KR102600361B1 - Prmt1 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는 혈관 질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 PRMT1 (Protein arginine methyltransferase 1) 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 이용하여 혈관 평활근 세포의 이상 증식과 같은 원인에 의해 유발되는 혈관 질환의 예방, 개선 및 치료용 조성물 및 치료 물질의 스크리닝 방법에 대한 것이다. 혈관 평활근 세포에서 Prmt1이 결손된 경우, 혈관 평활근 세포의 이상 증식에 의한 혈관 질환이 유발될 수 있으므로, 상기 PRMT1 단백질의 주입 및 Prmt1 유전자의 과발현을 통해 상기 혈관 질환에 대한 치료를 가능하게 할 수 있다.
Description
본 발명은 PRMT1 (Protein arginine methyltransferase 1) 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 이용하여 심부전, 동맥류 및 동맥 경화 등을 포함하는 혈관 질환의 완화 또는 치료용 조성물 및 치료 물질의 스크리닝 방법에 대한 것이다.
혈관 평활근 세포(vascular smooth muscle cell, VSMC)는 혈관벽을 형성하고 지지하는 성분 중의 하나로서, 혈관의 형상과 생리 작용을 유지하는 중요한 역할을 수행 한다(Vinters HV, Berliner JA. The blood vessel wall as an insulin target tissue. Diabete Metab. Jul 1987;13(3Pt 2):294-300). 그러나 혈관 평활근 세포의 증식이 정상적으로 조절되지 않아 과 발현된 경우, 고혈압, 동맥경화, 혈관 협착과 같은 다양한 혈관 질환을 유발할 수 있다. 특히 혈관 이식 또는 스텐트 시술 후 혈관 평활근 세포가 과다 증식 하는 경우 관련질환의 재발 및 심각한 부작용 등의 문제가 발생하고 있어, 이에 따른 근본적인 치료제의 개발이 요구되고 있는 실정이다.
PRMT1(protein arginine N-methyltransferase 1)은 단백질 아르기닌 메틸화 효소의 하나로서, 최근 연구에서, 심장 기능에 대한 PRMT1의 중요성이 입증되었다(Pyun JH, Kim HJ, Jeong MH, Ahn BY, Vuong TA, Lee DI, et al. Cardiac specific PRMT1 ablation causes heart failure through CaMKII dysregulation. Nat Commun. 2018;9:5107). 심근 세포에서 PRMT1이 결실된 경우, 양심실의 확장과 수축 기능 장애가 동반되는 확장성 심근병증(Dilated cardiomyopathy)의 증세를 보이며, 심부전으로 빠르게 진행되는 심근 병증을 일으킬 수 있다는 점이 알려졌으나, 다른 혈관 근육 세포 및 혈관 질환과 관련된 효과에 대해서는 알려진 바가 없다.
이에 본 발명자들은 혈관 질환과 관련하여 PRMT1의 역할을 연구하기 위해 실험을 진행한 결과, 혈관 평활근 세포에서 PRMT1이 넉아웃된 경우, 다양한 혈관 문제를 유발시킬 수 있다는 점을 확인하였으며, 반대로 PRMT1을 과발현한 경우, 관련 증상이 완화될 수 있다는 점에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 PRMT1 단백질 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 유효 성분으로 함유하는, 혈관 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 PRMT1 단백질 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 유효 성분으로 함유하는, 혈관 질환 예방 또는 개선용 식품 또는 건강 기능 식품 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 혈관 평활근 세포에 후보 물질을 처리하는 단계; 상기 후보 물질을 처리한 혈관 평활근 세포에서 PRMT1의 발현 또는 활성을 측정하는 단계; 및 비 처리군과 비교하여, PRMT1의 발현 또는 활성을 증진시키는 물질을 혈관 질환의 치료 물질로 선정하는 단계를 포함하는 혈관 질환 치료 물질의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 PRMT1 단백질 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 유효 성분으로 함유하는, 혈관 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 PRMT1 단백질 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 유효 성분으로 함유하는, 혈관 질환 예방 또는 개선용 식품 또는 건강 기능 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 양태로서, 상기 혈관 질환은 혈관 평활근 세포 이상 증식에 의해 유발되는 혈관 질환이 포함되며, 보다 상세하게는 동맥류, 동맥 경화증 또는 혈관 협착증 중에서 하나 이상 선택되는 질환일 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 혈관 평활근 세포에 후보 물질을 처리하는 단계; 상기 후보 물질을 처리한 혈관 평활근 세포에서 PRMT1의 발현 또는 활성을 측정하는 단계; 비 처리군과 비교하여, PRMT1의 발현 또는 활성을 증진시키는 물질을 혈관 질환의 치료 물질로 선정하는 단계를 포함하는 혈관 질환 치료 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 PRMT1 단백질 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 유효 성분으로 함유하는, 혈관 질환 예방 또는 치료용 조성물에 대한 것이다.
본 발명에서 상기 "혈관 질환(vascular disease)"은 혈관에 발생하는 모든 질환을 포함하는 것으로, 보다 상세하게는 혈관에 존재하는 세포, 특히 혈관 평활근 세포의 과다 증식에 의해 유발되는 질환 또는 병적 상태를 의미한다. 상기 혈관 질환에는 이에 제한되는 것은 아니나, 동맥류, 동맥 경화증 또는 혈관 협착증 등이 포함된다.
본 발명의 PRMT1 (Protein arginine methyltransferase 1)은 히스톤과 비 히스톤의 아르기닌 잔기에 메틸화를 매개하는 효소로서, 인간 세포에서 모든 아르기닌 메틸화의 85% 이상을 차지한다. PRMT1이 결실될 경우, 초기 배아에서 치사를 일으키는 것으로 알려져 있으며, 유전자의 전사, 세포증식, 세포사, DNA 손상, 간 포도당 대사 등 다양한 생물학적 과정과 연관되어 있는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 상기 PRMT1이 혈관 평활근 세포에서 결핍된 경우, 대동맥의 팽창, 수축기 혈압 저하, 대동맥 섬유화 및 대동맥 박리, 대동맥 혈관 장력 약화 등의 증상이 나타남을 확인하였으며, 한편 PRMT1이 과발현된 경우에는 혈관 평활근 세포의 DNA 손상이 회복되는 것을 확인하였다. 상기 결과는 PRMT1 단백질 또는 이를 발현하는 유전자를 처리할 경우, 혈관 평활근 세포의 손상이 완화될 수 있으며, 이를 통해 혈관 평활근 세포의 손상으로 인하여 유발되는 다양한 혈관 질환에 대한 치료 효과를 나타낼 수 있음을 보여주는 것이다.
본 발명에서 상기 PRMT1 단백질 또는 이를 암호화하는 Prmt1 유전자는, 공지된 유전자로서 인간 또는 마우스로부터 유래한 것일 수 있다. 또한, 일 양태로서 상기 Prmt1 유전자는 유전자 단편 또는 전달체에 포함된 핵산 분자의 형태로서 제공될 수 있고, 상기 전달체는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스(AAV)와 같은 바이러스성 벡터, 플라스미드, 리포좀과 같은 비 바이러스성 벡터일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 다른 양태로서 상기 Prmt1 유전자는 세포 내 도입되어, 세포 치료제 형태로 제공될 수 있다.
본 명세서에서 용어 "예방"은 본 발명에 따른 상기 조성물의 투여에 의해 혈관 평활근 세포 손상 및 이로부터 유발되는 혈관 질환을 억제하거나 발병을 지연시킬 수 있는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서에서 용어 "치료"는 본 발명에 따른 상기 조성물의 투여에 의해 혈관 평활근 세포 손상 및 이로부터 유발되는 혈관 질환과 관련한 증세가 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 말한다.
본 발명의 상기 약학적 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 상기 제형화에 필요한 담체 혹은 부형제 등을 추가로 포함할 수 있다. 상기 유효 성분에 추가로 포함될 수 있는 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등이 포함된다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
예를 들어, 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물 또는 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 적어도 면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스 (sucrose) 또는 락토오스 (lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 또는 비경구 투여(정맥주사, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)될 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도 및 약물 형태, 투여 경로 및 시간에 따라 다르며, 당업자에 의해 적절한 형태로 선택될 수 있다.
본 발명의 상기 약학적 조성물은, 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서 "약학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 양으로, 질병을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 그 기준은 환자의 질환, 중증도, 약물 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 병용되는 성분 및 기타 사항에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 상기 약학적 조성물은, 개별 치료제 혹은 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 상기 요소들을 모두 고려하여 부작용을 최소화할 수 있는 수준으로 투여량을 결정할 수 있고, 이는 당업자에 의해 용이한 수준으로 결정될 수 있다. 구체적으로 상기 약학적 조성물의 투여량은 환자의 연령, 체중, 중증도, 성별 등에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로 체중 1kg 당 0.001 내지 150 mg, 보다 바람직하게는 0.01 내지 100mg의 양을 매일 또는 격일, 1일 1 내지 3회 투여할 수 있다. 다만, 이는 예시적인 것으로, 상기 투여량은 필요에 달리 설정할 수 있다.
본 발명은 PRMT1 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는 혈관 질환의 예방 또는 개선용 식품, 특히 건강기능식품에 대한 것이다.
본 명세서에서 용어 "건강기능식품"은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
본 발명의 상기 식품 또는 건강기능식품은, 혈관 평활근 세포의 손상 및 이로부터 유래되는 혈관 질환의 예방 및 개선을 위한 목적으로 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 환제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 등 약학적 투여 형태 또는 티백, 침출자, 음료, 캔디, 젤리, 껌 등의 건강 기능 식품으로 제조 및 가공이 가능하다.
본 발명의 상기 식품 또는 건강기능식품 조성물은, 식품 첨가물로 사용될 수 있으며, 단독으로 혹은 다른 성분과 조합하여 제품화될 수 있다. 또한, 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제 및 증진제, 펙트산 및 이의 염, 알긴산 및 이의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등이 포함될 수 있다. 상기 성분은 단독 혹은 조합하여 사용될 수 있으며, 적절한 함량으로 조합되어 사용할 수 있다.
또한 본 발명은 ⅰ) 혈관 평활근 세포에 후보 물질을 처리하는 단계; ⅱ) 상기 후보 물질을 처리한 혈관 평활근 세포에서 PRMT1의 발현 또는 활성을 측정하는 단계; 및 ⅲ) 비 처리군과 비교하여, PRMT1의 발현 또는 활성을 증진시키는 물질을 혈관 질환의 치료 물질로 선정하는 단계를 포함하는 혈관 질환의 치료 물질의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명에서 상기 PRMT1의 발현 또는 활성을 측정하는 단계는 PRMT1 유전자의 발현에 의해 생성된 RNA 또는 단백질의 양을 측정할 수 있는 다양한 방법을 통해 실시될 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, RNA의 발현량은 RT-PCR(실시간 PCR), 마이크로어레이, 노던 블롯팅 등을 이용하여 확인할 수 있으며, 단백질의 활성 및 발현은 면역침강, 면역염색, 면역블롯, 크로마틴 면역염색, 효소면역분석(ELISA), 웨스턴블롯팅 등의 방법으로 확인할 수 있고, 그 방법에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 PRMT1 (Protein arginine methyltransferase 1) 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 동맥류, 동맥 경화증 및 혈관 협착과 같은 혈관 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 및 이를 이용하여 혈관 질환의 치료 물질을 스크리닝하는 방법에 대한 것으로, PRMT1이 혈관 평활근의 손상 등에 대하여 개선 효과를 가지는 점을 확인함으로써, 이를 이용하여 혈관 질환에 대한 효과적인 치료를 가능하게 할 수 있다.
도 1은 정상 마우스(Prmt1 fl/fl ) 와 혈관 평활근 특이적 Prmt1 결손 마우스 (Prmt1 SMKO )의 혈관을 촬영한 모습이다.
도 2는 Prmt1 fl/fl 와 Prmt1 SMKO 마우스의 대동맥 단편을 초음파로 촬영하여 정량화한 결과이다(n=5 Data represent means ±SD. *P<0.05 , **P<0.01, Student’s t-test).
도 3은 Prmt1 fl/fl 와 Prmt1 SMKO 마우스의 수축기 혈압을 각각 측정하여 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 Prmt1 fl/fl 와 Prmt1 SMKO 마우스의 대동맥을 분리하여 TUNEL assay를 시행한 사진이다.
도 5는 Prmt1 fl/fl 와 Prmt1 SMKO 마우스의 대동맥 단편에 대한 조직학적 관찰을 시행한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 Prmt1 fl/fl 와 Prmt1 SMKO 마우스의 알파-평활근 액틴(alpha smooth muscle actin)을 염색하여 관찰한 결과이다 (Scale bar: 100㎛).
도 7은 Prmt1 fl/fl 와 Prmt1 SMKO 마우스의 혈관 장력 검사를 실시한 결과이다(Data represent means ±SEM. **P<0.01, Student’s t-test).
도 8은 Prmt1 fl/fl 와 Prmt1 SMKO 마우스의 대동맥을 각각 분리하여, Myocardin의 발현을 qrt-PCR로 확인한 결과이다(Data represent means ±SEM. *P<0.05, Student’s t-test).
도 9는 Prmt1 fl/fl 와 Prmt1 SMKO 마우스 대동맥에서 발현되는 유전자 중, Myocardin의 타겟 유전자(Acta2, Myh11, Cnn1, Tagln)의 각각의 발현량을 분석한 결과이다(Data represent means ±SEM. *P<0.05, **P<0.01, Student’s t-test).
도 10은 Myocardin의 프로모터에서의 H4R3 디메틸화를 확인한 결과이다 (Data represent means ±SEM. **P < 0.01, Student’s t-test).
도 11은 대조군과 Prmt1이 과발현된 세포에 각각 안지오텐신Ⅱ에 의한 DNA 손상을 유발한 결과를 도시한 것이다.
도 2는 Prmt1 fl/fl 와 Prmt1 SMKO 마우스의 대동맥 단편을 초음파로 촬영하여 정량화한 결과이다(n=5 Data represent means ±SD. *P<0.05 , **P<0.01, Student’s t-test).
도 3은 Prmt1 fl/fl 와 Prmt1 SMKO 마우스의 수축기 혈압을 각각 측정하여 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 Prmt1 fl/fl 와 Prmt1 SMKO 마우스의 대동맥을 분리하여 TUNEL assay를 시행한 사진이다.
도 5는 Prmt1 fl/fl 와 Prmt1 SMKO 마우스의 대동맥 단편에 대한 조직학적 관찰을 시행한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 Prmt1 fl/fl 와 Prmt1 SMKO 마우스의 알파-평활근 액틴(alpha smooth muscle actin)을 염색하여 관찰한 결과이다 (Scale bar: 100㎛).
도 7은 Prmt1 fl/fl 와 Prmt1 SMKO 마우스의 혈관 장력 검사를 실시한 결과이다(Data represent means ±SEM. **P<0.01, Student’s t-test).
도 8은 Prmt1 fl/fl 와 Prmt1 SMKO 마우스의 대동맥을 각각 분리하여, Myocardin의 발현을 qrt-PCR로 확인한 결과이다(Data represent means ±SEM. *P<0.05, Student’s t-test).
도 9는 Prmt1 fl/fl 와 Prmt1 SMKO 마우스 대동맥에서 발현되는 유전자 중, Myocardin의 타겟 유전자(Acta2, Myh11, Cnn1, Tagln)의 각각의 발현량을 분석한 결과이다(Data represent means ±SEM. *P<0.05, **P<0.01, Student’s t-test).
도 10은 Myocardin의 프로모터에서의 H4R3 디메틸화를 확인한 결과이다 (Data represent means ±SEM. **P < 0.01, Student’s t-test).
도 11은 대조군과 Prmt1이 과발현된 세포에 각각 안지오텐신Ⅱ에 의한 DNA 손상을 유발한 결과를 도시한 것이다.
이하, 본 명세서를 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세히 설명한다. 그러나, 본 명세서에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 명세서의 범위가 아래에서 상술하는 실시예들에 한정되는 것으로 해석되지는 않는다. 본 명세서의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 명세서를 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1. 재료 및 실험 방법
1-1)
실험 모델 제작
혈관 평활근(VSMC)에서 Prmt1의 특정 절제를 위해, Prmt1 fl/fl 마우스를 SM22a(tagln) 프로모터의 전사 제어 하에 타목시펜-유도성 cre 재조합 효소를 발현하는 SM22a-creERT2 마우스와 교배시켰다. VSMC에서 Prmt1 유전자를 제거하기 위해 8-10 주령 생쥐에게 타목시펜을 100mg/kg i.p를 주당 4 일 동안, 2주 주사 한 후 마우스에게 타목시펜이 보충된 식이 (Envigo, TD. 130859)를 자유롭게 급여하였다. 본 연구의 동물 실험은 성균관대 학교 의과 대학 동물 실험 및 사용위원회 (SUSM)의 승인을 받아 SUSUM 윤리위원회의 동물 실험 지침을 준수하였으며 SUSM은 국제 실험 동물 관리 협회 (AAALAC International)의 공인 시설이며 실험실 동물 자원 연구소 (ILAR) 가이드를 준수한다.
1-2)
세포 배양, 형질감염, 감염
A7R5 (ATCC, CRL-1444) 세포는 10% FBS(우태아 혈청) 및 1% 항생제가 보충된 DMEM (Dulbecco 's Modified Eagle Medium)에서 배양되었다. 형질 감염 실험을 위해 배양된 세포는 리포펙타민 2000 (Invitrogen, 11668)을 사용하여 형질 감염되었다. PRMT1의 억제 효과를 분석하기 위해 배양된 RVSMC 또는 A7R5 세포를 20μM의 푸라미딘 (Sigma-Aldrich, A7154)에 24 시간 동안 노출시켰다. PRMT1을 제거하기 위해, 배양된 세포를 앞서 설명한 바와 같이 대조군 shRNA 또는 PRMT1 shRNA를 발현하는 아데노 바이러스로 감염시켰다 (Pyun JH, et al. 심장 특이적 PRMT1 절제는 CaMKII 조절 장애를 통해 심부전을 일으킨다. Nat Commun. 2018; 9 : 5107).
1-3)
단백질 및 RNA 분석
웨스턴 블롯 분석은 공지된 방법에 따라 수행되었다(Vuong TA, et al., A Sonic hedgehog coreceptor, BOC regulates neuronal differentiation and neurite outgrowth via interaction with ABL and JNK activation. 2017; 30: 30-40) 간단히 말해, 배양된 세포 또는 균질화 된 조직 샘플은 RIPA 버퍼(프로테아제 억제제 칵테일 (Roche, 1183617001), pH8.0; 150 mmol/L NaCl; 1mmol/L EDTA; 1% Triton X-100; 10mml / L Tris-HCl)에서 용해되었다.
RNA는 TRizol (Invitrogen, 15596026)을 사용하여 대동맥 조직 샘플 및 배양된 세포에서 추출되었다. cDNA는 제조업체의 지침에 따라 PrimeScript RT 시약 키트 (TaKaRa, RR064A)를 사용하여 증폭되었다. SYBR 프리믹스 EX Taq (TaKaRa, RR420)는 제조업체의 지시에 따라 Thermal Cycler Dice Real Time System (TaKaRa, TP950)에서 유전자 발현을 분석하는 데 사용되었다.
1-4)
조직학 및 면역 형광 분석
대동맥 조직의 조직학적 분석을 위해, PBS 관류 마우스에서 대동맥을 제거하고 4 % PFA로 고정하고, 파라핀에 매립하고, 6μm 두께 절편으로 제작하였다. 슬라이드는 Hematoxylin 및 Eosin (H & E, BBC 생화학), Masson Trichrome (abcam, ab150686) 및 Verhoeff-Van Gieson으로 염색되었다. 면역 조직 화학적 검사를 위해, 탈 파라핀화 된 샘플의 항원 검색을 위해 Tris-EDTA 완충액(pH 9.0, 0.05 % Tween 20)에서 끓인 다음 면역 염색을 위한 표준 프로토콜을 따라 수행하였다. 세포 사멸을 분석하기 위해 Click-iT TUNEL 분석 이미징 키트 (Invitrogen, C10243)를 사용하여 대동맥 절편을 처리했다. 면역 세포 화학의 경우, 커버 슬립에서 배양된 세포를 4% 파라포름알데히드를 사용하여 고정하고 PBS 중 0.1 % Triton X-100으로 투과화 하였다. 그 후 PBS에 희석된 10 % 염소 혈청으로 세포를 차단하였다. 세포는 4℃에서 밤새 차단 용액에 희석된 1 차 항체와 함께 배양되었다. 세포를 Alexa-488, 568 접합된 2 차 항체 (Invitrogen)와 함께 실온에서 1 시간 동안 배양했다. 염색된 세포는 Mowiol 용액으로 장착되었다. LSM-710 공 초점 현미경 시스템 (Carl Zeiss) 및 ZEN 소프트웨어 (Carl Zeiss)를 사용하여 형광 이미지를 얻었다.
1-5)
염색질 면역 침전 (ChIP 분석)
ChIP 분석은 공지된 방법에 따라 수행되었다(Jeong HJ, Lee SJ, Lee HJ, Kim HB, Vuong TA, Cho H, Bae GU, Kang JS, 2019 : Prmt7 promotes myoblast differentiation via methylation., Cell Death & Differentiation, 27, 573-586) 간단히 말해서, adenoviral-control 또는 shprmt1으로 감염된 A7R5 세포를 실온 (RT)에서 10 분 동안 1% 포름알데히드를 사용하여 고정하고 실온에서 5 분 동안 125mM 글리신으로 급냉시킨 후, 수거 된 세포를 용해시킨 후, 용해물을 초음파 처리하여 염색질을 200-1,000bp 길이로 전단하고, 단편화 된 염색질을 포함하는 용 해물을 항체와 함께 4 ℃에서 밤새 배양 한 후 제조업체의 프로토콜에 따라 Protein A Agarose/salmon 정자 DNA (Millipore, 16-157)로 침전시켰다. 페놀-클로로포름-이소아밀 알코올(Sigma, 77617)을 사용하여 비드에서 염색질을 추출하고 에탄올 침전을 통해 처리하였다.
1-6)
혈압 측정 및 심초음파
마우스의 수축기 혈압은 비 침습적 혈압 시스템 (AD 기기, IN125 / M)으로 측정되었습니다. 간단히 말해서, 마우스를 2 주 동안 매일 혈압 분석 조건에 대해 훈련시켰다. 조정 기간 후 혈압은 일주일에 한 번 측정되었다.
심 초음파 분석은 공지된 방법에 따라 수행되었다 (Jeong et al., 2017 : Cdon deficiency causes cardiac remodeling through hyperactivation of WNT/-catenin signaling. Proc Natl Acad Sci U S A, 114(8), E1345-E1354). 간단히 말해, 심 초음파 검사는 LV의 짧은 축에서 파생된 M 모드 이미지가 40MHz 프로브 (visual Sonics)가 있는 시각 초음파 Vevo LAZR-X 기계를 사용하여 기록됨에 따라 수행되었다. 2-3% 이소플루란을 사용하여 유도 챔버에서 마우스를 마취한 다음 심박수 모니터링을 위해 가열된 심전도 플랫폼으로 옮겼다. 대동맥궁 직경 측정을 위해 대동맥궁의 B 모드 이미지도 촬영했다. 데이터 분석은 VEVO 랩 3.1을 사용하여 수행되었다.
1-7)
와이어 미오그래피
등척성 장력 측정을 위해, 흉부 대동맥을 마우스에서 분리하고 Krebs 용액으로 헹구었다. 결합 조직을 조심스럽게 제거한 후 대동맥을 2mm 길이로 절개하여 폭기된 (95% O2 - 5% CO2) 크렙스 용액을 채운 와이어 근조 영실 (Danish Myo technology, 620M)에 장착하고 37 
에서 유지하였다. 평형을 위해, 분리된 대동맥 고리를 휴지 장력에 도달할 때까지 늘이고 60mM KCl Krebs 용액에 노출시켜 수축성을 분석했다. 누적 투여된 혈관 수축 작용제에 대한 수축 반응을 조사하기 위해 페닐에프린 (PE, sigma, P6126)을 각 대동맥에 처리했다.
1-8)
통계분석
데이터는 명시된 대로 ± SEM 또는 ± SD를 의미한다. 값은 쌍을 이루지 않거나 쌍을 이룬 양측 스튜던트 t-검정을 사용하여 분석되었다. 다중 비교를 위해 분산 분석 (ANOVA) 테스트에 이어 Dunnett의 테스트가 사용되었다 (GraphPad Prism 소프트웨어, 버전 7.00). 차이는 P <0.05에서 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.
실험예 1. 혈관 평활근 세포에서 Prmt1 결손에 의한 영향
1-1)
대동맥 팽창 및 수축기 혈압 저하
정상 마우스(Prmt1 fl/fl ) 와 혈관 평활근 특이적 Prmt1 결손 마우스 (Prmt1 SMKO )의 혈관을 분리하여 촬영한 사진(도 1)을 통해 Prmt1smKO 마우스에서 혈관이 팽창되어 있음을 확인하였다. 상기 실험 결과를 도 2와 같이 정량화하여 비교하였다.
아울러, Prmt1 fl/fl 및 Prmt1 SMKO 마우스에서 수축기 혈압을 각각 측정하여 비교하였다. 그 결과, Prmt1 SMKO 마우스에서 수축기 혈압이 현저히 낮아졌음을 도 3과 같이 확인하였다.
1-2)
대동맥 섬유화 및 대동맥 박리
Prmt1 fl/fl 및 Prmt1 SMKO 마우스에서 대동맥을 분리하여 TUNEL assay를 통해 대동맥 세포의 사멸 여부를 확인하였다. 그 결과, 도 4에서 보듯이, Prmt1 SMKO 마우스에서 대동맥의 세포 사멸이 관찰되었다.
또한, 대동맥의 혈관 조직 변화를 관찰하기 위하여, Prmt1 fl/fl 및 Prmt1 SMKO 마우스의 대동맥을 절삭하여 그 단편에 대한 조직학적 관찰을 시행하였다. 그 결과, 도 5에서 보듯이, Prmt1 SMKO 마우스의 대동맥 혈관 평활근 세포에서 탈 분화현상, 탄력 섬유질(Elastic fiber)에서의 부정렬이 나타났음을 확인하였다. 또한, 대동맥 조직의 섬유화, 대동맥 박리가 관찰되었다.
1-3)
대동맥 수축능 저하
Prmt1 fl/fl 및 Prmt1 SMKO 마우스에서 면역염색법을 통하여 a-sma(alpha smooth muscle actin)을 염색한 결과 넉아웃 마우스에서 액틴이 소실된 것을 관찰할 수 있었다(도 6). 또한, 상기 각각의 마우스의 대동맥을 분리하여 wire-myography 실험을 시행하였다. 먼저, 상기 방법으로 혈관 장력 검사를 실시한 결과, 넉아웃 마우스의 혈관 장력이 정상군에 비하여 현저히 저하된 것을 확인하였다(도 7).
실험예 2. PRMT1 결손에 의한 Myocardin 발현 영향
Prmt1 fl/fl 및 Prmt1 SMKO 마우스에서 대동맥을 분리한 후, qrt-PCR을 진행하였다. 그 결과, 수축성 단백질인 Myocardin 발현 저하가 일어난 것을 확인할 수 있었다(도 8).
Myocardin의 발현에 미치는 영향을 확인하기 위해, Myocardin에 의해 전사가 조절되는 타겟 유전자인 Acta2, Myh11, Cnn1, Tagln의 상대적인 발현량을 각각 확인하여, 비교하였다. 그 결과, 도 9에서 보듯이, Prmt1 SMKO 마우스의 대동맥에서는 Myocardin의 모든 타겟 유전자의 발현이 저하되어 있는 것을 확인하였다.
또한, 상기 Myocardin을 발현하는 유전자의 프로모터를 대상으로 Prmt1에 의해 매개되는 H4R3 디메틸화 항체(dimethylation antibody)로 염색질 면역 침전(Chromatin immunoprecipitation)을 수행한 결과, Prmt1이 결핍된 혈관 평활근 세포에서는 Myocardin 프로모터의 H4R3 디메틸화가 저하되었음을 관찰할 수 있었다(도 10).
상기의 결과로부터, PRMT1이 결손된 경우, 근 수축성 단백질인 Myocardin의 발현이 저하됨을 확인하였다.
실험예 3. Prmt1 과발현에 의한 DNA 손상 완화 효과
야생형의 혈관 평활근 세포와 Prmt1이 과발현된 혈관 평활근 세포에 안지오텐신Ⅱ(AngⅡ)을 처리하여 인위적인 DNA 손상을 유발하여 그 정도를 비교하였다. 그 결과, 도 11에서 보듯이, Prmt1이 과발현된 세포의 경우, DNA 손상이 완화되었음을 확인하였다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
Claims (8)
- PRMT1(Protein arginine methyltransferase 1) 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 혈관 평활근 세포 이상 증식에 의해 유발되는 혈관 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 혈관 질환은 동맥류, 동맥경화 및 혈관 협착으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 혈관 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- PRMT1(Protein arginine methyltransferase 1) 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 혈관 평활근 세포 이상 증식에 의해 유발되는 혈관 질환 예방 또는 완화용 건강 기능 식품 조성물.
- 삭제
- 제1항, 제3항, 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물은 혈관 섬유화 또는 혈관 박리를 방지 또는 완화하는 효과를 가지는 것인, 조성물. - 제1항, 제3항, 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물은 혈관 수축 단백질인 미오카딘의 발현을 촉진시키는 효과를 가지는 것인, 조성물.
- PRMT1(Protein arginine methyltransferase 1) 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 혈관 평활근 세포의 DNA 손상 억제용 조성물.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020200122967A KR102600361B1 (ko) | 2020-09-23 | 2020-09-23 | Prmt1 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는 혈관 질환의 예방 또는 치료용 조성물 |
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| KR1020200122967A KR102600361B1 (ko) | 2020-09-23 | 2020-09-23 | Prmt1 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는 혈관 질환의 예방 또는 치료용 조성물 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20220040131A KR20220040131A (ko) | 2022-03-30 |
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| KR1020200122967A KR102600361B1 (ko) | 2020-09-23 | 2020-09-23 | Prmt1 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는 혈관 질환의 예방 또는 치료용 조성물 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR102600361B1 (ko) |
-
2020
- 2020-09-23 KR KR1020200122967A patent/KR102600361B1/ko active IP Right Grant
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| BioMed Research International Volume 2018, Article ID 1547452, 8 pages |
| Mol Neurobiol. 2020 March 57(3) 1716~1732. |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20220040131A (ko) | 2022-03-30 |
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