KR102485215B1 - Prmt7 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는 심장 비대증의 치료 또는 완화용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 PRMT7 (Protein arginine methyltransferase 7) 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 이용하여 심장 비대증을 포함하는 심장 질환의 완화 또는 치료용 조성 물질 및 단백질의 스크리닝 방법에 대한 것이다. 심장에서 발현되는 PRMT7은 심장의 Wnt 신호 전달 경로를 조절할 수 있으며, 상기 PRMT7의 발현을 조절함으로써, 심장 비대증을 포함하는 심혈관 질환에 대한 효과적인 치료를 가능하게 할 수 있다.

Description

PRMT7 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는 심장 비대증의 치료 또는 완화용 조성물 {A composition for treating cardiac hypertrophy comprising a PRMT7 protein or a gene encoding the same}

본 발명은 PRMT7 (Protein arginine methyltransferase 7) 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 이용하여 심장 비대증을 포함하는 심장 질환의 완화 또는 치료 물질 및 단백질의 스크리닝 방법에 대한 것이다.

심장 리모델링 시, 심장은 심장 발달과 관련한 몇 가지 신호 경로를 재활성화 하며, 심장 비대 및 심근 섬유증에서 WNT/β-카테닌 (이하 'Wnt 신호 전달'이라 함.)신호 전달이 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 특히 심근 병증에서 Wnt 신호 전달은 심장 재형성, 심근 경색 후 사망률 및 심장 기능 감소 등에 관여하는 것으로 알려져 있기 때문에, 중요한 의미를 가진다. Wnt 신호는 복잡한 메커니즘을 통해 여러 수준에서 조절된다. Wnt 신호 전달의 주요 조절 단계는 Wnt 리간드가 프리즐드 수용체 및 공동 수용체 리포프로테인 지단백질 수용체 관련 단백질 (LRP)에 결합할 때, 억제 인산화, 유비퀴틴화 및 프로테오좀 분해를 억제하는 것으로 시작되며, 이에 따라 β-카테닌을 안정화시키기 위한 신호 전달 캐스케이드가 개시되어 안정화 및 후속 β-카테닌의 전위 및 표적 유전자 발현의 활성화를 통해 프로테오좀 분해를 방지함으로써 β-카테닌 단백질을 안정화시킨다(Angers S, Moon RT. Proximal events in Wnt signal transduction. Nat Rev Mol Cell Biol. 2009;10:468-77).

단백질 아르기닌 메틸트랜스퍼라제 (Protein arginine methyltransferase, PRMT)는 아르기닌 잔기에서 히스톤 및 비히스톤 기질 모두를 대칭적 또는 비대칭적으로 메틸화하여 다양한 신호 경로와 유전자 발현을 조절한다. PRMT는 크게 두 가지 유형으로 구분할 수 있으며, 유형 I PRMT (PRMT1, 2, 3, 4, 6 및 8)는 비대칭 디메틸화를 촉매하고, 유형 II PRMT (PRMT5 및 7)는 대칭 디메틸화를 촉매한다.

최근 연구에서, 심장 기능에 대한 PRMT1의 중요성이 입증되었다 (Pyun JH, Kim HJ, Jeong MH, Ahn BY, Vuong TA, Lee DI, et al. Cardiac specific PRMT1 ablation causes heart failure through CaMKII dysregulation. Nat Commun. 2018;9:5107). 심근 세포에서 PRMT1이 결실된 경우, 심부전으로 빠르게 진행되는 심근 병증을 일으킬 수 있다는 점이 알려졌으나, 다른 PRMT들의 심장 특이적 역할에 대해서는 공지된 바가 없다. 특히, PRMT7 은 아르기닌 잔기에 2개의 메틸기를 대칭으로 붙일 수 있는 효소로서, 약물 등에 의한 세포 독성반응을 조절하는 유전자로 처음 알려졌으나 심장 기능에서 상기 PRMT7의 역할은 현재 명확하게 밝혀진 바가 없다.

이에 본 발명자들은 심장 비대와 관련하여 PRMT7의 역할을 연구하기 위해 실험을 진행한 결과, 만성 AngⅡ를 주입하여 비대화된 심장에서 PRMT7의 발현이 감소되며, 아울러 PRMT7이 결핍된 마우스에서 심장 비대증이 유발될 수 있다는 결과를 확인하였고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 PRMT7 단백질 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 유효 성분으로 함유하는, 심장 비대증 예방 ,치료 또는 개선용 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 PRMT7 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 또는 활성을 조절하는 제제를 포함하는, 심장 비대증 예방, 치료 또는 개선용 조성물을 제공하는 것이다

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 심장 세포에 후보 물질을 처리하는 단계; 상기 후보 물질을 처리한 근육 세포에서 PRMT7 단백질의 발현 또는 활성을 측정하는 단계; 및 후보 물질의 비 처리군과 비교하여, PRMT7 단백질의 발현 또는 활성을 증진시키는 물질을 심장 비대증의 치료 물질로 선정하는 단계를 포함하는 심장 비대증 치료 물질의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 PRMT7 단백질 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 유효 성분으로 함유하는, 심장 비대증 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 PRMT7 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 또는 활성을 조절하는 제제를 포함하는, 심장 비대증 예방, 치료 또는 개선용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적을 제공하기 위하여, 본 발명은 심장 세포에 후보 물질을 처리하는 단계; 상기 후보 물질을 처리한 심장 세포에서 PRMT7의 발현 또는 활성을 측정하는 단계; 비 처리군과 비교하여, PRMT7의 발현 또는 활성을 증진시키는 물질을 심장 비대증의 치료 물질로 선정하는 단계를 포함하는 심장 비대증 치료 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 PRMT7 단백질 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 유효 성분으로 함유하는, 심장 비대증 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 대한 것이다.

본 발명에서 상기 "심장 비대증(cardiac hypertrophy)"은 다양한 병리학적 자극에 대한 심장의 적응 반응으로 나타나는 질환으로, 고혈압, 판막 질환 또는 심근 경색 등 다양한 원인에 의해 유발된다. 심장 비대증은 이와 같은 자극에 대해 심장에 가해지는 기계적 하중을 보상하기 위한 현상이나, 만성 심장 비대증은 중증 질병 상태로 종종 진행되므로, 이는 심혈관 질병의 유병률과 사망률에 있어 주요한 독립 위험인자로 여겨진다.

본 발명의 PRMT7 (Protein arginine methyltransferase 7)은 히스톤과 비 히스톤의 아르기닌 잔기에 메틸화를 매개하는 효소로서, 다양한 생물학적 신호 전달 과정을 조절할 수 있다. 특히 본 발명에서 심장 특이적인 Wnt/β-카테닌 신호전달(이하, 'Wnt 신호전달' 이라 함) 과정은 심장에서 심장 비대증과 같은 질환을 조절할 수 있다. PRMT7은 Wnt 신호전달과 관련된 인자인 β-카테닌의 일부 아르기닌 잔기를 대칭적으로 메틸화 하며, 본 발명에서는 PRMT7이 심장에서의 Wnt 신호전달 과정을 조절하는 역할을 수행함을 실험적으로 확인하였다.

즉, PRMT7은 심장에서 특이적으로 Wnt 신호전달 과정을 조절할 수 있는 역할을 수행함으로 인하여, 심장 질환, 그 중에서도 특히 심장 비대증을 예방, 치료 또는 완화할 수 있는 효과를 가진다. 상기 심장 비대증을 예방, 치료 또는 완화할 수 있는 효과는 생체 내 혹은 생체 외에서 비대해진 심장 세포의 크기를 감소시키거나, 심장의 무게를 감소시킨 결과로부터 확인할 수 있다.

본 명세서의 상기 조성물은 약학적 조성물을 포함하며, 이외에 관련된 질환의 증상을 개선 또는 완화할 수 있는 치료 효과를 가지는 모든 조성물의 형태를 포함한다.

본 명세서에서 용어 "예방"은 본 발명에 따른 상기 조성물의 투여에 의해 심장 비대증을 억제하거나 발병을 지연시킬 수 있는 모든 행위를 의미한다.

본 명세서에서 용어 "치료"는 본 발명에 따른 상기 조성물의 투여에 의해 심장 비대증과 관련한 증세가 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 말한다.

본 발명의 상기 약학적 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 상기 제형화에 필요한 담체 혹은 부형제 등을 추가로 포함할 수 있다. 상기 유효 성분에 추가로 포함될 수 있는 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등이 포함된다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

예를 들어, 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물 또는 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 적어도 면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스 (sucrose) 또는 락토오스 (lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 또는 비경구 투여(정맥주사, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)될 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도 및 약물 형태, 투여 경로 및 시간에 따라 다르며, 당업자에 의해 적절한 형태로 선택될 수 있다.

본 발명의 상기 약학적 조성물은, 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서 "약학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 양으로, 질병을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 그 기준은 환자의 질환, 중증도, 약물 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 병용되는 성분 및 기타 사항에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 상기 약학적 조성물은, 개별 치료제 혹은 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 상기 요소들을 모두 고려하여 부작용을 최소화할 수 있는 수준으로 투여량을 결정할 수 있고, 이는 당업자에 의해 용이한 수준으로 결정될 수 있다. 구체적으로 상기 약학적 조성물의 투여량은 환자의 연령, 체중, 중증도, 성별 등에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로 체중 1kg 당 0.001 내지 150 mg, 보다 바람직하게는 0.01 내지 100mg의 양을 매일 또는 격일, 1일 1 내지 3회 투여할 수 있다. 다만, 이는 예시적인 것으로, 상기 투여량은 필요에 달리 설정할 수 있다.

또한, 본 발명의 상기 조성물은 PRMT7 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는 심장 비대증의 예방 또는 개선용 식품, 특히 건강기능식품에 대한 것이다.

본 명세서에서 용어 "건강기능식품"은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.

본 발명의 상기 식품 또는 건강기능식품은, 심장 비대증의 예방 및 개선을 위한 목적으로 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 환제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 등 약학적 투여 형태 또는 티백, 침출자, 음료, 캔디, 젤리, 껌 등의 건강 기능식품으로 제조 및 가공이 가능하다.

본 발명의 상기 식품 또는 건강기능식품 조성물은, 식품 첨가물로 사용될 수 있으며, 단독으로 혹은 다른 성분과 조합하여 제품화될 수 있다. 또한, 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제 및 증진제, 펙트산 및 이의 염, 알긴산 및 이의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등이 포함될 수 있다. 상기 성분은 단독 혹은 조합하여 사용될 수 있으며, 적절한 함량으로 조합되어 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 PRMT7 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 또는 활성을 조절하는 제제를 포함하는 심장 비대증의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 대한 것이다.

상기 PRMT 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 또는 활성을 조절하기 위한 제제는, 천연물, 화합물, 펩티드, 핵산 분자 등 종류에 제한되는 것은 아니며, 본 발명의 상기 조성물에 포함되기 위하여 일반적으로 PRMT7 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 또는 활성을 증진시키거나, 촉진하는 것이면 제한없이 사용될 수 있다.

또한 본 발명은 ⅰ) 심장 세포에 후보 물질을 처리하는 단계; ⅱ) 상기 후보 물질을 처리한 심근 세포에서 PRMT7의 발현 또는 활성을 측정하는 단계; 및 ⅲ) 비 처리군과 비교하여, PRMT7의 발현 또는 활성을 증진시키는 물질을 심장 비대증의 치료 물질로 선정하는 단계를 포함하는 심장 비대증 치료 물질의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

본 발명에서 상기 PRMT7 단백질 또는 이의 유전자의 발현 또는 활성을 측정하는 단계는 PRMT7 유전자의 발현에 의해 생성된 RNA 또는 단백질의 양을 측정할 수 있는 다양한 방법을 통해 실시될 수 있다. 바람직하게, RNA의 발현량은 RT-PCR(실시간 PCR), 마이크로어레이, 노던 블롯팅 등의 공지된 방법을 이용하여 확인할 수 있고, 상기 단백질의 활성 및 발현은 면역침강, 면역염색, 크로마틴 면역염색, 효소면역분석(ELISA), 웨스턴블롯팅 등의 공지된 방법으로 확인할 수 있으며, 그 방법에 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 PRMT7 (Protein arginine methyltransferase 7) 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 이용하여 심장 비대증을 포함하는 심장 질환의 완화 또는 치료 물질 및 단백질의 스크리닝 방법에 대한 것이다. 심장에서 발현되는 PRMT7은 심장의 Wnt 신호 전달 경로를 조절할 수 있으며, 상기 PRMT7의 발현을 조절함으로써, 심장 비대증을 포함하는 심혈관 질환에 대한 효과적인 치료를 가능하게 할 수 있다.

도 1은 안지오텐신II (AngII)로 유도되는 심근 비대증에서 PRMT7의 발현양의 감소를 보여주며, 심근 비대증 진행 기전에서 PRMT7의 보호 역할의 가능성을 보여주는 것이다.
도 1A는 Veh 및 AngII이 주입된 심장 용해물의 면역 블롯 분석 결과.
도 1B는 AngII 처리된 NRVM 세포의 면역 블롯 분석 결과.
도 2는 NRVM 세포에서 PRMT7이 결핍되면, 심장 비대의 표현형을 보여주는 것이다.
도 2A는 대조군 또는 shPRMT7 발현 NRVM 세포의 대표적인 면역 염색 이미지(흰색 점선은 셀룰러 경계를 나타냄), 스케일 바는 50νm).
도 2B는 패널 A에 도시된 것과 유사한 실험에서 세포 표면적의 정량화 결과. pSuper의 경우 n=76, shPRMT7의 경우 60. (*** p<0.005 오차 범위±SEM).
도 2C는 심장 비대 마커에 대한 qRT-PCR 분석 결과. n=3, ***p<0.005. NS: 의미없음. 오류 표시줄±SD.
도 3은 심장 특이적 PRMT7결손 모델에서, 심장 비대 및 심근 섬유증이 유발된 결과를 나타낸 것이다.
도 3A는 WT 및 cKO 마우스의 심장 초음파 파라미터. EF: 좌심실구혈률, FS: 분획 단축률, LV mass: 좌심실질량. 그룹당 n=6. *p<0.05, **p<0.005, 스튜던트 t- 테스트. 오류 표시줄±SD.
도 3B는 체중에 의해 정규화된 4 개월령 마우스의 상대적 심장 무게. 각 유전자형 당 n=14. *p<0.05, 스튜던트 t-테스트. 오류 표시줄±SD
도 3C는 WT 및 cKO 하트의 헤 마톡 실린 및 에오신 (H & E) 염색에 대한 대표적인 이미지. 스케일 바: 150νm.
도 3D는 4 개월 된 WT 및 cKO 심장의 시리우스 레드 스테인에 대한 대표적인 이미지. 스케일 바: 200νm(상단), 100νm (하단).
도 3E는 패널 D에 도시 된 바와 같이, 전체 심장 영역 (n=3)에서 섬유 성 영역의 정량화 결과. *p<0.05 **p<0.005, 스튜던트 t- 테스트. 오차범위±SEM 표시.
도 4는 안지오텐신II (AngII)에 의해 유발된 질병 모델에서 PRMT7의 결손은 심근비대증을 악화시키고, PRMT7의 과발현은 심근비대증을 억제하여 심근질환에서 PRMT7의 보호 기능을 보여주는 결과이다.
도 4A는 Veh 또는 AngII가 주입된 WT 및 cKO 심장의 헤마톡실린 및 에오신 (H & E) 염색에 대한 대표적인 이미지. 스케일 바: 1mm.
도 4B는 Veh 또는 AngII가 주입된 WT 및 cKO 하트의 시리우스 레드 스테인의 대표적인 이미지. 스케일 바: 100νm.
도 4C는 Veh 또는 AngII가 주입된 WT 및 cKO 마우스의 체중에 대한 심장 중량의 상대적 결과와 패널 E에서 전체 심장 영역 (n=3)의 섬유 영역의 정량. 일원 분산 분석. 오차범위±SEM 표시.
도 4D는 대조군 및 AngII로 48 시간 동안 처리된 PRMT7-HA를 고려한 NRVM 세포의 대표적인 면역 염색 이미지. HA(적색) 및 act-액티닌(녹색). 스케일 바: 20νm.
도 4E는 패널 A에 나타낸 것과 유사한 실험에서 세포 표면적의 정량화. 7 개 이상의 필드의 평균값. 일원 분산 분석. 오차범위±SEM 표시. 각 그룹당 n=3.
도 4F는 대조군 및 AngII로 처리된 NRVM 세포를 과발현하는 pcDNA 또는 PRMT7에서의 ANP 발현에 대한 면역 블롯 분석 결과.
도 5는 Wnt signaling pathway의 주요 인자인 β-카테닌과 PRMT7과의 역상관관계를 보여주는 결과이다.
도 5A는 WT 및 cKO 심장 샘플에서 PRMT7 및 β-카테닌의 발현 수준에 대한 면역 블롯 검정 결과.
도 5B는 PRMT7 억제제인 DS-437을 처리한 NRVM 세포에서 β-카테닌의 발현에 대한 면역 블롯 분석 결과.
도 5C는 대조군 또는 PRMT7로 형질 감염된 10T1/2 세포에서의 탑-플래시 루시페라제 활성 결과. *p<0.05, 일원 분산 분석 결과 (오류 표시줄±SD가 표시됨).
도 5D는 Wnt3a에 반응하여 PRMT7가 과발현된 H9c2 세포에서 β-카테닌 발현에 대한 면역 블롯 분석 결과.
도 6은 PRMT7에 의해 진행되는 메틸화로 인해 β-카테닌의 단백질 안정성의 조절 기전을 보여주는 결과이다.
도 6A는 DS-437이 처리된 NRVM 세포에서 β-카테닌의 단백질 아르기닌의 메틸화 수준 (Symmetric methylation; SYM)을 분석하기 위한 면역 침전 결과.
도 6B는 WT 및 KO 심장에서 β-카테닌의 SYM을 분석하기 위한 면역 침전 결과.
도 6C는 WT 및 돌연변이의 β-카테닌의 SYM을 분석하기 위한 면역 침전 결과.
도 6D는 패널 B에서 β-카테닌의 상대적 대칭 아르기닌 메틸화 수준의 정량 결과. *** p <0.005, 스튜던트 t-검정 (오류 표시줄±SD가 표시됨).
도 6E는 24 시간 동안 MG132로 처리된 WT 또는 돌연변이 β-카테닌+ PRMT7로 형질 감염된 세포에서 β-카테닌 유비퀴틴화에 대한 면역 블롯팅 분석 결과.

이하, 본 명세서를 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세히 설명한다. 그러나, 본 명세서에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 명세서의 범위가 아래에서 상술하는 실시예들에 한정되는 것으로 해석되지는 않는다. 본 명세서의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 명세서를 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

실시예 1. 재료 및 실험 방법

1-1) 마우스 실험

PRMT7+/- 마우스는 기 공지된 문헌에 기재된 내용에 따라 준비되었다(Jeong HJ et al. Prmt7 Deficiency Causes Reduced Skeletal Muscle Oxidative Metabolism and Age-Related Obesity. Diabetes. 2016;65:1868-82.) 심장 특이적 PRMT7 결손 마우스를 생산하기 위하여, PRMT7Tm1c/Tm1c (PRMT7f/f, WT) 마우스를 Myh6-Cre 트랜스진 (Jackson Laboratory; Tg(Myh6-cre)2182Mds/ J)을 보유한 마우스와 교배 시켰다. 유전자형 분석은 상기 공지 문헌에 기재된 대로 수행되었다. 심근 병증에서 PRMT7의 효과를 평가하기 위해, 본 발명자들은 이형 접합 번식으로부터 3개월 내지 5개월된 한배 새끼 마우스를 사용하였다. 심장 비대의 발달을 위해, Angiotensin II(AngII)을 14 일 동안 (1.5mg/kg/일) 피하로 주사하였다. 이 연구는 성균관대 학교 의과 대학 (SUSM)의 기관 동물 관리 및 사용위원회(IACUC)에 의해 검토되었으며 윤리적 지침에 따라 수행되었다.

심장 초음파 분석을 위해, 마우스를 1-2%(vol/vol) 이소플루란으로 마취시켰다. 4 개월령의 마우스에서 심장 초음파 검사를 수행하였고, Vevo LAZR-X 광음향 이미징 시스템 (Fujifilm visual sonics)을 사용하여 LV의 단축에서 유도된 M-모드 이미지를 기록하였다. 심전도를 기록하기 위해, 마우스를 2% 이소플루란으로 마취시키고, 따뜻한 표면에서 복위 자세를 취하게 하였다.

1-2) 세포 배양, 형질 감염 및 리포터 어세이

HEK293T, 10T1/2 및 H9C2 세포를 10% 소태아 혈청(Gibco) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 둘베코 변형 이글배지(Gibco)에서 배양하였다. 형질 감염 연구는 공지 문헌에 기재된 내용에 따라 수행되었다(van Veelen W et al. beta-catenin tyrosine 654 phosphorylation increases Wnt signalling and intestinal tumorigenesis. Gut. 2011;60:1204-12). HEK293T 및 10T1/2 세포에는 리포펙타민 2000(Invitrogen)을 사용하고 H9C2 세포에는 폴리 에틸 레니민(1mg/ml, Sigma-Aldrich)을 사용하였다. Wnt 신호 전달에 대한 PRMT 억제 효과를 평가하기 위해, 세포를 50% M PRMT5 및 PRMT7 억제제 DS437 (Sigma-Aldrich) 또는 20μM PRMT1 특이적 푸라미딘 (Sigma-Aldrich)으로 0.2% BSA 또는 20ng/ml의 Wnt3a (R & D 시스템)으로 처리하였다. PRMT7 의존성 β-카테닌의 유비퀴틴화를 조사하기 위해, pCMV-PRMT7 및 pcDNA HA-태그된 유비퀴틴을 3:1 비로 형질 감염시켰다. 또한, 프로테아좀 분해를 억제하기 위해, 세포를 대조군 DMSO 또는 10 MM의 MG132(Calbiochem)로 6시간 동안 처리한 후 면역 블롯팅 하였다.

NRVM 세포는 상기 문헌에 기재된 대로 신생아 Sprague-Dawley (SD, 1-2 일) 쥐 심장 조직에서 분리되었다. 세포 비대를 유도하기 위해, 세포 배양 배지를 페닐에프린 (PE, 100μM, Sigma-Aldrich)이 포함된 무혈청 배양 배지로 교체하여 48시간 동안 배양하였다.

루시퍼라제 리포터 분석은 공지된 문헌에 기재된 대로 실시하였다(Jeong MH, et al. Cdo suppresses canonical Wnt signalling via interaction with Lrp6 thereby promoting neuronal differentiation. Nat Commun. 2014;5:5455.). 간략하게, 10T1/2 및 H9C2 세포를 0.7μg의 대조군 또는 PRMT7 과발현 플라스미드, 0.3μg의 β-카테닌-반응성 상부-플래시 루시퍼라제 컨스트럭트 및 0.1μg의 β-갈락토시다제 플라스미드를 이용하여 총 DNA 1.1μg의 비율로 형질 감염시켰다. 형질 감염 24 시간 후, 세포의 루시퍼라제 활성에 대하여 제조사의 프로토콜(Promega)에 따라 분석하였다. 대조군 WT 및 돌연변이체의 β-카테닌의 전사 활성을 추가로 분석하기 위해, TCF/LEF; H2B-GFP 리포터 플라스미드 구축물 (Addgene, Plasmid #32610)을 대조군 또는 돌연변이체 β-카테닌 구축물과 함께 10T1/2 세포로 공동-형질 감염시켰다. GFP-양성 10T1/2 세포를 Tissue FAXS PLUS (TISSUEGNOSTICS)로 계수하고 이미지를 TissuQuest 이미지 분석 소프트웨어로 분석하였다.

1-3) 단백질, 질량 분석빕 및 RNA 분석

면역 블로팅 및 면역 염색은 공지된 문헌에 기재된 방법으로 수행되었다(Leem YE, et al. Cdo Regulates Surface Expression of Kir2.1 K+ Channel in Myoblast Differentiation. PLoS One. 2016;11:e0158707). PRMT7과 β-카테닌 사이의 단백질 상호 작용을 조사하기 위해, 1mg의 대조군, PRMT7은 과발현된 HEK293T 세포 또는 심장 용해물 및 1μg의 1 차 항체를 사용하였다. 샘플은 20㎕의 디나 비드-단백질 A 또는 단백질 G(Invitrogen)로 면역 침전되었다. 면역 블롯팅 밴드의 밀도는 독립적으로 3회 반복된 이미지 J에 의해 측정되었다. β-카테닌 단백질의 번역 후 변형을 분석하기 위해, 1mg의 샘플 용해물을 1 ㎍의 항 β-카테닌, 항 -Flag 또는 항-포스포-티로신 항체로 면역 침전시켰다. 질량 분석을 위해, 플래그-태그 된 β-카테닌을 HEK293T 세포로 형질 감염시키고 β-카테닌 단백질을 플래그 항체를 사용하여 면역 침전시켰다. 정제된 Flag-β-카테닌 단백질의 질량 분석은 서울 대학교 의약 생체 융합 연구 센터에 의해 수행되었다. 질량 분석은 공지된 문헌(Pyun JH, et al. Cardiac specific PRMT1 ablation causes heart failure through CaMKII dysregulation. Nat Commun. 2018;9:5107)에 기재된 방법에 따라 수행되었다. 정량적 RT-PCR은 'Kwon YR, et al. The Shh coreceptor Cdo is required for differentiation of midbrain dopaminergic neurons. Stem Cell Res. 2014;13:262-74'에 기술된 바와 같이 수행되었다. 마우스 하트 및 NRVM 세포로부터의 총 RNA를 제조사의 지시에 따라 이지-블루 (iNtRON)시약으로 추출하였다. cDNA 샘플은 제조사의 프로토콜에 따라 PrimeScript RT 시약 키트 (TaKaRa)를 사용하여 0.5 ugg의 RNA로부터 생성되었다.

1-4) 조직학 및 면역 형광 분석

공지된 방법에 따라 심장 절편의 조직 분석이 수행되었다 [Lee HJ, et al. Overweight in mice and enhanced adipogenesis in vitro are associated with lack of the hedgehog coreceptor boc. Diabetes. 2015;64:2092-103, /Jeong MH, et al. Cdon deficiency causes cardiac remodeling through hyperactivation of WNT/beta-catenin signaling. Proc Natl Acad Sci USA. 2017) 간략하게 설명하면, 수확된 마우스 심장 세포를 4% 파라포름알데히드(PFA)로 고정시키고 광학 절단 온도(OCT, Sakura Finetec) 또는 파라핀 블록에 내장시켰다. 파라핀에 매립된 심장 샘플을 5㎛ 두께로 절단한 다음 헤마톡실린 및 에오신염색 (BBC 생화학적), 매스톤의 트리크롬 또는 시리우스 레드(Abcam)로 염색 하였다.

마우스 심장 샘플에서 PRMT7의 면역 조직 화학은 Jeong MH, et al.(Proc Natl Acad Sci U S A. 2017)에 기재된 방법에 따라 수행되었다. PRMT7의 발현을 조사하기 위해, 인간 좌심방 부속물의 섹션을 OCT에 신속하게 매립하고 7㎛ 두께로 절단하였다. 간략히 말해서, 섹션을 고정시키고, 투과화시키고, 0.3 %의 과산화수소로 처리하여 내인성 퍼옥시좀 활성을 제거한 다음, 용액 (2% 소혈청 알부민(BSA), 0.2% 트리톤 X-100 (PBS 중))에서 블락킹시켰다. 이어서, 섹션을 1 차 항-PRMT7 또는 대조군 이소형 항체 및 비오티닐화 항-토끼 항체와 순차적으로 인큐베이션 한 후 홀스래디쉬 퍼옥시다제 (HRP) 접합 스트렙타비딘 용액(Zymed)에서 인큐베이션하고, Dako REAL EnVision Detection System 키트 (Dako)를 사용하여 신호를 디벨롭 하였다. 면역 형광은 앞에서 설명한 대로 수행되었다(Vuong TA, et al. A Sonic hedgehog coreceptor, BOC regulates neuronal differentiation and neurite outgrowth via interaction with ABL and JNK activation. Cell Signal. 2017;30:30-40). 간단히 설명하면, 세포를 커버 슬립상에서 성장시키고, 대조군 및 pcDNA-HA-PRMT7 또는 pSuper-shPMRT7로 형질 감염시켜 PRMT7을 과발현 하거나 또는 고갈시켰다. 이어서, 세포를 4% PFA로 고정시키고 PBS에서 0.2% Triton X-100으로 투과화 시킨 후 차단시켰다(PBS에서 2 % BSA 또는 5% 염소 혈청). 1차 및 2차 항체를 차단 용액으로 희석하고 4℃에서 밤새 또는 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 형광 이미지는 LSM-710 공 초점 현미경 시스템 (Carl Zeiss) 및 Nikon ECLIPS TE-2000U를 이용하여 관찰하였다. NRVM 세포의 표면적은 NIS-Elements F 소프트웨어 (Nikon)에 의해 분석되었다.

1-5) 부위 지정 돌연변이 유발

β-카테닌의 93 및 591에서 아르기닌 잔기의 알라닌으로의 점 돌연변이를 생성하기 위해, QuikChange II XL 부위 지향 돌연변이 유발 키트(Agilent)를 사용하여 부위 지향적 돌연변이 유발을 제조사의 프로토콜에 따라 수행하였다. 돌연변이체 β-카테닌 플라스미드를 샘플 반응 완충액에서 0.5 ㎍의 주형(pcDNA-Flag- 인간β-카테닌)으로 합성하였다. 샘플 반응 후, 1㎕의 Dpn1 제한 효소를 37 ℃에서 1 시간 동안 즉시 인큐베이션하여 슈퍼 코일된 dsDNA를 소화시키고 DH5α 적격 세포로 형질 전환시켜, 돌연변이를 유발하였다.

1-6) 통계 분석

명시된 바와 같이 모든 값은 평균±SEM 또는 SD이다. 통계적 유의성은 쌍 또는 짝이 없는 양측 스튜던트 t 검정 또는 분산 분석(ANOVA) 검정에 이어 Tukey의 검정에 의해 계산되었다. 차이는 P <0.05에서 유의한 것으로 간주되었다.

실험예 1. 만성 AngII 및 이소프로테레놀의 투여에 의해 유발된 심장 비대증 모델에서의 PRMT7 감소

실시예 1-1)과 같이 2주 동안 AngII을 투여하여 심장 비대 및 심근 섬유증을 유발한 마우스 모델에서의 PRMT7의 변화를 관찰하였다. 일관되게, 심방 섬유증 유전자, 예를 들어 심방 나트륨 이뇨 펩티드(ANP) 및 콜라겐1α1(Col1α1)과 같은 유전자의 발현이 증가되었고, PRMT7 단백질은 AngII이 주입된 심장에서 크게 감소되었다(도 1A). 추가적으로, 신생아 랫트 심실 심근세포(NRVM)을 2-3일 동안 Ang II로 처리하여 관찰한 결과, in vivo 와 유사하게, Ang II 처리 시 ANP 및 Col1α1을 증가시킴과 동시에 PRMT7 발현은 감소시켰다 (도 1B). 이는 PRMT7이 심장 비대에서 역할을 담당하는 것을 시사하는 결과이다.

또한, 심근 세포에서 급성 PRMT7 결핍 효과를 조사하기 위해, 신생아 래트 심실 근육 세포 (NRVM)를 3 개의 상이한 PRMT7 shRNA로 형질 감염시켰다. PRMT7 단백질은 가변 효율을 갖는 시험된 shRNA에 의해 발현이 감소되었다 (도 2). NRVM 세포에서 shRNA #1 발현에 의해 PRMT7가 결핍된 경우, PRMT7이 고갈된 NRVM의 크기가 증가되며, 심장 세포에서의 비대성 반응을 유발하였음을 커패시턴스 분석을 통해 확인하였다(도 2A, B). 또한, 섬유질 반응 유전자, ANP, 뇌 나트륨 이뇨펩티드(BNP) 및 β-Myosin 중쇄(β-MHC)의 발현은 shRNA #1 또는 #2를 가지는 PRMT7-결손 NRVM 세포에서 대조군에 비해 현저하게 상승되었다 (도 2C). 이러한 데이터는 PRMT7 결손이 심근 세포 비대를 유발한다는 것을 시사한다.

실험예 2. 심장 특이적 PRMT7 절제에 의한 심장 비대 및 심근 섬유증 유발

심장-특이적 PRMT7 결손에 의한 결과를 확인하기 위하여, 심장 특이적 미오신-중쇄 6(Myh6)-Cre 재조합 효소를 보유한 마우스와 함께 PRMT7 Tm1c/Tm1c (PRMT7 f/f, WT)마우스의 육종에 의해 심장-특이적으로 PRMT7이 결손된 마우스를 제작하였다. 검사된 다양한 조직 중에서, PRMT7은 PRMT7의 특이적 절제를 지지하는 심장 조직에서 특이적으로 절제되었다. 심장 특이적 PRMT7 녹아웃 마우스(PRMT7cKO, cKO)는 2개월부터 시작하여 5개월까지 대략 23%의 치사율을 나타냈다. 심장 초음파 분석에서, cKO 마우스는 좌심실 구혈률(ejection fraction, EF) 및 분획 단축률(fractional shortening, FS)이 감소된 것을 확인하였다(도 3A). 또한, 4개월령의 WT 및 cKO 마우스 각각의 체중에 의해 정규화된 상대적 심장 무게를 측정한 결과, cKO 마우스는 야생형(WT)과 비교하여 증가된 심장 무게 및 크기를 가지는 것으로 관찰되었다(도 3B). 또한, 4개월령의 WT 및 cKO 마우스에서 측정된 체중 대비 상대적 심장 무게와 헤마톡실린 (H&E) 염색한 결과, cKO 마우스는 야생형(WT)과 비교하여 증가된 심장 무게 및 크기를 가지는 것으로 관찰되었다(도 3B 및 C). 시리우스 레드를 통한 조직학적 염색을 통해 cKO 심장에서 섬유증의 확대가 나타났음을 확인하였다 (도 3D 및 E).

상기 결과를 종합하면, PRMT7 결핍이 심근 확대, 결과적으로 심장에서의 수축성 기능 장애 및 섬유증을 유발한다는 것을 시사한다.

실험예 3. PRMT7 결핍 모델의 AngII에 의해 유발된 심근병증 악화 확인

Ang II으로 유도된 심근병증 모델에서, PRMT7의 작용에 대한 효과를 조사하였다. 2 주 동안 대조군 또는 Ang II-주입된 WT 및 cKO 마우스를 심초음파 분석으로 조사하였다. 만성 AngII 주입군은 대조군과 비교하여 WT 및 cKO 마우스 둘 다에서 심장 비대를 유발하였다(도 4A 및 C). AngII 주입군은 WT 및 cKO 마우스 둘 다에서 EF 및 FS가 감소되어, 심장 기능을 손상시켰고, 섬유화 영역이 크게 상승하여, PRMT7가 결핍된 cKO 마우스에서 심장 기능 장애가 더욱 악화되었음을 확인하였다(도 4B 및 C).

종합하면, 이들 데이터는 PRMT7이 결핍된 경우, Ang II에 의해 유발된 심근 병증을 더욱 악화시킬 수 있음을 시사한다.

실험예 4. AngII에 의해 유발된 심근 세포 비대에 대한 과발현된 PRMT7의 효과

심근 세포에 대하여 AngII를 주입하여 비대를 유발한 후, PRMT7을 과발현 하였을 때의 효과를 in vitro에서 확인하였다. 실시예 1-2)와 같이 NRVM 세포를 대조군 pcDNA-HA 또는 HA-태깅된 PRMT7 (PRMT7-HA)로 형질 감염시킨 후, Ang II 으로 처리하였다. PRMT7 결손으로 인한 비대성 반응과 대조적으로, PRMT7-과발현 심근 세포는 대조군-형질 감염된 세포와 비교하여 비히클 및 Ang II 처리군 모두에서 세포 크기가 더 작게 관찰되었다(도 4D 및 E). 또한, PRMT7 과발현은 Ang II처리된 NRVM 세포에서 ANP 발현을 실질적으로 감소시켰다 (도 4F).

종합하면, 이들 데이터는 PRMT7이 과발현된 경우, Ang II에 의해 유발된 심근 세포 비대를 억제함을 시사한다.

실험예 5. PRMT7에 의한 β-카테닌의 발현 및 활성 조절 메커니즘

Wnt 신호 전달은 Ang II에 의해 유발된 심장 비대와 관련성이 있다. 이를 확인하기 위하여, PRMT7 고갈로 인한 심근 병증에서 Wnt 신호의 역할을 조사하였다. Ang II이 주입된 심장에서 발현되는 PRMT7과 Wnt 신호 사이에 역 관계가 있을 것이라 판단하고, 이를 확인하기 위해 WT 및 cKO 심장 샘플에서 PRMT7 및 β-카테닌의 발현 수준에 대한 면역 블롯팅을 수행한 결과, cKO 심장 또는 PRMT7 결손된 심근 세포가 WT 심장과 비교하여 β-카테닌 단백질을 더 많이 발현한다는 것을 확인하였다(도 5A).

또한, PRMT7 억제제인 DS-437을 NRVM 세포에 처리하여, β-카테닌의 발현과 활성 여부를 면역 블롯팅을 통해 확인하였다. 그 결과, 도 5B에서 보듯이, PRMT7 억제제가 처리되어, PRMT7이 발현된 경우에, β-카테닌의 발현 및 활성이 모두 증가되어 있는 것을 알 수 있다.

이와 관련하여, PRMT7으로 형질 감염된 10T1/2 세포의 β-카테닌 활성을 루시퍼라아제 활성을 통해 확인하였으며, PRMT7로 형질 감염된 10T1/2 세포는 대조군에 비해 루시퍼라아제 활성이 낮아져 있음을 알 수 있다 (도 5C). 또한, Wnt3a에 반응하여 PRMT7가 과발현된 H9c2 세포에서 β-카테닌 발현 여부를 면역 블롯팅을 통해 확인한 결과, PRMT7이 과발현된 경우, β-카테닌의 발현 및 활성이 모두 감소되어 있는 것을 알 수 있다(도 5D).

실험예 7. PRMT7에 의한 β-카테닌의 대칭적 아르기닌 메틸화 조절 효과

β-카테닌의 활성은, PRMT7에 의해 조절될 수 있음을 앞서 실험예에서 확인하였다. 이는 PRMT7이 β-카테닌의 대칭적 아르기닌 메틸화(Symmetric methylation; SYM)를 통해 조절되는 것이다. 이전의 연구에서 RXR 및 아르기닌-글리신(RG) 모티프의 아르기닌 잔기가 PRMT7-매개 메틸화에 유리한 표적임(Feng Y, et al. J Biol Chem. 2013; 288:37010-25)을 언급하였으며, 실제로 DS437 처리된 마우스의 NRVM 세포에서 β-카테닌의 대칭 아르기닌 메틸화 수준을 분석하기 위한 β-카테닌 및 항-Sym10항체의 공동-면역 침전 결과(도 6A)에서 이를 확인하였다. 또한, 마우스 심장에서 β-카테닌의 SYM을 분석하기 위한 면역 침전을 수행한 결과에서도 상기와 같은 결과를 확인할 수 있었다(도 6B).

또한, 서열 분석을 통해 아르기닌 93 잔기(R93) 및 R591 잔기가 잠재적인 PRMT7에 의한 메틸화 부위일 것으로 예측하였다. 이를 확인하기 위하여, PRMT7을 발현하는 293T 세포에서 발현된 정제된 플래그-태그 인간 β-카테닌을 사용하여 LC-MS/MS 분석을 수행하였으며, 그 결과, 서열 예측과 일치되는 결과로서, 디메틸화된 아르기닌 잔기 93(R93) 및 R591을 함유하는 펩티드가 각각 96% 및 92%의 펩티드 식별 확률로 검출되었다. 따라서, R93 및 R591에서 β-카테닌의 아르기닌-알라닌 돌연변이체(R93A 및 R591A; RA)를 대상으로 기능을 분석하였다. R93A 또는 R591A 돌연변이의 SRM 수준을 확인한 결과, 도 6C 및 D에서 보듯이, WT/β-카테닌에 비해 각각 40% 또는 70%로 감소되어 있었다. 또한, 24 시간 동안 MG132로 처리된 β-카테닌 WT 또는 +PRMT7로 형질 감염된 돌연변이 세포에서 β-카테닌 유비퀴틴화에 대한 면역 블롯팅 분석 결과에서도, 돌연변이가 유발된 경우에 SRM 수준이 감소된 것을 확인할 수 있다. 종합하면, 이들 데이터는 PRMT7이 R93에서 메틸화를 통해 β-카테닌 활성을 음성으로 조절할 수 있다는 것을 시사한다.

종합적으로, 이들 데이터는 PRMT7 결핍이 β-카테닌 축적 및 과활성화를 초래하여 심장 비대 및 섬유증을 초래함을 시사하며, 이를 과발현 또는 주입함으로써, 상기 질병을 치료 또는 예방할 수 있는 효과를 가진다는 점을 알 수 있다. 또한, β-카테닌의 안정성과 활성을 제어하기 위한 중요 메커니즘이 R93에서 β-카테닌의 대칭적 아르기닌 메틸화임을 보여준다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (8)

1. PRMT7(Protein arginine methyltransferase 7) 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 심장 비대증 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 심장 비대증은 심장 특이적인 Wnt/β-카테닌 신호전달과 관련된 것을 특징으로 하는, 심장 비대증 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
3. 제1항에 있어서,
   상기 PRMT7은 심장에서 β-카테닌의 아르기닌 잔기를 메틸화하여 Wnt/β-카테닌 신호전달을 제어하는 것을 특징으로 하는 심장 비대증 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
4. PRMT7(Protein arginine methyltransferase 7) 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 심장 비대증 예방 또는 완화용 건강 기능 식품 조성물.
5. 제 1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 PRMT7(Protein arginine methyltransferase 7) 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현을 증진시키는 제제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
6. 삭제
7. 삭제
8. ⅰ) 심장 세포에 후보 물질을 처리하는 단계;
   ⅱ) 상기 후보 물질을 처리한 심장 세포에서 PRMT7 단백질의 발현 또는 활성을 측정하는 단계; 및
   ⅲ)비 처리군과 비교하여 PRMT7 단백질의 발현 또는 활성을 증진시키는 후보 물질들을 선정하는 단계를 포함하는 심장 비대증의 예방, 개선 또는 치료 물질의 스크리닝 방법.

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