KR102653020B1 - 락티플란티바실러스 플란타룸 opt-안티uv 균주의 발효 추출물을 함유하는 화장료 조성물 - Google Patents
락티플란티바실러스 플란타룸 opt-안티uv 균주의 발효 추출물을 함유하는 화장료 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 미역에서 분리한 신규 프로바이오틱스인 Lactiplantibacillus plantarum OPT-antiUV(KCTC15558BP) 균주 또는 이의 발효(배양) 추출물에 관한 것으로서, 상기 추출물이 UV 노출에 의한 피부 손상으로부터 피부를 보호하고, 피부장벽을 개선시키며, 피부재생 효능이 있다. 또한 UV 손상으로 인해 감염되는 스킨마이크로바이옴 기회감염 병원균인 Staphylococcus aureus 및 Staphylococcus epidermidis의 생육을 억제함에 따라 이들 병원균으로 인한 피부 손상 감염, 피부 질환 증상을 예방할 수 있고, 피부 감염 치료제, 또는 항균용 화장료 조성물로 유용하게 사용할 수 있다.
Description
본 발명은 락티플란티바실러스 플란타룸 OPT-안티UV(Lactiplantibacillus plantarum OPT-antiUV, KCTC15558BP) 균주의 발효(배양) 추출물을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다.
일상생활에서 우리는 햇빛에 항상 노출되어 있으며, 특히 UV-B와 같은 자외선 노출로 인해 발생하는 세포의 탄력 감소, 피부 주름 유발 등은 일상생활에서 피할 수 없는 요소이다. 따라서, 자외선의 노출로부터 피부 장벽 요소들을 증강시켜 피부세포를 보호하고, 복구하기 위한 화장료 소재나 다양한 피부질환 약품의 개발이 다양해지고 있고, 이 중의 하나인 천연물 소재로서 프로바이오틱스가 있다. 마이크로바이옴(Microbiome)은 미생물(Microbe)과 생태계(Biome)의 합성어로, 인체에 존재하며 인체에 영향을 주는 우리 몸을 공유하는 미생물들의 총합을 의미한다. 미생물 중 몇몇 균들을 유익균, 유해균으로 특정하거나 장내세균, 피부상재균 등으로 특정 신체부위의 세균들을 집합적으로 지칭하기도 하며, 이러한 균들이 서로 공생하며 균형을 유지할 때 생리적으로 유용한 효과를 기대할 수 있다. 최근에는 기존 장내세균 총에 국한된 연구에서 피부로 그 영역이 확장되고 있으며, 피부관련 연구는 화장품시장 뿐 아니라 아토피 등 피부질환 치료제 시장까지 활발히 진행되고 있다. 피부에 미치는 영향에 있어, 일부의 기회감염 병원균의 자정작용 또는 이들의 억제활성을 위해서는 대체적으로 프로바이오틱스로서 알려져 있던 균주들에 대한 개발에 보다 박차를 가하고 있다.
본 발명자들은 이러한 스킨마이크로바이옴 관련 연구를 하던 중, 미역으로부터 분리된 락티플란티바실러스 플란타룸 OPT-안티UV 균주의 발효 추출물이 UV-B로 인한 손상과 기회 감염 병원균의 성장을 억제하는 것을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 락티플란티바실러스 플란타룸 OPT-안티UV(Lactiplantibacillus plantarum OPT-antiUV, KCTC15558BP) 균주의 발효(배양) 추출물을 함유하는 화장료 조성물을 제공하는 데에 있다.
본 발명은 락티플란티바실러스 플란타룸 OPT-안티UV(Lactiplantibacillus plantarum OPT-antiUV, KCTC15558BP) 균주의 발효 추출물을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다.
상기 발효 추출물은 상기 균주의 배양물의 C1~C4 알코올 침전물인 것을 특징으로 한다. 상기 C1~C4 알코올은 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올 및 이소부탄올에서 선택되는 것일 수 있다.
상기 발효 추출물은 피부손상 보호 효능, 피부장벽 강화 효능 또는 피부재생 효능이 있는 것을 특징으로 한다. 상기 피부손상은 UV-B 노출로 인한 것일 수 있다.
상기 발효 추출물은 UV-B 노출로 인한 피부 손상으로 인해 감염되는 스킨마이크로바이옴 기회 감염 병원균인 스태피로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 및 스태피로코커스 에피더미스(Staphylococcus epidermidis) 중 선택되는 1종 이상의 병원균의 생육을 억제하는 것을 특징으로 한다.
또 다른 양태에서 본 발명은 신규한 락티플란티바실러스 플란타룸 OPT-안티UV(Lactiplantibacillus plantarum OPT-antiUV, KCTC15558BP) 균주에 관한 것이다.
상기 균주는 생균체, 사균체, 배양물, 균체를 포함하는 배양액, 균체를 제거한 배양액, 배양액의 농축물, 균체의 파쇄물, 균체의 추출물, 배양액의 추출물, 배양액 내 세포외 다당체의 농축물, 및, 균체나 배양액으로부터 분리된 대사체로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상이 포함된 것을 특징으로 한다.
본 발명은 상기 균주의 발효 추출물을 함유하는 피부 외용제 조성물을 제공하며, 상기 피부 외용제 조성물은 UV-B와 같은 자외선으로 인해 손상된 피부를 보호하고, 이를 통해 스킨마이크로바이옴 기회 감염 병원균을 조절한다.
또한, 본 발명은 상기 발효 추출물의 제조방법을 제공할 수 있다.
상기 발효 추출물은 락티플란티바실러스 플란타룸 OPT-안티UV 균주를 글루코스, 이스트 추출물, 소이 펩톤, 디포타슘포스페이트, 마그네슘 설페이트, 망가네이즈 설페이트 및 폴리소르베이트 80을 포함하는 배지에서 30~40℃에서 18~36시간 동안 배양하여 균주 배양액을 얻고, 상기 균주 배양액 100 중량부 기준으로 100~300 중량부의 에탄올을 첨가하고, 4~30℃에서 1~4일간 반응하여 얻은 침전물을 수거하여 얻을 수 있다. 상기 침전물은 바람직하게는 5000~20000 rpm에서 4~25℃에서 5~30분간 원심분리하여 수득할 수 있다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 균주는 30~37℃에서 16~48시간 배양하는 것이 바람직하며, 배양가능한 최적 온도는 37℃, 최소 온도는 15℃, 최대온도는 45℃이고, 최적 pH는 6.5, 배양가능한 최소 pH는 3.5 최대 pH는 7.8 이다. 최적 배양시간은 24시간이며 최소 배양시간은 8시간 최대 배양시간 120시간이다.
상기 균주의 계대배양에 사용되거나 발효 추출물의 제조에 이용되는 배지는 MRS 액체배지 또는 고체배지인 것일 수 있으며, 통상의 유산균 배양배지는 모두 사용가능하다. 또한, 바람직하게는 식물성 비건 배지로서, 글루코스, 이스트 추출물, 소이 펩톤, 디포타슘포스페이트, 마그네슘 설페이트, 망가네이즈 설페이트 및 폴리소르베이트 80을 포함하는 배지일 수 있고, 상기 배지는 글루코스 (Glucose) 0.1~5.0 중량%, 이스트 추출물 (Yeast extract) 0.1~2.0 중량%, 소이 펩톤 (Soy peptone) 0.1~2.0 중량%, 디포타슘포스페이트 (Dipotassium phosphate) 0.1~1.0 중량%, 마그네슘 설페이트 (Magnesium sulfate) 0.1~1.0 중량%, 망가네이즈 설페이트 (Manganese sulfate) 0.001~0.01 중량%, 폴리소르베이트 80 (Polysorbate 80) 0.01~0.1 중량%를 포함하고, 잔량으로 물을 포함하여 멸균한 액체 배지를 사용하여 사용할 수 있다.
상기 발효 추출물 100~500㎍/㎖ 처리로 인해 필라그린 생성이 2.0~3.0배 증강되며, 로리크린 또는 인볼루크린이 1.5~3.0배 증강된다. 또한 aFGF와 bFGF는 상기 발효 추출물 100~500㎍/㎖ 처리로 인해 1.2~1.7배로 증가된다.
본 발명은 상기 발효 추출물을 함유하는 피부외용제용 약학 조성물을 제공한다. 상기 발효 추출물은 본 발명의 약학 조성물에 0.001~100 중량%로 하여 첨가될 수 있다.
상기 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 투여량은 치료받을 대상의 연령, 성별, 체중과, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 일반적으로 투여량은 0.01㎎/㎏/일 내지 대략 2000㎎/㎏/일의 범위이다. 더 바람직한 투여량은 1㎎/㎏/일 내지 500㎎/㎏/일이다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 약학 조성물은 쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물은 독성 및 부작용이 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.
상기 발효 추출물을 함유하는 화장료 조성물의 제형으로는 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 에센스, 로션, 에멀젼, 팩, 핸드크림, 풋크림, 립밤, 립스틱, 아이섀도우, 아이라이너, 아이브로우 펜슬, 블러셔, 하이라이터, 일반화장수, 스킨, 크림, 세럼, 미용비누, 유연화장수, 약용화장수, 전신세정제, 클렌징폼, 클렌징로션, 겔, 클렌징 오일, 클렌징 크림, 샴푸, 린스, 헤어트리트먼트, 헤어로션, 클렌징 티슈 및 클렌징 워터에서 선택되는 것을 제공할 수 있다.
보다 더 자세하게는, 본 발명의 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다. 본 발명의 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판-부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다. 본 발명의 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다. 본 발명의 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다. 본 발명의 화장료 조성물의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 아세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다. 본 발명의 화장료 조성물은 형광물질, 살진균제, 굴수성 유발물질, 보습제, 방향제, 방향제 담체, 단백질, 용해화제, 당 유도체, 일광차단제, 비타민, 식물 추출물 등을 포함하는 부형제를 추가로 함유할 수 있다. 상기 성분들은 제형 또는 사용목적에 따라 그 첨가량을 화장료 조성물 고유의 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 선택할 수 있다. 상기 성분들의 첨가량은 예를 들어 조성물 총 중량에 대하여 0.1~10 중량%, 바람직하게는 0.1~6 중량%일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 미역에서 분리한 신규 프로바이오틱스인 Lactiplantibacillus plantarum OPT-antiUV(KCTC15558BP) 균주 또는 이의 발효(배양) 추출물에 관한 것으로서, 상기 추출물이 UV 노출에 의한 피부 손상으로부터 피부를 보호하고, 피부장벽을 개선시키며, 피부재생 효능이 있다. 또한 UV 손상으로 인해 감염되는 스킨마이크로바이옴 기회감염 병원균인 Staphylococcus aureus 및 Staphylococcus epidermidis의 생육을 억제함에 따라 이들 병원균으로 인한 피부 손상 감염, 피부 질환 증상을 예방할 수 있고, 피부 감염 치료제, 또는 항균용 화장료 조성물로 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 Lactiplantibacillus plantarum OPT-antiUV 균주의 당 발효 특성 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 Lactiplantibacillus plantarum OPT-antiUV의 발효 추출물 수득 공정을 나타내는 순서도 및 최종 발효 추출물의 사진이다.
도 3은 UV 조사된 인간 각질 세포주인 HaCaT세포에서 Lactiplantibacillus plantarum OPT-antiUV 발효 추출물의 피부장벽 보호 및 회복 효과를 나타낸 결과이다.
도 4는 UV 조사된 인간 각질 세포주인 HaCaT 세포에서 Lactiplantibacillus plantarum OPT-antiUV 발효 추출물의 피부 손상으로부터 보호 효과를 나타낸 사진이다.
도 5는 인간 섬유아 세포주인 CCD1064sk 세포에서 Lactiplantibacillus plantarum OPT-antiUV 발효 추출물의 피부 재생 효과를 나타낸 결과이다.
도 6은 인간 각질 세포주인 HaCaT 세포에서 Lactiplantibacillus plantarum OPT-antiUV 발효 추출물의 피부 재생 효과를 나타낸 사진이다.
도 7은 스킨마이크로바이옴 기회감염 병원균인 Staphylococcus aureus에 대한 Lactiplantibacillus plantarum OPT-antiUV 발효 추출물의 항균 활성 결과를 나타낸 사진이다.
도 8은 Lactiplantibacillus plantarum OPT-antiUV 발효 추출물이 함유된 배양 배지에서 배양된 스킨마이크로바이옴 기회감염 병원균인 Staphylococcus aureus의 생균 수를 나타낸 결과이다.
도 9는 스킨마이크로바이옴 기회감염 병원균인 Staphylococcus epidermidis에 대한 Lactiplantibacillus plantarum OPT-antiUV 발효 추출물의 항균 활성 결과를 나타낸 사진이다.
도 10은 Lactiplantibacillus plantarum OPT-antiUV 발효 추출물이 함유된 배양배지에서 배양된 스킨마이크로바이옴 기회감염 병원균인 Staphylococcus epidermidis의 생균 수를 나타낸 결과이다.
도 2는 Lactiplantibacillus plantarum OPT-antiUV의 발효 추출물 수득 공정을 나타내는 순서도 및 최종 발효 추출물의 사진이다.
도 3은 UV 조사된 인간 각질 세포주인 HaCaT세포에서 Lactiplantibacillus plantarum OPT-antiUV 발효 추출물의 피부장벽 보호 및 회복 효과를 나타낸 결과이다.
도 4는 UV 조사된 인간 각질 세포주인 HaCaT 세포에서 Lactiplantibacillus plantarum OPT-antiUV 발효 추출물의 피부 손상으로부터 보호 효과를 나타낸 사진이다.
도 5는 인간 섬유아 세포주인 CCD1064sk 세포에서 Lactiplantibacillus plantarum OPT-antiUV 발효 추출물의 피부 재생 효과를 나타낸 결과이다.
도 6은 인간 각질 세포주인 HaCaT 세포에서 Lactiplantibacillus plantarum OPT-antiUV 발효 추출물의 피부 재생 효과를 나타낸 사진이다.
도 7은 스킨마이크로바이옴 기회감염 병원균인 Staphylococcus aureus에 대한 Lactiplantibacillus plantarum OPT-antiUV 발효 추출물의 항균 활성 결과를 나타낸 사진이다.
도 8은 Lactiplantibacillus plantarum OPT-antiUV 발효 추출물이 함유된 배양 배지에서 배양된 스킨마이크로바이옴 기회감염 병원균인 Staphylococcus aureus의 생균 수를 나타낸 결과이다.
도 9는 스킨마이크로바이옴 기회감염 병원균인 Staphylococcus epidermidis에 대한 Lactiplantibacillus plantarum OPT-antiUV 발효 추출물의 항균 활성 결과를 나타낸 사진이다.
도 10은 Lactiplantibacillus plantarum OPT-antiUV 발효 추출물이 함유된 배양배지에서 배양된 스킨마이크로바이옴 기회감염 병원균인 Staphylococcus epidermidis의 생균 수를 나타낸 결과이다.
이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지도록, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.
실시예 1. 식물 유래 프로바이오틱스의 분리 및 동정
실시예 1-1. 해조류 유래 프로바이오틱스의 분리
해조류 유래 프로바이오틱스의 분리는 미역, 김, 다시마, 파래, 청각, 톳 등에서 분리하였으며, 분리 방법은 다음과 같다. 각각의 시료는 단계적으로 멸균수에 희석하여 Bromophenol blue solution (Samchun, Korea)이 0.004% 포함된 MRS agar 배지 (MB cell, Korea)에 시료를 도말하였고 37℃ incubator에서 48시간 배양하였다. 48시간 배양 후, 콜로니 주변에 노란색 환을 띄어 산성을 나타내는 프로바이오틱스 유산균의 콜로니들을 구별하였다.
실시예 1-2. 프로바이오틱스의 16S sequencing 분석
상기 위와 같이 구별된 프로바이오틱스들로부터 가장 피부 보호 효능이 우수한 균주를 선별하였고, 이 균주를 27F (서열번호 1)과 1492R (서열번호 2)의 프라이머를 사용하여 PCR을 통해 각각의 16S rRNA를 증폭시켜, 증폭된 뉴클레오티드는 코스모진텍에 sequencing 분석 의뢰를 통해 염기서열(서열번호 3)을 확보하였다. 염기서열은 NCBI ()계통 분석을 통해 프로바이오틱스를 Lactiplantibacillus plantarum OPT-antiUV라고 명명하였다. 또한 분리된 Lactiplantibacillus plantarum OPT-antiUV는 한국생명공학연구원 한국세포주은행(Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에 2023년 08월18일자로 KCTC15558BP기탁 번호를 부여받아 기탁하였다. * 서열번호 1 내지 3 : 표 6 참조
실시예 1-3. 프로바이오틱스의 당 발효 특성 조사
당 발효 특성은 API 50 CHL kit (Biomerieux, France)를 이용하여 Lactiplantibacillus plantarum OPT-antiUV가 49개의 당을 탄소원으로써 이용가능한지 여부를 조사하였다. API 50 CHL kit는 유산균이 자라면서 산을 생성하면 medium에 포함되어 있는 Bromcresol purple에 의해 보라색에서 노란색으로 변하면서 해당 당을 이용가능한지 확인 가능하다.
먼저 Lactiplantibacillus plantarum OPT-antiUV를 MRS agar 배지에 도말하여 37℃ incubator에서 24시간 배양 후, Suspension medium (Biomerieux, France)에 탁도를 2 McFarland로 현탁시켜 API 50 CHL medium (Biomerieux, France)에 1% 접종하여 API strip에 110μL씩 접종하였다. 이후 37℃ incubator에서 24시간, 48시간 배양한 뒤, 24시간 양성(++), 48시간 양성(+), 음성(-)으로 판독하여 발효 특성을 도 1, 표 1에 나타내었다.
Lactiplantibacillus plantarum OPT-antiUV | |||||
번호 | 종류 | 분해 정도 | 번호 | 종류 | 분해 정도 |
0 | Control | - | 25 | Esculin | ++ |
1 | Glycerol | - | 26 | Salicin | ++ |
2 | Erythritol | - | 27 | D-Cellobiose | ++ |
3 | D-Arabinose | - | 28 | D-Maltose | ++ |
4 | L-Arabinose | ++ | 29 | D-Lactose | ++ |
5 | D-Ribose | ++ | 30 | D-Melibiose | ++ |
6 | D-Xylose | - | 31 | D-Saccharose | ++ |
7 | L-Xylose | - | 32 | D-Trehalose | ++ |
8 | D-Adonitol | - | 33 | Inulin | - |
9 | Methyl-βD-Xylopyranoside | - | 34 | D-Melezitose | ++ |
10 | D-Galactose | ++ | 35 | D-Raffinose | + |
11 | D-Glucose | ++ | 36 | Amidon | - |
12 | D-Fructose | ++ | 37 | Glycogen | - |
13 | D-Mannose | ++ | 38 | Xylitol | - |
14 | L-Sorbose | - | 39 | Gentiobiose | ++ |
15 | L-Rhamnose | - | 40 | D-Turanose | ++ |
16 | Dulcitol | - | 41 | D-Lyxose | - |
17 | Inositol | - | 42 | D-Tagatose | - |
18 | Mannitol | ++ | 43 | D-Fucose | - |
19 | D-Sorbitol | ++ | 44 | L-Fucose | - |
20 | Methyl α D-mannopyranoside | + | 45 | D-Arabitol | - |
21 | Methyl αD-glucopyranoside | - | 46 | L-Arabitol | - |
22 | N-Acetylglucosamine | ++ | 47 | Potassium Gluconate | ++ |
23 | Amygdalin | ++ | 48 | Potassium 2-Ketogluconate | - |
24 | Arbutin | ++ | 49 | Potassium 5-Ketogluconate | - |
그 결과, Lactiplantibacillus plantarum OPT-antiUV는 총 25개 당을 이용함을 확인하였으며, 단당류인 L-Arabinose, D-Ribose, D-Galactose, D-Glucose, D-Fructose, D-Mannose, 당알콜인 Mannitol, D-Sorbitol, 다당류인 Methyl α D-mannopyranoside, N-Acetylglucosamine, 배당체인 Amygdalin, Arbutin, Esculin, Salicin, 이당류인 D-Cellobiose, D-Maltose, D-Lactose, D-Melibiose, D-Saccharose, D-Trehalose, Gentiobiose, D-Turanose, 삼당류인 D-Melezitose, D-Raffinose, 당화합물인 Potassium Gluconate를 이용하여 대사함에 따라 산을 생성하는 특성을 갖는 것을 확인하였다.
실시예 2.
Lactiplantibacillus plantarum
OPT-antiUV 발효 및 추출물 제조
상기 실시예 1에서 분리된 Lactiplantibacillus plantarum OPT-antiUV를 비건 식물성 배지 (Glucose 3.0 중량%, Yeast extract 1.0 중량%, Soy peptone 1.0 중량%, Dipotassium phosphate 0.1 중량%, Magnesium sulfate 0.1 중량%, Manganese sulfate 0.005 중량%, Polysorbate 80 0.05 중량%)에 1% (v/v)로 접종하여(총 균수 약 1x108cfu 내지 1x1012cfu), 37℃ incubator에서 24시간 배양하였다. 24시간 뒤에 Lactiplantibacillus plantarum OPT-antiUV를 10배 희석하여 OD600를 측정한 결과, OD6009.6 정도임을 확인하였으며, 생균수 분석을 통해 109CFU/mL의 생균을 포함하고 있음을 확인하였다. 상기 배양된 배양액과 순도 95% 에탄올을 1:2 부피비로 혼합하고 20℃에서 3일 침지시킨 후 원심분리 (10,000 rpm, 20℃, 10분)하여 발효 추출물을 획득하였다. 발효 추출물은 순차적으로 1 ㎛로 여과 후, 0.5 ㎛로 다시 여과하여 후 얻은 여과액을 회전증발농축기로 농축하여 진공 건조하여 실험에 사용하였다 (도 2).
실시예 3.
Lactiplantibacillus plantarum
OPT-antiUV 발효 추출물의 피부장벽 강화 효능 평가 비교
피부 상태 개선 효능을 확인하기 위하여 제조된 Lactiplantibacillus plantarum OPT-antiUV 발효 추출물을 이용하여 피부 장벽 개선 효능 평가를 진행하였다.
먼저, 독일 CLS (Cell Lines Service, Germany)사에서 구입한 인간 각질 세포주인 HaCaT 세포를 6웰 플레이트에 5x105cells/well로 분주하고 24시간 동안 배양하였다. 이 때, 세포의 배양 배지는 소태아혈청인 FBS (Fetal Bovine Serum, Gibco, USA)이 함유된 DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium, Welgene, Korea) 배지를 사용하였다. 다음, 각 웰을 무혈청 배지로 교체하고 상기 Lactiplantibacillus plantarum OPT-antiUV 발효 추출물과 양성대조군인 레티놀산 (Retinoic acid, TCI, Japan)을 처리하고 4시간 배양 후 UVB 30mJ/cm2을 조사하고 20시간 추가 배양하였다. 배양 후 피부 장벽 구성 유전자 (Filaggrin, Loricrin, Involucrin)의 발현을 관찰하였다.
HaCaT 세포에서 RNA를 추출하기 위한 방법은 다음과 같다. Lactiplantibacillus plantarum OPT-antiUV 발효 추출물과 양성대조군이 처리된 세포는 PBS (Phosphate buffered saline, Samchun, Korea)를 이용하여 세척한 후, 배양된 세포에 QIAzol® (QIAGEN, USA)를 처리하여 세포 용해 (cell lysis)를 진행하였다.
다음으로, 제조사인 QIAGEN에서 제공하는 protocol을 이용하여 RNA를 분리하였다. 분리된 RNA는 RNA 정량 키트 (Qubit® fluorometer with RNA BR Assay kit, Invitrogen, USA)를 이용하여 정량한 뒤 cDNA를 합성하여 Real-time PCR을 실시하였다. 이 때, cDNA의 합성은 cDNA 합성 키트 (qPCRBIO cDNA Synthesis Kit, Pcrbiosystems, UK)를 사용하였다. Real-time PCR은 Real-time PCR 키트 (2x qPCRBIO SyGreen Blue mix Lo-ROX, Pcrbiosystems UK)를 이용하여 유전자를 증폭한 후 증폭산물을 정량 분석하였다. Real-time PCR 조건은 모두 95℃에서 5초, 60℃에서 30초를 40 사이클로 진행하였다. 이 때, 모든 키트를 사용한 실험은 제조사에서 제공하는 프로토콜에 따라 진행하였다. Filaggrin, Loricrin, Involucrin 유전자 발현량 결과는 UVB 조사 군의 유전자 발현량을 기준으로 비율로 나타낸 결과를 도 3과 표 2에 나타내었다.
시료 | 유전자 발현량(% of control) | ||
Involucrin | Loricrin | Filaggrin | |
무처리(Control) | 209.1 | 217.1 | 213.3 |
UVB 30 mJ/cm2 | 100 | 100 | 100 |
UVB 30 mJ/cm2 + Lactiplantibacillus plantarum OPT-antiUV 100 μg/mL |
158.8 | 187.3 | 215.8 |
UVB 30 mJ/cm2 + Lactiplantibacillus plantarum OPT-antiUV 250 μg/mL |
203.1 | 236.1 | 265.0 |
UVB 30 mJ/cm2 + Lactiplantibacillus plantarum OPT-antiUV 500 μg/mL |
267.8 | 262.5 | 290.3 |
UVB 30 mJ/cm2 + 레티놀산(1μM) | 200.5 | 220.1 | 210.5 |
도 3 및 표 2와 같이, 인간 각질 세포주인 HaCaT 세포에 UVB 조사한 군에서는 피부 장벽 구성 관련 유전자 발현이 감소함을 확인하였다. 또한 Lactiplantibacillus plantarum OPT-antiUV 발효 추출물 처리 후 UVB를 조사한 군에서는 피부장벽 구성 관련 유전자의 발현이 UVB 처리군보다 감소되지 않았거나, 해당 유전자의 발현이 증가되는 것으로 확인되었다. 이러한 결과는 Lactiplantibacillus plantarum OPT-antiUV 발효 추출물이 피부장벽을 강화시켜 UV로부터 피부가 손상되는 것을 보호함과 동시에 회복에 도움을 줄 수 있어 피부 장벽 보호 및 치료제로 사용 가능함을 시사한다.
실시예 4.
Lactiplantibacillus plantarum
OPT-antiUV 발효 추출물의 세포 손상 보호 효과
UVB로부터 세포 손상보호를 확인하기 위하여, Lactiplantibacillus plantarum OPT-antiUV 발효 추출물을 이용해서 JC-1 stain을 진행하였다.
JC-1 staining은 미토콘드리아 특이적 Dye인 JC-1이 건강한 세포의 미토콘드리아 내에 모여 Red fluorescence를 나타내는데, 외부 자극에 의해 세포가 Apoptosis로 들어가면 미토콘드리아 막 전위에 이상이 생겨 JC-1이 세포질에서 Monomer 형태로 Green flourescence를 나타내게 되는 원리를 이용한 염색법이다.
먼저, 독일 CLS사에서 구입한 인간 각질세포주인 HaCaT 세포를 6웰 플레이트에 3x105cells/well로 분주하고 24시간 동안 배양하였다. 이 때, 세포의 배양 배지는 소태아혈청인 FBS (Gibco, USA)이 함유된DMEM (Welgene, Korea) 배지를 사용하였다. 다음, 각 웰을 무혈청 배지로 교체하고 상기 Lactiplantibacillus plantarum OPT-antiUV 발효 추출물을 처리하고 4시간 배양 후 UVB 30mJ/cm2을 조사하고 20시간 추가 배양하였다. 배양 후 배양액을 제거하고 JC-1 1 μg/mL이 함유된 배지로 교체하여 2시간 추가 반응하고 HBSS (Hanks' Balanced Salt Solution, Gibco, USA)로 2회 세척 후 형광 현미경으로 세포를 관찰하여 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4와 같이, UVB를 조사하지 않은 Control (CTL) 상태에서 건강한 세포의 미토콘드리아가 Red fluorescence를 보였으며 UVB 조사에 의해 세포가 손상되면서 Green fluorescence가 강하게 나타나는 것을 확인하였다. 또한 Lactiplantibacillus plantarum OPT-antiUV 발효 추출물 처리 후 UVB를 조사한 군에서는 농도 의존적으로 Red fluorescence에 가까운 것을 확인함에 따라 UVB로부터 세포가 손상되는 것을 보호하는 역할을 하는 것으로 확인되었다. 따라서 Lactiplantibacillus plantarum OPT-antiUV 발효 추출물은 UVB로부터 세포가 손상되는 것을 방지하고 건강한 미토콘드리아를 유지함으로써 DNA 손상에 의한 세포 보호 효과가 있어 세포 손상 보호제 및 각종 원료로 사용 가능함을 시사한다.
실시예 5.
Lactiplantibacillus plantarum OPT
-antiUV 발효 추출물의 세포 재생 효과
실시예 5-1. 인간 섬유아세포에서 세포 재생 효과
피부 재생 효능을 확인하기 위하여 제조된 Lactiplantibacillus plantarum OPT-antiUV 발효 추출물을 이용하여 피부 재생 효능 평가를 진행하였다. 먼저, 미국 ATCC (Cell Lines Service, USA)사에서 구입한 인간 섬유아 세포주인 CCD1064sk 세포를 소태아혈청인 FBS (Gibco, USA)가 함유된 IMDM (Iscove's Modified Eagel's Medium, Welgene, Korea) 배지를 사용하여 6웰 플레이트에 5x105cells/well로 분주하고24시간 동안 배양하였다. 다음, 각 웰을 무혈청 배지로 교체하고 상기 Lactiplantibacillus plantarum OPT-antiUV 발효 추출물과 양성대조군인 아스코빅애시드 (L-Ascorbic acid, TCI, Japan)를 100 μg/ml 농도로 처리하고 24시간 추가 배양하였다. 배양 후 피부 재생 유전자 (aFGF, bFGF)의 발현을 관찰하였다.
CCD1064sk 세포에서 RNA를 추출하기 위한 방법은 다음과 같다. Lactiplantibacillus plantarum OPT-antiUV 발효 추출물과 양성대조군이 처리된 세포에 PBS (Samchun, Korea) 를 이용하여 세척한 후, 배양된 세포에 QIAzol® (QIAGEN, USA) 를 처리하여 세포 용해 (cell lysis) 를 진행하였다. 다음, 제조사인QIAGEN에서 제공하는 protocol을 이용하여 RNA를 분리하였다. 분리된 RNA는 RNA 정량 키트 (Qubit® fluorometer with RNA BR Assay kit, Invitrogen, USA)를 이용하여 정량한 뒤cDNA를 합성하여Real-time PCR을 실시하였다. 이 때, cDNA의 합성은cDNA 합성 키트 (qPCRBIO cDNA Synthesis Kit, Pcrbiosystems, UK)를 사용하였다. Real-time PCR은 Real-time PCR 키트 (2x qPCRBIO SyGreen Blue mix Lo-ROX, Pcrbiosystems UK)를 이용하여 유전자를 증폭한 후 증폭산물을 정량 분석하였다. Real-time PCR 조건은 모두 95℃에서 5초, 60℃에서 30초를 40 사이클로 진행하였다. 이 때, 모든 키트를 사용한 실험은 제조사에서 제공하는 프로토콜에 따라 진행하였다. aFGF (Acidic fibroblast growth factor), bFGF (Basic fibroblast growth factor) 유전자 발현량 결과는 CTL의 유전자 발현량을 기준으로 비율로 나타낸 결과를 도 5와 표 3에 나타내었다.
시료 | 유전자 발현량(% of control) | |
aFGF | bFGF | |
무처리(Control) | 100.00 | 100.00 |
Lactiplantibacillus plantarum OPT-antiUV 100 μg/mL | 129.54 | 121.74 |
Lactiplantibacillus plantarum OPT-antiUV 250 μg/mL | 146.72 | 138.49 |
Lactiplantibacillus plantarum OPT-antiUV 500 μg/mL | 165.87 | 159.91 |
Ascorbic acid 100 μg/mL | 128.24 | 119.37 |
도 5 및 표 3과 같이, 인간 섬유아 세포주인 CCD1064sk 세포에 Lactiplantibacillus plantarum OPT-antiUV 발효 추출물 처리 후 CTL보다 Lactiplantibacillus plantarum OPT-antiUV 발효 추출물을 처리했을 때 유전자의 발현이 증가되는 것으로 확인되었다.
이러한 결과는 Lactiplantibacillus plantarum OPT-antiUV 발효 추출물은 피부에 도움이 되는 성장인자의 유전자 발현을 증가시키는 것으로 확인된다. 따라서 Lactiplantibacillus plantarum OPT-antiUV 발효 추출물은 세포 재생과 동시에 회복에 도움을 줄 수 있는 피부 재생 원료 및 치료제로 사용 가능함을 시사한다.
실시예 5-2. 인간 각질세포에서 세포 재생 효과
피부 재생 효능을 확인하기 위하여, Lactiplantibacillus plantarum OPT-antiUV 발효 추출물을 이용하여 피부 재생 효능 평가를 진행하였다. 앞서 사용한 인간 각질 세포주인 HaCaT 세포를 소태아혈청인 FBS (Gibco, USA)가 함유된 DMEM (Welgene, Korea) 배지를 사용하여 24웰 플레이트에 1.5x105cells/well로 분주하고 24시간 동안 배양하였다. 이후 배양액을 제거한 뒤 Confluence된 각 well을 Blue tip을 이용하여 일직선으로 세포를 긁어 cell free zone을 형성시켰으며, HBSS (Gibco, USA)를 이용하여 웰에 남아있는 혈청배지와 세포 잔여물을 세척해 주었다. 다음, 각 웰을 무혈청 DMEM 배지로 교체하고 상기 Lactiplantibacillus plantarum OPT-antiUV 발효 추출물과 양성대조군인 EGF (10ng/ml)를 처리하고 24시간 37℃, 5% CO2 조건에서 추가 배양하였다. 24시간 후 Fluorescence Microscopy (Nikon, ECLIPSE Ti2, Japan)를 이용하여 사진촬영을 진행하였으며 촬영된 이미지를 이용하여 cell free zone이 wound closure된 정도를 측정하였다. Wound closure된 결과는 도 6에 나타내었다.
도 6과 같이, Scratch 후 Control (CTL) 상태에서, Lactiplantibacillus plantarum OPT-antiUV 발효 추출물 처리 후 24시간이 지났을 때 농도 의존적으로wound closure을 보이는 것을 확인함에 따라 Lactiplantibacillus plantarum OPT-antiUV 발효 추출물이 세포 재생의 역할을 하는 것을 확인하였다.
따라서 Lactiplantibacillus plantarum OPT-antiUV 발효 추출물은 세포 이동 및 증식을 유도함으로써 세포 재생 효과가 있어 피부 재생 원료 및 치료제로 사용 가능함을 시사한다.
실시예 6. UV 유도 피부 손상이 있는 사람으로부터 스킨마이크로바이옴 기회감염 병원균 분리 및 동정
실시예 6-1. UV 유도 피부손상이 있는 사람의 피부에서 기회감염 병원균 분리
스킨마이크로바이옴 기회감염 병원균의 분리는 gpskin barrier (GPOWER Inc, Korea) 장비를 이용하여 UV에 의해 경피 수분 손실 (TEWL) 정도를 파악하였으며, 경피 수분 손실이 있는 사람들의 피부 부분을 검체 채취용 면봉을 이용하여 검체를 채취하였다. 각각의 검체는 단계적으로 멸균수에 희석하여 실시예 1-1과 동일한 방법을 이용하였으며, 실시예 1-1과 동일하게 콜로니 주변에 노란색 환을 띄어 산성을 나타내는 기회감염 병원균의 콜로니들을 구별하였다.
실시예 6-2. 분리된 기회감염 병원균의 16S sequencing 분석
상기 위와 같이 구별된 기회감염 병원균들로부터 실시예 1-2와 동일한 프라이머를 사용하여 PCR을 통해 각각의 16S rDNA 증폭 산물을 얻었으며, 증폭된 뉴클레오티드는 코스모진텍에 sequencing 분석 의뢰를 통해 각각의 유전자 염기서열(서열번호 4, 5)을 확보하였다. 각각의 염기서열은 NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov) 계통 분석을 통해 Staphylococcus aureus와 Staphylococcus epidermidis인 것을 확인하여 실시예 7, 8에 활용하였다. * 서열번호 4 및 5 : 표 6 참조
실시예 7. 스킨마이크로바이옴 기회 감염병원균인
Staphylococcus aureus
병원균에 대한 항균 활성 측정
실시예 7-1. 디스크 확산법을 이용한
Staphylococcus aureus
병원균에 대한 생장 억제 확인
UV에 의한 피부장벽 손상은 피부 염증, 건조증, 가려움증 등을 동반하며, 스킨마이크로바이옴의 불균형을 일으키는 원인 중 하나로 알려져 있다.
이러한 스킨마이크로바이옴의 불균형과 피부장벽 손상으로 인한 Staphylococcus aureus 병원균의 감염은 염증, 발진 및 통증 등을 일으키며, 농가진을 비롯한 여러 가지 화농성 피부 질환 등 각종 피부 질환을 유발한다. 따라서 스킨마이크로바이옴 기회감염 병원균인 Staphylococcus aureus 병원균의 생장을 저해하는지 확인하기 위하여 실시예 2에서 제조된 Lactiplantibacillus plantarum OPT-antiUV 발효 추출물을 실험에 사용하였다.
먼저 한국생명공학연구원 생물자원센터에서 분양받은 병원균인 Staphylococcus aureus subsp. aureus KCTC3881 병원균과 실시예 6에서 분리된 Staphylococcus aureus 병원균을 Brain Heart Infusion (Difco, USA) 배지를 이용해 37℃ incubator에서 24시간 배양하였으며, 각각 배양된 병원균을 Mueller Hinton (MB cell, Korea) 한천 배지에 1x105CFU/mL 농도로 함유시켜 굳힌 뒤, disc에 Lactiplantibacillus plantarum OPT-antiUV 발효 추출물을 1, 5, 10, 20 mg/100μL 농도로 분주하여 37℃ incubator에서 12시간 동안 배양하였다.
12시간 배양 후, Staphylococcus aureus 병원균 생장을 저해하여 생긴 생육저해환(clear zone)을 캘리퍼를 이용해 측정하였고 결과를 도 7과 표 4에 나타내었다.
생육 저해환의 지름 | ||||
실험 대상 병원균 | Lactiplantibacillus plantarum OPT-antiUV 발효 추출물 처리 농도 | |||
1mg | 5mg | 10mg | 20mg | |
Staphylococcus aureus subsp. aureus KCTC3881 | 10.14㎜ | 13.26㎜ | 19.50㎜ | 26.44㎜ |
Staphylococcus aureus | 10.31㎜ | 14.79㎜ | 20.54㎜ | 27.05㎜ |
도 7, 표 4와 같이, 디스크 확산법을 통해 Lactiplantibacillus plantarum OPT-antiUV 발효 추출물의 항균 활성을 측정한 결과, Lactiplantibacillus plantarum OPT-antiUV 발효 추출물은 Staphylococcus aureuss ubsp. aureus KCTC3881 병원균과 피부에서 분리된 Staphylococcus aureus 병원균에 대하여 농도 의존적으로 1~20mg 농도에서 생육저해환의 지름이 증가하는 것으로 확인하였다.
실시예 7-2. 생균 수 분석법을 이용하여
Staphylococcus aureus
병원균에 대한 생장 억제 확인
먼저 분양 받은 Staphylococcus aureuss ubsp. aureus KCTC3881 병원균과 실시예 6에서 분리된 Staphylococcus aureus 병원균을 Brain Heart Infusion (Difco, USA) 배지를 이용해 37℃ incubator에서 24시간 배양하였으며, 각각 배양된 Staphylococcus aureus 병원균을 Lactiplantibacillus plantarum OPT-antiUV 발효 추출물 0, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 20mg/mL이 포함된 BHI 배지에 각각의 Staphylococcus aureus 병원균을 1% (CFU/mL)를 접종하여 37℃ incubator에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 이후, 각각의 농도로 처리하여 배양된 각각의 Staphylococcus aureus 병원균의 생균 수를 측정하여 도 8에 나타내었다.
도 8과 같이, Staphylococcus aureuss ubsp. aureus KCTC3881와Staphylococcus aureus 병원균의 생균수를 측정한 결과, Lactiplantibacillus plantarum OPT-antiUV 발효 추출물은 농도 의존적이게 1~20mg/mL에서 병원균 생장을 억제하는 것으로 확인된다.
따라서 본 발명의 Lactiplantibacillus plantarum OPT-antiUV 발효 추출물은UV로부터 손상된 피부에서 생육하던 Staphylococcus aureus 병원균의 감염을 감소시킬 수 있는 효능이 있고, 스킨마이크로바이옴 내 유익한 환경을 구축할 수 있는 화장료, 약학 조성물로 기능할 수 있음을 입증한다.
실시예 8. 스킨마이크로바이옴 기회감염 병원균인
Staphylococcus epidermidis
병원균에 대한 항균 활성 측정
실시예 8-1. 디스크 확산법을 이용한
Staphylococcus epidermidis
병원균에 대한 생장 억제 확인
Staphylococcus epidermidis 병원균은 피부 상재균으로 글리세린, 유기산, 항균펩타이드 등을 생성해 피부의 보습이나 유해균의 번식을 억제한다고 알려져 있으나 피부장벽 손상 또는 피부 면역체계가 악화되어 있는 환자에서는 각종 피부 질환, 각막염 등을 유발하며, 의료기기를 통해 감염 시, 패혈증, 심내막염 등을 유발할 수 있는 기회감염 균이다. 따라서 스킨마이크로바이옴 기회감염 병원균인 Staphylococcus epidermidis 의 생장을 저해하는지 확인하기 위하여 실시예 2에서 제조된 Lactiplantibacillus plantarum OPT-antiUV 발효 추출물을 실험에 사용하였다.
이를 위해, 한국생명공학연구원 생물자원센터에서 Staphylococcus epidermidis KCTC1917 분양 받은 균과 실시예 6에서 분리된 Staphylococcus epidermidis 병원균 2종을 각각 Brain Heart Infusion (Difco, USA) 배지를 이용해 37℃ incubator에서 24시간 배양하였다.
Mueller Hinton (MB cell, Korea) 한천 배지에 각각의 Staphylococcus epidermidis를 1x105CFU/mL 농도로 함유시켜 굳힌 뒤, disc에 Lactiplantibacillus plantarum OPT-antiUV 발효 추출물을 1, 5, 10, 20 mg/100μL 농도로 분주하여 37℃ incubator에서 12시간 동안 배양하였다. 12시간 배양 후, Staphylococcus epidermidis의 생장을 저해하여 생긴 생육저해환(clear zone)을 캘리퍼를 이용해 측정하였고 결과를 도 9와 표 5에 나타내었다.
생육 저해환의 지름 | ||||
균주 | Lactiplantibacillus plantarum OPT-antiUV 발효 추출물 처리 농도 |
|||
1mg | 5mg | 10mg | 20mg | |
Staphylococcus epidermidis KCTC1917 | 10.17㎜ | 13.61㎜ | 19.30㎜ | 26.67㎜ |
Staphylococcus epidermidis | 10.18㎜ | 13.81㎜ | 19.64㎜ | 27.72㎜ |
도 9, 표 5과 같이, 디스크 확산법을 통해 Lactiplantibacillus plantarum OPT-antiUV 발효 추출물의 항균 활성을 측정한 결과, Lactiplantibacillus plantarum OPT-antiUV 발효 추출물은 Staphylococcus epidermidis KCTC1917와 피부에서 분리된 Staphylococcus epidermidis에 대하여 농도 의존적으로 1~20mg 농도에서 생육저해환을 확인하였다.
실시예 8-2. 생균 수 분석법을 이용한
Staphylococcus epidermidis
에 대한 생장 억제 확인
한국생명공학연구원 생물자원센터에서 Staphylococcus epidermidis KCTC1917 분양 받은 균과 실시예 6에서 분리된 Staphylococcus epidermidis 균을Brain Heart Infusion (Difco, USA) 배지를 이용해 37℃ incubator에서 24시간 각각 배양하였다.
Lactiplantibacillus plantarum OPT-antiUV 발효 추출물 1, 5, 10, 20 mg/mL이 포함된 BHI 배지에 각각의 배양된 Staphylococcus epidermidis를 1% (CFU/mL)를 접종하여 37℃ incubator에서 24시간 배양하였다. 24시간 이후, 개개의 농도로 처리하여 배양된 각각의 Staphylococcus epidermidis 생균 수를 측정하여 도 10에 나타내었다.
도 10과 같이, Staphylococcus epidermidis KCTC1917와 Staphylococcus epidermidis 생균수를 측정한 결과, Lactiplantibacillus plantarum OPT-antiUV 발효 추출물은 농도 의존적으로 1~20mg/mL 농도에서 생장을 억제한 것을 확인하였다.
따라서 본 발명의 Lactiplantibacillus plantarum OPT-antiUV 발효 추출물은 UV로부터 손상된 피부의 Staphylococcus epidermidis 감염을 감소시킬 수 있으며, 스킨마이크로바이옴 내 유익한 환경을 구축할 수 있다.
서열번호 No. | |
1 | 27F |
AGAGTTTGATCTGGCTCAG | |
2 | 1492R |
GGTTACCTTGTTACGACTTC | |
3 | Lactiplantibacillus plantarum OPT-antiUV |
AACTCTGGTATTGATTGGTGCTTGCATCATGATTTACATTTGAGTGAGTGGCGAACTGG TGAGTAACACGTGGGAAACCTGCCCAGAAGCGGGGGATAACACCTGGAAACAGATG CTAATACCGCATAACAACTTGGACCGCATGGTCCGAGCTTGAAAGATGGCTTCGGCT ATCACTTTTGGATGGTCCCGCGGCGTATTAGCTAGATGGTGGGGTAACGGCTCACCAT GGCAATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGACAC GGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTC TGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTCTGTTGTT AAAGAAGAACATATCTGAGAGTAACTGTTCAGGTATTGACGGTATTTAACCAGAAAGC CACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGG ATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCG GCTCAACCGAAGAAGTGCATCGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGACAG TGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGA AGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGTATGGGTAGCAAACAG GATTAGATACCCTGGTAGTCCATACCGTAAACGATGAATGCTAAGTGTTGGAGGGTTTC CGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCA AGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGT TTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATACTATGCAAATCTAAG AGATTAGACGTTCCCTTCGGGGACATGGATACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTC GTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTATCAGTTGCC AGCATTAAGTTGGGCACTCTGGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGG GATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGAT GGTACAACGAGTTGCGAACTCGCGAGAGTAAGCTAATCTCTTAAAGCCATTCTCAGTT CGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCA GCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAG AGTTTGTAACACCCAAAGTCGGTGGGGTAACCTTTTAGGAACCAGCCGCCT |
|
4 | Staphylococcus aureus |
AAGCTTGCTTCTCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGATAACCTACCT ATAAGACTGGGATAACTTCGGGAAACCGGAGCTAATACCGGATAATATTTTGAACCGC ATGGTTCAAAAGTGAAAGACGGTCTTGCTGTCACTTATAGATGGATCCGCGCTGCATT AGCTAGTTGGTAAGGTAACGGCTTACCAAGGCAACGATGCATAGCCGACCTGAGAG GGTGATCGGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAG TAGGGAATCTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATG AAGGTCTTCGGATCGTAAAACTCTGTTATTAGGGAAGAACATATGTGTAAGTAACTGTG CACATCTTGACGGTACCTAATCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCG GTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGC GGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAAC TGGAAAACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGC GCAGAGATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACG CTGATGTGCGAAAGCGTGGGGATCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCG TAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGC ATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGAC GGGGACCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACC TTACCAAATCTTGACATCCTTTGACAACTCTAGAGATAGAGCTTTCCCCTTCGGGGGA CAAAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAG TCCCGCAACGAGCGCAACCCTTAAGCTTAGTTGCCATCATTAAGTTGGGCACTCTAAG TTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCC TTATGATTTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAATACAAAGGGCAGCGAAACCGC GAGGTCAAGCAAATCCCATAAAGTTGTTCTCAGTTCGGATTGTAGTCTGCAACTCGAC TACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGCATGCTACGGTGAATACGTTCCC GGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGCCGGTG GAGTAACC |
|
5 | Staphylococcus epidermidis |
AGACGAGGAGCTTGCTCCTCTGACGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGAT AACCTACCTATAAGACTGGGATAACTTCGGGAAACCGGAGCTAATACCGGATAATATA TTGAACCGCATGGTTCAATAGTGAAAGACGGTTTTGCTGTCACTTATAGATGGATCCG CGCCGCATTAGCTAGTTGGTAAGGTAACGGCTTACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGA CCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGA GGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAACGCCGCG TGAGTGATGAAGGTCTTCGGATCGTAAAACTCTGTTATTAGGGAAGAACAAATGTGTA AGTAACTATGCACGTCTTGACGGTACCTAATCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCA GCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCG CGCGTAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTC ATTGGAAACTGGAAAACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCG GTGAAATGCGCAGAGATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTG TAACTGACGCTGATGTGCGAAAGCGTGGGGATCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAG TCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCA GCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAG GAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGC GAAGAACCTTACCAAATCTTGACATCCTCTGACCCCTCTAGAGATAGAGTTTTCCCCTT CGGGGGACAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTT GGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTAAGCTTAGTTGCCATCATTAAGTTGGG CACTCTAAGTTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATC ATCATGCCCCTTATGATTTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAATACAAAGGGTAG CGAAACCGCGAGGTCAAGCAAATCCCATAAAGTTGTTCTCAGTTCGGATTGTAGTCTG CAACTCGACTATATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGCATGCTACGGTGA ATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCG AAGCCGGTGG |
Claims (12)
- 락티플란티바실러스 플란타룸 OPT-안티UV(Lactiplantibacillus plantarum OPT-antiUV, KCTC15558BP) 균주의 발효 추출물을 함유하는 피부장벽 강화용 화장료 조성물로서,
상기 발효 추출물이, UV-B 노출로 인해 저하된 필라그린의 유전자 발현을 2.0 내지 3.0 배 증가시켜, 피부세포의 손상에 대한 회복 및 보호 효능이 있는 것을 특징으로 하는 피부장벽 강화용 화장료 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 발효 추출물이 상기 균주 배양물의 C1~C4 알코올 침전물인 것을 특징으로 하는 피부장벽 강화용 화장료 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 발효 추출물이 피부재생 효능이 있는 것을 특징으로 하는 피부장벽 강화용 화장료 조성물. - 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 발효 추출물이 UV-B 노출로 인한 피부 손상으로 인해 감염되는 스태피로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 및 스태피로코커스 에피더미스(Staphylococcus epidermidis) 중 선택되는 1종 이상의 병원균의 생육을 억제하는 효능이 있는 것을 특징으로 하는 피부장벽 강화용 화장료 조성물. - 신규한 락티플란티바실러스 플란타룸 OPT-안티UV(Lactiplantibacillus plantarum OPT-antiUV, KCTC15558BP) 균주로서,
상기 균주의 발효 추출물이, UV-B 노출로 인해 저하된 필라그린의 유전자 발현을 2.0 내지 3.0 배 증가시켜, 피부세포의 손상에 대한 회복 및 보호 효능이 있는 것을 특징으로 하는 균주. - 제6항에 있어서,
상기 균주의 발효 추출물이 피부재생 효능이 있는 것을 특징으로 하는 균주. - 삭제
- 제6항에 있어서,
상기 균주의 발효 추출물이 UV-B 노출로 인한 피부 손상으로 인해 감염되는 스태피로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 및 스태피로코커스 에피더미스(Staphylococcus epidermidis) 중 선택되는 1종 이상의 병원균의 생육을 억제하는 효능이 있는 것을 특징으로 하는 균주. - 삭제
- 삭제
- 글루코스, 이스트 추출물, 소이 펩톤, 디포타슘포스페이트, 마그네슘 설페이트, 망가네이즈 설페이트 및 폴리소르베이트 80을 포함하는 배지에,
락티플란티바실러스 플란타룸 OPT-안티UV(Lactiplantibacillus plantarum OPT-antiUV, KCTC15558BP) 균주를 배양하여 배양액을 얻고,
상기 배양액에 C1~C4 알코올을 첨가하여 침전물을 획득함으로써,
피부장벽 강화 효능이 있는 락티플란티바실러스 플란타룸 OPT-안티UV(Lactiplantibacillus plantarum OPT-antiUV, KCTC15558BP) 균주의 발효 추출물을 제조하는 방법.
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대한민국 등록특허 제10-2244812호 (발명의 명칭 : 락토바실러스 플란타룸 아종 플란타룸 sdcm 1002 및 사카로마에세스 세르비지에 sdcm 3017의 혼합 균주, 그 배양액, 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물, 출원인 : (주)에스디생명공학, 등록일 : 2020.09.23) |
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