KR102569540B1 - 세포 요법을 개선시키는 방법 - Google Patents

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Abstract

본원에서는 E-셀렉틴 및/또는 L-셀렉틴 리간드의 발현을 강화하도록 변형된 세포 집단의 투여를 포함하는 치료 방법이 제공되며, 여기서 상기 변형된 세포 집단은 이러한 발현을 강화하는 처리 후 적어도 70%의 세포 생존력을 갖는다.

Description

세포 요법을 개선시키는 방법
본 발명은 보건복지부(National Institutes of Health)에 의해 수여된 승인번호 PO1 HL107146(NHLBI Program of Excellence in Glycosciences), RO1 HL73714 및 RO1 HL60528 하에 정부 지원에 의해 이루어졌다. 정부는 본 발명에 있어 특정 권리를 갖는다.
본 발명은 세포 표면을 변형시키기 위한 조성물 및 방법, 및 염증성 병태, 조직 상해/손상 및 암의 세포-기반 치료에서의 이러한 변형된 세포의 개선된 효능 및 적용가능성에 관한 것이다.
세포-기반 치료법("입양 세포 치료"로서도 공지됨)의 성공은 관련 세포들을 의도된 생물학적 효과(들)를 달성하기에 충분한 양(들)으로 이러한 세포들이 요구되는 부위(들)로 도달하게 하는 것에 의존한다. 임상 적응증을 위한 세포 전달은 관련 조직(들)으로의 직접적 (국소) 주사, 혈관내 투여(예를 들면, 전신 또는 특정 혈관바탕(vascular bed)으로 카테터-기반 전달에 의해) 또는 환부로의 세포의 직접적 적용/배치(예를 들면, 피부 궤양, 화상 등의 경우)에 의해 달성될 수 있다. 모든 형태의 세포 투여에 있어, 투여된 세포가, 정확히는 의도된 효과, 예를 들면, 염증의 제어, 조직 복구, 거부의 제거, 암의 근절 등을 달성하는데 매우 중요한 조직 미세환경 내의 투여된 부위 내의 세포 정착(lodgement)을 촉진할 수 있는 막 분자를 지니는 것이 유리하다. 미세혈관계의 완전성 및 새로운 미세혈관 생성(즉, "혈관신생(angiogenesis)")이 조직 재생/복구에 결정적인 전제조건인 것으로 익히 공지되어 있기 때문에, 한가지 이러한 미세환경 부위는 손상된 조직 내의 미세혈관 내 및 주변에 존재하는 "혈관주위 영역"이다. 사실, 모든 조직 손상, 염증 및 암 부위에서, 이환된 조직(들)의 미세혈관 내의 내피 세포는 순환(혈액 유래) 세포의 표적 부위로의 모집에서 중요한 역할을 하는 부착 분자들의 특징적 세트를 제시한다. 이러한 내피 분자들은 종양 괴사 인자(TNF) 및 인터류킨 1(IL-1)과 같은 염증성 사이토킨에 의해 상향 조절되며, 인간에서는 분자 E-셀렉틴을 포함하고 마우스에서는 분자 E-셀렉틴 및 P-셀렉틴을 포함하며, 이들은 "셀렉틴"(하기에서 보다 상세히 설명할 것이다)으로서 공지된 부착 분자 계열(family)에 속하는 렉틴이다. 또한, 임의의 염증 부위(암을 포함) 또는 조직 상해/손상 부위로 모집된 백혈구는 "백혈구" 셀렉틴인 L-셀렉틴을 제시하며, 따라서 투여된 세포에서의 L-셀렉틴에 대한 리간드의 발현은 이환된 조직(들) 내의 백혈구 침윤 영역으로의 이러한 세포들의 정착을 촉진할 수 있다.
언뜻 보기에는, 직접 전달은, 특히 농축된 세포 덩어리(bolus)를 환부에 적용할 수 있었다는 점을 고려할 때 세포 투여에 가장 효과적인 접근법인 것으로 보일 수 있다. 그러나, 국소 주사가 실제로 의도된 치료 효과와는 반대되는 역효과를 낳을 수 있고, 게다가 국소 주사가 오직 특정 해부학적 위치들에 대해서만 실용적이라는 상황들이 있다: (1) 적절한 세포를 정수압 하에 배지 현탁액에 도입함으로써, 주사 절차는 전달된 세포에 해를 가할 수 있고, 게다가 조직 완전성을 약화시키고 초기의 조직 복구 및/또는 숙주 방어 과정을 방해함으로써, 염증성 병태를 악화시키거나 제자리(in situ)의 적절한 면역반응을 상쇄시킬 수 있다; (2) 주사 바늘/장치(및 현탁 용액)는 침습적 방법이기 때문에 표적 조직 손상을 유도할 수 있고/있거나 부수적 조직 손상을 조장할 수 있다; (3) 직접 주사는 명확한 해부학적 경계를 갖는 기관/조직(예: 심장)에 대해 가장 실행 가능성이 크며 광범위한 연결 조직 지지가 없는 조직(예: 폐)에 대해서는 비현실적이다; (4) 주사 절차는 기술적으로 부담이 크고, 노동-집약적이며, 특히 비교적 접근하기 어려운 및/또는 취약한 기관/조직(예: 중추신경계)에 대해 상당한 영상화 지지와 함께 정교한 전달 시스템의 사용을 필요로 한다; (5) 가장 중요한 점은, 많은 퇴행성 및 염증성 병태는 광범위하게 분포되어 있고 다초점성(multifocal)이고(예: 골다공증, 염증성 장질환, 다발성 경화증 등), 따라서 직접 주사는 실용적이지도 효과적이지도 않다는 점이다. 따라서, 국소 주사가 실현 가능한 임상적 병태/상황이 있다 해도, 혈관 투여 경로는 모든 일반적인 "전신" 장애 뿐만 아니라 국소 주사할 수 없는 문제적 접근 및/또는 해부구조를 갖는 임의의 조직(예를 들면, 당뇨병의 췌장, 만성 폐쇄성 폐질환의 폐)용으로 의무화되어 있다. 세포를 최소의 노력으로 반복 투여할 수 있는 능력은 전신 주입의 또 다른 중요한 실용적 이점이다. 따라서, 염증성 환경 내의 직접 주사된 세포들의 부착/정착 및 혈관내로 주사된 세포들의 이환된 부위(들)로의 생리학적 이동 둘 다를 지시하는 분자 이펙터(molecular effector)의 발현/활성을 최적화하는 방법의 창제는 모든 세포-기반 치료법들의 유망한 장래성을 달성하기 위한 비결이다.
혈액 유래 세포의 미리 결정된 위치로의 이동을 지시하는 능력("귀소(homing)")은 다양한 생리학적 및 병리학적 과정에 상당한 영향을 미친다. 순환 세포의 특정 해부학적 위치로의 모집은 혈류중 세포와 표적 조직(들)의 혈관 내피 간의 별개의 부착성 상호작용에 의해 개시된다. 이러한 접촉을 매개하는 분자는 "귀소 수용체"이며, 역사적으로 정의된 바와 같이, 이러한 구조들은 혈중 세포의 각 표적 조직으로의 지향성을 조정한다. 역사적으로, 3종의 "조직 특이적 귀소 수용체"가 설명되었다: 말초 림프절의 L-셀렉틴, 장 및 소화관 관련 림프계 조직의 α4β7 (LPAM-1), 및 특히 피부로의 세포 이동을 촉진하는 "피부 림프구 항원(CLA)"으로서 공지된 분자 P-셀렉틴 당단백질 리간드-1(PSGL-1)의 특화된 당형태(glycoform)(R. Sackstein, Curr Opin Hematol 12, 444 (2005)). 주목할만하게도, 이러한 조직들 외에, 순환 세포, 특히 조혈 줄기세포(HSC)가 효율적으로 골수로 향한다는 것이 수십년 동안 인식되어 있었고(T. Lapidot, A. Dar, O. Kollet, Blood 106, 1901 (2005)), 몇몇 연구는 HSC의 골수로의 모집을 매개하는데 있어서 셀릭틴, 주로 HSC E-셀렉틴 리간드에 결합하는 E-셀릭틴의 역할을 지적하였다.
생물물리학적 관점에서, 귀소 수용체는 분자 브레이크로서 작용하여, 혈류 중 세포가 지배적인 혈류 속도보다 낮은 속도로 혈관 내피로 처음 일시부착(tethering)하고 이어서 지속적인 회전(rolling) 접촉을 일으킨다(단계 1)(R. Sackstein, Curr Opin Hematol 12, 444 (2005)). 이후, 전형적으로 케모킨에 의해 강화되는 사건들의 캐스케이드(cascade)가 뒤따르고, 이로 인해 인테그린 부착 활성화(단계 2), 안정적인 부착(단계 3) 및 내피 이행(transmigration)(단계 4)이 발생한다(T. A. Springer, Cell 76, 301 (1994)). 이러한 "다단계 패러다임"은, 조직 특이적 이동이 소정의 순환 세포에서 귀소 수용체와 케모킨 수용체 발현과의 별개의 조합에 의해 조절되어, 관련 혈관 부착 리간드와 표적 내피에서 발현되는 케모킨에 의해 나타나는 적절한 "교통 시그널"을 기관-특이적 방식으로 인식할 수 있도록 한다고 주장한다. 귀소 수용체 참여 후, 세포의 골수로의 직접적 수송(trafficking)을 지시하는 몇가지 증거는 한가지 케모킨, 특히 SDF-1(CXCL12)이 세포의 이 부위로의 단계 2-매개 모집에서 중요한 역할을 한다는 것을 시사한다(T. Lapidot, A. Dar, O. Kollet, Blood 106, 1901 (2005); A. Peled et al., Science 283, 845 (1999); D. A. Sipkins et al., Nature 435, 969 (2005)). 그러나, SDF-1의 발현은 골수로 한정되지 않으며, 이러한 케모킨은 전형적으로 모든 조직 상해/염증 부위에서 발현된다(R. Sackstein, Immunol. Rev. 230: 140-163 (2009)).
단계 1의 회전 상호작용의 가장 효율적인 이펙터는 셀렉틴들(E-, P- 및 L-셀렉틴) 및 이들의 리간드들(R. Sackstein, Curr Opin Hematol 12, 444 (2005))이다. 그 이름에서 알 수 있듯이, 셀렉틴은, 원형적으로 테트라사카라이드 시알릴 루이스 X(Lewis X)(sLex; Neu5Acα2-3Galβ1-4[Fucα1-3]GlcNAcβ1-))로서 나타내지는 α(2,3)-결합된 시알산 치환기(들)와 α(1,3)-결합된 푸코스 변형(들)을 함유하는 시알로푸코실화로 이루어진 특화된 탄수화물 결정인자에 결합하는 렉틴이다(R. Sackstein, Curr Opin Hematol 12, 444 (2005); M. J. Polley et al., Proc Natl Acad Sci USA 88, 6224 (1991)). sLex 글리칸은 "HECA452"로서 공지된 mAb를 포함하는 다양한 모노클로날 항체들(mAb)에 의해 인식된다. E-셀렉틴 및 P-셀렉틴은 혈관 내피상에서 발현되고(P-셀렉틴도 혈소판에서 발현된다), L-셀렉틴은 순환 백혈구에서 발현된다(R. Sackstein, Curr Opin Hematol 12, 444 (2005)). E-셀렉틴 및 P-셀렉틴은 전형적으로 조직 손상 및 염증 부위에서만 현저하게 발현하는 유도성 내피 막 분자이고, 상기 부위에서 셀렉틴의 발현은 염증성 사이토킨에 반응하여 일어난다. 그러나, 골수 및 피부의 미세혈관계는 이들 셀렉틴을 항시(constitutively) 발현하고, 이들 셀렉틴은 혈액 유래 세포의 이들 부위로의 정상(定常) 상태 모집에서 중요한 역할을 한다(R Sackstein J Invest. Dermatology, 122:1061-1069 (2004)). 중요한 점은, 영장류(설치류는 제외)의 모든 염증 부위들 및 조직 상해/손상 부위들에서, E-셀렉틴은, 염증성 사이토킨 TNF 및 IL-1에 반응성인 프로모터 요소가 P-셀렉틴 유전자로부터 제거되었을 때, 세포 모집을 매개하는 주요 혈관 셀렉틴이라는 것이다. 따라서, 인간의 모든 염증성 부위들에서, 혈관 E-셀렉틴 발현은 P-셀렉틴의 발현보다 더 현저하다(R. Sackstein, Immunol. Rev. 230: 140-163 (2009)).
E-셀렉틴의 2가지 주요 리간드, PSGL-1의 고도로 시알로푸코실화된 CLA 당형태(Z. Laszik et al., Blood 88, 3010 (1996), R. Sackstein, Immunol. Rev. 230: 140-163 (2009)) 및 조혈 세포 E-/L-셀렉틴 리간드(HCELL)로서 공지된 특화된 시알로푸코실화된 CD44 당형태(C. J. Dimitroff, J. Y. Lee, S. Rafii, R. C. Fuhlbrigge, R. Sackstein, J Cell Biol 153, 1277 (2001); C. J. Dimitroff, J. Y. Lee, R. C. Fuhlbrigge, R. Sackstein, Proc Natl Acad Sci US A 97, 13841 (2000))가 인간 조혈 줄기/기원 세포(HSPC)에서 동정되었다. CD44는 다소 편재성 세포막 단백질이지만, HCELL 표현형은 주로 인간 HSPC에서 발견된다. HCELL의 제한된 분포와 대조적으로, CLA/PSGL-1은 골수에서 조혈 기원세포와 보다 성숙한 골수 및 림프계 세포에서 광범위하게 발현된다(Z. Laszik et al., Blood 88, 3010 (1996), R. Sackstein, Immunol. Rev. 230: 140-163 (2009)). HCELL은 조작상, 전단 조건하에 E-셀렉틴과 L-셀렉틴에 결합하는 CD44로서 정의되고, 시알릴 루이스 X(및 sLex 이외에, HECA452는 푸코스가 1형 락토사민 골격 내의 N-아세틸글루코사민에 α(1,4)-결합으로 부착되어 있는 "시알릴화된 루이스 a"(sLea)로서 공지된 sLex의 테트라사카라이드 이성체를 인식한다)를 인식하는 mAb HECA452 및 E-셀렉틴-Ig 키메라(E-Ig)와 반응성인 CD44 당형태로서 세포 용해물의 웨스턴 블롯 분석에 의해 동정된다. CLA 및 HCELL 이외에도, 인간 백혈구 및 HSPC는 또한 E-셀렉틴 리간드(Fuhlbrigge et al Blood 107:1421-1426 (2006), Merzaban et al Blood 118:1774-1783 (2011))로서 기능할 수 있는 "CD43-E"로서 공지된 CD43을 발현할 수 있으며, 마우스 백혈구에서, E-셀렉틴 리간드-1(ESL-1)로서 공지된 또 다른 E-셀렉틴 리간드가 설명된 바 있다(Merzaban et al Blood 118:1774-1783 (2011)). 모든 당단백질 셀렉틴 리간드(예: CD43-E, CLA, 및 HCELL)에서, E-셀렉틴(및 또한, L-셀렉틴 및 P-셀렉틴)에의 결합은 α(2,3)-시알산 및 α(1,3)-푸코스 변형에 결정적으로 의존한다(C. J. Dimitroff, J. Y. Lee, S. Rafii, R. C. Fuhlbrigge, R. Sackstein, J Cell Biol 153, 1277 (2001); C. J. Dimitroff, J. Y. Lee, R. C. Fuhlbrigge, R. Sackstein, Proc Natl Acad Sci US A 97, 13841 (2000); R. Sackstein, C. J. Dimitroff, Blood 96, 2765 (2000); C. J. Dimitroff, J. Y. Lee, K. S. Schor, B. M. Sandmaier, R. Sackstein, J Biol Chem 276, 47623 (2001)). 인간 HSPC에서, HCELL은 N-글리칸상의 적절한 시알로푸코실화된 셀렉틴 결합 결정인자를 제시한다(C. J. Dimitroff, J. Y. Lee, S. Rafii, R. C. Fuhlbrigge, R. Sackstein, J Cell Biol 153, 1277 (2001); R. Sackstein, C. J. Dimitroff, Blood 96, 2765 (2000)). 혈류역학적 전단 응력 하의 E- 및 L-셀렉틴 결합의 시험관내 검정은 HCELL이 임의의 인간 세포에서 발현되는 이러한 분자들의 가장 강력한 리간드임을 나타낸다(C. J. Dimitroff, J. Y. Lee, S. Rafii, R. C. Fuhlbrigge, R. Sackstein, J Cell Biol 153, 1277 (2001); C. J. Dimitroff, J. Y. Lee, K. S. Schor, B. M. Sandmaier, R. Sackstein, J Biol Chem 276, 47623 (2001)). 중요한 점은, E-셀렉틴이 골수 및 피부의 미세혈관 내피에서 항시 발현되지만, 상기 분자는, 염증이 직접적 조직 상해(예: 화상, 외상, 욕창 등), 허혈성/혈관 사건들(예: 심근경색, 뇌졸중, 쇼크, 출혈, 응고병증 등), 감염(예: 연조직염, 폐렴, 수막염, SIRS 등), 신생물(예: 유방암, 폐암, 림프종 등), 면역학적/자가면역 병태(예: 이식편대숙주병, 다발성 경화증, 당뇨병, 염증성 장질환, 홍반성 루프스, 류마티스 관절염, 건선 등), 퇴행성 질환(예: 골다공증, 골관절염, 알츠하이머병 등), 선천성/유전성 질환(예: 근위축증, 리소좀 축적병, 헌팅턴병 등), 유해 약물 효과(예: 약물 유발성 간염, 약물 유발성 심장 손상 등), 독성 손상(예: 방사선 노출(들), 화학적 노출(들), 알코올성 간염, 알코올성 췌장염, 알코올성 심근병증, 코카인 심근병증 등), 대사 교란(예: 요독성 심낭염, 대사산증 등), 의인성(醫因性) 병태(예: 방사선 유발성 조직 손상, 수술 관련 합병증 등) 및/또는 특발성 과정(예: 근위축성 측삭경화증, 파르소나지-터너 증후군(Parsonnage-Turner Syndrome) 등)에 의해 유발되는지 여부와 관계없이, 모든 염증 부위-급성 및 만성 유형 둘 다-의 내피 바탕(endothelial bed)에서 현저하게 발현된다는 점이다.
본 발명의 다양한 양상들 중에는 이환된 조직(들) 내의 혈관 내피 세포 및/또는 백혈구 침윤물에서의 E-셀렉틴 발현을 갖는 질환, 장애 또는 의학적 병태를 치료하는 방법의 제공이 있다. E-셀렉틴은 특정 백혈구 및 조혈 줄기/기원세포, 즉, 골수 세포(예: 호중구, 단핵구, 호산구, 대식세포 등), 수지상 세포(림프계 유래 및 골수 유래 둘 다), 림프구(예: 비접촉(naive) 및 메모리 T 세포, 비접촉 및 메모리 B 세포, 이펙터 T 세포, 조절 T 세포, 자연 살해 세포(NK 세포) 등), 조혈 기원세포 및 조혈 줄기세포의 표면에 본래 존재하는 시알화된, 푸코실화된 탄수화물(예: 시알화된 루이스 X 및 루이스 A 계열의 구성원들)에 결합한다. 따라서, 이들 세포 유형은 급성 및 만성 염증성 부위에서 발견되며 혈관 E-셀렉틴에 의해 이러한 염증성 부위로 모집된다. 백혈구 및 HSPC는 특징적으로 L-셀렉틴을 제시한다. L-셀렉틴 그 자체는 sLex와 같은 시알화된 푸코실화된 탄수화물에 결합한다. 따라서, 염증성 부위는 E-셀렉틴(내피 세포에서) 및 L-셀렉틴(침윤성 백혈구 및 HSPC에서)를 발현하는 세포를 갖는다.
세포-기반 치료법의 의도된 결과(들)를 달성하는 능력은 투여된 세포들을 이러한 세포들이 요구되는 부위로 전달하는 것 및 또한 특정 조직 미세환경 내의 투여된 세포들의 국소화에 의해 결정적으로 좌우된다. 따라서, 당업계에서는 투여된 세포들의 조직 상해/손상 부위, 염증 부위, 암 부위 및 감염 부위로의 혈관 전달을 증진시키는 방법이 요구된다. 또한, 당업계에서는 이환된 조직 내의 투여된 세포들의 정착/공동국소화를 증진시키는 것이 요구된다. 따라서, 간략하게 언급하면, 본 발명은 대상체에게 본래의 세포 집단의 수준을 초과하는 수준으로 E-셀렉틴 리간드 및/또는 L-셀렉틴 리간드를 발현하는 세포 집단을 투여함을 포함하는, 대상체에서 염증이 발생한 조직 및/또는 손상된 조직 및/또는 암으로서 나타나는 질환, 장애 또는 의학적 병태의 치료 방법에 관한 것이다. 투여는 표적 조직(예: 염증이 발생한 조직 및/또는 손상된 조직, 암성 조직) 내의 내피 세포상의 E-셀렉틴 발현과 일치하게 및/또는 표적 조직 내의 백혈구(예: 백혈구 침윤물) 축적과 일치하게 일어난다. 투여는 표적 조직 내 직접 주사에 의해 및/또는 혈관계를 통해 및/또는 하기에서 보다 상세히 설명되는 기타 수단을 통해 이루어질 수 있다.
본 발명은 추가로 E-셀렉틴 및/또는 L-셀렉틴 리간드를 발현하는 생존가능 세포들의 집단을 이용하여 염증을 치료하는 방법에 관한 것이다. 생존가능 세포 집단은 본래의 세포 집단의 발현 수준을 초과하는 수준으로 E-셀렉틴 리간드 및/또는 L-셀렉틴 리간드를 발현한다. 투여는 표적 조직(예: 염증이 발생한 조직 및/또는 손상된 조직, 암성 조직) 내의 내피 세포상의 E-셀렉틴 발현과 일치하게 및/또는 표적 조직 내의 백혈구(예: 백혈구 침윤물) 축적과 일치하게 일어난다. 투여는 표적 조직으로 직접 투여에 의해 및/또는 혈관계를 통해(및/또는 하기에서 보다 상세히 설명하는 기타 수단을 통해) 이루어질 수 있고, 질환, 장애 또는 의학적 병태의 치료는 투여된 세포의 장기간 생착을 동반할 필요가 없다(즉, 치료는 일시적 콜로니화 또는 치료 부위에서의 투여된 세포의 장기 존속/장수 또는 치료 부위에서의 투여된 세포의 증식 또는 치료 부위에서의 투여된 세포의 분화 및/또는 성숙 어느 것으로라도 달성될 수 있다).
본 발명은 추가로 대상체에서 염증을 치료하기 위한 의약의 제조에서 사용하기 위한 E-셀렉틴 및/또는 L-셀렉틴 리간드를 발현하는 생존가능 세포 집단에 관한 것이다. 생존가능 세포 집단은 본래의 세포 집단의 발현 수준을 초과하는 수준으로 E-셀렉틴 리간드 및/또는 L-셀렉틴 리간드를 발현한다. 투여는 표적 조직(예: 염증이 발생한 조직 및/또는 손상된 조직, 암성 조직) 내의 내피 세포상의 E-셀렉틴의 발현과 일치하게 및/또는 표적 조직 내 백혈구(예: 백혈구 침윤물)의 축적과 일치하게 일어난다. 투여는 표적 조직으로 직접 투여 의해 및/또는 혈관계를 통해 및/또는 하기에서 보다 상세히 설명하는 바와 같은 기타 수단을 통해 이루어질 수 있다.
본 발명은 추가로 종양/악성 질환의 치료를 위한 의약의 제조에서 사용하기 위한 E-셀렉틴 및/또는 L-셀렉틴 리간드를 발현하는 생존가능 세포 집단에 관한 것이며, 여기서 상기 치료는 대상체에게 E-셀렉틴 및/또는 L-셀렉틴 리간드를 발현하는 생존가능 세포 집단을 투여하는 것을 포함하고, 상기 집단은 본래의 세포 집단의 발현 수준을 초과하는 수준으로 E-셀렉틴 리간드 및/또는 L-셀렉틴 리간드를 발현하고, 상기 치료는 종양/악성종양 조직 내의 내피 세포상의 E-셀렉틴 발현과 일치하게 및/또는 종양/악성종양 조직 내의 백혈구 축적과 일치하게 상기 집단을 투여하는 것을 포함한다.
본 발명은 추가로 염증을 나타내는 질환 상태의 치료를 위한 의약의 제조에서 사용하기 위한 E-셀렉틴 및/또는 L-셀렉틴 리간드를 발현하는 생존가능 세포 집단에 관한 것이며, 여기서 상기 치료는 대상체에게 E-셀렉틴 및/또는 L-셀렉틴 리간드를 발현하는 세포 집단을 투여하는 것을 포함하고, 상기 세포 집단은 본래의 세포 집단의 발현 수준을 초과하는 수준으로 E-셀렉틴 리간드 및/또는 L-셀렉틴 리간드를 발현하고, 상기 치료는 종양/악성종양 조직 내의 내피 세포상의 E-셀렉틴의 발현 개시와 일치하게 및/또는 종양/악성종양 조직 내의 백혈구 축적과 일치하게 상기 집단을 투여하는 것을 포함한다.
본원에서 설명된 투여(예: 혈관계 및/또는 조직으로 직접 주사 및/또는 기타 수단을 통한 투여)를 수반한 기타 방법들은, 예를 들면, 대상체에서 염증이 발생한 조직 및/또는 손상된 조직 또는 암 부위(총칭하여, "표적" 조직)에서의 세포 전달 및 콜로니화를 증진시키는 방법, 대상체의 표적 조직으로의 세포 전달을 증진시키고/시키거나 대상체의 표적 조직 내의 조직 콜로니화를 증진시키는 방법, 대상체의 표적 조직으로의 세포 전달을 증진시키는 방법, 대상체의 표적 조직으로의 세포 전달 및 콜로니화를 증진시키는 방법, 대상체에서 표적 조직 내의 세포 집단의 귀소 및 생착을 증진시키는 방법, 대상체의 염증성 병태를 치료하는 방법, 대상체에서 조직 복구/재생을 증진시키는 방법 및 대상체에서 종양/악성 질환을 치료하는 방법을 포함한다.
일반적으로, 직접적 조직 상해(예: 화상, 외상, 욕창 등), 허혈성/혈관 사건들(예: 심근경색, 뇌졸중, 쇼크, 출혈, 응고병증 등), 감염(예: 연조직염, 폐렴, 수막염, SIRS 등), 신생물(예: 유방암, 폐암, 림프종 등), 면역학적/자가면역 병태(예: 이식편대숙주병, 다발성 경화증, 당뇨병, 염증성 장질환, 홍반성 루프스, 류마티스 관절염, 건선 등), 퇴행성 질환(예: 골다공증, 골관절염, 알츠하이머병 등), 선천성/유전성 질환(예: 수포성 표피박리증, 불완전 골형성증, 근위축증, 리소좀 축적병, 헌팅턴병 등), 유해 약물 효과(예: 약물 유발성 간염, 약물 유발성 심장 손상 등), 독성 손상(예: 방사선 노출(들), 화학적 노출(들), 알코올성 간염, 알코올성 췌장염, 알코올성 심근병증, 코카인 심근병증 등), 대사 교란(예: 요독성 심낭염, 대사산증 등), 의인성 병태(예: 방사선 유발성 조직 손상, 수술 관련 합병증 등) 및/또는 특발성 과정(예: 근위축성 측삭경화증, 파르소나지-터너 증후군 등)에 의해 개시된 것들을 포함하나 이들로 제한되지 않는 다양한 염증성 병태(예: 급성 및/또는 만성) 및/또는 손상된 조직 중 어느 것이라도 본원에 설명된 방법들에 따라서 치료될 수 있다.
특정 실시형태에서, 예를 들면, 세포 집단에 의해 발현되는 E-셀렉틴 리간드 및/또는 L-셀렉틴 리간드는 조혈 세포 E-/L-셀렉틴 리간드(HCELL), 신경세포 부착 분자 E-셀렉틴 리간드(NCAM-E), CD43E 및 CLA 중 하나 이상으로부터 선택된다. 한 실시형태에서, E-셀렉틴 리간드는 조혈 세포 E-/L-셀렉틴 리간드(HCELL) 및/또는 신경세포 부착 분자 E-셀렉틴 리간드(NCAM-E)이다. 다른 실시형태에서, E-셀렉틴 리간드는 HCELL이다. 다른 실시형태에서, E-셀렉틴 리간드는 NCAM-E이다. 다른 실시형태에서, L-셀렉틴 리간드는 HCELL이다. 주목할만하게도, E-셀렉틴이 이환된 조직의 내피 바탕 내에서 발현되고 백혈구가 특징적으로 L-셀렉틴을 발현하기 때문에, 강력한 E-셀렉틴 및 L-셀렉틴 리간드인 HCELL는 가장 강한 면역반응성/조직 손상의 미세환경 내에서 조직 정착을 명백히 촉진하는 작용을 할 수 있다.
본원의 다른 곳에서 보다 상세히 논의되는 바와 같이, 대상체에게 투여하기 위한 세포 집단을 제조하기 위해 다양한 방법들이 사용될 수 있다. 한 실시형태에서, 상기 집단은 세포 또는 세포 집단을 적절한 공여 뉴클레오타이드 당과 함께 글리코실트랜스퍼라제와 접촉시킴으로써 제조된다. 예를 들면, 푸코스 잔기(푸코실화), 시알산 잔기(시알릴화) 또는 이들 둘 다(시알로푸코실화)의 글리코실트랜스퍼라제-강화된 발현에 의해 조혈 세포 E-셀렉틴 리간드(HCELL)의 발현을 강화하기 위해 CD44를 시알로푸코실화시키는 데 글리칸 조작을 사용할 수 있다. 대안으로, 푸코실트랜스퍼라제와 같은 글리코실트랜스퍼라제를 사용하여 시알릴-루이스X 또는 시알릴-루이스a와 같은 온전한 글리칸 구조체를 세포 표면으로 전달할 수 있다. 또한, 비-효소적 방법을 사용하여 E-셀렉틴 및/또는 L-셀렉틴 리간드를 세포 표면에 공유 또는 비공유 결합시킬 수 있다. 예를 들면, 압타머, sLex(시알릴-루이스X), sLex 글리칸의 글리코미메틱(glycomimetic) 및/또는 펩티도미메틱(peptidomimetic), sLea(시알릴-루이스a), sLea 글리칸의 글리코미메틱 및/또는 펩티도미메틱, 및 E-셀렉틴 및/또는 L-셀렉틴에 결합하는 기타 모이어티를 바이오틴-스트렙타비딘 쌍을 이용하여 세포 표면에 비공유 결합시킬 수 있거나, 세포 표면에 공유 결합시킬 수 있으며, 이때 공유 또는 비공유 결합인지에 상관없이 결합은 직접적일 수 있거나 또는 링커를 통한 것일 수 있다. 추가 예로서, E-셀렉틴 및/또는 L-셀렉틴에 대한 처리된 세포의 부착을 매개하는 각 경우에, E-셀렉틴 및/또는 L-셀렉틴에 결합하는 파아지 디스플레이 입자 또는 항체를 세포 표면에 공유 또는 비공유 결합시킬 수 있다.
일반적으로 및 세포 집단의 제조 방식과는 관계없이, 제조 방식은 변형 시간으로부터 24시간째에 적어도 70%의 생존력을 갖는 변형된 세포 집단을 제공한다. 이러한 한 실시형태에서, 변형된 세포 집단은 변형 시간으로부터 24시간째에 적어도 80%의 생존력을 갖는다. 일부 실시형태에서, 변형된 세포 집단은 변형 시간으로부터 24시간째에 적어도 85%의 생존력을 갖는다. 일부 실시형태에서, 변형된 세포 집단은 변형 시간으로부터 24시간째에 적어도 90%의 생존력을 갖는다. 생존력은 트리판 블루 배제와 같은 당업계에 공지된 방법 및 요오드화프로피디움 및 아넥신 V 염색에 대한 이중 색상 유세포측정 평가에 의해 측정할 수 있다. 바람직하게는, 세포의 표현형(세포 표면 변형 이외의 다른 표현형)은 처리 후에 보존된다. 보존된 표현형에 의해, 세포가 이의 본래의 기능 및/또는 활성을 유지하도록 하고자 한다. 예를 들면, 세포가 줄기세포일 경우, 이는 이의 재생 능력, 예를 들면, 이의 전능(totipotency) 또는 이의 분화만능(pluripotency) 또는 이의 다분화능(multipotency) 또는 이의 단분화능(unipotency)을 유지한다.
변형된 세포 집단은 생존가능하고(즉, 전술한 변형 시간으로부터 24시간째에 적어도 70%의 생존력을 갖고) 본래의 세포 집단에 비해 증진된 E-셀렉틴 및/또는 L-셀렉틴에 대한 결합을 갖는다. 세포의 투여는 혈관계를 통해 및/또는 조직으로의 직접 주사에 의해(및/또는 하기에서 상세히 설명하는 기타 수단에 의해) 이루어질 수 있다. 한 실시형태에서, 변형된 세포 집단은 염증 또는 조직으로의 백혈구 침윤의 개시와 일치하는 시간에 투여된다. 다른 실시형태에서, 변형된 세포 집단은 염증 또는 조직으로의 백혈구 침윤의 개시 직전에 투여된다.
세포가 sLex 발현을 강화하기 위해 글리칸 조작되거나 sLex 구조로 수식(decoration)(예를 들면, 아비딘-스트렙타비딘 기술을 통해)되는 경우, 처리된 세포에서의 증가된 sLex 발현의 측정은 mAb HECA452 또는 sLex 결정인자를 인식하는 임의의 기타 mAb로 형광 염색하고 이어서 유세포측정에 의해 세포 형광 강도를 검출함으로써 수행할 수 있다. 변형된 세포 집단의 미리 결정된 형광성 역치는 먼저 본래의(미처리된) 세포의 샘플을 분석하여 측정한다. 처리된 세포의 sLex 증가는 본래의 세포 집단과 비교해 10% 초과의 마커-양성 세포(예: HECA452-반응성 세포)의 증가 퍼센트 및/또는 기저선(미처리된) 세포 집단의 평균 채널 형광 강도를 넘는 평균 채널 형광 강도의 10% 증가로서 정의된다. 처리된 세포 집단에서 E-셀렉틴에 대한 결합이 증가되었는지 여부를 검출하기 위해, 본원에 설명한 바와 같은 전단응력 조건 하에 병렬 플레이트 유동 챔버(parallel plate flow chamber) 연구를 사용하거나 E-셀렉틴-Ig 키메라로의 염색 및 유세분석에 의한 형광 강도 평가를 통해 E-셀렉틴에 대한 결합을 평가할 수 있다. 세포의 대조(기저선) 샘플은 본원의 다른 곳에서 설명된 기능적 E-셀렉틴 결합 검정을 사용하거나 당업계에 공지된 다른 일반적으로 채택된 E-셀렉틴 형광 결합 검정에 의해 검정한다. E-셀렉틴 결합 형광 수준은 대조(기저선) 집단 샘플에 대해 측정된다. 증진된 E-셀렉틴에 대한 결합은 E-셀렉틴-특이적 결합 검정에서 E-셀렉틴에 대한 부착이 증가된 처리된 세포로서 정의된다. 한 실시형태에서, 증진된 E-셀렉틴에 대한 결합은 형광색소-접합된 시약을 이용한 E-셀렉틴 결합 검정에서의 형광 이동, 예를 들면, 유세포측정에 의해 평가되는 E-셀렉틴-Ig 키메라에 대한 결합에 의해 정의될 수 있으며, 여기서 E-셀렉틴 결합을 보유한 집단 내의 세포의 수는 기저선 결합보다 적어도 10% 더 증가(즉, 마커-양성 집단에서 10% 증가)하고/하거나 평균 채널 형광이 미리 결정된 형광 역치(본래의 세포 집단과 연관됨)보다 적어도 10% 크다. 다른 실시형태에서, 증가된 E-셀렉틴 반응성을 보유한 세포의 비율이 25% 증가하고/하거나, 변형된 집단은 미리 결정된 형광 역치를 25% 초과한다. 다른 실시형태에서, 변형된 집단은 기저선 반응성 및/또는 미리 결정된 형광 역치를 50% 초과한다. 다른 실시형태에서, 증가된 E-셀렉틴 반응성을 보유한 세포의 비율은 E-셀렉틴-결합 세포 기저선 집단의 비율보다 75% 증가하고/하거나 변형된 집단은 미리 결정된 형광 역치를 75% 초과한다. 다른 실시형태에서, 변형된 집단의 세포들의 적어도 90%는 기저선 E-셀렉틴-결합 집단 및/또는 미리 결정된 형광 역치를 초과한다. 또 다른 실시형태에서, 변형된 집단의 세포들의 적어도 95%는 기저선 E-셀렉틴-결합 집단 및/또는 미리 결정된 형광 역치를 초과한다.
증진된 L-셀렉틴에 대한 결합은 동적 전단응력 조건 하의 병렬 플레이트 유동 챔버 또는 스탬퍼-우드러프(Stamper-Woodruff) 검정과 같은 높은 특이성을 갖는 기능적 L-셀렉틴 결합 검정을 사용하여 L-셀렉틴에 대한 결합의 증가로 측정할 수 있으며, 여기서 세포 처리는 L-셀렉틴-매개 부착을 지지하는 세포의 비율을 증가시킨다. 병렬 플레이트 검정의 경우, 처리된 세포 집단은 기저선(미처리된 세포)의 것과 비교해 L-셀렉틴(챔버 플라스틱 또는 유리 지지 표면상에 고정되어 디스플레이됨)에 대한 일시부착/회전 부착 상호작용의 적어도 10% 증가를 나타낸다. 스탬퍼-우드러프 검정의 경우, 증가된 L-셀렉틴 림프구 부착은 80 rpm의 회전 전단 하에 L-셀렉틴+ 림프구에 대한 처리된 세포 결합의 적어도 10% 증가로 정의되며; 기저선 세포 결합은 미처리된 세포 집단(대조군 집단)에서 평가되고 처리된 세포 집단과 직접 비교된다.
달리 정의하지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 분야의 숙련가들이 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 설명된 것들과 유사하거나 동등한 방법 및 재료들이 본 발명의 실시 및 시험에서 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 재료들이 하기 설명된다. 본원에 언급된 모든 공보, 특허출원, 특허 및 기타 참조문헌은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 상충되는 경우, 정의를 포함하는 본 명세서가 우선할 것이다. 또한, 재료, 방법 및 실시예는 단지 예시적이며 제한하기 위함이 아니다.
다른 목적 및 특징은 하기에서 부분적으로 명백해지고 부분적으로 언급될 것이다.
도 1(A) 내지 1(D). 마우스 중간엽 줄기세포( MSC )에 의한 E- 셀렉틴 리간드 발현에 미치는 엑소푸코실화( FTVI 처리)의 효과. (A) C57BL/6 골수 유래의 MSC는 CD45 발현이 결여되어 있으며 특징적 마우스 MSC 마커 Sca-1, CD29, CD44, CD73 및 CD105를 발현한다. MSC는 본래 mAb HECA452 및 E-셀렉틴-Ig 키메라(mE-Ig)(이소타입 = 적색 및 항체 = 청색)와의 반응성이 결여되어 있다. (B) 푸코실트랜스퍼라제 VI (FTVI)-변형된 MSC(실선)는 mAb HECA452에 대해 양성 염색되었으며 mE-Ig와 반응성이었다. 브로멜라인 및 프로테이나제 K를 이용한 FTVI-변형된 MSC의 분해(회색 히스토그램)는 뮤린(murine) E-셀렉틴-Ig 키메라(mE-Ig) 반응성을 현저하게 감소시켰지만, HECA452 염색은 그렇지 않았고, 이는 브로멜라인-민감성 당단백질이 글리칸-변형된(즉, FTVI-처리된) MSC에서 주요 E-셀렉틴 리간드(들)로서 작용함을 시사한다. 파선은 염색 대조군들(HECA452 염색에 대한 이소타입 및 mE-Ig 염색을 위한 EDTA를 이용한 칼슘 킬레이트화). (C) 비변형 MSC(-) 및 FTVI-변형된 MSC(+)의 세포 용해물의 HECA452(좌측) 및 mE-Ig(우측) 반응성의 웨스턴 블롯 분석. FTVI 변형은 대개 약 100 kDa의 이중선 당단백질 밴드상에서 HECA452- 및 mE-Ig-반응성 모이어티를 유도하였다. (D) CD44는 FTVI-변형된(+) MSC 또는 비변형(-) MSC로부터의 동량의 세포 용해물로부터 면역침전되었다. 이어서, 면역침전물을 전기천공시킨 다음, CD44(mAb KM114 및 IM7; 좌측) 및 HECA452(우측)으로 블롯팅시켰다.
도 2. TNF-α 처리된 인간 제대정맥 내피 세포(HUVEC)에의 FTVI-변형된 MSC 및 비변형 야생형 MSC 부착의 병렬 플레이트 유동 챔버 검정. FTVI 변형은 0.5 dynes/cm2에서 HUVEC에 대한 MSC 부착을 현저하게 개선시켰으며, 이때 결합은 20 dynes/cm2을 초과하는 전단응력에서 명백하였다. HUVEC를 항-E-셀렉틴(항-CD62E) 기능-차단 mAb로 처리하는 것은 FTVI-변형된 MSC의 회전 부착 상호작용(rolling adhesive interaction)을 비변형 MSC의 수준과 유사한 수준까지 감소시켰다. 마찬가지로, FTVI-변형된 MSC를 시알리다제 처리하여 sLex 결정인자를 제거하는 것은 부착을 비변형 MSC와 동등한 수준까지 감소시켰다.
도 3(A) 내지 3(C). 신규 발병 당뇨병 NOD 마우스에서 고혈당증에 미치는 비 변형 MSC 및 FTVI -변형된 MSC 의 정맥내 투여의 효과. (A) PBS가 주사된 고혈당증 NOD(미처리 대조군)는 고혈당증의 역전을 나타내지 않았다(600 mg 글루코스/dL 이상의 글루코스 수준). 비변형 MSC의 주입(B)과 비교해, FTVI-변형된 MSC의 주입(C)은 정상혈당으로 역전된 마우스의 수 및 당뇨병 역전의 지속성의 현저한 증가를 초래하였다. X축의 화살표는 MSC 주입 일수를 나타낸다.
도 4(A) 내지 4(H). 췌장에서 E- 셀렉틴의 발현 및 MSC 의 국소화를 평가하기 위한 섬세포의 면역형광 염색. 도 4(A) 및 4(B): (A) 당뇨병-내성 BALB/c 마우스 및 (B) NOD 마우스의 췌장 섬세포를 인슐린(녹색) 및 E-셀렉틴(적색)의 발현에 대해 염색하였다. 섬세포는 파선으로 경계가 표시되어 있다. BALB/c(A)와 비교해, NOD 마우스(B)는 췌도염으로 인한 감소된 인슐린 생산을 나타낸다. 도 4(C) 내지 4(G)에서, MSC-처리된 NOD 마우스로부터의 췌장의 크라이오스탯(cryostat) 절편은 DAPI(청색)으로 염색되었다. 도 4(C) 및 4(D): NOD 췌장의 연속적 절편들의 염색은 내피 마커 CD31(C) 및 E-셀렉틴 (D)의 공동국소화를 입증하며, 이는 섬세포-주변 내피 세포상의 E-셀렉틴의 존재를 확인시켜 준다. 도 4(E): NOD 섬세포의 DAPI(청색), T-세포 마커 CD3(녹색) 및 인슐린(적색)으로의 공동-염색(E)은 섬세포의 주변부에서의 특징적인 T-세포 침윤을 보여준다. 도 4(F) 및 4(G): 침윤성 MSC에 대해 염색된 크라이오스탯 절편(FITC-접합된 항-sLex mAb HECA452로 가시화됨; 녹색), 섬세포(F)(APC-접합된 항-인슐린 mAb; 적색) 및 E-셀렉틴-발현 미세혈관(G)(PE-접합된 항-E-셀렉틴 mAb로 가시화됨; 적색)의 면역형광 영상. 염색은 섬세포-주변 영역 내의 E-셀렉틴-발현 미세혈관에 근접하여 췌도염 구역 내에 있고 림프구성 침윤물의 영역(즉, 특징적으로 L-셀렉틴을 발현하는 세포) 내에 군집된 HECA452+ MSC을 동정해 준다. 도 4(H): 정맥내 투여된 MSC의 NOD 및 BALB/c 숙주로의 췌장 침윤. NOD 마우스의 췌장으로의 FTVI-변형된 MSC의 축적은 비변형 MSC의 축적에 비해서 3배 더 높은 반면(p<0.01), 췌장 침윤물의 차이는 BALB/c 숙주(n=그룹당 3마리 마우스;60X 배율에서 그룹당 최소 30개 시야가 계수되었다)에서 관찰되지 않는다.
도 5(A) 내지 5(B). MSC 의 FTVI -변형은 세포 생존 또는 면역억제 능력에 영향을 주지 않는다. (A) 유사한 수준의 hGH는 pHRST-hGH-형질도입된 FTVI-변형된 MSC 또는 비변형 MSC를 주사한 후 상이한 시점에서 NOD 마우스의 혈청 중에서 검출되었다. (B) FTVI-변형된 MSC 및 비변형 MSC는 CD3/CD28로 자극된 NOD CD4+ T 세포의 증식을 동등하게 억제하며, 이는 글리칸-변형이 림프구 증식을 억제하는 MSC 능력을 증가시키지 않음을 시사한다.
도 6(A) 내지 6(D). CD44 발현의 결여는 전신 투여된 FTVI -변형된 MSC 의 항-당뇨병 효과를 제거하였다. (A) 비변형 야생형 MSC(도 3(B))와 비교해, CD44-결핍 MSC의 투여는 크지 않은 항-당뇨병 효과를 나타낸다. 비변형 CD44 KO MSC가 투여된 오직 1마리 NOD 마우스(7마리 중)만이 일시적인 고혈당증의 역전(약 30일째에 당뇨병 재발)을 나타냈으며, 7마리의 당뇨병 NOD 마우스 중 6마리는 고혈당증을 유지하였다. (B) FTVI-변형된 야생형 MSC(도 3(C))가 투여된 마우스에서의 결과와 비교해, FTVI-변형된 CD44 KO MSC의 투여는 최소의 항-당뇨병 효과를 제공하였으며, 6마리 NOD 마우스 중 1마리만이 고혈당증의 역전을 나타냈다. (C) NOD 췌장 내 MSC 축적은 비변형 CD44 KO MSC가 투여된 마우스(검은색 막대)와 비교하여 FTVI-변형된 CD44 KO MSC가 투여된 마우스(흰색 막대)에서 차이가 없었고(p<0.01), 각 경우에 비변형 MSC가 투여된 마우스(도 4(H))와 유사하였다. MSC 침윤물은 X60 배율에서 정량되었다. (D) FTVI-변형된 CD44 KO MSC 및 비변형 CD44 KO MSC는 둘 다 CD3/CD28 T 세포 자극 검정에서 T 세포 증식을 유사하게 감소시키는 면역억제 능력을 보유한다.
도 7. 마우스 골수 유래의 MSC의 특징 규명. MSC는 골세포, 지방세포 및 연골세포(X200 배율)로 분화되었다.
도 8. CD44 -/- MSC의 FTVI 변형은 야생형(WT) MSC와 유사한 HECA452 반응성 증가를 초래한다. 비변형 MSC(점선)은 HECA452와의 반응성을 나타내지 않는 반면에, FTVI-변형된 MSC(실선) 및 FTVI-변형된 CD44 KO MSC(회색으로 채워진 부분)는 HECA452로의 유사한 염색 수준을 나타냈으며, 이는 엑소푸코실화가 CD44 KO MSC에서 대안적(즉, 비-CD44) 스캐폴드상에 시알로푸코실화된 에피토프를 생성함 시사한다.
도 9a 내지 9b: 신경 줄기세포(NSC)는 E-셀렉틴 리간드가 결여되어 있지만, 다수의 기타 세포 표면 부착 분자들을 발현한다. (a) NSC에서의 HECA452, KM93, CSLEX-1, E-셀렉틴 리간드(E-셀렉틴-Ig 키메라(E-Ig)에 결합) 및 P-셀렉틴 리간드(P-셀렉틴-Ig 키메라(P-Ig)에 결합) 발현의 유세포측정 분석. 상응하는 이소타입 대조군들은 조사된 각 항체, 즉 RatIgM(HECA-452에 대해; MFI: 1.9), 마우스 IgM (KM93 및 CSLEX-1에 대해; MFI: 2.7) 및 인간 IgG1(E-Ig 및 P-Ig에 대해; MFI: 3.5)에 대해 중복된 시그널을 나타냈다. 전형적 E-Ig 결합 프로파일을 나타내는 히스토그램 플롯은 99%를 넘는 세포가 푸코실트랜스퍼라제 VI로의 세포 표면 처리를 통한 글리코실트랜스퍼라제-프로그램된 입체치환(Glycosyltransferase-programmed stereosubstitution)(GPS) 후에 E-Ig 결합을 지속적으로 발현한다는 것을 예시하고 있다. (b) CD43(S7 및 1B11), PSGL-1(2PH1, 4RA10), CD44(IM7, KM114), NCAM, PSA, CD49d, CD49e, CD29, LPAM-1, CD11a, CD18 및 CXCR4의 유세포측정 분석. 점선은 이소타입 대조군이고, 검은색 선은 특이적 항체이다. 표시된 모든 결과들은 NSC에서 수행된 n = 5 유세포측정 실험들을 대표한다.
도 10a 내지 10c: NSC의 GPS 처리(즉, FTVI 처리를 통한 α(1,3)-엑소푸코실화)는 주로 당단백질상에 시알로푸코실화를 발생시키며, 상기 당단백질 중 일부는 글리코포스파티딜이노시톨(GPI)-연결된 것들이다. (a) BT-NSC(검은색 막대) 및 GPS-NSC(회색 막대)에서의 HECA452, CD15, KM93, CSLEX1, E-Ig 및 P-Ig 반응성의 유세포측정 분석. 조사된 각 항체에 대한 상응하는 이소타입 대조군들은 다음과 같았다: 래트 IgM(HECA-452에 대해; MFI: 1.8), 마우스 IgM(CD15, KM93 및 CSLEX-1에 대해; MFI: 1.9) 및 인간 IgG1(E-Ig 및 P-Ig에 대해; MFI: 3.2). 표시된 결과들은 5회의 개별적 실험들을 대표한다. (b) 비분해 GPS-NSC(검은색 막대) 또는 GPS 처리 전에 브로멜라인으로 분해된 GPS-NSC(회색 막대)의 HECA452 반응성의 유세포측정 분석. 값은 평균 ± SEM이다. (n = 각 그룹마다 3). (c) 비분해 GPS-NSC(검은색 막대) 또는 포스포리파제 C(PI-PLC)로 분해시켜 GPI 앵커가 절단된 GPS-NSC(회색 막대)의 HECA452 반응성의 유세포측정 분석. 값은 평균 ± SEM이다. (n = 각 그룹마다 3).
도 11a 내지 11c: NSC의 GPS 처리는 HCELL 및 N-CAM-E에 상응하는 100, 120 및 140-kDa의 E-셀렉틴 리간드를 생성한다. (a) CD44를 GPS-처리된(GPS) NSC 또는 완충액-처리된(BT) NSC로부터의 동량의 세포 용해물로부터 (CD44에 대한 IM7 및 KM114 mAb를 이용하여) 면역침전시켰다. 전기천공시키고 HECA452, E-Ig 및 CD44로 블롯팅한 NSC의 면역침전물 및 상기 면역침전물로부터의 상청액(SN)에 대한 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. (b) N-CAM을 PNGaseF로 처리되었거나(+) 처리되지 않은(-), GPS-처리된(+) 또는 완충액-처리된(-) NSC 용해물로부터의 동량의 세포 용해물로부터 (N-CAM 13을 이용하여) 면역침전시켰다. 이어서, 면역침전물을 전기천공시키고 E-Ig 및 N-CAM로 블롯팅하였다. Ca2+의 존재하에 E-Ig로 염색하였다. (c) NSC를 0일째에 GPS로 처리하고 정상 성장 배지에서 추가로 3일 동안 배양하였다. 24시간마다 세포의 분취액을 채취하여 유세포측정에 의해 E-셀렉틴 리간드 활성에 대해 검정하였다. 도 11a 내지 11c, 12a 내지 12b 및 13a 내지 13f를 또한 참조한다.
도 12a 내지 12b: GPS-NSC는 정의된 전단응력 조건 하에 내피 E-셀렉틴과의 내전단성 부착 상호작용을 현저하게 증진시켰다. (a) BT-NSC 또는 GPS-NSC를 1.0 dyn/cm2에서 IL-1β 및 TNF-α 자극된 HUVEC 위에 관류시켰다. 이어서, 1, 2, 4, 8, 16, 25 및 32 dyn/cm2의 전단응력에서 NSC 축적을 측정하였다. GPS-NSC는 32 dyn/cm2 이하의 전단응력에서 HUVEC상에서 회전 부착 상호작용을 나타낸다. GPS-NSC의 결합의 특이성을 대조하기 위해, EDTA를 검정 완충액에 첨가하거나(EDTA 그룹), 자극된 HUVEC를 부착 검정에서 사용하기 전에 E-셀렉틴에 대한 기능 차단 mAb로 전처리하였다(항-E-Sel 그룹). 값은 평균 ± SEM이다. (n = 각 그룹마다 4). 모든 전단응력 수준에서 GPS-NSC를 모든 나머지 그룹들과 비교하기 위한 P ≤ 0.001. (b) 0.6 dyne/cm2에서 NSC의 HECA-452-반응성 막 당단백질의 SDS-PAGE 면역블롯 위에 관류된 CHO-E 세포의 블롯 회전 검정(회전 세포/mm2)에 대한 부착 막대 그래프. 검정을 수행하기 전에, BT-NSC(검은색 막대) 및 GPS-NSC(회색 막대) 둘 다로부터의 CD44/HCELL 및 panNCAM의 면역침전물을 SDS-PAGE에 의해 분해시키고 HECA-452에 대해 블롯팅하였다. 막 당단백질에 대한 CHO-E 결합의 특이성을 대조하기 위해, EDTA를 부착 검정에서 사용하기 전에 CHO-E 세포 함유 완충액에 첨가하였고; 이러한 조건하에 결합된 세포는 없었다(데이터는 제시하지 않음). 제시된 결과들은 NSC의 다수의(n = 3) 막 제제들의 HECA-452 블롯에 대한 다수의 실험(n = 4)을 대표한다.
도 13a 내지 13f: GPS-NSC는 생체내 EAE 모델에서 개선된 귀소를 나타낸다. (a) 내지 (d) GPS-NSC는 BT-NSC보다 더 효율적으로 CNS 실질(實質)로 이동한다. 1×106 GPS-NSC 또는 BT-NSC를 PKH26 염료로 표지하고 면역화 후(PI) 9일째 및 13일째에 MOG-유도된 EAE 마우스에게 정맥내 주사하였다. (a) BT-NSC 또는 GPS-NSC가 투여된 EAE 마우스 전뇌의 분석(PI 17일째)은 GPS-NSC와 비교해 BT-NSC가 주사된 동물들에서 더 적은 수의 PKH26-양성 세포가 관찰됨을 보여주었다. 황색 화살표는 NSC를 나타내고, 흰색 화살표는 침윤물을 나타낸다. 흰색 파선은 뇌수막 경계를 나타낸다. 도 20a 내지 20b는 NSC(PKH26; 적색)가 Flk-1 혈관(녹색)의 외부에 국소화되어 있고 NSC가 SOX-2 양성(녹색)임을 확인하기 위한 이들 절편들의 추가 분석을 도시한 것이다. (b) 요추-천골 척수(삽도)를 PI 17일째에 수거하였다. PI 17일째에, BT-NSC보다 더 많은 GPS-NSC가 혈관에서 벗어나서 척수 실질로 이동하였다. 혈관은 Flk-1(VEGFR2; 녹색) 염색으로 가시화하였다. 척수 실질의 가장자리는 흰색 점선으로 강조되어 있다. PKH26 염료로 표지된 NSC는 적색으로 도시되어 있으며 TO-PRO-3으로 대조염색된 핵은 청색이다. WM: 백질. V: 혈관. (c) 삽도들은 도 20a에서 화살표로 표시된 이동된 NSC의 3차원 사진을 도시한다. (d) PI 17일째에 척수 면적당 200x 이동당 BT-NSC 및 GPS-NSC의 수의 정량을 측정하였다. BT-NSC와 대비해 이동 GPS-NSC의 수의 유의적 증가가 명백하였고, * p < 0.05. (e) NSC의 생체분포의 정량. GPS-NSC(회색 막대) 또는 BT-NSC(검은색 막대)를 CFDA-SE로 표지하고 면역화 후 9일째 및 13일째 MOG-처리된 C57BL6 마우스에게 정맥내 주사하였다. 뇌, 림프절, 비장, 간 및 폐를 마지막 주사한 후 16시간째에 분석하여 NSC를 나타내는 정의된 게이트 내에 존재하는 CFSE 양성 세포의 비율을 측정하였다. GPS-NSC 또는 BT-NSC가 투여된 비-EAE 마우스를 사용하여 시험된 각 조직에서 관찰된 시그널들을 표준화하였다. 세포를 투여하지 않은 마우스를 사용하여 배경 시그널을 측정하였다. 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타낸다. 데이터는 그룹당 10마리의 마우스가 시험된 2회의 개별적 실험들을 대표한다. (f) 엑소푸실화된 NSC가 생체내 비장에서 CD4 T 세포에 매우 가까운 곳에서 발견됨을 입증하는 생체내 공초점 영상(NSC는 분홍색으로 표지되고 CD4 T 세포는 녹색으로 표지된다); 이러한 NSC와 림프구의 공동국소화는 림프구 L-셀렉틴에의 NSC HCELL 결합에 의해 야기될 수 있다.
도 14a 내지 14i: GPS-NSC는 증진된 신경보호를 통해 EAE 증상의 유의적 개선에 기여한다. (a) 0일째에 MOG 35-55로 면역화되고 이어서 면역화 후 9일째 및 13일째에 1×106 GFP-표지된 완충액-처리된 NSC(BT-NSC; 적색 삼각형; n = 30) 또는 GPS-처리된 NSC(GPS-NSC; 녹색 원; n = 30)가 주사된 C57BL/6 마우스 또는 모의(sham)-처리된 마우스(NSC 없음; 검은색 원; n = 30)에서의 EAE 임상 스코어를 측정하였다. GPS-NSC가 투여된 마우스는 모의-처리된 마우스(p=0.0001) 및 BT-NSC가 정맥내 주사된 마우스(p=0.006)와 비교해 뚜렷한 임상적 개선을 나타냈다. (b) 질환의 누적 부하(cumulative burden)를 도 14a에서의 곡선들의 기울기를 비교하는 선형 회귀 분석을 수행하여 평가하였다. 이들 데이터는 GPS-NSC(녹색 점선)가 BT-NSC(적색 선)보다 임상 스코어를 유의적으로 개선시킴을 강조한다. GPS-NSC 또는 BT-NSC가 투여된 마우스는 NSC가 투여되지 않은 마우스(NSC 없음; 검은색 선)와 비교해 유의적으로 개선된 임상 스코어를 나타냈다. 이들 데이터는 또한 BT-HSPC(청색 선) 및 GPS-HSPC(자주색 선)가 질환을 악화시킴을 제시한다(도 21c 참조). (c) NSC가 주사된 EAE 마우스의 뇌의 PI 30일째에서의 신경병리상태를 항-CD11b mAb(녹색) 및 핵 표지 To-Pro3(청색)로 염색하여 분석하였다. GPS-NSC 주사는, 3개의 상이한 척수들의 20개의 상이한 절편들로부터의 CD11b 대식세포/미세교세포의 계수(numeration)로 측정한 바에 따르면 뇌 절편마다 유의적으로 적은 손상을 유도한다. 막대 그래프는 NSC가 없는 샘플, BT-NSC 또는 GPS-NSC가 투여된 EAE 마우스로부터의 고배율 시야(HPF)당 척수 절편에서의 CD11b 대식세포/미세교세포의 계수를도시하며, 또한 HPF당 침윤물의 계수를 To-Pro3 염색을 토대로 하여 계산하였다. 흰색 박스는 고배율 영상에 해당한다. 황색 화살표는 활성화된 미세교세포에 해당하며, 흰색 화살표는 뇌수막(m) 내 침윤물에 해당한다. NSC가 없는 샘플의 미세교세포는 BT-NSC 및 GPS-NSC 샘플에서 발견된 것보다 활성화됨을 주지한다. 또한, 뇌수막 내의 침윤물의 크기는 BT-NSC 샘플에서보다 NSC가 없는 샘플에서 더 크다. 축척 막대, 최상단 패널에 대해 100㎛. 축척 막대, 하단 패널에 대해 50㎛. (d) NSC가 없는 샘플(NSC가 없는 EAE), BT-NSC(EAE BT-NSC) 또는 GPS-NSC (EAE GPS-NSC)가 투여된 마우스로부터의 3개의 개별적 뇌의 20개의 상이한 절편들을 CD4(T 세포 침윤을 측정하기 위해), CNPase(재수초성 세포를 정량하기 위해), Olig-2(희소돌기아교세포 분화를 측정하기 위해) 또는 SOX-9(신경 전구세포의 다분화능을 측정하기 위해)(녹색) 및 To-Pro3(청색)로 염색하여, NSC가 주사된 EAE 마우스로부터의 뇌의 신경병리상태를 분석하였다. GPS-NSC 주사는 유의적으로 적은 T 세포 침윤, 증진된 재수초화, 많은 수의 희소돌기아교세포 및 기원세포 수의 보존을 유도한다. (e) 막대 그래프는 NSC가 없는 샘플, BT-NSC 또는 GPS-NSC(도 14d에 개요된 바와 같음)가 투여된 EAE 마우스의 고배율 시야(HPF)당 뇌 절편 내의 CD4 T, CNPase, Olig2, SOX-9 세포의 계수를 도시하며, 이는 GPS-NSC가 투여된 동물이 기원세포의 증진된 신경보호를 나타냄을 시사한다. (f) 내지 (i) GPS-NSC 및 BT-NSC 주사는, 500회가 넘는 개별적 측정에서 GAP43 픽셀 강도(pixel intensity)의 정량적 공초점 영상화로 평가된 증가된 GAP-43(녹색; p<0.001) 염색(f) 및 감소된 모노클로날 항체 SMI32로의 염색(적색; p<0.001)(h)에 의해 측정된 바에 따르면 NSC가 없는 대조군과 비교해 증가된 축삭 재생 및 축삭 보호를 유도한다. To-Pro3 염색 염료를 사용하여 세포 핵(청색)을 검출하였다. (g) 및 (h) 500회가 넘는 개별적 픽셀 강도 측정(Imitola, J., Cote, D., et al. 2011)의 정량적 공초점 영상화를 토대로 하여, GAP-43(g) 및 SMI32(i)의 그래프 표현을 결정하였다; SMI32 패턴(i)은 EAE가 있는 동물들에는 축삭 타원체가 존재하지만 NSC(i)가 주사된 동물에서는 감소되었음을 입증하였고, SMI32 픽셀 강도는 GPS-NSC를 갖는 동물에서 축삭 완전성의 점진적 교정을 나타냈다. 하단 도면 14i에 도시된 바와 같이, 대조군 및 BT-NSC과 비교해 축삭 타원체 및 축삭 단편의 감소가 있다. 축척 막대, SMI32 염색(여기서, 축척 막대: 50㎛)을 제외하고 100㎛.
도 15: 염증성 사이토킨 처리는 마우스 NSC에서 셀렉틴 리간드 발현을 유도하지 않는다. NSC를 10 ng/ml의 TNFα, 10 ng/ml IL-1β, 10 ng/ml IFNν를 이용하여 독립적으로 또는 함께 자극시켰다(모두 10 ng/ml에서). 24시간째에, NSC를 수거하고 E-셀렉틴 결합에 대한 유세포측정에 의해 분석하였다. 대조군은 미처리된 NSC 및 Kg1a 세포(E-셀렉틴 결합에 대한 양성 대조군)를 포함하였다.
도 16(A) 내지 16(C): HCELL 은 1종의(예시적) 인간 NSC주(CC-2599)에서 GPS 처리에 의해 생성된 유일한 E- 셀렉틴 리간드이다 . (A) GPS로 처리된 인간 NSC(회색 막대) 또는 완충액-처리된 인간 NSC(BT; 검은색 막대)에서의 CD15, CSLEX-1, HECA452 및 E-셀렉틴 리간드(E-Ig 결합) 발현의 유세포측정 분석. 각각의 측정된 항체에 대한 평균 형광 강도가 도시되어 있다. (B) CD44, PSGL-1, NCAM 및 CD43의 유세포측정 분석. (C) 마우스 및 인간 공급원으로부터의 NSC 용해물의 E-Ig 반응성의 웨스턴 블롯 분석. CD44 및 NCAM을 GPS-처리된(+) 또는 완충액-처리된(-) 마우스 NSC 또는 인간 NSC로부터의 동량의 세포 용해물로부터 면역침전시켰다. 이어서, 면역침전물을 전기천공시키고 E-Ig로 블롯팅하였다. GPS-처리된 NSC를 Ca2+의 존재하에 E-Ig로 염색하였다.
도 17: GPS 처리는 신경구를 형성하는 NSC의 능력에 영향을 미치지 않는다. 200개의 생존가능 GFP+ NSC를 7일 동안 GPS 처리한 후 즉시 96웰 플레이트 웰마다 플레이팅하였다. 생성된 신경구를 계수하고, 신경구의 수를 플레이팅된 세포의 수로 나누어 신경구 빈도를 계산하였다. BT-NSC와 GPS-NSC 간에 신경구의 밀도 또는 형성된 신경구의 수에서의 통계학적 유의차가 없었다. 본 실험들을 위해 사용된 GFP+ 신경구의 대표적 영상이 도시되어 있으며, 여기서 적색 형광은 네스틴 발현을 나타내며, 녹색 형광은 GFP를 나타낸다. BT-GFP+ NSC 및 GPS-GFP+ NSC는 둘 다 신경구를 동일하게 형성할 수 있었음을 주지한다. 본 도면은 도 11a 내지 11c와 관련된다.
도 18a 내지 18d: GPS 처리는 NSC의 뉴런(a), 성상교세포(b, d) 또는 희소돌기아교세포 전구체(d, d)로의 분화 능력에 영향을 미치지 않는다. 1×105 BT-NSC 및 GPS-NSC를 적당한 분화 배지에서 배양하고, 120시간 후 MAP-2+ 뉴런(a), GFAP+ 성상교세포(b,d) 및 NG2+ 희소돌기아교세포(c)의 수를 20x 시야마다 계수하였다. 이러한 3가지 계통(lineage)으로 분화하는 BT와 GPS-NSC의 능력 간에 통계학적 유의차는 없었다(p=0.1). (d) GFAP+ 성상교세포 및 NG2+ 희소돌기아교세포는 적색으로 도시되어 있으며, To-Pro3는 시험관내에서 대조 완충액(BT) 또는 FTVI(GPS)로 처리된 신경 줄기세포의 핵을 염색하는데 사용된다. 축척 막대: 50㎛. 본 도면들은 도 11a 내지 11c와 관련된다.
도 19a 내지 19c: GPS 처리는 시험관내에서 NSC의 면역조절 기능에 영향을 미치지 않는다. 림프절 세포(LNC)에 미치는 NSC의 직접적 시험관내 억제 효과를 나이브(naive) C57BL/6 마우스로부터 단리된 LNC와 방사선 조사된 NSC를 공배양하여 측정하였다. 방사선 조사된 BT-NSC와 GPS-NSC는 둘 다, 콘카나발린 A(ConA)에 반응하여 LNC로의 3H-티미딘 혼입(a)을 용량-의존적 방식으로 억제하였고, 또한 ELISA에 의해 측정된 바와 같은 염증성 사이토킨 생산(b)를 동일한 정도로 억제한다; 그 비는 NSC의 수 대 LNC의 수에 상응한다(1:4, 1:2, 1:1, 2:1 및 4:1). 단독의 LNC(첫번째 막대)와 비교해 NSC:LNC의 비가 증가함으로써 3H-티미딘 혼입량이 유의적으로 감소되었음을 주지한다(p=0.0005). 또한, 증식을 억제하는 BT-NSC와 GPS-NSC의 능력 간에 통계학적 유의차가 없음을 주지한다(p=0.2). (c) RNA 추출 및 cDNA 합성 전에, 1×106개의 BT-NSC 또는 GPS-NSC를 24시간 동안 염증성 사이토킨(10ng/mL IFN-ν 및 15ng/mL TNF-α)으로 처리하거나 처리하지 않고 E-Ig(5ng/mL)로 처리하거나 처리하지 않았다. 실시간 RT-PCR은 2-△△CT 방법을 사용하여 계산된 유전자 발현(BT 또는 단독의 GPS-NSC와 관련됨)의 배수 변화를 보여주었으며, LIF mRNA의 상대적 발현을 GAPDH 하우스키핑 유전자(housekeeping gene)와 대비하여 검정하였다. 값은 평균 ± SEM이다(n = 4회의 실험). 본 도면들은 도 11a 내지 11c와 관련된다.
도 20a 내지 20b: GPS-NSC는 BT-NSC보다 더 효율적으로 CNS 실질로 이동한다. 1×106 GPS-NSC 또는 BT-NSC를 PKH26 염료로 표지하고 면역화 후(PI) 9일째 및 13일째에 MOG-유도된 마우스에게 정맥내 주사하였다. PI 17일째에 뇌를 수거하고, 스냅-동결(snap-freezing)시킨 후, 20㎛ 절편을 제조하고, 각각 혈관 및 NSC의 위치를 밝히기 위해 다음의 항체들로 염색하였다: 항-Flk-1(VEGFR2; 녹색) 또는 항-SOX-2(적색). (a) BT NSC는 주로 FLK-1+ 내피 세포와 함께 국소화되는 반면에, GPS-NSC는 내피를 횡단하였기 때문에 실질에서 발견된다. 이들 NSC는 신경 줄기세포에 대한 마커인 sox-2를 발현한다(b). 본 도면들은 도 13a 내지 13f와 관련된다.
도 21a 내지 21c: GPS 처리는 마우스 HSPC에서 강력한 E-셀렉틴 리간드 활성을 발생시키지만, 이것은 EAE의 개선으로 바뀌지 않는다. (a) BT- 및 GPS-마우스 조혈 줄기/기원 세포(HSPC; 계통negC-키트pos)에서의 E-Ig 반응성의 유세포측정 분석. 평균 형광 강도는 BT-HSPC에서의 hIgG1 이소타입 대조군, E-Ig 반응성 및 GPS-HSPC에서의 E-Ig 반응성에 대한 각 히스토그램 위에 도시되어 있다. 이들 세포는 생체내 EAE 실험을 위한 대조군으로서 사용하였다. (b) 0일째에 MOG 35-55로 면역화되고 이어서 면역화 후 9일째 및 13일째에 1×106 완충액-처리된 HSPC(BT-HSPC; 가운데가 빈 파란색 다이아몬드; n = 30) 또는 GPS-처리된 HSPC(GPS-HSPC; 가운데가 빈 자주색 다이아몬드; n = 30)가 주사된 C57BL/6 마우스 또는 모의-처리된 마우스(NSC 없음; 검은색 원; n = 30)의 EAE 임상 스코어를 측정하였다. BT-HSPC 또는 GPS-HSPC가 투여된 마우스에서 임상 스코어의 유의적 개선은 명백하지 않았다. (c) 질환의 누적 부하를 도 21b의 곡선들의 기울기를 비교하는 선형 회귀 분석을 수행하여 평가하였다. 본 도면들은 도 14a 내지 14h와 관련된다.
도 22: PI 30일째에 EAE 마우스에 주사된 BT-NSC 또는 GPS-NSC로부터 GFP 시그널의 증거가 관찰되지 않았다.
C57BL/6 마우스를 MOG 35-55로 면역화시키고(0일째) 이어서 9일째 및 13일째에 1×106 완충액-처리된 NSC(BT-NSC) 또는 GPS-처리된 NSC(GPS-NSC)를 주사한 후 30일째에 희생시키거나, 모의-처리된 마우스(NSC 없음)를 희생시키고, GFP+ 세포에 대한 면역조직화학을 수행하였다. GFP에 대한 항체(적색)를 내인성 GFP 시그널(EGFP; 녹색)와 비교한 경우에도 PI 30일째에 GFP+ 세포는 관련 연구 그룹들의 절편에서 동정되지 않았다. 주사 전에 배양된 NSC는 양성 대조군(NSC-Pre Tx)으로서 사용되었으며 강력한 GFP 시그널을 나타냈다. 축척 막대: 50㎛. 본 도면은 도 14a 내지 14h와 관련된다.
도 23: EAE 마우스에서 내피 E-셀렉틴에 효율적으로 결합하는 신규 단계 1 이펙터인 HCELL 및 NCAM-E를 생성하는, 본래의 NSC 표면 단백질인 CD44 및 NCAM의 GPS 처리에 의해 제공된 신경복원 모델. 손상의 결과로서, 내피 세포 및 아교세포는 GPS-NSC를 손상-유도된 닛치(niche)를 향하도록 유도하는 손상 시그널(예: SDF-1α 및 E-셀렉틴)을 대조군 마우스보다 더 많은 수로 생성할 수 있다. 모집된 NSC의 수가 증가되었음에도 불구하고, 세포 치환 대신에, NSC는 SOX-9+/Olig-2+ 희소돌기아교세포의 수를 증가시킴으로써 면역의 국소 조절 및 CNS의 내인성 재생을 제공한다. 이는 후속적으로 더 성숙한 희소돌기아교세포(CNPase+), 더 적은 축삭 손실 및 더 많은 축삭 재생으로 이어진다. 원시 신경 줄기세포에 의해 분비된 닛치(Niche) 분자는 이의 증가된 콜로니화에 의해 제공된 효과들의 일부를 촉진할 수 있다.
도 24. 마른 대상체 및 비만 대상체로부터의 지방 유래의 MSC의 FTVII 처리는 세포 표면상에 sLex 구조체의 생성을 야기한다. 막대 그래프는 지방 유래의 MSC(n= 마른 대상체 및 비만 대상체로부터 유래된 4개의 MSC 샘플)의 α(1,3)-엑소푸코실화 후 sLex 발현(HECA452-반응성)의 유세포측정 결과(MFI, 평균 + SEM)를 나타낸다.
도 25. 지방 유래의 MSC의 세포 용해물의 웨스턴 블롯 분석. 골수로부터의 MSC(BM-MSC) 및 마른 대상체 및 비만 대상체의 지방 조직으로부터의 MSC(A-MSC)의 용해물을 FTVII(+)로 엑소푸코실화시키거나 단독의 완충액(-)으로 처리한 다음, SDS-PAGE에 적용시키고 HECA452 또는 항-인간 CD44 mAb로 블롯팅하였다. 조혈 세포주 KG1a(대조군) 및 섬유아세포주 PIF의 용해물을 공동-전기천공시키고 블롯팅하였다. KG1a 세포는 HCELL(약 80 kDa의 mw에서 HECA-452-반응성 CD44)를 발현한다. 본 도면에 도시된 바와 같이, FTVII 처리는 PIF 세포 및 마른 대상체 및 비만 대상체의 지방 조직으로부터 유래된 MSC에서 강화된 HCELL 발현(HECA452-반응성 CD44)을 야기한다(상단 패널); 각 용해물에서의 CD44 발현에 대한 염색은 HECA452 블롯 아래에 도시되어 있다. HCELL(약 80 kDa HECA452-반응성 밴드)의 발현은 세포의 시알리다제 처리 후 제거되었고(하단 패널), 이는 HCELL 발현의 시알리다제 민감성과 일치한다(즉, sLex의 제거). HCELL은 약 80kDa에서 이중선으로서 나타날 수 있고, 이는 HCELL 분자의 E-셀렉틴 또는 L-셀렉틴 리간드 활성에 영향을 주지않는 코어 CD44 당단백질의 가변적 글리코실화를 반영함을 주지하라(하단 패널의 FTVII-처리된 A-MSC의 프로파일을 참조).
도 26. TNF-자극된 인간 제대정맥 내피 세포(HUVEC) 위에 관류된 MSC의 병렬 플레이트 유동 챔버 연구의 결과. 정의된 혈류역학적 전단 조건(dynes/cm2, x축상에 도시됨) 하에 측정된 바와 같이, 마른 대상체(LA-MSC) 및 비만 대상체(OA-MSC)로부터 유래된 A-MSC의 α(1,3)-엑소푸코실화(FTVII 처리)는 TNF-자극된 HUVEC상에 제시된 E-셀렉틴에 강력한 E-셀렉틴 결합을 부여하고; FTVII-처리된(HCELL+) 지방 유래의 MSC의 E-셀렉틴 리간드 활성은 FTVII-처리된(HCELL+) 골수 유래의 MSC(BM-MSC; 하단 패널)의 E-셀렉틴 리간드 활성과 동등하다. 미처리된 MSC는 어떠한 전단응력 수준에서도 HUVEC에서 유의적 결합 상호작용을 갖지 않는다.
도 27(A) 내지 27(C). 다양한 백혈구의 E- 셀렉틴 결합에 미치는 α(1,3)- 엑 소푸코실화의 효과의 분석. (A) 본래의 말초혈 백혈구와 내피 E-셀렉틴(TNF-자극된 인간 제대정맥 내피 세포(HUVEC)에서 발현됨)의 일시부착 및 회전 상호작용의 병렬 플레이트 유동 챔버 분석. 단핵구, CD4 T 세포, CD8 T 세포 및 B 세포를 새로이 단리시킨 다음, TNF-자극된 HUVEC(즉, TNF는 HUVEC가 E-셀렉틴를 발현하도록 유도한다)상에 0.5 내지 16 dynes/cm2 범위의 유속으로 관류시켰고, 세포 회전을 관찰하고 비디오 분석을 위해 기록하였다. 단핵구 및 CD4 T 세포는 16 dynes/cm2 이하의 전단응력에서 TNF-활성화된 HUVEC에서의 회전 부착 상호작용을 나타내는 반면에, CD8 및 B 세포는 최소의 부착 내전단성 부착 상호작용을 나타낸다. 단핵구 세포 회전이 CD4 T 세포보다 3배 더 컸다는 것을 주지한다. 값은 최소 3회의 독립적 실험에 대해 평균 ± SEM이다. (B) 단핵구, CD4 및 CD8 T 세포 및 B 세포의 E-셀렉틴-Ig 키메라("E-Ig", E-셀렉틴 리간드에 대한 프로브(입수원: R&D Systems))(좌측) 및 mAb HECA452(우측)로의 염색의 대표적 유세포측정 히스토그램. 회색으로 채워진 곡선은 이소타입 대조군(또는, E-Ig 염색에 대한, 유입 Ca2+의 부재 하의 E-셀렉틴 결합)을 나타내고, 흰색 곡선은 특이적 반응성(E-Ig에 대한, 유입 Ca2 +의 존재 하의 결합)을 나타낸다. (C) 미처리된 세포(검은색 실선) 또는 프로테아제(브로멜라인) 처리된(점선) 세포를 HECA452 mAb으로 염색시키고 유세포측정법에 의해 분석하였다. 프로테아제(브로멜라인) 처리(점선)는 단핵구, CD4 T 세포, CD8 T 세포 및 B 세포의 HECA452 염색을 현저하게 감소시키며, 이는 당단백질이 이들 세포에서 sLex 결정인자의 주요 운반체임을 보여준다.
도 28a 내지 28c. 단핵구 및 림프구에서의 기능적 E-셀렉틴 리간드 발현은α(1,3)-엑소푸코실화 처리에 의해 증가된다. (a) 인간 단핵구를 FTVII 처리하거나 완충액 처리(모의)하고 E-셀렉틴-Ig 키메라("E-Ig", E-셀렉틴 리간드에 대한 프로브(입수원: R&D Systems))로 면역침전시킨 다음, SDS-PAGE에 적용시키고 각각 HECA-452, 항-CD43, 항-CD44 및 항-PSGL-1 mAb으로 블롯팅하였다. 단핵구의 FTVII 처리 후에 CD44(즉, HCELL의 생성) 및 CD43(CD43-E-셀렉틴 리간드("CD43-E")의 생성)에서 현저하게 E-Ig 면역침전이 증가되었음을 주지한다. (b) CD4 T 세포, CD8 T 세포 및 B 세포의 용해물로부터의 PSGL-1, CD43 및 CD44의 순차적 면역침전에 이은 E-Ig로의 염색의 웨스턴 블롯 분석. (c) TNF-α 활성화된 HUVEC(E-셀렉틴을 발현함)에서의 미처리된("unt") 및 FTVII-처리된(즉, α(1,3)-엑소푸코실화; "FT7") 단핵구, CD4 T 세포, CD8 T 세포 및 B 세포의 일시부착 및 회전 상호작용의 병렬 플레이트 유동 챔버 분석. FTVII 처리("FT7")는 시험된 모든 전단응력 수준 하에서 HUVEC에 대한 유동 세포의 E-셀렉틴-매개 부착을 현저하게 증가시킨다.
도 29(A) 내지 29(C): 단핵구 유래의 수지상 세포(즉, CD14 발현( CD14 -S mo-DC)에 의해 단핵구를 선별한 후 배양됨)에 의해 발현된 CD44 는 E- 셀렉틴에 결합한다. (A) mo-DC의 HECA-452 mAb 및 E-Ig 반응성 염색의 대표적 유세포측정 히스토그램. 회색 선은 이소타입 대조군 또는 Ca2 + 부재하의 E-Ig 염색을 나타나내는 반면에, 검은색 점선은 PA-S mo-DC를 나타내고, 검은색 실선은 CD14-S mo-DC이다. (B) CD14-S 및 PA-S mo-DC 용해물의 E-셀렉틴 염색의 웨스턴 블롯 분석. 2×106 mo-DC에 상당하는 전세포 용해물을 SDS-PAGE 겔상에서 분해시키고 면역블롯팅하였다. MW 마커는 Y축(kDa 단위)상에 있다. CD14 비이드상에서 배양된 Mo-DC(CD14-S Mo-DC)는 플라스틱상에서 배양된 Mo-DC(PA Mo-DC)보다 더 높은 HCELL 발현(약 80 kDa 밴드)을 갖는다. (C) CD14-S 및 PA-S mo-DC의 세포 용해물로부터 면역침전된 CD44의 웨스턴 블롯 분석. 이어서, CD44 면역침전물(CD44 IP)을 블롯팅하고 E-Ig 키메라 또는 항-CD44 mAb로 염색하였다. MW 마커는 주지된 바와 같이 Y축(kDa 단위)상에 있다. CD14-S mo-DC에서의 두드러진 HCELL 발현을 주지하라.
도 30(A) 내지 30(E). 인간 mo-DC의 α(1,3)- 엑소푸코실화는 더 높은 E- 셀렉틴 리간드 활성을 강화하며 내피 E- 셀렉틴 발현은 엑소푸코실화된 DC의 내피경유 이동(transendothelial migration)( TEM )을 촉진한다. (A) 2×106개의 KG1a 세포 및 mo-DC의 용해물의 E-셀렉틴 결합(E-Ig)을 비교하는 웨스턴 블롯 분석. (B) 완충액 처리된(-) 또는 FTVI-처리된(+) mo-DC의 E-Ig 반응성의 웨스턴 블롯 분석. FTVI 처리는 약 80 kDa에서 E-Ig 결합을 유도하며, 이는 HCELL의 강화된 발현을 시사한다. (C) TNF-α-자극된 HUVEC에서의 전단 유동 조건(2 dynes/cm2) 하에 완충액 처리된(BT) mo-DC 및 FTVI-처리된 mo-DC의 내피경유 이동(TEM) 검정. TEM 값은 미처리된 HUVEC(이는 최소한이다)에서의 이행한 세포와 비교한, TNF-α-자극된 HUVEC에서의 세포 이동의 배수 증가이다. TEM을 상이한 조건 하에 분석하였다: 기능 차단 항-E-셀렉틴 mAb 클론 68-5H11과 사전 항온배양된 HUVEC, 기능 차단 항-VLA-4 mAb HP2/1 또는 이소타입 mAb와 사전 항온배양된 mo-DC, 및 시알리다제 또는 백일해 독소(PTX)로 처리된 mo-DC. 도시된 바와 같이, 엑소푸코실화된 DC는 미처리된 세포보다 높은 TEM을 갖고; TEM은 E-셀렉틴 및 VLA-4에 대한 기능-차단 항체에 의해 그리고 세포의 시알리다제 또는 PTX 처리에 의해 제거된다. (D) TEM 검정에서 일시부착 및 회전 mo-DC(내피 표면적 cm2당)의 수 및 안정적으로 부착된 세포(내피 표면적 cm2당)의 수의 분석. 엑소푸코실화된 DC와의 더 높은 일시부착/회전 상호작용을 주지하라. (E) TEM 검정에서 완충액 처리된(BT) mo-DC 및 FTVI-처리된 mo-DC의 평균 회전 속도. 세포 수를 2.0 dyne/cm2 전단응력(즉, 2.0 dyne/cm2 전단응력에서 TNF-α-자극된 HUVEC 위에 관류됨)에서 계수하였다. 값은 평균 ± SD이다(n= 3). 통계학적 유의차(p<0.05)는 괄호와 별표(*)로 표시되어 있다. FTVI-처리된 DC의 보다 느린 회전은 혈류역학적 전단 조건하에 내피 E-셀렉틴에 대한 DC 결합 상호작용의 더 높은 효율성을 나타내는 지표이다.
도 31. CD3 및 CD28에 대한 항체 및 IL-2 보충의 존재 하에 인간 CD4+ 세포의 생체외 증식에 의해 생성된 조절 T 세포에서의 FoxP3 발현. 배양된 CD4+/CD127-낮은 T 세포에서의 CD4 및 FoxP3 발현을 보여주는 이중 색상 유세포측정 히스토그램; 높은 FoxP3 염색은 모든 배양-증식된(culture-expanded) 세포가 Treg임을 시사한다.
도 32. 완충액 처리된(담회색으로 채워짐) Treg 및 엑소푸코실화된(FTVII-처리; 검은색으로 채워짐) Treg의 sLex 발현(HECA452 염색)의 유세포측정 프로파일. 완충액-처리된 Treg는 sLex 발현이 없는(즉, 프로파일은 이소타입 대조군 염색(파선)과 유사하다) 반면, FTVII-처리된 세포는 높은 sLex 수준을 나타냄을 주지하라.
도 33. 인간 골수성 백혈병 세포주 KG1a와 비교한 FTVII-처리된 Treg 및 완충액 처리된(BT) Treg의 E-Ig 염색의 웨스턴 블롯 분석. 완충액 처리된 Treg는 E-셀렉틴 리간드를 갖지 않는다. α(1,3)-엑소푸코실화는 HCELL(약 80 kDa 밴드)의 발현을 포함하여, Treg에서 몇몇 당단백질 E-셀렉틴 리간드의 발현을 유도한다. KG1a 세포는 본래 HCELL을 발현한다.
도 34. 이종 이식편대숙주병(GVHD)에서 조절 T 세포 투여의 역가측정. 이종 GVHD-관련 체중 감소(PBMC 주사 후 50일째에 측정됨)는 1.5×105개 Treg의 정맥내 주사에 의해 없어졌지만, 유사한 용량의 완충액 처리된 Treg의 주사에 의해서는 없어지지 않았다(체중값은 N=3마리 마우스의 평균이다). 그러나, 5×105개 Treg의 주사는 투여된 Treg 세포의 α(1,3)-엑소푸코실화와 상관없이 GVHD 체중 감소를 방지한다. 따라서, Treg의 α(1,3)-엑소푸코실화는 GVHD의 면역조절에서의 효능을 3배 증가시킨다.
실시형태
본 발명은 대상체에서 염증이 발생한 조직 및/또는 손상된 조직 또는 암으로서 나타나는 질환, 장애 또는 의학적 병태의 치료 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 조직 복구/재생 또는 암 치료가 필요한 대상체에게 본래의 세포 집단의 수준을 초과하는 수준으로 E-셀렉틴 리간드 및/또는 L-셀렉틴 리간드를 발현하는 세포 집단을 투여하는 것을 수반한다. 세포의 조성물은 대상체에게 투여하기 위해 또는 대상체에게 투여하기 전에 보관(예를 들면, 냉동보존)하기 위해 약제학적으로 허용되는 용액, 현탁액, 담체 또는 비히클 중에 배치된다.
치료 적응증(therapeutic indications)에 대한 본원에 설명된 세포 집단의 투여는 해부학적 영상 기법(예를 들면, 방사선, MRI, 초음파 등) 또는 맵핑 기술(예: 전자생리학적(epiphysiologic) 맵핑 절차, 근전도검사 절차, 전기진단학적 절차 등)의 뒷받침의 존재 또는 부재하에 각종 해부학적 접근 장치, 각종 투여 장치 및 각종 해부학적 접근법을 사용하여 각 경우에 임상적으로 보장된/표시된 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 세포는 말초 혈관 접근(예: 정맥내 배치, 말초 정맥 접근 장치 등) 또는 중심 혈관 접근(예: 중심 정맥 카테터/장치, 동맥 접근 장치/접근법 등)을 통해 전신 투여될 수 있다. 세포는 세포의 혈관 덩어리를 의도된 부위로 전달할 수 있는 카테터-기반 접근법 또는 기타 혈관 접근 장치(예: 심장 카테터법 등)를 사용하여 의도된 조직 부위의 해부학적 공급 혈관으로 정맥내 전달할 수 있다. 세포는 척추관내로 및/또는 뇌실내로(즉, 수막강내로, 뇌척수액 및/또는 뇌실 내에 분포되도록 지주막하 공간으로) 도입될 수 있다. 세포는 카테터-기반 접근법 또는 직접 주사(예를 들면, 복강내, 흉강내, 심막내, 혈관내(예를 들면, 방광내로, 담낭내로, 골수내로, 담도계(담관 및 췌관 망을 포함)내로, 요도내로, 신우/요관내 접근을 통해, 질내로 등))에 의해 체강 또는 해부학적 구획으로 직접 투여될 수 있다. 세포는 혈관내 접근법(예: 심내막심근　주사) 또는 경피 접근법을 사용하여 또는 조직에의 수술적 노출/접근법을 통해 또는 복강경/흉강경/내시경/대장내시경 접근법을 통해 직접적 국소 조직 주사에 의해 도입될 수 있거나 해부학적으로 접근가능한 조직 부위로 직접 및/또는 영상화 기술(예를 들면, 관절내,　척추 디스크 및 기타 연골 내로, 골 내로, 근육 내로, 피부 내로, 연결 조직 내로, 및 중추신경계, 말초신경계, 심장, 간, 신장, 비장 등과 같은 관련 조직/기관 내로)의 유도하에 도입될 수 있다.　 세포는 또한 관련 조직 표면/부위로 직접 배치될 수도 있다(예를 들면, 조직으로 직접, 궤양, 화상　표면, 장막 또는 점막 표면, 심외막 등에 배치). 세포는 또한 조직 또는 구조 지지 장치(예를 들면, 조직 스캐폴드 장치 및/또는　조직 등에 배치된 스캐폴드내에 매립됨) 내로 투여될 수 있고/있거나 겔 중에서 투여될 수 있고/있거나 증진제(예를 들면, 지지 세포, 사이토킨, 성장 인자, 레솔빈(resolvin), 소염제 등과 혼합된)와 함께 투여될 수 있다.
세포 집단은 대상체의 하나 이상의 조직 내의 혈관 내피에서의 E-셀렉틴의 유도된 발현(및 바람직하게는 유도된 발현의 개시와 일치하게) 기간 동안(즉, 유도된 발현과 일치하게) 대상체에게 투여된다. 투여된 세포의 표면에서의 E-셀렉틴 리간드의 강화된 발현은 혈관재형성, 숙주 방어(예를 들면, 감염 또는 암에 대항하는 방어) 및/또는 조직 복구/재생에 도움이 되고/되거나 염증을 약화시키고/시키거나 염증을 예방할 수 있는 면역조절 과정을 매개할 것이다. E-셀렉틴에 대한 리간드의 발현은 염증 부위의 내피 세포에서 발현된 혈관 E-셀렉틴에 대한 혈액 유래의 세포의 결합을 매개함으로써 혈관내 투여된 세포의 염증 부위로의 전달을 인도한다. 게다가, 세포가 전신, 혈관내, 척추관내로 및/또는 뇌실내로(즉, 수막강내로, 뇌척수액 내에 분포되도록 지주막하 공간으로), 체강 또는 구획으로 직접, 직접적 국소 조직 주사에 의해 또는 관련 조직 표면/부위로 배침됨으로써 투여되는지 관계없이, 투여된 세포상의 E-셀렉틴 및/또는 L-셀렉틴에 대한 리간드의 발현은, 표적 조직 내의 각각 E-셀렉틴(즉, 내피 세포) 및/또는 L-셀렉틴(즉, 백혈구)을 보유한 세포와 동격으로, 이환된 조직 환경 내의 세포 정착을 촉진한다. 따라서, 표적 조직 내의 투여된 세포의 공간적 분포 및 국소화는 투여된 세포상의 E-셀렉틴 및/또는 L-셀렉틴 리간드 발현에 의해 조정된다.
특히, 염증 부위에서의 목적하는 세포 유형의 콜로니화는, 투여된 세포가 E-셀렉틴에 대한 증대된 결합을 갖도록 하는 투여된 세포에서의 세포 표면 E-셀렉틴 리간드의 강화된 발현의 결과로서 일어나고, 이로써 이환된 부위로 직접 주사될 경우에 목적하는 세포의 전신 전달 및/또는 세포의 정착이 촉진된다. 예를 들면, E-셀렉틴 리간드(예: HCELL, CD43-E, CLA/PSLG-1, ESL-1, NCAM-E 등)의 강화된 발현은 유리하게 직접 주사된 세포를 염증, 조직 손상 또는 암 부위의 E-셀렉틴-발현 혈관 내에 고정(anchoring)시킬 수 있다. 따라서, 본 방법은, 예를 들면, 조직-수복성 줄기세포를 전달하는 능력, 면역조절성 세포(예: 중간엽 줄기세포, T-조절 세포, NK-세포, 수지상 세포 등)를 전달하는 능력 및 조장된 염증 과정 또는 암을 퇴치하는 면역 이펙터 세포를 전달하는 능력(예를 들면, 감염 또는 악성종양의 경우, 각각 병원체-특이적 면역 이펙터 T 세포 암-특이적 세포독성 T 세포 또는 NK 세포의 전달)을 포함하여, 염증, 조직 손상 또는 암 부위에서의 또는 이러한 부위로의 관련 세포 전달의 효율을 증대시키고; 이러한 면역학적 세포(조절 T-세포, NK 세포, 세포독성 T-세포, 수지상 세포 등)는 항원-펄스(pulse), 종양 세포-펄스, 바이러스-펄스될 수 있고 항원 특이성을 생성하는 기타 수단에 의해 펄스될 수 있다. 마찬가지로, L-셀렉틴 리간드(예: HCELL, PSGL-1 등)의 강화된 발현은 유리하게 직접 주사된 세포를 염증, 조직 손상 또는 암 부위의 L-셀렉틴-발현 침윤 부위 내에 고정시킬 수 있다.
세포 표면에서의 증진된 E-셀렉틴 리간드 발현은 E-셀렉틴이 발현되는 임의의 부위로의 세포의 혈관 귀소를 구동할 것이다. 다양한 실시형태에서, 세포 집단은 조혈 세포 E-/L-셀렉틴 리간드(HCELL) 및/또는 신경세포 부착 분자 E-셀렉틴 리간드(NCAM-E)를 발현한다. 세포에 의해 발현될 수 있는 기타 E-셀렉틴 리간드는, 예를 들면, CD43-E, ESL-1, PSGL-1 및 PSGL-1의 CLA 당형태를 포함한다 . 예를 들면, CD44는 편재하여 발현되는 세포 막 단백질이며 "성체" 및 배아형 둘 다의 줄기/기원 세포 집단상에 제시되기 때문에, 생체외 글리칸 조작에 의해 상기 단백질의 글리코실화를 변형시켜 HCELL(CD44 당형태) 표현형을 생성시키는 능력은 생체내에서 주사된(예를 들면, 혈관내로)(입양 전달됨) 세포의 골수 또는 E-셀렉틴이 발현되는 임의의 조직/기관 부위로의 이동을 구동할 것이다. 따라서, 변형된 세포를 치료 환경에서 사용하여, 몇가지 병태를 열거하면, 예를 들면, 골 질환, 면역 질환, 감염성 질환 및 암 치료법을 포함하는 다양한 생리학적 및 병리학적 과정들에서 표적화된 세포 이동을 달성할 수 있다.
또한, 연관된 염증을 갖는 질환, 장애 또는 의학적 병태를 대상체에서 세포 집단의 분화의 부재하에서도 본 발명의 방법을 사용하여 치료할 수 있는 것다는 것이 발견되었다. 즉, 관련된 조직의 유형에 관계없이, 투여된 세포의 지속적 생착 및/또는 재증식이 없이도 염증 부위에서의 투여된 세포의 영양 효과가 있다. 이러한 영양 효과는 혈관재형성(예: VEGF)을 촉진하고 조직 복구(예: TGF-β)를 촉진하고 면역조절성이고(예: IL-10) 조직-체류 전구체(예: SCF, LIF 등)의 성장/증식 및 많은 기타 조직-수복 과정들(예: 세포로의 미토콘드리아 전달)을 자극하는 사이토킨/성장 인자의 방출을 포함한다. 또한, 투여된 세포(예: Tregs, MSC, 수지상 세포 등)는 활성화된 림프구(예를 들면, PDL-1의 발현을 통해)의 직접적 억제를 포함하는 강력한 면역조절 특성을 가질 수 있다.
도 4(A) 내지 4(H)로 예시된 바와 같고 실시예에서 보다 상세히 설명되는 바와 같이, 본래의 세포 유형 집단에 비해서 증진된 E-셀렉틴 및/또는 L-셀렉틴 결합 활성을 갖도록 변형된 세포 집단은 E-셀렉틴-발현 혈관계 부근의 조직을 귀소, 침윤 및 콜로니화시키는 능력이 증가되었다. 또한, 한 실시형태에서, 이러한 세포는 내피 세포상의 E-셀렉틴에 대한 결합을 통해 염증 부위에 정착하거나 염증성 부위 내의 침윤성 백혈구 부위에 정착한다(예를 들면, 도 4(F) 및 4(G) 참조). 추가로, 유익한 효과(예를 들면, 질환의 개선)는, 염증 또는 침윤성 백혈구 부위 내의 투여된 세포 정착 후에, 세포 분화(또는 장기간 생착)의 부재하에서도 염증 부위 또는 침윤성 백혈구 부위로의 비경구 전달 또는 직접 주사에 의해 실현될 수 있다(즉, 일시적 생착만으로도 의도된 생물학적 효과(들)을 전달하기에 충분할 수 있다).
특정 실시형태에서, 하기에서 상세히 논의될, 생존가능 세포 집단에서의 HCELL 발현 강화를 위한 미국 특허 제8,084,236호에 기재된 글리칸-조작 방법은 이러한 세포에서 많은 양의 E-셀렉틴 리간드 발현을 유도하여 염증 부위로의 세포의 혈관 전달을 촉진할 수 있고, 이환된 조직 환경 내의 세포 정착을 촉진할 수 있는 많은 양의 E-셀렉틴 리간드 및 L-셀렉틴 리간드를 유도할 수 있다.
대상체의 치료는 개체에서 연관된 염증을 갖는 질환, 장애 또는 의학적 병태의 임상적 증상을 감소시키거나 제거하거나 개체에서 이러한 질환, 장애 또는 의학적 병태의 임상적 증상의 개시를 지연시키거나 예방하는 것을 말한다. 예를 들면, 치료는 급성 및/또는 만성 염증을 특징으로 하는 병태의 증상을 예를 들면 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 적어도 95% 또는 적어도 100% 감소시키는 것을 의미한다. 급성 및 만성 염증과 연관된 실제 증상들은 널리 공지되어 있으며, 제한 없이 급성 및/또는 만성 염증의 위치, 급성 및/또는 만성 염증의 원인, 급성 및/또는 만성 염증의 중증도 및/또는 급성 및/또는 만성 염증에 의해 영향을 받은 조직 또는 장기를 포함하는 요인들을 고려함으로써 당업계의 숙련가들에 의해 결정될 수 있다. 당업계의 숙련가들은 급성 및/또는 만성 염증의 특정 유형과 연관된 적절한 증상 또는 지표를 알 것이며 개체가 본원에 개시된 바와 같은 치료의 후보인지 여부를 결정하는 방법을 알 것이다.
본원에 기재된 방법에 따라서 치료될 수 있는 대상체는 질환에 감수성일 수 있는 포유동물과 같은 임의의 포유동물(예: 인간)를 포함한다. 예에는, 예를 들면, 인간, 비-인간 영장류, 소, 말, 돼지, 양, 염소, 개, 고양이, 또는 마우스, 래트, 햄스터 또는 기니아 피그와 같은 설치류가 포함된다. 대상체는 연관된 염증을 갖는 질환, 장애 또는 의학적 병태로 진단되었거나 또는 그밖에 그 결과 또는 증상이 급성 및/또는 만성 염증인 질환, 장애 또는 의학적 병태를 갖는 것으로 공지된 대상체일 수 있다. 일부 실시형태에서, 대상체는 연관된 염증을 갖는 질환, 장애 또는 의학적 병태가 발생할 위험에 처한 것으로 진단될 수 있거나 위험에 처한 것으로 공지될 수 있다. 특정 실시형태에서, 대상체는 이 대상체에서의 결과 또는 증상이 급성 및/또는 만성 염증인 공지된 질환, 장애 또는 의학적 병태에 기초하여 치료를 위해 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 대상체는 이 대상체에서 의심되는 연관된 염증을 갖는 질환, 장애 또는 의학적 병태에 기초하여 치료를 위해 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 질환, 장애 또는 의학적 병태는, 생물학적 샘플(예를 들어, 뇨, 객담, 전혈, 혈청, 대변 등 또는 이들의 임의의 조합)에서 돌연변이 또는 기타 이상을 검출함으로써 진단할 수 있다. 따라서, 변형된 세포 집단은, 적어도 부분적으로 대상체로부터 수득된 적어도 하나의 샘플(예를 들어, 생검 샘플 또는 임의의 기타 생물학적 샘플)에서 돌연변이, 증상 또는 기타 이상이 검출된다는 사실에 기초하여 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, (예를 들면) 당뇨병, 다발성 경화증 또는 암은 대상체에서 검출되거나 대상체에 위치하지 않을 수 있지만, 적어도 하나의 생물학적 샘플 중의 당뇨병, 다발성 경화증 또는 암과 연관된 돌연변이, 증상 또는 기타 이상의 존재는 변형된 세포를 본원에 기재된 방법에 따라서 대상체에게 투여하기에 충분한 것일 수 있다. 일부 실시형태에서, 조성물은 당뇨병, 다발성 경화증 또는 암과 같은 질환, 장애 또는 의학적 병태의 발병을 예방하기 위해 투여될 수 있다. 그러나, 일부 실시형태에서, 기존의 질환, 장애 또는 의학적 병태의 존재는 의심되지만 아직 확진되지 않을 수 있고, 본 발명의 조성물은 질환, 장애 또는 의학적 병태의 추가 성장 또는 발달을 예방하기 위해 투여될 수 있다. 투여된 세포는 자가 공급원(즉, 숙주 자신으로부터 유래됨), 동계 공급원(일란성 쌍둥이로부터 유래됨) 또는 동종이계 공급원(유전적으로 동일하지 않은 공여자로부터 유래됨)으로부터 유래될 수 있다.
투여 시기
상기 주지된 바와 같이, 세포 집단은 대상체의 내피 세포에 의한 E-셀렉틴의 유도된 발현과 일치하게(그리고 바람직하게는 유도된 발현의 개시와 일치하게) 또는 이환된 조직 내에서 예상된 증가된 E-셀렉틴 발현 직전에(즉, E-셀렉틴-유도 염증성 자극의 전달 전 또는 이와 일치하는 예방책(예: 방사선 요법)으로서) 또는 혈관 E-셀렉틴 발현의 후속 상향규제를 갖는 병원체 또는 질환 과정에 대한 반응을 예상하고(예를 들면, 감염 인자에의 노출 또는 감염 인자의 내인성 재활성화 후, 자가면역 질환의 명시적 발발 전, 이식편대숙주병(GHVD)의 정교화 전 등) 대상체에게 투여된다. 따라서, 본원에 기재된 치료 방법은, 예를 들면, 대상체(예: 인간 환자)가 염증 또는 예상되는 염증 발발의 하나 이상의 증상을 그의/그녀의 내과의 또는 의료인에게 호소할 때 실행될 수 있다. 당뇨병이 있는 대상체의 경우, 예를 들면, 이러한 초기 증상은 다뇨증, 야뇨증, 체중 감소/증가 및/또는 포만감 상실을 포함할 수 있으며, 이때(및 당뇨병성 케토산증의 발생 전) 대상체에게 본 발명에 따른 변형된 세포가 투여될 수 있다. 다발성 경화증이 있는 대상체의 경우, 예를 들면, 이러한 초기 증상은 일시적 감각 교란(예: 무감각, 저림) 및/또는 속상수축(단일수축) 및/또는 근력 약화 에피소드를 포함할 수 있다.
일반적으로, 변형된 세포의 투여의 시간적 양상은, 예를 들면, 특정 변형된 세포 또는 치료하고자 하는 질환, 장애 또는 의학적 병태(및 관련 염증, 조직 손상 또는 암)의 성질에 의존할 수 있다. 기타 고려사항은 질환, 장애 또는 의학적 병태의 중증도; 특정 세포 또는 세포 단편의 활성 및 이용되는 변형; 이용되는 특정 조성; 대상체의 연령, 체중, 전반적 건강, 성별 및 식이; 투여 시간; 투여 경로 및 배출율; 치료 기간; 치료 용법과 병용하여 또는 동시에 사용되는 약물; 기타 인자들을 포함할 수 있다.
따라서, 변형된 세포의 투여는 단일 사건으로서 또는 치료의 시간 경과에 따라서 일어날 수 있다. 예를 들면, 변형된 세포는 시간마다(예를 들면, 매 시간마다, 2시간마다, 3시간마다, 4시간마다, 5시간마다, 6시간마다 등), 1일 1회, 주 1회, 2주 1회, 2개월 1회 또는 월 1회 투여될 수 있다. 급성 병태의 치료를 위해, 예를 들면, 치료의 시간 경과는 적어도 수시간, 수일 또는 수주일 있다. 특정 병태는 치료를 수일에서 수주, 수개월 또는 수년으로 연장시킬 수 있다. 예를 들면, 치료는 1주, 2주 또는 3주 이상으로(예를 들면, 1개월 내지 수 개월) 연장될 수 있다. 보다 만성인 병태의 경우, 치료는 수주에서 수개월, 수년 이상 또는 이러한 치료가 필요한 환자의 평생까지 연장될 수 있다. 대안으로, 화합물 및 제제는 예방 또는 치료 수단으로서 수주, 수개월, 수년 동안 또는 환자의 평생에 걸쳐서, 매시간마다, 1일 1회, 주 1회, 2주 1회, 2개월 1회 또는 월 1회 투여될 수 있다.
또한, 투여 횟수가 질환, 장애 또는 의학적 병태(및 연관된 염증)의 성질 및 중증도 및/또는 대상체의 질환, 장애 또는 의학적 병태의 병기에 따라서 증가되거나 감소될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 예를 들면, 이러한 요인 및 기타 요인에 따라서, 치료 시작시에는 덜 빈번한 투여가 바람직할 수 있고 말기 또는 거의 말기에는 보다 빈번한 투여가 바람직할 수 있거나 그 반대일 수 있다. 다양한 표적 및 증상을 또한 추적할 수 있으며(예를 들면, 당뇨병 대상체의 인슐린 수준) 투여 및 투여량을 그에 맞춰 조정할 수 있다.
경우에 따라, 세포는 투여 목적을 위해 다중 용량으로 나눌 수 있고; 결과적으로 1회 용량 조성물은 용량을 채우기 위해 이러한 양 또는 이의 약수를 함유할 수 있다.
적응증
본 발명은 E-셀렉틴이 이환된 조직(들)의 내피 바탕에서 발현되고/되거나 L-셀렉틴-발현 백혈구가 이환된 조직(들) 내에 침윤/축적된 질환, 장애 또는 의학적 병태의 치료에 관한 것이다. 상기 논의된 바와 같이, E-셀렉틴 및 L-셀렉틴은 각각 시알릴화된 푸코실화된 탄수화물에 결합하며, 세포 표면상의 이러한 시알로푸코실화된 글리칸 구조체의 강화된 발현은 이러한 셀렉틴들에 대한 결합을 프로그램하는 작용을 한다. 따라서, 본 발명은 투여된 세포상의 E-셀렉틴 리간드 발현을 증대시킴으로써 표적 조직(들)으로의 귀소를 증진시키는 방법을 설명한다; 추가로, 투여된 세포에서의 강력한 E-셀렉틴 및 L-셀렉틴 리간드(HCELL과 같은) 발현을 증진시켜 혈관 내피 세포상의 E-셀렉틴 및/또는 이환된 조직(들) 내의 조직-침윤성 백혈구상의 L-셀렉틴에 대한 부착을 촉진시키는 방법을 설명함에 있어서, 본 발명은 생물학적 효과가 의도되는 관련 조직 미세환경 내의 세포 콜로니화/정착을 증대시키는 수단을 제공한다. 일반적으로, 본원에 설명된 방법은, 면역요법 적용(예를 들면, 암 또는 감염성 질환 적용을 위한 배양-증식된 항원-특이적 T 세포 및/또는 배양-증식된 NK 세포의 투여, 배양-증식된 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포의 투여, 항원-펄스된 수지상 세포의 투여 등), 면역조절/면역억제 치료제 적용(예를 들면, 배양-증식된 조절 T 세포(Treg)의 투여, 항원-자극된 수지상 세포의 투여, 중간엽 줄기세포의 투여, 배양-증식된 NKT 세포의 투여 등) 또는 조직 복구/재생 의약 적용(예를 들면, 조직 재생/복원을 위한 줄기세포 및/또는 기원세포 또는 기타 조직-수복 세포의 사용; 조직 재생/복원을 위한 배양-증식된 줄기세포 및/또는 배양-증식된 기원세포의 사용)이든 상관없이 어떠한 세포-기반 치료 접근법의 결과라도 개선시키는 데 있어서 유용하다. 재생 의약 적용에서의 용도에 있어서, 투여된 세포는, 그 자체가 장기간 생착(수반되는 증식/분화를 가짐)에 의해 표적 조직의 재생에 기여하여 조직-특이적 세포(예를 들면, 혈액 세포 생산을 위한 조혈 줄기세포의 이식에서와 같은)를 생산할 수 있고/있거나, (예를 들면, 상주하는 줄기/기원 세포가 상해 조직(들)을 복구하도록 자극하는 영양 효과의 전달을 통해 및/또는 상해를 촉진하고 복구를 지연시키는 염증 과정을 약화시킴으로써) 장기간 생착 또는 조직-체류 세포로의 분화 없이 조직 복원/수복 효과를 전달할 수 있다. 본원에 기재된 모든 적응들에 대한 모든 적용은 단독으로 또는 증진제(예: 성장 인자, 조직 스캐폴드 등)와 함께 사용될 수 있다.
직접적 조직 상해(예: 화상, 외상, 골절, 골 변형, 욕창 등), 허혈성/혈관 사건들(예: 심근경색, 뇌졸중, 쇼크, 출혈, 응고병증 등), 감염(예: 연조직염, 폐렴, 수막염, 방광염, 패혈증, SIRS 등), 신생물(예: 유방암, 폐암, 전립선암, 신장세포 암, 림프종, 백혈병 등), 면역학적/자가면역 병태(예: 급성 또는 만성 GVHD, 다발성 경화증, 당뇨병, 염증성 장질환(예: 크론병, 궤양성 대장염), 류마티스 관절염, 건선 등), 퇴행성 질환(예: 골다공증, 골관절염, 척추디스크 퇴화, 알츠하이머병, 아테롬성 동맥경화증 등), 선천성/유전성 질환(예: 수포성 표피박리증, 불완전 골형성증, 근위축증, 리소좀 축적병, 헌팅턴병 등), 유해 약물 효과(예: 화학요법 유발성 조직/기관 독성, 방사선요법 독성, 약물 유발성 간염, 약물 유발성 심장 손상 등), 독성 손상(예: 방사선 노출(들), 화학적 노출(들), 알코올성 간염, 알코올성 췌장염, 알코올성 심근병증, 코카인 심근병증 등), 대사 교란(예: 요독성 심낭염, 대사산증 등), 의인성 병태(예: 방사선 유발성 조직 손상, 수술 관련 합병증 등), 및/또는 특발성 과정(예: 근위축성 측삭경화증, 파르소나지-터너 증후군 등)에 의해 개시되는 것들을 포함하나 이에 제한되지 않는, 연관된 염증(예: 급성 및/또는 만성), 조직 상해/손상 또는 신생물성 병태를 갖는 임의의 및 모든 질환, 장애 또는 의학적 병태는 본원에 설명된 방법에 따라서 치료될 수 있다.
본원에 설명된 방법에 따라서 치료될 수 있는 기타 일반적 및 구체적 질환, 장애 또는 의학적 상태는 다음을 포함하나 이에 제한되지 않는다:
급성 백혈병, 예를 들면, 급성 이중표현형 백혈병, 급성 림프구성 백혈병(ALL), 급성 골수성 백혈병(AML) 및 급성 미분화 백혈병;
골수형성이상 증후군, 예를 들면, 아밀로이드증 만성 골수단핵구 백혈병(CMML), 불응성 빈혈(RA), 모세포 과잉을 동반한 불응성 빈혈(RAEB), 변형과 모세포 과잉을 동반한 불응성 빈혈(RAEB-T) 및 고리형 철적모구를 동반한 불응성 빈혈(RARS);
골수증식 장애, 예를 들면, 급성 골수섬유증, 원인불명 골수성 화생(골수섬유증), 본태성 고혈소판증, 만성 골수성 백혈병 및 진성 적혈구증가증;
포식세포 장애, 예를 들면, 체디아크 히가시 증후군, 만성 육아종 질환, 백혈구 부착 결핍증, 미엘로퍼옥시다제 결핍증, 호중구 액틴 결핍증 및 세망 이생성;
리소좀 축적병, 예를 들면, 부신백질이영양증, 알파 만노스축적증, 고세병(Gaucher's Disease), 헌터 증후군(MPS-II), 헐러 증후군(MPS-IH), 크라베병, 마로토-라미 증후군(MPS-VI), 이염성백질디스트로피, 모르쿠오 증후군(MPS-IV), 점액지질증 II(I-세포 질환), 점액 다당류증(MPS), 니만 피크병, 산필리포 증후군(MPS-III), 샤이에 증후군(MPS-IS), 슬라이 증후군, 베타-글루쿠로니다제 결핍증(MPS-VII) 및 월만병;
유전적 적혈구 이상, 예를 들면, 베타 지중해빈혈, 블랙판-다이아몬드 빈혈, 진성 적혈구계 무형성증 및 겸상적혈구병;
유전적 혈소판 이상, 예를 들면, 거핵구증가증/선천성 혈소판감소증, 회색 혈소판 증후군;
고형 장기 악성종양, 예를 들면, 뇌 종양, 유잉 육종, 신경아세포종, 난소암, 신장 세포 암종, 폐암, 유방암, 위암, 식도암, 피부암, 구강 암, 내분비암, 간암, 담도계암, 췌장암, 전립선암 및 고환암;
기타 적용, 예를 들면, 골수 이식, 심장 질환(심근경색), 간 질환, 근육퇴행위축, 알츠하이머병, 파킨슨병, 척수 손상, 척추 디스크 질환/변성, 골 질환, 골절, 뇌졸중, 말초혈관 질환, 두부 외상, 물집 질환, 미토콘드리아 질환, 생체외 및 생체내 증식된 줄기세포 및 기원세포 집단, 시험관내 수정 적용 및 증진, 조혈 구조(Rescue) 상황(강한 화학/방사선), 다양한 조직 공급원으로부터 유래된 줄기세포 및 기원세포, 인간 및 동물에서의 적용 및 사지 재생, 단독의 또는 증진제와 병용된 재건 수술 절차/적응증;
만성 백혈병, 예를 들면, 만성 림프구성 백혈병(CLL), 만성 골수성 백혈병 (CML), 소아 만성 골수성 백혈병(JCML) 및 소아 골수단핵구 백혈병(JMML),
줄기세포 장애, 예를 들면, 재생불량 빈혈(중증), 선천성 혈구감소증, 선천성 이상각화증, 판코니 빈혈 및 발작성 야간 헤모글로빈뇨(PNH);
림프구증식 장애, 예를 들면, 호지킨병, 비호지킨 림프종 및 전림프구성 백혈병;
조직구 장애, 예를 들면, 가족성 적혈구포식성 림프조직구증식증, 혈구포식, 식혈세포성 림프조직구증, 조직구증-X 및 랑게르한스 세포 조직구증;
선천성(유전적) 면역계 장애, 예를 들면, T 세포 및 B 세포의 부재, T 세포의 부재, 정상 B 세포 SCID, 혈관확장성 운동실조증, 무표지 림프구 증후군, 공통 가변성 면역결핍증, 디죠지 증후군, 코스트만 증후군(Kostmann Syndrome), 백혈구 부착 결핍, 오멘 증후군(Omenn's Syndrome), 중증복합면역결핍증(SCID), 아데노신 데아미나제 결핍을 동반한 SCID, 비스코트-알드리치 증후군 및 X-연관 림프증식성 장애;
기타 유전성 장애, 예를 들면, 연골털형성저하증, 세로이드 지방갈색소증, 선천성 적혈구조혈포르피린증, 가족성 지중해열, 글란츠만 혈소판기능저하증, 레슈-니한 증후군, 골화석증 및 잔트호프병;
혈장 세포 장애, 예를 들면, 다발성 골수종, 혈장 세포 백혈병 및 발덴스트롬 마크로글로불린혈증; 및
자가면역 질환, 예를 들면, 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 전신 홍반성 루프스, 피부 경화증, 강직성 척추염, 진성 당뇨병 및 염증성 장질환.
관절 및 골격 질환/병태, 예를 들면, 디스크 변성, 윤활막 질환, 연골 변성, 연골 외상, 연골 파열, 관절, 골절, 골 변형, 골 재건, 불완전 골형성증, 선천성 골 질환/병태, 유전성 골 질환/병태, 골다공증. 골화석증, 저인산증, 대사성 골 질환 등.
물집 질환, 건선, 습진, 수포성 표피박리증, 궤양성 피부 병태, 연조직 변형(수술 후 피부 및 연조직 변형을 포함), 성형수술/재건 수술 적응증 등과 같은 피부/연조직 질환 및 병태.
일반적으로, 연관된 염증 증상은, 제한 없이, 발열, 통증, 부종, 충혈, 홍반, 타박상, 압통, 경직, 부어오름, 오한, 호흡 곤란, 저혈압, 고혈압, 코 막힘, 답답한 머리(stuffy head), 호흡 문제, 체액 저류, 혈액 응고, 식욕 상실, 체중 감소, 다뇨증, 야뇨증, 무뇨증, 호흡장애, 운동시 호흡장애, 근육 약화, 감각 변화, 심박동 증가, 심박동 저하, 부정맥, 다음다갈증, 육아종 형성, 섬유소성, 고름, 비점성 장액 또는 궤양을 포함한다. 급성 및/또는 만성 염증과 연관된 실제 증상은 익히 공지되어 있으며, 제한 없이, 염증의 위치, 염증의 원인, 염증의 중증도, 이환된 조직 또는 장기 및 관련된 장애를 포함는 요인들을 고려함으로써 당업계의 숙련가들에 의해 결정될 수 있다.
급성 및/또는 만성 염증의 구체적인 패턴은, 염증이 상피 표면에서 발생하거나 병원성 세균이 관여하는 경우와 같이, 체내에서 발생하는 특정 상황 동안에 관찰된다. 예를 들면, 육아종성 염증은 제한된 그러나 다양한 수의 질환으로부터 발생한 육아종의 형성으로부터 발생한 염증이며, 결핵, 나병, 유육종증 및 매독을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 화농성 염증은 호중구, 죽은 세포 및 체액으로 이루어진 다량의 고름을 생성하는 염증이다. 스타필로코커스와 같은 화농성 세균에 의한 감염은 이러한 종류의 염증의 특징이다. 장액 염증은 통상 장액 막의 중피 세포에 의해 생산되는 비점성 장액의 방대한 유출물로부터 발생한 염증이지만 혈장으로부터 유래될 수 있다. 피부 물집은 이러한 염증 패턴을 예시한다. 궤양성 염증은 상피 표면으로부터의 조직의 궤사성 손실로부터 발생하고 하부 층을 노출시켜 궤양을 형성하는 염증이다.
급성 및/또는 만성 염증은 다양한 질환 및 장애들의 근간이 되는 장애의 큰 비관련 그룹과 연관될 수 있다. 면역계는 흔히, 비정상 염증을 초래하는 많은 면역계 장애와 함께 2가지 알레르기 반응 모두, 관절염 병태 및 일부 근육병증에서 입증된 급성 및/또는 만성 염증 장애와 관련된다. 급성 및/또는 만성 염증 과정에 병인 근원을 갖는 비-면역 질환은 암, 아테롬성 동맥경화증 및 허혈성 심장병을 포함한다. 증상으로서 급성 및/또는 만성 염증을 나타내는 장애의 비제한적 예는, 제한 없이, 여드름, 위산 역류/속쓰림, 노화 관련 황반 변성(AMD), 알레르기, 알레르기성 비염, 알츠하이머병, 근위축성 측삭경화증, 빈혈, 맹장염, 동맥염, 관절염, 천식, 아테롬성 동맥경화증, 자가면역 장애, 귀두염, 안건염, 세기관지염, 기관지염, 수포성 유사천포창, 화상, 활액낭염, 암, 심장마비, 심장염, 셀리악병, 봉와직염, 자궁경관염, 담관염, 담낭염, 융모양막염, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD)(및/또는 이의 급성 악화), 간경변, 결장염, 울혈성 심부전, 결막염, 약물 유발성 조직 손상(예: 사이클로포스파미드 유발성 방광염), 낭성 섬유증, 방광염, 감기, 누선염, 욕창, 치매, 피부염, 피부근염, 당뇨병, 당뇨병성 신경병증, 당뇨병성 망막병증, 당뇨병성 신장병증, 당뇨병성 궤양, 소화계 질환, 습진, 폐기종, 뇌염, 심내막염, 내분비병증, 자궁내막염, 장염, 소장대장염(enterocolitis), 상과염, 부고환염, 근막염, 섬유근육통, 섬유증, 섬유염, 위염, 위장염, 치은염, 사구체신염, 설염, 심장병, 심장 판막 기능장애, 간염, 화농성 한선염, 헌팅턴병, 고지질혈증성 췌장염, 고혈압, 회장염, 감염, 염증성 장질환, 염증성 심장비대, 염증성 신경병증, 인슐린 내성, 간질성 방광염, 간질성 신염, 홍채염, 허혈, 허혈성 심장병, 각막염, 각결막염, 후두염, 루푸스 신장염, 황반변성, 유방염, 유양돌기염, 수막염, 대사증후군(증후군 X), 편두통, 점막염, 다발성 경화증, 척수염, 심근염, 근염, 신염, 신경세포염, 비알코올성 지방간염, 비만, 제염(omphalitis), 난소염, 고환염, 골연골염, 골연화증, 골척수염, 골다공증, 골염, 이염, 췌장염, 파킨슨병, 이하선염, 골반염증 질환, 심상성 천포창, 심낭염, 복막염, 인두염, 정맥염, 늑막염, 폐렴, 다낭성 신염, 직장항문염, 전립선염, 건선, 치수염, 신우신염, 문맥염, 방사선 유발성 손상, 신부전증, 재관류 손상, 망막염, 류마티스성 발열, 비염, 난관염, 유육종증, 타액선염, 부비강염, 경직결장, 울체피부염, 협착증, 구내염, 뇌졸중, 수술 합병증, 활액막염, 건염(tendonitis), 건병증(tendinosis), 건초염, 혈전정맥염, 갑상선염, 편도염, 외상, 외상성 뇌 손상, 이식 거부, 방광삼각염, 결핵, 종양, 궤양, 요도염, 활액낭염, 포도막염, 질염, 맥관염 및 외음염을 포함한다.
급성 및/또는 만성 염증을 초래하거나 그밖에 유발할 수 있는 질환, 장애 및 외상의 일반적 부류는 유전 질환, 신생물, 직접적 조직 손상, 자가면역 질환, 감염성 질환, 혈관 질환/합병증(예:허혈/재관류 손상), 의인성 원인(예: 약물 유해 효과, 방사선 손상 등) 및 알레르기 소견을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
한 실시형태에서, 급성 및/또는 만성 염증은 조직 염증을 포함한다. 일반적으로, 조직 염증은 특정 조직 또는 기관으로 한정된 급성 및/또는 만성 염증이다. 따라서, 예를 들면, 조직 염증은 피부 염증, 근육 염증, 힘줄 염증, 인대 염증, 골 염증, 연골/관절 염증, 폐 염증, 심장 염증, 간 염증, 담낭 염증, 췌장 염증, 신장 염증, 방광 염증, 치은 염증, 식도 염증, 위 염증, 장 염증, 항문 염증, 직장 염증, 혈관 염증, 질 염증, 자궁 염증, 고환 염증, 음경 염증, 외음부 염증, 뉴런 염증, 구강 염증, 안구 염증, 귀 염증, 뇌 염증, 심실/뇌수막 염증 및/또는 중추신경계 또는 말초신경계 세포/요소들과 관련된 염증을 포함할 수 있다.
다른 실시형태에서, 급성 및/또는 만성 염증은 전신 염증을 포함한다. 관련된 과정이 조직 염증과 동일하지 않을 경우 유사하더라도, 전신 염증은 특정 조직으로 한정되지 않고 오히려 상피, 내피, 신경 조직, 장막 표면 및 기관계를 포함하는 체내의 다수의 부위들과 관련된다. 이것이 감염에 기인하는 경우, 용어 패혈증이 사용될 수 있으며, 용어 세균혈증은 구체적으로 세균성 패혈증에 적용되며 바이러스혈증은 구체적으로 바이러스성 패혈증에 적용된다. 혈관확장 및 기관 기능장애는 패혈성 쇼크 및 사망을 초래할 수 있는 광범위한 감염과 연관된 심각한 문제이다.
다른 실시형태에서, 급성 및/또는 만성 염증은 관절염에 의해 유도된다. 관절염은, 예를 들면, 골관절염, 류마티스 관절염, 소아 특발성 관절염, 강직성 척수염과 같은 척추관절염, 반응성 관절염(라이터 증후군), 건선 관절염, 염증성 장질환과 연관된 장병성 관절염, 휘플병(Whipple disease) 및 베체트병(Behcet disease), 패혈성 관절염, 통풍(또한 통상 통풍성 관절염, 결정 활액막염, 대사 관절염으로서도 언급됨), 가성통풍(피로인산칼슘 침착병) 및 스틸병(Still's disease)을 포함하는 활막의 염증으로 인한 신체 관절의 손상이 관여하는 병태의 그룹을 포함한다. 관절염은 하나의 관절(단일 관절염), 2개 내지 4개의 관절(소수 관절염) 또는 5개 이상의 관절(다발성 관절염)에 영향을 미칠 수 있으며 자가면역 질환 또는 비-자가면역 질환일 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 급성 및/또는 만성 염증은 자가면역 장애에 의해 유도된다. 자가면역 질환은 각 질환의 주요 임상-병리학적 특징에 따라서 광범위하게 전신 및 기관-특이적 자가면역 장애로 나뉠 수 있다. 전신 자가면역 질환은, 예를 들면, 전신 홍반성 루프스(SLE), 쇼그렌 증후군, 피부 경화증, 류마티스 관절염 및 다발근육염을 포함한다. 국소 자가면역 질환은 내분비학적(1형 진성 당뇨병, 하시모토 갑상선염, 애디슨병 등), 피부학적(심상성 천포창), 혈액학적(자가면역 용혈성 빈혈), 신경성(다발성 경화증)일 수 있거나, 사실상 신체 조직의 어떠한 국한된 덩어리와도 관련될 수 있다. 자가면역 장애의 유형은, 제한 없이, 급성 산재성뇌척수염(ADEM), 애디슨병, 알레르기 또는 과민성, 근위축성 측삭경화증(ALS), 항-인지질 항체 증후군(APS), 관절염, 자가면역 용혈 빈혈, 자가면역 간염, 자가면역 내이 질환, 자가면역 췌장염, 수포성 유사천포창, 셀리악병, 샤가스병(Chagas disease), 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD)(이의 급성 악화를 포함), 1형 진성 당뇨병(IDDM), 자궁내막증, 섬유근육통, 굳파스춰 증후군(Goodpasture's syndrome), 그레이브스병(Graves' disease), 길랑-바레 증후군(Guillain-Barre syndrome: GBS), 하시모노 갑상선염, 화농성 한선염, 특발성 혈소판감소성 자반, 염증성 장질환(IBD), 간질성 방광염, 루푸스(원반상 홍반성 루푸스, 약물 유발성 홍반성 루푸스, 루푸스 신장염, 신생아 루푸스, 아급성 피부 홍반 루푸스 및 전신 홍반 루푸스를 포함), 반상경피증, 다발성 경화증(MS), 중증 근무력증, 근육병증, 기면증, 신경근긴장증, 심상성 천포창, 악성 빈혈, 원발성 담즙성 간경변, 재발성 산재성 뇌척수염(다중상 산재성 뇌척수염), 류마티스성 발열, 정신분열증, 피부경화증, 쇼그렌 증후군, 건초염, 맥관염 및 백반증을 포함한다. 하나의 특정 실시형태에서, 급성 및/또는 만성 염증은 대상체의 당뇨병으로부터 초래되거나 그 밖에 이에 의해 유도된다. 다른 특정 실시형태에서, 급성 및/또는 만성 염증은 대상체의 다발성 경화증으로부터 초래되거나 그 밖에 이에 의해 유발된다.
또 다른 실시형태에서, 급성 및/또는 만성 염증은 근육병증에 의해 유도된다. 일반적으로, 근육병증은, 면역계가 근육의 성분을 부적절하게 공격하여 근육내 염증을 초래할 때 유발된다. 근육병증은, 예를 들면, 염증성 근육병증 및 자가면역 근육병증을 포함한다. 근육병증은 피부근염, 봉입체 근염 및 다발근염을 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 급성 및/또는 만성 염증은 맥관염에 의해 유도된다. 맥관염은 백혈구 이동 및 이에 따른 손상으로 인한 림프관, 및 정맥(정맥염), 동맥(동맥염) 및 모세관과 같은 혈관을 포함하는 혈관벽의 염증을 특징으로 하는 장애들의 다양한 그룹이다. 염증은 체내 어느 곳이라도 어떠한 크기의 혈관에라도 영향을 미칠 수 있다. 이는 동맥 및/또는 정맥에 영향을 미칠 수 있다. 염증은 중심성(focal)일 수 있으며, 이는 염증이 혈관내 단일 위치에 영향을 미침을 의미하거나, 염증은 광범위할 수 있으며, 염증 부위가 특정 기관 또는 조직 전체에 걸쳐 산재되어 있거나, 심지어 체내의 하나 이상의 기관에 영향을 미침을 의미한다. 맥관염은, 제한 없이, 버거병(폐쇄성 혈전혈관염), 대뇌 맥관염(중추신경계 맥관염), ANCA-연관 맥관염, 척스트라우스(Churg-Strauss) 동맥염, 한성글로불린혈증, 본태성 한성글로불린혈증성 맥관염, 거대 세포(일시적) 동맥염, 골퍼 맥관염(Golfer's vasculitis), 헤노흐-쇤라인자반병(Henoch-Schonlein purpura), 고민감성 맥관염(알레르기성 맥관염), 가와사키병, 미세 다발동맥염/다발혈관염, 다발 결절 동맥염, 류마티스성 다발성 근육통(PMR), 류마티스성 맥관염, 다카야스 동맥염(Takayasu arteritis), 베게너 육아종증 및 전신 홍반 루푸스(SLE)와 같은 연결 조직 장애에 이차적인 맥관염(SLE), 류마티스 관절염(RA), 재발성 다발 연골염, 베체트병 또는 기타 연결 조직 장애, 바이러스 감염에 이차적인 맥관염을 포함한다.
다른 실시형태에서, 급성 및/또는 만성 염증은 피부 장애에 의해 유도된다. 피부 장애는, 예를 들면, 심상성좌창을 포함하는 여드름, 수포성 유사천포창, 아토피성 피부염 및 급성 및/또는 만성 광선 피부염을 포함하는 피부염, 아토피성 습진, 접촉성 습진, 건조성 습진, 지루성 피부염, 발한 장애, 원판형 습진, 정맥 습진, 피부염, 포진형 피부염, 신경피부염 및 자가습진화와 같은 습진, 및 울체피부염, 당뇨병 피부 합병증, 화농성 한선염, 편평태선, 플라크 건선(plaqure psoriasis), 손톱 건선, 적상 건선(guttate psoriasis), 두피 건선, 역 건선(inverse psoriasis), 농포성 건선, 홍피증 건선(erythrodermis psoriasis) 및 건선 관절염을 포함하는 건선, 주사(rosacea), 및 반상경피증을 포함하는 피부경화증, 궤양을 포함한다.
다른 실시형태에서, 급성 및/또는 만성 염증은 위장 장애에 의해 유도된다. 위장 장애는 자극성 장질환(IBD), 크론병과 같은 염증성 장질환 및 궤양성 직장염, 좌측 결장염, 범결장염(pancolitis) 및 전격 결장염과 같은 궤양성 결장염을 포함한다.
다른 실시형태에서, 급성 및/또는 만성 염증은 심혈관 질환에 의해 유도된다. LDL 콜레스테롤은 동맥 벽 속에 박히게 될 때 면역 반응을 야기할 수 있다. 급성 및/또는 만성 염증은 궁극적으로 동맥에 손상을 입힐 수 있으며, 이는 동맥을 파열시킬 수 있다. 일반적으로, 심혈관 질환은 심장 자체 및/또는 혈관계, 특히 심장으로 들어가고 심장에서 나오는 정맥 및 동맥에 영향을 미치는 다수의 특정 질환들 중 어느 하나이다. 예를 들면, 고혈압, 심내막염, 심근염, 심장 판막 기능장애, 울혈성 심부전, 심근 경색, 당뇨병성 심장 병태, 동맥염, 정맥염, 맥관염과 같은 혈관 염증; 동맥경화증 및 협착증, 염증성 심장비대, 말초 동맥 질환과 같은 동맥 폐색성 질환; 동맥류; 색전증; 박리; 가성동맥류; 혈관 기형; 혈관모반; 혈전증; 혈전성정맥염; 정맥류성 정맥; 뇌졸중을 포함하는 60가지가 넘는 유형의 심혈관 질환이 존재한다. 심장에 영향을 미치는 심혈관 장애의 증상은, 제한 없이, 흉부 통증 또는 흉부 불편함(협심증), 한쪽 또는 양쪽 팔, 좌측 어깨, 목, 턱 또는 등의 통증, 숨가뿜, 현기증, 보다 빠른 심박동, 오심, 비정상적인 심박동, 피로감을 포함한다. 뇌에 영향을 미치는 심혈관 장애의 증상은, 제한 없이, 얼굴, 팔 또는 다리, 특히 신체의 한쪽면의 갑작스러운 무감각 또는 약화, 갑작스러운 혼란 또는 말하기 또는 대화 이해의 곤란, 한쪽 또는 양쪽 눈에서 갑작스러운 시력 곤란; 갑작스러운 현기증, 도보 어려움, 또는 균형 또는 조화의 상실, 원인 불명의 갑작스러운 심각한 두통을 포함한다. 다리, 골반 및/또는 팔에 영향을 미치는 심혈관 장애의 증상은, 제한 없이, 근육의 통증, 아픔 또는 경련인 파행, 및 특히 야간에 다리 또는 발의 냉기 또는 저림을 포함한다.
다른 실시형태에서, 급성 및/또는 만성 염증은 암에 의해 유도된다. 일반적으로, 염증은 종양 주변의 미세환경을 조정하여, 증식, 생존 및 이동에 기여한다. 예를 들면, 섬유소성 염증은 피브린이 혈관을 통과하도록 하는 혈관 투과성의 큰 증가를 초래한다. 암 세포와 같이 적절한 응고촉진성 자극이 존재할 경우, 섬유소성 삼출물이 침착된다. 이는 흔히 장액성 강에서 관찰되며, 여기서 섬유소성 삼출물의 반흔으로의 역전이 혈청 막들 사이에 발생하여 이들의 기능을 제한할 수 있다. 다른 예에서, 암은 NF-κB-구동된 염증성 암과 같은 염증성 암이다.
다른 실시형태에서, 급성 및/또는 만성 염증은 약리학적으로-유도된 염증이다. 주요 비타민 및 무기질의 결핍을 포함하는 특정 약물 또는 외인성 화학적 화합물은 염증에 영향을 미치는 것으로 공지되어 있다. 예를 들면, 비타민 A 결핍증은 염증 반응의 증가를 유발하고, 비타민 C 결핍증은 연결조직 질환을 유발하고, 비타민 D 결핍증은 골다공증을 유도한다. 특정 약리학적 제제는 염증 합병증, 예를 들면, 약물 유발성 간염을 유발할 수 있다. 코카인 및 엑스타시와 같은 특정 비합법적 약물은 염증과 밀접하게 관련된 전사 인자(예를 들면, NF-κB)를 활성화시킴으로써 이의 유해 효과의 일부를 발휘할 수 있다. 방사선 요법은 폐 독성, 화상, 심근염, 점막염, 및 노출부위 및 선량에 의존하는 기타 조직 손상을 유도할 수 있다.
다른 실시형태에서, 급성 및/또는 만성 염증은 감염에 의해 유도된다. 감염성 유기체는 순환계 또는 림프계를 통해 즉각적 조직의 국한을 피할 수 있으며, 여기서 감염성 유기체가 신체의 다른 부분으로 확산될 수 있다. 유기체가 급성 염증의 작용에 의해 방지되지 않을 경우, 이는 근처의 림프관을 통해 림프계로의 접근을 획득할 수 있다. 림프관의 감염은 임파선염으로서 공지되어 있으며, 림프절의 감염은 림프절염으로서 공지되어 있다. 병원체는 순환계로의 림프 배수를 통해 혈류에 대한 접근을 획득할 수 있다. 감염은, 제한 없이, 세균성 방광염, 세균성 뇌염, 유행성 인플루엔자, 바이러스성 뇌염 및 바이러스성 간염(A, B 및 C)을 포함한다.
다른 실시형태에서, 급성 및/또는 만성 염증은 조직 또는 기관 손상에 의해 유도된다. 조직 또는 기관 손상은, 제한 없이, 화상, 열상, 상처, 관통 또는 외상을 포함한다.
다른 실시형태에서, 급성 및/또는 만성 염증은 이식 거부에 의해 유도된다. 이식 거부는, 수용자의 면역계가 이식된 기관 또는 조직을 공격하기 때문에 이식된 기관 또는 조직이 이식 수용자의 신체에 의해 허용되지 않는 경우에 발생한다. 후천성 면역 반응, 이식 거부는 T 세포-매개 면역 기작 및 체액성 면역(항체) 기작 둘 다에 의해 매개된다. 이식 거부는 초급성 거부, 급성 거부 또는 만성 거부로서 분류될 수 있다. 이식된 기관 또는 조직의 급성 및/또는 만성 거부는, 거부가 이식된 조직에 대한 불량하게 이해된 급성 및/또는 만성 염증 및 면역 반응으로 인한 것인 경우이다. 이식 거부로서, 급성 또는 만성 이식편대숙주병(GVHD) 중 어느 것이든 이식편대숙주병(GVHD)이 포함된다. GVHD는 이식된 골수 내의 기능적 면역 세포가 수용자를 "외래"로서 인식하여 면역학적 공격을 시작하는 동종이계 골수 이식의 흔한 합병증이다. 이는 또한 특정 상황하에 수혈시 발생할 수 있다. GVHD는 급성 형태 및 만성 형태로 나뉜다. 급성 및 만성 GVHD는 상이한 면역 세포 서브세트, 상이한 사이토킨 프로파일, 다소 상이한 숙주 표적이 관여하는 것으로 보이며, 치료에 상이하게 반응한다. 또 다른 실시형태에서, 급성 및/또는 만성 염증은 Th1-매개 염증 질환에 의해 유도된다. 잘 기능하는 면역계에서, 면역 반응은 면역 챌린지(challenge)를 다루기에 적합한 잘 조화된 염증촉진성 Th1 반응 및 소염 Th2 반응을 야기해야 한다. 일반적으로 말하면, 염증촉진성 Th1 반응이 개시되면, 신체는 이러한 Th1 반응에 대항하기 위해 Th2 반응에 의해 촉발된 소염 반응에 의존한다. 이러한 대항성 반응은, 예를 들면, 아토피에서 IgE 및 호산구성 반응의 촉진과 연관된 IL-4, IL-5, 및 IL-13 및 또한 소염 반응을 갖는 IL-10과 같은 Th2형 사이토킨의 방출을 포함한다. Th1-매개 염증성 질환에는 급성 및/또는 만성 염증을 초래하는 Th1 세포에 의해 생산되는 과도한 염증촉진성 반응이 관여한다. Th1-매개 질환은 바이러스적으로, 세균적으로 또는 화학적으로(예를 들면 환경적으로) 유도될 수 있다. 예를 들면, Th1-매개 질환을 유발하는 바이러스는 만성 또는 급성 감염을 유발할 수 있으며, 이는 호흡기 장애 또는 인플루엔자를 유발할 수 있다.
다른 실시형태에서, 급성 및/또는 만성 염증은 급성 및/또는 만성 신경성 염증을 포함한다. 급성 및/또는 만성 신경성 염증은 말초 감각 신경 말단(즉, 이들 신경에서 척추로의 정상적 구심성 시그널 전달과는 반대되는 원심성 기능)으로부터 방출된 SP 또는 CGRP와 같은 염증성 분자의 방출을 통해 개시되고/되거나 유지된 염증성 반응을 말한다. 급성 및/또는 만성 신경성 염증은 1차 염증 및 2차 신경성 염증 둘 다를 포함한다. 1차 신경성 염증은 1차 감각 신경 말단(예를 들면, C 및 A-델타 섬유)으로부터의 물질의 방출에 의해 개시되거나 이로부터 생성된 조직 염증(염증성 증상)을 말한다. 2차 신경성 염증은 펩타이드 또는 사이토킨과 같은 염증 매개체의 비-신경원성 공급원(예를 들면, 비만 세포 또는 면역 세포로부터의 것과 같은 혈관 바탕 또는 조직 간질 유래의 혈관외유출)에 의해 개시되고, 감각 신경 말단을 자극하여 신경으로부터 염증 매개체의 방출을 유발하는 조직 염증을 말한다. 급성 및/또는 만성 신경성 염증의 두 형태 모두(1차 및 2차)의 순 효과는 말초 감각 신경 섬유의 감작화에 의해 유지되는 염증성 상태를 갖는 것이다. 생성된 급성 및/또는 만성 신경성 염증의 생리학적 결과는, 예를 들면, 피부 통증(이질 통증, 통각과민증), 관절 통증 및/또는 관절염, 내장 통증 및 기능장애, 폐 기능장애(천식, COPD), 및 방광 기능장애(통증, 과활성 방광)과 같은 것을 야기하는 해당 조직에 의존한다.
투여 경로
E-셀렉틴 및/또는 L-셀렉틴 리간드를 발현하는 세포 집단은 수많은 적합한 투여 경로에 따라서 대상체에게 투여될 수 있다. 예시적 방법은 혈관 주사, 예를 들면 정맥내(i.v.) 주사 또는 대상체의 표적 부위로의 세포의 직접적 이식을 포함할 수 있다.
다른 전달 방법은 기관내 전달, 수막강내 전달, 골내 전달, 폐 전달, 구강(buccal) 전달, 에어로졸 전달, 흡입성 전달 및 경구 전달을 포함할 수 있다. 또 다른 방법은 동맥내 전달, 뇌내 전달, 장내 전달, 심장내 전달, 피하 전달, 근육내 전달, 안와내 전달, 낭내 전달, 척추내 전달, 복강내 전달, 흉골내 전달, 방광내 전달, 림프관내 전달, 강내 전달, 질 전달, 직장 전달, 경요도 전달, 피내 전달, 안구내 전달, 귀 전달, 유방내 전달, 정위(orthotopic) 전달, 기관내 전달, 병변내 전달, 경피 전달, 내시경 전달, 경점막 전달, 설하 전달 및 체표면에 직접적 적용(예를 들면, 피부 표면에 직접 적용)을 포함할 수 있다.
세포는 주사에 의한 도입 또는 대상체로의 이식을 촉진하는 전달 장치 내로 삽입될 수 있다. 이러한 전달 장치는 세포 및 체액을 수용 대상체의 신체로 주사하기 위한 관, 예를 들면, 카테터를 포함할 수 있다. 이러한 전달 장치는 또한 내시경 전달 장치 및 방법을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 튜브는 본 발명의 세포가 목적하는 위치에서 대상체에 도입될 수 있도록 하는 바늘, 예를 들면, 주사기를 추가로 갖는다.
세포는 E-셀렉틴 및/또는 L-셀렉틴 결합 활성을 증진시키는 조작/절차 후에 전달될 수 있거나, 일부 실시형태에서는 냉동보존되고 이어서 대상체에게 투여하기 전에 해동될 수 있다. 세포는 다양한 상이한 형태의 전달을 위해 준비될 수 있다. 예를 들면, 세포는 용액 또는 겔에 현탁될 수 있거나 이러한 전달 장치에 함유되는 경우에 지지 매트릭스에 매립될 수 있다. 세포는 본 발명의 세포가 생존 상태를 유지하는 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제와 혼합될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체 및 희석제는 염수, 수성 완충 용액, 용매 및/또는 분산 매질을 포함한다. 이러한 담체 및 희석제의 사용은 당업계에 익히 공지되어 있다. 용액은 바람직하게는 멸균의 유체이다. 바람직하게는, 용액은 제조 및 저장 조건 하에 안정하고, 예를 들면, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등의 사용을 통해 세균 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용을 방지하도록 보존된다. 용액은 본원에 기재된 바와 같은 세포를 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제 및 필요에 따라 기타 성분들에 혼입시키고 이어서 필터 멸균시킴으로써 제조할 수 있다.
세포 투여를 위한 바늘 또는 관-보조된 장치(예: 카테터-기반) 주사 기술을 통한 혈관내 전달은 또한 전체 혈관계에 걸친 분포 또는 예를 들면 간 또는 신장과 같은 특정 기관 또는 임의의 기타 기관으로의 분포를 달성하기 위해 사용될 수 있다. 이는 혈관계의 비특이적 표적화를 포함한다. 대안으로, 예를 들면, 간문맥과 같은 특정 주사 부위를 선택함으로써 어떠한 기관이라도 표적화할 수 있다. 대안으로, 체내의 임의의 정맥으로의 주사를 전신계적으로 수행할 수 있다. 상기 방법은 고령의 환자들에서 줄기세포 수를 증진시키는 데 유용하다. 또한, 세포는 비어있는 줄기세포 닛치에 정착하거나 새로운 줄기세포를 생성시켜 기관을 재생시킴으로써 기관 기능을 개선시키는 기능을 할 수 있다. 예를 들면, 세포는 혈관계 내의 혈관주위세포 위치를 차지할 수 있다.
일부 실시형태에서, 세포는 세포 응집체(예: 췌장 섬세포), 조직 또는 기관의 부분으로서, 예를 들면, 기관 이식 방법의 부분으로서 대상체에게 도입된다.
세포의 전달은 또한 활발한 혈관신생의 부위를 표적화하기 위해 사용될 수도 있다. 예를 들면, 내피 기원세포 또는 중간엽 줄기세포 또는 기원세포의 전달은 상처 부위에서 혈관신생 반응을 증진시킬 수 있다. 혈관신생의 표적화는 또한 세포를 비히클로서 사용하여 약물을 종양으로 표적화하기 위해 사용될 수도 있다.
변형된 세포 및 이의 생성 방법
적어도 부분적으로는 이의 증가된 귀소 능력 때문에, 특정 E-셀렉틴 및/또는 L-셀렉틴 발현 세포는 본원에 설명된 방법에서 유용하다. 예로써, 세포는, 세포-기반 요법(예를 들면, 골 질환을 위한)에서 MSC의 사용을 위해 또는 본원에 설명된 방법에 따른 재생 치료법 동안 상해된/손상된 조직(들)에서의 기원/줄기 세포의 이동 또는 침윤을 지시하기 위해, 임상 이식에서 HSPC와 같은 줄기세포의 생착을 개선시킬 수 있다.
따라서, 본원에 설명된 방법에서 사용되는 세포는 E-셀렉틴 리간드 및/또는 L-셀렉틴 리간드를 발현한다. 따라서, 예를 들면, 변형 후에 세포는 E-셀렉틴 및/또는 L-셀렉틴에 결합한다. 다양한 실시형태에서, 변형된 세포는 P-셀렉틴에 결합할 수 있다. 하나의 특정 실시형태에서, 변형 후에 세포는 조혈 세포 E-/L-셀렉틴 리간드(HCELL)로서 공지된 시알로푸코실화된 CD44 당형태를 발현한다. 다른 특정 실시형태에서, 변형 후에 세포는 신경세포 부착 분자 E-셀렉틴 리간드(NCAM-E)를 발현한다. 특정 실시형태에서, 변형 후에 세포는 HCELL와 NCAM-E 둘 다를 발현한다. 특정 실시형태에서, 세포는 HCELL 및/또는 CD43-E 및/또는 CLA를 발현한다. 변형 후에 세포는 생체내에서 골수 및/또는 염증 부위로 귀소할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본원에 설명된 방법에서 사용되는 세포는 L-셀렉틴 리간드를 발현한다. 하나의 특정 실시형태에서, 변형 후에 세포는 조혈 세포 E-/L-셀렉틴 리간드(HCELL), 시알로푸코실화된 CD44 당형태로서 공지된 강력한 L-셀렉틴 리간드를 발현한다. 다른 실시형태에서, 세포는 증가된 양의 L-셀렉틴 리간드 HCELL 및/또는 PSGL-1, 또는 E-셀렉틴 리간드 HCELL, CLA, CD43-E, NCAM-E 또는 ESL-1를 발현한다. 이러한 세포는 내피 세포상의 E-셀렉틴에 대한 결합을 통해 또는 염증 부위 내 침윤성 백혈구상에서 발현된 L-셀렉틴에 대한 결합을 통해 염증 부위에 정착할 수 있다.
글리코실트랜스퍼라제를 사용한 살아있는 세포 표면 글리칸의 생체외 맞춤식 조작을 위해, 처리된 세포는 반드시 처리(들) 후에 생존가능 상태를 유지하고 표현형이 보존되어야 한다. 이미, 망간과 같은 이가 금속 보조인자는 α(1,3)-푸코실트랜스퍼라제의 효소 활성을 위해 중요한 것으로 간주되었으며, 이러한 보조인자는 명백히 독성인 수준(예: 10 mM Mn++)에서 사용되었다. 그러나, 현재는 이들 글리코실트랜스퍼라제는 비교적 소량의 이가 금속 보조인자(예: 망간, 마그네슘, 칼슘, 아연, 코발트 또는 니켈과 같은 이가 양이온)의 존재하에 또는 이러한 이가 금속 보조인자의 부재하에서도 효소 활성을 지니는 것으로 공지되어 있다. 게다가, 이들 효소는 그 자체가 세포에 독성일 수 있는 글리세롤과 같은 안정화제의 부재 하에 저장할 수 있다. 미국 특허 제7,875,585호에 기재된 특정 글리코실트랜스퍼라제는 살아있는 세포에서의 글리칸 변형에 특히 유용하며, 그 후에 이 세포 및/또는 이의 입자 또는 단편은 본원에 기재된 치료 방법에서 사용될 수 있다. 줄기세포를 이용한 적용에서, 특징적 계통에 따른 분화가 효소 처리에 의해 영향을 받는지 여부를 분석하는 것도 중요하다.
E-셀렉틴 및/또는 L-셀렉틴에 결합하는 세포를 제조하기 위해 다양한 방법들이 사용될 수 있다.
예를 들면, 미국 특허 제7,875,585호 및 제8,084,236호는 생존가능 세포에서의 세포 표면 글리칸의 생체외 변형을 위한 조성물 및 방법을 제공하며, 여기서 후자는 결국 본원에 기재된 바와 같은 급성 또는 만성 염증의 치료 방법에서 사용될 수 있다. 조성물은 세포 생존력을 유지하도록 특수하게 만들어진 반응 완충액 및 반응 조건에서 적절한 공여 뉴클레오타이드 당과 함께 사용하기 위한 정제된 글리코실트랜스퍼라제 폴리펩타이드 및 생리학적으로 허용되는 용액을 포함한다. 특정의 바람직한 실시형태에서, 생리학적으로 허용되는 용액은 세포 생존력이 약화되지 않을 정도로 이가 금속 보조인자를 함유하지 않거나 실질적으로 함유하지 않는다. 이러한 및 기타 바람직한 실시형태에서, 조성물은 또한, 예를 들면, 글리세롤과 같은 안정화제 화합물을 함유하지 않거나 실질적으로 함유하지 않는다. 글리코실트랜스퍼라제는, 예를 들면, 푸코실트랜스퍼라제, 갈락토실트랜스퍼라제, 시알리트랜스퍼라제 및 N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제를 포함한다. 한 실시형태에서, 푸코실트랜스퍼라제는 알파 1,3 푸코실트랜스퍼라제 III, 알파 1,3 푸코실트랜스퍼라제IV, 알파 1,3 푸코실트랜스퍼라제 V, 알파 1,3 푸코실트랜스퍼라제 VI, 알파 1,3 푸코실트랜스퍼라제 VII 또는 알파 1,3 푸코실트랜스퍼라제 IX와 같은 알파 1,3 푸코실트랜스퍼라제이다. 시알릴트랜스퍼라제는 ST3GalII, ST3GalIV 또는 ST3GalVI일 수 있다.
세포 집단을 하나 이상의 전술한 글리코실트랜스퍼라제 조성물과 접촉시킴으로써 세포의 표면상의 글리칸을 변형시킨다. 세포는 글리코실트랜스퍼라제가 효소 활성을 갖는 조건 하에 적절한 뉴클레오타이드 당 공여체(예: GDP-푸코스, CMP-시알산)와 함께 글리코실트랜스퍼라제 조성물과 접촉된다. 이러한 방법에 따른 글리칸 변형은 처리한 후 24시간 이상째에 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 생존력을 갖는 세포를 생성한다. 한 실시형태에서, 예를 들면, 세포는 처리 후 48시간째에 적어도 70% 생존력을 갖는다. 하나의 이러한 실시형태에서, 예를 들면, 세포는 처리 후 48시간째에 적어도 75% 생존력을 갖는다. 한 실시형태에서, 예를 들면, 세포는 처리 후 48시간째에 적어도 80% 생존력을 갖는다. 또한, 세포의 표현형(글리칸 변형 이외의 것)은 바람직하게는 처리 후에 보존된다. 보존된 표현형에 의해, 세포는 이의 본래의 기능 및/또는 활성을 유지하도록 하고자 한다. 예를 들면, 세포가 줄기세포일 경우, 이는 이의 능력, 즉 특정 줄기세포 유형의 특징일 수 있는 이의 관련 전능(totipotency) 또는 분화만능(pluripotency) 또는 다분화능(multipotency) 또는 단분화능(unipotency)을 유지한다.
본원에 기재된 치료 방법에서 사용하기 위한 세포를 변형시키는 다른 방법은 미국 특허출원 공보 제2013/0040837호에서 찾아볼 수 있다. 상기 공보에 기재된 방법에 따르면, 비-핵산 표적에 특이적으로 결합하는 핵산(예: 압타머(aptamer))은 세포 막에 고정시킬 수 있다. 특정한 단백질에 결합할 수 있는 것과 같은 특정 표적에 대한 압타머를 선택할 수 있다. 따라서, 예를 들면, 세포 표면 수용체/부착 분자(예: E-셀렉틴, L-셀렉틴)에 결합하는 압타머를 세포 표면상에 고정시켜 세포 표적화를 개선시킬 수 있다. 압타머는 (i) 바이오틴 그룹을 세포 표면에 도입하기 위한 설폰화된 바이오티닐-N-하이드록시-석신이미드(NHS-바이오틴)으로의 세포의 처리(트립신 처리 후 현탁액 중에서), (ii) 스트렙타비딘과의 복합체화 및 (iii) 바이오티닐화된 압타머와의 커플링을 포함하는 3단계 변형 과정을 사용하여 세포 표면에 접합시킬 수 있다. 이러한 접근법을 사용함으로써, 카르프(Karp) 등은 US 2013/0040837에서 이러한 공정을 사용할 때 세포당 전형적으로 약 21,000개의 분자가 부착되었고 접합에서 사용되는 압타머 농도를 조정함으로써 세포 표면상의 압타머의 부위 밀도를 쉽게 조율할 수 있었다고 보고하였다.
셀렉틴 결합의 발현은 또한 sLex 또는 sLea 모이어티, 또는 셀렉틴에 결합하는 기타 올리고사카라이드 복합체의 공유 첨가에 의해 유도될 수 있다. 예를 들면, 카르프 등에 의해 US2011/0206740에서 보다 충분히 설명되고 예시된 바와 같이, 바이오틴-스트렙타비딘 접합을 사용하여 시알릴-루이스X 모이어티를 세포 표면상으로 화학적으로 혼입시켰다. 보다 구체적으로는, 세포의 표면에 존재하는 유리 아민 그룹을 바이오티닐-N-하이드록시-석신이미드의 N-하이드록시-석신이미드 그룹과 반응할 수 있도록 하여 세포 표면을 바이오티닐화시켰다. 이러한 단계에 이어서 후속적으로 세포 표면의 바이오틴 모이어티를 스트렙타비딘 분자와 반응시켰다. 바이오틴과 스트렙타비딘 간의 강력한 상호작용은 스트렙타비딘 분자가 세포 표면상에 고정되도록 한다. 그 다음, 스트렙타비딘을 바이오티닐화된 SLeX(시알릴-Lex-PAA-바이오틴)과 반응시켜 SLeX를 세포 표면상에 도입시킨다.
세포 표면의 글리칸 조작에 대한 대안적 접근법에서, 예를 들면, 문헌[Srivastava et al., J. Biol. Chem. 1992, 267:22356-22361]에 의해 설명된 바와 같이, 푸코실트랜스퍼라제가 sLex 또는 sLea 글리칸의 총 조립체를 세포 표면으로 혼입시키는 데 사용된다. 보다 구체적으로, 스리바스타바(Srivastava) 등은 보통 단일 푸코스 잔기의 전달을 위한 공여체로서 GDP-푸코스를 사용하는, 인간 모유로부터 부분적으로 정제된 Le-FucT가 입체적으로 요구가 많은 매우 큰 구조에 의해 C-6에서 치환된 푸코스 잔기도 전달할 것이라고 보고하였다. 따라서, 이러한 집단 세포의 표면상의 E-셀렉틴 리간드 및/또는 L-셀렉틴 리간드의 발현 수준을 본래의 세포 집단에 대한 발현 수준보다 큰 수준으로 증가시키기 위해 푸코실트랜스퍼라제를 사용하여 시알릴-루이스X와 같은 글리칸을 전달할 수 있다.
다른 실시형태에서, 다양한 이작용성 화학적 링커를 사용하여 (예를 들면, 파아지 디스플레이 기술에 의해 생성될 수 있는) sLex 또는 sLea 글리칸, 또는 sLex 또는 sLea의 글리코미메틱, 또는 sLex 또는 sLea의 펩티도미메틱을 공유 부착시킬 수 있다. 마찬가지로, E-셀렉틴 및/또는 L-셀렉틴에 결합하는 mAb 또는 이의 mAb 단편을 세포 표면에 접합시켜 각각 E-셀렉틴 및/또는 L-셀렉틴에 대한 결합을 증진시킬 수 있다.
전술한 것 외에도, E-셀렉틴 리간드 및/또는 L-셀렉틴 리간드를 발현하는 세포 또는 세포들을 변형시키는 임의의 기타 방법이 사용될 수 있다. 이는, 예를 들면, 세포 표면과 리간드, 파아지 디스플레이 생성물 등 간의 공유 및/또는 비-공유 상호작용, 수소 결합 및/또는 반데르발스 힘의 촉진을 포함한다.
일반적으로, 어떠한 유형의 세포라도 변형시켜 본원에 기재된 치료 방법에서 사용할 수 있다. 동물 사용의 경우 세포가 동물 기원의 것이 바람직한 한편, 인간 사용의 경우 세포가 인간 세포인 것이 바람직하다; 각 경우, 자가 세포 공급원이 사용될 수 있거나, 동계의 세포 공급원이 사용될 수 있거나, 동종이계 세포 공급원이 사용될 수 있거나(소정의 세포 집단에서 동종이계 공여 세포들의 조합을 포함), 이종 세포 공급원이 사용될 수 있다. 세포는 1차 세포, 예를 들면, 1차 간세포, 1차 신경 세포, 1차 근모세포, 1차 중간엽 줄기세포, 1차 기원세포일 수 있거나, 확립된 세포주 또는 배양-증식된 세포의 세포(예: T 세포, 수지상 세포 등)일 수 있다. 세포가 세포 분열을 겪어야할 필요는 없다; 최종적으로 분화된 세포가 본원에 기재된 방법에서 사용될 수 있다. 이러한 맥락에서, 세포는 배아 줄기세포, 성체 줄기세포, 유도 분화만능 줄기세포(induced pluripotent stem cell), 혈액 기원세포, 조직 기원세포, 상피, 내피, 신경, 지방, 심장, 골격근, 섬유아세포, 면역 세포(예를 들면, 수지상 세포, 단핵구, 대식세포, 백혈구(예: B-림프구, T-림프구와 같은 림프구, 또는 조절 림프구(CD4+/CD25+/FOXP3+)와 같은 T-림프구의 서브세트, 비접촉(naive) T 세포, 중심 메모리 T 세포, 이펙터 메모리 T 세포, 이펙터 T 세포, NK 세포 등), 간, 비장, 폐, 순환 혈액 세포, 혈소판, 생식 세포, 위장 세포, 신장 세포, 골수 세포, 심장 세포, 내피 세포, 내분비 세포, 피부 세포, 근육 세포, 신경 세포 및 췌장 세포를 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 세포 유형의 것일 수 있다. 세포는 세포주, 줄기세포(예: 중간엽 줄기세포, 조혈 줄기세포, 조직 줄기/기원 세포 (예를 들면, 신경 줄기세포, 위장 줄기세포, 근세포 줄기세포, 심근 기원/줄기 세포, 내피 기원세포 또는 폐 줄기세포), 제대 줄기세포 또는 배아 줄기세포, 또는 뇌, 간, 폐, 장, 위, 지방, 근육, 고환, 자궁, 난소, 피부, 비장, 내분비 기관 및 뼈 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 조직으로부터 단리된 1차 세포일 수 있다.
세포가 시험관내 조건 하에 유지되는 경우, 통상의 조직 배양 조건 및 방법이 사용될 수 있고 당업계의 숙련가들에게 공지되어 있다. 다양한 세포의 단리 및 배양 방법은 당업계의 숙련가들의 지식 안에 있다.
또한, 이종 세포 집단과 동종 세포 집단 둘 다, 본원에 기재된 방법 및 조성물에서 사용하는 것이 고려된다. 또한, 세포의 응집체, 입자에 부착된 또는 입자 내에 봉입된 세포, 하이드로겔과 같은 주사가능한 전달 비히클 내의 세포 및 이식가능한 기재(스캐폴드를 포함)에 부착되었거나 스캐폴드/이식가능한 기재를 보유한 조직 내로 적용된 세포가 본원에 기재된 방법 및 조성물에서 사용하는 것이 고려된다. 게다가, 세포는 조직 증식제/증진제 및/또는 소염제(예: 성장 인자, 사이토킨, 프로스타글란딘, 영양 제제, 레솔빈, NSAIDS, 스테로이드 등)과 함께 사용될 수 있다.
본 발명은 추가로 하기 열거된 실시형태들을 포함한다.
실시형태 1. E-셀렉틴 리간드 및/또는 L-셀렉틴 리간드를 발현하는 세포들의 집단을 대상체에게 투여함을 포함하는, 대상체의 표적 조직으로의 세포 전달을 증진시키고/시키거나 대상체의 표적 조직 내의 조직 콜로니화를 증진시키는 방법으로서, 상기 집단은 본래의 세포 집단의 발현 수준을 초과하는 수준으로 E-셀렉틴 리간드 및/또는 L-셀렉틴 리간드를 발현하고, 상기 세포 투여는 상기 표적 조직 내의 내피 세포상의 E-셀렉틴 발현과 일치하게 및/또는 상기 표적 조직 내의 백혈구 축적과 일치하게 일어나는, 방법.
실시형태 2. E-셀렉틴 리간드 및/또는 L-셀렉틴 리간드를 발현하는 세포들의 집단을 대상체에게 투여함을 포함하는, 대상체에서 염증이 발생한 조직 및/또는 손상된 조직으로서 나타나는 질환, 장애 또는 의학적 병태의 치료 방법으로서, 상기 집단은 본래의 세포 집단의 발현 수준을 초과하는 수준으로 E-셀렉틴 리간드 및/또는 L-셀렉틴 리간드를 발현하고, 상기 세포 투여는 상기 표적 조직 내의 내피 세포상의 E-셀렉틴 발현과 일치하게 및/또는 상기 표적 조직 내의 백혈구 축적과 일치하게 일어나고, 상기 집단은 투여된 본래의 세포 집단에 비해서 증진된, 염증이 발생한 조직 및/또는 손상된 조직 내의 국소화 및/또는 콜로니화를 나타내는, 방법.
실시형태 3. E-셀렉틴 리간드 및/또는 L-셀렉틴 리간드를 발현하는 세포들의 집단을 대상체에게 혈관 전달 및/또는 직접적 조직 주사를 통해(즉, 이환된 조직(들)으로 직접) 및/또는 수막강내로 및/또는 강내로 및/또는 방광내로 및/또는 해부학적 관(담도계, 비뇨기계 등) 내에서 및/또는 조직상으로(즉, 이환된 조직상으로 배치) 투여함을 포함하는, 대상체에서 표적 조직으로의 세포 전달을 개선시키는 방법으로서, 상기 집단은 본래의 세포 집단의 발현 수준을 초과하는 수준으로 E-셀렉틴 리간드 및/또는 L-셀렉틴 리간드를 발현하고, 상기 세포 투여는 상기 표적 조직 내의 내피 세포상의 E-셀렉틴 발현과 일치하게 및/또는 상기 표적 조직 내의 백혈구 축적과 일치하게 일어나고, 상기 투여된 세포 집단은 본래의 세포 집단에 비해서 증진된 귀소, 콜로니화 및 생착 중 하나 이상을 달성하는, 방법.
실시형태 4. E-셀렉틴 리간드 및/또는 L-셀렉틴 리간드를 발현하는 세포 집단을, 대상체의 염증이 발생한 조직 및/또는 손상된 조직에 직접 주사하거나 염증이 발생한 조직 및/또는 손상된 조직상에/내에 배치시킴을 포함하는, 대상체의 염증이 발생한 조직 및/또는 손상된 조직에서의 세포 전달 및 콜로니화를 증진시키는 방법으로서, 상기 집단은 본래의 세포 집단의 발현 수준을 초과하는 수준으로 E-셀렉틴 리간드 및/또는 L-셀렉틴 리간드를 발현하고, 상기 주사/배치는 상기 표적 조직 내의 내피 세포상의 E-셀렉틴 발현과 일치하게 및/또는 상기 표적 조직 내의 백혈구 축적과 일치하게 일어나는, 방법.
실시형태 5. E-셀렉틴 리간드 및/또는 L-셀렉틴 리간드를 발현하는 세포 집단을 대상체의 혈관계를 통해 투여함을 포함하는, 대상체의 표적 조직으로의 세포 전달, 콜로니화 및/또는 생착을 증진시키는 방법으로서, 상기 집단은 본래의 세포 집단의 발현 수준을 초과하는 수준으로 E-셀렉틴 리간드 및/또는 L-셀렉틴 리간드를 발현하고, 상기 투여는 상기 표적 조직 내의 내피 세포상의 E-셀렉틴 발현과 일치하게 및/또는 상기 표적 조직 내의 백혈구 축적과 일치하게 일어나는, 방법.
실시형태 6. E-셀렉틴 리간드 및/또는 L-셀렉틴 리간드를 발현하는 세포 집단을 표적 조직에 직접 주사하거나 표적 조직 상에 배치시킴을 포함하는, 대상체의 표적 조직 내의 세포 집단의 정착(lodgement), 콜로니화 및/또는 생착을 증진시키는 방법으로서, 상기 집단은 본래의 세포 집단의 발현 수준을 초과하는 수준으로 E-셀렉틴 리간드 및/또는 L-셀렉틴 리간드를 발현하고, 상기 주사는 표적 조직 내의 내피 세포상의 E-셀렉틴 발현과 일치하게 및/또는 표적 조직 내의 백혈구 축적과 일치하게 일어나고, 상기 집단은 본래의 세포 집단에 비해서 증진된 표적 조직 콜로니화를 달성하는 방법.
실시형태 7. E-셀렉틴 리간드 및/또는 L-셀렉틴 리간드를 발현하는 세포들의 집단을 대상체에게 투여함을 포함하는, 대상체에서 염증이 발생한 조직 및/또는 손상된 조직으로서 나타나는 질환, 장애 또는 의학적 병태의 치료 방법으로서, 상기 집단은 세포들의 본래 집단의 발현 수준을 초과하는 수준으로 E-셀렉틴 리간드 및/또는 L-셀렉틴 리간드를 발현하고, 상기 주사는 염증이 발생한 조직 및/또는 손상된 조직 내의 내피 세포상의 E-셀렉틴 발현과 일치하게 및/또는 염증이 발생한 조직 및/또는 손상된 조직 내의 백혈구 축적과 일치하게 일어나는, 방법.
실시형태 8. E-셀렉틴 리간드 및/또는 L-셀렉틴 리간드를 발현하는 세포들의 집단을 대상체에게 투여함을 포함하는, 종양/악성 질환의 치료 방법으로서, 상기 집단은 본래의 세포 집단의 발현 수준을 초과하는 수준으로 E-셀렉틴 리간드 및/또는 L-셀렉틴 리간드를 발현하고, 상기 투여는 종양/악성 세포를 보유하는 조직(들) 내의 내피 세포상의 E-셀렉틴 발현과 일치하게 및/또는 종양/악성 세포를 보유하는 조직(들) 내의 백혈구 축적과 일치하게 일어나는, 방법.
실시형태 9. 대상체에서 염증이 발생한 조직 및/또는 손상된 조직으로서 나타나는 질환, 장애 또는 의학적 병태의 치료용 의약의 제조에서 사용하기 위한 E-셀렉틴 리간드 및/또는 L-셀렉틴 리간드를 발현하는 세포 집단으로서, 상기 치료가 E-셀렉틴 리간드 및/또는 L-셀렉틴 리간드를 발현하는 세포들의 집단을 대상체에게 투여함을 포함하고, 상기 집단이 세포들의 본래 집단의 발현 수준을 초과하는 수준으로 E-셀렉틴 리간드 및/또는 L-셀렉틴 리간드를 발현하고, 상기 치료가 염증이 발생한 조직 및/또는 손상된 조직 내의 내피 세포상의 E-셀렉틴 발현과 일치하게 및/또는 염증이 발생한 조직 및/또는 손상된 조직 내의 백혈구 축적과 일치하게 및/또는 염증이 발생한 조직 및/또는 손상된 조직 내의 백혈구 축적과 일치하게 상기 집단을 투여함을 포함하는, 세포 집단.
실시형태 10. 종양/악성 질환의 치료용 의약의 제조에서 사용하기 위한 E-셀렉틴 리간드 및/또는 L-셀렉틴 리간드를 발현하는 세포 집단으로서, 상기 치료가 E-셀렉틴 리간드 및/또는 L-셀렉틴 리간드를 발현하는 세포들의 집단을 대상체에게 투여함을 포함하고, 상기 집단이 본래의 세포 집단의 발현 수준을 초과하는 수준으로 E-셀렉틴 리간드 및/또는 L-셀렉틴 리간드를 발현하고, 상기 치료가 종양/악성 조직 내의 내피 세포상의 E-셀렉틴 발현과 일치하게 및/또는 종양/악성 조직 내의 백혈구 축적과 일치하게 상기 집단을 투여함을 포함하는, 세포 집단.
실시형태 11. 실시형태 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포 투여가 내피 세포상의 E-셀렉틴 발현 및 표적 조직 내의 E-셀렉틴 보유 백혈구의 침윤과 일치하게 일어나는, 방법 또는 집단.
실시형태 12. 실시형태 1 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 상기 투여/주사가 하나의/상기 염증이 발생한 조직 및/또는 손상된 조직으로의 백혈구 침윤 동안 일어나는, 방법 또는 집단.
실시형태 13. 실시형태 1 내지 12 중 어느 하나에 있어서, 상기 투여된 세포 집단을 하나의/상기 염증이 발생한 조직 및/또는 손상된 조직의 환경에서 생착시킴을 추가로 포함하는 방법 또는 집단.
실시형태 14. 실시형태 1 내지 13 중 어느 하나에 있어서, 면역조절 효과가 하나의/상기 염증이 발생한 조직 및/또는 손상된 조직 내의 세포들의 콜로니화에 의해 달성되는, 방법 또는 집단.
실시형태 15. 실시형태 1 내지 14 중 어느 하나에 있어서, 조직 수복 효과가 하나의/상기 염증이 발생한 조직 및/또는 손상된 조직 내의 투여된 세포들의 콜로니화에 의해 달성되는, 방법 또는 집단.
실시형태 16. 실시형태 1 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 증진된 숙주 방어/면역 반응 효과가 하나의/상기 염증이 발생한 조직 및/또는 손상된 조직 내의 투여된 세포들의 전달 및 콜로니화에 의해 달성되는, 방법 또는 집단.
실시형태 17. 실시형태 1 내지 16 중 어느 하나에 있어서, 항-악성종양 효과가 하나의/상기 종양/악성 조직 부위 내의 투여된 세포들의 콜로니화에 의해 달성되는, 방법 또는 집단.
실시형태 18. 실시형태 1 내지 17 중 어느 하나에 있어서, 상기 투여/주사가 상기 세포 집단의 1회 또는 일련의 주사를 포함하는, 방법 또는 집단.
실시형태 19. 실시형태 1 내지 18 중 어느 하나에 있어서, 상기 투여/주사가 상기 세포 집단의 1일 1회, 주 1회, 2주 1회, 월 1회 또는 년 1회 주사를 포함하는, 방법 또는 집단.
실시형태 20. 실시형태 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 대상체에서 이전 투여/주사의 면역조절 효과가 감소시 1회 이상 추가 투여/주사함을 추가로 포함하는 방법 또는 집단.
실시형태 21. 실시형태 1 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포 집단이 정맥내로 투여/주사되는, 방법 또는 집단.
실시형태 22. 실시형태 1 내지 21 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포 집단이 염증이 발생한 조직 및/또는 손상된 조직으로의 직접 주사에 의해 투여되는, 방법 또는 집단.
실시형태 23. 실시형태 1 내지 21 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포 집단이 상기 염증이 발생한 조직 및/또는 손상된 조직상으로 배치되는, 방법 또는 집단.
실시형태 24. 실시형태 1 내지 21 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포 집단이 하나의/상기 염증이 발생한 조직 및/또는 손상된 조직상으로 배치되는, 방법 또는 집단.
실시형태 25. 실시형태 1 내지 21 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포 집단이 기타 증진제, 소염제 또는 조직 스캐폴드/이식가능한 장치/겔과 병용되어 사용되는, 방법 또는 집단.
실시형태 26. 실시형태 1 내지 25 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포 집단이 E-셀렉틴 리간드 및 L-셀렉틴 리간드를 발현하는, 방법 또는 집단.
실시형태 27. 실시형태 1 내지 26 중 어느 하나에 있어서, E-셀렉틴 리간드 및/또는 L-셀렉틴 리간드가 조혈 세포 E-/L-셀렉틴 리간드(HCELL), 신경세포 부착 분자 E-셀렉틴 리간드(NCAM-E), CD43E, CLA 및 ESL-1 중 하나 이상으로부터 선택되는, 방법 또는 집단.
실시형태 28. 실시형태 1 내지 27 중 어느 하나에 있어서, E-셀렉틴 리간드가 조혈 세포 E-/L-셀렉틴 리간드(HCELL) 및/또는 신경세포 부착 분자 E-셀렉틴 리간드(NCAM-E)인, 방법 또는 집단.
실시형태 29. 실시형태 1 내지 28 중 어느 하나에 있어서, E-셀렉틴 리간드가 HCELL인, 방법 또는 집단.
실시형태 30. 실시형태 1 내지 29 중 어느 하나에 있어서, E-셀렉틴 리간드가 NCAM-E인, 방법 또는 집단.
실시형태 31. 실시형태 1 내지 30 중 어느 하나에 있어서, L-셀렉틴 리간드가 HCELL인, 방법 또는 집단.
실시형태 32. 실시형태 1 내지 31 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포 집단이 상피, 내피, 신경, 지방, 심장, 골격근, 섬유아세포 및 면역 세포(예를 들면, 수지상 세포, 단핵구, 대식세포, 백혈구(예를 들면, NK 세포, B-림프구, T-림프구와 같은 림프구, 또는 조절 림프구(CD4+/CD25+/FOXP3+)와 같은 T-림프구의 서브세트, 세포독성 림프구 등), 간, 비장, 폐, 순환 혈액 세포, 혈소판, 생식 세포, 위장 세포, 신장 세포, 골수 세포, 췌장 세포, 줄기세포(예를 들면, 중간엽 줄기세포, 조혈 줄기세포, 조직 줄기/기원 세포(예를 들면, 신경 줄기세포, 근세포 줄기세포 또는 폐 줄기세포), 제대 줄기세포 또는 배아 줄기세포, 또는 유도 분화만능 줄기세포(induced pluripotent stem cell), 또는 배아 줄기세포 또는 유도 분화만능 줄기세포로부터 유래된 분화된 기원세포, 또는 성체 줄기세포로부터 유래된 분화된 기원세포, 또는 임의의 조직(예를 들면, 뇌, 간, 폐, 장, 위, 지방, 근육, 고환, 자궁, 난소, 피부, 비장, 내분비 기관 및 뼈)로부터 단리된 1차 세포, 또는 배양-증식된 기원세포 집단, 또는 배양-증식된 줄기세포 집단, 또는 배양-증식된 1차 세포 집단 중 하나 이상을 포함하는, 방법 또는 집단.
실시형태 33. 실시형태 1 내지 32 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포 집단이 중간엽 줄기세포, 조혈 줄기세포, 조직 줄기/기원 세포, 제대 줄기세포 또는 배아 줄기세포인, 방법 또는 집단.
실시형태 34. 실시형태 1 내지 33 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포 집단이 백혈구(예를 들면, NK 세포, B-림프구, T-림프구와 같은 림프구, 또는 조절 림프구 (CD4+/CD25+/FOXP3+)와 같은 T-림프구의 서브세트), 세포독성 T 세포 등)인, 방법 또는 집단.
실시형태 35. 실시형태 1 내지 34 중 어느 하나에 있어서, 상기 질환, 장애 또는 의학적 병태가 직접적 조직 상해(예: 화상, 외상, 욕창 등), 허혈성/혈관 사건들(예: 심근경색, 뇌졸중, 쇼크, 출혈, 응고병증 등), 감염(예: 연조직염, 폐렴, 수막염, 패혈증, SIRS 등), 신생물(예: 유방암, 폐암, 전립선암, 림프종, 백혈병 등), 면역학적/자가면역 병태(예: 이식편대숙주병, 다발성 경화증, 당뇨병, 염증성 장질환, 홍반성 루프스, 류마티스 관절염, 건선 등), 퇴행성 질환(예: 골다공증, 골관절염, 알츠하이머병 등), 선천성/유전성 질환(예: 수포성 표피박리증, 불완전 골형성증, 근위축증, 리소좀 축적병, 헌팅턴병 등), 유해 약물 효과(예: 약물 유발성 간염, 약물 유발성 심장 손상 등), 독성 손상(예: 방사선 노출(들), 화학적 노출(들), 알코올성 간염, 알코올성 췌장염, 알코올성 심근병증, 코카인 심근병증 등), 대사 교란(예: 요독성 심낭염, 대사산증 등), 의인성 병태(예: 방사선 유발성 조직 손상, 수술 관련 합병증 등), 및/또는 특발성 과정(예: 근위축성 측삭경화증, 파르소나지-터너 증후군 등) 중 하나 이상인, 방법 또는 집단.
실시형태 36. 실시형태 1 내지 35 중 어느 하나에 있어서, 상기 질환, 장애 또는 의학적 병태가 당뇨병인, 방법 또는 집단.
실시형태 37. 실시형태 1 내지 36 중 어느 하나에 있어서, 상기 질환, 장애 또는 의학적 병태가 다발성 경화증인, 방법 또는 집단.
실시형태 38. 실시형태 1 내지 37 중 어느 하나에 있어서, 상기 대상체가 인간, 비인간 영장류, 마우스, 래트, 개, 고양이, 말 또는 소인, 방법 또는 집단.
실시형태 39. 실시형태 1 내지 38 중 어느 하나에 있어서, 상기 대상체가 인간 환자인, 방법 또는 집단.
실시형태 40. 실시형태 1 내지 39 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포 집단이 E-셀렉틴 및/또는 L-셀렉틴 리간드의 강화된 발현을 갖는 변형된 세포 집단을 형성하도록 처리되고, 상기 세포 집단이 처리 후 24시간째에 적어도 70%의 생존력을 갖는, 방법 또는 집단.
실시형태 41. 실시형태 1 내지 40 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포 집단이 처리 후 24시간째에 적어도 80%의 생존력을 갖는, 방법 또는 집단.
실시형태 42. 실시형태 1 내지 40 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포 집단이 처리 후 48시간째에 적어도 70%의 생존력을 갖는, 방법 또는 집단.
실시형태 43. 실시형태 1 내지 42 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포 집단을 대상체에게 투여시, 상기 세포 집단이 침윤성 백혈구를 포함하는 조직 내에 정착하는, 방법 또는 집단.
실시형태 44. 실시형태 43에 있어서, 상기 투여가 조직으로의 직접 주사 또는 조직상으로의 배치인, 방법 또는 집단.
실시형태 45. 실시형태 43에 있어서, 투여가 혈관 투여인, 방법 또는 집단.
실시형태 46. 실시형태 1 내지 21 또는 25 내지 42 중 어느 하나에 있어서, 상기 집단이 말초 혈관 접근 또는 중심 혈관 접근을 통해 전신 투여되는, 방법 또는 집단.
실시형태 47. 실시형태 1 내지 21 또는 25 내지 42 중 어느 하나에 있어서, 상기 집단이, 카테터-기반 접근법 또는 세포의 혈관 덩어리(vascular bolus)를 의도된 부위로 전달할 수 있는 기타 혈관 접근 장치를 사용하여 의도된 조직 부위의 해부학적 공급 혈관으로 혈관내 투여되는, 방법 또는 집단.
실시형태 48. 실시형태 1 내지 21 또는 25 내지 42 중 어느 하나에 있어서, 상기 집단이 척추관으로의 도입에 의해 및/또는 뇌실내로 투여되는, 방법 또는 집단.
실시형태 49. 실시형태 1 내지 21 또는 25 내지 42 중 어느 하나에 있어서, 상기 집단이 카테터-기반 접근법 또는 직접 주사에 의해 체강으로 직접 투여되는, 방법 또는 집단.
실시형태 50. 실시형태 1 내지 21 또는 25 내지 42 중 어느 하나에 있어서, 상기 집단이 혈관내 접근법 또는 경피 접근법을 사용하는 직접적 국소 조직 주사에 의해 투여되거나 해부학적으로 접근가능한 조직 부위로 직접 투여되고/되거나 영상화 기술의 유도하에 투여되는, 방법 또는 집단.
실시형태 51. 실시형태 1 내지 21 또는 25 내지 42 중 어느 하나에 있어서, 상기 집단이 관련 조직 표면/부위로 직접 배치됨으로써 투여되는, 방법 또는 집단.
실시형태 52. 실시형태 1 내지 21 또는 25 내지 42 중 어느 하나에 있어서, 상기 집단이 스캐폴드 내로 투여되거나 조직 내로 배치된 스캐폴드 내에 매립되고/되거나 겔 중에서 투여되고/되거나 증진제와 함께 투여되는, 방법 또는 집단.
실시형태 53. 실시형태 1 내지 21 또는 25 내지 42 중 어느 하나에 있어서, 상기 집단이 뇌척수액 내로 투여되는, 방법 또는 집단.
본 발명을 상세히 설명하였으나, 첨부된 청구범위에 정의된 개시 범위에서 벗어나지 않고 변형 및 변화가 가능하다는 것이 명백할 것이다. 게다가, 본 발명의 모든 예들은 비제한적 예로서 제공된다는 것이 이해되어야 한다.
실시예
하기 비제한적 실시예는 본 발명을 추가로 예시하기 위해 제공된다. 하기 실시예에 개시된 기술들은 본 발명자들에 의해 본 발명을 실시함에 있어 잘 기능한 것으로 밝혀진 접근법을 대표하고 따라서 이의 실시를 위한 방식의 예들을 구성하는 것으로 간주될 수 있음이 당업계의 숙련가들에 의해 이해되어야 한다. 그러나, 당업계의 숙련가들은, 본원 개시 내용에 비추어 많은 변화들이 개시된 특정 실시형태들에서 이루어질 수 있고 본 발명의 범위에서 벗어나지 않고 동일하거나 또는 유사한 결과를 여전히 얻을 수 있음을 이해해야 한다.
실시예 1: 지방-유래의 중간엽 줄기세포의 알파(1,3)-푸코실트랜스퍼라제 처리는 HCELL의 발현을 강화한다
이전의 연구들은, 골수-유래의 중간엽 줄기세포(MSC)를 α(1,3)-푸코실트랜스퍼라제에 의해 글리칸 조작하여 강력한 E-셀렉틴 및 L-셀렉틴 리간드 HCELL를 생성할 수 있음을 나타냈다(R Sackstein et al, Nature Medicine 14:181-187 (2008)). HCELL 발현이 비-골수 공급원으로부터 유래된 MSC에서 강화될 수 있는지 여부를 측정하기 위해, 본 발명자들은 지방-유래의 중간엽 줄기세포에 미치는 α(1,3)-엑소푸코실화의 효과를 분석하였다. 이를 위해, 지방 조직을 마른 대상체와 비만 대상체 둘 다의 지방흡입 물질로부터 수득하고, 중간엽 줄기세포를 기재된 바와 같이 배양하였다(R Sackstein et al, Nature Medicine 14:181-187 (2008)). 세포들을 정상산소(21% O2) 조건 및 저산소(<5% O2) 조건 둘 다에서 FBS(20% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신를 함유한 DMEM) 또는 인간 혈소판 용해물(5% 인간 혈소판 용해물 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 함유한 DMEM)이 보충된 MSC 배지에서 낮은 밀도(컨플루언스(confluence) <60%)로 성장시켰다. 컨플루언스가 60%에 도달하였을 때 MSC를 계대배양하고 MSC를 계대 3 내지 6에서 수거하였다. 이어서, MSC(20×106/ml)를, 각 경우에 37℃에서 60분 동안 10 mM HEPES, 0.1% 인간 혈청 알부민 및 1 mM GDP-푸코스(Sigma)를 함유한 이가 양이온이 없는 행크스 평형 염용액(Hank's balanced salt solution)(HBSS) 중에서 20 ㎍/ml에서의 푸코실트랜스퍼라제 VII(FTVII; 제조원: R&D Systems, 이가 양이온이 없는 현탁액 중에서) 또는 푸코실트랜스퍼라제 VI(60 mU/ml (R Sackstein et al, Nature Medicine 14:181-187 (2008))로 처리한 반면, 대조군 세포(완충액-처리된)는 FTVII가 없거나 FTVI가 없는 동일한 완충액으로 처리하였다. 세포 생존력을 요오드화 프로피디움 및 아넥신 V 염색을 사용하여 이중 레이저 유세포측정기에 의해 통상적으로 평가하였다. 세포 생존력은 FTVI 또는 FTVII를 이용한 α(1,3)-엑소푸코실화 후 24시간째에 지속적으로 80%를 초과하였다. 도 24 내지 26 참조.
실시예 2: 인간 혈중 백혈구의 알파(1,3)-푸코실트랜스퍼라제 처리는 세포에서 높은 수준 E-셀렉틴 리간드 활성을 유도하고 HCELL의 발현을 강화한다.
목적하는 세포(예를 들면, 줄기세포, 기원세포, 백혈구 등)의 표면에서의 E-셀렉틴 리간드(즉, HCELL 및 기타 E-셀렉틴 리간드)의 강화된 발현은 이환된 조직(들) 내의 내피 세포에서의 혈관 E-셀렉틴 발현을 기초하여, 조직 염증/손상 부위 및 종양/암 침윤물의 부위로 혈관내 이동하는 이러한 세포들의 능력의 증대를 부여할 수 있다. 추가로, 투여된 세포가 내피 세포에서 발현된 E-셀렉틴에의 E-셀렉틴 리간드 부착을 통해 혈관주위 부위에 모일 수 있고 또한 투여된 세포가 염증이 발생한/손상된 또는 암 조직 환경 내의 침윤성 백혈구의 표면에 제시된 L-셀렉틴에 대한 L-셀렉틴 리간드 부착을 통해 고정될 수도 있으므로, 일단 혈관외유출되면, 관련 투여된 세포 표면에서의 HCELL(또는 기타 강화된 E-셀렉틴/ L-셀렉틴 리간드) 발현은 표적 조직 내의 투여된 세포의 콜로니화를 촉진하는 작용을 할 수 있다. 이와 같이, 줄기세포/기원세포 및 특정 백혈구 서브세트(예를 들면, NK 세포, CD4 T 세포, CD8 T 세포, Treg, 단핵구, 수지상 세포 및 과립구뿐만 아니라, 치료 목적을 위해 배양물에서 증식된 관련 백혈구(예: 항원-특이적 T 세포, 증식된 NK 세포, 키메라 항원 수용체 T 세포(CAR T 세포) 등)을 포함)에서의 HCELL 및 기타 E-셀렉틴 리간드 및/또는 L-셀렉틴 리간드의 발현을 강화시키는 것은 입양 세포 치료법(조직 재생/복구를 위해 및/또는 면역을 증대시키거나 면역을 감소시키는 면역요법을 위해)에서 활용될 수 있다. 따라서, 결정적으로, HCELL의 강화된 발현은 혈관내 투여된 세포들이 E-셀렉틴-의존적 내피 상호작용에 의해 표적 부위로 효율적으로 수송되도록 하여 혈액 유래의 세포가 모집되도록 하고 이후 뒤이어 혈관외유출된 세포들이 별개의 조직 미세환경에 대해 E-셀렉틴-매개 및 L-셀렉틴-매개 정착을 할 수 있도록 한다. 게다가, 마찬가지로, 이러한 세포들이 이환된 조직 상해/손상 부위(들) 또는 암 부위로 직접 주사된 경우에도, HCELL 및 기타 E-셀렉틴/L-셀렉틴 리간드의 강화된 발현은 조직 환경 내의 세포의 E-셀렉틴-매개 및 L-셀렉틴-매개 정착/콜로니화를 촉진할 수 있었다.
세포 표면 α(1,3)-엑소푸코실화의 분자 표적 및 백혈구 E-셀렉틴 및 L-셀렉틴 리간드 활성에 미치는 엑소푸코실화의 효과를 분석하기 위해, 시트르산 첨가된 전혈로부터 수득된 1차 인간 말초혈 백혈구에 대한 연구를 수행하였다. 백혈구를 면역자성구슬 분리법(Miltenyi)에 의해 단핵구(CD14+ 세포), CD4+ 림프구, CD8+ 림프구 및 B 세포(CD19+ 세포)로 분리시켰다. 세포를 각 경우에 37℃에서 60분 동안 10 mM HEPES, 0.1% 인간 혈청 알부민 및 1 mM GDP-푸코스(Sigma)를 함유한 이가 양이온이 없는 행크스 평형 염용액(HBSS) 중에서 20 ㎍/ml에서의 푸코실트랜스퍼라제 VII(FTVII; 제조원: R&D Systems, 이가 양이온이 없는 현탁액 중에서) 또는 푸코실트랜스퍼라제 VI(60 mU/ml에서 (R Sackstein et al, Nature Medicine 14:181-187 (2008)))로 처리한 반면, 대조군 세포(완충액-처리된)는 FTVII가 없거나 FTVI가 없는 동일한 완충액으로 처리하였다. 세포 생존력을 요오드화 프로피디움 및 아넥신 V 염색을 사용하여 이중 레이저 유세포측정기에 의해 통상적으로 평가하였다. 세포 생존력은 FTVI 또는 FTVII를 이용한 엑소푸코실화 후 24시간째에 지속적으로 80%를 초과하였다. 도 27(A) 내지 27(C) 및 도 28a 내지 28c 참조.
실시예 3: 인간 수지상 세포의 1차 배양물의 알파(1,3)- 푸코실트랜스퍼라제 처리는 상기 세포에서 높은 수준의 E- 셀렉틴 리간드 활성을 유도하고 HCELL 의 발현을 강화시킨다.
α(1,3)-엑소푸코실화가 인간 수지상 세포의 E-셀렉틴 및 L-셀렉틴 리간드 활성을 조절하는 능력을 평가하기 위해, 항-CD14 코팅된 자기 비이드(Miltenyi Biotech)(CD14-S)를 사용하거나 플라스틱 부착(PA-S)에 의해 인간 말초혈 단핵세포로부터 단핵구를 단리시킨 다음, 표준 프로토콜에 따라서 6일 동안 사이토킨 IL-4 및 GM-CSF와 함께 배양하여 단핵구 유래의 수지상 세포(mo-DC)로의 분화를 유도하였다. 단핵구 순도를 CD14 발현에 대해 유세포측정법으로 평가하고, mo-DC의 분화 및 성숙을 BDCA-1, HLA-DR, CD80 및 CD86(각각 제조원: BD Biosciences)의 발현에 대해 염색하여 평가하였다. 이어서, Mo-DC를 각 경우에 37℃에서 60분 동안 10 mM HEPES, 0.1% 인간 혈청 알부민 및 1 mM GDP-푸코스(Sigma)를 함유한 이가 양이온이 없는 행크스 평형 염용액(HBSS) 중에서 20 ㎍/ml에서의 푸코실트랜스퍼라제 VII(FTVII; 제조원: R&D Systems, 이가 양이온이 없는 현탁액 중에서) 또는 푸코실트랜스퍼라제 VI(60 mU/ml에서 (R Sackstein et al, Nature Medicine 14:181-187 (2008)))로 처리한 반면, 대조군 세포(완충액-처리된)는 FTVII가 없거나 FTVI가 없는 동일한 완충액으로 처리하였다. 세포 생존력을 요오드화 프로피디움 및 아넥신 V 염색을 사용하여 이중 레이저 유세포측정기에 의해 통상적으로 평가하였다. 세포 생존력은 FTVI 또는 FTVII를 이용한 엑소푸코실화 후 24시간째에 지속적으로 80%를 초과하였다. 도 29(A) 내지 29(C) 및 도 30(A) 내지 30(E) 참조.
실시예 4: 인간 조절 T 세포(Treg)의 1차 배양물의 알파(1,3)-푸코실트랜스퍼라제 처리는 상기 세포에서 높은 수준의 E-셀렉틴 리간드 활성을 유도하고 HCELL의 발현을 강화한다; 투여 HCELL+ Treg는 자가 세포에 의해 유도된 이종 GVHD를 억제한다.
면역조절 세포(MSC 및 Treg와 같은)의 염증 부위로의 전달을 증진시키는 능력은 면역학적 질환(예: GVHD, 류마티스 관절염 등) 및 감염(예: 패혈증, 전력 바이러스 감염 등)에서 조직 손상을 감소시키는 입양 세포 치료법의 잠재성을 개선시키는 작용을 할 수 있다. 이를 위해, 본 발명자들은 인간-마우스 GVHD 모델에서 이종 이식편대숙주병을 치료하는 혈관내 투여된 1차 인간 Treg의 능력에 미치는 α(1,3)-엑소푸코실화의 효과를 조사하였다. 이러한 전략이 임상의 조혈 줄기세포 이식과 관련될 수 있으므로(즉, Treg는 공여 조혈/면역 세포 접종물로부터 증식될 수 있고 따라서 공여 Treg를 사용하여, 공여 면역 세포에 의해 유도된 GVHD를 치료할 수 있다), 본 발명자들은 GVHD를 유도한 자가 림프구 공급원으로부터 유래된 Treg의 능력을 평가하고자 하였다. 이를 위해, 건강한 인간 공여자의 전혈을 Ficoll 구배 원심분리하여 말초혈 단핵세포(PBMC)를 수득하였다. CD4-높은/CD127-낮은 T 세포를 음성 선별 자기 면역비이드 시스템(Miltenyi)을 사용하여 단리시키고 IL-2가 보충된 항-CD3/항-CD28 mAb의 존재하에 배양물 중에서 증식하여 CD4+/FoxP3+/CD25+ 세포(Treg)를 생산하였다. 동일한 공여 대상체로부터의 미분별된 PBMC를 NSG 숙주 마우스에게 복강내로 IP(107개 세포/마우스)주사하였다. 주사한지 14일 후(따라서, Treg 증식의 14일째), 증식된 Treg 세포를 모은 다음, 각 경우에 37℃에서 60분 동안 10 mM HEPES, 0.1% 인간 혈청 알부민 및 1 mM GDP-푸코스(Sigma)를 함유한 이가 양이온이 없는 행크스 평형 염용액(HBSS) 중에서 20 ㎍/ml에서의 푸코실트랜스퍼라제 VII(FTVII; 제조원: R&D Systems, 이가 양이온이 없는 현탁액 중에서) 또는 푸코실트랜스퍼라제 VI(60 mU/ml에서 (R Sackstein et al, Nature Medicine 14:181-187 (2008)))로 처리한 반면, 대조군 세포(완충액-처리된)는 FTVII가 없거나 FTVI가 없는 동일한 완충액으로 처리하였다(세포 생존력을 요오드화 프로피디움 및 아넥신 V 염색을 사용하여 이중 레이저 유세포측정기에 의해 통상적으로 평가하였다; 세포 생존력은 FTVI 또는 FTVII를 이용한 엑소푸코실화 후 24시간째에 지속적으로 80%를 초과하였다). 이어서, 마우스에게 완충액-처리된(BT) Treg 또는 엑소푸코실화된 Treg를 2.5×105개 세포/마우스의 용량으로 혈관내 주사하였다. 이어서, 마우스를 임상적으로 추적하고 마우스 체중을 초기 PBMC 주사 후 50일 동안 모니터링하였다. 도면에 도시된 데이터는 인간 Treg의 FTVII 처리가 HCELL를 포함하는 E-셀렉틴 리간드의 발현을 유도함을 보여준다. 엑소푸코실화된 자가 유래의 Treg를 이종 GVHD(자가 PBMC의 이전 투여에 의해 유도됨)를 갖는 마우스에게 주사한 결과, 체중 감소의 역전으로 입증되는 바와 같이 GVHD가 감소된다; 엑소푸코실화된 Treg는 GVHD를 역전시키는데 있어 비푸코실화된 Treg보다 3배 더 강력하다. 도 31 내지 34 참조.
실시예 5: MSC 및 인간 혈중 백혈구의 알파(1,3)-푸코실트랜스퍼라제 처리는 스탬퍼-우드러프(Stamper-Woodruff) 림프구 부착 검정으로 평가되는 바에 따르면 상기 세포들에서 L-셀렉틴 리간드 활성을 유도한다.
스탬퍼 우드러프 림프구 부착 검정은 L-셀렉틴 리간드 활성을 평가하기 위한 통상의 도구이다(R. Sackstein, Immunol. Rev. 230: 140-163 (2009)). 림프절 고 내피 세정맥(lymph node high endothelial venule)에 대한 림프구 결합의 분자적 기초를 평가하기 위해 1970년대에 고안된 상기 검정은, L-셀렉틴-살아있는 림프구의 표면에서 본래 발현되는-이 관련 세포의 표면상에서 발현되는 이의 동족 리간드(들)에 부착하는 능력을 측정한다. 상기 검정은 결합 상호작용에 별개의 생물물리학적 제한을 가하는 회전 전단 조건하에 수행한다: 오직 가장 강력한 L-셀렉틴 리간드(유리에 부착된 세포의 표면에 제시됨)만이 림프구의 회전 현탁액에 제시된 L-셀렉틴의 부착을 지지할 것이다. 사실상, 상기 검정에서 림프구의 L-셀렉틴-매개 결합을 지지하기에 충분히 강력한 유일한 L-셀렉틴 리간드는 HCELL 및 림프절 고 내피 세정맥상에 제시된 "내피" L-셀렉틴 리간드(전체적으로, 이들 L-셀렉틴 리간드는 "어드레신(addressin)"으로서 총칭된다)(R. Sackstein, Immunol. Rev. 230: 140-163 (2009))이다.
α(1,3)-엑소푸코실화에 의해 유도된 L-셀렉틴 리간드 활성의 발현을 평가하기 위해, 스탬퍼-우드러프를 본래의 세포, 완충액-처리된 세포 및 α(1,3)-엑소푸코실화된 세포의 사이토스핀 제제들에서 수행하였다. 간략하게 언급하면, 인간 혈액으로부터 제조된 림프구 현탁액(RPMI 1640 배지 중 107/ml 림프구)를 세포원심분리에 의해 슬라이드상에 배치된 관련 세포의 제제를 함유한 유리 슬라이드상으로 오버레이하였다. 슬라이드를 4℃에서 30분 동안 전단 조건하에 항온배양하기 위해 회전 플랫폼에 위치시켰다. 이어서, 슬라이드를 PBS로 세정하여 비부착 림프구를 제거하고, 3% 글루타르알데히드 중에 고정시키고 메틸 그린-티오닌으로 염색하였다. 슬라이드를 광 현미경에 의해 세포원심분리된 세포에 대한 림프구 부착에 대해 검사하였다. 250X 배율하에 접안렌즈 그리드(ocular grid)를 사용하여 세포원심분리된 세포의 컨플루언트 영역에 부착된 림프구의 수를 계수함으로써 L-셀렉틴 리간드 활성을 측정하였다. 부착된 림프구를 갖는 세포원심분리된 세포를 스코어화하고, 세포원심분리된 세포의 전체 론(lawn) 내의 이러한 세포의 비율을 (하기 표 1의 기호설명에서 제시된 바와 같이) 정량한다.
Figure 112017073330110-pct00001
표 1에 제시된 바와 같이, 본래의 MSC는 L-셀렉틴 결합 활성을 갖지 않지만, MSC의 α(1,3)-엑소푸코실화는 상당한 L-셀렉틴 결합 활성을 유도하고, L-셀렉틴-매개 림프구 결합은 본질적으로 모든 엑소푸코실화된 세포에서 관찰되었다. 인간 CD4 T 세포, 인간 단핵구 및 인간 수지상 세포는 각각 크지 않은 L-셀렉틴 결합 활성을 나타내지만, 이들 세포는 α(1,3)-엑소푸코실화 후에 강력한 L-매개 림프구 부착을 뒷받침한다. 인간 Treg, B 세포 및 CD8 세포는 본래 L-셀렉틴 리간드 활성을 지니지 않지만, 각각의 세포 유형은 α(1,3)-엑소푸코실화에 의해 L-셀렉틴에 결합하도록 유도될 수 있으며, 여기서 엑소푸코실화된 Treg는 L-셀렉틴 부착의 현저한 증가를 나타낸다. 따라서, L-셀렉틴 결합은 α(1,3)-엑소푸코실화 후에 본질적으로 모든 인간 백혈구상에서 증진되고, 특히 L-셀렉틴 리간드 활성은 α(1,3)-엑소푸코실화에 의해 인간 MSC, CD4 T 세포, 단핵구, 수지상 세포 및 Treg에서 현저하게 유도될 수 있다. 각 경우에, 이러한 L-셀렉틴 결합 활성은 강화된 HCELL 발현을 반영하는 것이며, 도 25, 28a 내지 28c, 30(A) 내지 30(E) 및 33에 도시된 sLex/E-Ig에 대한 웨스턴 블롯 데이터 염색으로 나타난 바와 같은 이들 세포에서의 HCELL 발현의 결과에 부합한다.
실시예 6 - 뮤린 MSC에서의 HCELL 발현은 NOD 마우스에서 향췌장성(pancreatotropism)을 허용하며 자가면역 당뇨병의 지속성있는 역전을 부여한다.
서론
고혈당증 조절 약물요법의 상당한 진보에도 불구하고, 1형 당뇨병(T1D)은 여전히 현저한 이환율 및 사망율과 연관되고, 지속적으로 중대한 공중위생 부담을 주어서 획기적인 치료 전략을 요구하고 있다[1, 2]. T1D의 치료에서 유망한 접근법으로서 세포-기반 면역조절 요법이 대두되었다[3]. 중간엽 줄기세포(MSC)는 이의 면역조절 특성, 안정성 프로파일, 용이한 취득 및 강력한 생체외 증식 때문에 T1D를 포함하는 각종 불응성 면역-매개 질환의 치료를 위한 가장 빠르게 성장하는 세포 요법이 되었다[4 내지 7]. NOD 마우스를 사용한 전임상 모델에서, 본 발명자들 및 다른 이들은 전신 투여된 MSC가 자가면역 당뇨병을 감소시키는데 있어 유용성이 있다고 최근에 보고하였다[8 내지 13]. 그러나, 고혈당증의 역전에 있어 MSC 요법의 이득은 일시적이었고, 이는 T1D을 위한 MSC-기반 요법의 효과를 개선하기 위한 전략을 개발해할 절실한 필요성을 강조한다[6].
면역조절 세포 요법의 효능은 주입된 세포가 염증이 발생한 조직으로 이동하는 능력과 밀접하게 관련된다[14, 15]. 일부 기관(예: 심장)의 경우, 이환된 부위로의 세포의 직접(국소) 주사는 생리학적 이득에 필요한 콜로니화를 달성할 수 있다[16]. 그러나, T1D의 치료의 경우, 췌장 실질로의 세포의 직접 주사가 프로테아제 및 생명에 위협적인 상당한 췌장 염증을 유도할 수 있는 기타 효소의 방출을 촉발시킬 수 있기 때문에, 세포 전달의 혈관 경로가 의무적이다. 혈액 유래의 세포의 조직으로의 이동은 표적 조직 내피에서의 일시부착/회전 부착 상호작용에 의해 개시된다. 이들 결합 상호작용의 가장 강력한 매개체는 각각의 리간드에서 발현되는 시알로푸코실화된 글리칸 결정인자에 결합하는 3종의 Ca++-의존적 렉틴(E-, P- 및 L-셀렉틴, 각각 CD62E, CD62P 및 CD62L로서도 공지되어 있음)의 계열인 셀렉틴이다[17]. 중요한 점은, 모든 염증 부위의 미세혈관계 내에서 셀렉틴인 E-셀렉틴이 TNF-α와 같은 염증성 사이토킨에 반응하여 유도적으로 발현된다는 점이다[17,18]. E-셀렉틴은 "시알릴화된 루이스 X"(sLex)로서 공지된 시알로푸코실화된 테트라사카라이드를 원형적으로 제시하는 순환 세포상의 막 당단백질 및/또는 당지질에 결합한다. 그러나, MSC는 천연적으로 E-셀렉틴 리간드를 발현하지 않는다[19]. 이러한 수송의 결함은, 정맥내 투여 후, 염증이 발생한 말초 조직에서의 MSC 생착을 제한하여[17,20] MSC-기반 치료법의 유용성을 제약한다. 따라서, 본 발명자들은 염증이 발생한 췌장으로의 MSC 수송이 세포 표면 글리칸 변형에 의해 허용되어 E-셀렉틴 리간드 발현을 강화할 수 있는지 여부 및 이것이 NOD 마우스의 신규 발병 자가면역 당뇨병에서 MSC 치료 효과(들)에 영향을 줄 수 있는지 여부를 조사하고자 하였다. 본 발명자들의 조사결과들은, 당뇨병 NOD 마우스에서 고혈당증을 역전시키는 뮤린 MSC의 능력을 증진시키는데 있어서 E-셀렉틴 리간드 HCELL의 강화된 발현의 독특하고 중요한 역할을 강조하는, 당뇨병에서의 MSC 효과의 생물학에 대한 새로운 통찰력을 제공한다.
재료 및 방법
마우스
C57BL/6, B6.129(Cg)-Cd44tm1Hbg/J (CD57BL/6 유전적 배경 하의 CD44-/-; CD44-넉아웃(knock out)("CD44-KO")), BALB/c 및 NOD 마우스는 잭슨 래버러토리스(Jackson Laboratories)로부터 구입하고 하버드 의과대학의 동물 관리 및 수용 시설(Harvard Medical School Facilities for Animal Care and Housing)의 병원체 부재 환경에서 수용 및/또는 사육하였다. 마우스 사용을 필요로 하는 실험들은 실험동물운영위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)에 의해 승인되었다.
MSC 배양물
골수 MSC를 이전에 설명된 바와 같이 유도하였다[9, 10]. 간략하게 언급하면, C57BL/6(야생형)로부터 또는 CD44-KO 마우스로부터 단리된 골수 세포를 10% 소태아 혈청(Lonza), 10 ng/ml 섬유아세포 성장 인자(PeproTech), 100 U/ml 페니실린 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신(Gibco)를 함유한 둘베코 변형된 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium)로 이루어진 배양 배지에 플라스크-접종하였다. 계대 4 내지 6의 배양물 중의 MSC를 실험을 위해 사용하였다.
MSC 특징 규명 및 분화
MSC는 세포 표면 마커 Sca1, CD44, CD73, CD45, CD29 및 CD105에 대해 지시된 항-마우스 항체들(모두 eBioscience로부터 입수함)과 함께 관련 이소타입 대조군들을 사용하여 유세포측정법에 의해 특징규명하였다. 재조합 마우스 E-셀렉틴(CD62E)-인간 Fc 키메라는 R&D Systems로부터 구입하였다. MSC를, 이전에 설명된 바와 같이 다양한 중배엽 계통으로의 이의 분화 능력에 대해 시험하였다[21, 22]. 간략하게 언급하면, MSC의 연골세포 분화를 배양 배지에서 아스코르브산(50㎍/ml) 및 TGFβ1(1ng/ml)로 유도하였다. 3주 동안 배양한 후, 플레이트를 PBS로 세척하고 4% 파라포름알데히드로 고정시키고 연골의 광 현미경 가시화를 위해 0.05% 알시안 블루로 염색하였다. 골생성 분화를 배양 배지에서 아스코르브산(50㎍/ml), 나트륨 β-글리세로포스페이트(10mM) 및 덱사메타손(10nM)을 사용하여 유도하였다. 2주 후, 플레이트를 세척하고 4% 파라포름알데히드로 고정시키고 특징적인 칼슘 침착물의 가시화를 위해 2% 알리자린 레드로 염색하였다. 지방생성 분화를 1% 소태아 혈청, 1% 글루타민, 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 F12 배지에서 덱사메타손(100 nM) 및 인슐린(6 ng/ml)을 첨가하여 유도하였다. 세포를 4% 파라포름알데히드 중에 고정시키고 60% 이소프로판올 중의 0.3% 오일 레드 용액으로 염색하여 지질-적재된 액포를 평가하였다.
MSC 엑소푸코실화
현탁액 중의 MSC(200㎕ 반응당 10×106)를 37℃에서 90분 동안 20 mM HEPES, 0.1% 인간 혈청 알부민 및 1 mM GDP-푸코스를 함유하는 Ca2+- 및 Mg2+-비함유 행크스 평형 염용액(HBSS)("FTVI-변형된 MSC")으로 구성된 반응 완충액 중의 60 mU/mL 푸코실트랜스퍼라제 VI(FTVI) 또는 단독의 반응 완충액(비변형 MSC)으로 처리하였다. 처리 후, MSC를 0.2% HSA 및 20 mM HEPES를 함유하는 HBSS로 세척하였다. 세포 생존력을 트리판 블루 배제 및 요오드화프로피디움 염색에 의해 평가하였다(탈착 및 처리 후 24시간째에 지속적으로 85% 초과의 생존력). FTVI 변형을 유세포측정법에 의해 평가하였다. FTVI 효소는 롤랜드 볼게무트(Roland Wohlgemuth) 박사(Sigma Chemical Corporation)에 의해 제공받았다.
웨스턴 블롯 분석
FTVI-변형된 MSC 용해물 및 비변형 MSC 용해물을 완충액 A(150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 20 mg/mL 페닐메틸설포닐 플루오라이드, 0.02% 아지드화나트륨 및 프로테아제 저해제 칵테일 정제(Roche Molecular Biochemicals) 중에서 2% Nonidet P-40(NP-40)와 함께 항온처리하여 제조하였다. 전세포 세포 용해물 또는 면역침전된 단백질의 모든 웨스턴 블롯은 이전에 설명된 바와 같이 7.5% SDS-PAGE 겔상에서 환원 조건 하에 수행하였다[19]. 각 레인의 용해물의 양을 각각의 웨스턴 블롯이 수행된 세포의 수에 대해 정규화하였다. 블롯은 Lumi-Light Western Blotting Substrate(Roche)를 사용하여 화학발광으로 가시화하였다.
유세포측정 및 면역침전 연구
유세포측정법을 이전에 설명된 바와 같이 수행하였다[19]. 보다 상세한 사항에 대해서는 보충적 방법란을 참조한다.
병렬 플레이트 유동 챔버 부착 검정
이전에 설명된 바와 같이 E-셀렉틴 매개 MSC 결합을 자극된 인간 제대정맥 내피 세포(HUVEC)상에서 평가하기 위해 동적 유동 부착 검정을 병렬 플레이트 유동 챔버(250㎛ 채널 깊이×5.0 mm 채널 폭)를 사용하여 수행하였다[19]. 보다 상세한 사항에 대해서는 보충적 방법란을 참조한다.
hGH 바이러스 벡터에 의한 MSC의 형질도입
MSC를 이전에 설명된 바와 같이 hGH 플라스미드 작제물을 함유하는 렌티바이러스로 형질도입시켰다[21]. hGH 수준을 MSC 상청액 및 주사된 동물의 혈청 중에서 효소결합 면역흡착 검정(enzyme-linked immunosorbent assay)(Roche Diagnostics)에 의해 측정하였다.
GFP 바이러스 벡터에 의한 MSC의 형질도입
MSC를 이전에 설명된 바와 같이 GFP(GFP-MSC)를 함유하는 레트로바이러스 플라스미드로 형질도입시켰다[21]. 형질도입된 MSC를 형광 현미경에 의해 GFP의 핵주위 발현에 대해 평가하였다. 귀소를 평가하기 위한 GFP-MSC 이용에 대한 보완적 접근법으로서, MSC(GFP-형질도입되지 않음)를 형광 염료 CFSE로 표지하였다.
면역형광
췌장을 조직 Tek OCT에 포매시키고 냉동시키고 동결절편기로 절편화하였다. 면역형광 영상을 Nikon E-1000 형광 현미경(epifluorescence microscope) (X400 총 배율)을 사용하여 촬영하였다. 구체적 염색에 대한 보다 상세한 사항에 대해서는 보충적 방법란을 참조한다.
미토겐-자극 CD3/CD28 T 세포 증식 검정
항-CD3 및 항-CD28 자극을 사용한 T 세포 증식 검정을 사용하여 MSC의 면역조절 능력에 미치는 FTVI 변형의 효과를 평가하였다. 간략하게 언급하면, 1×105개의 NOD 비장세포를 방사선 조사된(3000 rad) 비변형 및 FTVI-변형된 MSC의 역가측정 농도(5×102 내지 5×104)의 존재하에 10% 소태아 혈청(Gemini Bio-Products), 1% 페니실린 스트렙토마이신(Lonza) 및 1% 글루타민(Lonza)이 보충된 RPMI 배지(Lonza) 중에서 72시간 동안 정제된 마우스 항-CD3e 및 항-CD28(각각 웰당 1㎍; eBioscience)로 자극시켰다. 72시간의 항온배양 기간의 마지막 12시간 동안, 세포를 1μCi의 3중수소 티미딘으로 펄스(pulse)시키고, 림프구 증식(3H-티미딘 혼입)을 섬광계수에 의해 측정하였다. 결과는 삼중 샘플의 평균치로서 보고된다(평균 cpm ± SEM).
NOD 마우스에서 신규 발병 고혈당증 역전의 연구
비변형 MSC 및 FTVI-변형된 MSC(200㎕ 중의 0.5×106개 세포)를 고혈당증(>250 mg 글루코스/dL) 2일차 및 고혈당증 발병 후 7일째 및 30일째에 마취 없이 꼬리 정맥을 통해 암컷 NOD 마우스에게 정맥내 주사하였다. 고혈당에 미치는 MSC 투여의 효과를 평가하기 위해, 꼬리 정맥을 통해 혈액을 채취하고, 이전에 설명된 바와 같이 글루코스를 측정하였다[9, 10].
통계
실험적 검정 및 면역조직학적 실험으로부터의 데이터를 표준 t검정 및 만 휘니(Mann Whitney) 검정을 사용하여 분석하였다. 생존 데이터를 카플란-마이어(Kaplan-Meyer) 분석을 사용하여 평가하였다. 분석을 수행하고 그래프를 작성하기 위해, Prism 소프트웨어(GraphPad Software, Inc., 캘리포니아주 샌 디에고)를 사용하였다. 0.05 미만의 P 값은 유의적인 것으로 간주된다. 데이터는 평균 ± SEM을 나타낸다.
보충적 방법
유세포측정 및 면역침전 연구
바이오티닐화된 mAb HECA452(sLex를 인식하는 항-인간 피부 림프구 항원; 래트 IgM (BioLegend)) 및 항-마우스 CD44 mAb(KM114; 래트 IgG1), 정제된 항-마우스 CD44 mAb(IM7; 래트 IgG2b) 및 피코에리트린(PE)-표지된 스트렙타비딘(모두 BD 파밍겐(BD Pharmingen)으로부터 입수함)를 사용하여 이전에 설명된 바와 같이19 유세포측정법을 수행하였다. 웨스턴 블롯팅을 위해, MSC 용해물을 항-CD44 면역침전 항체(KM114/IM7) 또는 적절한 이소타입 대조군과 함께 항온배양한 다음, 단백질 G-아가로스(Invitrogen)를 사용하여 수거하였다. 면역침전물을 2% NP-40를 함유하는 완충액 A, 1% SDS를 사용하여 광범위하게 세척한 다음, SDS-PAGE에 적용하고 폴리비닐리덴 디플루오라이드 막으로 이전시키고 HECA452 또는 항-마우스 CD44 항체(KM114/IM7)로 면역염색시키고, 이어서 Lumi-Light Western Blotting Substrate(Roche)를 사용하여 화학발광에 의해 가시화하기 위해 적절한 HRP-접합된 2차 항체와 함께 항온배양하였다.
병렬 플레이트 유동 챔버 부착 검정
E-셀렉틴 발현을 상향조절하기 위해 컨플루언트 HUVEC를 6시간 동안 TNF-α(40 ng/ml)로 자극하였다. 야생형(WT) 및 CD44KO MSC를 0.005% 트립신/EDTA를 사용하여 수거하고, 37℃에서 90분 동안 FTVI 변형시키거나 단독의 완충액으로 처리하였다(대조군). 이어서, MSC를 1 mM 염화칼슘, 1 mM 염화마그네슘, 5 mM HEPES 및 1 mg/ml BSA가 보충된 행크스 평형 염용액에 106개 세포/ml로 재현탁시켰다. MSC를 0.5 dynes/cm2에서 HUVEC 단층 위에 관류시킨 다음, 3분 간격으로 1.0, 2.0, 5.0, 10.0, 20.0 및 30.0 dynes/cm2의 전단응력 수준을 가하였다. HUVEC와 상호작용한 MSC(관측시야에서 회전하거나 10초 시간 이내에 관측시야 안으로 회전해 들어가는 세포)를 챔버의 중앙에서, 각각의 전단응력 수준에서 최소 6개의 관측시야에서 관측하였다. 자극된 HUVEC에 대한 E-셀렉틴 결합의 특이성을 평가하기 위한 대조군으로서, FTVI-변형된 MSC를 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae)로부터의 시알리다제(0.1 U/ml;Roche)로 처리하여 sLex로부터 말단 시알산을 절단하고, 또한 부착을 기능-차단 항-인간 E-셀렉틴 mAb(10 ㎍/ml)(BD 파밍게겐)의 존재하에서도 평가하였다.
면역형광
조직을 10㎛ 두께로 크라이오스탯-절편화하고 5분 동안 냉 아세톤 중에서 슬라이드상에 고정시켰다. 건조 후, 절편을 1% BSA으로 차단하고 1차 항체와 함께 밤새 항온배양하였다. 절편을 Tris-완충된 염수(TBS)로 3회 세척하고 2차 항체와 함께 1시간 동안 항온배양하였다. E-셀렉틴(CD62E) 염색을 1차 래트 항-마우스 CD62E(R&D Systems, 1:100) 및 2차 PE-접합된 염소 항-래트 IgG(Southern Biotech, 1:500)를 사용하여 수행하였다. 이소타입-매치된 래트 mAb를 염색 대조군으로서 사용하였다. CD31 염색을 래트 항-마우스 CD31(Biocare, 1:200) 및 2차 PE-접합된 염소 항-래트 IgG(Southern Biotech, 1:500)를 사용하여 수행하였다. CD31 및 E-셀렉틴 공동국소화의 평가를 연속 절편에서 수행하였다. 정제된 기니아 피그 항-인슐린(Dako, 1:5) 및 APC 접합된 당나귀 항-기니아 피그 IgG(H+L)(Jackson Immunoresearch, 1:200)을 사용하여 인슐린 염색을 실시하였다. HECA452 mAb(래트 항-CLA IgM mAb (Biolegend, 1:200)) 및 FITC 접합된 마우스 항-래트 IgM(Biolegend, 1:500)을 사용하여 조직 절편 내에서 FTVI-변형된 MSC를 검출하였다. 절편을 단독의 중첩 배지(mounting media)로 오버레이하거나, 지시가 있을 경우에는 DAPI(Vector Labs)를 함유하는 중첩 배지로 오버레이하고, 커버슬립으로 덮은 다음, 면역형광 현미경으로 가시화하였다.
결과
FTVI-변형된 MSC의 발현 및 기능 분석
당뇨병 내성 스트레인(strain)인 C57BL/6 마우스("야생형") 또는 CD44-KO 마우스(C57BL/6 배경 하의 CD44-/-)로부터의 골수 유래의 MSC는 특징적인 작은 방추 섬유아세포-유사 패턴을 나타냈고 중배엽 세포 유형(도 7)으로 분화될 수 있었다. MSC는 MSC의 특징인 세포 표면 마커를 발현하였다(도 1(A)). MSC는, mAb HECA 452 (기본형 시알로푸코실화된 E-셀렉틴 결합 결정인자(시알릴화된 루이스 X(sLex)와 같은)를 인식함)와의 반응성의 부재 및 E-셀렉틴-Ig 키메라(E-Ig)에 대한 결합의 부재로 나타난 바와 같이, 본래의 E-셀렉틴 리간드를 발현하지 않았다(도 1(B)).
인간 MSC의 이전 연구는, α-(1,3)-푸코실트랜스퍼라제 VI(FTVI)를 사용한 세포 표면 당조작(glycoengineering)(즉, 글리코실트랜스퍼라제-프로그램된 입체치환(Glycosyltransferase-programmed stereosubstitution)(GPS))이, 본래의 막 CD44가 E-셀렉틴에 강력하게 결합하는 CD44의 푸코실화된 시알릴락토사미닐화된 당변이체(glycovariant)인 조혈 세포 E-/L-셀렉틴 리간드(HCELL)로서 공지된 분자로 전환되는 것을 통해 E-셀렉틴 부착을 유도한다는 것을 보여주었다. 세포 표면 엑소푸코실화가 뮤린 MSC상의 E-셀렉틴 리간드 활성을 프로그램할 수 있는가 여부를 결정하기 위해, 세포를 세포 생존력을 보존하도록 최적화된 반응 조건을 사용하여 FTVI로 처리하였다. MSC의 FTVI 변형은 mAb HECA452로의 염색뿐만 아니라 뮤린 E-셀렉틴-Ig 키메라(mE-Ig)와의 결합을 현저하게 유도하였다(도 1(B)). 주목할만하게도, FTVI 변형 전의 MSC의 프로테아제 분해는 mE-Ig 반응성을 현저하게 감소시켰는데, 이는 당지질이 아닌 당단백질이 E-셀렉틴 결합 결정인자의 주요 운반체임을 시사한다(도 1(B)). 마우스 MSC의 엑소푸코실화 후, 전세포 용해물(도 1(C)) 및 면역침전된 CD44(도 1(D))의 웨스턴 블롯은 E-Ig 및 HECA-452에 의해 인식되는 시알로푸코실화로 수식된 주요 막 당단백질이 CD44(약 100 kDa)의 "표준"(즉, 스플라이스 변이체 엑손을 함유하지 않음) 형태였음을 나타냈다. 이들 데이터는 FTVI 변형이 뮤린 MSC 표면 CD44를 HCELL로 전환시킴을 시사한다.
FTVI-변형된 마우스 MSC는 생리학적 전단응력 조건 하에 E-셀렉틴에 대한 결합이 증가되었다.
생리학적 전단응력 조건 하에 E-셀렉틴에 결합하는 FTVI-변형된 마우스 MSC의 능력을 평가하기 위해, 본 발명자들은 비변형 MSC 및 TVI-변형된 MSC 둘 다의 병렬 플레이트 유동 챔버 검정을 수행하였다. 이를 위해, HUVEC 단층을 먼저 TNF-α로 자극하여 E-셀렉틴 발현을 상향조절하였다. 도 2에 도시된 바와 같이, FTVI-변형은 0.5 dynes/cm2 내지 20 dynes/cm2만큼 높은 전단응력 수준에서 MSC가 HUVEC에 부착되도록 할 수 있다. 유동 챔버 연구에서, HUVEC와 기능-차단 E-셀렉틴 mAb와의 항온배양 및 MSC의 시알리다제 처리(sLex 제시를 제거하기 위해)가 각각 FTVI-변형된 MSC의 부착을 비변형 MSC의 수준과 유사한 수준까지 감소시켰으므로, 자극된 HUVEC에 대한 MSC 부착은 E-셀렉틴 수용체/리간드 상호작용에 절대적으로 의존한다(도 2). 전체적으로, 이러한 조사결과들은 뮤린 MSC의 FTVI 변형이 모세혈관후세정맥의 전형적인 수준을 훨씬 능가하는 혈류역학적 전단응력 수준에서 E-셀렉틴 부착을 지속시킬 수 있는 강력한 E-셀렉틴 결합 활성을 유도함을 시사한다[17].
전신 투여된 FTVI-변형된 MSC는 NOD 마우스에서 신규 발병 고혈당증를 강력하게 역전시킨다.
FTVI-변형이 NOD 마우스에서 당뇨병을 조정하는 MSC의 능력에 영향을 주는가 여부를 평가하기 위해, 신규 발병 당뇨병 NOD 마우스에게 세포(미처리된 대조군)를 투여하거나, 고혈당증(글루코스 >250 mg/dL) 2일차에 5×105개 FTVI-변형된 또는 5×105개 비변형 C57BL/6 MSC를 정맥내로(꼬리 정맥을 통해) 투여하고 이어서 고혈당증의 발병 후 7일째 및 30일째에 정맥내 주사하였다. 도 3(A)에 도시된 바와 같이, 미처리된 NOD 마우스는, 고혈당증이 발병한지 수주 이내에 죽은 한마리 동물을 제외하고는, 신속한 혈당 수준 증가를 나타냈다. 자가면역 당뇨병의 일시적 역전(즉, 9마리 마우스 중 3마리는 3주째에 정상혈당이었으며, 9마리 동물 중 2마리는 6주째에 정상혈당이었고, 모든 동물들은 12주까지 고혈당이었다)을 초래한 비변형 MSC의 투여(도 3(B))와 비교하여, FTVI-변형된 MSC의 주입은 강력하고 영구적으로 고혈당증을 역전시켰다(도 3(C)). 두드러지게, 8마리 마우스 중 7마리는 3주 동안 정상혈당이었으며, 8마리 마우스 중 6마리는 6주 동안 정상혈당을 유지하였고, 8마리 마우스 중 5마리는 초기 처리 후 12주 이상 동안 당뇨병이 없었다(도 3(C)). 비변형 MSC 및 혈당 수준이 600 mg/dl 이상이었던 FTVI-변형된 MSC 그룹의 대다수의 마우스가 90일까지 생존한 반면, 비처리 그룹(MSC를 투여받지 않음)에서는 단 한마리(7마리 중)만이 90일 동안 생존하였다.
NOD 마우스의 췌장에서의 E-셀렉틴 발현 및 MSC 국소화
췌장으로의 MSC 수송에 미치는 FTVI-변형의 효과를 검사하기 위해, 본 발명자들은 먼저 면역형광 현미경을 사용하여 14주령 NOD 마우스의 췌장의 미세혈관계 내의 E-셀렉틴의 발현을 평가하였다. 섬세포-주변 미세혈관은 췌도염을 야기하는 염증 세포 수송의 1차 부위인 것으로 보고되어 있다[23, 24]. 당뇨병-내성 마우스의 췌장에는 E-셀렉틴 발현이 없었던 반면(도 4(A)), NOD 마우스의 췌장의 섬세포-주변 미세혈관은 E-셀렉틴을 발현하였으며(도 4(B)), 이는 연속적 절편에서 CD31 염색과 공동국소화되었다(도 4(C) 및 4(D)). T-세포의 당뇨병성 섬세포 가장자리로의 침윤을 당뇨병 발병 동안 NOD 췌장의 CD3 염색에 의해 확인하였다(도 4(E)). NOD 마우스에서 전신 투여된 FTVI-변형된 MSC의 췌장 침윤을 평가하기 위해, 본 발명자들은 췌장의 동결된 절편을 항체 HECA452로 염색하였다. 도 4(F) 및 4(G)에 도시된 바와 같이, HECA452+ MSC는 이식한지 1일 후 E-셀렉틴-발현 미세혈관계의 주변의 섬세포-주변 영역, 콜로니화(E-셀렉틴-발현) 혈관주위 영역 및 T 세포 침윤(L-셀렉틴-발현) 영역에서 관찰되었다. 전신 투여 후 FTVI-변형된 MSC 및 비변형 MSC의 귀소 정도를 평가하기 위해, GFP-형질도입된 FTVI-변형된 MSC 및 비변형 MSC를 NOD 마우스에게 정맥내 주사하고, 이의 췌장, 췌장 림프절, 장간막 림프절 및 비장을 주사 후 4일째에 수거하고, 절편화하고, 형광 현미경에 의해 MSC의 존재에 대해 평가하였다. FTVI-변형된 MSC는 비변형 MSC와 비교해 3배 더 높은 췌장의 침윤을 나타낸 반면에, 당뇨병-내성 BALB/c 마우스에서 주입된 FTVI-변형된 MSC와 비변형 MSC의 췌장 침윤물의 차이는 관찰되지 않았다(도 4(H)). 그러나, 처리된 NOD 마우스의 림프 조직으로의 FTVI-변형된 MSC 및 비변형 MSC의 귀소 정도에 있어 차이는 주지되지 않았다.
엑소푸코실화는 MSC 면역억제 능력 또는 생체내 생존에 효과가 없었다.
본 발명자들은 hGH-형질도입된 MSC에 의해 생산된 인간 성장 호르몬(hGH)을 측정하는 것이 투여된 MSC의 수명을 평가하는 민감한 방법이라는 것을 이전에 보고하였다[21]. 투여된 FTVI-변형된 MSC의 고혈당증의 증진된 역전이 생존 이점의 결과로서 일어난 것인지를 평가하기 위해, 5×105개의 hGH-형질도입된 FTVI-변형된 MSC 및 비변형 MSC를 고혈당증의 발병 후 2일째 및 7일째에 NOD 마우스에게 주사하고, 혈청 hGH를 주사 후 다양한 시점에서 측정하였다. 도 5(A)에 도시된 바와 같이, hGH 생산 패턴의 차이는 없었으며, 이는 FTVI 변형이 생체내 MSC 존속에 영향을 미치지 않았음을 시사한다. 엑소푸코실화가 MSC 면역조절 능력을 변형시키는지 여부를 평가하기 위해, 본 발명자들은 공동배양 T 세포 억제 검정을 수행하였다. T 세포 증식은 FTVI-변형된 MSC 및 비변형 MSC에 의해 동일하게 약화되었으며(도 5(B)), 이는 엑소푸코실화가 MSC에 추가의 면역조절 특성을 제공하지 않음을 시사한다.
MSC CD44 발현의 부재는 FTVI-변형된 MSC의 항-당뇨병 효과를 제거한다.
CD44 발현이 FTVI-변형된 MSC의 증진된 항-당뇨병 효과를 위한 필요조건인지를 검사하기 위해, 본 발명자들은 CD44 KO 마우스(C57BL/6 유전적 배경 하의 CD44-/-)로부터 MSC를 생성시켰다. CD44를 제외하고, CD44 KO 마우스의 골수로부터 생성된 MSC는 동일한 수준의 세포 표면 부착 분자를 나타냈다. 유세포측정에 의하면, 엑소푸코실화된 CD44 KO MSC는 엑소푸코실화된 야생형 MSC의 HECA452-반응성과 동등한 HECA452-반응성을 나타냈으며(도 8), 이는 시알로푸코실화된 결정인자가 대안적(즉, 비-CD44) 스캐폴드에서 생성되었음을 시사한다. CD44 KO MSC의 투여가 항-당뇨병 효과를 부여하였는지 여부를 평가하기 위해, 각각 5×105개 세포의 FTVI-변형된 CD44 KO 및 비변형 CD44 KO, 및 C57BL/6 야생형 MSC를 고혈당증 발병 후 2일째, 7일째 및 30일째에 신규 발병 당뇨병 NOD 마우스에게 주사하였다. 비변형 CD44 KO MSC가 투여된 6마리 마우스 중 5마리 및 FTVI-변형된 CD44 KO MSC가 투여된 7마리 마우스 중 6마리(각각 도 6(A) 및 6(B))에서 자가면역 당뇨병의 역전 실패로 입증되는 바와 같이, 야생형 MSC와 비교해, MSC의 CD44 결핍은 이의 항-당뇨병 효과의 현저한 손상을 초래하였다. NOD 마우스의 주사 후, CFSE-표지된 FTVI-변형된 CD44 KO MSC 및 비변형 CD44 KO MSC는 췌장으로의 수송에서 차이를 나타내지 않았고(도 6(C)), 그 수준들은 야생형 MSC에 대해 관찰된 것과 유사하였다(도 4(H)). MSC 억제 능력은 시험관내에서 MSC CD44 발현의 결여에 의해서도, CD44 KO MSC의 엑소푸코실화에 의해서도 제거되지 않았으며(도 6(D)), 이는 투여된 FTVI-처리된 CD44-/- MSC의 정상혈당 효과의 부재가 고유의 면역조절 결핍에 기인하지 않는다는 것을 제시한다. 주목할만하게도, 엑소푸코실화가 세포 표면 시알로푸코실화의 발현을 CD44 KO MSC상의 HECA452에 의해 인식될 수 있게 만들지만 이러한 세포가 당뇨병 NOD 마우스에서 의도한 생물학적 결과를 실현하지 않는다는 조사결과는, 세포 표면 글리칸 조작에 의해 유발된 강화된 셀렉틴 결합의 생물학적 영향을 정의/예측하는데 있어서- 단지 E-Ig 및 HECA452 면역반응성을 평가하기 위한 단순한 유세포측정 연구를 넘어서- 생화학적 연구들(예를 들면, 웨스턴 블롯 분석)의 중요성을 강조한다.
논의
MSC는 이의 면역조절 특성, 안정성 프로파일 및 생체외에서의 강력한 증식 때문에 T1D를 포함하는 다양한 불응성 면역-매개 질환을 치료하기 위한 몇몇 인간 시험의 중심이 되었다[6]. MSC는 T1D의 정교화에 매우 중요한 병원체 성분에 대한 다면적인 면역조절 효과를 통해 췌도염 및 자가면역 당뇨병을 억제하는 것으로 밝혀졌다[25, 26]. 이러한 효과들은 염증성 사이토킨 대 조절성 사이토킨의 발현을 조정함함으로써 조절성 DC 및 T 세포의 증식, 및 자가반응성 T 세포를 직접 저해할 수 있는 음성 공동자극 분자(예: PDL-1)의 MSC 발현을 촉진하는 능력을 포함한다[8-10,13]. 따라서, MSC 요법은 T1D 치료를 위한 흥미롭고 특별한 전략이 될 가능성이 크다. 그럼에도 불구하고, T1D에서 MSC-기반 요법의 효능을 개선시켜야 할 절실한 필요성이 있다[6].
이전의 연구에서, 본 발명자들은 완전히 동종이계인 MSC의 정맥내 투여가 당뇨병 NOD 마우스에서 고혈당증의 일시적 역전과 연관되었다는 것을 관찰하였다[9]. 본 발명자들은 보다 강력한 항-당뇨병 효과를 실현하는데 있어 가장 가까운 장애물은 염증이 발생한 췌장으로의 상대적으로 적은 MSC 귀소일 것이라고 가정하였다. 여기서, 본 발명자들은 강화된 HCELL 발현을 통해 귀소 능력이 증진된 MSC의 전신 투여가 NOD 모델에서 당뇨병의 역전에 영향을 주는지 여부를 평가하고자 하였다. 이를 위해, CD44 KO 표현형을 본 유전적 배경에서 이용할수 있었기 때문에, 본 발명자들은 MSC의 동종이계 공급원으로서 C57BL/6 스트레인을 이용하였다. 본 발명자들이 MSC의 항-당뇨병 효과를 매개하는 면역 기작을 이전에 검사하였기 때문에[9, 10], 본 발명자들은 MSC 요법의 효능을 평가하기 위한 1차 종점으로서 대사 제어에 중점을 두었다.
비교적 짧은 시간 동안(전형적으로 <30일) 효과를 특징적으로 평가하는 기타 연구들과 달리, 본 연구에서는 자가면역 당뇨병의 역전에 미치는 MSC의 효과를 장기간의 관찰 기간(90일)에 걸쳐서 평가하였다. 본원에서 본 발명자들의 데이터는 세포 표면 α-(1,3)-엑소푸코실화("FTVI-변형")에 의한 본래의 막 CD44의 HCELL로의 전환이 E-셀렉틴에 대한 높은 효능의 마우스 MSC 결합을 부여함을 시사한다. 본 발명자들은 당뇨병-내성 마우스의 췌장에서 췌도염이 있는 NOD 마우스의 췌장의 섬세포-주변 영역에서 E-셀렉틴 발현을 관찰하였다. 이러한 조사결과와 일치하게, 본 발명자들은 주사된 동종이계 C57BL/6 FTVI-변형된 MSC 및 비변형 MSC의 당뇨병-내성 마우스(BALB/c 숙주)의 췌장으로의 귀소 수준의 차이를 관찰하지 못하였지만, 비변형 MSC와 비교해, 당뇨병 NOD 마우스에서 전신 투여된 C57BL/6(동종이계) FTVI-변형된 MSC의 췌장 침윤은 고조되었고, 지속적 당뇨병 역전을 수반하였다. 주목할만하게도, 본 발명자들은 FTVI-변형된 MSC가 투여된 동물과 비변형 MSC가 투여된 동물 간에 림프 조직의 침윤의 차이를 관찰하지 못하였지만, E-셀렉틴-발현 미세혈관의 혈관주위 영역 내 및 백혈구 클러스터 내에서의 세포의 정착/생착이 현저하게 증가되었다. 전체적으로, 이들 데이터는 자가면역 당뇨병을 억제하는데 있어 MSC 췌장 콜로니화의 중요한 역할에 주목하지만, MSC의 췌장외 효과의 잠재적 기여를 제외하지 않는다.
본 연구 및 이전의 연구[9]에서 정맥내 투여된 완전 동종이계 비변형 MSC를 사용하여 관찰된 항-당뇨병 효과와 비교하여, 본원에서 관찰된 완전 동종이계 FTVI-변형된(HCELL) MSC를 사용하였을 때의 T1D 역전의 현저한 개선은, 당조작된 MSC 자체의 증진된 면역억제 능력 또는 MSC의 당조작에 의해 제공된 생체내 생존 이점에 기인하는 것으로 보이지 않는다. 이전의 연구에서, 본 발명자들은 NOR 마우스로부터 수득된 반-동종이계 MSC의 정맥내 투여 후 NOD 마우스에서 개선된 항-당뇨병 효과를 관찰하였으며[10], 이는 아마도 세포의 생체내 조직 콜로니화/존속을 야기하는 감소된 반-동종이계 MSC 거부를 반영하는 것일 수 있다. 그러나, 특히 제조 및 규제 문제가 "기성품(off-the-shelf)"(즉, 배양-증식된, 풀링된(pooled)) 동종이계 MSC 생성물의 이용을 지지하기 때문에, 임상 적용에서 완전 동종이계-공급원 MSC의 효능을 증대시키는 전략을 사용하는 것이 유리할 수 있다. 엑소푸코실화된 CD44 KO MSC가 고혈당증의 지속성있는 역전을 유도하는 능력이 결여되어 있다는 조사결과는, HEC452 반응성에 의해 검출될 수 있는 FTVI-의존적 표면 시알로푸코실화된 결정인자의 명백한 생성에도 불구하고, 강력한 항-당뇨병 효과를 달성하기 위해서는 CD44 스캐폴드상에 명확히 제시된 E-셀렉틴 결합 결정인자(즉, HCELL의 정교화)가 요구됨을 시사한다. 이것은 필요한 조직 귀소 및 혈관외유출[27]을 이루기 위한 HCELL 발현의 중요한 역할과 관련될 수 있고/있거나 관련 미세환경 부위에서 적절한 정착을 달성하기 위한 HCELL/CD44 발현의 필수조건을 반영할 수 있다[28]. MSC 효과(들)을 달성하기 위한 제자리 조직 정착의 역할은 면역특권을 갖는(immunoprivileged) 영역을 생성시키는 섬세포 동종이식편과 MSC의 동시이식의 연구에 의해 강조된 바 있다[29 내지 31]. 이와 관련하여, E-셀렉틴이 이환된 조직의 내피 바탕 내에서 발현되고, 백혈구가 L-셀렉틴을 특징적으로 발현하고, 강력한 E-셀렉틴 및 L-셀렉틴 리간드인 HCELL의 발현이 면역반응성이 가장 극심한 미세환경 내에서 조직 정착을 명확히 촉진하는 작용을 하기 때문에, 섬세포 혈관주위 영역 및 섬세포 백혈구 침윤물 내에서 관찰된 HCELL+ MSC 국소화는 면역조절을 허용하는데 있어 HCELL의 작용적 역할을 강조한다. 생체내 MSC의 면역조절 효과에 관한 추가 연구가 필요하지만, 본원의 데이터는 T1D의 요법에서 HCELL+ MSC의 전신 투여를 통한 증진된 향췌장성의 가능성을 강조한다. 보다 광범위하게, E-셀렉틴이 모든 염증성 부위의 내피 바탕 내에서 TNF 및 IL-1과 같은 사이토킨에 의해 상향조절된다는 사실[17,18]은 매우 다양한 염증성 병태를 위한 MSC-기반 요법의 효능을 개선시키기 위해 강화된 MSC HCELL 발현을 이용할 기회를 제공한다.
참조문헌 - 실시예 6
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실시예 7 - 신경 줄기세포의 세포 표면 글리칸 조작은 향신경성을 증대시키고 뮤린 다발성 경화증 모델에서 회복을 개선시킨다.
서론
자연은 순환 세포를 염증 및 상해 부위로 전달하는 매우 효율적인 기작을 발달시켰다. 이러한 과정은 분자 상호작용의 고도로 정렬된 캐스케이트에 의해 제어된다(Butcher, E.C. 1991; Sackstein, R. 2005; Springer, T.A. 1994). 세포 모집에서 제일 필수적인 사건은 3종의 Ca2+ 의존적 렉틴의 계열(E-셀렉틴, P-셀렉틴 및 L-셀렉틴으로 구성됨)인 셀렉틴의 이의 각각의 대응-수용체에 대한 결합에 의해 가장 효율적으로 매개되는 과정인 내피 세포 표면상에서의 유동 세포의 전단-내성 부착이다. 이러한 상호작용들은 초기에는 세포를 혈관벽에 일시부착시키고, 혈관 전단 유동의 맥락에서는 세포가 우세한 혈류역학적 흐름의 속도 미만의 속도로 내피 표면을 따라 회전하도록 한다(단계 1). 이러한 과정은 혈관주위 영역에 존재하는 적절한 사이토킨에 대한 특정 세포 유래의 케모킨 수용체의 결합을 용이하게 함으로써 인테그린 계열 구성원의 부착성 증가를 유도하는 내부-외부 시그널전달 사건을 촉발시킨다(단계 2). 이어서, 활성화된 세포 인테그린과 이의 동족 내피 세포 대응-수용체 간의 부착성 상호작용은 회전의 정지 및 혈관벽에 대한 세포의 안정적 부착을 유도하고(단계 3), 궁극적으로 내피경유(transendothelial) 이동을 유도한다(혈관외유출, 단계 4).
다발성 경화증(MS) 및 이의 동물 모델인 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)에서, 면역학적 이펙터의 모집은 혈관 셀렉틴인 E-셀렉틴 및 P-셀렉틴의 상향조절에 의해 매개된다. E-셀렉틴 및 P-셀렉틴은 LPS 또는 TNF-α에 의한 생체내 활성화 후에 뇌 내피에서 발현되지만, 뮤린 EAE에서는 P-셀렉틴이 오직 일시적으로만 발현된다(Piccio, L., Rossi, B., et al. 2002). 주목할만하게도, E-셀렉틴은 염증 기간 전반에 걸쳐 혈관들이 분지되는 부위에서 비대칭적 분포로 발현되는데, 이는 우선적인 모집 영역이 존재함을 제시한다(Piccio, L., Rossi, B., et al. 2002). E-셀렉틴은 또한 MS 환자의 급성 플라크로부터의 혈관에서 특징적으로 발견된다(Lee, S.J. and Benveniste, E.N. 1999; Washington, R., Burton, J., et al. 1994). 이러한 조사결과들은 E-셀렉틴이 염증성 질환에서 순환 세포의 뇌로의 모집에서 지배적 역할을 함을 제시한다.
모든 3종의 셀렉틴은 말단 테트라사카라이드 시알릴 루이스 X(sLex)로서 원형적으로 표시되는, 갈락토스상의 α(2,3)-연결된 시알산 치환 및 N-아세틸글루코사민상의 α(1,3)-결합된 푸코스 변형을 함유하는 시알로푸코실화로 이루어진 특화된 탄수화물 결정인자에 결합한다(Polley, M.J., Phillips, M.L., et al. 1991; Sackstein, R. 2005). "CD15s"로서도 공지된 상기 구조는 단백질 스캐폴드(즉, 당단백질) 또는 지질 스캐폴드(즉, 당지질) 상에 제시될 수 있고 CSLEX-1 및 HECA-452와 같은 mAb에 의해 인식된다(Alon, R., Feizi, T., et al. 1995; Dimitroff, C.J., Lee, J.Y., et al. 2001; Fuhlbrigge, R.C., Kieffer, J.D., et al. 1997; Gadhoum, S.Z. and Sackstein, R. 2008; Merzaban, J.S., Burdick, M.M., et al. 2011). 주로 황산화를 수반하는 추가의 구조적 변형이 sLex에 대한 P-셀렉틴 및 L-셀렉틴의 결합 친화성을 증가시킨다 해도, 이러한 변형이 E-셀렉틴의 최적의 결합을 위해 필요한 것은 아니다(Leppanen, A., White, S.P., et al. 2000; Rosen, S.D. 2004).
신경 줄기세포(NSC)-기반 요법은 CNS 염증 및/또는 퇴행성 질환에서 질환 진행의 중지 및/역전에 대한 많은 희망을 주었다(Ben-Hur, T., Einstein, O., et al. 2003; Einstein, O., Fainstein, N., et al. 2007; Einstein, O., Grigoriadis, N., et al. 2006; Imitola, J., Raddassi, K., et al. 2004; Lee, S.T., Chu, K., et al. 2008; Pluchino, S., Quattrini, A., et al. 2003; Pluchino, S., Zanotti, L., et al. 2005; Ziv, Y., Avidan, H., et al. 2006). NSC가 각각 CXCR4(Bezzi, P., Domercq, M., et al. 2001; Flax, J.D., Aurora, S., et al. 1998; Imitola, J., Raddassi, K., et al. 2004) 및 VLA-4(Pluchino, S., Zanotti, L., et al. 2005; Rampon, C., Weiss, N., et al. 2008)와 같은 단계 2 및 단계 3/4 이펙터들을 발현다는 것은 익히 공지되어 있지만, NSC가 본래 단계 1 이펙터를 발현하는지 여부에 대한 데이터는 없다. 따라서, 본 발명자들은 마우스 NSC에서의 단계 1 이펙터의 발현을 검사하였고 이들 세포가 명백히 단계 1 이펙터, 특히 E-셀렉틴 리간드가 결여되어 있음을 발견하였다. EAE 모델을 사용하여 본 발명자들은 세포 표면 글리칸 조작을 통해 강화된 E-셀렉틴 리간드 활성이 투여된 NSC의 이동 및 보다 중요하게는 투여된 세포들의 치료 효과(들)에 영향을 줄 수 있는지 여부를 분석하였다. 이를 위해, 본 발명자들은 글리코실트랜스퍼라제-프로그램된 입체치환(GPS)이라 불리는 기술을 이용하여 관련 세포 표면에 셀렉틴-결합 글리칸 결정인자를 생성시켰다(Sackstein, R., Merzaban, J.S., et al. 2008). 본원에서 본 발명자들은, GPS가 2종의 신경 줄기세포 막 당단백질, CD44 및 NCAM의 글리칸을 변형시켜 각각 E-셀렉틴 리간드 HCELL(조혈 세포 E-/L-셀렉틴 리간드) 및 NCAM-E를 생성시킴으로써, NSC에서의 E-셀렉틴 리간드의 발현을 강화한다고 보고한다. NSC E-셀렉틴 리간드 활성의 당조작은 검출가능한 장기간 생착의 부재하에 향신경성을 증가시키고 EAE의 임상 결과를 개선시켰으며, 이는 이들 조직-특이적 줄기세포가 직접적 재생 효과가 아닌 복원 효과를 야기함을 시사한다. 중요한 점은, GPS-조작된 마우스 조혈 줄기/기원 세포(HSPC)의 투여가 EAE 임상 과정을 개선시키지 않았므로 이러한 신경복원 효과는 성체 줄기세포의 보편적 특성이 아니라는 것이다. 이러한 조사결과들은 세포 이동의 이펙터들을 생성시키는 세포 표면 당조작이 줄기세포-기반 치료법을 개선시킬 수 있고 또한 신경염증성 질환의 치료에서 NSC의 이용에 대한 새로운 관점을 제공할 수 있다는 첫번째의 직접적 증거를 제공하는데 있어 상당한 임상적 의미를 갖는다.
결과
신경 줄기세포에서의 세포 이동의 분자 이펙터의 발현
세포 이동의 단계 1, 단계 2 및 단계 3/4의 세포 이펙터의 발현을 분석하기 위해, 마우스 NSC의 1차 배양물에 대해 유세포측정을 수행하였다. NSC는 E-셀렉틴-Ig 키메라(E-Ig) 및 P-셀렉틴-Ig 키메라(P-Ig)와의 반응성이 결여되어 있었으며, 이는 심지어 염증성 매개체의 존재하에서도(도 15) E-셀렉틴 리간드 및 P-셀렉틴 리간드가 부재함을 시사한다(도 9a); NSC는 또한 mAb CSLEX1, KM93 또는 HECA452(각각 sLex를 확인시켜 준다)으로도 염색되지 않았다. NSC는 CD44 및 인테그린 VLA-4(CD49d/CD29) 및 VLA-5(CD49e/CD29)뿐만 아니라 케모킨 수용체 CXCR4를 발현하였다; 이러한 NSC 마커 발현 패턴은 다른 이들에 의해 관찰되었다(Back, S.A., Tuohy, T.M., et al. 2005; Campos, L.S., Decker, L., et al. 2006; Campos, L.S., Leone, D.P., et al. 2004; Imitola, J., Raddassi, K., et al. 2004; Ji, J.F., He, B.P., et al. 2004; Leone, D.P., Relvas, J.B., et al. 2005; Pluchino, S., Quattrini, A., et al. 2003; Pluchino, S., Zanotti, L., et al. 2005)(도 9b). NSC는, 잘 설명된 폴리시알산(PSA) 외에도, 신경세포 부착 분자(NCAM)를 또한 특징적으로 발현하였다(Vitry, S., Avellana-Adalid, V., et al. 2001) (도 9b). NSC는 PSGL-1, CD43, LFA-1(CD11a(α1) 쇄 및 CD18(β2) 쇄 둘 다가 결여되어 있음) 및 LPAM-1(α4β7)를 발현하지 않았다(도 9b). 이러한 결과들은, NSC가 세포 이행의 다단계 캐스케이드의 단계 1 이펙터의 발현이 결핍되어 있지만 혈관외유출의 단계 2 내지 4를 매개하고 또한 방사상 이동을 통해 발달중인 뇌에서의 동원에 관여하는 케모킨 수용체 및 관련 인테그린 이펙터를 발현함을 시사한다(Imitola, J., Comabella, M., et al. 2004).
GPS는 신경 줄기세포상의 E-셀렉틴 리간드 활성을 강화한다.
NSC(Deboux, C., Ladraa, S., et al. 2013) 및 뇌 암 줄기세포(Fu, J., Yang, Q.Y., et al. 2013)의 이동에 관여하는 분자인 CD44는 배양물 중의 NSC들 간에 강력하게 발현된다(도 9b). 그러나, NSC가 E-셀렉틴 결합이 결여되어 있다는 조사결과(도 9a)는 이들 세포가 HCELL로서 공지된 CD44의 E-셀렉틴 결합 당형태를 본래 발현하지 않는다는 것을 시사한다(Dimitroff, C.J., Lee, J.Y., et al. 2000; Dimitroff, C.J., Lee, J.Y., et al. 2001; Sackstein, R. 2004). 따라서, 본 발명자들은 CD44 글리칸의 글리코실트랜스퍼라제-프로그램된 입체치환(GPS)이 HCELL 발현을 강화할 수 있는지 여부를 결정하고자 하였다(Sackstein, R., Merzaban, J.S., et al. 2008). 이를 위해, 본 발명자들은 NSC를 α(1,3)-연결-특이적 푸코실트랜스퍼라제인 푸코실트랜스퍼라제 VI (FTVI)로 처리하였다. 상기 효소는 특이적으로 푸코스를 말단 2형-락토사민 유닛상으로 배치시킨다; 락토사민이 α(2,3)-연결된 시알산으로 캡핑될 경우, sLex가 생성된다. NSC의 FTV 처리(GPS-NSC) 후, mAbs CSLEX1, KM93 및 HECA452와의 반응성이 유도되었으며, 이는 연관된 E-Ig 결합(도 10a)과 함께 sLex 에피토프의 강력한 발현(도 10a)과 일치하지만 P-Ig 결합의 유도(도 10a)는 없었다. 주목할만하게도, CD15의 발현(SSEA-1 또는 Lex로서도 공지됨)은 NSC에서 높고(도 10a), FTVI가 비시알릴화된 말단 락토사민을 푸코실화시킴으로써 CD15(SSEA-1)를 생성시킬 수 있었으나, CD15의 발현은 강화된 푸코실화 후에 변하지 않았다(도 10a). 종합하면, 이들 데이터는 α(1,3)-엑소푸코실화만이 시알릴화된 락토사미닐 글리칸에서 일어났음을 시사한다. GPS 처리 전의 NSC의 브로멜라인 분해는 HECA452 반응성을 현저하게 감소시켰으며(도 10b), 이는 당지질이 아닌 당단백질이 시알로푸코실화된 결정인자의 주요 운반체임을 입증한다. GPS-NSC의 포스파티딜이노시톨 포스포리파제 C(PI-PLC) 처리는 FACS에 따르면 HECA452 시그널의 크지 않지만 중요한 감소를 야기하였으며(도 10c), 이는 sLex-수식된 당단백질의 적은 집단이 글리코포스파티딜이노시톨(GPI)-연결된 것들임을 시사한다.
GPS-NSC로부터의 세포 용해물 및 면역침전된 CD44의 웨스턴 블롯은 HECA452에 의해 인식되는 필수적인 시알로푸코실화로 수식된 당백질들 중 하나가 CD44의 표준 비스플라이스된 형태(약 100 kDa; 도 11a)였으며, CD44도 E-Ig와 반응였음(도 11a)을 보여주었다. 그러나, CD44의 철저한 면역침전 후, 다른 후보 당단백질 E-셀렉틴 리간드(들)이 나머지 상청액 분획 중에서 E-Ig 및 HECA452와의 반응성 증거에 의해 확인되었다. 2개의 밴드가 약 120 및 약 140kDa에서 나타났다. 이들 밴드의 분자량 프로파일(도 11a) 및 NCAM의 120 kDa 형태의 특징(Gascon, E., Vutskits, L., et al. 2007; Maness, P.F. and Schachner, M. 2007; Rutishauser, U. 2008)인 E-셀렉틴 결합의 부분적 PI-PLC 민감성(도 10c)에 기초하여, 본 발명자들은 NCAM이추가의 E-셀렉틴 리간드로서 작용할 수 있다고 추측하였다. 따라서, 본 발명자들은 pan-NCAM mAb를 이용한 면역침전을 수행하였고 CD44의 철저한 면역침전 후에 지속되는 나머지 밴드들이 정말 NCAM의 것들이었음을 관찰하였다(도 11b). NCAM에서의 관련 시알로푸코실화가 N-글리칸상에 제시되었는지 여부를 결정하기 위해, 본 발명자들은 N-글리코시다제 F를 이용하여 분해시킨 후 GPS-NSC의 용해물의 웨스턴 블롯에서 E-Ig 반응성을 시험하였다(도 11a); 분해 후 E-Ig로의 명백한 염색은 관찰되지 않았으며, 이는 관련 E-셀렉틴 결합 결정인자(들)이 N-글리칸상에 제시됨을 시사한다. NSC의 강화된 푸코실화 후 전체 sLex 발현에 대한 NCAM-E의 GPI-고정된 형태의 기여는, PI-PLC 처리 후 HECA452 시그널(및 E-Ig 시그널- 데이터는 제시하지 않음)의 작은 감소로 나타난 바와 같이, 크지 않다(도 10c). 따라서, 뮤린 NSC의 강화된 α(1,3)-푸코실화는 HCELL뿐만 아니라 "NCAM-E"라 명명된 신경 전구체 분자의 독특한 E-셀렉틴 리간드 반응성 형태를 생성시켰다. 흥미롭게도, 인간 NSC(CC-2599)는 GPS 처리 후 HCELL만을 발현하고 NCAM-E를 발현하지 않는다(도 16(A) 내지 16(C))
NSC에서의 GPS-조작된 E-셀렉틴 리간드 활성의 안정성을 평가하기 위해, 본 발명자들은 강화된 엑소푸코실화 후 유세포측정에 의해 24시간 간격으로 E-Ig 반응성을 측정하였다. E-셀렉틴 리간드 활성은 24시간까지 안정하였고 이후에 72시간까지 검출할 수 없는 수준으로 감소되었으며, 이는 아마도 표면 단백질의 턴오버(turnover) 때문일 것이다(도 11c). NSC 생존력(도 17)은 강화된 엑소푸코실화에 의해 영향을 받지 않았으며 클론원성 검정(clonogenic assay)에서 신경구의 수 또는 증식 또는 NSC의 분화에 있어 차이가 없었다(도 18a 내지 18d). 따라서, E-셀렉틴 리간드의 생성을 제외하고는 NSC의 GPS 처리에 의해 유도된 명백한 표현형상 차이는 없었다.
NSC는 시험관내에서 T 세포의 증식을 저해하고(Einstein, O., Fainstein, N., et al. 2007; Einstein, O., Grigoriadis, N., et al. 2006; Martino, G. and Pluchino, S. 2006), 특히 시험관내에서 T 세포의 유사분열 반응을 감소시키는 것으로 나타났다. 이러한 NSC의 면역조절 기능이 강화된 E-셀렉틴 리간드 활성에 의해 영향을 받는지 여부를 평가하기 위해, 본 발명자들은 Con A 활성화에 반응하여 림프절 세포의 증식을 억제하는 GPS-NSC 및 대조군 완충액-처리된 NSC(BT-NSC)의 능력을 검사하였다. 도 19a 내지 19c에 나타난 바와 같이, GPS-NSC 및 BT-NSC 둘 다는 T 세포 증식을 감소시킬 수 있었을 뿐만 아니라 염증성 사이토킨 생산을 저해할 수도 있었으며, 이는 NSC에 대한 GPS 처리 자체에 의해 제공되는 면역조절성 장단점이 없음을 제시한다. 흥미롭게도, 본 발명자들은 GPS-처리된 세포가 E-Ig에 결합시 증진된 BT-NSC 및 GPS-NSC 둘 다에 대한 염증성 사이토킨 처리시 NSC로부터 백혈병 저해 인자(LIF)의 동일한 방출을 또한 관찰하였다(도 19c). 따라서, NSC의 강화된 엑소푸코실화는 시험관내 연구로 측정된 바와 같이 NSC 표현형 또는 기능에 대한 원치않는 효과 없이 일시적 E-셀렉틴 리간드 활성을 유도하였다.
GPS-NSC는 E-셀렉틴과의 강력한 생리학적 회전 상호작용을 나타낸다.
생리학적 혈류 조건 하에 GPS-NSC의 E-셀렉틴 리간드 활성의 효능을 분석하기 위해, E-셀렉틴을 발현하도록 사이토킨(IL-1β 및 TNF-α)에 의해 자극된 인간 제대정맥 내피 세포(HUVEC)를 사용하여 병렬 플레이트 유동 챔버 연구를 수행하였다. 도 12a에 도시된 바와 같이, GPS-NSC는 현저한 E-셀렉틴 리간드 활성을 나타냈으며, 이러한 활성은 EDTA의 존재 하에 또는 차단 항-E-셀렉틴 mAb의 사용에 의해 완전히 제거되었다. 유의적인 전단-내성 회전 상호작용은 통상의 후모세혈관정맥 전단 수준(1 내지 4 dynes/cm2) 내에서 관찰되었으며 20 dynes/cm2 이상에서 지속되었다(도 12a). 당조작된 E-셀렉틴 리간드인 HCELL 또는 NCAM-E 중 어느 것이 NSC에서 보다 강력한 E-셀렉틴 리간드인가를 분석하기 위해, 본 발명자들은 블롯-회전 검정을 사용하였다(Fuhlbrigge, R.C., King, S.L., et al. 2002). 상기 기술은 SDS-PAGE에 의해 분해된 막 단백질상의 전단-의존적 셀렉틴 리간드 상호작용을 검출함으로써 GPS-NSC의 E-셀렉틴 리간드 활성에 대한 HCELL 및 NCAM-E 각각의 기여를 평가할 수 있도록 한다. 따라서, 각각의 E-셀렉틴 결합 특성을 평가하기 위해, E-셀렉틴 형질감염된 CHO 세포(CHO-E)를 GPS-NSC 용해물의 HECA-452 면역염색된 블롯 위로 관류시켰다. 도 12b에 예시된 바와 같이, NCAM-E의 120kD 형태 또는 140kD 형태 어느 것보다도 더 많은 CHO-E 세포가 HCELL와 상호작용하여 부착되었다. 5 mM EDTA를 함유하는 유동 배지에 현탁된 CHO-E 세포는 상기 블롯의 어떠한 영역에라도 미미한 정도로 부착되었으며, 이는 셀렉틴 리간드 활성과 일치하는 Ca2+-의존적 결합을 확인시켜 준다.
GPS-NSC는 생체내 EAE에서 증가된 귀소 및 조직 침윤을 나타낸다.
주사된 NSC가 CNS 실질로 침윤되었는지 여부를 평가하기 위해, 본 발명자들은 공초점 현미경 연구를 수행하였다. 이를 위해, GPS-NSC 및 BT-NSC를 PKH26 염료로 표지하고 2회의 개별적 정맥내 주사로 MOG-유도된 만성 EAE 마우스에게 정맥내 주사하였다: 질환 발병 전(면역화 후(PI) 9일째) 및 질환 발병시(PI 13일째). 상기날수는 EAE의 뇌 내피에서의 E-셀렉틴 발현에 관한 이전 연구(Piccio, L., Rossi, B., et al. 2002)에 기초하여 선택되었다. 요추-천골 척수 및 뇌를 2차 NSC 주사 후 4일째(PI 17일)에 수거하였다. 뇌의 공초점 분석은 뇌에서 높은 양의 GPS-NSC(도 13a) 및 Flk-1+ 혈관 외부의 국소화(도 20a 내지 20b) 둘 다를 입증하였다. 추가로, 대다수의 병리상태가 EAE에서 발생하는 척수의 병행 분석(도 13b 내지 도 13d)은 PI 17일째까지 BT-NSC 침윤물보다 2배 더 많은 수의 혈관외 GPS-NSC 침윤물을 입증하였다(도 13d). 이들 데이터는 뇌와 척수 둘 다에서 GPS-NSC가 BT-NSC보다 훨씬 더 효율적으로 CNS 실질로 침윤함을 시사한다. 본원의 공초점 데이터를 추가 확인하기 위해, 본 발명자들은 생체내에서 NSC의 단기간 귀소에 미치는 GPS-조작된 E-셀렉틴 리간드 활성의 효과를 연구하였다. NSC를 형광색소 추적 염료(tracking dye)인 CFSA-SE(카복시플루오레신 디아세테이트 신이미딜 에스테르)를 사용하여 염색하고, 재료 및 방법란에서 설명한 바와 같이 MOG를 사용하여 PI 9일째 및 13일째에 C57BL/6 마우스로 입양 전이시켰다. 2차 세포 주사 후 16시간 이내에 본 발명자들은 GPS-NSC가 BT-NSC보다 3배 내지 5배 더 효율적으로 뇌, 비장 및 간에 축적되었음을 관찰하였다(도 13e). 뇌, 비장 및 간을 침윤하는데 있어 GPS-NSC의 상대적 이점은, 이들의 평균 CFDA-SE 형광이 BT-NSC에 비해 감소되지 않았으므로(데이터는 제시하지 않음) 단순히 제자리에서의 이들 세포의 우선적 증식이 아니라 수송에서의 진정한 차이를 반영하였다. 확실히 비장으로 이동한 이러한 세포들 중에 NSC와 CD4+ T 세포와의 밀접한 상호작용이 있는 것이 명백하다(도 13f). 주사된 세포들은 폐에도 축적되었지만 GPS-NSC와 BT-NSC 간에 차이는 없었으며, 이는 아마도 폐 미세혈관 내의 입체적 포획을 반영하는 것일 수 있다(도 13e). 따라서, GPS-처리 후 NSC상에 형성된 sLex 구조는, 이들 세포의 이들 기관으로의 이동을 허용하며 생체내 NSC의 조직-특이적 이동을 구동하는데 있어 E-셀렉틴 리간드 활성의 매우 중요한 역할을 강조한다.
GPS-NSC는 EAE에서 증진된 내인성 간접적 신경재생에 의해 신경병리상태 개선으로의 귀소 전환을 증가시켰다.
NSC의 개선된 조직 귀소가 치료 효과를 증진시켰는지 여부를 알기 위해, 본 발명자들은 MOG-유도된 만성 EAE 후에 NSC 주사가 투여된 C57BL/6 마우스의 신경학적 상태를 모니터링하고 임상 매개변수뿐만 아니라 조직 복원 및 병리상태를 분석하였다. 신경 전구체를 PI 9일째 및 PI 13일째에 2회의 개별적 정맥내 주사로 투여하였다. 5가지의 EAE 마우스 그룹을 시험하였다: (1) GPS-NSC; (2) BT-NSC; (3) HBSS(모의; 즉, 세포 없음); (4) BT-HSPC; 및 (5) GPS-HSPC. 임상 스코어를 개개의 마우스에서 맹검 방식으로 매일 평가하고(도 14a), 질환의 누적 부하의 선형 회귀를 계산하였다(도 14b 및 표 2).
Figure 112017073330110-pct00006
표 2.　GPS 처리된 NSC로 정맥내 처리된 C57BL/6 마우스에서의 EAE 특징
대조군 NSC(BT-NSC)의 주사는 HSPC 및 모의 처리된 동물과 비교해 EAE의 임상 중증도를 약화시켰다(p = 0.006). 그러나, GPS-NSC(n = 30)의 주사는 BT-NSC(n = 30; p = 0.006), GPS-HSPC(n = 30; p < 0.0001), BT-HSPC(n = 30; p < 0.0001) 및 모의(n = 30; p < 0.0001) 처리된 동물과 비교해 보다 유의적으로 개선된 임상 스코어를 나타냈다. GPS-HSPC(현저하게 증가된 E-셀렉틴 리간드 활성을 나타냄, 도 21a 참조)의 주사(Merzaban, J.S., Burdick, M.M., et al. 2011)) 또는 BT-HSPC의 주사 어느 것도 대조군 동물과 비교해 MOG-유도된 동물의 임상 스코어의 개선을 나타내지 않았기 때문에, 이러한 질환 중증도의 개선이 NSC에 특이적이라는 것을 주지하는 것이 중요하다(도 21b 내지 21c 및 표 3).
Figure 112017073330110-pct00007
표 3: GPS 처리된 HSPC가 정맥내 주사된 C57BL/6 마우스에서의 EAE 임상 특징
사실, GPS-HSPC 또는 BT-HSPC는 임상 결과가 악화되는 경향을 나타냈으며, 이는 관찰된 NSC 주입의 유익한 효과가 성체 줄기세포의 일반적 특성이 아니라는 것을 시사한다.
주목할만하게도, EAE 유도 후 30일째에 신경병리상태의 검사는 BT-NSC 및 모의 처리된 동물과 비교하여 GPS-NSC가 투여된 마우스에서 염증 및 신경재생의 몇가지 매개변수의 통계학적 유의차를 나타냈다(도 14c). EAE의 신경병리상태에 미치는 NSC 주사의 영향을 측정하기 위해, 본 발명자들은 다수의 상이한 마커들을 평가하였다. 첫째, 염증 정도를 평가하기 위해, 본 발명자들은 침윤성 대식세포 및 미세교세포를 확인시켜 주는 마커인 CD11b에 대해 각 마우스 연구 그룹으로부터의 척수의 절편을 염색하였다. 단독의 HBSS 완충액만이 투여된 EAE가 있는 동물은 CD11b에 대해 높은 수준의 염색을 나타냈고, 이때 세포는 활성화된 표현형의 형태학적 증거인 증가된 수의 막 과정을 나타냈다(도 14c). CD11b-염색된 세포의 수는 BT-NSC가 투여된 마우스에서 유의적으로 감소되었으며(p < 0.0001), 주목할만하게도, 이러한 수준들은 GPS-NSC가 주사된 동물에서 훨씬 더 감소되었다(BT-NSC와 비교하여 p<0.005). 중요한 점은, 대식세포/미세교세포가 감소된 활성화를 나타내는 지표인 감소된 CD11b 염색 및 보다 분리된 막 과정을 나타냈다는 것이다(도 14c). 또한, 상이한 처리군들에서의 뇌 CD4+ T 세포의 정량은 GPS-NSC가 투여된 동물에서 침윤성 T 세포의 유의적 감소를 보여주었다(도 14d 및 14e). 신경재생을 평가하기 위해, 본 발명자들은 척수의 절편들을 마커 GAP-43 및 SMI-32에 대해 염색하였다(도 14f 내지 14i). GPS-NSC가 주사된 동물에서는, BT-NSC 또는 단독의 HBSS 완충액이 투여된 마우스와 비교하여 축삭 완전성 및 재생과 연관된 분자인 GAP-43의 발현이 증가되었다(도 14f 내지 14i). 반대로, 본 발명자들은 BT-NSC 또는 HBSS 완충액이 투여된 마우스와 비교하여 GPS-NSC가 투여된 동물에서 축삭 변성의 마커인 SMI-32의 발현의 특이적 감소를 관찰하였다(도 14h 내지 14i). 이들 데이터는 BT-NSC를 능가하는 GPS-NSC에 의해 제공된 개선된 임상 효과가 조직-특이적 NSC의 증가된 병변성 이동에 뒤따른다는 개념을 뒷받침한다.
관찰된 GPS-NSC의 효과가 증가된 신경재생을 반영하는지 여부를 추가 평가하기 위해, 본 발명자들은 CNPase, Olig-2 및 SOX9를 포함하는, 희소돌기아교세포생성(oligodendrogenesis) 및 성숙한 희소돌기아교세포와 연관된 마커에 대해 염색하였다. 본 발명자들은 BT-NSC 또는 대조군과 비교하여 GPS-NSC가 투여된 동물에서 Olig-2, SOX9 및 CNPase 세포 수의 통계학적으로 유의적인 증진을 관찰하였다(도 14d 및 14e). 비록 PI 17일째에 주사된 NSC(SOX-2+ 세포; 도 20a 내지 20b)의 증거가 있었지만, 본 발명자들은 PI 30일째에 어떠한 주사 그룹에서도 NSC(GFP로 태그됨)에 의한 지속적인 콜로니화를 관찰하지 못하였고(도 22), 이는 개선된 귀소와 연관된 NSC 신경보호 기작이, 투여된 NSC의 지속된 존재도, 신경 계통 세포로의 분화도 필요하지 않음을 제시한다. 종합하면, 이들 데이터는 마우스의 GPS-NSC 처리가 NSC의 CNS로의 전달을 증진시켰으며, 직접적 신경재생(즉, 세포 치환)을 통한 것이 아니라 간접적 신경재생 효과를 통해 신경복원을 제공하였음을 시사한다.
논의
MS는 수초의 점진적 파괴를 야기하여 축삭 손상 및 손실을 초래하는 다초점 염증성 병변을 특징으로 하는 CNS의 만성 탈수초성 질환이다(Imitola, J., Chitnis, T., et al. 2006). 줄기세포-기반 치료법은 이환된 세포를 치환시킴에 의한(직접적 재생) 및/또는 내인성 세포한 조직 복원을 일으키는 환경의 지지/영양 인자들의 생산에 의한(간접적 재생) 손상된/염증이 발생한 조직의 복구 가능성을 제공한다. MS와 같은 파종 신경학적 질환의 경우, 조직-특이적 NSC의 사용은 CNS 회복을 달성하는데 있어 임상적으로 유용한 것으로 입증될 수 있지만, 이러한 목표를 달성하는 데 있어 가장 가까운 장애물은 적절한 수의 세포를 신경 손상 부위로 전달하는 것이다. 이전의 연구들은 뇌졸중, 척수 외상 및 MS의 실험 모델에서 이식된 NSC의 이득을 보여주었다(Ben-Hur, T., Einstein, O., et al. 2003; Einstein, O., Fainstein, N., et al. 2007; Einstein, O., Grigoriadis, N., et al. 2006; Imitola, J., Raddassi, K., et al. 2004; Lee, S.T., Chu, K., et al. 2008; Pluchino, S., Quattrini, A., et al. 2003; Pluchino, S., Zanotti, L., et al. 2005; Ziv, Y., Avidan, H., et al. 2006). 이환된 부위로의 직접 주사가 이들 연구에서 전달 경로로서 사용되었지만, 질환의 확산 성질 및 연관된 해부학적 제약을 고려해 볼 때 국소 투여(즉, 제자리 주사)가 비현실적이기 때문에, 다초점 CNS 질환에서 이환된 조직(들) 내에서의 NSC의 적절한 콜로니화를 달성하기 위해서는 혈관 전달 경로가 요구된다. 지금까지는 NSC에서의 세포 이동의 분자 이펙터들의 발현을 평가하는 연구가 없었으며, 보다 중요한 점은 이러한 이펙터들의 발현이 어떻게 NSC 향신경성을 증진시킬 수 있는가를 다루는 연구들이 없었다는 점이다.
본 발명자들의 연구는, NSC가 관련 단계 2 내지 4 이펙터들을 발현하지만, 눈에 띄게 단계 1 이펙터가 결핍되었음을 보여준다: (1) NSC는 (심지어 염증성 사이토킨의 존재하에서 성장하는 경우에도) 본래 E-셀렉틴 또는 P-셀렉틴에 대한 리간드를 발현하지 않는다(도 15); (2) NSC는 표준 셀렉틴 결합 결정인자인 글리칸 sLex의 발현이 결여되어 있다; 및 (3) NSC는 뇌로의 수송을 매개하는 것으로 보고된 수초-특이적 Th1 세포상의 셀렉틴 리간드인 당단백질 PSGL-1을 발현하지 않는다(Piccio, L., Rossi, B., et al. 2005; Piccio, L., Rossi, B., et al. 2002). 중요한 점은, 내피 셀렉틴, 특히 E-셀렉틴의 발현이 MS 및 EAE에서 면역학적 이펙터들의 모집에 연루되었다는 점이다(Lee, S.J. and Benveniste, E.N. 1999; Piccio, L., Rossi, B., et al. 2002). 따라서, 본 발명자들은 본원에서 E-셀렉틴 리간드의 발현을 강화하기 위한 NSC의 글리칸 조작이 세포의 전신 전달을 증진시킬 수 있고 그 결과로 MS 모델에서 생물학적 효과를 가질 수 있는지 여부를 평가하고자 하였다.
본원의 데이터세트는 배양된 NSC가 2종의 잘 특징 규명된 신경세포 표면 분자인 CD44 및 NCAM을 발현함을 보여준다(Back, S.A., Tuohy, T.M., et al. 2005; Pluchino, S., Quattrini, A., et al. 2003). 두드러지게도, 마우스 NSC의 엑소푸코실화는 주로 이들 당단백질상에서의 sLex 결정인자의 높은 발현을 야기하여, CD44의 강력한 E-셀렉틴 리간드 HCELL로의 전환을 프로그램하고(Dimitroff, C.J., Lee, J.Y., et al. 2000; Dimitroff, C.J., Lee, J.Y., et al. 2001), 또한 본 발명자들이 "NCAM-E"라 지정한, 약 120 kDa 및 약 140 kDa의 NCAM의 2종의 시알로푸코실화된 당형태의 발현을 유도한다. 블롯 회전 검정은 HCELL이 GPS-NSC상에서 발현된 주요 E-셀렉틴 리간드임을 보여주었다(도 12b). 이러한 조사결과들은 NSC sLex 발현 및 E-Ig 반응성의 상당한 유지를 보여주는, PI-PLC 분해에 의해 NCAM-E가 제거된 후의 유세포측정 결과에 의해 입증된다(도 10c).
면역글로불린 슈퍼패밀리의 구성원인 NCAM은 뉴런 및 아교세포 둘 다에서 발현되며 통상적으로 세포의 이의 환경에 대한 물리적 고정을 확립시키는 세포-세포 상호작용의 매개체로서 간주된다. NCAM 단백질 코어상의 α-2,8-연결된 폴리시알산(PSA)으로 이루어진 번역후 글리칸 변형은 신경 이동에서 독특한 특성들을 제공하고(Gascon, E., Vutskits, L., et al. 2007; Maness, P.F. and Schachner, M. 2007; Rutishauser, U. 2008), PSA-NCAM은 뇌에서 전구체 세포 이동을 매개하는데 있어 매우 중요한 역할을 하는 것으로 보인다(Glaser, T., Brose, C., et al. 2007; Lavdas, A.A., Franceschini, I., et al. 2006; Zhang, H., Vutskits, L., et al. 2004). 본 발명자들의 데이터는, NCAM이 엑소푸코실화를 위한 수용체로서 작용하여 sLex 결정인자를 생성할 수 있는 관련 말단 α-(2,3)-시알릴락토사미닐 글리칸을 제시한다는 첫번째 증거를 제공한다. NSC의 세포 표면 당조작 후, PSA 발현 수준은 변화되지 않았으며, 강화된 푸코실화 후 72시간 이내에 sLex 발현이 완전히 상실되었기 때문에 유도된 E-셀렉틴 리간드 활성은 영구적이 아니다(도 11a 내지 11c). 따라서, 혈관외유출 후에, 본래의 NCAM로의 일시적 복귀가 일어났을 것이며, 이어서 침윤성 NSC는 내인성 NCAM-매개 실질내 CNS 이동을 겪었을 수 있다. 특히, 뮤린 NSC가 α-(2,3)-시알릴락토사미닐 글리칸을 보유한 NCAM을 발현하지만, 본 발명자들의 인간 NSC(CC-2599)의 연구는 엑소푸코실화 후에 이들 세포가 오직 HCELL만을 발현하고 NCAM-E를 발현하지 않음을 나타낸다(도 15); 따라서, 인간 NSC는 오직 CD44상에서만 강화된 푸코실화를 위한 수용체로서 작용하는 관련 시알로락토사미닐 글리칸을 발현할 수 있다. 인간 NSC를 설치류 시스템에서 사용하는 이종이식편 연구를 해석할 때 이러한 종 차이들이 고려되어야 한다(Goncharova, V., Das, S., et al. 2014).
E-셀렉틴 리간드 활성의 유도는 E-셀렉틴을 발현하는 내피 바탕으로의 세포 이동을 지시하는 작용을 하는 세포 수송에 현저한 영향을 미친다. 다른 이들에 의해 제시된 바와 같이, 본 발명자들은 NSC가 케모킨 수용체 CXCR4 및 인테그린 VLA-4를 제시함을 관찰하였다(도 9a 내지 9b 참조). 인간 NSC상에서의 CXCR4 발현(Bezzi, P., Domercq, M., et al. 2001; Flax, J.D., Aurora, S., et al. 1998; Imitola, J., Raddassi, K., et al. 2004)이 생체내에서 CNS 상해부를 향한 이동을 촉진하고, 여기서 국소 성상교세포 및 내피는 동족 리간드 간질 세포 유래의 인자 1α(SDF-1α, CXCL12로서도 공지됨)를 상향조절한다는 것이 밝혀졌다(Imitola, J., Raddassi, K., et al. 2004). 이러한 관찰결과들은 CXCR4를 CNS 상해부로의 NSC 귀소를 촉진하는데 있어 중요한 단계 2 이펙터로서 정의한다. VLA-4에 대한 상응하는 내피 수용체 VCAM-1도 또한 상해에 대한 뇌의 염증 반응에서 상향조절된다(Justicia, C., Martin, A., et al. 2006). CXCR4 외에도 VLA-4를 항시(constitutively) 발현하는 NSC만이 EAE에서 이환된 병변 내의 염증이 발생한 CNS 미세혈관 주변에 축적될 수 있었다는 점에서(Pluchino, S., Zanotti, L., et al. 2005), VLA-4/VCAM-1 축도 마찬가지로 NSC의 이동에서 매우 중요한 역할을 하는 것으로 보였다. 최근의 이종이식편 연구는 인테그린이 래트 뇌졸중 모델에서 인간 NSC상에서의 이동의 단계 1 매개체로서 역할을 할 수 있다고 제시하고 있는데, 이는 셀렉틴 상호작용이 이러한 모델 시스템에서 필요하지 않다는 것을 제시한 것이다(Goncharova, V., Das, S., et al. 2014). 추가 연구가 필요하지만, 단계 1 상호작용의 매개체로서 인테그린의 다양한 역할(들)은 사용된 염증 모델, 숙주 동물 시스템, 혈관의 투과성, 염증 부위에서의 내피 부착 분자의 발현, 상기 부위에서의 가용성 부착 분자의 존재 및 유속을 좌우하는 혈관의 물리적 특성(즉, 혈관의 직경)의 차이를 반영할 수 있다(Berlin, C., Bargatze, R.F., et al. 1995; Ding, Z.M., Babensee, J.E., et al. 1999; Zarbock, A., Kempf, T., et al. 2012; Zarbocck, A., Lowell, C.A., et al. 2007). 어떠한 경우에라도, NSC상에서의 단계 1 이펙터로서 E-셀렉틴 리간드의 발현은 CXCR4 및 VLA-4의 항시(constitutive) 발현을 보완하는 작용을 함으로써 염증 부위로의 NSC의 모집을 최적화할 수 있다. 따라서, 본 발명자들이 정맥내 투여된(비-변형된) BT-NSC가 EAE 마우스의 뇌로 침윤할 수 있다는 것을 관찰하였다 해도(도 13e), 당조작에 의해 강화된 E-셀렉틴 리간드 발현은 뇌로의 NSC 이동을 현저하게 증가시켰다. 이렇게 증가된 향신경성은 현저하게 감소된 CNS 염증과 연관되었다(도 14a 내지 14i). 게다가, 도 13a 내지 13f에 도시된 바와 같이, CNS 실질 내 NSC 축적은 주사후 17일까지 BT-NSC보다 GPS-NSC들 간에 2배 더 높았으며, 이는 단계 1 이펙터의 강화된 발현이 혈관외유출을 촉진함을 시사한다.
증진된 향신경성 외에도, 단기 귀소 데이터도 또한 BT-NSC보다 유의적으로 더 높은 비장 및 간 내의 GPS-NSC 축적을 보여주었다(도 13e). 이러한 조사결과들은 전신 투여된 NSC가 EAE가 있는 마우스의 뇌 및 또한 비장 및 간 내에 축적되는 경향이 있음을 보고하는 연구 결과(Politi, L.S., Bacigaluppi, M., et al. 2007)와 일치한다. 비장에서의 E-셀렉틴 발현은 인간, 비-인간 영장류 및 설치류에서 설명된 바 있고(Alam, H.B., Sun, L., et al. 2000; Drake, T.A., Cheng, J., et al. 1993; Redl, H., Dinges, H.P., et al. 1991; Schweitzer, K.M., Drager, A.M., et al. 1996), CNS 염증 조건에서 특징적으로 발현되는 염증촉진성 사이토킨에 의해 상향조절된다(Emamgholipour, S., Eshaghi, S.M., et al. 2013; Weishaupt, A., Jander, S., et al. 2000); 실제로, 중합체에 대한 sLex의 접합은 비장 내의 이러한 중합체의 축적을 현저하게 증진시키는 것으로 나타났으며(Horie, K., Sakagami, M., et al. 2000; Horie, K., Sakagami, M., et al. 2004), sLex 발현이 비장으로의 전달을 촉진한다는 직접적 증거를 제공한다. NSC에 의한 비장 침윤은 상주하는 비장 세포(예: 대식세포)에 의한 염증성 사이토킨의 생산을 감소시켜 소염 효과를 초래한다는 것이 보고되었다(Lee, S.T., Chu, K., et al. 2008). 다른 이들의 연구는 혈관내 투여된 NSC가 신경재생을 증진시키기 보다는 말초 면역억제(Einstein, O., Fainstein, N., et al. 2007; Einstein, O., Grigoriadis, N., et al. 2006) 또는 CNS 상해를 저지하는 국소 면역조절을 제공한다고 보고하였다(Martino, G. and Pluchino, S. 2006; Pluchino, S., Zanotti, L., et al. 2009; Wang, L., Shi, J., et al. 2009). 따라서, 관찰된 NSC상에서의 E-셀렉틴 리간드 활성의 강화된 발현에 의해 증가된 비장으로의 귀소는 NSC 대 면역 세포의 조직 비가 증가됨으로 인한 면역조절을 통해 신경보호에 기여할 수 있다. 이러한 개념은, GPS-NSC가 대조군 NSC로 관찰된 것과 비교해 면역조절상의 이점을 제공하지 않았다 해도, 투입된 NSC 대 비장세포의 비가 증가됨에 따라 T 세포 증식이 감소됨을 보여주는 본 발명자들의 시험관내 데이터에 의해 뒷받침된다(도 19a).
세포 표면 엑소글리코실화(exoglycosylation)에 관한 이전의 연구들은 이종이식편 모델에서 인간 중간엽 줄기세포를 이용하였으며 조직 상해에 미치는 치료학적 영향, 즉 당조작된 줄기세포가 염증 부위로 귀소할 수 있는지 여부 및 이러한 세포가 목적하는 재생 및/또는 조직-보호 효과(들)을 가질 수 있는지 여부를 다루지 않았다. 비록 NSC의 CNS로의 모집 증진이 GPS-NSC의 주입 후에 관찰되었다 해도, 상응하는 NSC의 장기간 생착의 증가는 없었다. 따라서, 증진된 CNS 침윤이 생리학적 세포 이동을 이용함으로써(즉, CNS 조직 미세환경 구조를 보존할 수 있는 비-침습적 방식으로) 달성되었다 해도, 본 발명자들은 투여된 NSC가 제자리에서 기능적 CNS 조직을 재생하는(즉, 직접 재생을 통해) 자손으로 분화되는 것을 관찰하지 못하였다. 사실, 본 발명자들은 GPS-NSC의 투여가 희소돌기아교세포가 되는 내인성 신경 전구체의 능력을 개선시킨 것을 관찰하였다(도 14d 및 14e). 따라서, 본 발명자들의 조사결과는 직접적 신경재생의 패러다임을 뒷받침하지는 않지만, 대신에 CNS 조직 복구에서의 NSC의 주요 역할이, 내인성 세포에 의한 복구를 뒷받침하여 신경복원(즉, 간접적 신경재생을 통해)을 야기하는 영양 효과를 통한 것임을 제시한다(Caplan, A.I. 2009; Hess, D.C. and Borlongan, C.V. 2008; Laterza, C., Merlini, A., et al. 2013; Phinney, D.G. and Prockop, D.J. 2007). 이러한 개념과 일치하게, 미분화 NSC는 반흔 형성을 유의적으로 감소시키고 LIF와 같은 뉴로트로핀의 분비를 통해 내인성 신경교 및 신경 기원 세포의 생존 및 기능을 증가시키는 것으로 보고되었다(Laterza, C., Merlini, A., et al. 2013). 또한, NSC는 내인성 세포에 의한 간접적 신경재생을 촉발하는 BMP-4 및 노긴(Noggin)(Imitola, J., Raddassi, K., et al. 2004; Pluchino, S., Zanotti, L., et al. 2005)와 같은 분자들의 발현을 통해 손상-유도된 성장 닛치의 형성을 뒷받침한다.
전체적으로, 본 발명자들의 데이터는, E-셀렉틴 리간드의 발현을 강화하는 NSC의 당조작이 조직 콜로니화를 고조시켜, 투여된 NSC의 지속적/장기간 생착을 필요로 하지 않으면서 면역조절 및 조직 복구를 매개하는 기작을 뒷받침한다. 주목할만하게도, 증진된 E-셀렉틴 리간드 활성에도 불구하고, GPS-HSPC의 주입은 EAE의 과정을 개선시키지 않았으며(사실, HSPC 주사는 질환을 악화시킨다. 도 21a 내지 21b 및 표 3을 참조한다), 이는 관찰된 GPS-NSC의 신경보호 효과가 성체 줄기세포의 일반적 특성이 아니며 NSC 고유의 신경복원 효과로 인한 것임을 시사한다. 이러한 성체 줄기세포-특이적 생물학적 효과(들)의 조사결과와 일치하게, 인간 HSPC는 선천성 각막 질환의 마우스 모델에서 강력한 숙주 면역 거부를 유도하는 반면 중간엽 줄기세포와 같은 다른 성체 줄기세포는 숙주 면역 반응을 억제하는 것으로 밝혀졌다(Liu, H., Zhang, J., et al. 2010). 관찰된 NSC에 의한 신경보호를 매개하는 분자 기작(들)에 관한 추가 연구가 필요하지만, 본 발명자들의 결과는 세포 표면 글리칸 조작이 자가-재생 능력, 분화 잠재성을 변화시키지 않았거나 신경 줄기세포의 선천적 면역조절 능력을 변경시키지 않음을 시사한다. 전체적으로, 본원에 제시된 데이터는 본 발명자들로 하여금 NSC의 표면의 엑소푸코실화를 통해 강화된 E-셀렉틴 리간드 발현이 CNS 염증 부위에서 증가된 조직 모집을 야기하고 이로써 NSC 영양 인자의 필요한 곳으로의 페이로드(payload) 전달을 증진시키는 모델(도 23)을 제시하도록 이끌었다. E-셀렉틴 발현이 인간의 모든 염증 부위에서의 내피 바탕에서 현저하게 상향조절되기 때문에, 본 발명자들의 조사결과는 MS 뿐만 아니라 참혹한 다초점 염증성 질환을 위한 기타 줄기세포 치료법의 효능을 개선시키기 위해 세포 표면 글리칸 조작을 이용하는 향후의 임상 시험에 상당한 병진적 영향을 준다.
재료 및 방법
윤리 규약: 모든 마우스 실험들은 하버드 의과대학의 동물 보호 및 사용에 관한 공공위원회(Institutional Animal Care and Use Committees of Harvard Medical School)의 승인하에 동물의 관리 및 사용에 대한 NIH 지침에 따라서 수행하였다. 다음은 이들 실험에서 마우스 사용과 관련된 세부 사항이다. 사용 정당화: EAE는 인간 질환 다발성 경화증에 대한 유용한 모델이다. 생체내 질환을 대체할 수 있는 수학적 모델, 컴퓨터 시뮬레이션 또는 시험관내 시스템은 없다. MS 및 기타 자가면역 질환에서 이용가능한 많은 치료들을 먼저 시험하였고 이 치료들의 기작을 EAE에서 조사하였다. C57/BL6 마우스에서 MOG 유도된 EAE는 이러한 배경 하의 많은 넉아웃 및 트랜스제닉 마우스를 입수할 수 있기 때문에 가치가 크다. 수의학적 관리: 마우스는 연방, 기관 및 AAALAC 지침에 따라서 취급 및 관리된다. 유해 효과를 최소화하기 위한 절차: 면역화 후, 동물은 매일 검사한다. EAE가 발생한 동물들에서는 늘어진 꼬리(등급 1), 부분적 뒷다리 마비(등급 2), 완전한 뒷다리 마비(등급 3), 사지불완전마비(등급 4), 빈사 상태 또는 동물 사망(등급 5)이 발생한다. 대부분의 동물들은 등급 0 내지 3이며, 드물게 동물들은 등급 4에 도달하며 이러한 경우에는 안락사가 수행된다. 동물들이 EAE에 걸린 경우, 동물들은 물에 접근하는 것을 보장하기 위해 겔 팩이 제공되며 케이지 내에서 음식에 대한 접근이 허용된다. 안락사는 기관의 지침에 따라서 CO2 흡입에 의해 수행된다.
시약: 다음의 항체들은 BD 파밍겐으로부터 구입하였다: 기능 차단 마우스 항-인간 E-셀렉틴(68-5H11; IgG1), 래트 항-인간 CLA(HECA-452; IgM), 마우스 항-인간 sLex(CSLEX-1; IgM), 마우스 항-인간 CD15(IgM), 래트 항-마우스 PSGL-1(2PH1 및 4RA10; IgG1), 마우스 항-인간 PSGL-1(KPL-1; IgG1), 래트 항-마우스 CD44(KM114 및 IM7; IgG1), 마우스 항-인간 CD44(515; IgG1), 래트 항-마우스 CD43(S7; IgG2a), 마우스 항-인간 CD43(1G10; IgG1), 마우스 항-(마우스 항-성체 및 배아 pan N-Cam) CD56(NCAM13; IgG2b), 마우스 항-인간 CD56(NCAM16.2; IgG2b), 래트 항-인간 CXCR4(2B11; IgG2b), 마우스 항-인간 CXCR4(12G5; IgG2a), 래트 항-마우스 CD18(GAME-46; IgG1), 래트 항-마우스 CD29(KM16; IgG2a), 래트 항-마우스 CD49d (9C10; IgG2b), 래트 항-마우스 CD11a(2D7; IgG2a), 래트 항-마우스 CD11b (M1/70; IgG2b), 래트 항-마우스 CD49e(MFR5; IgG2a), 마우스 IgG1,κ 이소타입, 마우스 IgG2a 이소타입, 마우스 IgM 이소타입, 래트 IgG 이소타입, 래트 IgM 이소타입 및 인간 IgG1 이소타입. 다음의 2차 항체들 또한 BD 파밍겐으로부터 구입하였다: PE 스트렙타비딘, 바이오틴 항-래트 IgM 및 염소 항-마우스 Ig-HRP. 다음의 2차 항체들은 서던 바이오테크(Southern Biotech)으로부터 구입하였다: 토끼 항-인간 IgG-바이오틴, 염소 항-마우스 IgM-PE, 염소 항-래트 IgG-PE, 염소 항-마우스 Ig-바이오틴, 염소 항-래트 Ig-HRP 및 염소 항-인간 Ig-HRP. 재조합 마우스 E-셀렉틴/인간 Ig 키메라(E-Ig) 및 재조합 마우스 P-셀렉틴/인간 Ig 키메라(P-Ig)는 R&D로부터 구입하였다. 마우스 항-인간 sLex(KM93; IgM)는 칼바이오켐(Calbiochem)으로부터 구입하였다. 래트 항-마우스 CD43(1B11; IgG2a)는 바이오레겐드(Biolegend)로부터 구입하였다. 래트 항-마우스 LPAM-1 (DATK32; IgG2a) 및 마우스 항-SMI32 (SMI-32; IgG1)는 아브캄(Abcam)으로부터 구입하였다. 마우스 항-인간 CD15(80H5; IgM)는 쿨터-이뮤노텍(Coulter-Immunotech)으로부터 구입하였다. PNGase F는 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)으로부터 구입하였다. PI-PLC, 브로멜라인, 대두 트립신 저해제, DNase, 마우스 항-Map2(HM-2 ; IgG1)는 시그마(Sigma)로부터 구입하였다. 마우스-항 GFP(B2, IgG2a)는 산타 크루즈 바이오테크놀러지사(Santa Cruz Biotechnology, Inc, 캘리포니아주 산타 크루즈)로부터 구입하였다. To-pro3는 인비트로겐(Invitrogen)으로부터 구입하였다. 마우스 항-인간 폴리시알산(PSA; IgG2a)은 니콜라스 스타마토스(Nicholas Stamatos) 박사로부터 기증받았다. 푸코실트랜스퍼라제 VI(FTVI) 효소는 롤랜드 볼게무트(Roland Wohlgemuth) 박사(Sigma-Aldrich)로부터 기증받았다.
세포: 마우스 NSC를 이전에 설명된 바와 같이 단리시키고 배양하였다(Imitola, J., Comabella, M., et al. 2004; Imitola, J., Raddassi, K., et al. 2004). 간략하게 언급하면, 12일령의 뮤린 배아의 종뇌 VZ로부터 단리된 해리된 NSC(ml당 5×105개 세포)를 5% CO2에서 37℃에서 비코팅된 25-cm2 플라스크(Falcon) 내의 98% DMEM/F12(GIBCO), 1% N2 보충제(GIBCO), 1% 페니실린/스트렙토마이신(GIBCO) 8 mg/ml 헤파린(Sigma), 10 ng/ml 백혈병 저해 인자(LIF, Chemicon), 20 ng/ml bFGF(Calbiochem) 중에서 배양하였다. NSC는 대부분의 실험 동안 2차 계대배양 후에 사용하였다. 신경 줄기세포의 단일 세포 현탁은 베르센(Versene)(Life Technologies) 중에서 미세구의 기계적 해리에 의해 달성하였다.
마우스 HSPC의 단리를 위해, 골수를 C57BL/6 마우스의 대퇴골 및 경골로부터 수거하고 단일 세포 현탁액을 제조하였다. 적혈구를 적혈구 용해 완충액(Sigma)을 사용하여 용해시켰다. 이어서, 세포를 계통 세포 고갈 키트(Lineage Cell Depletion Kit)(구입원: Miltenyi Biotec)를 사용하여 계통 고갈하기 전에 세척하고 100㎛ 세포 스트레이너(BD Falcon)를 통해 여과하였다. 세포 제제를 autoMACS™ 분리기(Miltenyi Biotec.)를 사용하여 고갈시켰다. 고갈 후, 세포를 CD117 MicroBeads(Miltenyi Biotec.)를 사용하여 c-키트에 대해 양성적으로 선별하였다. 생성된 계통negC-키트pos 집단(HSPC라 지칭한다)을 생체내 EAE 마우스 연구를 위해 사용하였다.
차이니즈 햄스터 난소 세포를 전체길이 E-셀렉틴(CHO-E)으로 형질감염시키고 이전에 설명된 바와 같이 유지시켰다(Dimitroff, C.J., Lee, J.Y., et al. 2001). 인간 βFGF-의존적 NSC 세포주인 CC-2599를 이전에 설명된 바와 같이 배양하고(Imitola, J., Raddassi, K., et al. 2004) 도 16(A) 내지 16(C)에 제시된 데이터를 위해 사용하였다.
GPS-처리, PI-PLC 및 브로멜라인 반응: 뮤린 NSC의 GPS 처리를 위한 절차는 MSC에 대해 이전에 설명된 바와 같다(Sackstein, R., Merzaban, J.S., et al. 2008). 간략하게 언급하면, 신경구를 먼저 수거하고 37℃에서 15분 동안 PBS/EDTA(0.02%)와 함께 항온배양하여 단일 세포로 해리시켰다. 이어서, 세포를 HBSS로 세척하고 계수하고 37℃에서 40분 동안 20 mM HEPES, 0.1% 인간 혈청 알부민 및 1 mM GDP-푸코스를 함유하는 HBSS(Ca2 + 또는 Mg2 +이 없음) 중의 60 mU/ml FTVI에 재현탁시켰다. PI-PLC 반응을 37℃에서 0.1U/ml을 사용하여 1시간 동안 수행하였다. 브로멜라인 반응을 37℃에서 1시간 동안 HBSS+2%BSA+0.1% 브로멜라인 중에서 수행하였다.
유세포측정: 세포의 분취액(2×105개 세포)을 PBS/2% FBS로 세척하고 1차 mAb 또는 이소타입 대조군 mAb(접합되지 않거나 형광색소 접합된)와 함께 항온배양하였다. 세포를 PBS/2% FBS로 세척하고, 간접 면역형광을 위해 적절한 2차 형광색소-접합된 항-이소타입 항체와 함께 항온배양하였다. 세포를 세척한 후, FITC 또는 PE 형광 강도를 Cytomics FC 500 MPL 유세포측정기(Beckman Coulter Inc., Fullerton, CA)를 사용하여 측정하였다.
면역침전 연구: BT-NSC 또는 GPS-NSC의 세포 용해물을 면역침전 항체 또는 적절한 이소타입 대조군과 함께 항온배양한 다음, 단백질 G-아가로스와 함께 항온배양하였다. 면역침전물을 2% NP-40을 함유하는 완충액 A, 1% SDS를 사용하여 광범위하게 세척하였다. 일부 실험에서, 면역침전물을 이전에 설명된 바와 같이 N-글리코시다제 F(New England Biolabs)로 처리하였다(Dimitroff, C.J., Lee, J.Y., et al. 2001). 웨스턴 블롯 분석을 위해, 모든 면역침전물을 샘플 완충액에 희석시키고 비등시킨 다음, SDS-PAGE에 적용시키고 PVDF 막으로 이전시키고 HECA-452 또는 E-Ig로 면역염색하였다.
웨스턴 블롯 분석: BT-NSC 및 GPS-NSC를 완충액 A(150mM NaCl, 50mM Tris-HCI, pH 7.4, 1 mM EDTA, 20 ㎍/ml PMSF, 0.02% 아지드화나트륨; 및 프로테아제 저해제 칵테일 정제(Roche Molecular Biochemicals)) 중에서 2% NP-40을 사용하여 용해시켰다. 정량된 단백질 용해물 또는 면여침전된 단백질의 웨스턴 블롯을 이전에 설명된 바와 같은 환원 조건 하에 수행하였다(Dimitroff, C.J., Lee, J.Y., et al. 2001). 블롯을 Lumi-Light 웨스턴 블롯팅 기질(Roche)을 사용하여 화학발광으로 가시화하였다.
병렬 플레이트 유동 챔버 부착 검정: BT-NSC 및 GPS-NSC의 E-셀렉틴 결합 능력을 병렬 플레이트 유동 챔버 검정(Glycotech; Gaithersburg, MD)를 사용하여 수행하였다. NSC(0.5×106개 세포/ml, HBSS/10mM HEPES/2mM CaCl2 용액에 현탁됨)를 컨플루언트 HUVEC 단층 위에 관류시켰다. 먼저, NSC를 0.5 dyne/cm2의 전단응력에서 HUVEC 단층과 접촉하도록 하고, 이어서 유속을 0.5 내지 30 dynes/cm2 범위의 전단응력을 발휘하도록 조정하였다. HUVEC 단층에 부착된 BT-NSC 또는 GPS-NSC의 수를 0.5, 1, 2, 5, 10, 20 및 30 dyne/cm2의 전단응력에서 마지막 15초 간격에서 정량하였다. 각 검정은 적어도 3회 수행하였으며 값들의 평균을 구하였다. 5 mM EDTA를 검정 완충액에 첨가하여 셀렉틴 결합을 위해 요구되는 Ca2+를 킬레이트화시키거나 부착 검정에서 사용하기 전에 HUVEC를 37℃에서 5분 동안 기능-차단 항-인간 E-셀렉틴 mAb로 처리함으로써 대조군 검정을 수행하였다.
블롯 회전 검정: 블롯 회전 검정은 이전에 설명된 바 있으며(Dimitroff, C.J., Lee, J.Y., et al. 2000; Fuhlbrigge, R.C., King, S.L., et al. 2002; Sackstein, R. and Fuhlbrigge, R. 2006), 본원에서는 SDS-PAGE에 의해 분해된 NSC 막의 셀렉틴-결합 활성을 검출하기 위해 사용되었다. NSC 막 제제의 웨스턴 블롯을 항-CLA(HECA-452)로 염색하고 10% 글리세롤을 이용하여 DMEM에 침지시킴으로써 반투명해지도록 하였다. CHO-E 세포를 2mM CaCl2 및 10% 글리세롤을 함유하는 DMEM에 재현탁시켰다(5×106/mL). 블롯을 병렬 플레이트 유동 챔버 아래에 위치시키고, CHO-E 세포를 1.0 dyne/cm2의 생리학적으로 관련된 전단 응력에서 관류시키고, 유동 배지 중의 10% 글리세롤의 존재로 인한 속도의 증가를 해명하기 위해 체적 유속을 조정하였다. 분자량 마커를 관심대상의 염색된 밴드 위의 유동 챔버 배치를 돕기 위해 가이드로서 사용하였다. mm2당 상호작용 세포의 수를 분자량 영역의 함수로서 표로 작성하고 편집하여 부착 히스토그램을 만들었다. 비특이적 부착을 5mM EDTA를 함유하는 CHO-E 세포 현탁액을 유동 배지 중에서 관류시켜 평가하였다.
EAE-도입을 위한 면역화 및 신경 줄기세포 주사: NSC 또는 골수 HSPC(계통negC-키트pos)를 GPS로 처리하거나 처리하지 않고, 1×106개 세포를 MOG 35-55(옆구리에 피하 주사; 보충적 재료란의 상세 사항을 참조)로 면역화시킨 후(PI) 9일째 및 13일째에 C57BL/6 마우스의 꼬리 정맥에 주사하였다. EAE를 맹검 방식으로 스코어화하였다; 조사자는 주사에 관여하지 않았고 그룹의 조성에 대해 알지 못하였다. 등급 스케일의 상세 사항은 보충적 재료란에 요약되어 있다. BT-NSC, GPS-NSC, BT-HSPC 또는 GPS-HSPC를 0.2 ml의 HBSS의 용적 중에서 세포 현탁액으로서 EAE 마우스의 꼬리 정맥에 주사하였다. 단독의 HBSS가 주사된 모의 처리된 마우스(NSC 없음)는 음성 대조군으로서 사용하였다.
단기 귀소 연구: BT-NSC 및 GPS-NSC를 실온에서 5분 동안 10% FBS를 함유하는 RPMI 중에서 5mM CFDA-SE(Invitrogen)로 처리하고 면역화 후(PI) 9일째 및 13일째에 MOG-처리된 C57BL6 마우스에게 정맥내 주사하였다. 0.2mL의 HBSS의 용적 중의 2백만개의 NSC를 각 날에 각 마우스에게 주사하였다. 단독의 HBSS 완충액은 배경 시그널을 측정하기 위해 사용하였다. BT-NSC 및 GPS-NSC를 또한 MOG로 면역화되지 않은 동물들에게 주사하였고 검정된 각 조직에서 관찰된 시그널을 표준화하기 위해 사용하였다. 2차 NSC 전달 후 16시간째에 마우스들을 희생시키고 Ca2+ 및 Mg2+를 함유하지 않는 1X PBS로 관류시켰다. 뇌, 척수, 림프절, 비장, 간 및 폐를 단리시켰다. 뇌 및 척수를 균질화하였다. 수득된 펠렛을 0.25% 트립신-EDTA(Invitrogen)에 재현탁시키고 37℃에서 10분 동안 항온배양하였다. 0.01% SBTI, 0.001% DNase 및 0.075% BSA를 함유하는 DMEM을 사용하여 분해 과정을 중단시켰다. 림프절, 비장 및 간을 기계적으로 해리시키고, 수득된 단일-세포 현탁액을 FL1 채널 내에서 유세포측정에 의해 CFDA-SE 양성 세포의 빈도에 대해 평가하였다. 유세포측정 데이터를 분석하고, NSC를 포함하도록 설정되어 있는 협소한 게이트(narrow gate) 내에서 스캐닝된 200,000개 세포에서 검출된 CFDA-SE-양성 사건의 퍼센트로서 표현하였다. 상기 게이트를 시험된 각 조직(뇌, 척수, 림프절, 비장, 간 및 폐)으로부터 단리된 세포의 현탁액과 배양된 NSC의 혼합에 기초하여 결정하였다.
CNS로의 NSC 이동의 분석: BT-NSC, GPS-NSC를 PKH26 염료(Invitrogen)로 표지하고 면역화 후(PI) 9일째 및 13일째에 MOG-처리된 C57BL6 마우스에게 정맥내 주사하였다. 0.2mL의 HBSS의 용적 중의 1백만개의 NSC를 각 날에 각 마우스에게 주사하였다. 단독의 HBSS 완충액은 배경 시그널을 측정하기 위해 사용하였다. 2차 NSC 전달 후 4일째에 마우스들을 희생시키고 Ca2+ 및 Mg2+를 함유하지 않는 1X PBS로 관류시키고, 요추-천골 척수를 수거하였다. B6 모델에서 전뇌의 CNS 병변이 보다 예측가능한 위치(요천골 영역) 및 또한 보다 과도한 병리상태를 지니는 척수와 비교하여 크기 및 위치가 매우 가변적이기 때문에, 척수를 선택하였다(Chitnis, T., Najafian, N., et al. 2001; Rasmussen, S., Wang, Y., et al. 2007; Wang, Y., Imitola, J., et al. 2008). 이어서, FACS 분석을 위해, 척수를 균질화하고, 수득된 펠렛을 0.25% 트립신-EDTA(Invitrogen)에 재현탁시키고 37℃에서 10분 동안 항온배양하였다. 0.01% SBTI, 0.001% DNase 및 0.075% BSA를 함유하는 DMEM을 사용하여 분해 과정을 중단시켰다. 조직학 분석을 위해, 뇌 및 척수를 액체 질소 중에서 스냅-동결시키고 절편화할 때까지 -80℃에서 저장하였다. 요추-천골 척수 또는 전방, 중간 및 후방 뇌의 크라이오스탯-절편(20㎛)을 15분 동안 4% 파라포름알데히드로 고정시킨 다음, 관심대상의 항체로 염색하고, 혈관을 항-Flk-1(VEGFR2, Sigma)에 의해 가시화하고, NSC를 항-sox-2 (Millipore)로 염색하거나 PKH26 염료에 의해 적색으로 가시화하였다. 이어서, 척수를 균질화하고, 수득된 펠렛을 0.25% 트립신-EDTA(Invitrogen)에 재현탁시키고 37℃에서 10분 동안 항온배양하였다. 0.01% SBTI, 0.001% DNase 및 0.075% BSA를 함유하는 DMEM을 사용하여 분해 과정을 중단시켰다. 혈관을 Flk-1(VEGFR2) 염색에 의해 가시화하였다.
EAE-유도를 위한 면역화 및 NSC/HSPC 주사: NSC 또는 HSPC(계통negC-키트pos)를 GPS로 처리하거나 처리하지 않고 1×106개 세포를 MOG 35-55로 면역화시킨 후(PI) 9일째 및 13일째에 C57BL/6 마우스의 꼬리 정맥에 주사하였다. 마우스 서열에 상응하는 MOG 35-55(M-E-V-G-W-Y-R-S-P-F-S-R-O-V-H-L-Y-R-N-G-K)는 바이오소스 인터내셔날(BioSource International, 마이애미주 홉킨턴)의 분사인 QCB사(QCB Inc.)에 의해 합성되며 HPLC에 의해 99%를 초과하여 정제된다. 마우스는 0.4mg 마이코박테리움 투베르큘로시스(Mycobacterium Tuberculosis)(H37Ra, Difco, 미시간주 디트로이트)를 함유하는 0.1 ml PBS 및 0.1 ml CFA 중의 150 내지 200㎍의 MOG 펩타이드를 이용하여 옆구리에서 피하 면역화시키고, 면역화 당일 및 2일 후에 200ng 백일해 독소(List Laboratories, 캘리포니아주 캠프벨)를 복강내 주사한다. EAE를 맹검 방식으로 스코어화하였다; 조사자는 주사에 관여하지 않았고 그룹의 조성에 대해 알지 못하였다. 다음의 등급이 사용되었다: 등급 1, 축 처진 꼬리 또는 축 처진 꼬리가 없는 걸음걸이의 단독 약화; 등급 2, 부분적 뒷다리 마비; 등급 3, 전체 뒷다리 또는 부분적 뒷다리와 앞다리 마비; 등급 4, 전체 뒷다리 및 부분적 앞다리 마비; 등급 5, 빈사 상태 또는 동물 사망. BT-NSC, GPS-NSC, BT-HSPCs, GPS-HSPC를 0.2 ml의 HBSS의 용적 중에서 세포 현탁액으로서 EAE 마우스의 꼬리 정맥에 주사하였다. 단독의 HBSS가 주사된 모의 처리된 마우스(NSC 없음)는 음성 대조군으로서 사용하였다.
면역조직학적 염색: 마우스를 희생시켜 임의의 혈관내 PBMC를 제거하기 전에 50ml 표준 염수로 관류시켰다. 공초점 영상화를 위해, 동물을 PBS 중의 10 ml의 4% 파라포름알데히드로 심장내 관류시켰다. 뇌와 척수를 꺼내서 O.C.T. 중에 포매시키고 액체 질소 중에서 급속 동결시키고 절편화할 때까지 -70℃에서 저장하였다. 척수의 크라이오스탯 절편(10 ㎛)을 아세톤 또는 4% 파라포름알데히드로 고정시킨 다음, 관심대상의 항체로 표지하였다. 이소타입-매치된 Ig 및 1차 항체의 누락은 음성 대조군으로서 사용하였다. 각각의 검체를 최소 3가지의 상이한 절편화 수준에서 평가하였다. 전체 조직 절편(종방향 척수 절편)을 40X 배율에서 소정의 세포 마커에 대해 평가하였다. 소정의 마커에 대해 양성인 세포 염색의 수를 절편당 10개의40X (고배율 시야) 시야에서 계수하였다. 1개 절편의 결과들을 합계 처리하고, 절편들 간의 결과들의 평균을 냈다.
공초점 현미경 검사를 위한 염색: 파라포름알데히드 고정된 절편(40㎛)을 4% 염소 혈청, 0.3% BSA 및 0.3% 트리톤을 함유하는 PBS로 세척하고 이어서 1차 항체와 함께 밤새 항온배양하고 차단 용액 중에서 2차 항체와 함께 2시간 동안 항온배양하였다. 본 발명자들은 교차-반응성을 피하기 위해 고도로 교차-흡착된 2차 항체들(Alexa 488 및 Alexa 594)을 사용하였다. 두 형광색소들의 가능한 중복을 피하기 위한 멀티트랙 획득 프로토콜과 함께 Zeiss 레이저 주사 현미경 3D 분석 소프트웨어(Zeiss, 뉴욕주 톤우드)를 사용하여 공초점 현미경 검사를 수행하였다.
NSC 분화, 자가-재생 능력 및 시험관내 면역억제 효과에 미치는 GPS 처리의 효과 : 뮤린 NSC의 GPS 처리를 위한 절차는 MSC에 대해 이전에 설명된 바와 같다(Sackstein, R., Merzaban, J.S., et al. 2008). BT-NSC 및 GPS-NSC를 이들의 자가-재생하고, 신경구를 형성하고, MAP2+ 뉴런으로 분화하고 ConA 활성화된 림프절 세포의 증식을 저해하는 능력에 대해 시험관내에서 비교하였다. NSC 분화 및 자가-재생 능력: 처음에 FGF/EGF 함유 배지에서 배양된 신경구를 폴리-D-라이신(PDL)-코팅된 유리 커버슬립상에 플레이팅하여 증식되도록 한 다음, 수거하고, 완충액(대조군)으로 처리하거나 FTVI(60mU/mL)로 효소 처리하고, 이어서 수득된 BT-NSC 및 GPS-NSC를 ㎕당 20개 세포의 클론 밀도로 플레이팅하고 96시간 내지 5일 동안 신경구로서 증식되도록 하였다. 신경구 영상을 Axiovision 현미경(NY)을 이용하여 촬영하였다. 신경세포, 성상세포 및 희소돌기아교세포 분화를 위해, 해리된 신경구를 24웰 플레이트 내에서 PL-코팅된 유리 커버슬립상에 플레이팅하고 FGF/EGF 없이 그러나 1% 글루타맥스, 1% 항생제/항진균제 및 2% B27-보충제를 함유하는 신경세포배양용 배지(neurobasal medium)의 존재 하에 배양하였다. 새로운 배지를 5일째까지 격일로 첨가한 다음, 세포를 MAP2(뉴런), GFAP(성상교세포) 및 NG2(희소돌기아교세포 전구체)로 면역형광 염색하였다. MAP2+, GFAP+ 및 NG2+ 세포를 조사자가 해당 처리를 보지 못하게 하여 표준 입체학 기술을 사용하여 계수하였다. 신경 줄기세포 및 림프절 세포의 공동배양: 림프절을 나이브(naive) C57BL/6 마우스로부터 단리시켰다. 림프절 세포(LNC)를 이전에 설명된 바와 같이 96웰 플레이트내에서 웰당 2×105개 세포로 단일-세포 현탁액으로서 배양하였다(Einstein, O., Fainstein, N., et al. 2007). 배양 배지는 2.5㎍/ml 콘카나발린 A(ConA, Sigma)의 존재 또는 부재하에 10% 소태아 혈청, L-글루타민, 나트륨 피루베이트, 비필수 아미노산, 2-머캅토에탄올, HEPES 및 항생제(BioWhittaker)가 보충된 RPMI-1640로 구성되었다. 신경구를 해리시키고 먼저 GPS로 처리하거나 처리하지 않고(BT) 이어서 3,000 Rad의 방사선을 조사하였다. 방사선 조사 후, 해리된 NSC를 ConA 자극된 LNC와 함께 상이한 비율로 LNC 배양 배지에 직접 첨가하였다. 시험된 NSC의 수 대 LNC의 수의 비는 다음과 같았다: 1:4, 1:2, 1:1, 2:1 및 4:1. 이어서, 세포를 티미딘을 첨가하기 전에 48시간 동안 배양하였다. 16시간 후 티미딘 혼입 검정을 수행하였다.
NSC의 염증성 사이토킨 처리 후 E-셀렉틴 리간드의 평가: 1.5×106개 세포/웰을 웰당 3 ml 증식 배지를 함유하는 6웰 플레이트에 접종시키고 10 ng/ml의 TNFα(R&D; 410-TRNC), 10 ng/ml IL-1β(R&D; 401-ML), 10 ng/ml IFNν(R&D; 485-MI)를 독립적으로 또는 함께 사용하여 자극시켰다(세 가지 모두 10 ng/ml에서). 24시간 및 48시간 후, 신경구를 원심분리하여 수거하고 유세포측정 분석을 위해 E-Ig로 염색하였다.
LIF mRNA의 측정 : 1×106개의 마우스 배아 NSC를 24시간 동안 염증성 사이토킨(10ng/ml에서의 IFN-ν 및 15ng/ml에서의 TNF-α)으로 처리하거나 처리하지 않았다. 이어서, 총 RNA를 트리졸 시약을 이용하여 추출하고, 추출된 RNA의 양을 Agilent 2200 Tab 스테이션 시스템을 사용하여 측정하였다. 고성능 cDNA 역전사 키트(Applied Biosystems) 및 무작위적 헥사머를 사용하여 cDNA 합성을 수행하였다. mRNA 수준을 RT-PCR을 사용하여 측정하고, 유전자 발현의 배수 변화를 2-△△CT 방법을 사용하여 계산하였다. LIF 유전자를 위한 전방향 프라이머 서열은 CCTACCTGCGTCTTACTCCATCA 이고, 역방향 프라이머는 CCCCAAAGGCTCAATGGTT(Sigma)이었다. LIF mRNA의 상대적 발현을 GAPDH 하우스키핑 유전자와 대비하여 검정하였으며, 여기서 TGCACCACCAACTGCTTAGC는 전방향 프라이머로서 사용되었고, GGCATGGACTGTGGTCATGAG는 역방향 프라이머로서 사용되었다.
CNS로의 NSC 이동의 분석: BT-NSC, GPS-NSC를 PKH26 염료(Invitrogen)로 표지하고 면역화 후(PI) 9일째 및 13일째에 MOG-처리된 C57BL6 마우스에게 정맥내 주사하였다. 1백만개의 NSC를 각 날에 각 마우스에게 주사하였다. 단독의 HBSS 완충액은 배경 시그널을 측정하기 위해 사용하였다. 2차 NSC 전달 후 24시간 또는 4일째에 마우스들을 희생시키고, 관류시키고, 요추-천골 척수를 수거하였다. B6 모델에서 전뇌의 CNS 병변이, 보다 예측가능한 위치(요천골 영역) 및 또한 보다 과도한 병리상태를 지니는 척수와 비교하여 크기 및 위치가 매우 가변적이기 때문에, 척수를 선택하였다(Chitnis, T., Najafian, N., et al. 2001; Rasmussen, S., Wang, Y., et al. 2007; Wang, Y., Imitola, J., et al. 2008). 이어서, 유세포 측정 FACS 분석을 위해, 척수를 균질화하고, 수득된 펠렛을 0.25% 트립신-EDTA에 재현탁시키고 37℃에서 10분 동안 항온배양하였다. 0.01% SBTI, 0.001% DNase 및 0.075% BSA를 함유하는 DMEM을 사용하여 분해 과정을 중단시켰다. 조직학 분석을 위해, 뇌 및 척수를 액체 질소 중에서 스냅-동결시키고 절편화할 때까지 -80℃에서 저장하였다. 요추-천골 척수 또는 전방, 중간 및 후방 뇌의 크라이오스탯-절편(20㎛)을 고정시킨 다음, 관심대상의 항체로 염색하였다. 혈관을 항-Flk-1(VEGFR2)에 의해 가시화하고, NSC를 항-sox-2 (Millipore)로 염색하거나 PKH26 염료에 의해 적색으로 가시화하였다. 신경병리학 분석을 위해, 세포 정량을 상이한 그룹들의 동물들의 입체학적 분석에 의해 수행하였다. 척수 및 뇌를 절편화하고, 경추 및 요천골 영역의 3번째 절편마다 염색하고, 세포 정량을 3 내지 5개 절편의 고배율 확대로 수행하였다. 동력 스테이지를 갖는 LSM 510 공초점 현미경을 사용하여 염색 강도 및 고배율 확대당 총 세포수를 입체학적으로 계산하였다.
통계학적 분석- 데이터는 평균 ±SEM으로서 표현된다. 평균들 간의 차이의 통계학적 유의성은 2원 ANOVA로 측정하였다. 평균이 유의적으로 차이가 있는 것으로 나타난 경우, 터키 t검정에 의해 사후(post-hoc) 다중 비교를 수행하였다. 통계학적 유의성은 p<0.05로서 정의되었다.
참조문헌 - 실시예 7
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Claims (53)

  1. 당뇨병을 치료하는 방법에 사용하기 위한, 조혈 세포 E-/L-셀렉틴 리간드 (Hematopoietic Cell E-/L-selectin Ligand: HCELL)를 발현하는 중간엽 줄기 세포 (mesenchymal stem cell: MSC)들의 집단을 포함하는 조성물로서, 상기 방법이
    상기 조성물을 대상체에게 투여함을 포함하고,
    상기 투여가 표적 조직 내의 내피 세포 상의 E-셀렉틴 발현과 동시에 및/또는 상기 표적 조직 내의 백혈구의 축적과 동시에 일어나는, 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 표적 조직이 염증 발생된 조직 및/또는 손상된 조직인, 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 투여가 (i) 상기 대상체의 상기 표적 조직으로의 세포 전달을 증진시키는데 효과적이고/이거나 (ii) 상기 대상체의 상기 표적 조직의 정착(lodgment), 콜로니화 또는 생착(engraftment)을 증진시키는데 효과적인, 조성물.
  4. 제2항에 있어서, 상기 투여가 내피 세포 상의 E-셀렉틴 발현 및 상기 표적 조직 내의 L-셀렉틴 보유 백혈구의 침윤과 동시에 일어나거나, 상기 투여가 상기 염증 발생된 조직 및/또는 손상된 조직으로의 백혈구의 침윤 동안 일어나는, 조성물.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 투여가 직접 주사에 의해, 또는 상기 표적 조직 상으로의 상기 조성물의 배치에 의해, 정맥내로 일어나는, 조성물.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 투여가 상기 조성물의 1회 또는 일련의 주사를 포함하거나, 상기 투여가 상기 조성물의 1일 1회, 주 1회, 2주 1회, 월 1회 또는 년 1회 주사를 포함하는, 조성물.
  7. 제2항에 있어서, 상기 투여가 상기 대상체의 상기 염증 발생된 표적 조직 및/또는 손상된 표적 조직 내에서 면역조절 효과를 달성하기에 효과적이고, 상기 방법이 상기 조성물의 이전 투여의 면역조절 효과의 감소시 상기 조성물의 1회 이상의 추가 투여를 추가로 포함하는, 조성물.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 조성물이 기타 증진제, 소염제 또는 조직 스캐폴드/이식 가능한 장치/겔과 병용되어 사용되는, 조성물.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 조성물이 골수 세포를 포함하는, 조성물.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 대상체가 인간, 비인간 영장류, 마우스, 래트, 개, 고양이, 말 또는 소인, 조성물.
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 조성물이 말초 혈관 접근로(peripheral vascular access) 또는 중심 혈관 접근로(central vascular access)를 통해 전신 투여되거나,
    상기 조성물이, 카테터-기반 접근법 또는 세포의 혈관 볼루스(vascular bolus)를 의도된 조직 부위로 전달하는 기타 혈관 접근 장치를 사용하여 상기 의도된 조직 부위의 해부학적 공급 혈관으로 혈관내 투여되거나,
    상기 조성물이 카테터-기반 접근법 또는 직접 주사에 의해 체강으로 직접 투여되거나,
    상기 조성물이 혈관내 접근법 또는 경피 접근법을 사용하는 직접적 국소 조직 주사에 의해 투여되거나 해부학적으로 접근가능한 조직 부위로 직접 투여되고/되거나 영상 기술의 유도하에 투여되거나,
    상기 조성물이 관련 조직 표면/부위로 직접 배치됨으로써 투여되거나,
    상기 조성물이 스캐폴드 내로 투여되거나 조직 내로 배치된 스캐폴드 내에 매립되고/되거나 겔 내에 투여되고/되거나 증진제와 함께 투여되는, 조성물.
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