ES2967740T3 - GDF-15 como marcador de diagnóstico de melanoma - Google Patents
GDF-15 como marcador de diagnóstico de melanoma Download PDFInfo
- Publication number
- ES2967740T3 ES2967740T3 ES16778307T ES16778307T ES2967740T3 ES 2967740 T3 ES2967740 T3 ES 2967740T3 ES 16778307 T ES16778307 T ES 16778307T ES 16778307 T ES16778307 T ES 16778307T ES 2967740 T3 ES2967740 T3 ES 2967740T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- hgdf
- level
- antibody
- survival
- probability
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 title claims abstract description 83
- 108010041834 Growth Differentiation Factor 15 Proteins 0.000 title description 112
- 239000003550 marker Substances 0.000 title description 8
- 102000000597 Growth Differentiation Factor 15 Human genes 0.000 title 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 claims abstract description 139
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 119
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 95
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 154
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 99
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 99
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 99
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 86
- 102000003855 L-lactate dehydrogenase Human genes 0.000 claims description 73
- 108700023483 L-lactate dehydrogenases Proteins 0.000 claims description 73
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 72
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 72
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 55
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 claims description 53
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 claims description 38
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 claims description 25
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 21
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 19
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims description 13
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 9
- 239000012327 Ruthenium complex Substances 0.000 claims description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 7
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 claims description 6
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 claims description 6
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 5
- YQHZVYJAGWMHES-ZLUOBGJFSA-N Ser-Ala-Ser Chemical group OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YQHZVYJAGWMHES-ZLUOBGJFSA-N 0.000 claims description 4
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 claims description 4
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 claims description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 3
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 claims description 2
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 claims description 2
- -1 ser-ala-ser amino acids Chemical group 0.000 claims description 2
- 101000893549 Homo sapiens Growth/differentiation factor 15 Proteins 0.000 abstract description 200
- 102000046181 human GDF15 Human genes 0.000 abstract description 198
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 abstract description 36
- 102100040896 Growth/differentiation factor 15 Human genes 0.000 description 109
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 47
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 35
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 24
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 23
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 21
- 102100035360 Cerebellar degeneration-related antigen 1 Human genes 0.000 description 20
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 20
- 101000737793 Homo sapiens Cerebellar degeneration-related antigen 1 Proteins 0.000 description 19
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 19
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 18
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 18
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 17
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 17
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 15
- 101100112922 Candida albicans CDR3 gene Proteins 0.000 description 14
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 14
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 14
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 11
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 11
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 10
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 10
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 10
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 10
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 10
- 238000000611 regression analysis Methods 0.000 description 10
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 8
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 8
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 8
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 8
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 238000011984 electrochemiluminescence immunoassay Methods 0.000 description 7
- 239000000092 prognostic biomarker Substances 0.000 description 7
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 6
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 6
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 6
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 6
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 6
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 6
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 6
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 6
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 6
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 6
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 6
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 5
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 5
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 5
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 5
- 230000009278 visceral effect Effects 0.000 description 5
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 4
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 4
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 4
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 4
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 4
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 4
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 4
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 4
- 238000001325 log-rank test Methods 0.000 description 4
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 238000000491 multivariate analysis Methods 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 4
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 4
- 238000007473 univariate analysis Methods 0.000 description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 206010027480 Metastatic malignant melanoma Diseases 0.000 description 3
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 description 3
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 201000005969 Uveal melanoma Diseases 0.000 description 3
- 238000009098 adjuvant therapy Methods 0.000 description 3
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 3
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 3
- 208000035250 cutaneous malignant susceptibility to 1 melanoma Diseases 0.000 description 3
- 208000030381 cutaneous melanoma Diseases 0.000 description 3
- 230000034994 death Effects 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 3
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 238000010197 meta-analysis Methods 0.000 description 3
- 208000021039 metastatic melanoma Diseases 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 201000003708 skin melanoma Diseases 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 3-(dimethylamino)propyliminomethylidene-ethylazanium;chloride Chemical compound Cl.CCN=C=NCCCN(C)C FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 241000282836 Camelus dromedarius Species 0.000 description 2
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 2
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N HA peptide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=C(O)C=C1 HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N 0.000 description 2
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 2
- 101000737796 Homo sapiens Cerebellar degeneration-related protein 2 Proteins 0.000 description 2
- 101000960969 Homo sapiens Interleukin-5 Proteins 0.000 description 2
- 101000984753 Homo sapiens Serine/threonine-protein kinase B-raf Proteins 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- 238000010824 Kaplan-Meier survival analysis Methods 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-REOHCLBHSA-N L-lactic acid Chemical compound C[C@H](O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-O NAD(+) Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-O 0.000 description 2
- 208000007256 Nevus Diseases 0.000 description 2
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 2
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 102100027103 Serine/threonine-protein kinase B-raf Human genes 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000001772 Wald test Methods 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 2
- 208000029028 brain injury Diseases 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000009137 competitive binding Effects 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 2
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 2
- 229960005386 ipilimumab Drugs 0.000 description 2
- 229940116871 l-lactate Drugs 0.000 description 2
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 2
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N methionine Chemical compound CSCCC(N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002829 mitogen activated protein kinase inhibitor Substances 0.000 description 2
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 2
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 2
- 238000002638 palliative care Methods 0.000 description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 2
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 2
- 238000013517 stratification Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000009095 third-line therapy Methods 0.000 description 2
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GVJXGCIPWAVXJP-UHFFFAOYSA-N 2,5-dioxo-1-oxoniopyrrolidine-3-sulfonate Chemical compound ON1C(=O)CC(S(O)(=O)=O)C1=O GVJXGCIPWAVXJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 6-aminohexanoic acid Chemical class NCCCCCC(O)=O SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 102100022717 Atypical chemokine receptor 1 Human genes 0.000 description 1
- 102000008096 B7-H1 Antigen Human genes 0.000 description 1
- 102100038078 CD276 antigen Human genes 0.000 description 1
- 206010006895 Cachexia Diseases 0.000 description 1
- 101100279186 Caenorhabditis elegans efn-4 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000557626 Corvus corax Species 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010051542 Early Growth Response Protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100023226 Early growth response protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 206010063045 Effusion Diseases 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 description 1
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 description 1
- 102000002254 Glycogen Synthase Kinase 3 Human genes 0.000 description 1
- 108010014905 Glycogen Synthase Kinase 3 Proteins 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 101000678879 Homo sapiens Atypical chemokine receptor 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000884279 Homo sapiens CD276 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101000889276 Homo sapiens Cytotoxic T-lymphocyte protein 4 Proteins 0.000 description 1
- 101001117317 Homo sapiens Programmed cell death 1 ligand 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000611936 Homo sapiens Programmed cell death protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 238000000585 Mann–Whitney U test Methods 0.000 description 1
- 206010027452 Metastases to bone Diseases 0.000 description 1
- 206010027458 Metastases to lung Diseases 0.000 description 1
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 1
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 1
- 208000003788 Neoplasm Micrometastasis Diseases 0.000 description 1
- 101000690439 Nicotiana tabacum Floral homeotic protein AGAMOUS Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000009077 Pigmented Nevus Diseases 0.000 description 1
- 102100040678 Programmed cell death protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- KJTLSVCANCCWHF-UHFFFAOYSA-N Ruthenium Chemical class [Ru] KJTLSVCANCCWHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 description 1
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 1
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 1
- 108010040002 Tumor Suppressor Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000001742 Tumor Suppressor Proteins Human genes 0.000 description 1
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000006682 Warburg effect Effects 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002424 anti-apoptotic effect Effects 0.000 description 1
- 229940124599 anti-inflammatory drug Drugs 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 230000009833 antibody interaction Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002869 basic local alignment search tool Methods 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000009223 counseling Methods 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 238000013480 data collection Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 1
- 230000000925 erythroid effect Effects 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000009093 first-line therapy Methods 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009432 framing Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 description 1
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 102000043321 human CTLA4 Human genes 0.000 description 1
- 230000007954 hypoxia Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000003365 immunocytochemistry Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000011337 individualized treatment Methods 0.000 description 1
- 231100000405 induce cancer Toxicity 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 201000002699 melanoma in congenital melanocytic nevus Diseases 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000003147 molecular marker Substances 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 230000000683 nonmetastatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 description 1
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 1
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 description 1
- 238000010837 poor prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000000861 pro-apoptotic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000007430 reference method Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000008672 reprogramming Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 229960004641 rituximab Drugs 0.000 description 1
- 102220028358 rs386352325 Human genes 0.000 description 1
- 239000012146 running buffer Substances 0.000 description 1
- 229910052707 ruthenium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000009094 second-line therapy Methods 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- RPENMORRBUTCPR-UHFFFAOYSA-M sodium;1-hydroxy-2,5-dioxopyrrolidine-3-sulfonate Chemical compound [Na+].ON1C(=O)CC(S([O-])(=O)=O)C1=O RPENMORRBUTCPR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 210000004872 soft tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000013179 statistical model Methods 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004885 tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 1
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000005740 tumor formation Effects 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 230000036269 ulceration Effects 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 230000006459 vascular development Effects 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 208000016261 weight loss Diseases 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57407—Specifically defined cancers
- G01N33/5743—Specifically defined cancers of skin, e.g. melanoma
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
- G01N33/57488—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds identifable in body fluids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/475—Assays involving growth factors
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/475—Assays involving growth factors
- G01N2333/495—Transforming growth factor [TGF]
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
La presente invención se refiere a métodos para predecir la probabilidad de supervivencia de un paciente con cáncer de melanoma humano basándose en niveles de GDF-15 humano, y a aparatos y kits que pueden usarse en estos métodos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
GDF-15 como marcador de diagnóstico de melanoma
Campo de la invención
La presente invención se refiere a métodos para predecir la probabilidad de supervivencia de un paciente con cáncer de melanoma humano tal como se define en las reivindicaciones adjuntas 1 a 12, y a aparatos configurados para realizar dichos métodos, y a usos de kits en estos métodos.
Antecedentes
El nivel sérico de lactato deshidrogenasa (sLDH) es el biomarcador de pronóstico más ampliamente usado en melanoma y se ha incorporado en el sistema de estadificación del AJCC para pacientes con melanoma con metástasis a distancia desde 2001 (Balch, CMet al., J Clin Oncol/19/3635-48. 2001). Diferentes grupos de investigación han identificado sLDH como un marcador de pronóstico independiente para pacientes con enfermedad irresecable (Sirott, MNet al., Cancer/72/3091-8. 1993; Eton, Oet al., J Clin Oncol /16/1103-11. 1998; Manola, Jet al., J Clin Oncol/18/3782-93. 2000). Los resultados de un metanálisis integral basado en un gran conjunto de estudios clínicos (31.857 pacientes con diversos tumores sólidos) confirmaron el efecto constante de la LDH elevada en la SG (HR = 1,48; IC del 95 % = 1,43 a 1,53) en todos los subgrupos de enfermedades y estadios, con particular relevancia para los tumores metastásicos. Si bien el mecanismo exacto que subyace a la promoción tumoral por parte de la LDH sigue siendo desconocido y también puede estar relacionado con la hipoxia y la reprogramación metabólica a través del efecto Warburg, la LDH también refleja una alta carga tumoral (Zhang, J., Yao, Y.-H., Li, B.-G., Yang, Q., Zhang, P.-Y. y Wang, H.-T. (2015). Prognostic value of pretreatment serum lactate dehydrogenase level in patients with solid tumors: a systematic review and meta-analysis. Scientific Reports 5, 9800). Aun así, existe la necesidad de biomarcadores de pronóstico mejorados para los pacientes con melanoma.
Las concentraciones séricas de S100B (sS100B) se usan ampliamente sobre todo en Europa para detectar pacientes sin evidencia de enfermedad para detectar recaídas tempranamente (Pflugfelder, Aet al., J Dtsch Dermatol Ges/11 supl. 6/1-116, 1-26. 2013). Un metanálisis de Mocellinet al.resumió la evidencia sobre la idoneidad de sS100B para predecir la supervivencia de los pacientes. En este análisis se incluyeron veintidós series en las que participaron 3393 pacientes que comprendía todos los estadios. La positividad sérica de S100B se asoció con una supervivencia significativamente peor en pacientes con melanoma de todos los estadios, especialmente en el subgrupo de pacientes en estadios I a III, independientemente de otros factores de pronóstico (Mocellin, Set al., Int J Cancer/123/2370-6. 2008). En estudios anteriores, se demostró que sS100B y sLDH tenían un impacto independiente en el pronóstico de pacientes con metástasis a distancia y el análisis combinado de ambos marcadores podría usarse para seleccionar pacientes para metastasectomía completa (Weide, Bet al., PLoS One/8/e81624.2013; Weide, Bet al., Br J Cancer/107/422-8. 2012). Sin embargo, a pesar de esta gran evidencia, no existe un consenso mundial sobre su implementación en el entorno clínico habitual en pacientes con melanoma. El factor de crecimiento y diferenciación 15 (GDF-15, también conocido como citocina-1 inhibidora de macrófagos (MIC-1), TGF-� placentario (PTGF�), proteína morfogenética del hueso placentario (PLAB), gen activado por fármacos antiinflamatorios no esteroideos (NAG1) o factor derivado de la próstata (PDF) está sobreexpresado en células tumorales de varios tipos de cánceres sólidos (Mimeault, Met al., Br J Cancer/108/1079-91.2013; Bock, AJet al., Int J Gynecol Cancer / 20 / 1448-55.2010; Zhang, Let al., Oral Oncol/45/627-32.2009). GDF-15 es inducido por varias rutas supresoras de tumores, incluyendo p53, GSK-3� y EGR-1 (Wang, Xet al., Biochem Pharmacol 1851 597-606.2013) y también hay evidencia de que el propio GDF-15 puede ejercer efectos supresores de tumores, tal como se muestra en modelos de xenoinjerto de ratón desnudo (Martínez, JMet al., J Pharmacol Exp Ther/318/899-906. 2006; Eling, TEet al., J Biochem Mol Biol/39/649-55. 2006) y en ratones transgénicos (Baek, SJet al., Mol Pharmacol/59/901-8. 2001). Con respecto a las células tumorales, se han descrito efectos tanto proapoptóticos como antiapoptóticos para GDF-15 (Mimeault, Met al., Br J Cancer/108/1079-91. 2013; Baek, SJet al., Mol Pharmacol/59/901-8. 2001; Zimmers, TAet al., J Cancer Res Clin Oncol/136/571-6. 2010; Jones, MFet al., Cell Death Differ / 2015) y se ha sugerido una multitud de posibles rutas de señalización (Mimeault, M y Batra SK, J Cell Physiol/224/626-35. 2010). Recientemente se aumentó la complejidad cuando se demostró que la proproteína no procesada ingresa al núcleo donde alteró la señalización de SMAD dependiente de TGF-beta y, por tanto, los patrones de transcripción (Min, KWet al., Oncogene / 2015).In vivo, la sobreexpresión constitutiva de GDF-15 redujo la formación de tumores, pero aumentó la metástasis en un modelo animal para cáncer de próstata (Husaini, Yet al., PLoS One/7/e43833.2012). Además, se demostró que el GDF-15 induce caquexia por cáncer (Johnen, Het al., Nat Med/13/1333-40.2007). De manera similar, las solicitudes de patentes WO 2005/099746 y WO 2009/021293 se refieren a un anticuerpo anti-GDF-15 humano (Mab26) capaz de antagonizar los efectos de GDF-15 humano (hGDF-15) sobre la pérdida de peso inducida por tumoresin vivoen ratones. Los documentos WO 2014/049087 y PCT/EP2015/056654 se refieren a anticuerpos monoclonales contra hGDF-15 y usos médicos de los mismos.
Clínicamente, se encontró que un nivel sérico alto de GDF-15 (sGDF-15) se correlaciona con la presencia de metástasis óseas y un mal pronóstico en el cáncer de próstata (Selander, KSet al., Cancer Epidemiol Biomarkers Prev /16/532-7.2007). En el cáncer colorrectal, los pacientes con niveles plasmáticos altos mostraron un tiempo más corto hasta la recaída y una supervivencia global reducida (Wallin, Uet al., Br J Cancer/104/1619-27. 2011). El polimorfismo alélico H6D en el gen GDF-15 se identificó además como un predictor independiente de metástasis en el momento del diagnóstico (Brown, DA, Clin Cancer Res/9/2642-50. 2003). La asociación entre un nivel alto de sGDF-15 y un desenlace desfavorable se demostró además en cánceres de tiroides, páncreas, gástrico, de ovario y otros (Mimeault, M y Batra SK, J Cell Physiol/224/626-35. 2010; Bauskin, ARet al., Cancer Res/66/4983-6. 2006; Brown, DAet al., Clin Cancer Res/15/6658-64. 2009; Blanco-Calvo, Met al., Future Oncol/10/1187-202. 2014; Personal, ACet al., Gynecol Oncol/118/237-43. 2010). También se han informado hallazgos similares para el nivel de expresión tisular de GDF-15 evaluado mediante inmunohistoquímica (Wallin, Uet al., Br J Cancer/104/1619-27.
2011). En el melanoma, se encontró que la expresión de GDF-15 aumenta desde nevos benignos sobre melanoma primario hasta metástasis de melanoma (Mauerer, Aet al., Exp Dermatol/20/502-7.2011; Boyle, GMet al., J Invest Dermatol/129/383-91.2009). Las concentraciones séricas de GDF-15 fueron indicativas de metástasis en pacientes con melanoma uveal (Suesskind, Det al., Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol/250/887-95.2012) y se correlacionaron con el estadio en pacientes con melanoma cutáneo (Kluger, HMet al., ClinCancer Res/17/2417-25. 2011). Rikeret al.compararon la expresión genética en metástasis de melanoma y tumor primario, e identificaron GDF-15 como el único factor soluble entre los 5 principales genes que se correlacionan con metástasis (Riker, Alet al., BMC Med Genomics 11/13. 2008). Boyleet al.(Boyle, GMet al., J Invest Dermatol/129/383-91. 2009) encontraron mediante inmunohistoquímica que 15 de 22 melanomas primarios expresaban niveles bajos de GDF-15, mientras que 16 de 16 metástasis de melanoma mostraban una fuerte expresión. Además, la inactivación de GDF-15 en tres líneas celulares de melanoma da como resultado una disminución de la tumorigenicidad en el mismo estudio. Antes de eso, Talantovet al.(Talantov, Det al., Clin Cancer Res/11/7234-42. 2005) ya habían identificado GDF-15 en metástasis de melanoma, pero no en nevos ni ganglios linfáticos normales. Se informaron hallazgos similares en un estudio de Mauereret al.quienes encontraron que GDF-15 se expresa preferentemente en tumores metastásicos y en algunos melanomas primarios, pero no en nevos melanocíticos (Mauerer, Aet al., Exp Dermatol/20/502-7.2011). Sin embargo, sólo se ha demostrado un papel directo del GDF-15 en la metástasis en el cáncer de próstata, donde la sobreexpresión constitutiva de GDF-15 ralentizó el desarrollo del cáncer, pero aumentó las metástasis (Husaini, Yet al., PLoS One/7/e43833.2012). En dos estudios se informó la relevancia clínica de los niveles séricos de GDF-15 en pacientes con melanoma. Las concentraciones séricas de GDF-15 se asociaron con metástasis en una cohorte de 188 pacientes con melanoma uveal metastásico (n = 170) o no metastásico (n = 18) (Suesskind, Det al., Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol/250/887-95. 2012). Finalmente, Klugeret al.informaron una correlación entre los niveles plasmáticos de GDF-15 y el estadio en 216 pacientes con melanoma cutáneo (Kluger, HMet al., ClinCancer Res/17/2417-25. 2011). Sin embargo, en contraste con estos hallazgos, algunos estudios han sugerido un papel antitumoral del GDF-15 (véase, por ejemplo, Liu Tet al.: “Macrophage inhibitory cytokine 1 reduces cell adhesion and induces apoptosis in prostate cancer cells.” Cancer Res., vol. 63, n.º 16, 1 de agosto de 2003, páginas 5034-5040). Huhet al.(Soy J Pathol / 176 / 2948-57.2010) informan que la citocina-1 inhibidora de macrófagos regula el desarrollo vascular del melanoma. Lasithiotakiset al.(Cancer/107/1331-9. 2006) se refiere a la incidencia y mortalidad del melanoma cutáneo en el sur de Alemania. Correet al.(Stem Cells Transl Med/2/946-952. 2013) se refieren a Growth Differentiation Factor 15 in Pathology: A Clinical Role?. Ünalet al.(Arch Dermatol Res/307/551-7.
2015) se refieren a las funciones divergentes del factor de diferenciación de crecimiento 15 (GDF-15) en patologías cutáneas benignas y malignas.
Por tanto, a partir de los estudios mencionados anteriormente, y en vista del complejo papel funcional del GDF-15 humano (hGDF-15) en diversos cánceres y sus diferentes efectos sobre los tumores primarios y las metástasis en el cáncer de próstata, aún no se sabe, sin embargo, si hGDF-15 podría usarse como marcador clínico de pronóstico de la supervivencia del paciente con melanoma.
Por tanto, existe una necesidad en la técnica de biomarcadores de pronóstico para melanoma, y en particular de biomarcadores de pronóstico mejorados en melanoma, y de métodos que permitan predecir la supervivencia del paciente con melanoma de manera más fiable.
Descripción de la invención
La presente invención es tal como se define en las reivindicaciones adjuntas. La presente invención satisface las necesidades anteriores y resuelve los problemas anteriores en la técnica proporcionando las realizaciones que se describen a continuación:
En particular, para resolver los problemas anteriores, los presentes inventores se propusieron investigar el impacto de los niveles séricos de GDF-15 en la supervivencia global (SG) de pacientes con melanoma. En el transcurso de estos estudios, los presentes inventores han descubierto sorprendentemente que la probabilidad de supervivencia en pacientes con melanoma disminuye significativamente con niveles de hGDF-15 crecientes en los sueros de pacientes y viceversa. Los inventores han demostrado que un nivel sérico elevado de hGDF-15 es un potente biomarcador de supervivencia global deficiente en pacientes con melanoma en estadio III sin tumor y en pacientes con melanoma en estadio IV irresecable.
Por tanto, según la invención, la probabilidad de supervivencia en pacientes con melanoma se correlaciona inversamente con los niveles de hGDF-15.
Además, en los estudios de los inventores, el análisis de regresión de Cox reveló que el conocimiento de los niveles séricos de hGDF-15 añade información de pronóstico independiente, por ejemplo, si se considera en combinación con la categoría M, y es superior al biomarcador establecido LDH en pacientes con metástasis a distancia.
Por tanto, según la invención, los niveles de hGDF-15 pueden usarse como biomarcador para la predicción de la supervivencia. Este biomarcador es ventajoso, por ejemplo, porque tiene un valor de pronóstico independiente de biomarcadores conocidos tales como LDH. Esto significa que si se usan niveles de hGDF-15 para la predicción de la supervivencia del paciente con melanoma según la invención, pueden, en un aspecto preferido de la invención, combinarse con biomarcadores adicionales.
Según la invención, la combinación de niveles de hGDF-15 como biomarcador con biomarcadores adicionales tales como LDH o S100B proporciona una predicción mejorada de la supervivencia, que se mejora incluso en comparación con el uso de niveles de hGDF-15 solos.
Además, el uso del nivel de hGDF-15 como biomarcador también es ventajoso porque permite proporcionar una predicción de supervivencia que incluye subgrupos de pacientes con melanoma, tales como pacientes en estadio III macroscópicamente sin tumor, para los cuales S100B representa el único marcador predictivo y de diagnóstico disponible.
La presente invención es tal como se define en las reivindicaciones adjuntas. Por tanto, la presente invención proporciona medios mejorados para predecir la supervivencia de pacientes con melanoma tal como se detalla a continuación:
1. Un método para predecir la probabilidad de supervivencia de un paciente con melanoma humano, en el que el método comprende las etapas de:
a) determinar el nivel de hGDF-15 en una muestra de sangre humana obtenida de dicho paciente; y
b) predecir dicha probabilidad de supervivencia basándose en el nivel determinado de hGDF-15 en dicha muestra de sangre humana; en el que un nivel disminuido de hGDF-15 en dicha muestra de sangre humana indica una probabilidad aumentada de supervivencia,
en el que el paciente con melanoma humano es un paciente con melanoma en estadio III sin tumor o un paciente con melanoma en estadio IV irresecable,
en el que la etapa b) comprende comparar dicho nivel de hGDF-15 determinado en la etapa a) con un nivel umbral de hGDF-15, en el que dicha probabilidad se predice basándose en la comparación de dicho nivel de hGDF-15 determinado en la etapa a) con dicho nivel umbral de hGDF-15; y en el que un nivel de hGDF-15 en dicha muestra de sangre humana que está disminuido en comparación con dicho nivel umbral de hGDF-15 indica que la probabilidad de supervivencia está aumentada en comparación con una probabilidad de supervivencia en o por encima de dicho nivel umbral de hGDF-15,
en el que la muestra de sangre humana es una muestra de suero humano, y
en el que el nivel umbral de hGDF-15 es un nivel seleccionado del intervalo de entre 1,1 ng/ml y 2,2 ng/ml.
2. El método del punto 1, en el que el nivel umbral de hGDF-15 es un nivel de hGDF-15 seleccionado del intervalo de entre 1,2 ng/ml y 2,0 ng/ml.
3. El método del punto 1, en el que el nivel umbral de hGDF-15 es un nivel de hGDF-15 seleccionado del intervalo de entre 1,3 ng/ml y 1,8 ng/ml.
4. El método del punto 1, en el que el nivel umbral de hGDF-15 es un nivel de hGDF-15 seleccionado del intervalo de entre 1,4 ng/ml y 1,6 ng/ml.
5. El método del punto 1, en el que el nivel umbral de hGDF-15 es de 1,5 ng/ml.
6. El método según uno cualquiera de los puntos anteriores,
en el que la etapa a) comprende además determinar el nivel de lactato deshidrogenasa en dicha muestra de sangre humana, y
en el que en la etapa b), dicha probabilidad de supervivencia también se predice basándose en el nivel determinado de lactato deshidrogenasa en dicha muestra de sangre humana; y en el que un nivel disminuido de lactato deshidrogenasa en dicha muestra de sangre humana indica una probabilidad aumentada de supervivencia; en el que opcionalmente, la etapa b) comprende comparar dicho nivel de lactato deshidrogenasa determinado en la etapa a) con un nivel umbral de lactato deshidrogenasa, en el que dicha probabilidad también se predice basándose en la comparación de dicho nivel de lactato deshidrogenasa determinado en la etapa a) con dicho nivel umbral de lactato deshidrogenasa; y en el que un nivel de lactato deshidrogenasa en dicha muestra de sangre humana que está disminuido en comparación con dicho nivel umbral de lactato deshidrogenasa o está en dicho nivel umbral de lactato deshidrogenasa indica que la probabilidad de supervivencia está aumentada en comparación con una probabilidad de supervivencia por encima de dicho nivel umbral de lactato deshidrogenasa;
en el que opcionalmente, la etapa a) comprende además determinar el nivel de S100B en dicha muestra de sangre humana, y en el que en la etapa b), dicha probabilidad de supervivencia también se predice basándose en el nivel determinado de S100B en dicha muestra de sangre humana; y en el que un nivel disminuido de S100B en dicha muestra de sangre humana indica una probabilidad aumentada de supervivencia,
preferiblemente en el que la etapa b) comprende comparar dicho nivel de S100B determinado en la etapa a) con un nivel umbral de S100B, en el que dicha probabilidad se predice basándose en la comparación de dicho nivel de S100B determinado en la etapa a) con dicho nivel umbral de S100B; y en el que un nivel de S100B en dicha muestra de sangre humana que está disminuido en comparación con dicho nivel umbral de S100B o está en dicho nivel umbral de S100B indica que la probabilidad de supervivencia está aumentada en comparación con una probabilidad de supervivencia por encima de dicho nivel umbral de S100B.
7. El método según cualquiera de los puntos anteriores, en el que en la etapa b), dicha probabilidad de supervivencia también se predice basándose en la edad de dicho paciente; y en el que una edad aumentada indica una probabilidad disminuida de supervivencia,
preferiblemente en el que la etapa b) comprende comparar dicha edad de dicho paciente con una edad umbral, en el que dicha probabilidad se predice basándose en la comparación de dicha edad de dicho paciente con dicha edad umbral; y en el que una edad de dicho paciente que es igual o mayor en comparación con dicha edad umbral indica que la probabilidad de supervivencia está disminuida en comparación con una probabilidad de supervivencia por debajo de dicha edad umbral,
más preferiblemente en el que dicha edad umbral se selecciona del intervalo de 60 a 65 años,
más preferiblemente en el que dicha edad umbral es de 63 años.
8. El método según uno cualquiera de los puntos anteriores, en el que en la etapa b), dicha probabilidad de supervivencia también se predice basándose en la metástasis; y en el que la presencia de metástasis en órganos viscerales distintos del pulmón indica que la probabilidad de supervivencia está disminuida en comparación con la probabilidad de supervivencia cuando no hay metástasis en órganos viscerales distintos del pulmón.
9. El método según cualquiera de los puntos anteriores, en el que la etapa a) comprende determinar el nivel de hGDF-15 usando uno o más anticuerpos capaces de unirse a hGDF-15 o una porción de unión a antígeno del mismo,
preferiblemente en el que el uno o más anticuerpos capaces de unirse a hGDF-15 o la porción de unión a antígeno del mismo forman un complejo con hGDF-15,
y/o en el que el uno o más anticuerpos comprenden al menos un anticuerpo policlonal,
y/o en el que el uno o más anticuerpos o la porción de unión a antígeno comprenden al menos un anticuerpo monoclonal o una porción de unión a antígeno del mismo, y en el que la unión es preferiblemente unión a un epítopo conformacional o discontinuo en hGDF-15, y en el que el epítopo conformacional o discontinuo está comprendido por las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 26, y en el que preferiblemente, el anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende una región CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, una región CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 y una región CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, y el anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende una región CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, una región CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos ser-ala-ser y una región CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7.
10. El método según uno cualquiera de los puntos 1 a 9, en el que en la etapa a), el nivel de hGDF-15 se determina capturando hGDF-15 con un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo según el punto 9 y detectando hGDF-15 con un anticuerpo policlonal, o detectando hGDF-15 con un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a un epítopo diferente al del anticuerpo que captura hGDF-15.
11. El método según uno cualquiera de los puntos anteriores, en el que el método es un métodoin vitro.
12. El método según uno cualquiera de los puntos anteriores,
en el que
(i) en la etapa a), el nivel de hGDF-15 en la muestra de sangre humana se determina mediante un ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas, o
(ii) en la etapa a), el nivel de hGDF-15 en la muestra de sangre humana se determina mediante un ensayo de electroquimioluminiscencia, y en el que el ensayo de electroquimioluminiscencia es preferiblemente un método de detección tipo sándwich que comprende una etapa de formar un complejo de detección entre
(A) perlas recubiertas de estreptavidina;
(B) un primer anticuerpo biotinilado o porción de unión a antígeno del mismo capaz de unirse a hGDF-15;
(C) hGDF-15 de la muestra; y
(D) un segundo anticuerpo marcado con complejo de rutenio o porción de unión a antígeno del mismo capaz de unirse a hGDF-15;
en el que dicho complejo de detección tiene la estructura (A)-(B)-(C)-(D), y en el que el primer anticuerpo biotinilado o la porción de unión a antígeno del mismo se une a un primer epítopo de hGDF-15 y el segundo anticuerpo marcado con complejo de rutenio o la porción de unión a antígeno del mismo se une a un segundo epítopo de hGDF-15 que es diferente de dicho primer epítopo de hGDF-15,
en el que el método comprende además una etapa de detectar el complejo de detección midiendo la electroquimioluminiscencia,
y en el que el nivel de hGDF-15 en la muestra de sangre humana se determina basándose en la medición de electroquimioluminiscencia.
13. Un aparato configurado para realizar el método según uno cualquiera de los puntos 1-12, en el que el aparato es un analizador de electroquimioluminiscencia configurado para realizar el método según el punto 12, en el que en la etapa a), el nivel de hGDF-15 en la muestra de sangre humana se determina mediante un ensayo de electroquimioluminiscencia.
14. Uso de un kit de detección en un método según cualquiera de los puntos 1-12, comprendiendo el kit de detección:
(i) perlas recubiertas de estreptavidina;
(ii) un primer anticuerpo biotinilado o porción de unión a antígeno del mismo capaz de unirse a hGDF-15;
(iii) hGDF-15 recombinante, preferiblemente en forma de una disolución tamponada que comprende hGDF-15 recombinante, teniendo la disolución tamponada un pH en el intervalo de 4 a 7;
(iv) un segundo anticuerpo marcado con complejo de rutenio o porción de unión a antígeno del mismo capaz de unirse a hGDF-15; y opcionalmente
(v) instrucciones de uso, preferiblemente instrucciones de uso en un método según los puntos 1-12; y preferiblemente
(vi) un recipiente que contiene dicho hGDF-15 recombinante, en el que la superficie del recipiente que está en contacto con hGDF-15 recombinante está recubierta con un material no adhesivo,
en el que el primer anticuerpo biotinilado o porción de unión a antígeno del mismo es capaz de unirse a un primer epítopo de hGDF-15 y el segundo anticuerpo marcado con complejo de rutenio o porción de unión a antígeno del mismo es capaz de unirse a un segundo epítopo de hGDF-15 que es diferente de dicho primer epítopo de hGDF-15, preferiblemente en el que uno del primer anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo capaz de unirse a hGDF-15 y el segundo anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo capaz de unirse a hGDF-15 es un anticuerpo monoclonal o porción de unión a antígeno del mismo, en el que la unión es unión a un epítopo conformacional o discontinuo en hGDF-15 que está comprendido por las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 26, y en el que preferiblemente,
el anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende una región CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, una región CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 y una región CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, y el anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende una región CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, una región CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos ser-ala-ser y una región CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1: Supervivencia global de distintas poblaciones de pacientes con melanoma según los niveles séricos de GDF-15. Se muestran las curvas de Kaplan-Meier para la supervivencia global de 468 pacientes en estadio III sin tumor (A), 206 pacientes en estadio IV irresecable (B) y 87 pacientes en estadio IV sin tumor (C) con niveles de GDF-15 o bien normales (<1,5 ng/ml) o bien elevados (≥1,5 ng/ml). La censura se indica con líneas verticales; los valores de p se calcularon mediante estadísticas de rango logarítmico. En las figuras 1A y 1B, las curvas superiores son las de niveles normales de hGDF-15 y las curvas inferiores son las de niveles elevados de hGDF-15.
Figura 2: Combinaciones de niveles séricos de S100B y GDF-15 y su correlación con la supervivencia global de pacientes en estadio III. Usando un modelo de regresión de Cox, se demostró que los niveles de S100B y hGDF-15 predicen de manera independiente el pronóstico de pacientes en estadio III sin tumor. Se presentan curvas de Kaplan-Meier de supervivencia global para pacientes con diferentes combinaciones de biomarcadores para 466 pacientes. La censura se indica con líneas verticales. En la figura 2, la curva más alta es la curva para los niveles normales de hGDF-15 y los niveles normales de S100B, la 2ª curva más alta es la curva para niveles elevados de hGDF-15, la 2ª curva más baja es la curva para niveles elevados de S100B, y la curva más baja es la de niveles elevados de hGDF-15 y niveles elevados de S100B.
Figura 3: Supervivencia global de pacientes en estadio IV irresecable según combinaciones de niveles séricos de LDH y GDF-15, y el patrón de metástasis a distancia. El impacto de pronóstico independiente de los niveles séricos de GDF-15 en la supervivencia global se ilustra para las categorías M, para los pacientes M1a/b (A), así como para los pacientes M1c (B). Las líneas discontinuas indican todos los pacientes de la categoría M dada. Las líneas continuas representan subgrupos con niveles de GDF-15 bajos (azul) o altos (rojo), respectivamente. Las diferencias en la SG entre pacientes con niveles de GDF-15 altos o bajos fueron significativas para los pacientes M1a/b y M1c (valores de p de rango logarítmico 0,047 y 0,003, respectivamente). En (C), la supervivencia global se muestra según el número de valores desfavorables considerando los 3 factores de pronóstico independientes según el modelo 1 del análisis de regresión de Cox (niveles de LDH, patrón de metástasis visceral y niveles de GDF-15). El orden de las curvas (es decir, el orden desde la curva más alta a la más baja) en la leyenda contenida en los paneles (A) a (C) de la figura refleja el orden de las curvas en los paneles respectivos.
Figura 4: La supervivencia global se correlaciona con los niveles séricos de GDF-15 en pacientes con melanoma. Se asignaron aleatoriamente 762 pacientes a dos cohortes. En la cohorte de identificación (254 pacientes), se sometieron a prueba diferentes valores de corte mediante análisis de Kaplan-Meier y pruebas de rango logarítmico para obtener la mejor discriminación posible entre pacientes con niveles séricos de GDF-15 altos y bajos. La supervivencia global de los pacientes de la cohorte de identificación según el punto de corte optimizado (<1,5 ng/ml frente a ≥1,5 ng/ml) se muestra en (A). Se confirmaron diferencias en la supervivencia global en 508 pacientes de la cohorte de validación (B). La censura se indica con líneas verticales; los valores de p se calcularon mediante estadísticas de rango logarítmico. En las figuras 4A y 4B, las curvas superiores son las de niveles normales de hGDF-15 y las curvas inferiores son las de niveles elevados de hGDF-15.
Figura 5: Supervivencia global según niveles séricos de S100B. Se muestran las curvas de Kaplan-Meier para la supervivencia global de 466 pacientes en estadio III sin tumor (A), 193 pacientes en estadio IV irresecable (B) y 83 pacientes en estadio IV sin tumor (C). Los pacientes se clasificaron según los niveles séricos de S100B (normal frente a elevado). La censura se indica con líneas verticales; los valores de p se calcularon mediante estadísticas de rango logarítmico. En las figuras 5A a 5C, las curvas superiores son las de niveles normales de S100B y las curvas inferiores son las de niveles elevados de S100B.
Figura 6: Supervivencia global de los pacientes en estadio III según el número de valores desfavorables considerando los niveles séricos de GDF-15, S100B, edad y subestadio. El modelo 2 del análisis de regresión de Cox (tabla 2) reveló un impacto de pronóstico negativo independiente para los niveles de GDF-15 >1,5 ng/ml, para los niveles elevados de S100B, para la edad <63 años y para el subestadio IIIC. Ahora se estratificó a los pacientes según el número de valores desfavorables entre esos cuatro factores. Se presentan las curvas de Kaplan-Meier resultantes de supervivencia global y la censura se indica mediante líneas verticales. La curva más alta es la curva en la que todos los factores son favorables. La 2ª curva más alta es la curva en la que un factor es desfavorable. La 3ª curva más alta es la curva en la que dos factores son desfavorables. La 2ª curva más baja es la curva en la que tres factores son desfavorables. La curva más baja es la curva en la que todos los factores son desfavorables.
Figura 7: Supervivencia global de pacientes en estadio IV irresecable según el número de valores desfavorables considerando los niveles séricos de GDF-15, S100B, el patrón de metástasis a distancia y la edad. El modelo 2 del análisis de regresión de Cox (tabla 3) reveló un impacto de pronóstico negativo independiente para los niveles de GDF-15 >1,5 ng/ml, para los niveles elevados de S100B, para la afectación metastásica de órganos viscerales distintos del pulmón y para la edad de 63 años o más. Por tanto, se estratificó a los pacientes según el número de factores desfavorables. Se muestran las curvas de Kaplan-Meier resultantes para la supervivencia global y la censura se indica mediante líneas verticales. La curva más alta es la curva en la que todos los factores son favorables. La 2ª curva más alta es la curva en la que un factor es desfavorable. Los 3ª La curva más alta es la curva en la que dos factores son desfavorables. La 2ª curva más baja es la curva en la que tres factores son desfavorables. La curva más baja es la curva en la que todos los factores son desfavorables.
Figura 8: Supervivencia global posterior a la toma de muestra de suero de pacientes en estadio III según combinaciones de diferentes factores. Se desarrolló un nomograma (a) para pacientes en estadio III sin tumor usando la función de nomograma de R considerando el impacto relativo de factores independientes únicos según el análisis multivariado (sGDF-15, sS100B, patrón de metástasis locorregional). Se calculó una puntuación de riesgo que oscilaba entre 0 y 266 puntos para 466 pacientes en estadio III con datos completos. En (b), se muestran las curvas de Kaplan-Meier de supervivencia global posterior a la toma de muestra de suero para diferentes categorías de puntuación de riesgo. La censura se indica con líneas verticales.
Figura 9: Supervivencia global posterior a la toma de muestra de suero de pacientes en estadio IV irreseables según combinaciones de diferentes factores. Los niveles séricos de GDF-15 tienen un impacto independiente en la supervivencia global de pacientes en estadio IV irresecable, además de la categoría M. Esto se ilustra con las diferencias significativas en la SG según sGDF-15 tanto en pacientes M1a/b (a) como en pacientes M1c (b). Se desarrolló un nomograma (c) para pacientes en estadio IV irresecable usando la función de nomograma de R considerando el impacto relativo de factores independientes únicos según el análisis multivariado (sGDF-15, sS100B, afectación del SNC y número de sitios distantes afectados). Se calculó una puntuación de riesgo que oscilaba entre 0 y 334 puntos para 193 pacientes en estadio IV irresecable con datos completos. En (d), se muestran las curvas de Kaplan-Meier de supervivencia global posterior a la toma de muestra de suero para diferentes categorías de puntuación de riesgo. La censura se indica con líneas verticales.
Figura 10: Correlaciones de sGDF-15 con el estadio/estado de la enfermedad y sLDH. Los niveles séricos de GDF-15 se muestran para pacientes en estadio III sin tumor (n = 468), pacientes en estadio IV sin tumor (n = 87) y pacientes en estadio IV irreseables (n = 206) (a). En pacientes en estadio IV irresecable, el sGDF-15 se presenta según el número de metástasis a distancia (b) o se estratifica según la sLDH (c). Las barras rojas indican niveles medianos de GDF-15; *p < 0,01; * p < 0,001 usando pruebas de Mann Whitney.
Figura 11: La supervivencia global posterior a la toma de muestra de suero se correlaciona con los niveles séricos de GDF-15 en pacientes con melanoma. Se asignaron aleatoriamente 761 pacientes a dos cohortes. En la cohorte de identificación (254 pacientes), se sometieron a prueba diferentes valores de corte mediante análisis de Kaplan-Meier y pruebas de rango logarítmico para obtener la mejor discriminación posible entre pacientes con niveles séricos de GDF-15 altos y bajos. La supervivencia global posterior a la toma de muestra de suero de los pacientes de la cohorte de identificación según el punto de corte optimizado (<1,5 ng/ml frente a ≥1,5 ng/ml) se muestra en (a). Se confirmaron diferencias en la supervivencia global posterior a la toma de muestra de suero en 507 pacientes de la cohorte de validación (b). La censura se indica con líneas verticales; los valores de p se calcularon mediante estadísticas de rango logarítmico.
Figura 12: Asociación de sGDF-15, sS100B y sLDH con la SG según el momento de la toma de muestra de suero en pacientes en estadio III sin tumor. Supervivencia global de pacientes en estadio III sin tumor según sGDF-15 (izquierda), sS100B (centro) y sLDH (derecha) según el momento de la última recaída antes de la toma de muestra de suero. Los pacientes se clasificaron como sin tumor durante menos de 6 meses (a-c), entre 6 meses y 2 años (df) o durante más de 2 años (g-i) desde la detección de la última metástasis. La censura se indica con líneas verticales; los valores de p se calcularon mediante estadísticas de rango logarítmico.
Figura 13: Asociación de sGDF-15, sS100B y sLDH con la SG según el momento de la toma de muestra de suero en pacientes en estadio IV irresecable. Supervivencia global de pacientes en estadio IV irresecable según sGDF-15 (izquierda), S100B (centro) y LDH (derecha) según el lapso de tiempo desde el diagnóstico de la enfermedad en estadio IV. La primera metástasis a distancia se detectó en el plazo de 6 meses (a-c), entre 6 meses y 2 años (d-f) y más de 2 años (g-i) antes de la toma de muestra de suero. La censura se indica con líneas verticales; los valores de p se calcularon mediante estadísticas de rango logarítmico.
Figura 14: Supervivencia global posterior a la toma de muestra de suero según los niveles séricos de S100B. Se muestran las curvas de Kaplan-Meier para la supervivencia global posterior a la toma de muestra de suero de 466 pacientes en estadio III sin tumor (a), 83 pacientes en estadio IV sin tumor (b) y 193 pacientes en estadio IV irresecable (c). Los pacientes se clasificaron basándose en los niveles séricos de S100B (normal frente a elevado). La censura se indica con líneas verticales; los valores de p se calcularon mediante estadísticas de rango logarítmico.
Descripción detallada la invención
Definiciones y técnicas generales
A menos que se defina lo contrario a continuación, los términos usados en la presente invención se entenderán según su significado común conocido por el experto en la técnica.
El término “anticuerpo” tal como se usa en el presente documento se refiere a cualquier anticuerpo funcional que sea capaz de unirse específicamente al antígeno de interés, tal como se describe generalmente en capítulo 7 de Paul, W.E. (Ed.).: Fundamental Immunolgoy 2ª ed. Raven Press, Ltd., Nueva York 1989. Sin limitación particular, el término “anticuerpo” abarca anticuerpos de cualquier especie de origen apropiada, incluyendo pollos y mamíferos tales como ratones, cabras, primates no humanos y humanos. Preferiblemente, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado. El anticuerpo es preferiblemente un anticuerpo monoclonal que puede prepararse mediante métodos bien conocidos en la técnica. El término “anticuerpo” abarca un anticuerpo de isotipo IgG-1, IgG-2, IgG-3 o IgG-4, IgE, IgA, IgM o IgD. El término “anticuerpo” abarca anticuerpos monoméricos (tales como IgD, IgE, IgG) o anticuerpos oligoméricos (tales como IgA o IgM). El término “anticuerpo” también abarca, sin limitaciones particulares, anticuerpos aislados y anticuerpos modificados tales como anticuerpos genéticamente modificados, por ejemplo, anticuerpos quiméricos.
La nomenclatura de los dominios de los anticuerpos sigue los términos conocidos en la técnica. Cada monómero de un anticuerpo comprende dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras, tal como se conoce generalmente en la técnica. De estos, cada cadena pesada y ligera comprende un dominio variable (denominado VHpara la cadena pesada y VLpara la cadena ligera) que es importante para la unión al antígeno. Estos dominios variables de cadena pesada y ligera comprenden (en un orden N-terminal a C-terminal) las regiones FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4 (FR, región de entramado; CDR, región determinante de complementariedad que también es conocida como región hipervariable). La identificación y asignación de las regiones de anticuerpo mencionadas anteriormente dentro de la secuencia de anticuerpo generalmente es según Kabatet al.(Sequences of proteins of Immunological interest, Departamento de Salud y Servicios Humanos de EE.UU., Servicio de Salud Pública, Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, Md. 1983), o Chothiaet al.(Conformations of immunoglobulin hypervariable regions. Nature.
21-28 de diciembre de 1989; 342 (6252): 877-83), o puede realizarse usando el software IMGT/V-QUEST descrito en Giudicelliet al.(IMGT/V-QUEST, an integrated software program for immunoglobulin and T cell receptor V-J and V-D-J. Nucleic Acids Res. Julio de 2004;32 (problema del servidor web): W435-40). Preferiblemente, las regiones de anticuerpo indicadas anteriormente se identifican y asignan usando el software IMGT/V-QUEST.
Un “anticuerpo monoclonal” es un anticuerpo de una población esencialmente homogénea de anticuerpos, en la que los anticuerpos son sustancialmente idénticos en secuencia (es decir, idénticos excepto por una fracción menor de anticuerpos que contienen modificaciones de secuencia que se producen de manera natural tales como modificaciones de aminoácidos en sus extremos N-terminal y C-terminal). A diferencia de los anticuerpos policlonales que contienen una mezcla de diferentes anticuerpos dirigidos o bien a un único epítopo o bien a numerosos epítopos diferentes, los anticuerpos monoclonales se dirigen al mismo epítopo y, por tanto, son muy específicos. El término “anticuerpo monoclonal” incluye (pero no se limita a) anticuerpos que se obtienen a partir de una población de células monoclonales derivadas de un clon de una sola célula, como, por ejemplo, los anticuerpos generados mediante el método de hibridoma descrito en Köhler y Milstein (Nature, 7 de agosto de 1975; 256 (5517): 495-7) o Harlow y Lane (“Antibodies: A Laboratory Manual” Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York 1988). También puede obtenerse un anticuerpo monoclonal a partir de otros métodos adecuados, incluyendo técnicas de presentación en fagos tales como las descritas en Clacksonet al.(Nature.15 de agosto de 1991; 352 (6336): 624-8) o Markset al.(J Mol Biol. 5 de diciembre de 1991; 222 (3): 581-97). Un anticuerpo monoclonal puede ser un anticuerpo que se ha optimizado para propiedades de unión a antígeno tales como valores de Kd reducidos y cinéticas de asociación y disociación optimizadas mediante métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, los valores de Kd pueden optimizarse mediante métodos de presentación que incluyen la presentación en fagos, lo que da como resultado anticuerpos monoclonales madurados por afinidad. El término “anticuerpo monoclonal” no se limita a secuencias de anticuerpos de especies de origen particulares o de una única especie de origen. Por tanto, el significado del término “anticuerpo monoclonal” abarca anticuerpos monoclonales quiméricos tales como anticuerpos monoclonales humanizados.
Los “anticuerpos humanizados” son anticuerpos que contienen secuencias humanas y una porción menor de secuencias no humanas que confieren especificidad de unión a un antígeno de interés (por ejemplo, GDF-15 humano). Normalmente, los anticuerpos humanizados se generan reemplazando secuencias de la región hipervariable de un anticuerpo aceptor humano por secuencias de la región hipervariable de un anticuerpo donante no humano (por ejemplo, un anticuerpo donante de ratón, conejo o rata) que se une a un antígeno de interés (por ejemplo, GDF-15 humano). En algunos casos, las secuencias de la región de entramado del anticuerpo aceptor también pueden reemplazarse por las secuencias correspondientes del anticuerpo donante. Además de las secuencias derivadas de los anticuerpos donante y aceptor, un “anticuerpo humanizado” puede contener otros residuos o secuencias (adicionales o sustitutos) o no. Tales de otros residuos o secuencias pueden servir para mejorar adicionalmente las propiedades de los anticuerpos, tales como propiedades de unión (por ejemplo, para disminuir los valores de Kd) y/o propiedades inmunogénicas (por ejemplo, para disminuir la antigenicidad en humanos). En la técnica se conocen ejemplos no limitativos de métodos para generar anticuerpos humanizados, por ejemplo, de Riechmannet al.(Nature.24 de marzo de 1988; 332(6162):323-7) o Joneset al.(Nature.29 de mayo-4 de junio de 1986; 321 (6069): 522-5).
El término “anticuerpo humano” se refiere a un anticuerpo que contiene secuencias de dominio constante y variable humanas. Esta definición abarca anticuerpos que tienen secuencias humanas que portan sustituciones o modificaciones de aminoácidos individuales que pueden servir para mejorar adicionalmente las propiedades del anticuerpo tales como propiedades de unión (por ejemplo, para disminuir los valores de Kd) y/o propiedades inmunogénicas (por ejemplo, para disminuir la antigenicidad en humanos). El término “anticuerpo humano” excluye los anticuerpos humanizados en los que una porción de secuencias no humanas confiere especificidad de unión a un antígeno de interés.
Una “porción de unión a antígeno” de un anticuerpo tal como se usa en el presente documento se refiere a una porción de un anticuerpo que conserva la capacidad del anticuerpo para unirse específicamente al antígeno (por ejemplo, hGDF-15, PD-1, PD-L1 o CTLA4). Esta capacidad puede determinarse, por ejemplo, determinando la capacidad de la porción de unión al antígeno para competir con el anticuerpo por la unión específica al antígeno mediante métodos conocidos en la técnica. La porción de unión al antígeno puede contener uno o más fragmentos del anticuerpo. Sin limitación particular, la porción de unión al antígeno puede producirse mediante cualquier método adecuado conocido en la técnica, incluyendo métodos de ADN recombinante y preparación mediante fragmentación química o enzimática de anticuerpos. Las porciones de unión a antígeno pueden ser fragmentos Fab, fragmentos F(ab’), fragmentos F(ab’)2, anticuerpos de cadena sencilla (scFv), anticuerpos de dominio único, diacuerpos o cualquier otra porción del anticuerpo que conserve la capacidad del anticuerpo para unirse específicamente al antígeno.
Un “anticuerpo” (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal) o una “porción de unión a antígeno” puede haberse derivatizado o estar unido a una molécula diferente. Por ejemplo, las moléculas que pueden estar unidas al anticuerpo son otras proteínas (por ejemplo, otros anticuerpos), un marcador molecular (por ejemplo, una molécula fluorescente, luminiscente, coloreada o radiactiva), un agente farmacéutico y/o tóxico. El anticuerpo o la porción de unión al antígeno puede ligarse directamente (por ejemplo, en forma de una fusión entre dos proteínas) o mediante una molécula ligadora (por ejemplo, cualquier tipo adecuado de ligador químico conocido en la técnica).
Tal como se usa en el presente documento, los términos “que une” o “unión” se refieren a la unión específica al antígeno de interés (por ejemplo, GDF-15 humano). Preferiblemente, el valor de Kd es de menos de 100 nM, más preferiblemente de menos de 50 nM, todavía más preferiblemente de menos de 10 nM, todavía más preferiblemente de menos de 5 nM y lo más preferiblemente de menos de 2 nM.
El término “epítopo”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una pequeña porción de un antígeno que forma el sitio de unión para un anticuerpo.
Con el fin de caracterizar las propiedades de unión de los anticuerpos, se mide preferiblemente la unión o unión competitiva de los anticuerpos o sus porciones de unión al antígeno al antígeno de interés (por ejemplo, GDF-15 humano) usando mediciones de resonancia de plasmón superficial como ensayo convencional de referencia, tal como se describe a continuación.
Los términos “KD” o “valor de KD” se refieren a la constante de disociación en equilibrio tal como se conoce en la técnica. En el contexto de la presente divulgación, estos términos se refieren a la constante de disociación en equilibrio de un anticuerpo con respecto a un antígeno particular de interés (por ejemplo, GDF-15 humano). La constante de disociación en equilibrio es una medida de la propensión de un complejo (por ejemplo, un complejo antígeno-anticuerpo) a disociarse reversiblemente en sus componentes (por ejemplo, el antígeno y el anticuerpo). Para los anticuerpos según la divulgación, los valores de KD(tales como los del antígeno humano GDF-15) se determinan preferiblemente usando mediciones de resonancia de plasmón superficial tal como se describe a continuación.
Un “anticuerpo aislado” tal como se usa en el presente documento es un anticuerpo que se ha identificado y separado de la mayoría de los componentes (en peso) de su entorno fuente, por ejemplo, de los componentes de un cultivo celular de hibridoma o de un cultivo celular diferente que se usó para su producción (por ejemplo, células productoras tales como células CHO que expresan recombinantemente el anticuerpo). La separación se realiza de manera que retire suficientemente los componentes que de otro modo podrían interferir con la idoneidad del anticuerpo para las aplicaciones deseadas (por ejemplo, con un uso terapéutico del anticuerpo anti-GDF-15 humano). Los métodos para preparar anticuerpos aislados se conocen en la técnica e incluyen cromatografía de proteína A, cromatografía de intercambio aniónico, cromatografía de intercambio catiónico, filtración retentiva de virus y ultrafiltración. Preferiblemente, la preparación de anticuerpo aislado es al menos el 70 % pura (p/p), más preferiblemente al menos el 80 % pura (p/p), todavía más preferiblemente al menos el 90 % pura (p/p), todavía más preferiblemente al menos el 95 % pura (p/p), y lo más preferiblemente al menos el 99 % pura (p/p), tal como se mide usando el ensayo de proteína de Lowry.
Un “diacuerpo” tal como se usa en el presente documento es una pequeña porción de anticuerpo bivalente de unión a antígeno que comprende un dominio variable de cadena pesada unido a un dominio variable de cadena ligera en la misma cadena polipeptídica unida por un ligador peptídico que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena. Esto da como resultado el emparejamiento con los dominios complementarios de otra cadena y el ensamblaje de una molécula dimérica con dos sitios de unión a antígeno. Los diacuerpos pueden ser bivalentes y monoespecíficos (tales como diacuerpos con dos sitios de unión a antígeno para el GDF-15 humano), o pueden ser bivalentes y biespecíficos (por ejemplo, diacuerpos con dos sitios de unión a antígeno, siendo uno un sitio de unión para el GDF-15 humano, y el otro es un sitio de unión para un antígeno diferente). Una descripción detallada de los diacuerpos puede encontrarse en Holliger Pet al.(“Diabodies”: small bivalente and bispecific antibody fragments”. Proc Natl Acad Sci USA.15 de julio de 1993;90(14):6444-8.). Un “anticuerpo de dominio único” (que también se conoce como “Nanobody<™>”), tal como se usa en el presente documento, es un fragmento de anticuerpo que consiste en un único dominio de anticuerpo variable monomérico. Las estructuras y los métodos para producir anticuerpos de dominio único se conocen en la técnica, por ejemplo, de Holt LJet al.(“Domain antibodies: proteins for therapy.” Trends Biotechnol. Noviembre de 2003;21(11):484-90.), Saerens Det al.(“Single-domain antibodies as building blocks for novel therapeutics.” Curr Opin Pharmacol. Octubre de 2008;8(5):600-8. Publicación electrónica del 22 de agosto de 2008.), y Arbabi Ghahroudi Met al.(“Selection and Identification of single domain antibody fragments from camel heavy-chain antibodies.” FEBS Lett.15 de septiembre de 1997;414(3):521-6.).
Los términos “significativo”, “significativamente”, etc., tal como se usan en el presente documento, se refieren a una diferencia estadísticamente significativa entre valores evaluados mediante métodos apropiados conocidos en la técnica y evaluados mediante los métodos a los que se hace referencia en el presente documento.
Según la presente invención, cada aparición del término “que comprende” puede sustituirse opcionalmente por el término “que consiste en”.
Los términos “cáncer” y “célula cancerosa” se usan en el presente documento según su significado común en la técnica (véase, por ejemplo, Weinberg R.et al.: The Biology of Cancer. Garland Science: Nueva York 2006.850p). Los cánceres para los cuales se proporciona una predicción de un resultado clínico, en particular una predicción de la supervivencia del paciente según la presente invención son un melanoma tal como se define en las reivindicaciones adjuntas. Tal como se usa en el presente documento, el término “melanoma” se usa según su significado general conocido en la técnica. Los melanomas se clasifican según el sistema de estadificación del AJCC para pacientes con melanoma con metástasis a distancia desde 2001 (Balch, CMet al., J Clin Oncol/19/3635-48.
2001). Los estadios del melanoma a los que se hace referencia en el presente documento se refieren a este sistema de estadificación. En un aspecto preferido de la presente invención según todas las realizaciones de la presente invención, el melanoma no es un melanoma uveal.
Los pacientes con melanoma, para los cuales se proporciona una predicción de supervivencia según la invención, pueden someterse a un tratamiento del melanoma. Tal como se usan en el presente documento, términos tales como “tratamiento del cáncer” o “que trata el cáncer” o “tratamiento del melanoma” o “que trata el melanoma” se refieren a un tratamiento terapéutico. Tal como se usan en el presente documento, tales tratamientos no sólo incluyen tratamientos del melanoma en sí sino también tratamientos paliativos. Tales tratamientos paliativos se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, tratamientos que sólo mejoran los síntomas de la enfermedad del melanoma.
Tal como se hace referencia en el presente documento, un tratamiento del cáncer puede ser una terapia de primera línea, una terapia de segunda línea o una terapia de tercera línea o una terapia que va más allá de la terapia de tercera línea. El significado de estos términos se conoce en la técnica y según la terminología que usa comúnmente el Instituto Nacional del Cáncer de EE.UU.
Un tratamiento del cáncer no excluye que también se produzcan beneficios terapéuticos adicionales o secundarios en los pacientes. Por ejemplo, un beneficio adicional o secundario puede ser una influencia en la pérdida de peso inducida por el cáncer.
Tal como se hace referencia en el presente documento, un paciente con melanoma “sin tumor” es un paciente en el que no puede detectarse ningún tumor primario ni metástasis según métodos clínicos convencionales conocidos en la técnica. Esto, sin embargo, no excluye que en el paciente existan tumores (o micrometástasis) que se encuentren por debajo del límite de detección, o que existan células tumorales que puedan formar un nuevo tumor.
Muestras de sangre:
Tal como se menciona en el presente documento, el término “muestra de sangre” incluye, sin limitación, muestras de sangre completa, suero y plasma. También incluye otros tipos de muestras, tales como fracciones de sangre distintas del suero y el plasma. Dichas muestras y fracciones se conocen en la técnica.
Las muestras de sangre que se usan para los métodos según la divulgación pueden ser cualquier tipo de muestra de sangre que contenga hGDF-15. En la técnica se conocen tipos adecuados de muestras de sangre que contienen hGDF-15 e incluyen muestras de suero y plasma. Alternativamente, el experto también puede identificar fácilmente otros tipos de muestras de sangre que contienen hGDF-15, por ejemplo, midiendo si hGDF-15 está contenido en estas muestras y qué niveles de hGDF-15 están contenidos en estas muestras, usando los métodos descritos en el presente documento.
Resultados clínicos:
Los niveles de hGDF-15 en muestras de sangre humana pueden usarse para predecir la probabilidad de supervivencia de un paciente con melanoma humano.
La supervivencia de grupos de pacientes puede analizarse mediante métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante curvas de Kaplan-Meier.
Los periodos de tiempo apropiados para la evaluación de la supervivencia se conocen en la técnica y serán elegidos por el experto teniendo debidamente en cuenta factores tales como el estadio respectivo del melanoma.
Por ejemplo, la supervivencia, preferiblemente la supervivencia a corto plazo puede predecirse, por ejemplo, para momentos de 6 meses, 12 meses y/o 18 meses después del momento en que se hizo la predicción. Alternativamente, la supervivencia, preferiblemente la supervivencia a largo plazo puede evaluarse, por ejemplo, en un momento de 2 años, 3 años, 5 años y/o 10 años después del momento en que se hizo la predicción.
Predecir la probabilidad de un resultado clínico positivo según la invención
Para predecir la probabilidad de un resultado clínico positivo (es decir, supervivencia) según la invención, es decir, basándose en los niveles de hGDF-15, se usan preferiblemente los métodos de predicción, que se definen anteriormente en las realizaciones preferidas.
Para poner en práctica los métodos, pueden emplearse métodos estadísticos conocidos en la técnica.
Por ejemplo, la supervivencia global puede analizarse mediante análisis de regresión de Cox.
Los métodos estadísticos preferidos, que pueden usarse para generar modelos estadísticos de datos de pacientes a partir de estudios clínicos, se divulgan en el ejemplo 1. Se entiende que los métodos estadísticos divulgados en el ejemplo 1 no se limitan a las características particulares del ejemplo 1 tales como el estadio del melanoma, los niveles umbral particulares elegidos y los valores estadísticos particulares obtenidos en el ejemplo. Más bien, estos métodos divulgados en el ejemplo 1 pueden usarse generalmente en relación con cualquier aspecto de la divulgación.
Niveles de hGDF-15
En un aspecto ventajoso de la invención, existe una relación inversa entre los niveles de hGDF-15 y la probabilidad de un resultado clínico positivo, es decir, la probabilidad de supervivencia, en pacientes con melanoma humano. Por tanto, según la invención, un nivel disminuido de hGDF-15 indica una probabilidad aumentada de supervivencia en pacientes con melanoma humano.
Por tanto, tal como se usan en el presente documento, términos tales como “en el que un nivel disminuido de hGDF-15 en dicha muestra de sangre humana indica una probabilidad aumentada de supervivencia” significan que el nivel de hGDF-15 en dicha muestra de sangre humana y la probabilidad de supervivencia siguen una relación inversa. Por tanto, cuanto mayor sea el nivel de hGDF-15 en dicha muestra de sangre humana, menor será la probabilidad de supervivencia.
En relación con los métodos de predicción según la invención definidos en el presente documento, se usan niveles umbral de hGDF-15.
La relación inversa entre los niveles de hGDF-15 y la probabilidad de supervivencia se aplica a un valor umbral tal como se detalla en las reivindicaciones adjuntas.
Los niveles umbral de hGDF-15 preferibles son los niveles séricos de hGDF-15 tal como se definió anteriormente en las realizaciones preferidas.
Alternativamente, los niveles umbral de hGDF-15 según la presente divulgación pueden obtenerse y/o ajustarse adicionalmente usando los métodos estadísticos mencionados anteriormente, por ejemplo, los métodos del ejemplo 1.
Un nivel umbral de hGDF-15 puede ser un único nivel umbral de hGDF-15. La divulgación también abarca el uso de más de un nivel umbral de hGDF-15, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más niveles umbral de hGDF-15.
Para cada nivel umbral de hGDF-15 único de uno o más niveles umbral de hGDF-15, puede predecirse una probabilidad de supervivencia correspondiente en un momento dado.
Los niveles de hGDF-15 en muestras de sangre pueden medirse mediante cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, un método preferido para medir los niveles de hGDF-15 en muestras de sangre, incluyendo los niveles séricos, es una medición de los niveles de hGDF-15 mediante ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA) usando anticuerpos contra hGDF-15. Tales métodos de ELISA se ejemplifican en el ejemplo 1, pero también pueden incluir métodos basados en perlas tales como la tecnología Luminex y otros. Alternativamente, los niveles de hGDF-15 en muestras de sangre, incluyendo los niveles séricos, pueden determinarse mediante inmunoensayos de electroquimioluminisencia conocidos usando anticuerpos contra hGDF-15. Por ejemplo, puede usarse la tecnología Roche Elecsys<®>para tales inmunoensayos de electroquimioluminisencia. Otros métodos posibles incluirían la detección basada en anticuerpos de fluidos corporales después de la separación de proteínas en un campo eléctrico.
La mediana del nivel sérico de hGDF-15 de individuos de control humanos sanos es < 0,8 ng/ml. El intervalo esperado está entre 0,2 ng/ml y 1,2 ng/ml en controles humanos sanos (referencia: Tanno Tet al.: “Growth differentiation factor 15 in erythroid health and disease.” Curr Opin Hematol. Mayo de 2010; 17(3): 184-190.).
Según la invención, los niveles umbral de hGDF-15 son niveles séricos de hGDF-15 tal como se define en las reivindicaciones adjuntas.
Se entiende que para estos niveles séricos de hGDF-15, y basándose en la divulgación de la invención proporcionada en el presente documento, el experto puede obtener de forma rutinaria los niveles correspondientes de hGDF-15 en otras muestras de sangre (por ejemplo, comparando el nivel relativo de hGDF-15 con el nivel respectivo en otras muestras de sangre). Por tanto, la presente divulgación también abarca niveles preferidos de hGDF-15 en plasma, sangre completa y otras muestras de sangre, que corresponden a cada uno de los niveles y rangos séricos de hGDF-15 preferidos indicados anteriormente.
Niveles de lactato deshidrogenasa
Los niveles de lactato deshidrogenasa en muestras de sangre pueden medirse mediante cualquier método conocido en la técnica. Los niveles de lactato deshidrogenasa (LDH) normalmente se miden en unidades enzimáticas (U). Una unidad reducirá 1,0�mol de piruvato a L-lactato por minuto a pH 7,5 a 37 ºC.
[L-Deshidrogenasa láctica]
Piruvato �-NADH → L-Lactato �-NAD<+>
El lactato y el NAD+ se convierten en piruvato y NADH por acción de la LDH. El NADH absorbe fuertemente la luz a 340 nm, mientras que el NAD+ no. La tasa de aumento de la absorbancia a 340 nm es directamente proporcional a la actividad de LDH en la muestra. Por tanto, las unidades de LDH se determinan preferiblemente midiendo la absorbancia a 340 nm.
Se encuentran disponibles diversas pruebas de diagnóstico clínicamente aceptadas para medir los niveles de LDH. Según las presentes realizaciones, las pruebas que pueden aplicarse al melanoma se seleccionarán basándose en patrones clínicos conocidos. Las pruebas de isoformas específicas para LDH pueden realizarse según métodos conocidos en la técnica.
En otro aspecto ventajoso, existe también una relación inversa entre los niveles de lactato deshidrogenasa (LDH) y la probabilidad de un resultado clínico positivo, en particular la probabilidad de supervivencia, en pacientes con melanoma humano. Por tanto, en una realización según la invención, un nivel disminuido de lactato deshidrogenasa indica una probabilidad aumentada de supervivencia en pacientes con melanoma.
Por tanto, tal como se usa en el presente documento, términos tales como “en el que un nivel disminuido de lactato deshidrogenasa en dicha muestra de sangre humana indica una probabilidad aumentada de supervivencia” significan que el nivel de lactato deshidrogenasa en dicha muestra de sangre humana y la probabilidad de supervivencia siguen una relación inversa. Por tanto, cuanto mayor sea el nivel de lactato deshidrogenasa en dicha muestra de sangre humana, menor será la probabilidad de supervivencia.
Por ejemplo, en relación con los métodos de predicción según las realizaciones definidas en el presente documento, pueden usarse niveles umbral de lactato deshidrogenasa.
Según las realizaciones, la relación inversa entre los niveles de lactato deshidrogenasa y la probabilidad de supervivencia se aplica a cualquier valor umbral y, por tanto, la realización no se limita a valores umbral particulares. Alternativamente, los niveles umbral de lactato deshidrogenasa según la presente divulgación pueden obtenerse y/o ajustar adicionalmente usando los métodos estadísticos mencionados anteriormente, por ejemplo, los métodos del ejemplo 1.
Un nivel umbral de lactato deshidrogenasa puede ser un único nivel umbral de lactato deshidrogenasa. La realización también abarca el uso de más de un nivel umbral de lactato deshidrogenasa, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más niveles umbral de lactato deshidrogenasa.
Para cada nivel umbral de lactato deshidrogenasa único de uno o más niveles umbral de lactato deshidrogenasa, se puede predecir una probabilidad de supervivencia correspondiente.
Según la realización, los niveles umbral de lactato deshidrogenasa preferibles son los niveles séricos de lactato deshidrogenasa tal como se definió anteriormente.
En una realización muy preferida, el nivel umbral de lactato deshidrogenasa es un nivel umbral clínicamente aceptado que distingue entre niveles de LDH normales y elevados en pacientes. Tales niveles umbral clínicamente aceptados muy preferidos se conocen en la técnica y serán elegidos por el experto con respecto a las especificaciones particulares de la prueba de LDH.
Se entiende que para estos niveles séricos de lactato deshidrogenasa, y basándose en la divulgación proporcionada en el presente documento, el experto puede obtener de forma rutinaria los niveles correspondientes de lactato deshidrogenasa en otras muestras de sangre (por ejemplo, comparando el nivel relativo de lactato deshidrogenasa en suero con los niveles respectivos de lactato deshidrogenasa en suero en otras muestras de sangre). Por tanto, la presente realización también abarca niveles preferidos de lactato deshidrogenasa en plasma, sangre completa y otras muestras de sangre, que corresponden a cada uno de los niveles e intervalos séricos de lactato deshidrogenasa preferidos indicados anteriormente.
Niveles de S100B
En otro aspecto ventajoso, existe también una relación inversa entre los niveles de S100B y la probabilidad de un resultado clínico positivo, en particular la probabilidad de supervivencia, en pacientes con melanoma humano. Por tanto, en una realización según la invención, un nivel disminuido de S100B indica una probabilidad aumentada de supervivencia en pacientes con melanoma.
Por tanto, tal como se usan en el presente documento, términos tales como “en el que un nivel disminuido de S100B en dicha muestra de sangre humana indica una probabilidad aumentada de supervivencia” significan que el nivel de S100B en dicha muestra de sangre humana y la probabilidad de supervivencia siguen una relación inversa. Por tanto, cuanto mayor sea el nivel de S100B en dicha muestra de sangre humana, menor será la probabilidad de supervivencia.
Por ejemplo, en relación con los métodos de predicción según la realización definida en el presente documento, pueden usarse niveles umbral de S100B.
Según la realización, la relación inversa entre los niveles de S100B y la probabilidad de supervivencia se aplica a cualquier valor umbral y, por tanto, la realización no se limita a valores umbral particulares.
Los niveles umbral de S100B según la presente divulgación pueden obtenerse, por ejemplo, y/o ajustarse adicionalmente, usando los métodos estadísticos mencionados anteriormente, por ejemplo, los métodos del ejemplo 1.
Un nivel umbral de S100B puede ser un único nivel umbral de S100B. La realización también abarca el uso de más de un nivel umbral de S100B, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más niveles umbral de S100B.
En una realización muy preferida, el nivel umbral de S100B es un nivel umbral clínicamente aceptado que distingue entre niveles normales y elevados de S100B en pacientes. Tales niveles umbral clínicamente aceptados muy preferidos se conocen en la técnica y serán elegidos por el experto con respecto a las especificaciones particulares de la prueba de S100B.
Para cada nivel umbral de S100B único de uno o más niveles umbral de S100B, puede predecirse una probabilidad de supervivencia correspondiente.
Los niveles de S100B en muestras de sangre pueden medirse mediante cualquier método conocido en la técnica. Tales métodos incluyen ensayos basados en anticuerpos. Un método preferido para medir los niveles de S100B en muestras de sangre es una medición de los niveles séricos de S100B mediante ensayos de electroquimioluminiscencia, por ejemplo, mediante el uso de un inmunoensayo de electroquimioluminiscencia Elecsys S100. Se dan más ejemplos no limitativos de métodos para medir los niveles de S100B en Gonçalveset al.: “Biological and methodological features of the measurement of S100B, a putative marker of brain injury.” Clinical Biochemistry 41 (2008) 755-763).
Anticuerpos capaces de unirse a hGDF-15 que pueden usarse según la invención
Los métodos y kits usados en los métodos de la invención pueden usar uno o más anticuerpos capaces de unirse a hGDF-15 o una porción de unión a antígeno del mismo, tal como se definió anteriormente.
Anteriormente se demostró que un anticuerpo monoclonal puede seleccionar como diana ventajosamente la proteína GDF-15 humana (documento WO2014/049087), y que dicho anticuerpo tiene propiedades ventajosas que incluyen una alta afinidad de unión al GDF-15 humano, tal como lo demuestra una constante de disociación en equilibrio de aproximadamente 790 pM para el GDF-15 humano recombinante (véase el ejemplo de referencia 1). Por tanto, en una realización preferida, la invención usa un anticuerpo capaz de unirse a hGDF-15, o una porción de unión a antígeno del mismo. Preferiblemente, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal capaz de unirse a hGDF-15, o una porción de unión a antígeno del mismo.
Por tanto, en una realización más preferida, el anticuerpo capaz de unirse al hGDF-15 o a una porción de unión a antígeno del mismo usado en los métodos de la invención es un anticuerpo monoclonal capaz de unirse a GDF-15 humano, o a una porción de unión a antígeno del mismo, en el que el dominio variable de cadena pesada comprende una región CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 o una secuencia de aminoácidos al menos el 90 % idéntica a la misma, y en el que el dominio variable de cadena ligera comprende una región CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 o una secuencia de aminoácidos al menos el 85 % idéntica a la misma. En este aspecto, preferiblemente, el anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende una región CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 y una región CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, y el anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende una región CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, y una región CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos ser-ala-ser.
Por tanto, preferiblemente, el anticuerpo capaz de unirse al hGDF-15 o una porción de unión al antígeno del mismo usado en los métodos de la invención es un anticuerpo monoclonal capaz de unirse al GDF-15 humano, o una porción de unión al antígeno del mismo, en el que el anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende una región CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, una región CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 y una región CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 secuencia ácida de SEQ ID NO: 5, y en el que el anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende una región CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, una región CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos ser-ala-ser y una región CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7.
En otra realización según las realizaciones anteriores del anticuerpo monoclonal capaz de unirse a GDF-15 humano, o una porción de unión a antígeno del mismo, el dominio variable de cadena pesada comprende una región que comprende una región FR1, CDR1, FR2, CDR2 y FR3 y que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o una secuencia el 85 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % idéntica a la misma, y el dominio variable de cadena ligera comprende una región que comprende una región FR1, CDR1, FR2, CDR2 y FR3 y que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o una secuencia el 85 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % idéntica a la misma. En otra realización según las realizaciones anteriores del anticuerpo monoclonal capaz de unirse al GDF-15 humano, o una porción de unión al antígeno del mismo, el dominio variable de la cadena pesada comprende una región CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 y una región CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, y el dominio variable de cadena ligera comprende una región CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 y una región CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7. En un aspecto preferido de esta realización, el anticuerpo puede tener secuencias de CDR3 tal como se definió anteriormente
En otra realización según el anticuerpo monoclonal capaz de unirse al GDF-15 humano, o una porción de unión al antígeno del mismo, la porción de unión al antígeno es un anticuerpo de dominio único (también denominado “Nanobody<™>”). En un aspecto de esta realización, el anticuerpo de dominio único comprende las secuencias de aminoácidos CDR1, CDR2 y CDR3 de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5, respectivamente. En otro aspecto de esta realización, el anticuerpo de dominio único comprende las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 de SEQ ID NO: 6, ser-ala-ser, y SEQ ID NO: 7, respectivamente. En un aspecto preferido de esta realización, el anticuerpo de dominio único es un anticuerpo humanizado.
Preferiblemente, los anticuerpos capaces de unirse al GDF-15 humano o sus porciones de unión a antígeno tienen una constante de disociación en equilibrio para el GDF-15 humano que es igual a o de menos de 100 nM, de menos de 20 nM, preferiblemente de menos de 10 nM, más preferiblemente de menos de 5 nM y lo más preferiblemente entre 0,1 nM y 2 nM.
En otra realización según las realizaciones anteriores del anticuerpo monoclonal capaz de unirse al GDF-15 humano, o una porción de unión al antígeno del mismo, el anticuerpo capaz de unirse al GDF-15 humano o la porción de unión al antígeno del mismo se une al mismo epítopo de GDF-15 humano que el anticuerpo contra GDF-15 humano que puede obtenerse a partir de la línea celular B1-23 depositada en Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DMSZ) con el número de registro DSM ACC3142. Tal como se describe en el presente documento, la unión del anticuerpo al GDF-15 humano usado en los métodos de la presente invención se evalúa preferiblemente mediante mediciones de resonancia de plasmón superficial como método convencional de referencia, según los procedimientos descritos en el ejemplo de referencia 1. La unión al mismo epítopo sobre GDF-15 humano puede evaluarse de manera similar mediante experimentos de unión competitiva por resonancia de plasmón superficial del anticuerpo contra GDF-15 humano obtenible a partir de la línea celular B1-23 y el anticuerpo que se espera que se una al mismo epítopo de GDF-15 humano que el anticuerpo contra GDF-15 humano obtenible a partir de la línea celular B1-23.
En una realización muy preferida, el anticuerpo capaz de unirse al GDF-15 humano o porción de unión a antígeno del mismo es un anticuerpo monoclonal capaz de unirse al GDF-15 humano, o una porción de unión a antígeno del mismo, en el que la unión es unión a un epítopo conformacional o discontinuo en GDF-15 humano comprendido por las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 26. En un aspecto preferido de esta realización, el anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo es un anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo tal como se define por las secuencias de una cualquiera de las realizaciones anteriores.
En una realización adicional según las realizaciones anteriores, los anticuerpos que incluyen el anticuerpo capaz de unirse al GDF-15 humano o la porción de unión al antígeno del mismo pueden modificarse, por ejemplo, mediante una etiqueta o un marcador.
Una etiqueta puede ser, por ejemplo, una etiqueta de biotina o una etiqueta de aminoácido. Los ejemplos no limitativos de tales etiquetas de ácidos incluyen etiquetas de polihistidina (His-), etiqueta FLAG, etiqueta de hemaglutinina (HA), etiqueta de glicoproteína D (gD) y etiqueta c-myc. Las etiquetas pueden usarse para diversos fines. Por ejemplo, pueden usarse etiquetas para ayudar a la purificación del anticuerpo capaz de unirse al GDF-15 humano o la porción de unión al antígeno del mismo. Preferiblemente, tales etiquetas están presentes en el extremo C-terminal o N-terminal del anticuerpo capaz de unirse al GDF-15 humano o la porción de unión al antígeno del mismo.
Tal como se usa en el presente documento, el término “marcador” se refiere a cualquier molécula o grupo de moléculas que pueda facilitar la detección del anticuerpo. Por ejemplo, los marcadores pueden ser enzimáticos, tales como peroxidasa de rábano picante (HRP), fosfatasa alcalina (AP) o glucosa oxidasa. Los anticuerpos marcados enzimáticamente pueden emplearse, por ejemplo, en ensayos de inmunoadsorción ligados a enzimas. Los marcadores también pueden ser isótopos radiactivos, secuencias de ADN (que pueden usarse, por ejemplo, para detectar los anticuerpos mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR)), indicadores fluorogénicos y grupos electroquimioluminiscentes (por ejemplo, complejos de rutenio). Como alternativa al marcaje, los anticuerpos usados según la invención, en particular un anticuerpo capaz de unirse al GDF-15 humano o a su porción de unión al antígeno, pueden detectarse directamente, por ejemplo, mediante mediciones de resonancia de plasmón superficial. Métodos y técnicas
Generalmente, a menos que se defina lo contrario en el presente documento, los métodos usados en la presente divulgación (por ejemplo, métodos de clonación o métodos relacionados con anticuerpos) se realizan según procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo. los procedimientos descritos en Sambrooket al.(“Molecular Cloning: A Laboratory Manual.”, 2.ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York 1989), Ausubelet al.(“Current Protocols in Molecular Biology.” Greene Publishing Associates y Wiley Interscience; Nueva York 1992), y Harlow y Lane (“Antibodies: A Laboratory Manual” Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York 1988).
La unión de anticuerpos a sus respectivas proteínas diana puede evaluarse mediante métodos conocidos en la técnica. La unión de anticuerpos monoclonales a sus respectivas dianas se evalúa preferiblemente mediante mediciones de resonancia de plasmón superficial. Estas mediciones se llevan a cabo preferiblemente usando un sistema Biorad ProteOn XPR36 y chips sensores Biorad GLC, tal como se ejemplifica para el AcM-B1-23 anti-GDF-15 humano en el ejemplo de referencia 1.
Las alineaciones de secuencias según la invención se realizan usando el algoritmo BLAST (véase Altschulet al.(1990) “Basic local alignment search tool.” Journal of Molecular Biology 215. págs. 403-410.; Altschulet al.: (1997) Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res.
25:3389-3402). Preferiblemente, se usan los siguientes parámetros: secuencias diana máximas 10; tamaño de palabra 3; matriz BLOSUM 62; costes de hueco: existencia 11, extensión 1; ajuste condicional de la matriz de puntuación composicional. Por tanto, cuando se usan en relación con secuencias, términos tales como “identidad” o “idéntico” se refieren al valor de identidad obtenido usando el algoritmo BLAST.
Los anticuerpos monoclonales usados en los métodos de la invención pueden producirse mediante cualquier método conocido en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, los métodos a los que se hace referencia en Siegel DL (“Recombinant monoclonal antibody technology.” Transfus Clin Biol. Enero de 2002;9(1):15-22). En una realización, un anticuerpo usado en los métodos de la invención se produce mediante la línea celular de hibridoma B1-23 depositada en Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) con el número de registro DSM ACC3142 según el tratado de Budapest. El depósito se presentó el 29 de septiembre de 2011.
Los niveles de GDF-15 humano (hGDF-15) pueden medirse mediante cualquier método conocido en la técnica, incluyendo mediciones de los niveles de proteína hGDF-15 mediante métodos que incluyen (pero no se limitan a) espectrometría de masas para proteínas o péptidos derivados de GDF-15 humano, inmunotransferencia de tipo Western que usa anticuerpos específicos del GDF-15 humano, pruebas de tira que usan anticuerpos específicos del GDF-15 humano o inmunocitoquímica que usa anticuerpos específicos del GDF-15 humano. Un método preferido para medir los niveles séricos de hGDF-15 es una medición de los niveles séricos de hGDF-15 mediante ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA) usando anticuerpos contra GDF-15. Tales métodos de ELISA se ejemplifican en el ejemplo 1. Alternativamente, los niveles séricos de hGDF-15 pueden determinarse mediante inmunoensayos de electroquimioluminisencia conocidos usando anticuerpos contra hGDF-15. Por ejemplo, puede usarse la tecnología Roche Elecsys<®>para tales inmunoensayos de electroquimioluminisencia.
Aparatos
Un aparato puede ser un aparato tal como se define en las reivindicaciones adjuntas que está configurado para realizar los métodos de la invención.
Tal como se usa en el presente documento, el término “configurado para realizar” significa que el aparato está configurado específicamente para las etapas del método citados. Por ejemplo, un aparato configurado para realizar un método que usa un nivel umbral particular se configurará específicamente para usar ese umbral particular.
El aparato configurado para realizar los métodos de la invención es un analizador de electroquimioluminiscencia como analizador Cobas<®>. En esta divulgación, si se mide la LDH, ésta puede medirse, por ejemplo, en un aparato adicional, que no es un analizador de electroquimioluminiscencia, y que está configurado para realizar mediciones de LDH tales como pruebas enzimáticas.
Kits usados en la invención
La invención también se refiere a usos de kits tal como se definen en las reivindicaciones adjuntas.
El hGDF-15 recombinante contenido en los kits puede estar presente en una forma que pueda usarse convenientemente con fines de calibración. Por ejemplo, puede estar presente en forma de disoluciones madre que cubren varias concentraciones en el intervalo de 0 a 15 ng/ml, por ejemplo, al menos una concentración en el intervalo de 0-1 ng/ml, al menos una concentración en el intervalo de 1-3 ng/ml, al menos una concentración en el intervalo de 3-6 ng/ml, y preferiblemente al menos una concentración adicional en el intervalo de 6-10 ng/ml, y más preferiblemente que comprende además al menos una concentración adicional en el intervalo de 10-15 ng/ml.
Secuencias
Las secuencias de aminoácidos a las que se hace referencia en la presente solicitud son las siguientes (en orden N-terminal a C-terminal; representadas en el código de aminoácidos de una letra):
SEQ ID NO: 1 (región del dominio variable de cadena pesada que comprende una región FR1, CDR1, FR2, CDR2 y FR3 de la secuencia polipeptídica de AcM-B1-23 monoclonal anti-GDF-15 humano):
SEQ ID NO: 2 (región del dominio variable de cadena ligera que comprende una región FR1, CDR1, FR2, CDR2 y FR3 de la secuencia polipeptídica de AcM-B1-23 monoclonal anti-GDF-15 humano):
SEQ ID NO: 3 (secuencia peptídica de la región CDR1 de cadena pesada de AcM-B1-23 monoclonal anti-GDF-15 humano):
GFSLSTSGMG SEQ ID NO: 4 (secuencia peptídica de la región CDR2 de cadena pesada de AcM-B1-23 monoclonal anti-GDF-15 humano):
IYWDDDK SEQ ID NO: 5 (secuencia peptídica de la región CDR3 de cadena pesada de AcM-B1-23 monoclonal anti-GDF-15 humano):
ARSSYGAMDY SEQ ID NO: 6 (secuencia peptídica de la región CDR1 de cadena ligera de AcM-B1-23 monoclonal anti-GDF-15 humano):
QNVGTN
Secuencia peptídica de la región CDR2 de cadena ligera del AcM-B1-23 monoclonal antihumano GDF-15:
SAS SEQ ID NO: 7 (secuencia peptídica de la región CDR3 de cadena ligera de AcM-B1-23 monoclonal anti-GDF-15 humano):
QQYNNFPYT SEQ ID NO: 8 (proteína GDF-15 humana madura recombinante):
SEQ ID NO: 9 (proteína precursora de GDF-15 humano):
SEQ ID NO: 10 (proteína precursora de GDF-15 humano ligador GSGS N-terminal y C-terminal):
SEQ ID NO: 11 (péptido Flag): DYKDDDDKGG
SEQ ID NO: 12 (péptido HA): YPYDVPDYAG
SEQ ID NO: 13 (péptido derivado de GDF-15 humano): ELHLRPQAARGRR
SEQ ID NO: 14 (péptido derivado de GDF-15 humano): LHLRPQAARGRRR
SEQ ID NO: 15 (péptido derivado de GDF-15 humano): HLRPQAARGRRRA
SEQ ID NO: 16 (péptido derivado de GDF-15 humano): LRPQAARGRRRAR
SEQ ID NO: 17 (péptido derivado de GDF-15 humano): RPQAARGRRRARA
SEQ ID NO: 18 (péptido derivado de GDF-15 humano): PQAARGRRRARAR
SEQ ID NO: 19 (péptido derivado de GDF-15 humano): QAARGRRRARARN
SEQ ID NO: 20 (péptido derivado de GDF-15 humano): MHAQIKTSLHRLK
SEQ ID NO: 25 (péptido GDF-15 que comprende parte del epítopo de GDF-15 que se une a B1-23):
EVQVTMCIGACPSQFR SEQ ID NO: 26 (péptido GDF-15 que comprende parte del epítopo de GDF-15 que se une a B1-23):
TDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI
Las secuencias de ácido nucleico a las que se hace referencia en la presente solicitud son tal como sigue (en orden 5’ a 3’; representadas según el código de ácido nucleico convencional):
SEQ ID NO: 21 (secuencia de nucleótidos de ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos definida en SEQ ID NO: 1):
SEQ ID NO: 22 (secuencia de nucleótidos de ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos definida en SEQ ID NO: 2):
SEQ ID NO: 23 (secuencia de nucleótidos de ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos definida en SEQ ID NO: 5):
GCTCGAAGTTCCTACGGGGCAATGGACTAC SEQ ID NO: 24 (secuencia de nucleótidos de ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos definida en SEQ ID NO: 7):
CAGCAATATAACAACTTTCCGTACACG
Ejemplos
Los ejemplos de referencia 1 a 3 ejemplifican un anticuerpo contra hGDF-15, que puede usarse en los métodos, usos de kits y en los aparatos según la invención. Este anticuerpo contra hGDF-15 es un anticuerpo monoclonal conocido por el documento WO 2014/049087.
Ejemplo de referencia 1: Generación y caracterización del anticuerpo B1-23 contra GDF-15.
El anticuerpo B1-23 se generó en un ratón con GDF-15 inactivado. Como inmunógeno se usó GDF-15 humano recombinante (SEQ ID NO: 8).
La línea celular de hibridoma B1-23 que produce AcM-B1-23 la depositó la Julius-Maximilians-Universitat Würzburg, Sanderring 2, 97070 Würzburg, Alemania, en la Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DMSZ) con el número de registro DSM ACC3142, según el Tratado de Budapest.
Mediante un sistema de tiras reactivas disponible comercialmente, se identificó B1-23 como un isotipo IgG2a (cadena kappa). Usando mediciones de resonancia de plasmón superficial, la constante de disociación (Kd) se determinó de la siguiente manera:
La unión del anticuerpo monoclonal anti-GDF-15 humano, AcM-B1-23 anti-GDF-15 humano, según la invención se midió empleando mediciones de resonancia de plasmón superficial usando un sistema Biorad ProteOn XPR36 y chips sensores Biorad GLC:
Para preparar los biosensores, se inmovilizó proteína GDF-15 humana madura recombinante en las celdas de flujo 1 y 2. En una celda de flujo, se usó GDF-15 recombinante derivado de células de insecto transfectadas con baculovirus (células de insecto HighFive) y en la otra proteína recombinante derivada de la expresión enE. coli. El chip sensor GLC se activó usando Sulfo-NHS (N-hidroxisulfosuccinimida) y EDC (clorhidrato de 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida) (kit de acoplamiento de amina Biorad ProteOn) según la recomendación del fabricante; se cargó posteriormente la superficie del sensor con las proteínas hasta una densidad de aproximadamente 600 RU (1 Ru = 1 pg mm<-2>). A continuación, los grupos de acoplamiento que no reaccionaron se extinguieron mediante perfusión con etanolamina 1 M, pH 8,5, y el biosensor se equilibró perfundiendo el chip con tampón de ejecución (HEPES 10 M, NaCl 150 mM, EDTA 3,4 mM, Tween-20 al 0,005 %, pH 7,4, denominado HBS150). Como controles se usaron dos celdas de flujo, una vacía sin proteínas acopladas y otra acoplada con una proteína no fisiológica (interleucina-5 humana), que se inmovilizó usando la misma química de acoplamiento y la misma densidad de acoplamiento. Para las mediciones de interacción, se disolvió AcM-B1-23 anti-GDF-15 humano en HBS150 y se usó en seis concentraciones diferentes como analito (concentración: 0,4, 0,8, 3, 12, 49 y 98 nM). El analito se perfundió sobre el biosensor usando la configuración cinética de un solo disparo para evitar la regeneración intermitente; todas las mediciones se realizaron a 25 ºC y usando una velocidad de flujo de 100 μl min<-1>. Para el procesamiento, se eliminaron el efecto de cara a granel y la unión no específica a la matriz del sensor restando los datos de SPR de la celda de flujo vacía (celda de flujo 3) de todos los demás datos de SPR. El sensograma resultante se analizó usando el software ProteOn Manager versión 3.0. Para el análisis de la cinética de unión se asumió una interacción de tipo Langmuir 1:1. Para la tasa de asociación constante pudo determinarse un valor de 5,4+0,06×10<5>M<-1>s<-1>(kon) y para la constante de tasa de disociación un valor de 4,3+0,03×10<-4>s<-1>(koff) (los valores corresponden a la interacción del AcM-B1-23 anti-GDF-15 humano con GDF-15 derivado de la expresión de células de insecto). La constante de disociación en equilibrio se calculó usando la ecuación KD=koff/konpara producir un valor de aproximadamente 790 pM. Los valores de afinidad para la interacción de GDF-15 derivado de la expresión enE. coliy el AcM-B1-23 anti-GDF-15 humano difieren en menos de un factor de 2, constantes de velocidad para GDF-15 derivado de células de insecto yE. colise desvían en aproximadamente un 45 % y, por tanto, están dentro de la precisión de las mediciones de SPR y probablemente no reflejan una diferencia real en la afinidad. En las condiciones usadas, el AcM-B1-23 anti-GDF-15 humano no muestra unión a la interleucina-5 humana y, por tanto, confirma la especificidad de los datos de interacción y el AcM-B1-23 anti-GDF-15 humano. La secuencia de aminoácidos del GDF-15 humano recombinante (tal como se expresa en células de insecto transfectadas con baculovirus) es:
Por tanto, usando mediciones de resonancia de plasmón superficial, se determinó la constante de disociación (Kd) de 790 pM. A modo de comparación: el anticuerpo rituximab usado terapéuticamente tiene una afinidad significativamente menor (Kd = 8 nM).
Anteriormente se demostró que el AcM B1-23 inhibe la proliferación de células cancerosasin vitro,y que el AcM B1-23 inhibe el crecimiento de tumoresin vivo(documento WO2014/049087).
Ejemplo de referencia 2: AcM B1-23 reconoce un epítopo conformacional o discontinuo de GDF-15 humano Mapeo de epítopos: anticuerpo monoclonal de ratón GDF-15 contra péptidos lineales de 13 meros derivados de GDF-15
Antígeno: GDF-15:
La secuencia de proteínas se tradujo en péptidos de 13 meros con un desplazamiento de un aminoácido. Los extremos C-terminal y N-terminal se alargaron mediante un ligador GSGS neutro para evitar péptidos truncados (letras en negrita).
Péptidos de control:
Flag: DYKDDDDKGG (SEQ ID NO:13), 78 puntos; HA: YPYDVPDYAG (SEQ ID NO:14), 78 puntos (cada copia de la matriz)
Identificador de chip de péptido:
000264_01 (10/90, ligador Ala2Asp)
Condiciones de tinción:
Tampón convencional: PBS, pH 7,4 Tween 20 al 0,05 %
Tampón de bloqueo: tampón de bloqueo Rockland MB-070
Tampón de incubación: tampón convencional con tampón de bloqueo Rockland MB-070 al 10 %
Muestra primaria: anticuerpo monoclonal de ratón GDF-15 (1�g/ μl): tinción en tampón de incubación durante 16 h a 4 ºC en una dilución de 1:100 y agitación ligera a 500 rpm
Anticuerpo secundario: de cabra anti-IgG ratón (H+L) IRDye680, tinción en tampón de incubación con una dilución de 1:5000 durante 30 min a temperatura ambiente (TA)
Anticuerpos de control: monoclonal anti-HA (12CA5)-LL-Atto 680 (1:1000), monoclonal anti-FLAG(M2)-FluoProbes752 (1:1000); tinción en tampón de incubación durante 1 h a temperatura ambiente
Barrido:
Sistema de obtención de imágenes Odyssey, LI-COR Biosciences
Ajustes: desplazamiento: 1 mm; resolución: 21�m; intensidad verde/rojo: 7/7
Resultados:
Después de 30 minutos de hinchamiento previo en tampón convencional y 30 minutos en tampón de bloqueo, la matriz de péptidos con péptidos lineales derivados de B7H3 de 10, 12 y 15 meros, se incubó con anticuerpo secundario de cabra anti-IgG de ratón (H+L) marcado con IRDye680 solo a una dilución de 1:5000 durante 1 h a temperatura ambiente para analizar las interacciones de fondo del anticuerpo secundario. Se lavó el PEPperCHIP<®>2x1 min con tampón convencional, se enjuagó con agua destilada y se secó en una corriente de aire. La lectura se realizó con el sistema de obtención de imágenes Odyssey a una resolución de 21�m e intensidades verde/rojo de 7/7: se observó una interacción débil de péptidos ricos en arginina (ELHLRPQAARGRR (SEQ ID NO: 15), LHLRPQAARGRRR (SEQ ID NO: 16), HLRPQAARGRRRA (SEQ ID NO: 17), LRPQAARGRRRAR (SEQ ID NO: 18), RPQAARGRRRARA (SEQ ID NO: 19), PQAARGRRRARAR (SEQ ID NO: 20) y QAARGRRRARARN (SEQ ID NO: 21)) que se conocen como aglutinantes frecuentes, y con el péptido básico MHAQIKTSLHRLK (SEQ ID NO: 22) debido a interacciones iónicas con el colorante del anticuerpo cargado.
Después de un hinchamiento previo durante 10 minutos en tampón convencional, la micromatriz de péptidos se incubó durante la noche a 4 ºC con anticuerpo monoclonal de ratón GDF-15 en una dilución de 1:100. Al lavado repetido en tampón convencional (2x1 min) le siguió una incubación durante 30 min con el anticuerpo secundario en una dilución de 1:5000 a temperatura ambiente. Después de 2x10 s de lavado en tampón convencional y enjuague corto con agua destilada, se secó el PEPperCHIP<®>en una corriente de aire. La lectura se realizó con el sistema de obtención de imágenes Odyssey a una resolución de 21�m e intensidades verde/rojo de 7/7 antes y después de la tinción de los péptidos de control con anticuerpos anti-HA y anti-FLAG(M2).
Se demostró que ninguno de los péptidos lineales de 13 meros derivados de GDF-15 interactuaba con el anticuerpo monoclonal de ratón GDF-15, incluso a intensidades sobrerreguladas. Sin embargo, la tinción de los péptidos de control Flag y HA que enmarcan la matriz dio lugar a intensidades de puntos buenas y homogéneas.
Resumen:
El mapeo de epítopos del anticuerpo monoclonal de ratón GDF-15 contra GDF-15 no reveló ningún epítopo lineal con los péptidos de 13 meros derivados del antígeno. Según este hallazgo, es muy probable que el anticuerpo monoclonal de ratón GDF-15 reconozca un epítopo conformacional o discontinuo con baja afinidad de epítopos parciales. Debido a la evidente ausencia de cualquier señal de GDF-15 por encima de la tinción de fondo del anticuerpo secundario únicamente, se omitió la cuantificación de las intensidades de los puntos con el analizador PepSlide<®>y la posterior anotación de péptidos.
Ejemplo de referencia 3: Identificación estructural de epítopos de ligandos peptídicos mediante escisión y extracción de epítopos por espectrometría de masas
El epítopo del GDF-15 humano recombinante que se une al anticuerpo B1-23 se identificó mediante el método de escisión del epítopo y el método de extracción del epítopo (Suckauet al.Proc Natl Acad Sci U S A.1990 diciembre; 87(24): 9848-9852.; R.Stefanescuet al., Eur.J.Mass Spectrom.13, 69-75 (2007)).
Para la preparación de la columna de anticuerpos, se añadió el anticuerpo B1-23 a Sepharose acoplado con ácido 6-aminohexanoico activado por NHS. Después se cargó el anticuerpo B1-23 acoplado a Sepharose en una microcolumna de 0,8 ml y se lavó con tampones de bloqueo y lavado.
Experimento de extracción de epítopos:
Se digirió GDF-15 humano recombinante con tripsina durante 2 horas a 37 ºC (en disolución), dando como resultado diferentes péptidos, según los sitios de escisión de tripsina en la proteína. Después de la digestión completa, los péptidos se cargaron en la columna de afinidad que contenía el anticuerpo B1-23 inmovilizado. Se usaron péptidos de GDF-15 no unidos y potencialmente unidos para el análisis de espectrometría de masas. No fue posible la identificación de péptidos mediante espectrometría de masas. Esto fue un indicador adicional de que la región de unión de GDF-15 en el complejo inmune B1-23 comprende un epítopo discontinuo o conformacional. En el caso de un epítopo lineal continuo, los péptidos digeridos deben unirse a su compañero de interacción, a menos que haya un sitio de escisión de tripsina en el péptido epítopo. Un epítopo discontinuo o conformacional podría confirmarse mediante el método de escisión del epítopo que se describe en la siguiente parte.
Experimento de escisión de epítopos:
Luego se incubó el anticuerpo B1-23 inmovilizado en la columna de afinidad con GDF-15 recombinante durante 2 h. Luego se incubó el complejo inmune formado en la columna de afinidad con tripsina durante 2 horas a 37 ºC. La escisión dio como resultado diferentes péptidos derivados del GDF-15 recombinante. El propio anticuerpo inmovilizado es proteolíticamente estable. Los péptidos resultantes de la proteína GDF-15 digerida, que estaban protegidos por el anticuerpo y, por tanto, protegidos de la escisión proteolítica, se eluyeron en condiciones ácidas (TFA, pH 2), se recogieron y se identificaron mediante espectrometría de masas.
El método de escisión de epítopos mediante identificación por EM/EM dio como resultado los siguientes péptidos:
La parte del GDF-15 humano, que se une al anticuerpo B1-23, comprende un epítopo discontinuo o conformacional. La espectrometría de masas identificó dos péptidos en la proteína GDF-15, que son responsables de la formación del complejo inmunológico. Estos péptidos están restringidos a las posiciones 40-55 (EVQVTMCIGACPSQFR) y 94-114 (TDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI) en la secuencia de aminoácidos de GDF-15. Por tanto, estos dos péptidos comprenden un epítopo de la proteína GDF-15 que se une al anticuerpo B1-23.
Ejemplo 1:
Pacientes, materiales y métodos
Pacientes
Los pacientes del Departamento de Dermatología de la Universidad de Tübingen, Alemania, con melanoma confirmado histológicamente se identificaron en la base de datos del Registro Central de Melanoma Maligno (CMMR), que registra prospectivamente a pacientes de más de 60 centros dermatológicos en Alemania. Se seleccionaron 761 pacientes, con (a) muestras de suero archivadas tomadas entre enero de 2008 y febrero de 2012, (b) datos de seguimiento disponibles y (c) antecedentes o presencia de metástasis locorregional o a distancia en el momento de la extracción de sangre. Los objetivos y métodos de recopilación de datos por parte del CMMR se han publicado previamente con detalle (Lasithiotakis, KGet al., Cancer/107/1331-9. 2006). Los datos obtenidos para cada paciente incluyeron edad, sexo, fecha del último seguimiento y fecha y causa de muerte, si corresponde. Todos los pacientes habían dado su consentimiento informado por escrito para que los datos clínicos se registraran en el registro de CMMR. El comité de ética institucional de Tübingen aprobó el estudio (voto ético 125/2015BO2). Se evaluaron la edad, el patrón de metástasis a distancia (sólo pacientes en estadio IV), subestadio (IIIA frente a IIIB frente a IIIC; sólo pacientes en estadio III) según la clasificación del AJCC (Balch, CMet al., J Clin Oncol/27/6199-206. 2009), la LDH sérica y la S100B sérica (inmunoensayo de electroquimioluminiscencia Elecsys S100; Roche Diagnostics AG, Rotkreuz, Suiza) en el momento de la toma de muestra de suero. Las concentraciones séricas de hGDF-15 se cuantificaron por duplicado usando un kit de ELISA comercial según las instrucciones del fabricante (R&D Systems, Wiesbaden, Alemania):
Análisis de los niveles séricos de hGDF-15 mediante ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA):
Los niveles séricos de GDF-15 humano se midieron mediante un ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA).
Tampones y reactivos:
Disolución de bloqueo: BSA al 1 % (fracción V pH 7,0, PAA) en PBS
Disolución de lavado: PBS-Tween (0,05 %)
Patrón: GDF-15 humano (concentración madre 120�g/ml, de R&D Systems)
Anticuerpo de captura: AcM antiGDF-15 humano (clon 147627) de R&D Systems, IgG2B de ratón (n.º de catálogo MAB957, de R&D Systems, concentración madre de 360�g/ml)
Anticuerpo de detección: AcP purificado por afinidad biotinilado contra GDF-15 humano, IgG de cabra (n.º de catálogo BAF940, de R&D Systems, concentración madre de 9 μl/ml)
Estreptavidina-HRP (n.º de catálogo DY998, de R&D Systems)
Disolución de sustrato: 10 ml de NaOAc 0,1 M pH 6,0 100 μl de TMB 2 μl de H2OH2
Disolución de parada: H2SO41 M
Procedimiento de análisis:
1. Preparación de la placa:
a. El anticuerpo de captura se diluyó hasta la concentración de trabajo de 2�g/ml en PBS. Una microplaca de 96 pocillos (Nunc maxisorp<®>) se recubrió inmediatamente con 50 μl por pocillo del anticuerpo de captura diluido excluyendo las filas exteriores (A y H). Las filas A y H se llenaron con tampón para evitar la evaporación de las muestras durante el experimento. La placa se golpeó suavemente para asegurar que el fondo de cada pocillo estuviera completamente cubierto. La placa se colocó en una cámara húmeda y se incubó durante la noche a temperatura ambiente (TA).
b. Cada pocillo se aspiró y se lavó tres veces con PBS-Tween (0,05 %).
c. Se añadieron 150 μl de disolución de bloqueo a cada pocillo, seguido de incubación a temperatura ambiente durante 1 hora.
d. Cada pocillo se aspiró y se lavó tres veces con PBS-Tween (0,05 %).
2. Procedimiento de ensayo:
a. Se prepararon patrones. Se diluyó GDF-15 en disolución de bloqueo tamponada hasta una concentración final de 1 ng/ml (4,17 μl de GDF 496 μl de disolución de bloqueo tamponada). Se realizaron diluciones en serie 1:2.
b. Se prepararon muestras duplicadas 1:20 (6 μl 114 μl de disolución de bloqueo tamponada).
c. Se añadieron 50 μl de muestras o patrones diluidos por pocillo, seguido de una incubación durante 1 hora a temperatura ambiente.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
a. Cada pocillo se aspiró y se lavó tres veces con PBS-Tween (0,05 %).
b. El anticuerpo de detección se diluyó hasta una concentración final de 50 ng/ml (56 μl 10 ml de disolución de bloqueo tamponada). Se añadieron 50 μl del anticuerpo de detección diluido a cada pocillo, seguido de una incubación durante 1 hora a TA.
c. Cada pocillo se aspiró y se lavó tres veces con PBS-Tween (0,05 %).
d. Se diluyó estreptavidina-HRP 1:200 (50 μl 10 ml de tampón de bloqueo). Se añadieron 50 μl de la dilución de trabajo de estreptavidina-HRP a cada pocillo, seguido de una incubación durante 20 minutos a temperatura ambiente.
e. Cada pocillo se aspiró y se lavó tres veces con PBS-Tween (0,05 %).
f. Se preparó la disolución de sustrato. Se añadieron 50 μl de disolución de sustrato a cada pocillo, seguido de una incubación durante 20 minutos a temperatura ambiente.
g. Se añadieron 50 μl de disolución de parada a cada pocillo.
h. La densidad óptica de cada pocillo se determinó inmediatamente usando un lector de microplacas ajustado a 450 nm.
3. Cálculo del título sérico de GDF-15:
a. Cada muestra/dilución patrón de GDF-15 se aplicó por duplicado. Para determinar el título de GDF-15, se calculó el promedio de los duplicados y se restó el fondo (muestra sin GDF-15).
b. Para crear una curva de calibración, los valores de intervalo lineal se trazaron en un diagrama X-Y (eje X: concentración de GDF-15, eje Y: DO450) y se aplicó un ajuste de curva lineal. El título sérico de GDF-15 de las muestras de prueba se calculó interpolando los valores de DO450 de las diluciones patrón con concentración conocida.
c. Para calcular la concentración final de GDF-15 de las muestras, se consideró el factor de dilución distinto. Las muestras que arrojaron valores de DO inferiores o superiores a intervalo estándar se volvieron a analizar con diluciones apropiadas.
Análisis estadístico
El tiempo de seguimiento para el análisis de supervivencia se definió desde la fecha de la toma de muestra de sangre hasta el último seguimiento o la muerte. Las probabilidades de supervivencia acumuladas según Kaplan-Meier se calcularon junto con intervalos de confianza (IC) del 95 % y se compararon mediante estadísticas de prueba de rango logarítmico bilateral. Para el análisis de la SG, los pacientes que estaban vivos en el último seguimiento fueron censurados, mientras que los pacientes que habían fallecido se consideraron un “acontecimiento”. Para analizar el impacto de sGDF-15 en la SG, los pacientes se asignaron aleatoriamente a dos cohortes usando una razón de 1:2 (cohorte de identificación y validación, respectivamente). En la cohorte de identificación se aplicaron diferentes puntos de corte para categorizar a los pacientes según sGDF-15 en dos grupos equilibrados que comprendían ≥25 % de los pacientes cada uno. Se analizaron las diferencias en la SG entre pacientes con sGDF-15 alto y bajo para cada punto de corte y se seleccionó el que resultó en el valor de p de rango logarítmico más bajo, de manera similar a los algoritmos de optimización publicados anteriormente (Camp, RLet al., Clin Cancer Res/10/7252-9. 2004). Posteriormente se analizó el punto de corte óptimo definido en la cohorte de identificación en 507 pacientes de la cohorte de validación.
Se usó el análisis de regresión de riesgos proporcionales de Cox para calcular el efecto relativo considerando factores de pronóstico adicionales en toda la cohorte de pacientes. La edad se dicotomizó según la edad mediana de los pacientes. Los niveles séricos de S100B y sLDH se clasificaron como elevados frente a normales según los valores de corte utilizados en la rutina clínica (límite superior de lo normal 0,10�g/l y 250 U/I, respectivamente). Los pacientes con valores faltantes se excluyeron del análisis de regresión. Los resultados de los modelos se describieron mediante índices de riesgo; los valores de p se basaron en la prueba de Wald. Todos los análisis estadísticos se realizaron usando el software SPSS, versión 22 (IBM SPSS, Chicago, Illinois, EE.UU.).
Resultados
Pacientes
Las características de los pacientes se muestran en la tabla 1. Se analizó un total de 761 pacientes con melanoma (52,0 % hombres). La mediana de edad fue de 63 años. La mediana de seguimiento de los pacientes que murieron fue de 10,3 meses y de 45,3 meses para los pacientes que fueron censurados.
Los pacientes en estadio IV (n = 293) se asignaron a las categorías M M1c (n = 206; 70,3 %), M1b (n = 51; 17,4 %) o M1a (n = 36; 12,3 %) basándose en el sitio de metástasis a distancia y en la LDH sérica (sLDH) (Balch, CMet al., J Clin Oncol/27/6199-206.2009). La mediana de supervivencia estimada según Kaplan Meier fue de 10,7 meses. Las probabilidades de supervivencia fueron del 46,4 % al año, del 33,3 % a los 2 años y del 29,3 % a los 3 años.
Se incluyó un total de 468 pacientes en estadio III. El subestadio fue IIIA en el 15,6 %, IIIB en el 37,2 % y IIIC en el 47,2 % de 422 pacientes con datos completos para la clasificación. Las probabilidades de supervivencia fueron del 94,9 % a 1 año, del 85,0 % a 2 años y del 72,8 % a 5 años, respectivamente.
La mediana de la concentración sérica de hGDF-15 fue de 1,0 ng/ml considerando los 761 pacientes (0,9 ng/ml para los pacientes en estadio III frente a 1,5 ng/ml para los pacientes en estadio IV). El sGDF-15 medio fue de 2,6 (1,1 ng/ml para los pacientes en estadio III frente a 4,8 ng/ml para los pacientes en estadio IV; p<0,001).
Supervivencia global según niveles de hGDF-15
Se encontraron trece puntos de corte diferentes que oscilan desde 0,7 ng/ml hasta 1,9 ng/ml a incrementos de 0,1 ng/ml para clasificar a los pacientes de la cohorte de identificación (n=254) según sGDF-15 en dos grupos equilibrados (el grupo más pequeño debía comprender al menos el 25 % de los pacientes). La diferencia en el pronóstico fue mayor al comparar 86 pacientes (33,9 %) con niveles de hGDF-15 ≥1,5 ng/ml y SG deficiente con 168 (66,1 %) pacientes con niveles más bajos y SG favorable (p<0,001; figura 4A). La diferencia en la SG al aplicar este punto de corte para sGDF-15 se confirmó posteriormente en la cohorte de validación (n = 508; p <0,001; figura 4B). Esta correlación inversa entre sGDF-15 y OS se observó en pacientes en estadio III sin tumor y en pacientes en estadio IV irresecable (figura 1A; 1B), pero no en pacientes en estadio IV sin tumor (figura 1C), considerando a todos los pacientes (ambas cohortes combinadas).
Considerando a los pacientes en estadio III de ambas cohortes, la probabilidad de supervivencia a 1, 2 y 5 años fue del 96,1 %, el 87,8 % y el 75,7 % para aquellos con sGDF-15 por debajo de 1,5 ng/ml (n=369, 78,8 % de todos los pacientes en estadio III) pero sólo el 90,4 %, el 74,2 % y el 61,5 % para pacientes con sGDF-15 más alto (n=99, 21,2 %) (tabla 2).
Para los pacientes de ambas cohortes con metástasis a distancia irresecable y niveles altos de hGDF-15, la probabilidad de sobrevivir un año después del análisis fue sólo del 14,3 %, pero del 45,0 % para los pacientes con sGDF-15 bajo. De manera similar, la supervivencia a 2 y 5 años fue del 6,3 % y 2,6 % en comparación con el 19,9 % y el 5,2 %, respectivamente. La mediana de supervivencia fue de 5,7 meses frente a 11,0 meses para los pacientes en estadio IV irresecable con sGDF-15 alto y bajo, respectivamente (tabla 3).
Tabla 1: Características del paciente
El impacto de pronóstico relativo de sGDF-15 en pacientes en estadio III
Se realizaron análisis de regresión de Cox de toda la cohorte de pacientes en estadio III para determinar el impacto relativo de sGDF-15 en comparación con otros factores de pronóstico (tabla 3). En el primer modelo se incluyeron los tres biomarcadores sGDF-15, sS100B y sLDH para permitir una comparación directa. Los resultados se ajustaron para los subestadios, ya que el análisis univariado había revelado una tendencia hacia una mejor SG para los subestadios IIIA/B frente a IIIC (p = 0,088). Además del sGDF-15 elevado (HR 2,3; p<0,001), la sS100B elevada se asoció fuertemente con una SG deficiente (figura 5A) y tuvo un impacto negativo independiente en el pronóstico (HR 3,2; p<0,001) en el análisis multivariado. Las tasas de supervivencia a un año fueron las más altas, con un 97,4 % para los pacientes con resultados favorables en ambos biomarcadores, en fuerte contraste con un 56,2 % para aquellos con ambos marcadores elevados. Las probabilidades de supervivencia después de un año de los pacientes con sS100B elevada o sGDF-15 elevado fueron del 88,4 % o del 95,1 %, respectivamente. En el segundo modelo se consideraron además la edad y el sexo. En este caso, el estadio IIIC y la edad>63 años tuvieron un impacto negativo independiente en el pronóstico, además de sGDF15 y sS100B. El número de valores desfavorables considerando esos 4 factores estuvo fuertemente asociado con la supervivencia (figura 5). Tal como se esperaba para el melanoma en estadio III, la sLDH no mostró correlación con el resultado en ninguno de los modelos.
El impacto relativo de los niveles de hGDF-15 en pacientes en estadio IV
En pacientes en estadio IV sin evidencia de enfermedad en el momento de la toma de muestra de sangre (n = 87), no se observó relevancia de pronóstico para sGDF-15. Ni el patrón de metástasis a distancia ni la sLDH se asociaron con la SG (tabla 4). En cambio, sS100B fue el único factor de pronóstico en esta población de pacientes (figura 5C).
Observando a 203 pacientes con melanoma en estadio IV completamente caracterizados con carga tumoral irresecable, se aplicó el análisis de regresión de Cox para investigar el impacto de pronóstico relativo de sGDF-15 en comparación con otros factores. En el primer modelo, se comparó sGDF-15 con el patrón de metástasis a distancia y sLDH, ambos considerados factores de pronóstico en la clasificación del AJCC (tabla 3). Al igual que en el melanoma en estadio III, sGDF-15 tuvo un fuerte impacto independiente en la SG (HR 1,7; p<0,001) junto con el patrón de metástasis a distancia (HR 1,8; p<0,001) y sLDH (HR 1,6; p=0,002). El impacto independiente de los niveles de sGDF-15 fue evidente tanto en pacientes M1a/b (figura 3A) como en pacientes M1c (figura 3B). El número de valores desfavorables considerando los tres factores independientes sLDH, sGDF-15 y el patrón de metástasis a distancia se asoció fuertemente con la SG (figura 3C). De ese modo, el 47 % de los pacientes se situaron en un subgrupo recientemente identificado con una probabilidad extremadamente deficiente (3,3 %) de sobrevivir 1 año. El modelo multivariado 2 consideró todas las variables analizadas (tabla 3). En este caso, sS100B reemplazó a sLDH como parámetro de pronóstico significativo y la edad tuvo un impacto independiente adicional. La estratificación según el número de factores desfavorables considerando sS100B, la categoría M, hGDF-15 y la edad permitió la identificación de un subgrupo del 8 % de pacientes con pronóstico favorable y una SG a 1 año del 81,3 %. Por el contrario, el 16 % de los pacientes que mostraron valores desfavorables en los 4 factores independientes tuvieron el peor pronóstico con una SG a 1 año del 3,2 % (figura 7).
Ejemplo 2: Evaluación alternativa de las muestras de pacientes descritas en el ejemplo 1
Como ejemplo alternativo según la invención, las mismas muestras de pacientes, que ya se describieron en el ejemplo 1, se evaluaron de manera alternativa, tal como se describe a continuación:
Pacientes, materiales y métodos:
Pacientes
Los pacientes del Departamento de Dermatología de Tübingen, Alemania, con melanoma confirmado histológicamente se identificaron en la base de datos del Registro Central de Melanoma Maligno (CMMR) (Lasithiotakiset al., 2006). Se seleccionaron 761 pacientes, con (a) muestras de suero archivadas tomadas entre enero de 2008 y febrero de 2012, (b) datos de seguimiento disponibles y (c) antecedentes de metástasis locorregional o (d) antecedentes o presencia de metástasis a distancia en el momento de la extracción de sangre. Se tomaron muestras del suero usadas para el análisis de sGDF-15 durante extracciones de sangre de rutina para el análisis del estadio mediante sS100B que se definió según la clasificación AJCC (Balchet al., 2009). Se clasificaron la LDH sérica y S100B sérica (inmunoensayo de electroquimioluminiscencia Elecsys S100; Roche Diagnostics, Rotkreuz, Suiza) como elevados frente a normales según los valores de corte usados en la rutina clínica (límites superiores de lo normal 0,10�g/l y 250 U/I, respectivamente). Para el cálculo del número de sitios distantes afectados se consideraron tejidos blandos/nódulos linfáticos distantes, pulmón, cerebro, hígado, hueso y otros órganos viscerales. Por tanto, el número podría estar entre 1 y 6 para cada paciente en estadio IV. Las concentraciones séricas de GDF-15 se cuantificaron por duplicado usando un kit de ELISA comercial según las instrucciones del fabricante (R&D Systems, Wiesbaden, Alemania).
Todos los pacientes habían dado su consentimiento informado por escrito para que los datos clínicos se registraran en el registro CMMR. El comité de ética institucional de Tübingen aprobó el estudio (voto ético 125/2015BO2). Análisis estadístico
El tiempo de seguimiento se definió desde la fecha de la toma de muestra de sangre hasta el último seguimiento o muerte. Las probabilidades de supervivencia según Kaplan-Meier se calcularon junto con intervalos de confianza del 95 % y se compararon mediante pruebas de rangos logarítmicos bilaterales. Se censuró a los pacientes que estaban vivos en el último seguimiento o que murieron por motivos distintos al melanoma. Los pacientes se asignaron aleatoriamente a dos cohortes usando una razón de 1:2. En la cohorte de identificación, se analizaron las diferencias en la SG entre pacientes con sGDF-15 alto y bajo para determinar los puntos de corte que producen dos grupos equilibrados que comprenden ≥25 % de los pacientes cada uno. Luego, se seleccionó el punto de corte que dio como resultado el valor de p de rango logarítmico más bajo, similar a los algoritmos de optimización publicados anteriormente (Campet al., 2004) y posteriormente analizados en la cohorte de validación.
Se usó el análisis de regresión de Cox excluyendo a los pacientes con valores faltantes. Los resultados de los modelos multivariados se describieron mediante HR; los valores de p se basaron en la prueba de Wald. Se desarrollaron modelos combinados usando la función de nomograma en el paquete de supervivencia para R. Las diferencias en sGDF-15 según tratamientos sistémicos previos se analizaron mediante la prueba U de Mann-Whitney. Todos los análisis estadísticos se llevaron a cabo usando SPSS Versión 22 (IBM SPSS, Chicago, Illinois, EE.UU.) y R 3.2.1 (R Foundation for Statistical Computing, Viena, Austria).
Resultados:
Pacientes
Las características de los pacientes se muestran en la tabla 5. Se analizó un total de 761 pacientes con melanoma. La mediana de seguimiento de los pacientes que murieron fue de 10,3 meses y de 45,3 meses para los pacientes que estaban vivos en el momento del último seguimiento.
Los pacientes en estadio IV (n = 293) se asignaron a las categorías M M1c (n = 206; 70,3 %), M1b (n = 51; 17,4 %) o M1a (n = 36; 12,3 %). La mediana de supervivencia estimada según Kaplan Meier fue de 10,7 meses. Las probabilidades de supervivencia fueron del 46,4 % al año, del 33,3 % a los 2 años y del 29,3 % a los 3 años. La evaluación de los pacientes en estadio IV se realizó en el plazo de 12 semanas en 84 pacientes (28,7 %), o en el plazo de 12 meses después de la primera aparición de metástasis a distancia en 96 pacientes (32,7 %), o en momentos posteriores en 113 pacientes (38,6 %). En el momento respectivo, 87 pacientes (29,7 %) no tenían evidencia de enfermedad, mientras que 206 (70,3 %) tenían un tumor irresecable.
Se incluyó un total de 468 pacientes en estadio III. El subestadio fue IIIA en el 15,6 %, IIIB en el 37,2 % y IIIC en el 47,2 % de 422 pacientes con datos completos para la clasificación. Las probabilidades de supervivencia fueron del 94,9 % a 1 año, del 85,0 % a 2 años y del 72,8 % a 5 años, respectivamente. El momento de la evaluación fue en el plazo de 12 semanas para 55 pacientes (11,8 %), en el plazo de 12 meses posteriores a la primera aparición de metástasis locorregional para 100 (21,4 %) o más tarde para 313 pacientes (66,9 %). Ninguno de los pacientes en estadio III tenía evidencia de enfermedad en el momento respectivo.
Niveles séricos de GDF-15 según estadio, carga tumoral y tratamientos previos
La mediana de sGDF-15 fue de 1,0 ng/ml considerando los 761 pacientes (0,9 ng/ml para los pacientes en estadio III frente a 1,5 ng/ml para los pacientes en estadio IV). Los pacientes en estadio IV con evidencia clínica o radiológica de tumor tuvieron una mediana de sGDF-15 más alta (2,1 ng/ml) que los pacientes en estadio IV sin tumor o en estadio III sin tumor (ambos 0,9 ng/ml; figura 10A). Entre los pacientes en estadio IV sin tumor, la mediana de sGDF-15 no fue diferente entre 13 pacientes que tuvieron respuestas completas en curso después de tratamientos sistémicos y 74 pacientes que estaban sin tumor después de metastasectomía de metástasis a distancia (ambos 0,9 ng/ml). sGDF-15 se correlacionó con sLDH y el número de sitios distantes afectados en pacientes en estadio IV irresecable (figura 10B y 10C). En general, la mediana de sGDF-15 no fue diferente en pacientes que habían recibido tratamiento sistémico en las últimas 4 semanas o en cualquier momento antes de la toma de muestra de sangre (tabla 8). Un análisis separado sobre el impacto del pretratamiento con quimioterapia, ipilimumab, otra inmunoterapia, inhibidores de BRAF/MEK u otros tratamientos sistémicos mostró un sGDF-15 más bajo después de los inhibidores de BRAF/MEK y una tendencia hacia niveles más altos después de ipilimumab en pacientes en estadio IV irresecable. No se observó ningún impacto significativo de los tratamientos sistémicos previos en pacientes en estadio IV sin tumor. Se observó una diferencia pequeña pero significativa en sGDF-15 al comparar los pacientes en estadio III sin tumor que recibieron tratamiento adyuvante previo con interferón-� con los que no lo recibieron (0,8 ng/ml frente a 0,9 ng/ml; tabla 8).
Supervivencia global según niveles de GDF-15
En la cohorte de identificación (n = 254) se sometieron a prueba trece puntos de corte diferentes de sGDF-15 que oscilaban desde 0,7 ng/ml hasta 1,9 ng/ml. La diferencia más significativa en el pronóstico se observó cuando se compararon 86 pacientes (33,9 %) con sGDF-15 ≥1,5 ng/ml y SG deficiente con 168 pacientes (66,1 %) con niveles más bajos y SG favorable (p<0,001; figura 11A). La diferencia en la SG usando este punto de corte se confirmó posteriormente en la cohorte de validación (n=507; p<0,001; figura 11B). En la tabla 9 se proporciona una comparación de las características de los pacientes entre las cohortes de identificación y validación.
Esta correlación inversa entre sGDF-15 y SG se observó en pacientes en estadio III sin tumor y en pacientes en estadio IV irresecable (figurad 1A; 1B), pero no en pacientes en estadio IV sin tumor (figura 1C), considerando pacientes de ambas cohortes.
Entre los pacientes en estadio III, la probabilidad de SG a 1, 2 y 5 años fue del 96,1 %, el 87,8 % y el 75,7 % para aquellos con sGDF-15 <1,5 ng/ml, pero sólo del 90,4 %, el 74,2 % y el 61,5 % para los pacientes con mayor sGDF-15 (tabla 6 y tabla 10). La asociación con la SG fue significativa para los pacientes que habían estado sin tumor hasta 6 meses antes de la toma de muestra de suero, o durante de 6 a 24 meses. No se observaron diferencias en la SG en los pacientes que habían estado sin tumor durante más de 24 meses (figura 12).
Para los pacientes con metástasis a distancia irresecable y sGDF-15 ≥1,5 ng/ml, la probabilidad de SG a 1 año fue solo del 14,3 %, pero del 45,0 % para aquellos con sGDF-15 bajo. De manera similar, la supervivencia a 2 y 5 años fue del 6,3 % y 2,6 % en comparación con el 19,9 % y el 5,2 %, respectivamente (tabla 7 y tabla 11). La asociación con la SG fue significativa para los pacientes cuya evaluación se realizó dentro de los 6 meses y entre 6 y 24 meses después del primer diagnóstico de metástasis a distancia, pero no para aquellos que habían estado en el estadio IV durante más de 24 meses (figura 13).
El impacto de pronóstico relativo de sGDF-15 en pacientes en estadio III
Se realizó un análisis de regresión de Cox de todos los pacientes en estadio III sin tumor para determinar el impacto relativo de sGDF-15 en comparación con otros factores de pronóstico. El cociente de riesgos instantáneos (HR) fue de 2,2 (p<0,001) para los pacientes con sGDF15 ≥1,5 ng/ml cuando se ajustó para el subestadio según el American Joint Committee on Cancer (tabla 6; modelo 1). En el modelo 2, que consideró un amplio espectro de factores, la sS100B elevada se asoció fuertemente con una SG deficiente (figura 14A) y tuvo un impacto negativo independiente en la SG (HR 4,0; p<0,001) además del sGDF-15 elevado (HR 2,7; p <0,001) y el patrón de metástasis locorregional (HR = 4,1; p <0,001 para afectación combinada de ganglios linfáticos y en tránsito/satélite, HR = 2,4; p = 0,002 para afectación de ganglios linfáticos únicamente; tabla 6). Para obtener una puntuación de riesgo individual, se desarrolló un nomograma que tiene en cuenta el impacto relativo de estos tres factores (figura 8A). La SG a dos años fue del 96,1 % para los pacientes sin afectación de los ganglios linfáticos, sS100B normal y sGDF-15 <1,5 ng/ml (puntuación de riesgo 0), pero sólo del 40,2 % para aquellos con una puntuación de riesgo >175 (figura 8B). No se observaron asociaciones significativas con la SG en cuanto a edad, sexo, sLDH, subestadio, ulceración o grosor del tumor. La SG no fue diferente entre los pacientes que recibieron tratamientos sistémicos adyuvantes previos en comparación con los que no los recibieron (tabla 6). Se observó un impacto similar de sGDF-15 en la SG si el análisis se limitaba a pacientes en estadio III de la cohorte de validación (tabla 12).
El impacto relativo de los niveles de GDF-15 en pacientes en estadio IV
sGDF-15 tuvo un impacto independiente en la SG entre toda la cohorte de pacientes en estadio IV (n = 293). Tal como se esperaba, se observó un impacto prominente del estado de la enfermedad en el momento de la toma de muestra de suero (HR de enfermedad irresecable = 8,6; p <0,001 frente a sin tumor; tabla 13). Por tanto, los pacientes en estadio IV irresecable y aquellos que no tenían tumores después de la metastasectomía o las respuestas completas a tratamientos sistémicos previos se analizaron por separado.
En pacientes en estadio IV sin tumores (n = 87), no se observó ningún impacto en la SG para sGDF-15 (tabla 14). En cambio, el aumento de sS100B (figura 14B), ≥2 sitios distantes afectados y ningún tratamiento sistémico previo se asoció con una SG deficiente en el análisis univariado y multivariado. Ninguno de los 13 pacientes con respuestas completas en curso después de tratamientos sistémicos murió durante el seguimiento. Si el análisis se limitó al subgrupo de pacientes que no tenían tumores después de una metastasectomía completa, los mismos factores permanecieron asociados de manera independiente con la SG (tabla 15).
Al observar a 206 pacientes en estadio IV irresecable (tabla 7), el sGDF-15 elevado tuvo un fuerte impacto negativo independiente en la SG (HR 1,9; p<0,001) además de la categoría M (HR 1,6; p<0,001 para M1c). La asociación de sGDF-15 con la SG fue evidente tanto en pacientes M1a/b (figura 9A) como en pacientes M1c (figura 9B). En el modelo 2 multivariado más detallado, sGDF-15 elevado, sS100B elevada (figura 14C), afectación del SNC y ≥4 sitios distantes afectados se asociaron de manera independiente con una peor SG (tabla 7). Se observaron fuertes diferencias en la SG según la puntuación de riesgo basada en nomogramas que tiene en cuenta el impacto relativo de estos cuatro factores. El 31,1 % de los pacientes con una puntuación de riesgo <100 tuvieron una SG a 1 año del 48,3 %. Por el contrario, ninguno del 21,2 % de los pacientes que tenían una puntuación de riesgo ≥250 sobrevivió el primer año después de la toma de muestra de suero (figuras 9C, 9D). A pesar de estar asociados con la SG en el análisis univariado, la sLDH y el patrón de metástasis a distancia no tuvieron un impacto adicional en la SG cuando se consideraron junto con los otros factores. La SG de los pacientes que recibieron tratamiento sistémico previo no fue diferente en comparación con aquellos que no lo recibieron (tabla 7) y se observó un impacto independiente similar de sGDF-15 en la SG, si el análisis se limitó a pacientes irresecables que no habían recibido tratamiento previo (tabla 16), o sólo a los de la cohorte de validación (tabla 17). En pacientes con afectación del SNC, GDF-15, sLDH y sS100B se asociaron con la SG en el análisis univariado, pero no con factores independientes cuando se analizaron en combinación (tabla 18).
Resumen:
En el estudio actual, los inventores descubrieron sorprendentemente que la concentración sérica de hGDF-15 es un potente biomarcador de pronóstico para pacientes con melanoma metastásico.
Por ejemplo, los inventores descubrieron que las concentraciones séricas de hGDF-15 superiores a 1,5 ng/ml predecían con mayor fuerza una supervivencia global deficiente en una cohorte de 761 pacientes con melanoma metastásico.
En pacientes en estadio III sin tumor, no se usan biomarcadores de pronóstico aceptados mundialmente en la rutina clínica diaria. La estimación del pronóstico individual se basa principalmente en las características clínicas e histopatológicas consideradas para la definición de los subestadios IIIA, IIIB o IIIC, respectivamente (Balch, CMet al., J Clin Oncol/27/6199-206. 2009). La LDH sérica no alberga información de pronóstico en pacientes sin tumor después de la cirugía de metástasis locorregionales (Wevers, KPet al., Ann Surg Oncol/20/2772-9. 2013). Los niveles séricos de S100B sólo se analizan para la detección temprana de recaídas, principalmente en Europa (Pflugfelder, Aet al., J Dtsch Dermatol Ges/11/563-602. 2013), a pesar de una gran cantidad de evidencia de su impacto de pronóstico en pacientes con melanoma (Mocellin, Set al., Int J Cancer/123/2370-6.2008). En el estudio actual, los inventores descubrieron sorprendentemente que sGDF15 y sS100B son marcadores de pronóstico independientes para estos pacientes y son muy superiores a la subetapa clínica para la identificación de pacientes que probablemente morirán a causa de la enfermedad.
El análisis de sGDF-15 solo permitió identificar el 21 % de todos los pacientes en estadio III sin tumor con altas concentraciones séricas, que tenían un riesgo dos veces mayor de morir en el plazo de los tres años posteriores a la extracción de sangre en comparación con los pacientes con niveles bajos (el 33 % frente al 16 %, respectivamente). La consideración combinada de sGDF-15 y sS100B aumentó la proporción de pacientes en riesgo del 21 % (sGDF-15 elevado independientemente de sS100B) al 31 % (uno o ambos biomarcadores elevados) y amplió además la diferencia en la SG entre las categorías de biomarcadores. Con detalle, el riesgo de morir en el plazo de 3 años con sS100B normal y sGDF-15 bajo fue sólo del 14 % en comparación con el 33 % para los pacientes con al menos un biomarcador elevado. La extracción de sangre se realizó en ocasiones sin evidencia clínica o radiológica de enfermedad en estos pacientes, por lo que especialmente el análisis combinado de ambos biomarcadores puede permitir identificar pacientes que podrían beneficiarse de una vigilancia más intensa o terapias adyuvantes.
Por tanto, según la invención, el uso de hGDF-15 como biomarcador para la predicción de la supervivencia tal como se define en las reivindicaciones adjuntas, por ejemplo, en combinación con S100B como biomarcador adicional, resulta muy ventajoso incluso para subgrupos de pacientes con melanoma, para los cuales todavía no se dispone de un pronóstico fiable de supervivencia.
En pacientes con melanoma en estadio IV irresecable, el patrón de metástasis visceral y sLDH se usan regularmente para clasificar a los pacientes en categorías M de pronóstico diferente M1a, M1b o M1c (Balch, CMet al., J Clin Oncol/27/6199-206.2009). En el presente estudio, la consideración de sGDF-15 en combinación con estos dos factores de pronóstico establecidos mejoró significativamente la estimación del pronóstico para cada paciente (HR 1,7; p<0,001; patrón de metástasis visceral: HR 1,8; p<0,001; sLDH: HR 1,6; p=0,002) y permitió la identificación de un subgrupo relevante (que comprende el 30 % de todos los pacientes con metástasis a distancia irresecable) con una probabilidad extremadamente deficiente de sobrevivir 1 año (3,3 %). Por el contrario, la peor categoría de biomarcadores sin considerar el sGDF-15 (metástasis viscerales distintas de las pulmonares y sLDH elevado; 35 % de todos los pacientes en estadio IV irresecable) indicó una estimación de supervivencia a 1 año del 8,3 %. La consideración adicional de sGDF-15 añadió información de pronóstico para pacientes M1a/b así como para pacientes M1c. La ganancia en información de pronóstico basada en la consideración de sGDF-15 es valiosa para el asesoramiento y la estratificación de los pacientes dentro de los ensayos clínicos, y podría afectar la evaluación individual de riesgo/beneficio para las decisiones terapéuticas. Teniendo en cuenta la disponibilidad (y la aparición) de diversas opciones terapéuticas para el melanoma avanzado y el inevitable equilibrio entre eficacia y efectos secundarios, la predicción mejorada del pronóstico probablemente se convierta en un instrumento para una mayor orientación de la terapia individualizada.
En conclusión, sGDF-15 es un potente biomarcador de pronóstico en pacientes con melanoma tal como melanoma metastásico.
En pacientes en estadio III sin tumor, la consideración de sGDF-15 solo o en combinación con sS100B permite identificar individuos con mayor riesgo de morir a causa de la enfermedad que podrían beneficiarse de una vigilancia más intensa del paciente o de tratamientos adyuvantes. En pacientes con melanoma en estadio IV irresecable, el sGDF-15, la sLDH y el patrón de metástasis visceral son factores de pronóstico independientes. La consideración combinada de estos tres factores mejora la estimación individual del pronóstico en comparación con la categoría M sola y puede influir en las decisiones de tratamiento individualizadas.
Referencias
Arbabi Ghahroudi Met al.: “Selection and identification of single domain antibody fragments from camel heavy-chain antibodies.” FEBS Lett.15 de septiembre de 1997;414(3):521-6.
Ausubelet al.: “Current Protocols in Molecular Biology.” Greene Publishing Associates and Wiley Interscience; Nueva York 1992.
Baek, SJ; Okazaki, R; Lee, SH; Martinez, J; Kim, JS; Yamaguchi, K; Mishina, Y; Martin, DW; Shoieb, A; McEntee, MF; Eling, TE. Nonsteroidal anti-inflammatory drug-activated gene-1 over expression in transgenic mice suppresses intestinal neoplasia. Gastroenterology 1131 / 1553-60.2006
Baek, SJ; Kim, KS; Nixon, JB; Wilson, LC; Eling, TE. Cyclooxygenase inhibitors regulate the expression of a TGF-beta superfamily member that has proapoptotic and antitumorigenic activities. Mol Pharmacol / 59 / 901-8.2001 Balch, CM; Gershenwald, JE; Soong, SJ; Thompson, JF; Atkins, MB; Byrd, DR; Buzaid, AC; Cochran, AJ; Coit, DG; Ding, S; Eggermont, AM; Flaherty, KT; Gimotty, PA; Kirkwood, JM; McMasters, KM; Mihm, MC, Jr.; Morton, DL; Ross, MI; Sober, AJ; Sondak, VK. Final version of 2009 AJCC melanoma staging and classification. J Clin Oncol / 27 / 6199-206.2009
Balch, CM; Buzaid, AC; Soong, SJ; Atkins, MB; Cascinelli, N; Coit, DG; Fleming, ID; Gershenwald, JE; Houghton, A, Jr.; Kirkwood, JM; McMasters, KM; Mihm, MF; Morton, DL; Reintgen, DS; Ross, MI; Sober, A; Thompson, JA; Thompson, JF. Final version of the American Joint Committee on Cancer staging system for cutaneous melanoma. J Clin Oncol / 19 / 3635-48.2001
Bauskin, AR; Brown, DA; Kuffner, T; Johnen, H; Luo, XW; Hunter, M; Breit, SN. Role of macrophage inhibitory cytokine-1 in tumorigenesis and diagnosis of cancer. Cancer Res / 66 / 4983-6.2006
Blanco-Calvo, M; Tarrio, N; Reboredo, M; Haz-Conde, M; Garcia, J; Quindos, M; Figueroa, A; Anton-Aparicio, L; Calvo, L; Valladares-Ayerbes, M. Circulating levels of GDF15, MMP7 and miR-200c as a poor prognostic signature in gastric cancer. Future Oncol / 10 / 1187-202.2014
Bock, AJ; Stavnes, HT; Kempf, T; Trope, CG; Berner, A; Davidson, B; Staff, AC. Expression and clinical role of growth differentiation factor-15 in ovarian carcinoma effusions. Int J Gynecol Cancer / 20 / 1448-55.2010 Boyle, GM; Pedley, J; Martyn, AC; Banducci, KJ; Strutton, GM; Brown, DA; Breit, SN; Parsons, PG. Macrophage inhibitory cytokine-1 is overexpressed in malignant melanoma and is associated with tumorigenicity. J Invest Dermatol / 129 / 383-91.2009
Brown, DA; Lindmark, F; Stattin, P; Balter, K; Adami, HO; Zheng, SL; Xu, J; Isaacs, WB; Gronberg, H; Breit, SN; Wiklund, FE. Macrophage inhibitory cytokine 1: a new prognostic marker in prostate cancer. Clin Cancer Res / 15 / 6658-64.2009
Brown, DA; Ward, RL; Buckhaults, P; Liu, T; Romans, KE; Hawkins, NJ; Bauskin, AR; Kinzler, KW; Vogelstein, B; Breit, SN. MIC-1 serum level and genotype: associations with progress and prognosis of colorectal carcinoma. Clin Cancer Res / 9 / 2642-50.2003
Camp, RL; Dolled-Filhart, M; Rimm, DL. X-tile: a new bio-informatics tool for biomarker assessment and outcomebased cut-point optimization. Clin Cancer Res / 10 / 7252-9.2004
Chothia Cet al.: Conformations of immunoglobulin hypervariable regions. Nature. 21-28 de diciembre de 1989;342(6252):877-83.
Clackson Tet al.: “Making antibody fragments using phage display libraries.” Nature. 15 de agosto de 1991;352(6336):624-8.
Eisenhaueret al.: New response evaluation criteria in solid tumours: revised RECIST guideline (versión 1.1). Eur. J. Cancer.45, n.º 2, enero de 2009, págs.228-47.
Eling, TE; Baek, SJ; Shim, M; Lee, CH. NSAID activated gene (NAG-1), a modulator of tumorigenesis. J Biochem Mol Biol / 39 / 649-55.2006
Eton, O; Legha, SS; Moon, TE; Buzaid, AC; Papadopoulos, NE; Plager, C; Burgess, AM; Bedikian, AY; Ring, S; Dong, Q; Glassman, AB; Balch, CM; Benjamin, RS. Prognostic factors for survival of patients treated systemically for disseminated melanoma. J Clin Oncol / 16 / 1103-11.1998
Giudicelli Vet al.: IMGT/V-QUEST, an integrated software program for immunoglobulin and T cell receptor V-J and V-D-J rearrangement analysis. Nucleic Acids Res.1 de julio de 2004;32 (edición del servidor web):W435-40.
Gonçalveset al.: “Biological and methodological features of the measurement of S100B, a putative marker of brain injury.” Clinical Biochemistry 41 (2008) 755-763).
Harlow and Lane: “Antibodies: A Laboratory Manual” Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York 1988.
Holliger Pet al.: ““Diabodies”: small bivalent and bispecific antibody fragments.” Proc Natl Acad Sci USA.15 de julio de 1993;90(14):6444-8.
Holt LJet al.: “Domain antibodies: proteins for therapy.” Trends Biotechnol. Noviembre de 2003;21(11):484-90. Huh, SJ; Chung, CY; Sharma, A; Robertson, GP. Macrophage inhibitory cytokine-1 regulates melanoma vascular development. Am J Pathol / 176 / 2948-57.2010
Husaini, Y; Qiu, MR; Lockwood, GP; Luo, XW; Shang, P; Kuffner, T; Tsai, VW; Jiang, L; Russell, PJ; Brown, DA; Breit, SN. Macrophage inhibitory cytokine-1 (MIC-1/GDF15) slows cancer development but increases metastases in TRAMP prostate cancer prone mice. PLoS One / 7 / e43833.2012
Johnen, H; Lin, S; Kuffner, T; Brown, DA; Tsai, VW; Bauskin, AR; Wu, L; Pankhurst, G; Jiang, L; Junankar, S; Hunter, M; Fairlie, WD; Lee, NJ; Enriquez, RF; Baldock, PA; Corey, E; Apple, FS; Murakami, MM; Lin, EJ; Wang, C; During, MJ; Sainsbury, A; Herzog, H; Breit, SN. Tumor-induced anorexia and weight loss are mediated by the TGF-beta superfamily cytokine MIC-1. Nat Med /13 / 1333-40.2007
Jones PTet al.: “Replacing the complementarity-determining regions in a human antibody with those from a mouse.” Nature.29 de mayo-4 de junio de 1986;321 (6069):522-5.
Jones, MF; Ling Li, X; Subramanian, M; Shabalina, SA; Hara, T; Zhu, Y; Huang, J; Yang, Y; Wakefield, LM; Prasanth, KV; Lal, A. Growth differentiation factor-15 encodes a novel microRNA 3189 that functions as a potent regulator of cell death. Cell Death Differ / / 2015
Kabatet al.: Sequences of proteins of immunological interest, U.S. Dept. of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.1983.
Kluger, HM; Hoyt, K; Bacchiocchi, A; Mayer, T; Kirsch, J; Kluger, Y; Sznol, M; Ariyan, S; Molinaro, A; Halaban, R. Plasma markers for identifying patients with metastatic melanoma. ClinCancer Res / 17 / 2417-25.2011 Köhler G and Milstein C: “Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.” Nature.7 de agosto de 1975;256(5517):495-7.
Lasithiotakis, KG; Leiter, U; Gorkievicz, R; Eigentler, T; Breuninger, H; Metzler, G; Strobel, W; Garbe, C. The incidence and mortality of cutaneous melanoma in Southern Germany: trends by anatomic site and pathologic characteristics, 1976 to 2003. Cancer / 107 / 1331-9.2006.
Liu Tet al: “Macrophage inhibitory cytokine 1 reduces cell adhesion and induces apoptosis in prostate cancer cells.” Cancer Res., vol.63, n.º 16, 1 de agosto de 2003, págs.5034-5040.
Ma J, Tang X, Sun WW, Liu Y, Tan YR, Ma HL,et al.(2016) Mutant GDF15 presents a poor prognostic outcome for patients with oral squamous cell carcinoma. Oncotarget 7:2113-22.
Manola, J; Atkins, M; lbrahim, J; Kirkwood, J. Prognostic factors in metastatic melanoma: a pooled analysis of Eastern Cooperative Oncology Group trials. J Clin Oncol / 18 / 3782-93.2000
Marks JDet al.: “By-passing immunization. Human antibodies from V-gene libraries displayed on phage.” J Mol Biol.
5 de diciembre de 1991;222(3):581-97.
Martinez, JM; Sali, T; Okazaki, R; Anna, C; Hollingshead, M; Hose, C; Monks, A; Walker, NJ; Baek, SJ; Eling, TE. Drug-induced expression of nonsteroidal anti-inflammatory drug-activated gene/macrophage inhibitory cytokine-1/prostate-derived factor, a putative tumor suppressor, inhibits tumor growth. J Pharmacol Exp Ther / 318 / 899-906.
2006
Mauerer, A; Roesch, A; Hafner, C; Stempfl, T; Wild, P; Meyer, S; Landthaler, M; Vogt, T. Identification of new genes associated with melanoma. Exp Dermatol / 20 / 502-7.2011
Mimeault, M; Johansson, SL; Batra, SK. Marked improvement of cytotoxic effects induced by docetaxel on highly metastatic and androgen-independent prostate cancer cells by downregulating macrophage inhibitory cytokine-1. Br J Cancer / 108/ 1079-91.2013
Mimeault, M; Batra, SK. Divergent molecular mechanisms underlying the pleiotropic functions of macrophage inhibitory cytokine-1 in cancer. J Cell Physiol / 224 / 626-35.2010
Min, KW; Liggett, JL; Silva, G; Wu, WW; Wang, R; Shen, RF; Eling, TE; Baek, SJ. NAG-1/GDF15 accumulates in the nucleus and modulates transcriptional regulation of the Smad pathway. Oncogene / / 2015
Mocellin, S; Zavagno, G; Nitti, D. The prognostic value of serum S100B in patients with cutaneous melanoma: a meta-analysis. Int J Cancer / 123 / 2370-6.2008
Paul, W.E. (Ed.).: “Fundamental Immunology” 2ª Ed. Raven Press, Ltd., Nueva York 1989.
Pflugfelder, A; Kochs, C; Blum, A; Capellaro, M; Czeschik, C; Dettenborn, T; Dill, D; Dippel, E; Eigentler, T; Feyer, P; Follmann, M; Frerich, B; Ganten, MK; Gartner, J; Gutzmer, R; Hassel, J; Hauschild, A; Hohenberger, P; Hubner, J; Kaatz, M; Kleeberg, UR; Kolbl, O; Kortmann, RD; Krause-Bergmann, A; Kurschat, P; Leiter, U; Link, H; Loquai, C; Loser, C; Mackensen, A; Meier, F; Mohr, P; Mohrle, M; Nashan, D; Reske, S; Rose, C; Sander, C; Satzger, I; Schiller, M; Schlemmer, HP; Strittmatter, G; Sunderkotter, C; Swoboda, L; Trefzer, U; Voltz, R; Vordermark, D; Weichenthal, M; Werner, A; Wesselmann, S; Weyergraf, AJ; Wick, W; Garbe, C; Schadendorf, D. Malignant melanoma S3-guideline “diagnosis, therapy and follow-up of melanoma”. J Dtsch Dermatol Ges / 11 supl. 6 / 1-116, 1-26.2013
Pflugfelder, A; Kochs, C; Blum, A; Capellaro, M; Czeschik, C; Dettenborn, T; Dill, D; Dippel, E; Eigentler, T; Feyer, P; Follmann, M; Frerich, B; Ganten, MK; Gartner, J; Gutzmer, R; Hassel, J; Hauschild, A; Hohenberger, P; Hubner, J; Kaatz, M; Kleeberg, UR; Kolbl, O; Kortmann, RD; Krause-Bergmann, A; Kurschat, P; Leiter, U; Link, H; Loquai, C; Loser, C; Mackensen, A; Meier, F; Mohr, P; Mohrle, M; Nashan, D; Reske, S; Rose, C; Sander, C; Satzger, I; Schiller, M; Schlemmer, HP; Strittmatter, G; Sunderkotter, C; Swoboda, L; Trefzer, U; Voltz, R; Vordermark, D; Weichenthal, M; Werner, A; Wesselmann, S; Weyergraf, AJ; Wick, W; Garbe, C; Schadendorf, D. S3-guideline “diagnosis, therapy and follow-up of melanoma” -- short version. J Dtsch Dermatol Ges / 11 / 563-602.2013 Remington’s Pharmaceutical Sciences, Ed. AR Gennaro, 20ª edición, 2000, Williams & Wilkins, PA, EE.UU.
Riechmann Let al.: “Reshaping human antibodies for therapy.” Nature.1988 Mar 24;332(6162):323-7.
Riker, Al; Enkemann, SA; Fodstad, O; Liu, S; Ren, S; Morris, C; Xi, Y; Howell, P; Metge, B; Samant, RS; Shevde, LA; Li, W; Eschrich, S; Daud, A; Ju, J; Matta, J. The gene expression profiles of primary and metastatic melanoma yields a transition point of tumor progression and metastasis. BMC Med Genomics / 1 / 13.2008
Roth, P; Junker, M; Tritschler, I; Mittelbronn, M; Dombrowski, Y; Breit, SN; Tabatabai, G; Wick, W; Weller, M; Wischhusen, J. GDF-15 contributes to proliferation and immune escape of malignant gliomas. Clin Cancer Res / 16/ 3851-9.2010
Saerens Det al.: “Single-domain antibodies as building blocks for novel therapeutics.” Curr Opin Pharmacol. Octubre de 2008;8(5):600-8. Epub de 22 de agosto de 2008.
Sambrooket al.: “Molecular Cloning: A Laboratory Manual.”, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York 1989.
Selander, KS; Brown, DA; Sequeiros, GB; Hunter, M; Desmond, R; Parpala, T; Risteli, J; Breit, SN; Jukkola-Vuorinen, A. Serum macrophage inhibitory cytokine-1 concentrations correlate with the presence of prostate cancer bone metastases. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev / 16 / 532-7.2007
Siegel DL: “Recombinant monoclonal antibody technology.” Transfus Clin Biol. Enero de 2002;9(1):15-22.
Sirott, MN; Bajorin, DF; Wong, GY; Tao, Y; Chapman, PB; Templeton, MA; Houghton, AN. Prognostic factors in patients with metastatic malignant melanoma. A multivariate analysis. Cancer / 72 / 3091-8.1993
Staff, AC; Bock, AJ; Becker, C; Kempf, T; Wollert, KC; Davidson, B. Growth differentiation factor-15 as a prognostic biomarker in ovarian cancer. Gynecol Oncol / 118 / 237-43.2010
Stefanescu R.et al., Eur. J.Mass Spectrom.13, 69-75 (2007)
Suckauet al.Proc Natl Acad Sci USA. Diciembre de 1990; 87(24): 9848-9852.
Suesskind, D; Schatz, A; Schnichels, S; Coupland, SE; Lake, SL; Wissinger, B; Bartz-Schmidt, KU; Henke-Fahle, S. GDF-15: a novel serum marker for metastases in uveal melanoma patients. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol / 250 / 887-95.2012
Talantov, D; Mazumder, A; Yu, JX; Briggs, T; Jiang, Y; Backus, J; Atkins, D; Wang, Y. Novel genes associated with malignant melanoma but not benign melanocytic lesions. Clin Cancer Res / 11 / 7234-42.2005
Wallin, U; Glimelius, B; Jirstrom, K; Darmanis, S; Nong, RY; Ponten, F; Johansson, C; Pahlman, L; Birgisson, H. Growth differentiation factor 15: a prognostic marker for recurrence in colorectal cancer. Br J Cancer /104 / 1619-27.
2011
Wang, X; Baek, SJ; Eling, TE. The diverse roles of nonsteroidal anti-inflammatory drug activated gene (NAG-1/GDF15) in cancer. Biochem Pharmacol / 85 / 597-606.2013
Weide, B; Richter, S; Buttner, P; Leiter, U; Forschner, A; Bauer, J; Held, L; Eigentler, TK; Meier, F; Garbe, C. Serum S100B, lactate dehydrogenase and brain metastasis are prognostic factors in patients with distant melanoma metastasis and systemic therapy. PLoS One / 8/ e81624.2013
Weide, B; Elsasser, M; Buttner, P; Pflugfelder, A; Leiter, U; Eigentler, TK; Bauer, J; Witte, M; Meier, F; Garbe, C. Serum markers lactate dehydrogenase and S100B predict independently disease outcome in melanoma patients with distant metastasis. Br J Cancer / 107 / 422-8.2012
Weinberg R.et al.: The Biology of Cancer. Garland Science: Nueva York 2006.850p.
Wevers, KP; Kruijff, S; Speijers, MJ; Bastiaannet, E; Muller Kobold, AC; Hoekstra, HJ. S-100B: a stronger prognostic biomarker than LDH in stage IIIB-C melanoma. Ann Surg Oncol / 20 / 2772-9.2013
Zhang, J., Yao, Y.-H., Li, B.-G., Yang, Q., Zhang, P.-Y., and Wang, H.-T. (2015). Prognostic value of pretreatment serum lactate dehydrogenase level in patients with solid tumors: a systematic review and meta-analysis. Scientific Reports 5, 9800.
Zhang, L; Yang, X; Pan, HY; Zhou, XJ; Li, J; Chen, WT; Zhong, LP; Zhang, ZY. Expression of growth differentiation factor 15 is positively correlated with histopathological malignant grade and in vitro cell proliferation in oral squamous cell carcinoma. Oral Oncol / 451627-32.2009
Zhou, Z; Li, W; Song, Y; Wang, L; Zhang, K; Yang, J; Zhang, W; Su, H; Zhang, Y. Growth differentiation factor-15 suppresses maturation and function of dendritic cells and inhibits tumor-specific immune response. PLoS One / 8 / e78618.2013
Zimmers, TA; Gutierrez, JC; Koniaris, LG. Loss of GDF-15 abolishes sulindac chemoprevention in the ApcMin/+ mouse model of intestinal cancer. J Cancer Res Clin Oncol / 136 / 571-6.2010
Documento WO 2005/099746
Documento WO 2009/021293
Documento WO 2014/049087
Documento PCT/EP2015/056654
Claims (14)
1. Método para predecir la probabilidad de supervivencia de un paciente con melanoma humano, en el que el método comprende las etapas de:
a) determinar el nivel de hGDF-15 en una muestra de sangre humana obtenida de dicho paciente; y b) predecir dicha probabilidad de supervivencia basándose en el nivel determinado de hGDF-15 en dicha muestra de sangre humana; en el que un nivel disminuido de hGDF-15 en dicha muestra de sangre humana indica una probabilidad aumentada de supervivencia,
en el que el paciente con melanoma humano es un paciente con melanoma en estadio III sin tumor o un paciente con melanoma en estadio IV irresecable,
en el que la etapa b) comprende comparar dicho nivel de hGDF-15 determinado en la etapa a) con un nivel umbral de hGDF-15, en el que dicha probabilidad se predice basándose en la comparación de dicho nivel de hGDF-15 determinado en la etapa a) con dicho nivel umbral de hGDF-15; y en el que un nivel de hGDF-15 en dicha muestra de sangre humana que está disminuido en comparación con dicho nivel umbral de hGDF-15 indica que la probabilidad de supervivencia está aumentada en comparación con una probabilidad de supervivencia en o por encima de dicho nivel umbral de hGDF-15,
en el que la muestra de sangre humana es una muestra de suero humano, y
en el que el nivel umbral de hGDF-15 es un nivel seleccionado del intervalo de entre 1,1 ng/ml y 2,2 ng/ml.
2. Método según la reivindicación 1, en el que el nivel umbral de hGDF-15 es un nivel de hGDF-15 seleccionado del intervalo de entre 1,2 ng/ml y 2,0 ng/ml.
3. Método según la reivindicación 1, en el que el nivel umbral de hGDF-15 es un nivel de hGDF-15 seleccionado del intervalo de entre 1,3 ng/ml y 1,8 ng/ml.
4. Método según la reivindicación 1, en el que el nivel umbral de hGDF-15 es un nivel de hGDF-15 seleccionado del intervalo de entre 1,4 ng/ml y 1,6 ng/ml.
5. Método según la reivindicación 1, en el que el nivel umbral de hGDF-15 es de 1,5 ng/ml.
6. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores,
en el que la etapa a) comprende además determinar el nivel de lactato deshidrogenasa en dicha muestra de sangre humana, y
en el que en la etapa b), dicha probabilidad de supervivencia también se predice basándose en el nivel determinado de lactato deshidrogenasa en dicha muestra de sangre humana; y en el que un nivel disminuido de lactato deshidrogenasa en dicha muestra de sangre humana indica una probabilidad aumentada de supervivencia;
en el que opcionalmente, la etapa b) comprende comparar dicho nivel de lactato deshidrogenasa determinado en la etapa a) con un nivel umbral de lactato deshidrogenasa, en el que dicha probabilidad también se predice basándose en la comparación de dicho nivel de lactato deshidrogenasa determinado en la etapa a) con dicho nivel umbral de lactato deshidrogenasa; y en el que un nivel de lactato deshidrogenasa en dicha muestra de sangre humana que está disminuido en comparación con dicho nivel umbral de lactato deshidrogenasa o está en dicho nivel umbral de lactato deshidrogenasa indica que la probabilidad de supervivencia está aumentada en comparación con una probabilidad de supervivencia por encima de dicho nivel umbral de lactato deshidrogenasa;
en el que opcionalmente, la etapa a) comprende además determinar el nivel de S100B en dicha muestra de sangre humana, y en el que en la etapa b), dicha probabilidad de supervivencia también se predice basándose en el nivel determinado de S100B en dicha muestra de sangre humana; y en el que un nivel disminuido de S100B en dicha muestra de sangre humana indica una probabilidad aumentada de supervivencia,
preferiblemente en el que la etapa b) comprende comparar dicho nivel de S100B determinado en la etapa a) con un nivel umbral de S100B, en el que dicha probabilidad se predice basándose en la comparación de dicho nivel de S100B determinado en la etapa a) con dicho nivel umbral de S100B; y en el que un nivel de S100B en dicha muestra de sangre humana que está disminuido en comparación con dicho nivel umbral de S100B o está en dicho nivel umbral de S100B indica que la probabilidad de supervivencia está aumentada en comparación con una probabilidad de supervivencia por encima de dicho nivel umbral de S100B.
7. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que en la etapa b), dicha probabilidad de supervivencia también se predice basándose en la edad de dicho paciente; y en el que una edad aumentada indica una probabilidad disminuida de supervivencia,
preferiblemente en el que la etapa b) comprende comparar dicha edad de dicho paciente con una edad umbral, en el que dicha probabilidad se predice basándose en la comparación de dicha edad de dicho paciente con dicha edad umbral; y en el que una edad de dicho paciente que es igual o aumentada en comparación con dicha edad umbral indica que la probabilidad de supervivencia está disminuida en comparación con una probabilidad de supervivencia por debajo de dicha edad umbral,
más preferiblemente en el que dicha edad umbral se selecciona del intervalo de 60 a 65 años, más preferiblemente en el que dicha edad umbral es de 63 años.
8. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que en la etapa b), dicha probabilidad de supervivencia también se predice basándose en la metástasis; y en el que la presencia de metástasis en órganos viscerales distintos del pulmón indica que la probabilidad de supervivencia está disminuida en comparación con la probabilidad de supervivencia cuando no hay metástasis en órganos viscerales distintos del pulmón.
9. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la etapa a) comprende determinar el nivel de hGDF-15 usando uno o más anticuerpos capaces de unirse a hGDF-15 o una porción de unión a antígeno del mismo,
preferiblemente en el que el uno o más anticuerpos capaces de unirse a hGDF-15 o la porción de unión a antígeno del mismo forman un complejo con hGDF-15,
y/o en el que el uno o más anticuerpos comprenden al menos un anticuerpo policlonal,
y/o en el que el uno o más anticuerpos o la porción de unión a antígeno comprenden al menos un anticuerpo monoclonal o una porción de unión a antígeno del mismo, y en el que la unión es preferiblemente unión a un epítopo conformacional o discontinuo en hGDF-15, y en el que el epítopo conformacional o discontinuo está comprendido por las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 26, y en el que preferiblemente, el anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende una región CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, una región CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 y una región CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, y el anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende una región CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, una región CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos ser-ala-ser y una región CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7.
10. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que en la etapa a), el nivel de hGDF-15 se determina capturando hGDF-15 con un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo según la reivindicación 9 y detectando hGDF-15 con un anticuerpo policlonal, o detectando hGDF-15 con un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a un epítopo diferente al del anticuerpo que captura hGDF-15.
11. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el método es un métodoin vitro.
12. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores,
en el que
(i) en la etapa a), el nivel de hGDF-15 en la muestra de sangre humana se determina mediante un ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas, o
(ii) en la etapa a), el nivel de hGDF-15 en la muestra de sangre humana se determina mediante un ensayo de electroquimioluminiscencia, y en el que el ensayo de electroquimioluminiscencia es preferiblemente un método de detección tipo sándwich que comprende una etapa de formar un complejo de detección entre (A) perlas recubiertas de estreptavidina;
(B) un primer anticuerpo biotinilado o porción de unión a antígeno del mismo capaz de unirse a hGDF-15; (C) hGDF-15 de la muestra; y
(D) un segundo anticuerpo marcado con complejo de rutenio o porción de unión a antígeno del mismo capaz de unirse a hGDF-15;
en el que dicho complejo de detección tiene la estructura (A)-(B)-(C)-(D), y en el que el primer anticuerpo biotinilado o la porción de unión a antígeno del mismo se une a un primer epítopo de hGDF-15 y el segundo anticuerpo marcado con complejo de rutenio o la porción de unión a antígeno del mismo se une a un segundo epítopo de hGDF-15 que es diferente de dicho primer epítopo de hGDF-15,
en el que el método comprende además una etapa de detectar el complejo de detección midiendo la electroquimioluminiscencia,
y en el que el nivel de hGDF-15 en la muestra de sangre humana se determina basándose en la medición de electroquimioluminiscencia.
13. Aparato configurado para realizar el método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en el que el aparato es un analizador de electroquimioluminiscencia configurado para realizar el método según la reivindicación 12, en el que en la etapa a), el nivel de hGDF-15 en la muestra de sangre humana se determina mediante un ensayo de electroquimioluminiscencia.
14. Uso de un kit de detección en un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, comprendiendo el kit de detección:
(i) perlas recubiertas de estreptavidina;
(ii) un primer anticuerpo biotinilado o porción de unión a antígeno del mismo capaz de unirse a hGDF-15; (iii) hGDF-15 recombinante, preferiblemente en forma de una disolución tamponada que comprende hGDF-15 recombinante, teniendo la disolución tamponada un pH en el intervalo de 4 a 7;
(iv) un segundo anticuerpo marcado con complejo de rutenio o porción de unión a antígeno del mismo capaz de unirse a hGDF-15; y opcionalmente
(v) instrucciones de uso, preferiblemente instrucciones de uso en un método según las reivindicaciones 1-12; y preferiblemente
(vi) un recipiente que contiene dicho hGDF-15 recombinante, en el que la superficie del recipiente que está en contacto con hGDF-15 recombinante está recubierta con un material no adhesivo,
en el que el primer anticuerpo biotinilado o porción de unión a antígeno del mismo es capaz de unirse a un primer epítopo de hGDF-15 y el segundo anticuerpo marcado con complejo de rutenio o porción de unión a antígeno del mismo es capaz de unirse a un segundo epítopo de hGDF-15 que es diferente de dicho primer epítopo de hGDF-15,
preferiblemente en el que uno del primer anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo capaz de unirse a hGDF-15 y el segundo anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo capaz de unirse a hGDF-15 es un anticuerpo monoclonal o porción de unión a antígeno del mismo, en el que la unión es unión a un epítopo conformacional o discontinuo en hGDF-15 que está comprendido por las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 26, y en el que preferiblemente,
el anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende una región CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, una región CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 y una región CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, y el anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende una región CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, una región CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos ser-ala-ser y una región CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GBGB1517528.4A GB201517528D0 (en) | 2015-10-02 | 2015-10-02 | GDF-15 as a diagnosis marker for melanoma |
| PCT/EP2016/073521 WO2017055614A1 (en) | 2015-10-02 | 2016-09-30 | Gdf-15 as a diagnostic marker for melanoma |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2967740T3 true ES2967740T3 (es) | 2024-05-03 |
Family
ID=54606073
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES16778307T Active ES2967740T3 (es) | 2015-10-02 | 2016-09-30 | GDF-15 como marcador de diagnóstico de melanoma |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US20190004047A1 (es) |
| EP (1) | EP3356826B1 (es) |
| JP (1) | JP6840136B2 (es) |
| KR (1) | KR102615220B1 (es) |
| AU (1) | AU2016333540B2 (es) |
| CA (1) | CA3000292C (es) |
| DK (1) | DK3356826T3 (es) |
| ES (1) | ES2967740T3 (es) |
| FI (1) | FI3356826T3 (es) |
| GB (1) | GB201517528D0 (es) |
| PL (1) | PL3356826T3 (es) |
| PT (1) | PT3356826T (es) |
| WO (1) | WO2017055614A1 (es) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| TWI710377B (zh) | 2017-05-23 | 2020-11-21 | 丹麥商諾佛 儂迪克股份有限公司 | Ｍｉｃ－１化合物及其用途 |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2774620A1 (en) | 2004-04-13 | 2014-09-10 | St Vincent's Hospital Sydney Limited | Method for modulating weight loss |
| EP2187933A4 (en) | 2007-08-16 | 2010-12-08 | St Vincents Hosp Sydney | AGENTS AND METHODS FOR MODULATING MACROPHAGE INHIBITORY CYTOKINE ACTIVITY (MIC-1) |
| JP5836125B2 (ja) * | 2008-10-16 | 2015-12-24 | ユニバーシティ オブ ピッツバーグ − オブ ザ コモンウェルス システム オブ ハイヤー エデュケイション | 高分子量メラノーマ関連抗原に対する完全ヒト抗体およびその使用 |
| EP2388594A1 (en) * | 2010-05-17 | 2011-11-23 | Roche Diagnostics GmbH | GDF-15 based means and methods for survival and recovery prediction in acute inflammation |
| EP2506015A1 (en) * | 2011-04-01 | 2012-10-03 | Universität Regensburg | A prognostic and therapeutic signature for malignant melanoma |
| KR20130071953A (ko) * | 2011-12-21 | 2013-07-01 | 에스케이하이닉스 주식회사 | 집적 회로 |
| ES2742287T3 (es) * | 2012-09-26 | 2020-02-13 | Univ Wuerzburg J Maximilians | Anticuerpos monoclonales contra el factor de diferenciación de crecimiento 15 (GDF-15) |
| JP2015078138A (ja) | 2013-10-15 | 2015-04-23 | 株式会社ニックス | 小動物防除性樹脂組成物 |
| PT3653644T (pt) * | 2014-03-26 | 2023-12-19 | Univ Wuerzburg J Maximilians | Anticorpos monoclonais do fator de crescimento e diferenciação 15 (gdf-15) e suas utilizações para o tratamento da caquexia cancerosa e do cancro |
-
2015
- 2015-10-02 GB GBGB1517528.4A patent/GB201517528D0/en not_active Ceased
-
2016
- 2016-09-30 WO PCT/EP2016/073521 patent/WO2017055614A1/en active Application Filing
- 2016-09-30 JP JP2018516736A patent/JP6840136B2/ja active Active
- 2016-09-30 CA CA3000292A patent/CA3000292C/en active Active
- 2016-09-30 AU AU2016333540A patent/AU2016333540B2/en active Active
- 2016-09-30 KR KR1020187012437A patent/KR102615220B1/ko active IP Right Grant
- 2016-09-30 PL PL16778307.5T patent/PL3356826T3/pl unknown
- 2016-09-30 DK DK16778307.5T patent/DK3356826T3/da active
- 2016-09-30 US US15/765,187 patent/US20190004047A1/en not_active Abandoned
- 2016-09-30 PT PT167783075T patent/PT3356826T/pt unknown
- 2016-09-30 FI FIEP16778307.5T patent/FI3356826T3/fi active
- 2016-09-30 EP EP16778307.5A patent/EP3356826B1/en active Active
- 2016-09-30 ES ES16778307T patent/ES2967740T3/es active Active
-
2020
- 2020-05-18 US US16/876,482 patent/US20200386758A1/en not_active Abandoned
-
2023
- 2023-04-07 US US18/297,120 patent/US20230408521A1/en active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2017055614A1 (en) | 2017-04-06 |
| US20200386758A1 (en) | 2020-12-10 |
| PT3356826T (pt) | 2024-01-09 |
| CA3000292C (en) | 2024-01-09 |
| GB201517528D0 (en) | 2015-11-18 |
| DK3356826T3 (da) | 2024-01-15 |
| AU2016333540B2 (en) | 2022-03-31 |
| KR20180054869A (ko) | 2018-05-24 |
| US20190004047A1 (en) | 2019-01-03 |
| EP3356826B1 (en) | 2023-12-06 |
| KR102615220B1 (ko) | 2023-12-15 |
| PL3356826T3 (pl) | 2024-04-08 |
| JP2018535403A (ja) | 2018-11-29 |
| CA3000292A1 (en) | 2017-04-06 |
| EP3356826A1 (en) | 2018-08-08 |
| US20230408521A1 (en) | 2023-12-21 |
| AU2016333540A1 (en) | 2018-05-10 |
| JP6840136B2 (ja) | 2021-03-10 |
| FI3356826T3 (fi) | 2024-01-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20220242942A1 (en) | Gdf-15 as a diagnostic marker to predict the clinical outcome of a treatment with immune checkpoint blockers | |
| US8999656B2 (en) | PODXL protein in colorectal cancer | |
| JP7022191B2 (ja) | 前立腺がんの分析のための組成物及び方法 | |
| JP2015533788A5 (es) | ||
| AU2009339802A1 (en) | RBM3 as a marker for malignant melanoma prognosis | |
| JP6977105B2 (ja) | Ｉｇｆ−１ｒ抗体および癌の診断のためのその使用 | |
| US20230408521A1 (en) | Gdf-15 as a diagnostic marker for melanoma | |
| US20130143231A1 (en) | MST1/STK4 PHOSPHO-THREONINE 120 (pMST-T120) ANTIBODY |