KR20220002766A - 스타틴에 의한 고혈당 예방용 약학적 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 스타틴에 의한 고혈당을 예방하기 위한 약학적 조성물에 관한 것으로서, 스타틴은 혈중 콜레스테롤 수치를 강하하는 약제로서 가장 많이 사용되나 당뇨병 발병률을 증가시키므로, 본 발명은 시르투인 6(sirtuin 6)의 발현을 활성화(activation)하는 제제로서 microRNA(miR)-495의 발현을 억제하는 제제 또는 FoxO1의 탈아세틸화를 촉진하는 제제를 스타틴과 병용 투여하여 스타틴에 의한 고혈당을 예방하는 바, 스타틴을 복용해야 하는 심혈관질환 환자들에게 적절한 치료가 가능하게 한다.

Description

스타틴에 의한 고혈당 예방용 약학적 조성물{Composition for preventing of hyperglycemia by statin}
본 발명은 시르투인 6(Sirt 6)의 발현을 활성화하는 제제를 유효성분으로 포함하는 스타틴에 의한 고혈당 예방용 약학적 조성물에 대한 것이다.
스타틴(statin)은 HMG-CoA 환원제를 저해함으로써 혈중 콜레스테롤을 낮추고 주요 심혈관질환을 예방하는데 가장 많이 처방되는 약제이다. 스타틴은 일반적으로 안정하고 내약성이 우수한 것으로 알려져 있으나, 근병증(myopathy)과 같은 부작용이 흔하게 발생할 수 있어 약물 요법에 있어 주의가 필요하다. 최근, 스타틴의 부작용 중 하나로 제2형 당뇨병이 새롭게 문제되었으며, 스타틴 유도성 당뇨병(statin induced diabetes)은 화학적 구조와는 관계가 없고 용량의존적인 것으로 보고된다.
스타틴은 다양한 기관에 작용하며 그 중 콜레스테롤이 합성되는 간에 가장 많은 영향을 미친다. 간 포도당신생합성(hepatic gluconeogenesis)은 스타틴 유도성 포도당불내성(glucose intolerance)의 주요한 발병원인이나, 정확한 기전은 아직 연구되지 않았다. 스타틴의 복용 중단은 심혈관질환의 발병률을 증가시키므로 스타틴에 의한 포도당 조절장애(glucose dysregulation)를 예방하고 치료하는 것은 필요하며, 본 발명자들은 스타틴에 의한 고혈당을 예방하기 위한 제제를 개발하였다.
시르투인(sirtuin)은 NAD+-의존성 단백질 탈아세틸화제이며, 노화 관련 질환의 발병을 늦추는 것으로 알려져 있다. 포유류에 존재하는 7개의 시르투인 중 시르투인 6(sirtuin 6, Sirt6)은 수명 연장에 관여하며, 다양한 분자들을 타겟팅함으로써 인슐린 저항성(insulin resistance), 알코올성 및 비알코올성 지방간 질환(alcoholic- and nonalcoholic-fatty liver diseases)을 예방한다.
이에 본 발명자들은 시르투인 6의 발현을 활성화하는 제제가 간에서 FoxO1을 탈아세틸화하여 FoxO1 의존적인 포도당신생합성 유전자(gluconeogenesis gene)의 발현을 저해함으로써 스타틴에 의한 고혈당을 예방하는 효과를 발견하고 본 발명을 완성하였다.
US 10344002
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 스타틴에 의한 고혈당을 예방하기 위한 약학적 조성물로서 시르투인 6(sirtuin 6, Sirt6)의 발현을 활성화(activation)하는 제제를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명은 시르투인 6의 발현을 활성화하는 제제로서 microRNA(miR)-495의 발현을 억제하는 제제를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 miR-495 또는 시르투인 6의 발현 수준을 측정함으로써 스타틴에 의한 고혈당 예방 약물의 스크리닝 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 시르투인 6의 발현을 활성화하는 제제를 유효성분으로 포함하는 스타틴에 의한 고혈당 예방용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물은 스타틴에 의한 고혈당의 예방을 위하여, 스타틴과 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 시르투인 6의 발현을 활성화하는 제제는 miR-495의 발현을 억제하는 제제일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 시르투인 6의 발현을 활성화하는 제제는 FoxO1의 탈아세틸화를 촉진하는 제제일 수 있다.
상기 miR-495의 발현을 억제하는 제제는 siRNA, 앱타머(aptamer), 안티센스 올리고뉴클레오티드(antisense oligonucleotide) 및 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.
상기 시르투인 6의 발현을 활성화하는 제제는 후코이단, MDL-800, MDL-801, MDL-811, CL5D((2-(3-chloro-4-(2,4,6-trichloro-N-(2,4,6-trichlorobenzoyl)benzamido)phenyl)-1,3-dioxoisoindoline-5-carboxylic acid)), SW-055, SW-062으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.
상기 스타틴은 심바스타틴(simvastatin), 아토르바스타틴(atorvastatin), 플루바스타틴(fluvastatin), 로수바스타틴(rosuvastatin), 로바스타틴(lovastatin), 및 프라바스타틴(pravastatin)으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 시르투인 6의 발현을 활성화하는 제제는 간 포도당신생합성 유전자(hepatic gluconeogenesis gene)의 발현을 억제할 수 있다.
상기 간 포도당신생합성 유전자는 Pck1, G6pc, 및 Ppargc1a으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
상기 시르투인 6의 발현을 활성화하는 제제는 비절식 및/또는 절식 상태의 혈당을 감소시킬 수 있다.
상기 시르투인 6의 발현을 활성화하는 제제는 총 FoxO1의 발현을 억제할 수 있다.
상기 시르투인 6의 발현을 활성화하는 제제는 FoxO1의 핵 내 발현을 억제하고 세포질에서 발현 증가를 유도할 수 있다.
상기 시르투인 6의 발현을 활성화하는 제제는 FoxO1의 유비퀴틴화를 증가시켜 프로테아좀을 통한 분해를 촉진할 수 있다.
또 다른 측면에서 본 발명은, 하기 단계를 포함하는 스타틴에 의한 고혈당 예방용 약제의 스크리닝 방법을 제공한다.
(1) 간 세포에 스타틴과 후보물질을 병용 처리하고 시르투인 6의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(2) 시르투인 6의 발현 수준이 증가한 경우 상기 후보물질을 스타틴에 의한 고혈당 예방 약물로 선정하는 단계.
또한 본 발명은, 하기 단계를 포함하는 스타틴에 의한 고혈당 예방용 약제의 스크리닝 방법을 제공한다.
(1) 간 세포에 스타틴과 후보물질을 병용 처리하고 miR-495의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(2) miR-495의 발현 수준이 감소한 경우 상기 후보물질을 스타틴에 의한 고혈당 예방 약물로 선정하는 단계.
본 발명은 스타틴에 의한 고혈당(hyperglycemia)을 비롯한 당뇨병(diabetes), 포도당 조절장애(glucose dysregulation)을 포함한 간 포도당신생합성(gluconeogenesis) 관련 질병을 예방할 수 있다.
본 발명은 스타틴에 의한 고혈당을 예방하기 위한 약학적 조성물에 관한 것으로서, 스타틴은 혈중 콜레스테롤 수치를 강하하는 약제로서 가장 많이 사용되나 당뇨병 발병률을 증가시키므로, 본 발명은 시르투인 6의 발현을 활성화하는 제제로서 miR-495의 발현을 억제하는 제제 또는 FoxO1의 탈아세틸화를 촉진하는 제제를 스타틴과 병용 투여하여 스타틴에 의한 고혈당을 예방하는 바, 스타틴을 복용해야 하는 심혈관질환 환자들에게 적절한 치료가 가능하게 한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 스타틴에 의한 시르투인 6의 발현 감소와 간 포도당신생합성 유전자의 발현 증가를 나타낸 것으로, (A)는 비절식 또는 절식 상태의 마우스에서 심바스타틴을 2회 또는 3회 처리한 후 측정한 혈당을 나타낸 것이다. (B)는 마지막 심바스타틴 투여 3시간 후, 간 조직을 배양하고 qPCR로 분석한 결과를 나타낸 것이다. (C)는 간에서 시르투인의 발현을 웨스턴 블롯팅으로 측정한 결과를 나타낸 것이다. (D) 및 (E)는 마우스로부터 분리한 간세포를 지시된 농도 및 시점에서 심바스타틴으로 처리한 경우, 각각 웨스턴 블롯팅 및 qPCR 분석을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 혈당증 및 시르투인 6 발현에 대한 다양한 스타틴의 효과를 나타낸 것으로, (A)는 비절식 및 절식 상태의 혈당, (B)는 체중 및 간 중량을 나타낸 것이다. (C)는 포도당신생합성 유전자의 mRNA 발현 수준을 qPCR로 분석한 결과를 나타낸 것이다. (D)는 마우스로부터 분리한 간세포를 지시된 시점에 로수바스타틴 또는 아토르바스타틴으로 처리하고, 시르투인 6 발현을 웨스턴 블롯팅으로 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 시르투인 6 과발현에 따른 심바스타틴에 의한 간 포도당신생합성의 유도 약화를 나타낸 것이다. (A)는 마우스 꼬리 정맥으로부터 측정한 비절식 또는 절식 상태의 혈당을 나타낸 것이다. (B)는 6시간 금식 후 심바스타틴을 처리한 마우스의 간에서 간 G6Pase-루시퍼레이스 활성 측정을 통한 포도당신생합성을 나타낸 것이다. (C)는 (A)의 마우스에서 포도당신생합성 유전자의 mRNA 발현 수준을 나타낸 것이다. (D)는 마우스로부터 분리한 간세포에 Ad-LacZ(대조군), Ad-Sirt6(시르투인 6 아데노바이러스), 또는 Ad-mSirt6(탈아세틸화 효소 활성이 없는 시르투인 6 아데노바이러스)로 형질감염시키고, 6시간동안 심바스타틴 처리한 경우 포도당 생산 능력을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 심바스타틴 처리 후 마우스로부터 분리한 간세포에서 포도당신생합성 유전자의 발현을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 마우스에 아토르바스타틴 또는 로수바스타틴 투여 후 (A) 비절식 및 절식 상태의 혈당 및 (B) 간 포도당신생합성 유전자의 mRNA 발현 수준을 qPCR 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 스타틴에 의한 miR-495 유도 및 miR-495의 시르투인 6 억제 효과를 나타낸 것으로, (A)는 심바스타틴 처리 후 시르투인 6의 mRNA 발현 수준을 qPCR로 분석한 결과를 나타낸 것이다. (B)는 심바스타틴, 로수바스타틴, 및 아토르바스타틴 처리 시 영향을 받은 miRNA를 벤 다이어그램으로 나타낸 것이다. (C)는 마우스 간세포주인 AML12 세포에 대조군 또는 miR-495 모방체를 형질감염한 경우, (D)는 AML12 세포에 대조군 또는 miR-495 안티센스 올리고뉴클레오티드(antisense oligonucleotide)를 형질감염한 후 심바스타틴에 노출한 경우 시르투인 6 및 miR-495 발현 수준을 나타낸 것이다. (E)는 (D)와 같이 형질감염된 AML12 세포에서 포도당신생합성 유전자의 발현 수준을 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 시르투인 6를 타겟팅하는 miRNA를 선별하기 위한 것으로서, (A)는 심바스타틴 처리 후 시르투인 6의 mRNA 발현 수준을, (B)는 AML12 세포에 심바스타틴, 로수바스타틴, 또는 아토르바스타틴을 24시간 동안 처리하고, 시르투인 6를 표적하는 것으로 예측되는 miRNA의 발현 수준을 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 인간 간암 세포(HepG2)에서 심바스타틴에 의한 miR-495, 시르투인 6, 및 FoxO1의 발현 수준을 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 miR-495 조절에 의한 시르투인 6의 발현 수준을 나타낸 것으로서, (A)는 대조군 또는 miR-495 모방체로 형질감염된 AML12 세포, (B)는 대조군 또는 miR-495 안티센스 올리고뉴클레오티드로 형질감염된 후 심바스타틴으로 처리된 세포에서 수행된 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 심바스타틴에 의한 FoxO1의 상향 조절을 나타낸 것으로, (A)는 miR-495에 의해 표적화된 KEGG 경로 분석한 결과를 나타낸 것이다. (B) 및 (C)는 마우스 1차 간세포를 심바스타틴 처리한 채 배양한 경우, 전체 용해물, 세포질, 및 핵 추출물에서의 FoxO1 발현 수준을 나타낸 것이다. (D)는 시르투인 6 아데노 바이러스에 감염된 후 심바스타틴으로 처리된 마우스로부터 얻은 간에서 FoxO1에 대한 면역 블롯으로서, 아세틸화된 H3K9(Ac-H3K9)를 시르투인 6 활성의 지표로서 측정한 결과를 나타낸 것이다. (E)는 AML12 세포에서 전체 및 아세틸화된 FoxO1 발현에 미치는 miR-495 모방체의 영향을 나타낸 것이다. (F)는 24시간 동안 심바스타틴과 함께 배양한 후 FoxO1 수준에 대한 miR-495 안티센스 올리고뉴클레오티드 형질감염의 효과를 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 다양한 스타틴에 의한 시르투인 6 발현의 억제를 나타낸 것으로, (A)는 아토르바스타틴 또는 로수바스타틴 처리 후, 시르투인 6 및 FoxO1의 발현 수준을 나타낸 것이다. (B)는 아토르바스타틴 또는 로수바스타틴 처리 후, FoxO1 면역 침전물에서 Sirt6 및 아세틸화된 FoxO1의 발현 수준을 나타낸 것이다. (C)는 아토르바스타틴 또는 로수바스타틴 처리 후, 핵 및 세포질에서 FoxO1의 발현 수준을 웨스턴 블로팅으로 분석한 결과를 나타낸 것이다. (D)는 AML12 세포를 FHRE-Luc 프로모터로 형질감염하고, 아토르바스타틴 또는 로수바스타틴으로 처리한 경우, FHRE 루시퍼레이스 활성을 분석한 결과를 나타낸 것이다. (E)는 마우스 1차 간세포를 Ad-LacZ 또는 Ad-Sirt6로 형질감염하고, 아토르바스타틴 또는 로수바스타틴으로 처리한 경우, 웨스턴 블롯팅으로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 심바스타틴의 FoxO1 단백질 안정성에 대한 효과를 나타낸 것으로, (A)는 심바스타틴 처리 후 면역침강(co-immunoprecipitation, Co-IP)를 수행한 결과를 나타낸 것이다. (B) AML12 세포를 FHRE-Luc 프로모터로 형질감염하고, 심바스타틴으로 처리한 경우, FoxO1의 발현 수준을 나타낸 것이다. (C)는 심바스타틴의 유무에 관계없이 FoxO1으로 형질감염된 HEK293T 세포에 시클로헥시미드를 처리한 경우, FoxO1 발현 수준을 나타낸 것이다. (D)는 FoxO1- 및 유비퀴틴화된 플라스미드로 형질감염된 HEK293T 세포를 MG132의 존재하에 배양하여, 세포 용해물을 항-FoxO1 항체로 면역침강하고, 항-유비퀴틴 항체로 웨스턴 블롯팅으로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 시르투인 6를 활성화하는 제제의 심바스타틴 유도 고혈당에 대한 효과를 나타낸 것으로, 스타틴과 MDL-801 병용 후 (A)는 절식 상태의 혈당, (B)는 FoxO1 및 Sirt6 발현 수준, (C) 포도당신생합성 유전자의 발현 수준을 나타낸 것이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 후코이단의 심바스타틴 유도 고혈당에 대한 효과를 나타낸 것으로, 스타틴과 후코이단 병용 후 (A)는 절식 상태의 혈당, (B)는 포도당신생합성 유전자의 발현 수준을 나타낸 것이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따른 스타틴 복용자의 간에서 시르투인 6 발현 수준을 나타낸 것으로, (A) 스타틴 복용자와 건강한 사람들 간의 시르투인 6 및 총-, 아세틸화된-FoxO1의 발현 수준을 웨스턴 블롯팅을 통해 비교한 것이다. (B) 및 (C)는 인간 간 조직에서 miR-495 및 포도당신생합성 유전자의 발현 수준을 나타낸 것이다. (D)는 본 발명의 신호 전달 경로를 나타낸 것이다.
본 발명자들은 스타틴에 의한 고혈당을 예방하기 위한 제제에 대해 예의 연구한 결과 시르투인 6의 발현을 활성화하는 제제의 간 포도당신생합성 발현 억제 효과를 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명자들은 혈중 콜레스테롤 강하 제제인 스타틴이 간에서 miR-495 발현을 유도하고, 시르투인 6 발현을 억제하며, 총- 및 아세틸화된- FoxO1 발현을 증가시키고, 포스포에놀피루브산 카복시키네이스(phosphoenolpyruvate carboxykinase) 및 글루코스-6-포스파테이스(glucose-6-phosphatase) 발현을 증가시켜, 간 포도당신생합성 유전자의 발현을 증가시키는 경로를 확인하였다.
이에 본 발명은, miR-495의 발현을 억제하고, 시르투인 6의 발현을 활성화하기 위해, 스타틴과 시르투인 6의 발현을 활성화하는 제제로서, miR-495의 발현을 억제하는 제제 또는 FoxO1의 탈아세틸화를 촉진하는 제제를 병용 투여함으로써 스타틴에 의한 고혈당을 예방할 수 있는 제제를 개발한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 시르투인 6의 발현을 활성화하는 제제는 시르투인 6의 발현량을 감소시키거나 분해를 촉진함으로써 세포 내 시르투인 6의 수준을 감소시키거나 시르투인 6와 특이적으로 결합하여 그 활성을 감소시키는 것일 수 있으며, 시르투인 6의 탈아세틸화제 활성을 억제하는 제제일 수 있다.
또한, 본 발명은 간 세포에 스타틴과 후보물질을 병용 처리하고 miR-495 또는 시르투인 6의 발현 수준을 측정하여, 스타틴에 의한 고혈당 예방 약물을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
보다 구체적으로, 상기 간 세포에서 miR-495가 상대적으로 발현이 억제되거나, 시르투인 6가 상대적으로 발현이 증가한 경우, 해당 후보물질은 스타틴에 의한 고혈당 예방 약물인 것으로 선정하는 기술을 제공한다.
세포 내 존재하는 miR-495의 발현 수준을 측정하기 위해서 각종 제제를 사용할 수 있다. 상기 제제는 miRNA에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머, 프로브, 및/또는 항체를 사용할 수 있으며, 유전자 발현 정도를 측정하는데 이용되는 공지의 방법, 예를 들면 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하거나, 프로브의 혼성화 반응을 실시하여 발현 수준을 측정할 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 miRNA 발현 수준 측정은 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), 정량적 중합효소반응(quantitative RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블롯팅(Northern blotting), 또는 DNA 칩 방식으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, miR-495는 이를 구성하는 올리고뉴클레오티드의 작용성 등가물, 예를 들어 miR-495 올리고뉴클레오티드의 일부 염기서열이 결실(deletion), 치환(substitution) 또는 삽입(insertion)에 의해 변형되었지만, miR-495 핵산분자와 기능적으로 동일한 작용을 할 수 있는 변이체(variants) 및 모방체(mimic)을 포함하는 개념이다.
본 발명에 있어서, 상기 miR-495의 발현을 억제하는 제제는 miR-495의 발현량을 감소시키거나 분해를 촉진함으로써 세포 내 miR-495의 수준을 감소시키거나 miR-495와 특이적으로 결합하여 그 활성을 감소시키는 것일 수 있으며, siRNA, 앱타머(aptamer), 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 화합물로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다. 상기 화합물은 항산화제, 세포성장에 영향을 미치는 물질 및 세포신호전달물질 중 miRNA의 발현을 억제시키는 화합물이라면 어느 것이든지 사용할 수 있다. 하지만 이에 한정되지 않으며 miR-495의 발현을 억제하는 물질이라면 어느 것이든지 사용할 수 있다.
본 발명에서 "안티센스 올리고뉴클레오티드"는 상기 miRNA에 상보적으로 결합하여 발현을 억제하는 염기서열로서, 이에 제한되지는 않으나 antisenseRNA, antagonist miRNA를 포함한다.
상기 "siRNA"는 일반적으로 이중가닥의 RNA가 다이서에 의해 절단되어 생성되는 21-25 뉴클레오티드 크기의 작은 RNA 조각으로 상보적인 서열을 갖는 miRNA에 특이적으로 결합하여 발현을 억제하는 것을 말하나, 본 발명의 목적상 상기 siRNA는 miR-495에 특이적으로 결합하여 상기 miRNA의 발현을 억제하는 것으로서, 화학적으로 또는 효소학적으로 합성될 수 있다. siRNA의 제조방법으로는 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 공지된 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, siRNA를 직접 화학적으로 합성하는 방법, 시험관 내(in vitro) 전사를 이용한 siRNA의 합성법, 시험관 내(in vitro) 전사에 의해 합성된 긴 이중-가닥 RNA를 효소를 이용하여 절단하는 방법, shRNA 발현 플라스미드나 바이러스성 벡터의 세포내 전달을 통한 발현법 및 PCR(polymerase chain reaction) 유도 siRNA 발현 카세트(cassette)의 세포 내 전달을 통한 발현법 등이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 miR-495의 발현을 억제하는 제제의 세포 내로의 도입은 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 공동-침전법, 전기천공법 및 리포좀 이용법 등을 이용하여 실시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 예방이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 스타틴에 의한 고혈당 또는 그에 따른 이상을 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 또한, 본 발명의 스타틴에 의한 고혈당 예방용 약학적 조성물의 투여 대상 개체는 포유류라면 제한되지 아니하나, 바람직하게는 인간일 수 있고, 보다 구체적으로 스타틴 복용자일 수 있다.
본 발명에서 "약학적 조성물"은 증상 정도에 따라 투여 방법이 결정되는데, 일반적으로는 국소 투여 방식이 추천된다. 또한 상기 약학적 조성물 중 유효성분의 투여량은 질병의 정도, 환자의 나이, 성별, 체중, 투여경로 등의 조건에 따라 달라질 수 있으며, 일일 1회부터 수회까지 투여할 수 있다.
상기 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제, 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 "담체(carrier)"란 비이클(vehicle)이라고도 불리며, 세포 또는 조직 내로의 단백질 또는 펩타이드의 부가를 용이하게 하는 화합물을 의미하는 것으로서, 예를 들어 디메틸술폭사이드(DMSO)는 생물체의 세포 또는 조직 내로의 많은 유기물의 투입을 용이하게 하는 통상 사용되는 담체이다.
본 발명에서 "희석제(diluent)"란 대상 단백질 또는 펩타이드의 생물학적 활성 형태를 안정화시킬 뿐만 아니라, 단백질 또는 펩타이드를 용해시키게 되는 물에서 희석되는 화합물로 정의된다. 버퍼 용액에 용해되어 있는 염은 당해 분야에서 희석제로 사용된다. 통상 사용되는 버퍼 용액은 포스페이트 버퍼 식염수이며, 이는 인간 용액의 염 상태를 모방하고 있기 때문이다. 버퍼 염은 낮은 농도에서 용액의 pH를 제어할 수 있기 때문에, 버퍼 희석제가 화합물의 생물학적 활성을 변형하는 일은 드물다. 여기에 사용된 아젤라산을 함유하는 화합물들은 인간 환자에게 그 자체로서, 또는 결합 요법에서와 같이 다른 성분들과 함께 또는 적당한 담체나 부형제와 함께 혼합된 약학적 조성물로서, 투여될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 스타틴에 의한 고혈당 예방용 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 외용제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 상기 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 분해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구, 바람직하게는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 근육 주입, 정맥내 주입, 피하 주입, 복강 주입, 국소 투여, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 대용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 이하 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
실시예 1 : 스타틴의 영향 분석
스타틴 치료가 정상 혈당에 영향을 미치는지 확인하기 위하여 C57BL/6 마우스에 연속 3일 동안 하루에 1회 다양한 스타틴(10mg/kg 체중)을 복강 내로 주사하였다. 스타틴을 마지막으로 투여하고 2시간 후에, 마우스로부터 혈청 및 간 조직을 수집하여 추가 분석때까지 -80℃에 즉시 저장하였다.
실험동물은 8주에서 10주령의 C57BL/6 수컷 생쥐를 사용하였으며, 통제된 방벽 시설(12h light/dark cycle, 23±1°C, 60-70 % 습도)에서 표준 실험실 음식 및 물을 임의로 섭취하도록 하였다. 혈당 수준은 혈당 측정기를 사용하여 정해진 시간에 측정하였다. 모든 동물 실험은 미국 국립 보건원 (NIH Publication No. 85-23, 2011 년 개정)이 발표한 실험 동물의 관리 및 사용 가이드에 따라 수행되었다.
심바스타틴을 주사한 경우, 체중 및 간 중량의 영향 없이 비절식 및 절식 상태의 혈당 수준(도 1(A)) 및 포도당신생합성 유전자의 발현 수준이 증가하였으며(도 1(B), (E)). 다른 시르투인과 달리 시르투인 6(Sirt6)는 30% 정도 발현이 억제되었다(도 1(C)).
추가로 마우스 1차 간세포에서 시르투인 6(Sirt6) 단백질의 심바스타틴 하향 조절을 농도 의존적 방식으로 확인하였다(도 1(D)). 다른 스타틴, 예를 들어 로수바스타틴(rosuvastatin), 아토르바스타틴(atorvastatin), 플루바스타틴(fluvastatin), losuvastatin, 및 프라바스타틴(pravastatin)에서도 심바스타틴과 동일한 효과가 나타났다(도 2).
실시예 2 : Sirt6 과발현에 따른 스타틴의 억제 확인
C57BL/6 마우스에 1 x 109 pfu의 시르투인 6(Sirt6)을 발현하는 아데노바이러스(Ad-Sirt6), 탈아세틸화 효소 활성이 없는 돌연변이 Sirt6-H133Y(Ad-mSirt6), 및 β-갈락토시데이스(Ad-LacZ) 중 하나를 꼬리 정맥을 통해 주사하여 형질감염(transfection)시키고, 3일 동안 심바스타틴(10mg/kg 체중)을 복강 내로 주사하였다.
비절식 상태의 혈당은 두 번째 스타틴 투여 7시간 후 측정하였고, 절식 상태의 혈당은 마지막 스타틴 투여 3시간 후 측정하였다. 마우스는 절식 상태의 혈당 측정을 위해 17시간동안 금식하도록 했다. Ad-Sirt6로 형질감염된 경우, 비절식 및 절식 상태의 혈당이 증가하지 않았으나, Ad-mSirt6의 경우 효과가 없었다(도 3(A)).
간 포도당신생합성 유전자의 전사 활성을 측정하기 위해 in vivo 루시퍼레이스 생물 발광 이미징을 수행하였다.
보다 구체적으로, Ad-G6Pase-Luc (1 x 109 pfu/kg 체중)를 마우스의 꼬리 정맥에 주사하고, 아데노바이러스를 꼬리 정맥에 주사한 후, 3일동안 스타틴 처리하였으며, 스타틴의 마지막 투여 후 6시간동안 금식하도록 하고, 150 mg/kg의 반딧불이 D-루시페린을 주사하였다. 10분 후, 마우스를 마취시키고 IVIS Luminar XR 이미징 시스템을 사용하여 이미지화 하였다.
심바스타틴을 투여한 쥐는 대조군에 비해 현저하게 증가된 G6Pase 전사 활성을 보였으나, Ad-Sirt6를 처리한 쥐에서는 심바스타틴에 따른 G6Pase 전사 활성의 증가가 보이지 않았다(도 3(B)).
Ad-Sirt6 과발현에 의해 Pck1, G6pc, 및 Pargc1a의 발현은 증가하지 않았으며(도 3(C)), 이는 마우스 초기 간세포를 이용한 glucose production assay와 qPCR 분석을 통해 확인하였다(도 3(D), 도 4).
상기 결과는 아토르바스타틴 또는 로수바스타틴에 의해 유도된 고혈당을 예방하는데도 효과가 있었다(도 5).
실시예 3 : Sirt6을 타겟팅하는 miRNA 선별
Sirt6 mRNA의 3'-UTR에 결합하는 miRNA 중에서 miR-351, miR-495, 및 miR-1192는 심바스타틴, 로수바스타틴, 및 아토르바스타틴에 의해 발현이 상승하였다(도 6(B), 도 7(B)). 또한, 심바스타틴에 노출된 간세포에서 miR-495의 발현이 현저하게 증가하였다. 사이클로헥시미드 추적 분석(cycloheximide chase assay)에 따르면 심바스타틴은 Sirt6 단백질의 안정성에 영향을 미치지 않았다.
실시예 4 : 스타틴에 의한 miR-495 유도 및 Sirt6의 발현 억제
Sirt6의 발현 변화를 분석하여 miRNA 변형의 효과를 결정하였다. AML12 세포에 일시적으로 miR-495 모방체를 48시간동안 형질감염한 후 Sirt6의 발현을 확인하였고, AML12 세포에 일시적으로 miR-495 안티센스 올리고뉴클레오티드를 형질감염하고, 24시간동안 심바스타틴에 노출한 후, Sirt6의 발현을 확인하였다(도 6).
miR-495 모방체를 형질감염한 결과 Sirt6 발현이 감소했으나(도 6(C)), miR-495 안티센스 올리고뉴클레오티드를 형질감염한 결과 Sirt6 발현이 증가하였다(도 6(D)).
스타틴에 의한 고혈당에서 miR-495의 역할을 탐구하기 위해, miR-495 안티센스올리고뉴클레오타이드로 처리한 후 포도당신생합성 유전자 발현을 조사하였다. miR-495 사일런싱(silencing)한 결과, 포도당신생합성 유전자의 발현이 상당히 억제되었다(도 6(E)).
실시예 5 : 스타틴에 의한 FoxO1 상향 조절
스타틴 매개 Sirt6 억제의 다운스트림 타겟을 찾기 위한 노력으로, miR-495의 표적 유전자를 분석하였다. KEGG 경로 분석을 통해 FoxO1 신호 전달 경로에 관여하는 유전자가 상당히 풍부하다는 점을 확인하였다(도 10(A)).
FoxO1이 스타틴에 의한 포도당신생합성의 핵심인 Sirt6 조절에 관여하는지 확인하기 위해, C57BL/6 마우스에 연속 3일동안 스타틴을 투여하고, Sirt6 및 FoxO1 발현을 분석하였다. 1차 배양 간세포 실험 결과 심바스타틴에 의해 FoxO1 단백질 발현 및 아세틸화가 시간 및 농도의존적으로 증가한다는 점을 확인하였다(도 10(B)). FoxO1의 인산화에는 영향이 없었으나, FoxO1의 핵 내 발현은 증가하였고, 세포질에서의 발현은 감소하였다(도 10(C)).
Sirt6의 과발현에 따른 FoxO1 발현 변화를 확인하기 위해, Sirt6 아데노바이러스를 형질감염한 결과, 심바스타틴에 의한 총- 및 아세틸화된- FoxO1 발현이 감소하였다(도 10(D)). miR-495 모방체의 형질감염은 총- 및 아세틸화된- FoxO1 발현을 현저하게 증가시켰으며(도 10(E)), miR-495 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 의해 FoxO1 발현이 감소하였다(도 10(F)).
아토르바스타틴 및 로수바스타틴을 처리한 마우스의 간에서도 Sirt6 억제와 동시에 FoxO1 발현의 증가가 확인되었으며(도 11(A)), 아세틸화된 FoxO1, 핵 내 FoxO1, 및 FoxO1 프로모터 루시퍼레이스 활성을 증가시켰고, Sirt6 과발현에 의해 상기 증가효과가 방지되었다(도 11(B) 내지 (E)).
한편, 면역침강(Co-immunoprecipitation, Co-IP) 및 FHRE-루시퍼레이스 분석을 통해 Sirt6와 FoxO1간의 직접적 상호작용 및 심바스타틴 처리에 따른 FoxO1 프로모터 활성 증가를 확인하였다(도 11(A), (B)). 또한, 사이클로헥시미드 추적 분석(cycloheximide chase assay)에 따르면, 심바스타틴이 FoxO1의 핵 내 발현을 유도함에 따라 FoxO1 단백질의 안정성이 현저하게 증가한다는 점을 알 수 있었다(도 11(C)). FoxO1의 유비퀴틴화는 심바스타틴에 의해 억제되는 것으로 확인되었다(도 11(D)).
실시예 6 : 인간 간암 세포
인간 간암 세포주(Human liver cancer cell line, HepG2)를 24시간동안 심바스타틴으로 처리하였다. 심바스타틴에 의해 miR-495의 발현이 현저히 증가하였고, Sirt6 단백질의 발현은 감소했으며, FoxO1 단백질 및 포도당신생합성 유전자의 발현은 증가하였음을 확인하였다(도 8).
실시예 7 : 스타틴과 Sirt6을 활성화하는 제제의 병용 투여
C57BL/6 마우스에 MDL-801과 심바스타틴을 3일간 병용 투여하였다. 심바스타틴 단독 투여한 마우스에서는 혈당 증가가 관찰되었으나, 병용 투여한 마우스에서는 그렇지 않았다(도 13(A)). 심바스타틴을 투여한 마우스의 간에서는 FoxO1 상향 조절, Sirt6 억제 및 간 포도당신생합성 유전자의 발현 증가가 관찰되었으나, 이는 MDL-801과 병용 투여함으로써 완전히 제거되었다(도 13(C)). 후코이단을 병용 투여한 경우에도 스타틴에 의한 고혈당의 예방이 관찰되었다(도 14).
한편, Sirt6의 탈아세틸화를 촉진하는 제제는 알로스테릭(allosteric) Sirt6 활성화하는 제제일 수 있다.
실시예 8 : 스타틴 복용자
Sirt6 발현은 건강한 사람들에 비해 스타틴 복용자의 간에서 상당히 감소하였으나, FoxO1 발현 및 이의 아세틸화는 증가하였다(도 15(A)). miR-495 수준은 스타틴 복용자들의 간에서 소폭 증가하였다(도 15(B)). qPCR 분석을 통해 포스포에놀피루브산 카복시키네이스(phosphoenolpyruvate carboxykinase, PEPCK) 및 글루코스-6-포스파테이스(glucose-6-phosphatase, G6Pase)의 상향 조절을 확인하였다(도 15(C)).
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (10)

  1. 시르투인 6(sirtuin 6)의 발현을 활성화하는 제제를 유효성분으로 포함하는 스타틴에 의한 고혈당 예방용 약학적 조성물로서,
    상기 시르투인 6의 발현을 활성화하는 제제는 miR-495의 발현을 억제하는 제제 또는 Fox(forkhead box protein) O1의 탈아세틸화를 촉진하는 제제인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 스타틴과 동시에 또는 순차적으로 투여되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 시르투인 6의 발현을 활성화하는 제제는 후코이단, MDL-800, MDL-801, MDL-811, CL5D, SW-055, SW-062으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는, 약학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 miR-495의 발현을 억제하는 제제는 siRNA, 앱타머(aptamer), 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 miRNA 발현 억제제인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 스타틴은 심바스타틴(simvastatin), 아토르바스타틴(atorvastatin), 플루바스타틴(Fluvastatin), 로수바스타틴(rosuvastatin), 로바스타틴(lovastatin), 및 프라바스타틴(pravastatin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는, 약학적 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 시르투인 6의 발현을 활성화하는 제제는 Fox(forkhead box protein) O1의 핵 내 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 시르투인 6의 발현을 활성화하는 제제는 간 포도당신생합성 유전자(hepatic gluconeogenesis gene)의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 간 포도당신생합성 유전자는 Pck1, G6pc, 및 Ppargc1a로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는, 약학적 조성물.
  9. 하기 단계를 포함하는, 스타틴에 의한 고혈당 예방 약물의 스크리닝 방법:
    (1) 간 세포에 스타틴과 후보물질을 병용 처리하고 Sirt6의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    (2) Sirt6의 발현 수준이 증가한 경우 상기 후보물질을 스타틴에 의한 고혈당 예방 약물로 선정하는 단계.
  10. 하기 단계를 포함하는, 스타틴에 의한 고혈당 예방 약물의 스크리닝 방법:
    (1) 간 세포에 스타틴과 후보물질을 병용 처리하고 miR-495의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    (2) miR-495의 발현 수준이 감소한 경우 상기 후보물질을 스타틴에 의한 고혈당 예방 약물로 선정하는 단계.
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