480 gctgcactgg gttgcctggt gaaagactac ttcccagaac cagttaccgt gtcttggaac 540 tctggtgcac tgacctctgg tgttcacacc tttccagcag ttctccagtc ttctggtctg 600 tactccctgt ctagcgtggt taccgttccg tcttcttctc tgggtactca gacctacatc 660 tgcaacgtca accacaaacc gtccaacacc aaggtcgaca aaaaagtcga gccgaaatcc 720 tgtagtggag gtgggggctc aggtggaggc gggaccggtg gaggtggcag cgaggttcaa 780 ctgcttgagt ctggaggagg cctagtccag cctggaggga gcctgcgtct ctcttgtgca 840 gtaagcggca tcgacctgag caattacgcc atcaactggg tgagacaagc tccggggaag 900 tgtttagaat ggatcggtat aatatgggcc agtgggacga ccttttatgc tacatgggcg 960 aaaggaaggt ttacaattag ccgggacaat agcaaaaaca ccgtgtatct ccaaatgaac 1020 tccttgcgag cagaggacac ggcggtgtac tattgtgctc gcactgtccc aggttatagc 1080 actgcaccct acttcgatct gtggggacaa gggaccctgg tgactgtttc aagttaa 1137 <210> 22 <211> 1074 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain A26-645(gH5) <400> 22 gaagttcagc tggtcgagtc tggaggcggg cttgtccagc ctggagggag cctgcgtctc 60 tcttgtgcag caagcggttt cacgttcacc aactacggta tccactggat tcgtcaggca 120 ccaggtaaag gtctggaatg ggtagcctct atctctccgt ctggtggtct gacgtactac 180 cgtgactctg tcaaaggtcg tttcaccatc tctcgtgatg acgcgaaaaa ctctccgtac 240 ctgcaaatga actctctgcg tgcagaagat accgcagtgt actactgcgc tactggtggt 300 gaaggtatct tcgactactg gggtcagggt accctggtaa ctgtctcgag cgcttctaca 360 aagggcccaa gcgttttccc actggctccg tcctctaaat ccacctctgg tggtacggct 420 gcactgggtt gcctggtgaa agactacttc ccagaaccag ttaccgtgtc ttggaactct 480 ggtgcactga cctctggtgt tcacaccttt ccagcagttc tccagtcttc tggtctgtac 540 tccctgtcta gcgtggttac cgttccgtct tcttctctgg gtactcagac ctacatctgc 600 aacgtcaacc acaaaccgtc caacaccaag gtcgacaaaa aagtcgagcc gaaatcctgt 660 agtggaggtg ggggctcagg tggaggcggg accggtggag gtggcagcga ggttcaactg 720 cttgagtctg gaggaggcct agtccagcct ggagggagcc tgcgtctctc ttgtgcagta 780 agcggcatcg acctgagcaa ttacgccatc aactgggtga gacaagctcc ggggaagtgt 840 ttagaatgga tcggtataat atgggccagt gggacgacct tttatgctac atgggcgaaa 900 ggaaggttta caattagccg ggacaatagc aaaaacaccg tgtatctcca aatgaactcc 960 ttgcgagcag aggacacggc ggtgtactat tgtgctcgca ctgtcccagg ttatagcact 1020 gcaccctact tcgatctgtg gggacaaggg accctggtga ctgtttcaag ttaa 1074 <210> 23 <211> 1089 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain A26-645(gL4) including E.coli OmpA leader <400> 23 atgaaaaaga cagctatcgc aattgcagtg gcgttggctg gtttcgcgac cgttgcgcaa 60 gctgatatcc agatgaccca gagcccaagc agtctctccg ccagcgtagg cgatcgtgtg 120 actattacct gtcgtgcaac ccagagcatc tacaacgctc tggcttggta tcagcagaaa 180 ccgggtaaag cgccaaaact cctgatctac aacgcgaaca ctctgcatac tggtgttccg 240 tctcgtttct ctgcgtctgg ttctggtacg gactctactc tgaccatctc ctctctccag 300 ccggaagatt tcgcgaccta ctactgccag cagtactacg attacccact gacgtttggt 360 ggtggtacca aagttgagat caaacgtacg gttgcagctc catccgtctt catctttcca 420 ccgtctgacg aacagctcaa atctggtact gcttctgtcg tttgcctcct gaacaacttc 480 tatccgcgtg aagcgaaagt ccagtggaaa gtcgacaacg cactccagtc tggtaactct 540 caggaatctg tgaccgaaca ggactccaaa gactccacct actctctgtc tagcaccctg 600 actctgtcca aagcagacta cgagaaacac aaagtgtacg cttgcgaagt tacccatcag 660 ggtctgagct ctccggttac caaatccttt aatagagggg agtgtggtgg cggtggcagt 720 ggtggtggag gttccggagg tggcggttca gacatacaaa tgacccagag tccttcatcg 780 gtatccgcgt ccgttggcga tagggtgact attacatgtc aaagctctcc tagcgtctgg 840 agcaattttc tatcctggta tcaacagaaa ccggggaagg ctccaaaact tctgatttat 900 gaagcctcga aactcaccag tggagttccg tcaagattca gtggctctgg atcagggaca 960 gacttcacgt tgacaatcag ttcgctgcaa ccagaggact ttgcgaccta ctattgtggt 1020 ggaggttaca gtagcataag tgatacgaca tttgggtgcg gtactaaggt ggaaatcaaa 1080 cgtacctaa 1089 <210> 24 <211> 1026 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain A26-645(gL4) <400> 24 gatatccaga tgacccagag cccaagcagt ctctccgcca gcgtaggcga tcgtgtgact 60 attacctgtc gtgcaaccca gagcatctac aacgctctgg cttggtatca gcagaaaccg 120 ggtaaagcgc caaaactcct gatctacaac gcgaacactc tgcatactgg tgttccgtct 180 cgtttctctg cgtctggttc tggtacggac tctactctga ccatctcctc tctccagccg 240 gaagatttcg cgacctacta ctgccagcag tactacgatt acccactgac gtttggtggt 300 ggtaccaaag ttgagatcaa acgtacggtt gcagctccat ccgtcttcat ctttccaccg 360 tctgacgaac agctcaaatc tggtactgct tctgtcgttt gcctcctgaa caacttctat 420 ccgcgtgaag cgaaagtcca gtggaaagtc gacaacgcac tccagtctgg taactctcag 480 gaatctgtga ccgaacagga ctccaaagac tccacctact ctctgtctag caccctgact 540 ctgtccaaag cagactacga gaaacacaaa gtgtacgctt gcgaagttac ccatcagggt 600 ctgagctctc cggttaccaa atcctttaat agaggggagt gtggtggcgg tggcagtggt 660 ggtggaggtt ccggaggtgg cggttcagac atacaaatga cccagagtcc ttcatcggta 720 tccgcgtccg ttggcgatag ggtgactatt acatgtcaaa gctctcctag cgtctggagc 780 aattttctat cctggtatca acagaaaccg gggaaggctc caaaacttct gatttatgaa 840 gcctcgaaac tcaccagtgg agttccgtca agattcagtg gctctggatc agggacagac 900 ttcacgttga caatcagttc gctgcaacca gaggactttg cgacctacta ttgtggtgga 960 ggttacagta gcataagtga tacgacattt gggtgcggta ctaaggtgga aatcaaacgt 1020 acctaa 1026 <210> 25 <211> 1131 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain A26-645(gH5) including B72.3 leader sequence <400> 25 atggaatggt cctgggtctt cctgtttttc ctttctgtca caaccggggt gcacagcgag 60 gtgcagctcg tcgagtctgg aggcgggctt gtccagcctg gagggagcct gcgtctctct 120 tgtgcagcaa gcggtttcac gttcaccaac tacggtatcc actggattcg tcaggcacca 180 ggtaaaggtc tggaatgggt agcctctatc tctccgtctg gtggtctgac gtactaccgt 240 gactctgtca aaggtcgttt caccatctct cgtgatgacg cgaaaaactc tccgtacctg 300 cagatgaact ctctgcgtgc agaagatacc gcagtgtact actgcgctac tggtggtgaa 360 ggtatcttcg actactgggg tcagggtacc ctggtaactg tctcaagcgc ttctacaaag 420 ggcccatcgg tcttccccct ggcaccctcc tccaagagca cctctggggg cacagcggcc 480 ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc 540 gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg gctgtcctac agtcctctgg actctactcc 600 ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc agcttgggca cccagaccta catctgcaac 660 gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagaaag ttgagcccaa atcttgttcc 720 ggaggtggcg gttccggagg tggcggtacc ggtggcggtg gatccgaagt ccagctgctt 780 gaatccggag gcggactcgt gcagcccgga ggcagtcttc gcttgtcctg cgctgtatct 840 ggaatcgacc tgagcaatta cgccatcaac tgggtgagac aggcacctgg gaaatgcctc 900 gaatggatcg gcattatatg ggctagtggg acgacctttt atgctacatg ggcgaagggt 960 agattcacaa tctcacggga taatagtaag aacacagtgt acctgcagat gaactccctg 1020 cgagcagagg ataccgccgt ttactattgt gctcgcactg tcccaggtta tagcactgca 1080 ccctactttg atctgtgggg gcagggcact ctggtcaccg tctcgagttg a 1131 <210> 26 <211> 1074 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain A26-645(gH5) <400> 26 gaggtgcagc tcgtcgagtc tggaggcggg cttgtccagc ctggagggag cctgcgtctc 60 tcttgtgcag caagcggttt cacgttcacc aactacggta tccactggat tcgtcaggca 120 ccaggtaaag gtctggaatg ggtagcctct atctctccgt ctggtggtct gacgtactac 180 cgtgactctg tcaaaggtcg tttcaccatc tctcgtgatg acgcgaaaaa ctctccgtac 240 ctgcagatga actctctgcg tgcagaagat accgcagtgt actactgcgc tactggtggt 300 gaaggtatct tcgactactg gggtcagggt accctggtaa ctgtctcaag cgcttctaca 360 aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 420 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 480 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc tggactctac 540 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 600 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt 660 tccggaggtg gcggttccgg aggtggcggt accggtggcg gtggatccga agtccagctg 720 cttgaatccg gaggcggact cgtgcagccc ggaggcagtc ttcgcttgtc ctgcgctgta 780 tctggaatcg acctgagcaa ttacgccatc aactgggtga gacaggcacc tgggaaatgc 840 ctcgaatgga tcggcattat atgggctagt gggacgacct tttatgctac atgggcgaag 900 ggtagattca caatctcacg ggataatagt aagaacacag tgtacctgca gatgaactcc 960 ctgcgagcag aggataccgc cgtttactat tgtgctcgca ctgtcccagg ttatagcact 1020 gcaccctact ttgatctgtg ggggcagggc actctggtca ccgtctcgag ttga 1074 <210> 27 <211> 1086 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain A26-645(gL4) including B72.3 leader sequence <400> 27 atgtcagttc ccacacaggt gctgggcctg cttctgttgt ggctcaccga tgctaggtgt 60 gatatccaga tgacccagag tccaagcagt ctctccgcca gcgtaggcga tcgtgtgact 120 attacctgtc gtgcaaccca gagcatctac aacgctctgg cttggtatca gcagaaaccg 180 ggtaaagcgc caaaactcct gatctacaac gcgaacactc tgcataccgg tgttccgtct 240 cgtttctctg cgtctggttc tggtacggac tctactctga ccatctcctc tctgcagccg 300 gaagatttcg cgacctacta ctgccagcag tactacgatt acccactgac gtttggtggt 360 ggtaccaaag ttgagatcaa acgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccccca 420 tctgatgagc agttgaagtc tggcactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctac 480 cctagagagg ccaaagtcca gtggaaggtg gataacgccc ttcaatccgg aaactcccag 540 gagagtgtca ctgagcagga ctcaaaggac tccacctata gccttagcag cacactgaca 600 ctgagcaagg ctgactacga gaaacacaag gtctacgcct gcgaagtgac acatcaaggc 660 ctgagctcac ccgtgacaaa gagctttaac aggggagagt gtggtggagg tggctctggc 720 ggtggtggct ccggaggcgg aggaagcgac atccagatga cccagagccc ttcctctgta 780 agcgccagtg tcggagacag agtgactatt acctgccaaa gctccccttc agtctggtcc 840 aattttctat cctggtacca gcaaaagccc ggaaaggctc ctaaattgct gatctacgaa 900 gcaagcaaac tcaccagcgg cgtgcccagc aggttcagcg gcagtgggtc tggaactgac 960 tttaccctga caatctcctc actccagccc gaggacttcg ccacctatta ctgcggtgga 1020 ggttacagta gcataagtga tacgacattt ggatgcggca ctaaagtgga aatcaagcgt 1080 acctga 1086 <210> 28 <211> 1026 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain A26-645(gL4) <400> 28 gatatccaga tgacccagag tccaagcagt ctctccgcca gcgtaggcga tcgtgtgact 60 attacctgtc gtgcaaccca gagcatctac aacgctctgg cttggtatca gcagaaaccg 120 ggtaaagcgc caaaactcct gatctacaac gcgaacactc tgcataccgg tgttccgtct 180 cgtttctctg cgtctggttc tggtacggac tctactctga ccatctcctc tctgcagccg 240 gaagatttcg cgacctacta ctgccagcag tactacgatt acccactgac gtttggtggt 300 ggtaccaaag ttgagatcaa acgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccccca 360 tctgatgagc agttgaagtc tggcactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctac 420 cctagagagg ccaaagtcca gtggaaggtg gataacgccc ttcaatccgg aaactcccag 480 gagagtgtca ctgagcagga ctcaaaggac tccacctata gccttagcag cacactgaca 540 ctgagcaagg ctgactacga gaaacacaag gtctacgcct gcgaagtgac acatcaaggc 600 ctgagctcac ccgtgacaaa gagctttaac aggggagagt gtggtggagg tggctctggc 660 ggtggtggct ccggaggcgg aggaagcgac atccagatga cccagagccc ttcctctgta 720 agcgccagtg tcggagacag agtgactatt acctgccaaa gctccccttc agtctggtcc 780 aattttctat cctggtacca gcaaaagccc ggaaaggctc ctaaattgct gatctacgaa 840 gcaagcaaac tcaccagcgg cgtgcccagc aggttcagcg gcagtgggtc tggaactgac 900 tttaccctga caatctcctc actccagccc gaggacttcg ccacctatta ctgcggtgga 960 ggttacagta gcataagtga tacgacattt ggatgcggca ctaaagtgga aatcaagcgt 1020 acctga 1026 <210> 29 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain variable domain of anti-albumin antibody (no ds) <400> 29 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Asn Tyr 20 25 30 Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ile Ile Trp Ala Ser Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Thr Trp Ala Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Thr 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Gly Ala Cys Ala Cys Thr Gly Cys 260 265 270 Gly Gly Thr Thr Thr Ala Cys Thr Ala Thr Thr Gly Cys Gly Cys Gly 275 280 285 Cys Gly Thr Ala Cys Cys Gly Thr Thr Cys Cys Gly Gly Gly Cys Thr 290 295 300 Ala Thr Thr Cys Thr Ala Cys Thr Gly Cys Ala Cys Cys Gly Thr Ala 305 310 315 320 Cys Thr Thr Cys Gly Ala Cys Cys Thr Gly Thr Gly Gly Gly Gly Thr 325 330 335 Cys Ala Gly Gly Gly Thr Ala Cys Thr Cys Thr Gly Gly Thr Thr Ala 340 345 350 Cys Cys Gly Thr Cys Thr Cys Gly Ala Gly Thr Gly Gly Ala Gly Gly 355 360 365 Thr Gly Gly Cys Gly Gly Thr Thr Cys Thr Gly Gly Cys Gly Gly Thr 370 375 380 Gly Gly Cys Gly Gly Thr Thr Cys Cys Gly Gly Thr Gly Gly Cys Gly 385 390 395 400 Gly Thr Gly Gly Ala Thr Cys Gly Gly Gly Ala Gly Gly Thr Gly Gly 405 410 415 Cys Gly Gly Thr Thr Cys Thr Gly Ala Thr Ala Thr Cys Cys Ala Gly 420 425 430 Ala Thr Gly Ala Cys Cys Cys Ala Gly Ala Gly Thr Cys Cys Ala Ala 435 440 445 Gly Cys Ala Gly Thr Gly Thr Thr Thr Cys Cys Gly Cys Cys Ala Gly 450 455 460 Cys Gly Thr Ala Gly Gly Cys Gly Ala Thr Cys Gly Thr Gly Thr Gly 465 470 475 480 Ala Cys Thr Ala Thr Thr Ala Cys Cys Thr Gly Thr Cys Ala Gly Thr 485 490 495 Cys Cys Thr Cys Thr Cys Cys Gly Ala Gly Cys Gly Thr Thr Thr Gly 500 505 510 Gly Thr Cys Cys Ala Ala Cys Thr Thr Cys Cys Thr Gly Ala Gly Cys 515 520 525 Thr Gly Gly Thr Ala Cys Cys Ala Gly Cys Ala Gly Ala Ala Ala Cys 530 535 540 Cys Gly Gly Gly Thr Ala Ala Ala Gly Cys Cys Cys Cys Gly Ala Ala 545 550 555 560 Ala Cys Thr Gly Cys Thr Gly Ala Thr Cys Thr Ala Cys Gly Ala Gly 565 570 575 Gly Cys Gly Thr Cys Thr Ala Ala Ala Cys Thr Gly Ala Cys Cys Thr 580 585 590 Cys Thr Gly Gly Thr Gly Thr Ala Cys Cys Gly Thr Cys Cys Cys Gly 595 600 605 Thr Thr Thr Cys Thr Cys Thr Gly Gly Cys Thr Cys Thr Gly Gly Cys 610 615 620 Thr Cys Thr Gly Gly Thr Ala Cys Gly Gly Ala Cys Thr Thr Cys Ala 625 630 635 640 Cys Thr Cys Thr Gly Ala Cys Cys Ala Thr Cys Thr Cys Cys Thr Cys 645 650 655 Thr Cys Thr Gly Cys Ala Gly Cys Cys Gly Gly Ala Ala Gly Ala Cys 660 665 670 Thr Thr Thr Gly Cys Ala Ala Cys Gly Thr Ala Cys Thr Ala Cys Thr 675 680 685 Gly Cys Gly Gly Thr Gly Gly Thr Gly Gly Thr Thr Ala Cys Thr Cys 690 695 700 Thr Thr Cys Cys Ala Thr Cys Thr Cys Thr Gly Ala Cys Ala Cys Cys 705 710 715 720 Ala Cys Gly Thr Thr Cys Gly Gly Thr Thr Gly Thr Gly Gly Cys Ala 725 730 735 Cys Cys Ala Ala Ala Gly Thr Thr Gly Ala Ala Ala Thr Cys Ala Ala 740 745 750 Ala Cys Gly Thr Ala Cys Gly Cys Ala Thr Cys Ala Cys Cys Ala Thr 755 760 765 Cys Ala Cys Cys Ala Thr Cys Ala Cys Cys Ala Thr Cys Ala Cys Cys 770 775 780 Ala Thr Cys Ala Cys 785 <210> 38 <211> 263 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 645 gH5gL4ds specific to albumin <400> 38 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Asn Tyr 20 25 30 Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ile Ile Trp Ala Ser Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Thr Trp Ala Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Thr Val Pro Gly Tyr Ser Thr Ala Pro Tyr Phe Asp Leu Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln 130 135 140 Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val 145 150 155 160 Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Pro Ser Val Trp Ser Asn Phe Leu Ser 165 170 175 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Glu 180 185 190 Ala Ser Lys Leu Thr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly 195 200 205 Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp 210 215 220 Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gly Gly Tyr Ser Ser Ile Ser Asp Thr 225 230 235 240 Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr His His His 245 250 255 His His His His His His His 260

Claims (13)

  1. 단량체 형태의 인간 VH3 도메인 함유 항체를 다량체 형태의 항체로부터 분리하는 방법으로서,
    a) 단량체 및 다량체 형태의 인간 VH3 도메인 함유 항체를 포함하는 혼합물을, 단백질 A가 도메인 D 및/또는 E를 포함하는 단백질 A 크로마토그래피 재료에 적용하는 단계,
    b) 상기 항체의 단백질 A에의 결합을 허용하는 단계,
    c) 단량체 형태의 항체의 결합을 선택적으로 방해하는 용출 완충제를 적용하는 단계,
    d) 얻어진 용출액을 회수하는 단계, 및 경우에 따라
    e) 다량체 형태의 항체의 결합을 방해하는 제2 용출 완충제를 적용하고 이 제2 용출액을 회수하는 단계
    를 포함하고, 인간 VH3 도메인 함유 항체는 적어도 2개의 인간 VH3 도메인을 포함하되, Fc 영역을 함유하지 않는, 단량체 형태의 인간 VH3 도메인 함유 항체를 다량체 형태의 항체로부터 분리하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 결합하지 않은 물질이 제1 용액에서 제거되도록, 단량체 및 다량체 형태의 인간 VH3 도메인 함유 항체를 포함하는 혼합물을 적용한 후에 제1 용액을 단백질 A 크로마토그래피 재료에 첨가하는 것인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 단백질 A 크로마토그래피로부터 회수되는 용출액은 적용된 혼합물과 관련하여 다량체 항체보다 단량체 항체가 풍부한 것인 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 단백질 A는 천연 재조합 단백질 A인 방법.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, VH3 도메인 함유 항체가 F(ab')2, scFv, Fab-Fv, Fab-scFv, Fab-(scFv)2, Fab-(Fv)2, Fab-dsFv, 디아바디, 트리아바디, 및 테트라바디에서 선택되는 것인 방법.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 하나의 VH3 도메인이 서열번호 11에서 정의된 중쇄 가변 도메인과 서열번호 12에서 정의된 경쇄 가변 도메인을 포함하는 것인 방법.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, VH3 도메인 함유 항체가 OX40에 특이적으로 결합하는 것인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 VH3 도메인 함유 항체가
    - 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3에서 각각 정의된 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3; 및
    - 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6에서 각각 정의된 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3
    을 포함하는 것인 방법.
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
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