KR102597924B1 - 저분자량 히알루론산을 포함하는 피부 주름 및 탄력 개선용 화장료 조성물 및 이의 제조 방법 - Google Patents
저분자량 히알루론산을 포함하는 피부 주름 및 탄력 개선용 화장료 조성물 및 이의 제조 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 저분자량 히알루론산(Hyaluronic Acid)을 포함하는 피부 주름 및 탄력 개선용 화장료 조성물 및 이의 제조 방법에 관한 것으로서, 상기 방법에 따르면 콘드로이티나아제 ABC(Chondroitinase ABC, CAS No. 9024-13-9)를 이용하여 저분자화한 평균 분자량 378 내지 400 Da의 저분자량 히알루론산을 제조할 수 있고, 피부 탄력 인자의 발현을 증가시키고 콜라겐 분해효소 유전자의 발현을 감소시키므로, 이를 효과적으로 피부 주름 및 탄력 개선에 이용할 수 있다.
Description
본 발명은 저분자량 히알루론산을 포함하는 피부 주름 및 탄력 개선용 화장료 조성물 및 이의 제조 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 378 내지 400 Da의 저분자량 히알루론산, 및 히알루론산 또는 이의 염에 콘드로이틴 분해효소를 반응시킴으로써 저분자화된 히알루론산을 수득하는 방법에 관한 것이다.
히알루론산(Hyaluronic acid)은 N-아세틸-D-글루코사민(N-Acetyl-D-glycosamine)과 D-글루쿠론산(D-glucuronic acid)이 결합한 모노머(Monomer)를 기본 골격으로 이들이 반복적으로 결합되어 있는 폴리사카라이드(Polysaccharide)를 말한다. 히알루론산은 주로 포유동물의 결합조직, 표피, 신경 조직에 분포하는 글라이코사미노글리칸(Glycosaminoglycan) 중 하나로, 사람의 경우 피부, 연골 등에 주로 분포하고 있으며 물 분자와 결합하여 조직 내에 수분을 유지하는 역할을 한다. 히알루론산의 높은 수분 보유능과 안전성으로 피부 보습을 위한 화장품 소재로 주목을 받고 있으며, 이 외에도 인공 눈물, 필러 등에 주요 소재로 사용되고 있다.
히알루론산은 초기에 닭의 벼슬에서 분리, 추출되어 사용되어 왔으나, 최근에는 미생물을 이용하여 생산해 사용 중이다. 생산한 히알루론산은 N-아세틸-D-글루코사민과 D-글루쿠론산의 결합체인 모노머가 반복되는 길이에 따라 다양한 형태로 나타날 수 있다.
기존의 화장품 원료로 사용하는 히알루론산은 일반적으로 작게는 3,000 Da에서 크게는 1,410,000 Da 이상으로 사용하고 있어 히알루론산의 피부 흡수 촉진과 거리가 멀다. 반면, 기존에 저분자량의 히알루론산을 제조하는 방법으로 강산, 방사선 처리 등과 같이 인체에 유해한 공정을 통해 고분자량의 히알루론산을 분해한 저분자량 히알루론산을 제조하고 있다.
이러한 방법으로 제조된 저분자량의 히알루론산은 N-아세틸-D-글루코사민과 D-글루쿠론산이 결합되었을 때의 분자량인 378 Da 이하로 나타날 수 있다. 모노머인 N-아세틸-D-글루코사민과 D-글루쿠론산의 분자량을 더한 것보다도 작은 분자량의 히알루론산은 모노머 구조가 손상되어야만 발생할 수 있는 것으로 유추할 수 있다.
그 크기가 모노머의 분자량보다 크다고 하더라도, 히알루론산의 구조를 인식하여 특정 부분을 분해하는 것이 아닌 무작위적인 분해에 의한 결과물이기 때문에, 이러한 경우 구조가 훼손되어 온전한 히알루론산으로 보기 어렵다.
히알루론산이 피부 수분 공급에 가장 대표적인 화장품 소재로 주목받고 있는 만큼, 피부 흡수를 높일 수 있는 더 발전된 형태의 히알루론산에 대한 요구가 계속되고 있기 때문에 이러한 수요에 발맞춰 기술 개발이 필요한 실정이다.
이에 본 발명자들은 소듐 히알루로네이트(Sodium hyaluronate)를 콘드로이티나아제 ABC(Chondroitinase ABC)와 반응시켜 저분자량 히알루론산(Hyaluronic Acid)을 제조하고, 인간 진피섬유아세포(Human dermal fibroblast)에 처리하여 확인한 결과 고분자량 히알루론산 대비 탄력 인자인 COLIA1(Collagen 1 alpha 1)의 발현을 증가시키고 콜라겐 분해 효소인 MMP1(Matrix Metalloprotease 1)의 발현을 감소시킴으로써, 피부 주름 및 탄력 개선 효과를 발휘할 수 있음을 확인하였다.
이에, 본 발명의 목적은 평균 분자량 378 내지 400 Da의 저분자량 히알루론산을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 평균 분자량 378 내지 400 Da의 저분자량 히알루론산을 포함하는 피부 주름 및 탄력 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 히알루론산 또는 이의 염; 및 콘드로이틴 분해효소를 반응시키는 반응 단계를 포함하는 저분자량 히알루론산의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 평균 분자량 378 내지 400 Da의 저분자량 히알루론산을 포함하는 화장료 조성물의 피부 주름 및 탄력 개선 용도에 관한 것이다.
본 발명은 저분자량 히알루론산(Hyaluronic Acid)을 포함하는 피부 주름 및 탄력 개선용 화장료 조성물 및 이의 제조 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 평균 분자량 378 내지 400 Da의 저분자량 히알루론산은 콘드로이티나아제 ABC(Chondroitinase ABC)에 의해 저분자화된 것으로서 고분자량 히알루론산 대비 피부 탄력 인자의 발현을 촉진하고 콜라겐 분해효소 유전자의 발현을 억제시키는 효과가 우수하다.
또한 “The 500 Dalton rule for the skin penetration of chemical compounds and drugs”(2000, Jan D. Bos et al, Exp Dermatol.)에 의하면 본 발명에서 제공하는 378 내지 400 Da의 저분자 히알루론산은 고분자 히알루론산 대비 피부 투과도가 현저히 높을 것으로 예상되며, 효소 처리 시 친수성 잔기인 -OH기 등의 훼손 없이 결합구조에 대한 절단만 수행되므로, 히알루론산 고유의 기능인 피부 보습 효과 또한 유지될 것으로 기대할 수 있다.
이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일 양태는 평균 분자량 378 내지 400 Da의 저분자량 히알루론산이다.
본 발명에 있어서 상기 저분자량 히알루론산의 평균 분자량은 바람직하게는 397 내지 400 Da인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 양태는 평균 분자량 378 내지 400 Da의 저분자량 히알루론산을 포함하는 피부 주름 및 탄력 개선용 화장료 조성물이다.
본 발명에 있어서 상기 저분자량 히알루론산의 평균 분자량은 바람직하게는 397 내지 400 Da인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예컨대, 에멀젼, 화장수, 에센스, 크림 등의 일반 화장료 조성물 외에도 노화 기능성 화장료, 미백 기능성 화장료 등 다양한 기능성 화장료 조성물에도 적용 가능하다.
또한, 상기 화장료 조성물은 다양한 제형으로 제조할 수 있으며, 제형에 특별한 제한은 없고 예컨대, 크림, 화장수, 에멀젼, 에센스 등, 더욱 구체적으로 유연화장수, 영양화장수, 에센스, 영양에멀젼, 영양크림, 아이크림, 마사지크림, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 파우더, 팩, 모발용 화장품류, 바디에멀젼, 바디크림, 바디오일, 바디에센스, 바디 클렌저 등과 같은 제형으로 제조 가능하다.
바람직한 양태로서, 본 발명의 화장료 조성물은 크림, 에멀젼 또는 에센스의 제형일 수 있다. 이때 사용되는 담체 또는 첨가제는 화장품의 제형에 따라 선택적으로 사용할 수 있다.
따라서, 본 발명에서 사용되는 화장료 조성물은 상기 성분들 외에 일반적으로 크림, 에멀젼, 에센스 등과 같은 화장료에 사용될 수 있는 성분, 예를 들어, 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한(制汗)제, 방부제 및 용제를 더 포함할 수 있고, 선호도에 따라 향료를 더 첨가할 수 있다.
또한 본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화 아연 등이 이용될 수 있다. 본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로 플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸에테르와 같은 추진제를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸카보네이트, 에틸아세테이트, 벤질알코올, 벤질벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다. 본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라가칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 히알루론산 또는 이의 염; 및 콘드로이틴 분해효소를 반응시키는 반응 단계를 포함하는 저분자량 히알루론산의 제조 방법이다.
본 발명에 있어서 상기 히알루론산의 염은 소듐 히알루로네이트(Sodium hyaluronate), 소듐 히알루로네이트 크로스폴리머(Sodium Hyaluronate Crosspolymer), 하이드록시프로필트리모늄 히알루로네이트(Hydroxypropyltrimonium Hyaluronate), 소듐 아세틸화 히알루로네이트(Sodium Acetylated Hyaluronate), 및 포타슘 히알루로네이트(Potassim Hyaluronate)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있고, 예를 들어, 소듐 히알루로네이트인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 상기 콘드로이틴 분해효소는 콘드로이티나아제 ABC(Chondroitinase ABC), 콘드로이티나아제 AC(Chondroitinase AC) 및 콘드로이티나아제 B(Chondroitinase B)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있고, 예를 들어, 콘드로이티나아제 ABC(CAS No. 9024-13-9)인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 상기 반응 단계는 18 내지 60℃에서 수행되는 것일 수 있고, 바람직하게는 18 내지 55℃, 18 내지 50℃, 18 내지 45℃, 18 내지 40℃, 27 내지 60℃, 27 내지 55℃, 27 내지 50℃, 27 내지 50℃, 27 내지 45℃, 27 내지 40℃, 35 내지 60℃, 35 내지 55℃, 35 내지 50℃, 또는 35 내지 45℃에서 수행되는 것일 수 있고, 예를 들어, 35 내지 40℃에서 수행되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 반응 단계의 온도 조건이 18℃ 미만일 경우, 효소의 활성이 부족해짐에 따라 반응 효율이 감소할 수 있다. 반대로 온도 조건이 60℃를 초과하는 경우, 효소의 단백질 구조 변성 또는 히알루론산 모노머의 구조 변성에 따른 활성 소실이 나타날 우려가 있다.
본 발명에 있어서 상기 반응 단계는 1 내지 8시간 동안 수행되는 것일 수 있고, 바람직하게는 1 내지 6시간, 1 내지 4시간, 2 내지 8시간, 또는 2 내지 6시간 동안 수행되는 것일 수 있고, 예를 들어, 2 내지 4시간 동안 수행되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 반응 단계의 반응 시간이 1시간 미만일 경우, 반응이 충분히 수행되지 않아 반응효율이 감소할 수 있다.
본 발명에 있어서 상기 제조 방법은 반응 단계의 수행 후 70 내지 150℃의 온도 조건을 1 내지 20분 동안 유지시켜 반응을 종결시키는 반응종결 단계를 추가적으로 포함하는 것일 수 있다.
상기 반응 종결 단계의 온도 조건이 70℃ 미만이거나, 수행 시간이 1분 미만일 경우, 반응이 제대로 종결되지 않아 불필요한 효소 반응이 추가적으로 진행될 우려가 있다. 반대로 온도 조건이 150℃를 초과하거나, 수행 시간이 20분을 초과하는 경우, 히알루론산 모노머의 구조 변성에 따른 활성 소실이 나타날 우려가 있다.
상기 반응종결 단계는 바람직하게는 70 내지 130℃, 70 내지 110℃, 90 내지 150℃, 또는 90 내지 130℃에서 수행되는 것일 수 있고, 예를 들어, 90 내지 110℃에서 수행되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 반응종결 단계는 바람직하게는 1 내지 18분, 1 내지 16분, 1 내지 14분, 또는 1 내지 12분 동안 수행되는 것일 수 있고, 예를 들어, 1 내지 10분 동안 수행되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 상기 제조 방법은 반응종결 단계 이후 여과를 수행하는 여과 단계를 추가적으로 포함하는 것일 수 있다.
상기 여과 단계는 0.1 내지 1.0 μm의 필터를 사용하여 1회 이상 수행되는 것일 수 있고, 바람직하게는 2회 이상 수행되는 것일 수 있다.
상기 필터의 규격이 0.1 μm 미만일 경우, 원하는 분자량에 해당하는 저분자 히알루론산을 투과시키기 어려워 반응 결과물의 손실이 예상된다. 반대로 필터의 규격이 1.0 μm를 초과할 경우, 모노머 형태로 분해되지 않은 중간산물 또는 효소가 제거되지 않아 추가적인 정제 과정이 필요하게 될 가능성이 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 여과 단계는 제1 여과 단계 및 제2 여과 단계로 구분되어 수행되는 것일 수 있다.
상기 제1 여과 단계는 0.2 내지 0.8 μm의 필터를 사용하여 수행되는 것일 수 있고, 바람직하게는 0.2 내지 0.6 μm, 또는 0.4 내지 0.8 μm의 필터를 사용하여 수행되는 것일 수 있고, 예를 들어, 0.4 내지 0.6 μm의 필터를 사용하여 수행되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 제2 여과 단계는 0.1 내지 0.5 μm의 필터를 사용하여 수행되는 것일 수 있고, 바람직하게는 0.1 내지 0.3 μm, 또는 0.2 내지 0.5 μm의 필터를 사용하여 수행되는 것일 수 있고, 예를 들어, 0.2 내지 0.3 μm의 필터를 사용하여 수행되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 상기 제조 방법은 여과 단계의 수행 후 분리된 저분자량 히알루론산을 수득하는 수득 단계를 추가적으로 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 상기 저분자량 히알루론산의 평균 분자량은 378 내지 400 Da인 것일 수 있고, 바람직하게는 397 내지 400 Da인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 저분자량 히알루론산(Hyaluronic Acid)을 포함하는 피부 주름 및 탄력 개선용 화장료 조성물 및 이의 제조 방법에 관한 것으로서, 상기 방법에 따르면 콘드로이티나아제 ABC(Chondroitinase ABC, CAS No. 9024-13-9)를 이용하여 저분자화한 평균 분자량 378 내지 400 Da의 저분자량 히알루론산을 제조할 수 있고, 피부 탄력 인자의 발현을 증가시키고 콜라겐 분해효소 유전자의 발현을 감소시키므로, 이를 효과적으로 피부 주름 및 탄력 개선에 이용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 저분자량 히알루론산(Hyaluronic Acid)을 인간 진피섬유아세포(Human dermal fibroblast)에 처리한 경우 탄력 인자인 COLIA1의 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 저분자량 히알루론산을 인간 진피섬유아세포에 처리한 경우 콜라겐 분해 효소인 MMP1의 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 저분자량 히알루론산을 인간 진피섬유아세포에 처리한 경우 콜라겐 분해 효소인 MMP1의 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량)%, 고체/액체는 (중량/부피)%, 그리고 액체/액체는 (부피/부피)%이다.
제조예 1: 저분자량 히알루론산의 제조
소듐 히알루로네이트(Sodium hyaluronate)에 효소인 콘드로이티나아제 ABC(Chondroitinase ABC, CAS No. 9024-13-9)를 처리하여 35 내지 40℃의 온도 조건에서 2 내지 4시간 동안 반응시켜 378 Da 이상 400 Da 미만인 저분자량 히알루론산을 제조하였다.
구체적으로, 소듐 히알루로네이트에 정제수를 투입하여 약 30분가량 충분히 교반시켰다. 이후 콘드로이티나아제 ABC를 투입한 뒤 효소의 활성 온도인 35 내지 40℃에서 2 내지 4시간 동안 소듐 히알루로네이트가 충분히 분해될 수 있도록 반응시켰다. 반응이 끝난 후 90 내지 110℃의 온도 조건으로 1 내지 10분 동안 유지하여 반응을 종료시켰다.
0.5 μm 필터를 사용하여 1차 여과를 진행하고, 0.3 μm 필터를 사용하여 2차 여과를 진행하여 효소 반응에 의한 저분자량 히알루론산(실시예 1)을 제조하였다.
제조예 2: 효소 반응을 수행하지 않은 고분자량 히알루론산의 제조
상기 제조예 1의 제조 방법에서 콘드로이티나아제 ABC와의 반응 과정을 생략하여 수행하였다.
구체적으로, 소듐 히알루로네이트에 정제수를 투입하여 약 30분가량 충분히 교반시켰다. 이후 0.5 μm 필터를 사용하여 1차 여과를 진행하고, 0.3 μm 필터를 사용하여 2차 여과를 진행하여 고분자량 히알루론산(비교예 1)을 제조하였다.
제조예 3. 분자량별 히알루론산의 준비
화장품 원료로 이미 유통중인 히알루론산 중, 실시예 1의 히알루론산(378 내지 400 Da)과 비교했을 때 상대적으로 고분자량에 해당하는 히알루론산을 분자량별로 구매하여 피부 주름 및 탄력 인자의 발현 비교에 사용하였다.
구체적으로, 3,000 내지 5,000 Da(SHANDONG FOCUSCHEM BIOTECH)의 히알루론산(비교예 2), 5,000 내지 9,300 Da(QP, Japan)의 히알루론산(비교예 3), 8,000 내지 10,000 Da(SHANDONG FOCUSCHEM BIOTECH)의 히알루론산(비교예 4), 11,400 Da(BLOOMAGE BIOTECHNOLOGY CORP.LTD)의 히알루론산(비교예 5)을 구매해 사용하였다.
실험예 1: 액체크로마토그래피를 이용한 저분자량 히알루론산 분석
콘드로이티나아제 ABC를 이용하여 특이적으로 분해시켜 얻은 378 Da 이상 400 Da 미만의 저분자량 히알루론산을 액체크로마토그래피를 사용하여 분석하였다. 이를 위하여 음이온을 가진 분해 산물을 음이온교환수지 칼럼을 이용하여 232 nm에서 정량 분석하였다.
먼저 표준 용액의 제조를 위해서 히알루론산 표준 물질(Hyaluronic acid sodium salt, CAS No. 9067-32-7)을 칭량하고 완충용액인 33 mM Tris-HCl에 희석한 뒤, 60℃에서 완전히 용해시킨 용액을 준비하였다.
상기 용액 50 uL에 0.002 unit/uL의 콘드로이티나아제 ABC 50 uL와 완충용액 400 uL을 넣어 35 내지 40℃에서 2 내지 4시간 동안 반응시켰다.
반응이 끝난 뒤, 90 내지 110℃에서 1 내지 10분간 가열하고 0.5 μm 필터를 사용하여 1차 여과를 진행하고, 0.3 μm 필터를 사용하여 2차 여과를 진행하여 표준 용액을 제조하였다.
액체크로마토그래피의 수행을 위하여, 10 uL의 샘플에 대하여 40℃의 온도를 갖는 칼럼에서 0.01 M NaCl(pH 3.5) 용액을 이동상으로 하여 고속액체크로마토그래피를 수행하였으며, 232 nm 파장을 사용하여 검출하였다.
이후 히알루론산 표준용액을 사용하여 얻은 피크 면적으로 검량선을 작성하고, 검량선 식을 활용하여 시험용액 내의 히알루론산 농도를 구했다.
| 분석 샘플 | 시험 결과 (%) |
| 실시예 1 (저분자량 히알루론산) | 88.33 |
| 비교예 1 (고분자량 히알루론산) | Not Detected |
상기 표 1에서 확인할 수 있듯이, 실시예 1의 히알루론산을 상기 방법으로 분석하였을 때, 액체크로마토그래피 결과 약 88.33%가 히알루론산 이당류로 구성되어 있음을 확인하였다. 반면, 비교예 1인 고분자량 히알루론산은 분석 결과 히알루론산 이당류가 검출되지 않음을 확인하였다.
실험예 2: 저분자량 히알루론산의 피부 주름, 탄력 인자 증가 효과 확인
실시예 1의 히알루론산이 피부 주름, 탄력에 관여하는 인자들에 미치는 영향을 분석하였다.
구체적으로, 각각 10% 우태아혈청(FBS)과 1% 페니실린을 포함하는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배지를 사용하여 96 웰 플레이트(well plate)에 3.0 x 104 개의 인간 진피섬유아세포(Human dermal fibroblast)를 분주한 뒤 24시간 동안 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 이후 새로운 배지로 교체하고 실시예 1 및 비교예 1 내지 5에 해당하는 히알루론산 시료를 각각 0.5, 1 및 2%(v/v)의 농도로 처리하여 24시간 동안 배양하였다.
배양 후, 식염수로 충분히 세척하여 cDNA를 합성하고 100 ng/mL씩 정량한 다음 RT-qPCR(Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction)을 진행하였다. 피부 주름, 탄력 인자인 COLIA1(Collagen 1 alpha 1)과 분해 효소인 MMP1(Matrix Metalloprotease 1)의 발현을 확인하였다.
| 서열번호 | 프라이머 방향 | 서열 |
| 1 | COLIA1 정방향 | 5'-CCTGGAAAGAATGGAGATGATG-3' |
| 2 | COLIA1 역방향 | 5'-ATCCAAACCACTGAAACCTCTG-3' |
| 3 | MMP1 정방향 | 5'-TGAAAAGCGGAGAAATAGTGG-3' |
| 4 | MMP1 역방향 | 5'-GAGGACAAACTGAGCCACATC-3' |
| 5 | β-actin 정방향 | 5'-GGCCATCTCTTGCTCGAAGT-3' |
| 6 | β-actin 역방향 | 5'-GAGACCTTCAACACCCCAGC-3' |
각 유전자의 상대적인 발현량은 하우스키핑 유전자(Housekeeping gene)인 β-actin의 발현량으로 정규화(Normalization)하여 나타내었다. 실시예 1의 저분자량 히알루론산, 비교예 1의 효소 처리 전 히알루론산, 및 비교예 2 내지 5의 분자량별 히알루론산이 COLIA1 및 MMP1 발현에 미치는 영향을 분석하였다.
도 1에서 확인할 수 있듯이, 실시예 1의 저분자량 히알루론산은 비교예 1 내지 5의 히알루론산과 비교하였을 때 탄력 인자인 COLIA1의 발현량을 증가시켰고, 또한 시료의 처리 농도에 따라 증가하는 효과가 농도의존적으로 더 우세했다.
도 2에서 확인할 수 있듯이, 실시예 1의 저분자량 히알루론산은 비교예 1의 히알루론산과 비교하였을 때 콜라겐 분해효소 유전자인 MMP1의 발현을 감소시켰고, 또한 시료의 처리 농도에 따라 농도의존적으로 더욱 감소하는 효과가 나타났다.
Claims (9)
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- 히알루론산(Hyaluronic Acid) 또는 이의 염 및 콘드로이틴 분해효소를 반응시켜 평균 분자량 378 내지 400 Da의 저분자량 히알루론산을 생성시키는 반응 단계; 및 상기 저분자량 히알루론산을 이용하여 화장료 조성물을 제조하는 제조 단계;를 포함하는 피부 주름 및 탄력 개선용 화장료 조성물 제조 방법에 있어서,
상기 반응 단계는 18 내지 60℃에서 1 내지 8시간 동안 수행되는 것이며,
상기 반응 단계와 상기 제조 단계의 사이에, 70 내지 150℃의 온도 조건을 1 내지 20분 동안 유지시켜 반응을 종결시키는 반응종결 단계를 추가적으로 포함하며,
상기 반응종결 단계 이후 여과를 수행하는 여과 단계를 추가적으로 더 포함하는 것인, 피부 주름 및 탄력 개선용 화장료 조성물 제조 방법. - 제3항에 있어서, 상기 히알루론산의 염은 소듐 히알루로네이트(Sodium hyaluronate), 소듐 히알루로네이트 크로스폴리머(Sodium Hyaluronate Crosspolymer), 하이드록시프로필트리모늄 히알루로네이트(Hydroxypropyltrimonium Hyaluronate), 소듐 아세틸화 히알루로네이트(Sodium Acetylated Hyaluronate), 및 포타슘 히알루로네이트(Potassim Hyaluronate)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인, 피부 주름 및 탄력 개선용 화장료 조성물 제조 방법.
- 제3항에 있어서, 상기 콘드로이틴 분해효소는 콘드로이티나아제 ABC(Chondroitinase ABC), 콘드로이티나아제 AC(Chondroitinase AC) 및 콘드로이티나아제 B(Chondroitinase B)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인, 피부 주름 및 탄력 개선용 화장료 조성물 제조 방법.
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Journal of chromatography. biomedical applications, Vol 565, no 1, pp141-148* * |
| 대한화장품학회지, Vol.42, no.3, pp.235-245* * |
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