KR102574659B1 - 비선형 자가 희생 링커 및 이의 접합체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 적절한 조건 하에 절단가능하거나 변형가능하고 항체-약물 접합체의 소수성을 감소시키는 비선형 자가 희생 링커를 포함하는 링커-약물 화합물(LD) 및 항체-약물 접합체(ADC)에 관한 것이다.

Description

비선형 자가 희생 링커 및 이의 접합체
본 발명은 절단가능하거나 변형가능한 비선형 자가 희생(self-immolative) 링커를 포함하는 링커-약물 화합물(LD) 및 항체-약물 접합체(ADC)에 관한 것이다.
항체-약물 접합체(ADC)는 항체의 특이성과 세포독성 분자의 효능이 조합된 새로운 부류의 표적화된 치료법이다.
항체 및 표적 선택 외에, 약물 및 링커는 ADC 개발의 초점이 되어 왔다. 그 결과, 항체는 절단가능한 또는 비절단가능한 링커를 통해 다양한 세포독성 약물에 접합되어 왔다.
인간 환자의 치료용으로 이미 승인된 ADC의 예는 급성 골수성 백혈병의 치료용으로 미국 식품 의약청(FDA)에 의해 2000년에 승인된, 절단가능하고 산-가수분해가능한 링커를 통해 칼리케아마이신(calicheamicin)에 접합된 인간화 항-CD33 항체를 포함하는 Mylotarg™(젬투주맙 오조가마이신(gemtuzumab ozogamicin), Wyeth); 호지킨 림프종 및 역형성 큰세포 림프종(anaplastic large cell lymphoma)의 치료용으로 FDA에 의해 2011년에 승인된, 효소 절단가능한 링커를 통해 모노메틸 아우리스타틴 E(monomethyl auristatin E, MMAE)에 접합된 CD30에 대한 키메라 항체를 포함하는 ADC인 Adcetris™(브렌툭시맙 베도틴(brentuximab vedotin), Seattle Genetics); 및 이전에 트라스투주맙(trastuzumab) 및 탁산(taxane) 치료를 받은 HER2-양성 전이성 유방암 환자의 치료용으로 2013년 2월에 FDA에 의해 승인된 인간화 항-HER2 항체가 비절단가능한 티오에테르 링커를 통해 메르탄신(mertansine)(DM1로도 공지된 메이탄신(maytansine) 유도체)에 접합된 ADC인 Kadcyla™(T-DM1, 아도-트라스투주맙 엠탄신 또는 트라스투주맙 엠탄신, Roche)이다.
화학적으로 절단가능한 링커를 갖는 ADC와 비교하여, 효소 절단가능한 링커는 더 우수한 약물 방출의 제어를 달성할 수 있다. 그러나, 일부 효소 절단가능한 링커의 증가된 관련된 소수성은 특히 강한 소수성 약물을 갖는 ADC의 응집을 야기할 수 있다. 또한, 보다 소수성인 ADC는 동물 모델에서 순환으로부터 더 빠르게 제거된다. 이러한 더 빠른 제거는 상기 ADC에 대한 약물동력학(PK) 책임을 시사한다.
WO2014/124316(Novartis) 및 WO2015/177360(Synthon Biopharmaceuticals)에 개시된 바와 같이, ADC의 소수성은 항체의 중쇄 및 경쇄 모두의 Fab 및/또는 Fc 부분의 특정 위치에 있는 조작된 시스테인 잔기에 (소수성) 링커-약물을 접합시킴으로써 감소될 수 있다. 이러한 시스테인 잔기에 부착될 때, 링커-약물은 항체를 둘러싼 친수성 수성 환경으로부터 차폐되며, 이는 ADC의 소수성을 감소시킨다.
대안적으로, 링커-약물 및 생성된 ADC의 소수성은 적절한 링커를 선택함으로써 감소될 수 있다. 예를 들어, WO2015/123679에서 시애틀 제네틱스사(Seattle Genetics)는 비접합된 항체와 유사한 접합체 소수성을 유지하기 위해 친수성 아미노산만을 포함하는 링커를 사용하였다. 대안적인 접근법에서, 폴리에틸렌 글리콜 중합체와 같은 수용성 기가 링커에, 예컨대, WO2014/100762(Bioalliance and Abgenomics)에서와 같이 약물 및 항체의 부착 부위 사이에 또는 WO2015/057699(Seattle Genetics)에서와 같이 평행한 위치에 포함되었다. 소수성을 최소화하기 위한 제3 접근법은 항체에 약물-중합체를 부가하는 것이었고, 각각의 중합체는 WO2012/171020(Mersana)에서와 같이 다수의 약물을 함유한다. 그러나, 큰 가용화 기를 부가하는 것은 이러한 접합체의 제조 복잡성을 증가시킨다.
링커-약물 및/또는 ADC의 소수성을 감소시키기 위한 전술한 접근법에도 불구하고, ADC의 응집을 (더) 감소시키고 관련된 PK 책임을 극복하기 위한 목적으로 ADC의 상기 소수성을 감소시키기 위한 새로운 전략이 필요하다.
본 발명은 적절한 조건 하에 절단가능하거나 변형가능하며 항체-약물 접합체의 소수성을 감소시키는, 비선형 자가 희생 링커를 포함하는 링커-약물 화합물(LD) 및 항체-약물 접합체(ADC)에 관한 것이다.
제1 양태에서, 본 발명은 하기 화학식(I)의 링커-약물 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 수화물 또는 용매화물에 관한 것이다:
식 중에서,
V 1 은 화학적, 광화학적, 물리적, 생물학적, 또는 효소적 과정에 의해 절단되거나 변형될 수 있는 조건부 절단가능한 또는 조건부 변형가능한 모이어티이고;
Z는 페놀성 하이드록실 기를 포함하는 세포독성 약물이며, Z는 페놀성 하이드록실 기를 통해 링커에 부착되고, 바람직하게는 Z는 듀오카르마이신(duocarmycin) 또는 CBI 이량체 유도체이며, 더욱 바람직하게는 Z는 듀오카르마이신 유도체이고;
n은 0, 1, 2, 또는 3이며;
m은 0 또는 1이다.
제2 양태에서, 본 발명은 하기 화학식(I)의 링커-약물 화합물을 포함하는 항체-약물 접합체에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양태는 링커-약물 화합물 또는 항체-약물 접합체의 약제학적 조성물 및 특히 인간 고형 종양 및 혈액학적 악성종양의 치료에서 약제로서의 이들의 용도를 포함한다.
도 1a 및 1b. 링커-약물 화합물의 구조식.
도 2. 본 발명의 비선형 링커-약물을 포함하는 ADC 대 선형 vc-seco-DUBA(링커-약물 화합물 1)를 포함하는 비교군 ADC의 상대적 소수성.
도 3a. 본 발명의 비선형 링커-약물을 포함하는 야생형 및 조작된 시스테인 항-PSMA ADC 대 선형 vc-seco-DUBA(링커-약물 화합물 1)를 포함하는 비교군 항-PSMA ADC의 상대적 소수성.
도 3b. 본 발명의 비선형 링커-약물 또는 선형 vc-seco-DUBA(링커-약물 화합물 1)를 포함하는 조작된 시스테인 항-PSMA ADC 대 상기 링커-약물을 포함하는 비교군 비조작된 항-PSMA wt ADC(PSMA)의 상대적 소수성.
도 3c. 본 발명의 비선형 링커-약물 또는 선형 vc-seco-DUBA(링커-약물 화합물 1)를 포함하는 야생형 및 조작된 시스테인 항-PSMA ADC 대 선형 vc-seco-DUBA(링커-약물 화합물 1)를 포함하는 비교군 비조작된 항-PSMA wt ADC(PSMA)의 상대적 소수성의 델타.
도 4. 본 발명의 비선형 링커-약물을 포함하는 조작된 시스테인 항-PSMA ADC의 HIC 크로마토그램.
도 5. 마우스에서 생체내 LNCaP-C4.2 세포주 이종 이식 효능: 각각 2 mg/kg(도 5a) 또는 5 mg/kg(도 5b)의 단일 주사 후 링커-약물 화합물 4, 7 또는 8을 포함하는 조작된 시스테인 항-PSMA(VH S41C) ADC 대 선형 vc-seco-DUBA(링커-약물 화합물 1)를 포함하는 비교군 조작된 시스테인 항-PSMA(VH S41C) ADC.
항체-약물 접합체(ADC)는 소분자 치료법의 효능과 항체의 표적화 능력을 조합한 새로운 부류의 항암 치료법으로 떠오르고 있다. 이 두 가지 성분을 하나의 새로운 분자 물질(molecular entity)로 조합함으로써, 높은 세포독성 소분자 약물이 암 표적 조직에 전달되어, 소분자의 잠재적인 전신 독성 부작용을 감소시키면서 효능을 향상시킬 수 있다.
항체는 DNA에 결합하는 소분자(예컨대, 안트라사이클린), DNA를 알킬화하거나 가교시키는 소분자(예컨대, 각각 듀오카르마이신 또는 CBI 또는 피롤로벤조디아제핀 이량체), DNA 가닥 파손(break)을 유발하는 소분자(예컨대, 칼리케아마이신) 또는 미세소관을 파괴하는 소분자(예컨대, 메이탄시노이드, 아우리스타틴 및 튜불리신)를 포함하는 다양한 세포독성 약물에 접합되어 왔다.
약물은 항체 아미노산 잔기의 측쇄, 예컨대 시스테인 또는 리신 잔기의 측쇄, 및 약물을 연결하는 특정 화합물을 통해 항체에 부착될 수 있다. 이 연결 화합물, 즉, 링커는 절단될 수 있으므로, 약물의 방출이 미리 결정된 위치에서, 예컨대 암세포 리소좀 내에서 일어나도록 시기가 조절되어 약물의 전신 독성 효과를 감소시킬 수 있다.
본 발명은 비선형 자가 희생 링커를 포함하는 하기 화학식(I)의 링커-약물 화합물, 즉 링커-약물, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염 수화물 또는 용매화물에 관한 것이다.
식 중에서,
V 1 은 조건부 절단가능하거나 조건부 변형가능한 모이어티이다.
Z는 페놀성 하이드록실 기를 포함하는 세포독성 약물이며, Z는 페놀성 하이드록실 기를 통해 링커에 부착된다.
각각의 m 및 n은 독립적으로 0 또는 양의 정수이다.
말레이미드 모이어티는 링커-약물을 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 접합하는데 사용된다.
자가 희생 링커는 2개의 이격된 화학적 모이어티를 정상적으로 안정한 3부분(tripartite) 분자로 공유결합시킬 수 있는 이작용성 화학적 또는 생화학적 모이어티로서 정의될 수 있다. 그것은 예컨대, 효소적 절단에 의해 3부분 분자로부터 이격된 화학적 모이어티 중 하나를 방출시킬 수 있고; 이러한 효소적 절단 후, 나머지 분자로부터 자발적으로 절단되어 이격된 화학적 모이어티 중 다른 하나를 방출시킬 수 있다. 링커는, 선형 링커와 대조적으로, (효소적) 절단을 위한 부위가 제1 화학적 모이어티 및 제2 화학적 모이어티의 부착 부위 사이에 있지 않을 때 비선형인 것으로 간주된다.
본 발명은 링커 및 세포독성 약물의 특정 조합이 비접합된(네이키드) 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 유사한 소수성을 갖는 ADC를 제조하는데 사용될 수 있다는 발견에 일부 기초한다. 비접합된 항체와 유사한 소수성을 얻기 위해 접합체를 설계함으로써, 생체내에서 제거의 감소, 및/또는 표적 세포(들)의 노출 증가를 포함하는 생체내 유리한 약물동력학적 프로파일과 같은 네이키드 항체의 특정한 바람직한 특성이 유지될 수 있다. 유리하게도, 이러한 접합체는 폴리에틸렌 글리콜 또는 다른 수용성 중합체와 같은 부가적인 가용화 기를 포함할 필요 없이 네이키드 항체와 유사한 소수성을 갖도록 설계될 수 있다.
화학식(I)의 화합물 내의 비선형 자가 희생 링커는 ADC의 소수성을 감소시키도록 설계된다. 본 발명자들은 세포독성 약물 및 항체의 부착 부위 사이의 링커에서의 원자의 수를 감소시킴으로써, ADC의 소수성 역시 비례하여 감소한다는 것을 확인하였다.
임의의 특정 이론에 얽매이기를 바라지 않으면서, 본 발명자들은 소수성 약물 및 항체 사이의 거리를 더 짧게 만드는 본 발명의 링커에서의 배열을 통해, 약물이 항체에 의해 항체를 둘러싼 친수성 수성 환경으로부터 차폐되어, ADC의 소수성이 감소된다고 생각한다.
링커는 세포독성 또는 정균 효과를 유도하는데 충분할 정도로 표적 세포에서 또는 표적 세포 내에서 세포독성 약물을 효율적으로 방출시킨다. 전형적으로, 링커는 접합체가 표적 세포에 의해 내재화되면 약물을 효율적으로 방출하도록 설계된다.
V 1 은 화학적, 광화학적, 물리적, 생물학적, 또는 효소적 과정에 의해 절단되거나 변형될 수 있는, 조건부 절단가능하거나 조건부 변형가능한 모이어티이다. 다시 말하면, 그것은 특정 조건에 있을 때 화학적, 광화학적, 물리적, 생물학적, 또는 효소적 과정에 의해 변형되고/되거나 절단되도록 설계된다. 이 조건은, 예를 들어 본 발명의 화합물을 수성 환경에 있게 하여 V 1 의 가수분해를 야기하는 것, 또는 본 발명의 화합물을 V 1 을 인식하고 절단하는 효소를 함유하는 환경에 있게 하거나 본 발명의 화합물을 환원 조건 하에 있게 하여 V 1 의 환원 및/또는 제거를 야기하는 것 또는 본 발명의 화합물을 산화 조건에 있게 하여 V 1 의 산화 및/또는 제거를 야기하는 것 또는 본 발명의 화합물을 방사선, 예컨대, UV 광과 접촉시켜 변형 및/또는 절단을 야기하는 것, 또는 본 발명의 화합물을 열과 접촉시켜 변형 및/또는 절단을 야기하는 것, 또는 본 발명의 화합물을 감압 하에 있게 하여 변형, 예컨대, 역고리화첨가(retrocycloaddition), 및/또는 절단을 야기하는 것, 또는 본 발명의 화합물을 상승된 압력 또는 고압 하에 있게 하여 변형 및/또는 절단을 야기하는 것일 수 있다. 이 조건은 본 발명의 화합물을 포유동물, 예를 들어 인간에게 투여한 후 충족될 수 있다.
바람직하게는, V 1 은 조건부 절단가능한 모이어티이다. 더욱 바람직하게는, V 1 은 효소 절단가능한 모이어티이다.
절단에 의해 약물을 방출하기 위한 적합한 인식 부위는 링커로부터 약물을 효율적으로 분리하는 인식 부위이다. 바람직하게는, 인식 부위는 펩타이드 절단 부위이다. 펩타이드 절단 부위의 예는 세포내 프로테아제, 예컨대 리소좀에 존재하는 세포내 프로테아제에 의해 인식되는 펩타이드 절단 부위를 포함한다.
일 구현예에서, V 1 은 펩타이드이다.
바람직한 구현예에서, V 1 은 단백질분해 효소(프로테아제), 예를 들어 플라스민(plasmin), 카텝신(cathepsin), 카텝신 B, 전립선 특이적 항원(PSA), 우로키나아제(urokinase) 유형 플라스미노겐 활성자(u-PA), 또는 표적 세포, 예를 들어 종양 세포의 부근 또는 내부에 존재하는 매트릭스 메탈로프로테아제의 계열의 구성원에 의해 인식가능하고 절단가능한, 디-, 트리- 또는 테트라-펩타이드, 즉 2개, 3개 또는 4개의 아미노산 잔기로 구성된 펩타이드이다. V 1 에 대한 적합한 펩타이드는, 비제한적으로, 알라닐페닐알라닐리신, 발릴류실리신, 알라닐류실리신, 발릴페닐알라닐리신, 발릴트립토파닐리신, 알라닐트립토파닐리신, 알라닐페닐알라닐시트룰린, 발릴류실시트룰린, 알라닐류실시트룰린, 발릴페닐알라닐시트룰린, 발릴트립토파닐시트룰린, 알라닐트립토파닐시트룰린, 페닐알라닐리신, 발릴리신, 발릴알라닌, 글리실페닐알라닐리신, 알라닐리신, 발릴시트룰린, 페닐알라닐시트룰린, 이소류실시트룰린, 트립토파닐리신, 트립토파닐시트룰린, 페닐알라닐아르기닌, 페닐알라닐알라닌, 알라닐류실알라닐류신, 알라닐아르기닐아르기닌, 류실리신, 및 류실시트룰린을 포함한다. 바람직하게는, V 1 은 발릴알라닌, 발릴리신, 발릴시트룰린, 페닐알라닐리신, 및 알라닐페닐알라닐리신로부터 선택된다. 더욱 바람직하게는, V 1 은 발릴시트룰린 및 발릴알라닌으로부터 선택된다.
V 1 은 그의 C-말단 측면을 통해 비선형 링커에 부착되어 N-말단 측면을 노출시킨다. 임의로, V 1 의 N-말단 측면은 아민 차단기에 의해 캡핑된다. 아민 차단기의 적합한 예는 C1-C6 알킬, C1-C8 아실, (알콕시)카르보닐(예컨대, Boc로 공지된 t-부톡시카르보닐), (아릴 알콕시)카르보닐(예컨대, Cbz로 공지된 벤질옥시카르보닐 또는 카르보벤질옥시 및 Fmoc로 공지된 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐)을 포함한다.
일 구현예에서, V 1 의 N-말단 측면은 수용성 기, 예컨대 선형 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 올리고머에 의해 캡핑된다. 바람직하게는, 선형 PEG 올리고머는 1 내지 20개의 에틸렌 글리콜 모이어티, 더욱 바람직하게는 3 내지 10, 더욱더 바람직하게는 5 내지 7을 함유한다.
Z는 페놀성 하이드록실 기를 포함하는 세포독성 약물이며, Z는 페놀성 하이드록실 기를 통해 링커에 부착된다. 바람직하게는, Z는 듀오카르마이신 또는 CBI 이량체 유도체이다. 더욱 바람직하게는, Z는 듀오카르마이신 유도체이다.
스트렙토마이세스(Streptomyces) 종의 배양액으로부터 처음 분리된 구조적으로 관련된 독소의 부류인 듀오카르마이신은 듀오카르마이신 A, 듀오카르마이신 SA, 및 CC-1065를 포함하는 항종양 항생제 계열의 구성원이다.
듀오카르마이신은 DNA의 좁은 홈(minor groove)에 결합한 후 DNA의 비가역적 알킬화를 유발한다. 이는 핵산 구조를 파괴하여 결국 종양 세포를 사멸시킨다.
WO2010/062171는 DNA-알킬화제 CC-1065의 일련의 신규한 유사체를 개시한다. 이들 듀오카르마이신 유도체는 본 발명에 따라 사용하기에 적합하다. 많은 이들 약물의 화학적 합성은 WO2010/062171의 실시예 1-22에 기재되어 있다.
CBI 이량체(1,2,9,9a-테트라하이드로사이클로프로파[c]벤즈[e]인돌-4-온 이량체)는 또한 CC-1065로부터 유래된 높은 독성 항생제 그룹의 일부이지만, 듀오카르마이신은 DNA 알킬화를 유발하는 반면, 구조적으로 관련된 CBI 이량체는 가닥간 DNA 가교를 유발하여 세포를 사멸시킨다.
본 발명의 일 구현예에서, Z는 하기 화학식을 갖는다:
식 중에서, R1, R2, 및 R3은 H, OH, SH, NH2, N3, NO2, NO, CF3, CN, C(O)NH2, C(O)H, C(O)OH, 할로겐, Ra, SRa, S(O)Ra, S(O)2Ra, S(O)ORa, S(O)2ORa, OS(O)Ra, OS(O)2Ra, OS(O)ORa, OS(O)2ORa, ORa, NHRa, N(Ra)Rb, +N(Ra)(Rb)Rc, P(O)(ORa)(ORb), OP(O)(ORa)(ORb), SiRaRbRc, C(O)Ra, C(O)ORa, C(O)N(Ra)Rb, OC(O)Ra, OC(O)ORa, OC(O)N(Ra)Rb, N(Ra)C(O)Rb, N(Ra)C(O)ORb, N(Ra)C(O)N(Rb)Rc, 및 수용성 기(water-soluble group)로부터 독립적으로 선택되고,
Ra, Rb, 및 Rc는 H 및 임의로 치환된 (CH2CH2O)aaCH2CH2 X 1 Ra1, C1-15 알킬, C1-15 헤테로알킬, C3-15 사이클로알킬, C1-15 헤테로사이클로알킬, C5-15 아릴, 또는 C1-15 헤테로아릴로부터 독립적으로 선택되며, 여기서 aa는 1 내지 1000으로부터 선택되고, X 1 은 O, S, 및 NRb1로부터 선택되며, Rb1 및 Ra1은 H 및 C1-3 알킬로부터 독립적으로 선택되고, Ra, Rb, 및/또는 Rc 내의 임의의 치환기 중 하나 이상은 임의로 수용성 기이며, Ra, Rb, 및 Rc 중 둘 이상은 임의로 하나 이상의 결합에 의해 연결되어 하나 이상의 임의로 치환된 카르보사이클 및/또는 헤테로사이클을 형성한다.
용어 "수용성 기"는 수성 환경에서 잘 용매화되고 부착된 화합물에게 개선된 수용해도를 부여하는 작용기를 지칭한다. 수용성 기의 예는, 비제한적으로, 폴리알콜, 직쇄 또는 사이클릭 사카라이드, 1차, 2차, 3차, 또는 4차 아민 및 폴리아민, 설페이트 기, 설포네이트 기, 설피네이트 기, 카르복실레이트 기, 포스페이트 기, 포스포네이트 기, 포스피네이트 기, 아스코르베이트 기, 폴리에틸렌 글리콜을 포함하는 글리콜, 및 폴리에테르를 포함한다. 바람직한 수용성 기는 1차, 2차, 3차, 및 4차 아민, 카르복실레이트, 포스포네이트, 포스페이트, 설포네이트, 설페이트, -(CH2CH2O)yyCH2CH2 X 2 Ryy, -(CH2CH2O)yyCH2CH2 X 2 -, -X 2 (CH2CH2O)yyCH2CH2-, 글리콜, 올리고에틸렌 글리콜, 및 폴리에틸렌 글리콜이며, yy는 1 내지 1000로부터 선택되고, X 2 는 O, S, 및 NRzz로부터 선택되며, Rzz 및 Ryy는 H 및 C1-3 알킬로부터 독립적으로 선택된다.
용어 "치환된"은, "알킬", "헤테로알킬", "사이클로알킬", "헤테로사이클로알킬", "아릴", "헤테로아릴" 등에 대한 형용사로서 사용될 때, 상기 "알킬", "헤테로알킬", "사이클로알킬", "헤테로사이클로알킬", "아릴", "헤테로아릴", 또는 유사한 기가 하나 이상의 치환기(수소를 치환함으로써 도입됨)를 함유한다는 것을 나타낸다. 예시적인 치환기는, 비제한적으로, OH, =O, =S, =NRd, =N-ORd, SH, NH2, NO2, NO, N3, CF3, CN, OCN, SCN, NCO, NCS, C(O)NH2, C(O)H, C(O)OH, 할로겐, Rd, SRd, S(O)Rd, S(O)ORd, S(O)2Rd, S(O)2ORd, OS(O)Rd, OS(O)ORd, OS(O)2Rd, OS(O)2ORd, S(O)N(Rd)Re, OS(O)N(Rd)Re, S(O)2N(Rd)Re, OS(O)2N(Rd)Re, OP(O)(ORd)(ORe), P(O)(ORd)(ORe), ORd, NHRd, N(Rd)Re, +N(Rd)(Re)Rf, Si(Rd)(Re)(Rf), C(O)Rd, C(O)ORd, C(O)N(Rd)Re, OC(O)Rd, OC(O)ORd, OC(O)N(Rd)Re, N(Rd)C(O)Re, N(Rd)C(O)ORe, N(Rd)C(O)N(Re)Rf, 수용성 기, 및 이들 치환기의 티오 유도체, 및 이들 치환기 중 어느 것의 양자화된, 하전된, 및 탈양자화된 형태를 포함하며, Rd, Re, 및 Rf는 H 및 임의로 치환된 -(CH2CH2O)yyCH2CH2 X 2 Ryy, C1-15 알킬, C1-15 헤테로알킬, C3-15 사이클로알킬, C1-15 헤테로사이클로알킬, C5-15 아릴, 또는 C1-15 헤테로아릴, 또는 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고, yy는 1 내지 1000으로부터 선택되며, X 2 는 O, S, 및 NRzz로부터 독립적으로 선택되고, Rzz 및 Ryy는 H 및 C1-3 알킬로부터 독립적으로 선택되며, Rd, Re, 및 Rf 중 둘 이상은 임의로 하나 이상의 결합에 의해 연결되어 하나 이상의 임의로 치환된 카르보사이클 및/또는 헤테로사이클을 형성한다. 하나를 초과하는 치환기가 있는 경우, 각각의 치환기는 독립적으로 선택된다. 둘 이상의 치환기는 단일, 이중, 또는 삼중 결합일 수 있는 하나 이상의 연결 결합에 의해 각각의 치환기 상의 하나 이상의 수소 원자의 대체에 의해 서로 연결될 수 있거나, 또는, 공명 구조가 가능한 경우, 상기 결합의 결합 순서는 이들 둘 이상의 공명 구조에서 상이할 수 있다. 따라서, 2개의 치환기는 하나 이상의 고리의 형성 하에 연결될 수 있다.
치환기가 "하나 이상의 결합에 의해 연결되어 하나 이상의 임의로 치환된 카르보사이클 및/또는 헤테로사이클을 형성"할 수 있는 경우, 이것은 치환기가 하나 이상의 연결 결합에 의해 각각의 치환기 상의 하나 이상의 수소 원자의 대체를 통해 서로 연결될 수 있다는 것을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "아릴"은 5 내지 24개의 고리 탄소 원자를 포함하는 카르보사이클릭 방향족 치환기를 지칭하며, 이는 하전되거나 하전되지 않을 수 있고 하나의 고리 또는 함께 융합된 둘 이상의 고리로 구성될 수 있다. 아릴 기의 예는, 비제한적으로, 페닐, 나프틸, 및 안트라세닐을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "헤테로아릴"은 1 내지 24개의 고리 탄소 원자 및 적어도 하나의 고리 헤테로원자, 예컨대, 산소, 질소, 황, 규소, 또는 인을 포함하는 헤테로사이클릭 방향족 치환기를 지칭하며, 질소 및 황은 임의로 산화될 수 있고, 질소는 임의로 4차화될 수 있으며, 이는 하나의 고리 또는 함께 융합된 둘 이상의 고리로 구성될 수 있다. 헤테로원자는 서로 직접 연결될 수 있다. 헤테로아릴 기의 예는, 비제한적으로, 피리디닐, 피리미딜, 푸라닐, 피롤릴, 트리아졸릴, 피라졸릴, 피라지닐, 옥사졸릴, 이속사졸릴, 티아졸릴, 이미다졸릴, 티에닐, 인돌릴, 벤조푸라닐, 벤즈이미다졸릴, 벤조티아졸릴, 퓨리닐, 인다졸릴, 벤조트리아졸릴, 벤즈이속사졸릴, 퀴녹사리닐, 이소퀴놀릴, 및 퀴놀릴을 포함한다. 일 구현예에서, 헤테로아릴 기는 1 내지 4개의 헤테로원자를 포함한다. "C1 헤테로아릴 기"는 헤테로방향족 기의 고리 시스템에 하나의 탄소만이 존재한다는 것을 나타낸다는 것에 유의해야 한다(따라서, 임의의 치환기 내의 탄소 원자는 계수되지 않음). 이러한 헤테로방향족 기의 예는 테트라졸릴 기이다.
"아릴" 및 "헤테로아릴" 기는 또한 하나 이상의 비방향족 고리가 아릴 또는 헤테로아릴 고리 또는 고리 시스템에 융합된 고리 시스템을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "알킬"은 직쇄 또는 분지된, 포화된 또는 불포화된 하이드로카르빌 치환기를 지칭한다. 알킬 기의 예는, 비제한적으로, 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 헥실, 옥틸, 데실, 이소프로필, sec-부틸, 이소부틸, tert-부틸, 이소펜틸, 2-메틸부틸, 비닐, 알릴, 1-부테닐, 2-부테닐, 이소부틸레닐, 1-펜테닐, 2-펜테닐, 및 1-부티닐을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "헤테로알킬"은 적어도 하나의 탄소 원자가 헤테로원자, 예컨대, 산소, 질소, 황, 규소, 또는 인에 의해 대체된 직쇄 또는 분지된, 포화된 또는 불포화된 하이드로카르빌 치환기를 지칭하며, 질소 및 황은 임의로 산화될 수 있고, 질소는 임의로 4차화될 수 있다. 헤테로원자는 서로 직접 연결될 수 있다. 예는, 비제한적으로, 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 이소프로폭시, n-부틸옥시, tert-부틸옥시, 메틸옥시메틸, 에틸옥시메틸, 메틸옥시에틸, 에틸옥시에틸, 메틸아미노메틸, 디메틸아미노메틸, 메틸아미노에틸, 디메틸아미노에틸, 메틸티오메틸, 에틸티오메틸, 에틸티오에틸, 및 메틸티오에틸을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "사이클로알킬"은 하나의 고리 또는 서로 융합된 둘 이상의 고리로 구성될 수 있는 포화된 또는 불포화된 비방향족 사이클릭 하이드로카르빌 치환기를 지칭한다. 예는, 비제한적으로, 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로펜테닐, 사이클로펜타디에닐, 사이클로헥실, 사이클로헥세닐, 1,3-사이클로헥사디에닐, 데칼리닐, 및 1,4-사이클로헥사디에닐을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "헤테로사이클로알킬"은 포화된 또는 불포화된 비방향족 사이클릭 하이드로카르빌 치환기를 지칭하며, 이는 하나의 고리 또는 함께 융합된 둘 이상의 고리로 구성될 수 있고, 하나의 고리 내의 적어도 하나의 탄소는 헤테로원자, 예컨대, 산소, 질소, 황, 규소, 또는 인에 의해 대체되며, 질소 및 황은 임의로 산화될 수 있고, 질소는 임의로 4차화될 수 있다. 헤테로원자는 서로 직접 연결될 수 있다. 예는, 비제한적으로, 테트라하이드로푸라닐, 피롤리디닐, 피페리디닐, 1,4-디옥사닐, 데카하이드로퀴놀리닐, 피페라지닐, 옥사졸리디닐, 및 모르폴리닐을 포함한다. "C1 헤테로사이클로알킬 기"는 헤테로사이클로알칸의 고리 시스템에 오직 하나의 탄소가 존재한다는 것을 나타낸다는 것에 유의해야 한다(따라서, 임의의 치환기 내의 탄소 원자는 계수되지 않음). 이러한 그룹의 예는 디옥시라닐 기이다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "아실"은 카르보닐 작용성을 통해 모 구조에 부착된, 직쇄, 분지, 또는 사이클릭 배열 또는 이의 조합을 갖는 기를 지칭한다. 이러한 기는 포화된 또는 불포화된, 지방족 또는 방향족, 및 카르보사이클릭 또는 헤테로사이클릭일 수 있다. C1-C8 아실 기의 예는 아세틸-, 벤조일-, 니코티노일-, 프로피오닐-, 이소부티릴-, 옥살릴- 등을 포함한다.
"알킬", "헤테로알킬", "사이클로알킬", "헤테로사이클로알킬", "아릴", "헤테로아릴", "아실" 등이 함유할 수 있는 탄소 원자의 수는 상기 용어에 선행하는 명칭에 의해 표시되며, 즉, C1-10 알킬은 상기 알킬이 1개 내지 10개의 탄소(이 알킬에 부착된 임의의 치환기 내의 탄소 원자는 계수되지 않음)를 함유할 수 있다는 것을 의미한다.
본원에서 용어 "카르보사이클"은 포화된 또는 불포화된 사이클로알칸 또는 아렌 모이어티를 지칭하며, 용어 "사이클로알칸" 및 "아렌"은 상기 정의된 바와 같이, 각각 "사이클로알킬" 및 "아릴" 치환기의 모 모이어티로서 정의된다.
본원에서 용어 "헤테로사이클"은 포화된 또는 불포화된 헤테로사이클로알칸 또는 헤테로아렌 모이어티를 지칭하며, 용어 "헤테로사이클로알칸" 및 "헤테로아렌"은 상기 정의된 바와 같이, 각각 "헤테로사이클로알킬" 및 "헤테로아릴" 치환기의 모 모이어티로서 정의된다.
예를 들어 "알킬"과 대조적으로 "알킬렌"에서 "-일"과 대조적으로 확장자 "-일렌"은, 예를 들어 상기 "알킬"에서 하나의 단일 결합을 통해 하나의 모이어티에 연결된 일가 기와 대조적으로, 예를 들어 상기 "알킬렌"이 적어도 하나 이상의 이중 결합 또는 둘 이상의 단일 결합을 통해 하나 이상의 다른 모이어티에 연결된 2가(또는 다가) 모이어티라는 것을 나타낸다. 따라서, 용어 "알킬렌"은 직쇄 또는 분지된, 포화된 또는 불포화된 하이드로카르빌렌 모이어티를 지칭하며; 본원에 사용된 바와 같이 용어 "헤테로알킬렌"은 적어도 하나의 탄소가 헤테로원자에 의해 대체된 직쇄 또는 분지된, 포화된 또는 불포화된 하이드로카르빌렌 모이어티를 지칭하고; 본원에 사용된 바와 같이 용어 "아릴렌"은 카르보사이클릭 방향족 모이어티를 지칭하며, 이는 하나의 고리 또는 함께 융합된 둘 이상의 고리로 구성될 수 있고; 본원에 사용된 바와 같이 용어 "헤테로아릴렌"은 카르보사이클릭 방향족 모이어티를 지칭하며, 이는 하나의 고리 또는 함께 융합된 둘 이상의 고리로 구성될 수 있고, 하나의 고리 내의 적어도 하나의 탄소가 헤테로원자에 의해 대체되며; 본원에 사용된 바와 같이 용어 "사이클로알킬렌"은 포화된 또는 불포화된 비방향족 사이클릭 하이드로카르빌렌 모이어티를 지칭하며, 이는 하나의 고리 또는 함께 융합된 둘 이상의 고리로 구성될 수 있고; 본원에 사용된 바와 같이 용어 "헤테로사이클로알킬렌"은 포화된 또는 불포화된 비방향족 사이클릭 하이드로카르빌렌 모이어티를 지칭하며, 이는 하나의 고리 또는 함께 융합된 둘 이상의 고리로 구성될 수 있고, 하나의 고리 내의 적어도 하나의 탄소는 헤테로원자에 의해 대체된다. 예시적인 2가 모이어티는 하나의 수소 원자가 제거된 상기 일가 기에 대해 주어진 예를 포함한다.
"폴리알킬렌", "폴리헤테로알킬렌", "폴리아릴렌", "폴리헤테로아릴렌", "폴리사이클로알킬렌", "폴리헤테로사이클로알킬렌" 등에서 접두사 "폴리"는 이러한 "-일렌" 모이어티, 예컨대, 알킬렌 모이어티 중 둘 이상이 함께 연결되어 인접한 모이어티를 위한 둘 이상의 부착 부위를 함유하는 분지된 또는 비분지된 다가 모이어티를 형성한다는 것을 나타낸다. 유사하게, 예를 들어 올리고에틸렌 글리콜에서 접두사 "올리고"는 둘 이상의 에틸렌 글리콜 모이어티가 함께 결합하여 분지된 또는 비분지된 다가 모이어티를 형성하는 것을 나타낸다. "올리고" 및 "폴리" 사이의 차이는 접두사 "올리고"는 상대적으로 작은 수의 반복 단위를 나타내는데 가장 흔히 사용되는 반면, 접두사 "폴리"는 일반적으로 상대적으로 큰 수의 반복 단위를 지칭한다는 것이다.
각각의 m 및 n은 독립적으로 0 또는 양의 정수이다. 바람직하게는, n은 0, 1, 2, 또는 3이며, m은 0 또는 1이다. 더욱 바람직하게는, n은 0, 1, 2, 또는 3이며, m은 0이다.
일 구현예에서, 본 발명은 화학식(I)의 링커-약물 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 수화물 또는 용매화물에 관한 것이다:
식 중에서,
V 1 은 화학적, 광화학적, 물리적, 생물학적, 또는 효소적 과정에 의해 절단되거나 변형될 수 있는 조건부 절단가능하거나 조건부 변형가능한 모이어티이며;
Z는 페놀성 하이드록실 기를 포함하는 세포독성 약물이고, Z는 페놀성 하이드록실 기를 통해 링커에 부착되며, 바람직하게는 Z는 듀오카르마이신 또는 CBI 이량체 유도체, 더욱 바람직하게는 Z는 듀오카르마이신 유도체이고;
n은 0, 1, 2, 또는 3이며;
m은 0 또는 1이다.
일 구현예에서, Z는 하기 화학식을 갖는다:
식 중에서, R1, R2, 및 R3은 H, OH, SH, NH2, N3, NO2, NO, CF3, CN, C(O)NH2, C(O)H, C(O)OH, 할로겐, Ra, SRa, S(O)Ra, S(O)2Ra, S(O)ORa, S(O)2ORa, OS(O)Ra, OS(O)2Ra, OS(O)ORa, OS(O)2ORa, ORa, NHRa, N(Ra)Rb, +N(Ra)(Rb)Rc, P(O)(ORa)(ORb), OP(O)(ORa)(ORb), SiRaRbRc, C(O)Ra, C(O)ORa, C(O)N(Ra)Rb, OC(O)Ra, OC(O)ORa, OC(O)N(Ra)Rb, N(Ra)C(O)Rb, N(Ra)C(O)ORb, N(Ra)C(O)N(Rb)Rc, 및 수용성 기로부터 독립적으로 선택되고,
Ra, Rb, 및 Rc는 H 및 임의로 치환된 (CH2CH2O)aaCH2CH2 X 1 Ra1, C1-15 알킬, C1-15 헤테로알킬, C3-15 사이클로알킬, C1-15 헤테로사이클로알킬, C5-15 아릴, 또는 C1-15 헤테로아릴로부터 독립적으로 선택되며, 여기서 aa는 1 내지 1000으로부터 선택되고, X 1 은 O, S, 및 NRb1로부터 선택되며, Rb1 및 Ra1 은 H 및 C1-3 알킬로부터 독립적으로 선택되고, Ra, Rb, 및/또는 Rc 내의 임의의 치환기 중 하나 이상은 임의로 수용성 기며, Ra, Rb, 및 Rc 중 둘 이상은 임의로 하나 이상의 결합에 의해 연결되어 하나 이상의 임의로 치환된 카르보사이클 및/또는 헤테로사이클를 형성한다.
일 구현예에서, Z는 하기 화학식을 갖는다:
바람직한 구현예에서, Z는 하기 화학식을 갖는다:
일 구현예에서, R1은 H, 메틸 및 메톡시로부터 선택된다. 바람직하게는, R1은 메틸이다.
더욱 바람직한 구현예에서, Z는 하기 화학식을 갖는다:
특히 바람직한 구현예에서, Z는 하기 화학식을 갖는다:
또 다른 구현예에서, Z는 하기 화학식을 갖는다:
바람직한 구현예에서, Z는 하기 화학식을 갖는다:
일 구현예에서, R1은 H, 메틸 및 메톡시로부터 선택된다. 바람직하게는, R1은 메틸이다.
더욱 바람직한 구현예에서, Z는 하기 화학식을 갖는다:
일 구현예에서, 화학식(I)의 화합물은 하기 구조로 표시된다:
식 중에서, V 1 , Z 및 n은 이전 구현예에 정의된 바와 같다.
바람직한 구현예에서, 화학식(Ia)의 화합물은 하기 구조를 갖는다:
R4 및 R5는 독립적으로 H 또는 아민 차단기이다.
더욱 바람직한 구현예에서, 화학식(Ia)의 화합물은 하기 구조를 갖는다:
또 다른 바람직한 구현예에서, 화학식(Ia)의 화합물은 하기 구조를 갖는다:
추가의 바람직한 구현예에서, 화학식(Ia)의 화합물은 하기 구조를 갖는다:
일 구현예에서, 화학식(I)의 화합물은 하기 구조로 표시된다:
식 중에서, V 1 , Z 및 n은 이전 구현예에 정의된 바와 같다.
바람직한 구현예에서, 화학식(Ib)의 화합물은 하기 구조를 갖는다:
본 발명은 또한 본 발명에 따른 링커-약물 화합물(화학식(I))이 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 존재하는 시스테인을 통해 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 접합된 항체-약물 접합체(ADC)에 관한 것이다.
ADC의 평균 약물-대-항체 비율(DAR), 즉, 항체에 접합된 약물의 평균 수는, 전형적으로 1 내지 6의 범위이다. 당업계에 널리 알려진 바와 같이, DAR 및 약물 로드 분포는, 예를 들어, 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 또는 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)를 사용하여 결정될 수 있다. HIC는 평균 DAR을 결정하는데 특히 적합하다. 바람직하게는, 평균 DAR은 1 내지 4, 더욱 바람직하게는 1 내지 3, 가장 바람직하게는 1.5 내지 2의 범위이다.
본 발명에 따른 링커-약물은 이러한 링커-약물을 포함하는 ADC의 소수성이 선형 링커-약물을 포함하는 ADC의 소수성의 경우보다 네이키드 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 더 대등하도록 설계된다. 소수성의 제어는 ADC의 약물동력학적 매개변수를 관리하는데 사용될 수 있다.
ADC 소수성은 접합체의 소수성을 비접합된 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 소수성과 비교함으로써 결정될 수 있는데, 이는 상대적 소수성으로 지칭된다. 특정 구현예에서, 접합체의 체류 시간은 실시예의 표 1A 및 1B에 기재된 방법에 의해 결정된 바와 같이, 비접합된 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 체류 시간보다 3분 이하로 더 길다. 특정 다른 구현예에서, 접합체의 체류 시간은 실시예의 표 1A 및 1B에 기재된 방법에 의해 결정된 바와 같이, 비접합된 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 체류 시간보다 2분 이하로 더 길다. 특정 다른 구현예에서, 접합체의 체류 시간은 표 1A 및 1B에 기재된 방법에 의해 결정된 바와 같이, 비접합된 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 체류 시간보다 1분 30초 이하로 더 길다. 특정 다른 구현예에서, 접합체의 체류 시간은 표 1A 및 1B에 기재된 방법에 의해 결정된 바와 같이, 비접합된 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 체류 시간보다 1분 이하로 더 길다.
상대적 소수성에 대한 본 발명의 링커의 효과는 약물이 사실상 더 소수성인 구현예에서 더욱 두드러질 것이다.
본 발명의 맥락에서, 임의의 항체 - 특히 치료적 활성을 갖는 것으로 알려진 임의의 항체 또는 ADC의 분야에서 알려진 임의의 항체, 또는 이의 임의의 항원 결합 단편, 예컨대 F(ab')2 또는 Fab' 단편, 단일 사슬(sc) 항체, scFv, 단일 도메인(sd) 항체, 디아바디, 또는 미니바디가 본원에 청구된 링커-약물의 (야생형 또는 부위 특이적) 접합에 사용될 수 있다. 항체는 IgG, IgA 또는 IgM 항체와 같은 임의의 아이소타입(isotype)일 수 있다. 바람직하게는, 항체는 IgG 항체, 더욱 바람직하게는 IgG1 또는 IgG2 항체이다.
항체는 단일특이적(즉, 하나의 항원에 대해 특이적; 이러한 항원은 종 사이에 공통적이거나 종 사이에 관련된 항원을 가질 수 있음) 항체 또는 이중특이적(즉, 2개의 상이한 항원에 대해 특이적) 항체일 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 항체는 단일특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다.
이러한 항체는 재조합으로, 합성으로, 또는 당업계에 공지된 다른 적합한 방법에 의해 생산될 수 있다.
바람직하게는, 항체는 종양 세포의 세포막 내에 또는 세포막 상에서(예컨대, 세포 표면 상에서) 발현되는 항원 표적에 결합한다. 더욱 바람직하게는, ADC는 항체가 (항원) 표적에 결합한 후 세포에 의해 내재화되며, 이후 세포독성 약물이 세포내로 방출된다.
일 구현예에서, 본 발명에 따라 사용될 항체는 아넥신 A1, CA242(암 항원 242), CD19, CD22, CD30(종양 괴사 인자 8), CD33, CD37, CD38(사이클릭 ADP 리보스 가수분해효소), CD44, CD47(인테그린 관련 단백질), CD56(신경 세포 부착 분자), CD70, CD74, CD79, CD115(콜로니 자극 인자 1 수용체), CD123(인터루킨-3 수용체), CD138(Syndecan 1), CD203c(ENPP3), CD303, CD333, CEACAM, CLL-1(C형 렉틴 유사 분자-1), c-MET(간세포 성장 인자 수용체), Cripto, DLL3, EGFR, EPCAM, EphA2, EphB3, ETBR(엔도텔린 유형 B 수용체), FAP, FcRL5(Fc 수용체 유사 단백질 5, CD307), FGFR3, FOLR1(엽산 수용체 알파), GCC(구아닐릴 사이클라아제 C), GPNMB , HER2, HMW-MAA(고분자량 흑색종 관련 항원), 인테그린, 루이스 A 유사 탄수화물, 루이스 Y(CD174), LIV1, 메소텔린(MSLN), MN(CA9), MUC1, MUC16, NaPi2b, 넥틴-4, PSMA, SLC44A4, STEAP-1, 5T4 항원, Tag72, 조직 인자(TF, 트롬보플라스틴, CD142), TF-Ag, TROP2(종양 관련 칼슘 신호 전달자 2), 및 VLA로 이루어진 군으로부터 선택된 표적 중 하나에 대한 단일특이적 항체(또는 이의 항원 결합 단편)이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명에 따라 사용될 항체는 상기 열거된 군으로부터 선택된 2개의 표적의 조합에 대한 이중특이적 항체(또는 이의 항원 결합 단편)이다.
적합한 항체의 예는 블리나투모맙(blinatumomab)(CD19), 에프라투주맙(epratuzumab)(CD22), 이라투무맙(iratumumab) 및 브렌툭시맙(brentuximab)(CD30), 바다스툭시맙(vadastuximab)(CD33), 테툴루맙(tetulumab)(CD37), 이사툭시맙(isatuximab)(CD38), 비바투주맙(bivatuzumab)(CD44), 로르보투주맙(lorvotuzumab)(CD56), 보르세투주맙(vorsetuzumab)(CD70), 밀라투주맙(milatuzumab)(CD74), 폴라투주맙(polatuzumab)(CD79), 로발피투주맙(rovalpituzumab(DLL3), 푸툭시맙(futuximab)(EGFR), 오포르투주맙(oportuzumab)(EPCAM), 팔레투주맙(farletuzumab(FOLR1), 글렘바투무맙(glembatumumab)(GPNMB), 트라스투주맙(trastuzumab) 및 페르투주맙(pertuzumab)(HER2), 에타라시주맙(etaracizumab)(인테그린), 아네투맙(anetumab)(메소텔린), 판코맙(pankomab)(MUC1), 엔포르투맙(enfortumab)(Nectin-4), 및 H8, A1, 및 A3(5T4 항원)을 포함한다.
본 발명에 따라 사용될 항체는 바람직하게는 단일클론 항체(mAb)이며, 키메라, 인간화 또는 인간 mAb일 수 있다. 더욱 바람직하게는, 본 발명에 따라, 인간화 또는 인간 mAb, 더욱더 바람직하게는 인간화 또는 인간 IgG 항체, 가장 바람직하게는 인간화 또는 인간 IgG1 mAb가 사용된다. 바람직하게는, 상기 항체는 κ(kappa) 경쇄를 가지며, 즉, 인간화 또는 인간 IgG1-κ 항체이다.
인간화 항체에서, 중쇄(HC) 및 경쇄(LC)의 가변 영역 내의 항원 결합 상보성 결정 영역(CDR)은 비인간 종, 일반적으로 마우스, 랫트 또는 토끼의 항체로부터 유래된다. 이러한 비인간 CDR은 HC 및 LC의 가변 영역(프레임워크 영역 FR1, FR2, FR3 및 FR4)의 인간 프레임워크 내에 위치할 수 있다. 인간 프레임워크 영역 내의 선택된 아미노산은 낮은 면역원성을 유지하면서 결합 친화성을 개선하기 위해 상응하는 원래의 비인간 종 아미노산으로 교환될 수 있다. 이렇게 인간화 가변 영역은 인간 불변 영역과 조합된다. 대안적으로, 비인간 프레임워크를 포함하는 비인간 가변 영역은 인간 경쇄 불변 영역 및 인간 중쇄 불변 영역과 조합된다. 이 경우, 원래의 비인간 종 프레임워크 영역의 선택된 아미노산은 항체의 결합 친화성을 유지하면서 면역원성을 감소시키기 위해 이들의 상응하는 인간 아미노산으로 교환된다. 덜 바람직한 구현예에서, CDR 내에 위치한 아미노산 역시 항체의 친화성을 감소시키지 않으면서 면역원성을 감소시키기 위해 교환될 수 있다. 이들 인간화 항체의 아미노산 서열은 카밧 넘버링 시스템(항체 가변 영역 및 경쇄 불변 영역) 및 카밧 Eu 시스템(항체 중쇄 불변 영역)에 따라 넘버링될 수 있다.
항체 및 이의 항원 결합 단편은 절단가능하거나 비절단가능한 링커를 통해 다양한 세포독성 약물에 접합되어 왔다. 당업자에게 공지된 링커-약물의 예는 vc-seco-DUBA(즉, SYD980), mc-vc-PAB-MMAE(mc-vc-MMAE 및 vc-MMAE로도 약칭됨), mc-MMAF, 및 mc-vc-MMAF를 포함한다. 이러한 약칭은 당업자에게 널리 공지되어 있다(또한 WO2015/177360 참조). 링커-약물 vc-seco-DUBA는 WO2011/133039의 p. 210, ll. 21-27에 화합물 18b로서 개시되어 있다.
vc-seco-DUBA ADC의 일반 분자 구조는 하기 도시된 바와 같다:
vc- seco - DUBA ADC의 분자 구조
본 발명에 따라 사용된 링커는, 예컨대 비절단가능한 말레이미도카프로일(mc)과 대조적으로 절단가능한 링커이며, 예컨대 발린시트룰린(vc) 또는 발린알라닌(va)과 같은 절단가능한 디펩타이드를 포함할 수 있다.
선행 기술의 많은 링커는 선형 링커, 즉, 약물과 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 부착 부위 사이에 절단을 위한 부위를 갖는 선형 링커이다. 이러한 링커는 본 발명자들에 의해 "엔도-링커(endo-linker)"로서 정의된다. 링커-약물 및 이에 따라 생성된 ADC의 소수성을 개선시키기 위한 당업계에 공지된 시도는 약물과 항체 또는 이의 항원 결합 단편 사이에, 또는 평행 위치에(링커 내의 측면 그룹으로서) 폴리에틸렌 글리콜 중합체와 같은 수용성 기를 링커에 부착시키는 것을 포함한다. 그러나, 가용화 기를 부착시키는 것은 필연적으로 링커 분자의 복잡성을 증가시키고 큰 가용화 기의 경우에는 접합체의 제조 복잡성을 더 증가시킨다.
놀랍게도, 본 발명자들은 비선형 링커, 즉, 약물과 항체 또는 이의 항원 결합 단편 사이에 절단을 위한 부위를 갖지 않는 링커(본 발명자들에 의해 "엑소-링커(exo-linker)"로서 정의됨)를 사용하여 (부피가 큰) 수용성 기를 구축할 필요없이 ADC의 소수성이 개선될 수 있다는 것을 발견하였다. 임의의 특정 이론에 얽매이기를 바라지 않으면서, 본 발명에 따라 사용된 링커에서의 배열은 소수성 약물과 항체 또는 이의 항원 결합 단편 사이에 더 짧은 거리를 야기할 수 있다. 그 결과, 약물은 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 둘러싼 친수성 수성 환경으로부터 차폐되어, ADC의 소수성을 감소시킨다.
이 소수성 저하 효과는 항체(또는 항원 결합 단편)의 황 원자 및 약물의 산소 원자 사이의 원자의 수가 하기 표 A에 나타낸 바와 같이 감소되는 경우 증가한다.
예를 들어, vc-seco-DUBA ADC에는, 항체의 S-원자 및 약물의 O-원자 사이에 29개의 원자가 있다.
표 A.
* 야생형 ADC; vc-seco-DUBA는 선형 비교군 링커-약물이다.
** 상대적 소수성은 실시예의 표 1A에 기재된 바와 같이 결정된다.
일 구현예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 링커-약물이 조작된 시스테인을 통해 항체에 부위 특이적으로 접합된 ADC에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 용어 "조작된 시스테인"은 항체의 HC 또는 LC 내의 비시스테인 아미노산을 시스테인에 의해 대체하는 것, 기존 아미노산 사이에 시스테인을 부가하는 것 또는 천연 사슬간 디설파이드 결합 시스테인을 비시스테인 아미노산, 예컨대 세린으로 치환하여, 다른 사슬에서 유리 "조작된" 시스테인을 생성하는 것을 의미한다. 당업자에 의해 공지된 바와 같이, 시스테인 조작된 항체는 재조합 클로닝 방법에 의해 숙주 세포에서 발현될 수 있거나 또는 종래의 분자 클로닝 기술을 사용하여 제조될 수 있거나 또는 시스테인 돌연변이(들)를 갖는 항체의 HC 또는 LC 도메인(들)은 공지된 (펩타이드 또는 DNA) 합성 장비 및 절차를 사용하는 것과 같이 합성될 수 있다. 전형적으로, WO2015/177360에 개시된 것과 유사한 절차가 사용된다.
조작된 시스테인을 포함하는 항체는 부위 특이적 ADC를 제조하기 위한 기회를 제공하고, 링커-약물과의 양호한 반응성을 나타내는 접합 위치를 제공할 수 있으며, 동시에 항체 사이에 추가의 디설파이드 결합을 형성하거나(응집을 야기함) 또는 항체 구조를 방해할 위험을 감소시킨다. 항체의 적합한 위치에 시스테인 잔기를 도입하는 것은 접합 부위를 제어하고, 수득된 부위 특이적 접합체는 종래의 방법, 즉, 야생형 사슬간 디설파이드 시스테인을 통한 접합을 통해 수득된 접합체보다 더 균질하다. 이러한 종래의 방법은 ADC의 이종 혼합물을 야기하고, 이는 예컨대 비접합된 항체를 제거하기 위해 정제를 필요로 할 수 있다. 종래의 접합된 ADC 혼합물의 일부 개별 성분은 불량한 생체내 성능을 가질 수 있다. 효능, 안전성, 및 안정성의 측면에서 ADC의 생체내 성능은 ADC의 링커-약물이 문헌[B.-Q. Shen et al. in Nature Biotechnology, Vol. 30, Number 2, 2012, pages 184-189]에 따라 조작된 시스테인을 통해 부위 특이적으로 접합되면 개선될 수 있다.
하기 표 B에 나타난 바와 같이, 본 발명의 링커-약물의 소수성 저하 효과는 또한 링커-약물이 외부를 가리키고 있는 위치에서 링커-약물이 부위 특이적으로 접합된 ADC에서 명백하게 보일 수 있다.
표 B.
* 중쇄 내의 위치 120 상의 조작된 시스테인.
** vc-seco-DUBA는 선형 비교군 링커-약물이다.
본 발명자들은 소수성의 감소가 Fab 또는 Fc 공동(cavity) 내의 위치에 부위 특이적으로 접합될 때 훨씬 더 두드러진다는 것을 관찰하였다. 이 효과는 표 C의 LC 위치 40 및 41, 및 HC 위치 41에 나타나 있다. 참조 값으로서 야생형 접합된 PSMA-vc-seco-DUBA ADC의 소수성(부위 특이적으로 접합된 ADC에 대한 값을 나타내는 첫 번째 컬럼)을 사용하여 또는 각각의 부위 특이적으로 접합된 ADC의 소수성(부위 특이적으로 접합된 ADC에 대한 값을 나타내는 두 번째 컬럼)을 사용하여 상대적 소수성 값을 계산하였다. 참조 값은 1.0으로 인덱싱된다.
표 C.
* 각각 경쇄 내의 위치 40, 경쇄 내의 41 및 중쇄 내의 41 상의 조작된 시스테인.
** vc-seco-DUBA는 선형 비교군 링커-약물이다.
일 구현예에서, 본 발명은 중쇄 40, 41, 89(카밧 넘버링), 152, 153, 155, 171, 247, 297, 339, 375 및 376(Eu 넘버링), 및 경쇄 40, 41, 165 및 168(카밧 넘버링)로부터 선택된 상기 항체의 하나 이상의 위치에 있는 조작된 시스테인을 통해 항체에 부위 특이적으로 접합된 ADC에 관한 것이다.
본 발명의 맥락에서, 카밧 넘버링은 HC 가변 및 LC 가변 및 불변 영역 내의 조작된 시스테인의 아미노산 위치를 나타내기 위해 사용되며, Eu 넘버링은 항체의 HC 불변 영역 내의 위치를 나타내기 위해 사용된다.
표현 "카밧 넘버링"은 문헌[Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)]에서의 항체의 모음의 중쇄 가변 또는 경쇄 가변 또는 불변 도메인에 사용된 넘버링 시스템을 지칭한다. 이 넘버링 시스템을 사용하여, 실제 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 FR 또는 CDR의 단축 또는 가변 도메인의 FR 또는 CDR 내로의 삽입에 상응하는 더 적은 또는 추가의 아미노산을 함유할 수 있다. 잔기의 카밧 넘버링은 항체의 서열의 상동성 영역에서 "표준" 카밧 넘버링된 서열과의 정렬에 의해 주어진 항체에 대해 결정될 수 있다.
표현 "Eu 넘버링"은 문헌[카밧, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD., NIH publication no. 91-3242, pp. 662, 680, 689 (1991)]에서와 같은 Eu 지수를 지칭한다. "카밧에서와 같은 Eu 지수"는 인간 IgG1 Eu 항체의 잔기 넘버링을 지칭한다(Edelman, G.M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 63, 78-85 (1969)).
중쇄 위치 40, 41 및 89는 가변 영역에 위치하고, 위치 152, 153, 155, 171, 247, 297, 339, 375 및 376은 항체의 불변 영역에 위치한다. 경쇄 위치 40 및 41은 가변 영역에 위치하고, 위치 165 및 168은 항체의 불변 영역에 위치한다.
중쇄 위치 40, 41, 89, 152, 153, 155 및 171 및 경쇄 위치 40, 41, 165 및 168은 Fab 부분에 위치하고, 중쇄 위치 247, 297, 339, 375 및 376은 항체의 Fc 부분에 위치한다.
본 발명자들은 놀랍게도 본 발명의 부위 특이적으로 접합된 ADC가 선형 링커-약물이 항체의 천연(즉, 내인성) 사슬간 디설파이드 결합 시스테인을 통해 접합된 종래의 ADC와 비교하여, 개선된 물리화학적, 약리학적 및/또는 약물동력학적 특성을 나타낸다는 것을 발견하였다.
인간화 이외의 항체의 가변 도메인의 변형은, 항원 결합 특성의 부분적인 또는 완전한 손실을 야기할 수 있기 때문에 일반적으로 회피된다. 그러나, 항체의 중쇄 및 경쇄의 프레임워크 영역 내의 특정 아미노산 잔기는, 시스테인을 교환할 때, 접합에 적합하며 링커-약물의 접합 후에 항원 결합의 (유의한) 감소를 야기하지 않는다. 더욱이, Fab 부분에서 이들 위치에의 접합은 또한 완전히 온전한 항체 대신에 항원 결합 단편의 사용을 가능하게 한다. Fab 부분에서의 접합은 Fc 부분에서의 접합보다 바람직한데, 종양 미세환경에서 종양 관련 프로테아제가 힌지 영역 아래의 Fc 불변 도메인을 부분적으로 절단할 수 있기 때문이다. Fc 불변 도메인의 이러한 절단은 Fc 접합된 링커-약물의 손실을 초래할 것인데, 이들이 암세포에 의해 내재화되지 않고, 이는 결국 생체내에서 ADC의 활성을 감소시킬 수 있기 때문이다(Fan et al. Breast Cancer Res. 2012; 14: R116 및 Brezsky et al. PNAS 2009; 106: 17864-17869).
따라서, 바람직한 구현예에서, 본 발명은 링커-약물이 중쇄 위치 40, 41 및 89 및 경쇄 위치 40 및 41로부터 선택된 상기 항체의 하나 이상의 위치에 있는 조작된 시스테인을 통해 항체에 부위 특이적으로 접합된 ADC에 관한 것이다.
더욱 바람직한 구현예에서, 본 발명은 링커-약물이 중쇄 위치 41 및 경쇄 위치 40 및 41로부터 선택된 상기 항체의 하나 이상의 위치에 있는 조작된 시스테인을 통해 항체에 부위 특이적으로 접합된 ADC에 관한 것이다.
특히 바람직한 구현예에서, 본 발명은 링커-약물이 중쇄 위치 41에 있는 조작된 시스테인을 통해 항체에 부위 특이적으로 접합된 ADC에 관한 것이다.
한 가지 대표적인 예로서, 본 발명에 따라 사용되는 항체는 WO2015/177360에 SYD1030로서 개시된 중쇄의 위치 41에 조작된 시스테인을 갖는 항-PSMA 항체(즉, PSMA-HC41)이다(중쇄는 서열번호:2의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄는 서열번호:5의 아미노산 서열을 포함함).
또 다른 대표적인 예로서, 본 발명에 따라 사용되는 항체는 WO2015/177360에 H8-HC41로서 개시된 중쇄의 위치 41에 조작된 시스테인을 갖는 항-5T4 항원 항체이다(중쇄는 서열번호:8의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄는 서열번호:11의 아미노산 서열을 포함함).
본 발명에 따른 ADC는 당업자에게 널리 알려진 방법 및 절차에 따라 수득될 수 있다.
듀오카르마이신 링커-약물의 비부위 특이적(야생형) 접합, 즉, 내인성 사슬간 디설파이드 결합 시스테인에의 접합을 위한 적합한 방법은 WO2011/133039의 실시예 15에 개시되어 있다.
CBI 이량체 링커-약물의 비부위 특이적(야생형) 접합을 위한 적합한 방법은 WO2015/110935에 개시되어 있다.
본 발명에 따른 ADC는 네이키드 항체와 유사한 결합 친화성, 우수한 시험관내 독성, 및 양호한 생체내 효능을 갖는다. 특히, ADC는 선행 기술로부터 공지된 선형 링커-약물 vc-seco-DUBA에 접합된 ADC보다 일반적으로 덜 소수성이고 카텝신 B 절단에 덜 민감하며, 따라서 종양 덩어리(종양 미세환경) 내의 다른 세포내 또는 세포외 효소/프로테아제에 덜 민감하지만, 유사한 시험관내 세포독성을 나타내는 것으로 나타났다.
예기치 않게, 본 발명에 따른 ADC는 선형 링커-약물 vc-seco-DUBA에 접합된 ADC와 비교하여 종양 이종 이식 동물 모델에서 개선된 생체내 효능을 나타낸다.
특정 구현예에서, 본 발명은 하기 화학식(II)의 ADC에 관한 것이다:
식 중에서,
"항체"는 본원에 개시된 바와 같은 적어도 하나의 조작된 시스테인을 갖지 않거나 갖는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고;
n은 0, 1, 2 또는 3이며;
y는 1 내지 6, 바람직하게는 1 내지 4, 더욱 바람직하게는 1 내지 3, 가장 바람직하게는 1.5 내지 2의 평균 DAR을 나타내고;
V 1 및 Z는 이전 구현예에 정의된 바와 같다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 하기 화학식(III)의 ADC에 관한 것이다:
식 중에서,
"항체"는 본원에 개시된 바와 같은 적어도 하나의 조작된 시스테인을 갖지 않거나 갖는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고;
n은 0, 1, 2 또는 3이며;
y는 1 내지 6, 바람직하게는 1 내지 4, 더욱 바람직하게는 1 내지 3, 가장 바람직하게는 1.5 내지 2의 평균 DAR을 나타내고;
R은 하기로부터 선택된다:
특히 바람직한 구현예에서, 본 발명은 중쇄 위치 40 및 41, 및 경쇄 위치 40 및 41로부터 선택된 하나 이상의 위치에 조작된 시스테인을 갖는 항체를 포함하는 식 (II) 또는 (III)의 ADC에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 조작된 시스테인은 중쇄 위치 41 또는 경쇄 위치 40 또는 41, 더욱 바람직하게는 중쇄 위치 41에 있다.
본 발명은 또한 상기 기재된 바와 같은 링커-약물 또는 ADC 및 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 단일클론 항체 및 (단일클론) 항체-약물 접합체와 같은 치료적 단백질의 전형적인 약제학적 제제는 정맥내 주입 전에 (수성) 용해(즉, 재구성)를 필요로 하는 동결건조된 케이크(동결건조된 분말), 또는 사용 전에 해동을 필요로 하는 동결된 (수성) 용액의 형태를 취한다.
전형적으로, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 동결건조된 케이크의 형태로 제공된다. 약제학적 조성물(동결-건조 전)에 포함시키기 위한 적합한 약제학적으로 허용가능한 부형제는 완충액(예컨대, 물 중에 시트레이트, 히스티딘 또는 석시네이트를 함유하는 염), 동결건조보호제(예컨대, 수크로스, 트레할로스), 긴장성 변형제(예컨대, 염화나트륨), 계면활성제(예컨대, 폴리소르베이트), 및 증량제(예컨대, 만니톨, 글리신)를 포함한다. 동결 건조된 단백질 제제에 사용되는 부형제는 동결 건조 과정뿐만 아니라 저장 동안 단백질 변성을 방지하는 이들의 능력에 대해 선택된다. 예로서, Kadcyla™(Roche)의 멸균된 동결건조된 분말 1회용 제제는 주사용 정균 또는 멸균수(BWFI 또는 SWFI)로 재구성시 pH 5.0을 갖는 20 mg/mL 아도-트라스투주맙 엠탄신, 0.02% w/v 폴리소르베이트 20, 10 mM 석신산나트륨, 및 6% w/v 수크로스를 함유한다.
본 발명은 또한 약제로서 사용하기 위한 상기 기재된 바와 같은 링커-약물, ADC 또는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 인간 고형 종양 및 혈액학적 악성종양의 치료에 사용하기 위한 상기 기재된 바와 같은 링커-약물, ADC 또는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
제1의 바람직한 구현예에서, 본 발명은 유방암, 뇌암(예컨대, 교모세포종), 두경부암, 갑상선암, 부신암, 골암, 안구암, 식도암, 위암, 소장암, 결장직장암, 요로상피암(예컨대, 방광암 또는 신장암), 난소암, 자궁암, 질암 및 자궁경부암, 폐암(특히 비소 세포 폐암(NSCLC) 및 소세포 폐암(SCLC)), 중피종(특히 악성 흉막 중피종), 간암, 췌장암, 피부암, 고환암, 및 전립선암으로 이루어진 군으로부터 선택된 인간 고형 종양의 치료에 사용하기 위한 상기 기재된 바와 같은 링커-약물, ADC 또는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
제2의 바람직한 구현예에서, 본 발명은 유방암, 위암, 결장직장암, 요로상피암(예컨대, 방광암), 난소암, 자궁암, 폐암(특히, 비소 세포 폐암(NSCLC) 및 소세포 폐암(SCLC)), 중피종(특히 악성 특히 악성 흉막 중피종), 간암, 췌장암, 및 전립선암으로 이루어진 군으로부터 선택된 인간 고형 종양의 치료에 사용하기 위한 상기 기재된 바와 같은 링커-약물, ADC 또는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
제3의 바람직한 구현예에서, 본 발명은 인간 혈액학적 악성종양, 특히 백혈병, 더욱 특히 급성 림프구성 및 골수성 백혈병(각각 ALL 및 AML)으로 이루어진 군으로부터 선택된 백혈병의 치료에 사용하기 위한 상기 기재된 바와 같은 링커-약물, ADC 또는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 상기 기재된 바와 같은 링커-약물 화합물, ADC 또는 약제학적 조성물과 상기 기재된 바와 같은 인간 고형 종양 및 혈액학적 악성종양의 치료를 위한 추가의 암 관련 표적에 대한 치료적 항체, 화학요법제, 및/또는 ADC와 같은 하나 이상의 다른 치료제와의 순차적 또는 동시 투여된 조합의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 일 구현예에서, 치료적 항체는 아데카투무맙(adecatumumab), 알렘투주맙(alemtuzumab), 아마툭시맙(amatuximab), 베바시주맙(bevacizumab), 세툭시맙(cetuximab), 데노수맙(denosumab), 에타라시주맙(etaracizumab), 팔레투주맙(farletuzumab), 젬투주맙(gemtuzumab), 라베투주맙(labetuzumab), 마파투무맙(mapatumumab), 민레투모맙(minretumomab), 니모투주맙(nimotuzumab), 니볼루맙(nivolumab), 오레고보맙(oregovomab), 파니투무맙(panitumumab), 펨투모맙(pemtumomab), 페르투주맙(pertuzumab), 라무시루맙(ramucirumab), 시브로투주맙(sibrotuzumab), 트라스투주맙(trastuzumab) 또는 볼로식시맙(volociximab)이며, 화학요법제는 i) 알킬화제, 특히 질소 머스타드, 예컨대 메클로레타민, 클로람부실, 사이클로포스파미드, 이포스파미드 및 멜팔란; 니트로소우레아, 예컨대 스트렙토조신, 카르무스틴 및 로무스틴; 알킬 설포네이트, 예컨대 부설판; 트리아진, 예컨대 다카르바진 및 테모졸로미드; 에틸렌이민, 예컨대 티오테파 및 알트레타민; 또는 백금 약물, 예컨대 시스플라틴, 카르보플라틴 및 옥살리플라틴; ii) 항대사산물, 특히 5-플루오로우라실, 6-머캅토퓨린, 카페시타빈, 시타라빈, 플록수리딘, 플루다라빈, 젬시타빈, 하이드록시우레아, 메토트렉세이트 또는 페메트렉세드; iii) 항종양 항생제, 특히 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신, 이다루비신, 악티노마이신 D, 블레오마이신, 미토마이신-C 또는 미톡산트론; iv) 토포이소머라아제 억제제, 특히 토포이소머라아 I 억제제, 예컨대 토포테칸 및 이리노테칸; 또는 토포이소머라아제 II 억제제, 예컨대 에토포사이드, 테니포사이드 및 미톡산트론; v) 유사분열 억제제, 특히 탁산, 예컨대 파클리탁셀, 카바지탁셀 및 도세탁셀; 에포틸론, 예컨대 익사베필론; 빈카 알칼로이드, 예컨대 빈블라스틴, 빈크리스틴 및 비노렐빈; 또는 에스트라무스틴; vi) 신호전달 케스케이드 억제제, 특히 mTOR(라파마이신의 포유동물 표적) 억제제, 예컨대 템시로리무스 및 에베로리무스; 또는 티로신 키나아제 억제제, 예컨대 제피티닙, 에를로티닙, 이마티닙, 파조파닙, 세리티닙, 크리조티닙, 라파티닙 및 아파티닙; vii) 코르티코스테로이드, 특히 프레드니손, 메틸프레드니솔론 또는 덱사메타손; viii) 호르몬 치료제, 특히 안드로겐 수용체 조절제, 예컨대 비칼루타미드, 엔잘루타미드 및 아비라테론 아세테이트; 항에스트로겐, 예컨대 타목시펜; 또는 아로마타아제 억제제 또는 스테로이드 변형제, 예컨대 아나스트로졸, 레트로졸, 풀베스트란트 및 엑세메스탄; ix) PARP 억제제, 특히 올라파립; 또는 x) 또 다른 화학요법 약물, 특히 L-아스파라기나아제 또는 보르테조밉이다. 당업자는 상기 기재된 바와 같은 인간 고형 종양 및 혈액학적 악성종양의 치료에 사용하기 위한 적합한 조합 요법을 선택하는데 어려움이 없을 것이다.
본 발명에 따른 ADC의 치료적 유효량은 약 0.01 내지 약 15 mg/kg 체중의 범위, 특히 약 0.1 내지 약 10 mg/kg 체중의 범위, 더욱 특히 약 0.3 내지 약 10 mg/kg 체중의 범위이다. 이 후자의 범위는 링커-약물 또는 ADC의 20 내지 800 mg의 범위의 고정된 용량에 대략 상응한다. 본 발명의 화합물은 매주, 2주마다, 3주마다, 매월마다, 또는 6주마다 투여될 수 있다. 적합한 치료 요법은 질환의 중증도, 환자의 연령, 투여되는 화합물, 및 치료 의사에 의해 고려될 다른 인자에 의존한다.
실시예
물질 및 방법
시스테인 조작된 항체를 WO2015/177360에 기재된 물질 및 절차를 사용하여 수득하였다. 시약 및 완충액을 상업적인 공급업체로부터 입수하였다.
HIC - 분석적 HIC를 위해, 5-10 μL의 샘플(1 mg/ml)을 TSKgel 부틸-NPR 컬럼(4.6 mm ID x 3.5 cm L, Tosoh Bioscience, cat. nr. 14947)에 주입하였다. 용리 방법은 20분 동안 0.4 ml/분으로 100% 완충액 A(25 mM 인산나트륨, 1.5 M 황산암모늄, pH 6.95)부터 100% 완충액 B(25 mM 인산나트륨, pH 6.95, 20% 이소프로판올)까지의 선형 구배로 구성되었다. 컬럼 온도를 25℃로 유지시켰다. PDA-검출기 및 엠파워(Empower) 소프트웨어가 장착된 Waters Acquity H-Class 초고성능 액체 크로마토그래피(UPLC) 시스템을 사용하였다. 214 nm에서 흡광도를 측정하여 평균 DAR을 정량화하고 다양한 ADC의 상대적 소수성을 결정하였다.
SEC - 분석적 SEC를 위해, 5 μL의 샘플(1 mg/ml)을 TSKgel SWXL 가드 컬럼(7 μm, 6.0 mm ID x 4.0 cm L, Tosoh Bioscience, cat. no. 08543)이 장착된 TSKgel G3000SWXL 컬럼(5 μm, 7.8 mm ID x 30 cm L, Tosoh Bioscience, cat. no. 08541)에 주입하였다. 용리 방법은 30분 동안 0.6 ml/분으로 100% 50 mM 인산나트륨, 300 mM NaCl, pH 7.5를 이용한 용리로 구성되었다. 컬럼 온도를 25℃로 유지시켰다. PDA-검출기 및 엠파워 소프트웨어가 장착된 Waters Acquity H-Class UPLC 시스템을 사용하였다. 214 nm에서 흡광도를 측정하여 HMW 종의 양을 정량화하였다.
SHPC - 70 μl ADC 용액을 30 μl DMA와 혼합하여 샘플을 제조하였다. 50 μl의 샘플을 PDA-검출기 및 엠파워 소프트웨어가 장착된 Waters Acquity H-Class UPLC 시스템에 탑재된 차폐된 소수성 상 컬럼(SUPELCOSIL LC-HISEP 5 μm, 4.6 mm ID x 15 cm L, Supelco(Sigma-Aldrich), cat. no. 58935)에 주입하였다. 용리 방법은 10분 동안 1.0　ml/분으로 90% 완충액 A(100 mM 아세트산암모늄, pH 4.0) 및 10%의 완충액 B(아세토니트릴)부터 32% 완충액 A 및 68% 완충액 B까지의 선형 구배로 구성되었다. 컬럼 온도를 45℃로 유지시켰다. 325 nm에서 흡광도를 측정하여 유리 링커-약물의 양을 정량화하였다.
엑소 -링커-약물의 합성
사용된 용매는 시약 등급 또는 HPLC 등급이었다. NMR 스펙트럼을 Bruker AVANCE400에 기록하였다(1H의 경우 400MHz; 13C의 경우 100 MHz). 화학적 이동은 내부 표준으로서 테트라메틸실란 대비 ppm으로 보고된다.
링커-약물을 DMA에 용해시키고 용액을 Waters SunFire™ Prep C18 OBD™ 컬럼(5 μm 입자 크기, 50x150 mm)에 로딩한 다음, 20% 완충액 A부터 70% 완충액 A의 선형 구배를 사용하여 117 ml/분의 유속으로 용리시켜 조(crude) 링커-약물을 정제하였다. 완충액 A는 아세토니트릴이다. 완충액 B는 물 중의 0.1% TFA(m/m)이다. 순도를 0.4 ml/분의 유속으로 Waters ACQUITY UPLCⓒ BEH C18 컬럼(1.7 μm 입자 크기, 2.1x50 mm)을 사용하여 HPLC에 의해 평가하였다.
일반적으로, 링커-약물의 합성은 화합물 11 및 고리화 모듈로부터 시작하며, 이의 합성은 문헌[Elgersma et al. Mol. Pharmaceutics, 2015; 12: 1813-1835 및 WO 제2011/133039호]에 기재되어 있다.
화합물의 합성
화합물 12
보호된 말레이미드인 화합물 75를 문헌[Elduque et al. Bioconjugate Chem. 2013; 24: 832-839]에 기재된 바와 같이 합성하였다. NMR 스펙트럼은 이 문헌 내의 스펙트럼과 동일하였다.
Boc-Mom 보호된 약물-CS(11)(1.0 g, 1.16 mmol, 1 당량) 및 보호된 말레이미드 75(0.34 g, 1.75 mmol, 1.5 당량)를 건조 THF(20 ml)에 용해시킨 다음, 진공 농축하고 진공 건조시켰다. 고체 잔류물을 질소 분위기 하에 건조 THF(20 ml)에 재용해시키고, 트리페닐포스핀(0.46 g, 1.75 mmol, 1.5 당량)을 첨가하고, 생성된 혼합물을 얼음 수조에서 냉각시켰다. 다음으로, 디이소프로필 아조디카르복실레이트(DIAD)(0.35 g, 1.75 mmol, 1.5 당량)를 혼합물에 적가하고 실온(RT)으로 서서히 가온시키고, RT에서 30분 동안 교반을 계속하였다. 혼합물을 진공 농축시키고, 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(DCM/MeOH, 1:0부터 95:5, v/v)에 의해 정제하고, 생성물을 함유하는 분획을 조합하고, 진공 농축시키고, 톨루엔과 함께 공증발시키고 진공 건조시켜 백색 포말로서 화합물 12(1.06 mmol, 91%)를 수득하였다.
Figure 112019048052733-pct00032
화합물 17
THF(25 ml) 중의 화합물 13(2.01 g, 9.65 mmol, 1 당량)의 용액을 얼음 수조에서 0℃로 냉각시킨 다음, 4-니트로페닐클로로포르메이트(2.14 g, 10.62 mmol, 1.1 당량) 및 Et3N(2.69 ml, 19.30 mmol, 2 당량)을 첨가하고, 생성된 혼합물을 2시간 동안 교반하여 RT로 가온시켰다. 혼합물을 진공 농축시키고, 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(DCM/EtOAc, 1:0부터 1:1, v/v)에 의해 정제하고, 생성물을 함유하는 분획을 조합하고 진공 농축시켜 황색 오일로서 중간체 14(2.5 g, 6.70 mmol, 69%)를 수득하였다. DMF(20 ml) 중의 화합물 14(1.34 g, 3.58 mmol, 1.05 당량) 및 H-Val-Ala-PABA 15(US제2014/0363454호(Igenica Biotherapeutics)에 기재된 바와 같이 합성됨, 1.0 g, 3.41 mmol, 1　당량)를 얼음 수조에서 0℃로 냉각시키고, N,N-디이소프로필에틸아민(DIPEA)(1.49 ml, 8.52 mmol, 2.5 당량)을 용액에 첨가하고, 혼합물을 18시간 동안 교반하여 RT로 서서히 가온시켰다. 혼합물을 진공 농축시키고, 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(DCM/MeOH, 1:0부터 9:1, v/v)에 의해 정제하여 백색 고체로서 화합물 16(1.4　g, 2.65 mmol, 78%)을 수득하였다.
Figure 112019048052733-pct00034
DMF(20 ml) 중의 화합물 16(1.3 g, 2.46 mmol, 1 당량)의 용액을 얼음 수조에서 0℃로 냉각시키고, 비스(4-니트로페닐)카르보네이트(1.50 g, 4.93 mmol, 2 당량) 및 DIPEA(0.65 ml, 3.70 mmol, 1.5 당량)를 첨가하였다. 혼합물을 3시간 동안 교반하고, RT로 서서히 가온시켰다. 조 혼합물을 진공 농축시키고, 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(DCM/MeOH, 1:0부터 9:1, v/v)에 의해 정제하여 백색 고체로서 화합물 17(1.7 g, 2.45 mmol, 정량적 수율)을 수득하였다.
Figure 112019048052733-pct00035
화합물 19
MeCN/H2O(1:1)(100 ml) 중의 H-Val-Ala-PABA 15(US제2014/0363454호 (Igenica Biotherapeutics)에 기재된 바와 같이 합성됨, 1.4 g, 4.77 mmol, 1 당량)의 용액에 N-메틸모르폴린(1.05 ml, 9.54 mmol, 2 당량), 포름알데히드(3.55　ml, 47.7 mmol, 10 당량) 및 NaCNBH3(0.9 g, 14.32 mmol, 3 당량)을 순차적으로 첨가한 다음, 아세트산(0.55 ml, 9.54 mmol, 2 당량)을 적가하였다. 생성된 혼합물을 30분 동안 교반하였다. 그 후, 조 혼합물을 진공 농축시키고, 톨루엔과 함께 공증발시키고, 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(DCM/MeOH, 1:0부터 7:3, v/v)에 의해 정제하여 백색 왁스성 고체로서 화합물 18(1.55 g, 정량적 수율)을 수득하였다.
Figure 112019048052733-pct00037
DMF(20 ml) 중의 화합물 18(1.53 g, 4.77 mmol, 1 당량)의 용액을 얼음 수조에서 0℃로 냉각시키고, 비스(4-니트로페닐)카르보네이트(2.90 g, 9.54 mmol, 2 당량) 및 DIPEA(1.25　ml, 7.16 mmol, 1.5 당량)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 3시간 동안 교반하고, RT로 서서히 가온시켰다. 혼합물을 진공 농축시키고, 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(DCM/MeOH, 1:0부터 8:2, v/v)에 의해 정제하여 황색 왁스성 고체로서 화합물 19(2.2 g, 4.52 mmol, 95%)를 수득하였다.
Figure 112019048052733-pct00038
화합물 24
MeCN/H2O(1:1)(50 ml) 중의 H-Val-Lys(Boc)-PABA 20(WO2013/67597, 80-82 페이지(Ascend Biopharmaceuticals)에 기재된 바와 같이 합성됨, 1.26 g, 2.80 mmol, 1 당량)의 용액에 N-메틸모르폴린(0.62 ml, 5.59 mmol, 2 당량), 포름알데히드(2.08 ml, 28.0 mmol, 10 당량) 및 NaCNBH3(0.53 g, 8.39 mmol, 3 당량)을 첨가한 다음, 아세트산(0.32 ml, 5.59 mmol, 2 당량)을 적가하였다. 혼합물을 30분 동안 교반하였다. 혼합물을 진공 농축시키고, 톨루엔과 함께 공증발시켰다. 조 생성물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(DCM/MeOH, 1:0 내지 7:3 v/v)에 의해 정제하여 백색 왁스성 고체로서 화합물 21(1.13 g, 2.36 mmol, 84%)을 수득하였다.
Figure 112019048052733-pct00040
DCM(20 ml) 중의 화합물 21(1.06 g, 2.22 mmol, 1 당량)의 용액을 얼음 수조에서 0℃로 냉각시키고, TFA(15 ml)를 첨가하고, 30분 동안 교반한 다음, DCM으로 희석시키고, 진공 농축시키고, DCM과 함께 공증발시켰다(2회). 수득된 TFA-염을 THF(10 ml)에 용해시키고, 말레이미드-카르바메이트 22(0.34 g, 2.22 mmol, 1 당량)를 첨가한 다음, Et3N(1.24 ml, 8.86 mmol, 4 당량)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 50℃에서 48시간 동안 교반한 다음, 추가의 0.5 당량의 Et3N을 첨가하고, 24시간 동안 더 교반하였다. 혼합물을 진공 농축시키고, 조 생성물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(DCM/MeOH, 1:0부터 7:3 v/v)에 의해 정제하여 화합물 23을 수득하였고, 이를 다음 단계에 바로 사용하였다.
Figure 112019048052733-pct00041
DMF(10 ml) 중의 화합물 23(1.0 g, 2.18 mmol, 1 당량)의 용액을 얼음 수조에서 0℃로 냉각시키고, 비스(4-니트로페닐)카르보네이트(1.33 g, 4.36 mmol, 2 당량) 및 DIPEA(0.57 ml, 3.27 mmol, 1.5 당량)를 첨가하고, 생성된 혼합물을 얼음 수조에서 0℃에서 3시간 동안 교반하였다. 그 후, 혼합물을 진공 농축시키고, 조 생성물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(DCM/MeOH, 1:0부터 8:2 v/v)에 의해 정제하여 황백색 고체로서 화합물 24(0.55 g, 0.88 mmol, 40%)를 수득하였다.
Figure 112019048052733-pct00042
화합물 34
MeCN(25　ml) 중의 에탄-1,2-디아민 26(2.15 ml, 32.1 mmol, 4 당량), 요오드화칼륨(1.33 g, 8.03 mmol, 1 당량) 및 탄산칼륨(2.22 g, 16.06 mmol, 2 당량)의 혼합물에 2-(2-클로로에톡시)에탄올 25(0.85 ml, 8.03 mmol, 1 당량)의 용액을 적가하였다. 생성된 혼합물을 60℃에서 2일 동안 교반하였다. 다음으로, 조 혼합물을 진공 농축시키고, 톨루엔과 함께 공증발시키고, 잔류물을 EtOAc에 용해시키고 10분 동안 교반하였다. 현탁액을 여과하고, 여과액을 진공 농축시켜 무색 오일로서 화합물 27 2-(2-(2-아미노에틸아미노)에톡시)에탄올(750 mg, 5.06 mmol, 63%)을 수득하였다.
Figure 112019048052733-pct00044
THF(10 ml) 중의 2,2,2-트리플루오로아세테이트(602 μl, 5.06 mmol, 1 당량)의 냉각된(0℃) 용액에 THF(5 ml) 중의 2-(2-(2-아미노에틸아미노)에톡시)에탄올 27(750　mg, 5.06 mmol, 1 당량)의 용액을 적가하고, 혼합물을 45분 동안 교반하였다. 그 후, THF(5 ml) 중의 디-tert-부틸 디카르보네이트(1.33 g, 6.07 mmol, 1.2 당량)를 적가한 다음, Et3N(846 μl, 6.07 mmol, 1.2 당량)을 첨가하고 1시간 동안 교반하였다. 혼합물을 진공 농축시키고, 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(DCM/EtOAc, 1:0부터 1:1, v/v)에 의해 정제하여 황색 오일로서 화합물 28(980 mg, 2.85 mmol, 56%)을 수득하였다.
Figure 112019048052733-pct00045
MeOH(10 ml) 중의 화합물 28(900 mg, 2.61 mmol, 1 당량)의 용액에 NaOH(157 mg, 3.92 mmol, 1.5 당량, 물(5 ml)에 용해됨)를 첨가하고, 혼합물을 4시간 동안 RT에서 교반하였다. 혼합물을 진공 농축시키고, DCM 및 물(NaCl로 포화됨)을 첨가하였다. DCM-층을 MgSO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 농축시켜 황색 오일로서 화합물 29(660 mg, 100%)를 수득하였다.
Figure 112019048052733-pct00046
물(6 ml) 중의 화합물 29(650 mg, 2.62 mmol, 1 당량) 및 NaHCO3(440 mg, 5.24　mmol, 2 당량)의 용액에 THF(6 ml) 중의 Fmoc-Ala-OSu(1.18 g, 2.88 mmol, 1.1 당량)를 첨가하고, 혼합물을 밤새 RT에서 교반하였다. 그 후, THF를 증발시키고, 물을 첨가하고, EtOAc로 추출하였다(2회). 조합된 유기층을 염수로 세척하고, 건조시키고(MgSO4 상에서), 여과하고, 진공 농축시켰다. 조 생성물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(DCM/MeOH, 1:0부터 9:1, v/v)에 의해 정제하여 백색 고체로서 화합물 30(1.2 g, 2.22 mmol, 85%)을 수득하였다.
Figure 112019048052733-pct00047
DMF(10 ml) 중의 화합물 30(1.2 g, 2.16 mmol, 1 당량)의 용액에 피페리딘(4.4 ml, 44.3 mmol, 20 당량)을 첨가하고, 90분 동안 교반하였다. 혼합물을 진공 농축시키고, 톨루엔과 함께 공증발시키고, 물(12 ml)에 재용해시키고, 에테르로 2회 추출하였다. 그 후, THF(16 ml) 중의 Fmoc-Val-OSu(0.94 g, 2.16 mmol, 1 당량)의 용액을 물 층에 첨가한 다음, 중탄산나트륨(0.2 g, 2.38 mmol, 1.1　당량)을 첨가하고, 생성된 혼합물을 RT에서 4시간 동안 교반하였다. 다음으로, THF를 증발시키고, 물을 첨가하고, EtOAc로 2회 추출하였다. 조합된 유기층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 농축시켰다. 조 생성물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(DCM/MeOH, 1:0부터 9:1, v/v)에 의해 정제하여 백색 포말로서 화합물 31(1.4 g, 2.19　mmol, 정량적 수율)을 수득하였다.
Figure 112019048052733-pct00048
DMF(10 ml) 중의 화합물 31(1.4 g, 2.19 mmol, 1 당량)의 용액에 피페리딘(4.3 ml, 43.7 mmol, 20 당량)을 첨가하고, 2시간 동안 교반하였다. 조 혼합물을 진공 농축시키고, 톨루엔과 함께 공증발시키고, 고체 잔류물을 Et2O로 세척하고, 여과하고, 진공 건조시켜 회색 고체로서 화합물 32(0.68 g, 1.63 mmol, 74%)를 수득하였다.
Figure 112019048052733-pct00049
MeCN/H2O(50 ml, 1:1, v/v) 중의 화합물 32(680 mg, 1.63 mmol, 1 당량)의 용액에 N-메틸모르폴린(357 μl, 3.25 mmol, 2 당량), 포름알데히드(1.21 ml, 16.25 mmol, 10 당량) 및 NaCNBH3(306 mg, 4.87 mmol, 3 당량)을 순차적으로 첨가한 다음, 아세트산(186 μl, 3.25 mmol, 2 당량)을 적가하였다. 생성된 혼합물을 15분 동안 교반하였다. 조 혼합물을 진공 농축시키고, 톨루엔과 함께 공증발시키고, 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(DCM/MeOH, 1:0부터 8:2, v/v)에 의해 정제하였다. 생성물을 다시 톨루엔과 함께 공증발시켜 무색 오일로서 화합물 33(680 mg, 1.52 mmol, 94%)을 수득하였다.
Figure 112019048052733-pct00050
건조 THF(20 ml) 중의 화합물 33(680 mg, 1.52 mmol, 1 당량)의 용액을 질소 분위기 하에 두고, 말레이미드(192 mg, 1.98 mmol, 1.3 당량) 및 트리페닐포스핀(519 mg, 1.98 mmol, 1.3 당량)을 첨가하였다. 혼합물을 얼음 수조에서 0℃로 냉각시키고, DEAD(톨루엔 중의 2.2 M)(900 μl, 1.98 mmol, 1.3 당량)를 적가하고 RT에서 30분 동안 교반하였다. 조 혼합물을 진공 농축시키고, 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(DCM/MeOH, 1:0부터 9:1, v/v)에 의해 정제하여 무색 왁스성 고체로서 화합물 34(280　mg, 0.53 mmol, 35%)를 수득하였다.
Figure 112019048052733-pct00051
화합물 40
프탈이미드-테트라에틸렌글리콜-토실레이트 37의 합성이 몇 가지 문헌 절차, 예를 들어 문헌[Kim et al. Organic Letters, 2007, 9 (22): 4419-4422]에 기재되어 있다.
아세토니트릴(20 ml) 중의 tert-부틸 2-(벤질아미노)에틸(메틸)카르바메이트 38(664 mg, 2.51　mmol, 1 당량), 프탈이미드-테트라에틸렌글리콜-토실레이트 37(1.2 g, 2.51 mmol, 1 당량), K2CO3(695 mg, 5.03 mmol, 2 당량) 및 KI(417 mg, 2.51 mmol, 1 당량)의 혼합물을 3일 동안 환류시켰다. 혼합물을 진공 농축시키고, 조 생성물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(DCM/MeOH, 1:0부터 8:2, v/v)에 의해 정제하여 무색 오일로서 화합물 39(1.4 g, 2.46 mmol, 98%)를 수득하였다.
Figure 112019048052733-pct00053
팔라듐 온 탄소(262 mg, 0.25 mmol, 0.1 당량)를 MeOH(10 ml)에 현탁시킨 다음, 화합물 39(MeOH((10 ml) 중의 1.4 g, 2.46 mmol, 1 당량) 및 아세트산(422 μl, 7.37 mmol, 3 당량)을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 수소 하에서 3시간 동안 교반하였다. 혼합물을 셀라이트 상에서 여과시키고, 진공 농축시키고, 톨루엔과 함께 공증발시키고 진공 건조시켜 화합물 40(850 mg, 1.77 mmol, 72%)을 수득하였다.
Figure 112019048052733-pct00054
화합물 50
DMF(20 ml) 중의 화합물 15(3.58 g, 10.2 mmol, 1 당량)의 용액에 화합물 48(3.16 g, 10.2 mmol, 1 당량) 및 DIPEA(2.0 ml, 11.5 mmol, 1.1 당량)를 첨가하고, 생성된 혼합물을 2시간 동안 교반하였다. 그 후, 비스-(4-니트로페닐)카르보네이트(4.68 g, 15.4 mmol, 1.5　당량)를 첨가하고 18시간 동안 교반하였다. 혼합물을 진공 농축시키고, 조 생성물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(DCM/MeOH, 1:0, 9:1, v/v)에 의해 정제하고, 디옥산/물에 용해시키고 동결 건조시켜 황백색 고체로서 화합물 50(5.16 g, 7.7 mmol, 75%)을 수득하였다.
Figure 112019048052733-pct00056
화합물 56
화합물 38(2.05 g, 7.75 mmol, 1 당량), 2-브로모에탄올(54, 551 μl, 7.75 mmol, 1 당량), K2CO3(2.14 g, 15.5 mmol, 2 당량) 및 KI(1.29 g, 7.75 mmol, 1 당량)의 혼합물을 아세토니트릴(20 ml)에 용해시키고, 가열하여 72시간 동안 환류시켰다. 혼합물을 RT로 냉각시키고, 진공 농축시켰다. 조 생성물을 DCM에 용해시키고, 물(2x) 및 염수로 세척하고, MgSO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 농축시켰다. 조 생성물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(헵탄/EtOAc, 1:0부터 0:1 v/v)에 의해 정제하고, 생성물을 함유하는 분획을 조합하고 진공 농축시켜 오렌지색 오일로서 화합물 55(1 g, 3.24 mmol, 42%)를 수득하였다.
Figure 112019048052733-pct00058
MeOH(50 ml) 중의 Pd/C(345 mg, 0.32 mmol, 0.1 당량)의 현탁액에 화합물 55(MeOH 50 ml 중의 1 g, 3.24 mmol, 1 당량)의 용액을 첨가한 다음, 아세트산(557 μl, 9.73 mmol, 3 당량)을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 수소 분위기 하에 4시간 동안 교반하였다. 그 후, 혼합물을 셀라이트로 여과하고, 진공 농축시키고, 톨루엔과 함께 공증발시키고, 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(DCM/MeOH, 구배)에 의해 정제하고, 생성물을 함유하는 분획을 조합하고, 진공 농축시켜 오일로서 OEGCS(56)(720 mg, 3.3 mmol, 정량적 수율)를 수득하였다.
Figure 112019048052733-pct00059
화합물 57
화합물 A는 아크로스 오르가닉스(Acros Organics)(CAS nr. 836-43-1, suppl. Code 18196)로부터 상업적으로 이용가능하다.
DCM(20 ml) 중의 화합물 A(2.73 g, 12.7 mmol, 1 당량)의 용액을 얼음 수조에서 0℃로 냉각시키고, DIPEA(6.68 ml, 38.2 mmol, 3 당량)를 첨가한 다음, MOM-Cl(1.45 ml, 19.1 mmol, 1.5 당량)을 적가하였다. 혼합물을 RT에서 24시간 동안 교반하였다. 다음으로, 물 및 DCM을 첨가하고, 층을 분리하였다. DCM 층을 1M HCl-용액, 포화 NaHCO3 용액, 물 및 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시켰다. DCM 층을 여과하고, 여과액을 진공 농축시켰다. 조 생성물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(C7/EtOAc, 1:0부터 9:1, v/v)에 의해 정제하고, 생성물을 함유하는 분획을 조합하고 진공 농축시켜 무색 오일로서 화합물 B(2.6 g, 10.1 mmol, 79%)를 수득하였다.
Figure 112019048052733-pct00061
MeOH(6 ml) 중의 Pd/C(0.21 g, 2.01 mmol, 0.2 당량)의 현탁액에 THF(12 ml) 중의 화합물 B(2.6 g, 10.07 mmol, 1 당량)를 첨가하였다. 혼합물을 수소로 3회 퍼징하고, 수소 분위기 하에서 4시간 동안 교반하였다. 현탁액을 셀라이트로 여과하고, 진공 농축시키고, 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(C7/EtOAc, 1:0부터 3:1, v/v)에 의해 정제하였다. 생성물을 함유하는 분획을 조합하고, 진공 농축시켜 무색 오일로서 화합물 57(1.68 g, 9.99 mmol, 99%)을 수득하였다.
화합물 61
THF(25 ml) 중의 화합물 57(1.68 g, 10 mmol, 1 당량)의 용액을 얼음 수조에서 0℃로 냉각시키고, 4-니트로페닐클로로포르메이트(2.12 g, 10.5 mmol, 1.05 당량) 및 Et3N(4.18 ml, 30 mmol, 3 당량)을 첨가하고, 혼합물을 얼음 수조에서 30분 동안 0℃에서 교반하였다. 다음으로, HOBt(1.53 g, 10 mmol, 1 당량) 및 고리화 스페이서 4A(WO2011/133039, 실시예 1(Syntarga)에 기재된 바와 같이 합성됨, THF(10 ml) 중의 2.62 g, 10 mmol, 1 당량)를 첨가하고 50℃에서 90분 동안 교반하였다. 혼합물을 진공 농축시키고, 조 생성물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(DCM/EtOAc, 1:0부터 1:1, v/v)에 의해 정제하고, 생성물을 함유하는 분획을 조합하고, 진공 농축시켜 황색 오일로서 화합물 58(3.1　g, 6.8 mmol, 68%)을 수득하였다.
Figure 112019048052733-pct00064
THF(20 ml) 중의 화합물 58(1 g, 2.19 mmol, 1 당량)의 용액을 얼음 수조에서 냉각시키고, 알릴 클로로포르메이트(0.26 ml, 2.41 mmol, 1.1 당량) 및 피리딘(0.35 ml, 4.38 mmol, 2 당량)을 적가하였다. 혼합물을 얼음 수조에서 0℃에서 5 시간 동안 교반하였다. 조 혼합물을 진공 농축시키고, 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(DCM/EtOAc, 1:0부터 1:1, v/v)에 의해 정제하고, 생성물을 함유하는 분획을 조합하고, 진공 농축시켜 무색 오일로서 화합물 59(1.1 g, 2.0 mmol, 92%)를 수득하였다.
Figure 112019048052733-pct00065
화합물 59(250 mg, 0.46 mmol, 1 당량)를 클로로포름(6 ml)에 용해시키고, 얼음 수조에서 0℃로 냉각시키고, TFA(6 ml)를 첨가하고, 8시간 동안 교반하였다. 혼합물을 클로로포름으로 희석시키고, 진공 농축시키고, 톨루엔과 함께 공증발시키고, 진공 건조시켰다. 생성된 TFA-염을 건조 DMF(2 ml)에 재용해시키고, 얼음 수조에서 0℃로 냉각시켰다. 건조 DMF(2 ml) 중의 화합물 19(225 mg, 0.46 mmol, 1 당량)의 용액을 첨가한 다음, Et3N(0.14 ml, 1.39 mmol, 3 당량)을 적가하였다. 생성된 혼합물을 3시간 동안 교반한 다음, MeOH(2 ml)를 첨가하고, 15분 동안 더 교반하였다. 혼합물을 진공 농축시키고, 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(DCM/MeOH, 1:0부터 8:2, v/v)에 의해 정제하고, 생성물을 함유하는 분획을 조합하고 진공 농축시켜 연황색 오일로서 화합물 60(190 mg, 0.26 mmol, 55%)을 수득하였다.
Figure 112019048052733-pct00066
건조 DMF(2 ml) 중의 화합물 60(190 mg, 0.26 mmol, 1 당량)의 용액을 얼음 수조에서 0℃로 냉각시키고, 비스(4-니트로페닐)카르보네이트(155 mg, 0.51 mmol, 2 당량) 및 DIPEA(67 μl, 0.38 mmol, 1.5 당량)를 첨가하고, 4시간 동안 교반하였다. 혼합물을 진공 농축시키고, 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(DCM/MeOH, 1:0부터 9:1, v/v)에 의해 정제하고, 생성물을 함유하는 분획을 조합하고 진공 농축시켜 화합물 61(202 mg, 0.22 mmol, 87%)을 수득하였다.
Figure 112019048052733-pct00067
화합물 68
DCM(90 ml) 및 MeOH(30 ml) 중의 (S)-2-(((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐아미노)프로판산(5 g, 16.1 mmol) 및 (4-아미노페닐)메탄올(2.77 g, 22.5 mmol, 1.4 eq)의 용액을 0℃로 냉각시키고, 에틸 2-에톡시퀴놀린-1(2H)-카르복실레이트(7.94 g, 32.1 mmol, 2 당량)를 첨가하고, 18시간 동안 교반하였다. 혼합물을 진공 농축시키고, 에테르(100 ml)에서 교반하고, 여과하여 황백색 고체로서 (S)-(9H-플루오렌-9-일)메틸 1-(4-(하이드록시메틸)페닐아미노)-1-옥소프로판-2-일카르바메이트(6 g, 14.41 mmol, 90%)를 수득하였다.
Figure 112019048052733-pct00069
(S)-(9H-플루오렌-9-일)메틸 1-(4-(하이드록시메틸)페닐아미노)-1-옥소프로판-2-일카르바메이트(6 g, 14.41 mmol)를 DMF(25 ml)에 용해시키고, 피페리딘(9.81 g, 115 mmol)을 첨가하고, 1시간 동안 교반하였다. 혼합물을 농축시키고, 톨루엔과 함께 공증발시켰다. 조 생성물(고체)을 에테르(150 ml)에서 1시간 동안 교반하고, 여과하였다. 이 절차를 1회 반복하고, 수득된 고체 생성물을 높은 진공에서 건조시켜 백색 고체로서 탈보호화된 화합물 66(2.4 g, 12.36 mmol, 86%)을 수득하였고, 이를 다음 단계에서 직접 사용하였다.
DMF(5 ml) 중의 화합물 65(224 mg, 1.55 mmol, 1 당량) 및 탈보호화된 화합물 66(300 mg, 1.55 mmol, 1 당량)의 용액을 얼음 수조에서 0℃로 냉각시키고, EDAC(474　mg, 2.47 mmol, 1.6 당량), HOBt(284 mg, 1.85 mmol, 1.2 당량) 및 DIPEA(1.35 ml, 7.72　mmol, 5 당량)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 18시간 동안 교반하여 RT로 가온시켰다. 조 혼합물을 진공 농축시키고 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(DCM/MeOH, 1:0부터 9:1, v/v)에 의해 정제하여 정량적 수율로 화합물 67을 수득하였다.
Figure 112019048052733-pct00070
화합물 67(150 mg, 0.45 mmol, 1 당량)을 DMF(2.5 ml)에 용해시키고, 얼음 수조에서 0℃로 냉각시키고, 비스(4-니트로페닐)카르보네이트(272 mg, 0.89 mmol, 2 당량) 및 DIPEA(117 μl, 0.67 mmol, 1.5 당량)를 첨가하고, 생성된 용액을 3시간 동안 교반하여 RT로 가온시켰다. 그 후, 혼합물을 진공 농축시키고, 조 생성물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(DCM/MeOH, 1:0부터 95:5, v/v)에 의해 정제하여 황백색 고체로서 화합물 68(200 mg, 0.4 mmol, 89%)을 수득하였다.
Figure 112019048052733-pct00071
화합물 73
H-Lys(Boc)-PABA 화합물 70의 합성이 문헌[Nair et al. Chem. Commun. 2015; 51: 2403-2406]에 기재되어 있다.
화합물 71을 18시간 동안 DMF(20 ml) 중의 EDAC(1.6 당량), HOBt(1.2 당량) 및 DIPEA(5 당량)를 사용하여 H-Lys(Boc)-PABA 70(1 당량) 및 Me2ValOH(1.2 당량)의 커플링의 부 생성물로서 수득하였다. 이 부 반응은 Me2ValOH 내에 AcOH의 존재에 의해 유발되었다. 혼합물을 진공 농축시키고, 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(DCM/ MeOH, 1:0부터 9:1, v/v)에 의해 정제하고, 생성물을 함유하는 분획을 조합하고, 진공 농축시켜 에테르로부터 결정화 후에 백색 고체로서 화합물 71(540 mg, 1.37 mmol, 40%)을 수득하였다.
Figure 112019048052733-pct00073
클로로포름(12 ml) 중의 화합물 71(540 mg, 1.37 mmol, 1 당량)의 용액을 얼음 수조에서 0℃로 냉각시키고, TFA(8 ml)로 희석시키고, 혼합물을 45분 동안 교반하였다. 그 후, 반응 혼합물을 DCM으로 희석시키고, 진공 농축시키고, 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(DCM/MeOH, 1:0부터 1:1, v/v)에 의해 정제하고, 생성물을 함유하는 분획을 조합하고, 진공 농축시켜 연황색 오일로서 중간체 아민(300 mg, 1.02　mmol, 75%)을 생성하였다. 오일을 THF(20 ml)에 현탁시키고, 얼음 수조에서 0℃로 냉각시키고, 화합물 22(159 mg, 1.02 mmol, 1 당량) 및 Et3N(570 μl, 4.09 mmol, 4　당량)을 첨가하고, 20분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 48시간 동안 50℃로 가온시켰다. 혼합물을 진공 농축시키고, 조 생성물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(DCM/MeOH, 1:0부터 9:1, v/v)에 의해 정제하고, 생성물을 함유하는 분획을 조합하고, 진공 농축시켜 무색 왁스성 고체로서 화합물 72(90 mg, 0.24 mmol, 24%)를 수득하였다.
Figure 112019048052733-pct00074
DMF(2.5 ml) 중의 화합물 72(90 mg, 0.24 mmol, 1 당량)의 용액을 얼음 수조에서 0℃로 냉각시키고, 비스(4-니트로페닐)카르보네이트(147 mg, 0.48 mmol, 2 당량) 및 DIPEA(63 μl, 0.36 mmol, 1.5 당량)를 첨가하고, 생성된 용액을 3시간 동안 교반하여 서서히 RT로 가온시켰다. 그 후, 혼합물을 진공 농축시키고, 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(DCM/MeOH, 1:0부터 9:1 v/v)에 의해 정제하고, 생성물을 함유하는 분획을 조합하고, 진공 농축시켜 무색 고체로서 화합물 73(56 mg, 0.10 mmol, 43%)을 수득하였다.
Figure 112019048052733-pct00075
링커-약물 화합물의 합성
링커-약물 화합물 3
화합물 11(530 mg, 0.93 mmol, 1 당량)을 건조 THF(15 ml)에 용해시키고, 얼음 수조에서 0℃로 냉각시키고, 4-니트로페닐클로로포르메이트(206 mg, 1.02 mmol, 1.1 당량) 및 Et3N(647　μl, 1.49 mmol, 5 당량)을 첨가하고, 45분 동안 교반하였다. 그 후 건조 THF(3 ml) 중의 화합물 56(263 mg, 1.21 mmol, 1.3 당량) 및 HOBt(156 mg, 1.02 mmol, 1.1 당량)를 첨가하고, 생성된 혼합물을 2시간 동안 45℃로 가온시켰다. 이후, 조 혼합물을 RT로 냉각시키고, 진공 농축시키고, 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(DCM/MeOH, 1:0부터 93:7, v/v)에 의해 정제하고, 생성물을 함유하는 분획을 조합하고, 진공 농축시켜 백색 포말로서 생성물 46(580 mg, 0.71 mmol, 77%)을 수득하였다.
Figure 112019048052733-pct00077
건조 THF(4 ml) 중의 화합물 46(200 mg, 0.25 mmol, 1 당량), 말레이미드(31 mg, 0.32 mmol, 1.3 당량) 및 트리페닐포스핀(84 mg, 0.32 mmol, 1.3 당량)의 용액을 얼음 수조에서 0℃로 냉각시키고, DEAD(톨루엔에서 2.2 M, 145 μl, 0.32 mmol, 1.3 당량)를 적가하고, 혼합물을 RT에서 45분 동안 교반하였다. 혼합물을 진공 농축시키고, 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(DCM/MeOH, 1:0부터 95:5, v/v)에 의해 정제하고, 생성물을 함유하는 분획을 조합하고, 진공 농축시키고, 톨루엔과 함께 공증발시켜 백색 포말로서 화합물 47(150 mg, 0.17 mmol, 68%)을 수득하였다.
Figure 112019048052733-pct00078
클로로포름(4 ml) 중의 화합물 47(150 mg, 0.17 mmol, 1 당량)의 용액을 얼음 수조에서 0℃로 냉각시키고, TFA(2 ml)로 희석시키고, 3시간 동안 교반하였다. 혼합물을 진공 농축시키고, 톨루엔과 함께 공증발시키고, 진공 건조시켰다. 중간체를 건조 DMF(2 ml)에 용해시키고, 얼음 수조에서 0℃로 냉각시킨 다음, 활성화된 링커 19(98 mg, 0.20 mmol, 1.2 당량) 및 Et3N(47 μl, 0.34 mmol, 2 당량)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 2시간 동안 교반하였다. 혼합물을 진공 농축시키고, 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(DCM/MeOH, 1:0부터 7:3, v/v)에 의해 정제하고, 생성물을 함유하는 분획을 조합하고, 진공 농축하여 조 화합물 3을 수득하였고, 이를 분취 HPLC(Sunfire C-18, MeCN/ MilliQ 0.1% m/m TFA)에 의해 추가 정제하였다. 아세토니트릴을 증발시키고, 수성 잔류물을 동결 건조시키고, 수득된 고체를 디옥산/물(6 ml, 2:1)에 용해시키고, 동결 건조시켜 백색 고체로서 링커-약물 화합물 3의 TFA 염(69　mg, 0.06 mmol, 38%)을 수득하였다.
Figure 112019048052733-pct00079
링커-약물 화합물 4
DCM(5 ml) 중의 화합물 12(990 mg, 0.96 mmol, 1 당량)의 용액을 얼음 수조에서 0℃로 냉각시키고, TFA(5 ml)로 희석시켰다. 혼합물을 2.5시간 동안 교반한 다음, DCM으로 희석시키고, 진공 농축시키고, 톨루엔과 함께 공증발시켰다. 활성화된 화합물 19(512 mg, 1.05 mmol, 1.1 당량)를 건조 DMF(10 ml)에 용해시키고, 얼음 수조에서 0℃로 냉각시키고, 이후 Et3N(533 μl, 4.06 mmol, 4 당량)을 첨가한 다음, TFA-염(건조 DMF(10 ml)에 용해됨)을 적가하였다. 생성된 혼합물을 3시간 동안 교반하고, 얼음 수조에서 0℃부터 RT까지 서서히 가온시켰다. 다음으로, 혼합물을 진공 농축시키고, 조 생성물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(DCM/MeOH, 구배)에 의해 정제하고, 생성물을 함유하는 분획을 조합하고, 진공 농축시키고, 톨루엔과 함께 공증발시켰다. 그 후, 수득된 고체를 톨루엔(120 ml)에 현탁시키고, 5시간 이내에 90℃로 서서히 가온시켰다. 혼합물을 진공 농축시키고, 조 생성물을 분취 HPLC(Sunfire C-18, MeCN/ MilliQ 0.1% m/m TFA)에 의해 정제하였다. 아세토니트릴을 증발시키고, 물 잔류물을 동결 건조시켰다. 수득된 생성물을 디옥산/물(18 ml, 2:1)에 용해시키고, 2회 동결 건조시켜 백색 고체로서 링커-약물 화합물 4의 TFA 염(475 mg, 0.42 mmol, 44%)을 수득하였다.
Figure 112019048052733-pct00081
링커-약물 화합물 5
건조 THF(10 ml) 중의 화합물 44(720 mg, 0.80 mmol, 1 당량), 말레이미드(10 mg, 1.04 mmol, 1.3 당량) 및 트리페닐포스핀(272 mg, 1.04 mmol, 1.3 당량)의 용액을 얼음 수조에서 0℃로 냉각시키고, DEAD(톨루엔에서 2.2 M, 471 μl, 1.04 mmol, 1.3 당량)를 적가하고, RT에서 45분 동안 교반하였다. 혼합물을 진공 농축시키고, 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(DCM/MeOH, 1:0부터 95:5, v/v)에 의해 정제하고, 생성물을 함유하는 분획을 조합하고, 진공 농축시키고, 톨루엔으로 공증발시켜 백색 포말로서 화합물 45(590 mg, 0.60 mmol, 75%)를 수득하였다.
Figure 112019048052733-pct00083
클로로포름(2 ml) 중의 화합물 45(200 mg, 0.20 mmol, 1 당량)의 용액을 얼음 수조에서 0℃로 냉각시키고, TFA(2 ml)로 희석시키고, 3시간 동안 교반하였다. 혼합물을 진공 농축시키고, 톨루엔과 함께 공증발시키고, 진공 건조시켰다. 중간체를 건조 DMF(2 ml)에 용해시키고, 얼음 수조에서 0℃로 냉각시키고, 활성화된 링커 19(119 mg, 0.24 mmol, 1.2 당량) 및 Et3N(85 μl, 0.61 mmol, 3 당량)을 첨가하고, 혼합물을 2시간 동안 교반하였다. 혼합물을 진공 농축시키고, 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(DCM/MeOH, 1:0부터 7:3, v/v)에 의해 정제하여 조 화합물 5를 수득하였고, 이를 분취 HPLC(Sunfire C-18, MeCN/ MilliQ 0.1% m/m TFA)에 의해 정제하였다. MeCN을 증발시키고, 수성 잔류물을 동결 건조시키고, 수득된 고체를 디옥산/물(6 ml, 2:1)에 용해시키고, 동결 건조시켜 백색 고체로서 링커-약물 화합물 5의 TFA 염(18 mg, 0.013 mmol, 7%)을 수득하였다.
Figure 112019048052733-pct00084
링커-약물 화합물 6
건조 THF(5 ml) 중의 화합물 35(170 mg, 0.30 mmol, 1 당량)의 용액을 얼음 수조에서 0℃로 냉각시키고, 4-니트로페닐클로로포르메이트(66 mg, 0.33 mmol, 1.1 당량) 및 Et3N(207 μl, 1.49 mmol, 5 당량)을 첨가하고, 30분 동안 교반하였다. 다음으로, 건조 THF(3 ml) 중의 화합물 40(186 mg, 0.39 mmol, 1.3 당량)의 용액 및 HOBt(50 mg, 0.33 mmol, 1.1 당량)를 첨가하고, 생성된 혼합물을 2시간 동안 45℃로 가온시켰다. 혼합물을 RT로 냉각시키고, 진공 농축시키고, 조 생성물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(DCM/MeOH, 1:0부터 95:5, v/v)에 의해 정제하여 화합물 41(325 mg, 정량적 수율)을 수득하였다.
Figure 112019048052733-pct00086
DMF(3 ml) 중의 화합물 41(323 mg, 0.3 mmol, 1 당량)의 용액에 하이드라진(44 μl, 0.9 mmol, 3 당량)을 첨가하고, 45분마다 신선한 하이드라진(30 μl, 0.6 mmol, 2 당량)을 정기적으로 첨가하면서 혼합물을 5.5시간 동안 35℃로 가온시켰다. 조 혼합물을 진공 농축시키고, 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(DCM/MeOH, 1:0부터 7:3, v/v)에 의해 정제하여 황색/오렌지색 왁스성 고체로서 화합물 42(284 mg, 0.17 mmol, 56%)를 수득하였다.
Figure 112019048052733-pct00087
화합물 42(160 mg, 0.17 mmol, 1 당량)를 THF(5 ml) 및 포화 NaHCO3 용액(1 ml)의 혼합물에 용해시키고, 얼음 수조에서 0℃로 냉각시키고, 말레이미드-카르바메이트 22(26 mg, 0.17 mmol, 1 당량)를 첨가하였다. 혼합물을 30분 동안 교반하였다. 그 후, Na2CO3(H2O에서 1 M)(169 μl, 0.17 mmol, 1 당량)을 첨가하고, 추가 45분 동안 교반하였다. 그 후, H2O를 혼합물에 첨가하고, EtOAc로 2회 추출하고, MgSO4 상에서 건조시켰다. 용액을 여과하고, 진공 농축시킨 다음, 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(DCM/MeOH, 1:0부터 95:5 v/v)에 의해 조 생성물을 정제하여 백색 왁스성 고체로서 화합물 43(100 mg, 0.10 mmol, 58%)을 수득하였다.
Figure 112019048052733-pct00088
클로로포름(4 ml) 중의 화합물 43(100 mg, 0.097 mmol, 1 당량)의 용액을 얼음 수조에서 0℃로 냉각시키고, TFA(2 ml)로 희석시키고, 3시간 동안 교반하였다. 혼합물을 진공 농축시키고, 톨루엔과 함께 공증발시키고, 진공 건조시켰다. 그 후, 중간체를 건조 DMF(2 ml)에 용해시키고, 얼음 수조에서 0℃로 냉각시키고, 활성화된 링커 19(57　mg, 0.117 mmol, 1.2 당량) 및 Et3N(27 μl, 0.195 mmol, 2 당량)을 첨가하고, 혼합물을 2시간 동안 교반하였다. 혼합물을 진공 농축시키고, 조 생성물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(DCM/MeOH, 1:0부터 7:3, v/v)에 의해 정제하여 화합물 6을 수득하였고, 이를 분취 HPLC(Sunfire C-18, MeCN/ MilliQ 0.1% m/m TFA)에 의해 추가 정제하였다. 아세토니트릴을 증발시키고, 수성 잔류물을 동결 건조시키고, 수득된 고체를 디옥산/물(6 ml, 2:1)에 용해시키고, 동결 건조시켜 백색 고체로서 링커-약물 화합물 6의 TFA 염(19 mg, 0.015 mmol, 15%)을 수득하였다.
Figure 112019048052733-pct00089
링커-약물 화합물 7
DCM(5 ml) 중의 보호된 약물-CS 12(1.05 g, 1.02 mmol, 1 당량)의 용액을 얼음 수조에서 0℃로 냉각시킨 다음, TFA(5 ml)를 첨가하고, 생성된 혼합물을 2.5 시간 동안 교반한 후, DCM으로 희석시키고, 진공 농축시키고, 톨루엔과 함께 공증발시켰다. 다음으로, 활성화된 링커 17(0.70 g, 1.02 mmol, 1 당량)을 건조 DMF(10　ml)에 용해시키고, 얼음 수조에서 0℃로 냉각시키고, Et3N(0.57 ml, 4.06 mmol, 4 당량)을 첨가한 다음, 건조 DMF(10 ml) 중의 TFA-염을 적가하였다. 생성된 혼합물을 3시간 동안 교반하여, 혼합물을 RT로 가온시켰다. 혼합물을 진공 농축시키고, 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(DCM/MeOH, 1:0부터 7:3, v/v)에 의해 정제하고, 생성물을 함유하는 분획을 조합하고, 진공 농축시키고, 톨루엔과 함께 공증발시켰다. 그 후, 고체를 톨루엔(120 ml)에 현탁시키고, 3시간의 기간 동안 90℃로 서서히 가온시켰다. 다음으로, 혼합물을 진공 농축시키고, 분취 HPLC(Sunfire C-18, MeCN/ MilliQ 0.1% m/m TFA)에 의해 정제하였다. 수집된 분획의 아세토니트릴을 증발시키고, 물 잔류물을 동결 건조시켰다. 수득된 고체를 디옥산/물(18ml, 2:1)에 용해시키고, 2회 동결 건조시켜 백색 고체로서 화합물 7의 TFA 염(0.50 g, 0.37 mmol, 37%)을 수득하였다.
Figure 112019048052733-pct00091
링커-약물 화합물 8
디옥산(6 ml) 중의 화합물 11(630 mg, 0.73 mmol, 1 당량)의 용액에 디옥산(15 ml) 중의 4M HCl을 첨가하고, 혼합물을 2시간 동안 교반하였다. 그 후, 혼합물을 진공 건조시켰다. 다음으로, 활성화된 화합물 24(503 mg, 0.81 mmol, 1.1 당량)를 건조 DMF(5 ml)에 용해시키고, 얼음 수조에서 0℃로 냉각시키고, Et3N(307 μl, 2.20 mmol, 3 당량)을 첨가하였다. 그 후, HCl-염(5 ml DMF에 용해됨)을 적가하고, 혼합물을 3시간 동안 교반하고, RT로 서서히 가온시켰다. 다음으로, 혼합물을 진공 농축시키고, 조 생성물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(DCM/MeOH, 1:0부터 7:3, v/v)에 의해 정제하여 조 화합물 8을 수득하였고, 이를 분취 HPLC(Sunfire C-18, MeCN/MilliQ 0.1% m/m TFA)에 의해 추가 정제하였다. 수집된 분획의 아세토니트릴을 증발시키고, 물 잔류물을 동결 건조시켰다. 수득된 고체를 디옥산/물(12ml, 2:1)에 용해시키고, 2회 동결 건조시켜 백색 고체로서 링커-약물 화합물 8의 TFA 염(217 mg, 0.18 mmol, 25%)을 수득하였다.
Figure 112019048052733-pct00093
링커-약물 화합물 9
건조 THF(5 ml) 중의 화합물 51(200 mg, 0.35 mmol, 1 당량)의 용액을 얼음 수조에서 0℃로 냉각시키고, 4-니트로페닐클로로포르메이트(78 mg, 0.39 mmol, 1.1 당량) 및 Et3N(245 μl, 1.76 mmol, 5 당량)을 첨가하고, 30분 동안 교반하였다. 그 후, 건조 THF(3 ml) 중의 고리화 스페이서 4A의 용액(WO2011/133039, 실시예 1(Syntarga)에 기재된 바와 같이 합성됨, 138 mg, 0.53 mmol, 1.5 당량)의 용액 및 HOBt(60 mg, 0.39 mmol, 1.1 당량)를 첨가하고, 생성된 혼합물을 2시간 동안 50℃로 가온시켰다. 혼합물을 RT로 냉각시키고, 진공 농축시키고, 조 생성물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(DCM/MeOH, 1:0부터 93:7, v/v)에 의해 정제하여 백색 고체로서 화합물 52(250 mg, 0.28 mmol, 80%)를 수득하였다.
Figure 112019048052733-pct00095
디옥산(2 ml) 중의 화합물 52(125 mg, 0.14 mmol, 1 당량)의 용액을 디옥산(8 ml) 중의 4 M HCl로 희석시키고, RT에서 10분 동안 교반하였다. 혼합물을 진공 농축시키고, DCM과 함께 공증발시키고, 진공 건조시켰다. 수득된 HCl-염을 건조 DMF(2.5 ml)에 용해시키고, 얼음 수조에서 0℃로 냉각시킨 다음, 활성화된 화합물 50(142 mg, 0.21 mmol, 1.5 당량) 및 Et3N(39 μl, 0.28 mmol, 2 당량)을 첨가하였다. 혼합물을 1.5시간 동안 교반하여 RT로 가온시켰다. 혼합물을 진공 농축시키고, 조 생성물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(DCM/MeOH, 1:0부터 7:3, v/v)에 의해 정제하고, 생성물을 함유하는 분획을 조합하고, 진공 농축시켜 화합물 9를 수득하였고, 이를 분취 HPLC(Sunfire C-18, MeCN/MilliQ 0.1% m/m TFA, 구배)에 의해 추가 정제하였다. 아세토니트릴을 증발시키고, 수성 잔류물을 동결 건조시키고, 수득된 고체를 디옥산/물에 용해시키고, 동결 건조시켜 백색 고체로서 링커-약물 화합물 9의 TFA 염(57 mg, 0.05 mmol, 32%)을 수득하였다.
Figure 112019048052733-pct00096
링커-약물 화합물 10
화합물 52(200 mg, 0.23 mmol, 1 당량), 말레이미드(29 mg, 0.29 mmol, 1.3 당량) 및 트리페닐포스핀(77 mg, 0.29 mmol, 1.3 당량)을 건조 THF(5 ml)에 용해시키고, 얼음 수조에서 0℃로 냉각시키고, DEAD(톨루엔에서 2.2 M, 133 μl, 0.29 mmol, 1.3 당량)를 적가하였다. 혼합물을 RT에서 100분 동안 교반하였다. 혼합물을 진공 농축시키고, 조 생성물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(DCM/MeOH, 1:0부터 97:3, v/v)에 의해 정제하고, 생성물을 함유하는 분획을 조합하고, 진공 농축시켜 오렌지색 포말로서 화합물 53(100 mg, 0.10 mmol, 46%)을 수득하였다.
Figure 112019048052733-pct00098
클로로포름(2 ml) 중의 화합물 53(80 mg, 0.08 mmol, 1 당량)의 용액을 얼음 수조에서 0℃로 냉각시키고, TFA(2 ml)로 희석시키고, 3시간 동안 교반하였다. 그 후, 혼합물을 진공 농축시키고, 톨루엔과 함께 공증발시키고 진공 건조시켰다. 수득된 TFA 염을 건조 DMF(2 ml)에 용해시키고, 얼음 수조에서 0℃로 냉각시키고, 활성화된 화합물 19(48 mg, 0.10 mmol, 1.2 당량) 및 Et3N(58 μl, 0.41 mmol, 5 당량)을 첨가하고, 혼합물을 2시간 동안 교반하였다. 혼합물을 진공 농축시키고, 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(DCM/MeOH, 1:0부터 7:3, v/v)에 의해 정제하고, 생성물을 함유하는 분획을 조합하고, 진공 농축시켜 조 화합물 10을 수득하였고, 이를 분취 HPLC(Sunfire C-18, MeCN/ MilliQ 0.1% m/m TFA)에 의해 추가로 정제하였다. MeCN을 증발시키고, 수성 잔류물을 동결 건조시키고, 수득된 고체를 디옥산/물(6 ml, 2:1)에 용해시키고, 동결 건조시켜 백색 고체로서 링커-약물 화합물 10의 TFA 염(33 mg, 0.03 mmol, 34%)을 수득하였다.
Figure 112019048052733-pct00099
링커-약물 화합물 36
클로로포름(4 ml) 중의 화합물 34(140 mg, 0.27 mmol, 1 당량)의 용액을 얼음 수조에서 0℃로 냉각시키고, TFA(2 ml)를 첨가한 다음, 혼합물을 1시간 동안 교반하였다. 혼합물을 진공 농축시키고, 톨루엔으로 공증발시키고, 진공 건조시켰다. 별도로, 화합물 35(152 mg, 0.27 mmol, 1 당량)를 건조 THF(3 ml)에 용해시키고, 얼음 수조에서 0℃로 냉각시키고, 4-니트로페닐클로로포르메이트(59 mg, 0.29 mmol, 1.1　당량) 및 Et3N(186 μl, 1.33 mmol, 5 당량)을 첨가하고, 15분 동안 교반하였다. 그 후 THF(3 ml) 중의 HOBt(41 mg, 0.27 mmol, 1 당량) 및 TFA-염(탈보호화된 화합물 34의 TFA-염)을 용액에 첨가하고, 이를 50℃로 1시간 동안 가온시켰다. 조 혼합물을 진공 농축시키고, 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(DCM/MeOH, 1:0부터 7:3, v/v)에 의해 정제하고, 생성물을 함유하는 분획을 조합하고, 진공 농축시켰다. 나머지 고체를 클로로포름(3 ml)에 용해시키고, 얼음 수조에서 0℃로 냉각시키고, TFA(3 ml)를 첨가하고, 2시간 동안 교반하였다. 그 후 진공 농축시키고, 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(DCM/MeOH, 구배)에 의해 정제하고, 생성물을 함유하는 분획을 조합하고, 진공 농축시켜 조 생성물 36을 수득하였고, 이를 분취 HPLC(Sunfire C-18, MeCN/MilliQ 0.1% m/m TFA)에 의해 정제하였다. 아세토니트릴을 증발시키고, 수성 잔류물을 동결 건조시키고, 수득된 고체를 디옥산/물(6 ml, 2:1, v/v)에 용해시키고, 동결 건조시켜 백색 고체로서 링커-약물 화합물 36의 TFA 염(65 mg, 0.07 mmol, 25%)을 수득하였다.
Figure 112019048052733-pct00101
링커-약물 화합물 64
DCM(2 ml) 중의 화합물 62(60 mg, 0.06 mmol, 1 당량)의 용액을 얼음 수조에서 0℃로 냉각시키고, TFA(2 ml)로 희석시키고, 혼합물을 2시간 동안 교반하였다. 혼합물을 진공 농축시키고, 톨루엔과 함께 공증발시키고, 진공 건조시켰다. 다음으로, DMF(1 ml) 중의 화합물 61(64 mg, 0.07 mmol, 1.1 당량)의 용액을 얼음 수조에서 0℃로 냉각시키고, Et3N(36 ml, 0.26 mmol, 4 당량)을 첨가한 다음, TFA-염(1 ml DMF에 용해됨)을 적가하였다. 생성된 혼합물을 2시간 동안 교반하였다. 혼합물을 진공 농축시키고, 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(DCM/MeOH, 1:0부터 7:3, v/v)에 의해 정제하고, 생성물을 함유하는 분획을 조합하고, 진공 농축시켜 중간체 63을 수득하였다.
Figure 112019048052733-pct00103
중간체 63(30 mg, 0.02 mmol, 1 당량)을 THF(5 ml)에 용해시키고, Pd(PPh3)4(11 mg, 9.6 μmol, 0.5 당량)를 첨가한 다음, 2,2-디메틸-1,3-디옥산-4,6-디온(28　mg, 0.19 mmol, 10 당량)을 첨가하고, 혼합물을 질소 분위기 하에서 RT에서 3시간 동안 교반하였다. 혼합물을 진공 농축시키고, 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(DCM/MeOH, 1:0부터 7:3, v/v)에 의해 정제하고, 생성물을 함유하는 분획을 조합하고, 진공 농축시켜 조 생성물 64를 수득하였고, 이를 분취 HPLC(Sunfire C-18, MeCN/ MilliQ 0.1% m/m TFA)에 의해 추가로 정제하였다. MeCN을 증발시키고, 수성 잔류물을 동결 건조시키고, 수득된 고체를 디옥산/물(6 ml, 2:1)에 용해시키고, 동결 건조시켜 백색 고체로서 링커-약물 화합물 64의 TFA 염(6 mg, 3.9 μmol, 20%)을 수득하였다.
Figure 112019048052733-pct00104
링커-약물 화합물 69
클로로포름(3 ml) 중의 화합물 62(110 mg, 0.12 mmol, 1 당량)의 용액을 얼음 수조에서 0℃로 냉각시키고, TFA(3 ml)로 희석시키고, 3시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 진공 농축시키고, 톨루엔과 함께 공증발시키고, 진공 건조시켰다. 그 후, 생성된 TFA-염을 건조 DMF(2 ml)에 용해시키고, 얼음 수조에서 0℃로 냉각시키고, 활성화된 링커 68(65 mg, 0.13 mmol, 1.1 당량) 및 Et3N(33 μl, 0.23 mmol, 2 당량)을 첨가하고, 혼합물을 3시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 진공 농축시키고, 조 생성물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(DCM/MeOH, 1:0부터 7:3, v/v)에 의해 정제하고, 생성물을 함유하는 분획을 조합하고, 진공 농축하여 조 화합물 69를 수득하였고, 이를 분취 HPLC(Sunfire C-18, MeCN/ MilliQ 0.1% m/m TFA)에 의해 정제하였다. 아세토니트릴을 증발시키고, 수성 잔류물을 동결 건조시키고, 수득된 고체를 디옥산/물(6 ml, 2:1)에 용해시키고, 동결 건조시켜 백색 고체로서 링커-약물 화합물 69의 TFA 염(28 mg, 0.02 mmol, 21%)을 수득하였다.
Figure 112019048052733-pct00106
링커-약물 화합물 74
디옥산(2 ml) 중의 화합물 11(75 mg, 0.09 mmol, 1 당량)의 용액을 디옥산(6 ml) 중의 4 M HCl로 희석시키고, 2시간 동안 교반하였다. 혼합물을 진공 농축시키고, 진공 건조시켰다. 수득된 HCl-염을 DMA(2 ml)에 용해시키고, 얼음 수조에서 0℃로 냉각시키고, 화합물 73(56 mg, 0.10 mmol, 1.2 당량) 및 Et3N(24 μl, 0.17 mmol, 2 당량)을 첨가하고, 혼합물을 1.5시간 동안 교반하였다. 혼합물을 진공 농축시키고, 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(DCM/MeOH, 1:0부터 7:3, v/v)에 의해 정제하고, 생성물을 함유하는 분획을 조합하고, 진공 농축시켜 조 화합물 74를 수득하였고, 이를 분취 HPLC(Sunfire C-18, MeCN/ MilliQ 0.1% m/m TFA)에 의해 정제하였다. 아세토니트릴을 증발시키고, 수성 잔류물을 동결 건조시켰다. 수득된 고체를 디옥산/물(6 ml, 2:1)에 용해시키고, 동결 건조시켜 백색 고체로서 링커-약물 화합물 74(26 mg, 0.02　mmol, 27%)를 수득하였다.
Figure 112019048052733-pct00108
부위 특이적 및 야생형 접합을 위한 프로토콜
부분적으로 감소된 내인성 디설파이드를 통한 접합을 위한 일반적인 접합 프로토콜(야생형(wt) 접합)
항체의 용액(4.2 mM 히스티딘, 50 mM 트레할로스, pH 6 중의 5-10 mg/ml)을 EDTA(물 중의 25 mM, 4% v/v)로 희석하였다. pH를 트리스(물에서 1 M, pH 8)를 사용하여 ~7.4로 조절한 다음, TCEP(물에서 10 mM, 항체 및 원하는 DAR에 따라 1-3 당량)를 첨가하고, 생성된 혼합물을 RT에서 1-3시간 동안 배양하였다. DMA를 첨가한 다음, 링커-약물의 용액(DMA에서 10 mM)을 첨가하였다. DMA의 최종 농도는 5-10%이었다. 생성된 혼합물을 1-16시간 동안 빛의 부재하에 RT에서 배양하였다. 과량의 링커-약물을 제거하기 위해, 활성탄을 첨가하고, 혼합물을 1시간 동안 RT에서 배양하였다. 0.2　μm PES 필터를 사용하여 활성탄을 제거하고, 생성된 ADC를 비바스핀(Vivaspin) 원심분리 농축기(30 kDa 컷오프, PES)를 사용하여 4.2 mM 히스티딘, 50 mM 트레할로스, pH 6에서 제제화하였다. 마지막으로, ADC 용액을 0.22 μm PES 필터를 사용하여 멸균 여과하였다.
일반적인 부위 특이적 접합 프로토콜
부위 특이적 접합체를 프로토콜 A 또는 프로토콜 B에 기재된 바와 같은 절차에 따라 합성하였다.
1) 프로토콜 A
시스테인 조작된 항체의 용액(4.2 mM 히스티딘, 50 mM 트레할로스, pH 6에서5-10 mg/ml)을 EDTA(물에서 25 mM, 4% v/v)로 희석시켰다. pH를 트리스(물에서 1 M, pH 8)를 사용하여 ~7.4로 조절한 후, TCEP(물에서 10 mM, 20 당량)를 첨가하고, 생성된 혼합물을 실온(RT)에서 1-3시간 동안 배양하였다. 과량의 TCEP를 4.2 mM 히스티딘, 50 mM 트레할로스, pH 6을 사용하여 PD-10 탈염 컬럼 또는 원심분리 농축기(비바스핀 필터, 30 kDa 컷오프, PES)에 의해 제거하였다.
생성된 항체 용액의 pH를 트리스(물에서 1 M, pH 8)를 사용하여 ~7.4로 증가시킨 후, 데하이드로아스코르브산(물에서 10 mM, 20 당량)을 첨가하고 생성된 혼합물을 RT에서 1-2시간 동안 배양하였다. RT 또는 37℃에서, DMA를 첨가한 다음, 링커-약물의 용액(DMA에서 10 mM)을 첨가하였다. DMA의 최종 농도는 5-10%였다. 생성된 혼합물을 1-16시간 동안 빛의 부재하에 RT 또는 37℃에서 배양하였다. 과량의 링커-약물을 제거하기 위해, 활성탄을 첨가하고, 혼합물을 RT에서 1시간 동안 배양하였다. 0.2 μm PES 필터를 사용하여 활성탄을 제거하고, 생성된 ADC를 비바스핀 원심분리 농축기(30 kDa 컷오프, PES)를 사용하여 4.2 mM 히스티딘, 50 mM 트레할로스, pH 6에서 제제화하였다. 마지막으로, ADC 용액을 0.22　μm PES 필터를 사용하여 멸균 여과하였다.
2) 프로토콜 B
시스테인 조작된 항체의 용액(500 μl, 15 mM 히스티딘, 50　mM 수크로스, 0.01% 폴리소르베이트-20, pH 6에서 40 mg/ml)을 100 mM 히스티딘, pH 5(1300　μl)로 희석시켰다. 2-(디페닐포스피노)벤젠설폰산(DPPBS)(426 μl, 물에서 10 mM, 32 당량)을 첨가하고, 생성된 혼합물을 RT에서 16-24 시간 동안 배양하였다. 과량의 DPPBS를 4.2 mM 히스티딘, 50 mM 트레할로스, pH 6을 사용하여 원심분리 농축기(비바스핀 필터, 30 kDa 컷오프, PES)에 의해 제거하였다.
생성된 항체 용액의 pH를 트리스(물에서 1 M, pH 8)를 사용하여 ~7.4로 증가시켰다. RT 또는 37℃에서, DMA를 첨가한 다음, 링커-약물의 용액(DMA에서 10 mM)을 첨가하였다. DMA의 최종 농도는 5-10%였다. 생성된 혼합물을 1-16시간 동안 빛의 부재하에 RT 또는 37℃에서 배양하였다. 과량의 링커-약물을 제거하기 위해, 활성탄을 첨가하고, 혼합물을 RT에서 1시간 동안 배양하였다. 0.2 μm PES 필터를 사용하여 활성탄을 제거하고, 생성된 ADC를 비바스핀 원심분리 농축기(30 kDa 컷오프, PES)를 사용하여 4.2 mM 히스티딘, 50 mM 트레할로스, pH 6에서 제제화하였다. 마지막으로, ADC 용액을 0.22 μm PES 필터를 사용하여 멸균 여과하였다.
상기 일반적인 접합 절차를 사용하여, 본 발명의 링커-약물 및 vc-seco-DUBA(SYD980, 링커-약물 화합물 1) 링커-약물에 기반한 시스테인 조작된 및 야생형 ADC를 합성하고, 분석적 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC), 크기 배제 크로마토그래피(SEC), 및 차폐 소수성 상 크로마토그래피(SHPC)를 사용하여 특성을 규명하였다.
분석적 HIC에 의해 명확해진 바와 같이, 상이한 ADC의 DAR2 종에 대해 체류 시간(RT)의 차이가 있었다(표 1A 및 1B). 가장 흥미롭게도, 약물을 비선형 엑소-링커를 통해 항체에 접합시키는 것은 공지된 선형 링커를 통해 접합된 약물과 비교하여 체류 시간의 (극적인) 감소를 야기하였다. 약물이 항체에 더 가깝게 위치한, 즉, 약물과 항체 사이의 링커 내의 원자의 수가 더 낮은(링커-약물 화합물 3에 대해 7부터 링커-약물 화합물 6에 대해 16으로 증가하는 원자의 수) 비선형 엑소-링커를 포함하는 ADC에서 이러한 감소가 더 두드려졌다.
WO2015/177360에 나타낸 바와 같이, 항체의 Fab 공동 또는 Fc 공동 내부의 특정 부위에서 링커-약물을 접합시키는 것은 부분적으로 감소된 내인성 디설파이드를 통해 접합된 ADC와 비교하여 체류 시간을 감소시킨다. 이러한 특정 부위에서의 본 발명의 링커-약물의 접합은 체류 시간을 더 감소시키며, 즉, 접합된 항체와 비접합된 항체 사이의 소수성의 차이를 더 줄인다.
이러한 효과를 더 정량화하기 위해, 용어 상대적 소수성이 도입되며, 이는 다음과 같이 정의된다:
(RTDAR2 - RTDAR0) / (RTDAR2 , 참조- ADC - RTDAR0 , 참조- ADC).
본질적으로, 상대적 소수성은 HIC 데이터에 기초하여 링커가 선형 링커인 링커-약물을 포함하는 ADC와 비선형 엑소-링커를 갖는 링커-약물을 포함하는 ADC의 소수성을 손쉽게 비교하는 측정값이다. 데이터가 표 1A 및 1B에 요약되어 있다.
표 1A. 이전에 지정된 분석적 HIC 컬럼에서 다양한 야생형(wt) 항체 및 다양한 링커-약물 화합물(LD)을 포함하는 ADC의 상대적 소수성
1 무작위 - 비부위 특이적 - 접합
2 선형 링커를 갖는 링커-약물
3 HMW는 형성된 응집체의 양을 반영하는 고분자량 종이다
4 (RTDAR2 - RTDAR0) / (RTDAR2 , 참조- ADC - RTDAR0 , 참조- ADC)로서 정의되고, RT는 체류 시간이며; 링커-약물 화합물 1에 연결된 각각의 항체는 참조 ADC이다
도 2는 표 1A의 데이터를 그래프로 나타낸다. ADC의 (상대적) 소수성은 링커의 길이가 증가함에 따라 증가하며, 즉, 항체의 S-원자와 약물의 O-원자 사이의 원자의 수가 작을수록 (상대적) 소수성은 더 낮다. 링커-약물 화합물 3을 갖는 ADC는 가장 낮은 상대적 소수성을 나타낸다. 링커-약물 화합물 7을 갖는 ADC가 링커-약물 화합물 1을 갖는 비교군 ADC보다 더 낮은 상대적 소수성을 가짐에도 불구하고, 유사한 링커를 갖지만 PEG기가 결여된 링커-약물 화합물 4를 포함하는 ADC와 비교하여, 링커-약물 화합물 7 내의 절단 부위에 부착된 극성 PEG기는 ADC의 상대적 소수성을 더 감소시키지 않는다.
표 1B.
이전에 지정된 분석적 HIC 컬럼에서 항-PSMA 야생형(wt) 또는 시스테인 조작된 항체 및 다양한 링커-약물 화합물(LD)을 포함하는 ADC의 상대적 소수성
1 무작위 - 비부위 특이적 - 접합
2 선형 링커를 갖는 링커-약물
3 HMW는 형성된 응집체의 양을 반영하는 고 분자량 종이다
4 (RTDAR2 - RTDAR0) / (RTDAR2 , 참조- ADC - RTDAR0 , 참조- ADC)로서 정의되고, RT는 체류 시간이며; 링커-약물 화합물 1에 연결된 PSMA는 참조 ADC이다
5 외부를 가리키는 시스테인 잔기에 접합된 링커-약물을 갖는 비교군 ADC
도 3a-3c 및 4는 표 1B의 데이터를 그래프로 보여준다.
도 3a에서, 수평축 상의 링커-약물은 링커-약물 소수성이 감소하는 순서로 정렬되어 있다. 비교군 ADC는 선형 링커-약물 화합물 1에 접합된 동일한 야생형 또는 시스테인 조작된 항체를 갖는 ADC이다. 본 발명의 링커-약물을 갖는 ADC의 (상대적) 소수성은 비교군 ADC에 비해 감소된다. 이러한 소수성의 감소는 링커-약물이 Fab 공동에 위치한 시스테인에서 접합된 ADC에서 더 두드러진다.
도 3b에서, 본 발명의 링커-약물 및 참조 링커-약물 1을 포함하는 야생형 접합된 PSMA ADC의 소수성을 참조 값으로 취한다. 이 그래프는 하나의 항체에서 다양한 링커-약물 간의 차이를 보다 명확하게 시각화한다. 특히 링커-약물이 Fab 공동에 위치한 시스테인에서 접합된 ADC의 경우, 선형 참조 링커-약물 화합물 1과 비교하여 본 발명의 링커-약물과의 상대적 소수성에서 비교적 큰 차이가 있다.
도 3c는 참조 ADC PSMA-LD1에 대한 다양한 접합체의 상대적 소수성의 차이를 나타낸다. Fab 공동에 위치한 시스테인에 본 발명의 동일한 링커-약물을 포함하는 다양한 항체 간의 차이는 작지만, 선형 참조 링커-약물 화합물 1을 포함하는 동일한 항체에 대해 유의한 감소가 관찰된다. 따라서, Fab 공동의 잠재적인 차폐 효과는 본 발명의 비선형 링커 및 링커-약물와 조합하여 최적으로 사용된다.
도 4는 참조 네이키드(naked) 항체 PSMA-HC41에 대한 다양한 접합체의 상대적 소수성의 차이를 나타내는 HIC 크로마토그램이다. 본 발명의 링커-약물을 갖는 ADC의 (상대적) 소수성은 네이키드 항체에 비해 증가한다. 그러나, 이 증가는 항체와 약물 간의 거리가 더 작을 때, 즉, 항체의 S-원자 및 약물의 O-원자 사이의 원자의 수가 더 작을 때, 더 작다.
세포 결합
3개의 항-PSMA ADC PSMA-LD1, PSMA-HC41-LD1 및 비교군 PSMA-HC120-LD1은 야생형 항체와 유사한 PSMA 발현 LNCaP-C4.2 세포 상에서 동일한 결합 친화성을 가지고 있었으며(0.1-0.2 μg/ml 범위의 EC50), 3개의 모든 ADC는 PSMA-음성 DU-145 세포에 결합할 수 없었다(EC50 >10 μg/ml).
2개의 항-5T4 ADC H8-LD1 및 H8-HC40-LD1은 H8 항체와 유사한 5T4 발현 MDA-MB-468 세포 상에서 동일한 결합 친화성을 가지고 있었으며(0.1-1.2 μg/ml 범위의 EC50), ADC 모두는 5T4-음성 SK-MEL-30 세포에 결합할 수 없었다(EC50 >10 μg/ml).
따라서, ADC의 결합은 부착된 듀오카르마이신 유도체 링커-약물에 의해 영향을 받지 않았다.
시험관내 세포독성
야생형 또는 부위 특이적으로 접합된 본 발명의 비선형 링커-약물을 포함하는 항-PSMA ADC의 PSMA 발현 LNCaP-C4.2 세포 상에서의 효능(약물 당량을 기준으로, 0.2-2.1 nM 범위의 IC50, 하기 표 2A 참고)은 선형 참조 링커-약물 화합물 1을 포함하는 각각의 비교군 항-PSMA ADC의 효능과 유사하였다.
모든 ADC는 PSMA-음성 DU-145 세포에 비활성이었고(IC50 >70 nM), 이는 PSMA를 통한 종양 세포의 선택적 사멸을 나타낸다.
4개의 야생형 및 부위 특이적 비결합 대조군 ADC는 본 발명의 비선형 링커-약물을 포함하는 각각의 항-PSMA ADC보다 적어도 15배 덜 강력하였다.
표 2A. PSMA를 발현하는 인간 종양 세포에서 항-PSMA ADC의 시험관내 세포독성
1 무작위 - 비부위 특이적 - 접합
2 선형 링커를 갖는 링커-약물
3 95% CI는 95% 신뢰 구간이다
4 백분율 효능은 시험된 가장 높은 농도(~100 nM)에서 주어지며, 각각의 약물 또는 ADC에 대한 측정된 발광을 처리되지 않은 세포(성장 배지 단독)의 평균으로 나누고 100을 곱하여 계산되었다.
5 외부를 가리키는 시스테인 잔기에 접합된 링커-약물을 갖는 비교군 ADC
6 n.a.는 해당없음이다
7 상대적 IC50 값은 GraphPad Prism에서 곡선 피팅을 위한 가변 기울기를 갖는 비선형 회귀 S자 용량-반응 방정식을 사용할 때, 곡선의 하부 및 상부 사이의 중간에서 반응을 제공하는 농도로서 계산되었다.
본 발명의 링커-약물을 포함하는 야생형 항-HER2 ADC의 효능은 HER2 발현 SK-BR-3 세포에서 ADC 트라스투주맙-LD1과 유사하였다(0.1 내지 0.3 nM의 IC50, 표 2B). 항-HER2 ADC는 HER2-음성 SW620 세포에서 비활성이었다(IC50 >100 nM).
3개의 비결합 대조군 ADC는 항-HER2 ADC보다 적어도 200배 덜 강력하였다.
표 2B. HER2를 발현하는 인간 종양 세포에서 항-HER2 ADC의 시험관내 세포독성
1 무작위 - 비부위 특이적 - 접합
2 선형 링커를 갖는 링커-약물
3 95% CI는 95% 신뢰 구간이다
4 백분율 효능은 시험된 가장 높은 농도(~100 nM)에서 주어지며, 각각의 약물 또는 ADC에 대한 측정된 발광을 처리되지 않은 세포(성장 배지 단독)의 평균으로 나누고 100을 곱하여 계산되었다.
5 n.a.는 해당없음이다
6 상대적 IC50 값은 GraphPad Prism에서 곡선 피팅을 위한 가변 기울기를 갖는 비선형 회귀 S자 용량-반응 방정식을 사용할 때, 곡선의 하부 및 상부 사이의 중간에서 반응을 제공하는 농도로서 계산되었다.
함께, 이들 데이터는 본 발명의 링커-약물 화합물을 포함하는 ADC가 우수한 종양 세포 사멸 효능을 갖는다는 것을 보여준다. 더욱이, Fab 부분의 가변 영역에서의 상기 링커-약물의 부위 특이적 결합은 절단 후 동일한 듀오카르마이신 약물 단위를 방출하는 선형 비교군 링커-약물 화합물 1의 부위 특이적 결합에 비해 시험관내 세포독성에 영향을 미치지 않는다.
종양 이종 이식 동물 모델
4개의 항-PSMA ADC의 생체내 효능을 LNCaP-C4.2 전립선암 이종 이식 모델에서 평가하였다. LNCaP-C4.2 세포주는 모(parental) 안드로겐 의존적 LNCaP-FGC 이종 이식 세포주의 거세 유도 퇴행 및 재발 후에 마우스에서의 연속적으로 증식된 이종 이식으로부터 유래된 인간 전립선 암종 상피 세포주이다.
마트리겔(50:50, v:v)을 함유하는 200　μL의 RPMI 1640 중의 1x107의 LNCaP-C4.2 세포를 수컷 CB17-SCID 마우스의 우측 옆구리에 주사하여 종양을 피하 유도하였다. γ-공급원(1.44 Gy, 60Co, BioMep, Bretenieres, France)으로 전신 방사선 조사 후 24 내지 72시간에 LNCaP-C4.2 종양 세포 이식을 수행하였다. 종양이 100-200 mm3의 평균 부피에 도달하였을 때 치료를 시작하였다. 마우스를 이들의 개별 종양 부피에 따라 그룹으로 무작위로 배정하고 꼬리 정맥에 2 mg/kg(도 5a) 또는 5 mg/kg(도 5b) 항-PSMA ADC, 또는 비히클의 단일 정맥내 주사를 투여하였다. 종양 부피의 변화를 모니터링하였다. 4개의 모든 ADC는 대략 1.6-1.8의 평균 DAR을 갖는다.
모든 그룹에서 악액질(cachexia)이 관찰되었고; 4개의 ADC 사이에서 체중에 대한 효과에서 유의한 차이가 관찰되지 않았다.
도 5a 및 5b는 PSMA-H41C-LD4, -LD7, 및 -LD8 ADC가 PSMA-H41C-LD1 ADC보다 더 우수한 생체내 효능을 갖는다는 것을 명확히 입증한다.
함께, 이들 데이터는 본 발명의 비선형 링커-약물(감소된 소수성을 갖는 ADC를 초래함)에 결합된 항체가 이들의 항종양 활성에 대해 유리한 생체내 특성을 갖는다는 것을 보여준다.

Claims (16)

  1. 하기 화학식의 링커-약물 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 수화물 또는 용매화물:

    .
  2. 항체-약물 접합체로서, 제1항에 따른 화합물이 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 시스테인 잔기를 통해 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 접합되어 있는 것인 항체-약물 접합체.
  3. 제2항에 있어서, 화합물은 하기로부터 선택된 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 하나 이상의 위치에서, 조작된 시스테인을 통해 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 부위 특이적으로 접합되어 있는 것인 항체-약물 접합체:
    중쇄 40, 41 및 89(카밧 넘버링에 따름);
    중쇄 152, 153, 155, 171, 247, 297, 339, 375 및 376(Eu 넘버링에 따름); 및
    경쇄 40, 41, 165 및 168(카밧 넘버링에 따름).
  4. 제3항에 있어서, 화합물은 하기로부터 선택된 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 하나 이상의 위치에서, 조작된 시스테인을 통해 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 부위 특이적으로 접합되어 있는 것인 항체-약물 접합체:
    중쇄 40, 41 및 89(카밧 넘버링에 따름); 및
    경쇄 40 및 41(카밧 넘버링에 따름).
  5. 제2항에 있어서, 하기 화학식(III)을 갖는 항체-약물 접합체:

    식 중에서,
    항체는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고;
    n은 0, 1, 2 또는 3이며;
    y는 1 내지 6의 평균 DAR을 나타내고;
    R은 인 것인 항체-약물 접합체.
  6. 제2항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 아넥신 A1, CA242, CD19, CD22, CD30, CD33, CD37, CD38, CD44, CD47, CD56, CD70, CD74, CD79, CD115, CD123, CD138, CD203c, CD303, CD333, CEACAM, CLL-1, c-MET, Cripto, DLL3, EGFR, EPCAM, EphA2, EphB3, ETBR, FAP, FcRL5, FGFR3, FOLR1, GCC, GPNMB, HER2, HMW-MAA, 인테그린, 루이스 A 유사 탄수화물, 루이스 Y, LIV1, 메소텔린, MN, MUC1, MUC16, NaPi2b, Nectin-4, PSMA, SLC44A4, STEAP-1, 5T4 항원, Tag72, 조직 인자, TF-Ag, TROP2, 및 VLA로 이루어진 군으로부터 선택된 항원 표적에 결합하는 것인 항체-약물 접합체.
  7. 제2항에 따른 항체-약물 접합체 및 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는, 인간 고형 종양 및 혈액학적 악성종양의 치료에 사용하기 위한 약제학적 조성물.
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