KR20220011956A - 라나토시드-c를 유효성분으로 함유하는 세포노화 관련 질환 예방 또는 치료용 약학조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 라나토시드-C를 유효성분으로 함유하는 세포노화 관련 질환 예방 또는 치료용 약학조성물에 관한 것으로, 상기 라나토시드-C는 노화가 유도된 섬유아세포 및 망막색소상피세포의 세포 기능 및 형태를 복원시키는 세노모르픽스 효과를 나타내었으며, 노화가 유도된 혈관내피세포를 선택적으로 사멸시키는 세노리틱스 효과를 나타내는 것으로 확인됨에 따라, 상기 라나토시드-C는 세포 종류에 따라 다르게 작용하여 세포노화에 의해 발병되는 심혈관질환 및 안구질환을 효과적으로 예방하거나 치료하는 것으로 확인됨에 따라, 상기 라나토시드-C를 세노리틱스 및 세노모르픽스 약물로 제공하며, 세포 노화에 따른 심혈관 및 안구 질환 치료제로 제공하고자 한다.

Description

라나토시드-C를 유효성분으로 함유하는 세포노화 관련 질환 예방 또는 치료용 약학조성물{Pharmaceutical composition for preventing or treating cell senescence associated diseases comprising lanatoside C}

본 발명은 노화세포의 종류에 따라 다르게 작용하는 라나토시드-C (lanatoside C)를 유효성분으로 함유하는 세포노화 관련 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

노화세포는 노화에 따라 개체의 조직 및 기관에 축적되며, 노화세포의 축적은 노화로 인한 조직과 기관의 기능 및 구조 변화를 유도할 뿐만 아니라, 암, 당뇨와 비만, 조직 섬유화증, 노인성 안질환, 심뇌혈관질환, 퇴행성뇌질환, 골관절염, 피부노화 및 만성 피부상처 등과 같은 다양한 노화관련 질환의 병인에 중요한 작용을 한다. 따라서 노화를 지연시키거나 극복하는 것이 암, 당뇨, 심혈관질환과 같은 노화관련 질환의 예방과 치료에 가장 효과적인 방법임이 제안되었다.

라파마이신, SIRT1 활성제, 칼로리제한 모방약, AMPK 활성제, 텔로머라제 활성제 등이 노화 제어 약물로 가능성이 제시되고 있으며, 이와 더불어 최근 노화세포를 표적으로 하는 세노세라퓨틱스(senotherapeutics)가 개발되어 세포 수준과 동물모델에서 그 효능이 보고되고 있다. 세노세라퓨틱스는 노화세포만 선택적으로 죽이는 세노리틱스 (senolytics)와 노화세포의 기능이나 형태를 젊은 세포처럼 복원하는 세노모르픽스 (senomorphics)로 구분된다.

세노리틱스로는 퀘르세틴(quercetin)과 Bcr-Abl protein kinase 저해제인 다사티닙(dasatinib), Bcl-2 kinase 저해제인 ABT263과 ABT737, BCL-XL 저해제인 A1331852과 A1155463, MDM2/p53 저해제인 UBX0101, p53 저해제인 FOXO4-DRI, HSP90 저해제인 17-DMAG가 최근 보고되었다. 세노모르픽스로는 mTOR 저해제인 라파마이신, IKK/NFkB 저해제, 자유 라디칼 제거제 및 JAK 저해제 등이 보고되었다.

동물 모델에서 조직에 존재하는 노화세포를 제거하면 노화로 인한 조직 및 기관의 구조와 기능이 개선되어, 건강수명을 늘릴 수 있는 것으로 보고되었다. 또한, 죽상경화증, 폐 섬유화, 신장 섬유화, 골관절염 및 당뇨병 등과 같은 다양한 노화 관련 질환을 치료할 수 있는 것으로 보고됨에 따라 노화 및 노화세포를 표적으로 한 세노세라퓨틱스 개발을 통하여, 노화관련 질환을 예방하거나 치료하기 위한 새로운 전략에 대한 연구가 매우 활발히 진행되고 있다.

라나토시드-C (lanatoside C)는 Digitalis lantana에서 추출한 천연물 단일성분으로 울혈성심부전 (congestive heart failure), 부정맥 (cardiac arrhythmia) 치료제로 상용되고 있다. 그러나 아직까지 노화세포에 대한 특이적인 효능에 대해서는 보고된 바 없다.

대한민국 공개특허 제10-2014-0145570호 (2014.12.23. 공개)

본 발명은 라나토시드-C를 유효성분으로 함유하는 조성물을 제공하여 노화세포를 선택적으로 사멸시키거나 노화세포의 기능 및 형태를 복원시켜 세포 노화에 따른 질환을 개선하거나 치료하기 위한 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명은 라나토시드-C를 유효성분으로 함유하는 세노모르픽스 조성물을 제공한다.

본 발명은 라나토시드-C를 유효성분으로 함유하는 세노리틱스 조성물을 제공한다.

본 발명은 라나토시드-C를 유효성분으로 함유하는 세포노화 관련 질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.

본 발명은 라나토시드-C를 유효성분으로 함유하는 심혈관질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 라나토시드-C를 유효성분으로 함유하는 안구질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.

본 발명에 따르면, 라나토시드-C는 노화가 유도된 섬유아세포 및 망막색소상피세포의 세포 기능 및 형태를 복원시키는 세노모르픽스 효과를 나타내었으며, 노화가 유도된 혈관내피세포를 선택적으로 사멸시키는 세노리틱스 효과를 나타내는 것으로 확인됨에 따라, 상기 라나토시드-C는 세포 종류에 따라 다르게 작용하여 세포노화에 의해 발병되는 심혈관질환 및 안구질환을 효과적으로 예방하거나 치료하는 것으로 확인됨에 따라, 상기 라나토시드-C를 세노리틱스 및 세노모르픽스 약물로 제공하며, 세포 노화에 따른 심혈관 및 안구 질환 치료제로 제공하고자 한다.

도 1은 젊은 섬유아세포에서 라나토시드-C 처리 효과를 확인한 결과로, 젊은 섬유아세포(HDF)와 독소루비신에 의해 조기 노화된 섬유아세포에 100 nM 라파마이신, 100 nM ABT263 및 100 nM 라나토시드-C를 처리하고, 4일 후 라나토시드-C 처리에 따른 효과를 확인한 결과로, 도 1A는 SAβG 활성을 확인한 염색 결과이며, 도 1B는 SAβG 활성 염색 정도를 확인한 결과이며, 도 1C는 세포생존 수준을 확인한 결과이다. HDF=human dermal fibroblasts, Young=젊은 세포, Dox=doxorubicin, NT=0.01% DMSO, Rap=100 nM rapamycin, ABT=100 nM ABT263, Lana-C=100 nM lanatoside C. (*** p<0.001)
도 2는 젊은 섬유아세포(HDF)와 복제노화 섬유아세포에 100 nM ABT263과 100 nM 라나토시드-C를 처리하고, 4일 후 라나토시드-C 처리 효과를 확인한 결과로, 도 2A는 라나토시드-C의 농도에 따른 세포생존을 확인한 결과이며, 도 2B는 SAβG 활성을 확인한 염색사진이며, 도 2C는 SAβG 활성 염색 수준을 확인한 결과이며, 도 2D는 세포노화관련 단백질인 p53, p16의 웨스턴 블롯 분석결과이다. HDF=human dermal fibroblasts, Young=젊은 세포, Senescent=복제노화세포, NT=0.01% DMSO, Rap=100 nM rapamycin, Lana-C=100 nM lanatoside C. (**, p<0.01; ****, p<0.0001)
도 3은 젊은 혈관내피세포(HUVEC)와 독소루비신에 의해 조기 노화된 혈관내피세포에 100 nM 라파마이신, 100 nM ABT263 및 100 nM 라나토시드-C를 처리하고 4일 후 라나토시드-C 처리 효과를 확인한 결과로, 도 3A는 SAβG 활성 염색 결과이며, 도 3B는 SAβG 활성 염색 수준을 확인한 결과이며, 도 3C는 세포생존을 확인한 결과이다. HUVEC=human umbilical vascular endothelial cells, Young=젊은 세포, Dox=doxorubicin, NT=0.01% DMSO, Rap=100 nM rapamycin, ABT263=100 nM ABT263, Lana-C=100 nM lanatoside C. (****, p<0.0001)
도 4는 젊은 혈관내피세포(HUVEC)와 복제노화 혈관내피세포에 100 nM ABT263 및 100 nM 라나토시드-C를 처리하고, 4일 후 라나토시드-C 처리 효과를 확인한 결과로, 도 4A는 SAβG 활성 염색 결과이며, 도 4B는 SAβG 활성 염색 수준을 확인한 결과이며, 도 4C는 라나토시드-C의 농도에 따른 세포증식을 확인한 결과이며, 도 4D는 PARP과 caspase-3 단백질에 대한 웨스턴 블롯 분석 결과이다. HUVEC=human umbilical vascular endothelial cells, Young=젊은 세포, Senescent=복제노화세포, NT=0.01% DMSO, ABT=100 nM ABT263, Lana-C=100 nM lanatoside C. (*, p<0.05; **, p<0.01)
도 5는 독소루비신에 의해 조기 노화된 망막색소상피세포(ARPE)에 100 nM 라파마이신, 100 nM ABT263 및 100 nM 라나토시드-C를 처리하고, 4일 후 라나토시드-C 처리 효과를 확인한 결과로, 도 5A는 SAβG 활성 염색 결과이며, 도 5B는 SAβG 활성 염색 수준을 확인한 결과이며, 도 5C는 세포생존을 확인한 결과이다. ARPE=adult retinal pigmented epithelial cells, Dox=doxorubicin, NT=0.01% DMSO, Rap=100 nM rapamycin, ABT=100 nM ABT263, Lana-C=100 nM lanatoside C. (**, p<0.01; ***, p<0.001; ****, p<0.0001)
도 6은 생쥐에서 블레오마이신에 의한 폐 섬유화에 대한 라나토시드-C의 효능을 확인한 결과로, 도 6A는 실험과정을 나타낸 모식도이며, 도 6B는 실험 과정에서 체중변화를 확인한 결과이며, 도 6C는 폐 조직 표본의 헤마톡실린-에오신 (H&E) 및 트리크롬 (Trichrome) 염색 결과이며, 도 6D는 조직 표본에서 폐 섬유화 정도를 확인한 결과이며, 도 6E는 기도저항 (Penh) 분석 결과이며, 도 6F는 섬유화 및 노화 마커 단백질의 웨스턴 블롯 결과이다. D=라나토시드-C (10 μM/g mouse) 또는 PBS 복강 주사, NT=not treated, PBS=PBS 복강 주사, Lana-C=라나토시드-C 복강 주사 (*, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001; ****, p<0.0001).
도 7은 ApoE 결손 생쥐에 고지방 식이를 먹인 후 라나토시드-C를 복강주사하여 생쥐에서 죽상경화 병변에 미치는 라나토시드-C의 영향을 확인한 결과로, 도 7A는 실험과정을 나타낸 모식도이며, 도 7B는 실험 과정에서 수컷 생쥐 (male mouse)의 체중변화를 확인한 결과이며, 도 7C는 실험 과정에서 암컷 생쥐 (female mouse)의 체중변화를 확인한 결과이며, 도 7D는 수컷 생쥐의 혈청 지질 농도 변화를 확인한 결과이며, 도 7E는 암컷 생쥐의 혈청 지질 농도 변화를 확인한 결과이며, 도 7F는 대동맥굴(arotic sinus)의 Oil-red O 염색 결과이며, 도 7G는 Oil-red O 염색 수준을 정량 결과이다. HFD=high fat diet, Lana-C=lanatoside C (10 ?M/g mouse), T-C=total cholesterol, TG=triglyceride, HDL-C=high density lipoprotein cholesterol, LDL-C=low density lipoprotein cholesterol.
도 8은 수컷 ApoE 결손 생쥐에 고지방 식이를 시행한 후 라나토시드-C를 복강주사한 뒤 대동맥을 분석한 결과로, 도 8A는 대동맥활(arotic arch)에서 Oil-red O 및 SA-β-gal 활성을 확인한 SA-β-gal염색 결과이며, 도 8B는 대동맥활(arotic arch)의 동맥경화 병변 내에서 SA-β-gal염색 정도를 확인한 결과이며, 도 8C는 대동맥활(arotic arch)에서 동맥경화 병변의 넓이를 확인한 결과이며, 도 8D는 대동맥활(arotic arch)에서 SA-β-gal 양성 병변의 넓이를 확인한 결과이며, 도 8E는 대동맥 전면(en face)에서 Oil-red O 및 SA-β-gal염색 결과이며, 도 8F는 대동맥 전면(en face)에서 동맥경화 병변의 넓이를 확인한 결과이며, 도 8G는 대동맥 전면(en face)에서 SA-β-gal 양성 부분의 넓이를 확인한 결과이다.
도 9는 암컷 ApoE 결손 생쥐에 고지방 식이를 먹인 후 라나토시드-C를 복강주사한 뒤 대동맥을 분석한 결과로, 도 9A는 대동맥활(arotic arch)에서 Oil-red O 및 SA-β-gal 활성을 확인한 SA-β-gal 염색 결과이며, 도 9B는 대동맥활(arotic arch)의 동맥경화 병변 내에서 SA-β-gal 염색 정도를 확인한 결과이며, 도 9C는 대동맥활(arotic arch)에서 동맥경화 병변의 넓이를 확인한 결과이며, 도 9D는 대동맥활(arotic arch)에서 SA-β-gal 양성 병변의 넓이를 확인한 결과이며, 도 9E는 대동맥 전면(en face)에서 Oil-red O 및 SA-β-gal 염색 결과이며, 도 9F는 대동맥 전면(en face)에서 동맥경화 병변의 넓이를 확인한 결과이며, 도 9G는 대동맥 전면(en face)에서 SA-β-gal 양성 부분의 넓이를 확인한 결과이다.
도 10은 ApoE 결손 생쥐에 고지방 식이를 먹인 후 라나토시드-C를 복강주사한 뒤 대동맥을 웨스턴 블롯으로 분석한 결과로, 도 10A는 수컷 생쥐에서 웨스턴 블롯을 수행한 결과이며, 도 10B는 암컷 생쥐에서 웨스턴 블롯을 수행한 결과이다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

동물모델에서 조직에 존재하는 노화세포를 제거할 경우, 노화로 인한 조직 및 기관의 구조와 기능이 개선되어 노화 관련 질환이 치료되고, 건강수명이 증가하는 것으로 보고됨에 따라, 본 발명의 발명자들은 노화 및 노화세포를 표적으로 하는 세노세라퓨틱 연구를 진행하던 중 라나토시드-C가 노화 세포의 종류에 따라 다르게 작용하여 세포 노화에 따른 질환을 개선하고 치료하는 효과를 나타내는 것을 확인함에 따라 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 라나토시드-C를 유효성분으로 함유하는 세노모르픽스 조성물을 제공할 수 있다.

상기 세노모르픽스는 노화세포의 기능을 정상세포로 회복시키는 것일 수 있다.

상기 노화세포는 약물처리 또는 계대배양으로 노화가유도된 섬유아세포, 혈관내피세포 및 망막색소상피세포로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.

본 발명은 라나토시드-C를 유효성분으로 함유하며, 상기 호모해링토닌은 생체 외(in vitro)에서 노화된 세포의 기능 또는 형태를 정상세포로 회복시키는 것을 특징으로 하는 세노모르픽스용 시약조성물을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명은 생체 외에서 사람을 제외한 포유류로부터 분리된 섬유아세포, 혈관내피세포 및 망막색소상피세포에 라나토시드-C를 처리하는 단계를 포함하는 노화세포의 기능 또는 형태를 정상세포로 회복시키는 방법을 제공할 수 있다.

본 발명은 라나토시드-C를 유효성분으로 함유하는 세노리틱스 조성물을 제공할 수 있다.

상기 세노리틱스는 노화세포를 선택적으로 사멸시키는 것일 수 있다.

상기 노화세포는 약물처리 또는 계대배양으로 노화가유도된 섬유아세포, 혈관내피세포 및 망막색소상피세포로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.

본 발명은 라나토시드-C를 유효성분으로 함유하며, 상기 호모해링토닌은 생체 외(in vitro)에서 노화된 세포를 사멸시키는 것을 특징으로 하는 세노리틱스용 시약조성물을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명은 생체 외에서 사람을 제외한 포유류로부터 분리된 섬유아세포, 혈관내피세포 또는 망막색소상피세포에 호모해링토닌을 처리하는 단계를 포함하는 노화세포 사멸 방법을 제공할 수 있다.

본 발명은 라나토시드-C를 유효성분으로 함유하는 세포노화 관련 질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공할 수 있다.

본 발명은 라나토시드-C를 유효성분으로 함유하는 심혈관질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공할 수 있다.

상기 라나토시드-C는 노화세포를 선택적으로 사멸시키거나 노화세포의 기능 또는 형태를 정상세포로 회복시켜 심혈관질환을 예방 또는 치료하는 것일 수 있다.

상기 심혈관질환은 죽상동맥경화증, 급성 심근경색, 정맥 폐색증, 말초 동맥 폐색증, 고혈압 및 심부전으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.

본 발명은 라나토시드-C를 유효성분으로 함유하는 안구질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공할 수 있다.

상기 라나토시드-C는 노화세포를 선택적으로 사멸시키거나 노화세포의 기능 또는 형태를 정상세포로 회복시켜 안구질환을 예방 또는 치료하는 것일 수 있다.

상기 안구질환은 망막증, 각막염, 황반변성, 안구건조증, 녹내장 및 맥락막 혈관신생증으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.

본 발명의 한 구체예에서, 상기 라나토시드-C를 유효성분으로 함유하는 약학조성물은 통상적인 방법에 따라 주사제, 과립제, 산제, 정제, 환제, 캡슐제, 좌제,겔, 현탁제, 유제, 점적제 또는 액제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 제형을 사용할 수 있다.

본 발명의 다른 구체예에서, 라나토시드-C를 유효성분으로 함유하는 약학조성물은 약학조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제, 붕해제, 감미제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제, 향미제, 항산화제, 완충액, 정균제, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.

구체적으로 담체, 부형제 및 희석제는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 사용할 수 있으며, 경구투여를 위한고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트,수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 있으며 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기재로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면 상기 약학 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 대상체로 투여할 수 있다.

상기 라나토시드-C의 바람직한 투여량은 대상체의 상태 및 체중, 질환의 종류 및 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 달라질 수 있으며 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면 이에 제한되는 것은 아니지만 1일 투여량이 0.01 내지 200 mg/kg, 구체적으로는 0.1 내지 200 mg/kg, 보다 구체적으로는 0.1 내지 100 mg/kg 일 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고 수회로 나누어 투여할 수도 있으며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 '대상체'는 인간을 포함하는 포유동물일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

<실험예>

하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.

1. 세포배양

사람 섬유아세포 (human dermal fibroblast, HDF)와 사람 제대혈관내피세포 (human umbilical vascular endothelial cell, HUVEC)는 LONZA Inc. (Walkersville, MD)에서, 사람 망막색소상피세포 (human retinal pigmented epithelial cells, ARPE-19) ATCC (Manassas, VA) 에서 구입하여 사용하였다. 사람 섬유아세포는 10% FBS를 포함한 Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) 배양액, 사람 제대혈관내피세포는 EGM-2 배양액, 사람 망막색소상피세포는 10% FBS를 포함한 DMEM:F12 배양액으로 배양하였다.

세포 (2×10⁵)를 100 mm 배양 접시에 분주하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 계대 배양하였다. 배양 접시에 80-90% 정도로 세포가 자라면 트립신-EDTA 용액을 처리하여 배양 접시로부터 세포를 분리하고 세포 수를 측정하였다.

세포 성장 정도는 아래 식과 같이 세포집단배가시간 (population doubling time; PDT)으로 확인하였다.

PDT=((T-T₀)log2)/(logN-logN₀)

(N=배양 접시에서 자란 세포 수, N0 = 처음 분주한 세포 수, T-T0 = 세포배양 시간)

2. 독소루비신(doxorubicin) 처리에 의한 조기 노화세포 제조

각 세포를 독소루비신 (0.5 μM)이 포함된 무혈청 배양액에서 4시간 처리하였다. 세포를 무혈청 배양액으로 세척한 후, 10% FBS가 포함한 배양액에서 4일동안 배양하였다. 세포노화는 노화연관 베타 갈락토시다제 (senescence associated β-galactosidase (SAβG)) 염색으로 확인하였다.

3. 복제노화세포 제조

100 mm 배양 접시에 2×10⁵ 세포를 분주한 후, 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 배양접시에 80~90% 정도로 세포가 성장하면 트립신-EDTA를 처리하여 세포를 떼어내고, 세포 수를 측정하였으며 세포집단 배가시간 (PDT)를 측정하였다.

상기 과정으로 세포를 연속적으로 계대 배양하면서, 복제노화를 유도하였다. 젊은 섬유아세포의 PDT는 36시간, 복제노화 섬유아세포의 PDT는 12일, 젊은 혈관내피세포의 PDT는 24시간, 복제노화 혈관내피세포의 PDT는 7일이었다. 세포노화 정도는 SAβG 염색, p53과 p16 단백질 발현 분석 등으로 확인하였다.

4. 임상시험 화합물로부터 세노리틱스 및 세노모르픽스 효능 물질 탐색

한국화합물 은행으로부터 임상시험 화합물 2,150종을 분양받았다. 독소루비신 처리하여 조기 노화를 유도한 사람 섬유아세포와 사람 혈관내피세포를 96웰 플레이트에 분주한 후, 2,150종의 화합물을 100 nM 농도로 각각 4일 동안 처리하였다. 노화세포의 생존 정도를 CCK-8 분석으로, 세포의 노화 정도를 노화연관 베타 갈락토시다제 (SAβG) 염색으로 조사하였다.

5. 라나토시드-C (lanatoside C, Lana-C), 라파마이신 및 ABT263 처리

라나토시드-C는 Sigma-Aldrich (Saint Louis, MO, USA)에서, 라파마이신은 EMD Millipore (Burlington, MA, USA)에서, ABT263은 Selleckchem (Houston, TX, USA)에서 각각 구입하였다. 각 시료를 DMSO에 녹인 후, 라나토시드-C는 100 nM, 라파마이신은 100 nM, ABT263은 100 nM 농도로 젊은 세포, 복제노화세포, 독소루비신 처리 조기 노화세포에 처리하였다. 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 4일 동안 배양한 후, 세포생존 정도는 CCK-8 분석, 세포노화 정도는 노화연관 베타갈락토시다제 (SAβG) 염색, p53 및 p16 단백질 발현 분석, 세포사멸은 PARP, caspase-3 단백질 발현 분석으로 확인하였다.

6. 노화연관 베타 갈락토시다제 (Senescence-associated β-galactosidase, SAβG) 염색

세포를 1×인산완충용액로 세척하고, 3.7%(v/v) 파라포름알데하이드가 포함된 인산완충용액으로 고정하였다. 1 mg/ml 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside, 40 mM citric acid-sodium phosphate (pH 6.0), 5 mM potassium ferricyanide, 5 mM potassium ferrocyanide, 150 mM NaCl, 2 mM MgCl₂ 용액을 첨가한 후, 37℃에서 18시간 동안 반응시켰다. 대조 염색으로 에오신으로 염색하였다. 광학현미경을 사용하여 세포질에 파란색으로 염색된 세포를 확인하였다.

7. 세포생존 분석 (cell counting kit-8 (CCK-8) assay)

젊은 세포 (1×10³ cells/well) 또는 노화세포 (2×10³ cells/well)를 96웰 플레이트에 분주한 후, 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 하루 밤 배양하였다. 라나토시드-C, ABT263 및 라파마이신을 각 농도로 처리한 후, 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 4일 동안 배양하였다. 각 웰에 CCK-8 시약 (Dojindo Molecular Technologies Inc., Kumamoto, Japan)을 10 μl을 첨가하고, 배양기에서 2시간 배양하였다. Microplate reader를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포생존 정도는 DMSO만 처리한 대조군의 흡광도를 100%로 하고 이에 대한 상대적인 값으로 나타내었다.

8. 폐섬유화 생쥐 실험

동물실험은 영남대학교 의과대학 동물실험윤리위원회의 승인을 받아 수행하였다 (YUMC-AEC2018-025). 10주령 C57BL/6J 수컷 생쥐를 2.5% 아베르틴 (Avertin, 0.025 ml/g 체중)을 복강주사하여 마취시킨 후, 블레오마이신 (bleomycin)을 2 mU/g으로 기관지로 점적하여 폐로 주입하였다. 블레오마이신 점적 후, 3일, 5일, 7일에 체중을 측정하여 체중이 줄지 않는 생쥐는 실험에서 제외하였다. 블레오마이신 투여 5일 후부터 2일 간격으로 10 mM 라나토시드-C 2.5 μl를 100 μl 인산완충용액에 희석하여 복강으로 6회 주사하였다 (Lana-C 군). 대조군은 폐섬유화를 유도하지 않은 군 (NT 군), 블레오마이신 투여 후 2.5 μl DMSO가 들어있는 인산완충액 (PBS)을 주사한 군 (PBS 군)으로 하였다. 각 군별로 3마리의 생쥐를 사용하였다. 블레오마이신 투여 후, 17일 후에 마우스를 아베르틴으로 마취한 후, 희생시키고, 채혈한다. 몸속에 남아있는 혈액을 제거하기 위해 PBS(phosphate buffered saline)로 관류(perfusion)한 후, 폐를 적출한다. 적출한 장기는 W/B(western blotting) 및 PCR(polymerase chain reaction) 할 것은 적당량 잘라서 cryo tube에 담아 액체 질소를 이용해 냉동시킨 다음 -80℃ 냉동실에 넣은 후 냉동절편을 제작할 조직은 0.15M NaCl로 perfusion을 하고, 3.7% 파라포름알데하이드 (paraformaldehyde)로 고정시켰다. 폐세포의 노화와 페섬유화 병변을 알아보기 위해 헤마톡실린-에오신 (Hematoxylin-Eosin) 염색 및 트리크롬 (trichrome) 염색을 실시하고, 섬유화 및 노화 관련 단백질의 발현 변화는 W/B(western blotting)을 수행하여 분석하였다.

9. 기도저항(Penh) 측정 (plethysmography)

기도저항은 Buxco Resaeach Systems 기기를 사용하여 측정하였다.

(Pif = peak inspiratory flow, Pef= peak expiratory flow, Te= expiratory time, Rt= time to expire 65 % of the “volume”. Pause = Te/Rt -1. Penh = Pef/Pif × Pause.)

10. 동맥경화 생쥐 실험

10 주령의 ApoE^-/- 마우스에 먼저 고지방식이를 6주동안 실시하고, 라나토시드-C를 6주 (2회/주) 동안 복강투여하였다. 복강투여가 끝난 마우스를 아베르틴 (Avertin)으로 마취한 후, 희생시키고 채혈하였다. 몸속에 남아있는 혈액을 제거하기 위해 PBS (phosphate buffered saline)로 관류한 후, 장기 (간, 신장, 폐, 비장, 췌장, 지방, 심장 및 대동맥)를 적출하였다. 적출한 장기는 W/B(western blotting)을 위해 적당량 잘라서 cryo tube에 담아 액체 질소를 이용해 냉동시킨 후 -80℃ 냉동실에 보관하였다. 냉동절편으로 제작할 심장 조직과 대동맥은 0.15M NaCl로 관류하고, 3.7% 파라포름알데하이드로 고정시키고 대동맥은 바로 노화관련 β-갈락토시다아제 (Senescence-Associated β-galactosidase, SA-β gal) 염색 및 오일 레드 O (Oil red O) 염색을 수행한 후 W/B(western blotting)을 통하여 노화관련 단백질의 발현 변화를 분석하였다.

심장조직은 냉동절편을 제작하여, 대동맥굴 (aortic sinus)의 동맥경화 병변을 알아보기 위해 오일 레드 O 염색 및 헤마톡실린-에오신 염색을 수행하였다. 혈액으로부터 혈청을 분리한 후, 총콜레스테롤, HDL-콜레스테롤, LDL-콜레스테롤 및 중성지방을 측정하였다.

11. 단백질 추출 및 웨스턴 블롯 분석

세포를 60 mm 배양접시에 분주한 후, 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 하루밤 배양하였다. 라나토시드-C, ABT263, 라파마이신을 처리 한 후, 37℃, 5% CO2 배양기에서 3일 동안 배양하였다. 세포를 1×인산완충용액으로 세척한 후, RIPA 완충액 (12 mM EDTA, 137 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM Na3VO4 (Sigma-Aldrich, USA) 10 mM NaF (Sigma), 1 mM PMSF (Sigma), 1% Triton X-100, 10% 글리세롤, 프로테아제 억제 칵테일 (Roche, Germany))를 첨가하여 용해(lysis)하였다. 용해된 세포를 1.5 ml 튜브에 옮기고, 3-4회 피펫팅한 다음, 얼음 위에서 20분간 방치하였다. 12,000 rpm에서 20분간 원침하여 상청액을 회수하였다. 상청액의 단백질 농도를 BCA 분석으로 정량하였다.

조직에 RIPA 완충액을 넣고 WiseTis homogenizer HG-15D (DAIHAN Scientific, Seoul, South Korea)로 분쇄하였다. 4℃에서 12,000 rpm으로 20분간 원심분리하고, 상청액을 새 튜브로 옮겼다. 상청액의 단백질 농도를 BCA 법으로 정량하였다.

단백질 30 μg을 전기영동 (SDS-PAGE)한 후, 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 전기영동 후, 단백질을 겔에서 폴리비닐리덴 플루오라이드 멤브레인 (Polyvinylidene fluoride membrane, Pall Corporation)으로 옮겼다. 멤브레인을 상온에서 2시간동안 5% DifcoTM skim milk 용액 (Becton, Dickinson and Company, USA)로 처리하고, 1차 항체를 첨가한 한 후, 2시간 동안 상온에서 반응시켰다. 1차 항체로 항-p53 항체, 항-p21 항체, 항-p16 항체, 항-caspase 3 항체, 항-PARP 항체, 항-GAPDH 항체는 Santa Cruz Biotechnology, Inc. 에서, 항-인산화-Rb 항체는 New England Biolabs (Ipswich, MA, USA)에서, 항-SOD2 항체와 항-catalase 항체는 Bioworld Technology Inc. (Louis Park, MN, USA)에서, 항-α-smooth muscle actin 항체, 항-CD9 항체와 항-type I collagen 항체는 Abcam (Cambridge, UK)에서 구입하였다. 1차 항체 처리한 멤브레인을 TBST (20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 137 mM NaCl, 0.1% Tween 20)로 15분씩 3회 세척하였다. 2차 항체를 처리하여 60분간 반응시켰다. TBST로 60분 이상 세척한 후 ECL 검출 키트 (Elpis Biotech, Daejeon, South Korea)을 사용하여 단백질 발현을 확인하였다.

12. 조직 표본 제작 및 염색

10% 포르말린 용액에 고정한 조직을 파라핀으로 포매하고 4 μm로 절단하여 조직 표본을 제작하였다. 조직 표본에서 파라핀을 제거한 후, 헤마톡실린-에오신 염색 및 트리크롬 염색을 수행하였다. 폐 섬유화 정도는 트리크롬 염색 후, i-SolutionTM software program (IMT Inc., Canada)을 이용하여 콜라겐 염색 정도를 분석하여 측정하였다.

13. 임상시험 화합물로부터 세노리틱스 및 세노모르픽스 효능 약물 탐색

독소루비신 처리하여 조기노화를 유도한 사람 섬유아세포와 사람 혈관내피세포에서 2,150종의 화합물을 대상으로 세노리틱스 및 세노모르픽스 효능 물질을 탐색한 결과, 다수의 화합물을 선별할 수 있었다. 이 중에서 라나토시드-C에 대해 추가적인 실험을 진행하였다.

14. 통계분석

값은 평균과 표준에러 (standard error)로 표시하였다. 본 연구의 통계처리는 one-way ANOVA 분석하고 Turkey post hoc 검증하여 통계적인 유의성을 검토하였다.

<실시예 1> 라나토시드-C의 세노모르픽스 작용 확인

1) 사람 섬유아세포에 대한 라나토시드-C의 세노모르픽스 작용 확인

사람 섬유아세포에 독소루비신을 처리하여 조기 세포노화를 유도하였다. 조기 노화세포에 0.01% DMSO (NT), 100 nM 라나토시드-C (Lana-C), 100 nM 라파마이신 (Rap), 100 nM ABT263 (ABT)을 처리하고 4일 후, 세포의 노화정도를 SAβG 활성염색, 세포생존을 CCK-8 분석으로 확인하였다. 라파마이신은 세포노화를 억제하는 것으로 알려진 세노모르픽스 (senomorphics)의 일종이며, ABT263은 노화세포 특이적 세포사멸을 유도하는 것으로 알려진 세포리틱스 (senolyitcs)의 일종으로 양성대조 약물로 사용하였다.

그 결과, 도 1A 및 도 1B와 같이 독소루비신 처리에 의해 조기 세포노화가 유도된 사람 섬유아세포에 라나토시드-C를 100 nM 처리하였을 때, DMSO 처리한 군에 비해 SAβG 활성이 유의하게 (p<0.001) 감소하였으며, 도 1C와 같이 세포생존에는 유의한 차이가 없었다.

상기 결과로부터 라나토시드-C의 SAβG 활성 감소 효과는 라파마이신, ABT263에 비해 현저하게 우수한 것을 확인할 수 있었다.

조기 노화 사람 섬유아세포뿐만 아니라, 복제노화 사람 섬유아세포에서도 라나토시드-C가 노화세포 특이적인 세포독성을 나타내는지 확인하하기 위해, 젊은 섬유아세포와 복제노화 섬유아세포에 라나토시드-C (100 nM)를 처리한 결과, 도 2A와 같이 세포생존은 차이가 없으나 도 2B 및 도 2C와 같이 복제노화된 섬유아세포의 SAβG 활성이 라파마이신보다 현저하게 감소하였다.

또한, 복제노화 사람섬유아세포에 대한 라나토시드-C의 세노모르픽스 효과를 p53, p16 웨스턴 블롯 분석으로 확인하였다.

그 결과, 도 2D와 같이 라나토시드-C 처리에 의해 노화세포에서 노화마커 단백질 p53, p16의 발현이 농도의존적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과로부터 라나토시드-C는 사람 섬유아세포에서 노화세포의 기능과 형태를 젊은 세포로 복원시킬 수 있는 새로운 세노모르픽스 작용하는 약물임을 확인할 수 있었다.

2) 사람 망막색소상피세포에 대한 라나토시드-C의 세노모르픽스 작용 확인

사람 망막색소상피세포에 독소루비신을 처리하여 조기 세포노화를 유도한 후, 조기 노화세포에 0.01% DMSO, 100 nM 라나토시드-C, 100 nM 라파마이신, 100 nM ABT263을 처리하고 4일 후, 세포노화 정도를 SAβG 염색으로 확인하였으며, 세포의 세포생존을 CCK-8 분석으로 확인하였다.

그 결과, 도 5A 내지 5C와 같이 독소루비신 처리에 의해 조기 세포노화가 유도된 사람 망막색소상피세포에 라나토시드-C를 처리하였을 때, 세포성장이 농도의존적으로 억제되고 있으나 이는 노화세포 특이적인 세포사멸에 의한 것이 아니였으며, DMSO 처리한 군에 비해 SAβG 활성 염색이 유의하게 (p<0.001) 감소한 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과로부터 라나토시드-C은 사람 망막색소상피세포에서 노화세포의 기능과 형태를 젊은 세포로 복원시킬 수 있는 새로운 세노모르픽스로 작용할 수 있음이 확인되었다.

<실시예 2> 라나토시드-C의 세노리틱스 작용 확인

사람 제대혈관내피세포에 대한 라나토시드-C의 세노리틱스 작용 확인

사람 제대혈관내피세포에 독소루비신을 처리하여 조기 세포노화를 유도한 후, 조기 노화세포에 0.01% DMSO, 100 nM 라나토시드-C, 100 nM 라파마이신, 100 nM ABT263을 처리하고 4일 후, 세포노화 정도를 SAβG 염색으로, 세포의 세포생존을 CCK-8 분석으로 확인하였다.

그 결과, 도 3A 및 도 3B와 같이 독소루비신 처리에 의해 조기 세포노화가 유도된 사람 혈관내피세포에 라나토시드-C를 100 nM 처리하였을 때, DMSO 처리한 군에 비해 SAβG 활성 염색이 유의하게 (p<0.0001) 감소하였다. 상기 결과와 같이 라나토시드-C의 효과는 라파마이신에 비해 현저하게 우수한 것을 확인할 수 있었다.

그러나 도 3C와 같이 조기 노화된 혈관내피세포에 대한 세포생존은 DMSO 처리군과 비교하여 유의하게 차이가 있었다. 이러한 결과는 라나토시드-C가 노화된 세포를 사멸시킴으로써 SAβG 활성이 감소하는 것으로, 라나토시드-C이 노화된 혈관내피세포의 세포사멸을 유도하는 세노리틱스로 작용할 수 있음이 확인되었다.

조기 노화세포뿐만 아니라, 복제노화 혈관내피세포에 대해서도 라나토시드-C가 세노리틱스로 작용하는지 확인하였다.

예상대로, 도 4A 및 도 4B와 같이 라나토시드-C 처리에 의해 복제노화 혈관내피세포에서 SAβG 활성이 감소하였으며, 세포사멸을 유도하는 caspase-3 활성이 세노리틱스로 알려진 ABT263 처리에 의해 증가되었다. 또한, 도 4D와 같이 라나토시드-C에 의해 caspase-3 활성이 농도의존적으로 증가되는 것을 확인할 수 있었다. 반면, 도 4C 및 도 4D와 같이 상기 세포사멸효과가 젊은 혈관내피세포에서는 관찰되지 않았다.

상기 결과로부터 라나토시드-C는 사람 혈관내피세포에서 노화세포 특이적인 세포사멸을 유도하는 새로운 세노리틱스로 작용할 수 있음이 확인되었다.

<실시예 3> 폐 섬유화에 대한 라나토시드-C의 효능 확인

생쥐에서 블레오마이신에 의한 폐 섬유화는 폐 조직의 세포노화와 관련이 있는 것으로 잘 알려져 있다 (Schafer MJ, White TA, Iijima K, Haak AJ, Ligresti G, Atkinson EJ, et al. Nature communications. 2017;8:14532.).

폐 섬유화 유도 전의 체중과 17일째 체중 변화를 조사한 결과, 도 6B와 같이 NT 군에 비해 PBS 군과 Lana-C 군에서 체중 증가가 현저히 감소하였으나, PBS 군에 비해 Lana-C 군의 체중이 더 증가한 것을 확인할 수 있었다.

또한, 폐 조직 표본 제작하여, 헤마톡실린-에오신 염색, 트리크롬 염색을 하여 폐 조직의 손상 정도와 폐 섬유화 정도를 분석하였다.

그 결과, 도 6C 내지 7E와 같이 Lana-C 군에서 PBS 군에 비해 폐 조직 손상과 폐 섬유화 정도가 통계적으로 유의하게 감소하였다. 또한, 도 6F와 같이 블레오마이신에 의해 증가하는 섬유화 및 노화 마커 단백질들(Col1a, αSMA, p53, p21 및 p16)의 발현이 Lana-C 군에서 현저히 감소된 것을 확인 할 수 있었다.

상기 결과로부터 라나토시드-C가 블레오마이신에 의해 유도되는 폐 섬유화를 저해하는 효과를 나타내는 것이 확인되었다.

<실시예 4> 라나토시드-C에 의한 ApoE 결손 생쥐의 죽상경화 병변 감소 효과 확인

라나토시드-C가 죽상경화 병변을 저해하는 효능이 있는지 ApoE 결손 생쥐에서 확인하였다. ApoE 결손 생쥐에게 고지방식이 (HFD, high fat diet)를 6주를 먼저 시행하고, 고지방식이와 함께 라나토시드-C (Lana-C 군)과 대조군으로 DMSO (NT 군)를 각각 주2회 6주 동안 복강주사하고 도 7A와 같이 생쥐를 희생시킨 후 혈청 중성지방, 총콜레스테롤, 고밀도지단백 및 저밀도지단백의 농도를 측정하였다.

또한, 도 7D 내지 도 7G와 같이 대동맥굴 부위의 죽상경화 병변을 측정하기 위해 생쥐의 심장으로부터 대동맥굴 부위를 절제하여, OCT compound에 포매하였다. 냉동조직절편기를 이용하여 관상동맥이 시작되는 부위부터 대동맥판막이 끝나는 부위까지 20 μm 두께로 연속 냉동 절편을 제작하였다. 제작된 조직 절편에 Oil-red O 염색, Hematoxylin-eosin 염색을 수행하고, 죽상경화 병변의 면적을 전체 동맥 면적에서 Oil-red O로 염색된 부위를 Image J 프로그램 (Wayne Rasband, National Institutes of Health, USA)을 이용하여 측정하였다.

대동맥의 죽상경화 병변을 측정하기 위하여 수술용 현미경에 마우스를 놓은 후 미세수술 기구를 사용하여 대동맥을 조심스럽게 적출하고, 대동맥 주위의 지방조직을 제거한 후, 노화 정도를 측정하기 위하여 SA-β-gal 염색을 수행하였으며, 죽상경화증 병변을 확인하기 위하여 Oil-red O 염색을 수행하였다.

그 결과, 도 7B 및 도 7C와 같이 라나토시드-C 투여군에서 대조군 (NT)과 비교하여 체중과 도 7D와 도 7E의 혈청 지질함량 및 도 7F와 도 7G의 대동맥굴의 동맥경화 병변은 차이가 확인되지 않았으나, 도 8 및 도 9와 같이 대동맥의 죽상경화 병변과 SA-β-gal 염색 면적이 통계적으로 유의하게 감소하였다.

상기 결과로부터 라나토시드-C가 죽상경화 병변의 발생을 저해하는 효과를 나타내는 것이 확인되었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (13)

1. 라나토시드-C를 유효성분으로 함유하는 세노모르픽스 조성물.
2. 청구항 1에 있어서, 상기 세노모르픽스는 노화세포의 기능을 정상세포로 회복시키는 것을 특징으로 하는 세노모르픽스 조성물.
3. 청구항 2에 있어서, 상기 노화세포는 약물처리 또는 계대배양으로 노화가유도된 섬유아세포, 혈관내피세포 및 망막색소상피세포로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 세노모르픽스 조성물.
4. 라나토시드-C를 유효성분으로 함유하는 세노리틱스 조성물.
5. 청구항 4에 있어서, 상기 세노리틱스는 노화세포를 선택적으로 사멸시키는 것을 특징으로 하는 세노리틱스 조성물.
6. 청구항 5에 있어서, 상기 노화세포는 약물처리 또는 계대배양으로 노화가유도된 섬유아세포, 혈관내피세포 및 망막색소상피세포로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 세노리틱스 조성물.
7. 라나토시드-C를 유효성분으로 함유하는 세포노화 관련 질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
8. 라나토시드-C를 유효성분으로 함유하는 심혈관질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
9. 청구항 8에 있어서, 상기 라나토시드-C는 노화세포를 선택적으로 사멸시키거나 노화세포의 기능 또는 형태를 정상세포로 회복시켜 심혈관질환을 예방 또는 치료하는 것을 특징으로 하는 약학조성물.
10. 청구항 8에 있어서, 상기 심혈관질환은 죽상동맥경화증, 급성 심근경색, 정맥 폐색증, 말초 동맥 폐색증, 고혈압 및 심부전으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학조성물.
11. 라나토시드-C를 유효성분으로 함유하는 안구질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
12. 청구항 11에 있어서, 상기 라나토시드-C는 노화세포를 선택적으로 사멸시키거나 노화세포의 기능 또는 형태를 정상세포로 회복시켜 안구질환을 예방 또는 치료하는 것을 특징으로 하는 약학조성물.
13. 청구항 11에 있어서, 상기 안구질환은 망막증, 각막염, 황반변성, 안구건조증, 녹내장 및 맥락막 혈관신생증으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학조성물.

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