KR101640068B1 - Rip3-mlkl 경로 차단제를 포함하는 피부 세포 괴사성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 RIP3-MLKL 경로 차단제 또는 다브라페닙(dabrafenib)을 포함하는 피부 세포 괴사성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 인산화된 MLKL(mixed lineage kinase domain-like protein)를 검출하는 단계;를 포함하는 피부 세포 괴사성 질환 진단에 대한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 RIP3-MLKL 경로 차단제는 피부 세포 괴사성 질환에서 과발현되는 RIP3를 직접 억제하거나, 이로부터 연속적으로 유도되는 MLKL의 인산화 및 원형질막으로의 이동을 억제함으로서 괴사성 피부 세포 사멸을 효과적으로 방지할 수 있으므로, 괴사성 세포 사멸이 나타나는 다양한 피부 세포 괴사성 질환을 예방 또는 치료하는 효과가 우수하다.

Description

RIP3-MLKL 경로 차단제를 포함하는 피부 세포 괴사성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물{pharmaceutical composition comprising RIP3-MLKL pathway blocker for preventing or treating of skin cell necrosis disease}
본 발명은 RIP3-MLKL 경로 차단제 또는 다브라페닙(dabrafenib)을 포함하는 피부 세포 괴사성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 인산화된 MLKL(mixed lineage kinase domain-like protein)를 검출하는 단계;를 포함하는 피부 세포 괴사성 질환 진단에 대한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
세포사멸과 관련된 대다수의 연구는 programmed cell death (PCD)라고 알려진 세포의 자연사 (apoptosis)에 집중되어 왔으며 카스파제 (caspase)라는 효소가 발견됨으로써 많은 제약사들은 카스파제 억제제를 이용한 약물 개발을 지난 10년 동안 진행해 왔다. 그러나 아직까지 FDA의 승인을 받은 약물은 거의 없는 실정이며 이는 세포의 자연사가 생리적 상황에서 일어나는 세포사멸로서 체내의 항상성 (homeostasis)을 유지시키는 방어기전에 기인할 가능성이 크기 때문이다. 이와는 대조적으로, 세포괴사 (necrosis)는 주로 병적인 상황에서 일어나는 세포사멸로써 거의 대다수의 경우 염증 (inflammation) 반응을 동반하는 특징을 지니고 있다. 최근의 연구결과 (Proskurykakov SY et al. 2002, Biochemistry)에 따르면 세포괴사에 의해서 유발되는 질병은 허혈성 (ischemic, 예를 들어 심근경색, 뇌졸중, 신경색), 신경퇴행성 (neurodegenerative), 그리고 염증성 (inflammatory) 질환이 대표적이다. 세포괴사는 병적인 상황에서의 비조절적 사고사로서 이의 작용기전, 분자 타깃 및 신호 전달체계 등이 거의 연구되어 있지 않기 때문에 세포괴사가 원인이 되는 질환을 치료하고 세포괴사의 생물학적, 병리적 원인을 밝히기 위해 이러한 세포 괴사 억제 물질을 발견하여 개발하는 것은 매우 시급한 일임에도 불구하고 아직까지 이와 같은 세포 괴사성 질환의 적절한 치료제가 보고되어 있지 않다.
특히 세포 괴사성 질환에는 널리 처방되고 사용되는 약물에 의하여 나타나는 질병으로, 과량 또는 잘못 사용된 물질, 약물의 투여, 또는 적절히 투여된 올바른 물질, 약물에 의한 투여에 의하여 발생하는 약물 유도성 피부 장애가 포함되며, 이는 주로 원인을 알기 어렵고 적절한 치료제가 없어 불치병인 것으로 알려져 있다. 특히 대한약물역학위해관리학회에 따르면 약 1,700여 가지의 유통 의약품이 스티븐 존슨 증후군 또는 독성 표피괴사 융해와 같은 세포 괴사성 질환을 유도하는 것으로 알려져 있어 이와 같은 질환의 예방 또는 치료를 위한 새로운 치료제 및 치료법의 개발이 매우 시급하다.
본 발명자들은 RIP3에서 MLKL로 이어지는 경로가 세포자멸사(apoptosis)와 구별되는 세포 괴사성 질환을 유도하고, RIP3-MLKL 경로를 차단하는 경우 피부 세포 괴사성 질환을 효과적으로 치료할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은, RIP3-MLKL 경로 차단제를 포함하는 피부 세포 괴사성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이며, 특히 다브라페닙의 피부 세포 괴사성 질환 예방 또는 치료를 위한 신규한 용도를 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 인산화된 MLKL(mixed lineage kinase domain-like protein)를 검출하는 단계;를 포함하는 피부 세포 괴사성 질환 진단에 대한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 RIP3-MLKL 경로 차단제를 포함하는 피부 세포 괴사성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 다브라페닙을 포함하는 피부 세포 괴사성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 인산화된 MLKL(mixed lineage kinase domain-like protein)을 검출하는 단계;를 포함하는 피부 세포 괴사성 질환 진단에 대한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 RIP3-MLKL 경로 차단제는 피부 세포 괴사성 질환에서 과발현되는 RIP3를 직접 억제하거나, 이로부터 연속적으로 유도되는 MLKL의 인산화 및 원형질막으로의 이동을 억제함으로서 괴사성 피부 세포 사멸을 효과적으로 방지할 수 있으므로, 괴사성 세포 사멸이 나타나는 다양한 피부 세포 괴사성 질환을 예방 또는 치료하는 효과가 우수하다.
도 1은 TEN 환자 피부의 임상적 관찰(a), TEN 환자와 정상 환자의 각종 인자들의 발현 및 CRP와 RIP3와 발현 관계(b), RIP3의 발현 정도의 차이를 면역조직화학 분석법으로 분석한 결과(c,d) 및 하류 작용기 MLKL 의 수준을 확인한 결과(e)를 나타낸 도이다.
((b)에서, HR: 심장박동수, BUN: 혈액요소질소(Blood urea nitrogen), BSA: 체표면적, ESR: 적혈구침강속도(erythrocyte sedimentation rate), CRP: C-반응 단백질, PA/EA: 측정된 피부 상피 면적 당 색소화된 부위)
도 2의 a는 MEF 세포에서 RIP3 또는 RIP1의 넉아웃 및 CHX, TC, TCZ 처리에 의한 세포 생존률을 확인한 결과를 나타낸 도이며, b는 HDF 및 HaCaT 세포에서 RIP3 넉다운(shRIP3) 및 TCZ, TSZ, CHX 처리에 의한 세포 사멸 억제 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
(CHX: 시클로헥사마이드, TCZ: TNF-알파 +시클로헥사마이드+ zVAD, TSZ: TNF알파 + SMAC 유사체 + zVAD)
도 3은 HaCaT 및 HEKn 세포에서 SNP 처리에 따른 세포괴사성 사멸(a)과 MAPK 인산화 변화(b)를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 HaCaT 세포에서 SNP, 네크로스타틴-1(Nec-1) 및 zVAD 처리에 의한 세포 사멸 억제 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 HEKn 세포에서 SNP, 네크로스타틴-1(Nec-1), zVAD, TSZ, 다브라페닙(dabrafenib) 및 네크로술폰아미드(necrosulfonamide; NSA) 처리에 따른 세포 사멸 억제 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 RIP3 를 넉다운 시킨 shRIP3 HaCaT(a), HEKn(b)에서 SNP를 처리한 후, 세포 사멸 억제 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 RIP3 를 넉다운시킨 shRIP3 HaCaT(a), HEKn(b)에서 SNP를 처리한 후, SNP 유도된 스트레스 키나아제의 활성 억제 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 RIP3 과발현 HaCaT 및 HEKn 세포를 확인하고(a), SNP 처리에 따른 SNP 민감도를 확인한 결과(b)를 나타낸 도이다.
도 9는 RIP3 과발현 HaCaT 세포에서 SNP 유도된 스트레스 키나아제 활성 촉진 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 RIP3 과발현 HaCaT 세포에서 SNP 유도된 ROS 생성 촉진 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다(ROS: 활성산소종).
도 11의 a는 N-아세틸 시스테인(NAC) 전처리 및 Nec-1 처리에 따른 SNP 유도된 세포 사멸 억제 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이며, b는 SNP 유도된 세포사멸이 JNK 억제제인 SP420119(SP), p38 억제제인 sB202190(SB) 처리와 ERK 상류인 MEK 억제제 PD98059(PD) 에 의해 억제되었음을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 12는 HEKn 세포에서 SNP 처리에 따른 MLKL의 인산화 및 p-MLKL의 원형질막으로의 위치이동을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 13의 (a)는 RIP3 넉다운 세포 shRIP3 HEKn에서의 SNP 처리에 따른 MLKL 인산화 억제 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이며, (b)는 RIP3 과발현 세포에서 MLKL의 인산화 및 SNP 추가 처리에 의한 MLKL 인산화 촉진 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 14는 초기 단계에 처리된 SNP에 의한 p-MLKL의 위치를 면역염색을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 15는 RIP3 과발현된 HaCaT 및 HEKn 세포에서 항체를 이용한 형광 분석을 통해 p-MLKL 및 RIP3 위치를 분석한 결과를 나타내 도이다.
도 16은 TEN 환자의 피부에서 관찰되는 p-MLKL의 증가 양상을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 17은 다브라페닙 처리에 의한 RIP3 과발현 HaCaT 세포에서의 MLKL의 기저인산화 억제 및 SNP에 의해 유도되는 p-MLKL 억제 효과(a) 및 세포 사멸 억제 효과(b)를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 18은 RIP3-MLKL 경로 및 이의 차단에 의한 괴사성 세포 사멸 억제 기작을 나타낸 도이다.
본 발명은 RIP3 (Receptor-interacting protein kinase-3)-MLKL(mixed lineage kinase domain-like protein) 경로 차단제를 포함하는 피부 세포 괴사성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 RIP3-MLKL 경로 차단제는 피부 세포 괴사성 질환에서 과발현되는 RIP3를 직접 억제하거나, 이로부터 연속적으로 유도되는 MLKL의 인산화 및 원형질막으로의 이동을 억제함으로서 괴사성 세포 사멸을 효과적으로 방지할 수 있으므로, 괴사성 세포 사멸이 나타나는 다양한 피부 세포 괴사성 질환을 예방 또는 치료하는 효과가 우수하다.
상기 "RIP3-MLKL 경로 차단제"란 Receptor-interacting protein kinase-3 (이하, RIP3)와 mixed lineage kinase domain-like protein (이하, MLKL)로 이어지는 신호 전달 경로를 차단하는 물질을 말하며, 결과적으로 이를 통해 예정된 세포 괴사(programmed necrosis), 즉 네크롭토시스(Necroptosis)를 차단 또는 억제, 경감 시킬 수 있는 물질을 말한다. RIP3는 특정 조건하의 각질세포 내 염증 및 자발적 세포 사멸 그리고 괴사에 있어 중요한 역할을 하는 세포성 기전의 중요 구성부이다. 이와 같은 RIP3의 중요한 하위 경로, 즉 RIP3의 하류가 MLKL이며, 이는 TEN 의 피부 병변에서 정상 피부와 비교하여 뚜렷한 차이가 관찰되지 않으나, MLKL의 인산화는 정상 피부와 달리 증가되어 있다.
상기 경로 차단제는 RIP3의 인산화 차단, 인산화된 RIP3에 의한 MLKL의 인산화 차단, 인산화된 MLKL의 세포 형질막(plasma membrane)으로의 이동 차단, RIP3-MLKL로부터 유발되는 활성산소종(ROS)의 차단, ROS로부터 비롯되는 JNK 및 p38 활성화의 차단과 같은, RIP3와 MLKL이 관여하여 발생되는 세포 예정 괴사와 관련된 모든 경로를 차단하는 물질을 제한 없이 포함할 수 있다.
바람직하게 상기 RIP3-MLKL 경로 차단제는 RIP3 억제제, MLKL 억제제일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 상기 억제제는 RIP3 또는 MLKL의 활성을 촉진하는 단백질 또는 RIP3 또는 MLKL에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 모방체, 기질 유사체, 앱타머 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 활성 억제제 또는, RIP3 또는 MLKL 발현을 촉진하는 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, siRNA, shRNA 및 리보자임으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종으로, RIP3 또는 MLKL의 유전자 발현을 억제할 수 있는 물질을 포함할 수 있고, 더더욱 바람직하게는 RIP3 억제제가 RIP3 넉다운(knock down) 물질, 예컨대 네크로스타틴 1이며, MLKL 억제제는 네크로술폰아미드(Necrosulfonamide)이다.
본 발명에 따른 RIP3-MLKL 경로 차단제는 RIP3-MLKL 경로를 차단하는 효과를 우수하게 나타냄으로써, 피부 세포 괴사성 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 "피부 세포 괴사성 질환"은 세포 자멸사(apoptosis)와 구별되는 세포의 죽음에 의하여 발생하는 피부 질환을 말한다. 예정된 세포 괴사(programmed necrosis)는 사멸 수용체 리간드(death receptor ligand) 및 다른 세포성 스트레스에 의한 반응으로 활성화된다. 예정된 또는 조절된 세포의 괴사에 의한 죽음은 세포의 죽음에 카스파아제가 관여하지 않고 세포막의 투과율을 높이고 세포의 용출(lysis)에 의한 파괴를 유도한다는 점에서 세포 자멸사와 구별된다.
예정된 세포 괴사 경로는 네크로좀(necrosome) 또는 리팝토좀(Ripoptisome)을 형성하는 것을 포함하고, 이는 RIPK3(receptor-interacting protein kinases RIP3) 및 RIPK1을 함유하며, MLKL의 소환을 포함한다. RIP3 의존적 인산화 및 MLKL의 원형질막 위치는 세포 괴사에 필수적이며, 피부 세포괴사성 질환을 유도한다.
이하 본 발명의 명세서에서 사용되는 세포 사멸은 세포 괴사에 의하여 유발되는 세포의 죽음을 의미하는 것이 바람직하나, 광범위하게는 세포 사멸(apoptosis)에 의해 유발되는 세포의 죽음까지도 포함할 수 있다.
상기 피부 세포 괴사성 질환은 약물-유도성 세포괴사, 화상, 동상, 다형 홍반, 세균 또는 바이러스 감염에 의한 피부질환, 급성 두창 태선모양 잔비늘증, 홍반루푸스 및 편평태선으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상 일수 있으며, 보다 구체적으로 상기 약물-유도성 세포괴사는 약물발진, 스티븐스-존슨증후군/독성표피괴사융해증 (SJS/TEN), 피부 혈관염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종일 수 있다.
따라서 본 발명은, 피부 세포 괴사성 질환이 약물-유도성 세포괴사, 화상, 동상, 다형 홍반, 세균 또는 바이러스 감염에 의한 피부질환,급성 두창 태선모양 잔비늘증, 홍반루푸스 및 편평태선으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 피부 세포 괴사성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 "약물-유도성 세포괴사"란, 널리 처방되고 사용되는 약물에 의하여 나타나는 질병으로, 과량 또는 잘못 사용된 물질, 약물의 투여, 또는 적절히 투여된 올바른 물질, 약물에 의한 투여에 의하여 발생하는 다양한 원인에 의한 세포 괴사를 말한다. 이와 같이 약물 유도성 세포 괴사에 의해 발생할 수 있는 질병은 이에 제한되는 것은 아니나 약물발진, 스티븐스-존슨증후군/독성표피괴사융해증 (SJS/TEN), 피부 혈관염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종일 수 있다.
따라서 본 발명은 상기 약물-유도성 세포괴사가 약물발진, 스티븐스-존슨증후군/독성표피괴사융해증 (SJS/TEN), 피부 혈관염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종인, 피부 세포 괴사성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 스티븐스-존스 증후군/독성표피괴사융해증(SJS/TEN)이란, 초기에 얼굴, 목, 턱 등에 반점 발진이 생기고 이후 전신적으로 홍반, 괴사, 물집이 발생하는 질병으로 대부분 약물에 의해 발생하고 급성으로 나타나는 심한 피부 점막 반응을 수반한다. 전체 체표면적에 10%이하를 침범하면 SJS, 30%이상을 침범하면 TEN으로 분류한다.
이와 같은 스티븐스-존스 증후군/독성표피괴사융해증(SJS/TEN)는 대부분 약물이 주요 원인으로 알려져 있고, 대표적으로 항생제인 sulfonamide, cotrimoxazole, ampicillin, macrolide, 항경련제인 phenytoin, carbamazepine, Phenobarbital, lamotrigine, 진통소염제의 일종인 oxicam, 요산억제제인 allopurinol 이 원인이 될 수 있다.
또한 본 발명의 상기 RIP3-MLKL 경로 차단제는 피부 세포 괴사 및 관련 질환의 예방 또는 치료에 사용할 수 있는 물질과 병용 투여될 수 있다.
피부 세포 괴사 및 관련 질환의 예방 또는 치료에 사용할 수 있는 물질은 예컨대, 항암제, 항 바이러스제, 항생제, 항염증제, 항응혈제, 지질 개선제, 세포사 억제제, 항고혈압제, 당뇨/비만 치료제, 심혈관 질환 치료제, 퇴행성 신경질환 치료제, 항노화제, 및 대사성 질환 치료제로 구성된 그룹에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
특히 본 발명은 zVAD 또는 시클로헥사마이드(cycloheximide), SMAC(second mitochondrial derived activator of caspases)유사체를 더 포함하는 세포 괴사성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한 본 발명의 약학적 조성물은 세포 괴사성 질환 또는 세포 자멸사에 의하여 발생할 수 있는 피부 질환을 예방 또는 치료하기 위해 사용할 수 있는 추가적인 성분을 포함하여 함께, 동시에, 순차적으로 사용할 수 있다.
또한 본 발명은 다브라페닙(Dabrafenib)을 포함하는 스티븐스-존슨증후군/독성표피괴사융해증(SJS/TEN) 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 다브라페닙은 항암제로 알려져 있는 물질이나, RIP3-MLKL 경로에 있어서 RIP3의 키나아제 활성을 억제할 수 있는 RIP3 억제제로 RIP-3 매개된 MLKL 인산화를 억제할 수 있어 피부 세포 괴사를 효과적으로 억제할 수 있다.
본 발명의 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약학적 조성물에 포함되며 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일, 식염수, PBS(phosphate buffered saline) 또는 배지 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 바람직하게는 경구 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.
또한 본 발명은 RIP3-MLKL 경로 차단제를 대상에 투여하는 단계;를 포함하는 세포 괴사성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 대상은 인간을 포함한 포유류인 것이 바람직하며, 피부 세포 괴사성 질환을 앓고 있거나, 앓았거나, 앓을 가능성이 있는 잠재적인 환자군도 모두 제한 없이 포함할 수 있다. 상기 RIP3-MLKL 경로 차단제는 대상에게 약학적으로 유효한 양으로 전달될 수 있다.
또한 본 발명은 인산화된 MLKL(mixed lineage kinase domain-like protein)를 검출하는 단계;를 포함하는 피부 세포 괴사성 질환 진단에 대한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
피부 세포 괴사성 질환이 발병한 환자에서는 MLKL의 양은 증가되지 않으나, 이의 상류 조절자인 RIP3의 증가에 의하여 MLKL의 인산화가 강력하게 유도될 수 있다. 따라서 진단 시료에서 인산화된 MLKL의 인산화를 검출하면 대상 환자가 피부 세포 괴사성 질환 인지 아닌지에 대한 정보를 보다 신속하고 효과적으로 제공할 수 있다.
상기 인산화된 MLKL의 검출은 대상 물질의 인산화 정도를 확인할 수 있는 당 분야에 의하여 공지된 기술을 통해 제한 없이 실시할 수 있으며, 정상 수준의 인산화 MLKL과의 비교를 통해 검출 시료가 피부 세포 괴사성 질환 환자인지 아닌지를 판단할 수 있다.
이하, 본 발명을 제조예 및 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 제조예 및 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 제조예 및 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
면역조직화학 및 이미지 분석
10명의 독성표피괴사융해(이하, TEN) 환자로부터 피부 생검 시료 3mm를 수득하였으며 대조군으로 색소성 질환의 진단을 위하여 피부 생검을 수행한 환자 5명으로부터 정상 피부 조직을 얻었다. 3-마이크로미터 두께의 파라핀에 침지시킨 조직 섹션은 광학 현미경을 통해 분석하였다. 면역조직화학분석은 RIP3, MLKL, p-MLKL에 대한 일차 항체를 이용하여 당 분야의 표준 방법에 의하여 수행하였다. 면역조직화학의 양적인 분석은 Image Pro Plus, Version 4.5에 의해 수행하였다. 측정된 상피 부위에 대한 색소화된 부위, PA/EA는 정상 피부 및 TEN 피부 병변에서 측정하였다.
세포 배양
모든 세포는 37℃, 5% 이산화탄소 대기하의 일차 인간 피부 섬유아세포에서 배양하였다. 섬유아세포 및 HaCaT 세포는 10% FBS, 2mM 글루타민, 100U/ml 페니실린 및 100㎍/㎖ 스트렙토마이신이 보충된 DMEM에서 배양하였다. 일차 정상 인간 KC는 당 분야에 공지된 방법을 통해 배양하였으며, 피부 표본은 반복 Caesarean section deliveries로부터 얻었으며 인간 각질세포 성장 보충물과 함께 Epilife 배지에서 성장시켰다. 3-10 계대의 세포를 실험에 사용하였다. 인간 신생아 상피 각질세포(Human neonatal epidermal keratinocyte; 이하 HEKn)은 Gibco로부터 얻었고 제조사의 방법에 따라 유지시키고, 이하 실험에 사용하였다.
통계 처리
각 실험은 적어도 3회 반복하여 수행하였으며, 통계적 유의성은 Mann-Whitney U test (nonparametric)를 이용한 paired 분석에 의하여 평가하였다. 데이터값은 평균±표준편차로 나타내었고 통계적 유의성의 p<0.05로 하였다.
실시예 1. TEN 병변에서 증가된 RIP3 발현 확인
뚜렷한 상피 각질 세포 사멸을 나타내는 TEN 환자로부터 얻은 피부 조직에서 RIP3 단백질의 발현의 증가여부를 확인하였다. TEN 환자에 대한 실험은 IRB MED-KSP-13-029에 의해 승인받았다. 사용된 TEN 환자의 피부 상태 이미지 및 10명의 TEN 환자에서 관찰된 피부의 임상적이고 실험적인 관찰 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타낸 바와 같이, TEN 환자의 피부에서는 수포 및 상피 세포의 탈락, 다발성 홍반이 확인(a)되었으며, C-반응 단백질(CRP; C-reactive protein) 수준은 염증에 의하여 급격하게 증가하였음을 확인하였다. 또한 이와 같은 CRP 수준은 IHC에 의해 측정된 TEN 환자의 피부 병변에서 발현되는 RIP3와 양의 상관관계를 갖는 것(b)으로 나타났다. TEN 환자 및 정상 피부에서 RIP3의 발현 및 피부 병변을 면역조직화학 염색 및 H&E 염색을 이용하여 비교하였다. TEN 환자의 피부에서는 호산성 상피 괴사 및 dermo-epidermal junction의 분리를 갖는 TEN 피부 병변이 관찰되었으나, TEN에 의한 피부 병변을 나타내지 않는 정상세포의 경우 이상 소견이 관찰되지 않았다(d). 정상 세포와 비교하였을 때 상대적인 IHC 섹션은 TEN 환자의 피부에서 RIP3 발현 수준이 뚜렷하게 증가하였음을 보여주었으며, 이러한 상피 부분에서의 RIP3 발현(PA/EA)의 증가를 이미지 분석 프로그램을 통해 정량화한 결과 TEN 환자의 피부에서 정상 피부와 비교하여 현저하게 증가된 것을 다시 한번 확인하였다(c와 d). RIP3와 달리 하류 작용기(effector)인 MLKL은 정상 피부와 비교하여 TEN 피부에서 통계적인 차이를 나타내지 않았다(e).
이와 같은 결과를 통해 정상 피부와 비교하여 TEN 환자의 피부에서는 RIP3가 과발현되어 있으며, 계획된 세포괴사의 중요한 조절자로 RIP3가 타깃이 될 수 있음을 확인하였다.
실시예 2. 계획된 세포괴사와 RIP3 관련성 확인
실시예 1을 통해 세포 괴사를 나타내는 TEN 환자에서 RIP3의 과발현이 중요한 타깃이 될 수 있음을 확인하였으므로, RIP3를 발현하는 일차 멜라닌 세포(melanocyte), 섬유아세포(fibroblast), 각질세포(keratinocyte)와 같은 다양한 피부 세포 유형에서도 계획된 세포 괴사(programmed necrosis)를 나타낼 수 있는지 여부를 확인하였다.
불멸 인간 각질세포주인 HaCaT 및 신생아 포피로부터 분리된 일차 인간 상피 각질세포(HEKn)가 TNFα(TNFα+zVAD+시클로헥사마이드 또는 SMAC 유사체; 본원에서 TCZ 또는 TSZ로도 언급됨)에 의해 유도된 원형의 계획된 세포 괴사성 자극에 반응하였다. zVAD에 의한 카스파아제 활성의 억제는 카스파아제-3 및 PARP 단계를 완벽하게 차단하였으나, TNF-유도된 세포 사멸을 완벽하게 차단하지 못하는 것으로 나타났으며, 이러한 결과는 RIP3-발현 각질세포가 카스파아제 활성에 의한 세포자멸사(apoptosis)에 의한 것이 아니라 원형의 계획된 세포괴사에 의한 사멸(prototypical programmed necrosis)을 나타내는 것이라는 것을 보여준다. 이러한 결과는 계획된 세포 괴사 연구를 위한 표준 모델인 HT-29 세포주에서 확인된 결과와 유사하다. 추가적으로 RIP3와 RIP1이 TNF 유도된 괴사성 사멸에 영향을 미치는지 여부를 넉아웃 모델을 통해 확인하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2의 (a)에 나타낸 바와 같이, RIP3 및 RIP1 넉아웃 MEF 세포는 TNF 유도된 괴사성 세포 사멸 조건에 저항성이 있었으며, 이는 계획된 세포 괴사에서 이들 단백질의 역할과 일치한다.
또한 도 2의 (b)에 나타낸 바와 같이, RIP3 넉다운인 shRIP3 실험군에서는 인간 피부 섬유아세포 (human dermal fibroblast)에서의 TNF-유도된 괴사성 세포 사멸이 효과적으로 감소하였으며, 이러한 결과는 특히 RIP3가 피부 세포의 계획된 세포 괴사와 중요한 관련이 있음을 나타내는 것이다.
실시예 3. RIP3 억제제에 의한 세포 괴사 억제 효과
TEN 환자의 병변 피부는 높은 수준의 iNOS를 나타내는 특징이 있으며, NO 생산과 관련이 있는 것으로 알려져 있다. NO 수여 모델 시약인 SNP(sodium nitroprusside)는 RIP3 발현(또는 TNFα)을 유도하지 않으므로 TEN에서의 RIP3의 유도는 NO 생산과 독립적으로 이의 상류 단계에서 나타나는 것으로 예상된다. SNP와 TEN에서 관찰되는 RIP3와의 관련성을 확인하기 위하여, RIP3를 발현하는 HaCaT 세포와 HEKn 세포에 SNP를 0 내지 5mM로 24시간 동안 처리하고 세포 생존률과 관련 인자들의 인산화를 MTT 에세이와 웨스턴 블랏을 통해 확인하였다.
도 3에 나타낸 바와 같이 SNP 처리는 두 개 세포 모두에서 용량의존적인 세포 괴사성 사멸을 유도(a)하였으며, 처리 시간에 따라 MAPK의 인산화를 유도(b)하였다.
그러나 앞서 실시예 2에서 확인한 결과와 유사하게 판카스파아제(pan-caspase) 억제제인 zVAD는 SNP 유도된 세포 사멸에 영향을 크게 미치지 않는 것으로 나타났고, TNF/시클로헥사마이드(CHX) 및 SNP 에 의해 유도된 카스파아제-3 및 PARP 절단은 완전히 차단하였다.
SNP 유도된 세포 사멸이 RIP1 및 네크로스타틴-1(necrostatin-1; 이하 Nec-1) 및 zVAD 및 Nec-1의 복합 처리에 의하여 개선될 수 있는지 여부를 HaCaT 세포에서 MTT 분석 및 위상차 현미경을 통해 확인하였다. 세포는 80μM의 Nec-1 또는/및 20μM의 zVAD로 1시간 동안 전처리되었으며, 그 이후 SNP를 처리하였다. 이 후 세포 생존률을 확인한 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, SNP 유도된 세포 사멸은 Nec-1 및 zVAD의 전 처리에 의하여 감소하였으며, zVAD 단독보다 이를 Nec-1와 조합하여 처리한 실험군에서 SNP 유도된 세포 사멸이 더욱 뚜렷하게 억제되는 것을 확인하였다. 위상차 현미경 및 아넥신-V 염색 결과는 SNP 유도된 세포 사멸이 Nec-1과 같은 화합물들의 처리에 의하여 억제될 수 있다는 것을 보여주었다.
이러한 결과를 토대로 RIP3 키나아제 활성 억제제인 다브라페닙(dabrafenib)과 RIP3 인산화 하류 MLKL 기능을 억제하는 네크로술폰아미드(necrosulfonamide; 이하 NSA)의 세포 괴사 억제 효과를 추가적으로 확인하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, Nec-1, 다브라페닙 및 NSA의 처리는 모두 zVAD 보다 급성 SNP 세포 독성으로부터 HEKn 세포를 더욱 효과적으로 보호하는 것으로 나타났다. 이와 같은 결과는 SNP 유도된 세포 사멸이 판-카스파아제 억제제인 zVAD에 의해서는 부분적으로만 억제되나, RIP3 를 타깃으로 하는 Nec-1, 다브라페닙, NSA에 의해서 더욱 효과적으로 억제될 수 있다는 것을 나타낸다. 즉 TEN 환자에서의 세포 괴사는 TNF 유도된 세포 사멸을 억제하는 zVAD와 같은 기전으로 완벽하게 억제되지 않으나, RIP3 를 타깃으로 억제하는 하는 경우, TEN 환자의 세포 괴사가 효과적으로 억제된다는 것을 확인하였다.
실시예 4. RIP3 넉다운에 의한 SNP 유도 세포 사멸 억제 효과 확인
RIP3와 SNP 유도된 세포 사멸과의 관계를 추가적으로 확인하기 위하여, RIP3를 넉다운시켜 SNP 세포 사멸에 미치는 영향을 확인하였다. RIP3 넉다운은 shRIP3로 표시하였으며, shRIP3를 갖는 HaCaT 세포에 SNP를 24 시간 동안 처리하고 세포 생존률을 위상차 현미경과 MTT 분석을 통해 확인하였다. 또한 shRIP3를 갖는 HEKn 세포를 SNP 또는 TSZ로 24시간 동안 처리하고 동일한 분석을 수행하였으며, SNP 처리된 시간에 따라 세포로부터 수득한 용해물을 웨스턴 블랏으로 분석하였다. 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이, HaCaT, HEKn에서 RIP3를 넉다운시킨 shRIP3 실험군은 RIP3가 발현되지 않았으며, RIP3를 정상적으로 발현하는 세포와 비교하여 SNP 처리에 의해 유도된 세포 사멸이 모든 SNP 처리 농도에서 유의적으로 억제되었다.
스트레스 키나아제 JNK 및 p38의 지속적인 활성화는 종종 계획된 세포 괴사와 관련이 있는 것으로 여겨지고 있으며 이는 일부 세포 유형에서 세포 사멸에 필수적인 것으로 알려져 있다. 이와 관련하여 RIP3 넉다운 세포에서도 SNP 유도된 JNK 및 p38 활성화가 억제되어 세포 괴사를 억제할 수 있는지 여부를 확인하기 위하여 SNP로 처리된 세포의 용해물을 시간에 따라 웨스턴 블랏으로 분석하여 RIP3 넉다운 세포에서 p-JNK 및 p-38, p-ERK 의 발현 변화를 확인하였다. 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타낸 바와 같이, SNP 유도된 JNK 및 p38 활성화는 RIP3 넉다운 세포 shRIP3에서 뚜렷하게 억제되었다. 이와 같은 결과를 통해 RIP3-MLKL 경로의 억제를 통해 JNK 및 p38와 같은 스트레스 키나아제의 활성화를 억제시켜 세포 괴사를 억제할 수 있음을 확인하였다.
실시예 5. RIP3 과발현과 SNP 유도된 세포 사멸의 관계 확인
TEN 환자에서는 RIP3이 과발현되어 있으므로, 과발현된 RIP3의 기능을 확인하기 위하여 HaCaT 및 HEKn 세포에서의 RIP3를 이소성(ectopically)으로 발현시킨 후 이에 따른 세포의 SNP에 대한 민감성을 확인하였다. 이소성 RIP3 발현을 유도하기 위하여 HaCaT 세포 또는 HEKn 세포를 pLX303-hRIP 렌티바이러스 플라스미드로 감염시켰으며, 이의 3-6 계대 세포를 이후 실험에 사용하였다. 보다 구체적으로 hRIP3 mRNA (NM_006871)를 타깃으로 하는 short-hairpin RNA(shRNA) 플라스미드를 시그마-알드리치로부터 구입하여 사용하였으며, 렌티바이러스 플라스미드를 이용하여 293TN 세포로 감염시켰다. 감염 2일 후 슈도바이러스성 입자를 수집하고 이를 10㎍/mL 폴리브렌과 함께 세포로 감염시켰다. 감염된 세포는 감열 2일 후 퓨로마이신으로 선별하였다. 이와 같이 pLX303-hRIP 렌티바이러스 플라스미드를 이용하여 감염된 HaCaT 및 HEKn 세포가 RIP3를 안정적으로 과발현하는 지 여부를 웨스턴 블랏 및 면역조직화학법으로 확인하였으며 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타낸 바와 같이, 감염된 세포들은 모두 미처리된 세포와 비교하여 RIP3를 과발현하고 있는 것이 확인되었으며(a), SNP 5mM을 6시간 처리한 이후, RIP3를 과발현하는 세포는 SNP에 더 민감도가 높은 것을 Calcein/EthD-1 live/death 분석을 통해 확인하였다(b). 이와 같은 결과는 과발현 RIP3가 SNP 민감도를 증가시키는데 중요한 역할을 한다는 것을 나타낸다. SNP는 TEN 환자에서 계획된 세포 괴사를 유도하므로, RIP3 과발현은 괴사성 자극인 SNP에 대한 민감도를 증가시켜 세포 괴사 진행을 강화시키는 역할을 하는 것을 확인하였다.
지속된 JNK 활성과 활성 산소종(ROS) 유도는 괴사성 세포 사멸과 관련이 있는 것으로 알려져 있으므로 SNP에 의한 JNK 및 p38의 활성화가 RIP3 과발현에 의하여 촉진되는 지 여부를, SNP 5mM을 0 내지 7시간 동안 세포에 처리하고 p-JNK 및 p-p38의 웨스턴 블랏을 통해 확인하고 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타낸 바와 같이, RIP3 과발현은 TNF-알파 유도된 MAP 키나아제 활성화에는 영향을 주지 않는 것으로 확인되었으나, SNP에 의한 JNK 및 p38의 활성화는 RIP3 과발현에 의하여 촉진되었다. ROS가 JNK 활성화를 유도하는 JNK 인산화제를 불활성화 시키므로, SNP 처리에 의한 ROS 생산의 변화를 추가적으로 측정하였다. 세포는 5mM의 SNP로 5시간 동안 처리하였으며, ROS 생산(DCFH-DA)은 FACS 에 의해 측정하고 형광 현미경을 통해 시각화하였다. 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10에 나타낸 바와 같이, ROS 생산은 RIP3를 과발현하는 HaCaT 세포에서 매우 급격하게 증가하였다. 이러한 결과는 높은 RIP3의 발현이 ROS 생산과 관련이 있으며, 이를 촉진시켜 JNK 활성화를 강화시키고 SNP 유도된 세포 괴사를 촉진하는 역할을 할 수 있다는 것을 보여주는 결과이다.
그러나 도 11에 나타낸 바와 같이 ROS 소거능이 있는 N-아세틸시스테인(NAC)로 전처리된 세포는 SNP 유도된 세포 사멸이 Nec-1 처리군과 비슷한 정도로 억제(a)되었고, 이를 통해 ROS가 SNP 유도된 세포사멸과 관련이 있다는 것을 다시 한 번 확인하였다. 또한 SNP 유도된 세포사멸은 각각 JNK, p38 억제제인 SP420119(SP), sB202190(SB) 처리와 ERK 상류인 MEK 억제제인 PD98059(PD) 에 의하여 억제(b)되었다. 이러한 결과를 통해 RIP3의 증가는 ROS 생산의 증가를 유도하고, 이것은 JNK 및 p38을 활성화시킴으로써 궁극적으로 세포의 사멸을 촉진하는 역할을 한다는 것을 확인하였다.
실시예 6. 괴사성 세포 사멸에서 RIP3 및 MLKL 관계 확인
MLKL의 RIP-3 의존적 인산화 및 원형질막으로의 이동은 계획된 괴사성 세포 사멸에 있어서 필수적인 것으로 알려져 있다. 따라서 SNP 처리에 의한 MLKL의 인산화 및 RIP3 발현과의 관계를 확인하기 위한 실험을 수행하였다.
먼저 SNP 처리에 의하여 세포에서 MLKL의 인산화가 유도되는지 확인하기 위하여 HEKn 세포를 SNP로 7시간 동안 처리하고 HEKn 세포의 용해물을 각 시점에서 웨스턴 블랏으로 확인하였다. 또한 6시간 동안 TSZ와 SNP 5mM을 HEKn세포에 처리하고 인산화된 MLKL의 양상을 공초점 면역형광 사진을 이용하여 확인하였으며 결과를 도 12에 나타내었다.
도 12에 나타낸 바와 같이, SNP처리에 따라 p-MLKL이 시간에 따라 증가하는 것을 확인하였으며 SNP 유도된 p-MLKL 의 원형질막으로의 위치이동은 TSZ 처리와 유사한 경향을 나타내는 것을 확인하였다.
이후 높은 RIP3의 발현이 MLKL 활성화와 세포 괴사성 사멸과 관련이 있는지 여부를 확인하기 위하여 shRIP3-HEKn 세포를 5mM의 SNP로 처리한 후 이의 용해물을 웨스턴 블랏을 통해 확인하였다. 또한 부모 세포와 RIP3 과발현 HaCaT/HEKn 세포에서도 RIP3 과발현과 p-MLKL의 관계를 확인하였다. 결과를 도 13에 나타내었다.
도 13에 나타낸 바와 같이, RIP3의 넉다운된 세포에서는 MLKL 인산화가 나타나지 않았으며, 이는 MLKL 인산화가 RIP3 의존적이라는 것을 보여준다(a). 또한 RIP3가 과발현된 세포들에서는 SNP와 같은 추가 자극이 없이도 MLKL의 인산화가 관찰되었고 SNP가 추가적으로 처리된 경우 MLKL의 인산화가 더욱 촉진되는 것을 확인하였다(b). 또한 도 14에 나타낸 바와 같이 3mM SNP를 6시간 동안 초기 단계에 처리하고 p-MLKL을 면역염색을 통해 관찰한 결과 p-MLKL은 세포막으로 이동하기 전 punctate 구조에서 관찰되었으며, 이는 TSZ로 처리한 세포와 유사한 결과였다.
RIP3 과발현된 HEKn 세포를 TSZ와 5mM SNP으로 처리하고 p-MLKL 또는 p-MLKL과 Flag 항체를 염색하여 이의 위치를 확인하였다. 그 결과를 도 15에 나타내었으며, 도 15에 나타낸 바와 같이 SNP로 처리된 RIP3가 과발현된 HaCaT 및 HEKn 세포에서는 p-MLKL이 TSZ 처리와 유사한 패턴으로 이들의 초기 단계의 punctate 바디에 RIP3과 함께 위치하고 있는 것이 확인되었다.
이러한 결과를 통해 TEN 시료에서 MLKL의 증가된 인산화 수준이 계획된 세포 괴사를 활성화시키는 요소가 될 수 있고, RIP3-MLKL 경로가 TEN 병리에 있어서 중요한 역할을 할 수 있다는 것을 확인하였으며, RIP3와 MLKL의 넉다운이 결과적으로 SNP 유도된 괴사성 세포 사멸을 억제할 수 있다는 것을 확인하였다. 즉 SNP는 카스파아제 활성화를 개시할 뿐만아니라, 계획된 세포 사멸을 유도하나, RIP3 또는 MLKL을 타깃으로 하는 차단을 통해 카스파아제 활성화와 무관하게 SNP 유도된 괴사성 피부 세포 사멸을 억제할 수 있음을 알 수 있다.
실시예 7. RIP3-MLKL 경로 억제에 의한 괴사성 세포 사멸 억제 효과 확인
상기 실시예 6을 통해 RIP3-MLKL 경로의 차단을 통해 괴사성 세포 사멸이 억제될 수 있음을 확인하였으므로, 실제 해당 경로를 차단하는 물질을 처리하여 SNP 유도된 괴사성 세포 사멸이 효과적으로 억제될 수 있는지 확인하였다. 구체적으로 Nec-1, 다브라페닙, NSA를 처리하여 괴사성 세포 사멸 억제 효과를 확인하였다.
도 16에 나타낸 바와 같이, TEN 환자의 피부에서는 정상 피부와 달리 MLKL의 증가된 인산화가 검출된다. 따라서 RIP3 억제제가 MLKL의 증가된 인산화를 억제하고 세포 괴사를 억제할 수 있다면, TEN 환자의 치료의 효과적인 타깃이 될 수 있다. 이를 확인하기 위하여, RIP3 과발현 세포에서 다브라페닙에 의한 MLKL 인산화 억제 효과를 도 17에 나타내었다.
도 17에 나타낸 바와 같이, RIP3 과발현 세포에서의 MLKL의 기저인산화 및 SNP에 의해 유도되는 p-MLKL은 RIP3 억제제인 다브라페닙에 의해 제거되었다(a). 이와 같은 효과는 다브라페닙이 SNP에 의해 유도되는 세포의 사멸을 억제할 수 있다는 것을 나타낸다. RIP3 HaCaT 에서의 MLKL의 넉다운은 SNP에 의해 유도되는 세포 사멸 역시 감소시켰으며(b) 이는 MLKL의 활성화가 SNP 매개된 세포 사멸과 관련이 있음을 보여준다. 이와 같은 결과는 RIP3 억제제가 TEN 환자에서 이상 증가되어 있는 MLKL의 인산화에 의한 활성화를 효과적으로 억제할 수 있으며 이를 통해 TEN 환자의 세포 괴사, 특히 SNP에 의해 유도된 세포 괴사를 억제할 수 있다는 것을 보여준다.
상기 확인한 바와 같이, 괴사성 세포 사멸은 RIP3-MLKL 의 복합적인 경로를 차단함으로써 효과적으로 억제될 수 있으며, 이와 같은 경로 차단은 RIP3의 인산화를 차단 또는 억제하거나 MLKL 인산화를 억제하여 이루어질 수 있다. 이와 같은 RIP3-MLKL 경로 차단은 괴사성 피부 세포 사멸 억제를 통해 피부 세포 괴사성 질환을 효과적을 예방 또는 치료할 수 있으며, 관련 RIP3-MLKL 경로에 대한 모식도를 도 18에 나타내었다.

Claims (11)

  1. 다브라페닙, 네크로스타틴-1 및 네크로술폰아미드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 RIP3(Receptor-interacting protein kinase-3)-MLKL(mixed lineage kinase domain-like protein) 경로 차단제를 포함하는, 독성표피괴사융해증(TEN), 스티븐스-존슨증후군(SJS), 화상, 동상, 다형 홍반, 세균 또는 바이러스 감염에 의한 피부질환, 금성두창태선모양잔비늘증, 홍반루푸스, 편평태선, 약물 발진 및 피부 혈관염으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 피부 세포 괴사성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 RIP3-MLKL 경로 차단제는 RIP-3 억제제 또는 MLKL 억제제인 것을 특징으로 하는, 피부 세포 괴사성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 네크로스타틴-1(necrostatin-1)은 RIP3 인산화 억제제인 것을 특징으로 하는, 피부 세포 괴사성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 네크로술폰아미드(necrosulfonamide)는 MLKL 억제제인 것을 특징으로 하는, 피부 세포 괴사성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서, Z-VAD-FMK(Z-Val-Ala-Asp(OMe)-fluoromet hylketone), 시클로헥사마이드(cycloheximide) 및 SMAC(second mitochondrial derived activator of caspases) 유사체(mimetic)로 이루어진 군에서 선택된 1 종을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 피부 세포 괴사성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 다브라페닙(dabrafenib)을 포함하는 독성표피괴사융해증(TEN), 스티븐스-존슨증후군(SJS), 화상, 동상, 다형 홍반, 세균 또는 바이러스 감염에 의한 피부질환, 금성두창태선모양잔비늘증, 홍반루푸스, 편평태선, 약물 발진 및 피부 혈관염으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 피부 세포 괴사성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 다브라페닙은 RIP3 억제제인, 피부 세포 괴사성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  10. 삭제
  11. 인산화된 MLKL(mixed lineage kinase domain-like protein)를 검출하는 단계;를 포함하는 피부 세포 괴사성 질환 진단에 대한 정보를 제공하는 방법.
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