KR102657007B1

KR102657007B1 - 한약재 발효 조성물, 이의 제조방법 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102657007B1
Application number: KR1020220014152A
Authority: KR
Inventors: 김주영
Original assignee: 김주영
Priority date: 2021-07-09
Filing date: 2022-02-03
Publication date: 2024-04-16
Also published as: KR20230010167A

Abstract

본 발명은 한약재 또는 그 추출물을 고초균 및 유산균으로 이루어진 복합 균주로 발효시킨 한약재 발효 조성물, 그의 제조방법 및 상기 한약재 발효 조성물을 유효성분으로 포함하는 항암, 항염증 또는 항산화용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 한약재 발효 조성물은 고초균 및 유산균으로 이루어진 복합 균주로 발효됨으로써, 고초균 또는 유산균인 단독 균주로 발효시킨 한약재 발효 조성물에 비하여, 발효속도가 증가하여 동일 발효시간 대비 총 균수가 증가하고, 이에 따라 유산균 수가 증가하여 pH가 낮으며, 고초균의 산물인 단백질분해효소나 α-아밀라제 등의 활성도가 향상될 수 있다.

Description

한약재 발효 조성물, 이의 제조방법 및 이의 용도{Composion of fermented oriental herb, method of manufacturing the same and use of the same}

본 발명은 한약재 발효 조성물, 이의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것으로 보다 상세하게는 한약재 또는 그 추출물을 고초균 및 유산균으로 이루어진 복합 균주로 발효시킨 한약재 발효 조성물, 그의 제조방법 및 상기 한약재 발효 조성물을 유효성분으로 포함하는 항암, 항염증 또는 항산화용 조성물에 관한 것이다.

발효(fermentation)는 미생물이 가지고 있는 효소를 이용하여 유기물을 분해시켜서 인간 생활에 유용하게 사용되는 물질을 제조하는 과정으로서, 인체에 유용한 물질을 만들어내는 대표적인 발효 미생물로는 유산균, 효모 등이 있고, 다양한 발효물이 발효 과정에 의해서 생산된다.

또한, 발효는 유용 물질을 만들어 내는 것 이외에도 발효에 관여하는 유산균 또는 고초균이 장 내에서 면역 및 독소제거 (Detoxification)의 역할을 담당하기도 한다.

동의보감, 본초강목 등 고대 의학 문헌에 따르면 옛날부터 내려오는 우리 전통의 한방 약재의 다양한 효능이 보고되고 있고, 근래에는 이들 생약재에 대한 과학적인 임상실험 등을 거쳐 그 효능이 하나 둘씩 규명되고 있으며, 현대에 이르러는 양약이 해결할 수 없는 불치병에 이르기까지 한약을 복용하여 치료하는 사례가 점차 늘고 있다.

한편, 종래기술은 한약재를 발효시킴에 있어서, 유산균이나 고초균 단독 균주를 사용하여 한약재 발효 조성물을 제조하는 것이 알려져 있다 (특허문헌 1, 특허문헌 2).

그러나, 종래기술과 같이 유산균 또는 고초균 단독 균주를 사용하여 한약재를 발효시킨 경우, 복합균주를 사용하여 한약재를 발효시킨 경우에 비하여, 발효속도가 떨어지기 때문에 동일 발효시간 대비 총 균수가 적고, 이에 따라 유산균 수가 적어 pH가 더 높으며, 고초균의 산물인 단백질분해효소(protease)나 α-아밀라제(α-amylase) 등의 활성도가 낮은 문제가 있다.

대한민국 공개특허공보 제10-2012-0103918호 대한민국 공개특허공보 제10-2009-0034241호

본 발명의 목적은 복합 균주로 한약재 또는 그 추출물을 발효시킴으로써, 발효속도가 증가하여 동일 발효시간 대비 총 균수가 증가하고, 이에 따라 유산균 수가 증가하여 pH가 낮으며, 고초균의 산물인 단백질분해효소나 α-아밀라제 등의 활성도가 향상된 한약재 발효 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 복합 균주로 한약재 또는 그 추출물을 발효시킴으로써, 발효속도가 증가하여 동일 발효시간 대비 총 균수가 증가하고, 이에 따라 유산균 수가 증가하여 pH가 낮으며, 고초균의 산물인 단백질분해효소나 α-아밀라제 등의 활성도가 향상된 한약재 발효 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 한약재 발효 조성물의 항암, 항염증 또는 항산화용으로의 용도를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 황기, 인삼, 백출, 복령, 저령, 진피, 숙지황, 생지황, 당귀, 천궁, 백작약, 맥문동, 황금, 건강, 대조 및 감초를 포함하는 한약재 또는 상기 한약재의 추출물을 고초균(Bacillus subtilis) 및 유산균으로 이루어진 복합 균주로 발효시킨 한약재 발효 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로 상기 유산균은 락토바실러스속 균, 비피더스속 균, 아세토박터 아세티(Acetobacter aceti) 균, 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus) 및 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides)로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

본 발명의 일 구현예로 상기 락토바실러스속 균은 락토바실러스 서브틸리스(Lactobacillus subtilis), 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 및 락토바실러스 락티스(Lactobacillus lactis)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.

본 발명의 일 구현예로 상기 비피더스속 균은 비피도박테리엄 롱검(Bifidobacterium longum), 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis) 및 비피도박테리움 비피둠(Bifidobacterium bifidum)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.

본 발명의 일 구현예로 상기 한약재는 상기 조성물의 전체 중량 대비 55~65 중량%로 포함될 수 있다.

본 발명의 일 구현예로 상기 한약재는 황기 100 중량부에 대하여, 인삼 90~110 중량부, 백출 90~110 중량부, 복령 90~110 중량부, 저령 90~110 중량부, 진피 90~110 중량부, 숙지황 90~110 중량부, 생지황 90~110 중량부, 당귀 90~110 중량부, 천궁 90~110 중량부, 백작약 90~110 중량부, 맥문동 90~110 중량부, 황금 40~60 중량부, 건강 40~60 중량부, 대조 40~60 중량부및 감초 40~60 중량부를 포함할 수 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 황기, 인삼, 백출, 복령, 저령, 진피, 숙지황, 생지황, 당귀, 천궁, 백작약, 맥문동, 황금, 건강, 대조 및 감초를 포함하는 한약재 또는 상기 한약재의 추출물을 고초균 및 유산균으로 이루어진 복합 균주로 발효시키는 단계를 포함하는 한약재 발효 조성물의 제조방법을 재공한다.

본 발명의 일 구현예로 상기 한약재는 황기 100 중량부에 대하여, 인삼 90~110 중량부, 백출 90~110 중량부, 복령 90~110 중량부, 저령 90~110 중량부, 진피 90~110 중량부, 숙지황 90~110 중량부, 생지황 90~110 중량부, 당귀 90~110 중량부, 천궁 90~110 중량부, 백작약 90~110 중량부, 맥문동 90~110 중량부, 황금 40~60 중량부, 건강 40~60 중량부, 대조 40~60 중량부및 감초 40~60 중량부가 첨가될 수 있다.

본 발명의 일 구현예로 상기 발효는 35~39℃의 온도에서 36~96시간 동안 배양할 수 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 한약재 발효 조성물을 유효성분으로 포함하는 항암용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 한약재 발효 조성물을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 한약재 발효 조성물을 유효성분으로 포함하는 항염증용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 한약재 발효 조성물을 유효성분으로 포함하는 염증 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 한약재 발효 조성물을 유효성분으로 포함하는 염증 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 한약재 발효 조성물을 유효성분으로 포함하는 항산화용 식품 조성물을 제공한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 한약재 발효 조성물을 유효성분으로 포함하는 항산화용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 한약재 발효물은 고초균(Bacillus subtilis) 및 유산균으로 이루어진 복합 균주로 발효됨으로써, 고초균 또는 유산균인 단독 균주로 발효시킨 한약재 발효 조성물에 비하여, 발효속도가 증가하여 동일 발효시간 대비 총 균수가 증가하고, 이에 따라 유산균 수가 증가하여 pH가 낮으며, 고초균의 산물인 단백질분해효소나 α-아밀라제 등의 활성도가 향상된 한약재 발효 조성물을 제공할 수 있다.

도 1은 RAW264.7 세포에서 발효추출물의 LPS-유도 염증물질 생성 증가에 대한 억제 효과를 나타낸 것으로, A는 NO 생성량, B는 iNOS 단백질 발현, C는 COX-2 단백질 발현을 나타낸 것이다. iNOS와 COX-2의 발현은 웨스턴 블롯(Western blot) 방법으로 측정하였고, 히스토그렘(Histogram)은 액틴(actin) 발현에 대비한 iNOS 또는 COX-2 발현을 계산(mean±SD, n=3)하였다. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 vs. nor (a) 또는 LPS (b)
도 2는 RAW264.7 세포에서 발효추출물의 LPS-유도 ERK, NF-kB의 인산화 발현 증가에 대한 억제 효과를 나타낸 것으로, A는 ERK 단백질 발현, B는 NF-kB 단백질 발현을 나타낸 것이다. ERK, p-ERK, NF-kB, p-NF-kB의 발현은 Western blot 방법으로 측정하였고, Histogram은 ERK 발현 대비 p-ERK 발현, NF-kB 발현 대비 p-NF-kB 발현으로 계산(mean±SD, n=3)하였다. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 vs. nor (a) 또는 LPS (b)
도 3은 MCF-7 세포에서 발효추출물의 세포사멸 유도 효과를 나타낸 것으로, A는 Bax, B는 cytochrome c, C는 cleaved caspase-3, D는 PARP, E는 Bcl-2, F는 ERK 단백질 발현을 나타낸 것이다. 각 단백질 발현은 Western blot 방법으로 측정하였고, Histogram은 actin 발현 대비 (A~E) 또는 ERK 발현 대비 p-ERK의 발현(F)을 계산(mean±SD, n=3)하였다. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 vs. nor (a)
도 4는 A549 세포에서 발효추출물의 세포사멸 유도 효과를 나타낸 것으로, A는 Bax, B는 cytochrome c, C는 cleaved caspase-3, D는 PARP, E는 Bcl-2, F는 ERK 단백질 발현을 나타낸 것이다. 각 단백질 발현은 Western blot 방법으로 측정하였고, Histogram은 actin 발현 대비 (A~E) 또는 ERK 발현 대비 p-ERK의 발현(F)을 계산하였다(mean±SD, n=3). *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 vs. nor (a)
도 5는 HepG2 세포에서 발효추출물의 산화적 손상에 대한 세포 생존도 증가 효과를 나타낸 것이다. 데이타=mean±SD (n=3). **p<0.01, ***p<0.001 vs. nor (a) or H₂O₂ (b)
도 6은 HepG2 세포에서 발효추출물의 산화적 손상에 대한 세포 생존도 증가 효과를 나타낸 것이다. 데이타=mean±SD (n=3). **p<0.01, ***p<0.001 vs. nor (a) or H₂O₂ (b)

본 발명의 제1 구현예는 황기, 인삼, 백출, 복령, 저령, 진피, 숙지황, 생지황, 당귀, 천궁, 백작약, 맥문동, 황금, 건강, 대조 및 감초를 포함하는 한약재 또는 상기 한약재의 추출물을 고초균 및 유산균으로 이루어진 복합 균주로 발효시킨 한약재 발효 조성물에 관한 것이다.

상기 한약재에 포함되는 황기(Astragalus membranaceus)는 콩과에 속하는 식물로, 한의학에서 많이 사용되는 본초의 하나로서, 전통적으로 황기가 주로 사용되었던 질환은 만성피로, 식욕상실, 빈혈, 상처회복, 발열, 알레르기, 자궁출혈, 자궁탈(uterine prolapse) 등이 있다.

상기 한약재에 포함되는 인삼(panax ginseng)은 오가피과 인삼속 식물인 인삼 뿌리를 건조한 것으로, 한의학적으로는 기를 크게 보강하고 비장과 폐장의 기운을 북돋우며, 갈증을 멎게 하고 정신을 평안하게 하는 효능이 있고, 현대 약리학적으로는 중추신경계 조절, 면역증강, 강심, 혈당강하 등의 효능이 있다.

상기 한약재에 포함되는 백출(Atractylodes macrocephala Koidzumi)은 약리적으로 생쥐의 체중 증가와 지구력 증가, 탐식 능력을 증가, 세포 면역 기능을 촉진하고, 또한 장관(腸管) 억제 작용과 흥분 작용을 조절, 항궤양 및 간 기능 보호 작용, 면역 기능 항진작용, 혈관 확장 작용, 이뇨 작용 및 혈당 강하 작용, 항암 작용 등이 있다고 알려져 있다.

상기 한약재에 포함되는 저령(Polyporus umbellatus FR.)은 단풍나무·상수리나무·자작나무 등의 뿌리에서 생기는 균식물의 일종으로 한방에서 많이 쓰이는 약재로서, 약효는 이뇨작용이 현저하여 신장염으로 전신에 부종이 있을 때에 완만한 이뇨효과로 부종을 제거하고, 염증도 소실되게 한다. 또, 방광염, 요도염으로 소변을 잘 못 보고 통증이 있을 때에도 많이 응용되고 있다. 임신 중에 부종이 심할 때와 각기로 부종이 수반될 때에 이뇨목적으로 쓰인다.

상기 한약재에 포함되는 진피는 귤 껍질로서, 비타민이 풍부하고 겨울철 가래, 기침의 명약이라고 아려져 있다.

상기 한약재에 포함되는 생지황(rehmannia glutinosa var. purpurea)은 현삼과에 속한 다년생 초본인 지황 또는 그 밖의 동속식물의 신선한 뿌리이다. 한의학적으로는 열을 내려주고 음을 생성하며, 갈증을 멎게 하는 효능이 있으며, 현대 약리학적으로는 진정, 소염, 면역증강, 지혈 등의 작용이 있다.

상기 한약재에 포함되는 당귀는 한국 전국에 분포하는 미나리과 (Umbelliferae)에 속하는 왜당귀 (Angelica acutiloba KITAGAWA) 및 이의 동속식물들의 뿌리를 지칭하며, 그 성분으로는 리구스틸리드(ligustilide), 부틸리덴 프탈리드(Butylidene phthalide), 크니딜리드(Cnidilide), 이소크닐리드(Isocnilide), 세스퀘테르펜(sesquiterpene) 등의 성분이 알려져 있으며, 월경불순, 복통 등에 대한 치료작용 등이 알려져 있다.

상기 한약재에 포함되는 천궁(Cnidium officinale)은 진정 ·진통 ·강장 등에 효능이 있어 두통 ·빈혈증 ·부인병 등을 치료하는데 쓴다. 9~11월에 근경을 캐어 잎과 줄기를 제거하고 햇볕에 말린후 3~6g을 달여서 복용하거나, 환제나 산제로 하여 사용한다.

상기 한약재에 포함되는 백작은 약리 실험에서 페오니플로린 성분은 진정 작용, 진통 작용, 해열 작용, 소염 작용, 항궤양 작용, 혈압 강하 작용, 관상 혈관 확장 작용을 나타내고, 페놀 성분은 진정 작용, 해열 작용, 진통 작용, 소염 작용, 지혈 작용을 나타낸다고 알려져 있다.

상기 한약재에 포함되는 맥문동(Liriope platyphylla)은 한방에서 약재로 사용하는데 소염·강장 ·진해·거담제 및 강심제로 이용한다.

상기 한약재에 포함되는 황금(Scutellaria baicalensis)은 한방에서 뿌리를 해열·이뇨·지사·이담 및 소염제로 이용한다.

상기 한약재에 포함되는 건강은 위액분비촉진, 장관 연동작용 활성화, 소화촉진, 구토를 가라앉히며 심장을 흥분시켜 혈압을 상승하게 하고 혈액순환을 촉진한다. 항염, 진통작용, 억균작용이 있다고 알려져 있다.

상기 한약재에 포함되는 대조(Zizyphi fructus)는 식욕부진, 불면증, 설사, 이질, 위염, 빈혈, 궤양병, 피부암에 효과가 있다고 알려져 있다.

상기 한약재에 포함되는 감초((Glycyrrhiza uralensis Fischer)의 주요 성분은 감미 사포닌인 그리칠리틴, 플라보노이드 등이며, 근육통증, 진해, 거담, 위경련, 글리칠리틴의 원료 등에 효능이 있다.

본 발명의 일 구현예로 상기 유산균은 락토바실러스속 균, 비피더스속 균, 아세토박터 아세티(Acetobacter aceti) 균, 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus) 및 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides)로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예로 상기 락토바실러스속 균은 락토바실러스 서브틸리스(Lactobacillus subtilis), 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 및 락토바실러스 락티스(Lactobacillus lactis)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예로 상기 비피더스속 균은 비피도박테리엄 롱검(Bifidobacterium longum), 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis) 및 비피도박테리움 비피둠(Bifidobacterium bifidum)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예로 상기 한약재는 상기 조성물의 전체 중량 대비 55~65 중량%로 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예로 상기 한약재는 황기 100 중량부에 대하여, 인삼 90~110 중량부, 백출 90~110 중량부, 복령 90~110 중량부, 저령 90~110 중량부, 진피 90~110 중량부, 숙지황 90~110 중량부, 생지황 90~110 중량부, 당귀 90~110 중량부, 천궁 90~110 중량부, 백작약 90~110 중량부, 맥문동 90~110 중량부, 황금 40~60 중량부, 건강 40~60 중량부, 대조 40~60 중량부및 감초 40~60 중량부를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예로 상기 조성물은 상기 고초균 또는 유산균으로 발효시킨 한약재 발효 조성물에 비하여, 동일 발효시간 대비 총 균수가 더 많을 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예로 상기 조성물은 상기 고초균 또는 유산균으로 발효시킨 한약재 발효 조성물에 비하여, pH가 더 낮을 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예로 상기 조성물은 상기 고초균 또는 유산균으로 발효시킨 한약재 발효 조성물에 비하여, 프로테아제 및 α-아밀라아제의 활성도가 더 높을 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 제2 구현예는 황기, 인삼, 백출, 복령, 저령, 진피, 숙지황, 생지황, 당귀, 천궁, 백작약, 맥문동, 황금, 건강, 대조 및 감초를 포함하는 한약재 또는 상기 한약재의 추출물을 고초균 및 유산균으로 이루어진 복합 균주로 발효시키는 단계를 포함하는 한약재 발효 조성물의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로 상기 한약재는 상기 조성물의 전체 중량 대비 55~65 중량%, 바람직하게는 58~60 중량%로 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예로 상기 한약재는 황기 100 중량부에 대하여, 인삼 90~110 중량부, 바람직하게는 95~105 중량부, 백출 90~110 중량부, 바람직하게는 95~105 중량부, 복령 90~110 중량부, 바람직하게는 95~105 중량부, 저령 90~110 중량부, 바람직하게는 95~105 중량부, 진피 90~110 중량부, 바람직하게는 95~105 중량부, 숙지황 90~110 중량부, 바람직하게는 95~105 중량부, 생지황 90~110 중량부, 바람직하게는 95~105 중량부, 당귀 90~110 중량부, 바람직하게는 95~105 중량부, 천궁 90~110 중량부, 바람직하게는 95~105 중량부, 백작약 90~110 중량부, 바람직하게는 95~105 중량부, 맥문동 90~110 중량부, 바람직하게는 95~105 중량부, 황금 40~60 중량부, 바람직하게는 45~55 중량부, 건강 40~60 중량부, 바람직하게는 45~55 중량부, 대조 40~60 중량부, 바람직하게는 45~55 중량부 및 감초 40~60 중량부, 바람직하게는 45~55 중량부가 첨가될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예로 상기 발효는 35~39℃, 바람직하게는 36~38℃의 온도에서 36~96시간, 바람직하게는 48~72시간 동안 배양할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예로 상기 한약재 발효 조성물의 제조방법은 (a) 황기, 인삼, 백출, 복령, 저령, 진피, 숙지황, 생지황, 당귀, 천궁, 백작약, 맥문동, 황금, 건강, 대조 및 감초를 포함하는 한약재 또는 상기 한약재의 추출물을 준비하는 단계; (b) 상기 준비된 한약재를 고초균 및 유산균으로 이루어진 복합 균주로 발효시키는 단계; 및 (c) 상기 발효시킨 발효물을 동결건조시키는 단계를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 상기 제1 구현예 및 제2 구현예에서, 상기 “추출물”은 상기 한약재의 추출 처리에 의하여 얻어지는 추출액, 상기 추출액의 희석액이나 농축액, 상기 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 상기 추출액의 조정제물이나 정제물, 또는 이들의 혼합물 등, 추출액 자체 및 추출액을 이용하여 형성 가능한 모든 제형의 추출물을 포함한다.

본 발명의 제3 구현예는 상기 한약재 발효 조성물을 유효성분으로 포함하는 항암용 약학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 제4 구현예는 상기 한약재 발효 조성물을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 제5 구현예는 상기 한약재 발효 조성물을 유효성분으로 포함하는 항염증용 약학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 제6 구현예는 한약재 발효 조성물을 유효성분으로 포함하는 염증예방 또는 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 제7 구현예는 상기 한약재 발효 조성물을 유효성분으로 포함하는 염증예방 또는 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 제8 구현예는 한약재 발효 조성물을 유효성분으로 포함하는 항산화용 식품 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 제9 구현예는 한약재 발효 조성물을 유효성분으로 포함하는 항산화용 화장료 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 상기 약학적 조성물은 상기 한약재 발효 조성물을 유효성분으로 포함하며, 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다.

상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 사이클로덱스트린, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 등을 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 다른 통상의 첨가제를 더 포함할 수 있다.

또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 안과용 점안액, 환약, 캡슐, 과립, 또는 정제로 제제화할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제화에 관해서는 레밍턴의 문헌에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 제형에 특별한 제한은 없으나 점안제, 주사제 또는 경구 섭취제 등으로 제제화할 수 있다.

본 발명의 상기 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 점막, 정맥 내, 피하에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

본 발명에 따른 상기 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, “약학적으로 유효한 양”은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

본 발명에 따른 상기 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

구체적으로, 본 발명에 따른 상기 약학적 조성물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며 투여 경로, 질환의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있다.

상기 약학적 조성물에 대한 설명은 상충되지 않는 한 상기 식품 조성물에 동일하게 적용될 수 있다.

상기 식품 조성물은 건강기능성 식품을 포함하는 개념이다.

본 발명의 식품 조성물에서 본 발명의 조성물을 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 상기 조성물의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 15 중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있다.

본 발명의 건강기능성식품 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 성분을 함유하는 것 외에 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 당업자의 선택에 의해 적절하게 결정될 수 있다.

상기 외에 본 발명의 건강기능성식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율 또한 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다.

본 발명에 따른 상기 화장료 조성물에 포함되는 성분은 상기 유효 성분 이외에, 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 상기 화장료 조성물은 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 보습 크림, 영양 에센스, 젤, 로션, 또는 연고와 같은 당업계 공지의 임의의 제형으로 제형화될 수 있다.

본 발명에 따른 상기 화장료 조성물은 예를 들면, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 에센스, 영양 오일, 보습 오일, 영양 크림, 보습 크림, 파우더, 팩, 파운데이션, 메이크업 베이스, 스틱, 클렌징, 샴푸, 젤, 로션 및, 연고 등의 제형으로 제조되어 이용될 수 있고, 또한, 액상, 크림상, 페이스트상, 고체상 등 다양한 성상으로 적용이 가능하며, 통상의 화장료 제조법을 이용하여 제형화될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 제한되는 것은 아니다.

<실시예> (한약재 발효 조성물의 제조)

1. 원방 한약의 구성 및 추출물 제조

본 연구에 사용된 처방은 구성 약재의 무게를 측정한 후 총 건조중량의 10배 증류수(2.36L)를 가하여 180분 간 열수 추출하는 전탕 추출법으로 제조하였다.

각 구성 한약재에 대한 정보는 하기 표 1에 기술하였다. 추출물은 3M 종이 여과지를 통과시켜 여과한 후 121℃, 1.5 기압에서 15분간 가압 멸균하고, 상온까지 냉각시킨 후 발효에 사용하였다.

2. 발효추출물의 제조

원방 추출물의 발효에 사용된 균주는 모두 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC: kribb.re.kr)로부터 유산균(KCTC 3108; Lactoplantibacillus plantanum subsp. plantanum) 및 고초균(KCTC 2217: Bacillus subtilis)을 분양 받아 사용하였다. 유산균은 MRS 배지(Difco, Detroit, MI, USA), 고초균은 NA (Nutrient agar) 배지에 각각 계대 배양한 뒤 초기균수를 1×10⁶CFU/ml로 조절하여 사용하였다.

발효는 1M NaOH로 원방 추출물의 pH를 조정한 후 유산균 및 고초균을 추출물 용량 대비 1%(v/v) 비율로 접종하고, 37℃의 항온배양기에서 48시간 동안 배양하여 발효한약을 제조하였다.

각 추출물의 수율은 하기 표 2와 같다.

<실험예>

1. 대식세포에서의 항염증 효과

가. 실험 방법

① 세포배양

마우스(mouse)의 대식세포주(macrophage)인 RAW 264.7 세포를 10% fetal bovine serum (FBS)와 1% penicillin/streptomycin (P/S)이 포함된 Dulbecco’s modified eagle’s medium (DMEM, Gibco, Carlsbad, CA, USA) 배지를 배양액으로 하여 37℃, 5% CO₂ 조건의 incubator에서 배양하였다.

② 약물처리 및 염증자극

RAW 264.7 세포를 60 mm culture dish에 5×10⁵cells/mL로 분주하고 24시간 배양하면서 안정시킨 후, 각 약물을 1 mg/mL 농도로 처리하여 1시간 동안 배양하였다. 그 후, 염증반응 유도를 위하여 LPS (1 μg/mL)를 처리한 후 실험조건에 따라 일정 시간 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다.

③ Nitric oxide (NO) 생성 측정

약물과 LPS가 처리된 각 culture dish로부터 배양액을 수집한 후 96-well plate에 100 μL씩 넣고, Griess reagent (1% sulfanilamide in 5% phosphoric acid + 1% α-naphthyl amide in H₂0)를 100 μL 씩 넣어 혼합하였다.

이를 실온에서 5분 간 반응시킨 후 흡광도 측정기 (microplate reader)에서 540 ㎚의 흡광도로 발색 정도를 측정하였다. 배양액 내 NO의 농도는 소디움 나이트라이트(NaNO₂)의 표준 정량곡선을 이용하여 계산하였다.

④ 염증 단백질 발현 변화 분석(Western blot)

RAW 264.7 세포(5×10⁵cells/mL)를 30 mm culture dish에 분주하여 24시간 안정시킨 후, 각 약물(1 mg/mL)을 처리하고 1시간 배양하였다. 염증반응을 유도하기 위하여 LPS (1 μg/mL)를 처리한 후 ERK 단백질 발현 분석을 위해서 15분, NF-kB 단백질 발현 분석을 위해서 1시간 및 iNOS와 COX-2 발현 분석을 위해서 24시간 배양하였다.

이후 각 세포를 수거한 후 Lysis buffer [50 mM HEPES(pH 7.4), 150 mM NaCl, 1% deoxycholate, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1 μg/mL aprotinin]를 100 ㎕씩 넣어 4℃에서 30 분간 반응시킴으로써 세포막 용해를 유도하였다. 이를 14,000 rpm에서 20분 간 원심 분리함으로써 단백질이 함유된 상층액을 수거하고, Bradford's Protein Assay 용액을 이용하여 총 단백질의 양을 계산하였다.

Western blot을 위해서 각 세포로부터 분리된 단백질 중 30 ㎍을 5× loading buffer와 잘 섞은 후 95℃에서 5 분간 끓여 단백질 변성을 유도하고, 이를 SDS-PAGE(polyacrylamide gel electrophoresis)에 사용하였다.

단백질 전기영동 후 겔 상의 밴드들을 니트로셀룰로오즈 멤브레인으로 이동하고, Ponceau S Solution으로 염색한 후 사이즈 마커 대비 각 타겟 단백질의 크기에 따라 적정하게 멤브레인을 절단하였다. 각 멤브레인을 5% 스킴 밀크 용액에서 1시간 블로킹하여 비특이 반응을 제거한 후 각각 iNOS, COX-2, ERK, p-ERK, NF-kB, p-NF-kB에 대한 1차 항체들 또는 대조 단백질로서 β-락틴의 1차 항체와 4°C에서 24 시간 반응시켰다.

이를 1x TBS-T 완충액으로 15분 씩 3번 세척한 후 horseradish peroxidase가 감작(conjugation) 되어 있는 마우스 또는 래빗의 2차 항체와 실온에서 2시간 반응시켰다. 이를 다시 1x TBS-T 완충액으로 15분 간 3회 세척한 후 ECL solution (BioRad)을 사용하여 발색시키고, 자동화학영상분석기(RAS image system)를 이용하여 밴드의 발현 정도를 관찰하였다.

각 타겟 단백질의 발현 정도는 컴퓨터 상의 이미지를 β-락틴의 발현 정도와 비교하여 상대 값을 계산하였으며 최소 3회 이상 반복실험 결과를 이용하여 히스토그램으로 제시하였다.

⑤ 통계학적 검정

모든 실험결과는 최소 3회 반복실험에 대한 평균과 표준편차(mean±SD)로 나타내었으며, 통계학적 유의성은 GraphPad Prism 5.0 분석프로그램(GraphPad Software, CA, USA)을 이용하여 one-way ANOVA (Tukey's test)를 이용하여 검정하여 p값이 0.05 이하인 경우를 유의성 있는 것으로 판정하였다.

나. 실험 결과

염증반응은 정상적으로는 외부의 물리적, 화학적 자극이나 세균 감염 등에 대하여 면역세포가 이를 인지하고 다양한 염증 매개물질들을 합성, 분비함으로써 손상된 조직을 회복시키거나 재생하려는 기전이며, 이에 따라 임상적으로 발적, 발열, 종창, 통증 등의 증상을 유발하게 된다.

그러나 과도한 염증 발생은 각 종 질환을 유발하게 되며 만성 질환으로의 변화에 기여하기 때문에 적정 수준에서의 제어(항염증)가 필요하며 각 종 염증 관련 증상을 치료하기 위해 사용되는 약물의 세계 시장 규모는 항암치료제 시장만큼이나 크다.

산화질소(NO, nitric oxide)는 세포 신호전달에 중요한 분자이며 인체 여러 조직에서 신경전달물질로서 다양한 생물학적 과정 수행(혈관 확장 및 이완을 통한 긴장도 유지 등)에 중요한 역할을 한다.

염증반응은 대식세포와 같은 면역세포에서 iNOS(inducible nitric oxide synthase)를 발현시킴으로써 NO를 합성하게 되어 유발되지만, 과도한 염증물질의 생성은 비정상적인 염증반응 증가로 질병을 유발하게 된다. 한편 RAW264.7 세포는 마우스의 대식세포로서 세균의 외피 단백질 성분인 LPS (lipopolysaccharide)를 처리해주면 쉽게 염증반응을 유도할 수 있어서 보편적인 항염증 효과를 측정하기 위한 실험모델로 활용되고 있다.

(1) NO 생성 및 iNOS, COX-2 발현 증가에 대한 억제 효과

본 연구에서 RAW264.7 세포에 LPS를 처리하면(LPS), 정상군(Nor)에 비하여 NO 생성이 유의적으로(p<0.01) 증가하며, 이는 각 추출물 처리에 의해 감소하는 것으로 나타났다.

발효 전 추출물(N1, p<0.01), 유산균 발효 추출물(L1, p<0.01), 고초균 발효 추출물(B1, p<0.01) 및 유산균+고초균 혼합 추출물(L+B1, p<0.01) 모두에서 LPS 군에 비해 유의적으로 NO 생성 감소를 나타내었고, 특히 유산균+고초균 혼합 추출물이 가장 효과적인 것으로 나타났다(도 1의 A).

또한 NO 생성 단백질인 iNOS와 염증물질인 prostaglandin E2(PGE2)를 생성하는 단백질인 COX-2(cyclooxygenase-2)의 발현에서도 모두 정상군에 비하여 LPS 처리군에서 유의적인 증가를 나타내었고(p<0.01, p<0.001), 이는 각 추출물 처리에 의해 iNOS(그림1B)와 COX-2(도 1의 C)의 발현을 모두 효과적으로 감소하였다.

LPS 자극에 의한 NO 생성이나 iNOS, COX-2의 발현 증가는 비발효 추출물 보다는 발효 추출물들이 효과적으로 감소시켰고, 발효추출물들 중에는 유산균+고초균 혼합 추출물이 가장 효과적인 것으로 나타났다.

(2) ERK와 NF-kB의 인산화 발현 증가에 대한 억제 효과

핵 전사 인자인 nuclear factor-kappaB (NF-κB)는 대표적인 염증 조절 전사인자이며, 다양한 전염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokines; interleukin (IL)-6, IL-1beta, tumor necrosis factor (TNF)-α)의 생성과 iNOS, COX-2 발현을 위한 전사를 유도하여 염증물질인 NO와 PGE2의 분비를 증가시키게 된다.

ERK (extracellular signal-regulated kinase)는 MAPK(mitogen-activated protein kinase) 계열 단백질로 대식세포에서 LPS 등의 자극에 의해 인산화 되어 활성화하면 NF-kB와 같은 전사인자의 발현을 촉진함으로서 염증 반응 유발에 필요한 중요 신호들을 전달하게 된다. 따라서 NF-κB와 ERK MAPK의 인산화 발현을 통한 활성화를 억제하는 것은 염증 반응을 치료하는데 있어 중요한 이점이 된다.

본 연구에서 RAW264.7 세포에 LPS를 처리하였을 때, 정상군(Nor)에 비하여 ERK의 인산화 발현(p-ERK)과 NF-kB의 인산화 발현(p-NF-kB)이 유의적으로(p<0.01, p<0.001) 증가하며, 이는 각 추출물 처리에 의해 감소하였다.

먼저 LPS 자극에 의한 ERK의 인산화 발현 증가는 비발효추출물 보다 발효추출물에서 효과적으로 억제되었으며, 발효추출물들 중 유산균 발효 추출물(L1, p<0.01), 고초균 발효 추출물(B1, p<0.001) 및 유산균+고초균 혼합 추출물(L+B1, p<0.001) 모두에서 대조군 대비 유의적인 감소를 나타내었다. 특히 유산균과 고초균 혼합 추출물에서 가장 효과적인 p-ERK, p-NF-kB 억제 작용을 나타내었다(도 2의 A).

또한 LPS 자극에 의한 NF-kB의 인산화 발현 증가는 발효 전 추출물(N1, p<0.001), 유산균 발효 추출물(L1, p<0.01), 고초균 발효 추출물(B1, p<0.01) 및 유산균과 고초균 혼합 추출물(L+B1, p<0.01)에서 모두 대조군에 비해 유의적으로 감소하였으며, ERK에서와 마찬가지로 유산균+고초균 혼합 추출물에서 가장 효과적으로 억제되었다(도 2의 B).

2. 암세포에서의 세포사멸 유도를 통한 항암 효과

가. 실험 방법

① 세포배양

사람의 유방암 세포주(breast cancer cells)인 MCF-7 세포 및 폐암 세포주(lung cancer cells)인 A549 세포를 10% 소 태아 혈청(FBS)와 1% 페니실린 스트렙토마이신(P/S)가 포함된 Dulbecco’s modified eagle’s medium (DMEM, Gibco, Carlsbad, CA, USA) 배지를 이용하여 37℃, CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다.

② 약물처리

각 암세포를 60 mm dish에 5×10⁵cells/mL로 분주하고 24시간 배양하여 안정시킨 후, 각 추출물을 2 mg/mL 농도로 처리하고 24시간 동안 37℃, 5% CO₂ㅇ이인ba큐베이터에서 배양하였다.

③ 세포사멸 단백질의 발현 변화 분석(Western blot)

각 추출물이 처리된 암세포를 수거한 후 Lysis buffer를 넣어 4°C에서 30 분간 반응시킴으로써 세포막 용해를 유도하였다. 이를 14,000 rpm에서 20분 간 원심 분리하여 단백질이 함유된 상층액을 수거하고, Bradford's Protein Assay 용액을 이용하여 총 단백질의 양을 측정하였다.

각 세포 단백질(30 ㎍)을 SDS-PAGE한 후 겔 상의 밴드들을 니트로셀룰로오즈 멤브레인으로 이동시키고, 각 타겟 단백질에 대한 멤브레인을 제작하였다. 각 멤브레인을 5% 스킴 밀크 용액으로 1시간 실온에서 블로킹한 후 Bax, Bcl-2, cleaved caspase-3, cytochrome c, PARK, ERK, p-ERK에 대한 1차 항체 및 β-actin의 1차 항체와 4℃에서 24 시간 반응시켰다.

이를 1x TBS-T 완충액으로 15분 씩 3번 세척한 후, horseradish peroxidase가 감작(conjugation) 되어 있는 mouse 또는 rabbit의 2차 항체와 함께 실온에서 2시간 반응시켰다. 이를 다시 1x TBS-T 완충액으로 15분 간 3회 세척한 후 ECL 용액을 이용하여 발색시키고, RAS image system에서 밴드의 발현을 관찰하였다.

각 타겟 단백질의 발현 정도는 β-락틴 발현에 대비하여 계산하였으며, 최소 3회 이상 반복실험한 결과를 히스토그램으로 제시하였다.

④ 통계학적 검정

모든 실험결과는 최소 3회 반복실험에 대한 평균과 표준편차 (mean±SD)로 나타내었으며, 통계학적 유의성은 GraphPad Prism 5.0 분석프로그램(GraphPad Software, CA, USA)을 이용하여 one-way ANOVA (Tukey's test)를 이용하여 검정하여 p값이 0.05 이하인 경우를 유의성 있는 것으로 판정하였다.

나. 실험 결과

암은 유전자 변이, 세포 성장 조절 이상, 세포사멸 회피, 세포 에너지대사 조절 변화, 면역체계 이상 등에 의해 세포가 비정상적으로 과다 증식함으로써 각 종 문제를 유발하게 된다.

암의 치료는 암 발생을 촉진하는 기전을 타겟으로 조절(tumor suppressor gene의 기능 회복 및 reengineering)하거나, 세포사멸(apoptosis) 기전의 활성화 유도를 통해 증식을 막는 방법을 사용하게 된다. 이 중 세포사멸 유도 방법은 가장 오랫동안 사용되어 온 항암제 원리이며 주로 bax ((BCL2 Associated X, Apoptosis Regulator), PARP (Poly (ADP-ribose) polymerase), cytochrome c, caspase-3와 같은 세포사멸 유도 단백질들의 발현 증가로 이루어진다.

Bax는 종양발생 억제, 발생과정 중 신경세포 사멸, 림프계 및 생식기관의 항상성 유지, DNA 손상에 따른 세포사멸, 허혈-재관류 손상 등 다양한 역할을 하며, 그 발현은 세포생존 단백질인 Bcl-2에 의해 억제될 수 있다. 일반적으로 세포사멸이 일어나게 되면 Bcl-2는 감소하고 Bax는 증가하게 된다. 또한 세포사멸이 일어나면 caspases가 절단되는데 특히 caspase-3가 절단되어 cleaved caspase-3로 바뀌면서 활성화되게 된다.

Cytochrome c는 미토콘드리아의 내막에 있다가 세포사멸이 일어나면서 세포질로 방출되면서 칼슘을 방출하고, caspase 3가 활성화되면서 DNA repair 역할을 하는 PARP의 절단에 의한 세포사멸을 유발하게 된다. 따라서 Bax, cytochrome c, caspase-3, PARP 등 세포사멸 유도분자들의 발현 증가는 암 세포에서의 세포사멸 유도에 유리하게 작용할 수 있다.

한편, ERK도 암세포의 죽음이 유발될 때 발현 증가가 관찰되어 세포 성장 억제 및 세포사멸 유도와 관련된다고 알려져 있다.

(1) MCF-7 유방암 세포에서의 세포사멸 유도 효과

본 연구에서 MCF-7 유방암 세포에 각 추출물을 처리하였을 때, 정상세포(Nor)에 비하여 발효 전 추출물(N1), 유산균 발효 추출물(L1), 고초균 발효 추출물(B1) 및 유산균+고초균 혼합 추출물(L+B1, p<0.01) 모두 Bax(도 3의 A), cytochrome c(도 3의B), cleaved caspase-3(도 3의C), PARP(도 3의 D)의 발현을 증가시켰으며, Bcl-2(도 3의 E)의 발현을 감소시켰다. 또한 ERK의 인산화 발현(도 3의 F)을 증가시켰다.

발효 전 추출물에 비해 발효 추출물에서 이들 세포사멸 단백질들의 발현 증가가 더 효과적이었으며, 특히 여러 발효추출물들 중 유산균+고초균 혼합 추출물에서 가장 효과적인 것으로 나타났다.

(2) A549 폐암 세포에서의 세포사멸 유도 효과

A549 폐암 세포에서는 MCF-7 세포에서와 같이 정상세포(Nor)에 비하여 발효 전 추출물(N1), 유산균 발효 추출물(L1), 고초균 발효 추출물(B1) 및 유산균과 고초균 혼합 추출물(L+B1) 모두 Bax (도 4의 A), cytochrome c (도 4의 B), cleaved caspase-3 (도 4의 C), PARP (도 4의 D)의 발현을 증가시켰으며, Bcl-2(도 4의 E)의 발현을 감소시켰다. 또한 ERK의 인산화 발현(도 4의 F)을 증가시켰다.

특히 여러 추출물 중 유산균+고초균 혼합 추출물에서 세포사멸 유도 효과가 가장 우수한 것으로 나타났다.

본 추출물은 인체에 기와 혈을 보강하는 보약 중 하나로 예를 들어, 방사선이나 항암약물에 의한 골수기능 저하에 있어서 조혈줄기세포 활성을 높이는 등 생체방어(면역)에 효과가 뛰어나다고 알려져 있다. 반면 양방에서의 일반적인 항암약물은 암세포 및 정상세포를 파괴하는 기전(세포사멸)으로 위 세포사멸 단백질들의 발현을 유도함으로써 세포가 죽을 수 있도록 한다.

이런 관점에서 본 추출물은 세포를 오히려 보하는 작용이 크므로 암세포에서 세포사멸을 유도하는 작용은 적을 것으로 예상하였으나, 오히려 세포 사멸 유도를 증가시키는 것으로 나타나서 양방 항암제의 부작용 대비 보다 안전하게 항암활성을 나타낼 수 있을 것으로 기대되었다. 또한 이러한 효과는 발효 전 보다 발효를 하였을 때 현저히 증가되었기 때문에 암 환자에게 적용할 때는 발효기법을 적용하는 것이 효과적일 것으로 사료된다.

3. 간세포에서의 항산화 효과

가. 실험 방법

① 세포배양

사람의 간 세포주인 HepG2 세포(liver cells)를 10% FBS와 1% P/S가 포함된 DMEM 배지를 배양액으로 하여 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다.

② 약물처리 및 산화적 손상 자극

HepG2 세포를 60 mm dish에 5×10⁵cells/mL로 분주하고 24시간 배양하여 안정시킨 후, 각 추출물(1 mg/mL)을 처리하고 1시간 CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다. 그리고 산화적 손상을 유도하기 위하여 과산화수소(H₂O₂, 200 μM/mL)를 처리한 후 24시간 동안 배양하였다.

③ 세포 생존도 측정

H₂O₂ 처리에 의한 세포 독성 증가에 따른 각 추출물의 보호 효과를 확인하기 위해서 세포 생존도(cell viability) 평가를 수행하였다. 먼저 HepG2 세포(5×10⁵cells/mL)를 96 well plate에 well 당 100 ㎕ 씩 분주하여 배양한 후 각 추출물(1 mg/mL)을 처리하여 1시간 배양하였다.

여기에 H₂O₂ (200 μM/mL)를 처리하여 24시간 배양한 후 세포 생존도 측정 시약 (EZ-CYTOX, DoGenBio Co., Ltd., Seoul, Korea)을 10 ㎕ 씩 넣어 배양기에서 1시간 반응시킨 다음 Microplate reader에서 흡광도(450 nm)를 측정하였다. 세포 생존도(cell viability, %)의 정량화는 정상 세포의 세포 생존도를 100%로 하여 각 추출물 처리군의 생존도를 상대 평가하였다.

④ 항산화효소 단백질 발현 변화 분석(Western blot)

각 추출물이 처리된 HepG2 세포를 수거한 후 Lysis buffer를 넣어 4°C에서 30 분간 반응시킴으로써 세포막 용해를 유도하였다. 이를 14,000 rpm에서 20분 간 원심 분리하여 단백질이 함유된 상층액을 수거하고, Bradford's Protein Assay 용액을 이용하여 총 단백질의 양을 측정하였다.

각 세포 단백질(30 ㎍)을 SDS-PAGE 한 후 겔 상의 밴드들을 nitrocellulose membrane으로 이동시키고, 각 타겟 단백질에 대한 membrane을 제작하였다. 각 membrane을 5% skim milk 용액으로 1시간 실온에서 blocking한 후 SOD, catalase, HO-1, NRF-2에 대한 1차 항체 및 β-actin의 1차 항체와 4°C에서 24 시간 반응시켰다. 이를 1x TBS-T 완충액으로 15분 씩 3번 세척한 후 horseradish peroxidase가 감작(conjugation) 되어 있는 mouse 또는 rabbit의 2차 항체와 함께 실온에서 2시간 반응시켰다. 이를 다시 1x TBS-T 완충액으로 15분 간 3회 세척한 후 ECL 용액을 이용하여 발색시키고, RAS image system에서 밴드의 발현을 관찰하였다.

⑤ 통계학적 검정

나. 실험 결과

항산화 효소는 활성산소(reactive oxygen species, ROS)를 제거하여 질병으로부터 우리 몸을 보호하게 되는데, 대표적인 항산화효소로는 SOD (superoxide dismutase), catalase (CAT), glutathione peroxidase (GSH)가 있다. 이 중 SOD가 활성산소를 첫 번째로 제거하는 가장 중요한 효소로 알려져 있다. SOD가 활성산소를 만나면 과산화수소(H₂O₂)로 변환시키고, 과산화수소는 catalase를 통해 물로 변환, 배출되게 된다.

HO-1 (heme oxygenase-1)은 heme catabolism의 속도결정단계에 작용하는 효소로 다양한 세포에서 자외선, 과산화수소, 사이토카인, 저산소 상태 등 외부의 산화적 손상(stress) 발생에 대한 세포의 방어기전 역할에 해당한다. HO-1의 발현은 전사인자인 NRF-2 (nuclear factor-2-related factor-2)에 의해 조절되는데, NRF-2는 항산화 유전자의 유도 발현에 영향을 주는 대표적인 인자로서 인체 주요 조직에서 발현되고, HO-1의 발현 유도와 밀접하게 연관되어 있다.

(1) 세포 독성에 대한 보호 효과

세포독성 평가에서 정상군(Nor)에 비해 H₂O₂를 처리한 대조군에서는 세포 생존도가 유의적으로(p<0.001)으로 감소하였으며, 이는 각 추출물 처리에 의해 증가하였다(도 5).

또한 대조군에 비하여 발효 전 추출물(N1, p<0.001), 유산균 발효 추출물(L1, p<0.001), 고초균 발효 추출물(B1, p<0.01) 및 유산균과 고초균 혼합 추출물(L+B1, p<0.001) 처리군에서 모두 대조군 대비 유의적인 세포 생존도의 증가를 나타내었다.

발효 전 추출물에서도 세포 생존도의 증가가 관찰되었으며, 각 군간 유의적인 차이는 관찰되지 않아서 추출물 모두 H₂O₂에 의한 산화적 손상에 대한 세포 보호효과가 있는 것으로 보인다.

(2) 항산화 효소 단백질의 발현 조절 효과

H₂O₂ 자극으로 산화적 손상이 유발된 HepG2 간세포에 각 추출물을 처리하였을 때, 정상군(Nor)에 비하여 SOD와 catalase의 발현이 증가하였으며, 이는 발효 전 추출물(N1), 유산균 발효 추출물(L1), 고초균 발효 추출물(B1) 및 유산균+고초균 혼합 추출물 처리에 의해 감소하였다 (도 6의 A, B).

HO-1의 발현은 산화적 손상에 의해 감소하였고, 이는 유산균 발효 추출물(L1), 고초균 발효 추출물(B1) 및 유산균+고초균 혼합 추출물 처리에 의해 유의적으로 증가하여 비발효 추출물(N1) 보다 발효 추출물이 HO-1 발현 감소에 더 효과적인 것으로 나타났다.

또한 HO-1의 발현 증가(도 6의 C)에서와 같이 NRF-2의 발현 변화에서도 고초균 추출물 및 유산균+고초균 혼합 발효 추출물에서 유의적인 감소가 관찰되었다(도 6의 D).

따라서 비발효 추출물 보다 발효 추출물에서, 발효추출물들 중 특히 유산균+고초균 혼합 추출물에서 효과적으로 항산화효소들의 발현이 감소되는 것을 확인하였다.

많은 논문에서 H₂O₂ 처리 조건에 따라 HepG2에서의 항산화 효소들의 발현 증가 또는 감소 변화가 다르게 관찰되는데, 본 실험 조건에서는 산화적 손상 후 SOD, catalase, HO-1의 발현이 증가하였으며, 이는 간세포에서 H₂O₂ 처리에 의한 산화적 손상에 대하여 방어기전이 작동된 것으로 보인다. 추출물 처리 후 이들 항산화 효소들의 발현 감소는 약물이 산화물질 소거를 통해 간세포를 보호함으로써 정상상태를 유지하였기 때문으로 사료된다.

4. 결론

(1) RAW264.7 세포의 LPS-유도 염증반응에서 유산균, 고초균 및 유산균과 고초균 혼합 발효추출물은 모두 염증단백질인 iNOS의 발현을 억제함으로써 NO의 생성을 감소시켰으며, COX-2의 발현 억제 및 ERK, NF-kB의 인산화 발현 억제를 통해 항염증 효과를 나타내었다. 비발효추출물에 비해 발효추출물에서 효과적이었으며, 발효추출물 중 특히 유산균+고초균 발효 혼합추출물에서 가장 효과적인 것으로 나타났다.

(2) MCF-7 유방암세포와 A549 폐암세포에서 각 발효 추출물은 비발효추출물에 비해 Bax, cytochrome c, cleaved caspase-3, PARP 등의 세포사멸 유도 단백질들의 발현을 효과적으로 증가시킴으로써 세포사멸을 통한 항암 활성을 나타내었으며, 특히 유산균+고초균 혼합 발효추출물에서 효과적인 것으로 나타났다.

(3) HepG2 세포의 H₂O₂-유도 산화적 손상에서 비발효 추출물 및 발효 추출물들은 모두 세포 생존도의 감소를 회복시킴으로써 간세포를 보호하였으며, 비발효추출물에 비해 발효추출물들은 NRF2와 같은 전사인자의 발현 감소를 통해 산화적 손상에 따른 SOD, catalase, HO-1 등의 항산화 효소 발현의 증가를 억제할 수 있는 것으로 나타났다. 특히 발효추출물들 중 유산균+고초균 혼합 발효추출물이 항산화 효소 발현 조절에 매우 효과적인 것으로 나타났다.

본 한약재 추출물은 항염, 항암, 항산화 효과가 있는 약물이며, 이 추출물을 발효하게 되면(특히 고초균 또는 고초균+유산균) 항염, 항암, 항산화 효과가 증가하는데 특히 항암 활성에 좋은 효과가 기대된다.

<제조예 1> 약학 조성물의 제조

제조예 1-1. 산제의 제조

실시예 1에서 제조한 한약재 발효 조성물 10 ㎎

유당수화물 100 ㎎

탈크 10 ㎎

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

제조예 1-2. 정제의 제조

실시예 1에서 제조한 한약재 발효 조성물 10 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유당수화물 100 ㎎

스테아르산마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

제조예 1-3. 캅셀제의 제조

실시예 1에서 제조한 한약재 발효 조성물 10 ㎎

미결정셀룰로오스 3 ㎎

유당수화물 14.8 ㎎

스테아르산마그네슘 0.2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캅셀제의 제조방법에 다라서 젤라틴캡슐에 충전하여 캅셀제를 제조하였다.

제조예 1-4. 주사제의 제조

실시예 1에서 제조한 한약재 발효 조성물 10 ㎎

만니톨 180 ㎎

주사용 멸균 증류수 2974 ㎎

인산일수소나트퓸 26 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2mL) 상기의 성분 함량으로 제조하였다.

제조예 1-5. 액제의 제조

실시예 1에서 제조한 한약재 발효 조성물 10 ㎎

이성화당 10 ㎎

만니톨 5 ㎎

정제수 적량

레몬향 적량

상기의 성분을 통상의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 정제수를 가하여 전체 100mL로 조절한 후 멸균시켜 갈색병에 충진하여 액제를 제조한다.

<제조예 2> 건강식품의 제조

제조예 2-1. 건강보조식품의 제조

실시예 1에서 제조한 한약재 발효 조성물 10 ㎎

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이드 70 ㎍

비타민 E 1.0 ㎎

비타민 B1 0.13 ㎎

비타민 B2 0.15 ㎎

비타민 B6 0.5 ㎎

비타민 B12 0.2 ㎍

비타민 C 10 ㎎

비오틴 10 ㎍

니코틴산아미드 1.7 ㎎

엽산 50 ㎍

판토텐산 칼슘 0.5 ㎎

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 ㎎

산화아연 0.82 ㎎

탄산마그네슘 25.3 ㎎

제1인산칼륨 15 ㎎

제2인산칼슘 55 ㎎

구연산칼륨 30 ㎎

탄산칼슘 100 ㎎

염화마그네슘 24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

제조예 2-2. 건강음료의 제조

실시예 1에서 제조한 한약재 발효 조성물 10 mg

비타민 C 15 g

비타민 E(분말) 100 g

젖산철 19.75 g

산화아연 3.5 g

니코틴산아미드 3.5 g

비타민 A 0.2 g

비타민 B1 0.25 g

비타민 B2 0.3 g

정제수 정량

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1 시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2L 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다.

따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다. 본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 용이하게 이용될 수 있으며, 이러한 변형이나 변경은 모두 본 발명의 영역에 포함되는 것으로 볼 수 있다.

Claims

황기, 인삼, 백출, 복령, 저령, 진피, 숙지황, 생지황, 당귀, 천궁, 백작약, 맥문동, 황금, 건강, 대조 및 감초를 포함하는 한약재 또는 상기 한약재의 추출물을 KCTC 3108로 기탁된 락토바실러스 플랜타룸(Lactoplantibacillus plantanum subsp. plantanum) 및 KCTC 2217로 기탁된 고초균 (Bacillus subtilis)으로 이루어진 복합 균주로 발효시킨 한약재 발효물.
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제1항에 있어서, 상기 한약재는 상기 발효물의 전체 중량 대비 55~65 중량%로 포함되는 것을 특징으로 하는 한약재 발효물.
제1항에 있어서, 상기 한약재는 황기 100 중량부에 대하여, 인삼 90~110 중량부, 백출 90~110 중량부, 복령 90~110 중량부, 저령 90~110 중량부, 진피 90~110 중량부, 숙지황 90~110 중량부, 생지황 90~110 중량부, 당귀 90~110 중량부, 천궁 90~110 중량부, 백작약 90~110 중량부, 맥문동 90~110 중량부, 황금 40~60 중량부, 건강 40~60 중량부, 대조 40~60 중량부및 감초 40~60 중량부를 포함하는 것을 특징으로 하는 한약재 발효물.
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제1항, 제5항 및 제6항 중 어느 한 항에 따른 한약재 발효물을 유효성분으로 포함하는 항암용 약학적 조성물.
제1항, 제5항 및 제6항 중 어느 한 항에 따른 한약재 발효물을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 개선용 식품 조성물.
제1항, 제5항 및 제6항 중 어느 한 항에 따른 한약재 발효물을 유효성분으로 포함하는 항염증용 약학적 조성물.
제1항, 제5항 및 제6항 중 어느 한 항에 따른 한약재 발효물을 유효성분으로 포함하는 염증 예방 또는 개선용 식품 조성물.
제1항, 제5항 및 제6항 중 어느 한 항에 따른 한약재 발효물을 유효성분으로 포함하는 염증 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
제1항, 제5항 및 제6항 중 어느 한 항에 따른 한약재 발효물을 유효성분으로 포함하는 항산화용 식품 조성물.
제1항, 제5항 및 제6항 중 어느 한 항에 따른 한약재 발효물을 유효성분으로 포함하는 항산화용 화장료 조성물.