KR102604803B1 - 신규 plk1 분해 유도 화합물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 신규 PLK1 분해 유도 화합물, 이의 제조방법, 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 화합물은 PLK1 분해를 유도하는 효과를 나타낸다. 그러므로, 본 발명의 화합물은 PLK1 관련 질환의 예방 또는 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.

Description

신규 PLK1 분해 유도 화합물
본 발명은 신규 PLK1 분해 유도 화합물, 이의 제조방법, 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 PLK1의 효과적인 분해를 통해 비정상적인 세포 등에 특이적으로 작용할 수 있으며, 다양한 질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
Polo-like kinase 1 (PLK1)은 세린/트레오닌 인산화효소로서 세포 성장 및 분열 중에 G2/M기의 전환에 관여하는 것으로 알려져 있다. PLK1은 S phase부터 G2/M기까지 펄스 형태로 발현되고 활성화되었다가, 유사분열이 종료되면서 빠르게 분해된다.
PLK1은 대장암, 폐암, 방광암, 흑색종 등 다양한 암종에서 과발현되는 양상을 띄며, PLK1이 과발현된 암세포는 여러 종류의 항암제에 대해 저항성을 나타내는 경향을 보인다. 이와 같이 다양한 암종에서 PLK1 의존성이 밝혀짐에 따라, 볼라설팁(volasertib; BI6727로도 알려짐) 등 PLK1 억제제 화합물들의 개발이 시도된 바 있다.
그러나, 기존 PLK1 억제제들은 임상적으로 안전성이 확보된 농도에서 PLK1 활성을 충분히 억제하지 못하여, 암세포의 세포 주기를 일시적으로 지연시키더라도 결국 일부 암세포에서 세포 주기가 재개시되어, 충분한 임상적 효과를 거두지 못한 문제가 있다(문헌[Gheghiani et al. CULM Reports, 2017] 등). 실제로 베링거잉겔하임, GSK(GlaxoSmithKline) 등 다수 제약사들이 저분자 화합물 기반의 PLK1 억제제 개발을 시도하였으나 대부분 임상시험 단계에서 실패하거나 중단되어 현재까지 상용화된 PLK1 억제제는 전무한 상태이다. 이는 암세포의 PLK1 활성을 억제하여 항암효과를 도출하고자 하는 신약개발 의도에 있어서, 저분자화합물 억제제와 같이 PLK1의 활성부위에 결합하여 효소 활성을 억제하는 방식의 약리 기전이 충분히 효과적이지 않음을 보여준다.
최근 들어, 표적 단백질의 체내 단백질 분해(proteolysis)를 유도할 수 있는 저분자 화합물 기반 플랫폼 기술로서 PROTAC(Proteolysis targeting chimera)이 제시된 바 있다. PROTAC이란 질환 관련 표적 단백질에 결합하는 리간드 분자와 E3 유비퀴틴 라이게이즈 결합 모이어티가 화학적 링커로 연결된 이기능성 화합물이다. 이론적으로 PROTAC 화합물은 질환 관련 표적 단백질을 E3 유비퀴틴 라이게이즈 근처에 위치시킴으로써, 표적 단백질의 분해를 유도할 수 있다. 이렇게 기존의 저해제와 다른 새로운 기전에 기반하여, 많은 PROTAC 화합물들이 암, 염증성 질환 등의 치료제로 개발되고 있으며, 다양한 확장성을 가지고 연구되고 있다 (예를 들어, ADC(항체-약물 컨쥬게이트)의 페이로드). 하지만, 모든 범위의 결합 모이어티 또는 링커에서 PROTAC이 활성을 나타내는 것은 아니며, 실제로 PROTAC이 원하는 수준의 효능을 나타내기 위해서는 각 결합 모이어티와 링커가 적절하게 연결된 구조를 가져야 함이 여러 연구를 통해 알려져 있다(문헌[US2020-0325130A]). 특히, CRBN(세레블론) E3 라이게이즈를 표적하는 모이어티의 경우, 그 결합 모이어티의 종류 또는 그에 연결되는 화합물의 구조에 따라 CRBN의 네오-기질(neo-substrate) (GSPT1, IKZF1/3 등)을 분해하거나 그에 따른 오프-타겟 독성을 나타낼 우려가 있다. 따라서, PROTAC 약물 개발시 예상치 못한 독성을 나타내지 않도록 적절한 결합 모이어티를 선정하고 전체 화합물의 구조를 최적화하는 것이 중요하다.
PLK1을 타겟 단백질로 하는 PROTAC 화합물의 경우, 중국 공개특허 제106543185 A호는 볼라설팁 유도체 화합물과 E3 유비퀴틴 라이게이즈 CRBN에 대한 결합 모이어티를 화학적 링커로 연결한 이기능성 화합물을 일부 개시한다. 그러나, 상기 선행문헌에는 오직 일부 제한된 형태의 PROTAC 화합물의 합성예가 기재되어 있는데, 일반적으로 표적 단백질 모이어티, E3 유비퀴틴 라이게이즈 결합 모이어티 등의 선택에 따라 PROTAC의 타겟 분해 활성 및 선택성은 현저히 달라질 수 있다 (문헌[Burslem and Crews, 2017] 등).
또한, 위 문헌에 기재된 PROTAC 화합물은 PLK1 및 BRD4를 동시에 분해하는 것에 발명의 특징이 있는 화합물이며 PLK1 이외의 다른 PLK 패밀리 단백질 및 BRD4 등 다양한 단백질 분해 역시 유도하므로 약물 개발 시 오프 타겟 독성으로 인한 부작용 발생의 문제가 있다. 특히 BRD4의 활성을 강하게 억제하면 약리 효과와 함께 혈액독성 및 위장관 독성 같은 온 타겟 부작용(on target toxicity)이 필연적으로 동반된다는 사실이 이미 알려져 있음을 감안하면, 위 문헌에 기재된 PROTAC 화합물이 BRD4를 효과적으로 분해하면 할수록 임상적 부작용이 커질 것으로 예상된다 (문헌[Bolden et al. CULM Reports, 2014] 등).
더욱이, 위 문헌의 발명자에 의해 공개된 문헌[Mu et al. BBRC, 2019]에 따르면, 상기 PLK1 및 BRD4를 동시에 분해하는 PROTAC 화합물은 세포 수준에서 BRD4 분해능력이 PLK1 분해능력보다 월등히 강하고 세포 주기가 거의 G1 phase에 멈추는 등 기존 PLK1 억제제가 약리효과를 내는 방식과 전혀 상관없이 사실상 BRD4 억제제로서만 작용하는 것을 확인할 수 있다.
따라서, 부작용(예를 들어, 오프 타겟 독성)이 없거나 이를 최소화하는 효과적인 PLK1 분해 유도 화합물에 대한 미충족된 수요가 존재한다.
본 발명의 목적은 신규 PLK1 분해 유도 화합물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 신규 PLK1 분해 유도 화합물의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 신규 PLK1 분해 유도 화합물의 용도를 제공하는 것이다.
위와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명자들은 E3 라이게이즈 바인더, 타겟 결합 모이어티, 링커의 적절한 구조적 조합 및 최적화를 통해 PLK1을 과발현하는 비정상적인 세포에 특이적으로 작용하여 PLK1의 효과적인 분해를 유도하고 부작용을 최소화하는 신규 PROTAC 화합물을 발굴함으로써 본 발명을 완성하였다.
PLK1 선택적 분해 유도 화합물
본 발명은 PLK1의 효과적인 분해를 유도하는 신규 화합물을 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 PLK1 결합 모이어티와 E3 유비퀴틴 라이게이즈 결합 모이어티가 화학적 링커로 연결된 이기능성 화합물을 제공한다.
본 발명의 일 실시양태는 하기 화학식 I로 표시되는 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염이다:
[화학식 I]
상기 화학식 I에서,
ULM은 하기 화학식 1로 표시되는 모이어티이고;
[화학식 1]
PTM은 하기 화학식 2로 표시되는 모이어티이고;
[화학식 2]
Linker는 ULM과 PTM을 화학적으로 연결하는 기이고;
Rx는 -H 또는 -C1-4알킬이고;
V는 -NH-C(=O)-, -(CH2)v-NH-, -(CH2)v-N-C1-4알킬-, -O-, -C(=O)-, 또는 -C(=NH)-이고 {여기서, 상기 V 중 -(CH2)v-NH-의 N 원자는 상기 Rx와 연결되어 5-6원 고리를 형성할 수 있고, 상기 v는 0, 1, 2, 3, 또는 4임};
고리 U는 페닐, 피리디닐, 또는 피리미디닐이고 {여기서, 상기 페닐, 피리디닐, 또는 피리미디닐 고리의 하나 이상의 H는 RU로 치환될 수 있음};
RU는 -C1-4알킬, -C1-4하이드록시알킬, -C1-4아미노알킬, -C1-4할로알킬, -C1-4알콕시, -NH2, -OH, 또는 -할로이고 {여기서, 상기 RU는 상기 V 중 -(CH2)v-NH-의 N 원자와 연결되어 5-6원 고리를 형성할 수 있고 [이때, 상기 5-6원 고리의 하나 이상의 H는 -C1-4알킬 또는 =O로 치환될 수 있음], 상기 RU는 상기 V 중 -C(=NH)-의 N 원자와 연결되어 5-6원 고리를 형성할 수 있음 [이때, 상기 5-6원 고리의 하나 이상의 H는 -C1-4알킬로 치환될 수 있음]};
Y는 CR7이고;
R1은 -C1-4알킬 또는 3-7원 사이클로알킬이고;
R2는 -H이고;
R3 및 R4는 각각 독립적으로 -H, -C1-4알킬, 또는 -할로이고;
R5는 -C1-4알킬이고;
R6는 -C1-4알킬 또는 -C1-4알콕시이고;
R7은 -H 또는 -할로이다.
본 발명의 일 실시양태에서,
ULM은 하기 화학식 1-1 또는 화학식 1-2로 표시되는 모이어티이고;
[화학식 1-1]
[화학식 1-2]
Rx는 -H 또는 -C1-4알킬이고;
V는 -NH-C(=O)-, -(CH2)v-NH-, -(CH2)v-N-C1-4알킬-, -O-, 또는 -C(=NH)-이고 {여기서, 상기 V 중 -(CH2)v-NH-의 N 원자는 상기 Rx와 연결되어 5-6원 고리를 형성할 수 있고, 상기 v는 0, 1, 또는 2임};
U1 내지 U5는 각각 독립적으로 CRU 또는 N이고 {여기서, 상기 U1의 RU는 상기 V 중 -(CH2)v-NH-의 N 원자와 연결되어 5-6원 고리를 형성할 수 있고 [이때, 상기 5-6원 고리의 하나 이상의 H는 -C1-4알킬 또는 =O로 치환될 수 있음], 상기 U1의 RU는 상기 V 중 -C(=NH)-의 N 원자와 연결되어 5-6원 고리를 형성할 수 있음 [이때, 상기 5-6원 고리의 하나 이상의 H는 -C1-4알킬로 치환될 수 있음]};
RU는 -C1-4알킬, -C1-4할로알킬, -NH2, 또는 -할로이다.
본 발명의 일 실시양태에서,
ULM은 , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , 또는 이고;
RU1 및 RU2는 각각 독립적으로 -C1-4알킬, -C1-4할로알킬, 또는 -할로이다.
본 발명의 일 실시양태에서,
ULM은 , ,
, , , ,
, , , , , , , 또는 이고;
RU1 및 RU2는 각각 독립적으로 -C1-4할로알킬 또는 -할로이다.
본 발명의 일 실시양태에서,
PTM은 또는이고;
R6는 -C1-4알콕시이고;
R7은 -H 또는 -할로이다.
본 발명의 일 실시양태에서,
Linker는 -LU-L1-L2-L3-LP-이고;
LU는 -(CH2)x-, -(CH2)x-NH-, -(CH2)x-O-, -C(=O)-, 페닐, 또는 아무 것도 아니고(null) {여기서, LU는 ULM과 연결되고 [이때, 상기 LU가 아무 것도 아닌 경우(null) L1이 ULM과 직접 연결됨], 상기 x는 0, 1, 2, 3, 또는 4임};
L1은 헤테로사이클로알킬 또는 아무 것도 아니고(null) {여기서, 상기 L1이 아무 것도 아닌 경우(null) LU와 L2가 직접 연결되고, 상기 헤테로사이클로알킬은 고리 내 하나 이상의 N 원자를 포함하고, 상기 헤테로사이클로알킬 고리의 하나 이상의 H는 -C1-4알킬, -C1-4할로알킬, -C1-4알콕시, -OH, -할로, 또는 =O로 치환될 수 있음};
L2는 -(CH2)y1-, -(CD2)y1-, -(CH2)y2-C(=O)-(CH2)y3-, -(CH2)y2-NH-(CH2)y3-, 또는 -(CH2)y2-N(C1-4알킬)-(CH2)y3-이고 {여기서, 상기 y1 내지 y3는 각각 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6임};
L3는 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 또는 아무 것도 아니고(null) {여기서, 상기 L3가 아무 것도 아닌 경우(null) L2와 Lp가 직접 연결되고, 상기 헤테로사이클로알킬은 고리 내 하나 이상의 N 원자를 포함하고, 상기 사이클로알킬 또는 헤테로사이클로알킬 고리의 하나 이상의 H는 -C1-4알킬, -C1-4할로알킬, 또는 -할로로 치환될 수 있음};
LP는 -(CH2)p-NH-C(=O)- 또는 -(CH2)p-O-인 {여기서, 상기 LP의 -(C=O)- 또는 -O-가 PTM과 연결되고, p는 0, 1, 또는 2임}이다.
본 발명의 일 실시양태에서,
LU는 -(CH2)x- 또는 -(CH2)x-NH-이고 {여기서, LU는 ULM과 연결되고, 상기 x는 0 또는 1임};
L1은 4-12원 헤테로사이클로알킬 또는 아무 것도 아니고(null) {여기서, 상기 L1이 아무 것도 아닌 경우(null) LU와 L2가 직접 연결되고, 상기 4-12원 헤테로사이클로알킬은 단일 고리, 다리 연결된(bridged) 이중 고리, 또는 스파이로(spiro) 고리이고, 상기 4-12원 헤테로사이클로알킬은 고리 내 하나 이상의 N 원자를 포함하고 상기 N 원자는 LU 또는 ULM과 직접 연결되고, 상기 4-12원 헤테로사이클로알킬 고리의 하나 이상의 H는 -C1-4알킬, -OH, 또는 -할로로 치환될 수 있음};
L2는 -(CH2)y1-, -(CH2)y2-C(=O)-(CH2)y3-, -(CH2)y2-NH-(CH2)y3-, 또는 -(CH2)y2-N(C1-4알킬)-(CH2)y3-이고 {여기서, 상기 y1 내지 y3는 각각 독립적으로 0, 1, 2, 또는 3임};
L3는 4-6원 사이클로알킬 또는 4-12원 헤테로사이클로알킬 {여기서, 상기 4-12원 헤테로사이클로알킬은 단일 고리, 다리 연결된(bridged) 이중 고리, 또는 스파이로(spiro) 고리이고, 상기 4-12원 헤테로사이클로알킬은 고리 내 하나 이상의 N 원자를 포함하고, 상기 4-6원 사이클로알킬 또는 4-12원 헤테로사이클로알킬 고리의 하나 이상의 H는 -C1-4알킬, -C1-4할로알킬, 또는 -할로로 치환될 수 있음}; 및
LP는 -(CH2)p-NH-C(=O)-인 {여기서, 상기 LP의 -(C=O)-가 PTM과 연결되고, p는 0 또는 1임}이다.
본 발명의 구체적인 실시양태에 따르면, 화학식 I로 표시되는 화합물은 화합물 1 내지 44로 구성된 군에서 선택된 화합물이다.
본 발명에서 약학적으로 허용가능한 염이란 환자에게 비교적 비독성이고 무해한 유효작용을 갖는 농도로서 이 염에 기인한 부작용이 화학식 I로 표시되는 화합물의 이로운 효능을 저하시키지 않는 임의의 유기산 또는 무기산 부가염을 의미한다. 예컨대, 약학적으로 허용가능한 염은 무기산으로는 염산, 인산, 황산, 또는 질산 등일 수 있고, 유기산으로는 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 말레인산, 숙신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산, 만데르산, 프로피온산, 구연산, 젖산, 글리콜산, 글루콘산, 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산, 글루쿠론산, 아스파르트산, 아스코르브산, 카본산, 바닐릭산 또는 요오드화수소산일 수 있으나, 이들에 제한되지 않는다.
PLK1 선택적 분해 유도 화합물의 용도
본 발명의 일 실시양태는 화학식 I로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 PLK1 분해 유도용 조성물이다. 화학식 I는 위에서 정의된 바와 같다.
본 발명의 실험예에서, 본 발명의 화합물은 PLK1 단백질 분해를 효과적으로 유도한다는 점을 확인하였다.
본 발명의 PLK1 분해 유도 PROTAC 화합물은 작용 기전의 관점에서 타겟 단백질인 PLK1를 원천 분해할 수 있으므로, PLK1의 단순 활성을 억제하는 종래 PLK1 저분자 억제제와 비교하여서도 우수한 PLK1 억제 효과를 달성한다.
따라서, 본 발명의 화학식 I로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 조성물은 PLK1의 선택적 분해를 위해 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시양태는 화학식 I로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 PLK1 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물이다. 본 발명의 또 다른 실시양태는 이러한 조성물을 투여하여 PLK1 관련 질환을 예방 또는 치료하는 방법이다. 화학식 I는 위에서 정의된 바와 같다.
본 발명에서 PLK1 관련 질환은 PLK1의 분해 유도 또는 활성 억제로부터 치료, 경감, 지연, 저해 또는 예방될 수 있는 임의의 질환 또는 병태를 의미한다. 일 실시양태에서, PLK1 관련 질환은 암(악성 종양), 양성 종양, 신경질환, 또는 그 외 지나친 세포 분열로 인해 일어나는 유전적 또는 비유전적 질환일 수 있다.
상기　암은 PLK1의 활성 억제로 인해 예방 또는 치료 효능을 나타낼 수 있는 모든 암을 포함하며, 고형암　또는 혈액암일 수 있다. 예컨대, 상기 암은 편평상피세포암, 소세포폐암, 비소세포폐암, 폐의 선암, 폐의 편평상피암, 복막암, 피부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 직장암, 항문부근암, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 간세포암, 위장암, 위암, 췌장암, 교아종, 경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간종양, 유방암, 결장암, 대장암, 자궁내막 또는 자궁암, 침샘암, 신장암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 두경부암, 뇌암, 골육종, 고형암, 혈액암, 골암, 거대세포 림프종, 부신피질 종양, T-세포성 림프종/백혈병, 신경내분비암, 신경내분비종양, 담관암, 신경모세포종, 교모세포종, 신경교종 등으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기　암은 원발성　암뿐 아니라 전이성　암도 포함한다.
상기 양성 종양은 PLK1의 활성 억제로 인해 예방 또는 치료 효능을 나타낼 수 있는 모든 양성 종양, 예컨대 암 이전 단계의 양성 종양을 포함하며, 고형 종양 또는 혈액 종양일 수 있다. 예컨대, 상기 종양은 배럿 식도, 대장 선종 및 용종, 유방 섬유선종 및 낭종, 단세포 감마글로불린병증 (MGUS), 단클론 림프구증가증 등으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 신경질환은 PLK1의 활성 억제로 인해 예방 또는 치료 효능을 나타낼 수 있는 모든　신경질환을 포함하며, 구체적으로 중추 신경계 질환, 퇴행성　신경질환, 알츠하이머병, 파킨슨병, 다발성경화증, 헌팅톤병, 노인성 치매, 간질, 루게릭, 뇌졸증, 및 뇌 또는 척수 손상에 이은 신경손상과 축삭 변성 관련 장애 중에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 약학적 조성물은 화학식 I 로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 외에 동일 또는 유사한 약효를 나타내는 유효성분을 1종 이상 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시양태는 화학식 I로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 인간을 포함하는 포유류에 투여하여 PLK1 단백질을 분해하는 방법이다.
본 발명의 또다른 일 실시양태는 화학식 I로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 체외에서 샘플에 투여하여 PLK1 단백질을 분해하는 방법이다. 상기 샘플은 세포, 세포 배양물, 사람을 포함한 포유동물의 체액 또는 조직일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 화합물은 PLK1의 분해를 유도하는 효과를 나타낸다. 따라서 본 발명의 화합물은 PLK1 관련 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 화합물 1 내지 41을 처리한 루시퍼라제 분석 결과를 나타낸다.
달리 정의되지 않는한, 본원에서 사용된 모든 기술적, 과학적 용어들은 본 명세서가 속한 기술분야의 통상의 기술자에게 흔하게 이해되는 용어과 같은 의미를 가진다. 명세서에서 사용된 용어는 특정 실시양태를 설명하기 위한 것일뿐 본원을 제한하려는 의도가 아니다.
본 발명은 하기 표에 표시된 화합물 1 내지 44에 대한 합성 방법을 제공한다.
화합물 구조
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실시예 1. 4-((9-시클로펜틸-7,7-디플루오로-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(1-(4-((4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)카바모일)페닐)아미노)부타노일)피페리딘-4-일)-2-플루오로-5-메톡시벤즈아미드 (화합물 1)의 합성
단계 1. tert-부틸 (4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)카바모일)페닐)카바메이트 (3)의 합성
DMF (10 mL) 내 4-((tert-부톡시카보닐)아미노)벤조산 (1 g, 4.21 mmol) 용액에 DIPEA (1.63 g, 12.64 mmol, 2.20 mL) 및 HATU (3.21 g, 8.43 mmol)를 첨가하였다. 30분 후 3-아미노피페리딘-2,6-디온 (693.74 mg, 4.21 mmol, HCl 염)을 25 ℃에서 첨가하였다. 혼합물을 25 ℃에서 2시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 피크(~70%)를 확인하였다. 반응 혼합물을 물 (50 mL)로 희석하고 EtOAc (20 mL x 3)로 추출하였다. 합쳐진 유기상으로부터 백색 고체를 침전시켰다. 혼합물을 여과하였다. 여과케이크를 감압 건조하여 백색 고체의 tert-부틸 (4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)카바모일)페닐)카바메이트 (0.8 g, 2.14 mmol, 50.87% 수율, 93.1% 순도)를 수득하였다. MS(M+H)+=348.2
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ = 10.84 (s, 1H), 9.64 (s, 1H), 8.59 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.79 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.54 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 4.79-4.72 (m, 1H), 2.84-2.75 (m, 1H), 2.56-2.52 (m, 1H), 2.14-2.09 (m, 1H), 1.98-1.94 (m, 1H), 1.49 (s, 9H).
단계 2. 4-아미노-N-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)벤즈아미드 (4)의 합성
디옥산 (2 mL) 내 tert-부틸 (4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)카바모일)페닐)카바메이트 (0.8 g, 2.30 mmol) 용액에 HCl/디옥산 (4 M, 5 mL)을 첨가하였다. 혼합물을 25 ℃에서 1시간 동안 교반 하였다. LCMS로 출발물질이 완전히 소모되었음을 확인하였다. 혼합물을 감압 농축하여 백색 고체의 4-아미노-N-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)벤즈아미드 (660 mg, crude, HCl 염)를 수득하였고, 이를 다음 단계에 바로 사용하였다. MS(M+H)+=248.3
단계 3. 벤질 (E)-(1-(4-((4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)카바모일)페닐)아미노)부트-2-엔오일)피페리딘-4-일)카바메이트 (6)의 합성
DMF (3 mL) 내 4-아미노-N-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)벤즈아미드 (200 mg, 704.94 μmol, HCl) 용액에 NaI (31.70 mg, 211.48 μmol), 벤질 (E)-(1-(4-브로모부트-2-엔오일)피페리딘-4-일)카바메이트 (322.52 mg, 845.93 μmol) 및 DIPEA (273.33 mg, 2.11 mmol, 368.37 μL)를 첨가하였다. 혼합물을 25 ℃에서 14시간 동안 교반 하였다. TLC (EtOAc: 메탄올=10:1)로 수 개의 새로운 스팟 형성을 확인하였다. 반응 혼합물을 물 (30 mL)로 희석하고 EtOAc (10 mL x 3)로 추출하였다. 합쳐진 유기상을 포화 염수 (10 mL)로 세척하고, 무수 소듐 설페이트로 건조하고, 여과하고 감압 농축하여 잔여물을 얻었다. 잔여물을 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (ISCO®; 20 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, eluent of 0~40% 석유 에터 : EtOAc/MeOH(v/v=1/1) gradient @ 80 mL/분) 로 정제하여 황색 오일의 벤질 (E)-(1-(4-((4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)카바모일)페닐)아미노)부트-2-엔오일)피페리딘-4-일)카바메이트 (0.2 g, 365.23 μmol, 51.81% 수율)를 수득하였고, 이를 다음 단계에 바로 사용하였다. MS(M+H)+=548.3
단계 4. 4-((4-(4-아미노피페리딘-1-일)-4-옥소부틸)아미노)-N-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)벤즈아미드 (7)의 합성
CF3CH2OH (5 mL) 내 Pd/C (20 mg, 18.26 μmol, 10% 순도) 혼합물에 벤질 (E)-(1-(4-((4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)카바모일)페닐)아미노)부트-2-엔오일)피페리딘-4-일)카바메이트 (0.1 g, 182.61 μmol)를 25 ℃에서 첨가하였다. 혼합물을 25 ℃, H2 (15 Psi) 하에서 12시간 동안 교반 하였다. LCMS로 반응완료를 확인하였다. 혼합물을 여과하여 촉매를 제거하였다. 여과물을 감압 농축하여 황색 오일의 4-((4-(4-아미노피페리딘-1-일)-4-옥소부틸)아미노)-N-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)벤즈아미드 (80 mg, 92.23 μmol, 50.51% 수율, 47.9% 순도)를 수득하였고 이를 다음 단계에 바로 사용하였다. MS(M+H)+=416.2
단계 5. 4-((9-시클로펜틸-7,7-디플루오로-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(1-(4-((4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)카바모일)페닐)아미노)부타노일)피페리딘-4-일)-2-플루오로-5-메톡시벤즈아미드 (화합물 1)의 합성
DMF (2 mL) 내 4-((9-시클로펜틸-7,7-디플루오로-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-2-플루오로-5-메톡시벤조산 (80 mg, 171.89 μmol) 용액에 HATU (98.03 mg, 257.83 μmol) 및 DIPEA (66.65 mg, 515.66 μmol, 89.82 μL)를 첨가하였다. 30분 후 혼합물에 4-[[4-(4-아미노-1-피페리딜)-4-옥소-부틸]아미노]-N-(2,6-디옥소-3-피페리딜)벤즈아미드 (78.56 mg, 189.07 μmol)를 첨가하였다. 혼합물을 25 ℃에서 12시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 피크(60%)를 확인하였다. 반응 혼합물을 물(20 mL)로 희석하고 EtOAc (20 mL x 3)로 추출하였다. 합쳐진 유기상을 포화 염수 (10 mL)로 세척하고, 무수 소듐 설페이트로 건조하고, 여과하고 감압 농축하여 잔여물을 얻었다. 잔여물을 prep-HPLC (컬럼: Phenomenex Synergi C18 150 x 25 mm x 10 μm; 이동상:[water(FA)-ACN]; B%: 39%-69%, 10분) 후 prep-HPLC(컬럼: Waters Xbridge 150 x 25 mm x 5 μm; 이동상:[water(NH4HCO3)-ACN]; B%: 32%-62%, 8분)로 정제하고, 동결 건조하여 백색 고체의 4-((9-시클로펜틸-7,7-디플루오로-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(1-(4-((4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)카바모일)페닐)아미노)부타노일)피페리딘-4-일)-2-플루오로-5-메톡시벤즈아미드 (25.2 mg, 26.90 μmol, 15.65% 수율, 92.1% 순도)를 수득하였다. MS(M+H)+=863.3
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ = 10.79 (s, 1H), 8.29-8.23 (m, 3H), 8.03 (s, 1H), 7.97-7.95 (m, 1H), 7.64 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.19 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 6.57 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 6.25 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 4.85-4.79 (m, 1H), 4.74-4.67 (m, 1H), 4.34-4.29 (m, 1H), 4.10-3.98 (m, 3H), 3.91-3.84 (m, 4H), 3.27 (s, 3H), 3.13-3.07 (m, 3H), 2.76-2.71 (m, 1H), 2.52 (s, 3H), 2.44-2.40 (m, 2H), 2.13-2.03 (m, 1H), 1.98-1.91 (m, 3H), 1.83-1.71 (m, 5H), 1.66-1.57(m, 4H), 1.50-1.37 (m, 2H).
실시예 2. 4-((9-시클로펜틸-7,7-디플루오로-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(1-(2-(4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)카바모일)페닐)피페라진-1-일)아세틸)피페리딘-4-일)-3-메톡시벤즈아미드 (화합물 2)의 합성
단계 1. tert-부틸 4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)카바모일)페닐)피페라진-1-카복실레이트 (3)의 합성
DMF (5 mL) 내 4-(4-tert-부톡시카보닐피페라진-1-일)벤조산 (0.8 g, 2.61 mmol) 용액에 HATU (1.09 g, 2.87 mmol) 및 DIPEA (675.00 mg, 5.22 mmol, 909.70 μL)를 첨가하였다. 혼합물을 20 °C 에서 10분간 교반하고 DMF (5 mL) 내 3-아미노피페리딘-2,6-디온 (515.76 mg, 3.13 mmol, HCl 염), DIPEA (675.00 mg, 5.22 mmol, 909.70 μL) 용액을 첨가하고, 생성된 혼합물을 20 °C 에서 1시간 동안 교반 하였다. LCMS로 출발물질이 완전히 소모되었음 및 원하는 질량의 주 피크(96%)를 확인하였다. 반응 혼합물을 H2O (15 mL)로 희석하고 많은 백색 고체가 침전되었고, 백색 고체를 여과로 모으고 진공 건조시켜 백색 고체의 tert-부틸 4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)카바모일)페닐)피페라진-1-카복실레이트 (470 mg, 1.09 mmol, 41.92% 수율, 97% 순도)를 수득하였다. MS(M+H)+=417.3
단계 2. N-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-4-(피페라진-1-일)벤즈아미드 (4)의 합성
디옥산 (4 mL) 내 tert-부틸 4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)카바모일)페닐)피페라진-1-카복실레이트 (470 mg, 1.13 mmol) 용액에 HCl/디옥산 (4 M, 12 mL)을 20 °C 에서 첨가하고 생성된 혼합물을 20 °C 에서 30분간 교반 하였다. LCMS로 출발물질이 완전히 소모되었음 및 원하는 질량의 주 피크(94%)를 확인하였다. 반응 혼합물을 진공 농축하여 백색 고체의 N-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-4-(피페라진-1-일)벤즈아미드 (400 mg, crude, HCl 염)를 수득하였다. MS(M+H)+=317.4
단계 3. tert-부틸 (1-(2-(4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)카바모일)페닐)피페라진-1-일)아세틸)피페리딘-4-일)카바메이트 (6)의 합성
DMF (4 mL) 내 N-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-4-(피페라진-1-일)벤즈아미드 (200 mg, 566.87 μmol, HCl 염) 및 tert-부틸 N-[1-(2-클로로아세틸)-4-피페리딜]카바메이트 (172.57 mg, 623.56 μmol) 용액에 DIPEA (219.79 mg, 1.70 mmol, 296.22 μL) 및 NaI (16.99 mg, 113.37 μmol)를 20 °C 에서 첨가하고 생성된 혼합물을 80 °C 에서 16시간 동안 교반 하였다. LCMS로 출발물질이 완전히 소모되었음 및 원하는 질량의 피크(74%)를 확인하였다. 반응 혼합물을 H2O (12 mL)로 희석하고 EtOAc (12 mL x 3)로 추출하였다. 유기상을 염수 (12 mL x 3)로 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하고 농축하였다. 잔여물을 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (12 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, Eluent of 0~100 % EtOAc/석유 에터 gradient @ 100 mL/분)로 정제하여 오프 화이트(off-white) 고체의 tert-부틸 (1-(2-(4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)카바모일)페닐)피페라진-1-일)아세틸)피페리딘-4-일)카바메이트 (180 mg, 320.13 μmol, 56.47% 수율, 99% 순도)를 수득하였다. MS(M+H)+=557.3
단계 4. 3-(4-(2-(4-아미노피페리딘-1-일)-2-옥소에틸)피페라진-1-일)-N-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)벤즈아미드 (7)의 합성
디옥산 (4 mL) 내 tert-부틸 (1-(2-(4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)카바모일)페닐)피페라진-1-일)아세틸)피페리딘-4-일)카바메이트 (180 mg, 323.36 μmol) 용액에 HCl/디옥산 (4 M, 8 mL)을 20 °C 에서 첨가하고 생성된 혼합물을 20 °C 에서 1시간 동안 교반 하였다. LCMS로 출발물질이 완전히 소모되었음 및 원하는 질량의 주 피크(95%)를 확인하였다. 반응 혼합물을 진공 농축하여 오프 화이트(off-white) 고체의 3-(4-(2-(4-아미노피페리딘-1-일)-2-옥소에틸)피페라진-1-일)-N-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)벤즈아미드 (160 mg, crude, HCl 염)를 수득하였다. MS(M+H)+=457.4
단계 5. 4-((9-시클로펜틸-7,7-디플루오로-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(1-(2-(4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)카바모일)페닐)피페라진-1-일)아세틸)피페리딘-4-일)-3-메톡시벤즈아미드 (화합물 2)의 합성
DMF (2 mL) 내 4-[(9-시클로펜틸-7,7-디플루오로-5-메틸-6-옥소-8H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노]-3-메톡시-벤조산 (80 mg, 178.80 μmol) 용액에 HATU (74.78 mg, 196.68 μmol) 및 DIPEA (46.22 mg, 357.59 μmol, 62.29 μL)를 첨가하였다. 혼합물을 20 °C 에서 10분간 교반한 후, DMF (2 mL) 내 3-(4-(2-(4-아미노피페리딘-1-일)-2-옥소에틸)피페라진-1-일)-N-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)벤즈아미드 (96.96 mg, 196.68 μmol, HCl 염) 및 DIPEA (46.22 mg, 357.59 μmol, 62.29 μL) 용액을 첨가하고 생성된 혼합물을 20 °C 에서 추가로 1시간 동안 교반 하였다. LCMS로 출발물질이 완전히 소모되었음 및 원하는 질량의 피크(64%)를 확인하였다. 반응 혼합물을 H2O (10 mL)로 희석하고 EtOAc (10 mL x 6)로 추출하였다. 유기상을 Na2SO4로 건조하고, 여과하고 농축하였다. 잔여물을 prep-HPLC (컬럼: Waters Xbridge 150 x 25 mm x 5μm; 이동상: [water (NH4HCO3) - ACN]; B%: 29% - 59%, 10 분)로 정제하고 용출물을 동결 건조하여 백색 고체의 4-((9-시클로펜틸-7,7-디플루오로-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(1-(2-(4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)카바모일)페닐)피페라진-1-일)아세틸)피페리딘-4-일)-3-메톡시벤즈아미드 (24.3 mg, 27.15 μmol, 15.19% 수율, 99% 순도)를 수득하였다. MS(M+H)+=886.3
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ = 10.82 (s, 1H), 8.47 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 8.23 (s, 1H), 8.14 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.99 (s, 1H), 7.81 - 7.68 (m, 3H), 7.06 - 6.92 (m, 4H), 4.80 - 4.64 (m, 2H), 4.47 - 4.18 (m, 1H), 4.13 - 3.80 (m, 7H), 3.32 (br s, 7H), 3.19 - 2.91 (m, 4H), 2.84 - 2.73 (m, 1H), 2.57 (br d, J = 4.3 Hz, 5H), 2.11 (dq, J = 4.2, 12.7 Hz, 1H), 1.99 - 1.85 (m, 3H), 1.82 - 1.70 (m, 2H), 1.68 (br s, 2H), 1.62 - 1.41 (m, 6H).
실시예 3. 4-((9-시클로펜틸-7,7-디플루오로-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(1-(2-(4-(3-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)카바모일)페닐)피페라진-1-일)아세틸)피페리딘-4-일)-3-메톡시벤즈아미드 (화합물 3)의 합성
단계 1. tert-부틸 4-(3-(메톡시카보닐)페닐)피페라진-1-카복실레이트 (2)의 합성
톨루엔 (50 mL) 내 메틸 3-브로모벤조에이트 (2 g, 9.30 mmol), tert-부틸 피페라진-1-카복실레이트 (2.00 g, 10.74 mmol), Pd(OAc)2 (250.00 mg, 1.11 mmol), BINAP (600.00 mg, 963.59 μmol) 및 Cs2CO3 (6.50 g, 19.95 mmol) 혼합물을 탈기하고 N2로 3차례 퍼징한 후, 혼합물을 100 °C N2 기체 하에서 16시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 주 피크를 확인하였다. 반응 혼합물을 여과하고 여과물을 감압 농축하였다. 잔여물을 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (Biotage; 40 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, Eluent of 0 ~ 20% EtOAc: 석유 에터 gradient, 60 mL/분)로 정제하여 밝은 황색 오일의 tert-부틸 4-(3-(메톡시카보닐)페닐)피페라진-1-카복실레이트 (2.4 g, 7.49 mmol, 80.55% 수율)를 수득하였다. MS(M+H)+ = 321.3
단계 2. 3-(4-(tert-부톡시카보닐)피페라진-1-일)벤조산 (3)의 합성
MeOH (30 mL) 내 tert-부틸 4-(3-(메톡시카보닐)페닐)피페라진-1-카복실레이트 (2.4 g, 7.49 mmol) 용액에 H2O (30 mL) 내 LiOH (500 mg, 20.88 mmol)를 20 °C 에서 첨가하였다. 혼합물을 20 °C 에서 12시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 주 피크를 확인하였다. 반응 혼합물을 감압 농축하였다. 반응 혼합물을 H2O (30 mL)로 희석하고 0 °C 에서 HCl (1M)을 통해 pH = 7로 천천히 조정하고, 생성된 혼합물을 EtOAc (60 mL x 3)로 추출하고 Na2SO4로 건조하고, 여과하고 여과물을 감압 농축하여 밝은 황색 고체의 3-(4-(tert-부톡시카보닐)피페라진-1-일)벤조산 (2.2 g, crude)을 수득하였다. MS(M-56+H)+ = 251.2
단계 3. tert-부틸 4-(3-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)카바모일)페닐)피페라진-1-카복실레이트 (4)의 합성
DMF (20 mL) 내 3-(4-(tert-부톡시카보닐)피페라진-1-일)벤조산 (2.1 g, 6.85 mmol) 용액에 EDCI (2.10 g, 10.95 mmol), DIPEA (4.96 g, 38.36 mmol, 6.68 mL), HOBt (1.15 g, 8.48 mmol) 및 3-아미노피페리딘-2,6-디온 (1.40 g, 8.51 mmol, HCl 염)을 25 °C 에서 첨가하였다. 혼합물을 25 °C 에서 16 시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 주 피크를 확인하였다. 반응 혼합물을 H2O (30 mL)로 희석하고 EtOAc (80 mL x 2)로 추출하였다. 합쳐진 유기상을 염수 (60 mL x 3)로 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하고 여과물을 감압 농축하였다. 조 생성물을 25 oC 에서 MTBE (30 mL)로 30분간 분쇄한 후 여과하였다. 여과케이크를 MTBE (10 mL x 2)로 희석한 후, 감압 건조하여 백색 고체의 tert-부틸 4-(3-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)카바모일)페닐)피페라진-1-카복실레이트 (2.8 g, 6.72 mmol, 98.08% 수율)를 수득하였다. MS(M+H)+ = 417.4
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ = 10.87 (s, 1H), 8.70 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.43 (d, J = 1.1 Hz, 1H), 7.38 - 7.28 (m, 2H), 7.17 - 7.11 (m, 1H), 4.92 - 4.65 (m, 1H), 3.54 - 3.41 (m, 4H), 3.22 - 3.09 (m, 4H), 2.86 - 2.76 (m, 1H), 2.59 - 2.53 (m, 1H), 2.19 - 2.07(m, 1H), 2.02 - 1.94 (m, 1H), 1.43 (s, 9H)
단계 4. N-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-3-(피페라진-1-일)벤즈아미드 (5)의 합성
디옥산 (30 mL) 내 tert-부틸 4-(3-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)카바모일)페닐)피페라진-1-카복실레이트 (2.8 g, 6.72 mmol) 용액에 HCl/디옥산 (4 M, 30 mL)을 첨가하였다. 혼합물을 25 °C 에서 48시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 주 피크(95%)를 확인하였다. 반응 혼합물을 감압 농축하여 백색 고체의 N-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-3-(피페라진-1-일)벤즈아미드 (2.30 g, crude, HCl 염)를 수득하였다. MS(M+H)+ = 317.3
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ = 10.86 (s, 1H), 9.48 (br s, 2H), 8.83 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.47 (s, 1H), 7.42 - 7.33 (m, 2H), 7.21-7.15(m 1H), 4.80 - 4.73 (m, 1H), 3.47 - 3.38 (m, 4H), 3.27-3.15 (m, 4H), 2.86 - 2.75 (m, 1H), 2.59-2.52 (m, 1H), 2.21 - 2.08 (m, 1H), 2.01 - 1.93 (m, 1H).
단계 5. tert-부틸 (1-(2-(4-(3-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)카바모일)페닐)피페라진-1-일)아세틸)피페리딘-4-일)카바메이트 (6)의 합성
DMF (8 mL) 내 N-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-3-(피페라진-1-일)벤즈아미드 (450 mg, 1.28 mmol, HCl 염) 용액에 KI (45.00 mg, 271.08 μmol), DIPEA (890.40 mg, 6.89 mmol, 1.2 mL) 및 tert-부틸 (1-(2-클로로아세틸)피페리딘-4-일)카바메이트 (560 mg, 2.02 mmol)를 25 °C 에서 첨가하였다. 혼합물을 60 °C 에서 16시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 주 피크를 확인하였다. 반응 혼합물을 H2O (10 mL)로 희석하고 EtOAc (40 mL x 2)로 추출하였다. 합쳐진 유기상을 염수 (30 mL x 3)로 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하고 여과물을 감압 농축하였다. 잔여물을 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (Biotage; 10 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, Eluent of 0 ~ 20% MeOH : EtOAc gradient, 60 mL/분)로 정제하여 밝은 황색 고체의 tert-부틸 (1-(2-(4-(3-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)카바모일)페닐)피페라진-1-일)아세틸)피페리딘-4-일)카바메이트 (500 mg, 898.23 μmol, 70.42% 수율)를 수득하였다. MS(M+H)+ = 557.5
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ = 10.87 (s, 1H), 8.69 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.70 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.40 (s, 1H), 7.34 - 7.25 (m, 2H), 7.15-7.09 (m, 1H), 4.89 - 4.65 (m, 1H), 3.91 - 3.74 (m, 3H), 3.23 (br s, 4H), 2.97 (s, 2H), 2.86 - 2.77 (m, 2H), 2.64 - 2.51 (m, 6H), 2.21 - 2.05 (m, 1H), 2.00 - 1.94 (m, 1H), 1.71 - 1.63 (m, 2H), 1.39 (s, 9H), 1.37 - 1.28 (m, 2H).
단계 6. 3-(4-(2-(4-아미노피페리딘-1-일)-2-옥소에틸)피페라진-1-일)-N-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)벤즈아미드 (7)의 합성
디옥산 (10 mL) 내 tert-부틸 (1-(2-(4-(3-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)카바모일)페닐)피페라진-1-일)아세틸)피페리딘-4-일)카바메이트 (250 mg, 449.11 μmol) 용액에 HCl/디옥산 (4 M, 10 mL)을 첨가하였다. 혼합물을 25 °C 에서 3시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 주 피크를 확인하였다. 혼합물을 감압 농축하여 밝은 황색 고체의 3-(4-(2-(4-아미노피페리딘-1-일)-2-옥소에틸)피페라진-1-일)-N-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)벤즈아미드 (200 mg, crude, 2HCl 염)를 수득하였다. MS(M+H)+ = 457.5
단계 7. 4-((9-시클로펜틸-7,7-디플루오로-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(1-(2-(4-(3-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)카바모일)페닐)피페라진-1-일)아세틸)피페리딘-4-일)-3-메톡시벤즈아미드 (화합물 3)의 합성
DMF (2 mL) 내 4-((9-시클로펜틸-7,7-디플루오로-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-3-메톡시벤조산 (60 mg, 134.10 μmol) 용액에 HATU (76 mg, 199.88 μmol), DIPEA (89.04 mg, 688.93 μmol, 120 μL) 및 3-(4-(2-(4-아미노피페리딘-1-일)-2-옥소에틸)피페라진-1-일)-N-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)벤즈아미드 (80 mg, 151.10 μmol, 2HCl 염)를 25 °C에서 첨가하였다. 혼합물을 25 °C N2 기체 하에서 16시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 피크(78%)를 확인하였다. 혼합물을 여과하고 여과물을 prep-HPLC (컬럼: Unisil 3-100 C18 Ultra 150 x 50 mm x 3 μm; 이동상: [water (FA) - ACN]; B%: 11% - 41%, 7 분; 컬럼 온도: 30 °C)로 정제하고 prep-HPLC (컬럼: Waters Xbridge 150 x 25 mm x 5μm; 이동상: [water (NH4HCO3) - ACN]; B%: 20% - 60%, 9 분; 컬럼 온도: 30 °C)로 재정제한 후, 용출물을 동결 건조하여 백색 고체의 4-((9-시클로펜틸-7,7-디플루오로-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(1-(2-(4-(3-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)카바모일)페닐)피페라진-1-일)아세틸)피페리딘-4-일)-3-메톡시벤즈아미드 (73.4 mg, 80.36 μmol, 59.93% 수율, 97% 순도)를 수득하였다. MS(M+H)+ = 886.7
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ = 10.87 (s, 1H), 8.69 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 8.24 (s, 1H), 8.15 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 8.00 (s, 1H), 7.72 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.41 (s, 1H), 7.36 - 7.27 (m, 2H), 7.16 - 7.09 (m, 1H), 7.03 (s, 1H), 6.96 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 4.82 - 4.67 (m, 2H), 4.40 - 4.16 (m, 1H), 4.16 - 4.00 (m, 2H), 4.00 - 3.90 (m, 2H), 3.89 (s, 3H), 3.33 - 3.20 (m, 7H), 3.13 - 2.88 (m, 4H), 2.85 - 2.76 (m, 1H), 2.66 - 2.59 (m, 4H), 2.58 - 2.55 (m, 1H), 2.19 - 2.06 (m, 1H), 2.05 - 1.88 (m, 3H), 1.87 - 1.66 (m, 4H), 1.61 - 1.44 (m, 6H).
실시예 4. 4-((9-시클로펜틸-7,7-디플루오로-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(1-(3-(4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)카바모일)페닐)피페라진-1-일)프로파노일)피페리딘-4-일)-3-메톡시벤즈아미드 (화합물 4)의 합성
단계 1. tert-부틸 4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)카바모일)페닐)피페라진-1-카복실레이트 (3)의 합성
DMF (20 mL) 내 4-(4-tert-부톡시카보닐피페라진-1-일)벤조산 (2 g, 6.53 mmol) 용액에 HATU (3.72 g, 9.79 mmol) 및 DIPEA (1.69 g, 13.06 mmol, 2.27 mL)를 25 °C 에서 첨가하였다. 혼합물을 25 °C 에서 10분간 교반하고 DMF (15 mL) 내 3-아미노피페리딘-2, 6-디온 (1.40 g, 8.49 mmol, HCl) 용액을 DIPEA (1.69 g, 13.06 mmol, 2.27 mL)와 함께 첨가하였다. 혼합물을 25 °C 에서 14시간 동안 교반 하였다. TLC (석유 에터 : EtOAc = 3 : 1)는 출발물질이 완전히 소모되었음 및 새로운 스팟이 형성되었음을 보였다. 혼합물을 H2O (30 mL) 및 EtOAc (10 mL)로 희석하고 EtOAc (10 mL x 3)로 추출하였다. 합쳐진 유기상을 H2O (20 mL)로 세척하고 감압 농축하였다. 조 생성물(crude)을 MTBE (50 mL)로 희석하고 혼합물을 25 °C 에서 1시간 동안 교반 하였다. 혼합물을 여과하고, 여과케이크를 MTBE (10 mL)로 세척하였다. 여과케이크를 모아서 감압 건조하여 백색 고체의 tert-부틸 4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)카바모일)페닐)피페라진-1-카복실레이트 (2.48 g, 5.84 mmol, 89.39% 수율, 98% 순도)를 수득하였다. MS(M+H)+=417.3
단계 2. N-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-4-(피페라진-1-일)벤즈아미드 (4)의 합성
디옥산 (10 mL) 내 tert-부틸 4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)카바모일)페닐)피페라진-1-카복실레이트 (1 g, 2.40 mmol) 용액에 HCl/디옥산 (4 M, 20 mL)를 25 °C 에서 첨가하였다. 혼합물을 25 °C 에서 1시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량을 관측하였다. 반응 혼합물을 감압 농축하여 백색 고체의 N-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-4-(피페라진-1-일)벤즈아미드 (850 mg, crude, HCl)를 수득하였다. MS(M+H)+=317.1
단계 3. tert-부틸 (1-(3-(4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)카바모일)페닐)피페라진-1-일)프로파노일)피페리딘-4-일)카바메이트(5)의 합성
DMF (8 mL) 내 N-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-4-(피페라진-1-일)벤즈아미드 (600 mg, 1.70 mmol, HCl) 및 tert-부틸 N-[1-(3-클로로프로파노일)-4-피페리딜]카바메이트 (716.96 mg, 2.47 mmol) 용액에 DIPEA (659.37 mg, 5.10 mmol, 888.65 μL) 및 KI (62.97 mg, 379.33 μmol)를 첨가하였다. 혼합물을 80 °C 에서 12시간 동안 교반 하였다. LCMS로 26%의 N-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-4-(피페라진-1-일)벤즈아미드가 남아 있음 및 원하는 질량의 피크(46%)를 확인하였다. 혼합물을 H2O (30 mL)로 희석하고 EtOAc (30 mL x 3)로 추출하였다. 합쳐진 유기상을 염수 (20 mL x 2)로 세척하였다. 합쳐진 유기상을 감압 농축하였다. 잔여물을 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (10 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, Eluent of 50~100% EtOAc/석유 에터 to 0~10% MeOH /EtOAc gradient @ 100 mL/분)로 정제하여 황색 고체의 tert-부틸 (1-(3-(4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)카바모일)페닐)피페라진-1-일)프로파노일)피페리딘-4-일)카바메이트 (320 mg, 560.74 μmol, 32.97% 수율)를 수득하였다. MS(M+H)+=571.4
단계 4. 4-(4-(3-(4-아미노피페리딘-1-일)-3-옥소프로필)피페라진-1-일)-N-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)벤즈아미드 (6)의 합성
디옥산 (3 mL) 내 tert-부틸 (1-(3-(4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)카바모일)페닐)피페라진-1-일)프로파노일)피페리딘-4-일)카바메이트 (320 mg, 560.74 μmol) 용액에 HCl/디옥산 (4 M, 9 mL)을 25 °C 에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 25 °C 에서 1시간 동안 교반 하였다. LCMS로 출발물질이 소모되었음 및 원하는 질량의 피크(91%)를 확인하였다. 혼합물을 감압 농축하여 황색 고체의 4-(4-(3-(4-아미노피페리딘-1-일)-3-옥소프로필)피페라진-1-일)-N-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)벤즈아미드 (280 mg, crude, HCl 염)를 수득하였다. MS(M+H)+=471.2
단계 5. 4-((9-시클로펜틸-7,7-디플루오로-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(1-(3-(4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)카바모일)페닐)피페라진-1-일)프로파노일)피페리딘-4-일)-3-메톡시벤즈아미드 (화합물 4)의 합성
DMF (1 mL) 내 4-((9-시클로펜틸-7,7-디플루오로-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-3-메톡시벤조산 (70 mg, 156.45 μmol) 용액에 HATU (89.23 mg, 234.67 μmol) 및 DIPEA (44.52 mg, 344.47 μmol, 60 μL)를 첨가하고 혼합물을 25 °C 에서 15분간 교반 하였다. DMF (1 mL) 내 4-(4-(3-(4-아미노피페리딘-1-일)-3-옥소프로필)피페라진-1-일)-N-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)벤즈아미드 (100 mg, 197.23 μmol, HCl 염) 및 DIPEA (44.52 mg, 344.47 μmol, 60 μL) 용액을 첨가하고 혼합물을 25 °C 에서 1시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량을 확인하였다. 혼합물을 H2O (10 mL)로 희석하고 EtOAc (10 mL x 3)로 추출하였다. 합쳐진 유기상을 염수 (10 mL x 3)로 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하였다. 여과물을 감압 농축하였다. 조 생성물(crude)을 prep-HPLC (컬럼: Waters Xbridge 150 x 25 mm x 5μm; 이동상: [water (NH4HCO3) -ACN]; B%: 33% - 63%, 9분)로 정제하고 용출물을 동결 건조하여 백색 고체의 4-((9-시클로펜틸-7,7-디플루오로-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(1-(3-(4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)카바모일)페닐)피페라진-1-일)프로파노일)피페리딘-4-일)-3-메톡시벤즈아미드 (22 mg, 22.98 μmol, 14.69% 수율, 94% 순도)를 수득하였다. MS(M+H)+=900.1
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ = 10.82 (s, 1H), 8.46 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 8.30 - 8.25 (m, 2H), 8.15 (br d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.97 (s, 1H), 7.75 (d, J = 8.9 Hz, 2H), 7.51 - 7.46 (m, 2H), 6.98 (d, J = 8.9 Hz, 2H), 4.80 - 4.70 (m, 2H), 4.43 - 4.34 (m, 1H), 4.10 - 3.90 (m, 7H), 3.30 (s, 3H), 3.28 - 3.24 (m, 4H), 3.18 - 3.09 (m, 1H), 2.84 - 2.73 (m, 1H), 2.62 - 2.53 (m, 11H), 2.17 - 2.04 (m, 1H), 1.99 - 1.78 (m, 5H), 1.73 - 1.66 (m, 1H), 1.65 - 1.34 (m, 6H).
실시예 5. 4-(4-(3-(4-(4-((9-시클로펜틸-7,7-디플루오로-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-3-메톡시벤즈아미도)피페리딘-1-일)-3-옥소프로필)피페라진-1-일)-N-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-2-플루오로벤즈아미드 (화합물 5)의 합성
단계 1. tert-부틸 4-(3-플루오로-4-(메톡시카보닐)페닐)피페라진-1-카복실레이트 (3)의 합성
톨루엔 (20 mL) 내 메틸 4-브로모-2-플루오로벤조에이트 (1.5 g, 6.44 mmol) 및 tert-부틸 피페라진-1-카복실레이트 (1.20 g, 6.44 mmol) 용액에 Pd(OAc)2 (144.51 mg, 643.68 μmol), BINAP (801.61 mg, 1.29 mmol) 및 Cs2CO3 (6.29 g, 19.31 mmol)를 첨가했다. 혼합물을 100 °C N2 조건 하에서 16시간 동안 교반 하였다. LCMS로 메틸 4-브로모-2-플루오로벤조에이트가 완전히 소모되었음 및 원하는 질량을 확인하였다. 반응 혼합물을 감압 농축하여 용매를 제거하였다. 잔여물을 컬럼 크로마토그래피 (SiO2, 석유 에터/EtOAc = 20 - 50%)로 정제하여 백색 고체의 tert-부틸 4-(3-플루오로-4-(메톡시카보닐)페닐)피페라진-1-카복실레이트 (1.8 g, 3.40 mmol, 52.89% 수율, 64% 순도)를 수득하였다. MS(M+H-56)+=283.0
단계 2. 4-(4-(tert-부톡시카보닐)피페라진-1-일)-2-플루오로벤조산 (4)의 합성
THF (8 mL) 및 H2O (4 mL) 내 tert-부틸 4-(3-플루오로-4-(메톡시카보닐)페닐)피페라진-1-카복실레이트 (1 g, 2.96 mmol) 용액에 LiOH (353.87 mg, 14.78 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 25 °C 에서 1시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 하나의 주 피크를 확인하였다. 반응 혼합물을 pH = 5로 조절한 후 EtOAc (20 mL x 3)로 추출하였다. 합쳐진 유기상을 염수 (20 mL)로 세척하고, 무수 소듐 설페이트로 건조하고, 여과하고 감압 농축하여 백색 고체의 4-(4-(tert-부톡시카보닐)피페라진-1-일)-2-플루오로벤조산 (850 mg, 2.62 mmol, 88.68% 수율)을 수득하였고 이를 다음 단계에 바로 사용하였다. MS(M+H-56)+=269.1
단계 3. tert-부틸 4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)카바모일)-3-플루오로페닐) 피페라진-1-카복실레이트 (6)의 합성
DMF (7 mL) 내 4-(4-(tert-부톡시카보닐)피페라진-1-일)-2-플루오로벤조산 (400 mg, 1.23 mmol) 및 3-아미노피페리딘-2,6-디온 (158.01 mg, 1.23 mmol) 용액에 HATU (703.38 mg, 1.85 mmol) 및 DIPEA (478.17 mg, 3.70 mmol, 644.43 μL)를 첨가하였다. 혼합물을 25 °C 에서 2시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 주 피크를 확인하였다. 반응 혼합물을 물 20 mL로 희석하고 EtOAc (10 mL x 3)로 추출하였다. 합쳐진 유기상을 염수 10 mL로 세척하고, 무수 소듐 설페이트로 건조하고, 여과하고 감압 농축하여 잔여물을 얻었다. 잔여물을 컬럼 크로마토그래피 (SiO2, MeOH/EtOAc = 0 - 10%)로 정제하여 밝은 황색 고체의 tert-부틸 4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)카바모일)-3-플루오로페닐) 피페라진-1-카복실레이트 (450 mg, 1.02 mmol, 82.31% 수율, 98% 순도)를 수득하였다. MS(M+H)+=435.3
단계 4. N-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-2-플루오로-4-(피페라진-1-일)벤즈아미드 (7)의 합성
DCM (3 mL) 내 tert-부틸 4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)카바모일)-3-플루오로페닐)피페라진-1-카복실레이트 (450 mg, 1.04 mmol) 및 HCl/디옥산 (4 M, 3 mL) 용액을 25 °C 에서 1시간 동안 교반 하였다. LCMS로 반응물이 완전히 소모되었음을 확인하였다. 반응 혼합물을 감압 농축하여 밝은 황색 고체의 N-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-2-플루오로-4-(피페라진-1-일)벤즈아미드 (450 mg, crude, HCl 염)를 수득하였고 다음 단계에 바로 사용하였다. MS(M+H)+=335.2
단계 5. tert-부틸 (1-(3-(4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)카바모일)-3-플루오로페닐) 피페라진-1-일)프로파노일)피페리딘-4-일)카바메이트 (9)의 합성
DMF (8 mL) 내 N-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-2-플루오로-4-(피페라진-1-일)벤즈아미드 (200 mg, 611.16 μmol, HCl 염) 및 tert-부틸 (1-(3-chloro프로파노일)피페리딘-4-일)카바메이트 (226.62 mg, 677.81 μmol) 용액에 DIPEA (236.96 mg, 1.83 mmol, 319.36 μL) 및 KI (101.45 mg, 611.16 μmol)를 첨가하였다. 혼합물을 80 °C 에서 3시간 동안 교반 하였다. LCMS로 N-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-2-플루오로-4-(피페라진-1-일)벤즈아미드가 완전히 소모되었음 및 원하는 질량을 확인하였다. 반응 혼합물을 물 20 mL로 희석하고 EtOAc (10 mL x 3)로 추출하였다. 합쳐진 유기상을 염수 10 mL로 세척하고, 무수 소듐 설페이트로 건조하고, 여과하고 감압 농축하여, 잔여물을 얻었다. 잔여물을 컬럼 크로마토그래피 (SiO2, MeOH/EtOAc = 0 - 10%)로 정제하여 밝은 황색 고체의 tert-부틸 (1-(3-(4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)카바모일)-3-플루오로페닐) 피페라진-1-일)프로파노일)피페리딘-4-일)카바메이트 (130 mg, 172.25 μmol, 28.18% 수율, 78% 순도)를 수득하였다. MS(M+H)+=589.2
단계 6. 4-(4-(3-(4-아미노피페리딘-1-일)-3-옥소프로필)피페라진-1-일)-N-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-2-플루오로벤즈아미드 (10)의 합성
DCM (2 mL) 내 tert-부틸 (1-(3-(4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)카바모일)-3-플루오로페닐)피페라진-1-일)프로파노일)피페리딘-4-일)카바메이트 (130 mg, 220.84 μmol) 및 HCl/디옥산 (4 M, 2 mL) 혼합물을 25 °C 에서 30분간 교반 하였다. LCMS로 반응이 완료되었음을 확인하였다. 반응 혼합물을 감압 농축하여 밝은 황색 고체의 4-(4-(3-(4-아미노피페리딘-1-일)-3-옥소프로필)피페라진-1-일)-N-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-2-플루오로벤즈아미드를 수득하였고 이를 다음 단계에 바로 사용하였다. MS(M+H)+=489.3
단계 7. 4-(4-(3-(4-(4-((9-시클로펜틸-7,7-디플루오로-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-3-메톡시벤즈아미도)피페리딘-1-일)-3-옥소프로필)피페라진-1-일)-N-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-2-플루오로벤즈아미드 (화합물 5)의 합성
DMF (4 mL) 내 4-(4-(3-(4-아미노피페리딘-1-일)-3-옥소프로필)피페라진-1-일)-N-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-2-플루오로벤즈아미드 (130 mg, 247.61 μmol, HCl 염) 및 4-((9-시클로펜틸-7,7-디플루오로-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-3-메톡시벤조산 (110.79 mg, 247.61 μmol) 용액에 HATU (141.22 mg, 371.42 μmol) 및 DIPEA (96.01 mg, 742.84 μmol, 129.39 μL)를 첨가하였다. 혼합물을 25 °C 에서 2시간 동안 교반 하였다. LCMS로 4-(4-(3-(4-아미노피페리딘-1-일)-3-옥소프로필)피페라진-1-일)-N-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-2-플루오로벤즈아미드가 완전히 소모되었음 및 원하는 질량의 하나의 주 피크를 확인하였다. 반응 혼합물을 물 (20 mL)로 희석하고 EtOAc (10 mL x 3)로 추출하였다. 합쳐진 유기상을 염수 (10 mL)로 세척하고, 무수 소듐 설페이트로 건조하고, 여과하고 감압 농축하여 여과물을 얻었다. 잔여물을 컬럼 크로마토그래피 (SiO2, MeOH/EtOAc = 0 - 10%)로 정제하였다. 그리고나서 잔여물을 prep-HPLC (neutral condition: 컬럼: Waters Xbridge 150 x 25mm x 5μm; 이동상: [water (NH4HCO3) -ACN]; B%: 36%-66%, 10분)로 정제하고 용출물을 동결 건조하여 백색 고체의 4-(4-(3-(4-(4-((9-시클로펜틸-7,7-디플루오로-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-3-메톡시벤즈아미도)피페리딘-1-일)-3-옥소프로필)피페라진-1-일)-N-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-2-플루오로벤즈아미드 (53.3 mg, 56.90 μmol, 22.98% 수율, 98% 순도)를 수득하였다. MS(M+H)+=918.4
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ = 10.85 (s, 1H), 8.33 - 8.25 (m, 2H), 8.16 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 8.08 - 8.01 (m, 1H), 7.98 (s, 1H), 7.64 (t, J = 9.0 Hz, 1H), 7.53 - 7.46 (m, 2H), 6.87 - 6.74 (m, 2H), 4.81 - 4.69 (m, 2H), 4.41 - 4.32 (m, 1H), 4.07 - 4.03 (m, 3H), 4.02 - 3.96 (m, 1H), 3.94 (s, 3H), 3.34 (s, 3H), 3.32 - 3.28 (m, 4H), 3.15 - 3.06 (m, 1H), 2.83 - 2.73 (m, 1H), 2.64 - 2.53 (m, 11H), 2.13 - 2.06 (m, 1H), 2.05 - 1.80 (m, 5H), 1.77 - 1.66 (m, 1H), 1.65 - 1.56 (m, 4H), 1.53 - 1.36 (m, 2H).
실시예 6. 3-(4-(3-(4-(4-((9-시클로펜틸-7,7-디플루오로-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-3-메톡시벤즈아미도)피페리딘-1-일)-3-옥소프로필)피페라진-1-일)-N-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-2-플루오로벤즈아미드 (화합물 6)의 합성
단계 1. tert-부틸 4-(2-플루오로-3-(메톡시카보닐)페닐)피페라진-1-카복실레이트 (3)의 합성
톨루엔 (15 mL) 내 메틸 3-브로모-2-플루오로벤조에이트 (1 g, 4.29 mmol) 및 tert-부틸 피페라진-1-카복실레이트 (879 mg, 4.72 mmol) 용액에 Cs2CO3 (4.19 g, 12.87 mmol), BINAP (267.20 mg, 429.12 μmol) 및 Pd(OAc)2 (48.17 mg, 214.56 μmol)를 첨가하고 혼합물을 100 ℃에서 14시간 동안 교반 하였다. LCMS로 출발물질이 소모되었음 및 워크 업 후 원하는 질량 76% 피크를 확인하였다. 혼합물을 감압 농축하여 잔여물을 얻었다. 잔여물을 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (10 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, Eluent of 0~20% EtOAc/석유 에터 @ 50 mL/분)로 정제하여 백색 고체의 tert-부틸 4-(2-플루오로-3-(메톡시카보닐)페닐)피페라진-1-카복실레이트 (0.97 g, 2.18 mmol, 50.77% 수율, 76% 순도)를 수득하였다. MS(M+H)+=338.4
단계 2. 3-(4-(tert-부톡시카보닐)피페라진-1-일)-2-플루오로벤조산 (4)의 합성
MeOH (10 mL) 및 THF (10 mL) 내 tert-부틸 4-(2-플루오로-3-(메톡시카보닐)페닐)피페라진-1-카복실레이트 (0.97 g, 2.87 mmol) 용액에 NaOH (3 M, 1.43 mL)를 첨가하였다. 혼합물을 25 ℃에서 14시간 동안 교반 하였다. LCMS로 출발물질이 소모되었음 및 원하는 질량의 85% 피크를 확인하였다. 혼합물을 감압 농축하여 백색 고체의 3-(4-(tert-부톡시카보닐)피페라진-1-일)-2-플루오로벤조산 (1 g, crude)을 수득하였다. MS(M+H)+=347.1
단계 3. tert-부틸 4-(3-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)카바모일)-2-플루오로페닐)피페라진-1-카복실레이트 (6)의 합성
DMF (10 mL) 내 3-(4-(tert-부톡시카보닐)피페라진-1-일)-2-플루오로벤조산 (1 g, 2.89 mmol), 3-아미노피페리딘-2,6-디온 (570.29 mg, 3.46 mmol, HCl), EDCI (830.29 mg, 4.33 mmol) 및 HOBt (780.32 mg, 5.77 mmol) 용액에 DIPEA (1.12 g, 8.66 mmol, 1.51 mL)를 첨가하고 혼합물을 25 ℃에서 14시간 동안 교반 하였다. LCMS로 출발물질이 소모되었음 및 원하는 질량의 88% 피크를 확인하였다. 혼합물을 H2O (20 mL)로 희석하고 EtOAc (30 mL x 3)로 추출하고, 합쳐진 유기상을 염수 (20 mL)로 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하였다. 여과물을 감압 농축하였다. 잔여물을 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (10 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, Eluent of 0~50% EtOAc/석유 에터 @ 50 mL/분)로 정제하여 백색 고체의 tert-부틸 4-(3-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)카바모일)-2-플루오로페닐)피페라진-1-카복실레이트 (1.06 g, 2.44 mmol, 84.50% 수율, 100% 순도)를 수득하였다. MS(M+H)+=434.8
단계 4. N-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-2-플루오로-3-(피페라진-1-일)벤즈아미드 (7)의 합성
디옥산 (10 mL) 내 tert-부틸 4-(3-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)카바모일)-2-플루오로페닐)피페라진-1-카복실레이트 (1 g, 2.30 mmol) 용액에 HCl/디옥산 (4 M, 9 mL)를 첨가하고 혼합물을 25 ℃에서 1시간 동안 교반 하였다. LCMS로 출발물질이 소모되었음 및 원하는 질량의 96% 피크를 확인하였다. 혼합물을 감압 농축하여 백색 고체의 N-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-2-플루오로-3-(피페라진-1-일)벤즈아미드 (910 mg, crude, HCl)를 수득하였다. MS(M+H)+=335.0
단계 5. tert-부틸 (1-(3-(4-(3-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)카바모일)-2-플루오로페닐)피페라진-1-일)프로파노일)피페리딘-4-일)카바메이트 (9)의 합성
DMF (10 mL) 내 N-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-2-플루오로-3-(피페라진-1-일)벤즈아미드 (910 mg, crude, HCl) 및 tert-부틸 (1-(3-클로로프로파노일)피페리딘-4-일)카바메이트 (927.71 mg, 3.19 mmol) 용액에 DIPEA (964.60 mg, 7.46 mmol, 1.30 mL) 및 KI (20.40 mg, 122.89 μmol)를 첨가하였다. 혼합물을 80 ℃에서 14시간 동안 교반 하였다. LCMS로 출발물질이 소모되었음을 확인하였다. 혼합물을 H2O (15 mL)로 희석하고 EtOAc (25 mL x 3)로 추출하였고, 합쳐진 유기상을 염수 (30 mL)로 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하였다. 여과물을 감압 농축하였다. 잔여물을 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (10 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, Eluent of 0~100% EtOAc/석유 에터 to 0~30%MeOH/EtOAc gradient @ 100 mL/분)로 정제하여 갈색 고체의 tert-부틸 (1-(3-(4-(3-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)카바모일)-2-플루오로페닐)피페라진-1-일)프로파노일)피페리딘-4-일)카바메이트 (0.53 g, 900.34 μmol, 36.69% 수율)를 수득하였다. MS(M+H)+=589.3
단계 6. 3-(4-(3-(4-아미노피페리딘-1-일)-3-옥소프로필)피페라진-1-일)-N-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-2-플루오로벤즈아미드 (10)의 합성
디옥산 (5 mL) 내 tert-부틸 (1-(3-(4-(3-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)카바모일)-2-플루오로페닐)피페라진-1-일)프로파노일)피페리딘-4-일)카바메이트 (0.53 g, 900.34 μmol) 용액에 HCl/디옥산 (4 M, 8 mL)를 첨가하였다. 혼합물을 25 ℃에서 1시간 동안 교반 하였다. LCMS로 출발물질이 소모되었음 및 원하는 질량의 96% 피크를 확인하였다. 혼합물을 감압 농축하여 갈색 고체의 3-(4-(3-(4-아미노피페리딘-1-일)-3-옥소프로필)피페라진-1-일)-N-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-2-플루오로벤즈아미드 (470 mg, crude, HCl)를 수득하였다. MS(M+H)+=489.2
단계 7. 3-(4-(3-(4-(4-((9-시클로펜틸-7,7-디플루오로-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-3-메톡시벤즈아미도)피페리딘-1-일)-3-옥소프로필)피페라진-1-일)-N-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-2-플루오로벤즈아미드 (화합물 6)의 합성
DMF (0.8 mL) 내 4-((9-시클로펜틸-7,7-디플루오로-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-3-메톡시벤조산 (60 mg, 134.10 μmol) 용액에 HATU (76 mg, 199.88 μmol) 및 DIPEA (14.84 mg, 114.82 μmol, 20 μL)를 첨가하고 혼합물을 25 ℃에서 15분간 교반 하였다. DMF (0.7 mL) 내 3-(4-(3-(4-아미노피페리딘-1-일)-3-옥소프로필)피페라진-1-일)-N-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-2-플루오로벤즈아미드 (120 mg, crude, HCl) 및 DIPEA (14.84 mg, 114.82 μmol, 20 μL) 용액을 첨가하고 혼합물을 25 ℃에서 1시간 동안 교반 하였다. 워크 업 후 LCMS로 원하는 질량의 피크(94%)가 검출됨을 확인하였다. 혼합물을 H2O (10 mL)로 희석하고 EtOAc (10 mL x 3)로 추출하고, 합쳐진 유기상을 염수 (10 mL x 3)로 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하였다. 여과물을 감압 농축하였다. 잔여물을 prep-HPLC (컬럼: Waters Xbridge 150*25 mm* 5 ㎛; 이동상:[water (NH4HCO3)-ACN]; B%: 34%-64%, 10분)로 정제하고 용출물을 동결 건조하여 백색 고체의 3-(4-(3-(4-(4-((9-시클로펜틸-7,7-디플루오로-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-3-메톡시벤즈아미도)피페리딘-1-일)-3-옥소프로필)피페라진-1-일)-N-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-2-플루오로벤즈아미드 (35.2 mg, 35.28 μmol, 26.31% 수율, 92% 순도)를 수득하였다. MS(M+H)+=918.2
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ = 10.86 (s, 1H), 8.62-8.56 (m, 1H), 8.31-8.24 (m, 2H), 8.15 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.97 (s, 1H), 7.51-7.46 (m, 2H), 7.20-7.11 (m, 3H), 4.82-4.71 (m, 2H), 4.44-4.35 (m, 1H), 4.10-4.00 (m, 3H), 3.98-3.91 (m, 4H), 3.31-3.28 (s, 3H), 3.17-3.09 (m, 1H), 3.07-2.97 (m, 4H), 2.84-2.74 (m, 1H), 2.71-2.53 (m, 11H), 2.12-2.02 (m, 1H), 2.01-1.80 (m, 4H), 1.75-1.66 (m, 2H), 1.65-1.53 (m, 4H), 1.52-1.33 (m, 2H).
실시예 7. 5-(4-(3-(4-(4-((9-시클로펜틸-7,7-디플루오로-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-3-메톡시벤즈아미도)피페리딘-1-일)-3-옥소프로필)피페라진-1-일)-N-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)피콜린아미드 (화합물 7)의 합성
단계 1. tert-부틸 4-(6-(메톡시카보닐)피리딘-3-일)피페라진-1-카복실레이트 (2)의 합성
톨루엔 (20 mL) 내 메틸 5-브로모피콜리네이트 (1 g, 4.63 mmol) 및 tert-부틸 피페라진-1-카복실레이트 (862.14 mg, 4.63 mmol) 용액에 Pd2(dba)3 (105.97 mg, 115.72 μmol), RuPhos (216.00 mg, 462.89 μmol) 및 Cs2CO3 (4.52 g, 13.89 mmol)를 N2 하에서 첨가하고 혼합물을 100 °C 에서 16시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 주 피크를 확인하였다. 혼합물을 여과하고 여과물을 진공 농축하여 황색 고체의 tert-부틸 4-(6-(메톡시카보닐)피리딘-3-일)피페라진-1-카복실레이트 (1.5 g, crude)를 수득하였고 이를 다음 단계에 바로 사용하였다. MS(M+H)+=322.0
단계 2. 메틸 5-(피페라진-1-일)피콜리네이트 (3)의 합성
디옥산 (6 mL) 내 tert-부틸 4-(6-(메톡시카보닐)피리딘-3-일)피페라진-1-카복실레이트 (1 g, 3.11 mmol) 용액에 HCl/디옥산 (4 M, 6 mL)를 첨가하고, 혼합물을 25 °C 에서 1시간 동안 교반 하였다. LCMS로 출발물질이 완전히 소모됨과 원하는 질량을 확인하였다. 혼합물을 여과하고, 여과케이크를 MeOH (10 mL)로 희석하여 황색 고체의 메틸 5-(피페라진-1-일)피콜리네이트 (1 g, crude, HCl)를 수득하였다. MS(M+H)+=221.9
단계 3. 메틸 5-(4-(3-(4-((tert-부톡시카보닐)아미노)피페리딘-1-일)-3-옥소프로필) 피페라진-1-일)피콜리네이트 (4)의 합성
DMF (20 mL) 내 메틸 5-(피페라진-1-일)피콜리네이트 (1 g, 3.88 mmol, HCl) 및 tert-부틸 (1-(3-클로로프로파노일)피페리딘-4-일)카바메이트 (3.38 g, 11.64 mmol) 용액에 DIPEA (1.50 g, 11.64 mmol, 2.03 mL) 및 NaI (58.16 mg, 388.02 μmol)를 첨가하고, 혼합물을 80 °C 에서 16시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량을 확인하였다. 혼합물을 물 (20 mL)로 희석하고 EtOAc (20 mL x 3)로 추출하였다. 합쳐진 유기상을 Na2SO4로 건조하고, 여과하고 진공 농축하였다. 조 생성물을 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (Biotage, 4 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, Eluent of 4~100% EtOAc/석유 에터 gradient @ 45 mL/분)로 정제하여 황색 가루의 메틸 5-(4-(3-(4-((tert-부톡시카보닐)아미노)피페리딘-1-일)-3-옥소프로필)피페라진-1-일)피콜리네이트 (580 mg, 1.21 mmol, 31.12% 수율, 99% 순도)를 수득하였다. MS(M+H)+=476.
단계 4. 5-(4-(3-(4-((tert-부톡시카보닐)아미노)피페리딘-1-일)-3-옥소프로필) 피페라진-1-일)피콜린산 (5)의 합성
THF (10 mL) 및 H2O (5 mL) 내 메틸5-(4-(3-(4-((tert-부톡시카보닐)아미노)피페리딘-1-일)-3-옥소프로필)피페라진-1-일)피콜리네이트 (300 mg, 630.81 μmol) 용액에 LiOH (30.21 mg, 1.26 mmol)를 0 °C 에서 첨가하고, 혼합물을 25 °C 에서 4시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 주 피크를 확인하였다. 혼합물을 농축하고 동결 건조하여 황색 가루의 5-(4-(3-(4-((tert-부톡시카보닐)아미노)피페리딘-1-일)-3-옥소프로필) 피페라진-1-일)피콜린산 (280 mg, crude)을 수득하였고 바로 사용하였다. MS(M+H)+=462.0
단계 5. tert-부틸 (1-(3-(4-(6-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)카바모일)피리딘-3-일) 피페라진-1-일)프로파노일)피페리딘-4-일)카바메이트 (6)의 합성
DMF (2 mL) 내 5-(4-(3-(4-((tert-부톡시카보닐)아미노)피페리딘-1-일)-3-옥소프로필)피페라진-1-일)피콜린산(100 mg, 213.45μmol Li) 용액에 HATU (121.74 mg, 320.17 μmol) 및 DIPEA (82.76 mg, 640.35 μmol, 111.54 μL)를 첨가하고, 1분동안 교반한 후, 3-아미노피페리딘-2,6-디온 (42.16 mg, 256.14 μmol, HCl)을 첨가하였다. 혼합물을 25 °C 에서 2시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 주 피크를 확인하였다. 혼합물을 물 (3 mL)로 희석하고 EtOAc (5 mL x 3)로 추출하였다. 유기상을 Na2SO4로 건조하고, 여과하고 진공 농축하였다. 조 생성물을 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (Biotage, 4 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, Eluent of 4~50% MeOH/EtOAc gradient @ 25 mL/분)로 정제하여 황색 가루의 tert-부틸 (1-(3-(4-(6-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)카바모일)피리딘-3-일) 피페라진-1-일)프로파노일)피페리딘-4-일)카바메이트 (110 mg, 153.94 μmol, 72.12% 수율, 80% 순도)를 수득하였다. MS(M+H)+=572.1
단계 6. 5-(4-(3-(4-아미노피페리딘-1-일)-3-옥소프로필)피페라진-1-일)-N-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)피콜린아미드 (7)의 합성
디옥산 (4 mL) 내 tert-부틸 (1-(3-(4-(6-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)카바모일)피리딘-3-일)피페라진-1-일)프로파노일)피페리딘-4-일)카바메이트 (110 mg, 192.42 μmol) 용액에 HCl/디옥산 (4 M, 4 mL, 83.15)을 첨가하고, 반응 혼합물을 25 °C 에서 1시간 동안 교반 하였다. LCMS로 출발물질이 완전히 소모됨과 원하는 질량을 확인하였다. 혼합물을 진공 농축하여 백색 가루의 5-(4-(3-(4-아미노피페리딘-1-일)-3-옥소프로필)피페라진-1-일)-N-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)피콜린아미드 (110 mg, crude, HCl)를 수득하였다. MS(M+H)+=472.0
단계 7. 5-(4-(3-(4-(4-((9-시클로펜틸-7,7-디플루오로-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-3-메톡시벤즈아미도)피페리딘-1-일)-3-옥소프로필)피페라진-1-일)-N-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)피콜린아미드 (화합물 7)의 합성
DMF (2 mL) 내 4-((9-시클로펜틸-7,7-디플루오로-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-3-메톡시벤조산 (60 mg, 134.10 μmol) 용액에 HATU (76.48 mg, 201.15 μmol) 및 DIPEA (51.99 mg, 402.29 μmol, 70.07 μL)를 첨가했다. 혼합물을 25 °C 에서 1분간 교반한 후, 5-(4-(3-(4-아미노피페리딘-1-일)-3-옥소프로필)피페라진-1-일)-N-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)피콜린아미드 (68.12 mg, 134.10 μmol, HCl)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 25 °C 에서 1시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량을 확인하였다. 혼합물을 물 (3 mL)로 희석하고 EtOAc (5 mL x 3)로 추출하였다. 유기상을 Na2SO4로 건조하고, 여과하고 진공 농축하였다. 조 생성물을 Prep-HPLC (컬럼: Phenomenex Synergi Polar-RP 100 x 25mm x 4μm;이동상: [water(TFA)-ACN];B%: 28%-48%,7분) 및 Prep-HPLC (컬럼: Waters Xbridge 150 x 25mm x 5μm;이동상: [water(NH4HCO3)-ACN];B%: 25%-58%,8분)로 정제하고, 동결 건조하여 백색 가루의 5-(4-(3-(4-(4-((9-시클로펜틸-7,7-디플루오로-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-3-메톡시벤즈아미도)피페리딘-1-일)-3-옥소프로필)피페라진-1-일)-N-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)피콜린아미드 (47.2 mg, 51.55 μmol, 38.44% 수율, 98.4% 순도)를 수득하였다. MS(M+H)+=901.3
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ = 10.85 (s, 1 H), 8.73 (d, J = 8.31 Hz, 1 H), 8.33 (d, J = 2.69 Hz, 1 H), 8.26 - 8.30 (m, 2 H), 8.16 (d, J = 7.70 Hz, 1 H), 7.97 (s, 1 H), 7.87 (d, J = 8.80 Hz, 1 H), 7.47 - 7.51 (m, 2 H), 7.43 (dd, J = 8.93, 2.81 Hz, 1 H) ,4.70 - 4.82 (m, 2 H) ,4.40 (d, J = 12.23 Hz, 1 H), 3.95 - 4.12 (m, 4 H), 3.94 (s, 3 H), 3.34 - 3.37 (m, 4 H), 3.31 (s, 3 H), 3.14 (t, J = 12.29 Hz, 1 H), 2.74 - 2.84 (m, 1 H), 2.66 - 2.74 (m, 1 H), 2.53 - 2.66 (m, 10 H), 2.12 - 2.19 (m, 1 H), 1.87 - 2.06 (m, 4 H), 1.72 - 1.85 (m, 2 H), 1.61 - 1.70 (m, 2 H), 1.49 - 1.58 (m, 2 H), 1.36 - 1.53 (m, 2 H).
실시예 8. 4-(4-(3-(4-(4-((9-시클로펜틸-7,7-디플루오로-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-3-메톡시벤즈아미도)피페리딘-1-일)-3-옥소프로필)피페라진-1-일)-N-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)피콜린아미드 (화합물 8)의 합성
단계 1. tert-부틸 4-(2-(메톡시카보닐)피리딘-4-일)피페라진-1-카복실레이트 (2)의 합성
톨루엔 (20 mL) 내 메틸 4-브로모피콜리네이트 (1 g, 4.63 mmol) 및 tert-부틸 피페라진-1-카복실레이트 (862.14 mg, 4.63 mmol) 용액에 Pd2(dba)3 (105.97 mg, 115.72 μmol), RuPhos (216.00 mg, 462.89 μmol) 및 Cs2CO3 (4.52 g, 13.89 mmol)을 N2 하에서 첨가하고, 혼합물을 100 °C 에서 16시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 주 피크를 확인하였다. 혼합물을 여과하고 여과물을 진공 농축하여 조 생성물을 얻었다. 조 생성물을 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (Biotage, 4 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, Eluent of 4~100% EtOAc/석유 에터 gradient @ 40 mL/분)로 정제하여 황색 오일의 tert-부틸 4-(2-(메톡시카보닐)피리딘-4-일)피페라진-1-카복실레이트 (780 mg, 1.53 mmol, 33.03% 수율, 63% 순도)를 수득하였다. MS(M+H)+=322.0
단계 2. 메틸 4-(피페라진-1-일)피콜리네이트 (3)의 합성
디옥산 (4 mL) 내 tert-부틸 4-(2-(메톡시카보닐)피리딘-4-일)피페라진-1-카복실레이트 (780 mg, 2.43 mmol) 용액에 HCl/디옥산 (4 M, 4 mL)을 첨가하였다. 혼합물을 25 °C 에서 2시간 동안 교반 하였다. LCMS로 출발물질이 완전히 소모되었음 및 원하는 질량을 확인하였다. 혼합물을 여과하였다. 여과케이크를 농축하여 황색 고체의 메틸 4-(피페라진-1-일)피콜리네이트 (540 mg, crude, HCl)를 수득하였다. MS(M+H)+=221.9
단계 3. 메틸 4-(4-(3-(4-((tert-부톡시카보닐)아미노)피페리딘-1-일)-3-옥소프로필)피페라진-1-일)피콜리네이트 (4)의 합성
DMF (15 mL) 내 메틸 4-(피페라진-1-일)피콜리네이트 (540 mg, 2.10 mmol, HCl) 및 tert-부틸 (1-(3-클로로프로파노일)피페리딘-4-일)카바메이트 (1.83 g, 6.29 mmol) 용액에 DIPEA (812.42 mg, 6.29 mmol, 1.09 mL) 및 KI (69.57 mg, 419.07 μmol)를 첨가하고, 혼합물을 80 °C 에서 16시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량을 확인하였다. 혼합물을 물 (3 mL)로 희석하고 EtOAc (5 mL x 3)로 추출하였다. 유기상을 Na2SO4로 건조하고, 여과하고 진공 농축하여 조 생성물을 얻었다. 조 생성물을 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (Biotage, 4 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, Eluent of 4~90% EtOAc/석유 에터 gradient @ 20 mL/분)로 정제하여 황색 오일의 메틸 4-(4-(3-(4-((tert-부톡시카보닐)아미노)피페리딘-1-일)-3-옥소프로필)피페라진-1-일)피콜리네이트 (150 mg, 315.40 μmol, 15.05% 수율)를 수득하였다. MS(M+H)+=476.1
단계 4. 4-(4-(3-(4-((tert-부톡시카보닐)아미노)피페리딘-1-일)-3-옥소프로필) 피페라진-1-일)피콜린산 (5)의 합성
H2O (3 mL) 및 THF (6 mL) 내 메틸 4-(4-(3-(4-((tert-부톡시카보닐)아미노)피페리딘-1-일)-3-옥소프로필)피페라진-1-일)피콜리네이트 (150 mg, 315.40 μmol) 용액에 LiOH (26.47 mg, 630.81 μmol)를 첨가하였다. 혼합물을 25 °C 에서 4시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 주 피크를 확인하였다. 혼합물을 농축하고 동결 건조하여 황색 가루의 4-(4-(3-(4-((tert-부톡시카보닐)아미노)피페리딘-1-일)-3-옥소프로필) 피페라진-1-일)피콜린산 (130 mg, crude)을 수득하였고 이를 바로 사용하였다. MS(M+H)+=462.1
단계 5. tert-부틸 (1-(3-(4-(2-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)카바모일)피리딘-4-일)피페라진-1-일)프로파노일)피페리딘-4-일)카바메이트 (6)의 합성
DMF (3 mL) 내 4-(4-(3-(4-((tert-부톡시카보닐)아미노)피페리딘-1-일)-3-옥소프로필)피페라진-1-일)피콜린산 (130 mg, 277.48 μmol) 용액에 HATU (158.26 mg, 416.23 μmol) 및 DIPEA (107.59 mg, 832.45 μmol, 145.00 μL)를 첨가한 후, 3-아미노피페리딘-2,6-디온 (54.81 mg, 332.98 μmol, HCl)을 첨가하였다. 혼합물을 25 °C 에서 16시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량을 확인하였다. 혼합물을 물 (3 mL)로 희석하고 EtOAc (5 mL x 3)로 추출하였다. 유기상을 Na2SO4로 건조하고, 여과하고 진공 농축하여 황색 오일의 tert-부틸 (1-(3-(4-(2-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)카바모일)피리딘-4-일)피페라진-1-일)프로파노일)피페리딘-4-일)카바메이트 (130 mg, crude)를 수득하였다. MS(M+H)+=572.1
단계 6. 4-(4-(3-(4-아미노피페리딘-1-일)-3-옥소프로필)피페라진-1-일)-N-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)피콜린아미드 (7)의 합성
디옥산 (2 mL) 내 tert-부틸 (1-(3-(4-(2-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)카바모일)피리딘-4-일)피페라진-1-일)프로파노일)피페리딘-4-일)카바메이트 (130 mg, 227.41 μmol) 용액에 HCl/디옥산 (4 M, 56.85 μL)을 첨가하고, 혼합물을 25 °C 에서 1시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 피크를 확인하였다. 혼합물을 진공 농축하여 황색 파우더의 4-(4-(3-(4-아미노피페리딘-1-일)-3-옥소프로필)피페라진-1-일)-N-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)피콜린아미드 (100 mg, crude, HCl)를 수득하였다. MS(M+H)+=472.0
단계 7. 4-(4-(3-(4-(4-((9-시클로펜틸-7,7-디플루오로-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-3-메톡시벤즈아미도)피페리딘-1-일)-3-옥소프로필)피페라진-1-일)-N-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)피콜린아미드 (화합물 8)의 합성
DMF (2 mL) 내 4-[(9-시클로펜틸-7,7-디플루오로-5-메틸-6-옥소-8H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노]-3-메톡시-벤조산 (85 mg, 189.97 μmol) 용액에 HATU (108.35 mg, 284.96 μmol) 및 DIPEA (73.66 mg, 569.92 μmol, 99.27 μL)를 첨가한 후, 4-(4-(3-(4-아미노피페리딘-1-일)-3-옥소프로필)피페라진-1-일)-N-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)피콜린아미드 (96.51 mg, 189.97 μmol, HCl)를 첨가하였다. 혼합물을 25 °C 에서 16시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 주 피크를 확인하였다. 혼합물을 물 (3 mL)로 희석하고 EtOAc (5 mL x 3)로 추출하였다. 유기상을 Na2SO4로 건조하고, 여과하고 진공 농축하였다. 조 생성물을 Prep-HPLC (컬럼: Phenomenex Synergi Polar-RP 100 x 25mm x 4μm;이동상: [water(TFA)-ACN];B%: 23%-43%,7분), 이후 Prep-HPLC (컬럼: Waters Xbridge 150 x 25mm x 5μm;이동상: [water( NH4HCO3)-ACN];B%: 30%-60%, 8분)로 정제한 후 동결 건조하여 백색 가루의 4-(4-(3-(4-(4-((9-시클로펜틸-7,7-디플루오로-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-3-메톡시벤즈아미도)피페리딘-1-일)-3-옥소프로필)피페라진-1-일)-N-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)피콜린아미드 (32.9 mg, 36.33 μmol, 19.13% 수율, 99.5% 순도)를 수득하였다. MS(M+H)+=901.0
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ = 10.86 (s, 1 H), 8.96 (d, J = 8.31 Hz, 1 H), 8.27 - 8.32 (m, 2 H), 8.24 (d, J = 5.99 Hz, 1 H), 8.16 (d, J = 7.46 Hz, 1 H), 7.98 (s, 1 H), 7.46 - 7.52 (m, 3 H), 7.04 (dd, J = 5.99, 2.57 Hz, 1 H), 4.71 - 4.82 (m, 2 H), 4.41 (d, J = 13.20 Hz, 1 H), 3.95 - 4.13 (m, 4 H), 3.95 (s, 3 H), 3.40 (d, J = 4.65 Hz, 4 H), 3.34 (s, 3 H), 3.06 - 3.20 (m, 1 H), 2.75 - 2.86 (m, 1 H), 2.69 (dd, J = 3.61, 1.65 Hz, 1 H), 2.53 - 2.67 (m, 10 H), 2.14 - 2.26 (m, 1 H), 1.87 - 2.06 (m, 4 H), 1.82-1.72 (m, 2 H), 1.62 -1.69 (m, 2 H), 1.60 - 1.68 (m, 2 H), 1.34 - 1.53 (m, 2 H).
실시예 9. 4-((9-시클로펜틸-7,7-디플루오로-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(4-((4-(3-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)카바모일)페닐)피페라진-1-일)메틸)피페리딘-1-일)-3-메톡시벤즈아미드 (화합물 9)의 합성
단계 1. tert-부틸 (4-((4-(3-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)카바모일)페닐)피페라진-1-일)메틸)피페리딘-1-일)카바메이트 (2)의 합성
DCE (10 mL) 내 N-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-3-(피페라진-1-일)벤즈아미드 (300 mg, 850.30 μmol, HCl) 용액에 tert-부틸 (4-포르밀피페리딘-1-일)카바메이트 (240 mg, 1.05 mmol) 및 NaOAc (100 mg, 1.22 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 25 °C 에서 1시간 동안 교반한 후, NaBH(OAc)3 (700 mg, 3.30 mmol)를 25 °C 에서 첨가하고 생성된 혼합물을 25 °C 에서 15시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 피크(78%)를 확인하였다. 반응 혼합물을 0 °C 에서 H2O (10 mL)로 희석하고 0 °C 에서 포화 NaHCO3로 pH 9 근처로 조정한 후, EtOAc 60 mL (20 mL x 3)로 추출하였다. 합쳐진 유기상을 염수 (30 mL x 3)로 세척하고, 무수 소듐 설페이트로 건조하고, 여과하였다. 여과물을 감압 농축하였다. 잔여물을 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (Biotage; 10 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, Eluent of 0 ~ 25% MeOH : EtOAc gradient, 60 mL/분)로 정제하고 밝은 황색 고체의 tert-부틸 (4-((4-(3-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)카바모일)페닐)피페라진-1-일)메틸)피페리딘-1-일)카바메이트 (160 mg, 302.66 μmol, 35.59% 수율)를 수득하였다. MS(M+H)+ = 529.3
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ = 10.89 (s, 1H), 8.70 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.98 - 7.74 (m, 1H), 7.43 - 7.34 (m, 1H), 7.32 - 7.22 (m, 2H), 7.10 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 4.82 - 4.73 (m, 1H), 3.56 - 3.33 (m, 4H), 3.23 - 3.17 (m, 4H), 2.90 - 2.83 (m, 2H), 2.82 - 2.74 (m, 1H), 2.59 - 2.53 (m, 1H), 2.46 - 2.41 (m, 2H), 2.18 - 2.13 (m, 2H), 2.03 - 1.96 (m, 1H), 1.86 - 1.85 (m, 1H), 1.73 - 1.65 (m, 2H), 1.42 (s, 1H), 1.38 (s, 9H), 1.21 - 1.11 (m, 2H).
단계 2. 3-(4-((1-아미노피페리딘-4-일)메틸)피페라진-1-일)-N-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)벤즈아미드 (3)의 합성
DCM (6 mL) 내 tert-부틸 (4-((4-(3-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)카바모일)페닐)피페라진-1-일)메틸)피페리딘-1-일)카바메이트 (150 mg, 283.75 μmol) 용액에 TFA (8 mL)를 첨가하였다. 혼합물을 25 °C 에서 2시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 주 피크를 확인하였다. 반응 혼합물을 감압 농축하여 황색 오일의 3-(4-((1-아미노피페리딘-4-일)메틸)피페라진-1-일)-N-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)벤즈아미드 (150 mg, crude, 2TFA)를 수득하였다. MS(M+H)+ = 429.2
단계 3. 4-((9-시클로펜틸-7,7-디플루오로-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(4-((4-(3-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)카바모일)페닐)피페라진-1-일)메틸)피페리딘-1-일)-3-메톡시벤즈아미드 (화합물 9)의 합성
DMF (2 mL) 내 4-((9-시클로펜틸-7,7-디플루오로-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-3-메톡시벤조산 (60 mg, 134.10 μmol) 용액에 EDCI (50 mg, 260.82 μmol), HOBt (30 mg, 222.02 μmol), DIPEA (148.40 mg, 1.15 mmol, 200 μL) 및 3-(4-((1-아미노피페리딘-4-일)메틸)피페라진-1-일)-N-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)벤즈아미드 (100 mg, 152.31 μmol, 2TFA 염)를 25 °C에서 첨가하였다. 혼합물을 25 °C 에서 16시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 피크(58%)를 확인하였다. 혼합물을 여과하고 여과물을 prep-HPLC (컬럼: Phenomenex Synergi Polar-RP 100 x 25 mm x 4μm; 이동상: [water (TFA) - ACN]; B%: 27% - 47%, 7 분; 컬럼 온도: 30 °C)로 정제하고 용출물을 동결 건조하여 백색 고체의 4-((9-시클로펜틸-7,7-디플루오로-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(4-((4-(3-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)카바모일)페닐)피페라진-1-일)메틸)피페리딘-1-일)-3-메톡시벤즈아미드 (45.7 mg, 45.61 μmol, 34.01% 수율, 97% 순도, TFA 염)를 수득하였다. MS(M+H)+ = 858.4
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ = 8.16 (s, 1H), 8.13 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.59 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 7.55 - 7.51 (m, 2H), 7.47 - 7.41 (m, 2H), 7.29 - 7.23 (m, 1H), 5.11 - 5.03 (m, 1H), 4.92 - 4.90 (m, 1H), 4.18 (t, J = 12.2 Hz, 2H), 4.03 (s, 3H), 4.00 - 3.84 (m, 2H), 3.83 - 3.66 (m, 2H), 3.42 (s, 3H), 3.28 - 3.17 (m, 6H), 2.87 - 2.70 (m, 4H), 2.27 - 2.20 (m, 2H), 2.14 - 2.01 (m, 3H), 2.01 - 1.81 (m, 5H), 1.81 - 1.55 (m, 7H).
실시예 10. 4-((9-시클로펜틸-7,7-디플루오로-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(4-(2-(4-(3-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)카바모일)페닐)피페라진-1-일)에틸)피페리딘-1-일)-3-메톡시벤즈아미드 (화합물 10)의 합성
단계 1. tert-부틸 (4-(2-(4-(3-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)카바모일)페닐)피페라진-1-일)에틸)피페리딘-1-일)카바메이트 (2)의 합성
DMF (8 mL) 내 N-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-3-(피페라진-1-일)벤즈아미드 (400 mg, 1.13 mmol, HCl) 용액에 DIPEA (890.43 mg, 6.89 mmol, 1.20 mL), KI (100 mg, 602.40 μmol) 및 2-(1-((tert-부톡시카보닐)아미노)피페리딘-4-일)에틸4-메틸벤젠설포네이트 (600.02 mg, 1.51 mmol)를 25 °C 에서 첨가하였다. 혼합물을 60 °C 에서 16시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 피크(30%)를 확인하였다. 반응 혼합물을 H2O (10 mL)로 희석하고 EtOAc (30 mL x 2)로 추출하였다. 합쳐진 유기상을 염수 (30 mL x 3)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조하고, 여과하고 여과물을 감압 농축하였다. 잔여물을 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (Biotage; 10 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, Eluent of 0 ~ 25% MeOH: EtOAc gradient, 60 mL/분)로 정제하여 밝은 황색 고체의 tert-부틸 (4-(2-(4-(3-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)카바모일)페닐)피페라진-1-일)에틸)피페리딘-1-일)카바메이트 (200 mg, 368.55 μmol, 32.51% 수율)를 수득하였다. MS(M+H)+ = 543.5
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ = 10.89 (s, 1H), 8.70 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.99 - 7.76 (m, 1H), 7.39 (s, 1H), 7.34 - 7.25 (m, 2H), 7.17 - 7.05 (m, 1H), 4.85 - 4.69 (m, 1H), 3.36 - 3.35 (m, 4H), 3.19 - 3.16 (m, 4H), 2.89 - 2.75 (m, 3H), 2.59 - 2.55 (m, 1H), 2.45 - 2.38 (m, 2H), 2.36 - 2.30 (m, 2H), 2.17 - 2.06 (m, 1H), 2.01 - 1.94 (m, 1H), 1.68 - 1.60 (m, 2H), 1.44 - 1.39 (m, 2H), 1.37 (s, 9H), 1.24 - 1.15 (m, 3H).
단계 2. 3-(4-(2-(1-아미노피페리딘-4-일)에틸)피페라진-1-일)-N-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)벤즈아미드 (3)의 합성
디옥산 (5 mL) 내 tert-부틸 (4-(2-(4-(3-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)카바모일)페닐)피페라진-1-일)에틸)피페리딘-1-일)카바메이트 (180 mg, 331.69 μmol) 용액에 HCl/디옥산 (4 M, 10 mL)을 첨가하였다. 혼합물을 25 °C 에서 16시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 피크(84%)를 확인하였다. 반응 혼합물을 감압 농축하여 밝은 황색 고체의 3-(4-(2-(1-아미노피페리딘-4-일)에틸)피페라진-1-일)-N-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)벤즈아미드 (160 mg, crude, 2HCl 염)를 수득하였다. MS(M+H)+ = 443.4
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ = 10.86 (s, 1H), 10.84 - 10.70 (m, 1H), 8.76 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.46 (s, 1H), 7.38 (d, J = 4.9 Hz, 2H), 7.23 - 7.17 (m, 1H), 4.80 - 4.72 (m, 1H), 3.97 - 3.79 (m, 3H), 3.24 - 2.99 (m, 8H), 2.91 - 2.73 (m, 2H), 2.59 - 2.56 (m, 1H), 2.19 - 2.11 (m, 1H), 2.05 - 1.93 (m, 2H), 1.87 - 1.66 (m, 4H), 1.50 - 1.22 (m, 3H).
단계 3. 4-((9-시클로펜틸-7,7-디플루오로-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(4-(2-(4-(3-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)카바모일)페닐)피페라진-1-일)에틸)피페리딘-1-일)-3-메톡시벤즈아미드 (화합물 10)의 합성
DMF (2 mL) 내 4-((9-시클로펜틸-7,7-디플루오로-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-3-메톡시벤조산 (60 mg, 134.10 μmol) 용액에 HATU (70 mg, 184.10 μmol), DIPEA (111.30 mg, 861.17 μmol, 150 μL) 및 3-(4-(2-(1-아미노피페리딘-4-일)에틸)피페라진-1-일)-N-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)벤즈아미드 (80 mg, 155.20 μmol, 2HCl 염)를 25 °C 에서 첨가하였다. 혼합물을 25 °C 에서 16시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 피크(40%)를 확인하였다. 혼합물을 여과하고 여과물을 prep-HPLC (컬럼: Phenomenex Synergi Polar-RP 100 x 25mm x 4μm; 이동상: [water (TFA) -ACN]; B%: 28% - 48%, 7 분; 컬럼 온도: 30 °C)로 정제하고 prep-HPLC (컬럼: Waters Xbridge 150 x 25mm x 5μm; 이동상: [water (NH4HCO3) -ACN]; B%: 28% - 66%, 9 분; 컬럼 온도: 30 °C)로 재정제하고, 용출물을 동결 건조하여 백색 고체의 4-((9-시클로펜틸-7,7-디플루오로-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(4-(2-(4-(3-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)카바모일)페닐)피페라진-1-일)에틸)피페리딘-1-일)-3-메톡시벤즈아미드 (30.7 mg, 33.80 μmol, 25.20% 수율, 96% 순도)를 수득하였다. MS(M+H)+ = 872.7
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ = 10.87 (s, 1H), 9.39 - 9.19 (m, 1H), 8.77 - 8.60 (m, 1H), 8.36 - 8.16 (m, 2H), 7.97 (s, 1H), 7.49 - 7.36 (m, 3H), 7.34 - 7.27 (m, 2H), 7.15 - 7.09 (m,1H), 4.83 - 4.72 (m, 2H), 4.12 - 4.00 (m, 2H), 3.93 (s, 3H), 3.33 - 3.32 (m, 3H), 3.24 - 3.17 (m 4H), 3.06 - 2.98 (m, 2H), 2.84 - 2.73 (m, 3H), 2.58 - 2.53 (m, 5H), 2.42 - 2.35 (m, 2H), 2.18 - 2.09 (m, 1H), 2.01 - 1.90 (m, 3H), 1.76 - 1.57 (m, 8H), 1.48 - 1.26 (m, 5H).
실시예 11. 4-((9-시클로펜틸-7,7-디플루오로-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(3-(2-(4-(3-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)카바모일)페닐)피페라진-1-일)에틸)피롤리딘-1-일)-3-메톡시벤즈아미드 (화합물 11)의 합성
단계 1. tert-부틸 (4-((4-(3-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)카바모일)페닐)피페라진-1-일)메틸)피페리딘-1-일)카바메이트(2A) 및 tert-부틸 (3-(2-(4-(3-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)카바모일)페닐)피페라진-1-일)에틸)피롤리딘-1-일)카바메이트 (2B)의 합성
DMF (8 mL) 내 N-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-3-(피페라진-1-일)벤즈아미드 (500 mg, 1.42 mmol, HCl) 용액에 KI (60 mg, 361.44 μmol), DIPEA (1.04 g, 8.04 mmol, 1.4 mL) 및 (1-((tert-부톡시카보닐)아미노)피페리딘-4-일)메틸 4-메틸벤젠설포네이트 (500.00 mg, 1.30 mmol)를 25 °C 에서 첨가하였다. 혼합물을 60 °C N2 기체 하에서 16시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 주 피크를 확인하였다. 반응 혼합물을 H2O (10 mL)로 희석하고 EtOAc (30 mL x 2)로 추출하였다. 합쳐진 유기상을 염수 (30 mL x 3)로 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하고 여과물을 감압 농축하였다. 잔여물을 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (Biotage; 10 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, Eluent of 0 ~ 25% MeOH : EtOAc gradient, 60 mL/분)로 정제하여 밝은 황색 고체의 tert-부틸 (4-((4-(3-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)카바모일)페닐)피페라진-1-일)메틸)피페리딘-1-일)카바메이트 (130 mg, 245.91 μmol, 17.35% 순도) 및 밝은 황색 고체의 tert-부틸 (3-(2-(4-(3-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)카바모일)페닐)피페라진-1-일)에틸)피롤리딘-1-일)카바메이트 (260 mg, 491.83 μmol, 34.70% 수율)를 수득하였고 2D NMR로 확인하였다. MS(M+H)+ = 529.5
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ = 10.87 (s, 1H), 8.69 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.88 (s, 1H), 7.39 (s, 1H), 7.33 - 7.22 (m, 2H), 7.13 - 7.07 (m, 1H), 4.82 - 4.70 (m, 1H), 3.40 - 3.35 (m, 4H), 3.19 - 3.16 (m, 4H), 2.93 (t, J = 8.1 Hz, 1H), 2.87 - 2.77 (m, 2H), 2.77 - 2.72 (m, 1H), 2.58 - 2.53 (m, 1H), 2.49 - 2.44 (m, 2H), 2.35 - 2.24 (m, 2H), 2.16 - 2.01 (m, 2H), 1.96 - 1.90 (m, 1H), 1.54 - 1.46(m, 2H), 1.37 (s, 9H), 1.34 -1.24 (m, 1H).
단계 2. 3-(4-(2-(1-아미노피롤리딘-3-일)에틸)피페라진-1-일)-N-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)벤즈아미드 (3)의 합성
디옥산 (10 mL) 내 tert-부틸 (3-(2-(4-(3-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)카바모일)페닐)피페라진-1-일)에틸)피롤리딘-1-일)카바메이트 (150 mg, 283.75 μmol) 용액에 HCl/디옥산 (4 M, 10 mL)를 첨가하였다. 혼합물을 25 °C 에서 3시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 주 피크를 확인하였다. 반응 혼합물을 감압 농축하여 밝은 황색 고체의 3-(4-(2-(1-아미노피롤리딘-3-일)에틸)피페라진-1-일)-N-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)벤즈아미드 (130 mg, crude, 2HCl 염)를 수득하였다. MS(M+H)+ = 429.2
단계 3. 4-((9-시클로펜틸-7,7-디플루오로-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(3-(2-(4-(3-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)카바모일)페닐)피페라진-1-일)에틸)피롤리딘-1-일)-3-메톡시벤즈아미드 (화합물 11)의 합성
DMF (2 mL) 내 4-((9-시클로펜틸-7,7-디플루오로-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-3-메톡시벤조산 (80 mg, 178.80 μmol) 용액에 EDCI (60 mg, 312.99 μmol), HOBt (30 mg, 222.02 μmol) 및 3-(4-(2-(1-아미노피롤리딘-3-일)에틸)피페라진-1-일)-N-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)벤즈아미드 (100.00 mg, 199.43 μmol, 2HCl 염)를 25 °C 에서 첨가하였다. 혼합물을 25 °C 에서 16시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 피크(57%)를 확인하였다. 혼합물을 여과하고 여과물을 prep-HPLC (컬럼: Phenomenex Synergi Polar-RP 100 x 25 mm x 4μm; 이동상: [water (TFA) - ACN]; B%: 28% - 48%, 7분; 컬럼 온도: 30 °C)로 정제하여 백색 고체의 4-((9-시클로펜틸-7,7-디플루오로-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(3-(2-(4-(3-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)카바모일)페닐)피페라진-1-일)에틸)피롤리딘-1-일)-3-메톡시벤즈아미드 (78.5 mg, 77.53 μmol, 43.36% 수율, 96% 순도, TFA 염)를 수득하였다. MS(M+H)+ = 858.4
1H NMR (400 MHz, MeOD) δ = 8.24 - 8.11 (m, 2H), 7.61 - 7.50 (m, 3H), 7.49 - 7.39 (m, 2H), 7.31 - 7.23 (m, 1H), 5.10 - 5.01 (m, 1H), 4.98 - 4.91 (m, 1H), 4.23 - 4.12 (m 2H), 4.02 (s, 3H), 3.99 - 3.61 (m, 4H), 3.42 (s, 3H), 3.38 - 3.33 (m, 4H), 3.32 - 3.26 (m, 4H), 3.25 - 3.15 (m, 2H), 3.09 - 3.00 (m, 1H), 2.92 - 2.81 (m, 1H), 2.78 - 2.70 (m, 1H), 2.53 - 2.41 (m, 1H), 2.31 - 2.18 (m, 3H), 2.09 - 1.97 (m, 4H), 1.89 - 1.79 (m, 2H), 1.77 - 1.68 (m, 4H).
실시예 12. 4-((9-시클로펜틸-7,7-디플루오로-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(4-((4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)카바모일)-2-플루오로페닐)피페라진-1-일)메틸)피페리딘-1-일)-3-메톡시벤즈아미드 (화합물 12)의 합성
단계 1. tert-부틸 4-(2-플루오로-4-(메톡시카보닐)페닐)피페라진-1-카복실레이트 (3)의 합성
DMSO (20 mL) 내 메틸 3,4-디플루오로벤조에이트 (2 g, 11.62 mmol) 및 tert-부틸 피페라진-1-카복실레이트 (2.60 g, 13.94 mmol) 용액에 K2CO3 (3.21 g, 23.24 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 100 °C 에서 16시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 주 피크를 확인하였다. 반응 혼합물을 염수 (50 mL)로 희석하고 EtOAc (50 mL Х 3)로 추출하였다. 합쳐진 유기상을 염수 (30 mL x 2)로 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하고 감압 농축하였다. 잔여물을 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (Biotage; 10 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, Eluent of 10~65% EtOAc/석유 에터 @ 40 mL/분)로 정제하여 백색 고체의 tert-부틸 4-(2-플루오로-4-(메톡시카보닐)페닐)피페라진-1-카복실레이트 (3 g, 8.69 mmol, 74.78% 수율, 98% 순도)를 수득하였다. MS(M+H)+=338.8
단계 2. 4-(4-(tert-부톡시카보닐)피페라진-1-일)-3-플루오로벤조산 (4)의 합성
THF (30 mL) 및 H2O (10 mL) 내 tert-부틸 4-(2-플루오로-4-(메톡시카보닐)페닐)피페라진-1-카복실레이트 (3 g, 8.87 mmol) 용액에 LiOH·H2O (744.09 mg, 17.73 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 20 °C 에서 16시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 주 피크(97%)를 확인하였다. 혼합물을 물 (30 mL)로 희석하였다. 수용상을 HCl (1N)로 pH=6으로 조정하고, EtOAc (40 mL Х 3)로 추출하였다. 합쳐진 유기상을 Na2SO4로 건조하고, 여과하고 감압 농축하여 백색 고체의 4-(4-(tert-부톡시카보닐)피페라진-1-일)-3-플루오로벤조산 (2.8 g, crude)을 수득하였다. MS(M-100+H)+=225.1
단계 3. tert-부틸 4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)카바모일)-2-플루오로페닐)피페라진-1-카복실레이트 (6)의 합성
DMF (40 mL) 내 4-(4-(tert-부톡시카보닐)피페라진-1-일)-3-플루오로벤조산 (2.6 g, 8.02 mmol), 3-아미노피페리딘-2,6-디온 (1.45 g, 8.82 mmol, HCl 염) 용액에 EDCI (2.31 g, 12.02 mmol), HOBt (1.62 g, 12.02 mmol), DIPEA (3.11 g, 24.05 mmol, 4.19 mL)를 첨가하고, 혼합물을 20 °C 에서 16시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 주 피크를 확인하였다. 반응 혼합물을 염수 (100 mL)로 희석하고 EtOAc (100 mL x 3)로 추출하였다. 합쳐진 유기상을 염수 (100 mL x 2)로 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하고 감압 농축하였다. 잔여물을 MTBE (20 mL)로 20 oC 에서 10분간 분쇄하여 백색 고체의 tert-부틸 4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)카바모일)-2-플루오로페닐)피페라진-1-카복실레이트 (3 g, 6.70 mmol, 83.56% 수율, 97% 순도)를 수득하였다. MS(M+H)+=435.2
단계 4. N-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-3-플루오로-4-(피페라진-1-일)벤즈아미드 (7)의 합성
디옥산 (2 mL) 내 tert-부틸 4-[4-[(2,6-디옥소-3-피페리딜)카바모일]-2-플루오로-페닐]피페라진-1-카복실레이트 (200 mg, 460.34 μmol) 용액에 HCl/디옥산 (4 M, 2 mL)를 첨가하고, 혼합물을 20 °C 에서 1시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 주 피크를 확인하였다. 혼합물을 감압 농축하여 백색 고체의 N-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-3-플루오로-4-(피페라진-1-일)벤즈아미드 (150 mg, crude)를 수득하였고 이를 다음 단계에 바로 사용하였다. MS(M+H)+=335.1
단계 5. tert-부틸 (4-((4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)카바모일)-2-플루오로페닐) 피페라진-1-일)메틸)피페리딘-1-일)카바메이트 (9)의 합성
DCM (4 mL) 내 N-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-3-플루오로-4-(피페라진-1-일)벤즈아미드 (150 mg, 404.52 μmol, HCl 염) 및 tert-부틸 (4-formyl피페리딘-1-일)카바메이트 (92.35 mg, 404.52 μmol), AcOH (12.15 mg, 202.26 μmol, 11.57 μL) 혼합물을 20 °C 에서 1시간 동안 교반하고, NaBH(OAc)3 (257.21 mg, 1.21 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 20 °C 에서 16시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 피크(27%)를 확인하였다. 반응 혼합물을 H2O (10 mL)로 희석하였다. 유기상을 분리하고, 수용상을 EtOAc (10 mL Х 3)로 추출하였다. 합쳐진 유기상을 염수 (20 mL x 2)로 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하였다. 여과물을 감압 농축하였다. 잔여물을 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (ISCO®; 40 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, Eluent of 5~20 % Ethylacetate/MeOH @ 100 mL/분)로 정제하여 황색 고체의 tert-부틸 (4-((4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)카바모일)-2-플루오로페닐) 피페라진-1-일)메틸)피페리딘-1-일)카바메이트 (130 mg, 195.01 μmol, 48.21% 수율, 82% 순도)를 수득하였다. MS(M+H)+=547.4
단계 6. 4-(4-((1-아미노피페리딘-4-일)메틸)피페라진-1-일)-N-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-3-플루오로벤즈아미드 (10)의 합성
DCM (5 mL) 내 tert-부틸 (4-((4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)카바모일)-2-플루오로페닐)피페라진-1-일)메틸)피페리딘-1-일)카바메이트 (130 mg, 237.82 μmol) 용액에 TFA (1.54 g, 13.51 mmol, 1 mL)를 첨가하고, 혼합물을 20 °C 에서 30분간 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 주 피크를 확인하였다. 반응 혼합물을 진공 농축하여 갈색 고체의 4-(4-((1-아미노피페리딘-4-일)메틸)피페라진-1-일)-N-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-3-플루오로벤즈아미드 (100 mg, crude, TFA 염)를 수득하였다. MS(M+H)+=447.3
단계 7. 4-((9-시클로펜틸-7,7-디플루오로-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(4-((4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)카바모일)-2-플루오로페닐)피페라진-1-일)메틸)피페리딘-1-일)-3-메톡시벤즈아미드 (화합물 12)의 합성
DMF (2 mL) 내 4-((9-시클로펜틸-7,7-디플루오로-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-3-메톡시벤조산 (79.82 mg, 178.40 μmol) 용액에 HATU (101.75 mg, 267.60 μmol) 및 DIPEA (69.17 mg, 535.20 μmol, 93.22 μL)를 첨가하고, 혼합물을 20 °C 에서 1시간 동안 교반 하였다. 4-(4-((1-아미노피페리딘-4-일)메틸)피페라진-1-일)-N-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-3-플루오로벤즈아미드 (100 mg, 178.40 μmol, TFA 염)를 첨가하고 생성된 혼합물을 20 °C 에서 2시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 주 피크를 확인하였다. 반응 혼합물을 염수 (10 mL)로 희석하고 EtOAc (10 mL x 3)로 추출하였다. 합쳐진 유기상을 염수 (20 mL x 2)로 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하였다. 여과물을 감압 농축하였다. 잔여물을 prep-TLC (SiO2, DCM: MeOH = 10:1)로 정제하고 역상 HPLC (컬럼: Waters Xbridge 150 x 25 mm x 5μm;이동상: [water (NH4HCO3) - ACN]; B%: 37% - 67%, 9 분)로 재정제하였다. 용출물을 동결 건조하여 백색 고체의 4-((9-시클로펜틸-7,7-디플루오로-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(4-((4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)카바모일)-2-플루오로페닐)피페라진-1-일)메틸)피페리딘-1-일)-3-메톡시벤즈아미드 (41 mg, 42.13 μmol, 23.61% 수율, 90% 순도)를 수득하였다. MS(M+H)+=876.5
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ = 10.85 (s, 1H), 9.31 (s, 1H), 8.66 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 8.31 - 8.23 (m, 2H), 7.96 (s, 1H), 7.69 - 7.59 (m, 2H), 7.46 - 7.38 (m, 2H), 7.09 (t, J = 8.7 Hz, 1H), 4.82 - 4.70 (m, 2H), 4.04 (t, J = 14.1 Hz, 2H), 3.93 (s, 3H), 3.33 (s, 3H), 3.18 - 3.09 (m, 4H), 3.06 - 2.98 (m, 2H), 2.88 - 2.72 (m, 3H), 2.58 - 2.52 (m, 5H), 2.27 - 2.18 (m, 2H), 2.16 - 2.04 (m, 1H), 2.01 - 1.88 (m, 3H), 1.82 - 1.66 (m, 4H), 1.65 - 1.51 (m, 5H), 1.34 - 1.16 (m, 2H).
실시예 13. 4-((9-시클로펜틸-7,7-디플루오로-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(1-(3-(4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)페닐)피페라진-1-일)프로파노일)피페리딘-4-일)-3-메톡시벤즈아미드 (화합물 13)의 합성
단계 1. tert-부틸 4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)페닐)피페라진-1-카복실레이트 (2)의 합성
DMF (10 mL) 내 tert-부틸 4-(4-아미노페닐)피페라진-1-카복실레이트 (1 g, 3.61 mmol) 용액에 3-브로모피페리딘-2,6-디온 (761.50 mg, 3.97 mmol) 및 DIPEA (1.40 g, 10.82 mmol, 1.88 mL)를 첨가하고, 혼합물을 80 ℃에서 16시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 주 피크를 확인하였다. 혼합물을 물 (3 mL)로 희석하고 EtOAc (5 mL x 3)로 추출하였다. 유기상을 Na2SO4로 건조하고, 여과하고 진공 농축하였다. 조 생성물을 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (Biotage, 4 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, Eluent of 4~80% EtOAc/석유 에터 gradient @ 20 mL/분)로 정제하여 갈색 파우더의 tert-부틸 4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)페닐)피페라진-1-카복실레이트 (0.96 g, 2.08 mmol, 57.58% 수율, 84% 순도)를 수득하였다. MS(M+H)+=388.9
단계 2. 3-((4-(피페라진-1-일)페닐)아미노)피페리딘-2,6-디온 (3)의 합성
디옥산 (8 mL) 내 tert-부틸 4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)페닐)피페라진-1-카복실레이트 (500 mg, 1.29 mmol) 용액에 HCl/디옥산 (4 M, 321.78 μL)을 첨가하고, 혼합물을 25 ℃에서 2시간 동안 교반 하였다. LCMS로 출발물질이 완전히 소모되었음 및 원하는 질량의 주 피크를 확인하였다. 혼합물을 진공 농축하여 갈색 파우더의 3-((4-(피페라진-1-일)페닐)아미노)피페리딘-2,6-디온 (550 mg, crude)을 수득하였다. MS(M+H)+=288.9
단계 3. tert-부틸 (1-(3-(4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)페닐)피페라진-1-일)프로파노일)피페리딘-4-일)카바메이트 (4)의 합성
DMF (15 mL) 내 3-((4-(피페라진-1-일)페닐)아미노)피페리딘-2,6-디온 (550 mg, 1.69 mmol, HCl) 용액에 tert-부틸 (1-(3-클로로프로파노일)피페리딘-4-일)카바메이트 (541.63 mg, 1.86 mmol), DIPEA (656.55 mg, 5.08 mmol, 884.84 μL) 및 KI (56.22 mg, 338.66 μmol)를 첨가하고, 혼합물을 80 ℃에서 16시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 피크(40%)를 확인하였다. 혼합물을 물 (3 mL)로 희석하고 EtOAc (5 mL x 3)로 추출하였다. 유기상을 Na2SO4로 건조하고, 여과하고 진공 농축하였다. 조 생성물을 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (Biotage, 4 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, Eluent of 4~80% EtOAc/석유 에터 gradient @ 20 mL/분)로 정제하여 갈색 파우더의 tert-부틸 (1-(3-(4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)페닐)피페라진-1-일)프로파노일)피페리딘-4-일)카바메이트 (260 mg, 354.54 μmol, 20.94% 수율, 74% 순도)를 수득하였다. MS(M+H)+=543.1
단계 4. 3-((4-(4-(3-(4-아미노피페리딘-1-일)-3-옥소프로필)피페라진-1-일)페닐)아미노)피페리딘-2,6-디온 (5)의 합성
디옥산 (6 mL) 내 tert-부틸 (1-(3-(4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)페닐)피페라진-1-일)프로파노일)피페리딘-4-일)카바메이트 (260 mg, 479.11 μmol) 용액에 HCl/디옥산 (4 M, 6 mL)를 첨가하고, 혼합물을 25 ℃에서 1시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 주 피크를 확인하고 혼합물을 진공 농축하여 녹색 파우더의 3-((4-(4-(3-(4-아미노피페리딘-1-일)-3-옥소프로필)피페라진-1-일)페닐)아미노)피페리딘-2,6-디온 (300 mg, crude, HCl)을 수득하였다. MS(M+H)+=443.0
단계 5. 4-((9-시클로펜틸-7,7-디플루오로-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(1-(3-(4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)페닐)피페라진-1-일)프로파노일)피페리딘-4-일)-3-메톡시벤즈아미드 (화합물 13)의 합성
DMF (2 mL) 내 4-((9-시클로펜틸-7,7-디플루오로-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-3-메톡시벤조산 (100 mg, 223.50 μmol) 용액에 HATU (127.47 mg, 335.24 μmol) 및 DIPEA (86.66 mg, 670.49 μmol, 116.79 μL)를 첨가한 후, 3-((4-(4-(3-(4-아미노피페리딘-1-일)-3-옥소프로필)피페라진-1-일)페닐)아미노)피페리딘-2,6-디온 (128.47 mg, 268.20 μmol, HCl 염)를 첨가하고 생성된 혼합물을 25 ℃에서 16시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 주 피크를 확인하였다. 혼합물을 물 (5 mL)로 희석하고 EtOAc (10 mL x 3)로 추출하였다. 유기상을 Na2SO4로 건조하고, 여과하고 진공 농축하였다. 조 생성물을 Prep-HPLC (컬럼: Phenomenex Synergi Polar-RP 100*25mm*4 ㎛; 이동상:[water (TFA)-ACN]; B%: 26%-46%, 7 분) 및 Prep-HPLC (컬럼: Waters Xbridge 150*25mm* 5 ㎛;이동상:[water(NH4HCO3)-ACN]; B%: 28%-58%, 8 분)로 정제하고, 용출물을 동결 건조하여 적색 파우더의 4-((9-시클로펜틸-7,7-디플루오로-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(1-(3-(4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)페닐)피페라진-1-일)프로파노일)피페리딘-4-일)-3-메톡시벤즈아미드 (40.4 mg, 44.15 μmol, 19.76% 수율, 95.3% 순도)를 수득하였다. MS(M+H)+=872.1
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ = 10.74 (s, 1 H), 8.33-8.20 (m, 2 H), 8.15 (d, J = 6.75 Hz, 1 H), 7.96 (s, 1 H), 7.56-7.43 (m, 2 H), 6.75 (d, J=7.75 Hz, 2 H), 6.60 (d, J=8.13 Hz, 2 H), 5.37 (d, J=7.00 Hz, 1 H), 4.83-4.70 (m, 1 H), 4.39 (d, J=10.01 Hz, 1 H), 4.18 (s, 1 H), 4.04 (t, J=13.82 Hz, 3 H), 3.99-3.93 (m, 4 H), 3.31 (s, 3 H), 3.22-3.04 (m, 2 H), 2.98-2.93 (m, 4 H), 2.69 (d, J=12.76 Hz, 3 H), 2.63-2.56 (m, 5 H), 2.14-2.06 (m, 1 H), 2.00-1.77 (m, 6 H), 1.76-1.52 (m, 7 H) 1.52-1.35 (m, 2 H).
실시예 14. 4-((9-시클로펜틸-7,7-디플루오로-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(1-(3-(4-(3-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)페닐)피페라진-1-일)프로파노일)피페리딘-4-일)-3-메톡시벤즈아미드 (화합물 14)의 합성
단계 1. tert-부틸 4-(3-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)페닐)피페라진-1-카복실레이트 (3)의 합성
DMF (10 mL) 내 tert-부틸 4-(3-아미노페닐)피페라진-1-카복실레이트 (1 g, 3.61 mmol) 용액에 DIPEA (1.40 g, 10.82 mmol, 1.88 mL) 및 3-브로모피페리딘-2,6-디온 (692.28 mg, 3.61 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 50 °C 에서 16시간 동안 교반 하였다. LCMS로 42%의 출발물질이 남아 있음 및 원하는 질량의 피크(48%)를 확인하였다. 반응 혼합물을 H2O (30 mL)로 희석하고 EtOAc (30 mL x 3)로 추출하였다. 합쳐진 유기상을 염수 (60 mL x 2)로 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하였다. 여과물을 감압 농축하였다. 잔여물을 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (Biotage; 10 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, Eluent of 10~65% EtOAc/석유 에터 @ 40 mL/분)로 정제하여 황색 고체의 tert-부틸 4-(3-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)페닐)피페라진-1-카복실레이트 (450 mg, 1.11 mmol, 30.84% 수율, 96% 순도)를 수득하였다. MS(M+H)+=389.0
단계 2. 3-((3-(피페라진-1-일)페닐)아미노)피페리딘-2,6-디온 (4)의 합성
디옥산 (4 mL) 내 tert-부틸 4-(3-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)페닐)피페라진-1-카복실레이트 (450 mg, 1.16 mmol) 용액에 HCl/디옥산 (4 M, 4 mL)을 첨가하고, 혼합물을 20 °C 에서 10분간 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 주 피크를 확인하였다. 혼합물을 감압 농축하여 백색 고체의 3-((3-(피페라진-1-일)페닐)아미노)피페리딘-2,6-디온 (380 mg, crude, HCl 염)을 수득하였고 이를 다음 단계에 바로 사용하였다. MS(M+H)+=289.0
단계 3. tert-부틸 (1-(3-(4-(3-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)페닐)피페라진-1-일)프로파노일)피페리딘-4-일)카바메이트 (6)의 합성
DMF (5 mL) 내 3-((3-(피페라진-1-일)페닐)아미노)피페리딘-2,6-디온 (200 mg, 615.75 μmol, HCl 염) 용액에 tert-부틸 (1-(3-클로로프로파노일)피페리딘-4-일)카바메이트 (268.58 mg, 923.63 μmol), DIPEA (238.75 mg, 1.85 mmol, 321.76 μL) 및 NaI (9.23 mg, 61.58 μmol)를 첨가하고, 혼합물을 60 °C 에서 24시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 주 피크를 확인하였다. 반응 혼합물을 H2O (15 mL)로 희석하고 EtOAc (15 mL x 3)로 추출하였다. 합쳐진 유기상을 염수 (30 mL x 2)로 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하고 여과물을 감압 농축하였다. 잔여물을 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (Biotage; 10 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, Eluent of 50~100% EtOAc/석유 에터 to 10% MeOH/ EtOAc gradient @ 60 mL/분)로 정제하여 황색 오일의 tert-부틸 (1-(3-(4-(3-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)페닐)피페라진-1-일)프로파노일)피페리딘-4-일)카바메이트 (100 mg, 178.75 μmol, 29.03% 수율, 97% 순도)를 수득하였다. MS(M+H)+=543.3
단계 4. 3-((3-(4-(3-(4-아미노피페리딘-1-일)-3-옥소프로필)피페라진-1-일)페닐)아미노) 피페리딘-2,6-디온 (7)의 합성
디옥산 (4 mL) 내 tert-부틸 (1-(3-(4-(3-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)페닐)피페라진-1-일)프로파노일)피페리딘-4-일)카바메이트 (100 mg, 184.27 μmol) 용액에 HCl/디옥산 (4 M, 4 mL)를 첨가하고, 혼합물을 20 °C 에서 1시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 주 피크를 확인하였다. 혼합물을 감압 농축하여 백색 고체의 3-((3-(4-(3-(4-아미노피페리딘-1-일)-3-옥소프로필)피페라진-1-일)페닐)아미노)피페리딘-2,6-디온 (88 mg, crude, HCl 염)을 수득하였다. MS(M+H)+=443.1
단계 5. 4-((9-시클로펜틸-7,7-디플루오로-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(1-(3-(4-(3-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)페닐)피페라진-1-일)프로파노일)피페리딘-4-일)-3-메톡시벤즈아미드 (화합물 14)의 합성
DMF (2 mL) 내 4-((9-시클로펜틸-7,7-디플루오로-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-3-메톡시벤조산 (74.73 mg, 167.01 μmol) 용액에 HATU (95.25 mg, 250.51 μmol) 및 DIPEA (64.75 mg, 501.03 μmol, 87.27 μL)를 첨가하고, 혼합물을 20 °C 에서 30분간 교반 하였다. 이후 3-((3-(4-(3-(4-아미노피페리딘-1-일)-3-옥소프로필)피페라진-1-일)페닐)아미노)피페리딘-2,6-디온 (80 mg, 167.01 μmol, HCl 염)을 첨가하고 20 °C 에서 16시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 주 피크를 확인하였다. 반응 혼합물을 염수 (10 mL)로 희석하고 EtOAc (10 mL x 3)로 추출하였다. 합쳐진 유기상을 염수 (30 mL x 2)로 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하고 감압 농축하였다. 잔여물을 prep-TLC (SiO2, DCM: MeOH = 10:1)로 정제하고 역상 HPLC (컬럼: Waters Xbridge 150 x 25 mm x 5μm; 이동상: [water (NH4HCO3) - ACN]; B%: 32% - 62%, 8 분)로 재정제하였다. 용출물을 동결 건조하여 백색 고체의 4-((9-시클로펜틸-7,7-디플루오로-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(1-(3-(4-(3-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)페닐)피페라진-1-일)프로파노일)피페리딘-4-일)-3-메톡시벤즈아미드 (50 mg, 55.05 μmol, 32.96% 수율, 96% 순도)를 수득하였다. MS(M+H)+=872.1
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ = 10.77 (s, 1H), 8.31 - 8.24 (m, 2H), 8.17 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.98 (s, 1H), 7.53 - 7.45 (m, 2H), 6.91 (t, J = 8.1 Hz, 1H), 6.31 - 6.10 (m, 3H), 5.63 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 4.84 - 4.69 (m, 1H), 4.45 - 4.27 (m, 2H), 4.13 - 4.00 (m, 3H), 4.00 - 3.90 (m, 4H), 3.33 (s, 3H), 3.18 - 3.02 (m, 5H), 2.81 - 2.53 (m, 11H), 2.15 - 2.04 (m, 1H), 2.00 - 1.79 (m, 5H), 1.76 - 1.67 (m, 2H), 1.66 - 1.55 (m, 4H), 1.54 - 1.34 (m, 2H).
실시예 15. 4-((9-시클로펜틸-7,7-디플루오로-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(1-(3-(4-(3-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)(메틸)아미노)페닐)피페라진-1-일)프로파노일)피페리딘-4-일)-3-메톡시벤즈아미드 (화합물 15)의 합성
단계 1. tert-부틸 4-[3-[(2,6-디옥소-3-피페리딜)아미노]페닐]피페라진-1-카복실레이트 (2)의 합성
DMF (10 mL) 내 tert-부틸 4-(3-아미노페닐)피페라진-1-카복실레이트 (1 g, 3.61 mmol) 용액에 DIPEA (1.40 g, 10.82 mmol, 1.88 mL) 및 tert-부틸 4-(3-아미노페닐)피페라진-1-카복실레이트 (1.09 g, 5.70 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 50 °C 에서 16시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 피크를 확인하였다. 반응 혼합물을 물 (10 mL)로 희석하고 EtOAc (30 mL x 3)로 추출하였다. 합쳐진 유기상을 염수 (20 mL x 2)로 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하고 감압 농축하였다. 잔여물을 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (20 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, Eluent of 20~30% EtOAc/석유 에터 gradient @ 60 mL/분)로 정제하여 황색 고체의 tert-부틸 4-[3-[(2,6-디옥소-3-피페리딜)아미노]페닐]피페라진-1-카복실레이트 (500 mg, 1.29 mmol, 35.70% 수율)를 수득하였다. MS(M+H)+=389.3
단계 2. tert-부틸 4-[3-[(2,6-디옥소-3-피페리딜)-메틸-아미노]페닐]피페라진-1-카복실레이트 (3)의 합성
MeOH (5 mL) 내 tert-부틸 4-[3-[(2, 6-디옥소-3-피페리딜)아미노]페닐]피페라진-1-카복실레이트 (500 mg, 1.29 mmol) 및 HCHO (193.24 mg, 1.93 mmol, 177.28 μL, 37% 순도) 용액에 HOAc (7.73 mg, 128.71 μmol, 7.36 μL) 및 소듐 시아노보로하이드라이드 (121.33 mg, 1.93 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 25 °C 에서 2시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 주 피크를 확인하였다. 반응 혼합물을 감압 농축하여 MeOH를 제거하였다. 잔여물을 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (20 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, Eluent of 40~70% EtOAc/석유 에터 gradient @ 60 mL/분)로 정제하여 백색 고체의 tert-부틸 4-[3-[(2,6-디옥소-3-피페리딜)-메틸-아미노]페닐]피페라진-1-카복실레이트 (300 mg, 693.19 μmol, 53.86% 수율, 93% 순도)를 수득하였다. MS(M+H)+=403.3
단계 3. 3-(메틸(3-(피페라진-1-일)페닐)아미노)피페리딘-2,6-디온 (4)의 합성
디옥산 (1 mL) 내 tert-부틸 4-[3-[(2,6-디옥소-3-피페리딜)-메틸-아미노]페닐]피페라진-1-카복실레이트 (250 mg, 621.14 μmol) 용액에 HCl/디옥산 (4 M, 10.00 mL)를 첨가하였다. 혼합물을 25 °C 에서 16시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 피크를 확인하였다. 반응 혼합물을 농축하여 백색 고체의 3-(메틸(3-(피페라진-1-일)페닐)아미노)피페리딘-2,6-디온 (200 mg, crude, HCl 염)을 수득하였다. MS(M+H)+=303.3
단계 4. tert-부틸 (1-(3-(4-(3-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)(메틸)아미노)페닐)피페라진-1-일)프로파노일)피페리딘-4-일)카바메이트 (7)의 합성
DMF (2 mL) 내 3-(메틸(3-(피페라진-1-일)페닐)아미노)피페리딘-2,6-디온 (200 mg, 661.44 μmol, HCl 염) 용액에 NaI (99.15 mg, 661.44 μmol), DIPEA (427.43 mg, 3.31 mmol, 576.05 μL) 및 tert-부틸 N-[1-(3-클로로프로파노일)-4-피페리딜]카바메이트 (192.34 mg, 661.44 μmol)을 첨가하고 반응혼합물을 80 °C 에서 16시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 피크를 확인하였다. 반응 혼합물을 물 (20 mL)로 희석하고 EtOAc (20 mL x 2)로 추출하였다. 합쳐진 유기상을 염수 (10 mL x 2)로 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하고 감압 농축하였다. 잔여물을 prep-HPLC (컬럼: Phenomenex luna C18 150 x 40 mm x 15μm; 이동상: [water (TFA) -ACN]; B%: 13% - 43%, 10 분)로 정제하고 용출물을 동결 건조 하여 백색 고체의 tert-부틸 (1-(3-(4-(3-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)(메틸)아미노)페닐)피페라진-1-일)프로파노일)피페리딘-4-일)카바메이트 (160 mg, 287.41 μmol, 43.45% 수율)를 수득하였다. MS(M+H)+=557.1
단계 5. 3-((3-(4-(3-(4-아미노피페리딘-1-일)-3-옥소프로필)피페라진-1-일)페닐)(메틸)아미노)피페리딘-2,6-디온 (8)의 합성
DCM (1 mL) 내 tert-부틸 (1-(3-(4-(3-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)(메틸)아미노)페닐)피페라진-1-일)프로파노일)피페리딘-4-일)카바메이트 (80 mg, 143.71 μmol) 용액에 TFA (262.17 mg, 2.30 mmol, 170.24 μL)을 첨가하였다. 혼합물을 25 °C 에서 1시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 피크를 확인하였다. 반응 혼합물을 감압 농축하여 황색 고체의 3-((3-(4-(3-(4-아미노피페리딘-1-일)-3-옥소프로필)피페라진-1-일)페닐)(메틸)아미노)피페리딘-2,6-디온 (65 mg, crude, TFA 염)을 수득하였다. MS(M+H)+ = 457.1
단계 6. 4-((9-시클로펜틸-7,7-디플루오로-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(1-(3-(4-(3-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)(메틸)아미노)페닐)피페라진-1-일)프로파노일)피페리딘-4-일)-3-메톡시벤즈아미드 (화합물 15)의 합성
DMF (1 mL) 내 3-((3-(4-(3-(4-아미노피페리딘-1-일)-3-옥소프로필)피페라진-1-일)페닐)(메틸)아미노)피페리딘-2,6-디온 (65 mg, 142.36 μmol, TFA) 용액에 HATU (64.96 mg, 170.84 μmol), DIPEA (92.00 mg, 711.81 μmol, 123.99 μL) 및 4-((9-시클로펜틸-7,7-디플루오로-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-3-메톡시벤조산 (63.70 mg, 142.36 μmol)을 첨가하였다. 혼합물을 25 °C 에서 1시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 피크를 확인하였다. 반응 혼합물을 prep-HPLC (컬럼: Waters Xbridge 150 x 25 mm x 5μm; 이동상: [water (NH4HCO3) -ACN]; B%: 36% - 66%, 8 분)로 정제하고 용출물을 동결 건조하여 백색 고체의 4-((9-시클로펜틸-7,7-디플루오로-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(1-(3-(4-(3-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)(메틸)아미노)페닐)피페라진-1-일)프로파노일)피페리딘-4-일)-3-메톡시벤즈아미드 (32 mg, 33.95 μmol, 23.85% 수율, 94% 순도)를 수득하였다. MS(M+H)+=886.6
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ = 10.76 (s, 1H), 8.32 - 8.24 (m, 2H), 8.15 (br d, J=7.70 Hz, 1H), 7.96 (s, 1H), 7.53 - 7.44 (m, 2H), 6.99 (t, J=8.13 Hz, 1H), 6.36 - 6.22 (m, 3H), 4.99 - 4.72 (m, 1H), 4.81 - 4.71 (m, 1H), 4.39 (br d, J=12.23 Hz, 1H), 4.04 (br t, J=14.00 Hz, 3H), 3.98 - 3.90 (m, 4H), 3.27 (s, 3H), 3.17 - 3.08 (m, 5H), 2.91 - 2.77 (m, 1H), 2.77 - 2.55 (m, 13H), 2.31 - 2.22 (m, 1H), 2.02 - 1.81 (m, 5H) 1.77 - 1.66 (m, 2H), 1.65 - 1.55 (m, 4H), 1.51 - 1.33 (m, 2H).
실시예 16. 4-((9-시클로펜틸-7,7-디플루오로-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(1-(3-(4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)(메틸)아미노)-2-플루오로페닐)피페라진-1-일)프로파노일)피페리딘-4-일)-3-메톡시벤즈아미드 (화합물 16)의 합성
단계 1. tert-부틸 4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)-2-플루오로페닐)피페라진-1-카복실레이트 (2)의 합성
DMF (20 mL) 내 tert-부틸 4-(4-아미노-2-플루오로페닐)피페라진-1-카복실레이트 (1 g, 3.39 mmol) 교반액에 3-브로모피페리딘-2,6-디온 (1.95 g, 10.16 mmol) 및 NaHCO3 (2.84 g, 33.86 mmol, 1.32 mL)을 첨가하고, 혼합물을 85 °C 에서 16시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 주 피크를 확인하였다. 반응 혼합물을 염수 (60 mL)로 세척하고, EtOAc (50 mL Х 5)로 추출하였다. 합쳐진 유기상을 염수 (200 mL x 2)로 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하였다. 여과물을 감압 농축하였다. 잔여물을 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (Biotage; 20 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, Eluent of 20~70% EtOAc/석유 에터 to 10% MeOH/ EtOAc gradient @ 40 mL/분)로 정제하여 청색 고체의 tert-부틸 4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)-2-플루오로페닐)피페라진-1-카복실레이트 (670 mg, 1.57 mmol, 46.25% 수율, 95% 순도)를 수득하였다. MS(M+H)+=406.9
단계 2. tert-부틸 4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)(메틸)아미노)-2-플루오로페닐) 피페라진-1-카복실레이트 (3)의 합성
MeOH (10 mL) 내 tert-부틸 4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)-2-플루오로페닐)피페라진-1-카복실레이트 (620 mg, 1.53 mmol) 및 포름알데히드 (185.68 mg, 2.29 mmol, 170.35 μL, 37% 순도) 용액에 아세트산 (9.16 mg, 152.54 μmol, 8.72 μL)를 첨가하고, 반응물을 20 °C 에서 30분간 교반 하였다. NaBH3CN (143.79 mg, 2.29 mmol)을 첨가하고 생성된 혼합물을 20 °C 에서 16시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 주 피크를 확인하였다. 생성된 혼합물을 H2O (20 mL)로 희석하고 EtOAc (20 mL x 3)로 추출하였다. 합쳐진 유기상을 염수 (20 mL x 2)로 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하였다. 여과물을 감압 농축하였다. 잔여물을 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (Biotage; 20 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, Eluent of 20~70% EtOAc/석유 에터@ 40 mL/분)로 정제하여 청색 고체의 tert-부틸 4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)(메틸)아미노)-2-플루오로페닐) 피페라진-1-카복실레이트 (200 mg, 437.60 μmol, 28.69% 수율, 92% 순도)를 수득하였다. MS(M+H)+=420.8
단계 3. 3-((3-플루오로-4-(피페라진-1-일)페닐)(메틸)아미노)피페리딘-2,6-디온 (4)의 합성
디옥산 (2 mL) 내 tert-부틸 4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)(메틸)아미노)-2-플루오로페닐)피페라진-1-카복실레이트 (100 mg, 237.83 μmol) 용액에 HCl/디옥산 (4 M, 2 mL)을 첨가하고, 혼합물을 20 °C 에서 30분간 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 주 피크를 확인하였다. 혼합물을 감압 농축하여 청색 고체의 3-((3-플루오로-4-(피페라진-1-일)페닐)(메틸)아미노)피페리딘-2,6-디온 (80 mg, crude, HCl 염)을 수득하였다. MS(M+H)+=321.1
단계 4. tert-부틸 (1-(3-(4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)(메틸)아미노)-2-플루오로페닐) 피페라진-1-일)프로파노일)피페리딘-4-일)카바메이트 (6)의 합성
DMF (1 mL) 내 3-((3-플루오로-4-(피페라진-1-일)페닐)(메틸)아미노)피페리딘-2,6-디온 (80 mg, 224.20 μmol, HCl 염) 용액에 tert-부틸 (1-(3-클로로프로파노일)피페리딘-4-일)카바메이트 (97.79 mg, 336.30 μmol) 및 DIPEA (86.93 mg, 672.60 μmol, 117.16 μL)를 첨가하고, 혼합물을 80 °C 에서 16시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 주 피크를 확인하였다. 반응 혼합물을 H2O (3 mL)로 희석하고 EtOAc (3 mL x 3)로 추출하고, 합쳐진 유기상을 염수 (10 mL x 3)로 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하였다. 여과물을 진공 농축하였다. 잔여물을 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (Biotage; 10 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, Eluent of 20~100% EtOAc/석유 에터 to 10% MeOH/ EtOAc gradient @ 40 mL/분)로 정제하여 갈색 고체의 tert-부틸 (1-(3-(4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)(메틸)아미노)-2-플루오로페닐) 피페라진-1-일)프로파노일)피페리딘-4-일)카바메이트 (100 mg, 161.83 μmol, 72.18% 수율, 93% 순도)를 수득하였다. MS(M+H)+=575.4
단계 5. 3-((4-(4-(3-(4-아미노피페리딘-1-일)-3-옥소프로필)피페라진-1-일)-3-플루오로페닐)(메틸)아미노)피페리딘-2,6-디온 (7)의 합성
디옥산 (2 mL) 내 tert-부틸 (1-(3-(4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)(메틸)아미노)-2-플루오로페닐)피페라진-1-일)프로파노일)피페리딘-4-일)카바메이트 (100 mg, 174.01 μmol) 용액에 HCl/디옥산 (4 M, 43.50 μL)을 첨가하고, 혼합물을 20 °C 에서 1시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 주 피크를 확인하였다. 혼합물을 감압 농축하여 백색 고체의 3-((4-(4-(3-(4-아미노피페리딘-1-일)-3-옥소프로필)피페라진-1-일)-3-플루오로페닐)(메틸)아미노)피페리딘-2,6-디온 (80 mg, 156.55 μmol, 89.96% 수율, HCl 염)을 수득하였고 이를 다음 단계에 바로 사용하였다. MS(M+H)+=475.3
단계 6. 4-((9-시클로펜틸-7,7-디플루오로-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(1-(3-(4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)(메틸)아미노)-2-플루오로페닐)피페라진-1-일)프로파노일)피페리딘-4-일)-3-메톡시벤즈아미드 (화합물 16)의 합성
DMF (2 mL) 내 4-((9-시클로펜틸-7,7-디플루오로-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-3-메톡시벤조산 (70.04 mg, 156.55 μmol) 용액에 HATU (89.29 mg, 234.82 μmol) 및 DIPEA (60.70 mg, 469.64 μmol, 81.80 μL)를 첨가하고, 혼합물을 20 °C 에서 30분간 교반 하였다. 3-((4-(4-(3-(4-아미노피페리딘-1-일)-3-옥소프로필)피페라진-1-일)-3-플루오로페닐)(메틸)아미노)피페리딘-2,6-디온 (80 mg, 156.55 μmol, HCl 염)을 첨가하고 생성된 혼합물을 20 °C 에서 1시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 주 피크를 확인하였다. 반응 혼합물을 염수 (5 mL)로 희석하고 EtOAc (5 mL x 3)로 추출하였다. 합쳐진 유기상을 염수 (10 mL x 2)로 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하고 감압 농축하였다. 잔여물을 prep-TLC (SiO2, DCM: MeOH = 10:1)로 정제하고 역상 HPLC (컬럼: Waters Xbridge 150 x 25 mm x 5μm;이동상: [water (NH4HCO3) - ACN]; B%: 30% - 63%, 9 분)로 재정제하였다. 용출물을 동결 건조하여 백색 고체의 4-((9-시클로펜틸-7,7-디플루오로-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(1-(3-(4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)(메틸)아미노)-2-플루오로페닐)피페라진-1-일)프로파노일)피페리딘-4-일)-3-메톡시벤즈아미드 (51.2 mg, 54.94 μmol, 35.09% 수율, 97% 순도)를 수득하였다. MS(M+H)+=904.5
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ = 10.78 (s, 1H), 8.32 - 8.24 (m, 2H), 8.15 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.97 (s, 1H), 7.53 - 7.45 (m, 2H), 6.88 (t, J = 9.6 Hz, 1H), 6.72 - 6.63 (m, 1H), 6.57 - 6.48 (m, 1H), 4.85 - 4.71 (m, 2H), 4.43 - 4.35 (m, 1H), 4.04 (t, J = 13.9 Hz, 3H), 3.98 - 3.89 (m, 4H), 3.31 (s, 3H), 3.19 - 3.08 (m, 1H), 2.93 - 2.77 (m, 5H), 2.73 - 2.63 (m, 5H), 2.59 - 2.54 (m, 7H), 2.31 - 2.20 (m, 1H), 1.98 - 1.80 (m, 5H), 1.77 - 1.52 (m, 7H), 1.51 - 1.34 (m, 2H).
실시예 17. 4-((7,7-디플루오로-9-이소프로필-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(4-((4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)-2-플루오로페닐)피페라진-1-일)메틸)피페리딘-1-일)-3-메톡시벤즈아미드 (화합물 17)의 합성
단계 1. tert-부틸 4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)-2-플루오로페닐)피페라진-1-카복실레이트 (3)의 합성
DMF (40 mL) 내 tert-부틸 4-(4-아미노-2-플루오로페닐)피페라진-1-카복실레이트 (2 g, 6.77 mmol) 혼합물에 3-브로모피페리딘-2,6-디온 (2.60 g, 13.54 mmol) 및 NaHCO3 (2.84 g, 33.86 mmol, 1.32 mL)을 첨가하고, 85 ℃에서 16시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 주 피크를 확인하였다. 반응 혼합물을 염수 (120 mL)로 희석하고 수용상을 EtOAc (120 mL x 3)로 추출하였다. 합쳐진 유기상을 염수 (200 mL x 2)로 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하였다. 여과물을 감압 농축하여 잔여물을 얻었다. 잔여물을 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (Biotage; 20 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, Eluent of 0~60% EtOAc/석유 에터 gradient @ 40 mL/분)로 정제하여 청색 고체의 tert-부틸 4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)-2-플루오로페닐)피페라진-1-카복실레이트 (1 g, 2.46 mmol, 36.33% 수율, 100% 순도)를 수득하였다. MS(M+H)+=407.0
단계 2. 3-((3-플루오로-4-(피페라진-1-일)페닐)아미노)피페리딘-2,6-디온 (4)의 합성
디옥산 (10 mL) 내 tert-부틸 4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)-2-플루오로페닐)피페라진-1-카복실레이트 (1 g, 2.46 mmol) 용액에 HCl/디옥산 (4 M, 10 mL)를 첨가하고, 혼합물을 20 ℃에서 2시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 주 피크를 확인하였다. 혼합물을 진공 농축하여 청색 고체의 3-((3-플루오로-4-(피페라진-1-일)페닐)아미노)피페리딘-2,6-디온 (800 mg, crude, HCl 염)을 수득하였다. MS(M+H)+=306.9
단계 3. tert-부틸 (4-((4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)-2-플루오로페닐)피페라진-1-일)메틸)피페리딘-1-일)카바메이트 (6)의 합성
MeOH (20 mL) 내 3-((3-플루오로-4-(피페라진-1-일)페닐)아미노)피페리딘-2,6-디온 (800 mg, crude, HCl 염) 및 tert-부틸 (4-포르밀피페리딘-1-일)카바메이트 (532.77 mg, 2.33 mmol) 용액에 NaOAc (382.89 mg, 4.67 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 20 ℃에서 30분간 교반 하고, NaBH3CN (439.97 mg, 7.00 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 20 ℃에서 16시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 피크(10%)를 확인하였다. 반응 혼합물을 H2O (50 mL)로 희석하고 EtOAc (50 mL x 3)로 추출하였다. 합쳐진 유기상을 염수 (50 mL x 2)로 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하였다. 여과물을 감압 농축하였다. 잔여물을 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (Biotage; 20 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, Eluent of 50~100% EtOAc/석유 에터 to 10% MeOH/ EtOAc gradient @ 40 mL/분)로 2회 정제하고, prep-HPLC (컬럼: Phenomenex luna C18 150*40 mm* 15 ㎛; 이동상:[water (FA)-ACN]; B%: 8%-38%, 10 분)로 재정제하고, 용출물을 동결 건조하여 갈색 고체의 tert-부틸 (4-((4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)-2-플루오로페닐)피페라진-1-일)메틸)피페리딘-1-일)카바메이트 (350 mg, 661.37 μmol, 28.34% 수율, 98% 순도)를 수득하였다. MS(M+H)+=519.4
단계 4. 3-((4-(4-((1-아미노피페리딘-4-일)메틸)피페라진-1-일)-3-플루오로페닐)아미노)피페리딘-2,6-디온 (7)의 합성
DCM (10 mL) 내 tert-부틸 (4-((4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)-2-플루오로페닐)피페라진-1-일)메틸)피페리딘-1-일)카바메이트 (350 mg, 674.86 μmol) 용액에 TFA (3.08 g, 27.01 mmol, 2 mL)를 첨가하고, 혼합물을 20 ℃에서 1시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 주 피크를 확인하였다. 반응 혼합물을 감압 농축하여 황색 오일의 3-((4-(4-((1-아미노피페리딘-4-일)메틸)피페라진-1-일)-3-플루오로페닐)아미노)피페리딘-2,6-디온 (350 mg, crude, TFA 염)을 수득하였다. MS(M+H)+=419.2
단계 5. 4-((7,7-디플루오로-9-이소프로필-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(4-((4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)-2-플루오로페닐)피페라진-1-일)메틸)피페리딘-1-일)-3-메톡시벤즈아미드 (화합물 17)의 합성
DMF (10 mL) 내 4-((7,7-디플루오로-9-이소프로필-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-3-메톡시벤조산 (276.96 mg, 657.24 μmol) 용액에 HATU (374.85 mg, 985.86 μmol), DIPEA (254.83 mg, 1.97 mmol, 343.44 μL)를 첨가하고, 혼합물을 20 ℃에서 30분간 교반 하고, 3-((4-(4-((1-아미노피페리딘-4-일)메틸)피페라진-1-일)-3-플루오로페닐)아미노)피페리딘-2,6-디온 (350 mg, crude, TFA 염)을 첨가하고, 생성된 혼합물을 20 ℃에서 16시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 주 피크를 확인하였다. 반응 혼합물을 H2O (20 mL)로 희석하고 EtOAc (20 mL x 3)로 추출하였다. 합쳐진 유기상을 염수 (20 mL x 2)로 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하였다. 여과물을 감압 농축하였다. 잔여물을 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (Biotage; 20 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, Eluent of 20~100% EtOAc/석유 에터 to 10% MeOH/ EtOAc gradient @ 40 mL/분)로 정제하고 prep-HPLC (컬럼: Waters Xbridge C18 150*50 mm* 10 ㎛; 이동상:[water (NH4HCO3)-ACN]; B%: 30%-60%, 10 분)로 재정제하였다. 용출물을 동결 건조하여 황색 고체의 4-((7,7-디플루오로-9-이소프로필-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(4-((4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)-2-플루오로페닐)피페라진-1-일)메틸)피페리딘-1-일)-3-메톡시벤즈아미드 (207.1 mg, 249.46 μmol, 37.96% 수율, 99% 순도)를 수득하였다. MS(M+H)+=822.4
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ = 10.77 (s, 1H), 9.27 (s, 1H), 8.33-8.27 (m, 1H), 8.22 (s, 1H), 7.87 (s, 1H), 7.48-7.39 (m, 2H), 6.83 (t, J = 9.4 Hz, 1H), 6.54-6.47 (m, 1H), 6.45-6.39 (m, 1H), 5.80 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 4.93-4.83 (m, 1H), 4.31-4.21 (m, 1H), 4.03 (t, J = 13.5 Hz, 2H), 3.93 (s, 3H), 3.30 (s, 3H), 3.05-2.98 (m, 2H), 2.90-2.80 (m, 4H), 2.80-2.68 (m, 3H), 2.60-2.51 (m, 5H), 2.23-2.16 (m, 2H), 2.14-2.03 (m, 1H), 1.92-1.81 (m, 1H), 1.80-1.71 (m, 2H), 1.60-1.46 (m, 1H), 1.31-1.18 (m, 8H).
실시예 18. 4-((7,7-디플루오로-9-이소프로필-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(4-((4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)-2,6-디플루오로페닐)피페라진-1-일)메틸)피페리딘-1-일)-3-메톡시벤즈아미드 (화합물 18)의 합성
단계 1. tert-부틸 4-(2,6-디플루오로-4-니트로페닐)피페라진-1-카복실레이트 (3)의 합성
ACN (50 mL) 내 tert-부틸 피페라진-1-카복실레이트 (6.29 g, 28.24 mmol) 및 1,2,3-트리플루오로-5-니트로벤젠 (5 g, 28.24 mmol) 용액에 K2CO3 (7.80 g, 56.47 mmol)를 첨가하였다. 생섣왼 혼합물을 16시간 동안 50 °C 까지 승온했다. LCMS로 원하는 질량의 주 피크를 확인하였다. 반응 혼합물을 H2O (200 mL)로 희석하고 EtOAc (200 mL x 3)로 추출하였다. 합쳐진 유기상을 염수 (200 mL x 2)로 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하였다. 여과물을 감압 농축하였다. 잔여물을 20 oC 에서 10분간 MTBE (40 mL)로 분쇄하여 황색 고체의 tert-부틸 4-(2,6-디플루오로-4-니트로페닐)피페라진-1-카복실레이트 (9.5 g, 27.67 mmol, 98.00% 수율)를 수득하였다. MS(M-56+H)+=288.0
단계 2. tert-부틸 4-(4-아미노-2,6-디플루오로페닐)피페라진-1-카복실레이트 (4)의 합성
MeOH (200 mL) 내 tert-부틸 4-(2,6-디플루오로-4-니트로페닐)피페라진-1-카복실레이트 (9.5 g, 27.67 mmol) 및 Pd/C (1 g, 10% 순도) 혼합물을 탈기하고 H2로 3차례 퍼징하였다. 이후 20 °C H2 기체 (15 Psi) 하에서 20시간 동안 교반 하였다. TLC로 출발물질이 완전히 소모되었음 및 더 큰 극성의 새로운 주요 스팟을 확인하였다. 혼합물을 셀라이트 패드로 여과하였다. 여과물을 진공 농축하여 황색 고체의 tert-부틸 4-(2,6-디플루오로-4-니트로페닐)피페라진-1-카복실레이트 (8 g, crude)를 수득하였다. MS(M+H)+=314.2
단계 3. tert-부틸 4-(4-((2,6-비스(벤질옥시)피리딘-3-일)아미노)-2,6-디플루오로페닐) 피페라진-1-카복실레이트 (6)의 합성
디옥산 (40 mL) 내 tert-부틸 4-(4-아미노-2,6-디플루오로페닐)피페라진-1-카복실레이트 (1 g, 3.19 mmol), 2,6-비스(벤질옥시)-3-브로모피리딘 (1.54 g, 4.15 mmol), Cs2CO3 (3.12 g, 9.57 mmol) 혼합물을 질소와 함께 15분간 탈기하였다. XPhos (152.14 mg, 319.14 μmol) 및 Pd2(dba)3 (292.24 mg, 319.14 μmol)를 첨가하고 혼합물을 질소와 함께 5분간 탈기하였다. 생성된 혼합물을 N2 기체 하에서 16시간 동안 100 °C 까지 승온하였다. LCMS로 원하는 질량의 주 피크를 확인하였다. 혼합물을 셀라이트 패드로 여과하였다. 여과물을 H2O (100 mL)로 희석하고 EtOAc (100 mL x 3)로 추출하였다. 합쳐진 유기상을 염수 (200 mL x 2)로 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하였다. 여과물을 감압 농축하였다. 잔여물을 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (Biotage; 40 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, Eluent of 0~10% EtOAc/석유 에터 gradient @ 40 mL/분)로 정제하여 황색 고체의 tert-부틸 4-(4-((2,6-비스(벤질옥시)피리딘-3-일)아미노)-2,6-디플루오로페닐) 피페라진-1-카복실레이트 (1.9 g, 3.06 mmol, 95.82% 수율, 97% 순도)를 수득하였다. MS(M+H)+=603.2
단계 4. tert-부틸 4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)-2,6-디플루오로페닐)피페라진-1-카복실레이트 (7)의 합성
CF3CH2OH (20 mL) 내 tert-부틸 4-(4-((2,6-비스(벤질옥시)피리딘-3-일)아미노)-2,6-디플루오로페닐)피페라진-1-카복실레이트 (1.9 g, 3.15 mmol) 및 Pd/C (200 mg, 10% 순도) 혼합물을 탈기하고 H2로 3차례 퍼징하였다. 혼합물을 20 °C H2 기체 (15 Psi) 하에서 16시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 주 피크를 확인하였다. 혼합물을 셀라이트 패드로 여과하였다. 여과물을 진공 농축하여 청색 고체의 tert-부틸 4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)-2,6-디플루오로페닐)피페라진-1-카복실레이트 (1.3 g, crude)를 수득하였다. MS(M+H)+=425.2
단계 5. 3-((3,5-디플루오로-4-(피페라진-1-일)페닐)아미노)피페리딘-2,6-디온 (8)의 합성
디옥산 (3 mL) 내 tert-부틸 4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)-2,6-디플루오로페닐)피페라진-1-카복실레이트 (300 mg, 706.81 μmol) 용액에 HCl/디옥산 (4 M, 3 mL)을 첨가하고, 혼합물을 20 °C 에서 1시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 주 피크를 확인하였다. 혼합물을 진공 농축하여 청색 고체의 3-((3,5-디플루오로-4-(피페라진-1-일)페닐)아미노)피페리딘-2,6-디온 (250 mg, crude, HCl 염)을 수득하였고 이를 다음 단계에 바로 사용하였다. MS(M+H)+=325.1
단계 6. tert-부틸 (4-((4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)-2,6-디플루오로페닐) 피페라진-1-일)메틸)피페리딘-1-일)카바메이트 (10)의 합성
MeOH (4 mL) 내 3-((3,5-디플루오로-4-(피페라진-1-일)페닐)아미노)피페리딘-2,6-디온 (250 mg, 692.93 μmol, HCl 염), tert-부틸 (4-포르밀피페리딘-1-일)카바메이트 (158.19 mg, 692.93 μmol) 용액에 NaOAc (113.69 mg, 1.39 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 20 °C 에서 1시간 동안 교반한 후, NaBH3CN (130.64 mg, 2.08 mmol)를 첨가하고 생성된 혼합물을 20 °C 에서 16시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 주 피크를 확인하였다. 반응 혼합물을 H2O (10 mL)로 희석하고 EtOAc (10 mL x 3)로 추출하였다. 합쳐진 유기상을 염수 (10 mL x 2)로 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하였다. 여과물을 감압 농축하였다. 잔여물을 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (Biotage; 20 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, Eluent of 20~100% EtOAc/석유 에터 to 10% MeOH/ EtOAc gradient @ 40 mL/분)로 정제하여 황색 고체의 tert-부틸 (4-((4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)-2,6-디플루오로페닐) 피페라진-1-일)메틸)피페리딘-1-일)카바메이트 (66 mg, 120.53 μmol, 17.39% 수율, 98% 순도)를 수득하였다. MS(M+H)+=537.3
단계 7. 3-((4-(4-((1-아미노피페리딘-4-일)메틸)피페라진-1-일)-3,5-디플루오로페닐)아미노)피페리딘-2,6-디온 (11)의 합성
DCM (2 mL) 내 tert-부틸 (4-((4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)-2,6-디플루오로페닐)피페라진-1-일)메틸)피페리딘-1-일)카바메이트 (66 mg, 122.99 μmol) 용액에 TFA (0.5 mL)를 첨가하고, 혼합물을 20 °C 에서 2시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 주 피크를 확인하였다. 반응 혼합물을 감압 농축하여 황색 오일의 3-((4-(4-((1-아미노피페리딘-4-일)메틸)피페라진-1-일)-3,5-디플루오로페닐)아미노)피페리딘-2,6-디온 (65 mg, crude, TFA 염)을 수득하였고, 이를 다음 단계에 바로 사용하였다. MS(M+H)+=437.3
단계 8. 4-((7,7-디플루오로-9-이소프로필-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(4-((4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)-2,6-디플루오로페닐)피페라진-1-일)메틸)피페리딘-1-일)-3-메톡시벤즈아미드 (화합물 18)의 합성
DMF (2 mL) 내 4-((7,7-디플루오로-9-이소프로필-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-3-메톡시벤조산 (49.75 mg, 118.07 μmol) 용액에 HATU (67.34 mg, 177.11 μmol), DIPEA (45.78 mg, 354.21 μmol, 61.70 μL)를 첨가하고, 혼합물을 20 °C 에서 30분간 교반한 후, 3-((4-(4-((1-아미노피페리딘-4-일)메틸)피페라진-1-일)-3,5-디플루오로페닐)아미노)피페리딘-2,6-디온 (65 mg, 118.07 μmol, TFA 염)을 첨가하고, 20 °C 에서 16시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 주 피크를 확인하였다. 반응 혼합물을 H2O (20 mL)로 희석하고 EtOAc (20 mL x 3)로 추출하였다. 합쳐진 유기상을 염수 (20 mL x 2)로 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하고 여과물을 감압 농축하였다. 잔여물을 prep-TLC (SiO2, DCM: MeOH = 10:1)로 정제하고 역상 HPLC (컬럼: Waters Xbridge 150 x 25 mm x 5μm; 이동상: [water (NH4HCO3) - ACN]; B%: 39% - 69%, 9 분)로 재정제하였다. 용출물을 동결 건조하여 백색 고체의 4-((7,7-디플루오로-9-이소프로필-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(4-((4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)-2,6-디플루오로페닐)피페라진-1-일)메틸)피페리딘-1-일)-3-메톡시벤즈아미드 (16.4 mg, 18.94 μmol, 16.04% 수율, 97% 순도)를 수득하였다. MS(M+H)+=840.4
1H NMR (400 MHz, CD3CN) δ = 8.73 (s, 1H), 8.47 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 8.07 (s, 1H), 7.80 - 7.61 (m, 2H), 7.46 - 7.30 (m, 2H), 6.33 - 6.21 (m, 2H), 5.07 - 4.89 (m, 2H), 4.18 - 4.09 (m, 1H), 4.02 - 3.89 (m, 5H), 3.33 (s, 3H), 3.15 - 3.08 (m, 2H), 3.06 - 2.99 (m, 4H), 2.77 - 2.57 (m, 4H), 2.51 - 2.42 (m, 4H), 2.27 - 2.22 (m, 3H), 1.90 - 1.86 (m, 1H), 1.84 - 1.78 (m, 2H), 1.64 - 1.49 (m, 1H), 1.36 - 1.24 (m, 8H).
실시예 19. N-(4-((4-(2-클로로-4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)페닐)피페라진-1-일)메틸)피페리딘-1-일)-4-((7,7-디플루오로-9-이소프로필-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-3-메톡시벤즈아미드 (화합물 19)의 합성
단계 1. tert-부틸 4-(2-클로로-4-니트로페닐)피페라진-1-카복실레이트 (3)의 합성
DMF (50 mL) 내 2-클로로-1-플루오로-4-니트로벤젠 (5 g, 28.48 mmol) 및 tert-부틸 피페라진-1-카복실레이트 (5.84 g, 31.33 mmol) 용액에 K2CO3 (7.87 g, 56.97 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 100 °C 에서 16시간 동안 교반 하였다. LCMS로 2-클로로-1-플루오로-4-니트로벤젠이 완전히 소모되었음 및 원하는 질량 88%을 확인하였다. 반응 혼합물을 H2O (200 mL)로 희석하고 EtOAc (150 mL x 3)로 추출하였다. 합쳐진 유기상을 염수 (200 mL x 5)로 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하고 진공 농축하였다. 잔여물을 10분간 MTBE (20 mL)로 분쇄하고, 현탁액을 여과하고 여과케이크를 MTBE (20 mL)로 세척했다. 여과케이크를 모아서 건조하여 회색 고체의 tert-부틸 4-(2-클로로-4-니트로페닐)피페라진-1-카복실레이트 (9.18 g, 26.86 mmol, 94.30% 수율)를 수득하였다. MS(M-56+H)+=286.1
단계 2. tert-부틸 4-(4-아미노-2-클로로페닐)피페라진-1-카복실레이트 (4)의 합성
MeOH (90 mL) 내 tert-부틸 4-(2-클로로-4-니트로페닐)피페라진-1-카복실레이트 (9.18 g, 26.86 mmol) 용액에 Fe (7.50 g, 134.29 mmol), NH4Cl (7.18 g, 134.29 mmol) 및 H2O (9 mL)을 첨가하고, 혼합물을 70 °C 에서 16시간 동안 교반 하였다. LCMS로 출발물질이 완전히 소모되었음 및 원하는 질량 91%을 확인하였다. 반응 혼합물을 HCl 용액 (1 M, 200 mL)에 붓고, 생성된 혼합물에 K2CO3를 첨가하여 pH > 12로 조정하고, 현탁액을 여과하고 여과케이크를 MeOH (50 mL)로 세척했다. 여과물을 진공 농축하여 메탄올 대부분을 제거하였다. 잔여물을 H2O (100 mL)로 희석하고, EtOAc (80 mL x 3)로 추출하였다. 합쳐진 유기상을 Na2SO4로 건조하고, 여과하고 진공 농축하여 검은 고체의 tert-부틸 4-(4-아미노-2-클로로페닐)피페라진-1-카복실레이트 (2.91 g, 9.33 mmol, 34.75% 수율)를 수득하여 이를 다음 단계에 바로 사용하였다. MS(M+H)+=312.1
단계 3. tert-부틸 4-(2-클로로-4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)페닐)피페라진-1-카복실레이트 (5)의 합성
DMF (8 mL) 내 tert-부틸 4-(4-아미노-2-클로로페닐)피페라진-1-카복실레이트 (500 mg, 1.60 mmol) 및 3-브로모피페리딘-2,6-디온 (923.70 mg, 4.81 mmol) 용액에 NaHCO3 (1.35 g, 16.04 mmol, 623.66 μL)를 첨가하고, 혼합물을 80 °C 에서 16시간 동안 교반 하였다. LCMS로 39%의 tert-부틸 4-(4-아미노-2-클로로페닐)피페라진-1-카복실레이트가 남아있음 및 원하는 질량 59%를 확인하였다. 반응 혼합물을 H2O (120 mL)로 희석하고 EtOAc (100 mL x 3)로 추출하였다. 합쳐진 유기상을 염수 (150 mL x 5)로 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하고 진공 농축하였다. 잔여물을 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (20 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, Eluent of 12~26% EtOAc/석유 에터 gradient @ 100 mL/분)로 정제하여 청색 고체의 tert-부틸 4-(2-클로로-4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)페닐)피페라진-1-카복실레이트 (300 mg, 709.38 μmol, 44.24% 수율)를 수득하였다. MS(M+H)+=423.2
단계 4. 3-((3-클로로-4-(피페라진-1-일)페닐)아미노)피페리딘-2,6-디온 (6)의 합성
디옥산 (5 mL) 내 tert-부틸 4-(2-클로로-4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)페닐)피페라진-1-카복실레이트 (300 mg, 709.38 μmol) 용액에 HCl/디옥산 (4 M, 10 mL)을 첨가하고, 혼합물을 15 °C 에서 2시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량 88%을 확인하였다. 혼합물을 진공 농축하여 청색 고체의 3-((3-클로로-4-(피페라진-1-일)페닐)아미노)피페리딘-2,6-디온 (420 mg, HCl 염)을 수득하였다. MS(M+H)+=323.2
단계 5. tert-부틸 (4-((4-(2-클로로-4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)페닐)피페라진-1-일)메틸)피페리딘-1-일)카바메이트 (8)의 합성
MeOH (5 mL) 내 3-((3-클로로-4-(피페라진-1-일)페닐)아미노)피페리딘-2,6-디온 (270 mg, 751.57 μmol, HCl 염), tert-부틸 (4-포르밀피페리딘-1-일)카바메이트 (240.20 mg, 1.05 mmol) 및 NaOAc (184.96 mg, 2.25 mmol) 혼합물을 15 °C 에서 30분간 교반한 후, NaBH3CN (283.38 mg, 4.51 mmol)을 첨가하고 생성된 혼합물을 15 °C 에서 12시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량 76%을 확인하였다. 반응 혼합물을 다른 배치(150mg 스케일)과 합치고 합친 혼합물을 여과하였다. 여과물을 진공 농축하고 잔여물을 prep-HPLC (컬럼: Phenomenex luna C18 150 x 40mm x 15μm; 이동상: [water(FA) - ACN]; B%: 10% - 40%, 10 분)로 정제하고, 용출물을 동결 건조하여 갈색 고체의 tert-부틸 (4-((4-(2-클로로-4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)페닐)피페라진-1-일)메틸)피페리딘-1-일)카바메이트 (55 mg, 71.95 μmol, 9.57% 수율, 70% 순도)을 수득하였다. MS(M+H)+=535.3
단계 6. 3-((4-(4-((1-아미노피페리딘-4-일)메틸)피페라진-1-일)-3-클로로페닐)아미노)피페리딘-2,6-디온 (9)의 합성
DCM (3 mL) 내 tert-부틸 (4-((4-(2-클로로-4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)페닐)피페라진-1-일)메틸)피페리딘-1-일)카바메이트 (50.00 mg, 65.41 μmol, 70% 순도) 용액에 TFA (74.58 mg, 654.11 μmol, 48.43 μL)를 0 °C에서 첨가하고, 15 °C 에서 4시간 동안 교반 하였다. LCMS로 42%의 출발물질이 남아있음 및 원하는 질량 32%을 확인하였다. 추가적인 TFA (74.58 mg, 654.11 μmol, 48.43 μL)를 첨가하고 생성된 혼합물을 15 °C 에서 4시간 동안 추가로 교반한 후, LCMS로 출발물질이 완전히 소모되었음을 확인하였다. 반응 혼합물을 진공 농축하여 갈색 오일의 3-((4-(4-((1-아미노피페리딘-4-일)메틸)피페라진-1-일)-3-클로로페닐)아미노)피페리딘-2,6-디온 (50 mg, TFA 염)을 수득하였다. MS(M+H)+=435.0
단계 7. N-(4-((4-(2-클로로-4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)페닐)피페라진-1-일)메틸)피페리딘-1-일)-4-((7,7-디플루오로-9-이소프로필-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-3-메톡시벤즈아미드 (화합물 19)의 합성
DMF (0.5 mL) 내 4-((7,7-디플루오로-9-이소프로필-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-3-메톡시벤조산 (25 mg, 59.33 μmol) 용액에 HATU (33.84 mg, 88.99 μmol) 및 DIPEA (115.01 mg, 889.90 μmol, 155.00 μL)를 첨가하고, 혼합물을 15 °C 에서 15분간 교반한 후, DMF (1.5 mL) 내 3-((4-(4-((1-아미노피페리딘-4-일)메틸)피페라진-1-일)-3-클로로페닐)아미노)피페리딘-2,6-디온 (50 mg, 91.08 μmol, TFA 염) 용액을 첨가하고 생성된 혼합물을 15 °C 에서 1시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 피크(90%)를 확인하였다. 반응 혼합물을 H2O (30 mL)로 희석하고 EtOAc (20 mL x 3)로 추출하였다. 합쳐진 유기상을 염수 (40 mL x 5)로 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하고 진공 농축하였다. 잔여물을 prep-HPLC (컬럼: Waters Xbridge 150 x 25mm x 5μm; 이동상: [water(NH4HCO3) - ACN]; B%: 41% - 71%, 8 분)로 정제하고 용출물을 동결 건조하여 오프 화이트(off-white) 고체의 N-(4-((4-(2-클로로-4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)페닐)피페라진-1-일)메틸)피페리딘-1-일)-4-((7,7-디플루오로-9-이소프로필-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-3-메톡시벤즈아미드 (15.0 mg, 16.64 μmol, 28.05% 수율, 93% 순도)를 수득하였다. MS(M+H)+=838.2
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ = 10.77 (s, 1H), 9.34 - 9.16 (m, 1H), 8.36 - 8.26 (m, 1H), 8.22 (s, 1H), 7.87 (s, 1H), 7.52 - 7.38 (m, 2H), 6.96 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 6.75 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 6.60 (dd, J = 2.5, 8.6 Hz, 1H), 5.86 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 4.96 - 4.79 (m, 1H), 4.36 - 4.19 (m, 1H), 4.03 (br t, J = 13.5 Hz, 2H), 3.93 (s, 3H), 3.30 (s, 3H), 3.01 (br d, J = 10.4 Hz, 2H), 2.84 (br s, 4H), 2.75 (br dd, J = 5.2, 11.8 Hz, 2H), 2.72 - 2.68 (m, 1H), 2.61 - 2.51 (m, 5H), 2.21 (br d, J = 6.6 Hz, 2H), 2.07 (dt, J = 5.0, 8.5 Hz, 1H), 1.93 - 1.82 (m, 1H), 1.76 (br d, J = 11.0 Hz, 2H), 1.57 - 1.46 (m, 1H), 1.24 (d, J = 6.8 Hz, 8H).
실시예 20. 4-((7,7-디플루오로-9-이소프로필-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(1-((1-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)-2-플루오로페닐)아제티딘-3-일)메틸)피페리딘-4-일)-3-메톡시벤즈아미드 (화합물 20)의 합성
단계 1. tert-부틸 3-((토실옥시)메틸)아제티딘-1-카복실레이트 (2)의 합성
DCM (50 mL) 내 tert-부틸 3-(히드록시메틸)아제티딘-1-카복실레이트 (5 g, 26.70 mmol) 용액에 TEA (8.11 g, 80.11 mmol) 및 TosCl (7.13 g, 37.39 mmol)를 20 °C 에서 첨가하고 12 시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 피크(76%)를 확인하였다. 반응 혼합물을 진공 농축하였다. 잔여물을 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (80 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, Eluent of 0~20% EtOAc/석유 에터 gradient @ 100 mL/분)로 정제하여 황색 오일의 tert-부틸 3-((토실옥시)메틸)아제티딘-1-카복실레이트 (7.5 g, 21.75 mmol, 81.44% 수율, 99% 순도)를 수득하였다. MS(M-56+H)+=286.2
단계 2. tert-부틸 3-((4-(((벤질옥시)카보닐)아미노)피페리딘-1-일)메틸)아제티딘-1-카복실레이트 (3)의 합성
DMF (50 mL) 내 tert-부틸 3-((토실옥시)메틸)아제티딘-1-카복실레이트 (5 g, 14.64 mmol) 및 벤질 피페리딘-4-일카바메이트 (4.46 g, 19.04 mmol) 용액에 NaI (439.03 mg, 2.93 mmol) 및 DIPEA (5.68 g, 43.93 mmol, 7.65 mL)를 20 °C 에서 첨가하고 생성된 혼합물을 80 °C 에서 16시간 동안 교반 하였다. LCMS로 출발물질이 완전히 소모되었음 및 원하는 질량의 피크(78%)를 확인하였다. 반응 혼합물을 H2O (200 mL)로 희석하고 EtOAc (200 mL x 3)로 추출하였다. 유기상을 염수 (200 mL x 3)로 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하고 농축하였다. 잔여물을 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (80 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, Eluent of 0~100% EtOAc/석유 에터 gradient @ 100 mL/분)로 정제하여 2 배치의 표제 화합물을 얻었다. 배치 1: 황색 오일의 tert-부틸 3-((4-(((벤질옥시)카보닐)아미노)피페리딘-1-일)메틸)아제티딘-1-카복실레이트 (4.9 g, 12.14 mmol, 82.92% 수율) 및 배치 2: 황색 오일의 tert-부틸 3-((4-(((벤질옥시)카보닐)아미노)피페리딘-1-일)메틸)아제티딘-1-카복실레이트 (1.7 g, 4.21 mmol, 28.77% 수율) MS(M+H)+=404.4
단계 3. 벤질 (1-(아제티딘-3-일메틸)피페리딘-4-일)카바메이트 (4)의 합성
DCM (10 mL) 내 tert-부틸 3-((4-(((벤질옥시)카보닐)아미노)피페리딘-1-일)메틸)아제티딘-1-카복실레이트 (4.9 g, 12.14 mmol) 용액에 TFA (4.15 g, 36.43 mmol, 2.70 mL)를 20 °C 에서 첨가하고 생성된 혼합물을 20 °C 에서 1시간 동안 교반 하였다. LCMS로 반응이 확인되지 않아서 TFA (5.54 g, 48.57 mmol, 3.60 mL)를 추가로 첨가하고 반응 혼합물을 20 °C 에서 추가로 16시간 동안 교반 하였다. LCMS로 56%의 출발물질이 남아 있음 및 원하는 질량의 29% 피크를 확인하고, 반응 혼합물을 20 °C 에서 추가로 32시간 동안 교반 하였다. LCMS로 출발물질이 완전히 소모되었음을 확인하였다. 반응 혼합물을 워크 업을 위해 다른 배치(1.7g 스케일)와 합혔다. 합쳐진 반응 혼합물을 진공 농축하여 주황색 오일의 벤질 (1-(아제티딘-3-일메틸)피페리딘-4-일)카바메이트 (13.9 g, crude, TFA 염)를 수득하였다. MS(M+H)+=304.4
단계 4. 벤질 (1-((1-(2-플루오로-4-니트로페닐)아제티딘-3-일)메틸)피페리딘-4-일)카바메이트 (5)의 합성
DMSO (15 mL) 내 벤질 (1-(아제티딘-3-일메틸)피페리딘-4-일)카바메이트 (3.94 g, 9.43 mmol, TFA 염) 용액에 K2CO3 (2.61 g, 18.86 mmol) 및 1,2-디플루오로-4-니트로벤젠(1 g, 6.29 mmol, 694.44 μL)을 20 °C 에서 첨가하고 생성된 혼합물을 40 °C 에서 1시간 동안 교반 하였다. TLC (SiO2, 석유 에터: EtOAc = 10:1)로 1,2-디플루오로-4-니트로벤젠이 남아 있음 및 새로운 하나의 스팟 형성을 확인하였다. 반응 혼합물을 H2O (50 mL)로 희석하고 EtOAc (50 mL x 3)로 추출하였다. 합쳐진 유기상을 염수 (50 mL x 3)로 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하고 농축하였다. 잔여물을 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (25 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, Eluent of 0~100% EtOAc/석유 에터 gradient @ 100 mL/분)로 정제하여 황색 고체의 벤질 (1-((1-(2-플루오로-4-니트로페닐)아제티딘-3-일)메틸)피페리딘-4-일)카바메이트 (1.1 g, 2.49 mmol, 39.55% 수율)를 수득하였다. MS(M+H)+=443.3
단계 5. 벤질 (1-((1-(4-아미노-2-플루오로페닐)아제티딘-3-일)메틸)피페리딘-4-일)카바메이트 (6)의 합성
EtOH (10 mL) 및 H2O (5 mL) 내 벤질 (1-((1-(2-플루오로-4-니트로페닐)아제티딘-3-일)메틸)피페리딘-4-일)카바메이트 (1.1 g, 2.49 mmol) 용액에 Fe (832.98 mg, 14.92 mmol) 및 NH4Cl (797.87 mg, 14.92 mmol)을 20 °C 에서 첨가하고 생성된 혼합물을 80 °C 에서 12시간 동안 교반 하였다. LCMS로 출발물질이 완전히 소모되었음 및 원하는 질량의 피크(70%)를 확인하였다. 혼합물의 pH를 포화 NaHCO3로 pH=10으로 조정하고 생성된 혼합물을 EtOAc (15 mL x 3)로 추출하였다. 합쳐진 유기상을 Na2SO4로 건조하고, 여과하고 농축하여 주황색 고체의 벤질 (1-((1-(4-아미노-2-플루오로페닐)아제티딘-3-일)메틸)피페리딘-4-일)카바메이트 (926 mg, 2.24 mmol, 90.30% 수율)를 수득하였다. MS(M+H)+=413.2
단계 6. 벤질 (1-((1-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)-2-플루오로페닐)아제티딘-3-일)메틸)피페리딘-4-일)카바메이트 (7)의 합성
DMF (15 mL) 내 벤질 (1-((1-(4-아미노-2-플루오로페닐)아제티딘-3-일)메틸)피페리딘-4-일)카바메이트 (926 mg, 2.24 mmol) 및 3-브로모피페리딘-2,6-디온 (1.29 g, 6.73 mmol) 용액에 NaHCO3 (1.89 g, 22.45 mmol, 873.07 μL)를 20 °C 에서 첨가하고 생성된 혼합물을 85 °C 에서 16시간 동안 교반 하였다. LCMS로 출발물질이 완전히 소모되었음 및 원하는 질량의 피크(39%)를 확인하였다. 반응 혼합물을 EtOAc (30 mL)로 희석하고 여과하였다. 여과물을 H2O (100 mL)로 희석하고 EtOAc (100 mL x 3)로 추출하였다. 합쳐진 유기상을 염수 (100 mL x 3)로 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하고 농축하였다. 잔여물을 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (12 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, Eluent of 0~100% EtOAc/석유 에터 gradient @ 100 mL/분)로 정제하여 녹색 고체의 벤질 (1-((1-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)-2-플루오로페닐)아제티딘-3-일)메틸)피페리딘-4-일)카바메이트 (545 mg, 1.04 mmol, 46.37% 수율)를 수득하였다. MS(M+H)+=524.2
단계 7. 3-((4-(3-((4-아미노피페리딘-1-일)메틸)아제티딘-1-일)-3-플루오로페닐) 아미노)피페리딘-2,6-디온 (8)의 합성
CF3CH2OH (5 mL) 내 벤질 (1-((1-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)-2-플루오로페닐)아제티딘-3-일)메틸)피페리딘-4-일)카바메이트 (200 mg, 381.97 μmol) 용액에 Pd/C (0.1 g, 10% 순도)를 N2 기체 하에서 첨가하였다. 현탁액을 탈기하고 H2로 3차례 퍼징하였다. 혼합물을 20 °C H2 기체 (15 Psi) 하에서 16시간 동안 교반 하였다. LCMS로 출발물질이 완전히 소모되었음 및 원하는 질량의 피크를 확인하였다. 반응 혼합물을 CF3CH2OH (20 mL)로 희석하고 여과하였다. 여과물을 진공 농축하여 청색 고체의 3-((4-(3-((4-아미노피페리딘-1-일)메틸)아제티딘-1-일)-3-플루오로페닐) 아미노)피페리딘-2,6-디온 (201 mg, crude)을 수득하였다. MS(M+H)+=390.2
단계 8. 4-((7,7-디플루오로-9-이소프로필-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(1-((1-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)-2-플루오로페닐)아제티딘-3-일)메틸)피페리딘-4-일)-3-메톡시벤즈아미드 (화합물 20)의 합성
DMF (2 mL) 내 4-((7,7-디플루오로-9-이소프로필-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-3-메톡시벤조산 (80 mg, 189.84 μmol) 용액에 HATU (79.40 mg, 208.83 μmol) 및 DIPEA (73.61 mg, 569.53 μmol, 99.20 μL)를 첨가하였다. 혼합물을 20 °C 에서 10분간 교반 하고, DMF (2 mL) 내 3-((4-(3-((4-아미노피페리딘-1-일)메틸)아제티딘-1-일)-3-플루오로페닐)아미노)피페리딘-2,6-디온 (147.88 mg, 379.69 μmol) 용액을 첨가하고 생성된 혼합물을 20 °C 에서 1시간 동안 교반 하였다. LCMS로 출발물질이 완전히 소모되었음 및 원하는 질량의 피크를 확인하였다. 반응 혼합물을 H2O (12 mL)로 희석하고 EtOAc (12 mL x 3)로 추출하였다. 유기상을 염수 (12 mL x 3)로 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하고 농축하였다. 잔여물을 prep-TLC (SiO2, DCM: MeOH = 10:1) 이후 prep-HPLC (컬럼: Unisil 3-100 C18 Ultra 150 x 50 mm x 3 μm; 이동상: [water (FA) -ACN]; B%: 10% - 40%, 7 분)로 정제하고 용출물을 동결 건조하여 회색 고체의 4-((7,7-디플루오로-9-이소프로필-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(1-((1-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)-2-플루오로페닐)아제티딘-3-일)메틸)피페리딘-4-일)-3-메톡시벤즈아미드 (32 mg, 34.52 μmol, 18.18% 수율, 88% 순도, 0.5FA 염)를 수득하였다. MS(M+H)+=793.2
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ = 10.75 (s, 1H), 8.34 - 8.27 (m, 1H), 8.22 (s, 1H), 8.15 - 8.10 (br, 1H), 7.87 (s, 1H), 7.54 - 7.45 (m, 2H), 6.52 - 6.44 (m, 1H), 6.43 - 6.32 (m, 2H), 5.53 (br d, J = 7.1 Hz, 1H), 4.93 - 4.82 (m, 1H), 4.23 - 4.14 (m, 1H), 4.04 (br t, J = 13.5 Hz, 2H), 3.94 (s, 3H), 3.86 (br t, J = 6.7 Hz, 2H), 3.82 - 3.71 (m, 1H), 3.42 - 3.34 (m, 5H), 2.91 - 2.79 (m, 3H), 2.77 - 2.68 (m, 1H), 2.58 (br d, J = 5.1 Hz, 3H), 2.12 - 2.01 (m, 3H), 1.89 - 1.74 (m, 3H), 1.65 - 1.52 (m, 2H), 1.24 (d, J = 6.7 Hz, 6H).
실시예 21. 4-((7,7-디플루오로-9-이소프로필-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(4-((4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)-2-(트리플루오로메틸)페닐)피페라진-1-일)메틸)피페리딘-1-일)-3-메톡시벤즈아미드 (화합물 21)의 합성
단계 1. tert-부틸 4-(4-니트로-2-(트리플루오로메틸)페닐)피페라진-1-카복실레이트 (3)의 합성
DMF (50 mL) 내 1-플루오로-4-니트로-2-(트리플루오로메틸)벤젠 (5 g, 23.91 mmol, 3.29 mL) 및 tert-부틸 피페라진-1-카복실레이트 (4.90 g, 26.30 mmol) 용액에 K2CO3 (6.61 g, 47.82 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 50 °C 에서 16시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 피크(70%)를 확인하였다. 반응 혼합물을 H2O (250 mL)로 희석하고 EtOAc (150 mL x 3)로 추출하였다. 합쳐진 유기상을 염수 (200 mL x 5)로 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하고 진공 농축하였다. 잔여물을 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (20 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, Eluent of 6% EtOAc/석유 에터 gradient @ 100 mL/분)로 정제하여 황색 고체의 tert-부틸 4-(4-니트로-2-(트리플루오로메틸)페닐)피페라진-1-카복실레이트 (7.1 g, 18.92 mmol, 79.11% 수율)를 수득하였다. MS(M-56+H)+=320.1
단계 2. tert-부틸 4-(4-아미노-2-(트리플루오로메틸)페닐)피페라진-1-카복실레이트 (4)의 합성
CF3CH2OH (80 mL) 내 tert-부틸 4-(4-니트로-2-(트리플루오로메틸)페닐)피페라진-1-카복실레이트 (7.1 g, 18.92 mmol) 용액에 Pd/C (1 g, 10% 순도)를 N2 하에서 첨가하고, 현탁액을 탈기하고 H2로 몇차례 퍼징하였다. 혼합물을 15 °C H2 (15 Psi) 하에서 16시간 동안 교반 하였다. LCMS로 출발물질이 완전히 소모되었음 및 원하는 질량의 주 피크(99%)를 확인하였다. 반응 혼합물을 여과하고 여과케이크를 CF3CH2OH (100 mL)로 세척하고, 여과물을 진공 농축하여 회색 고체의 tert-부틸 4-(4-아미노-2-(트리플루오로메틸)페닐)피페라진-1-카복실레이트 (6.08 g, 17.60 mmol, 93.07% 수율)를 수득하였다. MS(M+H)+=346.1
단계 3. tert-부틸 4-(4-((2,6-비스(벤질옥시)피리딘-3-일)아미노)-2-(트리플루오로메틸)페닐)피페라진-1-카복실레이트 (6)의 합성
디옥산 (20 mL) 내 tert-부틸 4-(4-아미노-2-(트리플루오로메틸)페닐)피페라진-1-카복실레이트 (800 mg, 2.32 mmol) 및 2,6-비스(벤질옥시)-3-브로모피리딘 (1.11 g, 3.01 mmol) 용액에 Cs2CO3 (2.26 g, 6.95 mmol), Pd2(dba)3 (212.12 mg, 231.64 μmol) 및 XPhos (110.43 mg, 231.64 μmol)를 첨가하고, 혼합물을 100 °C N2 하에서 16시간 동안 교반 하였다. LCMS로 tert-부틸 4-(4-아미노-2-(트리플루오로메틸)페닐)피페라진-1-카복실레이트가 완전히 소모되었음 및 원하는 질량의 피크(56%)를 확인하였다. 반응 혼합물을 여과하고 여과케이크를 EtOAc (30 mL)로 세척하고, 여과물을 진공 농축하였다. 잔여물을 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (12 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, Eluent of 0~6% EtOAc/석유 에터 gradient @ 100 mL/분)로 정제하여 황색 오일의 tert-부틸 4-(4-((2,6-비스(벤질옥시)피리딘-3-일)아미노)-2-(트리플루오로메틸)페닐)피페라진-1-카복실레이트 (1.43 g, 2.25 mmol, 97.27% 수율)를 수득하였다. MS(M+H)+=635.2
단계 4. tert-부틸 4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)-2-(트리플루오로메틸)페닐) 피페라진-1-카복실레이트 (7)의 합성
CF3CH2OH (30 mL) 내 tert-부틸 4-(4-((2,6-비스(벤질옥시)피리딘-3-일)아미노)-2-(트리플루오로메틸)페닐)피페라진-1-카복실레이트 (930 mg, 1.47 mmol) 및 CH3COOH (8.80 mg, 146.53 μmol, 8.38 μL) 용액에 Pd(OH)2/C (200 mg, 10% 순도)를 N2 하에서 첨가하고, 현탁액을 탈기하고 H2로 몇차례 퍼징하였다. 혼합물을 15 °C H2 (15 Psi) 하에서 16시간 동안 교반 하였다. LCMS로 출발물질이 완전히 소모되었음 및 원하는 질량의 피크(55%)를 확인하였다. 반응 혼합물을 여과하고, 여과케이크를 CF3CH2OH (50 mL)로 세척하였다. 여과물을 진공 농축하여 청색 고체의 tert-부틸 4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)-2-(트리플루오로메틸)페닐) 피페라진-1-카복실레이트 (590 mg)를 수득하였다. MS(M+H)+=457.2
단계 5. 3-((4-(피페라진-1-일)-3-(트리플루오로메틸)페닐)아미노)피페리딘-2,6-디온 (8)의 합성
디옥산 (6 mL) 내 tert-부틸 4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)-2-(트리플루오로메틸)페닐)피페라진-1-카복실레이트 (590 mg, 1.29 mmol) 용액에 HCl/디옥산 (4 M, 12 mL)을 첨가하고, 혼합물을 15 °C 에서 2시간 동안 교반 하였다. LCMS로 출발물질이 완전히 소모되었음 및 원하는 질량의 피크(69%)를 확인하였다. 잔여물을 진공 농축하였다. 잔여물을 prep-HPLC (컬럼: Phenomenex luna C18 150 x 25mm x 10μm; 이동상: [water(FA)-ACN]; B%: 1% - 23%, 11 분)로 정제하고, 용출물을 동결 건조하여 밝은 갈색 고체의 3-((4-(피페라진-1-일)-3-(트리플루오로메틸)페닐)아미노)피페리딘-2,6-디온 (240 mg, 610.99 μmol, 47.27% 수율, HCl 염)을 수득하였다. MS(M+H)+=357.0
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ = 11.22 - 10.41 (m, 1H), 8.33 (s, 1H), 7.27 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.01 - 6.79 (m, 2H), 6.24 (br d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.43 - 4.34 (m, 1H), 2.93 (br s, 4H), 2.84 - 2.75 (m, 4H), 2.75 - 2.68 (m, 1H), 2.58 (td, J = 4.0, 17.4 Hz, 1H), 2.13 - 2.01 (m, 1H), 1.90 (dq, J = 4.6, 12.2 Hz, 1H).
단계 6. tert-부틸 (4-((4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)-2-(트리플루오로메틸)페닐)피페라진-1-일)메틸)피페리딘-1-일)카바메이트 (10)의 합성
MeOH (8 mL) 내 3-((4-(피페라진-1-일)-3-(트리플루오로메틸)페닐)아미노)피페리딘-2,6-디온 (240 mg, 610.99 μmol, HCl 염), tert-부틸 (4-포르밀피페리딘-1-일)카바메이트 (488.19 mg, 2.14 mmol) 및 NaOAc (150.37 mg, 1.83 mmol) 용액을 15 °C 에서 30분간 교반한 후, NaBH3CN (153.58 mg, 2.44 mmol)를 첨가하고 생성된 혼합물을 15 °C 에서 16시간 동안 교반 하였다. LCMS로 3-((4-(피페라진-1-일)-3-(트리플루오로메틸)페닐)아미노)피페리딘-2,6-디온이 완전히 소모되었음 및 원하는 질량을 확인하였다. 반응 혼합물을 진공 농축하고 잔여물을 prep-HPLC (컬럼: Shim-pack C18 150 x 25 x 10μm; 이동상: [water (TFA) - ACN]; B%: 15% - 45%, 10분)로 정제하고, 용출물을 동결 건조하여 갈색 고체의 tert-부틸 (4-((4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)-2-(트리플루오로메틸) 페닐)피페라진-1-일)메틸)피페리딘-1-일)카바메이트 (160 mg, 234.38 μmol, 38.36% 수율, TFA 염)를 수득하였다. MS(M+H)+=569.3
단계 7. 3-((4-(4-((1-아미노피페리딘-4-일)메틸)피페라진-1-일)-3-(트리플루오로메틸)페닐)아미노)피페리딘-2,6-디온 (11)의 합성
DCM (2 mL) 내 tert-부틸 (4-((4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)-2-(트리플루오로메틸)페닐)피페라진-1-일)메틸)피페리딘-1-일)카바메이트 (150 mg, 219.73 μmol, TFA 염) 용액에 TFA (250.54 mg, 2.20 mmol, 162.69 μL)를 첨가하고, 혼합물을 15 °C 에서 5시간 동안 교반 하였다. LCMS로 미량의 출발물질이 남음 및 원하는 질량의 피크(53%)를 확인하였다. 반응 혼합물을 N2로 버블링하여 대부분의 용매를 없애고 갈색 오일의 3-((4-(4-((1-아미노피페리딘-4-일)메틸)피페라진-1-일)-3-(트리플루오로메틸)페닐)아미노)피페리딘-2,6-디온 (130 mg, TFA 염)을 수득하였다. MS(M+H)+=469.2
단계 8. 4-((7,7-디플루오로-9-이소프로필-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(4-((4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)-2-(트리플루오로메틸)페닐)피페라진-1-일)메틸)피페리딘-1-일)-3-메톡시벤즈아미드 (화합물 21)의 합성
DMF (2 mL) 내 4-((7,7-디플루오로-9-이소프로필-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-3-메톡시벤조산 (85 mg, 201.71 μmol) 용액에 HATU (115.04 mg, 302.56 μmol) 및 DIPEA (338.90 mg, 2.62 mmol, 456.75 μL)을 첨가하고, 혼합물을 15 °C 에서 15분간 교반한 후, 3-((4-(4-((1-아미노피페리딘-4-일)메틸)피페라진-1-일)-3-(트리플루오로메틸)페닐)아미노)피페리딘-2,6-디온 (129.25 mg, 221.88 μmol, TFA 염)을 첨가하고 생성된 혼합물을 15 °C 에서 1시간 동안 교반 하였다. LCMS로 3-((4-(4-((1-아미노피페리딘-4-일)메틸)피페라진-1-일)-3-(트리플루오로메틸)페닐)아미노)피페리딘-2,6-디온이 완전히 소모되었음 및 원하는 질량의 피크(62%)를 확인하였다. 혼합물에 CH3COOH를 첨가하여 pH < 7 로 조정하고 생성된 혼합물을 여과하고 여과물을 prep-HPLC (컬럼: Phenomenex C18 75 x 30mm x 3μm; 이동상: [water(FA) - ACN];B%: 18% - 48%, 7 분)로 정제하고, 용출물을 동결 건조하여 갈색 고체의 4-((7,7-디플루오로-9-이소프로필-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(4-((4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)-2-(트리플루오로메틸)페닐)피페라진-1-일)메틸)피페리딘-1-일)-3-메톡시벤즈아미드 (12.1 mg, 12.77 μmol, 6.33% 수율, 93% 순도, 0.2FA 염)를 수득하였다. MS(M+H)+=872.1
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ = 10.80 (s, 1H), 9.29 (s, 1H), 8.34 - 8.26 (m, 1H), 8.22 (s, 1H), 7.88 (s, 1H), 7.50 - 7.39 (m, 2H), 7.33 (br d, J = 8.8 Hz, 1H), 6.99 - 6.84 (m, 2H), 6.35 - 6.12 (m, 1H), 4.96 - 4.79 (m, 1H), 4.45 - 4.32 (m, 1H), 4.04 (br t, J = 13.5 Hz, 2H), 3.94 (s, 3H), 3.31 (br s, 3H), 3.03 (br d, J = 9.9 Hz, 2H), 2.90 - 2.69 (m, 7H), 2.61 (br d, J = 3.8 Hz, 2H), 2.57 - 2.52 (m, 5H), 2.11 - 2.05 (m, 1H), 1.97 - 1.89 (m, 1H), 1.78 (br d, J = 10.8 Hz, 2H), 1.67 - 1.50 (m, 1H), 1.25 (d, J = 6.7 Hz, 8H).
실시예 22. 4-((9-시클로펜틸-7,7-디플루오로-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(4-(2-(4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)-2-플루오로페닐)피페라진-1-일)에틸)피페리딘-1-일)-3-메톡시벤즈아미드 (화합물 22)의 합성
단계 1. tert-부틸 (4-(2-(4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)-2-플루오로페닐)피페라진-1-일)에틸)피페리딘-1-일)카바메이트 (2)의 합성
DMF (1 mL) 내 3-((3-플루오로-4-(피페라진-1-일)페닐)아미노)피페리딘-2,6-디온 (0.25 g, 729.30 μmol, HCl 염) 및 2-(1-((tert-부톡시카보닐)아미노)피페리딘-4-일)에틸 4-메틸벤젠설포네이트 (290.64 mg, 729.30 μmol) 용액에 25°C에서 DIPEA (282.76 mg, 2.19 mmol, 381.08 μL) 및 NaI (21.86 mg, 145.86 μmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 60°C로 가열하여 2시간 동안 교반 하였다. LCMS로 출발물질이 완전히 소모됨을 확인하였고 원하는 질량의 메인 피크가 검출되었다. 조 생성물을 prep-HPLC (컬럼: Phenomenex luna C18 150x40 mmx 15um; 이동상: [water (FA) - ACN]; B%: 3% - 35%, 9분)로 정제 후 동결 건조하여 갈색 고체의 tert-부틸 (4-(2-(4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)-2-플루오로페닐)피페라진-1-일)에틸)피페리딘-1-일)카바메이트 (0.1 g, crude)를 수득하였다. MS(M+H)+ = 533.3
단계 2. 3-((4-(4-(2-(1-아미노피페리딘-4-일)에틸)피페라진-1-일)-3-플루오로페닐)아미노)피페리딘-2,6-디온 (3)의 합성
DCM (2 mL) 내 tert-부틸 (4-(2-(4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)-2-플루오로페닐)피페라진-1-일)에틸)피페리딘-1-일)카바메이트 (0.1 g, 187.74 μmol) 용액에 25°C에서 TFA (1.26 g, 11.09 mmol, 821.07 μL)를 첨가했다. 생성된 혼합물을 25°C 에서 30분 동안 교반하였다. LCMS로 출발물질이 완전히 소모됨을 확인하였고 원하는 질량의 메인 피크가 검출되었다. 반응 혼합물을 감압 농축하여 갈색 고체의 3-((4-(4-(2-(1-아미노피페리딘-4-일)에틸)피페라진-1-일)-3-플루오로페닐)아미노)피페리딘-2,6-디온 (0.1 g, crude, TFA 염)을 수득하였다. MS(M+H)+ = 433.2
단계 3. 4-((9-시클로펜틸-7,7-디플루오로-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(4-(2-(4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)-2-플루오로페닐)피페라진-1-일)에틸)피페리딘-1-일)-3-메톡시벤즈아미드 (화합물 22)의 합성
DMF (1 mL) 내 4-((9-시클로펜틸-7,7-디플루오로-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-3-메톡시벤조산 (0.1 g, 223.50 μmol) 용액에 HATU (101.98 mg, 268.20 μmol) 및 DIPEA (115.54 mg, 893.99 μmol, 155.71 μL)를 첨가하였다. 혼합물을 25°C에서 10분 동안 교반 하였다. 이후 3-((4-(4-(2-(1-아미노피페리딘-4-일)에틸)피페라진-1-일)-3-플루오로페닐)아미노)피페리딘-2,6-디온 (97.72 mg, 178.80 μmol, TFA 염)을 첨가 후 생성된 혼합물을 25°C에서 1시간 동안 교반 하였다. LCMS로 3-((4-(4-(2-(1-아미노피페리딘-4-일)에틸)피페라진-1-일)-3-플루오로페닐)아미노)피페리딘-2,6-디온 이 완전히 소모됨을 확인하였고 원하는 질량의 피크 (41 %)가 검출되었다. 반응 혼합물을 여과하였다. 여과물을 prep-HPLC (컬럼: Unisil 3-100 C18 Ultra 150x50 mmx3 um; 이동상: [water (FA) - ACN]; B%: 18% - 48%, 7 분)로 정제 후 prep-HPLC (컬럼: Waters Xbridge 150x25 mmx 5um; 이동상: [water (NH4HCO3) - ACN]; B%: 37% - 67%, 8분)로 재정제하였고, 용출물을 동결 건조하여 백색 고체의 4-((9-시클로펜틸-7,7-디플루오로-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(4-(2-(4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)-2-플루오로페닐)피페라진-1-일)에틸)피페리딘-1-일)-3-메톡시벤즈아미드 (36 mg, 40.51 μmol, 18.13% 수율, 97% 순도)를 수득하였다. MS(M+H)+ = 862.5
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ = 10.78 (s, 1H), 9.28 (s, 1H), 8.35 - 8.20 (m, 2H), 7.96 (s, 1H), 7.51 - 7.37 (m, 2H), 6.91 - 6.77 (m, 1H), 6.52 (dd, J = 1.8, 15.0 Hz, 1H), 6.43 (dd, J = 1.7, 8.8 Hz, 1H), 5.80 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 4.88 - 4.70 (m, 1H), 4.26 (td, J = 5.5, 11.3 Hz, 1H), 4.05 (br t, J = 14.1 Hz, 2H), 3.94 (s, 3H), 3.30 (s, 3H), 3.00 (br d, J = 9.6 Hz, 2H), 2.86 (br s, 4H), 2.80 - 2.66 (m, 3H), 2.59 (br d, J = 4.1 Hz, 5H), 2.38 - 2.32 (m, 2H), 2.14 - 2.04 (m, 1H), 2.00 - 1.80 (m, 3H), 1.77 - 1.54 (m, 8H), 1.48 - 1.21 (m, 5H).
실시예 23. 4-((9-시클로펜틸-7,7-디플루오로-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(4-(2-(4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)(메틸)아미노)-2-플루오로페닐)피페라진-1-일)에틸)피페리딘-1-일)-3-메톡시벤즈아미드 (화합물 23)의 합성
단계 1. tert-부틸 4-(2-플루오로-4-니트로페닐)피페라진-1-카복실레이트 (2)의 합성
DMSO (80 mL) 내 1,2-디플루오로-4-니트로벤젠 (6.3 g, 39.60 mmol, 4.37 mL), tert-부틸 피페라진-1-카복실레이트(7.38g, 39.60mmol) 및 K2CO3 (16.42 g, 118.80 mmol) 혼합물을 60°C에서 4시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 주 피크가 검출되었다. 혼합물을 물 (300 mL)에 붓고 EtOAc (80 mL x 5)으로 추출하였다. 합친 유기상을 염수 (80 mL x 3)로 세척하고, Na2SO4로 건조, 여과 및 농축하여 황색 고체의 tert-부틸 4-(2-플루오로-4-니트로페닐)피페라진-1-카복실레이트 (13.7 g, crude)를 수득하였다. MS(M-100+H)+ = 226.0
단계 2. tert-부틸 4-(4-아미노-2-플루오로페닐)피페라진-1-카복실레이트 (3)의 합성
THF (300 mL) 및 MeOH (300 mL) 내 tert-부틸 4-(2-플루오로-4-니트로페닐)피페라진-1-카복실레이트 (13 g, 39.96 mmol) 용액에 질소N2 기체 하 25°C에서 Pd/C (1 g, 10% 순도)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 H2 하 3차례 탈기 및 퍼지 했다. 혼합물을 H2 (15 Psi) 하 25°C에서 2시간 동안 교반 하였다. LCMS로 출발물질이 완전히 소모됨을 확인하였고 원하는 질량의 메인 피크가 검출되었다. 반응 혼합물을 셀라이트 패드로 여과 후 여과물을 농축하여 갈색 고체의 tert-부틸 4-(4-아미노-2-플루오로페닐)피페라진-1-카복실레이트 (12 g, crude)를 수득하였다. MS(M+H)+ = 296.1
단계 3. tert-부틸 4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)-2-플루오로페닐)피페라진-1-카복실레이트 (4)의 합성
ACN (20 mL) 내 tert-부틸 4-(4-아미노-2-플루오로페닐)피페라진-1-카복실레이트 (0.5 g, 1.69 mmol), 3-브로모피페리딘-2,6-디온 (650.11 mg, 3.39 mmol) 및 NaHCO3 (711.07 mg, 8.46 mmol, 329.20 μL) 혼합물을 80°C에서 12시간 동안 교반 하였다. LCMS로 대부분의 출발물질이 여전히 남아있었고 원하는 질량의 피크 (14 %)가 검출되었다. 추가로 25°C에서 3-브로모피페리딘-2,6-디온 (325.05 mg, 1.69 mmol) 및 NaHCO3 (426.64 mg, 5.08 mmol, 197.52 μL)를 첨가하고 생성된 혼합물을 80°C에서 12시간 동안 교반 하였다. LCMS로 출발물질이 여전히 남아있었고 원하는 질량의 피크 (44%)가 검출되었다. 추가로 25°C에서 3-브로모피페리딘-2,6-디온 (487.58 mg, 2.54 mmol) 및 NaHCO3 (426.64 mg, 5.08 mmol, 197.52 μL)를 첨가하고 혼합물을 80°C에서 12시간 동안 추가 교반 하였다. LCMS로 출발물질이 여전히 남아있었고 원하는 질량의 피크 (65%)가 검출되었다. 반응 혼합물을 여과 케이크를 EtOAc (30 mL)로 세척했다. 합친 여과물을 농축했다. 잔여물을 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (12 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, Eluent of 0~35% EtOAc/석유 에터 gradient @ 60 mL/분)로 정제하여 녹색 고체의 tert-부틸 4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)-2-플루오로페닐)피페라진-1-카복실레이트 (0.5 g, crude)를 수득하였다. MS(M+H)+ = 407.2
단계 4. tert-부틸 4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)(메틸)아미노)-2-플루오로페닐)피페라진-1-카복실레이트 (5)의 합성
MeOH (5 mL) 내 tert-부틸 4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)-2-플루오로페닐)피페라진-1-카복실레이트 (0.4 g, 984.13 μmol), HCHO (159.73 mg, 1.97 mmol, 146.54 μL, 37% 순도) 및 AcOH (59.10 mg, 984.13 μmol, 56.28 μL) 혼합물을 25°C에서 30분 동안 교반 하였다. 25°C에서 NaBH3CN (185.53 mg, 2.95 mmol)를 첨가하고 생성된 혼합물을 25°C에서 1시간 동안 교반 하였다. LCMS로 출발물질 질량의 피크(50%) 및 원하는 질량의 피크(43%)가 검출되었다. 추가로 25°C에서 HCHO (159.73 mg, 1.97 mmol, 146.54 μL, 37% 순도)를 반응 혼합물에 첨가하고 추가 10분 동안 25°C에서 교반한 후 25°C에서 NaBH3CN (123.69 mg, 1.97 mmol)를 첨가하고 생성된 혼합물을 25°C에서 12시간 동안 교반 하였다. LCMS로 출발물질 질량의 피크(9%) 및 원하는 질량의 피크(86%)가 검출되었다. 반응 용액을 농축하여 유기상을 제거했다. 조 생성물을 EtOAc (50 mL)에 용해 후 포화 NaHCO3 (20 mL)로 세척하고, 유기상을 Na2SO4로 건조, 여과 및 감압 농축하여 청색 고체의 tert-부틸 4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)(메틸)아미노)-2-플루오로페닐)피페라진-1-카복실레이트 (0.6 g, crude)를 수득하였다. MS(M+H)+ = 421.0
단계 5. 3-((3-플루오로-4-(피페라진-1-일)페닐)(메틸)아미노)피페리딘-2,6-디온 (6)의 합성
디옥산 (2 mL) 내 tert-부틸 4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)(메틸)아미노)-2-플루오로페닐)피페라진-1-카복실레이트 (0.6 g, 1.43 mmol) 용액에 25°C에서 HCl/디옥산 (4 M, 36.62 mL)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 25°C에서 30 분 동안 교반 하였다. LCMS로 출발물질이 완전히 소모됨을 확인하였다. 반응 혼합물을 감압 농축하여 청색 고체의 3-((3-플루오로-4-(피페라진-1-일)페닐)(메틸)아미노)피페리딘-2,6-디온 (0.7 g, crude)를 수득하였다. MS(M+H)+=321.4
단계 6. tert-부틸 (4-(2-(4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)(메틸)아미노)-2-플루오로페닐)피페라진-1-일)에틸)피페리딘-1-일)카바메이트 (7)의 합성
DMF (1 mL) 내 3-((3-플루오로-4-(피페라진-1-일)페닐)(메틸)아미노)피페리딘-2,6-디온 (200 mg, 560.50 μmol, HCl 염) 및 2-(1-((tert)-부톡시카보닐)아미노)피페리딘-4-일)에틸 4-메틸벤젠술포네이트 (223.37 mg, 560.50 μmol) 용액에 25°C에서 DIPEA (217.32 mg, 1.68 mmol, 292.88 μL) 및 NaI (16.80 mg, 112.10 μmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 60°C로 가열하여 4시간 동안 교반 하였다. LCMS로 출발물질이 완전히 소모됨을 확인하였고 원하는 질량의 메인 피크가 검출되었다. 혼합물을 물 (20 mL)에 붓고 EtOAc (15 mL x 4)으로 추출하였다. 합친 유기상을 염수 (15 mL x 3)로 세척 후 Na2SO4로 건조, 여과 및 감압 농축했다. 조 생성물을 prep-HPLC (컬럼: Phenomenex Synergi Polar-RP 100x25 mmx4um; 이동상: [H2O (TFA) - ACN]; B%: 21% - 41%, 7 분)로 정제하고 용출물을 동결 건조하여 갈색 고체의 tert-부틸 (4-(2-(4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)(메틸)아미노)-2-플루오로페닐)피페라진-1-일)에틸)피페리딘-1-일)카바메이트 (50 mg, crude)를 수득하였다. MS(M+H)+ = 547.4
단계 7. 3-((4-(4-(2-(1-아미노피페리딘-4-일)에틸)피페라진-1-일)-3-플루오로페닐)(메틸)아미노)피페리딘-2,6-디온 (8)의 합성
DCM (2 mL) 내 tert-부틸 (4-(2-(4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)(메틸)아미노)-2-플루오로페닐)피페라진-1-일)에틸)피페리딘-1-일)카바메이트 (50 mg, 91.46 μmol) 용액에 25°C에서 TFA (616.00 mg, 5.40 mmol, 0.4 mL)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 25°C에서 30분 동안 교반 하였다. LCMS로 출발물질이 완전히 소모됨을 확인하였고 원하는 질량의 메인 피크가 검출되었다. 반응 혼합물을 감압 농축하여 황색 오일의 3-((4-(4-(2-(1-아미노피페리딘-4-일)에틸)피페라진-1-일)-3-플루오로페닐)(메틸)아미노)피페리딘-2,6-디온 (55 mg, crude, TFA 염)을 수득하였다. MS(M+H)+ = 447.3
단계 8. 4-((9-시클로펜틸-7,7-디플루오로-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(4-(2-(4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)(메틸)아미노)-2-플루오로페닐)피페라진-1-일)에틸)피페리딘-1-일)-3-메톡시벤즈아미드 (화합물 23)의 합성
DMF (1 mL) 내 4-((9-시클로펜틸-7,7-디플루오로-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-3-메톡시벤조산 (50 mg, 111.75 μmol) 용액에 HATU (50.99 mg, 134.10 μmol) 및 DIPEA (57.77 mg, 446.99 μmol, 77.86 μL)를 첨가하였다. 혼합물을 25°C에서 10분 동안 교반 하였다. 3-((4-(4-(2-(1-아미노피페리딘-4-일)에틸)피페라진-1-일)-3-플루오로페닐)(메틸)아미노)피페리딘-2,6-디온 (50.12 mg, 89.40 μmol, TFA 염)을 첨가하고 생성된 혼합물을 25°C에서 1시간 동안 교반 하였다. LCMS로 출발물질이 완전히 소모됨을 확인하였고 원하는 질량의 피크 (34 %)가 검출되었다. 혼합물을 물 (30 mL)에 붓고 EtOAc (10 mL x 5)으로 추출하였다. 합친 유기상을 염수 (10 mL x 3)로 세척 후 Na2SO4로 건조, 여과하였다. 여과물을 감압 농축했다. 조 생성물을 prep-HPLC (컬럼: Unisil 3-100 C18 Ultra 150x50 mm x 3 um; 이동상: [H2O (FA) - ACN]; B%: 15% - 45%, 7 분)로 정제하고 용출물을 동결 건조하여 백색 고체의 4-((9-시클로펜틸-7,7-디플루오로-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(4-(2-(4-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)(메틸)아미노)-2-플루오로페닐)피페라진-1-일)에틸)피페리딘-1-일)-3-메톡시벤즈아미드 (35.6 mg, 37.39 μmol, 33.46% 수율, 92% 순도)를 수득하였다. MS(M+H)+ = 876.5
1H NMR (400 MHz, CD3CN) δ = 8.78 - 8.65 (m, 1H), 8.46 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 8.10 (s, 1H), 7.92 - 7.77 (m, 1H), 7.73 (s, 1H), 7.46 - 7.30 (m, 2H), 7.01 - 6.89 (m, 1H), 6.70 - 6.52 (m, 2H), 4.95 - 4.81 (m, 1H), 4.60 (dd, J = 5.1, 12.8 Hz, 1H), 4.03 - 3.91 (m, 5H), 3.66 - 3.49 (m, 2H), 3.44 - 3.35 (m, 2H), 3.33 (s, 3H), 3.21 - 3.13 (m, 5H), 3.10 - 2.99 (m, 2H), 2.77 - 2.74 (m, 3H), 2.73 - 2.64 (m, 3H), 2.40 - 2.26 (m, 2H), 2.02 (dd, J = 2.5, 5.0, 10.1 Hz, 3H), 1.83 - 1.55 (m, 11H), 1.51 - 1.33 (m, 3H).
실시예 24. 4-((7,7-디플루오로-9-이소프로필-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2 -일)아미노)-N-(7-((1-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)-2-플루오로페닐)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[ 3.5]노난-2-일)-3-메톡시벤즈아미드 (화합물 24)의 합성
단계 1. tert-부틸 2-(((벤질옥시)카보닐)아미노)-7-아자스피로[3.5]노난-7-카복실레이트 (2)의 합성
THF (10 mL) 및 H2O (5 mL) 내 tert-부틸 2-아미노-7-아자스피로[3.5]노난-7-카복실레이트 (1 g, 4.16 mmol) 용액에 0°C에서 NaHCO3 (1.05 g, 12.48 mmol, 485.46 μL)를 첨가하였다. 이후 0°C에서 CbzCl (922.73 mg, 5.41 mmol, 768.94 μL)를 한 방울씩 가하고 생성된 혼합물을 20°C에서 2시간 동안 교반 하였다. LCMS로 출발물질이 완전히 소모됨을 확인하였고 원하는 질량의 피크 (35 %)가 검출되었다. 반응 혼합물을 H2O (20 mL)로 희석 후 EtOAc (20 mL x 3)로 추출하였다. 합친 유기상을 Na2SO4로 건조, 여과 및 농축했다. 잔여물을 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (12 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, Eluent of 0~33% EtOAc/석유 에터 gradient @ 100 mL/분)로 정제하여 백색 고체의 tert-부틸 2-(((벤질옥시)카보닐)아미노)-7-아자스피로[3.5]노난-7-카복실레이트 (1.4 g, 3.74 mmol, 89.85% 수율)를 수득하였다. MS(M-100+H)+ = 275.4
단계 2. 벤질(7-아자스피로[3.5]노난-2-일)카바메이트 (3)의 합성
DCM (5 mL) 내 tert-부틸 2-(((벤질옥시)카보닐)아미노)-7-아자스피로[3.5]노난-7-카복실레이트 (1.4 g, 3.74 mmol) 용액에 20°C에서 TFA (2.13 g, 18.69 mmol, 1.38 mL)를 첨가하고 혼합물을 20°C에서 12시간 동안 교반 하였다. LCMS로 출발물질이 완전히 소모됨을 확인하였고 원하는 질량의 피크 (70 %)가 검출되었다. 반응 혼합물을 진공 농축하여 황색 오일의 벤질(7-아자스피로[3.5]노난-2-일)카바메이트 (3 g, crude, TFA 염)를 수득하였다. MS(M+H)+ = 275.5
단계 3. tert-부틸 4-((2-(((벤질옥시)카보닐)아미노)-7-아자스피로[3.5]노난-7-일)메틸)피페리딘-1-카복실레이트 (4)의 합성
DMF (10 mL) 내 벤질 (7-아자스피로[3.5]노난-2-일)카바메이트 (2g, 5.15mmol, TFA 염) 용액에 20°C에서 DIPEA (3.33g, 25.75mmol, 4.48mL) 및 tert-부틸 4-(요오도메틸)피페리딘-1-카복실레이트 (1.34g, 4.12mmol)를 첨가하고 생성된 혼합물을 60°C에서 16시간 동안 교반 하였다. LCMS로 출발물질이 남아있음 및 원하는 질량의 피크 (21%)가 검출되었다. 반응 혼합물을 80°C에서 16시간 동안 교반 하였다. LCMS로 미량의 남아있는 출발물질 및 원하는 질량의 피크 (28 %)가 검출되었다. 반응 혼합물을 H2O (20 mL)로 희석 후 EtOAc (20 mL x 3)로 추출하였다. 합친 유기상을 염수 (20 mL x 3)로 세척 후 Na2SO4로 건조, 여과 및 농축했다. 잔여물을 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (40 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, Eluent of 0~80% EtOAc/석유 에터 gradient @ 100 mL/분)로 정제하여 황색 오일의 tert-부틸 4-((2-(((벤질옥시)카보닐)아미노)-7-아자스피로[3.5]노난-7-일)메틸)피페리딘-1-카복실레이트 (1.6 g, 3.39 mmol, 65.88% 수율)를 수득하였다. MS(M+H)+ = 472.3
단계 4. 벤질 (7-(피페리딘-4-일메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)카바메이트 (5)의 합성
DCM (5 mL) 내 tert-부틸 4-((2-(((벤질옥시)카보닐)아미노)-7-아자스피로[3.5]노난-7-일)메틸)피페리딘-1-카복실레이트 (1.6 g, 3.39 mmol) 용액에 20°C에서 TFA (1.93 g, 16.96 mmol, 1.26 mL)를 첨가하고 생성된 혼합물을 20°C에서 12시간 동안 교반 하였다. LCMS로 출발물질이 완전히 소모됨을 확인하였고 원하는 질량의 피크 (56 %)가 검출되었다. 반응 혼합물을 진공 농축하여 황색 오일의 벤질 (7-(피페리딘-4-일메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)카바메이트 (3.1 g, crude, TFA 염)를 수득하였다. MS(M+H)+ = 372.4
단계 5. 벤질 (7-((1-(2-플루오로-4-니트로페닐)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)카바메이트 (6)의 합성
DMSO (10 mL) 내 1,2-디플루오로-4-니트로-벤젠(1 g, 6.29 mmol, 694.44 μL) 용액에 20°C에서 K2CO3 (2.61 g, 18.86 mmol) 및 벤질(7-(피페리딘-4-일메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)카바메이트(3.05 g, 6.29 mmol, TFA)를 첨가하고 생성된 혼합물을 40°C에서 1시간 동안 교반 하였다. LCMS로 1,2-디플루오로-4-니트로-벤젠 이 남아있음 및 원하는 질량의 피크 (52 %)가 검출되었다. 반응 혼합물을 H2O (30 mL)로 희석 후 EtOAc (30 mL x 3)으로 추출하였다. 유기상을 염수 (30 mL x 3)로 세척 후 Na2SO4로 건조, 여과 및 농축했다. 잔여물을 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (12 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, Eluent of 0~100% EtOAc/석유 에터 gradient @ 100 mL/분)로 정제하여 2 배치의 표제 화합물을 얻었다. 배치 1: 벤질 (7-((1-(2-플루오로-4-니트로페닐)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)카바메이트(896 mg, 1.60 mmol, 25.40% 수율, 91% 순도)가 황색 고체로 얻어졌고, 배치 2: 벤질 (7-((1-(2-플루오로-4-니트로페닐)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)카바메이트(490 mg, 921.27 μmol, 14.66% 수율, 96% 순도)가 황색 고체로 얻어졌다. 카바메이트MS(M+H)+ = 511.3
단계 6. 벤질 (7-((1-(4-아미노-2-플루오로페닐)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)카바메이트 (7)의 합성
EtOH (6 mL) 및 H2O (3 mL) 내 벤질(7-((1-(2-플루오로-4-니트로페닐)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)카바메이트 (490mg, 959.66 μmol) 용액에 20°C에서 Fe (321.55 mg, 5.76 mmol) 및 NH4Cl (308.00 mg, 5.76 mmol)를 첨가하고 생성된 혼합물을 80°C에서 12시간 동안 교반 하였다. LCMS로 출발물질이 완전히 소모됨을 확인하였고 원하는 질량의 피크 (91 %)가 검출되었다. 반응 혼합물을 워크업을 위해 다른 배치 (896 mg 스케일)과 합쳤다. 이 반응 혼합물에 NaHCO3 (20 mL)를 첨가하여 pH = 10으로 조정 후 EtOAc (40 mL x 3)으로 추출하였다. 합친 유기상을 Na2SO4로 건조, 여과 및 농축하여 주황색 오일의 벤질 (7-((1-(4-아미노-2-플루오로페닐)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)카바메이트 (1.1 g, crude)를 수득하였다. MS(M+H)+ = 481.4
단계 7. (7-((1-(4-((2,6-비스(벤질옥시)피리딘-3-일)아미노)-2-플루오로페닐)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난- 2-일)카바메이트 (8)의 합성
디옥산 (10 mL) 내 2,6-디벤질옥시-3-브로모-피리딘 (600 mg, 1.62 mmol) 및 벤질 (7-((1-(4-아미노-2-플루오로페닐)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)카바메이트(934.65mg, 1.94mmol) 용액에 20°C N2 하 Pd-PEPPSI-IHeptCl (78.82 mg, 81.03 μmol) 및 Cs2CO3 (1.58 g, 4.86 mmol)를 첨가하고 생성된 혼합물을 100°C에서 16시간 동안 교반 하였다. LCMS로 모든 출발물질이 완전히 소모됨을 확인하였고 원하는 질량의 피크 (54 %)가 검출되었다. 반응 혼합물을 여과하고 여과물을 진공 농축하였다. 잔여물을 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (25 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, Eluent of 0~80% EtOAc/석유 에터 gradient @ 100 mL/분)로 정제하여 2 배치의 표제 화합물을 얻었다. 배치 1: (7-((1-(4-((2,6-비스(벤질옥시)피리딘-3-일)아미노)-2-플루오로페닐)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)카바메이트(742 mg, 963.71 μmol, 59.47% 수율)를 녹색 오일로 수득하였고 배치 2: (7-((1-(4-((2,6-비스(벤질옥시)피리딘-3-일)아미노)-2-플루오로페닐)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)카바메이트(246 mg, 319.50 μmol, 19.72% 수율)를 녹색 오일로 얻었다. MS(M+H)+ = 770.1
단계 8. 3-((4-(4-((2-아미노-7-아자스피로[3.5]노난-7-일)메틸)피페리딘-1-일)-3-플루오로페닐)아미노)피페리딘-2,6-디온 (9)의 합성
CF3CH2OH (10 mL) 내 벤질 (7-((1-(4-((2,6-비스(벤질옥시)피리딘-3-일)아미노)-2-플루오로페닐)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)카바메이트 (400 mg, 519.52 μmol) 용액에 N2 기체 하 Pd/C (0.1 g, 10% 순도)를 첨가하였다. 현탁액을 H2 하 3차례 탈기 및 퍼징 하였다. 혼합물을 20°C에서 H2 (15 Psi)하 16시간 동안 교반 하였다. LCMS로 출발물질이 완전히 소모됨을 확인하였고 원하는 질량의 피크가 검출되었다. 반응 혼합물을 워크업을 위해 다른 배치 (246 mg 스케일)과 합쳤다. 반응 혼합물을 EtoAc (15 mL)로 희석 후 여과하였다. 여과물을 진공 농축 후 녹색 오일의 3-((4-(4-((2-아미노-7-아자스피로[3.5]노난-7-일)메틸)피페리딘-1-일)-3-플루오로페닐)아미노)피페리딘-2,6-디온 (219 mg, 478.60 μmol, 92.12% 수율)을 수득하였다. MS(M+H)+ = 458.1
단계 9. 4-((7,7-디플루오로-9-이소프로필-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(7-((1-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)-2-플루오로페닐)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)-3-메톡시벤즈아미드 (화합물 24)의 합성
DMF (2 mL) 내 4-((7,7-디플루오로-9-이소프로필-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-3-메톡시벤조산 (100 mg, 237.31 μmol) 용액에 HATU (99.25 mg, 261.04 μmol) 및 DIPEA (92.01 mg, 711.92 μmol, 124.00 μL)를 첨가하였다. 혼합물을 20°C에서 10분 동안 교반 후 DMF (2 mL) 내 3-((4-(4-((2-아미노-7-아자스피로[3.5]노난-7-일)메틸)피페리딘-1-일)-3-플루오로페닐)아미노)피페리딘-2,6-디온 (217.17mg, 474.61μmol) 용액을 첨가 후 생성된 혼합물을 20°C에서 1 시간 동안 교반 하였다. LCMS로 출발물질이 완전히 소모됨을 확인하였고 원하는 질량의 피크 (68 %)가 검출되었다. 반응 혼합물을 H2O (15 mL)로 희석 후 EtOAc (15 mL x 3)으로 추출하였다. 유기상을 염수 (15 mL x 3)으로 세척 후 Na2SO4로 건조, 여과 및 농축했다. 잔여물을 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (12 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, Eluent of 0~100% EtOAc/석유 에터 gradient @ 100 mL/분), 이어서 prep-HPLC (컬럼: Phenomenex luna C18 150*40 mm* 15um;이동상: [water (FA) -ACN]; B%: 13% - 43%, 10 분)로 정제하고 용출물을 동결 건조하여 회색 고체의 4-((7,7-디플루오로-9-이소프로필-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2 -일)아미노)-N-(7-((1-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)-2-플루오로페닐)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)-3-메톡시벤즈아미드 (119.5 mg, 126.42 μmol, 53.27% 수율, 94% 순도, 0.6 FA 염)를 수득하였다. MS(M+H)+ = 861.1
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ = 10.77 (s, 1H), 8.42 (br d, J = 7.2 Hz, 1H), 8.30 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 8.22 (s, 1H), 8.16 (s, 1H), 7.88 (s, 1H), 7.54 - 7.45 (m, 2H), 6.82 (br t, J = 9.3 Hz, 1H), 6.49 (dd, J = 2.0, 15.0 Hz, 1H), 6.41 (br d, J = 8.7 Hz, 1H), 5.77 (br d, J = 7.3 Hz, 1H), 4.94 - 4.82 (m, 1H), 4.47 - 4.34 (m, 1H), 4.30 - 4.19 (m, 1H), 4.04 (br t, J = 13.5 Hz, 2H), 3.94 (s, 3H), 3.32 (s, 3H), 3.10 (br d, J = 11.1 Hz, 2H), 2.78 - 2.67 (m, 1H), 2.61 - 2.54 (m, 2H), 2.54 - 2.50 (m, 2H), 2.50 - 2.23 (m, 2H), 2.22 - 2.03 (m, 6H), 1.90 - 1.78 (m, 3H), 1.74 (br d, J = 11.7 Hz, 2H), 1.59 (br d, J = 19.2 Hz, 5H), 1.27 - 1.17 (m, 8H).
실시예 25. 4-((7,7-디플루오로-9-이소프로필-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(7-((1-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)-2,6-디플루오로페닐)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)-3-메톡시벤즈아미드 (화합물 25)의 합성
단계 1. tert-부틸 2-(((벤질옥시)카보닐)아미노)-7-아자스피로[3.5]노난-7-카복실레이트 (2)의 합성
THF (10 mL) 및 H2O (5 mL) 내 tert-부틸 2-아미노-7-아자스피로[3.5]노난-7-카복실레이트(1 g, 4.16 mmol) 용액에 0°C에서 NaHCO3 (1.05 g, 12.48 mmol)를 첨가하였다. 이후 0°C에서 CbzCl (922.73 mg, 5.41 mmol)를 한방울씩 첨가하고 생성된 혼합물을 20°C에서 2시간 동안 교반 하였다. LCMS로 출발물질이 완전히 소모됨을 확인하였고 원하는 질량의 피크 (35 %)가 검출되었다. 반응 혼합물을 H2O (20 mL)로 희석 후 EtOAc (20 mL x 3)으로 추출하였다. 유기상을 Na2SO4 로 건조, 여과 및 농축했다. 잔여물을 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (12 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, Eluent of 0~33% EtOAc/석유 에터 gradient @ 100 mL/분)로 정제하여 백색 고체의 tert-부틸 2-(((벤질옥시)카보닐)아미노)-7-아자스피로[3.5]노난-7-카르복카복실레이트 (1.4 g, 3.74 mmol, 89.85% 수율)를 수득하였다. MS(M-100+H)+ = 275.4
단계 2. 벤질(7-아자스피로[3.5]노난-2-일)카바메이트 (3)의 합성
디옥산 (30 mL) 내 tert-부틸 2-(((벤질옥시)카보닐)아미노)-7-아자스피로[3.5]노난-7-카복실레이트 (6 g, 16.02 mmol) 용액에 HCl/디옥산 (4 M, 30 mL)를 첨가 후 혼합물을 20°C에서 2시간 동안 교반 하였다. LCMS로 출발물질이 완전히 소모됨을 확인하였고 원하는 질량의 피크가 검출되었다. 혼합물을 진공 농축 후 백색 고체의 벤질(7-아자스피로[3.5]노난-2-일)카바메이트 (6 g, crude)를 수득하였고 이를 다음 반응에 바로 사용하였다. MS(M+H)+ = 275.2
단계 3. tert-부틸 4-((2-(((벤질옥시)카보닐)아미노)-7-아자스피로[3.5]노난-7-일)메틸)피페리딘-1-카복실레이트 (4)의 합성
DCE (60 mL) 내 벤질(7-아자스피로[3.5]노난-2-일)카바메이트 (5g, 16.09mmol, HCl 염), tert-부틸 4-포르밀피페리딘-1-카복실레이트 (3.43g, 16.09mmol) 및 AcOH (966.03mg, 16.09 mmol) 용액을 20°C에서 30분 동안 교반 하였다. 이후 NaBH(OAc)3 (6.82 g, 32.17 mmol)를 첨가 후 생성된 혼합물을 20°C에서 1시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 메인 피크가 검출되었다. 반응 혼합물을 NaHCO3 용액 (100 mL)에 부었다. 층을 분리하였다. 수용상을 DCM (30 mL x 3)으로 추출 하였다. 합친 유기상을 Na2SO4 로 건조 및 농축하여 백색 고체의 tert-부틸 4-((2-(((벤질옥시)카보닐)아미노)-7-아자스피로[3.5]노난-7-일)메틸)피페리딘-1-카복실레이트 (7.5 g, 15.90 mmol, 98.85% 수율)를 수득하였다. MS(M+H)+ = 472.4
단계 4. 벤질 (7-(피페리딘-4-일메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)카바메이트 (5)의 합성
EtOAc (25 mL) 내 tert-부틸 4-((2-(((벤질옥시)카보닐)아미노)-7-아자스피로[3.5]노난-7-일)메틸)피페리딘-1-카복실레이트 (6 g, 12.72 mmol) 용액에 HCl/디옥산 (4 M, 30.00 mL)를 첨가하고 혼합물을 20°C에서 1시간 동안 교반 하였다. LCMS로 출발물질이 완전히 소모됨을 확인하였고 원하는 질량이 검출되었다. 반응 혼합물을 농축하여 백색 고체의 벤질 (7-(피페리딘-4-일메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)카바메이트 (5 g, crude, 2HCl 염)를 수득하였다. MS(M+H)+=372.2
단계 5. 벤질 (7-((1-(2,6-디플루오로-4-니트로페닐)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)카바메이트 (6)의 합성
MeCN (20 mL) 내 벤질 (7-(피페리딘-4-일메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)카바메이트 (2.5g, 5.63mmol, 2HCl 염) 및 1,2,3-트리플루오로-5-니트로-벤젠 (996.10mg, 5.63mmol) 용액에 20°C에서 Et3N (2.85 g, 28.13 mmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 80°C에서 1시간 동안 교반 하였다. LCMS로 출발물질이 완전히 소모됨을 확인하였고 원하는 질량이 검출되었다. 반응 혼합물을 농축하였다. 조 생성물을 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (25 g 실리카 겔 컬럼, EtOAc/석유 에터 = 10-60%, 80 mL/분)로 정제하여 황색 고체의 벤질 (7-((1-(2,6-디플루오로-4-니트로페닐)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)카바메이트 (1 g, 1.89 mmol, 33.63% 수율)를 수득하였다. MS(M+H)+ = 529.3
단계 6. 벤질 (7-((1-(4-아미노-2,6-디플루오로페닐)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)카바메이트 (7)의 합성
EtOH (20 mL) 및 H2O (10 mL) 내 벤질 (7-((1-(2,6-디플루오로-4-니트로페닐)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)카바메이트 (1 g, 1.89 mmol) 및 NH4Cl (607.18mg, 11.35mmol) 혼합물에 20°C에서 Fe (633.89 mg, 11.35 mmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 80°C에서 1시간 동안 교반 하였다. LCMS로 출발물질이 완전히 소모됨을 확인하였고 원하는 질량이 검출되었다. 반응 혼합물에 NaHCO3 용액 (200 mL)를 붓고 EtOAc (50 mL x 4)로 추출하였다. 합친 유기상을 Na2SO4 로 건조 및 감압 농축하여 황색 고체의 벤질 (7-((1-(4-아미노-2,6-디플루오로페닐)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)카바메이트 (900 mg, crude)를 수득하였고 다음 반응에 바로 사용하였다. MS(M+H)+ = 499.5
단계 7. 벤질 (7-((1-(4-((2,6-비스(벤질옥시)피리딘-3-일)아미노)-2,6-디플루오로페닐)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5 ]노난-2-일)카바메이트 (8)의 합성
디옥산 (15 mL) 내 벤질 (7-((1-(4-아미노-2,6-디플루오로페닐)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)카바메이트 (900 mg, 1.81 mmol), 2, 6-디벤질옥시-3-브로모-피리딘 (801.95mg, 2.17mmol) 및 Cs2CO3 (1.76g, 5.42mmol) 혼합물에 20°C에서 Pd-PEPPSI-IHeptCl (87.79 mg, 90.25 μmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 N2로 퍼지 및 탈기 후 100°C로 가열하고 14시간 동안 교반 하였다. LCMS로 출발물질이 완전히 소모됨을 확인하였고 원하는 질량이 검출되었다. 반응 혼합물을 EtOAc (50 mL)로 희석 후 여과하였다. 여과물을 농축했다. 조 생성물을 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (12 g 실리카 겔 컬럼, EtOAc/석유 에터 = 10-40%, 80 mL/분)로 정제하여 갈색 고체의 벤질 (7-((1-(4-((2,6-비스(벤질옥시)피리딘-3-일)아미노)-2,6-디플루오로페닐)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)카바메이트 (900 mg, 959.47 μmol, 53.16% 수율, 84% 순도)를 수득하였다. MS(M+H)+=788.8
단계 8. 3-((4-(4-((2-아미노-7-아자스피로[3.5]노난-7-일)메틸)피페리딘-1-일)-3,5-디플루오로페닐)아미노)피페리딘-2,6-디온 (9)의 합성
THF (15 mL) 내 벤질 (7-((1-(4-((2,6-비스(벤질옥시)피리딘-3-일)아미노)-2,6-디플루오로페닐)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)카바메이트 (800mg, 1.02mmol) 용액에 20°C에서 N2 하 Pd/C (200 mg, 10% 순도)를 첨가하였다. 혼합물을 H2로 3차례 퍼지 및 탈기 후 20°C에서 H2 (15 Psi)하 2시간 동안 교반 하였다. LCMS로 대부분의 출발물질이 남아 있음을 확인하였다. 반응 혼합물을 20°C에서 H2 (15 Psi) 하12시간 추가로 교반 하였다. LCMS로 출발물질이 남아있었고 원하는 질량이 검출되었다. 반응 혼합물을 셀라이트 패드로 여과하였다. 여과물에 20°C N2 하 Pd/C (100 mg, 10% 순도)를 첨가하였다. 혼합물을 H2로 3차례 퍼지 및 탈기 후 20°C에서 H2 (15 Psi)하 4시간 동안 교반 하였다. LCMS로 출발물질이 완전히 소모됨을 확인하였고 원하는 질량이 검출되었다. 반응 생성물을 셀라이트 패드로 여과하여 THF 용액으로 3-((4-(4-((2-아미노-7-아자스피로[3.5]노난-7-일)메틸)피페리딘-1-일)-3,5-디플루오로페닐)아미노)피페리딘-2,6-디온 (400 mg, crude)을 수득하였고 다음 반응에 바로 사용하였다. MS(M+H)+ = 476.3
단계 9. 4-((7,7-디플루오로-9-이소프로필-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(7-((1-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)-2,6-디플루오로페닐)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)-3-메톡시벤즈아미드 (화합물 25)의 합성
THF (20 mL) 내 3-((4-(4-((2-아미노-7-아자스피로[3.5]노난-7-일)메틸)피페리딘-1-일)-3,5-디플루오로페닐)아미노)피페리딘-2,6-디온 (400 mg, 841.09 μmol), 4-[(7,7-디플루오로-9-이소프로필-5-메틸-6-옥소-8H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2- 일)아미노]-3-메톡시-벤조산 (248.10mg, 588.76μmol) 및 DIPEA (543.53mg, 4.21mmol) 용액에 20°C에서 HATU (319.81 mg, 841.09 μmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 20°C에서 13시간 동안 교반 하였다. LCMS로 출발물질이 완전히 소모됨을 확인하였고 원하는 질량이 검출되었다. 반응 혼합물을 농축하였다. 조 생성물을 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (4 g 실리카 겔 컬럼, EtOAc/석유 에터 = 30-100% 이후 MeOH/EtOAc = 10-20%, 40 mL/분)로 정제하여 조 생성물을 얻고 이를 prep-HPLC (컬럼: Unisil 3-100 C18 Ultra 150*50 mm*3 um; 이동상: [H2O (FA) -ACN]; B%: 13% - 43%, 7 분)로 추가 정제아고, 용출물을 동결 건조하여 백색 고체의 4-((7,7-디플루오로-9-이소프로필-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(7-((1-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)-2,6-디플루오로페닐)피페리딘-4-일)메틸)-7- 아자스피로[3.5]노난-2-일)-3-메톡시벤즈아미드 (40.6 mg, 45.54 μmol, 5.41% 수율, 98.6% 순도)를 수득하였다. MS(M+H)+ = 879.4
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ = 10.82 (s, 1H), 8.45 (br d, J = 6.7 Hz, 1H), 8.31 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 8.22 (s, 1H), 7.89 (s, 1H), 7.53 - 7.46 (m, 2H), 6.31 (br d, J = 12.3 Hz, 2H), 6.24 (br d, J = 7.8 Hz, 1H), 4.88 (td, J = 6.6, 13.2 Hz, 1H), 4.45 - 4.37 (m, 1H), 4.35 - 4.27 (m, 1H), 4.04 (br t, J = 13.6 Hz, 2H), 3.94 (s, 3H), 3.32 (br s, 3H), 2.98-2.90 (m, 4H), 2.75 - 2.71 (m, 1H), 2.40-2.35 (m, 2H), 2.25-2.15 (m, 4H), 2.10 - 2.01 (m, 2H), 1.90-1.80 (m, 4H), 1.74 - 1.63 (m, 7H), 1.24 (br d, J = 6.7 Hz, 8H).
실시예 26. 4-((7,7-디플루오로-9-이소프로필-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(7-((1-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)(메틸)아미노)-2-플루오로페닐)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)-3-메톡시벤즈아미드 (화합물 26)의 합성
단계 1. tert-부틸 (7-((1-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)-2-플루오로페닐)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)카바메이트 (2)의 합성
THF (20 mL) 내 벤질 (7-((1-(4-((2,6-비스(벤질옥시)피리딘-3-일)아미노)-2-플루오로페닐)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)카바메이트 (500 mg, 649.40 μmol) 용액에 Boc2O (500 mg, 2.29 mmol, 526.32 μL) 및 Pd/C (200 mg, 10% 순도)를 N2 기체 하에서 첨가하고, 현탁액을 탈기하고 H2로 몇차례 퍼징하고, 20 °C H2 (15 Psi) 하에서 16시간 동안 교반 하였다. LCMS로 출발물질이 완전히 소모되었음 및 원하는 질량의 피크를 확인하였다. 반응 혼합물을 여과하고 감압 농축하였다. 잔여물을 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (Biotage; 10 g SepaFlash ® 실리카 플래시 컬럼, Eluent of 0 ~ 20 % MeOH: DCM gradient, 60 mL/분)로 정제하여 갈색 고체의 tert-부틸 (7-((1-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)-2-플루오로페닐)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)카바메이트 (300 mg, 537.93 μmol, 82.83% 수율)를 수득하였다. MS(M+H)+=558.3
단계 2. tert-부틸 (7-((1-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)(메틸)아미노)-2-플루오로페닐)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)카바메이트 (3)의 합성
MeOH (20 mL) 내 tert-부틸 (7-((1-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)-2-플루오로페닐)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)카바메이트 (300 mg, 537.93 μmol) 용액에 HOAc (32.30 mg, 537.93 μmol, 30.77 μL) 및 HCHO (750.00 mg, 9.24 mmol, 688.07 μL, 37% 순도)를 첨가하였다. 혼합물을 20 °C 에서 1시간 동안 교반 하였다. 이후 NaBH3CN (375.00 mg, 5.97 mmol)를 0 °C 에서 첨가하고, 생성된 혼합물을 20 °C 에서 15시간 동안 교반 하였다. LCMS로 출발물질이 완전히 소모되었음 및 원하는 질량의 하나의 주 피크를 확인하였다. 반응 혼합물을 H2O (15 mL)로 희석하고 농축하였다. 잔여물을 EtOAc (30 mL)에 용해한 후, 포화 NaHCO3를 첨가하여 pH=9로 조정하고 혼합물을 EtOAc (30 mL x 2)로 추출하였다. 합쳐진 유기상을 염수 (30 mL x 2)로 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하였다. 여과물을 감압 농축하였다. 잔여물을 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (Biotage; 10 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, Eluent of 0 ~ 20 % 메탄올: 디클로로메탄 gradient, 60 mL/분)로 정제하여 밝은 황색 고체의 tert-부틸 (7-((1-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)(메틸)아미노)-2-플루오로페닐)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)카바메이트 (280 mg, 489.75 μmol, 91.04% 수율)를 수득하였다. MS(M+H)+=572.3
단계 3. 3-((4-(4-((2-아미노-7-아자스피로[3.5]노난-7-일)메틸)피페리딘-1-일)-3-플루오로페닐)(메틸)아미노)피페리딘-2,6-디온 (4)의 합성
DCM (5 mL) 내 tert-부틸 (7-((1-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)(메틸)아미노)-2-플루오로페닐)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)카바메이트 (280 mg, 489.75 μmol) 용액에 TFA (4.52 g, 39.67 mmol, 2.94 mL)를 N2 기체 하에서 첨가하고, 혼합물을 20 °C 에서 1시간 동안 교반 하였다. LCMS로 출발물질이 완전히 소모되었음을 확인하고 원하는 질량의 피크(65%)를 확인하였다. 반응 혼합물을 농축하여 황색 오일의 3-((4-(4-((2-아미노-7-아자스피로[3.5]노난-7-일)메틸)피페리딘-1-일)-3-플루오로페닐)(메틸)아미노)피페리딘-2,6-디온 (286 mg, crude, TFA 염)을 수득하였다. MS(M+H)+=472.3
단계 4. 4-((7,7-디플루오로-9-이소프로필-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(7-((1-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)(메틸)아미노)-2-플루오로페닐)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)-3-메톡시벤즈아미드 (화합물 26)의 합성
DMF (4 mL) 내 4-((7,7-디플루오로-9-이소프로필-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-3-메톡시벤조산 (220 mg, 522.07 μmol) 용액에 HATU (280 mg, 736.40 μmol), DIPEA (544.12 mg, 4.21 mmol, 733.32 μL) 및 3-((4-(4-((2-아미노-7-아자스피로[3.5]노난-7-일)메틸)피페리딘-1-일)-3-플루오로페닐)(메틸)아미노)피페리딘-2,6-디온 (286 mg, 488.36 μmol, TFA 염)을 20 °C 에서 첨가하였다. 혼합물을 20 °C에서 N2 기체 하에서 16시간 동안 교반 하였다. LCMS로 출발물질이 완전히 소모되었음 및 원하는 질량의 피크(40%)를 확인하였다. 반응 혼합물을 H2O (10 mL)로 희석하고 EtOAc (20 mL x 2)로 추출하였다. 합쳐진 유기상을 염수 60 mL (20 mL x 3)로 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하였다. 여과물을 감압 농축하였다. 잔여물을 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (Biotage; 10 g SepaFlash ® 실리카 플래시 컬럼, Eluent of 0 ~ 25% MeOH : DCM gradient, 60 mL/분)로 정제하고 prep-HPLC (컬럼: Unisil 3-100 C18 Ultra 150 x 50 mm x 3 μm; 이동상: [water (FA) - ACN]; B%: 13% - 43%, 7 분; 컬럼 온도: 30 °C)로 재정제하고, 용출물을 동결 건조하여 백색 고체의 4-((7,7-디플루오로-9-이소프로필-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(7-((1-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)(메틸)아미노)-2-플루오로페닐)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)-3-메톡시벤즈아미드 (109.6 mg, 124.01 μmol, 23.75% 수율, 99% 순도)를 수득하였다. MS(M+H)+ = 875.2
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ = 10.80 (s, 1H), 8.44 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 8.35 - 8.28 (m, 1H), 8.22 (s, 1H), 7.89 (s, 1H), 7.55 - 7.44 (m, 2H), 6.89 (t, J = 9.6 Hz, 1H), 6.70 - 6.62 (m, 1H), 6.56 - 6.48 (m, 1H), 4.95 - 4.87 (m, 1H), 4.84 - 4.76 (m, 1H), 4.45 - 4.33 (m, 1H), 4.04 (t, J = 13.8 Hz, 2H), 3.94 (s, 3H), 3.34 (s, 3H), 3.18 - 3.10 (m, 2H), 2.89 - 2.76 (m, 1H), 2.67 (s, 3H), 2.56 - 2.51 (m, 6H), 2.28 - 2.13 (m, 6H), 1.87 - 1.78 (m, 3H), 1.78 - 1.71 (m, 2H), 1.65 - 1.53 (m, 5H), 1.29 - 1.18 (m, 8H).
실시예 27. 4-((7,7-디플루오로-9-이소프로필-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(7-((1-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)(메틸)아미노)페닐)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)-3-메톡시벤즈아미드 (화합물 27)의 합성
단계 1. 벤질 (7-((1-(4-니트로페닐)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)카바메이트 (2)의 합성
DMSO (15 mL) 내 벤질 (7-(피페리딘-4-일메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)카바메이트 (2 g, 4.90 mmol, HCl 염) 용액에 K2CO3 (2.03 g, 14.71 mmol) 및 1-플루오로-4-니트로벤젠 (1.04 g, 7.35 mmol, 780.12 μL)을 첨가하고, 20 °C 에서 12시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 피크(~45%)를 확인하였다. 반응 혼합물을 물 (80 mL)로 희석하고 EtOAc (60 mL x 3)로 추출하였다. 합쳐진 유기상을 염수 (100 mL)로 세척하고, 무수 소듐 설페이트로 건조하고, 여과하였다. 여과물을 감압 농축하였다. 잔여물을 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (ISCO®; 40 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, Eluent of 0~30% 석유 에터: (EtOAc / EtOH = 2/1) gradient @ 80 mL/분)로 정제하여 황색 고체의 벤질 (7-((1-(4-니트로페닐)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)카바메이트 (1.2 g, 2.41 mmol, 49.10% 수율, 98.8% 순도)를 수득하였다. MS(M+H)+=493.2.
단계 2. 벤질 (7-((1-(4-아미노페닐)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)카바메이트 (3)의 합성
EtOH (8 mL) 내 벤질 (7-((1-(4-니트로페닐)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)카바메이트 (1.2 g, 2.44 mmol) 용액에 Fe (544.16 mg, 9.74 mmol)와 H2O (8 mL) 내 NH4Cl (521.22 mg, 9.74 mmol) 용액을 첨가하였다. 혼합물을 80 °C 에서 16시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 피크(87%)를 확인하였다. 혼합물을 포화 소듐 바이카보네이트 용액 (100 mL)으로 희석한 후, 여과하여 불용성 고체를 제거하였다. 여과물을 EtOAc (50 mL x 4)로 추출하고, 합쳐진 유기상을 염수 (150 mL)로 세척하고, 무수 소듐 설페이트로 건조하고 여과하였다. 여과물을 감압 농축하여 회색 고체의 벤질 (7-((1-(4-아미노페닐)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)카바메이트 (1 g, 1.53 mmol, 62.65% 수율, 70.6% 순도)를 수득하였다. MS(M+H)+=463.3.
단계 3. 벤질 (7-((1-(4-((2,6-비스(벤질옥시)피리딘-3-일)아미노)페닐)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)카바메이트 (5)의 합성
디옥산 (10 mL) 내 벤질 (7-((1-(4-아미노페닐)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)카바메이트 (1 g, 2.16 mmol) 용액에 2,6-비스(벤질옥시)-3-브로모피리딘 (880.33 mg, 2.38 mmol), Cs2CO3 (2.11 g, 6.48 mmol) 및 Pd-PEPPSI-IHeptCl (210.27 mg, 216.16 μmol)을 첨가하였다. 혼합물을 100 °C N2 기체 하에서 12시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 피크(54%)를 확인하였다. 반응 혼합물을 물 (100 mL)로 희석하고 EtOAc (60 mL x 3)로 추출하였다. 합쳐진 유기상을 염수 (100 mL)로 세척하고, 무수 소듐 설페이트로 건조하고, 여과하였다. 여과물을 감압 농축하였다. 잔여물을 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (ISCO®; 20 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, Eluent of 0~35% 석유 에터 : (EtOAc/EtOH =2/1) gradient @ 80 mL/분)로 정제하여 갈색 오일의 벤질 (7-((1-(4-((2,6-비스(벤질옥시)피리딘-3-일)아미노)페닐)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)카바메이트 (1.45 g, 1.93 mmol, 89.21% 수율)를 수득하였다. MS(M+H)+=752.4.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ = 7.56 - 7.49 (m, 1H), 7.42 - 7.29 (m, 15H), 6.79 (s, 4H), 6.34 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 5.38 (s, 2H), 5.25 (s, 2H), 4.98 (s, 2H), 3.98 - 3.89 (m, 1H), 3.45 (d, J = 11.9 Hz, 2H), 3.33 - 3.29 (m, 4H), 2.56 - 2.52 (m, 4H), 2.0 - 2.06 (m, 2H), 1.80 - 1.44 (m, 11H), 1.24 - 1.21 (m, 2H).
단계 4. tert-부틸 (7-((1-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)페닐)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)카바메이트 (6)의 합성
THF (5 mL) 내 벤질 (7-((1-(4-((2,6-비스(벤질옥시)피리딘-3-일)아미노)페닐)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)카바메이트 (0.5 g, 664.94 μmol) 및 Boc2O (435.36 mg, 1.99 mmol, 458.27 μL) 용액에 Pd/C (50 mg, 66.49 μmol, 10% 순도)를 N2 기체 하에서 첨가하였다. 혼합물을 20 °C H2 (15 Psi) 하에서 16시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 피크(~20%)를 확인하였다. 반응 혼합물을 여과하였다. 여과물을 감압 농축하였다. 잔여물을 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (ISCO®; 12 g SepaFlash ® 실리카 플래시 컬럼, Eluent of 0~40% 석유 에터 : (EtOAc / MeOH =1/2) gradient @ 60 mL/분)로 정제하여 회색 고체의 tert-부틸 (7-((1-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)페닐)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)카바메이트 (160 mg, 278.67 μmol, 41.91% 수율, 94% 순도)를 수득하였다. MS(M+H)+=540.3
단계 5. tert-부틸 (7-((1-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)(메틸)아미노)페닐)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)카바메이트 (7)의 합성
MeOH (5 mL) 내 tert-부틸 (7-((1-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)페닐)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)카바메이트 (160 mg, 296.46 μmol) 용액에 HCHO (433.04 mg, 5.34 mmol, 397.29 μL, 37% 순도), HOAc (8.90 mg, 148.23 μmol, 8.48 μL)를 20 °C 에서 첨가하고, 1시간 동안 교반한 후, NaBH3CN (335.34 mg, 5.34 mmol)를 첨가하고, 생성된 혼합물을 20 °C 에서 12시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 주 피크(90%)를 확인하였다. 반응 혼합물을 물 (50 mL)로 희석하고 EtOAc (50 mL x 3)로 추출하였다. 합쳐진 유기상을 염수 (50 mL)로 세척하고, 무수 소듐 설페이트로 건조하고, 여과하였다. 여과물을 감압 농축하여 갈색 오일의 tert-부틸 (7-((1-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)(메틸)아미노)페닐)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)카바메이트 (160 mg, 288.95 μmol, 97.47% 수율)를 수득하였다. MS(M+H)+=554.4
단계 6. 3-((4-(4-((2-아미노-7-아자스피로[3.5]노난-7-일)메틸)피페리딘-1-일)페닐)(메틸)아미노)피페리딘-2,6-디온 (8)의 합성
DCM (3 mL) 내 tert-부틸 (7-((1-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)(메틸)아미노)페닐)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)카바메이트 (160 mg, 288.95 μmol) 용액에 TFA (1 mL)를 첨가하였다. 혼합물을 20 °C 에서 1시간 동안 교반 하였다. TLC (메탄올: 디클로로메탄 = 2:1)로 출발물질이 완전히 소모되었음을 확인하였다. 혼합물을 감압 농축하여 황색 오일의 3-((4-(4-((2-아미노-7-아자스피로[3.5]노난-7-일)메틸)피페리딘-1-일)페닐)(메틸)아미노)피페리딘-2,6-디온 (180 mg, crude, TFA 염)을 수득하였다. MS(M+H)+=454.2
단계 7. 4-((7,7-디플루오로-9-이소프로필-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(7-((1-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)(메틸)아미노)페닐)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)-3-메톡시벤즈아미드 (화합물 27)의 합성
DMF (3 mL) 내 4-((7,7-디플루오로-9-이소프로필-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-3-메톡시벤조산 (133.63 mg, 317.10 μmol) 용액에 HATU (180.86 mg, 475.65 μmol) 및 DIPEA (122.95 mg, 951.30 μmol, 165.70 μL)를 첨가하고, 30분간 교반한 후, 3-((4-(4-((2-아미노-7-아자스피로[3.5]노난-7-일)메틸)피페리딘-1-일)페닐)(메틸)아미노)피페리딘-2,6-디온 (180 mg, 317.10 μmol, TFA 염)를 첨가하였다. 혼합물을 20 °C 에서 12시간 동안 교반하였다. LCMS로 원하는 질량의 피크(40%)를 확인하였다. 반응 혼합물을 물 (30 mL)로 희석하고 EtOAc (50 mL x 3)로 추출하였다. 합쳐진 유기상을 염수 (50 mL)로 세척하고, 무수 소듐 설페이트로 건조하고, 여과하였다. 여과물을 감압 농축하였다. 잔여물을 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (ISCO®; 20 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, Eluent of 0~80% 석유 에터/ (EtOAc/EtOH; v/v=1:2) gradient @ 60 mL/분)로 정제한 후, prep-HPLC(컬럼: Waters Xbridge 150 x 50 mm x 10 μm; 이동상: [water (NH4HCO3)-ACN]; B%: 50% - 80%, 10 분)로 재정제하고, 용출물을 동결 건조하여 백색 고체의 4-((7,7-디플루오로-9-이소프로필-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(7-((1-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)(메틸)아미노)페닐)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)-3-메톡시벤즈아미드 (21.4 mg, 24.10 μmol, 7.60% 수율, 96.5% 순도)를 수득하였다. MS(M+H)+=857.4.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ = 10.72 (s, 1H), 8.41 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 8.33 - 8.28 (m, 1H), 8.22 (s, 1H), 7.88 (s, 1H), 7.53 - 7.46 (m, 2H), 6.83 - 6.78 (m, 2H), 6.73 - 6.71 (m, 2H), 4.91 - 4.84 (m, 1H), 4.71 (dd, J = 4.8, 12.3 Hz, 1H), 4.45 - 4.34 (m, 1H), 4.04 (t, J = 13.6 Hz, 2H), 3.94 (s, 3H), 3.42 (d, J = 11.6 Hz, 2H), 3.29 (s, 3H), 2.85 - 2.77 (m, 1H), 2.67 (s, 3H), 2.57 - 2.52 (m, 3H), 2.29 - 2.09 (m, 8H), 1.89 - 1.71 (m, 6H), 1.63 - 1.51 (m, 5H), 1.24 (d, J = 6.8 Hz, 6H), 1.22 - 1.14 (m, 2H).
실시예 28. 4-((7,7-디플루오로-9-이소프로필-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(7-((1-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)페닐)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)-3-메톡시벤즈아미드 (화합물 28)의 합성
단계 1. 3-((4-(4-((2-아미노-7-아자스피로[3.5]노난-7-일)메틸)피페리딘-1-일)페닐)아미노)피페리딘-2,6-디온 (2)의 합성
DCM (2 mL) 내 tert-부틸 (7-((1-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)페닐)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)카바메이트 (160 mg, 296.46 μmol) 용액에 TFA (33.80 mg, 296.46 μmol, 21.95 μL)를 첨가하였다. 혼합물을 20 °C 에서 1시간 동안 교반 하였다. TLC (메탄올: 디클로로메탄 = 2:1)로 새로운 스팟 형성을 확인하였다. 혼합물을 감압 농축하여 녹색 오일의 3-((4-(4-((2-아미노-7-아자스피로[3.5]노난-7-일)메틸)피페리딘-1-일)페닐)아미노)피페리딘-2,6-디온 (0.2 g, crude, TFA 염)을 수득하였다. MS(M+H)+=440.4.
단계 2. 4-((7,7-디플루오로-9-이소프로필-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(7-((1-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)페닐)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)-3-메톡시벤즈아미드 (화합물 28)의 합성
DMF (3 mL) 내 4-((7,7-디플루오로-9-이소프로필-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-3-메톡시벤조산 (160 mg, 379.69 μmol) 용액에 HATU (216.55 mg, 569.53 μmol) 및 DIPEA (245.36 mg, 1.90 mmol, 330.68 μL)를 첨가하고, 30분간 교반 하였다. 이후 3-((4-(4-((2-아미노-7-아자스피로[3.5]노난-7-일)메틸)피페리딘-1-일)페닐)아미노)피페리딘-2,6-디온 (199.69 mg, 360.70 μmol, TFA 염)을 첨가하고 생성된 혼합물을 20 °C 에서 12시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 피크(~50%)를 확인하였다. 반응 혼합물을 물 (30 mL)로 희석하고 EtOAc (20 mL x 3)로 추출하였다. 합쳐진 유기상을 염수 (50 mL)로 세척하고, 무수 소듐 설페이트로 건조하고, 여과하고 감압 농축하였다. 잔여물을 prep-HPLC(컬럼: Phenomenex luna C18 150 x 25 mm x 10 μm; 이동상: [water (FA) - ACN]; B%: 3% - 33%,10 분) 후 prep-HPLC (컬럼: Waters Xbridge 150 x 25 mm x 5 μm; 이동상: [water (NH4HCO3) - ACN]; B%: 42% - 72%, 8 분)로 정제하고 동결 건조하여 회색 고체의 4-((7,7-디플루오로-9-이소프로필-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(7-((1-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)페닐)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)-3-메톡시벤즈아미드 (41.5 mg, 43.96 μmol, 11.58% 수율, 89.3% 순도)를 수득하였다. MS(M+H)+=843.2.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ = 10.76 (s, 1H), 8.43 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 8.30 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 8.22 (s, 1H), 7.88 (s, 1H), 7.53 - 7.46 (m, 2H), 6.75 - 6.73 (m, 2H), 6.60 - 6.57 (m, 2H), 5.36 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 4.91 - 4.84 (m, 1H), 4.42 - 4.35 (m, 1H), 4.21 - 4.14 (m, 1H), 4.04 (t, J = 13.8 Hz, 2H), 3.94 (s, 3H), 3.41 - 3.40 (m, 2H), 3.32 (s, 3H), 2.75 - 2.67 (m, 1H), 2.60 - 2.57 (m, 3H), 2.27 - 2.06 (m, 8H), 1.91 - 1.68 (m, 6H), 1.64 - 1.51 (m, 5H), 1.24 (d, J = 6.6 Hz, 6H), 1.21 - 1.13 (m, 2H).
실시예 29. 4-((7,7-디플루오로-9-이소프로필-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(7-((1-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)(메틸)아미노)-2,6-디플루오로페닐)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)-3-메톡시벤즈아미드 (화합물 29)의 합성
단계 1. tert-부틸 (7-((1-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)-2,6-디플루오로페닐) 피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)카바메이트 (2)의 합성
THF (20 mL) 내 벤질 (7-((1-(4-((2,6-비스(벤질옥시)피리딘-3-일)아미노)-2,6-디플루오로페닐)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)카바메이트 (500 mg, 634.57 μmol) 및 Boc2O (415.48 mg, 1.90 mmol) 용액에 Pd/C (100 mg, 10% 순도)를 N2 기체 하에서 첨가하였다. 생성된 혼합물을 탈기하고 H2로 3차례 퍼징하고, 현탁액을 20 °C에서 H2 (15 Psi) 하에서 16시간 동안 교반 하였다. LCMS로 중간체 및 원하는 질량을 확인하였다. 혼합물을 여과하였다. 여과물에 Pd/C (200 mg, 10% 순도)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 20 °C에서 H2 (15 Psi) 하에서 추가로 18시간 동안 교반 하였다. LCMS로 중간체가 완전히 소모되었음 및 원하는 질량의 주 피크를 확인하였다. 반응 혼합물을 여과하고 여과물을 농축하여 어두운 녹색 고체의 tert-부틸 (7-((1-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)-2,6-디플루오로페닐) 피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)카바메이트 (360 mg, crude)를 수득하였다. 조 생성물을 다음 단계에 바로 사용하였다. MS(M+H)+=576.5
단계 2. tert-부틸 (7-((1-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)(메틸)아미노)-2,6-디플루오로페닐)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)카바메이트 (3)의 합성
MeOH (10 mL) 내 tert-부틸 (7-((1-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)-2,6-디플루오로페닐) 피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)카바메이트 (360 mg, 625.34 μmol), HCHO (1.01 g, 12.51 mmol, 37% 순도) 및 AcOH (37.55 mg, 625.34 μmol) 용액을 20 °C 에서 1시간 동안 교반 하였다. 이후 NaBH3CN (785.95 mg, 12.51 mmol)를 첨가하고 생성된 혼합물을 20 °C 에서 14시간 동안 교반 하였다. LCMS로 출발물질이 남아있음 및 원하는 질량의 피크를 확인하였다. 또다른 분량의 HCHO (507.47 mg, 6.25 mmol, 465.57 μL, 37% 순도)를 혼합물에 첨가하고 혼합물을 20 °C 에서 1시간 동안 교반 하였다. 이후 NaBH3CN (392.97 mg, 6.25 mmol)를 첨가하고 생성된 혼합물을 20 °C 에서 15시간 동안 교반 하였다. LCMS로 출발물질이 남아있음 및 원하는 질량의 피크를 확인하였다. 반응 혼합물을 농축하여 메탄올을 제거하였다. 잔여물을 EtOAc (20 mL)에 용해시키고 NaHCO3 용액 (10 mL)으로 세척하고, Na2SO4로 건조하고 여과하고 농축하였다. 조 생성물을 prep-TLC (DCM : MeOH = 10:1, Rf = 0.6)로 정제하여 조 생성물을 얻었다. 조 생성물을 MeOH (6 mL)에 용해시킨 후, HCHO (405.98 mg, 5.00 mmol, 372.46 μL, 37% 순도) 및 AcOH (37.55 mg, 625.34 μmol, 35.80 μL)를 추가하였다. 혼합물을 20 °C 에서 1시간 동안 교반 하였다. NaBH3CN (314.38 mg, 5.00 mmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 20 °C 에서 13시간 동안 교반 하였다. LCMS로 미량의 출발물질이 남아있음 및 원하는 질량의 피크를 확인하였다. 반응 혼합물을 농축하여 메탄올을 제거하였다. 잔여물을 EtOAc (20 mL)에 용해시키고 NaHCO3 용액 (10 mL)으로 세척하고, Na2SO4로 건조하고 여과하고 농축하여 황색 오일의 tert-부틸 (7-((1-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)(메틸)아미노)-2,6-디플루오로페닐)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)카바메이트 (150 mg, crude)를 수득하였다. MS(M+H)+=590.5
단계 3. 3-((4-(4-((2-아미노-7-아자스피로[3.5]노난-7-일)메틸)피페리딘-1-일)-3,5-디플루오로페닐)(메틸)아미노)피페리딘-2,6-디온 (4)의 합성
DCM (4 mL) 내 tert-부틸 (7-((1-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)(메틸)아미노)-2,6-디플루오로페닐)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)카바메이트 (150 mg, 254.36 μmol) 용액에 TFA (1.54 g, 13.51 mmol)를 20 °C 에서 첨가하였다. 생성된 용액을 20 °C 에서 30분간 교반 하였다. LCMS로 출발물질이 완전히 소모되었음 및 원하는 질량의 주 피크를 확인하였다. 반응 혼합물을 농축하여 갈색 오일의 3-((4-(4-((2-아미노-7-아자스피로[3.5]노난-7-일)메틸)피페리딘-1-일)-3,5-디플루오로페닐)(메틸)아미노)피페리딘-2,6-디온 (150 mg, crude, TFA 염)을 수득하였다. MS(M+H)+=490.4
단계 4. 4-((7,7-디플루오로-9-이소프로필-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(7-((1-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)(메틸)아미노)-2,6-디플루오로페닐)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)-3-메톡시벤즈아미드 (화합물 29)의 합성
DMF (3 mL) 내 3-((4-(4-((2-아미노-7-아자스피로[3.5]노난-7-일)메틸)피페리딘-1-일)-3,5-디플루오로페닐)(메틸)아미노)피페리딘-2,6-디온 (150 mg, 248.50 μmol, TFA 염), 4-[(7,7-디플루오로-9-이소프로필-5-메틸-6-옥소-8H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노]-3-메톡시-벤조산 (73.30 mg, 173.95 μmol) 및 DIPEA (192.70 mg, 1.49 mmol) 혼합물에 HATU (94.49 mg, 248.50 μmol)를 20 °C 에서 첨가하였다. 생성된 혼합물을 20 °C 에서 30분간 교반 하였다. LCMS로 출발물질이 완전히 소모됨과 원하는 질량을 확인하였다. 반응 혼합물을 물 (20 mL)에 붓고, EtOAc (10 mL x 3)로 추출하였다. 합쳐진 유기상을 염수 (10 mL)로 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하고 농축하였다. 조 생성물을 prep-HPLC (컬럼: Unisil 3-100 C18 Ultra 150 x 50 mm x 3 μm; 이동상: [water (FA) - ACN]; B%: 18% - 48%, 7 분)로 정제하고, 용출물을 동결 건조하여 백색 고체의 4-((7,7-디플루오로-9-이소프로필-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(7-((1-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)(메틸)아미노)-2,6-디플루오로페닐)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)-3-메톡시벤즈아미드 (10.3 mg, 9.93 μmol, 3.99% 수율, 90.5% 순도, FA 염)를 수득하였다. MS(M+H)+=893.5
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ = 10.84 (br s, 1H), 8.44 (br d, J = 7.5 Hz, 1H), 8.30 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 8.26 (s, 1H), 8.22 (s, 1H), 7.89 (s, 1H), 7.53 - 7.46 (m, 2H), 6.49 (s, 1H), 6.45 (s, 1H), 4.92 - 4.80 (m, 2H), 4.45 - 4.35 (m, 1H), 4.04 (br t, J = 13.9 Hz, 2H), 3.94 (s, 3H), 3.32 (br s, 3H), 2.98 - 2.92 (m, 4H), 2.84 - 2.77 (m, 1H), 2.67 (s, 3H), 2.582.55 (m, 1H), 2.32-2.20 (m, 5H), 2.17 - 2.10 (m, 4H), 1.87 - 1.77 (m, 3H), 1.74 - 1.65 (m, 2H), 1.63 - 1.51 (m, 5H), 1.24 (d, J = 6.6 Hz, 6H), 1.20 - 1.13 (m, 2H).
실시예 30. 4-((7,7-디플루오로-9-이소프로필-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-((7-((1-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)-2,6-디플루오로페닐)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)메틸)-3-메톡시벤즈아미드 (화합물 30)의 합성
단계 1. tert-부틸 2-(아미노메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-7-카복실레이트 (2)의 합성
MeOH (30 mL) 내 tert-부틸 2-시아노-7-아자스피로[3.5]노난-7-카복실레이트 (1.5 g, 5.99 mmol) 용액에 NH3.H2O (2.73 g, 21.81 mmol, 3 mL, 28% 순도) 및 Raney-Ni (300.00 mg, 3.50 mmol)를 N2 하에서 첨가하고, H2로 혼합물에 버블링하고, 혼합물을 20 °C에서 H2 (45 psi) 하에서 16시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 주 피크를 확인하였고, 혼합물을 여과하고 여과물을 진공 농축하여 황색 오일의 tert-부틸 2-(아미노메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-7-카복실레이트 (1.5 g, crude)를 수득하였다. MS(M+H)+= 255.1.
단계 2. tert-부틸 2-((((벤질옥시)카보닐)아미노)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-7-카복실레이트 (3)의 합성
THF (28 mL) 및 H2O (7 mL) 내 tert-부틸 2-(아미노메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-7-카복실레이트 (1.4 g, crude) 용액에 CbzCl (1.13 g, 6.60 mmol, 938.92 μL) 및 Na2CO3 (1.17 g, 11.01 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 20 °C 에서 16시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 주 피크를 확인하고, 혼합물을 물 (30 mL)로 희석하고 EtOAc (25 mL x 3)로 추출하고, 유기상을 Na2SO4로 건조하고, 여과하고 진공 농축하여 백색 파우더의 tert-부틸 2-((((벤질옥시)카보닐)아미노)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-7-카복실레이트 (2.6 g, crude)를 수득하였다. MS(M+H)+= 389.1
단계 3. 벤질 ((7-아자스피로[3.5]노난-2-일)메틸)카바메이트 (4)의 합성
디옥산 (2 mL) 내 tert-부틸 2-((((벤질옥시)카보닐)아미노)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-7-카복실레이트 (100 mg, crude) 용액에 HCl/디옥산 (4 M, 1.00 mL)을 첨가하고, 혼합물을 20 °C 에서 1시간 동안 교반 하였다. LCMS로 출발물질이 소모되었음 및 원하는 질량을 확인하였다. 혼합물을 진공 농축하여 황색 오일의 벤질 ((7-아자스피로[3.5]노난-2-일)메틸)카바메이트 (110 mg, crude)를 수득하였다. MS(M+H)+= 289.1
단계 4. 4-(((tert-부틸디페닐실릴)옥시)메틸)-1-(2,6-디플루오로-4-니트로페닐)피페리딘 (6)의 합성
DMSO (10 mL) 내 4-(((tert-부틸디페닐실릴)옥시)메틸)피페리딘 (505.16 mg, 1.43 mmol) 용액에 1,2,3-트리플루오로-5-니트로벤젠 (230 mg, 1.30 mmol) 및 K2CO3 (538.52 mg, 3.90 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 20 °C 에서 16시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량을 확인하고, 혼합물을 물 (15 mL)로 희석하고 EtOAc (15 mL x 3)로 추출하고, 유기상을 Na2SO4로 건조하고, 여과하고 진공 농축하였다. 조 생성물을 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (Biotage, 4 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, Eluent of 4~60% EtOAc/석유 에터 gradient @ 15 mL/분)로 정제하여 황색 오일의 4-(((tert-부틸디페닐실릴)옥시)메틸)-1-(2,6-디플루오로-4-니트로페닐)피페리딘 (420 mg, 822.49 μmol, 63.32% 수율, 100% 순도)을 수득하였다. MS(M+H)+= 511.2.
단계 5. (1-(2,6-디플루오로-4-니트로페닐)피페리딘-4-일)메탄올 (7)의 합성
DMSO (10 mL) 내 4-(((tert-부틸디페닐실릴)옥시)메틸)-1-(2,6-디플루오로-4-니트로페닐)피페리딘 (420 mg, 822.49 μmol) 용액에 CsF (187.40 mg, 1.23 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 20 °C 에서 16시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 주 피크를 확인하고, 혼합물을 물 (3 mL)로 희석하고 EtOAc (5 mL x 3)로 추출하고, 유기상을 Na2SO4로 건조하고, 여과하고 진공 농축하여 황색 오일의 (1-(2,6-디플루오로-4-니트로페닐)피페리딘-4-일)메탄올 (450 mg, crude)을 수득하였다. MS(M+H)+ = 273.0
단계 6. 1-(2,6-디플루오로-4-니트로페닐)피페리딘-4-카브알데히드 (8)의 합성
DCM (6 mL) 내 DMSO (717.45 mg, 9.18 mmol, 717.45 μL) 용액에 옥살릴클로라이드 (233.12 mg, 1.84 mmol, 160.77 μL)를 -70 °C 에서 첨가하고 10분간 교반 하고, DCM (2 mL) 내 (1-(2,6-디플루오로-4-니트로페닐)피페리딘-4-일)메탄올 (250 mg,crude) 용액을 -65 °C 에서 20분에 걸쳐 첨가하고 TEA (464.60 mg, 4.59 mmol, 639.07 μL)를 -65 °C 에서 한 방울씩 가한 후, 20 °C 까지 승온하고 30분간 교반 하고, TLC(EtOAc/석유 에터=1/1)로 출발물질이 소모되었음을 확인하였다. 혼합물을 물 (3 mL)로 희석하고 EtOAc (5 mL x 3)로 추출하고, 유기상을 Na2SO4로 건조하고, 여과하고 진공 농축하여 황색 오일의 1-(2,6-디플루오로-4-니트로페닐)피페리딘-4-카브알데히드 (200 mg, crude)를 수득하였고, 다음 단계에 바로 사용하였다. MS(M+H)+ = 271.2.
단계 7. 벤질 ((7-((1-(2,6-디플루오로-4-니트로페닐)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)메틸)카바메이트 (9)의 합성
DCE (2 mL) 내 벤질 ((7-아자스피로[3.5]노난-2-일)메틸)카바메이트 (200 mg, crude) 용액에 1-(2,6-디플루오로-4-니트로페닐)피페리딘-4-카브알데히드 (96.17 mg, 296.04 μmol, HCl), NaOAc (60.71 mg, 740.11 μmol) 및 AcOH (4.44 mg, 74.01 μmol, 4.23 μL)을 첨가하고, 혼합물을 20 °C 에서 30분간 교반 하고, NaBH(OAc)3 (188.23 mg, 888.13 μmol)를 첨가하고, 혼합물을 20 °C 에서 15.5시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 피크를 확인하고, 혼합물을 물 (3 mL)로 희석하고 EtOAc (5 mL x 3)로 추출하고, 유기상을 소듐 설페이트로 건조하고, 여과하고 진공 농축하였다. 조 생성물을 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (Biotage, 4 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, Eluent of 4~98% EtOAc/석유 에터 gradient @ 20 mL/분)로 정제하여 황색 오일의 벤질 ((7-((1-(2,6-디플루오로-4-니트로페닐)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)메틸)카바메이트 (700 mg, crude)를 수득하였다. MS(M+H)+=543.3.
단계 8. (7-((1-(2,6-디플루오로-4-니트로페닐)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)메탄아민 (10)의 합성
TFA (3 mL) 내 벤질 ((7-((1-(2,6-디플루오로-4-니트로페닐)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)메틸)카바메이트 (700 mg, crude) 혼합물을 40 °C 에서 16시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량을 확인하고, 혼합물을 진공 농축하여 갈색 오일의 (7-((1-(2,6-디플루오로-4-니트로페닐)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)메탄아민 (500 mg, crude)을 수득하였다. MS(M+H)+=409.2.
단계 9. tert-부틸 ((7-((1-(2,6-디플루오로-4-니트로페닐)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)메틸)카바메이트 (11)의 합성
디옥산 (10 mL) 내 (7-((1-(2,6-디플루오로-4-니트로페닐)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)메탄아민 (500 mg, crude) 용액에 TEA (1.24 g, 12.24 mmol, 1.70 mL)를 첨가하여 pH를 8로 조정하고, Boc2O (534.29 mg, 2.45 mmol, 562.41 μL)를 첨가하고 혼합물을 20 °C 에서 16시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량을 확인하고,혼합물을 물 (3 mL)로 희석하고 EtOAc (5 mL x 3)로 추출하고, 유기상을 Na2SO4로 건조하고, 여과하고 진공 농축하였다. 조 생성물을 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (Biotage, 4 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, Eluent of 4~77% EtOAc/석유 에터 gradient @ 20 mL/분)로 정제하여 황색 오일의 tert-부틸 ((7-((1-(2,6-디플루오로-4-니트로페닐)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)메틸)카바메이트 (140 mg, 261.50 μmol, 21.36% 수율, 95% 순도)를 수득하였다. MS(M+H)+=509.2
단계 10. tert-부틸 ((7-((1-(4-아미노-2,6-디플루오로페닐)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)메틸)카바메이트 (12)의 합성
EtOH (5 mL) 및 H2O (5 mL) 내 tert-부틸 ((7-((1-(2,6-디플루오로-4-니트로페닐)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)메틸)카바메이트 (140 mg, 275.27 μmol) 용액에 Fe (153.72 mg, 2.75 mmol) 및 NH4Cl (147.24 mg, 2.75 mmol)를 80 °C 에서 첨가하고, 혼합물을 80 °C 에서 2시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 주 피크를 확인하고, 혼합물을 NaHCO3 수용액 (10 mL)으로 희석하고, EtOAc (10 mL x 3)로 추출하고, 유기상을 소듐 설페이트로 건조하고, 여과하고 진공 농축하여 황색 오일의 tert-부틸 ((7-((1-(4-아미노-2,6-디플루오로페닐)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)메틸)카바메이트 (140 mg, crude)를 수득하였고 다음 단계에 바로 사용하였다. MS(M+H)+=479.2
단계 11. tert-부틸 ((7-((1-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)-2,6-디플루오로페닐)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)메틸)카바메이트 (13)의 합성
DMF (0.2 mL) 내 tert-부틸 ((7-((1-(4-아미노-2,6-디플루오로페닐)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)메틸)카바메이트 (120 mg, crude) 용액에 3-브로모피페리딘-2,6-디온 (481.41 mg, 2.51 mmol) 및 NaHCO3 (421.25 mg, 5.01 mmol, 195.02 μL)를 첨가하고, 혼합물을 80 °C 에서 72시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량을 확인하고, 혼합물을 물 (10 mL)로 희석하고, EtOAc (10 mL x 3)로 추출하고, 유기상을 소듐 설페이트로 건조하고, 여과하고 진공 농축하였다. 조 생성물을 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (Biotage, 4 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, Eluent of 4~70% EtOAc/석유 에터 gradient @ 20 mL/분)로 정제하여 황색 오일의 tert-부틸 ((7-((1-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)-2,6-디플루오로페닐)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)메틸)카바메이트 (80 mg, 135.66 μmol, 54.11% 수율, 100% 순도)를 수득하였다. MS(M+H)+=590.1
단계 12. 3-((4-(4-((2-(아미노메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-7-일)메틸)피페리딘-1-일)-3,5-디플루오로페닐)아미노)피페리딘-2,6-디온 (14)의 합성
DCM (2.5 mL) 내 tert-부틸 ((7-((1-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)-2,6-디플루오로페닐)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)메틸)카바메이트 (70 mg, 118.70 μmol) 용액에 TFA (770.00 mg, 6.75 mmol, 0.5 mL)를 첨가하고, 혼합물을 20 °C 에서 1시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량을 확인하고, 혼합물을 진공 농축하여 갈색 오일의 3-((4-(4-((2-(아미노메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-7-일)메틸)피페리딘-1-일)-3,5-디플루오로페닐)아미노)피페리딘-2,6-디온 (100 mg, crude, TFA)을 수득하였고, 다음 단계에 바로 사용하였다. MS(M+H)+=490.3
단계 13. 4-((7,7-디플루오로-9-이소프로필-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-((7-((1-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)-2,6-디플루오로페닐)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)메틸)-3-메톡시벤즈아미드 (화합물 30)의 합성
DMF (2 mL) 내 4-((7,7-디플루오로-9-이소프로필-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-3-메톡시벤조산 (50 mg, 118.65 μmol) 용액에 HATU (67.67 mg, 177.98 μmol) 및 DIPEA (46.01 mg, 355.96 μmol, 62.00 μL)를 첨가하고, 3-((4-(4-((2-(아미노메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-7-일)메틸)피페리딘-1-일)-3,5-디플루오로페닐)아미노)피페리딘-2,6-디온 (71.62 mg, crude, TFA)을 첨가하고 혼합물을 25 °C 에서 16시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 피크(46%)를 확인하고, 혼합물을 물 (3 mL)로 희석하고, EtOAc (5 mL x 3)로 추출하고, 유기상을 소듐 설페이트로 건조하고, 여과하고 진공 농축하였다. 조 생성물을 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (Biotage, 4 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, Eluent of 4~15% EtOAc/MeOH gradient @ 20 mL/분)로 정제하고 Prep-HPLC (컬럼: Waters Xbridge 150*25mm* 5um;이동상: [water( NH4HCO3)-ACN];B%: 50%-80%,8분)로 재정제하고 동결 건조하여 백색 파우더의 4-((7,7-디플루오로-9-이소프로필-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-((7-((1-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)-2,6-디플루오로페닐)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)메틸)-3-메톡시벤즈아미드 (9.3 mg, 9.48 μmol, 7.99% 수율, 91.0% 순도)를 수득하였다. MS(M+H)+=893.5
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ = 10.81 (s, 1H), 8.38 - 8.28 (m, 2H), 8.22 (s, 1H), 7.89 (s, 1H), 7.54 - 7.47 (m, 2H), 6.31 (d, J = 12.2 Hz, 2H), 6.22 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 4.88 (td, J = 6.6, 13.5 Hz, 1H), 4.35 - 4.27 (m, 1H), 4.04 (t, J = 13.6 Hz, 2H), 3.94 (s, 3H), 3.51 - 3.46 (m, 3H), 3.38 (s, 3H), 2.92 (d, J = 6.7 Hz, 4H), 2.82 - 2.72 (m, 2H), 2.30 - 2.02 (m, 7H), 1.88 - 1.76 (m, 3H), 1.68 (d, J = 11.7 Hz, 2H), 1.58 - 1.43 (m, 7H), 1.25 (d, J = 6.7 Hz, 6H), 1.20 - 1.10 (m, 2H).
실시예 31. 4-((7,7-디플루오로-9-이소프로필-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(4-(7-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)(메틸)아미노)페닐)-2,7-디아자스피로[3.5]노난-2-일)피페리딘-1-일)-3-메톡시벤즈아미드 (화합물 31)의 합성
단계 1. tert-부틸 7-(4-니트로페닐)-2,7-디아자스피로[3.5]노난-2-카복실레이트 (3)의 합성
DMSO (10 mL) 내 1-플루오로-4-니트로벤젠 (1 g, 7.09 mmol, 751.88 μL) 및 tert-부틸 2,7-디아자스피로[3.5]노난-2-카복실레이트(1.5 g, 6.63 mmol) 용액에 K2CO3 (2.75 g, 19.88 mmol)를 첨가하고 혼합물을 60°C에서 5시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 메인 피크 (100 %)가 검출되었다. 혼합물을 물 (30 mL)로 희석 후 여과했다. 여과 케이크를 물 (50 mL)로 세척 하고 모아 감압 건조하여 황색 고체의 tert-부틸 7-(4-니트로페닐)-2,7-디아자스피로[3.5]노난-2-카복실레이트 (2.1 g, crude)를 수득하였다. MS(M+H)+ = 348.1
단계 2. tert-부틸 7-(4-아미노페닐)-2,7-디아자스피로[3.5]노난-2-카복실레이트 (4)의 합성
EtOH (40 mL) 내 tert-부틸 7-(4-니트로페닐)-2,7-디아자스피로[3.5]노난-2-카복실레이트 (2.1 g, 6.04 mmol) 용액에 N2 기체 하 Pd/C (0.2 g, 10% 순도)를 첨가 후 혼합물을 H2 하 3차례 탈기 및 퍼지하고, 이후 혼합물을 H2 (15 Psi) 하 20°C에서 14시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 메인 피크 (100 %)가 검출되었다. 혼합물을 여과하였다. 여과 케이크를 MeOH (100 mL)로 세척했다. 여과물을 감압 농축하여 회색 고체의 tert-부틸 7-(4-아미노페닐)-2,7-디아자스피로[3.5]노난-2-카복실레이트 (1.9 g, crude)를 수득하였다. MS(M+H)+ = 318.2
단계 3. tert-부틸 7-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)페닐)-2,7-디아자스피로[3.5]노난-2-카복실레이트 (5)의 합성
MeCN (10 mL) 내 tert-부틸 7-(4-아미노페닐)-2,7-디아자스피로[3.5]노난-2-카복실레이트 (1 g, 3.15 mmol) 및 3-브로모피페리딘-2,6-디온 (1.31 g, 6.84 mmol) 용액에 NaHCO3 (1.44 g, 17.11 mmol, 665.33 μL)를 첨가하고 혼합물을 80°C에서 14시간 동안 교반 하였다. HPLC로 원하는 질량의 피크 (92%)가 검출되었다. 혼합물을 여과하고, 여과 케이크를 EtOAc (50 mL) 및 THF (50 mL)로 세척했다. 여과물을 감압 농축하였다. 잔여물을 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (12 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, Eluent of 70~100% EtOAc/석유 에터 gradient @ 80 mL/분)로 정제하여 흑갈색 고체의 tert-부틸 7-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)페닐)-2,7-디아자스피로[3.5]노난-2-카복실레이트 (1 g, 1.87 mmol, 59.26% 수율, 80% 순도)를 수득하였다. MS(M+H)+ = 429.2
단계 4. tert-부틸 7-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)(메틸)아미노)페닐)-2,7-디아자스피로[3.5]노난-2-카복실레이트 (6)의 합성
MeOH (20 mL) 내 tert-부틸 7-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)페닐)-2,7-디아자스피로[3.5]노난-2-카복실레이트 (1 g, 1.87 mmol, 80% 순도) 용액에 HCHO (196.20 mg, 2.42 mmol, 180 μL, 37% 순도) 및 AcOH (105.00 mg, 1.75 mmol, 0.1 mL)를 첨가하고 혼합물을 20°C에서 30분 동안 교반 하였다. NaBH3CN (352 mg, 5.60 mmol)를 첨가하고 혼합물을 20°C에서 3시간 동안 추가 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 피크 (70%)가 검출되었다. 추가의 HCHO (109.00 mg, 1.34 mmol, 0.1 mL, 37% 순도)를 첨가하고 혼합물을 20°C에서 30분 동안 교반 하였다. 이후 NaBH3CN (351.95 mg, 5.60 mmol)를 첨가하고 혼합물을 20°C에서 1시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량이 검출되었고 혼합물을 20°C에서 2시간 동안 교반 하였다. 혼합물을 감압 농축했다. 조 생성물을 H2O (30 mL)로 희석 후 EtOAc (10 mL x 3)로 추출하고, 합친 유기상을 물 (10 mL x 2)로 세척하고 Na2SO4 로 건조, 여과하였다. 여과물을 감압 농축하여 회색 고체의 tert-부틸 7-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)(메틸)아미노)페닐)-2,7-디아자스피로[3.5]노난-2-카르복카복실레이트 (1 g, crude)를 수득하였다. MS(M+H)+ = 443.4
단계 5. 3-((4-(2,7-디아자스피로[3.5]노난-7-일)페닐)(메틸)아미노)피페리딘-2,6-디온 (7)의 합성
DCM (0.5 mL) 내 tert-부틸 7-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)(메틸)아미노)페닐)-2,7-디아자스피로[3.5]노난-2-카복실레이트 (0.1 g, 225.96 μmol) 용액에 0°C에서 TFA (246.40 mg, 2.16 mmol, 160 μL)를 첨가하고 혼합물을 20°C에서 1시간 동안 교반 하였다. LCMS로 미량의 출발물질이 남아있음 및 원하는 질량이 검출되었다. 혼합물을 감압 농축하여 흑갈색 오일의 3-((4-(2,7-디아자스피로[3.5]노난-7-일)페닐)(메틸)아미노)피페리딘-2,6-디온 (0.1 g, crude, TFA 염)을 수득하였다. MS(M+H)+ = 343.4
단계 6. 4-((7,7-디플루오로-9-이소프로필-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(4-(7-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)(메틸)아미노)페닐)-2,7-디아자스피로[3.5]노난-2-일)피페리딘-1-일)-3-메톡시벤즈아미드 (화합물 31)의 합성
DCE (10 mL) 내 3-((4-(2,7-디아자스피로[3.5]노난-7-일)페닐)(메틸)아미노)피페리딘-2,6-디온 (0.3 g, 657.24 μmol, TFA 염) 용액에 0°C에서 TEA (392.58 mg, 3.88 mmol, 540 μL) 및 4A MS(0.3 g)에 이어 4-((7,7-디플루오로-9-이소프로필-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-3-메톡시-N-(4-옥소피페리딘-1-일)벤즈아미드 (450 mg, 869.52 μmol)을 첨가하였다. 혼합물을 0°C에서 30분 동안 교반 하였다. 이후 NaBH(OAc)3 (417.59 mg, 1.97 mmol)를 첨가하고 혼합물을 20°C에서 3시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량이 검출되었다. 혼합물을 여과하고 여과 케이크를 DCM (20 mL)로 세척했다. 여과물을 감압 농축하였다. 잔여물을 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (12 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, Eluent of 25~100% MeOH/ EtOAc gradient @ 80 mL/분)로 정제했다. 조 생성물을 20°C에서 MTBE (10 mL)로 30분 동안 분쇄하였다. 혼합물을 여과하고 여과 케이크를 MTBE (20 mL)로 세척했다. 여과물을 DCM/MeOH=10/1 (20 mL) 및 H2O (10 mL)로 희석 후 DCM/MeOH=10/1 (10 mL x 2)로 추출하고, 합친 유기상을 물 (10 mL x 2)로 세척 후 Na2SO4로 건조 및 여과했다. 여과물을 감압 농축하였다. 생성물을 ACN (6 mL), MeOH (2 mL) 및 탈이온수 (40 mL)로 세척 후 동결 건조하여 청색 고체의 생성물(214.6 mg, 221.22 μmol, 33.66% 수율, 87% 순도)을 얻었다. 80 mg의 생성물 (87 % 순도)을 prep-HPLC (컬럼: Phenomenex Synergi Polar-RP 100*25 mm*4um; 이동상: [H2O (TFA) -ACN]; B%: 19%- 39%, 7 분)로 정제하고 용출물을 동결 건조했다. 70 mg의 생성물 (87 % 순도)을 prep-HPLC (컬럼: Phenomenex Synergi Polar-RP 100*25mm*4um; 이동상: [H2O (TFA) -ACN]; B%: 20%-40%, 7분)로 정제하였다. 용출물을 합하고 동결 건조하여 회색 고체의 4-((7,7-디플루오로-9-이소프로필-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(4-(7-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)(메틸)아미노)페닐)-2,7-디아자스피로[3.5]노난-2-일)피페리딘-1-일)-3-메톡시벤즈아미드 (140.4 mg, 133.37 μmol, 75.04% 수율, 91% 순도, 2TFA)를 수득하였다. MS(M+H)+ = 844.2
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ = 10.85 - 10.80 (m, 1H), 9.55 - 9.48 (m, 1H), 8.31 - 8.20 (m, 2H), 8.14 - 8.02 (m, 1H), 7.46 - 7.40 (m, 2H), 7.39 - 7.15 (m, 2H), 6.94 - 6.83 (m, 2H), 4.95 - 4.83 (m, 2H), 4.11 - 4.04 (m, 6H), 3.93 (s, 3H), 3.38 - 3.31 (m, 6H), 3.15 - 3.07 (m, 2H), 2.93 - 2.70 (m, 5H), 2.62 - 2.52 (m, 4H), 2.20 - 2.04 (m, 4H), 2.00 - 1.83 (m, 4H), 1.56 - 1.42 (m, 2H), 1.24 (d, J = 6.7 Hz, 6H).
실시예 32. 4-((7,7-디플루오로-9-이소프로필-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(4-(7-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)-2-플루오로페닐)-2,7-디아자스피로[3.5]노난-2-일)피페리딘-1-일)-3-메톡시벤즈아미드 (화합물 32)의 합성
단계 1. tert-부틸 7-(2-플루오로-4-니트로페닐)-2,7-디아자스피로[3.5]노난-2-카복실레이트 (3)의 합성
DMSO (20 mL) 내 1,2-디플루오로-4-니트로벤젠 (1.5 g, 9.43 mmol, 1.04 mL) 및 tert-부틸 2,7-디아자스피로[3.5]노난-2-카복실레이트 (2 g, 8.84 mmol) 용액에 K2CO3 (3.66 g, 26.51 mmol)를 첨가하고 혼합물을 60°C에서 5시간 동안 교반 하였다. TLC (석유 에터: EtOAc=5:1)에서 새로운 스팟이 형성됨을 확인하였다. 혼합물을 H2O (50 mL)로 희석 후 EtOAc (20 mL x 3)로 추출하였다. 합친 유기상을 염수 (10 mL x 2)로 세척 후 Na2SO4 로 건조 및 여과하였다. 여과물을 감압 농축했다. 잔여물을 컬럼 크로마토그래피 (SiO2, 석유 에터/EtOAc=10/1 to 0/1)로 정제하여 황색 고체의 tert-부틸 7-(2-플루오로-4-니트로페닐)-2,7-디아자스피로[3.5]노난-2-카복실레이트 (2.93 g, 7.30 mmol, 82.57% 수율, 91% 순도)를 수득하였다. MS(M+H)+ = 366.2
단계 2. tert-부틸 7-(4-아미노-2-플루오로페닐)-2,7-디아자스피로[3.5]노난-2-카복실레이트 (4)의 합성
EtOH (50 mL) 내 tert-부틸 7-(2-플루오로-4-니트로페닐)-2,7-디아자스피로[3.5]노난-2-카복실레이트 (2.93 g, 8.02 mmol) 용액에 N2 기체 하 Pd/C (300 mg, 10% 순도)를 첨가하고 반응 혼합물을 H2 하 3차례 탈기 및 퍼지하고, 이후 혼합물을 H2 (15 Psi) 하 20°C에서 14시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 메인 피크 (99 %)가 검출되었다. 혼합물을 여과하고 여과 케이크를 MeOH (100 mL) 및 THF (30 mL)로 세척했다. 여과물을 감압 농축하여 회색 고체의 tert-부틸 7-(4-아미노-2-플루오로페닐)-2,7-디아자스피로[3.5]노난-2-카복실레이트 (2.6 g, crude)를 수득하였다. MS(M+H)+ = 336.1
단계 3. tert-부틸 7-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)-2-플루오로페닐)-2,7-디아자스피로[3.5]노난-2-카복실레이트 (5)의 합성
MeCN (15 mL) 내 tert-부틸 7-(4-아미노-2-플루오로페닐)-2,7-디아자스피로[3.5]노난-2-카복실레이트 (1 g, 2.98 mmol) 및 3-브로모피페리딘-2,6-디온 (1.24 g, 6.47 mmol) 용액에 NaHCO3 (1.36 g, 16.19 mmol, 629.64 μL)를 첨가 하고 혼합물을 80°C에서 14시간 동안 교반 하였다. LCMS로 출발물질이 남아있음 및 원하는 질량이 검출되었다. 혼합물을 감압 농축하였다. 잔여물을 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (12 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, Eluent of 40~60% EtOAc/석유 에터 gradient @ 50 mL/분)로 정제하여 회색 고체의 tert-부틸 7-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)-2-플루오로페닐)-2,7-디아자스피로[3.5]노난-2-카복실레이트 (610 mg, 1.35 mmol, 45.36% 수율, 99% 순도)를 수득하였다. MS(M+H)+ = 447.2
단계 4. 3-((3-플루오로-4-(2,7-디아자스피로[3.5]노난-7-일)페닐)아미노)피페리딘-2,6-디온 (6)의 합성
DCM (1.5 mL) 내 tert-부틸 7-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)-2-플루오로페닐)-2,7-디아자스피로[3.5]노난-2-카복실레이트 (0.3 g, 671.87 μmol) 용액에 0°C에서 TFA (770.00 mg, 6.75 mmol, 0.5 mL)를 첨가하고 혼합물을 2시간 동안 0°C에서 교반 하였다. LCMS로 26%의 출발물질이 남아있음 및 59%의 원하는 질량이 검출되었다. 혼합물을 0°C에서 0.5시간 동안 교반하였다. 혼합물을 감압 농축하여 흑갈색 오일의 3-((3-플루오로-4-(2,7-디아자스피로[3.5]노난-7-일)페닐)아미노)피페리딘-2,6-디온 (0.3 g, crude, TFA 염)을 수득하였다. MS(M+H)+ = 347.3
단계 5. 4-((7,7-디플루오로-9-이소프로필-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(4-(7-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)-2-플루오로페닐)-2,7-디아자스피로[3.5]노난-2-일)피페리딘-1-일)-3-메톡시벤즈아미드 (화합물 32)의 합성
DCE (10 mL) 내 3-((3-플루오로-4-(2,7-디아자스피로[3.5]노난-7-일)페닐)아미노)피페리딘-2,6-디온 (0.3 g, 651.58 μmol, TFA 염) 용액에 0°C에서 TEA (399.85 mg, 3.95 mmol, 550 μL) 및 4A MS(0.5 g)에 이어 4-((7,7-디플루오로-9-이소프로필-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-3-메톡시-N-(4-옥소피페리딘-1-일)벤즈아미드 (0.5 g, 966.13 μmol)를 첨가하였다. 혼합물을 0°C에서 30분 동안 교반 하였다. 이후 NaBH(OAc)3 (414 mg, 1.95 mmol)를 첨가하고 혼합물을 20°C에서 3시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 피크 (73 %)가 검출되었다. 혼합물을 여과하고 여과 케이크를 DCM (20 mL)로 세척하였다. 여과물을 감압 농축했다. 잔여물을 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (12 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, Eluent of 30% MeOH / EtOAc gradient @ 80 mL/분)로 정제했다. 생성물을 MTBE (20 mL)로 희석하고 20°C에서 30분 동안 교반하였다. 혼합물을 여과하고 여과 케이크를 MTBE (30 mL)로 세척 했다. 여과물을 모아 감압 건조했다. 생성물을 ACN (5 mL) 및 탈이온수 (40 mL)로 희석 후 동결 건조하여 회색 고체의 4-((7,7-디플루오로-9-이소프로필-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(4-(7-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)-2-플루오로페닐)-2,7-디아자스피로[3.5]노난-2-일)피페리딘-1-일)-3-메톡시벤즈아미드 (406.1 mg, 464.57 μmol, 71.30% 수율, 97% 순도)를 수득하였다. MS(M+H)+ = 848.2
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ = 10.79 (s, 1H), 9.43 (br s, 1H), 8.31 (br d, J = 8.2 Hz, 1H), 8.22 (s, 1H), 7.89 (s, 1H), 7.46 - 7.40 (m, 2H), 6.83 (t, J = 9.3 Hz, 1H), 6.54 - 6.48 (m, 1H), 6.44 - 6.39 (m, 1H), 5.83 (br d, J = 7.7 Hz, 1H), 4.92 - 4.84 (m, 1H), 4.31 - 4.22 (m, 1H), 4.04 (br t, J = 13.6 Hz, 2H), 3.94 (s, 3H), 3.33 - 3.29 (m, 8H), 3.12 - 3.02 (m, 3H), 2.88 - 2.66 (m, 7H), 2.12 - 2.04 (m, 1H), 1.97 - 1.79 (m, 7H), 1.52 - 1.37 (m, 2H), 1.25 (d, J = 6.7 Hz, 6H).
실시예 33. 4-((7,7-디플루오로-9-이소프로필-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(4-(7-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)(메틸)아미노)-2-플루오로페닐)-2,7-디아자스피로[3.5]노난-2-일)피페리딘-1-일)-3-메톡시벤즈아미드 (화합물 33)의 합성
단계 1. 벤질 (4-(7-(2-플루오로-4-니트로페닐)-2,7-디아자스피로[3.5]노난-2-일)피페리딘-1-일)카바메이트 (3)의 합성
DMSO (15 mL) 내 벤질 (4-(2,7-디아자스피로[3.5]노난-2-일)피페리딘-1-일)카바메이트 (1.6 g, 4.05 mmol, HCl 염) 및 1,2-디플루오로-4-니트로벤젠 (800.00 mg, 5.03 mmol, 555.56 μL) 용액에 K2CO3 (1.68 g, 12.15 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 20 °C 에서 14시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량을 확인하였다. 혼합물을 H2O (50 mL)로 희석하고 EtOAc (20 mL x 3)로 추출하였다. 합쳐진 유기상을 염수 (20 mL x 2)로 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하였다. 여과물을 감압 농축하였다. 잔여물을 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (12 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, Eluent of 0~30% MeOH/EtOAc gradient @ 70 mL/분)로 정제하여 황색 오일의 벤질 (4-(7-(2-플루오로-4-니트로페닐)-2,7-디아자스피로[3.5]노난-2-일)피페리딘-1-일)카바메이트 (1.19 g, 2.39 mmol, 59.03% 수율)를 수득하였다. MS(M+H)+=498.3
단계 2. 4-(7-(2-플루오로-4-니트로페닐)-2,7-디아자스피로[3.5]노난-2-일)피페리딘-1-아민 (4)의 합성
TFA (20 mL) 내 벤질 (4-(7-(2-플루오로-4-니트로페닐)-2,7-디아자스피로[3.5]노난-2-일)피페리딘-1-일)카바메이트 (2.28 g, 4.58 mmol) 용액을 60 °C 에서 3시간 동안 교반 하였다. LCMS로 13%의 출발물질이 남아있음 및 원하는 질량의 피크(62%)를 확인하였다. 혼합물을 60 °C 에서 2시간 동안 교반 하였다. LCMS로 6%의 출발물질이 남아있음 및 원하는 질량의 피크(67%)를 확인하였다. 혼합물을 감압 농축하여 황색 오일의 4-(7-(2-플루오로-4-니트로페닐)-2,7-디아자스피로[3.5]노난-2-일)피페리딘-1-아민 (2.2 g, crude, TFA 염)을 수득하였다. MS(M+H)+=364.0
단계 3. tert-부틸 (4-(7-(2-플루오로-4-니트로페닐)-2,7-디아자스피로[3.5]노난-2-일)피페리딘-1-일)카바메이트 (5)의 합성
THF (20 mL) 내 4-(7-(2-플루오로-4-니트로페닐)-2,7-디아자스피로[3.5]노난-2-일)피페리딘-1-아민 (2.2 g, 4.61 mmol, TFA 염) 용액에 NaOH (1 M, 7 mL) 및 Boc2O (2.01 g, 9.22 mmol, 2.12 mL)을 0 °C 에서 첨가하고, 혼합물을 20 °C 에서 14시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 피크를 확인하였다. 혼합물을 H2O (50 mL)로 희석하고 EtOAc (20 mL x 3)로 추출하였다. 합쳐진 유기상을 H2O (10 mL x 2)로 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하였다. 여과물을 감압 농축하여 잔여물 A를 얻었다. 수용상을 감압 농축하였다. 조 생성물을 포화 NaHCO3 (10 mL) 및 THF (10 mL)로 희석한 후, Boc2O (1.01 g, 4.61 mmol, 1.06 mL)를 첨가하고 혼합물을 20 °C 에서 14시간 동안 교반 하였다. 혼합물을 EtOAc (20 mL x 3)로 추출하고, 합쳐진 유기상을 H2O (10 mL x 2)로 세척하고, Na2SO4로 건조하고 여과하고, 여과물을 진공 농축하여 잔여물 B를 얻었다. 잔여물 A, B를 합치고 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (5 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, Eluent of 20 % MeOH/EtOAc gradient @ 50 mL/분)로 정제하여 황색 오일의 tert-부틸 (4-(7-(2-플루오로-4-니트로페닐)-2,7-디아자스피로[3.5]노난-2-일)피페리딘-1-일)카바메이트 (1.17 g, 2.27 mmol, 49.30% 수율, 90% 순도)를 수득하였다. MS(M-100+H)+=364.3
단계 4. tert-부틸 (4-(7-(4-아미노-2-플루오로페닐)-2,7-디아자스피로[3.5]노난-2-일)피페리딘-1-일)카바메이트 (6)의 합성
EtOH (20 mL) 및 H2O (20 mL) 내 tert-부틸 (4-(7-(2-플루오로-4-니트로페닐)-2,7-디아자스피로[3.5]노난-2-일)피페리딘-1-일)카바메이트 (1.17 g, 2.52 mmol) 용액에 Fe (845.80 mg, 15.14 mmol) 및 NH4Cl (810.06 mg, 15.14 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 80 °C 에서 2시간 동안 교반 하였다. TLC (디클로로메탄 : 메탄올 = 10:1)로 새로운 스팟 형성을 확인하였다. 혼합물을 여과하고 여과케이크를 DMF (20 mL) 및 EtOH (20 mL)로 세척하였다. 여과물을 감압 농축하였다. 조 생성물을 H2O (20 mL)로 희석하고 EtOAc (10 mL x 3)로 추출하였다. 합쳐진 유기상을 물 (10 mL x 2)로 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하였다. 여과물을 감압 농축하여 갈색 오일의 tert-부틸 (4-(7-(4-아미노-2-플루오로페닐)-2,7-디아자스피로[3.5]노난-2-일)피페리딘-1-일)카바메이트 (460 mg, 1.06 mmol, 42.04% 수율)를 수득하였다. MS(M+H)+=434.3
단계 5. tert-부틸 (4-(7-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)-2-플루오로페닐)-2,7-디아자스피로[3.5]노난-2-일)피페리딘-1-일)카바메이트 (8)의 합성
ACN (10 mL) 내 tert-부틸 (4-(7-(4-아미노-2-플루오로페닐)-2,7-디아자스피로[3.5]노난-2-일)피페리딘-1-일)카바메이트 (460 mg, 1.06 mmol) 및 3-브로모피페리딘-2,6-디온 (442.07 mg, 2.30 mmol) 용액에 NaHCO3 (483.71 mg, 5.76 mmol, 223.94 μL)를 첨가하고 혼합물을 80 °C 에서 14시간 동안 교반 하였다. LCMS로 tert-부틸 (4-(7-(4-아미노-2-플루오로페닐)-2,7-디아자스피로[3.5]노난-2-일)피페리딘-1-일)카바메이트가 남아 있음 및 원하는 질량을 확인하였다. 추가로 3-브로모피페리딘-2,6-디온 (407.44 mg, 2.12 mmol) 및 NaHCO3 (445.65 mg, 5.30 mmol, 206.32 μL)를 첨가하고 혼합물을 80 °C 에서 14시간 동안 교반 하였다. LCMS로 tert-부틸 (4-(7-(4-아미노-2-플루오로페닐)-2,7-디아자스피로[3.5]노난-2-일)피페리딘-1-일)카바메이트가 완전히 소모되었음을 확인하였다. 혼합물을 여과하고 여과케이크를 DCM (20 mL) 및 THF (20 mL)로 세척하였다. 여과케이크를 모아서 진공 건조하였다. 잔여물을 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (5 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, Eluent of 30~50% MeOH/EtOAc gradient @ 50 mL/분)로 정제하여 갈색 고체의 tert-부틸 (4-(7-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)-2-플루오로페닐)-2,7-디아자스피로[3.5]노난-2-일)피페리딘-1-일)카바메이트 (190 mg, 289.54 μmol, 27.29% 수율, 83% 순도)를 수득하였다. MS(M+H)+=545.2
단계 6. tert-부틸 (4-(7-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)(메틸)아미노)-2-플루오로페닐)-2,7-디아자스피로[3.5]노난-2-일)피페리딘-1-일)카바메이트 (9)의 합성
MeOH (2 mL) 내 tert-부틸 (4-(7-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)-2-플루오로페닐)-2,7-디아자스피로[3.5]노난-2-일)피페리딘-1-일)카바메이트 (100.29 mg, 184.14 μmol) 및 포름알데히드 (21.80 mg, 268.63 μmol, 20 μL, 37% 순도) 용액에 AcOH (10.41 mg, 173.31 μmol, 9.91 μL)를 첨가하고 혼합물을 20 °C 에서 30분동안 교반 하였다. NaBH3CN (32.67 mg, 519.94 μmol)를 첨가하고 혼합물을 20 °C 에서 3시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량을 확인하였다. 혼합물을 감압 농축하였다. 잔여물을 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (5 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, Eluent of 30% MeOH/ EtOAc gradient @ 50 mL/분)로 정제하여 갈색 고체의 tert-부틸 (4-(7-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)(메틸)아미노)-2-플루오로페닐)-2,7-디아자스피로[3.5]노난-2-일)피페리딘-1-일)카바메이트 (80 mg, 143.19 μmol, 82.62% 수율)를 수득하였다. MS(M+H)+=559.3
단계 7. 3-((4-(2-(1-아미노피페리딘-4-일)-2,7-디아자스피로[3.5]노난-7-일)-3-플루오로페닐)(메틸)아미노)피페리딘-2,6-디온 (10)의 합성
DCM (1 mL) 내 tert-부틸 (4-(7-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)(메틸)아미노)-2-플루오로페닐)-2,7-디아자스피로[3.5]노난-2-일)피페리딘-1-일)카바메이트 (80 mg, 143.19 μmol) 용액에 TFA (246.40 mg, 2.16 mmol, 160 μL)를 첨가하고 혼합물을 20 °C 에서 1시간 동안 교반 하였다. LCMS로 16%의 출발물질이 남아있음 및 원하는 질량의 피크(54%)를 확인하였다. 혼합물을 감압 농축하여 갈색 오일의 3-((4-(2-(1-아미노피페리딘-4-일)-2,7-디아자스피로[3.5]노난-7-일)-3-플루오로페닐)(메틸)아미노)피페리딘-2,6-디온 (80 mg, crude, TFA 염)을 수득하였다. MS(M+H)+=459.1
단계 8. 4-((7,7-디플루오로-9-이소프로필-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(4-(7-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)(메틸)아미노)-2-플루오로페닐)-2,7-디아자스피로[3.5]노난-2-일)피페리딘-1-일)-3-메톡시벤즈아미드 (화합물 33)의 합성
DMF (1 mL) 내 4-((7,7-디플루오로-9-이소프로필-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-3-메톡시벤조산 (45 mg, 106.79 μmol) 및 HATU (50.60 mg, 133.07 μmol) 용액에 DIPEA (29.79 mg, 230.53 μmol, 40.15 μL)를 첨가하고 혼합물을 20 °C 에서 15분간 교반 하였다. 이후 DMF (1 mL) 내 3-((4-(2-(1-아미노피페리딘-4-일)-2,7-디아자스피로[3.5]노난-7-일)-3-플루오로페닐)(메틸)아미노)피페리딘-2,6-디온 (80.00 mg, 139.72 μmol, TFA 염) 및 DIPEA (148.97 mg, 1.15 mmol, 200.77 μL) 용액을 첨가하고 혼합물을 20 °C 에서 1시간 동안 교반 하였다. TLC (디클로로메탄: 메탄올=10:1)로 새로운 스팟 형성을 확인하였다. 반응 혼합물을 H2O (10 mL)로 희석하고 EtOAc (10 mL x 3)로 추출하였다. 합쳐진 유기상을 염수 (10 mL x 2)로 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하였다. 여과물을 감압 농축하였다. 조 생성물을 prep-TLC (디클로로메탄: 메탄올=10:1)로 정제한 후, prep-HPLC (컬럼: Phenomenex Synergi Polar-RP 100 x 25 mm x 4μm; 이동상: [water (TFA) - ACN]; B%: 28% - 48%, 7 분)로 재정제하고 용출물을 동결 건조하여 청색 고체의 4-((7,7-디플루오로-9-이소프로필-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(4-(7-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)(메틸)아미노)-2-플루오로페닐)-2,7-디아자스피로[3.5]노난-2-일)피페리딘-1-일)-3-메톡시벤즈아미드 (31.6 mg, 25.41 μmol, 22.91% 수율, 96.8% 순도, 3TFA)를 수득하였다. MS(M+H)+=862.4
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ = 10.77 - 10.75 (m, 1H), 10.01 - 9.63 (m, 1H), 9.54 - 9.42 (m, 1H), 8.31 - 8.17 (m, 2H), 7.47 - 7.41 (m, 2H), 6.73 - 6.62 (m, 2H), 6.57 - 6.50 (m, 1H), 4.92 - 4.84 (m, 1H), 4.77 - 4.70 (m, 1H), 4.13 - 4.02 (m, 2H), 3.92 (s, 3H), 3.69 - 3.56 (m, 2H), 3.40 - 3.18 (m, 9H), 3.13 - 3.05 (m, 2H), 2.90 - 2.77 (m, 2H), 2.66 (s, 3H), 2.57 - 2.50 (m, 3H), 2.30 - 2.20 (m, 1H), 2.17 - 2.07 (m, 3H), 2.04 - 1.90 (m, 3H), 1.89 - 1.82 (m, 1H), 1.79 - 1.65 (m, 2H), 1.24 (d, J = 6.7 Hz, 6H).
실시예 34. 4-((9-시클로펜틸-7,7-디플루오로-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-((1r,4r)-4-(((1-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)-2-플루오로페닐)피페리딘-4-일)메틸)(메틸)아미노)시클로헥실)-3-메톡시벤즈아미드 (화합물 34)의 합성
단계 1. 벤질 4-((((1r,4r)-4-((tert-부톡시카보닐)아미노)시클로헥실)아미노)메틸)피페리딘-1-카복실레이트 (3)의 합성
MeOH (20 mL) 내 벤질 4-포르밀피페리딘-1-카복실레이트 (2 g, 8.09 mmol), tert-부틸 ((1r,4r)-4-아미노시클로헥실)카바메이트 (1.73 g, 8.09 mmol) 및 AcOH (485.68 mg, 8.09 mmol, 462.55 μL) 혼합물을 20 °C 에서 30분간 교반한 후, NaBH3CN (1.52 g, 24.26 mmol)를 첨가하고 혼합물을 20 °C 에서 16시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 주 피크를 확인하였다. 반응 혼합물을 진공 농축하고, NaHCO3 (20 mL)로 켄칭하고, EtOAc (20 mL Х 3)로 추출하였다. 합쳐진 유기상을 Na2SO4로 건조하고, 여과하였다. 여과물을 진공 농축하여 잔여물을 얻었다. 잔여물을 정제하여 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (Biotage; 20 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, Eluent of 50~100% EtOAc/석유 에터 to 10% MeOH/ EtOAc gradient @ 100 mL/분)로 정제하여 무색 오일의 벤질 4-((((1r,4r)-4-((tert-부톡시카보닐)아미노)시클로헥실)아미노)메틸)피페리딘-1-카복실레이트 (3.6 g, 8.08 mmol, 99.89% 수율)를 수득하였다. MS(M+H)+=446.3
단계 2. 벤질 4-((((1r,4r)-4-((tert-부톡시카보닐)아미노)시클로헥실)(메틸)아미노)메틸)피페리딘-1-카복실레이트 (4)의 합성
MeOH (30 mL) 내 벤질 4-((((1r,4r)-4-((tert-부톡시카보닐)아미노)시클로헥실)아미노)메틸)피페리딘-1-카복실레이트 (3.6 g, 8.08 mmol), 포름알데히드 (1.31 g, 16.16 mmol, 1.20 mL, 37% in H2O) 및 AcOH (485.15 mg, 8.08 mmol, 462.05 μL) 혼합물을 20 °C 에서 30분간 교반하였다. NaBH3CN (1.52 g, 24.24 mmol)를 첨가하고 혼합물을 20 °C 에서 16시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 주 피크를 확인하였다. 반응 혼합물을 진공 농축하여 대부분의 용매를 제거하였다. 혼합물을 NaHCO3 (30 mL)로 켄칭하고, EtOAc (40 mL Х 3)로 추출하였다. 합쳐진 유기상을 염수 (50 mL x 2)로 세척하고 Na2SO4로 건조하고, 여과하였다. 여과물을 진공 농축하였다. 잔여물을 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (Biotage; 20 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, Eluent of 50~100% EtOAc/석유 에터 to 10% MeOH/ EtOAc gradient @ 100 mL/분)로 정제하여 무색 오일의 벤질 4-((((1r,4r)-4-((tert-부톡시카보닐)아미노)시클로헥실)(메틸)아미노)메틸)피페리딘-1-카복실레이트 (3.7 g, 8.05 mmol, 99.64% 수율)를 수득하였다. MS(M+H)+=460.3
단계 3. tert-부틸 ((1r,4r)-4-(메틸(피페리딘-4-일메틸)아미노)시클로헥실)카바메이트 (5)의 합성
MeOH (40 mL) 내 벤질 4-((((1r,4r)-4-((tert-부톡시카보닐)아미노)시클로헥실)(메틸)아미노)메틸)피페리딘-1-카복실레이트 (3.7 g, 8.05 mmol) 혼합물에 Pd/C (370 mg, 8.05 mmol, 10% 순도)를 N2 하에서 첨가하고 탈기하고 H2로 3차례 퍼징하고,혼합물을 20 °C 에서 44시간 동안 교반하였다. LCMS로 원하는 질량의 주 피크를 확인하였다. 혼합물을 셀라이트 패드로 여과하였다. 여과물을 진공 농축하여 황색 오일의 tert-부틸 ((1r,4r)-4-(메틸(피페리딘-4-일메틸)아미노)시클로헥실)카바메이트 (2.6 g, crude)를 수득하였다. MS(M+H)+=326.2
단계 4. tert-부틸 ((1r,4r)-4-(((1-(2-플루오로-4-니트로페닐)피페리딘-4-일)메틸)(메틸)아미노)시클로헥실)카바메이트 (7)의 합성
DMSO (5 mL) 내 tert-부틸 ((1r,4r)-4-(메틸(피페리딘-4-일메틸)아미노)시클로헥실)카바메이트 (500 mg, crude), 1,2-디플루오로-4-니트로벤젠 (244.39 mg, 1.54 mmol, 169.71 μL) 용액에 K2CO3 (636.92 mg, 4.61 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 20 °C 에서 16시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 주 피크를 확인하였다. 혼합물을 염수 (15 mL)로 희석하고 EtOAc (15 mL Х 3)로 추출하였다. 합쳐진 유기상을 염수 (40 mL x 2)로 세척하고 Na2SO4로 건조하고, 여과하였다. 여과물을 진공 농축하여 잔여물을 얻었다. 잔여물을 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (Biotage; 20 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, Eluent of 50~100% EtOAc/석유 에터 to 20% MeOH/ EtOAc gradient @ 100 mL/분)로 정제하여 황색 고체의 tert-부틸 ((1r,4r)-4-(((1-(2-플루오로-4-니트로페닐)피페리딘-4-일)메틸)(메틸)아미노)시클로헥실)카바메이트 (500 mg, 1.08 mmol, 70.06% 수율)를 수득하였다. MS(M+H)+=465.3
단계 5. tert-부틸 ((1r,4r)-4-(((1-(4-아미노-2-플루오로페닐)피페리딘-4-일)메틸)(메틸)아미노)시클로헥실)카바메이트 (8)의 합성
CF3CH2OH (10 mL) 내 tert-부틸 ((1r,4r)-4-(((1-(2-플루오로-4-니트로페닐)피페리딘-4-일)메틸)(메틸)아미노)시클로헥실)카바메이트 (500 mg, 1.08 mmol) 혼합물에 Pd/C (100 mg, 1.08 mmol, 10% 순도)를 N2 하에서 첨가하고 탈기한 후, H2로 3차례 퍼징하고, 혼합물을 20 °C에서 H2 (15 Psi) 하에서 12시간 동안 교반하였다. LCMS로 원하는 질량의 주 피크를 확인하였다. 혼합물을 셀라이트 패드로 여과하였다. 여과물을 진공 농축하여 갈색 오일의 tert-부틸 ((1r,4r)-4-(((1-(4-아미노-2-플루오로페닐)피페리딘-4-일)메틸)(메틸)아미노)시클로헥실)카바메이트 (450 mg, crude)를 수득하였다. MS(M+H)+=435.3
단계 6. tert-부틸 ((1r,4r)-4-(((1-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)-2-플루오로페닐)피페리딘-4-일)메틸)(메틸)아미노)시클로헥실)카바메이트 (10)의 합성
ACN (5 mL) 내 3-브로모피페리딘-2,6-디온 (309.27 mg, 1.61 mmol), tert-부틸 ((1r,4r)-4-(((1-(4-아미노-2-플루오로페닐)피페리딘-4-일)메틸)(메틸)아미노)시클로헥실)카바메이트 (350 mg, crude) 용액에 NaHCO3 (338.28 mg, 4.03 mmol, 156.61 μL)를 첨가하고, 혼합물을 80 °C 에서 16시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 주 피크를 확인하였다. 혼합물을 물 (10 mL)로 희석하고 EtOAc (10 mL Х 3)로 추출하였다. 합쳐진 유기상을 Na2SO4로 건조하고, 여과하였다. 여과물을 진공 농축하여 잔여물을 얻었다. 잔여물을 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (Biotage; 20 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, Eluent of 20~100% EtOAc/석유 에터 to 10% MeOH/ EtOAc gradient @ 100 mL/분)로 정제하여 회색 고체의 tert-부틸 ((1r,4r)-4-(((1-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)-2-플루오로페닐)피페리딘-4-일)메틸)(메틸)아미노)시클로헥실)카바메이트 (400 mg, crude)를 수득하였다. MS(M+H)+=546.4
단계 7. 3-((4-(4-((((1r,4r)-4-아미노시클로헥실)(메틸)아미노)메틸)피페리딘-1-일)-3-플루오로페닐)아미노)피페리딘-2,6-디온 (11)의 합성
DCM (1 mL) 내 tert-부틸 ((1r,4r)-4-(((1-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)-2-플루오로페닐)피페리딘-4-일)메틸)(메틸)아미노)시클로헥실)카바메이트 (100 mg, 183.26 μmol) 용액에 TFA (770.00 mg, 6.75 mmol, 0.5 mL)를 첨가하고, 혼합물을 20 °C 에서 1시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 주 피크를 확인하고, 혼합물을 진공 농축하여 갈색 오일의 3-((4-(4-((((1r,4r)-4-아미노시클로헥실)(메틸)아미노)메틸)피페리딘-1-일)-3-플루오로페닐)아미노)피페리딘-2,6-디온 (100 mg, crude, TFA)을 수득하였다. MS(M+H)+=446.3
단계 8. 4-((9-시클로펜틸-7,7-디플루오로-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-((1r,4r)-4-(((1-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)-2-플루오로페닐)피페리딘-4-일)메틸)(메틸)아미노)시클로헥실)-3-메톡시벤즈아미드 (화합물 34)의 합성
DMF (2 mL) 내 4-((9-시클로펜틸-7,7-디플루오로-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-3-메톡시벤조산 (79.96 mg, 178.70 μmol) 용액에 HATU (101.92 mg, 268.05 μmol), DIPEA (115.48 mg, 893.50 μmol, 155.63 μL)를 첨가하고, 혼합물을 20 °C 에서 1시간 동안 교반 하였다. 3-((4-(4-((((1r,4r)-4-아미노시클로헥실)(메틸)아미노)메틸)피페리딘-1-일)-3-플루오로페닐)아미노)피페리딘-2,6-디온 (100 mg, crude, TFA)을 첨가하고, 생성된 혼합물을 20 °C 에서 15시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 주 피크를 확인하였다. 반응 혼합물을 염수 (30 mL)로 희석하고 EtOAc (20 mL Х 3)로 추출하였다. 합쳐진 유기상을 염수 (40 mL x 2)로 세척하고 Na2SO4로 건조하고, 여과하였다. 여과물을 진공 농축하여 잔여물을 얻었다. 잔여물을 prep-TLC (SiO2, DCM : MeOH = 10:1)로 정제한 후, 역상 HPLC (컬럼: Waters Xbridge 150*25 mm* 5um;이동상: [water (NH4HCO3) - ACN]; B%: 46% - 76%, 8 분)로 재정제하였다. 용출물을 동결 건조하여 백색 고체의 4-((9-시클로펜틸-7,7-디플루오로-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-((1r,4r)-4-(((1-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)아미노)-2-플루오로페닐)피페리딘-4-일)메틸)(메틸)아미노)시클로헥실)-3-메톡시벤즈아미드 (39.9 mg, 44.23 μmol, 24.75% 수율, 97% 순도)를 수득하였다. MS(M+H)+=875.4
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ = 10.77 (s, 1H), 8.30 - 8.21 (m, 2H), 8.06 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.95 (s, 1H), 7.52 - 7.44 (m, 2H), 6.83 (t, J = 9.3 Hz, 1H), 6.54 - 6.45 (m, 1H), 6.44 - 6.37 (m, 1H), 5.77 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 4.82 - 4.70 (m, 1H), 4.30 - 4.20 (m, 1H), 4.04 (t, J = 14.1 Hz, 2H), 3.93 (s, 3H), 3.78 - 3.67 (m, 1H), 3.30 (s, 3H), 3.16 - 3.05 (m, 2H), 2.77 - 2.67 (m, 1H), 2.61 - 2.53 (m, 3H), 2.35 - 2.32(m, 1H), 2.23 - 2.24 (m, 2H), 2.20 (s, 3H), 2.13 - 2.04 (m, 1H), 1.98 - 1.81 (m, 5H), 1.80 - 1.67 (m, 6H), 1.66 - 1.54 (m, 4H), 1.51 - 1.42 (m, 1H), 1.41 - 1.29 (m, 4H), 1.27 - 1.15 (m, 2H).
실시예 35. 4-((7,7-디플루오로-9-이소프로필-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(7-((1-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)옥시)-2-플루오로페닐)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)-3-메톡시벤즈아미드 (화합물 35)의 합성
단계 1. 4-(((tert-부틸디페닐실릴)옥시)메틸)피페리딘 (2)의 합성
DCM (150 mL) 내 피페리딘-4-일 메탄올(10 g, 86.83 mmol) 용액에 TEA (13.18 g, 130.24 mmol, 18.13 mL) 및 DMAP (530.37 mg, 4.34 mmol)를 첨가한 후, tert-부틸클로로디페닐실란 (35.80 g, 130.24 mmol, 33.46 mL)을 한 방울씩 첨가하였다. 혼합물을 20 °C 16시간 동안 교반 하였다. TLC (디클로로메탄 : 메탄올 = 10:1)로 피페리딘-4-일 메탄올이 완전히 소모되었음 및 하나의 새로운 스팟 형성을 확인하였다. 반응 혼합물을 0 °C 에서 물 (100 mL)로 희석하고 디클로로메탄 (80 mL x 2)으로 추출하였다. 합쳐진 유기상을 염수 (30 mL x 3)로 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하고 감압 농축하여 잔여물을 얻었고, 이를 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (ISCO®; 80 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, Eluent of 0~100% EtOAc/석유 에터 gradient @ 80 mL/분)로 정제하고 MTBE로 분쇄하여 백색 고체의 4-(((tert-부틸디페닐실릴)옥시)메틸)피페리딘 (9.6 g, 27.15 mmol, 31.27% 수율)을 수득하였다. MS(M+H)+ = 354.6
단계 2. 4-(4-(((tert-부틸디페닐실릴)옥시)메틸)피페리딘-1-일)-3-플루오로페놀 (4)의 합성
디옥산 (12 mL) 내 4-브로모-3-플루오로페놀 (500 mg, 2.62 mmol), 4-(((tert-부틸디페닐실릴)옥시)메틸)피페리딘 (1.02 g, 2.88 mmol), DavePhos (164.84 mg, 418.85 μmol), Pd2(dba)3 (143.83 mg, 157.07 μmol) 및 NaOBu-t (2 M, 3.93 mL) 혼합물을 탈기하고 N2로 3차례 퍼징하고, 혼합물을 100 °C에서 N2 기체 하에서 16시간 동안 교반 하였다. LCMS로 38%의 4-(((tert-부틸디페닐실릴)옥시)메틸)피페리딘이 남아있음을 확인하였다. LCMS로 몇 개의 새로운 피크와 원하는 화합물의 피크(31%)를 확인하였다. 반응 혼합물을 포화 암모늄 클로라이드 수용액 (20 mL)으로 0 °C 에서 희석하고, EtOAc (30 mL x 2)로 추출하였다. 합쳐진 유기상을 염수 (20 mL)로 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하고 감압 농축하여 잔여물을 얻고, 이를 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (ISCO®; 20 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, Eluent of 0~16% EtOAc/석유 에터 gradient @ 50 mL/분)로 정제하여 황색 고체의 4-(4-(((tert-부틸디페닐실릴)옥시)메틸)피페리딘-1-일)-3-플루오로페놀 (400 mg, 819.57 μmol, 31.31% 수율, 95% 순도)을 수득하였다. MS(M+H)+ = 464.2
단계 3. 3-(4-(4-(((tert-부틸디페닐실릴)옥시)메틸)피페리딘-1-일)-3-플루오로페녹시)피페리딘-2,6-디온 (5)의 합성
THF (5 mL) 내 4-(4-(((tert-부틸디페닐실릴)옥시)메틸)피페리딘-1-일)-3-플루오로페놀 (200 mg, 431.35 μmol) 용액에 NaH (43.14 mg, 1.08 mmol, 60% 순도)를 0 °C 에서 첨가하고, 혼합물을 0 °C 에서 1시간 동안 교반한 후, THF (2 mL) 내 3-브로모피페리딘-2,6-디온 (91.11 mg, 474.49 μmol) 용액을 0 °C 에서 한 방울씩 첨가하고 생성된 혼합물을 20 °C 에서 2시간 동안 교반 하였다. LCMS로 40%의 4-(4-(((tert-부틸디페닐실릴)옥시)메틸)피페리딘-1-일)-3-플루오로페놀이 남아있음 및 원하는 질량의 피크(52%)를 확인하였다. 이후 혼합물을 추가로 2시간 동안 교반 하였다. TLC (석유 에터 : EtOAc=3:1, Rf=0.23)로 더 큰 극성의 하나의 새로운 스팟 형성을 확인하였다. 반응 혼합물에 포화 암모늄 클로라이드 수용액 (15mL)를 0 °C 에서 첨가하여 켄칭한 후, EtOAc (30 mL x 2)로 추출하였다. 합쳐진 유기상을 염수 (20 mL)로 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하고 감압 농축하여 잔여물을 얻고, 이를 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (ISCO®; 12 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, Eluent of 0~45% EtOAc/석유 에터 gradient @ 50 mL/분)로 정제하여 황색 고체의 3-(4-(4-(((tert-부틸디페닐실릴)옥시)메틸)피페리딘-1-일)-3-플루오로페녹시)피페리딘-2,6-디온 (190 mg, 320.66 μmol, 74.34% 수율, 97% 순도)을 수득하였다. MS(M+H)+ = 575.4
단계 4. 3-(3-플루오로-4-(4-(히드록시메틸)피페리딘-1-일)페녹시)피페리딘-2,6-디온 (6)의 합성
DMSO (1 mL) 내 3-(4-(4-(((tert-부틸디페닐실릴)옥시)메틸)피페리딘-1-일)-3-플루오로페녹시)피페리딘-2,6-디온 (140 mg, 243.58 μmol) 용액에 CsF (74.00 mg, 487.16 μmol, 17.96 μL)를 첨가하였다. 혼합물을 30 °C 에서 2.5시간 동안 교반 하였다. LCMS로 9%의 3-(4-(4-(((tert-부틸디페닐실릴)옥시)메틸)피페리딘-1-일)-3-플루오로페녹시)피페리딘-2,6-디온이 남아 있음 및 원하는 질량의 피크(44%)를 확인하였다. 반응 혼합물을 포화 암모늄 클로라이드 수용액 (20 mL)으로 0 °C 에서 희석한 후, EtOAc (20 mL Х 2)을 추출하였다. 합쳐진 유기상을 염수 (10 mL)로 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하고 감압 농축하여 잔여물을 얻었고, 이를 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (ISCO®; 12 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, Eluent of 0~100% EtOAc/석유 에터 gradient @ 50 mL/분)로 정제하여 황색 고체의 3-(3-플루오로-4-(4-(히드록시메틸)피페리딘-1-일)페녹시)피페리딘-2,6-디온 (50 mg, 148.65 μmol, 61.03% 수율)을 수득하였다. MS(M+H)+ = 337.4
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 7.76 (s, 1H), 6.99 - 6.87 (m, 1H), 6.85 - 6.74 (m, 2H), 4.77 (dd, J = 4.4, 7.5 Hz, 1H), 3.58 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 3.44 - 3.33 (m, 2H), 3.02 - 2.90 (m, 1H), 2.74 - 2.58 (m, 3H), 2.38 - 2.23 (m, 2H), 1.91 - 1.78 (m, 2H), 1.69 - 1.59 (m, 1H), 1.51 - 1.41 (m, 2H), 1.37 - 1.29 (m, 1H).
단계 5. 1-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)옥시)-2-플루오로페닐)피페리딘-4-카브알데히드 (7)의 합성
DCM (1 mL) 내 3-(3-플루오로-4-(4-(히드록시메틸)피페리딘-1-일)페녹시)피페리딘-2,6-디온 (50 mg, 148.65 μmol) 용액에 DMP (75.66 mg, 178.38 μmol, 55.23 μL)을 첨가하였다. 혼합물을 20 °C 에서 2시간 동안 교반 하였다. LCMS로 3-(3-플루오로-4-(4-(히드록시메틸)피페리딘-1-일)페녹시)피페리딘-2,6-디온의 일부가 남아 있음을 확인하였다. 이후 혼합물을 추가로 2시간 동안 교반하고, LCMS로 3-(3-플루오로-4-(4-(히드록시메틸)피페리딘-1-일)페녹시)피페리딘-2,6-디온이 완전히 소모되었음을 확인하였다. 반응 혼합물을 여과하고 여과물을 농축하여 황색 고체의 1-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)옥시)-2-플루오로페닐)피페리딘-4-카브알데히드 (49 mg, crude)를 수득하였고 이를 다음 단계에 바로 사용하였다. MS(M+H+18)+ =353.1
단계 6. 4-((7,7-디플루오로-9-이소프로필-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(7-((1-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)옥시)-2-플루오로페닐)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)-3-메톡시벤즈아미드 (화합물 35)의 합성
DCE (0.5 mL) 내 1-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)옥시)-2-플루오로페닐)피페리딘-4-카브알데히드 (49 mg, 146.56 μmol) 및 4-((7,7-디플루오로-9-이소프로필-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-3-메톡시-N-(7-아자스피로[3.5]노난-2-일)벤즈아미드 (76.51 mg, 131.90 μmol, HCl 염) 용액에 NaOAc (18.03 mg, 219.84 μmol)를 20 °C 에서 첨가하였다. 첨가 후, 혼합물을 20 °C 에서 1시간 동안 교반한 후, NaBH(OAc)3 (155.31 mg, 732.78 μmol)를 첨가하고 생성된 혼합물을 20 °C 에서 16시간 동안 교반 하였다. LCMS로 1-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)옥시)-2-플루오로페닐)피페리딘-4-카브알데히드가 완전히 소모되었음 및 원하는 질량의 하나의 피크(52%)를 확인하였다. 반응 혼합물에 포화 소듐 바이카보네이트 수용액 (10 mL)을 첨가하여 0 °C 에서 켄칭한 후, EtOAc (20 mL Х 2)로 추출하였다. 합쳐진 유기상을 염수 (15 mL)로 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하고 감압 농축하여 잔여물을 얻고 이를 prep-TLC (SiO2, DCM: MeOH = 5:1)로 정제한 후 prep-HPLC (컬럼: Phenomenex luna C18 150 x 25 mm x 10μm;이동상: [water (FA) -ACN]; B%: 15% - 45%, 10 분)로 정제하고 prep-HPLC (컬럼: Waters Xbridge 150 x 25mm x 5μm; 이동상: [water (NH4HCO3) - ACN]; B%: 44% - 74%, 8 분)로 정제하고, 용출물을 동결 건조하여 백색 고체의 4-((7,7-디플루오로-9-이소프로필-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(7-((1-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)옥시)-2-플루오로페닐)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)-3-메톡시벤즈아미드 (10.2 mg, 11.36 μmol, 7.75% 수율, 96% 순도)를 수득하였다. MS(M+H)+=862.2
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ = 10.92 (s, 1H), 8.42 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 8.35 - 8.27 (m, 1H), 8.22 (s, 1H), 7.88 (s, 1H), 7.54 - 7.46 (m, 2H), 6.96 (t, J = 9.4 Hz, 1H), 6.88 (dd, J = 2.7, 13.9 Hz, 1H), 6.77 - 6.74 (m, 1H), 5.13-5.09 (m 1H), 4.93 - 4.83 (m, 1H), 4.46 - 4.32 (m, 1H), 4.04 (t, J = 13.6 Hz, 2H), 3.94 (s, 3H), 3.30 (s, 3H), 3.21-3.18 (m, 2H), 2.66 - 2.59 (m, 2H), 2.57 - 2.56 (m, 2H), 2.32 - 2.26 (m, 2H), 2.26 - 2.19 (m, 2H), 2.19 - 2.08 (m, 6H), 1.85 - 1.72 (m, 4H), 1.64 - 1.52 (m, 5H), 1.24 (d, J = 6.6 Hz, 8H).
실시예 36. 4-((7,7-디플루오로-9-이소프로필-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(7-((1-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)옥시)페닐)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)-3-메톡시벤즈아미드 (화합물 36)의 합성
단계 1. 4-(4-(((tert-부틸디페닐실릴)옥시)메틸)피페리딘-1-일)페놀 (3)의 합성
디옥산 (10 mL) 내 4-브로모페놀 (450 mg, 2.60 mmol), 4-(((tert-부틸디페닐실릴)옥시)메틸)피페리딘 (1.01 g, 2.86 mmol), DavePhos (204.73 mg, 520.21 μmol), Pd2(dba)3 (142.91 mg, 156.06 μmol) 및 NaOBu-t (2 M, 3.90 mL) 혼합물을 탈기하고 N2로 3차례 퍼징하고, 혼합물을 100 °C N2 기체 하에서 16시간 동안 교반 하였다. LCMS로 12%의 4-(((tert-부틸디페닐실릴)옥시)메틸)피페리딘이 남아 있음 및 원하는 화합물의 피크(54%)를 확인하였다. 반응 혼합물을 포화 암모늄 클로라이드 수용액 (20 mL)으로 0 °C 에서 희석하고 EtOAc (30mL x 2)로 추출하였다. 합쳐진 유기상을 염수 (20 mL)로 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하고 감압 농축하여 잔여물을 얻고 이를 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (ISCO®; 20 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, Eluent of 0~18% EtOAc/석유 에터 gradient @ 50 mL/분)로 정제하여 황색 고체의 4-(4-(((tert-부틸디페닐실릴)옥시)메틸)피페리딘-1-일)페놀 (650 mg, 1.40 mmol, 53.83% 수율, 96% 순도)을 수득하였다. MS(M+H)+=446.2
단계 2. 3-(4-(4-(((tert-부틸디페닐실릴)옥시)메틸)피페리딘-1-일)페녹시)피페리딘-2,6-디온 (5)의 합성
THF (10 mL) 내 4-(4-(((tert-부틸디페닐실릴)옥시)메틸)피페리딘-1-일)페놀 (320 mg, 718.02 μmol) 용액에 NaH (71.80 mg, 1.80 mmol, 60% 순도)를 0 °C 에서 첨가하였다. 첨가 후, 혼합물을 0 °C 에서 1시간 동안 교반한 후, THF (2 mL) 내 3-브로모피페리딘-2,6-디온 (165.44 mg, 861.63 μmol) 용액을 0 °C 에서 한 방울씩 첨가하고 생성된 혼합물을 20 °C 에서 3시간 동안 교반 하였다. LCMS로 4-(4-(((tert-부틸디페닐실릴)옥시)메틸)피페리딘-1-일)페놀이 완전히 소모되었음 및 원하는 질량을 확인하였다. 반응 혼합물을 포화 암모늄 클로라이드 수용액 (20 mL)으로 0 °C 에서 켄칭하고 EtOAc (30 mL Х 2)로 추출하였다. 합쳐진 유기상을 염수 (20 mL)로 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하고 감압 농축하여 잔여물을 얻었고, 이를 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (ISCO®; 12 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, Eluent of 0~50% EtOAc/석유 에터 gradient @ 50 mL/분)로 정제하여 황색 고체의 3-(4-(4-(((tert-부틸디페닐실릴)옥시)메틸)피페리딘-1-일)페녹시)피페리딘-2,6-디온 (380 mg, 662.04 μmol, 92.20% 수율, 97% 순도)을 수득하였다. MS(M+H)+=557.3
단계 3. 3-(4-(4-(히드록시메틸)피페리딘-1-일)페녹시)피페리딘-2,6-디온 (6)의 합성
DMSO (2 mL) 내 3-(4-(4-(((tert-부틸디페닐실릴)옥시)메틸)피페리딘-1-일)페녹시)피페리딘-2,6-디온 (380 mg, 682.51 μmol) 용액에 CsF (207.35 mg, 1.37 mmol, 50.33 μL)를 첨가하였다. 혼합물을 30 °C 에서 4시간 동안 교반 하였다. LCMS로 3-(4-(4-(((tert-부틸디페닐실릴)옥시)메틸)피페리딘-1-일)페녹시)피페리딘-2,6-디온이 완전히 소모되었음 및 원하는 질량을 확인하였다. 반응 혼합물을 포화 암모늄 클로라이드 수용액 (10 mL)으로 0 °C 에서 희석하고 EtOAc (30 mL Х 2)로 추출하였다. 합쳐진 유기상을 염수 (20 mL)로 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하고 감압 농축하여 잔여물을 얻고, 이를 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (ISCO®; 20 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, Eluent of 0~100% EtOAc/석유 에터 gradient @ 50 mL/분)로 정제하여 황색 고체의 3-(4-(4-(히드록시메틸)피페리딘-1-일)페녹시)피페리딘-2,6-디온 (120 mg, 376.92 μmol, 55.23% 수율)을 수득하였다. MS(M+H)+=319.1
단계 4. 1-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)옥시)페닐)피페리딘-4-카브알데히드 (7)의 합성
DCM (2 mL) 내 3-(4-(4-(히드록시메틸)피페리딘-1-일)페녹시)피페리딘-2,6-디온 (60 mg, 188.46 μmol) 용액에 DMP (95.92 mg, 226.15 μmol, 70.02 μL)를 첨가하였다. 혼합물을 20 °C 에서 5시간 동안 교반 하였다. TLC (석유 에터 : EtOAc = 0:1, Rf=0.7)로 3-(4-(4-(히드록시메틸)피페리딘-1-일)페녹시)피페리딘-2,6-디온이 완전히 소모되었음 및 더 낮은 극성의 신규 스팟 형성을 확인하였다. 반응 혼합물을 여과하고 여과물을 농축하여 적색 고체의 1-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)옥시)페닐)피페리딘-4-카브알데히드 (59 mg, crude)를 수득하였고, 이를 추가 정제 없이 다음 단계에 바로 사용하였다. MS(M+H)+=317.4
단계 5. 4-((7,7-디플루오로-9-이소프로필-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(7-((1-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)옥시)페닐)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)-3-메톡시벤즈아미드 (화합물 36)의 합성
DCE (2 mL) 내 1-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)옥시)페닐)피페리딘-4-카브알데히드 (59 mg, 186.50 μmol) 및 4-((7,7-디플루오로-9-이소프로필-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-3-메톡시-N-(7-아자스피로[3.5]노난-2-일)벤즈아미드 (97.37 mg, 167.85 μmol, HCl 염) 용액에 NaOAc (22.95 mg, 279.75 μmol)를 20 °C 에서 첨가하였다. 첨가 후 혼합물을 20 °C 에서 1시간 동안 교반한 후, NaBH(OAc)3 (237.16 mg, 1.12 mmol)를 첨가하고 생성된 혼합물을 20 °C 에서 16시간 동안 교반 하였다. TLC (디클로로메탄 : 메탄올=5:1)로 4-((7,7-디플루오로-9-이소프로필-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-3-메톡시-N-(7-아자스피로[3.5]노난-2-일)벤즈아미드가 남아있음 및 더 낮은 극성의 몇 개의 새로운 스팟들이 형성되었음을 확인하였다. 반응 혼합물을 포화 소듐 바이카보네이트 수용액 (15 mL)으로 0 °C에서 희석한 후, EtOAc (40 mL x 2)로 추출하였다. 합쳐진 유기상을 염수 (20 mL)로 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하고 감압 농축하여, 잔여물을 얻고, 이를 prep-TLC (SiO2, DCM: MeOH = 5:1) 후 (컬럼: Waters Xbridge 150 x 25 mm x 5μm;이동상: [water (NH4HCO3) - ACN]; B%: 38% - 68%, 9 분)로 정제하고 용출물을 동결 건조하여 백색 고체의 4-((7,7-디플루오로-9-이소프로필-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(7-((1-(4-((2,6-디옥소피페리딘-3-일)옥시)페닐)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)-3-메톡시벤즈아미드 (10.0 mg, 10.90 μmol, 5.84% 수율, 92% 순도)를 수득하였다. MS(M+H)+=844.4
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ = 10.88 (s, 1H), 8.42 - 8.40 (m, 1H), 8.35 - 8.28 (m, 1H), 8.22 (s, 1H), 7.92 - 7.84 (m, 1H), 7.56 - 7.45 (m, 2H), 6.99 - 6.78 (m, 4H), 5.01-5.0 (m, 1H), 4.94 - 4.83 (m, 1H), 4.45 - 4.34 (m, 1H), 4.10 - 3.99 (m, 2H), 3.94 (s, 3H), 3.50 (d, J = 12.0 Hz, 2H), 3.29 (s, 3H), 2.73 - 2.63 (m, 2H), 2.62 - 2.58 (m, 2H), 2.32 - 2.24 (m, 2H), 2.24 - 2.18 (m, 2H), 2.18 - 2.01 (m, 6H), 1.86 - 1.72 (m, 4H), 1.65 - 1.50 (m, 5H), 1.30 - 1.13 (m, 8H).
실시예 37. 4-((9-시클로펜틸-7,7-디플루오로-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(1-(2-(1-(1-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-3-메틸-2-옥소-2,3-디히드로-1H-벤조[d]이미다졸-4-일)피페리딘-4-일)에틸)피페리딘-4-일)-3-메톡시벤즈아미드 (화합물 37)의 합성
단계 1. 4-(2-((tert-부틸디페닐실릴)옥시)에틸)피페리딘 (2)의 합성
DCM (150 mL) 내 2-(피페리딘-4-일)에탄-1-올 (10 g, 77.40 mmol) 용액에 TEA (15.66 g, 154.80 mmol, 21.55 mL) 및 DMAP (472.79 mg, 3.87 mmol)를 첨가하고, tert-부틸-클로로-디페닐-실란 (31.91 g, 116.10 mmol, 29.82 mL)을 천천히 첨가하고 혼합물을 20 °C 에서 16시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 피크(33%)를 확인하였다. 혼합물을 물 (30 mL)로 희석하고 EtOAc (50 mL x 3)로 추출하였다. 유기상을 Na2SO4로 건조하고, 여과하고 진공 농축하였다. 조 생성물을 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (Biotage, 4 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, Eluent of 4~100% EtOAc/석유 에터 gradient @100 mL/분)로 정제하여 새성물을 얻고 이를 MTBE (20 mL)로 20 °C 에서 30분간 분쇄하고, 여과하여 백색 고체의 4-(2-((tert-부틸디페닐실릴)옥시)에틸)피페리딘 (2.54 g, 6.56 mmol, 8.48% 수율, 95%)을 수득하였다. MS(M+H)+=368.2
단계 2. 3-(4-(4-(2-((tert-부틸디페닐실릴)옥시)에틸)피페리딘-1-일)-3-메틸-2-옥소-2,3-디히드로-1H-벤조[d]이미다졸-1-일)-1-(4-메톡시벤질)피페리딘-2,6-디온 (3)의 합성
디옥산 (10 mL) 내 3-(4-브로모-3-메틸-2-옥소-2,3-디히드로-1H-벤조[d]이미다졸-1-일)-1-(4-메톡시벤질)피페리딘-2,6-디온 (450 mg, 981.88 μmol) 용액에 4-(2-((tert-부틸디페닐실릴)옥시)에틸)피페리딘 (360.94 mg, 981.88 μmol), Cs2CO3 (639.83 mg, 1.96 mmol) 및 Pd-PEPPSI-IHeptCl (47.76 mg, 49.09 μmol)을 첨가하고, 혼합물을 100 °C N2 기체 --하에서 16시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 피크를 확인하고, 혼합물을 물 (10 mL)로 희석하고 EtOAc (10 mL x 3)로 추출하였다. 합쳐진 유기상을 Na2SO4로 건조하고, 여과하고 진공 농축하였다. 조 생성물을 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (Biotage, 4 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, Eluent of 4~70% EtOAc/석유 에터 gradient @ 20 mL/분)로 정제하여 황색 오일의 3-(4-(4-(2-((tert-부틸디페닐실릴)옥시)에틸)피페리딘-1-일)-3-메틸-2-옥소-2,3-디히드로-1H-벤조[d]이미다졸-1-일)-1-(4-메톡시벤질)피페리딘-2,6-디온 (730 mg, crude)을 수득하였다. MS(M+H)+= 745.3
단계 3. 3-(4-(4-(2-히드록시에틸)피페리딘-1-일)-3-메틸-2-옥소-2,3-디히드로-1H-벤조[d]이미다졸-1-일)-1-(4-메톡시벤질)피페리딘-2,6-디온 (4)의 합성
DMSO (15 mL) 내 3-(4-(4-(2-((tert-부틸디페닐실릴)옥시)에틸)피페리딘-1-일)-3-메틸-2-옥소-2,3-디히드로-1H-벤조[d]이미다졸-1-일)-1-(4-메톡시벤질)피페리딘-2,6-디온 (730 mg, 979.88 μmol) 용액에 CsF (223.27 mg, 1.47 mmol, 54.19 μL)를 첨가하고, 혼합물을 20 °C 에서 16시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량을 확인하고, 혼합물을 물 (3 mL)로 희석하고 EtOAc (5 mL x 3)로 추출하였다. 합쳐진 유기상을 Na2SO4로 건조하고, 여과하고 진공 농축하고, 조 생성물을 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (Biotage, 4 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, Eluent of 4~65% EtOAc/석유 에터 gradient @ 20 mL/분)로 정제하여 황색 오일의 3-(4-(4-(2-히드록시에틸)피페리딘-1-일)-3-메틸-2-옥소-2,3-디히드로-1H-벤조[d]이미다졸-1-일)-1-(4-메톡시벤질)피페리딘-2,6-디온 (200 mg, 363.21 μmol, 37.07% 수율, 92% 순도)을 수득하였다. MS(M+H)+= 507.3
단계 4. 2-(1-(1-(1-(4-메톡시벤질)-2,6-디옥소피페리딘-3-일)-3-메틸-2-옥소-2,3-디히드로-1H-벤조[d]이미다졸-4-일)피페리딘-4-일)에틸 4-메틸벤젠설포네이트 (5)의 합성
DCM (2 mL) 내 3-(4-(4-(2-히드록시에틸)피페리딘-1-일)-3-메틸-2-옥소-2,3-디히드로-1H-벤조[d]이미다졸-1-일)-1-(4-메톡시벤질)피페리딘-2,6-디온 (200 mg, 394.80 μmol) 용액에 TEA (119.85 mg, 1.18 mmol, 164.85 μL), TosCl (112.90 mg, 592.19 μmol) 및 DMAP (4.82 mg, 39.48 μmol)를 첨가하고, 혼합물을 20 °C 에서 16시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량을 확인하고, 혼합물을 물 (3 mL)로 희석하고 EtOAc (5 mL x 2)로 추출하였다. 유기상을 Na2SO4로 건조하고, 여과하고 진공 농축하여, 조 생성물을 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (Biotage, 4 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, Eluent of 4~98% EtOAc/석유 에터 gradient @ 20 mL/분)로 정제하여 황색 오일의 2-(1-(1-(1-(4-메톡시벤질)-2,6-디옥소피페리딘-3-일)-3-메틸-2-옥소-2,3-디히드로-1H-벤조[d]이미다졸-4-일)피페리딘-4-일)에틸 4-메틸벤젠설포네이트 (200 mg, 236.09 μmol, 59.80% 수율, 78% 순도)를 수득하였다. MS(M+H)+= 661.2
단계 5. tert-부틸 (1-(2-(1-(1-(1-(4-메톡시벤질)-2,6-디옥소피페리딘-3-일)-3-메틸-2-옥소-2,3-디히드로-1H-벤조[d]이미다졸-4-일)피페리딘-4-일)에틸)피페리딘-4-일)카바메이트 (6)의 합성
DMF (8 mL) 내 2-(1-(1-(1-(4-메톡시벤질)-2,6-디옥소피페리딘-3-일)-3-메틸-2-옥소-2,3-디히드로-1H-벤조[d]이미다졸-4-일)피페리딘-4-일)에틸 4-메틸벤젠설포네이트 (200 mg, 302.67 μmol) 및 tert-부틸 N-(4-피페리딜) 카바메이트 (90.93 mg, 454.01 μmol) 용액에 DIEA (117.35 mg, 908.02 μmol) 및 NaI (4.54 mg, 30.27 μmol)를 20 °C 에서 첨가하였다. 생성된 혼합물을 80 °C 에서 2시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 주 피크를 확인하였다. 반응 혼합물을 물 (20 mL)에 붓고 EtOAc (10 mL x 3)로 추출하였다. 합쳐진 유기상을 염수 (10 mL x 3)로 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 농축하여 갈색 고체의 tert-부틸 (1-(2-(1-(1-(1-(4-메톡시벤질)-2,6-디옥소피페리딘-3-일)-3-메틸-2-옥소-2,3-디히드로-1H-벤조[d]이미다졸-4-일)피페리딘-4-일)에틸)피페리딘-4-일)카바메이트 (210 mg, crude)를 수득하였다. 조 생성물을 다음 단계에 바로 사용하였다. MS(M+H)+ =689.4
단계 6. 3-(4-(4-(2-(4-아미노피페리딘-1-일)에틸)피페리딘-1-일)-3-메틸-2-옥소-2,3-디히드로-1H-벤조[d]이미다졸-1-일)피페리딘-2,6-디온 (7)의 합성
톨루엔 (9 mL) 내 tert-부틸 (1-(2-(1-(1-(1-(4-메톡시벤질)-2,6-디옥소피페리딘-3-일)-3-메틸-2-옥소-2,3-디히드로-1H-벤조[d]이미다졸-4-일)피페리딘-4-일)에틸)피페리딘-4-일)카바메이트 (200 mg, crude) 용액에 MsOH (4.05 g, 42.14 mmol, 3 mL)를 첨가하고, 혼합물을 100 °C 에서 3시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량을 확인하였고, 혼합물을 NaHCO3 (20 mL) 수용액으로 희석하고, EtOAc (20 mL x 3)로 추출하고, 수용상을 동결 건조로 농축하여 백색 고체를 수득하고, 상기 고체를 THF (50 mL)로 분쇄하고 20 °C 에서 1시간 동안 교반하고, 여과하고 여과물을 진공 농축하여 황색 오일의 3-(4-(4-(2-(4-아미노피페리딘-1-일)에틸)피페리딘-1-일)-3-메틸-2-옥소-2,3-디히드로-1H-벤조[d]이미다졸-1-일)피페리딘-2,6-디온 (48 mg, crude)을 수득하였다. MS(M+H)+=469.3
단계 7. 4-((9-시클로펜틸-7,7-디플루오로-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(1-(2-(1-(1-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-3-메틸-2-옥소-2,3-디히드로-1H-벤조[d]이미다졸-4-일)피페리딘-4-일)에틸)피페리딘-4-일)-3-메톡시벤즈아미드 (화합물 37)의 합성
DMF (1 mL) 내 4-((9-시클로펜틸-7,7-디플루오로-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-3-메톡시벤조산 (30 mg, 67.05 μmol) 용액에 HATU (38.24 mg, 100.57 μmol) 및 DIPEA (26.00 mg, 201.15 μmol, 35.04 μL)를 첨가한 후, 3-(4-(4-(2-(4-아미노피페리딘-1-일)에틸)피페리딘-1-일)-3-메틸-2-옥소-2,3-디히드로-1H-벤조[d]이미다졸-1-일)피페리딘-2,6-디온 (38.79 mg, crude)을 첨가하고 혼합물을 20 °C 에서 16시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 주 피크를 확인하고, 혼합물을 물 (3 mL)로 희석하고 EtOAc (5 mL x 3)로 추출하고, 유기상을 Na2SO4로 건조하고, 여과하고 진공 농축하고, 조 생성물을 Prep-HPLC(컬럼: Waters Xbridge 150*25mm* 5um; 이동상: [water(NH4HCO3) - ACN]; B%: 48% - 78%, 8 분)로 정제하고 동결 건조하여 백색 파우더의 4-((9-시클로펜틸-7,7-디플루오로-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(1-(2-(1-(1-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-3-메틸-2-옥소-2,3-디히드로-1H-벤조[d]이미다졸-4-일)피페리딘-4-일)에틸)피페리딘-4-일)-3-메톡시벤즈아미드 (8.5 mg, 8.99 μmol, 13.41% 수율, 95% 순도)를 수득하였다. MS(M+H)+=898.4
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ = 11.10 (s, 1H), 8.32 - 8.24 (m, 2H), 8.12 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.97 (s, 1H), 7.53 - 7.46 (m, 2H), 7.02 - 6.83 (m, 3H), 5.36 (dd, J = 5.3, 12.5 Hz, 1H), 4.77 (t, J = 8.3 Hz, 1H), 4.05 (t, J = 14.2 Hz, 2H), 3.94 (s, 3H), 3.84 - 3.71 (m, 1H), 3.63 (s, 3H), 3.34 (s, 3H), 3.10 (d, J = 9.8 Hz, 2H), 2.92 (d, J = 9.7 Hz, 2H), 2.74 - 2.60 (m, 4H), 2.37 - 2.35 (m, 2H), 2.07 - 1.87 (m, 6H), 1.90 - 1.78 (m, 4H), 1.76 - 1.75 (m, 2H), 1.68 - 1.52 (m, 6H), 1.49 - 1.34 (m, 5H).
실시예 38. 4-((7,7-디플루오로-9-이소프로필-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(7-((1-(1-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-3-메틸-2-옥소-2,3-디히드로-1H-벤조[d]이미다졸-4-일)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)-3-메톡시벤즈아미드 (화합물 38)의 합성
단계 1. 5-옥소테트라히드로퓨란-2-카보닐 클로라이드 (2)의 합성
5-옥소테트라히드로퓨란-2-카복실산 (10 g, 76.86 mmol)에 SOCl2 (20 mL)를 0 °C 에서 천천히 첨가하고, 혼합물을 85 °C 에서 2시간 동안 교반한 후, 혼합물을 15 °C 에서 4시간 동안 교반 하였다. TLC (디클로로메탄 : 메탄올 = 10:1)로 출발물질이 완전히 소모되었음을 확인하고 더 낮은 극성의 하나의 주요한 새로운 스팟 형성을 확인하였다. 혼합물을 진공 농축하여 갈색 오일의 5-옥소테트라히드로퓨란-2-카보닐 클로라이드 (11 g, crude)를 수득하였고, 이를 다음 단계에 바로 사용하였다. MS(M+H)+=149.5
단계 2. N-(4-메톡시벤질)-5-옥소테트라히드로퓨란-2-카복사미드 (3)의 합성
5-옥소테트라히드로퓨란-2-카보닐 클로라이드 (11 g, 74.05 mmol)를 Dry DCM (100 mL)에 0 °C에서 N2 하에서 용해시켰다. 이후 DCM (30 mL) 내 TEA (14.99 g, 148.10 mmol, 20.61 mL) 및 PMBNH2 (8.13 g, 59.24 mmol, 7.67 mL)를 첨가하고 혼합물을 15 °C 에서 3시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 피크를 확인하였다. H2O (100 mL)을 첨가하고 유기상을 분리하고, 수용상을 EtOAc (100 mL Х 3)로 추출하였다. 합쳐진 유기상을 0.5 M HCl (50 mL) 및 염수 (50 mL)로 세척하고, 무수 소듐 설페이트로 건조하고, 여과하였다. 여과물을 진공 농축하였다. 잔여물을 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (Biotage; 20 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, Eluent of 50~100% EtOAc/석유 에터 gradient @ 40 mL/분)로 정제하여 황색 고체의 N-(4-메톡시벤질)-5-옥소테트라히드로퓨란-2-카복사미드 (10 g, 40.12 mmol, 54.18% 수율)를 수득하였다. MS(M+H)+=250.0
단계 3. 3-히드록시-1-(4-메톡시벤질)피페리딘-2,6-디온 (4)의 합성
무수 THF (15 mL) 내 N-(4-메톡시벤질)-5-옥소테트라히드로퓨란-2-카복사미드 (1.5 g, 6.02 mmol) 용액을 -78 ° C 로 냉각하였다. 이후 무수 THF (10 mL) 용액 내 t-BuOK (1 M, 6.62 mL) (1 N in THF)를 -78 °C에서 질소 기체 하 한 방울씩 첨가하였다. 생성된 혼합물을 -40 °C 에서 1시간 동안 교반 하였다. TLC (EtOAc)로 출발물질이 완전히 소모되었음 및 2개의 새로운 스팟 형성을 확인하였다. 반응 혼합물을 NH4Cl (20 mL)의 첨가로 켄칭하고, EtOAc (20 mL Х 3)로 추출하였다. 합쳐진 유기상을 염수 (20 mL x 2)로 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하였다. 여과물을 진공 농축하였다. 잔여물을 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (Biotage; 20 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, Eluent of 0~60% EtOAc/석유 에터 gradient @ 40 mL/분)로 정제하여 백색 고체의 3-히드록시-1-(4-메톡시벤질)피페리딘-2,6-디온 (900 mg, crude)을 수득하였다. MS(M+H)+=250.3
단계 4. 1-(4-메톡시벤질)-2,6-디옥소피페리딘-3-일 트리플루오로메탄설포네이트 (5)의 합성
DCM (5 mL) 내 3-히드록시-1-(4-메톡시벤질)피페리딘-2,6-디온 (500 mg, 2.01 mmol) 및 Py (317.44 mg, 4.01 mmol, 323.92 μL) 용액에 Tf2O (848.84 mg, 3.01 mmol, 496.40 μL)를 0 °C 에서 한 방울씩 첨가하였다. 혼합물을 -10 °C에서 N2 하에서 1.5시간 동안 교반 하였다. TLC (석유 에터 : EtOAc = 3:1)로 출발물질이 완전히 소모되었음 및 더 낮은 극성의 하나의 주요한 새로운 스팟 형성을 확인하였다. 혼합물을 진공 농축하였다. 잔여물을 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (Biotage; 20 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, Eluent of 0~50% EtOAc/석유 에터 gradient @ 40 mL/분)로 정제하여 황색 오일의 1-(4-메톡시벤질)-2,6-디옥소피페리딘-3-일 트리플루오로메탄설포네이트 (740 mg, 1.94 mmol, 96.74% 수율)를 수득하였다. MS(M+H)+=381.3
단계 5. 3-(4-브로모-3-메틸-2-옥소-2,3-디히드로-1H-벤조[d]이미다졸-1-일)-1-(4-메톡시벤질)피페리딘-2,6-디온 (7)의 합성
THF (10 mL) 내 7-브로모-1-메틸-1,3-디히드로-2H-벤조[d]이미다졸-2-온 (396.57 mg, 1.75 mmol) 용액에 t-BuOK (1 M, 2.33 mL)를 첨가하였다. 혼합물을 0 °C 에서 30분간 교반 하였다. 이어서, THF (4 mL) 내 1-(4-메톡시벤질)-2,6-디옥소피페리딘-3-일 트리플루오로메탄설포네이트 (740 mg, 1.94 mmol)를 한 방울씩 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 20 °C에서 N2 하에서 30분간 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 주 피크를 확인하였다. 반응 혼합물을 물 (20 mL)로 희석하고 EtOAc (20 mL x 3)로 추출하였다. 합쳐진 유기상을 염수 (20 mL x 2)로 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하였다. 여과물을 진공 농축하였다. 잔여물을 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (Biotage; 20 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, Eluent of 20~100% EtOAc/석유 에터 to 10% MeOH/ EtOAc gradient @ 40 mL/분)로 정제하고 prep-TLC (SiO2, 석유 에터 : EtOAc = 1:1)로 재정제하여 황색 고체의 3-(4-브로모-3-메틸-2-옥소-2,3-디히드로-1H-벤조[d]이미다졸-1-일)-1-(4-메톡시벤질)피페리딘-2,6-디온 (600 mg, 1.17 mmol, 60.04% 수율, 89% 순도)을 수득하였다. MS(M+H)+=458.0
단계 6. 벤질 (7-((1-(1-(1-(4-메톡시벤질)-2,6-디옥소피페리딘-3-일)-3-메틸-2-옥소-2,3-디히드로-1H-벤조[d]이미다졸-4-일)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)카바메이트 (9)의 합성
디옥산 (3 mL) 내 3-(4-브로모-3-메틸-2-옥소-2,3-디히드로-1H-벤조[d]이미다졸-1-일)-1-(4-메톡시벤질)피페리딘-2,6-디온 (300 mg, 654.59 μmol) 및 벤질 (7-(피페리딘-4-일메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)카바메이트 (291.09 mg, 654.97 μmol, 2HCl) 용액에 Pd-PEPPSI-IHeptCl (63.68 mg, 65.46 μmol) 및 Cs2CO3 (1.07 g, 3.27 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 100 °C 에서 16시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 피크(20%)를 확인하였다. 혼합물을 셀라이트 패드로 여과하고 여과물을 진공 농축하였다. 잔여물을 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (Biotage; 20 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, Eluent of 50~100% EtOAc/석유 에터 to 10% MeOH/ EtOAc gradient @ 40 mL/분)로 정제하고 prep-TLC (SiO2, DCM: MeOH = 10:1)로 재정제하여 황색 고체의 벤질 (7-((1-(1-(1-(4-메톡시벤질)-2,6-디옥소피페리딘-3-일)-3-메틸-2-옥소-2,3-디히드로-1H-벤조[d]이미다졸-4-일)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)카바메이트 (70 mg, 93.47 μmol, 14.28% 수율, N/A 순도)를 수득하였다. MS(M+H)+=749.4
단계 7. 3-(4-(4-((2-아미노-7-아자스피로[3.5]노난-7-일)메틸)피페리딘-1-일)-3-메틸-2-옥소-2,3-디히드로-1H-벤조[d]이미다졸-1-일)피페리딘-2,6-디온 (10)의 합성
TFA (0.5 mL) 내 벤질 (7-((1-(1-(1-(4-메톡시벤질)-2,6-디옥소피페리딘-3-일)-3-메틸-2-옥소-2,3-디히드로-1H-벤조[d]이미다졸-4-일)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)카바메이트 (70 mg, 93.47 μmol) 용액에 TfOH (1.19 g, 7.93 mmol, 700.01 μL)를 첨가하고, 혼합물을 100 °C 에서 2시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 피크(33%)를 확인하였다. 혼합물을 진공 농축하여 갈색 오일의 3-(4-(4-((2-아미노-7-아자스피로[3.5]노난-7-일)메틸)피페리딘-1-일)-3-메틸-2-옥소-2,3-디히드로-1H-벤조[d]이미다졸-1-일)피페리딘-2,6-디온 (50 mg, crude, TFA)을 수득하였고, 이를 다음 단계에 바로 사용하였다. MS(M+H)+=495.3
단계 8. 4-((7,7-디플루오로-9-이소프로필-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(7-((1-(1-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-3-메틸-2-옥소-2,3-디히드로-1H-벤조[d]이미다졸-4-일)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)-3-메톡시벤즈아미드 (화합물 38)의 합성
DMF (1 mL) 내 4-((7,7-디플루오로-9-이소프로필-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-3-메톡시벤조산 (35.55 mg, 84.37 μmol) 용액에 HATU (46.85 mg, 123.22 μmol) 및 DIPEA (31.85 mg, 246.45 μmol, 42.93 μL)를 첨가하고, 혼합물을 20 °C 에서 1시간 동안 교반 하였다. 3-(4-(4-((2-아미노-7-아자스피로[3.5]노난-7-일)메틸)피페리딘-1-일)-3-메틸-2-옥소-2,3-디히드로-1H-벤조[d]이미다졸-1-일)피페리딘-2,6-디온 (50 mg, crude, TFA)을 첨가하였다. 혼합물을 20 °C 에서 16시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 피크(37%)를 확인하였다. 반응 혼합물을 물 (5 mL)로 희석하고 EtOAc (10 mL x 5)로 추출하였다. 합쳐진 유기상을 염수 (10 mL x 2)로 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하고 감압 농축하여 잔여물을 얻었다. 잔여물을 prep-TLC (SiO2, DCM: MeOH = 9:1)로 정제하고 역상 HPLC (컬럼: Waters Xbridge 150 x 25 mm x 5μm;이동상: [water (NH4HCO3) - ACN]; B%: 43% - 73%, 9 분)로 재정제하였다. 용출물을 동결 건조하여 백색 고체의 4-((7,7-디플루오로-9-이소프로필-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(7-((1-(1-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-3-메틸-2-옥소-2,3-디히드로-1H-벤조[d]이미다졸-4-일)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)-3-메톡시벤즈아미드 (8.7 mg, 9.30 μmol, 11.32% 수율, 96% 순도)를 수득하였다. MS(M+H)+=898.4
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ = 11.08 (s, 1H), 8.42 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 8.33 - 8.28 (m, 1H), 8.22 (s, 1H), 7.88 (s, 1H), 7.53 - 7.44 (m, 2H), 7.00 - 6.93 (m, 1H), 6.92 - 6.83 (m, 2H), 5.41 - 5.29 (m, 1H), 4.94 - 4.82 (m, 1H), 4.46 - 4.35 (m, 1H), 4.04 (t, J = 13.6 Hz, 2H), 3.94 (s, 3H), 3.62 (s, 3H), 3.29 (s, 3H), 3.15 - 3.06 (m, 2H), 2.92 - 2.84 (m, 1H), 2.72 - 2.69 (m, 1H), 2.65 - 2.57 (m, 3H), 2.29 - 2.11 (m, 7H), 2.03 - 1.97 (m, 1H), 1.86 - 1.76 (m, 4H), 1.66 - 1.51 (m, 5H), 1.37 - 1.17 (m, 9H).
실시예 39. 4-((9-시클로펜틸-7,7-디플루오로-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H -피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(7-((1-(3-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-1-메틸-1H-인다졸-6-일)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)-3-메톡시벤즈아미드 (화합물 39)의 합성
단계 1. 6-브로모-3-요오드-1-메틸-1H-인다졸 (2)의 합성
아세톤 (30 mL) 내 6-브로모-3-요오드-1H-인다졸 (5 g, 15.48 mmol) 및 KOH (2.17 g, 38.71 mmol) 용액에 MeI (3.30 g, 23.22 mmol, 1.45 mL)를 한 방울씩 첨가하고, 혼합물을 20 °C 에서 16시간 동안 교반 하였다. TLC (SiO2, 석유 에터: EtOAc = 5:1)로 출발물질이 일부 남아 있음 및 더 낮은 극성의 하나의 주요한 새로운 스팟 형성을 확인하였다. 혼합물을 여과하고 여과케이크를 아세톤 (50 mL)으로 세척하고, 여과물을 진공 농축하였다. 잔여물을 EtOAc (30 mL)로 희석하고 물 (30 mL x 2) 및 염수 (30 mL)로 세척하였다. 유기상을 Na2SO4로 건조하고, 여과하고 진공 농축하였다. 잔여물을 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (20 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, Eluent of 4% EtOAc/석유 에터 gradient @ 200 mL/분)로 정제하여 밝은 황색 고체의 6-브로모-3-요오드-1-메틸-1H-인다졸 (5.04 g, 14.96 mmol, 96.60% 수율)을 수득하였다. MS(M+H)+=336.6
단계 2. 3-(2,6-비스(벤질옥시)피리딘-3-일)-6-브로모-1-메틸-1H-인다졸 (4)의 합성
THF (36 mL) 및 H2O (6 mL) 내 6-브로모-3-요오드-1-메틸-1H-인다졸 (1.3 g, 3.86 mmol) 및 2,6-비스(벤질옥시)-3-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보로란-2-일)피리딘 (1.8 g, 3.45 mmol, 80% 순도) 용액에 Cs2CO3 (2.25 g, 6.90 mmol) 및 Pd(dppf)Cl2 (75.75 mg, 103.52 μmol)를 첨가하고, 혼합물을 80 °C N2 기체 하에서 14시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 피크(70%)를 확인하였다. 혼합물을 물 (60 mL)로 희석하고 EtOAc (30 mL x 3)로 추출하였다. 합쳐진 유기상을 물 (30 mL)로 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하였다. 여과물을 감압 농축하였다. 잔여물을 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (12 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, Eluent of 15 % EtOAc/석유 에터 gradient @ 80 mL/분)로 정제하여 황색 고체의 3-(2,6-비스(벤질옥시)피리딘-3-일)-6-브로모-1-메틸-1H-인다졸 (1.6 g, 3.01 mmol, 87.10% 수율, 94% 순도)을 수득하였다. MS(M+H)+=500.3
단계 3. 에틸 1-(3-(2,6-비스(벤질옥시)피리딘-3-일)-1-메틸-1H-인다졸-6 -일)피페리딘-4-카복실레이트 (7)의 합성
디옥산 (10 mL) 내 3-(2,6-비스(벤질옥시)피리딘-3-일)-6-브로모-1-메틸-1H-인다졸 (860 mg, 1.72 mmol) 및 에틸 피페리딘-4-카복실레이트 (367.20 mg, 2.34 mmol, 360 μL) 용액에 Cs2CO3 (1.68 g, 5.16 mmol), Pd2(dba)3 (31.48 mg, 34.37 μmol) 및 XPhos (24.58 mg, 51.56 μmol)를 20 °C 에서 첨가하고, 혼합물을 100 °C에서 N2 기체 하에서 14시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 피크(87%)를 확인하였다. 혼합물을 여과하고 여과케이크를 EtOAc (20 mL) 및 THF (20 mL)로 세척하였다. 여과물을 감압 농축하였다. 잔여물을 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (12 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, Eluent of 40% EtOAc/석유 에터 gradient @ 80 mL/분)로 정제하여 황색 오일의 에틸 1-(3-(2,6-비스(벤질옥시)피리딘-3-일)-1-메틸-1H-인다졸-6 -일)피페리딘-4-카복실레이트 (870 mg, 1.51 mmol, 87.78% 수율)를 수득하였다. MS(M+H)+=577.4
단계 4. (1-(3-(2,6-비스(벤질옥시)피리딘-3-일)-1-메틸-1H-인다졸-6-일)피페리딘-4-일)메탄올 (8)의 합성
THF (15 mL) 내 에틸 1-(3-(2,6-비스(벤질옥시)피리딘-3-일)-1-메틸-1H-인다졸-6-일)피페리딘-4-카복실레이트 (870 mg, 1.51 mmol) 용액에 LAH (87.00 mg, 2.29 mmol)를 천천히 첨가하고, 혼합물을 20 °C 에서 1시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 주 피크(95%)를 확인하였다. 혼합물을 물 (5 mL)로 켄칭하고 20 °C 에서 5분간 교반 하였다. 혼합물을 EtOAc (30 mL)로 희석하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하고 감압 농축하여 황색 오일의 (1-(3-(2,6-비스(벤질옥시)피리딘-3-일)-1-메틸-1H-인다졸-6-일)피페리딘-4-일)메탄올 (0.8 g, crude)을 수득하였다. MS(M+H)+=535.3
단계 5. 3-(6-(4-(히드록시메틸)피페리딘-1-일)-1-메틸-1H-인다졸-3-일)피페리딘-2,6-디온 (9)의 합성
CF3CH2OH (30 mL) 내 (1-(3-(2,6-비스(벤질옥시)피리딘-3-일)-1-메틸-1H-인다졸-6-일)피페리딘-4-일)메탄올 (0.8 g, 1.50 mmol) 용액에 TFA (184.80 mg, 1.62 mmol, 120 μL)를 첨가한 후 Pd/C (100 mg, 10% 순도)를 N2 기체 하에서 첨가하고, 반응 혼합물을 탈기하고 H2로 3차례 퍼징하고, 혼합물을 20 °C에서 H2 (15 Psi) 하에서 14시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 피크(85%)를 확인하였다. 혼합물을 여과하고 여과케이크를 EtOH (100 mL) 및 THF (20 mL)로 세척하였다. 여과물을 감압 농축하였다. 조 생성물을 THF (10 mL)로 희석하고 DIPEA를 첨가하여 pH=7로 조정하였다. 혼합물을 농축하고 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (12 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, Eluent of 20~30% MeOH/ EtOAc gradient @ 80 mL/분)로 정제하였다. 생성물을 EtOH (2 mL) 및 석유 에터 (10 mL)로 희석하였다. 혼합물을 여과하였다. 여과케이크를 모으고 감압 건조하여 백색 고체의 3-(6-(4-(히드록시메틸)피페리딘-1-일)-1-메틸-1H-인다졸-3-일)피페리딘-2,6-디온 (370 mg, 1.01 mmol, 67.30% 수율, 97% 순도)을 수득하였다. MS(M+H)+=357.4
단계 6. 1-(3-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-1-메틸-1H-인다졸-6-일)피페리딘-4-카브알데히드 (10)의 합성
DCM (2 mL) 내 3-(6-(4-(히드록시메틸)피페리딘-1-일)-1-메틸-1H-인다졸-3-일)피페리딘-2,6-디온 (100 mg, 280.57 μmol) 용액에 DMP (179 mg, 422.03 μmol, 130.66 μL)를 첨가하고, 혼합물을 20 °C 에서 3시간 동안 교반 하였다. 혼합물을 감압 농축하였다. 조 생성물을 MeOH (1 mL)로 희석하고 여과하였다. 여과케이크를 MeOH (1 mL)로 세척하고 여과물을 감압 농축하여 황색 오일의 1-(3-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-1-메틸-1H-인다졸-6-일)피페리딘-4-카브알데히드 (0.1 g, crude)를 수득하였다. MS(M+H)+=355.1
단계 7. 4-((9-시클로펜틸-7,7-디플루오로-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H -피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(7-((1-(3-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-1-메틸-1H-인다졸-6-일)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)-3-메톡시벤즈아미드 (화합물 39)의 합성
MeOH (1 mL) 내 4-((9-시클로펜틸-7,7-디플루오로-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-3-메톡시-N-(7-아자스피로[3.5]노난-2-일)벤즈아미드 (70 mg, 115.49 μmol, HCl 염) 용액에 NaOAc (9.5 mg, 115.81 μmol)를 첨가한 후, MeOH (1 mL) 내 1-(3-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-1-메틸-1H-인다졸-6-일)피페리딘-4-카브알데히드 (100 mg, 282.17 μmol) 용액을 첨가하고 혼합물을 20 °C 에서 30분간 교반 하였다. 이후 NaBH3CN (21.77 mg, 346.47 μmol)를 첨가하고 혼합물을 20 °C 에서 2시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 피크(19%)를 확인하였다. 혼합물을 20 °C 에서 12시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 피크(18%)를 확인하였다. 혼합물을 감압 농축하였다. 조 생성물을 prep-TLC (디클로로메탄: 메탄올=9:1), 이어서 prep-HPLC (컬럼: Phenomenex Synergi Polar-RP 100*25 mm*4um; 이동상: [water (TFA) - ACN]; B%: 25% - 55%, 9 분)로 정제하고, 용출물을 동결 건조하여 백색 고체의 4-((9-시클로펜틸-7,7-디플루오로-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H -피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(7-((1-(3-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-1-메틸-1H-인다졸-6-일)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)-3-메톡시벤즈아미드 (14.0 mg, 14.65 μmol, 12.68% 수율, 95% 순도)를 수득하였다. MS(M+H)+=907.9
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ = 10.86 (s, 1H), 8.99 - 8.80 (m, 1H), 8.53 - 8.45 (m, 1H), 8.29 - 8.22 (m, 2H), 8.16 - 8.10 (m, 1H), 7.54 - 7.47 (m, 3H), 6.95 (br d, J = 7.7 Hz, 1H), 6.91 - 6.87 (m, 1H), 4.84 - 4.73 (m, 1H), 4.49 - 4.38 (m, 1H), 4.29 - 4.24 (m, 1H), 4.08 (br t, J = 13.9 Hz, 2H), 3.95 (s, 3H), 3.90 (s, 3H), 3.87 - 3.81 (m, 2H), 3.42 - 3.38 (m, 2H), 3.34 (s, 3H), 3.08 - 2.94 (m, 3H), 2.88 - 2.77 (m, 3H), 2.64 - 2.61 (m, 1H), 2.41 - 2.36 (m, 1H), 2.30 - 2.26 (m, 1H), 2.23 - 2.12 (m, 2H), 2.03 - 1.69 (m, 14H), 1.67 - 1.52 (m, 4H), 1.43 - 1.32 (m, 2H).
실시예 40. 4-((9-시클로펜틸-7,7-디플루오로-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(7-((1-(3-(2,4-디옥소테트라히드로피리미딘-1(2H)-일)-1-메틸-1H-인다졸-6-일)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)-3-메톡시벤즈아미드 (화합물 40)의 합성
단계 1. 3-((6-브로모-1-메틸-1H-인다졸-3-일)아미노)프로판산 (2)의 합성
H2O (3 mL) 내 아크릴산 (956.27 mg, 13.27 mmol, 910.73 μL) 및 6-브로모-1-메틸-1H-인다졸-3-아민 (3 g, 13.27 mmol) 용액에 HOAc (1.89 g, 31.47 mmol, 1.8 mL)를 첨가하였다. 혼합물을 100 °C 에서 14시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량을 확인하였다. 혼합물을 EtOAc (5 mL), MTBE (5 mL) 및 H2O (10 mL)로 희석하고 여과하였다. 여과케이크를 EtOAc (10 mL) 및 H2O (10 mL)로 세척하였다. 여과케이크를 모아서 감압 건조하였다. 여과물을 Na2CO3 포화 용액으로 pH=9로 조정하고 EtOAc (10 mL x 3)로 추출하고, 유기상을 제거하였다. 수용상을 1N HCl로 pH=3으로 조정하고, EtOAc (10 mL x 3)로 추출하였다. 합쳐진 유기상을 Na2SO4 로 건조하고 여과하고 감압 농축하여 황색 고체의 3-((6-브로모-1-메틸-1H-인다졸-3-일)아미노)프로판산 (1.67 g, crude)을 수득하였다. MS(M+H)+=298.2
단계 2. 메틸 3-((6-브로모-1-메틸-1H-인다졸-3-일)아미노)프로파노에이트 (3)의 합성
톨루엔 (2 mL) 및 MeOH (2 mL) 내 3-((6-브로모-1-메틸-1H-인다졸-3-일)아미노)프로판산 (1.67 g, 5.60 mmol) 용액에 TMSCHN2 (2 M, 8.40 mL)를 첨가하고, 혼합물을 20 °C 에서 14시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 피크를 확인하였다. 혼합물을 감압 농축하였다. 조 생성물을 다른 배치 (1g 스케일)과 합치고, MTBE (10 mL)로 희석하고 혼합물을 20 °C 에서 30분간 교반 하였다. 혼합물을 여과하고 여과케이크를 MTBE (10 mL)로 세척하였다. 합쳐진 여과물을 감압 농축하였다. 잔여물을 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (12 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, Eluent of 40 % EtOAc/석유 에터 gradient @ 80 mL/분)로 정제하여 황색 오일의 메틸 3-((6-브로모-1-메틸-1H-인다졸-3-일)아미노)프로파노에이트 (1.3 g, 3.87 mmol, 69.09% 수율, 93% 순도)를 수득하였다. MS(M+H)+=312.1
단계 3. 메틸 3-((6-(4-((2-(((벤질옥시)카보닐)아미노)-7-아자스피로[3.5]노난-7-일)메틸)피페리딘-1-일)-1-메틸-1H-인다졸-3-일)아미노)프로파노에이트 (5)의 합성
디옥산 (13 mL) 내 메틸 3-((6-브로모-1-메틸-1H-인다졸-3-일)아미노)프로파노에이트 (0.5 g, 1.60 mmol) 및 벤질 (7-(피페리딘-4-일메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)카바메이트 (734 mg, 1.80 mmol, HCl 염) 용액에 Cs2CO3 (1.57 g, 4.81 mmol) 및 Pd-PEPPSI-IHeptCl (31.16 mg, 32.03 μmol)를 첨가하고, 혼합물을 100 °C 에서 28시간 동안 교반 하였다. LCMS로 메틸 3-((6-브로모-1-메틸-1H-인다졸-3-일)아미노)프로파노에이트가 남아 있음을 확인하고 추가로 Pd-PEPPSI-IHeptCl (31.16 mg, 32.03 μmol)를 20 °C 에서 첨가하고 혼합물을 100 °C 에서 48시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 피크(28%)를 확인하였다. 혼합물을 여과하고 여과케이크를 EtOAc (50 mL)로 세척하였다. 여과물을 감압 농축하였다. 잔여물을 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (12 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, Eluent of 100~10% MeOH/EtOAc gradient @ 80 mL/분)로 정제하고 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (12 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, Eluent of 100% EtOAc/석유 에터 gradient @ 80 mL/분)로 정제하여 황색 오일의 메틸 3-((6-(4-((2-(((벤질옥시)카보닐)아미노)-7-아자스피로[3.5]노난-7-일)메틸)피페리딘-1-일)-1-메틸-1H-인다졸-3-일)아미노)프로파노에이트 (190 mg, 277.39 μmol, 17.32% 수율, 88% 순도)를 수득하였다. MS(M+H)+=603.6
단계 4. 메틸 3-(1-(6-(4-((2-(((벤질옥시)카보닐)아미노)-7-아자스피로[3.5]노난-7 -일)메틸)피페리딘-1-일)-1-메틸-1H-인다졸-3-일)우레이도)프로파노에이트 (6)의 합성
AcOH (4 mL) 내 메틸 3-((6-(4-((2-(((벤질옥시)카보닐)아미노)-7-아자스피로[3.5]노난-7-일)메틸)피페리딘-1-일)-1-메틸-1H-인다졸-3-일)아미노)프로파노에이트 (190 mg, 277.39 μmol, 88% 순도) 용액에 KOCN (35 mg, 411.06 μmol)를 첨가하고 혼합물을 20 °C 에서 14시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 피크(67%)를 확인하였다. 혼합물을 감압 농축하였다. 조 생성물을 MeCN (3 mL) 및 물 (30 mL)로 희석하고 동결 건조하여 황색 오일의 메틸 3-(1-(6-(4-((2-(((벤질옥시)카보닐)아미노)-7-아자스피로[3.5]노난-7 -일)메틸)피페리딘-1-일)-1-메틸-1H-인다졸-3-일)우레이도)프로파노에이트 (0.2 g, crude)를 수득하였다. MS(M+H)+=646.5
단계 5. 벤질 (7-((1-(3-(2,4-디옥소테트라히드로피리미딘-1(2H)-일)-1-메틸-1H-인다졸-6-일)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)카바메이트 (7)의 합성
MeCN (4 mL) 내 메틸 3-(1-(6-(4-((2-(((벤질옥시)카보닐)아미노)-7-아자스피로[3.5]노난-7-일)메틸)피페리딘-1-일)-1-메틸-1H-인다졸-3-일)우레이도)프로파노에이트 (190 mg, 294.21 μmol) 용액에 Triton B (828.00 mg, 1.98 mmol, 0.9 mL, 40% 순도)를 천천히 첨가하고 혼합물을 20 °C 에서 1시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 주 피크(90%)를 확인하였다. 혼합물을 물 (10 mL)로 희석하고 EtOAc/MeOH=10/1 (10 mL x 3)로 추출하였다. 합쳐진 유기상을 물 (10 mL x 3)로 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하였다. 여과물을 감압 농축하였다. 잔여물을 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (5 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, Eluent of 0~30% MeOH/EtOAc gradient @ 80 mL/분)로 정제하여 황색 고체의 벤질 (7-((1-(3-(2,4-디옥소테트라히드로피리미딘-1(2H)-일)-1-메틸-1H-인다졸-6-일)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)카바메이트 (110 mg, 161.30 μmol, 54.83% 수율, 90% 순도)를 수득하였다. MS(M+H)+=614.6
단계 6. 1-(6-(4-((2-아미노-7-아자스피로[3.5]노난-7-일)메틸)피페리딘-1-일)-1-메틸-1H-인다졸-3-일)디히드로피리미딘-2,4(1H,3H)-디온 (8)의 합성
TFA (1.5 mL) 내 벤질 (7-((1-(3-(2,4-디옥소테트라히드로피리미딘-1(2H)-일)-1-메틸-1H-인다졸-6-일)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)카바메이트 (95 mg, 154.79 μmol) 용액을 60 °C 에서 2시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 주 피크(95%)를 확인하였다. 혼합물을 감압 농축하여 황색 오일의 1-(6-(4-((2-아미노-7-아자스피로[3.5]노난-7-일)메틸)피페리딘-1-일)-1-메틸-1H-인다졸-3-일)디히드로피리미딘-2,4(1H,3H)-디온 (90 mg, crude, TFA 염)을 수득하였다. MS(M+H)+=480.5
단계 7. 4-((9-시클로펜틸-7,7-디플루오로-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(7-((1-(3-(2,4-디옥소테트라히드로피리미딘-1(2H)-일)-1-메틸-1H-인다졸-6-일)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)-3-메톡시벤즈아미드 (화합물 40)의 합성
DMF (0.7 mL) 내 4-((9-시클로펜틸-7,7-디플루오로-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-3-메톡시벤조산 (60 mg, 134.10 μmol) 용액에 HATU (56.09 mg, 147.51 μmol) 및 DIPEA (29.68 mg, 229.64 μmol, 40 μL)를 첨가하고 혼합물을 20 °C 에서 15분동안 교반 하였다. 이후 DMF (0.8 mL) 내 1-(6-(4-((2-아미노-7-아자스피로[3.5]노난-7-일)메틸)피페리딘-1-일)-1-메틸-1H-인다졸-3-일)디히드로피리미딘-2,4(1H,3H)-디온 (90 mg, 151.61 μmol, TFA 염) 및 DIPEA (89.04 mg, 688.93 μmol, 120.00 μL) 용액을 첨가하고 20 °C 에서 1시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 피크(65%)를 확인하였다. 혼합물을 물 (20 mL)로 희석하고 EtOAc (10 mL x 3)로 추출하였다. 합쳐진 유기상을 염수 (10 mL x 3)로 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하였다. 여과물을 감압 농축하였다. 조 생성물을 prep-TLC (DCM: MeOH=10:1)로 정제하였다. 생성물을 MeCN (3 mL), MeOH (2 mL) 및 탈이온화수 (30 mL)로 희석하고, 혼합물을 동결 건조하여 황색 고체의 4-((9-시클로펜틸-7,7-디플루오로-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(7-((1-(3-(2,4-디옥소테트라히드로피리미딘-1(2H)-일)-1-메틸-1H-인다졸-6-일)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)-3-메톡시벤즈아미드 (61.1 mg, 63.18 μmol, 47.12% 수율, 94% 순도)를 수득하였다. MS(M+H)+=908.9
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ = 10.50 (s, 1H), 8.48 - 8.41 (m, 1H), 8.30 - 8.25 (m, 2H), 7.97 (s, 1H), 7.50 - 7.46 (m, 2H), 7.43 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 6.90 (br d, J = 9.0 Hz, 1H), 6.81 (s, 1H), 4.81 - 4.72 (m, 1H), 4.45 - 4.36 (m, 1H), 4.05 (br t, J = 14.2 Hz, 2H), 3.94 (s, 3H), 3.91 - 3.86 (m, 5H), 3.84 - 3.76 (m, 2H), 3.30 (s, 3H), 2.79 - 2.70 (m, 4H), 2.63 - 2.55 (m, 3H), 2.25 - 2.10 (m, 4H), 1.98 - 1.91 (m, 3H), 1.86 - 1.77 (m, 4H), 1.75 - 1.52 (m, 11H), 1.34 - 1.18 (m, 2H).
실시예 41. 4-((7,7-디플루오로-9-이소프로필-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(4-(7-(1-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-3-메틸-2-옥소-2,3-디히드로-1H-벤조[d]이미다졸-4-일)-2,7-디아자스피로[3.5]노난-2-일)피페리딘-1-일)-3-메톡시벤즈아미드 (화합물 41)의 합성
단계 1. 벤질 (4-(7-(1-(1-(4-메톡시벤질)-2,6-디옥소피페리딘-3-일)-3-메틸-2-옥소-2,3-디히드로-1H-벤조[d]이미다졸-4-일)-2,7-디아자스피로[3.5]노난-2-일)피페리딘-1-일)카바메이트 (3)
디옥산 (15 mL) 내 3-(4-브로모-3-메틸-2-옥소-2,3-디히드로-1H-벤조[d]이미다졸-1-일)-1-(4-메톡시벤질)피페리딘-2,6-디온 (360 mg, 785.50 μmol) 및 벤질 (4-(2,7-디아자스피로[3.5]노난-2-일)피페리딘-1-일)카바메이트 (310.23 mg, 785.50 μmol, HCl) 용액에 Pd-PEPPSI-IHeptCl (76.41 mg, 78.55 μmol) 및 Cs2CO3 (1.28 g, 3.93 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 100 °C 에서 16시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 피크(19%)를 확인하였다. 혼합물을 셀라이트 패드로 여과하고 여과물을 진공 농축하였다. 잔여물을 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (Biotage; 20 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, Eluent of 20~100% EtOAc/석유 에터 to 10% MeOH/ EtOAc gradient @ 40 mL/분)로 정제하고 prep-TLC (SiO2, DCM: MeOH = 9:1)로 재정제하여 황색 고체의 벤질 (4-(7-(1-(1-(4-메톡시벤질)-2,6-디옥소피페리딘-3-일)-3-메틸-2-옥소-2,3-디히드로-1H-벤조[d]이미다졸-4-일)-2,7-디아자스피로[3.5]노난-2-일)피페리딘-1-일)카바메이트 (110 mg, 136.03 μmol, 17.32% 수율, 91% 순도)를 수득하였다. MS(M+H)+=736.4
단계 2. 3-(4-(2-(1-아미노피페리딘-4-일)-2,7-디아자스피로[3.5]노난-7-일)-3-메틸-2-옥소-2,3-디히드로-1H-벤조[d]이미다졸-1-일)피페리딘-2,6-디온 (4)의 합성
TFA (1 mL) 내 벤질 (4-(7-(1-(1-(4-메톡시벤질)-2,6-디옥소피페리딘-3-일)-3-메틸-2-옥소-2,3-디히드로-1H-벤조[d]이미다졸-4-일)-2,7-디아자스피로[3.5]노난-2-일)피페리딘-1-일)카바메이트 (100 mg, 135.89 μmol) 용액에 TfOH (340.00 mg, 2.27 mmol, 0.2 mL)를 첨가하고, 100 °C 에서 3시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 피크(32%)를 확인하였다. 혼합물을 진공 농축하여 갈색 오일의 3-(4-(2-(1-아미노피페리딘-4-일)-2,7-디아자스피로[3.5]노난-7-일)-3-메틸-2-옥소-2,3-디히드로-1H-벤조[d]이미다졸-1-일)피페리딘-2,6-디온 (70 mg, crude, TFA)을 수득하였고 이를 다음 단계에 바로 사용하였다. MS(M+H)+=482.3.
단계 3. 4-((7,7-디플루오로-9-이소프로필-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(4-(7-(1-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-3-메틸-2-옥소-2,3-디히드로-1H-벤조[d]이미다졸-4-일)-2,7-디아자스피로[3.5]노난-2-일)피페리딘-1-일)-3-메톡시벤즈아미드 (화합물 41)의 합성
DMF (2 mL) 내 4-((7,7-디플루오로-9-이소프로필-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-3-메톡시벤조산 (56.00 mg, 132.89 μmol) 용액에 HATU (67.03 mg, 176.29 μmol) 및 DIPEA (45.57 mg, 352.58 μmol, 61.41 μL)를 첨가하고, 혼합물을 20 °C 에서 30분간 교반하고, 3-(4-(2-(1-아미노피페리딘-4-일)-2,7-디아자스피로[3.5]노난-7-일)-3-메틸-2-옥소-2,3-디히드로-1H-벤조[d]이미다졸-1-일)피페리딘-2,6-디온 (70 mg, 117.53 μmol, TFA)을 첨가하고, 혼합물을 20 °C 에서 2시간 동안 교반 하였다. LCMS로 원하는 질량의 피크(36%)를 확인하였다. 반응 혼합물을 물 (5 mL)로 희석하고 EtOAc (10 mL x 5)로 추출하였다. 합쳐진 유기상을 염수 (10 mL x 2)로 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하고 감압 농축하여 잔여물을 얻었다. 잔여물을 prep-TLC (SiO2, DCM: MeOH = 9:1)로 정제하고 역상 HPLC (컬럼: Waters Xbridge 150 x 25 mm x 5μm;이동상: [water (NH4HCO3) -ACN];B%: 33%-63%, 9 분)로 재정제하였다. 용출물을 동결 건조하여 백색 고체의 4-((7,7-디플루오로-9-이소프로필-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(4-(7-(1-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-3-메틸-2-옥소-2,3-디히드로-1H-벤조[d]이미다졸-4-일)-2,7-디아자스피로[3.5]노난-2-일)피페리딘-1-일)-3-메톡시벤즈아미드 (10.2 mg, 11.18 μmol, 9.51% 수율, 97% 순도)를 수득하였다. MS(M+H)+=885.5.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ = 11.14 - 11.04 (m, 1H), 9.28 (s, 1H), 8.30 (d, J = 5.9 Hz, 1H), 8.22 (s, 1H), 7.87 (s, 1H), 7.47 - 7.40 (m, 2H), 7.00 - 6.93 (m, 1H), 6.90 - 685 (m, 2H), 5.41 - 5.29 (m, 1H), 4.94 - 4.81 (m, 1H), 4.08 - 3.99 (m, 2H), 3.93 (s, 3H), 3.62 (s, 3H), 3.30 (s, 3H), 3.06 - 2.92 (m, 9H), 2.81 - 2.73 (m, 3H), 2.70 - 2.67 (m, 2H), 2.17 - 2.09 (m, 1H), 2.03 - 1.97 (m, 1H), 1.91 - 1.79 (m, 4H), 1.75 - 1.67 (m, 2H), 1.37 - 1.30 (m, 2H), 1.27 - 1.21 (m, 7H).
실시예 42. 4-((9-시클로펜틸-7,7-디플루오로-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(7-((1-(6-(6,8-디옥소-2,7-디아자스피로[4.5]데칸-2-일)피리딘-2-일)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)-3-메톡시벤즈아미드 (화합물 42)의 합성
단계 1. 벤질 (7-((1-(6-클로로피리딘-2-일)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)카바메이트 (3)의 합성
DMF (6 mL) 내 2-클로로-6-플루오로-피리딘 (300 mg, 2.28 mmol) 및 벤질(7-(피페리딘-4-일메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)카바메이트 (600 mg, 1.47 mmol, HCl) 용액에 20°C에서 DIPEA (884.32 mg, 6.84 mmol, 1.19 mL)를 첨가 후 생성된 혼합물을 60°C에서 12시간 동안 교반 하였다. LCMS로 출발물질이 완전히 소모됨을 확인하였고 원하는 질량의 피크 22 %가 검출되었다. 반응 혼합물을 H2O (15 mL)로 희석 후 EtOAc (15 mL x 3)으로 추출하였다. 유기상을 염수 (15 mL x 3)로 세척 후 Na2SO4로 건조, 여과 및 농축했다. 잔여물을 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (10 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, Eluent of 0~100 % EtOAc/석유 에터 gradient @ 100 mL/분)로 정제하여 백색 고체의 벤질 (7-((1-(6-클로로피리딘-2-일)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)카바메이트 (430 mg, 863.48 μmol, 37.86% 수율, 97% 순도)를 수득하였다. MS(M+H)+ = 483.4
단계 2. (2-아미노-2-옥소에틸)트리페닐포스포늄 클로라이드 (9)의 합성
ACN (100 mL) 내 2-클로로아세트아미드 (10 g, 106.94 mmol) 용액에 20°C에서 PPh3 (29.45 g, 112.28 mmol)를 첨가 후 생성된 혼합물을 80°C에서 16시간 동안 교반 하였다. LCMS로 출발물질이 완전히 소모됨을 확인하였고 원하는 질량의 피크 (54 %)가 검출되었다. 반응 혼합물을 여과하고 여과 케이크를 진공 건조했다. 조 생성물을 20°C에서 EtOAc (100 mL)로 15분 동안 분쇄하고 여과했다. 여과 케이크를 진공 건조하여 백색 고체의 (2-아미노-2-옥소에틸)트리페닐포스포늄 클로라이드 (27.2 g, 84.91 mmol, 79.40% 수율, 100% 순도)를 수득하였다. MS(M+H)+ = 320.4
단계 3. 3-(트리페닐-15-포스파닐리덴)피페리딘-2,6-디온 (11)의 합성
MeOH (200 mL) 내 (2-아미노-2-옥소에틸)트리페닐포스포늄 클로라이드 (20 g, 62.43 mmol) 용액에 20°C에서 NaOH (2.50 g, 62.43 mmol) 및 메틸 프로프-2-에노에이트 (6.45 g, 74.92 mmol, 6.75 mL)를 첨가 후 생성된 혼합물을 20°C에서 12시간 동안 교반 하였다. LCMS로 출발물질이 완전히 소모됨을 확인하였고 원하는 질량의 피크 (33 %)가 검출되었다. 반응 혼합물을 감압 농축하여 백색 고체의 3-(트리페닐-15-포스파닐리덴)피페리딘-2,6-디온 (20 g, crude)을 수득하였다. MS(M+H)+ = 374.3
단계 4. 3-메틸렌피페리딘-2,6-디온 (12)의 합성
DCE (200 mL) 내 3-(트리페닐-15-포스파닐리덴)피페리딘-2,6-디온 (20 g, 53.56 mmol) 용액에 20°C에서 파라포름알데히드 (1.93 g)를 첨가하고 생성된 혼합물을 80°C에서 1시간 동안 교반 하였다. LCMS로 출발물질이 완전히 소모됨을 확인하였고 원하는 질량의 피크가 검출되었다. 반응 혼합물을 진공 농축하여 백색 고체의 3-메틸렌피페리딘-2,6-디온 (6.7 g, crude)을 수득하였다. MS(M+H)+ = 126.1
단계 5. 2-벤질-2,7-디아자스피로[4.5]데칸-6,8-디온 (14)의 합성
DCM (100 mL) 내 3-메틸렌피페리딘-2,6-디온 (6.7 g, 53.55 mmol) 및 N-벤질-1-메톡시-N-((트리메틸실릴)메틸)메탄아민 (10.17 g, 42.84 mmol) 용액에 20°C에서 TFA (3.97 g, 34.81 mmol, 2.58 mL)를 첨가하고 생성된 혼합물을 20°C에서 16시간 동안 교반 하였다. LCMS로 출발물질이 완전히 소모됨을 확인하였고 원하는 질량이 검출되었다. 반응 혼합물을 진공 농축하였다. 잔여물을 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (80 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, Eluent of 0~100 % EtOAc/석유 에터 gradient @ 100 mL/분)로 정제하여 불순물이 섞인 생성물을 수득하였고, 이를 20°C에서 혼합 용액 (20 mL, MTBE: EtOAc = 5:1)으로 15분 동안 분쇄 후 여과했다. 여과물을 진공 건조하여 불순물이 섞인 생성물 B 를 수득하였고, 이를 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (80 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, Eluent of 0~100 % EtOAc/석유 에터 gradient @ 100 mL/분)로 및 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (40 g SepaFlash® 실리카 플래시 컬럼, Eluent of 0~100% EtOAc/석유 에터 gradient @ 100 mL/분)로 재정제하여 밝은 황색 고체의 2-벤질-2,7-디아자스피로[4.5]데칸-6,8-디온 (976 mg, 3.78 mmol, 32.53% 수율)을 수득하였다. MS(M+H)+ = 259.1
단계 6. 2,7-디아자스피로[4.5]데칸-6,8-디온 (4)의 합성
CF3CH2OH (10 mL) 내 2-벤질-2,7-디아자스피로[4.5]데칸-6,8-디온 (976 mg, 3.78 mmol) 용액에 N2 기체 하 Pd/C (100 mg, 10% 순도)를 첨가하였다. 현탁액을 H2 하 3차례 탈기 및 퍼지 했다. 이후 H2 (15 Psi) 하 20°C에서 16시간 동안 교반 하였다. LCMS로 출발물질이 완전히 소모됨을 확인하였고 원하는 질량의 피크가 검출되었다. 반응 혼합물을 CF3CH2OH (30 mL)로 희석 후 여과했다. 잔여물을 진공 농축하여 황색 오일의 2,7-디아자스피로[4.5]데칸-6,8-디온 (742 mg, crude)을 수득하였다. MS(M+H)+ = 169.0
단계 7. 벤질 (7-((1-(6-(6,8-디옥소-2,7-디아자스피로[4.5]데칸-2-일)피리딘-2-일)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로 [3.5]노난-2-일)카바메이트 (5)의 합성
디옥산 (3 mL) 내 벤질 (7-((1-(6-클로로피리딘-2-일)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)카바메이트 (100 mg, 207.02 μmol) 및 2,7-디아자스피로[4.5]데칸-6,8-디온 (104.46 mg, 621.06 μmol) 용액에 N2 하 20°C에서 Pd-PEPPSI-IHeptCl (10.07 mg, 10.35 μmol) 및 Cs2CO3 (202.35 mg, 621.06 μmol)를 첨가하고 생성된 반응 혼합물을 N2 하 100°C에서 12시간 동안 교반 하였다. LCMS로 12%의 벤질 (7-((1-(6-클로로피리딘-2-일)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)카바메이트가 남아있음 및 원하는 질량의 피크 (70 %)가 검출되었다. 반응 혼합물을 진공 농축하였다. 잔여물을 prep-TLC (SiO2, EtOAc : MeOH = 10:1)로 정제하여 백색 고체의 벤질 (7-((1-(6-(6,8-디옥소-2,7-디아자스피로[4.5]데칸-2-일)피리딘-2-일)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로 [3.5]노난-2-일)카바메이트 (66 mg, 101.99 μmol, 49.26% 수율, 95% 순도)를 수득하였다. MS(M+H)+ = 615.3
단계 8. 2-(6-(4-((2-아미노-7-아자스피로[3.5]노난-7-일)메틸)피페리딘-1-일)피리딘-2-일)-2,7-디아자스피로[4.5]데칸-6,8-디온 (6)의 합성
20°C에서 TFA (2 mL) 내 벤질 (7-((1-(6-(6,8-디옥소-2,7-디아자스피로[4.5]데칸-2-일)피리딘-2-일)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)카바메이트 (66 mg, 107.36 μmol) 혼합물 및 생성된 반응 혼합물을 40°C에서 13시간 동안 교반 하였다. LCMS로 출발물질이 완전히 소모됨을 확인하였고 원하는 질량의 피크 (77 %)가 검출되었다. 반응 혼합물을 진공 농축하여 황색 오일의 2-(6-(4-((2-아미노-7-아자스피로[3.5]노난-7-일)메틸)피페리딘-1-일)피리딘-2-일)-2,7-디아자스피로[4.5]데칸-6,8-디온 (64 mg, crude, TFA)을 수득하였다. MS(M+H)+ = 481.3
단계 9. 4-((9-시클로펜틸-7,7-디플루오로-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(7-((1-(6-(6,8-디옥소-2,7-디아자스피로[4.5]데칸-2-일)피리딘-2-일)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)-3-메톡시벤즈아미드 (화합물 42)의 합성
DMF (1 mL) 내 4-((9-시클로펜틸-7,7-디플루오로-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-3-메톡시벤조산 (50 mg, 111.75 μmol) 용액에 HATU (46.74 mg, 122.92 μmol) 및 DIPEA (28.89 mg, 223.50 μmol, 38.93 μL)를 첨가하였다. 혼합물을 20°C에서 10분 동안 교반 하고, DMF (1 mL) 내 2-(6-(4-((2-아미노-7-아자스피로[3.5]노난-7-일)메틸)피페리딘-1-일)피리딘-2-일)-2,7-디아자스피로[4.5]데칸-6,8-디온 (64 mg, 107.62 μmol, TFA) 용액 및 DIPEA (43.33 mg, 335.24 μmol, 58.39 μL)를 첨가 하고 생성된 혼합물을 20°C에서 1시간 동안 교반 하였다. LCMS로 모든 출발물질이 소모됨을 확인하였고 원하는 질량의 피크 (28 %)가 검출되었다. 반응 혼합물을 H2O (10 mL)로 희석 후 EtOAc (10 mL x 3)으로 추출하였다. 유기상을 염수 (10 mL x 3)로 세척 후 Na2SO4로 건조, 여과 및 농축했다. 잔여물을 prep-TLC (SiO2, DCM: MeOH = 10:1)로 정제 후 동결 건조하여 밝은 황색 고체의 4-((9-시클로펜틸-7,7-디플루오로-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(7-((1-(6-(6,8-디옥소-2,7-디아자스피로[4.5]데칸-2-일)피리딘-2-일)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)-3-메톡시벤즈아미드 (16.1 mg, 15.92 μmol, 14.25% 수율, 90% 순도)를 수득하였다. MS(M+H)+ = 910.2
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ = 10.73 (s, 1H), 8.43 (br d, J = 7.1 Hz, 1H), 8.31 - 8.21 (m, 2H), 7.96 (s, 1H), 7.53 - 7.44 (m, 2H), 7.23 (t, J = 8.1 Hz, 1H), 5.97 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 5.68 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 4.83 - 4.71 (m, 1H), 4.46 - 4.32 (m, 1H), 4.28 - 4.15 (m, 2H), 4.04 (br t, J = 14.1 Hz, 2H), 3.94 (s, 3H), 3.72 (br d, J = 10.9 Hz, 1H), 3.52 - 3.41 (m, 3H), 3.31 (br s, 3H), 2.66 - 2.56 (m, 4H), 2.31 - 2.27 (m, 2H), 2.21 (br dd, J = 4.5, 6.4 Hz, 2H), 2.18 - 2.12 (m, 2H), 2.09 (br d, J = 5.5 Hz, 2H), 2.04 - 1.98 (m, 2H), 1.97 - 1.90 (m, 3H), 1.81 (br t, J = 10.0 Hz, 2H), 1.73 - 1.68 (m, 4H), 1.63 - 1.52 (m, 8H), 1.30 - 1.19 (m, 2H), 1.11 - 0.96 (m, 2H).
실시예 43. 4-((9-시클로펜틸-7,7-디플루오로-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(7-((1-(6-(6,8-디옥소-2,7-디아자스피로[4.5]데칸-2-일)피리딘-3-일)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)-3-메톡시벤즈아미드 (화합물 43)의 합성
MS(M+H)+=911.1, 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ = 10.72 (s, 1H), 8.46 (br d, J = 7.6 Hz, 1H), 8.29 - 8.24 (m, 2H), 7.96 (s, 1H), 7.78 (d, J = 2.9 Hz, 1H), 7.52 - 7.46 (m, 2H), 7.27 (dd, J = 2.7, 9.2 Hz, 1H), 6.40 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 4.83 - 4.71 (m, 1H), 4.46 - 4.32 (m, 1H), 4.04 (t, J = 14.0 Hz, 2H), 3.94 (s, 3H), 3.71 (d, J = 10.6 Hz, 1H), 3.51 - 3.38 (m, 5H), 3.31 (s, 3H), 2.61 - 2.57 (m, 2H), 2.29 - 2.18 (m, 3H), 2.17 (br s, 1H), 2.15 (br d, J = 1.4 Hz, 1H), 2.12 (br d, J = 5.5 Hz, 2H), 2.05 - 1.98 (m, 3H), 1.96 - 1.90 (m, 3H), 1.85 - 1.79 (m, 2H), 1.78 - 1.69 (m, 4H), 1.62 - 1.54 (m, 8H), 1.28 - 1.17 (m, 6H).
실시예 44. 4-((7,7-디플루오로-9-이소프로필-5-메틸-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로-5H-피리미도[4,5-b][1,4]디아제핀-2-일)아미노)-N-(7-((1-(1-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-3-메틸-2-옥소-2,3-디히드로-1H-벤조[d]이미다졸-5-일)피페리딘-4-일)메틸)-7-아자스피로[3.5]노난-2-일)-3-메톡시벤즈아미드 (화합물 44)의 합성
MS(M+H)+=899.0, 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ = 11.06 (s, 1H), 8.52 - 8.39 (m, 1H), 8.34 - 8.27 (m, 1H), 8.22 (s, 1H), 7.89 (s, 1H), 7.54 - 7.46 (m, 2H), 6.96 - 6.91 (m, 1H), 6.86 - 6.78 (m, 1H), 6.69 - 6.58 (m, 1H), 5.34 - 5.25 (m, 1H), 4.93 - 4.82 (m, 1H), 4.49 - 4.35 (m, 1H), 4.10 - 3.99 (m, 2H), 3.94 (s, 3H), 3.69 - 3.54 (m, 2H), 3.31 - 3.28 (m, 6H), 3.09 - 2.83 (m, 3H), 2.72 - 2.57 (m, 4H), 2.22 - 2.09 (m, 3H), 2.03 - 1.95 (m, 2H), 1.86 - 1.76 (m, 4H), 1.65 - 1.52 (m, 2H), 1.41 - 1.13 (m, 13H).
<실험예>
1. PLK1 웨스턴 블롯 분석
(1) HeLa 세포주의 배양
HeLa 세포주를 한국세포주은행에서 구입하였다. 배양 세포의 계대(Passage)를 P115 내지 P125로 유지하였다.
세포 계수를 위해, Thermo사의 세포 계수기(Thermo Fisher Scientific Inc., Catalog # AMQAX1000) 및 0.4% 트립판 블루(Trypan blue) 용액을 사용하였다.
세포 배양을 위해, DMEM(Gibco, Cat. No. 1195-65; Lot. No. 2085318), FBS(Gibco, Cat. No. 16000-044; Lot. No. 2097593), 페니실린/스트렙토마이신(PS)(Gibco, Cat. No. 15140-122; Lot. No. 2058855), 100　㎟　세포배양 디쉬(SPL, Cat. No. 20100), 150　㎟　세포배양 디쉬(SPL, Cat. No. 20150), 12-웰 배양 플레이트(SPL, Cat. No. 30012), PBS pH7.4(Gibco, Cat. No. 10010-023; Lot. No. 2085080), TrypLETM　Express(Gibco, Cat. No. 12605-010; Lot. No. 2070638), 카운팅 챔버(Hematocytometer)(Hirschmann, Cat. No. 8100204), 및 0.4% 트립판 블루 용액(DYNEBIO, Cat. No. CBT3710; Lot. No. 20190723)를 사용하였다.
(2) 본 발명의 화합물 처리
12-웰 플레이트(SPL사)의 각 웰마다 2Х105개의 세포를 시딩하였고, 배양 배지 부피를 총 2 mL로 하여 세포를 배양하였다.
실시예 화합물은 DMSO에 완전 용해시켜 실험에 사용하였고, 티미딘(thymidine)은 DW에 완전 용해시켜 실험에 사용하였다. 티미딘 블록을 위해, 티미딘(Sigma-Aldrich Cat. No. T9250-5G) 2 mM 처리 후 24 시간 동안 인큐베이션하였다.
방출(release) 및 화학적 처리를 위해, 배지를 석션한 후 1× PBS로 3 회 세척하였다. 완전 배지(complete media)를 넣고 CO2 인큐베이터에서 4 시간 인큐베이션하였다. 각각의 화합물을 최고 농도 3 uM에서 3 fold 희석하여 최저 농도 10 point 처리한 후 다시 6 시간 인큐베이션하였다.
(3) 웨스턴 블롯팅
SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅을 위해, 1X RIPA 용해 버퍼(Rockland, Cat. No. MB-030-0050; Lot no. 39751), 100X 프로테아제 억제제 칵테일(Quartett, Cat. No. PPI1015; Lot no. PCO50038424), Pierce™ BCA protein assay kit(ThermoScientific, Cat. No. 23225; Lot no. UC276876), 알부민 standard(ThermoScientific, Cat. No. 23209; Lot no. UB269561), 4-15 % Mini-PROTEAN TGX stain-free gel(Bio-rad, Cat. No. 4568085; Lot no. L007041B), 10X Tris/Glycine/SDS buffer(Bio-rad, Cat. No. 1610732; Lot no. 10000044375B); 10X TBS(Bio-rad, Cat. No. 1706435; Lot no. 1000045140B), 10% Tween 20 용액(Cat. No. 1610781; Lot no. L004152B), Color protein standard broad range(NEB, Cat. No. P7719S; Lot no. 10040349), 4X　Laemmli　sample buffer(Bio-rad, Cat. No. 1610747; Lot no. L004133B), β-머캡토에탄올(Sigma-Aldrich, Cat. No. M3148; Lot no. 60-24-2), SuperBlock™ T20 (TBS) blocking buffer(ThermoScientific, Cat. No. 37536; Lot no. UC282578), 1M 소듐 아자이드 용액(Sigma-Aldrich, Cat. No. 08591-1mL-F; Lot no. BCBV4989), α-Rabbit pAb to Ms IgG(abcam, Cat. No. ab97046; Lot no. GR3252115-1), α-Goat pAb to Rb IgG(CST, Cat. No. 7074S; Lot no. 28), α-GAPDH(abcam, Cat. No. ab8245; Lot no. GR3275542-2), α-Plk1(CST, Cat. No. 208G4), α-BRD4(CST, Cat. No. 13440S), ECL™ Prime western blotting reagents(GE Healthcare, Cat. No. RPN2232; Lot no. 17001655), Ponceau S 용액(Sigma-Aldrich, Cat. No. P7170; Lot no. SLBV4112), Difco™ Skim milk(BD, Cat. No. 232100; Lot no. 8346795), iBlot®　2 NC Regular stacks(Invitrogen, Cat. No. IB23001; Lot no. 2NR110619-02)을 사용하였다.
세포 수확을 위해, 트립신을 사용하여 세포를 플레이트에서 분리한 뒤 배지 및 PBS로 세척하였다. 구체적으로, 배지를 석션한 뒤 1 mL PBS로 세척하고, PBS를 석션하였다. 0.5 mL TrypLE™ Express를 37　℃,　7 분 동안 처리하여 세포를 분리시킨 다음, 0.5 mL 완전 배지를 첨가하여 1 mL의 세포 배양액을 수집하였다. 그 다음, 1 mL의 세포 수집액을 8,000 rpm에서 120 초 동안 원심분리하고, 상층액을 제거하였다. 0.2 mL의 PBS로 세척한 후, PBS를 제거하였다.
세포 용해(lysis)를 위해, 용해 버퍼(lysis buffer)를 첨가하고 세포 파쇄물(debris)을 제거하여 세포 용해물(lysate)을 얻었다. 구체적으로, 세포에 프로테아제 억제제가 함유된 70 μL의 1X RIPA 버퍼를 처리하고 얼음 위에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 세포를 4 ℃ 15,000 rpm에서 10 분 동안 원심분리하여 세포 용해물을 얻었다.
그 다음, BCA 어세이를 이용하여 표준 커브를 구하고 이를 대입하여 용해물 내 단백질 질량을 정량하였다. 혼합물에는 20 μL의 표준 또는 샘플 용액, 200 μL의 BCA 또는 브래드포드 용액을 사용하여 37 ℃에서 30 분 동안 인큐베이션하였고, 562 nm 흡광도에서 측정하였다. 샘플은 각 웰당 15μg이 되도록 4X 샘플 버퍼를 넣어 준비하였다.
4-15 % Mini-PROTEAN TGX stain-free gel (15　wULM)에 120 V로 100 분의 러닝 타임을 설정하여 SDS-PAGE를 수행하였다. iBlot®　2 NC　Mini stacks에 Dry blotting system의 P0 mode를 사용하여 트랜스퍼하였다. Ponceau S 용액을 사용하여 염색한 뒤, 블로킹 버퍼(Thermo)로 1 시간 동안 블로킹하였다. 0.05% Tween20를 포함한 1X TBS로 세척한 후, 1차 항체로서 1X TBS-T 내 항-Plk1(CST) 항체(1:500), 항-BRD4 (CULM signaling) 항체 (1:1000) 또는 항-GAPDH(abcam) 항체(1:10,000)와 함께 4 ℃에서 16 시간 동안 반응시켰다. 0.05% Tween20를 포함한 1X TBS로 10 분 동안 3회 세척한 후, 2차 항체로서 1X TBS-T 내 항-마우스 항체(abcam)(1:10,000) 또는 항-래빗 항체(CST)(1:5,000)와 함께 상온에서 1 시간 동안 반응시켰다. 그 다음, 0.05% Tween 20을 포함한 1X TBS로 10 분 동안 3회 세척한 후, ECL 워킹 용액(1:1)으로 검출하였다.
결과 분석을 위해, 이미지 애널라이저(GE)를 사용하여 최종 블롯 데이터를 얻었다. 그 결과, 본 발명의 모든 화합물이 우수한 PLK1 단백질 분해능을 갖는 것을 확인하였다.
2. PLK1 루시퍼라제 분석
(1) HeLa LgBit (Plk1-HiBit KI) 세포주의 제작 및 배양
HeLa 세포주에 LgBit 벡터를 형질주입하여 안정적으로 발현시킨 세포주를 제작하였다. 그 다음, 세포 내 내재하고 있는 Plk1 유전자 C-말단 뒤에 HiBit 아미노산 서열을 발현할 수 있도록 gRNA와 donor를 제작한 후 CRISPR/Cas9을 발현할 수 있는 벡터와 함께 세포 내 삽입하였다. 삽입이 완료되어 Knock-in이 진행된 세포만을 선별한 뒤 계대하여 사용하였다.
세포 배양을 위해, DMEM (Gibco, Cat. No. 11995-065; Lot. No. 2467189), FBS (Gibco, Cat. No. 16000-044; Lot. No. 2420173P), 페니실린/스트렙토마이신 (PS)(Gibco, Cat. No. 15140-122; Lot. No. 2321114), 100　㎟　세포배양 디쉬 (SPL, Cat. No. 20100), 150　㎟　세포배양 디쉬 (SPL, Cat. No. 20150), 96-웰 화이트 플레이트 (SPL, Cat. No. 30196), PBS pH 7.4 (Gibco, Cat. No. 10010-023; Lot. No. 2085080), TrypLETM　Express (Gibco, Cat. No. 12605-010; Lot. No. 2323417), 카운팅 챔버 (Hematocytometer)(Marienfeld Superior, Cat. No. 0650010) 및 0.4 % 트립판 블루 용액(DYNEBIO, Cat. No. CBT3710; Lot. No. 20211201)을 사용하였다.
(2) 본 발명의 화합물 처리 및 루시퍼라제 분석 실험법
실시예 화합물은 DMSO (Sigma-Aldrich Cat. No. D2438, Lot. No. RNBJ9566)에 완전 용해시켜 실험에 사용하였다.
HeLa LgBit (Plk1-HiBit KI)의 경우 티미딘 블록 후 방출한 후 화합물을 처리하였고 그 과정은 아래와 같다. 티미딘 (Sigma-Aldrich Cat. No. T9250-5G)은 DW에 완전 용해시켜 실험에 사용하였다. 티미딘 블록을 위해, 티미딘 2 mM 처리 후 24 시간 동안 인큐베이션하였다. 방출 및 화학적 처리를 위해, 배지를 석션한 후 1× PBS로 세척하였다. TrypLETM을 넣고 37 ℃ CO2 인큐베이터에서 5 분 동안 인큐베이션 하였다. 완전 배지를 넣어 중화된 세포를 계수기를 통해 카운팅 하였다. 96-웰 화이트 플레이트 (SPL사)의 각 웰마다 3.3 x 104 개 만큼 배지 총 부피는 150 μL로 하여 시딩 후 CO2 인큐베이터에서 인큐베이션 하였다.
각각의 세포주를 CO2 인큐베이터에서 18 시간 동안 인큐베이션 한 뒤 Endurazine을 총 부피의 4 %가 될 수 있도록 각 웰에 첨가하였다. 본 발명의 화합물의 농도가 300 nM이 되도록 96-웰 화이트 플레이트 (SPL사)에 넣어준 뒤 플레이트 리더기 (BMG Labtech, CLARIOstar Plus)의 파장을 470 - 480 nM로 설정 후 흡광도를 실시간으로 측정하였다. 9 시간이 지난 시점에 발광값을 구한 뒤 엑셀 프로그램을 통해 막대 그래프로 표시하였다.
결과는 하기 표 2, 도 1과 같다.
실시예 화합물 활성도
화합물 1 ++
화합물 4 +
화합물 6 ++
화합물 7 +
화합물 9 ++
화합물 10 ++
화합물 11 ++
화합물 13 +++
화합물 14 ++
화합물 15 ++
화합물 16 +++
화합물 17 ++
화합물 18 +
화합물 19 +
화합물 20 ++
화합물 21 ++
화합물 22 +++
화합물 23 +++
화합물 24 +++
화합물 25 +++
화합물 26 +++
화합물 27 +++
화합물 28 ++
화합물 29 ++
화합물 30 +++
화합물 31 ++
화합물 32 ++
화합물 33 ++
화합물 34 +++
화합물 35 +++
화합물 36 +++
화합물 37 ++
화합물 38 ++
화합물 40 ++
화합물 41 +
표 2에서, 활성도는 각 실시예 화합물 처리군과 DMSO 처리군의 형광값 비율에 따라 표기하였다. (+++: < 0.3, ++ < 0.6, + < 0.7).
3. H526 세포주에서의 세포 생존능 분석
(1) NCI-H526 세포주 배양
NCI-H526 (이하, H526) 세포주는 한국세포주은행에서 분양 받았다. 세포 배양을 위해 RPMI 1640 (Gibco, Cat. No. 22400-089; Lot. No. 2277021), FBS (Gibco, Cat. No. 16000-044; Lot. No. 2351176P), 페니실린/스트렙토마이신 (PS)(Gibco, Cat. No. 15140-122; Lot. No. 2321114), 75T 세포배양 플라스크 (SPL, Cat. No. 71075), 175T 세포배양 플라스크 (SPL, Cat. No. 71175), 96-웰 세포배양 플레이트 (SPL, Cat. No. 30096), PBS pH 7.4 (Gibco, Cat. No. 10010-023; Lot. No. 2085080), TrypLETM　Express (Gibco, Cat. No. 12605-010; Lot. No. 2323417), 카운팅 챔버 (Hematocytometer)(Marienfeld Superior, Cat. No. 0650010), 및 0.4 % 트립판 블루 용액 (DYNEBIO, Cat. No. CBT3710; Lot. No. 20211201)을 사용하였다.
(2) 본 발명의 화합물 처리 및 세포 생존능 분석 실험법
실시예 화합물은 DMSO (Sigma-Aldrich Cat. No. D2438, Lot. No. RNBJ9566)에 완전 용해시켜 실험에 사용하였다.
H526 세포주를 96-웰 세포배양 플레이트에 각 웰 당 3 X 104 개가 되도록 시딩하였으며, 각 웰의 배지 부피는 150 μL가 되도록 맞추었다.
본 발명의 화합물의 세포 내 처리 용량은 최대 농도 3000 nM이 되도록 하고, 이를 1/3 씩 희석하여 농도 별로 처리하였으며, 최저 농도는 0.46 nM이 되도록 하였다. 각 웰 마다 전체 용액의 부피가 200 μL가 되도록 화합물을 처리한 후 5 일 동안 CO2 인큐베이터 (Thermo Fisher Science, Cat. No. 4111)에서 배양 하였다.
이후 각 웰에 EZ-Cytox (DOGEN, Cat.NO. EZ-3000, Lot. No. DLS2109)를 20 μL씩 처리 후 CO2 인큐베이터에서 4 시간 배양 하였다. 플레이트 리더기 (BMG Labtech, CLARIOstar Plus)의 파장을 450 nM로 설정하여 배양이 종료된 샘플의 흡광도를 측정하였으며, 측정 전 플레이트 리더기 내에서 3 분간 교반한 후 측정하였다. 최종 측정값은 엑셀 파일로 정리 후 Prism-GraphPad 프로그램을 통해 그래프를 표시하고, IC50 값을 측정하였다.
결과는 하기 표 3과 같다.
H526 세포주에서의 세포 생존능 분석
실시예 화합물 활성도
화합물 1 B
화합물 6 B
화합물 9 B
화합물 10 A
화합물 11 A
화합물 13 A
화합물 14 A
화합물 15 B
화합물 16 A
화합물 17 B
화합물 18 A
화합물 19 B
화합물 20 B
화합물 21 C
화합물 22 A
화합물 23 A
화합물 24 A
화합물 25 A
화합물 26 B
화합물 27 A
화합물 28 A
화합물 29 B
화합물 30 A
화합물 31 C
화합물 32 B
화합물 33 B
화합물 34 A
화합물 35 B
화합물 36 A
화합물 37 B
화합물 38 A
화합물 40 A
표 3에서, 활성도는 H526 세포주에 각 실시예 화합물을 처리한 군의 IC50 값에 따라 표기하였다 (A: < 30 nM, B: < 50 nM, C: < 100 nM, D: < 200 nM, E: < 400 nM).
4. MRC-5 세포주에서의 세포 생존능 분석
(1) MRC-5 세포주의 배양
MRC-5 세포주를 한국세포주은행(KCLB, 서울, 한국)에서 구입하였다. 배양 세포의 계대(Passage)를 P15 내로 유지하였다.
세포 배양을 위해, MEM/EBSS(Hyclone, Cat. No. SH30024.01; Lot. No. AG29697698), FBS(Gibco, Cat. No. 16000-044; Lot. No. 2234018P), 페니실린/스트렙토마이신(PS)(Gibco, Cat. No. 15140-122; Lot. No. 2211099), 175T　세포배양 플라스크(SPL, Cat. No. 71175), 96-웰 배양 플레이트(SPL, Cat. No. 30096), PBS pH7.4(Gibco, Cat. No. 10010-023; Lot. No. 2085080), TrypLETM　Express(Gibco, Cat. No. 12605-010; Lot. No. 2070638), 카운팅 챔버 (Hematocytometer)(Hirschmann, Cat. No. 8100204), 및 0.4 % 트립판 블루 용액(DYNEBIO, Cat. No. CBT3710; Lot. No. 20190723)을 사용하였다.
(2) 본 발명의 화합물 처리
175T 세포배양 플라스크에서 배양 중인 MRC-5 세포주를 TrypLETM Express을 이용하여 플라스크로부터 세포를 분리하였다. 96-웰 플레이트(SPL사)의 각 웰마다 6Х103 개의 세포를 시딩하였고, 배양 배지 부피를 총 150 μL로 하여 세포를 배양하였다.
실시예 화합물은 DMSO(Sigma-Aldrich, Cat. No. D2438-50ML, Lot. No. RNBK6387)에 완전 용해시켜 실험에 사용하였고, 10 μM를 최고농도로 하여 1/3씩 연속적으로 희석하여 최저 농도가 1.52nM이 되도록 계산하여 처리 하였다. 각 웰에는 배지와 함께 혼합하여 처리하였으며, 부피는 50 μL가 되도록 하여 각 웰의 총 부피는 200 μL가 되도록 하였다. 이 후, 37℃ CO2 인큐베이터(Thermo Fisher Science, Cat. No. 4111, Lot. No. 300512709)에서 5일간 배양 하였다.
하기의 화합물들은 비교예로서 사용되었으며, 실시예 화합물과 동일한 방법으로 세포 생존능 분석을 수행하였다.
비교예 1. Mu et al. BBRC, 2020, 521(4): 833 문헌에 기재된 예시화합물 (비교화합물 1)
비교예 2. BI2536 (비교화합물 2)
비교예 3. 볼라설팁 (비교화합물 3)
비교예 4. TAK960 (비교화합물 4)
(3) 세포독성 실험
배양이 끝난 플레이트의 각 웰에 Easy-cytox(DOGEN, Cat. No. EZ-3000, Lot. No. DLS2012) 용액을 20 μL씩 처리 후 4시간 동안 37도씨 CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 96-웰 플레이트를 플레이트 리더기(BMG Labtech, Clariostar Plus)에 넣고 2분간 혼합 후, 450nM 파장에서 흡광도를 측정하였다. 데이터는 Prism (ver.9) 프로그램을 이용하여 그래프로 변환하였다.
결과는 하기의 표 4 및 표 5와 같다.
MRC-5 세포주에서의 세포 생존능 분석
실시예 화합물 활성도
화합물 1 N.D.
화합물 6 N.D.
화합물 9 N.D.
화합물 10 N.D.
화합물 11 N.D.
화합물 13 N.D.
화합물 14 N.D.
화합물 15 N.D.
화합물 16 N.D.
화합물 17 N.D.
화합물 18 N.D.
화합물 19 N.D.
화합물 20 N.D.
화합물 21 N.D.
화합물 22 N.D.
화합물 23 N.D.
화합물 24 23219
화합물 25 9241
화합물 26 6553
화합물 28 10213
화합물 29 18491
화합물 30 7869
화합물 32 N.D.
화합물 33 25034
화합물 34 N.D.
화합물 35 16877
화합물 36 9802
화합물 37 N.D.
화합물 38 3963
표 4에서, 활성도는 MRC-5 세포주에 각 실시예 화합물을 처리한 군의 IC50 값 (nM)에 따라 표기하였다. N.D. (not determined)는 10 μM 까지 세포독성이 나타나지 않았음을 의미한다. 그 결과, 본 발명의 모든 화합물이 정상 세포주보다 암 세포주에서 높은 수준의 세포독성을 특이적으로 나타냄을 확인하였다.
MRC-5 세포주에서의 세포 생존능 분석
비교화합물 활성도
비교화합물 1 106.6
비교화합물 2 3085.4
비교화합물 3 2939.3
비교화합물 4 9152.5
표 5에서, 활성도는 MRC-5 세포주에 각 실시예 화합물을 처리한 군의 IC50 값 (nM)에 따라 표기하였다. 특히 공지의 PROTAC 화합물인 비교화합물 1은 본 발명의 실시예 화합물과 달리 정상 세포주에서 높은 수준의 세포독성을 나타내었다.

Claims (17)

  1. 하기 화학식 I로 표시되는 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염:
    [화학식 I]

    상기 화학식 I에서,
    ULM은 하기 화학식 1로 표시되는 모이어티이고;
    [화학식 1]

    PTM은 하기 화학식 2로 표시되는 모이어티이고;
    [화학식 2]

    Linker는 ULM과 PTM을 화학적으로 연결하는 기이고;
    Rx는 -H 또는 -C1-4알킬이고;
    V는 -NH-C(=O)-, -(CH2)v-NH-, -(CH2)v-N-C1-4알킬-, -O-, -C(=O)-, 또는 -C(=NH)-이고 {여기서, 상기 V 중 -(CH2)v-NH-의 N 원자는 상기 Rx와 연결되어 5-6원 고리를 형성할 수 있고, 상기 v는 0, 1, 2, 3, 또는 4임};
    고리 U는 페닐, 피리디닐, 또는 피리미디닐이고 {여기서, 상기 페닐, 피리디닐, 또는 피리미디닐 고리의 하나 이상의 H는 RU로 치환될 수 있음};
    RU는 -C1-4알킬, -C1-4하이드록시알킬, -C1-4아미노알킬, -C1-4할로알킬, -C1-4알콕시, -NH2, -OH, 또는 -할로이고 {여기서, 상기 RU는 상기 V 중 -(CH2)v-NH-의 N 원자와 연결되어 5-6원 고리를 형성할 수 있고 [이때, 상기 5-6원 고리의 하나 이상의 H는 -C1-4알킬 또는 =O로 치환될 수 있음], 상기 RU는 상기 V 중 -C(=NH)-의 N 원자와 연결되어 5-6원 고리를 형성할 수 있음 [이때, 상기 5-6원 고리의 하나 이상의 H는 -C1-4알킬로 치환될 수 있음]};
    Y는 CR7이고;
    R1은 -C1-4알킬 또는 3-7원 사이클로알킬이고;
    R2는 -H이고;
    R3 및 R4는 각각 독립적으로 -H, -C1-4알킬, 또는 -할로이고;
    R5는 -C1-4알킬이고;
    R6는 -C1-4알킬 또는 -C1-4알콕시이고;
    R7은 -H 또는 -할로이고;
    Linker는 -LU-L1-L2-L3-LP-이고;
    LU는 -(CH2)x-, -(CH2)x-NH-, -(CH2)x-O-, -C(=O)-, 페닐, 또는 아무 것도 아니고(null) {여기서, LU는 ULM과 연결되고 [이때, 상기 LU가 아무 것도 아닌 경우(null) L1이 ULM과 직접 연결됨], 상기 x는 0, 1, 2, 3, 또는 4임};
    L1은 헤테로사이클로알킬 또는 아무 것도 아니고(null) {여기서, 상기 L1이 아무 것도 아닌 경우(null) LU와 L2가 직접 연결되고, 상기 헤테로사이클로알킬은 고리 내 하나 이상의 N 원자를 포함하고, 상기 헤테로사이클로알킬 고리의 하나 이상의 H는 -C1-4알킬, -C1-4할로알킬, -C1-4알콕시, -OH, -할로, 또는 =O로 치환될 수 있음};
    L2는 -(CH2)y1-, -(CD2)y1-, -(CH2)y2-C(=O)-(CH2)y3-, -(CH2)y2-NH-(CH2)y3-, 또는 -(CH2)y2-N(C1-4알킬)-(CH2)y3-이고 {여기서, 상기 y1 내지 y3는 각각 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6임};
    L3는 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 또는 아무 것도 아니고(null) {여기서, 상기 L3가 아무 것도 아닌 경우(null) L2와 Lp가 직접 연결되고, 상기 헤테로사이클로알킬은 고리 내 하나 이상의 N 원자를 포함하고, 상기 사이클로알킬 또는 헤테로사이클로알킬 고리의 하나 이상의 H는 -C1-4알킬, -C1-4할로알킬, 또는 -할로로 치환될 수 있음};
    LP는 -(CH2)p-NH-C(=O)- 또는 -(CH2)p-O-이다 {여기서, 상기 LP의 -(C=O)- 또는 -O-가 PTM과 연결되고, p는 0, 1, 또는 2임}.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 ULM은 하기 화학식 1-1 또는 화학식 1-2로 표시되는 모이어티이고;
    [화학식 1-1]

    [화학식 1-2]

    Rx는 -H 또는 -C1-4알킬이고;
    V는 -NH-C(=O)-, -(CH2)v-NH-, -(CH2)v-N-C1-4알킬-, -O-, 또는 -C(=NH)-이고 {여기서, 상기 V 중 -(CH2)v-NH-의 N 원자는 상기 Rx와 연결되어 5-6원 고리를 형성할 수 있고, 상기 v는 0, 1, 또는 2임};
    U1 내지 U5는 각각 독립적으로 CRU 또는 N이고 {여기서, 상기 U1의 RU는 상기 V 중 -(CH2)v-NH-의 N 원자와 연결되어 5-6원 고리를 형성할 수 있고 [이때, 상기 5-6원 고리의 하나 이상의 H는 -C1-4알킬 또는 =O로 치환될 수 있음], 상기 U1의 RU는 상기 V 중 -C(=NH)-의 N 원자와 연결되어 5-6원 고리를 형성할 수 있음 [이때, 상기 5-6원 고리의 하나 이상의 H는 -C1-4알킬로 치환될 수 있음]};
    RU는 -C1-4알킬, -C1-4할로알킬, -NH2, 또는 -할로인;
    화합물, 이의 입체이성질체 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염.
  3. 제 1 항에 있어서,
    ULM은 , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , 또는 이고;
    RU1 및 RU2는 각각 독립적으로 -C1-4알킬, -C1-4할로알킬, 또는 -할로인;
    화합물, 이의 입체이성질체 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염.
  4. 제 3 항에 있어서,
    ULM은 , , , , , , , , , , , , , 또는 이고;
    RU1 및 RU2는 각각 독립적으로 -C1-4할로알킬 또는 -할로인;
    화합물, 이의 입체이성질체 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 PTM은 또는이고;
    R6는 -C1-4알콕시이고;
    R7은 -H 또는 -할로인;
    화합물, 이의 입체이성질체 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염.
  6. 삭제
  7. 제 1 항에 있어서,
    LU는 -(CH2)x- 또는 -(CH2)x-NH-이고 {여기서, LU는 ULM과 연결되고, 상기 x는 0 또는 1임};
    L1은 4-12원 헤테로사이클로알킬 또는 아무 것도 아니고(null) {여기서, 상기 L1이 아무 것도 아닌 경우(null) LU와 L2가 직접 연결되고, 상기 4-12원 헤테로사이클로알킬은 단일 고리, 다리 연결된(bridged) 이중 고리, 또는 스파이로(spiro) 고리이고, 상기 4-12원 헤테로사이클로알킬은 고리 내 하나 이상의 N 원자를 포함하고 상기 N 원자는 LU 또는 ULM과 직접 연결되고, 상기 4-12원 헤테로사이클로알킬 고리의 하나 이상의 H는 -C1-4알킬, -OH, 또는 -할로로 치환될 수 있음};
    L2는 -(CH2)y1-, -(CH2)y2-C(=O)-(CH2)y3-, -(CH2)y2-NH-(CH2)y3-, 또는 -(CH2)y2-N(C1-4알킬)-(CH2)y3-이고 {여기서, 상기 y1 내지 y3는 각각 독립적으로 0, 1, 2, 또는 3임};
    L3는 4-6원 사이클로알킬 또는 4-12원 헤테로사이클로알킬 {여기서, 상기 4-12원 헤테로사이클로알킬은 단일 고리, 다리 연결된(bridged) 이중 고리, 또는 스파이로(spiro) 고리이고, 상기 4-12원 헤테로사이클로알킬은 고리 내 하나 이상의 N 원자를 포함하고, 상기 4-6원 사이클로알킬 또는 4-12원 헤테로사이클로알킬 고리의 하나 이상의 H는 -C1-4알킬, -C1-4할로알킬, 또는 -할로로 치환될 수 있음};
    LP는 -(CH2)p-NH-C(=O)-인 {여기서, 상기 LP의 -(C=O)-가 PTM과 연결되고, p는 0 또는 1임};
    화합물, 이의 입체이성질체 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염.
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 화학식 I로 표시되는 화합물이 하기 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염:








    .
  9. 삭제
  10. 제 1 항 내지 제 5 항, 제 7 항 및 제 8 항 중 어느 하나의 항에 따른 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 PLK1 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서,
    상기 PLK1 관련 질환은 암, 양성 종양 및 신경질환으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상인, 약학적 조성물.
  11. 삭제
  12. 제 10 항에 있어서,
    상기 암 또는 양성 종양은 편평상피세포암, 소세포폐암, 비소세포폐암, 폐의 선암, 폐의 편평상피암, 복막암, 피부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 직장암, 항문부근암, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 간세포암, 위장암, 위암, 췌장암, 교아종, 경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간종양, 유방암, 결장암, 대장암, 자궁내막 또는 자궁암, 침샘암, 신장암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 두경부암, 뇌암, 골육종, 배럿 식도, 대장 선종 및 용종, 유방 섬유선종 및 낭종, 단세포 감마글로불린병증 (MGUS), 단클론 림프구증가증, 고형암, 혈액암, 골암, 거대세포 림프종, 부신피질 종양, T-세포성 림프종/백혈병, 신경내분비암, 신경내분비종양, 담관암, 신경모세포종, 교모세포종 및 신경교종으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상인, 약학적 조성물.
  13. 제 10 항에 있어서,
    상기 신경질환은 중추 신경계 질환, 퇴행성　신경질환, 알츠하이머병, 파킨슨병, 다발성경화증, 헌팅톤병, 노인성 치매, 간질, 루게릭, 및 뇌졸증으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상인, 약학적 조성물.
  14. 삭제
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  17. 삭제
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