JP6866300B2

JP6866300B2 - タンパク質精製の方法

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Publication number: JP6866300B2
Application number: JP2017555232A
Authority: JP
Inventors: フィリップヘイウッド、サム; バリーワイルド、ギャヴィン
Original assignee: ユーシービーバイオファルマエスアールエル
Priority date: 2015-04-22
Filing date: 2016-04-20
Publication date: 2021-04-28
Anticipated expiration: 2036-04-20
Also published as: CL2017002614A1; EP3286205A1; BR112017022073A2; KR20170139131A; IL254883B; JP2018520089A; JP2021066734A; GB201506868D0; US10927164B2; US20180100007A1; CN107636012B; AR104358A1; US20210171609A1; MY189854A; AU2016251223A1; CN107636012A; WO2016169992A1; AU2016251223B2; IL254883A0; EA201792328A1

Description

本発明は、タンパク質精製の分野、より具体的には抗体精製の分野におけるものである。

治療法の分野において、タンパク質並びに抗体及び抗体由来分子の使用は、特に存在感及び重要性が益々増加してきており、結果として、それと同時に管理された製造プロセスの必要性が生じてきた。治療用タンパク質の商業化には、その大量生産が必要とされる。この目的のためには、タンパク質を宿主細胞において頻繁に発現させ、その後、投与可能な形態に調製する前に回収し、精製しなければならない。

抗体分子の最も一般的なクラスは、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）であり、２本の重鎖及び２本の軽鎖で構成されるヘテロ四量体である。ＩｇＧ分子は、２つの機能的サブユニット：（１）抗体の尾部を構成し、細胞表面受容体と相互作用して免疫応答を活性化する結晶化可能な断片（Ｆｃ）、及び（２）抗原認識を媒介する抗原結合断片（Ｆａｂ）に細分することができる。Ｆｃ領域は、２つの対合している重鎖由来の定常ドメイン（ＣＨ２及びＣＨ３）を２対含むが、Ｆａｂ領域は、可変ドメインとそれに続く重鎖由来の定常ドメイン（それぞれＶＨ及びＣＨ１）からなり、それらは、軽鎖由来の可変及び定常ドメイン（それぞれＶＬ及びＣＬ）と対合する。Ｆｃ及びＦａｂ領域は、ヒンジ領域により線引きされ、その領域は、２本の鎖を結びつけるジスルフィド結合を含有する。ＩｇＧクラスの全長抗体は、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）から得られるプロテインＡを使用する親和性クロマトグラフィーの捕捉工程を含む方法を使用して伝統的に精製されてきた。プロテインＡと抗体のＦｃ領域との結合の特異性が高いため、クロマトグラフィーのこのモードは、細胞培養採集培地などの複合溶液から直接開始する単一の工程で９８％より多くの不純物を除去することができる。このプロセス工程から得られる大きな精製率は、下流の精製プロセス全ての簡素化に役立つ。一般に、この精製工程後にはごく微量の夾雑物（高分子量集塊、残留宿主細胞タンパク質、浸出したプロテインＡ）のみが除去されずに残り、精製は、その後１〜２回のクロマトグラフィー工程で通常実現し得る。

更に、プロテインＡを結合する「代替の結合」部位が、ヒト重鎖可変領域の特異的フレームワークサブグループ３を含有する抗体において記述されておりＳａｓｓｏらＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ１９９１年、１４７：１８７７〜１８８３頁、「ブドウ球菌プロテインＡに結合するヒトＩｇＡ及びＩｇＧＦ（ａｂ’）２は、ＶＨＩＩＩサブグループに属する（ＨｕｍａｎＩｇＡａｎｄＩｇＧＦ（ａｂ’）２ｔｈａｔ、ｂｉｎｄｔｏｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌｐｒｏｔｅｉｎＡｂｅｌｏｎｇｔｏｔｈｅＶＨＩＩＩｓｕｂｇｒｏｕｐ）」、可変重鎖ドメインＶＨ３とも呼ばれ、しばしば二次相互作用として分類されてきた。プロテインＡの５つ全てのドメイン（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ）がＩｇＧに、そのＦｃ領域を介して結合するが、ドメインＤ及びＥだけが有意なＶＨ３結合を呈する。プロテインＡ親和性クロマトグラフィーを使用する、即ちＩｇＧのＦｃドメインとプロテインＡとの相互作用に基づくＩｇＧ精製の文脈において、これらＶＨ３ドメインとプロテインＡとの相互作用は、精製しようとする抗体の溶出プロファイルに影響を及ぼすならば、好ましくないと考えられており、ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ製ＳｕＲｅ（登録商標）などプロテインＡのドメインＢだけを含有する別の樹脂が開発され、市販されている。

しかしながら、現在利用可能な並びに／又は開発中の抗体及び抗体由来分子の多くはＦｃ領域を含有しておらず、その精製方法を更に修正する必要がある。ＶＨ３領域によるプロテインＡの上記結合のため、そのような抗体の製造にプロテインＡを使用できる可能性がある。

抗体精製の特別な要件は、単量体形態である所望の抗体若しくは抗体由来分子を回収すること、又は二量体及び三量体などより高分子量の種が本質的に存在しないことである。

特定の抗体分子は、可変ドメインと隣接する分子内の可変ドメインとの無差別対合の結果得られる多量体を形成する傾向がより高い。特にこれは、対象とする異なるドメイン間にリンカー領域を使用するより複雑な抗体由来分子に当てはまる。

従って、特に分子がＦｃ領域を含有しない単量体形態の抗体及び抗体由来分子を製造し、精製する更なる方法の必要性が当業者に残されている。

ｐＨ勾配溶出によるプロテインＡ樹脂からのＡ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖの溶出プロファイルを示しているクロマトグラムである。ＳＥＣ−ＨＰＬＣにより分析した、図１に表されるクロマトグラフィーの結果得られる画分のそれぞれに存在する合計タンパク質、単量体及び多量体Ａ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖの量を示す図である。ｐＨ勾配溶出によるプロテインＡ樹脂からのＦｃ構築物の溶出プロファイルを示しているクロマトグラムである。ＳＥＣ−ＨＰＬＣにより分析した、図３に表されるクロマトグラフィーの結果得られる画分のそれぞれに存在する合計タンパク質、単量体及び多量体形態の量を示す図である。ｐＨ段階溶出によるプロテインＡ樹脂からのＡ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖの溶出プロファイルを示しているクロマトグラムである。図５に表されるプロテインＡクロマトグラフィーの結果得られる画分のＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析を示す図である。点線は、ｐＨ３．８で溶出された画分の分析を表し、実線は、ｐＨ３．０で溶出された画分の分析を表す。図５に表されるｐＨ段階溶出によりＡ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖのプロテインＡクロマトグラフィーから回収した画分の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。レーン１は、分子量マーカーを示し、レーン２は、プロテインＡクロマトグラフィーにロードした、清澄な細胞培養上清のサンプルを示し、レーン３は、プロテインＡクロマトグラフィーから回収したフロースルー画分を示し、レーン４は、ｐＨ３．８での溶出後に回収した画分、及びレーン５は、ｐＨ３．０での溶出後に回収した画分である。図５に表されるｐＨ段階溶出によりＡ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖのプロテインＡクロマトグラフィーから回収した画分の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。レーン１は、分子量マーカーを示し、レーン２は、プロテインＡクロマトグラフィーにロードした、清澄な細胞培養上清のサンプルを示し、レーン３は、プロテインＡクロマトグラフィーから回収したフロースルー画分を示し、レーン４は、ｐＨ３．８での溶出後に回収した画分、及びレーン５は、ｐＨ３．０での溶出後に回収した画分である。例４に記載の勾配溶出によりＡ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖのプロテインＡクロマトグラフィーから回収した画分のＳＥＣ−ＵＰＬＣ分析を示す図であり、合計タンパク質、単量体及び多量体Ａ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖの量を示す図である。例５に記載の勾配溶出によりＡ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖのプロテインＡクロマトグラフィーから回収した画分のＳＥＣ−ＵＰＬＣ分析を示す図であり、合計タンパク質、単量体及び多量体Ａ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖの量を示す図である。例６に記載の勾配溶出によりＡ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖのプロテインＡクロマトグラフィーから回収した画分のＳＥＣ−ＵＰＬＣ分析を示す図であり、合計タンパク質、単量体及び多量体Ａ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖの量を示す図である。単量体Ｆａｂ−ｄｓＦｖ及びＦａｂ−ｄｓＦｖの多量体バージョン、並びにその基本的な構成要素であるＦａｂ及びｄｓＦｖの概略図である。この図解は、考え得る単量体、二量体及び三量体を例示している。しかしながら、二量体及び三量体が環状構造を形成する場合、全てのリンカーは、実際には同じ長さになる。様々な抗体分子配列及びその構成要素を示す図である。様々な抗体分子配列及びその構成要素を示す図である。様々な抗体分子配列及びその構成要素を示す図である。様々な抗体分子配列及びその構成要素を示す図である。様々な抗体分子配列及びその構成要素を示す図である。様々な抗体分子配列及びその構成要素を示す図である。様々な抗体分子配列及びその構成要素を示す図である。様々な抗体分子配列及びその構成要素を示す図である。様々な抗体分子配列及びその構成要素を示す図である。ｐＨ勾配溶出によるプロテインＡ樹脂からのＴｒＹｂｅの溶出プロファイルを示しているクロマトグラムを示す図である。図２１に表されるプロテインＡクロマトグラフィーの結果得られる画分のＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析を示す図である。図２３Ａは、図２１に表されるｐＨ勾配溶出によりＴｒＹｂｅのプロテインＡクロマトグラフィーから回収した画分の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。図２３Ｂは、図２１に表されるｐＨ勾配溶出によりＴｒＹｂｅのプロテインＡクロマトグラフィーから回収した画分の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。ＳＥＣ−ＨＰＬＣにより分析した、図２１に表されるクロマトグラフィーの結果得られる画分のそれぞれに存在する合計タンパク質、単量体及び多量体ＴｒＹｂｅの量を示す図である。ｐＨ勾配溶出によるプロテインＡ樹脂からのＢＹｂｅの溶出プロファイルを示しているクロマトグラムを示す図である。図２５に表されるプロテインＡクロマトグラフィーの結果得られる画分のＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析を示す図である。図２７Ａは、図２５に表されるｐＨ勾配溶出によりＢＹｂｅのプロテインＡクロマトグラフィーから回収した画分の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。図２７Ｂは、図２５に表されるｐＨ勾配溶出によりＢＹｂｅのプロテインＡクロマトグラフィーから回収した画分の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。ＳＥＣ−ＨＰＬＣにより分析した、図２５に表されるクロマトグラフィーの結果得られる画分のそれぞれに存在する合計タンパク質、単量体及び多量体ＢＹｂｅの量を示す図である。本発明の方法による精製の影響を受けやすい別の単量体Ｆａｂ−ｓｃＦｖ形式の概略図である。本発明の方法による精製の影響を受けやすい別の単量体Ｆａｂ−２ｘｄｓｓｃＦｖ（ＴｒＹｂｅ［登録商標］）及びＦａｂ−ｄｓｓｃＦｖ−ｄｓＦｖ形式の概略図である。

本発明は、単量体形態のヒトＶＨ３ドメイン含有抗体を回収するための新たな方法を提供することにより上で判明した必要性を解決する。ヒトＶＨ３ドメインとプロテインＡの結合の間で結合活性効果が今や観察された。この効果は、Ｆｃ領域とプロテインＡとの相互作用について記述されておらず、この効果により、抗体の単量体及び多量体形態を含有する混合物からの単量体ヒトＶＨ３ドメイン含有抗体の回収を可能にする新たな方法の開発に至ったことを思えば、この発見は驚くべきものである。

第１の実施形態において、本発明は、単量体形態のヒトＶＨ３ドメイン含有抗体を得るための方法であって、方法が、
ａ）抗体がプロテインＡに結合できる条件下で、プロテインＡがドメインＤ及び／又はＥを含むプロテインＡクロマトグラフィー物質に、単量体及び多量体形態のヒトＶＨ３ドメイン含有抗体を含む混合物を適用する工程と、
ｂ）単量体形態のヒトＶＨ３ドメイン含有抗体を回収する工程と
を含み、ヒトＶＨ３ドメイン含有抗体がＦｃ領域を含有しない、上記方法に関する。

第２の別の実施形態において、本発明は、ヒトＶＨ３ドメイン含有抗体を製造するための方法あって、方法が、
ａ）宿主細胞において抗体を発現させる工程と、
ｂ）抗体、宿主細胞及び他の夾雑物を含有する混合物を回収する工程と、
ｃ）プロテインＡがドメインＤ及び／又はＥを含む少なくとも１つのプロテインＡクロマトグラフィー工程を使用して抗体を精製する工程と、
ｄ）ヒトＶＨ３ドメイン含有抗体を回収する工程と
を含み、ヒトＶＨ３ドメイン含有抗体がＦｃ領域を含有しない、上記方法に関する。

第３の別の実施形態において、本発明は、多量体形態の抗体から単量体形態のヒトＶＨ３ドメイン含有抗体を分離する方法であって、方法が、
ａ）プロテインＡがドメインＤ及び／又はＥを含むプロテインＡクロマトグラフィー物質に、単量体及び多量体形態のヒトＶＨ３ドメイン含有抗体を含む混合物を適用する工程と、
ｂ）前記抗体をプロテインＡに結合させる工程と、
ｃ）単量体形態の抗体の結合を選択的に破壊する溶出緩衝液を適用する工程と、
ｄ）得られた溶出液を回収する工程と、任意選択で、
ｅ）多量体形態の抗体の結合を破壊する第２の溶出緩衝液を適用し、この第２の溶出液を回収する工程と
を含み、ヒトＶＨ３ドメイン含有抗体がＦｃ領域を含有しない、上記方法に関する。

第４の別の実施形態において、本発明は、多量体形態の抗体から単量体形態のヒトＶＨ３ドメイン含有抗体を分離する方法であって、方法が、
ａ）プロテインＡがドメインＤ及び／又はＥを含むプロテインＡクロマトグラフィー物質に、単量体及び多量体形態のヒトＶＨ３ドメイン含有抗体を含む混合物を適用する工程と、
ｂ）多量体形態の抗体を結合させる工程と、
ｃ）フロースルーにおいて単量体形態の抗体を回収する工程と、任意選択で
ｄ）多量体形態の抗体の結合を選択的に破壊する溶出緩衝液を適用する工程と、
ｅ）ｄ）の結果得られる溶出液を回収する工程と
を含み、ヒトＶＨ３ドメイン含有抗体がＦｃ領域を含有しない、上記方法に関する。

更なる実施形態において、本発明の方法は、残存している不純物を除去するために１つ又は複数の別のクロマトグラフィー工程を更に含むことになる。一般にそのような工程は、ゲルろ過クロマトグラフィー、陽イオンクロマトグラフィー、陰イオンクロマトグラフィー、ミックスモードクロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー及び疎水性電荷誘導クロマトグラフィー用として適当な官能性を持つ固相を使用する非親和性クロマトグラフィー工程を利用することになる。これらは、結合及び溶出モード又はフロースルーモードで操作することができる。フロースルーモードにおいて、標的タンパク質は溶出液又はフロースルー中に回収されるが、不純物は固相に結合する又は固相中での移動度が減少する。適当な官能性を持つビーズ樹脂又は膜などクロマトグラフィー用として適当な固相は、当業者にとって容易に利用できる。本発明の方法による特定の実施形態において、方法は、フロースルーモードで操作される陰イオン交換クロマトグラフィーの工程を更に含む。

更なる特定の実施形態において、本発明の方法は、プロテインＡクロマトグラフィー工程とそれに続くタンパク質を含有するフロースルーを産生する陰イオン交換クロマトグラフィーである第１のクロマトグラフィー工程及びタンパク質を含有する溶出液が回収される陽イオン交換クロマトグラフィーである第２のクロマトグラフィー工程を含む。

別法として、本発明の方法は、プロテインＡクロマトグラフィーとそれに続くタンパク質を含有する溶出液を回収する陽イオン交換クロマトグラフィーである第１のクロマトグラフィー工程及びタンパク質を含有するフロースルーを産生する陰イオン交換クロマトグラフィーである第２のクロマトグラフィー工程を含む。

一般に、プロテインＡクロマトグラフィーは、結合及び溶出モードで実行され、固相への対象とするタンパク質の結合により対象とするタンパク質は固相に結合したまま残り、混在タンパク質などの不純物はクロマトグラフィー媒体を通過することができる。次いで、結合している対象とするタンパク質は、対象とするタンパク質が前記固相に結合する機構を破壊する溶出緩衝液により固相から回収される。

更なる実施形態において、本発明の方法は、溶液中において結合していない物質が除去されるように、単量体及び多量体形態のヒトＶＨ３ドメイン含有抗体を含む混合物を適用した後に第１の溶液がプロテインＡクロマトグラフィー物質に添加される工程を含む。

本発明による方法の更なる実施形態において、結合している抗体が遊離するように溶出緩衝液がプロテインＡクロマトグラフィー物質に適用される。

本発明による方法の更なる実施形態において、プロテインＡクロマトグラフィーから回収された溶出液は、適用した混合物に対して多量体抗体よりも単量体抗体が濃縮されている。

本文脈において、プロテインＡクロマトグラフィーから回収された溶出液が、プロテインＡクロマトグラフィー工程前の混合物に対してより高いパーセンテージで単量体形態の抗体を含有するタンパク質内容物を有することは、当業者には理解されよう。

特定の実施形態において、プロテインＡクロマトグラフィーから回収される溶出液は、単量体形態のヒトＶＨ３ドメイン含有抗体を少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、又は少なくとも９０％含む。

更なる別の実施形態において、多量体形態の抗体を回収しようとする場合、プロテインＡクロマトグラフィーからの溶出液は、プロテインＡクロマトグラフィー工程前の混合物に対してより高いパーセンテージで多量体形態の抗体を含有するタンパク質内容物を有する。特定の実施形態において、プロテインＡクロマトグラフィーから回収される溶出液は、多量体形態のヒトＶＨ３ドメイン含有抗体を少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、又は少なくとも９０％含む。

本発明による方法の更なる実施形態において、前記プロテインＡは、天然の組換えプロテインＡである。

例えばＭａｂＳｅｌｅｃｔ（登録商標）（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ａｂｓｏｌｕｔｅ（登録商標）（Ｎｏｖａｓｅｐ）、ＣａｐｔｉｖＡ（登録商標）（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ）、又はＡｍｓｐｈｅｒｅ（登録商標）（ＪＳＲ）など前記天然の組換えプロテインＡを含有する当業者に利用可能なクロマトグラフィー物質が多く存在する。

本発明の方法の特定の実施形態において、結合している抗体は、抗体結合を破壊するのに適当なｐＨの溶出緩衝液を適用することにより、プロテインＡクロマトグラフィー物質から遊離する。前記ｐＨは、特定の分子によって決まり、一般に当業者により経験的に決定され、所望の終点を実現するように調整される、即ち、適用した混合物から可能な限り最大量の単量体を回収することが望ましい場合があり、又は可能な限り最高純度で単量体を得ることが望まれる場合もある。本発明の方法の特定の実施形態において、溶出緩衝液は、ｐＨ３．０〜ｐＨ４．５、好ましくはｐＨ３．２〜ｐＨ４．３、ｐＨ３．５〜ｐＨ４、好ましくはｐＨ３．６〜ｐＨ３．９、又はｐＨ３．８を有する。

プロテインＡクロマトグラフィーにおいて洗浄及び溶出緩衝液用として適当な緩衝液は、当技術分野においては容易に利用でき、非限定的な例としてリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、Ｔｒｉｓ、ヒスチジン、酢酸、クエン酸緩衝液、又はＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸イミダゾール）、ＢＥＳ（Ｎ，Ｎ−（ビス−２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸）、ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モルホリノ）−プロパンスルホン酸）、若しくはＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸）緩衝液の中から選ぶことができる。

特定の実施形態において、本発明の方法は、抗体がプロテインＡに結合できる条件下で、プロテインＡがドメインＤ及び／又はＥを含むプロテインＡクロマトグラフィー物質に、単量体及び多量体形態のヒトＶＨ３ドメイン含有抗体を含む混合物を適用する工程と、溶液中において結合していない物質が除去されるように第１の溶液又は洗浄緩衝液を適用する工程と、結合している抗体が遊離するようにプロテインＡクロマトグラフィー物質に溶出緩衝液を適用する工程と、単量体形態のヒトＶＨ３ドメイン含有抗体を回収する工程とを含み、回収した溶液は、適用した混合物に対して単量体形態のＶＨ３ドメイン含有抗体に濃縮されており、ヒトＶＨ３ドメイン含有抗体はＦｃ領域を含有しない。

更に特定の実施形態において、本発明の方法は、抗体がプロテインＡに結合できる条件下で、プロテインＡがドメインＤ及び／又はＥを含むプロテインＡクロマトグラフィー物質に、単量体及び多量体形態のヒトＶＨ３ドメイン含有抗体を含む混合物を適用する工程と、溶液中において結合していない物質が除去されるように第１の溶液又は洗浄緩衝液を適用する工程と、単量体形態で結合している抗体が遊離するようにプロテインＡクロマトグラフィー物質に溶出緩衝液を適用する工程と、単量体形態のヒトＶＨ３ドメイン含有抗体を回収する工程とを含み、回収した溶液は、適用した混合物に対して単量体形態のＶＨ３ドメイン含有抗体に濃縮されており、ヒトＶＨ３ドメイン含有抗体はＦｃ領域を含有しない。

本発明による更なる実施形態において、ＶＨ３ドメイン含有抗体は、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ−Ｆｖ、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ、Ｆａｂ−（ｓｃＦｖ）_２、Ｆａｂ−（Ｆｖ）_２、ダイアボディ、トリアボディ及びテトラボディから選択される。

本発明による方法の更なる実施形態において、ＶＨ３ドメイン含有抗体は、ヒトＶＨ３ドメインを少なくとも２つ含む。

本発明による方法の更なる実施形態において、ヒトＶＨ３ドメイン含有抗体は、ＯＸ４０に特異的に結合する。

本発明の方法の一実施形態において、抗体は、ＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０７４４０９に開示されているＦａｂＦｖ又はそのジスルフィド安定化形態であり、参照により本明細書に組み込む。

一実施形態において、抗体は、ヒト血清アルブミンに特異的な結合ドメイン、特にＷＯ２０１３／０６８５６３に開示されているＣＤＲ又は可変領域を含み、参照により本明細書に組み込む。

本発明の方法の更なる実施形態において、前記ヒトＶＨ３ドメイン含有抗体は、
−配列番号１、配列番号２及び配列番号３でそれぞれ定義される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３；並びに
−配列番号４、配列番号５及び配列番号６でそれぞれ定義される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む。

本発明による方法の更なる特定の実施形態において、抗体は、ＷＯ２０１３／０６８５６３に定義されている通りＯＸ４０に特異的に結合するＦａｂ部及び血清アルブミンを特異的に結合するＦｖ部を含むＡ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖであり、両方の部分がジスルフィド結合によって安定化されており、参照により本明細書に組み込む。

更に特定の実施形態において、本発明の方法は、抗体がプロテインＡに結合できる条件下で、プロテインＡがドメインＤ及び／又はＥを含むプロテインＡクロマトグラフィー物質に、単量体及び多量体形態のＡ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖを含む混合物を適用する工程と、溶液中において結合していない物質が除去されるように第１の溶液又は洗浄緩衝液を適用する工程と、単量体形態で結合している抗体が遊離するようにプロテインＡクロマトグラフィー物質に溶出緩衝液を適用する工程と、単量体形態のＡ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖを回収する工程とを含み、回収した溶液は、適用した混合物に対して単量体形態のＡ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖに濃縮されており、溶出緩衝液は、ｐＨ３．５〜ｐＨ４．２、好ましくは、ｐＨ３．６〜ｐＨ４．１、ｐＨ３．７〜ｐＨ４．０、好ましくはｐＨ３．８〜ｐＨ３．９又はｐＨ３．８を有する。

更なる特定の実施形態において、本発明の方法は、プロテインＡクロマトグラフィー物質に第２の溶出緩衝液を適用して、多量体形態で結合しているＡ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖを回収する工程を更に含み、前記第２の溶出緩衝液は、ｐＨ３．５未満、好ましくはｐＨ３．４未満、好ましくはｐＨ２．８〜ｐＨ３．２、好ましくはｐＨ２．９〜ｐＨ３．１、好ましくはｐＨ３．０を有する。

従って、本開示は、Ｎ末端から順に、第１の重鎖可変ドメイン（ＶＨ＃１）、ＣＨ１ドメイン及び第２の重鎖可変ドメイン（ＶＨ＃２）を含む重鎖、Ｎ末端から順に、第１の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ＃１）、ＣＬドメイン及び第２の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ＃２）を含む軽鎖を含むヒトＯＸ４０並びにヒト血清アルブミンに結合する二重特異性抗体融合タンパク質を提供し、前記重及び軽鎖は、ＶＨ＃１及びＶＬ＃１が第１の抗原結合部位を形成し、ＶＨ＃２及びＶＬ＃２が第２の抗原結合部位を形成するように整列されており、第１の抗原結合部位が結合する抗原がヒトＯＸ４０であり、第２の抗原結合部位が結合する抗原がヒト血清アルブミンであり、特に、重鎖の第１の可変ドメイン（ＶＨ＃１）が、ＣＤＲ−Ｈ１に対する配列番号１に与えられる配列、ＣＤＲ−Ｈ２に対する配列番号２に与えられる配列及びＣＤＲ−Ｈ３に対する配列番号３に与えられる配列を含み、並びに軽鎖の第１の可変ドメイン（ＶＬ＃１）が、ＣＤＲ−Ｌ１に対する配列番号４に与えられる配列、ＣＤＲ−Ｌ２に対する配列番号５に与えられる配列及びＣＤＲ−Ｌ３に対する配列番号６に与えられる配列を含み、第２の重鎖可変ドメイン（ＶＨ＃２）が、配列番号１１に与えられる配列を有し、第２の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ＃２）が、配列番号１２に与えられる配列を有し、第２の重鎖可変ドメイン（ＶＨ＃２）及び第２の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ＃２）がジスルフィド結合により接続されている。

一実施形態において、ＣＨ１ドメインと第２の重鎖可変ドメイン（ＶＨ＃２）の間にペプチドリンカーが存在する。一実施形態において、ＣＬドメインと第２の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ＃１）の間にペプチドリンカーが存在する。一実施形態において、第１の重鎖可変ドメイン（ＶＨ＃１）は、配列番号８に与えられる配列を含む。一実施形態において、第１の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ＃１）は、配列番号７に与えられる配列を含む。一実施形態において、重鎖は、配列番号１５に与えられる配列を含む又はそれからなる。一実施形態において、軽鎖は、配列番号１６に与えられる配列を含む又はそれからなる。

従って一実施形態において、ヒトＯＸ４０及びヒト血清アルブミンに結合し、配列番号１５に与えられる配列を含む重鎖、及び配列番号１６に与えられる配列を含む軽鎖を有する二重特異性抗体融合タンパク質が提供される。

一実施形態において、Ｆａｂ−ｄｓＦｖ形式などの抗体分子は、ＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０７４４０９又はＷＯ２０１４／０１９７２７に開示される１つであり、参照により本明細書に組み込む。

別の実施形態において、抗体分子は、ＷＯ２０１３／０６８５７１に開示されるＦａｂ−ｓｃＦｖ融合タンパク質形式であり、参照により本明細書に組み込む。

別の実施形態において、抗体分子は、
ａ）式（Ｉ）のポリペプチド鎖：
ＶＨ−ＣＨ１−Ｘ−Ｖ１；及び
ｂ）式（ＩＩ）のポリペプチド鎖：
ＶＬ−ＣＬ−Ｙ−Ｖ２；
を含む又はそれからなる多重特異性抗体分子であり、
式中、
ＶＨは、重鎖可変ドメインを表し；
ＣＨ１は、重鎖定常領域のドメイン、例えばそのドメイン１を表し；
Ｘは、結合又はリンカーを表し；
Ｙは、結合又はリンカーを表し；
Ｖ１は、ｄｓＦｖ、ｓｄＡｂ、ｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖを表し；
ＶＬは、軽鎖可変ドメインを表し；
ＣＬは、Ｃκなどの軽鎖定常領域由来のドメインを表し；
Ｖ２は、ｄｓＦｖ、ｓｄＡｂ、ｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖを表し；
Ｖ１又はＶ２のうちの少なくとも１つがｄｓＦｖ若しくはｄｓｓｃＦｖであり、ＷＯ２０１５／１９７７７２に記述されており、参照により本明細書に組み込む。

特定の一実施形態において、抗体分子は、ＷＯ２０１５／１９７７７２に記述される形式Ｆａｂ−２ｘｄｓｓｃＦｖの多重特異性抗体分子であり、参照により本明細書に組み込む。

更なる特定の実施形態において、形式Ｆａｂ−２ｘｄｓｓｃＦｖの多重特異性抗体分子は、三価抗体であり、即ち各Ｆｖは異なるエピトープに結合する。

更なる特定の実施形態において、多重特異性抗体分子は、ＷＯ２０１５／１９７７７２に記載の通りＦａｂ−ｄｓｓｃＦｖ−ｄｓＦｖ形式を有し、参照により本明細書に組み込む。

本発明の方法に従って製造することができる抗体は、組換え抗体をコードしている１つ又は複数の発現ベクターをトランスフェクトした真核生物宿主細胞を培養することにより産生できる。真核生物宿主細胞は、好ましくは哺乳動物細胞、より好ましくはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。

哺乳動物細胞は、その生育及び抗体の発現を支援することになる任意の培地中で培養することができ、好ましくは、培地は、動物血清及びペプトンなど動物由来の産物を含まない化学的に定義済みの培地である。細胞生育及びタンパク質産生を可能にする適当な濃度で存在するビタミン、アミノ酸、ホルモン、成長因子、イオン、緩衝液、ヌクレオシド、グルコース又は同等のエネルギー源の異なる組み合わせを含む、当業者に利用可能な異なる細胞培養培地がある。更なる細胞培養培地構成要素を、当業者に公知であろう細胞培養サイクル中の異なる時間に適当な濃度で細胞培養培地に含めることができる。

哺乳動物細胞培養は、振とうフラスコ又はバイオリアクターなど任意の適当な容器中で行うことができ、その培養は、必要とされる産生規模に応じてフェドバッチ培養モードで操作できる場合も又は操作できない場合もある。これらのバイオリアクターは、攪拌槽又はエアリフトリアクターであってよい。様々な大規模バイオリアクターは、１０００Ｌ〜５００００Ｌより大きい、好ましくは５０００Ｌ〜２００００Ｌ、又は１００００Ｌの容積で利用可能である。別法として、２Ｌ〜１００Ｌなどより小規模のバイオリアクターを使用して本発明の方法による抗体を製造することもできる。

本発明の方法に従って製造することができる抗体又はその抗原結合断片は、哺乳動物宿主細胞培養、一般にＣＨＯ細胞培養の上清中に一般に見られる。抗体又はその抗原結合断片など対象とするタンパク質が、上清に分泌されるＣＨＯ培養プロセスの場合、前記上清は、当技術分野においてに公知の方法、一般に遠心分離により採取される。

従って本発明の特定の実施形態において、本方法は、タンパク質精製の前に遠心分離及び上清回収の工程を含む。更なる特定の実施形態において、前記遠心分離は、連続遠心分離である。念のために明記すると、上清とは、細胞培養の遠心分離の結果得られる沈降した細胞の上に存在する液体を意味する。

別法として前記上清は、当業者に公知の清澄化技術例えば深層ろ過などを使用して回収することができる。従って本発明の特定の実施形態において、本方法は、タンパク質精製の前に深層ろ過及び上清回収の工程を含む。

別法として、宿主細胞は、原核生物細胞、好ましくはグラム陰性細菌である。より好ましくは、宿主細胞は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞である。タンパク質発現用の原核宿主細胞は、当技術分野において公知である（Ｔｅｒｐｅ、Ｋ．［２００６年］、「異種タンパク質産生のための細菌発現系の概要：分子及び生化学の基礎から商業的システムまで（Ｏｖｅｒｖｉｅｗｏｆｂａｃｔｅｒｉａｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍｓｆｏｒｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓｐｒｏｔｅｉｎｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ：ｆｒｏｍｍｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓｔｏｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｓｙｓｔｅｍｓ）」、ＡｐｐｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ７２、２１１〜２２２頁）。宿主細胞は、抗体断片など対象とするタンパク質を産生するために遺伝子操作されている組換え細胞である。組換え大腸菌宿主細胞は、ＭＣ４１００、ＴＧ１、ＴＧ２、ＤＨＢ４、ＤＨ５α、ＤＨ１、ＢＬ２１、Ｋ１２、ＸＬ１Ｂｌｕｅ及びＪＭ１０９を含めた任意の適当な大腸菌株から得ることができる。１例は、組換えタンパク質発酵に一般に使用される宿主株の大腸菌株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）である。抗体断片は、修飾された大腸菌株、例えばＷＯ２０１１／０８６１３６、ＷＯ２０１１／０８６１３８又はＷＩ２０１１／０８６１３９に記述されている株など代謝突然変異体若しくはプロテアーゼ欠失大腸菌株、を培養することにより産生することもでき、参照により本明細書に組み込む。

本発明の方法に従って精製することができる抗体は、タンパク質の性質、産生規模及び使用する大腸菌株に応じて、大腸菌宿主細胞のペリプラズム又は宿主細胞培養上清のいずれかの中に一般に見られる。これらの区画へとタンパク質を標的化する方法は、当技術分野において公知である（Ｍａｋｒｉｄｅｓ，Ｓ．Ｃ．［１９９６年］「大腸菌において遺伝子の高レベル発現を実現するための戦略（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓｆｏｒａｃｈｉｅｖｉｎｇｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｇｅｎｅｓｉｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ．）」ＭｉｃｒｏｂｉｏｌＲｅｖ６０、５１２〜５３８頁）。タンパク質を大腸菌のペリプラズムに導く適当なシグナル配列の例には、大腸菌ＰｈｏＡ、ＯｍｐＡ、ＯｍｐＴ、ＬａｍＢ及びＯｍｐＦシグナル配列がある。タンパク質は、天然の分泌経路を利用することにより又は外膜のわずかな漏出を誘導してタンパク質分泌を引き起こすことにより上清へと標的化することができ、それらの例は、ｐｅｌＢリーダー、プロテインＡリーダーの使用、培養培地へのグリシンの添加を伴うバクテリオシン放出タンパク質、マイトマイシン誘導性バクテリオシン放出タンパク質の同時発現、及び膜透過化処理のためのｋｉｌ遺伝子の同時発現である。最も好ましくは、本発明の方法において、組換えタンパク質は、宿主大腸菌のペリプラズムに発現される。

大腸菌宿主細胞における組換えタンパク質の発現は、誘導可能な系の制御下にあってもよく、それにより、大腸菌における組換え抗体の発現は、誘導可能なプロモーターの制御下にある。大腸菌における使用に適当な多くの誘導可能なプロモーターが、当技術分野において公知であり、組換えタンパク質の発現は、プロモーターに応じて温度又は生育培地中の特定の材料の濃度など様々な因子により誘導することができる。誘導可能なプロモーターの例には、ラクトース又は加水分解抵抗性ラクトース類似体、イソプロピル−ｂ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘導可能な大腸菌ｌａｃ、ｔａｃ及びｔｒｃプロモーター並びにリン酸塩、トリプトファン及びＬ−アラビノースによりそれぞれ誘導されるｐｈｏＡ、ｔｒｐ及びａｒａＢＡＤプロモーターがある。発現は、例えば、誘導物質の添加又は誘導が温度依存的である場合には温度の変化により誘導することができる。組換えタンパク質発現の誘導が、培養への誘導物質の添加により実現される場合、誘導物質は、発酵系及び誘導物質に応じた任意の適当な方法、例えば、単回若しくは複数回のショット添加（shot additions）により又は供給による誘導物質の漸進的な添加により添加することができる。当然のことながら誘導物質の添加とタンパク質発現の実際の誘導との間に遅延がある場合があり、例えば、誘導物質がラクトースである場合、タンパク質発現の誘導が起こる前に、任意の先在する炭素供給源がラクトースより先に利用される間の遅延があり得ることが理解されよう。

大腸菌宿主細胞培養（発酵）は、大腸菌の生育及び組換えタンパク質の発現を支援することになる任意の培地中で培養することができる。培地は、例えばＤｕｒａｎｙＯら（２００４年）「大腸菌における組換えフクロース−１−リン酸アルドラーゼの発現に関する研究（Ｓｔｕｄｉｅｓｏｎｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｆｕｃｕｌｏｓｅ−１−ｐｈｏｓｐｈａｔｅａｌｄｏｌａｓｅｉｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ．）」ＰｒｏｃｅｓｓＢｉｏｃｈｅｍ３９、１６７７〜１６８４頁に記述されているものなど化学的に定義されている任意の培地であってよい。

大腸菌宿主細胞の培養は、必要とされる産生の規模に応じて振とうフラスコ又は発酵槽など任意の適当な容器中で行うことができる。様々な大規模発酵槽が、１０００Ｌより大きく約１０００００Ｌまでの容積で利用可能である。好ましくは、１０００〜５００００Ｌの発酵槽、より好ましくは１０００〜２５０００、２００００、１５０００、１２０００又は１００００Ｌが使用される。より小規模の発酵槽を、０．５〜１０００Ｌの容積で使用することもできる。

大腸菌の発酵は、任意の適当な系、例えばタンパク質及び必要とする収量に応じて連続、バッチ又フェドバッチ培養モードで実行することができる。バッチモードは、必要な際に栄養分又は誘導物質をショット添加して使用することができる。別法として、フェドバッチ培養を使用することができ、培養は、発酵槽中に最初から存在する栄養分を使用して持続させ得る最大比生育速度でのバッチモード前誘導、及び発酵が完了するまで生育速度を制御するために使用される１つ又は複数の栄養分の供給体制で生育させ得る。フェドバッチモードは、前誘導を使用して、大腸菌宿主細胞の代謝を制御し、より高い細胞密度に至らせることもできる。

必要に応じて、宿主細胞は、発酵培地から採取されてもよく、例えば、宿主細胞は、遠心分離、ろ過又は濃化によりサンプルから採取することができる。

一実施形態において、本発明によるプロセスは、タンパク質を抽出する前に遠心分離及び細胞回収の工程を含む。

抗体断片など対象とするタンパク質が宿主細胞のペリプラズム空間に見られる大腸菌発酵プロセスの場合、宿主細胞からタンパク質を遊離させることが必要である。遊離は、機械的若しくは圧力処理、凍結−解凍処理、浸透圧ショック、抽出薬剤又は熱処理による細胞溶解など任意の適当な方法により実現することができる。タンパク質遊離のためのそのような抽出方法は、当技術分野において公知である。従って特定の実施形態において、本発明の方法は、タンパク質精製の前に追加のタンパク質抽出工程を含む。

更なる実施形態において、本発明による方法は、細胞培養培地から宿主細胞を回収する工程と、タンパク質抽出工程を使用してタンパク質を採集する工程と、タンパク質抽出工程の結果得られる混合物を含有するタンパク質を回収する工程と、混合物から前記タンパク質を精製する工程とを更に含み、前記精製が、少なくとも１つのプロテインＡクロマトグラフィー工程を含む。

特定の実施形態において、抽出工程は、サンプルに抽出緩衝液を添加する工程と、得られたタンパク質を回収する工程とを含む。好ましくは、抽出工程は、天然の立体配座でタンパク質を回収できるような適当な時間に、適当な温度で実行され、各特定のタンパク質について経験的に最適化される。本発明の特定の実施形態において、前記抽出工程は、２５℃〜３５℃、２７℃〜３３℃、好ましくは２９℃〜３１℃で実行される。タンパク質抽出工程は、ある期間にわたって実行され、及び使用される特定のタンパク質及び温度に応じて経験的に最適化される。特定の実施形態において、前記抽出工程は、４〜２０時間、６〜１８時間、好ましくは８〜１２時間実行される。特定の実施形態において、タンパク質抽出工程は、２９℃〜３１℃で８〜１２時間、好ましくは３０℃で１１時間実行される。

別の実施形態において、抽出緩衝液がサンプルに添加され、次いでサンプルは熱処理工程を受ける。熱処理工程は、好ましくは米国特許第５，６６５，８６６号に詳細に記載されている通りであり、参照により本明細書に組み込む。

抽出の工程の後に、抗体など対象とするタンパク質を含有する混合物は、遠心分離及び／又はろ過の工程を受けることができる。

更なる特定の実施形態において、本発明の方法は、抽出工程の後及び前記混合物からタンパク質を精製する前に、対象とするタンパク質を含有する混合物のｐＨを調整する工程を含むことができる。

本明細書で使用するとき、用語「抗体（単数）」又は「抗体（複数）」とは、モノクローナル又はポリクローナル抗体のことを指す。本明細書で使用するとき、用語「抗体（単数）」又は「抗体（複数）」は、当業者に公知の組換え技術により生成される組換え抗体を含むが、これに限定されない。「抗体（単数）」又は「抗体（複数）」は、任意の種、特に、２本の本質的に完全な重及び２本の本質的に完全な軽鎖を有する抗体を含めた哺乳動物種の抗体、ＩｇＤ、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２ａ、ＩｇＧ_２ｂ、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＥを含めた任意のアイソタイプのヒト抗体及びＩｇＡ_１、ＩｇＡ_２を含めたこの基本構造の二量体若しくはＩｇＭなどの五量体及びその修飾されたバリアントとして産生される抗体、例えばチンパンジー、ヒヒ、アカゲザル若しくはカニクイザル由来の非ヒト霊長類抗体、例えばマウス若しくはラット由来の齧歯目抗体；ウサギ抗体、ヤギ若しくはウマ抗体、及びラクダ科抗体（例えば、Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ［商標］などラクダ又はラマ由来）及びその誘導体、並びに鶏抗体などトリ種又はサメ抗体など魚種の抗体を含む。用語「抗体（単数）」又は「抗体（複数）」とは、少なくとも１つの重鎖及び／又は軽鎖抗体配列の第１の部分が第１の種由来であり、重鎖及び／又は軽鎖抗体配列の第２の部分が第２の種由来である「キメラ」抗体のことも指す。本明細書で対象とするキメラ抗体には、非ヒト霊長類（例えばヒヒ、アカゲザル又はカニクイザルなど旧世界ザル）から得られる可変ドメイン抗原結合配列とヒト定常領域配列を含む「霊長類化」抗体がある。「ヒト化」抗体は、非ヒト抗体から得られる配列を含有するキメラ抗体である。大部分の場合、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域由来の残基がマウス、ラット、ウサギ、鶏又は非ヒト霊長類などの非ヒト種の超可変領域［又は、相補性決定領域（ＣＤＲ）］（ドナー抗体）由来の残基により置き換えられているヒト抗体（レシピエント抗体）であり、所望の特異性、親和性及び活性を有する。殆どの場合、ＣＤＲ以外の、即ちフレームワーク領域（ＦＲ）にある、ヒト（レシピエント）抗体の残基は、対応する非ヒト残基により更に置き換えられる。更にまた、ヒト化抗体は、レシピエント抗体又はドナー抗体に見られない残基を含むことができる。これらの修飾は、抗体能力を更に洗練するために作られる。ヒト化は、ヒトにおける非ヒト抗体の免疫原性を減少させ、従って、ヒト疾患の処置への抗体の適用を容易にする。ヒト化抗体及びそれを生成するためのいくつかの異なる技術は、当技術分野において公知である。用語「抗体（単数）」又は「抗体（複数）」とは、ヒト化に代わるものとして生成できるヒト抗体のことも指す。例えば、免疫化と同時に、内生的なマウス抗体を産生することなくヒト抗体の完全なレパートリーを産生することができるトランスジェニック動物（例えば、マウス）を産生することが可能である。例えば、キメラ及び生殖細胞系変異体マウスにおける抗体重鎖連結領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合欠失が、内生的な抗体産生を完全に阻害することが記述されている。そのような生殖細胞系変異体マウスにヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子アレイを移植することにより、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子を保有しているトランスジェニック動物を前記抗原で免疫化すると、特定の抗原に対して特異性を持つヒト抗体を産生することになる。そのようなトランスジェニック動物を産生する技術及びそのようなトランスジェニック動物からヒト抗体を単離し、産生する技術は当技術分野において公知である。別法として、トランスジェニック動物；例えばマウスにおいて、マウス抗体の可変領域をコードしている免疫グロブリン遺伝子だけが、対応するヒト可変免疫グロブリン遺伝子配列で置き換えられる。抗体定常領域をコードしているマウス生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子は、変化しないままである。このように、トランスジェニックマウスの免疫系における抗体エフェクター機能、ひいてはＢ細胞発生は本質的に変化せず、ｉｎｖｉｖｏで抗原投与に対する抗体応答の改善が導かれ得る。対象とする特定の抗体をコードしている遺伝子が、そのようなトランスジェニック動物から単離されたら、完全なヒト抗体を得るために定常領域をコードしている遺伝子をヒト定常領域遺伝子で置き換えることができる。ｉｎｖｉｔｒｏでヒト抗体を得るための他の方法は、ファージディスプレイ又はリボソームディスプレイ技術などの表示技術に基づいており、少なくとも部分的に人工的か又はドナーの免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーからかいずれかで生成される組換えＤＮＡライブラリーが使用される。ヒト抗体を生成するためのファージ及びリボソームディスプレイ技術は、当技術分野において公知である。ヒト抗体は、対象とする抗原によりｅｘｖｉｖｏで免疫化され単離したヒトＢ細胞から生成することもでき、その後ハイブリドーマを生成するために融合され、次いで最適なヒト抗体としてスクリーニングされ得る。本明細書で使用するとき、用語「抗体（単数）」又は「抗体（複数）」は、脱グリコシル化抗体のことも指す。

本発明の実施形態のいずれかにおいて使用される抗体分子には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖなどの抗体断片及びｓｃＦｖ断片；並びにＢｉＴＥｓ（登録商標）（二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー［Engagers］）及びＤＡＲＴｓ（商標）（二重親和性再標的化技術）などの形式を含めたダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、ｓｄＡｂｓ、ＶＨＨ及びＶＮＡＲ断片などのドメイン抗体（ｄＡｂｓ）、Ｆａｂ−Ｆｖ、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ、Ｆａｂ（Ｆｖ）_２若しくはＦａｂ−（ｓｃＦｖ）_２構築物を含むがこれに限定されない抗体断片若しくは抗体から形成される一本鎖抗体、二重特異性、三重特異性、四重特異性又は多重特異性抗体がある。上で定義した抗体断片は、当技術分野においてに公知である。明快にするために、Ｆａｂ−Ｆｖとは、任意の順序で連結された１つのＦｖ領域及び１つのＦａｂ領域を含有する構築物、即ちＦａｂ−Ｆｖ又はＦｖ−Ｆａｂのことを指し、一方の領域の最後のアミノ酸の後ろに次の領域の第１のアミノ酸がある又はその逆であると理解されるべきである。同様に、Ｆａｂ−ｓｃＦｖとは、任意の順序で連結された１つのｓｃＦｖ領域及び１つのＦａｂ領域を含有する構築物、Ｆａｂについてはいずれかのポリペプチド鎖、即ちＦａｂ−ｓｃＦｖ又はｓｃＦｖ−Ｆａｂのことを指し、一方の領域の最後のアミノ酸の後ろに次の領域の第１のアミノ酸がある又はその逆であると理解されるべきである。同じ様式で、Ｆａｂ−（Ｆｖ）_２とは、任意の順序で連結された２つのＦｖ領域及び１つのＦａｂ領域を含有する構築物、即ちＦａｂ−Ｆｖ−Ｆｖ、Ｆｖ−Ｆａｂ−Ｆｖ又はＦｖ−Ｆｖ−Ｆａｂのことを指し、一方の領域の最後のアミノ酸の後ろに次の領域の第１のアミノ酸がある又はその逆であると理解されるべきである。同様に、Ｆａｂ−（ｓｃＦｖ）_２とは、任意の順序で連結された２つのｓｃＦｖ領域及び１つのＦａｂ領域を含有する構築物、Ｆａｂについてはいずれかのポリペプチド鎖のことを指し、２０個の可能な置き換えを得られると理解されるべきである。

一般にこれらの構築物は、第１の領域（例えばＦａｂ）と第２の領域（例えばＦｖ）の間にペプチドリンカーを含む。そのようなリンカーは当技術分野において公知であり、１つ又は複数のアミノ酸であってよく、当業者により長さ及び組成が一般に最適化され得る。別法として前記領域は、直接接続されてもよい、即ちペプチドリンカーを含まない。

可変ドメインをＦａｂ又はＦａｂ’に接続するのに適当なリンカー領域の例は、ＷＯ２０１３／０６８５７１及びＷＯ２０１４／０９６３９０に記述されており、参照により本明細書に組み込み、柔軟なリンカー配列及び剛直なリンカー配列があるが、これに限定されない。柔軟なリンカー配列には、Ｈｕｓｔｏｎら、１９８８年、１０ＰＮＡＳ８５：５８７９〜５８８３頁；Ｗｒｉｇｈｔ及びＤｅｏｎａｒａｉｎ、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００７年、４４（１１）：２８６０〜２８６９頁；Ａｌｆｔｈａｎら、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．１９９５年、８（７）：７２５〜７３１頁；Ｌｕｏら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９５年、１１８（４）：８２５〜８３１頁；Ｔａｎｇら、１９９６年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（２６）：１５６８２〜１５６８６頁；及びＴｕｒｎｅｒら、１９９７年、ＪＩＭＭ２０５、４２〜５４頁に開示されているものがある。

本明細書使用するとき、用語「ＶＨ３ドメイン」とは、免疫グロブリンのヒト重鎖可変領域のフレームワークサブグループ３のことを指す。抗体の重鎖可変ドメインは、ＤＮＡ配列及びタンパク質相同性に基づいて別個のサブファミリー（ＶＨ１〜ＶＨ６）に分類される（ＷａｌｔｅｒらＡｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．４２：４４６〜４５１頁、１９８８年、「遺伝的変動の分析により、ヒト免疫グロブリンＶＨ−領域遺伝子組織化が明らかになる（ＡｎａｌｙｓｉｓｆｏｒｇｅｎｅｔｉｃｖａｒｉａｔｉｏｎｒｅｖｅａｌｓｈｕｍａｎｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎＶＨ−ｒｅｇｉｏｎｇｅｎｅｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）」；Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒら、ＩｎｔＩｍｍｕｎｏｌ．１９９０年；２（１）：４１〜５０頁、「哺乳動物ＶＨファミリーの構造と進化（ＳｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｅｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆｍａｍｍａｌｉａｎＶＨｆａｍｉｌｉｅｓ）」。

本明細書使用するとき、用語「Ｆｃ領域」とは、天然の抗体のＦｃ領域のことを指し、これは、定常重ドメイン１（ＣＨ１）を欠く定常領域二量体である。当技術分野において公知のように、抗体のＦｃ領域は、ペプシン又はパパインのいずれかによる天然の抗体の消化後に回収される結晶化可能な断片（Ｆｃ）である。

本明細書では「Ｆｃ領域を含有しない」抗体とは、天然の定常重ドメイン２（ＣＨ２）、天然の定常重ドメイン３（ＣＨ３）及び天然の定常重ドメイン４（ＣＨ４）領域を含有しない抗体のことを指す。

プロテインＡへの結合に関与するＦｃ領域内の残基は、当技術分野においてこれまでに記載されている（Ｎａｇａｏｋａら、「マウスＩｇＧ１Ｆｃ領域における単一アミノ酸置換は、プロテインＡに対する親和性の急激な増大を誘導する（ＳｉｎｇｌｅａｍｉｎｏａｃｉｄｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｉｎｔｈｅｍｏｕｓｅＩｇＧ１ＦｃｒｅｇｉｏｎｉｎｄｕｃｅｓｄｒａｓｔｉｃｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔｏｆｔｈｅａｆｆｉｎｉｔｙｔｏｐｒｏｔｅｉｎＡ）」、ＰＥＤＳ第１６巻、第４号、２４３〜２４５頁）。結果的に、当業者は、プロテインＡに結合する能力を失ったＦｃ領域を有する抗体を開発することができ、そのような抗体は、本発明による方法での使用に適当であろう。

本明細書使用するとき、用語「多量体」又は「多量体形態」とは、２つ以上の単量体由来のドメインからなる抗体形態のことを指し、その形態においてドメインの全ては正しく折り畳まれ、対合している。多量体の例が図１２に提供されており、異なる抗体分子が正しく折り畳まれ、各ＶＨドメインは相補的ＶＬドメインと対合される。

明快にするために、相補的ＶＨ−ＶＬ対が協調して同じ抗原に結合することは理解されよう。本明細書使用するとき、用語「プロテインＡ」又は「ブドウ球菌のプロテインＡ」とは、グラム陽性細菌スタフィロコッカス・アウレウスの殆どの株の細胞壁に共有結合しているＩ型膜タンパク質のことである。それは、様々な種、例えばヒト、ウサギ及びモルモット由来のＩｇＧに高い親和性を有するが、ウシ及びマウスとは弱い相互作用しかない。プロテインＡは、２つの別個の結合事象：ヒトＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２及びＩｇＧ_４のＦｃ部分にある「標準的な」結合部位、並びにＶＨ３サブファミリーの重鎖を含有するヒトＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ及びＩｇＥのＦａｂ部分に見られる「代替の」結合部位によって抗体と相互作用する。スタフィロコッカス・アウレウス由来プロテインＡの最も報告されている分子量は、約４２０００Ｄａである。組換え連鎖球菌プロテインＡは、２９９アミノ酸からなり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより推定した通り３３．８ｋＤａの予測分子量を有する。

プロテインＡは、３つの領域：分泌中にプロセスされるシグナル配列であるＳ；５つの相同なＩｇＧ結合ドメインＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ及びＣ並びに細胞壁係留領域ＸＭからなる。領域Ｘを欠いている短縮タンパク質は、約３１ｋＤの分子量を有する。ドメインは、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２及びＩｇＧ_４のＦｃ部分にそれぞれ独立に結合できるが、ＩｇＧ_３とは弱い相互作用しか示さない。加えて、天然のプロテインＡドメインの全ては、同程度のＦａｂ結合を示し、領域Ｄ及びＥにより媒介されると記述されている。

本明細書使用するとき、用語「ＯＸ４０」とは、ＣＤ１３４、ＴＮＦＲＳＦ４、ＡＣＴ３５又はＴＸＧＰ１Ｌとしても公知の分子のことを指し、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーであり、最適なＴ細胞増殖並びに生存に必要とされるＣＤ２８及びＯＸ４０の連続する会合による共刺激受容体として作用する。

本明細書で抗体に言及する場合に使用する用語、所与の分子及び等価物に「特異的に結合する」、「特異的に結合している」は、抗体が、生物学的に意味がある効果を実現するのに充分な親和性及び特異性で前記所与の分子に結合することになることを意味する。選択された抗体は、所与の分子に対して結合親和性を通常有することになり、例えば、抗体は、Ｋｄ値１００ｎＭ〜１ｐＭで所与の分子に結合することができる。抗体親和性は、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイなど表面プラズモン共鳴に基づくアッセイ；酵素結合免疫吸着剤アッセイ（ＥＬＩＳＡ）；及び競合アッセイ（例えばＲＩＡ）により決定することができる。本発明の意味の範囲で、前記所与の分子に特異的に結合する抗体は、例えば二重特異性抗体の場合の非限定的な例として別の分子に結合することもできる。

（例１）
ｐＨ勾配溶出によるＡ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖのプロテインＡ精製
Ａ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖの大腸菌発現、抽出及び清澄化
Ａ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖ（ヒトＯＸ４０及び血清アルブミンに結合する抗体断片）を、大腸菌Ｗ３１１０宿主細胞においてＩＰＴＧ（イソプロピル−ｂ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド）による誘導で異種タンパク質として発現させ、異種タンパク質を、ｐＨ７．４に調整した１００ｍＭＴｒｉｓ／１０ｍＭＥＤＴＡ緩衝液の添加及び３０℃でのタンパク質抽出工程により宿主細胞のペリプラズム空間から遊離させた。細胞物質を遠心分離によって除去し、異種タンパク質を含有する細胞抽出物を、遠心分離及び０．２２μｍろ過の組み合わせを使用して次いで清澄化した。

ｐＨ勾配溶出によるＡ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖのプロテインＡ精製
清澄な大腸菌抽出物を、Ｄｅｌｂｅｃｃｏｓリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．４で平衡化した天然のプロテインＡクロマトグラフィーカラム、ＨｉＴｒａｐＭａｂＳｅｌｅｃｔ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）５ｍＬに適用した。カラムを、ＰＢＳで先ず洗浄して結合していない物質を除去し、結合している物質を、ｐＨ勾配ｐＨ７．４〜ｐＨ２．１でその後溶出させた。溶出した物質を、ＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷＸＬＳＥＣ−ＨＰＬＣ（ＴｏｓｏｈＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用してＳＥＣ−ＨＰＬＣ（サイズ排除クロマトグラフィー−高速液体クロマトグラフィー）によって分画し、分析した。ＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析を使用して、各画分に存在する％単量体及び多量体を決定した。Ａ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖ単量体は、およそ９分間の保持時間を有した。二量体、三量体、四量体及びより高次構造は全て、９分間未満の保持時間を示し、一括して多量体種又はより高分子量種（ＨＭＷＳ）と称した。

プロテインＡクロマトグラフィーカラムからの溶出の間に、２つのピークがｐＨ勾配全体で観察された、図１を参照のこと。第２のピークにおける多量体種のレベル上昇と比較して、単量体のレベル上昇が、第１のピークに観察された、表１及び図２を参照のこと。

Ａ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖは、Ｆｃを欠き、従ってプロテインＡに対する結合は、Ｖ−領域のヒトＶＨ３可変フレームワークサブクラスによるものであった。多量体種の結合の増加が、プロテインＡに対するこれら分子の結合活性の増加によるものであったことが、提案される。多量体種は、より多くのＶＨ３領域を有し、従ってプロテインＡ樹脂により強く結合し、溶出のために低いｐＨを必要とする。

（例２）
ｐＨ勾配溶出によるＦｃ構築物のプロテインＡ精製
多量体ＦｃのＣＨＯ発現及び清澄化
Ｆｃを多量体へと組み立てるヒトＩｇＭ尾部に融合されたヒトＩｇＧ１のＦｃドメインを含有するＦｃ構築物を、安定なジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）欠失チャイニーズハムスター卵巣細胞系（ＣＨＯＤＧ４４）において発現させた。細胞に、製造業者の使用説明書に従ってＮｕｃｌｅｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）を使用して、選択可能なマーカーであるＤＨＦＲ遺伝子と産物をコードしている遺伝子の両方を含有するプラスミドベクターをトランスフェクした。トランスフェクトした細胞を、ヒポキサンチン及びチミジンを欠く培地中で、ＤＨＦＲ阻害剤メトトレキサートの存在下で選択した。培養を、バッチモードの振盪されたフラスコ培養で維持し、１４日後に採集した。

細胞培養上清の清澄化を、遠心分離（４０００×ｇ、室温で６０分間）によって実施し、次に深層及び滅菌ろ過した。

清澄な細胞培養上清を濃化し、構築物を含むＦｃの全てを、ＰＢＳｐＨ７．４で平衡化したプロテインＡクロマトグラフィーカラム、ＨｉＴｒａｐＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）５ｍＬを使用して精製した。カラムをＰＢＳで洗浄し、結合している物質を０．１Ｍクエン酸ｐＨ３．４で溶出させた。溶出した物質を、ＰＢＳｐＨ７．４に緩衝液交換した。

精製したＦｃ構築物を、ＰＢＳｐＨ７．４で平衡化した天然のプロテインＡクロマトグラフィーカラム、ＨｉＴｒａｐＭａｂＳｅｌｅｃｔ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）５ｍＬに適用した。カラムを、ＰＢＳで先ず洗浄して結合していない物質を除去し、結合している物質を、ｐＨ勾配ｐＨ７．４〜ｐＨ２．１でその後溶出させた、図３を参照のこと。溶出した物質を、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ（Ｇ３０００ＳＥＣ−ＨＰＬＣ、ＴｏｓｏｈＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）によって分画し、分析した。ＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析を使用して、各画分に存在する％単量体及び多量体Ｆｃを決定した。Ｆｃ単量体は、およそ９．３分間の保持時間を有する。三量体、六量体及びより高次構造は全て、９．４分間未満の保持時間を有し、一括して多量体種又はより高分子量種（ＨＭＷＳ）と称した、表２及び図４を参照のこと。

Ｆｃ構築物は、上向及び下向の湾曲上にわずかな肩を伴う単一のピークとして溶出した。しかしながら、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによる画分の分析から、分子の単量体及び多量体形態が同時に溶出することが明らかになった、表２及び図４を参照のこと。異なる種間の分離は、勾配溶出全体で観察されなかった。

Ｆｃ構築物の多量体は、複数のＦｃ領域を含有するが、可変領域を欠き、そのためヒトＶＨ３ドメインによってプロテインＡに結合する可能性を欠いている。単量体及び多量体Ｆｃ構築物は、勾配溶出においてプロテインＡカラムから共溶出し、このことは樹脂に対するＦｃ領域結合活性が溶出の因子でなかったことを実証している。従って、単量体及び多量体Ｆｃ領域含有分子を、この技術によって効率的に分離することはできない。ｐＨ勾配を使用するＦｃ領域を持たないＶＨ３−ドメイン含有抗体の、プロテインＡからの溶出が、単量体と多量体とを分離できたことは、例１及び２とは対照的である。

（例３）
ｐＨ段階溶出によるＡ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖのプロテインＡ精製
Ａ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖのＣＨＯ発現及び清澄化
ヒトＯＸ４０及び血清アルブミンに結合する構築物を、安定なジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）欠失チャイニーズハムスター卵巣細胞系（ＣＨＯＤＧ４４）において発現させた。細胞に、製造業者の使用説明書に従ってＮｕｃｌｅｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）を使用して、選択可能なマーカーであるＤＨＦＲ遺伝子と産物をコードしている遺伝子の両方を含有するプラスミドベクターをエレクトロポレーションによりトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、ヒポキサンチン及びチミジンを欠く培地中で、ＤＨＦＲ阻害剤メトトレキサートの存在下で選択した。培養を、バッチモードの振盪されたフラスコ培養で維持し、１４日後に採集した。

ｐＨ段階溶出によるＡ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖのプロテインＡ精製
清澄な細胞培養上清を、Ｄｅｌｂｅｃｃｏｓリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．４で平衡化した天然のプロテインＡクロマトグラフィーカラム、ＨｉＴｒａｐＭａｂＳｅｌｅｃｔ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）５ｍＬに適用した。カラムを、ＰＢＳで先ず洗浄して結合していない物質を除去し、結合している物質を、その後先ずｐＨ３．８で溶出させ、次いで第２の溶出工程をｐＨ３．０で実施した、図５を参照のこと。溶出した物質を、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ（Ｇ３０００ＳＥＣ−ＨＰＬＣ、ＴｏｓｏｈＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）によって分画し、分析し、４〜２０％Ｔｒｉｓ／グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥを還元及び非還元条件下の両方で実行した。

ＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析を使用して、各画分に存在する％単量体及び多量体を決定した。Ａ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖ単量体は、およそ９分間の保持時間を有する。二量体、三量体、四量体及びより高次構造は全て、９分間未満の保持時間を有し、一括して多量体種又はより高分子量種（ＨＭＷＳ）と称した。図６及び表３を参照のこと。

非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、溶出ピークにおける上の単量体及び多量体レベルを確認した。Ａ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖ単量体は、９７〜６６ｋＤａの間に泳動され、レーン４における主要なバンドであり、ｐＨ３．８での溶出に対応しており、Ａ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖ多量体は、１２０ｋＤａより上の複数のバンドとして泳動され、レーン５におけるバンドの大多数であり、ｐＨ３．０での溶出から回収した画分に対応している、図７を参照のこと。

還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおけるバンドの全てが、Ａ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖと関連していることが確認された、図８を参照のこと。

ｐＨ３．８での溶出は、２．８カラム体積において下向の湾曲上にわずかなテールを伴う単一のピークを溶出した。ＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析は、このピークが単量体形態のＡ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖを７９％含有したことを実証し、多量の単量体も、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって確認された。ｐＨ３．０での溶出は、単一のピークを溶出した。ＨＰＬＣ−ＳＥＣ分析は、このピークが多量体形態のＡ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖ９７％であることを実証し、多量の多量体も、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって確認された。

上の結果は、プロテインＡに対するＶＨ３結合により多量体種から単量体を効果的に分離できることを実証している。これは、前例に示したプロテインＡに対するＦｃ結合と対照的である。

（例４）
勾配溶出によるＡ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖのプロテインＡ（Ａｍｓｐｈｅｒｅ）精製
Ａ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖのＣＨＯ発現及び清澄化
ヒトＯＸ４０及び血清アルブミンに結合する構築物を、安定なジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）欠失チャイニーズハムスター卵巣細胞系（ＣＨＯＤＧ４４）において発現させた。細胞に、製造業者の使用説明書に従ってＮｕｃｌｅｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）を使用して、選択可能なマーカーであるＤＨＦＲ遺伝子と産物をコードしている遺伝子の両方を含有するプラスミドベクターをエレクトロポレーションによりトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、ヒポキサンチン及びチミジンを欠く培地中で、ＤＨＦＲ阻害剤メトトレキサートの存在下で選択した。培養を、バッチモードの振盪されたフラスコ培養で維持し、１４日後に採集した。

ｐＨ勾配溶出によるＡ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖのプロテインＡ精製（Ａｍｓｐｈｅｒｅ）
清澄な上清を、ＡｍｓｐｈｅｒｅプロテインＡクロマトグラフィーカラムに適用し、（ベッド高１０ｃｍでカラム体積５ｍＬ）Ｄｅｌｂｅｃｃｏｓリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．４で平衡した。次いでカラムを、ＰＢＳで洗浄して結合していない物質を除去し、結合している物質を、ｐＨ勾配、ｐＨ６．０〜ｐＨ２．１でその後溶出させた。溶出した物質を、ＡｃｑｕｉｔｙＵＰＬＣＢＥＨ４５０ＳＥＣ２．５μｍカラムを使用してＳＥＣ−ＵＰＬＣ（サイズ排除クロマトグラフィー−超高速高分離液体クロマトグラフィー）によって分画し、分析した。ＳＥＣ−ＵＰＬＣ分析を使用して、各画分に存在する％単量体及び多量体を決定した。Ａ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖ単量体は、およそ２．２分間の保持時間を有した。二量体、三量体、四量体及びより高次構造は全て、２．２分間未満の保持時間を示し、一括して多量体種又はより高分子量種（ＨＭＷＳ）と称した。

ＡｍｓｐｈｅｒｅプロテインＡクロマトグラフィーカラムからの溶出の間に、２つのピークがｐＨ勾配全体で観察された、図９を参照のこと。第２のピークにおける多量体種のレベル上昇と比較して、単量体のレベル上昇が、第１のピークに観察された、表４及び図９を参照のこと。

Ａ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖは、Ｆｃを欠き、従ってＡｍｓｐｈｅｒｅプロテインＡに対する結合は、Ｖ−領域のヒトＶＨ３可変フレームワークサブクラスによるものであった。多量体種の結合の増加が、プロテインＡに対するこれら分子の結合活性の増加によるものであったことが、提案される。多量体種は、より多くのＶＨ３領域を有し、従ってプロテインＡ樹脂により強く結合し、溶出により低いｐＨを必要とする。

（例５）
勾配溶出によるＡ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖのプロテインＡ（ＮｏｖａＳｅｐＡｂｓｏｌｕｔｅ）精製
Ａ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖのＣＨＯ発現及び清澄化
ヒトＯＸ４０及び血清アルブミンに結合する構築物を、安定なジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）欠失チャイニーズハムスター卵巣細胞系（ＣＨＯＤＧ４４）において発現させた。細胞に、製造業者の使用説明書に従ってＮｕｃｌｅｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）を使用して、選択可能なマーカーであるＤＨＦＲ遺伝子と産物をコードしている遺伝子の両方を含有するプラスミドベクターをエレクトロポレーションによりトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、ヒポキサンチン及びチミジンを欠く培地中で、ＤＨＦＲ阻害剤メトトレキサートの存在下で選択した。培養を、バッチモードの振盪されたフラスコ培養で維持し、１４日後に採集した。

ｐＨ勾配溶出によるＡ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖのプロテインＡ精製（ＮｏｖａＳｅｐＡｂｓｏｌｕｔｅ）
清澄な上清を、ＮｏｖａＳｅｐＡｂｓｏｌｕｔｅプロテインＡクロマトグラフィーカラム（ベッド高１０ｃｍでカラム体積５ｍＬ）に適用し、Ｄｅｌｂｅｃｃｏｓリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．４で平衡化した。カラムを、ＰＢＳで先ず洗浄して結合していない物質を除去し、結合している物質を、ｐＨ勾配ｐＨ６．０〜ｐＨ３．０でその後溶出させた。溶出した物質を、ＡｃｑｕｉｔｙＵＰＬＣＢＥＨ４５０ＳＥＣ２．５μｍカラムを使用してＳＥＣ−ＵＰＬＣによって分画し、分析した。ＳＥＣ−ＵＰＬＣ分析を使用して、各画分に存在する％単量体及び多量体を決定した。Ａ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖ単量体は、およそ２．２分間の保持時間を有した。二量体、三量体、四量体及びより高次構造は全て、２．２分間未満の保持時間を示し、一括して多量体種又はより高分子量種（ＨＭＷＳ）と称した。

ＮｏｖａＳｅｐＡｂｓｏｌｕｔｅプロテインＡクロマトグラフィーカラムからの溶出の間に、２つのピークがｐＨ勾配全体で観察された、図１０を参照のこと。第２のピークにおける多量体種のレベル上昇と比較して、単量体のレベル上昇が、第１のピークに観察された、表５及び図１０を参照のこと。

Ａ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖは、Ｆｃを欠き、従ってＮｏｖａＳｅｐＡｂｓｏｌｕｔｅプロテインＡに対する結合は、Ｖ−領域のヒトＶＨ３可変フレームワークサブクラスによるものであった。多量体種の結合の増加が、プロテインＡに対するこれら分子の結合活性の増加によるものであったことが、提案される。多量体種は、より多くのＶＨ３領域を有し、従ってプロテインＡ樹脂により強く結合し、溶出により低いｐＨを必要とする。

（例６）
勾配溶出によるＡ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖのプロテインＡ（ＡｃｒｏＳｅｐ）精製
Ａ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖのＣＨＯ発現及び清澄化
ヒトＯＸ４０及び血清アルブミンに結合する構築物を、安定なジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）欠失チャイニーズハムスター卵巣細胞系（ＣＨＯＤＧ４４）において発現させた。細胞に、製造業者の使用説明書に従ってＮｕｃｌｅｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）を使用して、選択可能なマーカーであるＤＨＦＲ遺伝子と産物をコードしている遺伝子の両方を含有するプラスミドベクターをエレクトロポレーションによりトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、ヒポキサンチン及びチミジンを欠く培地中で、ＤＨＦＲ阻害剤メトトレキサートの存在下で選択した。培養を、バッチモードの振盪されたフラスコ培養で維持し、１４日後に採集した。

ｐＨ勾配溶出によるＡ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖのプロテインＡ精製（ＡｃｒｏＳｅｐ）
清澄な上清を、ＡｃｒｏＳｅｐプロテインＡクロマトグラフィーカラム（ベッド高１．５ｃｍでカラム体積１ｍＬ）に適用し、Ｄｅｌｂｅｃｃｏｓリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．４で平衡化した。カラムを、ＰＢＳで先ず洗浄して結合していない物質を除去し、結合している物質を、ｐＨ勾配ｐＨ６．０〜ｐＨ３．０でその後溶出させた。溶出した物質を、ＡｃｑｕｉｔｙＵＰＬＣＢＥＨ４５０ＳＥＣ２．５μｍカラムを使用してＳＥＣ−ＵＰＬＣによって分画し、分析した。ＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析を使用して、各画分に存在する％単量体及び多量体を決定した。Ａ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖ単量体は、およそ２．２分間の保持時間を有した。二量体、三量体、四量体及びより高次構造は全て、２．２分間未満の保持時間を示し、一括して多量体種又はより高分子量種（ＨＭＷＳ）と称した。

ＡｃｒｏＳｅｐプロテインＡクロマトグラフィーカラムからの溶出の間、単一の幅広い溶出ピークが、ｐＨ勾配全体で観察された、図１１を参照のこと。分解能の減少は、おそらくベッド高の減少によるものであるが、溶出ピークの下向の湾曲中の多量体種のレベル上昇と比較して、単量体のレベル上昇が、ピークの上向の湾曲中もなお観察された、表６及び図１１を参照のこと。

Ａ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖは、Ｆｃを欠き、従ってＡｃｒｏＳｅｐＡｂｓｏｌｕｔｅプロテインＡに対する結合は、Ｖ−領域のヒトＶＨ３可変フレームワークサブクラスによるものであった。多量体種の結合の増加が、プロテインＡに対するこれら分子の結合活性の増加によるものであったことが、提案される。多量体種は、より多くのＶＨ３領域を有し、従ってプロテインＡ樹脂により強く結合し、溶出により低いｐＨを必要とする。

（例７）
ｐＨ勾配溶出によるＴｒＹｂｅ（登録商標）のプロテインＡ精製
ｐＨ勾配溶出によるＴｒＹｂｅ（登録商標）のプロテインＡ精製
ＴｒＹｂｅ（登録商標）のＣＨＯ発現及び清澄化
ＷＯ２０１５／１９７７７２に記載されている形式Ｆａｂ−２ｘｄｓｓｃＦｖの多重特異性三価抗体分子（ＴｒＹｂｅ［登録商標］）を、安定なジヒドロ葉酸（ｄｉｈｙｒｏｆｏｌａｔｅ）レダクターゼ（ＤＨＦＲ）欠失チャイニーズハムスター卵巣細胞系（ＣＨＯＤＧ４４）において発現させた。細胞に、製造業者の使用説明書に従ってＮｕｃｌｅｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）を使用して、選択可能なマーカーであるＤＨＦＲ遺伝子と産物をコードしている遺伝子の両方を含有するプラスミドベクターをトランスフェクした。トランスフェクトした細胞を、ヒポキサンチン及びチミジンを欠く培地中で、ＤＨＦＲ阻害剤メトトレキサートの存在下で選択した。発現を、高い細胞数を産する独自のフェドバッチ培養プロセスで実施した。

細胞培養上清の清澄化を、遠心分離（４０００×ｇ、室温で６０分間）によって実施し、次に深層及び滅菌ろ過した。清澄な細胞培養上清を、Ｄｅｌｂｅｃｃｏｓリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．４で平衡化したＨｉＴｒａｐＭａｂＳｅｌｅｃｔ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）５ｍＬに適用した。カラムをＰＢＳで洗浄し、結合している物質をｐＨ勾配、ｐＨ７．４〜ｐＨ２．１で溶出させた、図２１を参照のこと。溶出した物質を、Ｇ３０００ＳＥＣ−ＨＰＬＣ及び４〜２０％Ｔｒｉｓ／グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元及び非還元）によって分画し、分析した。ＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析を使用して、％単量体及び多量体を決定した。ＴｒＹｂｅ（登録商標）単量体は、およそ９．４分間の保持時間を有する。二量体、三量体、四量体及びより高次構造は全て、保持時間＜９．４分を有し、一括して多量体種又はＨＭＷＳと称した。ＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析の場合、画分のクロマトグラムは、図２２を参照のこと。

ｐＨ勾配溶出の全体で、２つのピークが、下向の湾曲上の肩とともに観察された、図２１を参照のこと。これら３つの画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した、図２３を参照のこと。非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより溶出プロファイルの全体でいくつかのバンドが、観察された。単量体は、１１６〜２００ｋＤａ分子量バンドの間に泳動される。単量体より上に泳動される全てのバンドを、一括して多量体又はＨＭＷＳと称した。鎖間ジスルフィド種を欠いている軽鎖関連不純物並びにジスルフィド結合していない重鎖及び軽鎖は、３７〜５５ｋＤａ分子量マーカーの間に泳動される。画分１（レーン２）は、単量体及び軽鎖関連種で主に構成されており、ＨＭＷＳは殆ど又は全く見えなかった。単量体は、画分２（レーン３）における主要なバンドである。ＨＭＷＳバンドが見えるが、そのレベルは、画分３（レーン４）に見られるそれに対し有意に減少している。還元ゲルにおいて、産物関連種の全ては、レーン３及び４において還元できない物質の弱いバンドを有する重鎖及び軽鎖にまで還元される。レーン２により、画分１が軽鎖関連種についてかなり濃縮されたことが確認される。

第１ピーク（１）は、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより軽鎖関連不純物と同定され、ＳＥＣ−ＨＰＬＣで分析したときＨＭＷＳ２％を含有した。第２ピーク（２）は、ＴｒＹｂｅ（登録商標）と同定され、単量体７２％及びＨＭＷＳ２２％を含有した、表７及び図２４を参照のこと。ピーク２の下向の湾曲、画分３は、ＴｒＹｂｅ（登録商標）と同定され、単量体６％及びＨＭＷＳ９２％を含有した。

ＴｒＹｂｅ（登録商標）は、Ｆｃを欠き、従ってプロテインＡに対する結合は、Ｖ−領域のヒトＶＨ３可変フレームワークサブクラスによるものであった。多量体種の結合の増加が、プロテインＡに対するこれら分子の結合活性の増加によるものであったことが、提案される。多量体種は、より多くのＶＨ３領域を有し、従ってプロテインＡ樹脂により強く結合し、溶出により低いｐＨを必要とする。

（例８）
ｐＨ勾配溶出によるＢＹｂｅのプロテインＡ精製
ＢＹｂｅのＣＨＯ発現及び清澄化
Ｆａｂ−ｓｃＦｖ融合タンパク質（Ｂｙｂｅ）を、異なる可変領域配列を使用してＷＯ２０１３／０６８５７１の例４に記載の通り基本的に構築した。構築物を、安定なジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）欠失チャイニーズハムスター卵巣細胞系（ＣＨＯＤＧ４４）において発現させた。細胞に、製造業者の使用説明書に従ってＮｕｃｌｅｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）を使用して、選択可能なマーカーであるＤＨＦＲ遺伝子と産物をコードしている遺伝子の両方を含有するプラスミドベクターをトランスフェクした。トランスフェクトした細胞を、ヒポキサンチン及びチミジンを欠く培地中で、ＤＨＦＲ阻害剤メトトレキサートの存在下で選択した。振とうフラスコ段階まで培養した後に、生育及び生産性を評価し、２４個の最も高発現しているクローンを選んで、フェドバッチ培養振とうフラスコプロセスにおいて評価した。３Ｌの振とうフラスコに、０．３×１０^６個生細胞／ｍＬの開始密度で、１Ｌの培養で植え付け、５％ＣＯ_２の空気中で、３６．８℃に制御した。栄養分供給を３〜１２日目に添加し、グルコースを、その濃度が５．８ｇ／Ｌ未満に低下した際にボーラス添加で添加した。１４日目に培養を、４０００×ｇで６０分間の遠心分離によって採集し、その後０．２μｍろ過した。

ｐＨ勾配溶出によるＢＹｂｅのプロテインＡ精製
清澄な細胞培養上清を、Ｓｉｇｍａリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．４で平衡化したＨｉＳｃｒｅｅｎＭａｂＳｅｌｅｃｔ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラム４．７ｍＬに適用した。カラムを、ＰＢＳで、続けて９０％０．２Ｍリン酸ナトリウム／１０％クエン酸、ｐＨ７．４で洗浄し、結合している物質をｐＨ７．４〜ｐＨ２．１のｐＨ勾配で溶出させた、図２５を参照のこと。溶出した物質を、Ｇ３０００ＳＥＣ−ＨＰＬＣ及び４〜２０％Ｔｒｉｓ／グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元及び非還元）によって分画し、分析した。ＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析を使用して、％単量体及び多量体を決定した。ＢＹｂｅ単量体は、およそ９．６分間の保持時間を有する。二量体、三量体、四量体及びより高次構造は全て、保持時間＜９．６分を有し、一括して多量体種又はＨＭＷＳと称した。ＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析の場合、画分のクロマトグラムは、図２６を参照のこと。

ｐＨ勾配溶出の全体で、単一のピークが観察された、図２５を参照のこと。溶出ピーク画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した、図２７を参照のこと。非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより溶出プロファイルの全体でいくつかのバンドが、観察された。単量体は、９８ｋＤａ分子量マーカー近くに泳動される。単量体（２５０ｋＤａ〜９８ｋＤａ分子量マーカーの間）より上に泳動される全てのバンドを、一括して多量体又はＨＭＷＳと称した。ジスルフィド結合していない重及び軽鎖は、５０〜６４ｋＤａの間及び３０ｋＤａ分子量マーカーの位置にそれぞれ泳動される。画分Ｂ９〜Ｂ６（レーン６〜９）は、単量体で主に構成されており、ＨＭＷＳは殆ど又は全く見えなかった。画分Ｂ５〜Ｂ３（レーン１０〜１２）においてＨＭＷＳバンドは、ｐＨ勾配がより酸性になるにつれて増加する／より強くなる。還元ゲルにおいて、産物関連種の全ては、重鎖及び軽鎖にまで還元される。

溶出ピークは、ＢＹｂｅと同定され、全体で単量体８４％及びＨＭＷＳ１６％を含有した、表８及び図２８を参照のこと。

ＢＹｂｅは、Ｆｃを欠き、従ってプロテインＡに対する結合は、Ｖ−領域のヒトＶＨ３可変フレームワークサブクラスによるものであった。多量体種の結合の増加が、プロテインＡに対するこれら分子の結合活性の増加によるものであったことが、提案される。多量体種は、より多くのＶＨ３領域を有し、従ってプロテインＡ樹脂により強く結合し、溶出により低いｐＨを必要とする。

Claims

単量体形態のヒトＶＨ３ドメイン含有抗体を得るための方法であって、前記方法が、
ａ）抗体がプロテインＡに結合できる条件下で、プロテインＡがドメインＤ及び／又はＥを含むプロテインＡクロマトグラフィー物質に、単量体及び多量体形態のヒトＶＨ３ドメイン含有抗体を含む混合物を適用する工程と、
ｂ）単量体形態の前記ヒトＶＨ３ドメイン含有抗体を回収する工程と
を含み、
プロテインＡクロマトグラフィーから回収される溶出液は、適用した混合物に対して多量体抗体よりも単量体抗体が濃縮されており、
前記ヒトＶＨ３ドメイン含有抗体がＦｃ領域を含有しない、上記方法。
ヒトＶＨ３ドメイン含有抗体を製造するための方法であって、前記方法が、
ａ）宿主細胞において抗体を発現させる工程と、
ｂ）前記抗体、宿主細胞及び他の夾雑物を含有する混合物を回収する工程と、
ｃ）プロテインＡがドメインＤ及び／又はＥを含む少なくとも１つのプロテインＡクロマトグラフィー工程を使用して前記抗体を精製する工程と、
ｄ）ヒトＶＨ３含有抗体を回収する工程と
を含み、
プロテインＡクロマトグラフィーから回収される溶出液は、適用した混合物に対して多量体抗体よりも単量体抗体が濃縮されており、
前記ヒトＶＨ３ドメイン含有抗体がＦｃ領域を含有しない、上記方法。
ａ）プロテインＡがドメインＤ及び／又はＥを含むプロテインＡクロマトグラフィー物質に、単量体及び多量体形態のヒトＶＨ３ドメイン含有抗体を含む混合物を適用する工程と、
ｂ）前記抗体をプロテインＡに結合させる工程と、
ｃ）単量体形態の前記抗体の結合を選択的に破壊する溶出緩衝液を適用する工程と、
ｄ）得られた溶出液を回収する工程と
を含む、多量体形態の抗体から単量体形態のヒトＶＨ３ドメイン含有抗体を分離する方法であって、プロテインＡクロマトグラフィーから回収される溶出液は、適用した混合物に対して多量体抗体よりも単量体抗体が濃縮されており、
前記ヒトＶＨ３ドメイン含有抗体がＦｃ領域を含有しない、上記方法。
さらに、
ｅ）多量体形態の前記抗体の結合を破壊する第２の溶出緩衝液を適用し、この第２の溶出液を回収する工程を含む、請求項３に記載の方法。
多量体形態の抗体から単量体形態のヒトＶＨ３ドメイン含有抗体を分離する方法であって、前記方法が、
ａ）プロテインＡがドメインＤ及び／又はＥを含むプロテインＡクロマトグラフィー物質に、単量体及び多量体形態のヒトＶＨ３ドメイン含有抗体を含む混合物を適用する工程と、
ｂ）多量体形態の前記抗体を結合させる工程と、
ｃ）フロースルーにおいて単量体形態の前記抗体を回収する工程と
を含み、
プロテインＡクロマトグラフィーから回収される溶出液は、適用した混合物に対して多量体抗体よりも単量体抗体が濃縮されており、
前記ヒトＶＨ３ドメイン含有抗体がＦｃ領域を含有しない、上記方法。
さらに、
ｄ）多量体形態の前記抗体の結合を選択的に破壊する溶出緩衝液を適用する工程と、
ｅ）ｄ）の結果得られる溶出液を回収する工程と
を含む、請求項５に記載の方法。
溶液中において結合していない物質が除去されるように、単量体及び多量体形態の前記ヒトＶＨ３ドメイン含有抗体を含む混合物を適用した後に第１の溶液が前記プロテインＡクロマトグラフィー物質に添加される、請求項１から６までのいずれか一項に記載の方法。
前記結合している抗体が遊離するように溶出緩衝液が前記プロテインＡクロマトグラフィー物質に適用される、請求項１、２又は７に記載の方法。
前記プロテインＡが、天然の組換えプロテインＡである、請求項１から８までのいずれか一項に記載の方法。
前記ＶＨ３ドメイン含有抗体が、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ−Ｆｖ、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ、Ｆａｂ−（ｓｃＦｖ）_２、Ｆａｂ−（Ｆｖ）_２、Ｆａｂ−ｄｓＦｖ、ダイアボディ、トリアボディ及びテトラボディから選択される、請求項１から９までのいずれか一項に記載の方法。
前記ＶＨ３ドメイン含有抗体が、ヒトＶＨ３ドメインを少なくとも２つ含む、請求項１から１０までのいずれか一項に記載の方法。
前記ＶＨ３ドメイン含有抗体が、ＯＸ４０に特異的に結合する、請求項１から１１までのいずれか一項に記載の方法。
前記ＶＨ３ドメイン含有抗体が、
−配列番号１、配列番号２及び配列番号３でそれぞれ定義される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３；並びに
−配列番号４、配列番号５及び配列番号６でそれぞれ定義される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む、請求項１２に記載の方法。
前記ＶＨ３ドメイン含有抗体が、配列番号１１で定義される第２重鎖可変ドメイン及び配列番号１２で定義される第２軽鎖可変ドメインをさらに含む、請求項１３に記載の方法。