CN114401984A - 纯化抗体的方法 - Google Patents

纯化抗体的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN114401984A
CN114401984A CN202080044910.3A CN202080044910A CN114401984A CN 114401984 A CN114401984 A CN 114401984A CN 202080044910 A CN202080044910 A CN 202080044910A CN 114401984 A CN114401984 A CN 114401984A
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
ser
imidazole
thr
gly
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202080044910.3A
Other languages
English (en)
Inventor
N·A·沃特森
C·W·菲本
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
UCB Biopharma SRL
Original Assignee
UCB Biopharma SRL
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by UCB Biopharma SRL filed Critical UCB Biopharma SRL
Publication of CN114401984A publication Critical patent/CN114401984A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 - B01D15/36
    • B01D15/3804—Affinity chromatography
    • B01D15/3809—Affinity chromatography of the antigen-antibody type, e.g. protein A, G, L chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/18—Ion-exchange chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/06—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
    • C07K16/065—Purification, fragmentation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/26—Conditioning of the fluid carrier; Flow patterns
    • G01N30/38—Flow patterns
    • G01N2030/381—Flow patterns centrifugal chromatography
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • G01N2030/8809—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample
    • G01N2030/8813—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials
    • G01N2030/8831—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials involving peptides or proteins

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及制造重组抗体分子的领域。特别地，提供了纯化这种重组抗体分子的方法，其中在重组抗体分子从亲和色谱树脂诸如基于蛋白A的树脂中洗脱的过程中加入咪唑或咪唑类似物。

Description

纯化抗体的方法
发明领域
本发明涉及制造重组抗体分子的领域，尤其涉及使用亲和层析和使用特定洗脱条件纯化此类重组抗体分子的方法。
发明背景
在治疗领域，生物实体诸如蛋白质(尤其包括抗体和抗体衍生的分子)的使用一直在不断地获得存在和重要性，与此同时，对受控的大规模制造过程的需求也随之发展。
蛋白A是由几种金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)菌株产生的细胞壁组分，其与抗体分子的Fc区结合。使用固定化蛋白A作为配体的亲和色谱已经广泛用于抗体纯化，并且至今仍是大多数抗体纯化过程中的核心纯化步骤，允许从原料中高度去除杂质。此外，还已知蛋白A结合抗体分子上存在的VH3区，这就提供了基于VH3区与蛋白A之间的亲和相互作用纯化缺少Fc区的替代抗体形式的某些策略。
蛋白质A在中性pH下对Fc结构域具有高亲和力。因此，通常在中性pH下将含有待纯化抗体的起始材料加载在蛋白A树脂上。典型的过程之后是一个或多个用也在中性pH下的缓冲液洗涤色谱材料的步骤，以确保尽可能多地去除杂质。最后，洗脱步骤是从蛋白A中回收结合的抗体所必需的。该洗脱步骤包括使用酸性pH值(通常为约2.5至约4.0)的洗脱缓冲液，该缓冲液会破坏抗体和蛋白A之间的相互作用。类似地，WO2016/169992描述了基于VH3区通过蛋白A的结合的用于缺少Fc区的抗体分子的纯化方法，该方法也依赖于pH的酸化从蛋白A中洗脱。
通常，较低的pH也允许较低的洗脱体积，这直接影响整个工艺的效率。关于较低洗脱体积的另一个考虑是，它们使得能够使用静态结合条件，这与常规的动态结合条件相反，在常规的动态结合条件下，在色谱树脂上洗涤大量洗脱缓冲液。
然而，必须在低到足以破坏抗体分子与蛋白A结合的pH值、并且又未低到破坏蛋白质三级结构的pH值之间找到平衡。此外，聚集是暴露于酸性条件下的常见后果，导致在纯化过程中必须除去更多杂质，最终导致较低的工艺产率。因此，对于一些更不稳定的抗体分子，找到允许在更高的pH下从蛋白A中洗脱的条件可能是有利的。
为了克服这些挑战，已经有不同的尝试通过向洗脱缓冲液中添加额外的组分来增强抗体分子从蛋白A中的洗脱，所述组分可与抗体分子竞争对蛋白A的结合并且/或者增加洗脱pH。
Arakawa等人(用精氨酸水溶液从蛋白-A柱中洗脱抗体；2004；ProteinExpression&Purification，244-248)和US 8,470,328描述了在具有4.0至5.0的pH的洗脱缓冲液中使用精氨酸或精氨酸衍生物。然而，随着洗脱缓冲液的pH升高，洗脱体积也增加，因为高pH只会导致抗体从树脂上弱解离，然后抗体也容易重新结合到树脂上。
商业大规模生产工艺的另一个考虑因素是每个色谱循环所花费的时间，这又直接受到色谱载体诸如蛋白A的装载、洗涤和洗脱中所使用的体积的影响。当放大到生产体积时，在小范围内优化这些参数会有很大的影响，导致在必须处理的废料方面的改进，更短的生产时间，以及因此而改善的成本分布。
还使用了蛋白质纯化的替代形式，其包括表达具有组氨酸标签的重组蛋白质，然后使用镍亲和色谱(其结合组氨酸标签)纯化所得蛋白质，并借助于咪唑洗脱蛋白质。然而，这种方法的不利方面是，对于许多用途，需要在纯化后通过蛋白水解去除标签才可以使用所述蛋白质。
基于以上所述，持续需要提供在生产工艺中纯化抗体的快速和稳定的方法，特别是从亲和色谱树脂中洗脱抗体的改进方法。本发明解决了这一需求。
发明内容
在第一方面，本发明涉及用于纯化抗体的方法，其包括：
a)将包含待纯化抗体的混合物装载到亲和色谱树脂上，其中所述亲和色谱树脂不是镍基、锌基或钴基树脂，
b)用洗涤缓冲液洗涤色谱树脂；
c)用包含0.01M至1.0M咪唑或咪唑类似物且pH为3至5的洗脱缓冲液洗脱抗体。
附图说明
图1：静态结合研究结果；
图2：在pH 3.6+/-咪唑下的IgG1色谱洗脱曲线重叠图；
图3：在pH 4.0+/-咪唑下的IgG1色谱洗脱曲线重叠图；
图4：在pH 3.6+/-咪唑下的IgG4色谱洗脱曲线重叠图；
图5：在pH 4.0+/-咪唑下的TrYbe(VH3)色谱洗脱曲线重叠图；
图6：动态结合研究结果；
图7：在pH 3.6+/-1,3二甲基-1H-吡唑下的IgG1色谱洗脱曲线重叠图。
具体实施方案
本发明通过提供用于纯化抗体的新方法解决了上述问题，所述方法包括亲和色谱步骤，其中在咪唑或咪唑类似物存在的情况下进行洗脱。不受任何理论的束缚，据信咪唑或其类似物结合在洗脱步骤过程中从色谱树脂解离的抗体分子。因此，咪唑或其类似物能够防止抗体分子与树脂重新结合。这有助于改善洗脱动力学，从而减少洗脱体积，这是优于本领域所述方法的有利方面。
本发明的方法适用于包括在静态和动态条件下进行的亲和色谱步骤的抗体纯化方法。
在本发明的上下文中，动态条件被认为是这样的条件，其中亲和树脂通常在色谱柱或膜中，将包含待纯化的抗体、洗涤缓冲液和/或洗脱缓冲液的混合物添加到柱上，并从柱中回收洗脱液。静态色谱条件是这样的条件，所述条件涉及将色谱树脂与包含待纯化抗体的混合物混合，然后孵育一段时间，随后将色谱树脂从液相中分离，随后从色谱树脂中洗脱结合的部分。
在本发明方法的一个优选实施方案中，步骤a)、b)和c)中的一个、两个或全部步骤在动态条件下进行。
在第一方面，本发明涉及用于纯化抗体的方法，其包括：
a)将包含待纯化的抗体的混合物装载到亲和色谱树脂上，
其中所述亲和色谱树脂不是镍基、锌基或钴基树脂，
b)用洗涤缓冲液洗涤色谱树脂，以及
c)用包含0.01M至1.0M咪唑或咪唑类似物且pH为3至5的洗脱缓冲液洗脱抗体。
亲和色谱树脂能够结合抗体，优选通过抗体的Fc区或VH3结构域。在一个实施方案中，所述亲和色谱树脂不是基于金属离子的树脂。在另一个实施方案中，所述亲和色谱树脂选自：蛋白A色谱树脂、蛋白G色谱树脂和蛋白L色谱树脂。
本领域技术人员可以获得许多含有蛋白A、蛋白G或蛋白L的亲和色谱材料，例如
Figure BDA0003419768850000041
(GE Healthcare)、
Figure BDA0003419768850000042
(Novasep)、Captiv
Figure BDA0003419768850000043
(Repligen)、Praesto AP(Purolite)或
Figure BDA0003419768850000044
(JSR)。
适合在蛋白A色谱中用作洗涤和洗脱缓冲液的缓冲液在本领域中是容易获得的，并且可以选自如下非限制性的实例：磷酸盐缓冲盐水(PBS)、Tris、组氨酸、乙酸盐、甲酸盐、柠檬酸盐缓冲液或MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸咪唑)、BES(N,N-(双-2-羟基乙基)-2-氨基乙磺酸)、MOPS(3-(N-吗啉代)-丙磺酸)或HEPES(N-2-羟基乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸)缓冲液。
在一个实施方案中，洗脱缓冲液包含0.01M至0.75M的咪唑或咪唑类似物，诸如0.01M至0.5M，例如0.1M至0.5M，诸如0.2M至0.5M，例如0.2M至0.3M，诸如0.25M的咪唑或咪唑类似物。
在一个实施方案中，洗脱缓冲液的pH为3.5-4.5，诸如3.5至4.0或4.0至4.5，或3.6至3.9，诸如3.7至3.9。
在一个实施方案中，洗涤缓冲液还包含咪唑或咪唑类似物。在一个实施方案中，洗涤缓冲液包含0.01M至0.75M的咪唑或咪唑类似物，诸如0.01M至0.5M，例如0.1M至0.5M，例如0.2M至0.5M，例如0.2M至0.3M，诸如0.25M的咪唑或咪唑类似物。
咪唑是化学式为C3N2H4的有机化合物。其为芳香杂环，分类为二唑，并有不相邻的氮原子。
如本文中所用，术语“咪唑类似物”是指咪唑或包含至少两个氮原子的其它5元环结构(即二唑或三唑)，诸如吡唑和三唑。
该环可以是被取代的或未被取代的。如果存在取代，在一个实施方案中，它们选自甲基、乙基、羟基或羟甲基。在一个实施方案中，只有一个取代基，诸如一个甲基。在另一个实施方案中，存在两个取代，诸如两个甲基。
在一个实施方案中，该环在1位或2位处未被取代，诸如在1位或2位未被取代的咪唑环(式I)。
Figure BDA0003419768850000051
(式I-咪唑)
优选的咪唑类似物包括4(5)-甲基咪唑、吡唑、1,5-二甲基-1H-吡唑、1,3-二甲基-1H-吡唑和1H-咪唑-1-基甲醇。
在另一个实施方案中，咪唑类似物是组氨酸或组氨酸类似物，诸如正-boc-L-组氨酸、正-苄基氧基羰基-D-组氨酸或L-组氨酸甲酯二氢氯化物。
在一个优选实施方案中，该环是未被取代的，优选为未取代的咪唑或吡唑。
在一个实施方案中，本发明的方法包括在将包含抗体的混合物装载到色谱树脂上之前，用包含咪唑或咪唑类似物的平衡缓冲液平衡色谱树脂的进一步步骤。
在另外一个实施方案中，本发明的方法将包括一个或多个额外的色谱步骤以除去剩余的杂质。通常，此类步骤将使用非亲和色谱步骤，所述步骤使用具有适当功能性的固相，用于凝胶过滤色谱、阳离子色谱、阴离子色谱、混合模式色谱、疏水色谱和疏水电荷诱导色谱。这些可以以结合和洗脱模式或流通模式进行操作。在流通模式中，杂质在固相中结合或具有降低的迁移率，而靶蛋白在洗出液或流通级分中得到回收。本领域技术人员很容易获得用于色谱的合适的固相，诸如具有合适功能性的珠状树脂或膜。在根据本发明方法的一个特定实施方案中，所述方法另外包括以流通模式操作的阴离子交换色谱的步骤。
在另外一个特定实施方案中，本发明的方法包括蛋白质A色谱步骤，随后是第一色谱步骤和第二色谱步骤，所述第一色谱步骤是产生含有蛋白质的流通液的阴离子交换色谱，所述第二色谱步骤是阳离子交换色谱，从中回收含有蛋白质的洗脱液。
在另一个实施方案中，本发明的方法包括蛋白质A色谱，随后是第一色谱步骤和第二色谱步骤，所述第一色谱步骤是从中回收含有蛋白质的洗脱液的阳离子交换色谱，所述第二色谱步骤是产生含有蛋白质的流通液的阴离子交换色谱。
抗体
如本文中所用，术语“抗体”包括单克隆抗体和多克隆抗体。此外，如本文中所用，术语“抗体”包括但不限于通过本领域已知的重组技术产生的重组抗体。“抗体”包括任何物种的抗体，特别是哺乳动物物种的抗体；诸如任何同种型的人抗体，包括IgD、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgG4IgE和作为该基本结构的二聚体产生的抗体，包括IgGA1、IgGA2或五聚体诸如IgM及其修饰变体，非人的灵长类抗体，例如来自黑猩猩、狒狒、恒河猴或食蟹猴的抗体；啮齿动物抗体，例如来自小鼠或大鼠的抗体；兔、山羊或马抗体；以及骆驼抗体(例如来自骆驼或美洲驼的抗体，诸如NanobodiesTM)及其衍生物；或禽类物种诸如鸡抗体或鱼物种诸如鲨鱼抗体。术语“抗体”也指“嵌合”抗体，其中至少一条重链和/或轻链抗体序列的第一部分来自第一物种，并且重链和/或轻链抗体序列的第二部分来自第二物种。本文中目标嵌合抗体包括“灵长类化的(primatized)”抗体，其包含源自非人灵长类动物(例如，旧大陆猴，诸如狒狒、恒河猴或食蟹猴)的可变结构域抗原结合序列和人恒定区序列。“人源化”抗体是嵌合抗体，其包含源自非人抗体的序列。在大多数情况下，人源化抗体是其中来自受者的高变区的残基被非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠、兔、鸡或非人类灵长类动物的高变区[或互补决定区(CDR)]的残基取代，具有所需的特异性、亲和力和活性的人抗体(受者抗体)。在大多数情况下，CDR之外，即框架区(FR)中的人(受者)抗体的残基另外地被相应的非人残基取代。此外，人源化抗体可包含受者抗体或供体抗体中不存在的残基。进行这些修饰以进一步精制抗体特性。人源化降低了非人抗体在人体中的免疫原性，从而促进了抗体在人疾病治疗中的应用。人源化抗体和产生它们的几种不同技术在本领域中是公知的。术语“抗体”也指人抗体，其可作为人源化的替代物产生。例如，有可能产生转基因动物(例如小鼠)，其在免疫后能够在不产生内源性鼠抗体的情况下产生完全人抗体库。体外获得人抗体/抗体片段的其它方法基于展示技术，诸如噬菌体展示或核糖体展示技术，其中使用至少部分人工产生的或来自供体免疫球蛋白可变(V)结构域基因库的重组DNA文库。用于产生人抗体的噬菌体和核糖体展示技术在本领域中是公知的。人抗体也可以从分离的人B细胞产生，用目标抗原离体免疫所述分离的人B细胞，随后将其融合产生杂交瘤，然后可以对所述杂交瘤筛选最佳人抗体。如本文中所用，术语“抗体”也指无糖基化的(aglycosylated)抗体。
如本文中所用，术语“抗体”不仅指任何物种的全长抗体，包括来自人(例如IgG)和其它哺乳动物物种的全长抗体，而且还指抗体片段。抗体的片段包含本领域已知的至少一个重链或轻链免疫球蛋白结构域，并与一种或多种抗原结合。根据本发明的抗体片段的实例包括Fab、Fab’、F(ab’)2以及Fv和scFv片段；以及二抗体、三抗体、四抗体、微型抗体、结构域抗体(dAb)，诸如sdAb、VHH和VNAR片段、单链抗体、由抗体片段或抗体形成的双特异性、三特异性、四特异性或多特异性抗体，包括但不限于Fab-Fv或Fab-Fv-fv构建体。如上定义的抗体片段是本领域已知的。
在一个实施方案中，使用本发明方法纯化的抗体不包含任何下列基序：聚组氨酸基序、HQ基序、HN基序或hat基序，其中聚组氨酸基序是五个或更多个连续组氨酸残基的序列，HQ基序是包含组氨酸和谷氨酰胺的至少三个交替的序列(HQHQHQ(SEQ ID NO:7))，HN基序是包含组氨酸和天冬酰胺的至少三个交替的序列(HNHNHN(SEQ ID NO:8))以及HAT基序是序列KDHLIHNVHKEEHAHAHNK(SEQ ID NO:9)。
在本发明方法的一个实施方案中，待纯化的抗体是包含Fc区的抗体。
在一个实施方案中，待纯化的抗体是包含CH2和CH3结构域的抗体。
在一个实施方案中，待纯化的抗体是含有VH3区并通过VH3区结合亲和色谱树脂的抗体。
在另一个实施方案中，抗体选自：IgG、Fab’、F(ab’)2、scFv、Fab-Fv、Fab-scFv、Fab-(scFv)2、Fab-(Fv)2、二抗体、三抗体和四抗体。
在本发明方法的一个实施方案中，抗体是FabFv或其二硫化物稳定的形式，如PCT/EP2014/074409(其通过引用并入本文)中所公开的。
在一个实施方案中，抗体包含对人血清白蛋白特异的结合结构域，特别是如WO2013/068563(其通过引用并入本文)中公开的CDR或可变区的结合结构域。
在一个实施方案中，抗体，例如Fab-dsFv形式是在PCT/EP2014/074409或WO2014/019727(其通过引用并入本文)中公开的抗体。
在另一个实施方案中，抗体是WO2013/068571(其通过引用并入本文)中公开的Fab-scFv融合蛋白形式。
在另一个实施方案中，抗体是多特异性抗体分子，其包含或由以下组成：
a)式(I)的多肽链：
VH-CH1-X-V1；和
b)式(II)的多肽链：
VL-CL-Y-V2；
其中：
VH代表重链可变结构域；
CH1代表重链恒定区的结构域，例如其结构域1；
X代表键或接头；
Y代表键或接头；
V1代表dsFv、sdAb、scFv或dsscFv；
VL代表轻链可变结构域；
CL代表来自轻链恒定区的结构域，诸如Ckappa；
V2代表dsFv、sdAb、scFv或dsscFv；
其中V1或V2中的至少一个是dsFv或dsscFv，如WO2015/197772(其通过引用并入本文)中所述。
如本文中所用，“单链可变片段”或“scFv”是指包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)或由所述重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)组成的单链可变片段，其通过VH与VL可变结构域之间的肽接头来稳定。VH和VL可变结构域可以采用任何合适的取向，例如VH的C端可与VL的N端连接，或者VL的C端可与VH的N端连接。
“二硫键稳定化的单链可变片段”或“dsscFv”是指由VH与VL可变结构域之间的肽接头稳定化，并且还包括VH与VL之间的结构域间二硫键的单链可变片段。
“二硫键稳定化的可变片段”或“dsFv”是指单链可变片段，其在VH与VL可变结构域之间不包含肽接头，而是通过VH与VL之间的结构域间二硫键稳定。
在一个特定的实施方案中，抗体是WO2015/197772(其通过引用并入本文)中描述的Fab-2x dsscFv形式的多特异性抗体。
在又一特定实施方案中，Fab-2x dsscFv形式的多特异性抗体是三价抗体，即每个Fv结合不同的表位。
在又一特定实施方案中，多特异性抗体具有如WO2015/197772(其通过引用并入本文)中所述的Fab-dsscFv-dsFv形式。
在一个实施方案中，待纯化的抗体包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的序列。
SEQ ID NO:1:(a)抗白蛋白抗体的重链可变结构域(无ds)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIDLSNYAINWVRQAPGKGLEWIGIIWASGTTFYATWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARTVPGYSTAPYFDLWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:2:(b)抗白蛋白抗体的重链可变结构域(ds)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIDLSNYAINWVRQAPGKCLEWIGIIWASGTTFYATWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARTVPGYSTAPYFDLWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:3:(c)抗白蛋白抗体的轻链可变结构域(无ds)
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCQSSPSVWSNFLSWYQQKPGKAPKLLIYEASKLTSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCGGGYSSISDTTFGGGTKVEIKRT
SEQ ID NO:4:(d)抗白蛋白抗体的轻链可变结构域(ds)
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCQSSPSVWSNFLSWYQQKPGKAPKLLIYEASKLTSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCGGGYSSISDTTFGCGTKVEIKRT
SEQ ID NO:5:对白蛋白特异的645gH5gL4
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIDLSNYAINWVRQAPGKGLEWIGIIWASGTTFYATWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARTVPGYSTAPYFDLWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCQSSPSVWSNFLSWYQQKPGKAPKLLIYEASKLTSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCGGGYSSISDTTFGGGTKVEIKRT
SEQ ID NO:6:对白蛋白特异的645gH5gL4ds
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIDLSNYAINWVRQAPGKCLEWIGIIWASGTTFYATWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARTVPGYSTAPYFDLWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCQSSPSVWSNFLSWYQQKPGKAPKLLIYEASKLTSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCGGGYSSISDTTFGCGTKVEIKRT
在许多实施方案中，包含在本发明方法的步骤a)中装载到亲和色谱树脂上的抗体的混合物直接或间接来源于细胞培养物(例如哺乳动物或细菌培养物)，其中抗体是重组产生的。
可以通过培养用编码重组抗体的一种或多种表达载体转染的真核宿主细胞来生产用于大规模商业目的的重组抗体或抗体衍生物，诸如抗体片段。真核宿主细胞优选哺乳动物细胞，更优选中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
哺乳动物细胞可以在支持其生长和抗体表达的任何培养基中培养，优选培养基是不含动物来源的产品诸如动物血清和蛋白胨的化学成分确定的培养基。本领域技术人员可以获得不同的细胞培养基，其包含维生素、氨基酸、激素、生长因子、离子、缓冲液、核苷、葡萄糖或等效能源的不同组合，以适当的浓度存在，以使得细胞生长和蛋白质产生。本领域技术人员已知，在细胞培养周期中的不同时间，另外的细胞培养基组分可以以合适的浓度包含在细胞培养基中。
哺乳动物细胞培养可以在任何合适的容器，诸如摇瓶或生物反应器中进行，根据所需的生产规模，其可以以或可以不以补料分批模式操作。这些生物反应器可以是例如搅拌罐或气升式反应器。有各种大规模生物反应器可供利用，其容量可以大于1,000L至50,000L，优选为5,000L至20,000L，或至10,000L。或者，较小规模的生物反应器，诸如2L至100L，也可用于制造待根据本发明方法纯化的抗体。
可以根据本发明的方法制造的抗体或其抗原结合片段通常存在于哺乳动物宿主细胞培养物(通常是CHO细胞培养物)的上清液中。对于其中目标蛋白诸如抗体或其抗原结合片段分泌在上清液中的CHO培养过程，所述上清液通过本领域已知的方法，通常通过离心收集。为避免疑问，上清液表示位于细胞培养物离心后沉淀细胞上方的液体。
在本发明的一个实施方案中，所述方法包括培养表达目标抗体的CHO细胞，回收上清液，并从混合物中纯化所述抗体，其中所述纯化包括至少一个根据本发明方法进行的亲和色谱步骤。
或者，宿主细胞优选为原核细胞，优选为革兰阴性菌。更优选地，宿主细胞是大肠杆菌(E.coli)细胞。用于蛋白质表达的原核宿主细胞是本领域公知的(Terpe,K.(2006).Overview of bacterial expression systems for heterologous proteinproduction:from molecular and biochemical fundamentals to commercialsystems.Appl Microbiol Biotechnol 72,211-222.)。宿主细胞是已被遗传工程化以产生目标蛋白质，诸如抗体片段的重组细胞。重组大肠杆菌宿主细胞可以来源于任何合适的大肠杆菌菌株，包括来自MC4100、TG1、TG2、DHB4、DH5α、DH1、BL21、K12、XL1Blue和JM109。一个实例是大肠杆菌菌株W3110(ATCC 27,325)，一种用于重组蛋白发酵的常用宿主菌株。抗体片段也可通过培养经修饰的大肠杆菌菌株，例如代谢突变体或缺乏蛋白酶的大肠杆菌菌株来产生。
可以根据本发明的方法纯化的抗体片段通常存在于大肠杆菌宿主细胞的周质或宿主细胞培养上清液中，这取决于蛋白质的性质、生产规模和所用的大肠杆菌菌株。将蛋白质靶向这些区室的方法在本领域是公知的(Makrides,S.C.(1996).Strategies forachieving high-level expression of genes in Escherichia coli.Microbiol Rev60,512-538.)。将蛋白质导向大肠杆菌周质的合适信号序列的实例包括大肠杆PhoA、OmpA、OmpT、LamB和OmpF信号序列。可通过依赖天然分泌途径或通过诱导外膜的有限渗漏以引起蛋白质分泌来将蛋白质靶向上清液，其实例是使用pelB前导序列、蛋白质A前导序列、细菌素释放蛋白质的共表达、丝裂霉素诱导的细菌素释放蛋白质以及向培养基中添加甘氨酸和共表达用于膜透化的kil基因。最优选地，在本发明的方法中，抗体在宿主大肠杆菌的周质中表达。
抗体在大肠杆菌宿主细胞中的表达也可以受诱导型系统的控制，由此重组抗体在大肠杆菌中的表达受诱导型启动子的控制。许多适用于大肠杆菌的诱导型启动子在本领域中是公知的，并且取决于启动子，重组蛋白的表达可通过不同的因素诸如温度或生长培养基中特定物质的浓度来诱导。诱导型启动子的实例包括可用乳糖或不可水解的乳糖类似物，异丙基-b-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导的大肠杆菌lac、tac和trc启动子，和分别用磷酸盐、色氨酸和L-阿拉伯糖诱导的phoA、trp和araBAD启动子。表达可通过例如添加诱导剂或温度变化(其中诱导是温度依赖性的)来诱导。当通过向培养物中添加诱导剂来实现重组蛋白表达的诱导时，可以根据发酵系统和诱导剂通过任何合适的方法添加诱导剂。
大肠杆菌宿主细胞培养物(发酵物)可以在支持大肠杆菌生长和重组蛋白表达的任何培养基中培养。所述培养基可以是任何化学成分确定的培养基，诸如Durany O,C.G.d.M.C.L.-S.J.(2004)Studies on the expression of recombinant fuculose-1-phosphate aldolase in Escherichia coli.Process Biochem 39,1677-1684中所述的培养基。
大肠杆菌宿主细胞的培养可以在任何合适的容器诸如摇瓶或发酵罐中进行，这取决于所需的生产规模。有各种大型发酵罐可供利用，其容量可以超过1,000升至最高达100,000升。优选地，使用1,000升至50,000升的发酵罐，更优选1,000升至25,000升、20,000升、15,000升、12,000升或10,000升的发酵罐。也可以使用容量在0.5升至1000升的小型发酵罐。
大肠杆菌的发酵可以在任何合适的系统(例如连续、分批或补料分批模式)中进行，这取决于所需的蛋白质和产率。如果需要，可将分批模式与营养剂或诱导剂的快速添加一起使用。或者，可使用补料分批培养，并且以分批模式预诱导培养物以最大比生长速率生长，所述最大比生长速率可以使用最初存在于发酵罐中的营养物和一种或多种用于控制生长速率的营养物进料方式来维持，直到发酵完成。补料分批模式也可以用于预诱导，以控制大肠杆菌宿主细胞的代谢，并允许达到更高的细胞密度。
如果需要，可从发酵培养基中收集宿主细胞，例如可以通过离心、过滤或浓缩从样品中收集宿主细胞。
在一个实施方案中，根据本发明的方法包括在提取抗体之前离心和细胞回收的步骤。
对于其中目标蛋白质诸如抗体片段存在于宿主细胞的周质空间中的大肠杆菌发酵过程，需要从宿主细胞中释放蛋白质。释放可以通过任何合适的方法，诸如通过机械或压力处理、冻融处理、渗压休克(osmo tic shock)、提取剂或热处理进行的细胞裂解来实现。用于蛋白质释放的此类提取方法在本领域是公知的。
在又一实施方案中，根据本发明的方法还包括从细胞培养基中回收宿主细胞，使用在还原剂存在下进行的蛋白质提取步骤收获蛋白质，回收由蛋白质提取步骤产生的含抗体的混合物，并从混合物中纯化所述抗体，其中所述纯化包括根据本发明的方法进行的至少一个亲和色谱步骤。
实施例
实施例1：静态结合MODDE研究
方法
以静态结合模式(CV＝1mL)使用PrA MabSelect SuRe树脂，GE。MODDE DoE研究被设计用于测试四种咪唑洗脱缓冲液(N1-N4)，其中以一式三份将第五缓冲液用于中心点(N5-N7)(表1)。用pH 7.0的100mM磷酸钠平衡树脂。将单克隆IgG1抗体以40g/L树脂加载到树脂上。然后用pH 7.0的100mM磷酸钠洗涤树脂。用这五种缓冲液之一进行洗脱，进行四个连续的洗脱循环以最大化回收率。然后计算每个洗脱循环所洗脱的总量。
表1–静态结合MODDE研究数据
Figure BDA0003419768850000151
结果和结论
图1是在MODDE分析软件中由表1的数据生成的系数图(coefficient plot)。每个条块代表所研究的参数之一，以及当参数值增加时，所测量的因子会发生什么。正条块表示参数的较高值增加了所测量的因子的值，而负条块表示参数的较高值减少了所测量的因子。
图1示出了咪唑对第1和第2循环时的回收量有静态显著影响。但对第3和第4循环没有影响，因为在这些步骤中大部分产物已经洗脱，产生的量与不存在咪唑时相当。高pH会对洗脱量和回收率产生负面影响，但添加咪唑可以抵消这种影响。随着越来越多的IgG1在较早的循环中被回收，咪唑由于其更快的洗脱动力学而使得循环数、从而洗脱体积减少。例如，与不含咪唑的4个循环相比，在pH 4.0下，含咪唑仅需要3个循环就能达到相同的量。
实施例2：IgG色谱图洗脱曲线
方法
以在动态结合模式使用两个MabSelect SuRe HiScreen柱。用pH7.0的100mM磷酸钠平衡树脂。将单克隆抗体IgG1或IgG4以50g/L树脂装载到树脂上。然后用pH 7.0的100mM磷酸钠洗涤树脂，接着用pH 6.9的100mM磷酸钠和500mM氯化钠进行盐洗涤。用pH 3.6或pH4.0(用NaOH调节的)的100mM柠檬酸钠或者用pH 3.6或pH4.0(用HCl调节的)的100mM柠檬酸钠和300mM咪唑进行洗脱。
结果和结论
图2和图3示出了针对IgG1单克隆抗体获得的结果：柠檬酸盐洗脱液在pH3.6下回收了83％的产物，在pH 4.0下回收了39％。然而，通过加入咪唑，这些产率分别增加到94％和65％。另外，在pH 3.6下，随着咪唑的加入，洗脱体积减小。在pH4.0下，使用咪唑的洗脱体积大于不使用咪唑的缓冲液的洗脱体积，这是因为洗脱了更多的产物，并且对于不使用咪唑的运行来说，为了达到相同的回收率，将需要接近无穷大的洗脱体积，因为其具有较慢的洗脱动力学。图4显示了用IgG4获得的等效结果。
实施例3：VH3色谱洗脱曲线
方法
以动态结合模式使用了两个MabSelect HiScreen柱,GE,(9.4mL CV)。用pH 7.0的100mM磷酸钠平衡树脂。如WO2015/197772
Figure BDA0003419768850000171
中所描述的形式Fab-2x dsscFv的多特异性三价抗体分子以30g/L树脂装载到树脂上。然后用pH 7.0的100mM磷酸钠洗涤树脂。用pH 4.0的100mM柠檬酸钠(用NaOH调节的)或者用pH 4.0的100mM柠檬酸钠加300mM咪唑(用HCl调节的)进行洗脱。
结果和结论
图5示出了柠檬酸盐洗脱在pH4.0下回收了36％的产物。然而，通过添加咪唑，在相同体积的洗脱缓冲液中，产率增加到49％。因此，咪唑的添加增加了洗脱动力学，从而允许更多的产物更快地洗脱，因此需要更少的缓冲液来实现相同的回收率。另外，该实验表明咪唑可以防止产物通过Fc和VH3结合位点重新结合到树脂配体上。
实施例4：IgGMODDE研究
方法
以动态结合模式使用了两个MabSelect SuRe HiScreen柱，GE,(9.4mL CV)。用pH7.0的100mM磷酸钠平衡树脂。将单克隆抗体IgG1以50g/L树脂装载到树脂上。然后用pH 7.0的100mM磷酸钠洗涤树脂，接着用pH 6.9的100mM磷酸钠和500mM氯化钠进行盐洗涤。在具有不同咪唑浓度和pH值的DoE中测试了一系列不同的0.1M柠檬酸盐洗脱缓冲液(表2)。测试了额外的咪唑洗涤缓冲液，代替最终的预洗脱洗涤，以研究用咪唑预装载柱是否对洗脱动力学有更大的影响。
表.2–动态结合MODDE研究数据
Figure BDA0003419768850000181
结果和结论
图6是在MODDE分析软件中以与图1相同的方式但使用了表2中的数据生成的系数图。“ImE”是洗脱缓冲液中咪唑的浓度，“ImW”是洗涤缓冲液中咪唑的浓度。“*”表示各术语之间的相互作用。
图6显示了MODDE研究的结果，该结果进一步支持了之前的实验，因为其确定了咪唑对减少洗脱体积具有静态显著效果，因此增加了洗脱液中的产物浓度。该研究还确定了咪唑浓度的平方项(ImE*ImE)，其表明存在最佳使用浓度，偏离该范围将导致洗脱体积增加。另外，在洗脱之前用咪唑缓冲液洗涤柱会进一步减少洗脱体积。在洗脱步骤之前将咪唑预装载到柱上可防止沿柱向下移动的洗脱前沿处于不含咪唑的环境中。因此，用咪唑预装载能够防止洗脱步骤的所有方面重新结合到树脂上，这因此增加了洗脱动力学。
实施例5：咪唑类似物洗脱曲线
方法
在动态结合模式下使用了两个MabSelect HiScreen柱，GE(9.4mL CV)。用pH 7.0的100mM磷酸钠平衡树脂。将单克隆抗体IgG1以35g/L树脂装载到树脂上。然后用pH 7.0的100mM磷酸钠洗涤树脂。用pH 3.6的100mM柠檬酸钠或者用pH 3.6的100mM柠檬酸钠加250mM1,3-二甲基-1H-吡唑进行洗脱。在初步的类似物研究中，该类似物被认为能有效减少洗脱体积。
结果和结论
图7示出了对照柠檬酸盐洗脱在pH3.6下于2.85个柱体积中回收了95％的产物。然而，通过加入1,3-二甲基-1H-吡唑，洗脱体积减少到1.76个柱，相当的回收率为94％。因此，1,3-二甲基-1H-吡唑的添加提高了洗脱动力学，从而允许产物洗脱更快，从而需要更少的缓冲液来实现类似的回收。
序列表
<110> UCB Biopharma Srl
<120> 纯化抗体的方法
<130> PF0185
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗白蛋白抗体的重链可变结构域 (无ds)
<400> 1
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ile Ile Trp Ala Ser Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Thr Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Thr Val Pro Gly Tyr Ser Thr Ala Pro Tyr Phe Asp Leu Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 2
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗白蛋白抗体的重链可变结构域 (ds)
<400> 2
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ile Ile Trp Ala Ser Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Thr Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Thr Val Pro Gly Tyr Ser Thr Ala Pro Tyr Phe Asp Leu Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 3
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗白蛋白抗体的轻链可变结构域 (无ds)
<400> 3
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Pro Ser Val Trp Ser Asn
20 25 30
Phe Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Glu Ala Ser Lys Leu Thr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gly Gly Tyr Ser Ser Ile
85 90 95
Ser Asp Thr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr
100 105 110
<210> 4
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗白蛋白抗体的轻链可变结构域 (ds)
<400> 4
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Pro Ser Val Trp Ser Asn
20 25 30
Phe Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Glu Ala Ser Lys Leu Thr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gly Gly Tyr Ser Ser Ile
85 90 95
Ser Asp Thr Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr
100 105 110
<210> 5
<211> 253
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 特异于白蛋白的645 gH5gL4
<400> 5
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ile Ile Trp Ala Ser Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Thr Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Thr Val Pro Gly Tyr Ser Thr Ala Pro Tyr Phe Asp Leu Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln
130 135 140
Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val
145 150 155 160
Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Pro Ser Val Trp Ser Asn Phe Leu Ser
165 170 175
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Glu
180 185 190
Ala Ser Lys Leu Thr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly
195 200 205
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp
210 215 220
Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gly Gly Tyr Ser Ser Ile Ser Asp Thr
225 230 235 240
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr
245 250
<210> 6
<211> 253
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 特异于白蛋白的645 gH5gL4ds
<400> 6
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ile Ile Trp Ala Ser Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Thr Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Thr Val Pro Gly Tyr Ser Thr Ala Pro Tyr Phe Asp Leu Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln
130 135 140
Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val
145 150 155 160
Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Pro Ser Val Trp Ser Asn Phe Leu Ser
165 170 175
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Glu
180 185 190
Ala Ser Lys Leu Thr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly
195 200 205
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp
210 215 220
Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gly Gly Tyr Ser Ser Ile Ser Asp Thr
225 230 235 240
Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr
245 250

Claims (9)

1.一种纯化抗体的方法，其包括：
a)将包含待纯化的所述抗体的混合物装载到亲和色谱树脂上，其中所述亲和色谱树脂不是镍基、锌基或钴基树脂，
b)用洗涤缓冲液洗涤所述色谱树脂；
c)用包含0.01M至1.0M咪唑或咪唑类似物且pH为3至5的洗脱缓冲液洗脱所述抗体。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述亲和色谱树脂不是基于金属离子的树脂。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述亲和色谱树脂选自：蛋白质A色谱树脂、蛋白质G色谱树脂和蛋白质L色谱树脂。
4.根据任何前述权利要求所述的方法，其中所述洗脱缓冲液包含0.01M至0.5M咪唑或咪唑类似物。
5.根据任何前述权利要求所述的方法，其中所述洗涤缓冲液包含咪唑或咪唑类似物。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述洗涤缓冲液包含0.01M至0.5M咪唑或咪唑类似物。
7.根据任何前述权利要求所述的方法，其中所述方法包括在将包含所述抗体的混合物装载到所述色谱树脂上之前，用包含咪唑或咪唑类似物的平衡缓冲液平衡所述色谱树脂的进一步步骤。
8.根据任何前述权利要求所述的方法，其中步骤a)、b)和c)中的一个、两个或全部步骤都在动态条件下进行。
9.根据任何前述权利要求所述的方法，其中所述抗体选自：IgG、Fab’、F(ab’)2、scFv、Fab-Fv、Fab-scFv、Fab-(scFv)2、Fab-(Fv)2、二抗体、三抗体和四抗体。
CN202080044910.3A 2019-08-02 2020-07-30 纯化抗体的方法 Pending CN114401984A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP19189841.0 2019-08-02
EP19189841 2019-08-02
PCT/EP2020/071533 WO2021023619A1 (en) 2019-08-02 2020-07-30 Methods for purifying antibodies

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN114401984A true CN114401984A (zh) 2022-04-26

Family

ID=67658409

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202080044910.3A Pending CN114401984A (zh) 2019-08-02 2020-07-30 纯化抗体的方法

Country Status (13)

Country Link
US (1) US20220280887A1 (zh)
EP (1) EP4007771A1 (zh)
JP (1) JP2022543187A (zh)
KR (1) KR20220039744A (zh)
CN (1) CN114401984A (zh)
AR (1) AR119546A1 (zh)
AU (1) AU2020326087A1 (zh)
BR (1) BR112021023542A2 (zh)
CA (1) CA3142610A1 (zh)
IL (1) IL289959A (zh)
MX (1) MX2022001349A (zh)
SG (1) SG11202112846RA (zh)
WO (1) WO2021023619A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7462762B2 (ja) * 2020-01-20 2024-04-05 ウーシー バイオロジクス アイルランド リミテッド アフィニティークロマトグラフィー用の新規な洗浄緩衝液

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5726293A (en) * 1992-10-02 1998-03-10 The General Hospital Corporation Affinity purification methods involving imidazole elution
US20040063153A1 (en) * 2002-08-12 2004-04-01 Tomas Jelinek Method for isolation of protein complexes using affinity binding
US20130096284A1 (en) * 2010-06-21 2013-04-18 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method for purifying protein using amino acid
JP2015020955A (ja) * 2013-07-17 2015-02-02 東ソー株式会社 抗体精製用溶出液および当該溶出液を用いた抗体精製方法

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8084032B2 (en) 2004-01-21 2011-12-27 Ajinomoto Co., Inc. Purification method which prevents denaturation of an antibody
EP2776466B1 (en) 2011-11-11 2017-08-23 UCB Biopharma SPRL Albumin binding antibodies and binding fragments thereof
UA112203C2 (uk) 2011-11-11 2016-08-10 Юсб Фарма С.А. Злитий білок біоспецифічного антитіла, який зв'язується з ox40 людини та сироватковим альбуміном людини
GB201208370D0 (en) 2012-05-14 2012-06-27 Ucb Pharma Sa Antibodies
GB201411320D0 (en) 2014-06-25 2014-08-06 Ucb Biopharma Sprl Antibody construct
GB201506868D0 (en) * 2015-04-22 2015-06-03 Ucb Biopharma Sprl Method for protein purification

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5726293A (en) * 1992-10-02 1998-03-10 The General Hospital Corporation Affinity purification methods involving imidazole elution
US20040063153A1 (en) * 2002-08-12 2004-04-01 Tomas Jelinek Method for isolation of protein complexes using affinity binding
US20130096284A1 (en) * 2010-06-21 2013-04-18 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method for purifying protein using amino acid
JP2015020955A (ja) * 2013-07-17 2015-02-02 東ソー株式会社 抗体精製用溶出液および当該溶出液を用いた抗体精製方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ALEJANDRO ARUFFO等: "CD62/P-Selectin Recognition of Myeloid and Tumor Cell Sulfatides", CELL, vol. 67, pages 35 - 44 *

Also Published As

Publication number Publication date
BR112021023542A2 (pt) 2022-03-22
KR20220039744A (ko) 2022-03-29
CA3142610A1 (en) 2021-02-11
EP4007771A1 (en) 2022-06-08
IL289959A (en) 2022-03-01
US20220280887A1 (en) 2022-09-08
JP2022543187A (ja) 2022-10-11
AU2020326087A1 (en) 2021-12-16
AR119546A1 (es) 2021-12-29
WO2021023619A1 (en) 2021-02-11
SG11202112846RA (en) 2021-12-30
MX2022001349A (es) 2022-03-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20220289832A1 (en) Protein purification
CN107636012B (zh) 蛋白质纯化方法
AU2014247034B2 (en) A method for increasing pyro-glutamic acid formation of a protein
CN108779143B (zh) 蛋白质纯化
CN107108692A (zh) 蛋白质制造
CN108350415A (zh) 调节灌注模式中重组蛋白生产概况的方法
CN114401984A (zh) 纯化抗体的方法
JP2024516892A (ja) 組換えタンパク質の生産方法
TW202430649A (zh) 重組蛋白之製造方法
WO2024079114A1 (en) Process for the production of recombinant proteins
EA041325B1 (ru) Способ очистки белков
EP3510141A1 (en) Methods for modulating production profiles of recombinant proteins

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 40064737

Country of ref document: HK

SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination