KR102615220B1 - 흑색종에 대한 진단 마커로서 gdf-15 - Google Patents

흑색종에 대한 진단 마커로서 gdf-15 Download PDF

Info

Publication number
KR102615220B1
KR102615220B1 KR1020187012437A KR20187012437A KR102615220B1 KR 102615220 B1 KR102615220 B1 KR 102615220B1 KR 1020187012437 A KR1020187012437 A KR 1020187012437A KR 20187012437 A KR20187012437 A KR 20187012437A KR 102615220 B1 KR102615220 B1 KR 102615220B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
hgdf
antibody
level
antigen
binding
Prior art date
Application number
KR1020187012437A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20180054869A (ko
Inventor
요에르그 위츠휘센
티나 셰퍼
베냐민 바이데
Original Assignee
율리우스-막시밀리안스 우니버지태트 뷔르츠부르크
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 율리우스-막시밀리안스 우니버지태트 뷔르츠부르크 filed Critical 율리우스-막시밀리안스 우니버지태트 뷔르츠부르크
Publication of KR20180054869A publication Critical patent/KR20180054869A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102615220B1 publication Critical patent/KR102615220B1/ko

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/5743—Specifically defined cancers of skin, e.g. melanoma
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57488—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds identifable in body fluids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/475—Assays involving growth factors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/475—Assays involving growth factors
    • G01N2333/495—Transforming growth factor [TGF]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Abstract

본 발명은 인간 GDF-15의 수준에 기초하여 인간 흑색종 암 환자의 생존 확률을 예측하는 방법 및, 이러한 방법에 사용될 수 있는 장치와 키트에 관한 것이다.

Description

흑색종에 대한 진단 마커로서 GDF-15
본 발명은 인간 흑색종 암 환자의 생존 확률을 예측하는 방법 및 이러한 방법에 사용될 수 있는 장치 및 키트에 관한 것이다.
젖산 탈수소효소의 혈청 수준 (sLDH)은 흑색종에서 가장 널리 사용되는 예후 바이오마커이며, 2001년 이래 원격 전이가 있는 흑색종 환자를 위한 AJCC 병기분류 시스템 (staging system)에 통합되었다 (Balch, CM et al., J Clin Oncol / 19 / 3635-48. 2001). sLDH는 여러 연구 그룹들에 의해 절제불가능한 질병을 갖는 환자에 대한 독립적인 예후 마커로 확인되었다 (Sirott, MN et al., Cancer / 72 / 3091-8. 1993; Eton, O et al., J Clin Oncol / 16 / 1103-11. 1998; Manola, J et al., J Clin Oncol / 18 / 3782-93. 2000). 대규모 임상 연구 (다양한 고형 종양을 갖는 31,857명의 환자)에 기반한 포괄적인 메타-분석의 결과에서, 모든 질병 하위 군 및 단계에 걸쳐 OS (HR = 1.48, 95%CI = 1.43 내지 1.53)에 대한 LDH 상승의 일관된 결과들이 검증되었으며, 특히 전이성 종양과 관련성이 있었다. LDH에 의한 정확한 종양 촉진 기전은 알져지지 않았고 바르부르크 효과 (Warburg effect)를 통한 저산소증 및 대사 재프로그램과도 또한 관련있을 수 있지만, LDH는 높은 종양 부담도 반영한다 (Zhang, J., Yao, Y.-H., Li, B.-G., Yang, Q., Zhang, P.-Y., and Wang, H.-T. (2015). Prognostic value of pretreatment serum lactate dehydrogenase level in patients with solid tumors: a systematic review and meta-analysis. Scientific Reports 5, 9800). 그럼에도 불구하고, 흑색종 환자에 대한 개선된 예후 바이오마커에 대한 요구가 존재한다.
S100B의 혈청 농도(sS100B)는 유럽에서 재발을 조기에 발견하기 위해 질병의 증거가 없는 환자를 스크리닝하기 위해 주로 널리 사용된다 (Pflugfelder, A et al., J Dtsch Dermatol Ges / 11 Suppl 6 / 1-116, 1-26. 2013). Mocellin 등에 의한 메타-분석에서는 환자의 생존을 예측하기 위한 sS100B의 적합성에 관한 증거를 요약하였다. 모든 단계를 포함하는 3393명의 환자가 등록된 22개의 시리즈가 이 분석에 포함되었다. 혈청 S100B 양성은 특히 다른 예후 인자와는 독립적인 I 내지 III 단계 환자의 하위 군에서 모든 단계의 흑색종 환자에서의 유의하게 더 불량한 생존과 관련되어 있었다 (Mocellin, S et al., Int J Cancer / 123 / 2370-6. 2008). 선행 연구에서, sS100B 및 sLDH는 원격 전이가 있는 환자의 예후에 독립적인 영향을 미치고, 두 마커의 복합 분석은 완전한 절제술을 위한 환자를 선택하는데 사용될 수 있음이 입증되었다 (Weide, B et al., PLoS One / 8 / e81624. 2013; Weide, B et al., Br J Cancer / 107 / 422-8. 2012). 그러나, 이러한 강력한 증거에도 불구하고, 흑색종 환자의 일상적인 임상 설정에서의 실행에 대한 전세계적인 합의는 존재하지 않는다.
성장 및 분화 인자-15 (GDF-15, 대식세포 억제제 사이토카인-1 (MIC-1)로도 공지됨, 태반 TGF-β (PTGFβ), 태반 뼈 형성 단백질 (PLAB), 비-스테로이드성 항염증 약물-활성화 유전자 (NAG1) 또는 전립선-유도 인자 (PDF))는 몇몇 유형의 고형 암의 종양 세포에서 과다 발현된다 (Mimeault, M et al., Br J Cancer / 108 / 1079-91. 2013; Bock, AJ et al., Int J Gynecol Cancer / 20 / 1448-55. 2010; Zhang, L et al., Oral Oncol / 45 / 627-32. 2009). GDF-15는 p53, GSK-3β, 및 EGR-1을 포함하는 다수의 종양 억제 경로에 의해 유도되며 (Wang, X et al., Biochem Pharmacol / 85 / 597-606. 2013), 누드 마우스 이종이식 모델 (Martinez, JM et al., J Pharmacol Exp Ther / 318 / 899-906. 2006; Eling, TE et al., J Biochem Mol Biol / 39 / 649-55. 2006) 및 형질전환 마우스 (Baek, SJ et al., Mol Pharmacol / 59 / 901-8. 2001)에서 나타난 바와 같이 GDF-15 자체가 종양 억제 효과를 나타낼 수 있다는 증거도 있다. 종양 세포와 관련하여 프로- 및 항-세포자멸 효과가 GDF-15에 대해 기술된 바 있으며 (Mimeault, M et al., Br J Cancer / 108 / 1079-91. 2013; Baek, SJ et al., Mol Pharmacol / 59 / 901-8. 2001; Zimmers, TA et al., J Cancer Res Clin Oncol / 136 / 571-6. 2010; Jones, MF et al., Cell Death Differ / 2015), 다수의 가능한 신호전달 경로가 제안되어 왔다 (Mimeault, M and Batra SK, J Cell Physiol / 224 / 626-35. 2010). 미처리된 프로-단백질이 TGF-베타 의존성 SMAD 신호전달을 변경하여 전사 패턴을 변화시키는 핵으로 들어가는 것이 밝혀지면서 최근에는 더 많은 복잡성이 추가되었다 (Min, KW et al., Oncogene / 2015). 생체 내에서, 구성적 GDF-15 과발현은 종양 형성을 감소시키지만, 전립선 암에 대한 동물 모델에서 전이를 증가시킨다 (Husaini, Y et al., PLoS One / 7 / e43833. 2012). GDF-15는 암 악액질을 유도하는 것으로 추가로 밝혀졌다 (Johnen, H et al., Nat Med / 13 / 1333-40. 2007). 유사하게, 특허출원 제WO 2005/099746호 및 제WO 2009/021293호는 마우스에서의 생체 내 종양 유도된 체중 감소에 대한 인간 GDF-15 (hGDF-15)의 길항 효과를 나타낼 수 있는 항-인간-GDF-15 항체 (Mab26)에 관한 것이다. 제WO 2014/049087호 및 제PCT/EP2015/056654호는 hGDF-15에 대한 단일클론 항체 및 이의 의학적 용도에 관한 것이다.
임상적으로, 높은 GDF-15 혈청 수준 (sGDF-15)은 전립선 암에서 골 전이 및 불량한 예후와 관련되어 있다는 것이 밝혀졌다 (Selander, KS et al., Cancer Epidemiol Biomarkers Prev / 16 / 532-7. 2007). 대장암에서, 높은 혈장 수준을 갖는 환자는 재발 시간이 더 짧고 전체 생존기간 (overall survival)이 감소된 것으로 나타났다 (Wallin, U et al., Br J Cancer / 104 / 1619-27. 2011). GDF-15 유전자의 대립형 H6D 다형성은 진단 시 전이의 독립적인 예측 인자로서 추가로 확인되었다 (Brown, DA, Clin Cancer Res / 9 / 2642-50. 2003). 높은 sGDF-15와 불량한 결과 사이의 관련성은 갑상선암, 췌장암, 위암, 난소암 및 다른 암에 대해 추가로 밝혀졌다 (Mimeault, M and Batra SK, J Cell Physiol / 224 / 626-35. 2010; Bauskin, AR et al., Cancer Res / 66 / 4983-6. 2006; Brown, DA et al., Clin Cancer Res / 15 / 6658-64. 2009; Blanco-Calvo, M et al., Future Oncol / 10 / 1187-202. 2014; Staff, AC et al., Gynecol Oncol / 118 / 237-43. 2010). 면역조직화학에 의해 평가된 바와 같이 GDF-15 조직 발현 수준에 대해서도 유사한 결과가 또한 보고되었다 (Wallin, U et al., Br J Cancer / 104 / 1619-27. 2011). 흑색종에서, GDF-15 발현은 원발성 흑색종에서 흑색종 전이에 걸쳐 양성 모반 (benign nevi)으로부터 증가하는 것으로 밝혀졌다 (Mauerer, A et al., Exp Dermatol / 20 / 502-7. 2011; Boyle, GM et al., J Invest Dermatol / 129 / 383-91. 2009). GDF-15의 혈청 농도는 포도막 흑색종(uveal melanoma)을 가진 환자에서 전이를 나타냈고 (Suesskind, D et al., Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol / 250 / 887-95. 2012) 피부 흑색종 (cutaneous melanoma)을 가진 환자의 병기와 관련이 있었다 (Kluger, HM et al., ClinCancer Res / 17 / 2417-25. 2011). Riker et al.은 흑색종 전이와 원발성 종양에서의 유전자 발현을 비교하였고, 전이와 관련있는 상위 5개 유전자 중 유일한 용해 인자로서 GDF-15을 확인하였다 (Riker, AI et al., BMC Med Genomics / 1 / 13. 2008). Boyle et al. (Boyle, GM et al., J Invest Dermatol / 129 / 383-91. 2009)은 면역조직화학에서 22개의 원발성 흑색종 중 15개가 낮은 수준의 GDF-15을 발현한 반면, 16개의 흑색종 중 16개가 강한 발현을 나타냄을 밝혔다. 또한, 3개의 흑색종 세포주에서 GDF-15의 넉다운은 동일한 연구에서 종양원성을 감소시켰다. 그 전에, Talantov et al. (Talantov, D et al., Clin Cancer Res / 11 / 7234-42. 2005)은 이미 흑색종 전이에서 GDF-15을 확인하였지만, 모반과 정상 림프절에서는 확인되지 않았다. 유사한 결과가 Mauerer et al.의 연구에서 보고되었으며, 그는 GDF-15가 전이성 종양 및 일부 원발성 흑색종에서 우선적으로 발현되지만, 멜라닌세포성 모반에서는 발현되지 않는다는 것을 발견하였다 (Mauerer, A et al., Exp Dermatol / 20 / 502-7. 2011). 그러나, 전이에서 GDF-15의 직접적인 역할은 GDF-15의 구성적 과발현이 암 발달을 늦추지만 전이를 증가시키는 전립선 암에서만 나타났다 (Husaini, Y et al., PLoS One / 7 / e43833. 2012). 2가지 연구에서 흑색종 환자에서 GDF-15 혈청 수준의 임상적 관련성이 보고되었다. GDF-15 혈청 농도는 전이성 (n=170) 또는 비-전이성 (n=18) 포도막 흑색종을 가진 188명의 환자의 코호트에서 전이와 관련되어 있었다 (Suesskind, D et al., Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol / 250 / 887-95. 2012). 마지막으로, Kluger et al.은 피부 흑색종을 가진 216명의 환자에서 혈장 수준의 GDF-15와 병기 사이의 상관관계를 보고하였다 (Kluger, HM et al., ClinCancer Res / 17 / 2417-25. 2011). 그러나, 이러한 연구결과와는 반대로, 일부 연구는 GDF-15의 항-종양성 역할을 시사해왔다 (예컨대, Liu T et al 참조: "Macrophage inhibitory cytokine 1 reduces cell adhesion and induces apoptosis in prostate cancer cells." Cancer Res., vol. 63, no. 16, 1 August 2003, pp.5034-5040).
따라서, 전술된 연구로부터, 그리고 다양한 암에서의 인간 GDF-15 (hGDF-15)의 복잡한 기능적 역할과 전립선 암의 원발성 종양 및 전이에 대한 이의 상이한 영향에 비추어 볼때, hGDF-15는 흑색종에서의 환자 생존을 위한 예후 임상 마커로서 사용될수 있는지 여부는 알려지지 않았다.
따라서, 흑색종에 대한 예후 바이오마커, 특히 흑색종에서 개선된 예후 바이오마커 및 흑색종에서 환자의 생존을 보다 신뢰성있게 예측할 수 있는 방법에 대한 요구가 당해 기술 분야에 존재한다.
WO 2005/099746 WO 2009/021293 WO 2014/049087 PCT/EP2015/056654
Arbabi Ghahroudi M et al.: "Selection and identification of single domain antibody fragments from camel heavy-chain antibodies." FEBS Lett. 1997 Sep 15;414(3):521-6. Ausubel et al.: "Current Protocols in Molecular Biology." Greene Publishing Associates and Wiley Interscience; New York 1992. Baek, SJ; Okazaki, R; Lee, SH; Martinez, J; Kim, JS; Yamaguchi, K; Mishina, Y; Martin, DW; Shoieb, A; McEntee, MF; Eling, TE. Nonsteroidal anti-inflammatory drug-activated gene-1 over expression in transgenic mice suppresses intestinal neoplasia. Gastroenterology / 131 / 1553-60. 2006 Baek, SJ; Kim, KS; Nixon, JB; Wilson, LC; Eling, TE. Cyclooxygenase inhibitors regulate the expression of a TGF-beta superfamily member that has proapoptotic and antitumorigenic activities. Mol Pharmacol / 59 / 901-8. 2001 Balch, CM; Gershenwald, JE; Soong, SJ; Thompson, JF; Atkins, MB; Byrd, DR; Buzaid, AC; Cochran, AJ; Coit, DG; Ding, S; Eggermont, AM; Flaherty, KT; Gimotty, PA; Kirkwood, JM; McMasters, KM; Mihm, MC, Jr.; Morton, DL; Ross, MI; Sober, AJ; Sondak, VK. Final version of 2009 AJCC melanoma staging and classification. J Clin Oncol / 27 / 6199-206. 2009 Balch, CM; Buzaid, AC; Soong, SJ; Atkins, MB; Cascinelli, N; Coit, DG; Fleming, ID; Gershenwald, JE; Houghton, A, Jr.; Kirkwood, JM; McMasters, KM; Mihm, MF; Morton, DL; Reintgen, DS; Ross, MI; Sober, A; Thompson, JA; Thompson, JF. Final version of the American Joint Committee on Cancer staging system for cutaneous melanoma. J Clin Oncol / 19 / 3635-48. 2001 Bauskin, AR; Brown, DA; Kuffner, T; Johnen, H; Luo, XW; Hunter, M; Breit, SN. Role of macrophage inhibitory cytokine-1 in tumorigenesis and diagnosis of cancer. Cancer Res / 66 / 4983-6. 2006 Blanco-Calvo, M; Tarrio, N; Reboredo, M; Haz-Conde, M; Garcia, J; Quindos, M; Figueroa, A; Anton-Aparicio, L; Calvo, L; Valladares-Ayerbes, M. Circulating levels of GDF15, MMP7 and miR-200c as a poor prognostic signature in gastric cancer. Future Oncol / 10 / 1187-202. 2014 Bock, AJ; Stavnes, HT; Kempf, T; Trope, CG; Berner, A; Davidson, B; Staff, AC. Expression and clinical role of growth differentiation factor-15 in ovarian carcinoma effusions. Int J Gynecol Cancer / 20 / 1448-55. 2010 Boyle, GM; Pedley, J; Martyn, AC; Banducci, KJ; Strutton, GM; Brown, DA; Breit, SN; Parsons, PG. Macrophage inhibitory cytokine-1 is overexpressed in malignant melanoma and is associated with tumorigenicity. J Invest Dermatol / 129 / 383-91. 2009 Brown, DA; Lindmark, F; Stattin, P; Balter, K; Adami, HO; Zheng, SL; Xu, J; Isaacs, WB; Gronberg, H; Breit, SN; Wiklund, FE. Macrophage inhibitory cytokine 1: a new prognostic marker in prostate cancer. Clin Cancer Res / 15 / 6658-64. 2009 Brown, DA; Ward, RL; Buckhaults, P; Liu, T; Romans, KE; Hawkins, NJ; Bauskin, AR; Kinzler, KW; Vogelstein, B; Breit, SN. MIC-1 serum level and genotype: associations with progress and prognosis of colorectal carcinoma. Clin Cancer Res / 9 / 2642-50. 2003 Camp, RL; Dolled-Filhart, M; Rimm, DL. X-tile: a new bio-informatics tool for biomarker assessment and outcome-based cut-point optimization. Clin Cancer Res / 10 / 7252-9. 2004 Chothia C et al.: Conformations of immunoglobulin hypervariable regions. Nature. 1989 Dec 21-28;342(6252):877-83. Clackson T et al.: "Making antibody fragments using phage display libraries." Nature. 1991 Aug 15;352(6336):624-8. Eisenhauer et al.: New response evaluation criteria in solid tumours: revised RECIST guideline (version 1.1). Eur. J. Cancer. 45, No. 2, January 2009, pp 228-47. Eling, TE; Baek, SJ; Shim, M; Lee, CH. NSAID activated gene (NAG-1), a modulator of tumorigenesis. J Biochem Mol Biol / 39 / 649-55. 2006 Eton, O; Legha, SS; Moon, TE; Buzaid, AC; Papadopoulos, NE; Plager, C; Burgess, AM; Bedikian, AY; Ring, S; Dong, Q; Glassman, AB; Balch, CM; Benjamin, RS. Prognostic factors for survival of patients treated systemically for disseminated melanoma. J Clin Oncol / 16 / 1103-11. 1998 Giudicelli V et al.: IMGT/V-QUEST, an integrated software program for immunoglobulin and T cell receptor V-J and V-D-J rearrangement analysis. Nucleic Acids Res. 2004 Jul 1;32(Web Server issue):W435-40. Goncalves et al.: "Biological and methodological features of the measurement of S100B, a putative marker of brain injury." Clinical Biochemistry 41 (2008) 755-763). Harlow and Lane: "Antibodies: A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York 1988. Holliger P et al.: ""Diabodies": small bivalent and bispecific antibody fragments." Proc Natl Acad Sci U S A. 1993 Jul 15;90(14):6444-8. Holt LJ et al.: "Domain antibodies: proteins for therapy." Trends Biotechnol. 2003 Nov;21(11):484-90. Huh, SJ; Chung, CY; Sharma, A; Robertson, GP. Macrophage inhibitory cytokine-1 regulates melanoma vascular development. Am J Pathol / 176 / 2948-57. 2010 Husaini, Y; Qiu, MR; Lockwood, GP; Luo, XW; Shang, P; Kuffner, T; Tsai, VW; Jiang, L; Russell, PJ; Brown, DA; Breit, SN. Macrophage inhibitory cytokine-1 (MIC-1/GDF15) slows cancer development but increases metastases in TRAMP prostate cancer prone mice. PLoS One / 7 / e43833. 2012 Johnen, H; Lin, S; Kuffner, T; Brown, DA; Tsai, VW; Bauskin, AR; Wu, L; Pankhurst, G; Jiang, L; Junankar, S; Hunter, M; Fairlie, WD; Lee, NJ; Enriquez, RF; Baldock, PA; Corey, E; Apple, FS; Murakami, MM; Lin, EJ; Wang, C; During, MJ; Sainsbury, A; Herzog, H; Breit, SN. Tumor-induced anorexia and weight loss are mediated by the TGF-beta superfamily cytokine MIC-1. Nat Med / 13 / 1333-40. 2007 Jones PT et al.: "Replacing the complementarity-determining regions in a human antibody with those from a mouse." Nature. 1986 May 29-Jun 4;321(6069):522-5. Jones, MF; Ling Li, X; Subramanian, M; Shabalina, SA; Hara, T; Zhu, Y; Huang, J; Yang, Y; Wakefield, LM; Prasanth, KV; Lal, A. Growth differentiation factor-15 encodes a novel microRNA 3189 that functions as a potent regulator of cell death. Cell Death Differ / / 2015 Kabat et al.: Sequences of proteins of immunological interest, U.S. Dept. of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. 1983. Kluger, HM; Hoyt, K; Bacchiocchi, A; Mayer, T; Kirsch, J; Kluger, Y; Sznol, M; Ariyan, S; Molinaro, A; Halaban, R. Plasma markers for identifying patients with metastatic melanoma. ClinCancer Res / 17 / 2417-25. 2011 Kohler G and Milstein C: "Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity." Nature. 1975 Aug 7;256(5517):495-7. Lasithiotakis, KG; Leiter, U; Gorkievicz, R; Eigentler, T; Breuninger, H; Metzler, G; Strobel, W; Garbe, C. The incidence and mortality of cutaneous melanoma in Southern Germany: trends by anatomic site and pathologic characteristics, 1976 to 2003. Cancer / 107 / 1331-9. 2006. Liu T et al: "Macrophage inhibitory cytokine 1 reduces cell adhesion and induces apoptosis in prostate cancer cells." Cancer Res., vol. 63, no. 16, 1 August 2003, pp.5034-5040. Ma J, Tang X, Sun WW, Liu Y, Tan YR, Ma HL, et al. (2016) Mutant GDF15 presents a poor prognostic outcome for patients with oral squamous cell carcinoma. Oncotarget 7:2113-22. Manola, J; Atkins, M; Ibrahim, J; Kirkwood, J. Prognostic factors in metastatic melanoma: a pooled analysis of Eastern Cooperative Oncology Group trials. J Clin Oncol / 18 / 3782-93. 2000 Marks JD et al.: "By-passing immunization. Human antibodies from V-gene libraries displayed on phage." J Mol Biol. 1991 Dec 5;222(3):581-97. Martinez, JM; Sali, T; Okazaki, R; Anna, C; Hollingshead, M; Hose, C; Monks, A; Walker, NJ; Baek, SJ; Eling, TE. Drug-induced expression of nonsteroidal anti-inflammatory drug-activated gene/macrophage inhibitory cytokine-1/prostate-derived factor, a putative tumor suppressor, inhibits tumor growth. J Pharmacol Exp Ther / 318 / 899-906. 2006 Mauerer, A; Roesch, A; Hafner, C; Stempfl, T; Wild, P; Meyer, S; Landthaler, M; Vogt, T. Identification of new genes associated with melanoma. Exp Dermatol / 20 / 502-7. 2011 Mimeault, M; Johansson, SL; Batra, SK. Marked improvement of cytotoxic effects induced by docetaxel on highly metastatic and androgen-independent prostate cancer cells by downregulating macrophage inhibitory cytokine-1. Br J Cancer / 108 / 1079-91. 2013 Mimeault, M; Batra, SK. Divergent molecular mechanisms underlying the pleiotropic functions of macrophage inhibitory cytokine-1 in cancer. J Cell Physiol / 224 / 626-35. 2010 Min, KW; Liggett, JL; Silva, G; Wu, WW; Wang, R; Shen, RF; Eling, TE; Baek, SJ. NAG-1/GDF15 accumulates in the nucleus and modulates transcriptional regulation of the Smad pathway. Oncogene / / 2015 Mocellin, S; Zavagno, G; Nitti, D. The prognostic value of serum S100B in patients with cutaneous melanoma: a meta-analysis. Int J Cancer / 123 / 2370-6. 2008 Paul, W.E. (Ed.).: "Fundamental Immunology" 2nd Ed. Raven Press, Ltd., New York 1989. Pflugfelder, A; Kochs, C; Blum, A; Capellaro, M; Czeschik, C; Dettenborn, T; Dill, D; Dippel, E; Eigentler, T; Feyer, P; Follmann, M; Frerich, B; Ganten, MK; Gartner, J; Gutzmer, R; Hassel, J; Hauschild, A; Hohenberger, P; Hubner, J; Kaatz, M; Kleeberg, UR; Kolbl, O; Kortmann, RD; Krause-Bergmann, A; Kurschat, P; Leiter, U; Link, H; Loquai, C; Loser, C; Mackensen, A; Meier, F; Mohr, P; Mohrle, M; Nashan, D; Reske, S; Rose, C; Sander, C; Satzger, I; Schiller, M; Schlemmer, HP; Strittmatter, G; Sunderkotter, C; Swoboda, L; Trefzer, U; Voltz, R; Vordermark, D; Weichenthal, M; Werner, A; Wesselmann, S; Weyergraf, AJ; Wick, W; Garbe, C; Schadendorf, D. Malignant melanoma S3-guideline "diagnosis, therapy and follow-up of melanoma". J Dtsch Dermatol Ges / 11 Suppl 6 / 1-116, 1-26. 2013 Pflugfelder, A; Kochs, C; Blum, A; Capellaro, M; Czeschik, C; Dettenborn, T; Dill, D; Dippel, E; Eigentler, T; Feyer, P; Follmann, M; Frerich, B; Ganten, MK; Gartner, J; Gutzmer, R; Hassel, J; Hauschild, A; Hohenberger, P; Hubner, J; Kaatz, M; Kleeberg, UR; Kolbl, O; Kortmann, RD; Krause-Bergmann, A; Kurschat, P; Leiter, U; Link, H; Loquai, C; Loser, C; Mackensen, A; Meier, F; Mohr, P; Mohrle, M; Nashan, D; Reske, S; Rose, C; Sander, C; Satzger, I; Schiller, M; Schlemmer, HP; Strittmatter, G; Sunderkotter, C; Swoboda, L; Trefzer, U; Voltz, R; Vordermark, D; Weichenthal, M; Werner, A; Wesselmann, S; Weyergraf, AJ; Wick, W; Garbe, C; Schadendorf, D. S3-guideline "diagnosis, therapy and follow-up of melanoma" -- short version. J Dtsch Dermatol Ges / 11 / 563-602. 2013 Remington's Pharmaceutical Sciences, Ed. AR Gennaro, 20th edition, 2000, Williams & Wilkins, PA, USA. Riechmann L et al.: "Reshaping human antibodies for therapy." Nature. 1988 Mar 24;332(6162):323-7. Riker, AI; Enkemann, SA; Fodstad, O; Liu, S; Ren, S; Morris, C; Xi, Y; Howell, P; Metge, B; Samant, RS; Shevde, LA; Li, W; Eschrich, S; Daud, A; Ju, J; Matta, J. The gene expression profiles of primary and metastatic melanoma yields a transition point of tumor progression and metastasis. BMC Med Genomics / 1 / 13. 2008 Roth, P; Junker, M; Tritschler, I; Mittelbronn, M; Dombrowski, Y; Breit, SN; Tabatabai, G; Wick, W; Weller, M; Wischhusen, J. GDF-15 contributes to proliferation and immune escape of malignant gliomas. Clin Cancer Res / 16 / 3851-9. 2010 Saerens D et al.: "Single-domain antibodies as building blocks for novel therapeutics." Curr Opin Pharmacol. 2008 Oct;8(5):600-8. Epub 2008 Aug 22. Sambrook et al.: "Molecular Cloning: A Laboratory Manual.", 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York 1989. Selander, KS; Brown, DA; Sequeiros, GB; Hunter, M; Desmond, R; Parpala, T; Risteli, J; Breit, SN; Jukkola-Vuorinen, A. Serum macrophage inhibitory cytokine-1 concentrations correlate with the presence of prostate cancer bone metastases. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev / 16 / 532-7. 2007 Siegel DL: "Recombinant monoclonal antibody technology." Transfus Clin Biol. 2002 Jan;9(1):15-22. Sirott, MN; Bajorin, DF; Wong, GY; Tao, Y; Chapman, PB; Templeton, MA; Houghton, AN. Prognostic factors in patients with metastatic malignant melanoma. A multivariate analysis. Cancer / 72 / 3091-8. 1993 Staff, AC; Bock, AJ; Becker, C; Kempf, T; Wollert, KC; Davidson, B. Growth differentiation factor-15 as a prognostic biomarker in ovarian cancer. Gynecol Oncol / 118 / 237-43. 2010 Stefanescu R. et al., Eur.J.Mass Spectrom. 13, 69-75 (2007) Suckau et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 1990 December; 87(24): 9848-9852. Suesskind, D; Schatz, A; Schnichels, S; Coupland, SE; Lake, SL; Wissinger, B; Bartz-Schmidt, KU; Henke-Fahle, S. GDF-15: a novel serum marker for metastases in uveal melanoma patients. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol / 250 / 887-95. 2012 Talantov, D; Mazumder, A; Yu, JX; Briggs, T; Jiang, Y; Backus, J; Atkins, D; Wang, Y. Novel genes associated with malignant melanoma but not benign melanocytic lesions. Clin Cancer Res / 11 / 7234-42. 2005 Wallin, U; Glimelius, B; Jirstrom, K; Darmanis, S; Nong, RY; Ponten, F; Johansson, C; Pahlman, L; Birgisson, H. Growth differentiation factor 15: a prognostic marker for recurrence in colorectal cancer. Br J Cancer / 104 / 1619-27. 2011 Wang, X; Baek, SJ; Eling, TE. The diverse roles of nonsteroidal anti-inflammatory drug activated gene (NAG-1/GDF15) in cancer. Biochem Pharmacol / 85 / 597-606. 2013 Weide, B; Richter, S; Buttner, P; Leiter, U; Forschner, A; Bauer, J; Held, L; Eigentler, TK; Meier, F; Garbe, C. Serum S100B, lactate dehydrogenase and brain metastasis are prognostic factors in patients with distant melanoma metastasis and systemic therapy. PLoS One / 8 / e81624. 2013 Weide, B; Elsasser, M; Buttner, P; Pflugfelder, A; Leiter, U; Eigentler, TK; Bauer, J; Witte, M; Meier, F; Garbe, C. Serum markers lactate dehydrogenase and S100B predict independently disease outcome in melanoma patients with distant metastasis. Br J Cancer / 107 / 422-8. 2012 Weinberg R. et al.: The Biology of Cancer. Garland Science: New York 2006. 850p. Wevers, KP; Kruijff, S; Speijers, MJ; Bastiaannet, E; Muller Kobold, AC; Hoekstra, HJ. S-100B: a stronger prognostic biomarker than LDH in stage IIIB-C melanoma. Ann Surg Oncol / 20 / 2772-9. 2013 Zhang, J., Yao, Y.-H., Li, B.-G., Yang, Q., Zhang, P.-Y., and Wang, H.-T. (2015). Prognostic value of pretreatment serum lactate dehydrogenase level in patients with solid tumors: a systematic review and meta-analysis. Scientific Reports 5, 9800. Zhang, L; Yang, X; Pan, HY; Zhou, XJ; Li, J; Chen, WT; Zhong, LP; Zhang, ZY. Expression of growth differentiation factor 15 is positively correlated with histopathological malignant grade and in vitro cell proliferation in oral squamous cell carcinoma. Oral Oncol / 45 / 627-32. 2009 Zhou, Z; Li, W; Song, Y; Wang, L; Zhang, K; Yang, J; Zhang, W; Su, H; Zhang, Y. Growth differentiation factor-15 suppresses maturation and function of dendritic cells and inhibits tumor-specific immune response. PLoS One / 8 / e78618. 2013 Zimmers, TA; Gutierrez, JC; Koniaris, LG. Loss of GDF-15 abolishes sulindac chemoprevention in the ApcMin/+ mouse model of intestinal cancer. J Cancer Res Clin Oncol / 136 / 571-6. 2010
본 발명은 후술된 구현예를 제공함으로써 전술한 요구를 만족시키고 당해 기술 분야의 전술된 문제점을 해결한다:
특히, 전술한 문제점을 해결하기 위해, 본 발명자들은 혈청 GDF-15 수준이 흑색종 환자의 전체 생존기간 (overall survival, OS)에 미치는 영향을 조사하고자 하였다. 이러한 연구 과정에서, 본 발명자들은 놀랍게도 흑색종 환자에서 생존 확률이 환자의 혈청에서 hGDF-15 수준이 증가함에 따라 현저히 감소하고 그 반대도 마찬가지라는 것을 발견하였다. 예컨대, 본 발명자들은 hGDF-15의 높은 혈청 수준이 종양이 없는 III 단계 및 절제불가능한 IV 단계의 흑색종 환자에서 불량한 전체 생존기간을 위한 강력한 바이오마커임을 밝혀냈다.
따라서, 본 발명에 따르면, 흑색종 환자에서 생존 확률은 hGDF-15 수준과 역의 상관관계로 존재한다.
또한, 본 발명자들의 연구에서, 콕스 (Cox) 회귀 분석은 hGDF-15 혈청 수준에 대한 지식이 예컨대, M-분류와 함께 고려하는 경우 독립적인 예후 정보를 부가한다는 것과, 원격 전이를 가진 환자에서 확립된 바이오마커 LDH보다 우수하다는 것을 밝혔다.
따라서, 본 발명에 따르면, hGDF-15 수준은 생존 예측에 대한 바이오마커로서 사용될 수 있다. 이러한 바이오마커는 유리한데, 그 이유는 LDH와 같이 공지된 바이오마커와는 무관한 예후 가치를 가지고 있기 때문이다. 이는 hGDF-15 수준이 본 발명에 따른 흑색종 환자 생존 예측에 사용되는 경우, 본 발명의 바람직한 양태에서, 추가의 바이오마커와 조합될 수 있음을 의미한다.
본 발명에 따라, LDH 또는 S100B와 같은 부가적인 바이오마커를 갖는 바이오마커로서 hGDF-15 수준의 조합은 개선된 생존 예측을 제공하며, 이는 심지어는 hGDF-15 수준 단독의 사용에 비해 개선된다.
또한, 바이오마커로서 hGDF-15 수준의 사용은, 거시적인 종양이 없는 III 단계 환자와 같은 흑색종 환자의 하위-군을 포함하는 생존 예측을 제공할 수 있기 때문에 또한 유리하며, S100B는 유일하게 이용가능한 예측 및 진단 마커를 나타낸다.
따라서, 본 발명은 후술되는 바람직한 구현예를 제공함으로써 흑색종 환자의 생존을 예측하기 위한 개선된 수단을 제공한다:
1. 인간 흑색종 환자의 생존 확률을 예측하는 방법으로서, 다음의 단계를 포함하는 방법:
(a) 상기 환자로부터 수득된 인간 혈액 샘플에서 hGDF-15 수준을 결정하는 단계; 및
(b) 상기 인간 혈액 샘플에서 hGDF-15의 결정된 수준에 기초하여 상기 생존 확률을 예측하는 단계를 포함하며, 상기 인간 혈액 샘플내 hGDF-15의 수준 감소는 생존 확률의 증가를 의미하는, 방법.
2. 1번 항목에 있어서, 단계 (b)는 단계 (a)에서 결정된 상기 hGDF-15의 수준을 hGDF-15 역치 수준과 비교하는 단계를 포함하며, 상기 확률은 단계 (a)에서 결정된 상기 hGDF-15 수준을 상기 hGDF-15 역치 수준과 비교한 것에 기초하여 예측되고; 상기 인간 혈액 샘플내 hGDF-15 수준이 hGDF-15 역치 수준과 비교해 낮은 경우는, 생존 확률이 상기 hGDF-15 역치 수준 이상에서의 생존 확률 보다 높은 것을 의미하는, 방법.
3. 1번 또는 2번 항목에 있어서, 인간 혈액 샘플이 인간 혈청 샘플인 방법.
4. 3번 항목에 있어서, 상기 hGDF-15 역치 수준은 1.1 ng/ml 내지 2.2 ng/ml 범위로부터 선택되는 수준인 방법으로서, 상기 hGDF-15 역치 수준이 바람직하게는 1.2 ng/ml 내지 2.0 ng/ml 범위로부터 선택되는 hGDF-15 수준이고, 상기 hGDF-15 hGDF-15 역치 수준이 보다 바람직하게는 1.3 ng/ml 내지 1.8 ng/ml 범위로부터 선택되는 hGDF-15 수준이고, 상기 hGDF-15 역치 수준이 보다 더 바람직하게는 1.4 ng/ml 내지 1.6 ng/ml 범위로부터 선택되는 hGDF-15 수준인 방법.
5. 4번 항목에 있어서, hGDF-15 역치 수준이 1.5 ng/ml인 방법.
6. 3번 항목에 있어서, 상기 hGDF-15 역치 수준이 3.3 ng/ml 내지 4.3 ng/ml 범위로부터 선택되는 수준이고, 상기 hGDF-15 역치 수준이 바람직하게는 3.6 ng/ml 내지 4.0 ng/ml 범위로부터 선택되는 수준이고, 상기 hGDF-15 역치 수준이 보다 바람직하게는 3.8인 방법.
7. 전술된 항목 중 어느 한 항목에 있어서,
단계 (a)가 상기 인간 혈액 샘플에서 젖산 탈수소효소의 수준을 결정하는 단계를 추가로 포함하고,
단계 (b)에서, 상기 생존 확률이 또한 상기 인간 혈액 샘플에서 젖산 탈수소효소의 결정된 수준에 기초하여 예측되며; 상기 인간 혈액 샘플내 젖산 탈수소효소의 수준 감소는 생존 확률의 증가를 의미하는, 방법.
8. 7번 항목에 있어서,
단계 (b)가 단계 (a)에서 결정된 상기 젖산 탈수소효소의 수준을 젖산 탈수소효소 역치 수준과 비교하는 단계를 포함하며, 상기 확률은 또한 단계 (a)에서 결정된 상기 젖산 탈수소효소의 수준을 상기 젖산 탈수소효소 역치 수준과 비교한 것에 기초하여 예측되고; 상기 인간 혈액 샘플내 젖산 탈수소효소의 수준이 젖산 탈수소효소 역치 수준 이하인 경우는, 생존 확률이 상기 젖산 탈수소효소 역치 수준 보다 높을 경우의 생존 확률과 비교해 높다는 것을 의미하는, 방법.
9. 전술된 항목 중 어느 한 항목에 있어서,
단계 (a)가 상기 인간 혈액 샘플에서 S100B 수준을 결정하는 단계를 추가로 포함하고,
단계 (b)에서, 상기 생존 확률이 또한 상기 인간 혈액 샘플에서 S100B의 결정된 수준에 기초하여 예측되며, 상기 인간 혈액 샘플내 S100B의 수준 감소는 생존 확률의 증가를 의미하는, 방법.
10. 9번 항목에 있어서,
단계 (b)가 단계 (a)에서 결정된 상기 S100B의 수준을 S100B 역치 수준과 비교하는 단계를 포함하며, 상기 확률은 단계 (a)에서 결정된 상기 S100B의 수준을 S100B의 역치 수준과 비교한 것에 기초하여 예측되고; 상기 인간 혈액 샘플에서의 S100B의 수준이 상기 S100B 역치 수준 이하인 경우는, 생존 확률이 상기 S100B 역치 수준 이상일 경우의 생존 확률에 비해 높다는 것을 의미하는, 방법.
11. 전술된 항목 중 어느 한 항목에 있어서, 단계 (b)에서, 상기 생존 확률은 또한 상기 환자의 연령에 기초하여 예측되며; 연령 증가는 생존 확률의 감소를 의미하는, 방법.
12. 11번 항목에 있어서, 단계 (b)가 상기 환자의 상기 연령을 임계 연령과 비교하는 단계를 포함하며, 상기 확률은 상기 환자의 상기 연령을 상기 임계 연령과 비교한 것에 기초하여 예측되고; 상기 환자의 연령이 임계 연령 이상인 경우는, 생존 확률이 상기 임계 연령 미만일 경우의 생존 확률과 비교해 낮다는 것을 의미하는, 방법.
13. 12번 항목에 있어서, 상기 임계 연령이 60 내지 65세의 범위로부터 선택되는 방법.
14. 13번 항목에 있어서, 상기 임계 연령이 63세인 방법..
15. 전술된 항목 중 어느 한 항목에 있어서, 단계 (b)에서, 상기 생존 확률이 또한 전이에 기초하여 예측되며; 폐 이외의 내장 기관에서의 전이의 존재는 생존 확률이 전이가 폐 이외의 내장 기관에서 부재하는 경우의 생존 확률에 비해 낮다는 것을 의미하는, 방법.
16. 전술된 항목 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 인간 흑색종 환자는 종양이 없는 흑색종 IV 단계 환자가 아닌 방법.
17. 전술된 항목 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 인간 흑색종 환자는 종양이 없는 III 단계 흑색종 환자이거나 절제불가능한 IV 단계 흑색종 환자인 방법.
18. 1번 내지 16번 항목 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 인간 흑색종 환자는 IV 단계 흑색종 환자인 방법.
19. 1번 내지 16번 항목 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 인간 흑색종 환자는 III 단계 흑색종 환자인 방법.
20. 17번 항목에 있어서, 상기 인간 흑색종 환자는 종양이 없는 III 단계 흑색종 환자인 방법.
21. 17번 항목에 있어서, 상기 인간 흑색종 환자는 절제불가능한 IV 단계 흑색종 환자인 방법.
22. 전술된 항목 중 어느 한 항목에 있어서, 단계 (a)가 hGDF-15에 결합할 수 있는 하나 이상의 항체 또는 이의 항원-결합 영역의 사용에 의해 hGDF-15의 수준을 결정하는 것을 포함하는 방법.
23. 22번 항목에 있어서, 상기 hGDF-15에 결합할 수 있는 하나 이상의 항체 또는 이의 항원-결합 영역이 hGDF-15와 함께 복합체를 형성하는 방법.
24. 22번 또는 23번 항목에 있어서, 상기 하나 이상의 항체가 적어도 하나의 다클론 항체를 포함하는 방법.
25. 22번, 23번 또는 24번 항목에 있어서, 상기 하나 이상의 항체 또는 상기 항원-결합 영역이 적어도 하나의 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 영역을 포함하는 방법.
26. 25번 항목에 있어서, 상기 결합이 hGDF-15 상의 입체형태적 또는 불연속 에피토프에 대한 결합이고, 상기 입체형태적 또는 불연속 에피토프가 서열번호 25 및 서열번호 26의 아미노산 서열로 구성되는, 방법.
27. 25번 또는 26번 항목에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 영역이 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 영역, 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 영역 및 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하고, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 영역이 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 영역, ser-ala-ser 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 영역 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 방법.
28. 1번 내지 27번 항목 중 어느 한 항목에 있어서, 단계 (a)에서, 상기 hGDF-15 수준이 25항 내지 27항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로 hGDF-15을 포획하고 다클론 항체로 hGDF-15을 검출함으로써, 또는 hGDF-15을 포획하는 항체와는 다른 에피토프에 결합하는 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로 hGDF-15을 검출함으로써 결정되는 방법.
29. 전술된 항목 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 방법이 시험관내 방법인 방법.
30. 전술된 항목 중 어느 한 항목에 있어서, 단계 (a)에서, 인간 혈액 샘플에서 hGDF-15의 수준이 효소-연계된 면역흡착 분석법에 의해 결정되는 방법.
31. 1번 내지 29번 항목 중 어느 한 항목에 있어서, 단계 (a)에서, 인간 혈액 샘플에서 hGDF-15의 수준이 전기화학발광 분석법에 의해 결정되는 방법.
32. 31번 항목에 있어서, 상기 전기화학발광 분석법은 하기 물질들 건의 검출 복합체를 형성하는 단계를 포함하는 샌드위치 검출 방법이고:
(A) 스트렙타비딘-코팅된 비드;
(B) hGDF-15에 결합할 수 있는 바이오틴화된 제1 항체 또는 이의 항원-결합 영역;
(C) 상기 샘플로부터의 hGDF; 및
(D) 루테늄 복합체가 표지(labelling)된, hGDF-15에 결합할 수 있는 2차 항체 또는 이의 항원-결합 영역;
상기 검출 복합체는 구조 (A)-(B)-(C)-(D)를 가지며, 상기 바이오틴화된 제1 항체 또는 이의 항원-결합 영역은 제1 hGDF-15 에피토프에 결합하고 상기 루테늄 복합체가 표지된 제2 항체 또는 이의 항원-결합 영역은 제1 hGDF-15 에피토프와는 상이한 제2 hGDF-15 에피토프에 결합하고,
상기 방법은 전기화학발광을 측정함으로써 검출 복합체를 검출하는 단계를 추가로 포함하고,
상기 인간 혈액 샘플내 hGDF-15의 수준은 전기화학발광 측정에 기초하여 결정되는 것인 방법.
33. 1번 내지 32번 항목 중 어느 한 항목에 따른 방법을 수행하도록 구성된 장치.
34. 25번 항목에 있어서, 상기 장치는 31번 또는 32번 항목에 따른 방법을 수행하도록 구성된 전기화학발광 분석기인 장치.
35. 검출 키트로서:
(i) 스트렙타비딘-코팅된 비드;
(ii) hGDF-15에 결합할 수 있는 바이오틴화된 제1 항체 또는 이의 항원-결합 영역;
(iii) 재조합 hGDF-15, 바람직하게는 재조합 hGDF-15을 포함하는 완충된 용액 형태로서, 상기 완충된 용액은 4 내지 7의 범위의 pH를 가짐;
(iv) 루테늄 복합체가 표지(labelling)된, hGDF-15에 결합할 수 있는 2차 항체 또는 이의 항원-결합 영역; 및 선택적으로
(v) 사용 설명서, 바람직하게는 1번 내지 32번 항목에 따른 방법에 이용하기 위한 사용 설명서; 및 바람직하게는
(vi) 상기 재조합 hGDF-15을 수용하는 용기, 여기서, 재조합 hGDF-15와 접촉되는 용기의 표면이 비-접착성 물질로 코팅된 용기를 포함하며,
상기 바이오틴화된 제1 항체 또는 이의 항원-결합 영역은 제1 hGDF-15 에피토프에 결합할 수 있고, 상기 루테늄 복합체-표지된 제2 항체 또는 이의 항원-결합 영역은 상기 제1 hGDF-15 에피토프와는 상이한 제2 hGDF-15 에피토프에 결합할 수 있는 키트.
36. 35번 항목에 있어서, hGDF-15에 결합할 수 있는 제1 항체 또는 이의 항원-결합 영역 및 hGDF-15에 결합할 수 있는 제2 항체 또는 이의 항원-결합 영역 중 하나는 26번 내지 28번 항목 중 어느 한 항목에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 영역인 검출 키트.
37. 인간 흑색종 환자의 생존 확률을 예측하기 위한 시험관내 방법에서의 35번 내지 36번 항목 중 어느 한 항목의 검출 키트의 용도.
도 1: GDF-15 혈청 수준에 따른 뚜렷한 흑색종 환자 집단의 전체 생존기간. 카플란-마이어 곡선은 468명의 종양이 없는 III 단계 (a), 206명의 절제불가능한 IV 단계 (b) 및 87명의 종양이 없는 IV 단계 (c)의 정상 (<1.5 ng/mL) 또는 상승된 (≥1.5 ng/mL) GDF-15 수준을 갖는 환자를 나타낸다. 중도절단 (censoring)은 수직선으로 표시된다; p-값은 로그 순위 통계에 의해 계산되었다. 도 1a 및 1b에서, 상부 곡선은 정상 hGDF-15 수준에 대한 곡선이고, 하부 곡선은 상승된 hGDF-15 수준에 대한 곡선이다.
도 2: S100B와 GDF-15 혈청 수준의 조합과 III 단계 환자의 전체 생존기간과 이의 상관관계. 콕스 회귀 모델을 사용하여, S100B 및 hGDF-15 수준이 독립적으로 종양이 없는 III 단계 환자의 예후를 예측할 수 있는 것으로 나타났다. 상이한 바이오마커 조합을 가진 환자에 대한 전체 생존기간의 카플란-마이어 곡선이 466명의 환자에 대해 제시되어 있다. 중도절단은 수직선으로 표시된다. 도 2에서, 가장 위쪽의 곡선은 정상 hGDF-15 수준 및 정상 S100B 수준에 대한 곡선이고, 두 번째로 높은 곡선은 상승된 hGDF-15 수준에 대한 곡선이고, 두 번째로 낮은 곡선은 상승된 S100B 수준에 대한 곡선이고, 가장 낮은 곡선은 상승된 hGDF-15 수준 및 상승된 S100B 수준 중 하나이다.
도 3: LDH 및 GDF-15의 혈청 수준의 조합에 따른 절제불가능한 IV 단계 환자의 전체 생존기간, 및 원격 전이 패턴. 전체 생존기간에 미치는 GDF-15 혈청 수준의 독립적인 예후 영향이 M-분류 M1a/b (a) 및 M1c 환자 (b)에 대해 도시되어 있다. 파선은 주어진 M-분류의 모든 환자를 나타낸다. 연속선은 각각 낮거나 (파란색) 높은(붉은색) GDF-15 수준을 갖는 하위-군을 나타낸다. 높거나 낮은 GDF-15 수준을 가진 환자 사이의 OS의 차이는 M1a/b 및 M1c 환자에서 유의하였다 (로그 순위 P-값은 각각 0.047 및 0.003). (c)에서, 전체 생존기간을 콕스 회귀 분석 (LDH 수준, 내장 전이 패턴, 및 GDF-15 수준)의 모델 1에 따라 모든 3가지 독립적인 예후 인자를 고려하여 불리한 값의 수에 따라 나타냈다. 도면의 패널 (a) 내지 (c)에 포함된 범례의 곡선의 순서 (즉, 가장 위쪽의 곡선에서 가장 아래 곡선으로의 순서)는 각각의 패널에서의 곡선 순서를 반영한다.
도 4: 흑색종 환자에서 GDF-15 혈청 수준과 전체 생존기간의 상관관계. 762명의 환자를 2개의 코호트에 무작위로 배정하였다. 식별된 코호트(254명의 환자)에서, 카플란-마이어 분석 및 로그 순위 검정에 의해 상이한 컷-오프 값을 시험하여 GDF-15 혈청 수준이 높은 환자와 낮은 환자 사이의 차이를 가능한 최고로 수득하였다. 최적화된 컷-오프 지점 (<1.5 ng/mL 대 ≥1.5 ng/mL)에 따른 식별 코호트의 환자의 전체 생존기간을 (a)에 나타냈다. 전체 생존기간의 차이를 검증 코호트 (b)의 508명의 환자에서 확인하였다. 중도절단은 수직선으로 표시된다; p-값을 로그 순위 통계에 의해 계산하였다. 도 4a 및 4b에서, 상부 곡선은 정상 hGDF-15 수준에 대한 곡선이고, 하부 곡선은 상승된 hGDF-15 수준에 대한 곡선이다.
도 5: S100B 혈청 수준에 따른 전체 생존기간. 카플란-마이어 곡선은 466명의 종양이 없는 III 단계 (a), 193명의 절제불가능한 IV 단계 (b), 및 83명의 종양이 없는 IV 단계 (c)의 환자의 전체 생존기간을 나타낸다. 환자를 S100B 혈청 수준 (정상 대 상승)에 기초하여 분류하였다. 중도절단은 수직선으로 표시된다; p-값을 로그 순위 통계에 의해 계산하였다. 도 5a 내지 5c에서, 상부 곡선은 정상 S100B 수준에 대한 곡선이고, 하부 곡선은 상승된 S100B 수준에 대한 곡선이다.
도 6: GDF-15, S100B, 연령, 및 하위-단계의 혈청 수준을 고려하여 불리한 값의 수에 따른 III 단계 환자의 전체 생존기간. 모델 2의 콕스 회귀 분석 (표 2)은 GDF-15 수준이 >1.5 ng/mL인 경우, S100B 수준이 상승된 경우, 연령이 <63세인 경우, 및 IIIC 하위-단계인 경우의 독립적인 음성 예후 영향을 나타낸다. 환자는 이제 4가지 인자 중 불리한 값의 수에 따라 계층화되었다. 전체 생존기간의 카플란-마이어 곡선의 결과를 나타냈으며 중도절단은 수직선으로 표시된다. 가장 위쪽의 곡선은 모든 인자가 유리한 곡선이다. 두 번째로 높은 곡선은 하나의 인자가 불리한 곡선이다. 세 번째로 높은 곡선은 2개의 인자가 불리한 곡선이다. 두 번째로 낮은 곡선은 3개의 인자가 불리한 곡선이다. 가장 낮은 곡선은 모든 인자가 불리한 곡선이다.
도 7: GDF-15, S100B, 원격 전이 패턴, 및 연령의 혈청 수준을 고려하여 불리한 값의 수에 따른 절제불가능한 IV 단계 환자의 전체 생존기간. 모델 2의 콕스 회귀 분석 (표 3)은 GDF-15 수준이 >1.5 ng/mL인 경우, S100B 수준이 상승된 경우, 폐 이외의 내장 기관의 전이가 있는 경우, 및 63세 이상의 연령인 경우의 독립적인 음성 예후 영향을 나타낸다. 따라서, 환자는 불리한 인자의 수에 따라 계층화되었다. 전체 생존기간의 카플란-마이어 곡선의 결과를 나타냈으며 중도절단은 수직선으로 표시된다. 가장 위쪽의 곡선은 모든 인자가 유리한 곡선이다. 두 번째로 높은 곡선은 하나의 인자가 불리한 곡선이다. 세 번째로 높은 곡선은 2개의 인자가 불리한 곡선이다. 두 번째로 낮은 곡선은 3개의 인자가 불리한 곡선이다. 가장 낮은 곡선은 모든 인자가 불리한 곡선이다.
도 8: 상이한 인자의 조합에 따라 III 단계 환자의 혈청 샘플링 후의 전체 생존기간. 노모그램 (a)는 다변량 분석 (sGDF-15, sS100B, 국소 제어(loco-regional) 전이 패턴)에 따라 단일 독립적인 인자의 상대적인 영향을 고려하여 R의 노모그램 함수를 사용하여 종양이 없는 III 단계 환자에 대해 개발되었다. 완전한 데이터가 있는 466명의 III 단계 환자에 대해 0점과 266점 사이의 위험 점수를 계산하였다. (b)에서, 혈청 샘플링 후의 전체 생존기간의 카플란-마이어 곡선은 상이한 위험 점수 분류에 대해 표시된다. 중도절단은 수직선으로 표시된다.
도 9: 상이한 인자의 조합에 따른 절제불가능한 IV 단계 환자의 혈청 샘플링 후의 전체 생존기간. GDF-15 혈청 수준은 M 분류 외에 절제불가능한 IV 단계 환자의 전체 생존기간에 독립적인 영향을 갖는다. 이는 M1a/b 환자 (a), 및 M1c 환자 (b) 모두에서 sGDF-15에 따른 OS의 유의한 차이에 의해 설명된다. 노모그램 (c)는 다변량 분석 (sGDF-15, sS100B, CNS 관여, 관련 원거리 부위 수)에 따른 단일 독립적인 인자의 상대적인 영향을 고려하여 R의 노모그램 함수를 사용하여 절제불가능한 IV 단계 환자에 대해 개발되었다. 완전한 데이터가 있는 193명의 절제불가능한 IV 단계 환자에 대해 0점과 334점 사이의 위험 점수를 계산하였다. (b)에서, 혈청 샘플링 후의 전체 생존기간의 카플란-마이어 곡선은 상이한 위험 점수 분류에 대해 표시된다. 중도절단은 수직선으로 표시된다.
도 10: sGDF-15와 단계/질병 상태 및 sLDH의 상관관계. 혈청 GDF-15 수준을 종양이 없는 III 단계 (n=468), 종양이 없는 IV 단계 환자 (n=87) 및 절제불가능한 IV 단계 환자 (n=206)에 대해 나타냈다 (a). 절제불가능한 IV 단계 환자에서, sGDF-15는 원격 전이의 수에 따라 나타냈거나 (b), sLDH에 따라 계층화하였다 (c). 적색 막대는 GDF-15의 중간 수준을 나타냈다; 만 위트니 검정을 사용한 ** p < 0.01; *** p < 0.001.
도 11: 혈청 샘플링 후 전체 생존기간은 흑색종 환자에서 GDF-15 혈청 수준과 관련있다. 761명의 환자를 2개의 코호트에 무작위적으로 배정하였다. 식별 코호트 (254명의 환자)에서, 상이한 컷-오프 값을 카플란-마이어 분석 및 로그 순위 검정에 의해 시험하여 높은 GDF-15 혈청 수준과 낮은 GDF-15 혈청 수준을 가진 환자 사이의 최대 가능한 차이를 수득하였다. 최적화된 컷-오프 지점 (≤1.5ng/mL 대 ≥ 1.5ng/mL)에 따른 식별 코호트의 환자의 혈청 샘플링 후의 전체 생존기간을 (a)에 나타냈다. 혈청 샘플링 이후 전체 생존기간의 차이를 검증 코호트의 507명의 환자에서 확인하였다 (b). 중도절단은 수직선으로 표시된다; p-값은 로그 순위 통계에 의해 계산하였다.
도 12: 종양이 없는 III 단계 환자에서 혈청 샘플링의 시점에 따른 sGDF-15, sS100B 및 sLDH와 OS와의 관련성. 혈청 샘플링 전 마지막 재발 시점에 따른 sGDF-15 (좌측), sS100B (중간) 및 sLDH (우측)에 따른 종양이 없는 III 단계 환자의 전체 생존기간. 환자를 마지막 전이의 검출 후 6개월 미만 (a-c), 6개월 내지 2년 사이 (d-f) 또는 2년 이상 (g-i) 동안 종양이 이 없는 것으로 분류하였다. 중도절단은 수직선으로 표시된다; p-값은 로그 순위 통계에 의해 계산하였다.
도 13: 절제불가능한 IV 단계 환자에서 혈청 샘플링 시점에 따라 sGDF-15, sS100B 및 sLDH와 OS와의 관련성. IV 단계 질병의 진단 이후 연장된 시점에 따른 sGDF-15 (좌측), S100B (중간) 및 LDH (우측)에 따른 절제불가능한 IV 단계 환자의 전체 생존기간. 첫 번째 원격 전이가 혈청 샘플링 전 6개월 이내 (a-c), 6개월 내지 2년 사이 (d-f), 및 2년 이상 (g-i)에 검출되었다. 중도절단은 수직선으로 표시된다; p-값은 로그 순위 통계에 의해 계산하였다.
도 14: S100B 혈청 수준에 따른 혈청 샘플링 이후의 전체 생존기간. 카플란-마이어 곡선은 466명의 종양이 없는 III 단계 (a), 83명의 종양이 없는 IV 단계 (b), 및 193명의 절제불가능한 IV 단계 (c)의 혈청 샘플링 이후의 전체 생존기간에 대해 나타낸다. 환자는 S100B 혈청 수준 (정상 대 상승)에 기초하여 분류된다. 중도절단은 수직선으로 표시된다; p-값은 로그 순위 통계에 의해 계산되었다.
정의 및 일반 기법
하기에서 달리 정의되지 않은 한, 본원에 사용되는 용어들은 당해 기술 분야의 당업자에게 공지된 일반적인 의미로 이해될 것이다.
본원에 사용된 용어 "항체"는 일반적으로 본원에 참조로 포함된 Paul, W.E. (Ed.).: Fundamental Immunology 2nd Ed. Raven Press, Ltd., New York 1989의 제7장에 개요가 기재된 바와 같이, 대상 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 기능적인 항체를 지칭한다. 특정 제한 없이, 용어 "항체"는 닭 및 포유류 예컨대 마우스, 염소, 비-인간 영장류 및 인간을 비롯한 임의의 적절한 공급원 종으로부터의 항체를 포함한다. 바람직하게는, 항체는 인간화 항체이다. 항체는 바람직하게는 당해 기술 분야에 널리 공지된 방법에 의해 제조될 수 있는 단일클론 항체이다. 용어 "항체"는 IgG-1, -2, -3, 또는 -4, IgE, IgA, IgM, 또는 IgD 이소형 항체를 포함한다. 용어 "항체"는 모노머 항체 (예컨대 IgD, IgE, IgG) 또는 올리고머 항체 (예컨대 IgA 또는 IgM)를 포함한다. 용어 "항체"는 또한 특정 제한 없이, 단리된 항체 및 변형된 항체, 예컨대 유전적으로 조작된 항체, 예컨대 키메라 항체를 포함한다.
항체 도메인의 명명법은 당해 기술 분야에 공지된 용어를 따른다. 항체 각각의 단량체는 일반적으로 당해 기술 분야에 공지된 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함한다. 이 중에서, 각각의 중쇄 및 경쇄는 항원 결합에 중요한 가변 도메인 (중쇄의 경우 VH 및 경쇄의 경우 VL로 지칭됨)을 포함한다. 이러한 중쇄 및 경쇄 가변 도메인은 (N-말단에서 C-말단의 순서로) 영역 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, 및 FR4 (FR, 골격 영역; CDR, 초가변 영역으로도 공지된 상보성 결정 영역)를 포함한다. 항체 서열 내의 전술된 항체 영역의 식별 및 지정은 일반적으로 Kabat et al. (Sequences of proteins of immunological interest, U.S. Dept. of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. 1983), 또는 Chothia et al. (Conformations of immunoglobulin hypervariable regions. Nature. 1989 Dec 21-28;342(6252):877-83.)에 따르거나, 본원에 참조로 포함된 Giudicelli et al. (IMGT/V-QUEST, 면역글로불린 및 T 세포 수용체 V-J 및 V-D-J 재배열 분석을 위한 통합 소프트웨어 프로그램. Nucleic Acids Res. 2004 Jul 1;32(Web Server issue):W435-40.)에 기술된 IMGT/V-QUEST 소프트웨어를 사용하여 수행될 수 있다. 바람직하게는, 상기 지시된 항체 영역은 IMGT/V-QUEST 소프트웨어를 사용하여 식별되고 지정된다.
"단일클론 항체"는 본질적으로 균일한 항체 집단으로부터의 항체이고, 여기서, 항체는 서열이 실질적으로 동일하다 (즉, 자연 발생 서열 변형, 예컨대 이의 N- 및 C-말단에서의 아미노산 변형을 포함하는 항체의 작은 부분을 제외하고 동일함). 단일 에피토프에 대해 작용하거나 다수의 상이한 에피토프에 대해 작용하는 상이한 항체의 혼합물을 함유하는 다클론 항체와 달리, 단일클론 항체는 동일한 에피토프에 대해 작용하고, 따라서 고도로 특이적이다. 용어 "단일클론 항체"는 예컨대 Kohler 및 Milstein (Nature, 1975 Aug 7;256(5517):495-7) 또는 Harlow 및 Lane ("Antibodies: A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York 1988)에 기술된 하이브리도마 방법에 의해 생성된 항체와 같이, 단일 세포 클론으로부터 유래된 단일클론 세포 집단으로부터 수득된 항체를 포함한다 (그러나 이에 제한되지 않음). 단일클론 항체는 또한 파지 디스플레이 기술, 예컨대 Clackson et al. (Nature. 1991 Aug 15;352(6336):624-8) 또는 Marks et al. (J Mol Biol. 1991 Dec 5;222(3):581-97)에 기재된 것을 포함하여, 다른 적절한 방법으로부터 수득될 수 있다. 단일클론 항체는 당해 기술 분야에 공지된 방법에 의해 항원-결합 특성, 예컨대 감소된 Kd 값, 최적화된 결합 및 해리 동력학에 대해 최적화된 항체일 수 있다. 예컨대, Kd 값은 친화도-성숙 단일클론 항체를 생성하는 파지 디스플레이를 포함하는 디스플레이 방법에 의해 최적화될 수 있다. 용어 "단일클론 항체"는 기원하는 특정 종으로부터 또는 기원하는 하나의 단일 종으로부터의 항체 서열로 제한되지 않는다. 따라서, 용어 "단일클론 항체"의 의미는 키메라 단일클론 항체 예컨대 인간화된 단일클론 항체를 포함한다.
"인간화 항체"는 인간 서열 및 대상 항원 (예컨대, 인간 GDF-15)에 대한 결합 특이성을 부여하는 비-인간 서열의 작은 부분을 포함하는 항체이다. 전형적으로, 인간화 항체는 인간 어셉터 항체로부터의 초가변 영역 서열을 대상 항원 (예컨대, 인간 GDF-15)에 결합하는 비-인간 도너 항체 (예컨대, 마우스, 토끼, 랫트 도너 항체)로부터의 초가변 영역 서열로 대체함으로써 생성된다. 일부 경우에, 어셉터 항체의 골격 영역 서열은 또한 도너 항체의 상응하는 서열에 의해 대체될 수 있다. 공여자 및 어셉터 항체로부터 유래된 서열 이외에, "인간화 항체"는 다른 (추가의 또는 대체의) 잔기 또는 서열을 함유할 수 있거나 함유하지 않을 수 있다. 이러한 다른 잔기 또는 서열은 또한 항체 특성 예컨대 결합 특성 (예컨대 Kd 값을 감소시키는 것) 및/또는 면역원성 특성 (예컨대, 인간에서 항원성을 감소시키는 것)을 추가로 개선하는 기능을 수행할 수 있다. 인간화 항체를 생산하는 방법의 비제한적인 예가 당해 기술 분야에, 예컨대 Riechmann et al. (Nature. 1988 Mar 24; 332(6162):323-7) 또는 Jones et al. (Nature. 1986 May 29-Jun 4; 321(6069):522-5)로부터 공지되어 있다.
용어 "인간 항체"는 인간 가변 및 불변 도메인 서열을 포함하는 항체에 관한 것이다. 이러한 정의는 항체 특성 예컨대 결합 특성 (예컨대 Kd 값을 감소시키는 것) 및/또는 면역원성 특성 (예컨대 인간에서 항원성을 감소시키는 것)을 추가로 개선하는 기능을 수행할 수 있는 단일 아미노산 치환 또는 변형을 보유하는 인간 서열을 갖는 항체를 포함한다. 용어 "인간 항체"는 비-인간 서열의 부분이 대상 항원에 대한 결합 특이성을 부여하는 인간화 항체를 제외한다.
본원에 사용된 항체의 "항원-결합 영역"은 항원 (예컨대 hGDF-15, PD-1, PD-L1 또는 CTLA4)에 특이적으로 결합하는 항체의 능력을 보유하는 항체의 부분을 지칭한다. 이러한 능력은, 예컨대, 당해 기술 분야에 공지된 방법에 의해 항원에 특이적인 결합을 위한 항체와 경쟁하기 위한 항원-결합 영역의 능력을 결정하는 것에 의해 결정될 수 있다. 항원-결합 영역은 항체의 하나 이상의 단편을 포함할 수 있다. 특정 제한 없이, 항원-결합 영역은 재조합 DNA 방법 및 항체의 화학적 또는 효소적 단편화에 의한 제조를 비롯하여, 당해 기술 분야에 공지된 임의의 적절한 방법에 의해 생산될 수 있다. 항원-결합 영역은 항원에 특이적으로 결합하기 위한 항체의 능력을 보유하는 항체의 Fab 단편, F(ab') 단편, F(ab')2 단편, 단일쇄 항체 (scFv), 단일-도메인 항체, 다이아바디 (diabody) 또는 임의의 다른 부분일 수 있다.
"항체" (예컨대, 단일클론 항체) 또는 "항원-결합 영역"은 유도체화되거나 상이한 분자에 연결될 수 있다. 예컨대, 항체에 연결될 수 있는 분자는 다른 단백질 (예컨대, 다른 항체), 분자 표지 (예컨대, 형광, 발광, 착색 또는 방사성 분자), 약제 및/또는 독성 물질이다. 항체 또는 항원-결합 영역은 직접 (예컨대, 2개의 단백질 사이의 융합 형태로), 또는 링커 분자 (예컨대, 당해 기술 분야에 공지된 임의의 적절한 유형의 화학적 링커)를 통해 연결될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "결합하는" 또는 "결합하다"는 대상 항원 (예컨대, 인간 GDF-15)에 대한 결합 특이성을 지칭한다. 바람직하게는, Kd 값은 100 nM 미만, 보다 바람직하게는 50 nM 미만, 보다 더 바람직하게는 10 nM 미만, 보다 더 바람직하게는 5 nM 미만이고, 가장 바람직하게는 2 nM 미만이다.
본원에 사용된 용어 "에피토프"는 항체에 대한 결합 부위를 형성하는 항원의 작은 부분을 지칭한다.
본 발명의 측면에서, 항체의 결합 특성을 분석하기 위한 목적을 위해, 항체 또는 이의 항원-결합 영역의 대상 항원 (예컨대, 인간 GDF-15)에 대한 결합 또는 경쟁적 결합은 바람직하게는 후술되는 바와 같은 참조 표준 분석법으로서의 표면 플라즈몬 공명 측정을 사용하여 측정된다.
용어 "KD" 또는 "KD 값"은 당해 기술 분야에 공지된 평형 해리 상수를 지칭한다. 본 발명의 측면에서, 이러한 용어는 관심 특정 항원 (예컨대 인간 GDF-15)에 대한 항체의 평형 해리 상수를 지칭한다. 평형 해리 상수는 복합체 (예컨대 항원-항체 복합체)가 이의 성분 (예컨대 항원 및 항체)으로 가역적으로 해리되는 경향의 척도이다. 본 발명에 따른 항체에 대해, KD 값 (예컨대, 항원 인간 GDF-15에 대한 값)은 바람직하게는 후술되는 바와 같은 표면 플라즈몬 공명 측정을 사용하여 결정된다.
본원에 사용된 "단리된 항체"는 이의 공급 환경의 대부분의 성분 (중량 기준)으로부터, 예컨대 하이브리도마 세포 배양물 또는 이의 생산을 위해 사용된 상이한 세포 배양물의 성분 (예컨대, 재조합적으로 항체를 발현하는 생산자 세포, 예컨대 CHO 세포)으로부터 확인되고 분리된 항체이다. 분리는 요구되는 용도에 대한 항체의 적합성 (예컨대 본 발명에 따른 항-인간 GDF-15 항체의 치료 용도를 가짐)을 방해할 수 있는 성분을 충분히 제거하도록 수행된다. 단리된 항체의 제조 방법이 당해 기술 분야에 공지되어 있고, 단백질 A 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 바이러스 체류 여과 (retentive filtration) 및 한외여과를 포함한다. 바람직하게는, 단리된 항체 제제는 라우리 (Lowry) 단백질 분석법을 사용하여 측정하는 경우, 순도가 적어도 70 % (w/w), 보다 바람직하게는 적어도 80 % (w/w), 보다 더 바람직하게는 적어도 90 % (w/w), 보다 더 바람직하게는 적어도 95 % (w/w), 그리고 가장 바람직하게는 적어도 99 % (w/w)이다.
본원에 사용된 용어 "다이아바디"는 동일한 쇄 상의 2개의 도메인 사이의 쌍 형성을 허용하기에는 너무 짧은 펩티드 링커에 의해, 동일한 폴리펩티드 쇄 상의 경쇄 가변 도메인에 연결된 중쇄 가변 도메인을 포함하는 작은 2가 항원-결합 항체 부분이다. 이는 또 다른 쇄의 상보성 도메인과의 쌍 형성 및 2개의 항원 결합 부위를 갖는 이량체 분자의 조립을 유발한다. 다이아바디는 2가 및 단일특이적일 수 있거나 (예컨대 인간 GDF-15에 대한 2개의 항원 결합 부위를 갖는 다이아바디), 또는 2가 및 이중특이적일 수 있다 (예컨대, 2개의 항원 결합 부위를 갖는 다이아바디, 하나는 인간 GDF-15에 대한 결합 부위이고, 다른 하나는 상이한 항원에 대한 결합 부위임). 다이아바디에 대한 상세한 설명을 Holliger P et al. (""Diabodies": small bivalent and bispecific antibody fragment." Proc Natl Acad Sci U S A. 1993 Jul 15;90(14):6444-8)에서 확인할 수 있다.
본원에 사용된 "단일-도메인 항체" ("나노바디(Nanobody)TM"로도 지칭됨)는 단일 단량체 가변 항체 도메인으로 이루어진 항체 단편이다. 단일-도메인 항체의 구조 및 생산 방법이 당해 기술 분야, 예컨대 Holt LJ et al. ("Domain antibodies: proteins for therapy." Trends Biotechnol. 2003 Nov;21(11):484-90.), Saerens D et al. ("Single-domain antibodies as building blocks for novel therapeutics." Curr Opin Pharmacol. 2008 Oct;8(5):600-8. Epub 2008 Aug 22.), 및 Arbabi Ghahroudi M et al. ("Selection and identification of single domain antibody fragments from camel heavy-chain antibodies." FEBS Lett. 1997 Sep 15;414(3):521-6.)로부터 공지되어 있다.
본원에 사용된 용어 "유의한", "유의하게" 등은 당해 기술 분야에 공지된 적절한 방법에 의해 평가된 값과 본원에 언급된 방법에 의해 평가된 값 사이의 통계학적으로 유의한 차이를 지칭한다.
본원에서, 용어 "포함하는"은 각각 선택적으로 용어 "구성되는"으로 치환될 수 있다.
용어 "암" 및 "암 세포"는 당해 기술 분야에서 이의 통상적인 의미에 따라 본원에서 사용된다 (예컨대, 그 전체가 참조로써 본원에 포함된, Weinberg R. et al.: The Biology of Cancer. Garland Science: New York 2006. 850p를 참조한다).
임상 경과의 예측, 특히 본 발명에 따른 환자 생존 예측을 위해 제공된 암은 흑색종이다. 본원에 사용된 용어 "흑색종"은 당해 기술 분야에 공지된 이의 일반적인 의미에 따라 사용된다. 흑색종은 2001년 이래로 원격 전이가 있는 흑색종 환자의 AJCC 병기 분류 체계에 따라 분류된다 (Balch, CM et al., J Clin Oncol / 19 / 3635-48. 2001). 본원에 언급된 흑색종 단계는 이러한 병기 분류 체계를 지칭한다. 본 발명의 모든 구현예에 따른 본 발명의 바람직한 양태에서, 흑색종은 포도막 흑색종이 아니다.
본 발명에 따른 생존 예측을 위해 제공되는 흑색종 환자는 흑색종 치료를 받을 수 있다. 본원에 사용된 용어 예컨대 "암 치료" 또는 "암 치료하기" 또는 "흑색종 치료" 또는 "흑색종 치료하기"는 치료학적 처치를 지칭한다. 본원에 사용된 이러한 치료는 흑색종 그 자체의 치료 뿐만 아니라 일시적(palliative) 치료를 포함한다. 이러한 일시적인 치료가 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, 예컨대 흑색종 질환의 증상만을 개선하는 치료를 포함한다.
본원에 언급된 바와 같이, 암 치료는 1차 요법, 2차 요법 또는 3차 요법, 또는 3차 요법을 넘어서는 요법일 수 있다. 이러한 용어의 의미는 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, 미국 국립 암 연구소 (US National Cancer Institute)에서 통상적으로 사용되는 용어에 따른다.
암 치료는 추가 또는 2차 치료적 이익이 환자에게도 발생한다는 것을 배제하지 않는다. 예컨대, 추가 또는 2차 이익은 암-유발 체중 감소에 영향을 미칠 수 있다.
본원에 언급된 "종양이 없는" 흑색종 환자는 당해 기술 분야에 공지된 임상 표준 방법에 따라 1차 종양 및 전이가 검출될 수 없는 환자이다. 그러나, 이는 검출 한계 이하이거나, 종양 세포가 존재하여 새로운 종양을 형성할 수 있는 종양 (또는 미세전이)이 존재하는 환자에게 존재하는 것을 배제하지 않는다.
혈액 샘플:
본원에서, 용어 "혈액 샘플"은 전혈, 혈청 및 혈장 샘플을 포함하나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 또한, 혈청 및 혈장 이외의 혈액 분획 (blood fraction)과 같은 다른 동일한 유형들도 포함된다. 이러한 샘플 및 분획들은 당해 기술 분야에 공지되어 있다.
본 발명에 따른 방법에 사용되는 혈액 샘플은 hGDF-15을 함유하는 임의의 유형의 혈액 샘플일 수 있다. hGDF-15을 함유하는 적절한 유형의 혈액 샘플이 당해 기술 분야에 공지되어 있으며 혈청 및 혈장 샘플을 포함한다. 대안적으로, hGDF-15을 함유하는 추가 유형의 혈액 샘플이 또한 당업자에 의해, 예컨대 본원에 개시된 방법을 사용하여, hGDF-15가 이러한 샘플에 함유되었는지 여부를 측정하고 hGDF-15의 수준이 이러한 샘플에 함유되어 있는지를 측정함으로써 용이하게 확인될 수 있다.
임상 경과:
본 발명에 따르면, 인간 혈액 샘플 중의 hGDF-15의 수준은 인간 흑색종 환자의 생존 확률을 예측하는데 사용될 수 있다.
환자 군의 생존은 당해 기술 분야에 공지된 방법에 의해, 예컨대 카플란-마이어 곡선에 의해 분석될 수 있다.
생존 평가를 위한 적절한 시간 주기가 당해 기술 분야에 공지되어 있고 흑색종의 각각의 단계와 같은 인자를 고려하여 당업자에 의해 선택될 것이다.
예컨대, 생존, 바람직하게는 단기 생존은, 예컨대 예측이 이루어진 시점 이후 6개월, 12개월 및/또는 18개월의 시점에 대해 예측될 수 있다. 대안적으로, 생존, 바람직하게는 장기 생존은, 예컨대 예측이 이루어진 시점 후 2년, 3년, 5년 및/또는 10년의 시점에서 평가될 수 있다.
본 발명에 따른 긍정적인 임상 경과의 확률 예측
본 발명에 따른 긍정적인 임상 경과 (예컨대 생존)의 확률을 예측하기 위해, 예컨대 hGDF-15 수준에 기초하여, 바람직한 구현예에서 위에 정의된 예측 방법이 바람직하게는 사용된다.
본 발명의 방법을 실행하기 위해, 당해 기술 분야에 공지된 통계학적 방법이 사용될 수 있다.
예컨대, 전체 생존기간은 콕스 회귀 분석에 의해 분석될 수 있다.
임상 연구로부터 환자 데이터의 통계 모델을 생성하기 위해 본 발명에 따라 사용될 수 있는 바람직한 통계학적 방법이 실시예 1에 개시되어 있다. 실시예 1에 개시된 통계학적 방법은 실시예 1의 특정 특징 예컨대 흑색종 단계, 선택된 특정 역치 수준 및 실시예에서 수득된 특정 통계학적 값으로 제한되지 않는다는 것이 이해된다. 오히려, 실시예 1에 개시된 이러한 방법은 일반적으로 본 발명의 임의의 구현예와 관련하여 사용될 수 있다.
hGDF -15 수준
본 발명의 유리한 양태에서, 인간 흑색종 환자에서 hGDF-15 수준과 긍정적인 임상 경과의 확률, 특히 생존 확률 사이에는 역의 상관관계가 존재한다. 따라서, 본 발명에 따르면, hGDF-15의 감소된 수준은 인간 흑색종 환자에서 생존 확률의 증가를 의미한다.
따라서, 본원에 사용된 바와 같이, "상기 인간 혈액 샘플에서 hGDF-15의 감소된 수준은 생존 확률의 증가를 의미한다"라는 표현은 상기 인간 샘플내 hGDF-15의 수준과 생존 확률이 역의 상관관계를 따른다는 것을 의미한다. 따라서, 상기 인간 혈액 샘플 중의 hGDF-15의 수준이 높을수록 생존 확률이 더 낮다.
예컨대, 본원에 정의된 본 발명에 따른 예측 방법과 관련하여, hGDF-15 역치 수준이 사용될 수 있다.
본 발명에 따르면, hGDF-15 수준과 생존 확률의 역의 상관관계가 임의의 역치 값에 적용되므로, 본 발명은 특정 역치 값에 제한되지 않는다.
바람직한 hGDF-15 역치 수준은 바람직한 구현예에서 상기 정의된 hGDF-15 혈청 수준이다.
대안적으로, 본 발명에 따른 hGDF-15 역치 수준은 전술된 통계학적 방법, 예컨대 실시예 1의 방법을 사용하여 수득 및/또는 추가로 조정될 수 있다.
hGDF-15 역치 수준은 단일 hGDF-15 역치 수준일 수 있다. 본 발명은 또한 하나 이상의 hGDF-15 역치 수준, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 hGDF-15 역치 수준의 사용을 포함한다.
하나 이상의 hGDF-15 역치 수준의 각각의 단일 hGDF-15 역치 수준에 대해, 상응하는 생존 확률이 주어진 시점에서 예측될 수 있다.
혈액 샘플내 hGDF-15 수준은 당해 기술 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 측정될 수 있다. 예컨대, 혈청 수준을 비롯하여 혈액 샘플내 hGDF-15 수준을 측정하는 바람직한 방법은 hGDF-15에 대한 항체를 사용하여 효소-연계된 면역흡착 분석법 (ELISA)에 의해 hGDF-15 수준을 측정하는 것이다. 이러한 ELISA 방법이 실시예 1에 예시되어 있지만, 또한 비드-기반 방법, 예컨대 루미넥스 기술 (Luminex technology) 등을 포함할 수 있다. 대안적으로, 혈청 수준을 비롯하여 혈액 샘플내 hGDF-15 수준은 hGDF-15에 대한 항체를 사용하여 공지된 전기화학적발광 면역검정법에 의해 결정될 수 있다. 예컨대, Roche Elecsys® 기술이 이러한 전기화학적발광 면역검정법에서 사용될 수 있다. 다른 가능한 방법은 전기장에서 단백질을 분리한 후에 체액으로부터의 항체-기반 검출을 포함한다.
건강한 인간 대조군 개체의 hGDF-15 혈청 수준의 중앙값은 < 0.8 ng/ml이다. 건강한 인간 대조군에서 예상되는 범위는 0.2 ng/ml 내지 1.2 ng/ml 사이이다 (참조: Tanno T et al.: "Growth differentiation factor 15 in erythroid health and disease." Curr Opin Hematol. 2010 May; 17(3): 184-190.).
본 발명에 따르면, 바람직한 hGDF-15 역치 수준은 바람직한 구현예에서 상기 정의된 hGDF-15 혈청 수준이다.
이러한 hGDF-15 혈청 수준, 및 본원에 제공된 본 발명의 개시에 기초하여, 다른 혈액 샘플 중의 상응하는 hGDF-15 수준은 당업자에 의해 일상적으로 수득될 수 있다 (예컨대, 혈청 중의 hGDF-15의 상대적인 수준을 다른 혈액 샘플 중의 각각의 수준과 비교함으로써). 따라서, 본 발명은 또한 혈청, 전혈 및 다른 혈액 샘플 중의 바람직한 hGDF-15 수준을 포함하며, 이는 각각의 바람직한 hGDF-15 혈청 수준 및 상기 지시된 범위에 상응한다.
젖산 탈수소효소 수준
혈액 샘플 중의 젖산 탈수소효소 수준은 당해 기술 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 측정될 수 있다. 젖산 탈수소효소 (LDH) 수준은 전형적으로 효소 단위 (U)로 측정된다. 1 단위는 37 ℃에서 pH 7.5에서 분 당 1.0 μmole의 피루베이트를 L-락테이트로 환원시킬 것이다.
[L-락트산 탈수소효소]
피루베이트 + β-NADH → L-락테이트 + β-NAD+
락테이트 및 NAD+는 LDH의 작용에 의해 피루베이트 및 NADH로 전환된다. NADH는 340 nm에서 빛을 강하게 흡수하는 반면 NAD+는 그렇지 않다. 340 nm에서의 흡수에 있어서 증가율은 샘플 중의 LDH 활성에 직접적으로 비례한다. 따라서, LDH 단위는 바람직하게는 340 nm에서 흡수를 측정함으로써 결정된다.
다양한 임상적으로 인정된 진단 시험을 통해 LDH 수준을 측정할 수 있다. 본 발명에 따르면, 흑색종에서 적용될 수 있는 시험은 공지된 임상 표준에 기초하여 선택될 것이다. LDH에 대한 이소형 특이적 시험이 당해 기술 분야에 공지된 방법에 따라 수행될 수 있다.
본 발명의 추가의 유리한 양태에서, 인간 흑색종 환자에서, 젖산 탈수소효소 (LDH) 수준과 긍정적인 임상 경과의 확률, 특히 생존 확률 사이의 역의 상관관계가 또한 존재한다. 따라서, 본 발명에 따른 구현예에서, 흑색종 환자에서 젖산 탈수소효소의 감소된 수준은 생존 확률의 증가를 나타낸다.
따라서, 본원에 사용된 바와 같이, "여기서, 상기 인간 혈액 샘플 중의 젖산 탈수소효소의 감소된 수준은 생존 확률의 증가를 나타낸다"라는 용어는 인간 혈액 샘플 중의 젖산 탈수소효소의 수준과 생존 확률이 역의 상관관계를 따른다는 것을 의미한다. 따라서, 상기 인간 혈액 샘플 중의 젖산 탈수소효소의 수준이 높을 수록 생존 확률은 더 낮다.
예컨대, 본원에 정의된 본 발명에 따른 예측 방법과 관련하여, 젖산 탈수소효소 역치 수준이 사용될 수 있다.
본 발명에 따르면, 젖산 탈수소효소 수준과 생존 확률 사이의 역의 상관관계가 임의의 역치 값에 적용되므로, 본 발명은 특정 역치 값으로 제한되지 않는다.
대안적으로, 본 발명에 따른 젖산 탈수소효소 역치 수준은 전술된 통계학적 방법, 예컨대 실시예 1의 방법을 사용하여 수득 및/또는 추가로 조정될 수 있다.
젖산 탈수소효소 역치 수준은 단일 젖산 탈수소효소 역치 수준일 수 있다. 본 발명은 또한 하나 이상의 젖산 탈수소효소 역치 수준, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 젖산 탈수소효소 역치 수준을 포함한다.
하나 이상의 젖산 탈수소효소 역치 수준의 각각의 단일 젖산 탈수소효소 역치 수준에 대해, 상응하는 생존 확률이 예측될 수 있다.
본 발명에 따르면, 바람직한 젖산 탈수소효소 역치 수준은 바람직한 구현예에서 상기 정의된 젖산 탈수소효소 혈청 수준이다.
매우 바람직한 구현예에서, 젖산 탈수소효소 역치 수준은 환자에서 정상 LDH 수준과 상승된 LDH 수준 사이를 구분하는 임상적으로 허용되는 역치 수준이다. 이러한 매우 바람직한 임상적으로 허용되는 역치 수준이 당해 기술 분야에 공지되어 있고, LDH 시험의 특정 특이성과 관련하여 당업자에 의해 선택될 것이다.
이러한 젖산 탈수소효소 혈청 수준 및 본원에 제공된 본 발명의 개시에 기초하여, 다른 혈액 샘플 중에 상응하는 젖산 탈수소효소 수준이 당업자에 의해 일상적으로 수득될 수 있다 (예컨대 혈청 중의 젖산 탈수소효소의 상대적 수준을 다른 혈액 샘플 중의 각각의 수준과 비교함으로써). 따라서, 본 발명은 또한 혈장, 전혈 및 다른 혈액 샘플 중의 바람직한 젖산 탈수소효소 수준을 포함하며, 이들은 각각의 바람직한 젖산 탈수소효소 혈청 수준 및 상기 지시된 범위에 해당한다.
S100B 수준
본 발명의 추가의 유리한 양태에서, 인간 흑색종 환자에서 S100B 수준과 긍정적인 임상 경과의 확률, 특히 생존 확률 사이에는 또한 역의 상관관계가 있다. 따라서, 본 발명에 따른 구현예에서, 인간 흑색종 환자에서 S100B의 감소된 수준은 생존 확률의 증가를 의미한다.
따라서, 본원에 사용된 바와 같이, "상기 인간 혈액 샘플내 S100B 수준 감소는 생존 확률의 증가를 의미한다"라는 표현은 상기 인간 혈액 샘플 중의 S100B의 수준과 생존 확률이 역의 상관관계를 따른다는 것을 의미한다. 따라서, 상기 인간 혈액 샘플 중의 S100B의 수준이 높을수록 생존 확률이 더 낮다.
예컨대, 본원에 정의된 본 발명에 따른 예측 방법과 관련하여, S100B 역치 수준이 사용될 수 있다.
본 발명에 따르면, S100B 수준과 생존 확률의 역의 상관관계가 임의의 역치 값에 적용되므로, 본 발명은 특정 역치 값에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 S100B 역치 수준은, 예컨대 전술된 통계학적 방법, 예컨대 실시예 1의 방법을 사용하여 수득 및/또는 추가로 조정될 수 있다.
S100B 역치 수준은 단일 S100B 역치 수준일 수 있다. 본 발명은 또한 하나 이상의 S100B 역치 수준, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 S100B 역치 수준의 사용을 포함한다.
매우 바람직한 구현예에서, S100B 역치 수준은 환자에서 정상 S100B 수준과 상승된 S100B 수준 사이를 구분하는 임상적으로 허용되는 역치 수준이다. 이러한 매우 바람직한 임상적으로 허용되는 역치 수준이 당해 기술 분야에 공지되어 있고, S100B 시험의 특정 특이성과 관련하여 당업자에 의해 선택될 것이다.
하나 이상의 S100B 역치 수준의 각각의 단일 S100B 역치 수준에 대해, 상응하는 생존 확률이 예측될 수 있다.
혈액 샘플 중의 S100B 수준은 당해 기술 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 측정될 수 있다. 이러한 방법은 항체-기반 분석법을 포함한다. 혈액 샘플 중의 S100B 수준을 측정하는 바람직한 방법은, 예컨대 ELECSYS S100 전기화학발광 면역분석법의 사용에 의한, 전기화학발광 분석법에 의한 S100B 혈청 수준의 측정이다. S100B 수준의 측정 방법의 추가의 비-제한적인 예가 Goncalves et al.: "Biological and methodological features of the measurement of S100B, a putative marker of brain injury." Clinical Biochemistry 41 (2008) 755-763)에 주어져 있다.
본 발명에 따라 사용될 수 있는 hGDF-15에 결합할 수 있는 항체
본 발명의 방법, 장치 및 키트는 상기 정의된 hGDF-15에 결합할 수 있는 하나 이상의 항체 또는 이의 항원-결합 영역를 사용할 수 있다.
인간 GDF-15 단백질이 단일클론 항체에 의해 유리하게 표적화될 수 있고 (WO2014/049087, 이는 그 전체가 참조로써 본원에 포함됨), 이러한 항체는 인간 GDF-15에 높은 결합 친화도를 비롯한 유리한 특성을 가지며, 이는 재조합 인간 GDF-15에 대해 약 790pM의 평형 해리 상수에 의해 입증된다 (예컨대 참조예 1 참조). 따라서, 바람직한 구현예에서, 본 발명은 hGDF-15에 결합할 수 있는 항체 또는 이의 항원-결합 영역을 사용한다. 바람직하게는, 항체는 hGDF-15에 결합할 수 있는 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 영역이다.
따라서, 보다 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 hGDF-15에 결합할 수 있는 항체 또는 이의 항원-결합 영역은 인간 GDF-15에 결합할 수 있는 단일클론 항체이거나 이의 항원-결합 영역이고, 여기서, 중쇄 가변 도메인은 서열번호 5의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 영역을 포함하고, 여기서 경쇄 가변 도메인은 서열번호 7의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 영역을 포함한다. 이러한 구현예에서, 바람직하게는, 항체 또는 이의 항원-결합 영역은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 영역 및 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 영역을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하고, 항체 또는 이의 항원-결합 영역은 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 영역, 및 ser-ala-ser 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 영역을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
따라서, 보다 더 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 hGDF-15에 결합할 수 있는 항체 또는 이의 항원-결합 영역은 인간 GDF-15에 결합할 수 있는 단일클론 항체, 또는 이의 항원-결합 영역이며, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 영역은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 영역, 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 영역 및 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하고, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 영역은 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 영역, ser-ala-ser 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 영역 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
인간 GDF-15에 결합할 수 있는 단일클론 항체, 또는 이의 항원-결합 영역의 상기 구현예에 따른 또 다른 구현예에서, 중쇄 가변 도메인은 FR1, CDR1, FR2, CDR2 및 FR3 영역을 포함하고 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이와 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 서열을 포함하는 영역을 포함하고, 경쇄 가변 도메인은 FR1, CDR1, FR2, CDR2 및 FR3 영역을 포함하고 서열번호 2의 아미노산 서열 또는 이와 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 서열을 포함하는 영역을 포함한다.
인간 GDF-15에 결합할 수 있는 단일클론 항체, 또는 이의 항원-결합 영역의 상기 구현예에 따른 또 다른 구현예에서, 중쇄 가변 도메인은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 영역 및 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 영역을 포함하고, 경쇄 가변 도메인은 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 영역 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 영역을 포함한다. 이러한 구현예의 바람직한 양태에서, 항체는 전술된 본 발명의 임의의 구현예에 정의된 CDR3 서열을 포함할 수 있다.
인간 GDF-15에 결합할 수 있는 단일클론 항체, 또는 이의 항원-결합 영역의 상기 구현예에 따른 또 다른 구현예에서, 항원-결합 영역은 단일-도메인 항체 ("나노바디(Nanobody)TM로도 지칭됨")이다. 이러한 구현예의 일 양태에서, 단일-도메인 항체는 각각 서열번호 3, 서열번호 4, 및 서열번호 5의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 아미노산 서열을 포함한다. 이러한 구현예의 또 다른 양태에서, 단일-도메인 항체는 각각 서열번호 6, ser-ala-ser, 및 서열번호 7의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 아미노산 서열을 포함한다. 이러한 구현예의 바람직한 양태에서, 단일-도메인 항체는 인간화 항체이다.
바람직하게는, 인간 GDF-15에 결합할 수 있는 항체 또는 이의 항원-결합 영역은 100 nM 이하, 20 nM 이하, 바람직하게는 10 nM 이하, 보다 바람직하게는 5 nM 이하 및 가장 바람직하게는 0.1 nM 내지 2 nM인 인간 GDF-15에 대한 평형 해리 상수를 갖는다.
인간 GDF-15에 결합할 수 있는 단일클론 항체, 또는 이의 항원-결합 영역의 상기 구현예에 따른 또 다른 구현예에서, 인간 GDF-15에 결합할 수 있는 항체 또는 이의 항원-결합 영역은 Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DMSZ)에 기탁번호 DSM ACC3142로 기탁된 세포주 B1-23으로부터 수득될 수 있는 인간 GDF-15에 대한 항체와 동일한 인간 GDF-15 에피토프에 결합한다. 본원에 기술된 바와 같이, 본 발명에 따른 인간 GDF-15에 결합하는 항체는 바람직하게는 참조예 1에 기술된 절차에 따라, 참조 표준 방법과 같은 표면 플라즈몬 공명 측정에 의해 평가된다. 인간 GDF-15 상의 동일한 에피토프에 대한 결합은 세포주 B1-23으로부터 수득될 수 있는 인간 GDF-15에 대한 항체 및 세포주 B1-23으로부터 수득될 수 있는 인간 GDF-15에 대한 항체와 동일한 인간 GDF-15 에피토프에 결합할 것으로 예측되는 항체의 표면 플라즈몬 공명 경쟁적 결합 실험에 의해 유사하게 평가될 수 있다.
매우 바람직한 구현예에서, 인간 GDF-15에 결합할 수 있는 항체 또는 이의 항원-결합 영역은 인간 GDF-15에 결합할 수 있는 단일클론 항체, 또는 이의 항원-결합 영역이며, 여기서, 이러한 결합은 서열번호 25 및 서열번호 26의 아미노산 서열에 의해 포함된 인간 GDF-15 상의 입체형태적 또는 불연속 에피토프로의 결합이다. 이러한 구현예의 바람직한 양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 영역은 상기 구현예 중 임의의 하나의 서열에 의해 정의된 항체 또는 이의 항원-결합 영역이다.
상기 구현예에 따른 추가의 구현예에서, 인간 GDF-15에 결합할 수 있는 항체 또는 이의 항원-결합 영역을 비롯한 항체는, 예컨대 테그 또는 표지에 의해 변형될 수 있다.
테그는, 예컨대 비오틴 테그 또는 아미노산 테그일 수 있다. 이러한 산 테그 테그의 비-제한적인 예는 폴리히스티딘 (His-) 테그, FLAG-테그, 헤마글루티닌 (HA) 테그, 당단백질 D (gD) 테그, 및 c-myc 테그를 포함한다. 테그는 다양한 목적을 위해 사용될 수 있다. 예컨대, 테그는 인간 GDF-15에 결합할 수 있는 항체 또는 이의 항원-결합 영역의 정제를 돕기 위해 사용될 수 있다. 바람직하게는, 이러한 테그는 인간 GDF-15에 결합할 수 있는 항체 또는 이의 항원-결합 영역의 C-말단 또는 N-말단에 존재한다.
본원에 사용된 용어 "표지"는 항체의 검출을 용이하게 할 수 있는 임의의 분자 또는 분자의 군을 지칭한다. 예컨대, 표지는 효소 예컨대 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP), 알칼린 포스파타제 (AP) 또는 글루코스 옥시다제일 수 있다. 효소적으로 표지된 항체는, 예컨대 효소-연계된 면역흡착 분석법에서 사용될 수 있다. 표지는 또한 방사선 동위원소, DNA 서열 (이는 예컨대 중합효소 쇄 반응 (PCR)에 의해 항체를 검출하기 위해 사용될 수 있음), 형광생성 리포터 및 전기화학발광 기 (예컨대 루테늄 복합체)일 수 있다. 표지화에 대한 대안으로서, 본 발명에 따라 사용된 항체, 특히 인간 GDF-15에 결합할 수 있는 항체 또는 이의 항원-결합 영역은 예컨대 표면 플라즈몬 공명 측정에 의해 직접적으로 검출될 수 있다.
방법 및 기술
일반적으로, 본원에서 달리 정의되지 않은 한, 본 발명에서 사용된 방법 (예컨대, 클로닝 방법 또는 항체와 관련된 방법)은 당해 기술 분야에 공지된 절차, 예컨대 Sambrook et al. ("Molecular Cloning: A Laboratory Manual.", 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York 1989), Ausubel et al. ("Current Protocols in Molecular Biology." Greene Publishing Associates and Wiley Interscience; New York 1992), 및 Harlow and Lane ("Antibodies: A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York 1988)에 기술된 절차 (이들 모두는 참조로써 본원에 포함되어 있음)에 따라 수행된다.
항체의 이의 각각의 표적 단백질로의 결합은 당해 기술 분야에 공지된 방법에 의해 평가될 수 있다. 단일클론 항체의 이의 각각의 표적에 대한 결합은 바람직하게는 표면 플라즈몬 공명 측정에 의해 평가된다. 이러한 방법은 바람직하게는, 참조예 1에서 항-인간 GDF-15 mAb-B1-23에 대해 예시된 바와 같이, Biorad ProteOn XPR36 시스템 및 Biorad GLC 센서 칩을 사용하여 수행된다.
본 발명에 따른 서열의 서열 정렬은 BLAST 알고리즘을 사용하여 수행된다 (다음을 참조: Altschul et al.(1990) "Basic local alignment search tool." Journal of Molecular Biology 215. p. 403-410.; Altschul et al.: (1997) Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res. 25:3389-3402., 이들 모두는 참조로써 본원에 포함되어 있음). 바람직하게는, 다음의 파라미터가 사용된다: 최대 표적 서열 10 (Max target sequences 10); 단어 크기 3 (Word size 3); BLOSUM 62 매트릭스 (matrix); 갭 값(gap costs): 존재 11 (existence 11), 연장 (extension 1); 조건부 구성 점수 매트릭스 조정 (conditional compositional score matrix adjustment). 따라서, 서열과 관련하여 사용되는 경우, 용어 "동일성" 또는 "동일한"은 BLAST 알고리즘을 사용하여 수득된 동일성 값을 지칭한다.
본 발명에 따른 단일클론 항체는, Siegel DL ("Recombinant monoclonal antibody technology." Transfus Clin Biol. 2002 Jan;9(1):15-22.,이는 참조로써 본원에 포함됨)에 언급된 방법을 비제한적으로 포함하여, 당해 기술 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 생산될 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명에 따른 항체는 부다페스트 조약 하에 기탁 번호 DSM ACC3142로 Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ)에 기탁된 하이브리도마 세포주 B1-23에 의해 생산된다. 이러한 기탁은 2011년 9월 29일에 제출되었다.
인간 GDF-15 (hGDF-15)의 수준은, 인간 GDF-15로부터 유래된 단백질 또는 펩티드에 대한 질량 분광법, 인간 GDF-15에 특이적인 항체를 사용하는 웨스턴 블롯, 인간 GDF-15에 특이적인 항체를 사용하는 스트립 테스트, 또는 인간 GDF-15에 특이적인 항체를 사용하는 면역화학을 포함하는 (그러나 이에 제한되지 않음) 방법에 의해 hGDF-15 단백질의 측정을 포함하여, 당해 기술 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 측정될 수 있다. hGDF-15 혈청 수준을 측정하는 바람직한 방법은 GDF-15에 대한 항체의 사용에 의한 효소-연계된 면역흡착 분석법 (ELISA)에 의한 hGDF-15 혈청 수준의 측정이다. 이러한 ELISA 방법이 실시예 1에 예시되어 있다. 대안적으로, hGDF-15 혈청 수준은 hGDF-15에 대한 항체를 사용하는 공지된 전기화학발광 면역분석법에 의해 결정될 수 있다. 예컨대 Roche Elecsys® 기술이 이러한 전기화학발광 면역분석법에서 사용될 수 있다.
본 발명의 장치
본 발명은 또한 상기 정의된 장치에 관한 것이다.
본 발명의 장치는 본 발명의 방법을 수행하기 위해 구성된 임의의 장치일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "수행하도록 구성된"은 언급된 방법의 단계를 위해 특별히 구성된 장치를 의미한다. 예컨대, 특정 역치 수준을 사용하는 방법을 수행하도록 구성된 장치는 그러한 특정 역치를 사용하도록 특별히 구성될 것이다.
바람직한 구현예에서, 장치는 전기화학발광 분석기, 예컨대 Cobas® 분석기이다. 이러한 구현예에서, LDH가 측정되는 경우, 이는, 예컨대 전기화학발광 분석기가 아니고, LDH 측정 예컨대 효소 시험을 수행하기 위해 구성된 추가의 장치 상에서 측정될 수 있다. 따라서, 이러한 구현예의 바람직한 양태에서, 본 발명의 전기화학발광 분석기는 LDH 수준의 측정을 제외하고 본 발명의 방법을 수행하도록 구성된다.
본 발명의 키트
본 발명은 또한 상기 정의된 키트에 관한 것이다.
이러한 키트에 포함된 재조합 hGDF-15는 보정 (calibration) 목적으로 편리하게 사용될 수 있는 형태로 존재할 수 있다. 예컨대, 이는 0 내지 15 ng/ml 내의 범위인 몇몇 농도, 예컨대 0 내지 1 ng/ml의 범위 내의 적어도 하나의 농도, 1 내지 3 ng/ml의 범위 내의 적어도 하나의 농도, 3 내지 6 ng/ml의 범위 내의 적어도 하나의 농도, 및 바람직하게는 6 내지 10 ng/ml의 범위 내의 적어도 하나의 추가의 농도를 커버하는, 및 보다 바람직하게는 10 내지 15 ng/ml의 범위 내의 적어도 하나의 추가의 농도를 추가로 포함하는 저장 용액의 형태로 존재할 수 있다.
서열
본 발명에 언급된 아미노산 서열은 다음과 같다 (N-말단에서 C-말단 순서로; 1-글자 아미노산 코드로 제시됨):
서열번호 1 (단일클론 항-인간 GDF-15 mAb-B1-23의 폴리펩티드 서열로부터의 FR1, CDR1, FR2, CDR2 및 FR3 영역을 포함하는 중쇄 가변 도메인 영역):
QVKLQQSGPGILQSSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGVSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPTLKSRLTISKDPSRNQVFLKITSVDTADTATYYC
서열번호 2 (단일클론 항-인간 GDF-15 mAb-B1-23의 폴리펩티드 서열로부터의 FR1, CDR1, FR2, CDR2 및 FR3 영역을 포함하는 경쇄 가변 도메인 영역):
DIVLTQSPKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWFLQKPGQSPKALIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFC
서열번호 3 (단일클론 항-인간 GDF-15 mAb-B1-23의 중쇄 CDR1 영역 펩티드 서열):
GFSLSTSGMG
서열번호 4 (단일클론 항-인간 GDF-15 mAb-B1-23의 중쇄 CDR2 영역 펩티드 서열):
IYWDDDK
서열번호 5 (단일클론 항-인간 GDF-15 mAb-B1-23의 중쇄 CDR3 영역 펩티드 서열):
ARSSYGAMDY
서열번호 6 (단일클론 항-인간 GDF-15 mAb-B1-23의 경쇄 CDR1 영역 펩티드 서열):
QNVGTN
단일클론 항-인간 GDF-15 mAb-B1-23의 경쇄 CDR2 영역 펩티드 서열:
SAS
서열번호 7 (단일클론 항-인간 GDF-15 mAb-B1-23의 경쇄 CDR3 영역 펩티드 서열):
QQYNNFPYT
서열번호 8 (재조합 성숙 인간 GDF-15 단백질):
GSARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI
서열번호 9 (인간 GDF-15 전구체 단백질):
MPGQELRTVNGSQMLLVLLVLSWLPHGGALSLAEASRASFPGPSELHSEDSRFRELRKRYEDLLTRLRANQSWEDSNTDLVPAPAVRILTPEVRLGSGGHLHLRISRAALPEGLPEASRLHRALFRLSPTASRSWDVTRPLRRQLSLARPQAPALHLRLSPPPSQSDQLLAESSSARPQLELHLRPQAARGRRRARARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI
서열번호 10 (인간 GDF-15 전구체 단백질 + N-말단 및 C-말단 GSGS 링커):
GSGSGSGMPGQELRTVNGSQMLLVLLVLSWLPHGGALSLAEASRASFPGPSELHSEDSRFRELRKRYEDLLTRLRANQSWEDSNTDLVPAPAVRILTPEVRLGSGGHLHLRISRAALPEGLPEASRLHRALFRLSPTASRSWDVTRPLRRQLSLARPQAPALHLRLSPPPSQSDQLLAESSSARPQLELHLRPQAARGRRRARARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCIGSGSGSG
서열번호 11 (플래그 (Flag) 펩티드): DYKDDDDKGG
서열번호 12 (HA 펩티드): YPYDVPDYAG
서열번호 13 (인간 GDF-15로부터 유래된 펩티드): ELHLRPQAARGRR
서열번호 14 (인간 GDF-15로부터 유래된 펩티드): LHLRPQAARGRRR
서열번호 15 (인간 GDF-15로부터 유래된 펩티드): HLRPQAARGRRRA
서열번호 16 (인간 GDF-15로부터 유래된 펩티드): LRPQAARGRRRAR
서열번호 17 (인간 GDF-15로부터 유래된 펩티드): RPQAARGRRRARA
서열번호 18 (인간 GDF-15로부터 유래된 펩티드): PQAARGRRRARAR
서열번호 19 (인간 GDF-15로부터 유래된 펩티드): QAARGRRRARARN
서열번호 20 (인간 GDF-15로부터 유래된 펩티드): MHAQIKTSLHRLK
서열번호 25 (B1-23에 결합하는 GDF-15 에피토프의 부분을 포함하는 GDF-15 펩티드):
EVQVTMCIGACPSQFR
서열번호 26 (B1-23에 결합하는 GDF-15 에피토프의 부분을 포함하는 GDF-15 펩티드):
TDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI
본 발명에서 언급된 핵산 서열은 다음과 같다 (5'에서 3' 순서로; 표준 핵산 코드에 따라 제시됨):
서열번호 21 (서열번호 1에 정의된 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 뉴클레오티드 서열):
CAAGTGAAGCTGCAGCAGTCAGGCCCTGGGATATTGCAGTCCTCCCAGACCCTCAGTCTGACTTGTTCTTTCTCTGGGTTTTCACTGAGTACTTCTGGTATGGGTGTGAGCTGGATTCGTCAGCCTTCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGCACACATTTACTGGGATGATGACAAGCGCTATAACCCAACCCTGAAGAGCCGGCTCACAATCTCCAAGGATCCCTCCAGAAACCAGGTATTCCTCAAGATCACCAGTGTGGACACTGCAGATACTGCCACATACTACTGT
서열번호 22 (서열번호 2에 정의된 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 뉴클레오티드 서열):
GACATTGTGCTCACCCAGTCTCCAAAATTCATGTCCACATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCGTCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATGTGGGTACTAATGTGGCCTGGTTTCTACAGAAACCAGGGCAATCTCCTAAAGCACTTATTTACTCGGCATCCTACCGGTACAGTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAACGTGCAGTCTGAAGACTTGGCAGAGTATTTCTGT
서열번호 23 (서열번호 5에 정의된 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 뉴클레오티드 서열):
GCTCGAAGTTCCTACGGGGCAATGGACTAC
서열번호 24 (서열번호 7에 정의된 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 뉴클레오티드 서열):
CAGCAATATAACAACTTTCCGTACACG
실시예
참조예 1 내지 3은 본 발명에 따른 방법, 키트 및 장치에서 사용될 수 있는 hGDF-15에 대한 항체를 예시한다. 이러한 hGDF-15 항체는 그 전체가 참조로써 본원에 포함된 WO 2014/049087로부터 공지된 단일클론 항체이다.
참조예 1 : GDF-15 항체 B1-23의 생산 및 특성분석
항체 B1-23을 GDF-15 넉아웃 마우스에서 생산하였다. 재조합 인간 GDF-15 (서열번호 8)를 면역원으로서 사용하였다.
mAb-B1-23을 생산하는 하이브리도마 세포주 B1-23을 부다페스트 조약에 따라, 독일 뷔르츠부르크 97070, 샌더링 2 소재, 율리우스-막시밀리안스-대학교 뷔르츠부르크 (Julius-Maximilians-Universitat Wurzburg)에 의해, 기탁번호 DSM ACC3142로 Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DMSZ)에 기탁하였다.
상업적으로 이용가능한 시험 스트립 시스템을 사용하여, B1-23을 IgG2a (카파 쇄) 이소형으로서 단리하였다. 표면 플라즈몬 공명 측정을 사용하여, 해리 상수 (Kd)를 다음과 같이 결정하였다:
본 발명에 따른 단일클론 항-인간-GDF-15 항체인 항-인간 GDF-15 mAb-B1-23의 결합을 Biorad ProteOn XPR36 시스템 및 Biorad GLC 센서 칩을 사용하여 표면 플라즈몬 공명 측정을 사용하여 측정하였다:
바이오센서를 제조하기 위해, 재조합 성숙 인간 GDF-15 단백질을 플로우 셀 (flow cell) 1 및 2에 고정시켰다. 하나의 플로우 셀에서, 배큘로바이러스-형질감염된 곤충 세포 (HighFive 곤충 세포)로부터 유래된 재조합 GDF-15 및 E. coli에서 발현으로부터 유래된 다른 재조합 단백질을 사용하였다. GLC 센서 칩을 제조사의 추천에 따라 설포-NHS (N-히드록시설포숙신이미드) 및 EDC (1-에틸-3-[3-다이메틸아미노프로필]카보다이이미드 히드로클로라이드) (Biorad ProteOn 아민 커플링 키트)를 사용하여 활성화시키고, 이어서 센서 표면을 약 600RU (1Ru = 1pg mm-2)의 밀도 까지 단백질로 로딩하였다. 이어서, 미-반응된 커플링 기를 1M 에탄올아민 pH 8.5로 관류하여 퀀칭하고, 바이오센서를 러닝 완충액 (10M HEPES, 150mM NaCl, 3.4mM EDTA, 0.005% Tween-20, pH 7.4, HBS150로 지칭됨)을 사용하여 칩을 관류시켜 평형화하였다. 대조군으로서 2개의 플로우 셀을 사용하였는데, 하나는 단백질이 결합되지 않아 비어있었고, 다른 하나는 비-생리적인 단백질 파트너 (인간 인터류킨-5)와 결합되었으며, 이는 동일한 커플링 화학 및 동일한 커플링 밀도를 사용하여 고정화되었다. 상호작용 측정을 위해, 항-인간 GDF-15 mAb-B1-23을 HBS150 중에 용해하고 분석물로서 6개의 상이한 농도에서 사용하였다 (농도: 0.4, 0.8, 3, 12, 49 및 98 nM). 간헐적인 재생을 피하기 위해 원-샷 동력학 설정을 사용하여 바이오센서 상에서 분석물을 관류하여, 모든 측정을 25 ℃에서 100 ㎕ 분-1의 유속을 사용하여 수행하였다. 처리를 위해, 벌크 페이스 효과 및 센서 매트릭스에 대한 비특이적인 결합을 다른 모든 SPR 데이터로부터 빈 플로우 셀 (플로우 셀 3)의 SPR 데이터를 빼서 제거하였다. 생성된 센소그램(sensogram)을 ProteOn Manager 소프트웨어 버전 3.0을 사용하여 분석하였다. 결합 동력학의 분석을 위해, 1:1 랑그뮈어(Langmuir)-유형 상호작용을 가정하였다. 결합 속도 상수에 대한 5.4±0.06x105 M-1s-1 (kon) 값, 및 해리 속도 상수에 대한 4.3±0.03x10-4 s-1 (koff) 값이 결정될 수 있다 (값은 항-인간 GDF-15 mAb-B1-23과 곤충 세포 발현으로부터 유도된 GDF-15의 상호작용에 대한 것임). 평형 해리 상수를 식 KD = koff/kon을 사용하여 계산하여 약 790pM의 값을 산출하였다. E. coli 발현으로부터 유래된 GDF-15와 항-인간 GDF-15 mAb-B1-23의 상호작용에 대한 친화도 값은 약 45% 벗어나서 곤충 세포 및 E. coli에서 유래된 GDF-15에 대한 속도 상수가 2의 인자 미만으로 상이하므로, SPR 측정의 정확도 내에서 그리고 친화도의 실제 차이를 반영하지 않을 가능성이 있다. 사용된 조건 하에서, 항-인간 GDF-15 mAb-B1-23은 인간 인터류킨-5에 대한 결합을 나타내지 않으므로, 상호작용 데이터 및 항-인간 GDF-15 mAb-B1-23의 특이성을 확인하였다.
재조합 인간 GDF-15 (배큘로바이러스-형질감염된 곤충 세포에서 발현됨)의 아미노산 서열은 다음과 같다:
GSARNGDHCP LGPGRCCRLH TVRASLEDLG WADWVLSPRE VQVTMCIGAC PSQFRAANMH AQIKTSLHRL KPDTVPAPCC VPASYNPMVL IQKTDTGVSL QTYDDLLAKD CHCI (서열번호 8)
따라서, 표면 플라스몬 공명 측정을 사용하여, 790pM의 해리 상수 (Kd)를 결정하였다. 비교로서: 치료학적으로 사용한 항체 리툭시맵 (Rituximab)은 유의하게 더 낮은 친화도를 갖는다 (Kd = 8 nM).
이전에, mAb B1-23이 시험관내에서 암 세포 증식을 억제하고, mAb B1-23이 생체 내에서 종양 성장을 억제한다는 것이 밝혀졌다 (WO2014/049087).
참조예 2 : mAb B1-23은 인간 GDF-15의 입체형태적 또는 불연속적 에피토프를 인지한다.
에피토프 맵핑: GDF-15로부터 유래된 13량체 선형 펩티드에 대한 단일클론 마우스 항체 GDF-15
항원: GDF-15:
GSGSGSGMPGQELRTVNGSQMLLVLLVLSWLPHGGALSLAEASRASFPGPSELHSEDSRFRELRKRYEDLLTRLRANQSWEDSNTDLVPAPAVRILTPEVRLGSGGHLHLRISRAALPEGLPEASRLHRALFRLSPTASRSWDVTRPLRRQLSLARPQAPALHLRLSPPPSQSDQLLAESSSARPQLELHLRPQAARGRRRARARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCIGSGSGSG (링커가 포함된 322개 아미노산)(서열번호 10)
단백질 서열은 1개의 아미노산 서열 이동을 가진 13량체 펩티드로 번역되었다. 절단된 펩티드를 피하기 위해 천연 GSGS 링커에 의해 C-말단 및 N-말단을 연장시켰다 (굵은 글자).
대조군 펩티드:
플래그: DYKDDDDKGG (서열번호13), 78개 지점; HA: YPYDVPDYAG (서열번호14), 78개 지점 (각각의 어레이 사본)
펩티드 칩 식별자:
000264_01 (10/90, Ala2Asp 링커)
염색 조건:
표준 완충액: PBS, pH 7.4 + 0.05% Tween 20
차단 완충액: Rockland 차단 완충액 MB-070
인큐베이션 완충액: 10% Rockland 차단 완충액 MB-070이 포함된 표준 완충액
1차 샘플: 단일클론 마우스 항체 GDF-15 (1 ㎍/ ㎕): 1:100의 희석에서 4 ℃에서 16시간 동안 인큐베이션 완충액 중에서 염색하고 500 rpm에서 약하게 진탕
2차 항체: 염소 항-마우스 (H+L) IRDye680, 인큐베이션 완충액 중에서 1:5000의 희석으로 실온(RT)에서 30분 동안 염색
대조군 항체: 단일클론 항-HA (12CA5)-LL-Atto 680 (1:1000), 단일클론 항-FLAG(M2)-FluoProbes752 (1:1000); 실온(RT)에서 1시간 동안 인큐베이션 완충액 중에서 염색
스캐너:
Odyssey 영상화 시스템, LI-COR Biosciences
설정: 오프셋: 1mm; 해상도: 21 μm; 강도 녹/적: 7/7
결과:
표준 완충액 중에서 30분 간 사전 팽창하고 차단 완충액 중에서 30분 후에, 10, 12 및 15mer B7H3-유도된 선형 펩티드를 가진 펩티드 어레이를 희석 시에만 2차 염소 항-마우스 IgG (H+L) IRDye680 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하여 2차 항체의 배경 상호작용을 분석하였다. PEPperCHIP®을 표준 완충액으로 2x1분 세척하고 정제수로 헹구고 공기 흐름으로 건조시켰다. Odyssey 영상화 시스템으로 21 μm에서 적/녹 강도 7/7에서 판독을 수행하였다: 우리는, 하전된 항체 염료로 인한 이온 상호작으로 인한, 빈번한 결합제로 공지되어 있는 아르기닌-풍부 펩티드 (ELHLRPQAARGRR (서열번호15), LHLRPQAARGRRR (서열번호16), HLRPQAARGRRRA (서열번호17), LRPQAARGRRRAR (서열번호18), RPQAARGRRRARA (서열번호19), PQAARGRRRARAR (서열번호20) 및 QAARGRRRARARN (서열번호21))와 염기성 펩티드 MHAQIKTSLHRLK (서열번호22)의 약한 상호작용을 관찰하였다.
표준 완충액 중에서 10분 동안 사전-팽창시킨 후, 펩티드 마이크로어레이를 1:100의 희석인 단일클론 마우스 항체 GDF-15와 함께 4 ℃에서 밤새 인큐베이션 하였다. 표준 완충액 중에서 반복된 세척 (2x1분)을 수행한 후 실온에서 1:5000의 희석인 2차 항체와 함께 30분 동안 인큐베이션 하였다. 표준 완충액 중에서 2x10초 세척 및 정제수로 짧게 세척한 후, PEPperCHIP®을 공기 흐름에서 건조시켰다. Odyssey 영상화 시스템으로 21 μm의 해상도 및 적/녹 강도 7/7에서 항-HA 및 항-FLAG(M2) 항체에 의한 대조군 펩티드로 염색하기 전 및 염색한 후에 판독을 수행하였다.
GDF-15로부터 유래된 선형 13량체 펩티드 중 어느 것도 과도로 조절된 강도에서 단일클론 마우스 항체 GDF-15와 상호작용하지 않는 것으로 나타났다. 그러나, 어레이를 프레임화하는 플래그 및 HA 대조군 펩티드의 염색은 우수하고 균질한 지점 강도를 상승시켰다.
종합:
GDF-15에 대한 단일클론 마우스 GDF-15 항체의 에피토프 맵핑은 항원으로부터 유도된 13mer 펩티드를 갖는 어떠한 선형 에피토프도 나타내지 않았다. 이러한 발견에 따르면, 단일클론 마우스 항체 GDF-15가 부분 에피트포의 낮은 친화도를 갖는 입체형태적 또는 불연속적 에피토프를 인식할 가능성은 매우 높다. 2차 항체의 배경 염색 위에서만 GDF-15 신호가 명백하게 전혀 없기 때문에, PepSlide® 분석기를 사용한 지점 강도의 정량화 및 후속 펩티드 주석을 생략하였다.
참조예 3 : 질량 분광적 에피토프 적출 및 에피토프 추출에 의한 펩티드 리간드 에피토프의 구조적 동정
항체 B1-23에 결합하는 재조합 인간 GDF-15의 에피토프를 에피토프 적출 방법 및 에피토프 추출 방법에 의해 동정하였다 (Suckau et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 1990 December; 87(24): 9848-9852.; R.Stefanescu et al., Eur.J.Mass Spectrom. 13, 69-75 (2007)).
항체 컬럼의 제조를 위해, 항체 B1-23을 NHS-활성화된 6-아미노헥산 결합된 세파로즈에 첨가하였다. 세파로즈-결합된 항체 B1-23을 이어서 0.8 ml 마이크로컬럼 내로 로딩하고 차단 및 세척 완충액으로 세척하였다.
에피토프 추출 실험:
재조합 인간 GDF-15을 37 ℃에서 2시간 동안 트립신으로 소화시켜서 (용액 중에서), 단백질 중의 트립신 절단 부위에 따른 상이한 펩티드를 생성하였다. 완전한 소화 후에, 펩티드를 고정된 항체 B1-23을 함유하는 친화도 컬럼 상에 로딩하였다. 부착되지 않은 것 및 잠재적으로 부착된 GDF-15 펩티드를 질량 분광 분석에서 사용하였다. 질량 분광법을 이용한 펩티드의 단리는 불가능하였다. 이는 면역 복합체 B1-23 중의 GDF-15의 결합 영역이 불연속 또는 입체형태적 에피토프를 포함하는 추가의 지표였다. 연속 선형 에피토프의 경우, 소화된 펩티드는 에피토프 펩티드 내에 트립신 절단 부위가 없는 한, 이의 상호작용 파트너와 결합해야 한다. 불연속적 또는 입체형태적 에피토프는 다음의 파트에서 기술된 에피토프 적출 방법에 의해 확인될 수 있다.
에피토프 적출 실험:
이어서, 친화도 컬럼 상의 고정된 항체 B1-23을 2시간 동안 재조합 GDF-15와 함께 인큐베이션 하였다. 이어서, 친화도 컬럼 상에 형성된 면역 복합체를 37 ℃에서 2시간 동안 트립신과 함께 인큐베이션 하였다. 절단은 재조합 GDF-15로부터 유도된 상이한 펩티드를 생성하였다. 고정된 항체 그 자체는 단백질분해적으로 안정하다. 항체에 의해 차폐되고 단백질 분해 절단으로부터 보호된 소화된 GDF-15 단백질의 생성된 펩티드를 산성 조건 하 (TFA, pH2)에서 용리하고, 질량 분광법에 의해 수집 및 단리하였다.
MS/MS 단리를 사용하는 에피토프 적출는 다음의 펩티드를 생성하였다:
펩타이드 서열내 위치 질량 이온/전하
EVQVTMCIGACPSQFR 40-55 1769.91 590.50(3+)
(서열번호 25)
TDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI 94-114 2310,96 771:33(3+)
(서열번호 26)
항체 B1-23에 결합하는 인간 GDF-15의 부분은 불연속 또는 입체형태적 에피토프를 포함한다. 질량 분광법은 면역 복합체의 형성을 담당하는 GDF-15 단백질에서 2개의 펩티드를 확인하였다. 이러한 펩티드는 GDF-15 아미노산 서열에서 위치 40-55 (EVQVTMCIGACPSQFR) 및 94-114 (TDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI)로 제한된다. 따라서, 이러한 2개의 펩티드는 항체 B1-23에 결합하는 GDF-15 단백질의 에피토프를 포함한다.
본 발명은 다음의 비-제한적인 실시예에 의해 설명된다:
실시예 1 :
환자, 재료 및 방법
환자
조직학적으로 확인된 흑색종을 가진, 독일 튀빙겐 대학의 피부과 학과의 환자들을 독일의 60개 이상의 피부과학 센터로부터의 환자를 전향적으로 기록하는 중앙 악성 흑색종 등록 (Central Malignant Melanoma Registry, CMMR) 데이터베이스에서 확인하였다. (a) 2008년 1월 내지 2012년 2월 사이에 취해진 보관된 혈청 샘플, (b) 이용가능한 추적 데이터, 및 (c) 혈액 추출 시점에서 국소 또는 원격 전이의 병력 또는 존재 여부를 가진 761명의 환자를 선별하였다. CMMR에 의한 데이터 수집의 목적과 방법은 이전에 상세하게 공개되어 있다 (Lasithiotakis, KG et al., Cancer / 107 / 1331-9. 2006). 각각의 환자에 대해 수득된 데이터는 연령, 성별, 마지막 추적 데이터, 및 사망일 및 원인을 포함한다 (해당되는 경우). 모든 환자는 CMMR 등록기관에 의해 기록된 임상 데이터를 가지고 있는 서면 동의서를 받았다. 기관 윤리 위원회인 튀빙겐은 이러한 연구를 승인하였다 (윤리 투표 125/2015BO2). 연령, AJCC 분류 (Balch, CM et al., J Clin Oncol / 27 / 6199-206. 2009)에 따른 원격 전이 패턴 (IV 단계 환자에만 해당), 하위 단계 (IIIA 대 IIIB 대 IIIC; III 단계 환자에만 해당), 혈청 LDH 및 혈청 S100B (Elecsys S100 전기화학발광 면역분석법; Roche Diagnostics AG, 스위스 로크르즈 소재)를 혈청 샘플링 시점에서 평가하였다. hGDF-15 혈청 농도를 상업적인 ELISA 키트를 사용하여 제조사의 지침 (R&D systems, 독일 비스바덴 소재)에 따라 2회 중복으로 정량화하였다:
효소-연계된 면역흡착 분석법 (ELISA)에 의한 hGDF -15 혈청 수준 분석:
인간 GDF-15 혈청 수준을 효소-연계된 면역흡착 분석법 (ELISA)으로 측정하였다.
완충액 및 시약:
차단 용액: PBS 중의 1% BSA (분획 V pH 7.0, PAA)
세척 용액: PBS-Tween (0.05%)
표준: 인간 GDF-15 (원액 농도 120 ㎍/ml, R&D Systems로부터)
포획 항체: R&D Systems으로부터의 인간 GDF-15 MAb (클론 147627), 마우스 IgG2B (카탈로그 #MAB957, R&D Systems로부터, 원액 농도 360 ㎍/ml)
검출 항체: 인간 GDF-15 바이오틴화된 친화도 정제된 PAb, 염소 IgG (카탈로그 #BAF940, R&D Systems 로부터, 원액 농도 9 ㎕/ml)
스트렙타비딘-HRP (카탈로그 #DY998, R&D Systems로부터)
기질 용액: 10 ml 0.1 M NaOAc pH6.0 + 100 ㎕ TMB + 2 ㎕ H2O2
정지 용액: 1 M H2SO4
분석 절차:
1. 플레이트 준비:
a. 포획 항체를 PBS 중의 2 ㎍/ml의 작동 농도로 희석하였다. 96-웰 마이크로플레이트 (Nunc maxisorp®)를 외측 줄 (A 및 H)을 제외하고 희석된 포획 항체로 웰 당 50 ㎕ 로 즉시 코팅하였다. A 및 H 줄에 완충액을 채워 실험 동안 샘플의 증발을 방지하였다. 플레이트를 부드럽게 두드려서 각각의 웰의 바닥이 완전히 덮히도록 하였다. 플레이트를 습기가 있는 챔버에 두고 실온 (RT)에서 밤새 인큐베이션 하였다.
b. 각각의 웰을 흡인하고 PBS-Tween (0.05%)으로 3회 세척하였다.
c. 150 ㎕의 차단 용액을 각각의 웰에 첨가하고, RT에서 1시간 동안 인큐베이션 하였다.
d. 각각의 웰을 흡인하고 PBS-Tween (0.05%)으로 3회 세척하였다.
2. 분석 절차:
a. 표준을 제조하였다. GDF-15을 완충된 차단 용액 중에서 희석하여 최종 농도가 1 ng/ml이 되게 하였다 (4.17 ㎕ GDF + 496 ㎕ 완충된 차단 용액). 1:2 연속 희석을 제조하였다.
b. 2회 중복된 샘플 1:20 (6 ㎕ + 114 ㎕ 완충된 차단 용액)을 제조하였다.
c. 50 ㎕의 희석된 샘플 또는 표준을 각각의 웰에 첨가하고, RT에서 1시간 동안 인큐베이션 하였다.
a. 각각의 웰을 흡인하고 PBS-Tween (0.05%)로 3회 세척하였다.
b. 검출 항체를 희석하여 최종 농도가 50 ng/ml이 되게 하였다 (56 ㎕ + 10 ml 완충된 차단 용액). 50 ㎕의 희석된 검출 항체를 각각의 웰에 첨가한 후 RT에서 1시간 동안 인큐베이션 하였다.
c. 각각의 웰을 흡인하고 PBS-Tween (0.05%)으로 3회 세척하였다.
d. 스트렙타비딘-HRP를 1:200으로 희석하였다 (50 ㎕ + 10 ml 차단 완충액). 50 ㎕의 작동 희석의 스트렙타비딘-HRP를 각각의 웰에 첨가한 후 RT에서 20분 동안 인큐베이션 하였다.
e. 각각의 웰을 흡인하고 PBS-Tween (0.05%)으로 3회 세척하였다.
f. 기질 용액을 제조하였다. 50 ㎕의 기질 용액을 각각의 웰에 첨가한 후, RT에서 20분 동안 인큐베이션 하였다.
g. 50 ㎕의 정지 용액을 각각의 웰에 첨가하였다.
h. 450 nm로 설정된 마이크로플레이트 판독기를 사용하여, 각각의 웰의 광학 밀도를 즉시 측정하였다.
3. GDF-15 혈청 역가 계산:
a. 각각의 샘플/GDF-15 표준 희석을 2회 중복으로 적용하였다. GDF-15 역가를 측정하기 위해, 2회 중복의 중간을 계산하고 배경 (GDF-15가 없는 샘플)을 뺐다.
b. 표준 곡선을 생성하기 위해, 선형 범위로부터의 값을 X-Y-다이어그램 상에 플롯팅하고 (X 축: GDF-15 농도, Y 축: OD450), 선형 곡선 맞춤을 적용하였다. 시험 샘플의 GDF-15 혈청 역가를 공지된 농도를 갖는 표준 희석의 OD450 값으로부터 외삽하여 계산하였다.
c. 샘플의 최종 GDF-15 농도를 계산하기 위해, 뚜렷한 희석 인자를 고려하였다. 표준 범위 이하 또는 이상의 OD 값을 생성하는 샘플을 적절한 희석에서 재-분석하였다.
통계학적 분석
생존 분석에 대한 추적 관찰 기간은 혈액 샘플링 날짜로부터 마지막 추적 관찰까지 또는 사망까지로 정의되어 있다. 카플란-마이어에 따른 누적 생존 확률을 95% 신뢰 구간 (CI)과 함께 계산하였고 양면 로그-순위 검정 통계를 사용하여 비교하였다. OS의 분석을 위해, 마지막 추적 관찰에서 생존한 환자를 중도절단한 반면, 사망한 환자를 "사건"으로 간주하였다. OS에 대한 sGDF-15의 영향을 분석하기 위해, 환자를 1:2 비율을 사용하여 2개의 코호트에 무작위로 배정하였다 (각각 식별 및 검증 코호트). 식별 코호트에서, 상이한 컷-오프 지점을 적용하여 sGDF-15에 따라 환자를 각각 25% 이상의 환자를 포함하는 2개의 균형잡힌 군으로 분류하였다. 이전에 공개된 최적화 알고리즘(Camp, RL et al., Clin Cancer Res / 10 / 7252-9. 2004)과 유사하게, 고농도 대 저농도 sGDF-15을 가진 환자 사이의 OS에서의 차이를 각각의 컷오프 지점에 대해 분석하고 가장 낮은 로그 순위 p-값을 생성하는 하나를 선택하였다. 이후에 식별 코호트에서 정의된 최적의 컷-오프 지점을 검증 코호트의 507명 환자에서 분석하였다.
콕스 비례 위험 회귀 분석을 사용하여 전체 환자 코호트에서 추가적인 예후 인자를 고려한 상대 효과를 계산하였다. 연령을 환자의 중간 연령에 따라 이분화하였다. 혈청 S100B 수준 및 sLDH를 임상적 기본에서 사용한 컷-오프 값에 따라 상승된 것 대 정상인 것으로 분류하였다 (각각 정상 0.10 ㎍/l 및 250 U/l의 상한). 누락된 값을 가진 환자를 회귀 분석에서 배제하였다. 모델의 결과를 위험 비율 방법으로 기술하였다; p-값은 월드 검정(Wald test)에 기초하였다. 모든 통계학적 분석은 SPSS Version 22 (IBM SPSS, 미국 일리노이 시키고 소재)를 사용하여 수행하였다.
결과
환자
환자의 특성을 표 1에 나타냈다. 총 761명의 흑색종 환자 (52.0% 남성)를 분석하였다. 중간 연령은 63세였다. 사망한 환자의 중간 추적 관찰은 10.3개월이었고, 중도절단된 환자는 45.3개월이었다.
IV 단계 환자 (n=293)를 원격 전이 부위 및 혈청 LDH (sLDH) (Balch, CM et al., J Clin Oncol / 27 / 6199-206. 2009)에 기초하여 M-분류 M1c (n=206; 70.3%), M1b (n=51; 17.4%), 또는 M1a (n=36; 12.3%)에 배정하였다. 카플란 마이어에 따른 중간 생존 예측은 10.7개월 이었다. 생존 확률은 1년이 46.4%, 2년이 33.3%, 및 3년이 29.3%였다.
총 468명의 III 단계 환자를 포함시켰다. 하위 단계는 분류에 대해 완전한 데이터를 가진 422명의 환자 중 15.6%가 IIIA, 37.2%가 IIIB, 및 47.2%가 IIIC였다. 생존 확률은 각각 1년이 94.4%, 2년이 85.0%, 및 5년이 72.8%였다.
중간 hGDF-15 혈청 농도는 모든 761명의 환자를 고려하여 1.0 ng/mL이었다 (III 단계 환자의 경우 0.9 ng/mL 대 IV 단계 환자의 경우 1.5 ng/mL). 중간 sGDF-15는 2.6 이었다 (III 단계 환자의 경우 1.1 ng/mL 대 IV 단계 환자의 경우 4.8 ng/mL; p<0.001).
hGDF-15 수준에 따른 전체 생존 기간
0.1 ng/mL의 증가분에서 0.7 ng/mL 내지 1.9 ng/mL 범위의 13가지 상이한 컷-오프 지점이 sGDF-15에 따른 식별 코호트 (n=254)의 환자를 2개의 균형잡힌 군으로 분류한다는 것이 밝혀졌다 (보다 작은 군은 적어도 25%의 환자를 포함해야 함). 예후의 차이는 1.5ng/mL 이상의 hGDF-15 수준 및 불량한 OS를 갖는 86명의 환자 (33.9%)를 낮은 수준 및 양호한 OS를 갖는 168명 (66.1%)에 대해 비교했을 때 가장 컸다 (p<0.001; 도 4a). 이어서 sGDF-15에 대한 이러한 컷-오프 지점을 적용한 OS의 차이를 검증 코호트에서 확인하였다 (n=508; p<0.001; 도 4b).
sGDF-15와 OS의 이러한 역 상관 관계는 모든 환자를 고려하였을 때 (두 코호토를 합함) 종양이 없는 III 단계 환자와 절제불가능한 IV 단계 환자에서 관찰되었지만 (도 1a; 1b), 종양이 없는 IV 단계 환자 (도 1c)에서는 관찰되지 않았다.
2개의 코호트 모두의 III 단계 환자를 고려했을 때, 1년, 2년, 및 5년 생존 확률은 1.5 ng/mL 이하의 sGDF-15을 가진 환자(n=369, 모든 III 단계 환자의 78.8%)에 대해 96.1%, 87.8% 및 75.7%였지만, 보다 높은 sGDF-15을 가진 환자 (n=99, 21.2%)의 경우 단지 90.4%, 74.2% 및 61.5%였다 (표 2).
절제불가능한 원격 전이와 높은 hGDF-15 수준을 가진 2개의 코호트의 환자의 경우, 분석 후 1년 생존 확률은 단지 14.3%였지만, 낮은 sGDF-15을 가진 환자의 경우 45.0%였다. 유사하게, 2년 및 5년 생존은 각각 19.9% 및 5.2%에 비교하여 6.3% 및 2.6%였다. 높은 및 낮은 sGDF-15을 가진 절제불가능한 IV 단계 환자에 대한 중간 생존은 각각 5.7개월 대 11.0개월 이었다 (표 3).
AJCC: 미국 공동 암 위원회(American Joint Committee on Cancer); LDH: 락테이트 탈수소효소
CI: 신뢰 구간
CI: 신뢰 구간; n.r.: 도달하지 못함
LDH: 젖산 탈수소효소; CI: 신뢰 구간; n.r.: 도달하지 못함; n.d.: 측정 불가
III 단계 환자에서의 상대적인 예후 영향
III 단계 환자의 전체 코호트의 콕스 회귀 분석을 수행하여 다른 예후 인자와 비교한 sGDF-15의 상대적인 영향을 결정하였다 (표 3). 첫 번 째 모델에서는 세 가지 바이오마커인 sGDF-15, sS100B, 및 sLDH를 포함시켜 직접적인 비교를 가능케 하였다. 단변량 분석 결과 하위-단계 IIIA/B 대 IIIC에 대한 OS가 개선되는 경향이 나타남(p=0.088)에 따라 하위 단계로 조정하였다. 상승된 sGDF-15 (HR 2.3; p<0.001) 외에, 다변량 분석에서, 상승된 sS100B은 불량한 OS (도 5a)와 강하게 연관되어 있으며 예후에 독립적으로 부정적인 영향을 주었다 (HR 3.2; p<0.001). 1년 생존율은 두 마커 모두가 상승된 환자의 경우 56.2%와 강하게 대조적으로 두 가지 바이오마커의 유리한 결과를 가진 환자의 경우 97.4%로 가장 높았다. 상승된 sS100B 또는 높은 sGDF-15을 가진 환자의 1년 후의 생존 확률은 각각 88.4% 또는 95.1%였다. 두 번째 모델에서는 연령 및 성별을 추가적으로 고려하였다. 여기서, IIIC 단계 및 63세 초과의 환자는 sGDF15 및 sS100B 이외에도 예후에 독립적인 부정적인 영향을 미쳤다. 이러한 4가지 인자를 고려한 불리한 값의 수는 생존과 강력하게 연관되어 있다 (도 5). III 단계 흑색종에 대한 예상과 같이, sLDH는 두 모델 모두에서 결과와 상관 관계를 보이지 않았다.
IV 단계 환자에서 hGDF-15 수준의 상대적인 영향
혈액 샘플링 시점에서 질병의 증거가 없는 IV 단계 환자에서 (n=87), sGDF-15에 대한 예후적 관련성은 관찰되지 않았다. 원격 전이 패턴이나 sLDH도 OS와 관련이 없었다 (표 4). 대신에, sS100B는 이러한 환자 군에서 유일한 예후 인자였다 (도 5c).
절제불가능한 종양 부하를 가진 203명의 완전히 특성분석된 IV 단계 흑색종 환자를 조사한 결과, 우리는 다른 인자에 비해 sGDF-15의 상대적인 예후 영향을 조사하기 위해 콕스 회귀 분석을 적용하였다. 첫 번째 모델에서, sGDF-15을 AJCC 분류에서 예후 인자로 고려되는 원격 전이 및 sLDH 둘 모두의 패턴과 비교하였다 (표 3). III 단계 흑색종과 마찬가지로, sGDF-15는 원격 전이 (HR 1.8; p<0.001) 및 sLDH (HR 1.6; p=0.002)의 패턴과 함께 OS (HR 1.7; p<0.001)에 강한 독립적인 영향을 미쳤다. sGDF-15 수준의 독립적인 영향은 M1a/b (도 3a) 및 M1c 환자 (도 3b)에서 모두 나타났다. 세 가지 독립적인 인자인 sLDH, sGDF-15 및 원격 전이 패턴을 고려한 불리한 값의 수가 OS와 강하게 연관되어 있었다 (도 3c). 이로써, 47%의 환자가 새롭게 확인된 하위 군으로 분류되어 1년 생존 확률이 매우 낮았다 (3.3%). 다변량 모델 2는 모든 분석된 변수를 고려하였다 (표 3). 여기에서, sS100B는 sLDH를 중요한 예후 파라미터로 대체하고 연령은 추가적인 독립적인 영향을 미쳤다. sS100B를 고려한 불리한 인자의 수, M-분류, hGDF-15, 및 연령에 따른 계층화는 유리한 예후 및 81.3%의 1년 OSfmf 갖는 환자의 8%의 하위 군의 식별을 가능케 하였다. 이와 대조적으로, 모든 4개의 독립적인 인자에서 불리한 값을 나타낸 16%의 환자는 3.2%의 1년 OS를 갖는 가장 불량한 예후를 가졌다 (도 7).
실시예 2: 실시예 1에 기술된 환자 샘플의 대안적인 평가
본 발명에 따른 대안적인 실시예로서, 실시예 1에서 이미 기술된 동일한 환자 샘플을 다음에 기술된 바와 같이 대안적인 방식으로 평가하였다:
환자, 재료 및 방법:
환자
조직학적으로 확인된 흑색종을 가진, 독일 튀빙겐의 피부과 학과의 환자들을 중앙 악성 흑색종 등록 (CMMR) 데이터베이스 (Lasithiotakis et al., 2006)서 확인하였다. (a) 2008년 1월 내지 2012년 2월 사이에 취해진 보관된 혈청 샘플, (b) 이용가능한 추적 관찰 데이터, 및 혈액 추출 시점에서 (c) 국소적 병력 또는 (d) 원격 전이의 병력을 가진 761명의 환자를 선별하였다. AJCC 분류 (Balch et al., 2009)에 따라 정의된 sS100B 단계의 분석을 위해 일상적인 혈액 추출 동안 샘플링된 sGDF-15의 분석을 위해 사용된 혈청인, 혈청 LDH 및 혈청 S100B(Elecsys S100 전기화학발광 면역검정; Roche Diagnostics, 스위스 로크르즈)를 임상 기본에서 사용된 컷-오프에 따라 상승된 것과 정상인 것으로 분류하였다 (각각 정상의 0.10 ㎍/l 및 250 U/l의 상한). 원거리 연조직/림프절, 폐, 뇌, 간, 뼈, 및 다른 내장 기관이 관련된 먼 위치의 수를 계산하기 위해 고려되었다. 따라서, 수는 각각의 IV 단계 환자에 대해 1 내지 6명이 될 수 있다. GDF-15 혈청 농도를 상업적인 ELISA 키트를 사용하여 제조사의 지침 (R&D systems, 독일 비스바덴)에 따라 2회 중복으로 정량화하였다.
모든 환자는 CMMR 등록 기관에서 기록한 임상 데이터를 가지고 있는 서면 동의를 받았다. 기관 윤리 위원회 튀빙겐은 이 연구를 승인하였다 (윤리 투표 125/2015BO2).
통계학적 분석
추적 관찰 기간은 혈액 샘플링 날짜로부터 마지막 추적 관찰까지 또는 사망 까지로 정의된다. 카플란-마이어에 따른 생존 확률을 95% 신뢰 구간과 함께 계산하였고, 양면 로그-순위 검정을 사용하여 비교하였다. 마지막 추적 관찰 시 생존해 있거나 흑색종 외의 이유로 사망한 환자를 중도절단 하였다. 환자를 1:2의 비율을 사용하여 2개의 코호트에 무작위로 배정하였다. 식별 코호트에서, 높은 sGDF-15 대 낮은 sGDF-15을 가진 환자 사이의 OS의 차이를, 각각의 환자의 25% 이상을 포함하는 2개의 균형있는 군을 산출하는 컷-오프 지점에 대해 분석하였다. 이어서, 가장 낮은 로그 순위 p-값을 생성하는 컷-오프 지점을, 이전에 공개된 (Camp et al., 2004) 최적화 알고리즘과 유사하게 선별한 후에 검증 코호트에서 분석하였다.
누락된 값을 가진 환자를 제외하고 콕스 회귀 분석을 사용하였다. 다변량 모델의 결과를 HR 방법에의해 기술하였다; p-값은 월드 검정에 기초하였다. 조합 모델은 R의 생존 패키지에서 노모그램 함수를 사용하여 개발하였다. 이전의 전신 치료법에 따른 sGDF-15에서의 차이를 만-위트니 U 검정으로 분석하였다. 모든 통계학적인 분석은 SPSS 버전 22 (IBM SPSS, 미국 일리노이 시카고) 및 R 3.2.1 (R Foundation for Statistical Computing, 호주 비엔나)을 사용하여 수행하였다.
결과:
환자
환자의 특성을 표 5에 나타냈다. 총 761명의 흑색종 환자를 분석하였다. 사망한 환자의 경우 중간 추적 관찰은 10.3개월이었고 마지막 추적 관찰의 시점에서 살아있는 환자의 경우 45.3개월 이었다.
IV 단계 환자 (n=293)를 M-분류 M1c (n=206; 70.3%), M1b (n=51; 17.4%), 또는 M1a (n=36; 12.3%)에 배정하였다. 카플란 마이어에 따른 중간 생존 예측은 10.7개월 이었다. 생존 확률은 1년이 46.4%, 2년이 33.3%, 및 3년이 29.3%이었다. IV 단계 환자에 대한 평가는 12주 이내에 84명 (28.7%)에서, 또는 원격 전이의 첫 번째 발생 후 12개월 이내에 96명 (32.7%)에서, 또는 마지막 시점에서 113명의 환자 (38.6%)에 이루어졌다. 각각의 시점에서 87명의 환자 (29.7%)는 질병의 증거가 없는 반면 206명 (70.3%)은 절제불가능한 종양을 가졌다.
총 468명의 III 단계 환자를 포함시켰다. 하위 단계는 분류에 대한 완전한 데이터를 가진 422명의 환자 중 IIIA가 15.6%, IIIB가 37.2%, 그리고 IIIC가 47.2%였다. 생존 확률은 각각 1년이 94.9%, 2년이 85.0%, 그리고 5년이 72.8%였다. 평가 시점은 55명 (11.8%)의 환자의 경우 12주 이내였고, 100명 (21.4%)의 경우 국소 전이의 첫 번째 발생 이후 또는 313명의 환자 (55.9%)의 경우 그 이후에 12개월 이내였다. III 단계 환자 중 각각의 시점에서 질병의 증거를 가진 환자는 없었다.
단계, 종양 부담 및 이전의 치료에 따른 GDF-15 혈청 수준
모든 761명의 환자를 고려한 중간 sGDF-15는 1.0 ng/mL 이었다 (III 단계의 경우 0.9 ng/mL 대 IV 단계 환자의 경우 1.5 ng/mL). 종양의 임상적 또는 방사선학적 증거를 가진 IV 단계 환자는 종양이 없는 IV 단계 또는 종양이 없는 III 단계 환자 (둘 모두 0.9 ng/mL; 도 10a)보다 더 높은 중간 sGDF-15 (2.1 ng/mL)를 가졌다. 종양이 없는 IV 단계 환자 중에서, 중간 sGDF-15는 전신 치료 후 진행중인 완전한 반응을 가진 13명의 환자와 원격 전이의 절제수술 후 종양이 없는 74명의 환자에서 (둘 모두 0.9 ng/mL) 다르지 않았다. sGDF-15는 절제불가능한 IV 단계 환자에서 sLDH 및 관련된 먼 부위의 수와 관련 있었다 (도 10b 및 10c). 일반적으로, 중간 sGDF-15는 마지막 4주 이내 또는 혈액 샘플링 전 임의의 시기에 전신 치료를 받은 환자에서 다르지 않았다 (표 8). 화학요법, 이필리무맙, 기타 면역요법, BRAF/MEK 억제제 또는 다른 전신 치료와 함께 전처리가 미치는 영향에 대한 별도의 분석은 BRAF/MEK 억제제 투여 후 낮은 sGDF-15을 나타냈으며 절제불가능한 IV 단계 환자에서 이필리무맙 후 보다 높은 수준을 향하는 경향을 나타냈다. 종양이 없는 IV 단계 환자에서 이전의 전신 치료의 유의한 영향은 관찰되지 않았다. 이전에 보조 치료로 인터페론-α를 처리한 종양이 없는 III 단계 환자와 처리하지 않은 환자를 비교했을 때, sGDF-15에서 작지만 유의한 차이가 관찰되었다(0.8 ng/mL 대 0.9 ng/mL; 표 8).
GDF-15 수준에 따른 전체 생존기간
0.7 ng/mL 내지 1.9 ng/mL의 범위의 sGDF-15의 13개의 상이한 컷-오프 지점을 식별 코호트 (n=254)에서 시험하였다. 예후의 가장 유의한 차이는 1.5 ng/mL 이상의 sGDF-15 및 불량한 OS를 가진 86명의 환자를 보다 낮은 수준 및 유리한 OS (p<0.001; 도 11a)를 가진 환자와 비교했을 때 관찰되었다. 이러한 컷오프 지점으 사용한 OS에서의 차이를 이어서 검증 코호트 (n=507; p<0.001; 도 11b)에서 확인하였다. 식별 및 검증 코호트 사이의 환자 특성의 비교를 표 9에 나타냈다.
두 코호트의 환자를 고려하여, sGDF-15와 OS의 이러한 역 상관관계가 종양이 없는 III 단계 환자 및 절제불가능한 IV 단계 환자 (도 1a; 1b)에서 발견되었지만 종양이 없는 IV 단계 환자 (도 1c)에서는 발견되지 않았다.
III 단계의 환자 중에서, 1년, 2년 및 5년 OS 확률은 1.5 ng/mL 미만의 sGDF-15을 가진 환자의 경우 96.1%, 87.8% 및 75.7%였지만, 보다 높은 sGDF-15을 가진 환자의 경우 단지 90.4%, 74.2% 및 61.5%였다 (표 6 및 표 10). OS와의 관련성은 혈청 샘플링 전 6개월까지, 또는 6 내지 24개월 까지 종양이 없는 환자의 경우 유의하였다. 24개월 이상의 종양이 없는 환자의 경우 OS에 있어서 차이는 관찰되지 않았다 (도 12).
절제불가능한 원격 전이가 있고 1.5 ng/mL 이상의 sGDF-15을 가진 환자의 경우, 1년 OS 확률은 단지 14.3%였지만, 낮은 sGDF-15을 가진 환자의 경우 45.0%였다. 유사하게, 2년 및 5년 생존은 각각 19.9% 및 5.2%에 비해 6.3% 및 2.6%였다 (표 7 및 표 11). OS와의 연관성은 원격 전이가 처음 진단된 후 6 개월 이내 및 6 내지 24개월 사이에 평가된 환자의 경우 유의하였지만, 24개월 이상의 IV 단계인 환자에서는 유의하지 않았다 (도 13).
III 단계 환자에서 sGDF-15의 상대적인 예후 영향
다른 예후 인자와 비교한 sGDF-15의 상대적인 영향을 결정하기 위해 모든 종양이 없는 III 단계 환자의 콕스 회귀 분석을 수행하였다. 미국 공동 암 위원회에 따라 하위 단계에 대해 조정하는 경우 1.5 ng/mL 이상의 sGDF15을 가진 환자의 경우 위험 비율 (HR)은 2.2였다 (p<0.001) (표 6; 모델 1). 광범위한 인자를 고려한 모델 2에서, 상승된 sS100B는 불량한 OS와 강하게 관련되어 있고 (도 14a), 상승된 sGDF-15 (HR 2.7; p<0.001) 외에 OS (HR 4.0; p<0.001) 상에 독립적인 부정적인 영향 및 국소 전이 패턴 (HR=4.1; 림프절 합병 및 수송중/위성 관련의 경우 p<0.001; 림프절 관여만의 경우 p=0.002; 표 6)을 가졌다. 개별적인 위험 점수를 수득하기 위해, 이러한 세 가지 인자의 상대적인 영향을 설명하는 노모그램을 개발하였다 (도 8a). 2년의 OS는 림프절 개입이 없는, 정상 sS100B, 및 1.5 ng/mL 미만의 sGDF-15을 갖는 (위험 점수 0) 환자의 경우 96.1%였지만, 175 초과의 위험 점수를 갖는 환자의 경우 단지 40.2%였다 (도 8b). 연령, 성별, sLDH, 하위 단계, 궤양 또는 종양의 두께에 대해 OS와의 유의한 관계는 관찰되지 않았다. OS는 이전 보조 전신 치료를 받은 환자와 받지 않은 환자를 비교했을 때 상이하지 않았다 (표 6). 분석이 검증 코호트의 III 단계 환자에 제한되는 경우, OS 상의 sGDF-15의 유사한 영향이 관찰되었다 (표 12).
IV 단계 환자에서 GDF-15 수준의 상대적인 영향
sGDF-15는 IV 단계 환자 (n=293)의 전체 코호트 사이에서 OS에 독립적인 영향을 미쳤다. 예상되는 바와 같이, 혈청 샘플링 시점에서 질병 상태의 현저한 영향이 관찰되었다 (절제불가능한 질병 HR=8.6; p<0.001 대 종양이 없는; 표 13). 따라서, 절제불가능한 IV 단계 환자 및 절제수술 후 종양이 없거나 이전의 전신 치료 시 완전한 반응을 보인 환자를 개별적으로 분석하였다.
종양이 없는 IV 단계 환자에서 (n=87), sGDF-15의 경우 OS에 대한 영향이 관찰되지 않았다 (표 14). 대신에, 증가된 sS100B (도 14b), 2 이상의 연관된 먼 부위, 및 이전의 전신 치료가 없는 것은 단변량 및 다변량 분석에서 불량한 OS와 관련되어 있었다. 전신 치료 후 완전한 반응을 보인 13명의 환자 중 추적 관찰 동안 사망한 환자는 없었다. 분석이 완전 절제술 후 종양이 없는 환자의 하위 군으로 제한되는 경우, 동일한 인자가 OS와 독립적으로 연관되어 있다 (표 15).
206명의 절제불가능한 IV 단계 환자를 살펴보면 (표 7), 상승된 sGDF-15는 M 분류 (HR 1.6; M1c의 경우 p<0.001) 외에 OS (HR 1.9; p<0.001)에 강력한 독립적인 부정적인 영향을 미쳤다. sGDF-15와 OS와의 관련성은 M1a/b (도 9a) 및 M1c 환자 (도 9b) 둘 모두에서 분명했다. 보다 상세한 다변량 모델 2에서, 상승된 sGDF-15, 상승된 sS100B (도 14c), CNS 연루, 및 4개 이상의 연루된 먼 부위는 불량한 OS (표 7)와 독립적으로 관련되어 있었다. OS의 강력한 차이는 이러한 네 가지 인자의 상대적인 영향을 설명하는 노모그램-기반 위험 점수에 따라 관찰되었다. 100 미만의 위험 점수를 갖는 31.1%의 환자는 48.3%의 1년 OS를 가졌다. 이와 대조적으로, 250 이상의 위험 점수를 가진 21.2%의 환자 중 그 누구도 혈청 샘플링 후 첫 해에 생존하지 않았다 (도 9c, 9d). 다변량 분석에서 OS와 관련이 있음에도 불구하고, sLDH 및 원격 전이 패턴은 다른 인자와 함께 고려되는 경우 OS에 추가의 영향을 미치지 않았다. 분석이 치료에 순응하지 않는 절제불가능한 환자 (표 16), 또는 검증 코호트에서만의 환자 (표 17)에만 제한되는 경우, 이전의 전신 치료를 받은 환자의 OS는 받지 않은 환자와 비교했을 때 다르지 않았고 (표 7), OS에 sGDF-15의 유사한 독립적인 영향이 관찰되었다. CNS-연루된 GDF-15을 가진 환자에서, sLDH 및 sS100B는 단변량 분석에서 OS와 관련이 있었지만, 조합에서 분석 시 독립적인 인자와는 관련이 없었다 (표 18).
약어: AJCC, 미국 공동 암 위원회; CNS, 중추 신경계; LDH, 젖산 탈수소효소; sLDH, 젖산 탈수소효소의 혈청 수준; sS100B, 혈청 중의 S100B.
약어: sGDF-15, 성장 및 분화 인자 15의 혈청 수준; sLDH, 젖산 탈수소효소의 혈청 수준; sS100B, 혈청 중의 S100B. *95% 신뢰 구간을 표 10에 나타냈다.
약어: CNS, 중추 신경계; sGDF-15, 성장 및 분화 인자 15의 혈청 수준; sLDH, 젖산 탈수소효소의 혈청 수준; sS100B, 혈청 중의 S100B. *95% 신뢰 구간을 표 11에 나타냈다.
1: 1명의 환자에서 이용불가능한 데이터, 2: 2명의 환자에서 이용불가능함, 3: 5명의 환자에서 이용불가능함
CI: 신뢰 구간; n.r.: 도달하지 못함.
CI: 신뢰 구간.
LDH: 젖산 탈수소효소, CI: 신뢰 구간.
LDH: 젖산 탈수소효소, CI: 신뢰 구간.
LDH: 젖산 탈수소효소; CI: 신뢰 구간; n.d.: 수행되지 않음
LDH: 젖산 탈수소효소, CI: 신뢰 구간; n.d.: 수행되지 않음.
LDH: 젖산 탈수소효소, CI: 신뢰 구간.
LDH: 젖산 탈수소효소, CI: 신뢰 구간.
LDH: 젖산 탈수소효소, CI: 신뢰 구간.
종합:
본 연구에서, 본 발명자들은 놀랍게도 hGDF-15의 혈청 농도가 전이성 흑색종 환자에 대한 강력한 예후 바이오마커임을 발견하였다.
예컨대, 본 발명자들은 전이성 흑색종을 가진 761명의 환자의 코호트에서 1.5 ng/mL 초과의 hGDF-15 혈청 농도가 전체 생존기간을 가장 강력하게 예측한다는 것을 발견하였다.
종양이 없는 III 단계 환자에서, 전 세계적으로 인정되는 예후 바이오마커는 매일 임상 기본에서 사용되지 않는다. 개별적인 예후의 평가는 주로 각각의 하위 단계 IIIA, IIIB, 또는 IIIC의 정의에 대해 고려된 임상 및 조직병리학적 특성에 기초한다 (Balch, CM et al., J Clin Oncol / 27 / 6199-206. 2009). 혈청 LDH는 국소전이 수술 후 종양이 없는 환자에서 예후 정보를 보유하지 못한다 (Wevers, KP et al., Ann Surg Oncol / 20 / 2772-9. 2013). S100B의 혈청 수준은 흑색종 환자에서 예후에 영향을 준다는 많은 증거가 있음에도 불구하고 (Mocellin, S et al., Int J Cancer / 123 / 2370-6. 2008), 유럽에서 주로 재발의 조기 발견만을 위해서만 분석되었다 (Pflugfelder, A et al., J Dtsch Dermatol Ges / 11 / 563-602. 2013). 본 연구에서, 본 발명자들은 놀랍게도 sGDF15 및 sS100B가 모두 이러한 환자에 대한 독립적인 예후 마커이며 질병으로부터 사망할 가능성이 있는 환자를 확인하기 위한 임상-하위 단계보다 훨신 우수함을 확인하였다.
sGDF-15의 분석만으로 높은 혈청 농도를 가진 모든 종양이 없는 III 단계 환자의 21%를 확인할 수 있었고, 이들은 낮은 수준을 가진 환자 (각각 33% 대 16%)와 비교하여 혈액 추출 후 3년 이내에 사망 위험이 2배 높았다. sGDF-15와 sS100B를 조합하여 고려한 결과, 위험에 처한 환자의 비율이 21% (sS100B와 관계 없이 sGDF-15가 상승)에서 31% (상승된 바이오마커 중 하나 또는 둘 모두)로 증가하였으며, 바이오마커 분류 간 OS 차이가 더욱 확대되었다. 구체적으로, 정상적인 sS100B 및 낮은 sGDF-15로 3년 이내에 사망할 위험은 적어도 하나의 바이오마커가 상승된 환자의 경우 33%에 비해 겨우 14%에 불과했다. 이러한 환자에서 임상적 또는 방사선학적 증거 없이 혈액을 채취한 경우 특히 바이오마커 둘 모두를 조합하여 분석하면 보다 강력한 감시 또는 보조 요법으로 이익을 얻을 수 있는 환자를 확인할 수 있다.
따라서, 본 발명에 따르면, 생존 예측을 위한 바이오마커로서의 hGDF-15의 사용은, 예컨대 추가의 바이오마커로서의 S100B와의 조합하여, 생존의 신뢰성있는 예후가 아직 이용가능하지 않은 흑색종 환자의 하위 집단에 대해서조차도 매우 유리하다.
절제불가능한 IV 단계 흑색종 환자에서, 내장 전이 패턴 및 sLDH는 환자를 예후가 상이한 M-분류 M1a, M1b, 또는 M1c (Balch, CM et al., J Clin Oncol / 27 / 6199-206. 2009)로 분류하는데 규칙적으로 사용된다. 본 연구에서, 이러한 2개의 확립된 예후 인자와 조합된 sGDF-15의 고려는 개별적인 환자의 경우 예후의 예측을 개선하였고 (HR 1.7; p<0.001; 내장 전이 패턴: HR 1.8; p<0.001; sLDH: HR 1.6; p=0.002), 1년 (3.3%) 생존에 대한 매우 불량한 확률을 가진 관련 하위 군 (절제불가능한 원격 전이를 가진 모든 환자의 30%를 포함함)의 식별을 가능케 하였다. 이와 대조적으로, sGDF-15 (폐 이외의 내장 전이 및 상승된 sLDH; 35%의 모든 절제불가능한 IV 단계 환자)를 고려하지 않은 최악의 바이오마커 분류는 8.3%의 1년 생존 예측을 나타냈다. sGDF-15의 추가 고려사항은 M1a/b 및 M1c 환자에 대한 예후 정보를 추가했다. sGDF-15을 고려한 예후 정보의 확보는 환자 상담 및 임상 시험 내 층화에 유용하며, 치료 결정을 위한 개별적인 위험/이익 평가에 영향을 미칠 수 있다. 진행된 흑색종에 대한 다양한 치료 선택의 유용성 (및 출현)과 유효성과 부작용 간의 피할수 없는 절충을 고려할 때, 향상된 예후 예측은 개별화된 치료의 추가 지침을 위한 도구가 될 가능성이 높다.
결론적으로, 본 발명에 따르면, sGDF-15는 흑색종 예컨대 전이성 흑색종을 가진 환자에서 강력한 예후 바이오마커이다.
종양이 없는 III 단계 환자에서, sGDF-15 단독 또는 sS100B와의 조합을 고려하면 보다 강력한 환자 감시 또는 보조 치료로부터 이익을 얻을 수 있는 질병으로부터 사망할 위험이 높은 개인을 확인할 수 있다. 절제불가능한 IV 단계 흑색종 sGDF-15을 가진 환자에서, sLDH 및 내장 전이 패턴은 독립적인 예후 인자이다. 이러한 세 가지 인자의 조합된 고려는 M-분류 단독에 비해 개인의 예후 예측을 향상시키고 개별화된 치료 결정에 영향을 줄 수 있다.
본 발명에 따른 장치 및 키트는 진단 제품의 제조에 대한 공지된 표준에 따라, 항목별 예측 방법을 위한 제품으로서 산업적으로 제조되고 판매될 수 있다. 따라서, 본 발명은 산업적으로 이용가능하다.
DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMACC3142 20110929
SEQUENCE LISTING <110> Julius-Maximilians-Universitaet Wurzburg <120> GDF-15 as a diagnostic marker for melanoma <130> 192308 <150> GB 1517528.4 <151> 2015-10-02 <160> 26 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 97 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Gln Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Ser Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Thr 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Pro Ser Arg Asn Gln Val 65 70 75 80 Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys <210> 2 <211> 88 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn 20 25 30 Val Ala Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ala Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys 85 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 3 Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser Gly Met Gly 1 5 10 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys 1 5 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 5 Ala Arg Ser Ser Tyr Gly Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 6 <211> 6 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 6 Gln Asn Val Gly Thr Asn 1 5 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 7 Gln Gln Tyr Asn Asn Phe Pro Tyr Thr 1 5 <210> 8 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant mature human GDF-15 protein <400> 8 Gly Ser Ala Arg Asn Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys 1 5 10 15 Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala 20 25 30 Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly 35 40 45 Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys 50 55 60 Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys 65 70 75 80 Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr 85 90 95 Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His 100 105 110 Cys Ile <210> 9 <211> 308 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Met Pro Gly Gln Glu Leu Arg Thr Val Asn Gly Ser Gln Met Leu Leu 1 5 10 15 Val Leu Leu Val Leu Ser Trp Leu Pro His Gly Gly Ala Leu Ser Leu 20 25 30 Ala Glu Ala Ser Arg Ala Ser Phe Pro Gly Pro Ser Glu Leu His Ser 35 40 45 Glu Asp Ser Arg Phe Arg Glu Leu Arg Lys Arg Tyr Glu Asp Leu Leu 50 55 60 Thr Arg Leu Arg Ala Asn Gln Ser Trp Glu Asp Ser Asn Thr Asp Leu 65 70 75 80 Val Pro Ala Pro Ala Val Arg Ile Leu Thr Pro Glu Val Arg Leu Gly 85 90 95 Ser Gly Gly His Leu His Leu Arg Ile Ser Arg Ala Ala Leu Pro Glu 100 105 110 Gly Leu Pro Glu Ala Ser Arg Leu His Arg Ala Leu Phe Arg Leu Ser 115 120 125 Pro Thr Ala Ser Arg Ser Trp Asp Val Thr Arg Pro Leu Arg Arg Gln 130 135 140 Leu Ser Leu Ala Arg Pro Gln Ala Pro Ala Leu His Leu Arg Leu Ser 145 150 155 160 Pro Pro Pro Ser Gln Ser Asp Gln Leu Leu Ala Glu Ser Ser Ser Ala 165 170 175 Arg Pro Gln Leu Glu Leu His Leu Arg Pro Gln Ala Ala Arg Gly Arg 180 185 190 Arg Arg Ala Arg Ala Arg Asn Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly 195 200 205 Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly 210 215 220 Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys 225 230 235 240 Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln 245 250 255 Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro 260 265 270 Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr 275 280 285 Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp 290 295 300 Cys His Cys Ile 305 <210> 10 <211> 322 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human GDF-15 precursor protein + N-terminal and C-terminal GSGS linker <400> 10 Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Met Pro Gly Gln Glu Leu Arg Thr Val 1 5 10 15 Asn Gly Ser Gln Met Leu Leu Val Leu Leu Val Leu Ser Trp Leu Pro 20 25 30 His Gly Gly Ala Leu Ser Leu Ala Glu Ala Ser Arg Ala Ser Phe Pro 35 40 45 Gly Pro Ser Glu Leu His Ser Glu Asp Ser Arg Phe Arg Glu Leu Arg 50 55 60 Lys Arg Tyr Glu Asp Leu Leu Thr Arg Leu Arg Ala Asn Gln Ser Trp 65 70 75 80 Glu Asp Ser Asn Thr Asp Leu Val Pro Ala Pro Ala Val Arg Ile Leu 85 90 95 Thr Pro Glu Val Arg Leu Gly Ser Gly Gly His Leu His Leu Arg Ile 100 105 110 Ser Arg Ala Ala Leu Pro Glu Gly Leu Pro Glu Ala Ser Arg Leu His 115 120 125 Arg Ala Leu Phe Arg Leu Ser Pro Thr Ala Ser Arg Ser Trp Asp Val 130 135 140 Thr Arg Pro Leu Arg Arg Gln Leu Ser Leu Ala Arg Pro Gln Ala Pro 145 150 155 160 Ala Leu His Leu Arg Leu Ser Pro Pro Pro Ser Gln Ser Asp Gln Leu 165 170 175 Leu Ala Glu Ser Ser Ser Ala Arg Pro Gln Leu Glu Leu His Leu Arg 180 185 190 Pro Gln Ala Ala Arg Gly Arg Arg Arg Ala Arg Ala Arg Asn Gly Asp 195 200 205 His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg 210 215 220 Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg 225 230 235 240 Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg 245 250 255 Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys 260 265 270 Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro 275 280 285 Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr 290 295 300 Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile Gly Ser Gly Ser Gly 305 310 315 320 Ser Gly <210> 11 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flag peptide <400> 11 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly 1 5 10 <210> 12 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HA peptide <400> 12 Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Gly 1 5 10 <210> 13 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide derived from human GDF-15 <400> 13 Glu Leu His Leu Arg Pro Gln Ala Ala Arg Gly Arg Arg 1 5 10 <210> 14 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide derived from human GDF-15 <400> 14 Leu His Leu Arg Pro Gln Ala Ala Arg Gly Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 15 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide derived from human GDF-15 <400> 15 His Leu Arg Pro Gln Ala Ala Arg Gly Arg Arg Arg Ala 1 5 10 <210> 16 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide derived from human GDF-15 <400> 16 Leu Arg Pro Gln Ala Ala Arg Gly Arg Arg Arg Ala Arg 1 5 10 <210> 17 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide derived from human GDF-15 <400> 17 Arg Pro Gln Ala Ala Arg Gly Arg Arg Arg Ala Arg Ala 1 5 10 <210> 18 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide derived from human GDF-15 <400> 18 Pro Gln Ala Ala Arg Gly Arg Arg Arg Ala Arg Ala Arg 1 5 10 <210> 19 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide derived from human GDF-15 <400> 19 Gln Ala Ala Arg Gly Arg Arg Arg Ala Arg Ala Arg Asn 1 5 10 <210> 20 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide derived from human GDF-15 <400> 20 Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys 1 5 10 <210> 21 <211> 291 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 21 caagtgaagc tgcagcagtc aggccctggg atattgcagt cctcccagac cctcagtctg 60 acttgttctt tctctgggtt ttcactgagt acttctggta tgggtgtgag ctggattcgt 120 cagccttcag gaaagggtct ggagtggctg gcacacattt actgggatga tgacaagcgc 180 tataacccaa ccctgaagag ccggctcaca atctccaagg atccctccag aaaccaggta 240 ttcctcaaga tcaccagtgt ggacactgca gatactgcca catactactg t 291 <210> 22 <211> 264 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 22 gacattgtgc tcacccagtc tccaaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc 60 gtcacctgca aggccagtca gaatgtgggt actaatgtgg cctggtttct acagaaacca 120 gggcaatctc ctaaagcact tatttactcg gcatcctacc ggtacagtgg agtccctgat 180 cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcaa cgtgcagtct 240 gaagacttgg cagagtattt ctgt 264 <210> 23 <211> 30 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 23 gctcgaagtt cctacggggc aatggactac 30 <210> 24 <211> 27 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 24 cagcaatata acaactttcc gtacacg 27 <210> 25 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg 1 5 10 15 <210> 26 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys 1 5 10 15 Asp Cys His Cys Ile 20

Claims (37)

  1. 인간 흑색종 환자의 생존 확률을 예측하는 방법으로서,
    상기 방법이
    (a) 상기 환자로부터 수득된 인간 혈액 샘플에서 hGDF-15 수준을 결정하는 단계; 및
    (b) 상기 인간 혈액 샘플에서 hGDF-15의 결정된 수준에 기초하여 상기 생존 확률을 예측하는 단계를 포함하며;
    상기 인간 혈액 샘플내 hGDF-15의 수준 감소는 생존 확률의 증가를 의미하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    단계 (b)는 단계 (a)에서 결정된 상기 hGDF-15의 수준을 hGDF-15 역치 수준과 비교하는 단계를 포함하며, 상기 확률은 단계 (a)에서 결정된 상기 hGDF-15 수준을 상기 hGDF-15 역치 수준과 비교한 것에 기초하여 예측되고; 상기 인간 혈액 샘플내 hGDF-15 수준이 hGDF-15 역치 수준과 비교해 낮은 경우는, 생존 확률이 상기 hGDF-15 역치 수준 이상에서의 생존 확률 보다 높은 것을 의미하는, 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 인간 혈액 샘플이 인간 혈청 샘플인, 방법.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 hGDF-15 역치 수준이 1.1 ng/ml 내지 2.2 ng/ml, 1.2 ng/ml 내지 2.0 ng/ml, 1.3 ng/ml 내지 1.8 ng/ml, 또는 1.4 ng/ml 내지 1.6 ng/ml, 범위로부터 선택되는 수준 또는 1.5 ng/ml이거나; 또는
    상기 hGDF-15 역치 수준이 3.3 ng/ml 내지 4.3 ng/ml, 또는 3.6 ng/ml 내지 4.0 ng/ml 범위로부터 선택되는 수준 또는 3.8 ng/ml인, 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    단계 (a)가 상기 인간 혈액 샘플에서 젖산 탈수소효소의 수준을 결정하는 단계를 추가로 포함하고; 및
    단계 (b)에서, 상기 생존 확률이 또한 상기 인간 혈액 샘플에서 젖산 탈수소효소의 결정된 수준에 기초하여 예측되며; 상기 인간 혈액 샘플내 젖산 탈수소효소의 수준 감소는 생존 확률의 증가를 의미하거나, 또는
    단계 (b)가 단계 (a)에서 결정된 상기 젖산 탈수소효소의 수준을 젖산 탈수소효소 역치 수준과 비교하는 단계를 포함하며, 상기 확률은 또한 단계 (a)에서 결정된 상기 젖산 탈수소효소의 수준을 상기 젖산 탈수소효소 역치 수준과 비교한 것에 기초하여 예측되고; 상기 인간 혈액 샘플내 젖산 탈수소효소의 수준이 젖산 탈수소효소 역치 수준 이하인 경우는, 생존 확률이 상기 젖산 탈수소효소 역치 수준 보다 높을 경우의 생존 확률과 비교해 높다는 것을 의미하는, 방법.
  6. 제1항에 있어서
    단계 (a)가 상기 인간 혈액 샘플에서 S100B 수준을 결정하는 단계를 추가로 포함하고; 및
    단계 (b)에서, 상기 생존 확률이 또한 상기 인간 혈액 샘플에서 S100B의 결정된 수준에 기초하여 예측되며, 상기 인간 혈액 샘플내 S100B의 수준 감소는 생존 확률의 증가를 의미하거나, 또는
    단계 (b)가 단계 (a)에서 결정된 상기 S100B의 수준을 S100B 역치 수준과 비교하는 단계를 포함하며, 상기 확률은 단계 (a)에서 결정된 상기 S100B의 수준을 S100B의 역치 수준과 비교한 것에 기초하여 예측되고; 여기서, 상기 인간 혈액 샘플내 S100B의 수준이 S100B 역치 수준 이하인 경우는, 생존 확률이 상기 S100B 역치 수준 보다 높은 경우의 생존 확률에 비해 높다는 것을 의미하는, 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    단계 (b)에서, 상기 생존 확률은 또한 상기 환자의 연령에 기초하여 예측되며; 연령 증가는 생존 확률의 감소를 의미하거나, 또는
    단계 (b)가 상기 환자의 상기 연령을 임계 연령과 비교하는 단계를 포함하며, 상기 확률은 상기 환자의 상기 연령을 상기 임계 연령과 비교한 것에 기초하여 예측되고; 상기 환자의 연령이 임계 연령 이상인 경우는, 생존 확률이 상기 임계 연령 미만일 경우의 생존 확률과 비교해 낮다는 것을 의미하는, 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 임계 연령이 60 내지 65세의 범위로부터 선택되거나 또는 63세인, 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    단계 (b)에서, 상기 생존 확률이 또한 전이에 기초하여 예측되며; 폐 이외의 내장 기관으로의 전이의 존재는, 생존 확률이 전이가 폐 이외의 내장 기관에 없을 경우의 생존 확률 보다 낮다는 것을 의미하는, 방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 인간 흑색종 환자가 종양이 없는 흑색종 IV 단계 (tumor-free melanoma stage IV) 환자가 아니거나, 종양이 없는 III 단계 흑색종 환자 또는 절제불가능한 IV 단계의 흑색종 환자거나, IV 단계 흑색종 환자 또는 III 단계 흑색종 환자인, 방법.
  11. 제1항에 있어서,
    단계 (a)가 hGDF-15에 결합할 수 있는 하나 이상의 항체 또는 이의 항원-결합 영역의 사용에 의해 hGDF-15의 수준을 결정하는 것을 포함하는, 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 하나 이상의 항체 또는 이의 항원-결합 영역이 hGDF-15와 함께 복합체를 형성하거나,
    상기 하나 이상의 항체가 적어도 하나의 다클론 항체를 포함하거나,
    상기 하나 이상의 항체 또는 상기 항원-결합 영역이 적어도 하나의 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 영역을 포함하거나,
    상기 하나 이상의 항체 또는 상기 항원-결합 영역이 적어도 하나의 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 영역을 포함하고, 상기 결합이 hGDF-15 상의 입체형태적 또는 불연속 에피토프에 대한 결합이고, 상기 입체형태적 또는 불연속 에피토프가 서열번호 25 및 서열번호 26의 아미노산 서열로 구성되거나, 또는
    상기 하나 이상의 항체 또는 상기 항원-결합 영역이 적어도 하나의 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 영역을 포함하고, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 영역이 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 영역, 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 영역 및 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하고, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 영역이 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 영역, ser-ala-ser 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 영역 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는, 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    단계 (a)에서, 상기 hGDF-15 수준이 제12항에 따른 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로 hGDF-15을 포획하고, 다클론 항체로 hGDF-15을 검출함으로써, 또는 hGDF-15을 포획하는 항체와는 다른 에피토프에 결합하는 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로 hGDF-15을 검출함으로써 결정되는, 방법.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 방법이 시험관내 방법인, 방법.
  15. 제1항에 있어서,
    단계 (a)에서, 인간 혈액 샘플에서 hGDF-15의 수준이 효소-연계된 면역흡착 분석법에 의해 결정되거나,
    단계 (a)에서, 인간 혈액 샘플에서 hGDF-15의 수준이 전기화학발광 분석법에 의해 결정되거나, 하기 물질들 간의 검출 복합체를 형성하는 단계를 포함하는 샌드위치 검출 방법을 포함하는 전기화학발광 분석법에 의하여 결정되고:
    (A) 스트렙타비딘-코팅된 비드;
    (B) hGDF-15에 결합할 수 있는 바이오틴화된 제1 항체 또는 이의 항원-결합 영역;
    (C) 상기 샘플로부터의 hGDF; 및
    (D) 루테늄 복합체가 표지(labelling)된, hGDF-15에 결합할 수 있는 2차 항체 또는 이의 항원-결합 영역;
    상기 검출 복합체는 구조 (A)-(B)-(C)-(D)를 가지며, 상기 바이오틴화된 제1 항체 또는 이의 항원-결합 영역은 제1 hGDF-15 에피토프에 결합하고 상기 루테늄 복합체가 표지된 제2 항체 또는 이의 항원-결합 영역은 제1 hGDF-15 에피토프와는 상이한 제2 hGDF-15 에피토프에 결합하고,
    상기 방법은 전기화학발광을 측정함으로써 검출 복합체를 검출하는 단계를 추가로 포함하고,
    상기 인간 혈액 샘플내 hGDF-15의 수준은 전기화학발광 측정에 기초하여 결정되는, 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 방법을 수행하도록 구성된 장치.
  17. 제15항에 따른 방법을 수행하도록 구성된 전기화학발광 분석 장치로서,
    단계 (a)에서, 인간 혈액 샘플에서 hGDF-15의 수준이 전기화학발광 분석법에 의해 결정되는, 장치.
  18. (i) 스트렙타비딘-코팅된 비드;
    (ii) hGDF-15에 결합할 수 있는 바이오틴화된 제1 항체 또는 이의 항원-결합 영역;
    (iii) 재조합 hGDF-15, 또는 재조합 hGDF-15을 포함하는 완충된 용액 형태의 재조합 hGDF-15로서, 상기 완충된 용액은 4 내지 7의 범위의 pH를 가짐;
    (iv) 루테늄 복합체가 표지(labelling)된, hGDF-15에 결합할 수 있는 2차 항체 또는 이의 항원-결합 영역;
    (v) 사용 설명서, 또는 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 방법에 이용하기 위한 사용 설명서; 및
    (vi) 상기 재조합 hGDF-15을 수용하는 용기로서, 재조합 hGDF-15와 접촉되는 용기의 표면이 비-접착성 물질로 코팅되어 있는 용기를 포함하는 검출 키트로서,
    상기 바이오틴화된 제1 항체 또는 이의 항원-결합 영역은 제1 hGDF-15 에피토프에 결합할 수 있으며, 루테늄 복합체가 표지된 제2 항체 또는 이의 항원-결합 영역은 상기 제1 hGDF-15 에피토프와는 상이한 제2 hGDF-15 에피토프에 결합할 수 있거나, 또는
    hGDF-15에 결합할 수 있는 제1 항체 또는 이의 항원-결합 영역, 및 hGDF-15에 결합할 수 있는 제2 항체 또는 이의 항원-결합 영역 중 하나가 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 영역이고, 상기 결합이 hGDF-15 상의 입체형태적 또는 불연속 에피토프에 대한 결합이고, 상기 입체형태적 또는 불연속 에피토프가 서열번호 25 및 서열번호 26의 아미노산 서열로 구성되거나, 또는
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 영역이 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 영역, 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 영역 및 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하고, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 영역이 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 영역, ser-ala-ser 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 영역 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는,
    검출 키트.
  19. 제18항에 있어서, 상기 검출 키트는 인간 흑색종 환자의 생존 확률을 예측하기 위한 시험관내 방법에 사용하기 위한 것인, 검출 키트.
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 삭제
  27. 삭제
  28. 삭제
  29. 삭제
  30. 삭제
  31. 삭제
  32. 삭제
  33. 삭제
  34. 삭제
  35. 삭제
  36. 삭제
  37. 삭제
KR1020187012437A 2015-10-02 2016-09-30 흑색종에 대한 진단 마커로서 gdf-15 KR102615220B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB1517528.4 2015-10-02
GBGB1517528.4A GB201517528D0 (en) 2015-10-02 2015-10-02 GDF-15 as a diagnosis marker for melanoma
PCT/EP2016/073521 WO2017055614A1 (en) 2015-10-02 2016-09-30 Gdf-15 as a diagnostic marker for melanoma

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20180054869A KR20180054869A (ko) 2018-05-24
KR102615220B1 true KR102615220B1 (ko) 2023-12-15

Family

ID=54606073

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020187012437A KR102615220B1 (ko) 2015-10-02 2016-09-30 흑색종에 대한 진단 마커로서 gdf-15

Country Status (11)

Country Link
US (3) US20190004047A1 (ko)
EP (1) EP3356826B1 (ko)
JP (1) JP6840136B2 (ko)
KR (1) KR102615220B1 (ko)
AU (1) AU2016333540B2 (ko)
CA (1) CA3000292C (ko)
DK (1) DK3356826T3 (ko)
FI (1) FI3356826T3 (ko)
GB (1) GB201517528D0 (ko)
PT (1) PT3356826T (ko)
WO (1) WO2017055614A1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI710377B (zh) 2017-05-23 2020-11-21 丹麥商諾佛 儂迪克股份有限公司 Ｍｉｃ－１化合物及其用途

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130071953A1 (en) * 2010-05-17 2013-03-21 Roche Diagnostics Operations, Inc. Gdf-15 based means and methods for survival and recovery prediction in acute inflammation
WO2014049087A1 (en) 2012-09-26 2014-04-03 Julius-Maximilians-Universität Würzburg Monoclonal antibodies to growth and differentiation factor 15 (gdf-15)

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2774620A1 (en) 2004-04-13 2014-09-10 St Vincent's Hospital Sydney Limited Method for modulating weight loss
AU2008286706B2 (en) 2007-08-16 2014-03-06 Garvan Institute Of Medical Research Agents and methods for modulating macrophage inhibitory cytokine (MIC-1) activity
CA2737597C (en) * 2008-10-16 2017-03-14 University Of Pittsburgh-Of The Commonwealth System Of Higher Education Fully human antibodies to high molecular weight-melanoma associated antigen and uses thereof
EP2506015A1 (en) * 2011-04-01 2012-10-03 Universität Regensburg A prognostic and therapeutic signature for malignant melanoma
KR20130071953A (ko) * 2011-12-21 2013-07-01 에스케이하이닉스 주식회사 집적 회로
JP2015078138A (ja) 2013-10-15 2015-04-23 株式会社ニックス 小動物防除性樹脂組成物
HRP20231514T1 (hr) * 2014-03-26 2024-03-01 Julius-Maximilians-Universität Würzburg Monoklonska antitijela za faktor rasta i diferencijacije 15 (gdf-15), te njihova uporaba za liječenje tumorske kaheksije i raka

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130071953A1 (en) * 2010-05-17 2013-03-21 Roche Diagnostics Operations, Inc. Gdf-15 based means and methods for survival and recovery prediction in acute inflammation
WO2014049087A1 (en) 2012-09-26 2014-04-03 Julius-Maximilians-Universität Würzburg Monoclonal antibodies to growth and differentiation factor 15 (gdf-15)

Non-Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Andreas Mauerer et al, Experimental Dermatology (2011.), vol 20, no 6, pp 502-507.
B Weide et al, British Journal of Cancer (2012.), vol 107, no 3, pp 422-428.
Betul Unal et al, Archives of Dermatological Research (2015.), vol 307, pp 551-557.
Daniela Suesskind et al, Clinical and Experimental Ophthalmology (2012.), vol 250, pp 887-895.
Glen M Boyle et al, Journal of Investigative Dermatology (2009.), vol 129, no 2, pp 383-391.
Harriet M Kluger et al, Clinical Cancer Research (2011.), vol 17, no 8, pp 2417-2425.
Jill Corre et al, Stem Cells Translational Medicine (2013.), vol 2, no 12, pp 946-952.
Konstantinos G Lasithiotakis et al, Cancer (2006.), vol 107, no 6, pp 1331-1339.
Murielle Mimeault et al, Journal of Cellular Physiology (2010.), vol 224, no 3, pp 626-635.
Sung Jin Huh et al, The American Journal of Pathology (2010.), vol 176, no 6, pp 2948-2957.

Also Published As

Publication number Publication date
CA3000292A1 (en) 2017-04-06
CA3000292C (en) 2024-01-09
JP2018535403A (ja) 2018-11-29
KR20180054869A (ko) 2018-05-24
EP3356826A1 (en) 2018-08-08
FI3356826T3 (fi) 2024-01-08
JP6840136B2 (ja) 2021-03-10
AU2016333540A1 (en) 2018-05-10
AU2016333540B2 (en) 2022-03-31
DK3356826T3 (da) 2024-01-15
EP3356826B1 (en) 2023-12-06
GB201517528D0 (en) 2015-11-18
US20200386758A1 (en) 2020-12-10
US20230408521A1 (en) 2023-12-21
WO2017055614A1 (en) 2017-04-06
PT3356826T (pt) 2024-01-09
US20190004047A1 (en) 2019-01-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20220242942A1 (en) Gdf-15 as a diagnostic marker to predict the clinical outcome of a treatment with immune checkpoint blockers
AU2020260440B2 (en) Monoclonal antibodies to growth and differentiation factor 15 (GDF-15), and uses thereof for treating cancer cachexia and cancer
JP7443298B2 (ja) ヒト成長分化因子１５（ｇｄｆ－１５）の阻害剤及び免疫チェックポイントブロッカーを使用する併用療法
RU2657517C2 (ru) Анализ адромедуллина и способы определения зрелого адромедуллина
US20230408521A1 (en) Gdf-15 as a diagnostic marker for melanoma
JP5876833B2 (ja) 抗１本鎖ｉｖ型コラーゲンポリペプチド抗体、並びに該抗体を含む医薬、及び腫瘍の診断薬、予防薬、又は治療薬
US20200283515A1 (en) Anti-human migration stimulating factor (msf) and uses thereof
CA3115887A1 (en) Antibodies specific for glycosylated apoj and uses thereof
EA044887B1 (ru) Комбинированное лечение с использованием ингибиторов человеческого фактора роста и дифференцировки 15 (gdf-15) и блокаторов контрольных точек иммунного ответа
CN117883572A (zh) 人gdf-15抑制剂和含其的组合物与试剂盒及其应用
US20130143231A1 (en) MST1/STK4 PHOSPHO-THREONINE 120 (pMST-T120) ANTIBODY

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant